WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

 

  На правах рукописи

                               

  Григорьев Владимир Викторович

РАЗРАБОТКА СИСТЕМЫ поиска препаратов для КОРРЕКЦИИ нарушений Когнитивных функций при нейродегенеративных заболеваниях в ряду лигандов 

глутаматных рецепторов

14.00.25 – фармакология, клиническая фармакология

 

 

  Автореферат

       диссертации на соискание ученой степени 

  доктора биологических наук

Москва - 2009

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте физиологически активных веществ РАН

Научный консультант:

Член-корреспондент РАН, доктор химических наук, профессор

Сергей Олегович Бачурин

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор Георгий Иванович Ковалев

Доктор биологических наук Анатолий Николаевич Иноземцев

Доктор биологических наук, профессор Николай Михайлович Митрохин

Ведущая организация – ГОУ ВПО Российский государственный медицинский университет Росздрава

  Защита состоится __________ 2009 года в ____ часов на заседании диссертационного Совета  Д 001.024.01 при ГУ НИИ фармакологии им. В.В. Закусова РАМН по адресу: г. Москва, ул. Балтийская, д. 8.

Автореферат разослан “_____”_____________  2009 г.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ фармакологии  им. В.В. Закусова РАМН (г. Москва, ул. Балтийская, д. 8).

Ученый секретарь

диссертационного совета,

доктор медицинских наук                 Е.А. Вальдман

  ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

   Характерной тенденцией развития современного общества в большинстве стран мира является увеличение продолжительности жизни и связанное с этим повышение в структуре населения доли лиц пожилого и старческого возраста. Эти процессы видоизменяют удельный вес различных форм патологий в популяции, среди которых доминирующее место занимают нейродегенеративные болезни. Именно поэтому, проблема когнитивных расстройств, в большинстве случаев развивающихся при нейродегенеративных заболеваниях позднего возраста, признается в настоящее время одной из наиболее актуальных и значимых с медико-социальной точки зрения (Иллариошкин, 2007). 

Болезнь Альцгеймера (БА) является наиболее распространенной формой нейродегенеративных заболеваний в пожилом возрасте. Ежегодно число больных БА и родственными формами увеличивается на 800 тысяч в Европе и на 360 тысяч в США и Канаде (Brookmeyer et al., 1998; Sykes et al., 2001). К настоящему времени число людей с БА составляет около 20 млн. человек во всем мире, что наносит экономический ущерб, оцениваемый в 100 миллиардов долларов ежегодно (Fillit, Hill, 2005). Проблема старческого слабоумия является исключительно актуальной также и для нашей страны. Анализ эпидемиологических исследований позволяет говорить о том, что общая численность больных БА в России превышает 1 млн. человек (Гаврилова, 2001).

Вместе с тем, в настоящее время в реальной медицинской практике для лечения, в частности, БА широко используется крайне ограниченное число препаратов – всего четыре, три  из которых являются ингибиторами ацетилхолинэстеразы. Все эти препараты обладают рядом побочных свойств. Поэтому создание новых препаратов для лечения нейродегенеративных заболеваний и улучшения когнитивных функций является важнейшей задачей современной фармакологии (Воронина Т.А., Середенин С.Б., 1998; Воронина, Т.А., 2003; Островская Р.У. и др., 2002;  Bachurin, 2003; Середенин С.Б. и др., 2006).

Одним из наиболее интенсивно развиваемых в настоящее время направлений создания новых лекарственных средств является поиск потенциаторов АМРА рецепторов и блокаторов NMDA рецепторов глутаматергической системы мозга (Lynch, Gall, 2006; Villmann, Becker, 2007). Неконкурентный блокатор NMDA рецепторов мемантин уже используется для лечения больных БА (Farlow, 2004). В то же время попытки применения других блокаторов NMDA- или потенциаторов АМРА рецепторов для лечения нейродегенеративных заболеваний и улучшения когнитивных функций у человека дают неоднозначные результаты. Потенцируя АМРА рецепторы в опытах in vitro, и улучшая память экспериментальных животных в поведенческих экспериментах, а также у людей-добровольцев, ряд потенциаторов АМРА рецепторов в клинических испытаниях не показывает достоверного улучшения когнитивных функций больных (Goff  et al., 2008; Chappel et al., 2007). Безуспешными до сих пор остаются и попытки клинического использования антагонистов NMDA рецепторов (кроме мемантина) (Ikonomidou et al., 2000; Ikonomidou, Turski, 2002; Albensi et al., 2004). Все это делает актуальным выработку системы поиска перспективных соединений среди потенциаторов АМРА- и блокаторов NMDA рецепторов для оптимизации процесса создания новых лекарственных средств.

Цель исследования.

Определить прогностическую роль модуляции АМРА и NMDA рецепторов ЦНС млекопитающих лигандами глутаматных рецепторов с целью оптимизации поиска лекарственных средств для коррекции нарушений когнитивных функций при нейродегенеративных заболеваниях

Задачи исследования

1. Изучить влияние ряда эндогенных гормонов и пептидов на функциональное состояние АМРА и NMDA рецепторов нейронов мозга млекопитающих.

2.  Определить электрофизиологическим методом параметры ответов АМРА и NMDA  рецепторов  нейронов коры и мозжечка головного мозга млекопитающих на воздействие новых соединений.

3. Исследовать когнитивно-стимулирующие свойства наиболее активных соединений в поведенческих тестах.

4. Изучить нейропротективное и когнитивно-стимулирующее действие отечественного лекарственного препарата димебон и участие глутаматных рецепторов в его реализации.

5. По результатам исследований определить критерии поиска лекарственных средств для лечения нарушений когнитивных функций при нейродегенеративных заболеваниях в ряду лигандов глутаматных рецепторов.

Научная новизна

Впервые электрофизиологическим методом показано существование в коре и гиппокампе головного мозга млекопитающих четырех типов нейронов, в которых ответы NMDA рецепторов на агонисты NMDA и хинолинат, соагонист глицин, конкурентные антагонисты АР5 и АР7 значительно отличаются. Полученные результаты, наряду с данными других исследователей, полученными методами молекулярной биологии, послужили основанием для идентификации 4-х основных типов NMDA рецепторов в нейронах головного мозга млекопитающих.

Получены новые данные о механизмах действия ряда эндогенных пептидов на глутаматные рецепторы, свидетельствующие об их способности существенно модулировать работу АМРА и NMDA рецепторов нейронов головного мозга и тем самым влиять на когнитивные функции и нейродегенеративные процессы.

Впервые выявлено, что кортикотропин-подобный промежуточный лобный пептид (CLIP) потенцирует токи АМРА рецепторов и блокирует токи NMDA рецепторов. Установлено, что соматостатин аналогичным образом влияет на

ответы АМРА и NMDA рецепторов.  Можно предположить, что эти свойства CLIP и соматостатина определяют их важную роль в процессах формирования памяти.

Среди новых представителей химических классов: ациклических производных изотиомочевины (дибензиламинов и изотиомочевин) и N,N′-замещенных 3,7-диазабицикло[3.3.1]нонанов выявлены вещества, обладающие свойствами позитивных аллостерических модуляторов АМРА рецепторов и неконкурентных антагонистов NMDA рецепторов. Показано, что соединения-лидеры – IP5051, IP9040, IP9150 и ХХХ-2 – обладают высокими когнитивно-стимулирующими свойствами и низкой токсичностью.

Впервые установлен механизм действия димебона на АМРА и NMDA рецепторы и изучены его переносимость и влияние на отдельные показатели старения у экспериментальных животных при длительном применении.

Установлено, что действие димебона на АМРА и NMDA рецепторы аналогично действию эндогенных пептидов, играющих важную роль в формировании памяти.

Сформулирована система поиска лекарственных средств для лечения нарушений когнитивных функций при нейродегенеративных заболеваниях в ряду лигандов глутаматных рецепторов на основе способности веществ одновременно потенцировать АМРА- и блокировать NMDA рецепторы.

Научно-практическая значимость

1. Разработана методология поиска препаратов для коррекции когнитивных функций при нейродегенративных заболеваниях в ряду лигандов глутаматных рецепторов.

2. Расширено представительство химических классов позитивных модуляторов АМРА рецепторов.

3. Показано, что соединения-лидеры – IP5051, IP9040, IP9150 и ХХХ-2  представляют  несомненный интерес для дальнейших предклинических  испытаний в качестве препаратов для лечения нарушений когнитивных функций при нейродегенеративных заболеваниях.

4. Показано, что представитель гидрированных пиридо ([4,3-b]) индолов – димебон – помимо высоких когнитивно-стимулирующих и  нейропротекторных свойств, обладает также свойствами при длительном применении предупреждать развитие отдельных признаков старения экспериментальных животных.

5. Результаты электрофизиологических и фармакологических исследований димебона легли в основу нормативных материалов и были представлены в Россздравнадзор для получения разрешения на проведение клинических испытаний димебона по новому применению – в качестве средства для лечения БА.

Личный вклад автора

  Личный вклад соискателя заключается в разработке идеи и планов работы, в постановке и проведении экспериментальных исследований, в статистической обработке и интерпретации полученных результатов.

Апробация работы

Результаты исследования и основные положения работы доложены на следующих научных конференциях и съездах: на I Всесоюзном Совещании «Глутаматные рецепторы», Ленинград, 1987; на 7-th Conference of European  Neurochemichal Society, Sweden, Stockholm, 1988; на межреспубл. конференции, Волгоград, 1989; на XIY Менделеевском Съезде, Москва, 1989; на 13rd Int. Congress of the Int. Society for Neurochemistry, Australia, Sydney, 1991; на 3rd Int. Congress of Compar. Physiol. and Bioch., Tokyo, 1991, на 16-th Meeting of the Int. Society for Neurochemistry, 1997, Boston, USA; на 4-th Congress of European Society for Clinical Neuropharmacology, 1997, Eilat, Israel; на 9-th Int. Congress of the Czech and Slovak Neurochemichal Society, 1998, Martin, Slovakia; на 2-й Российской  конф. Болезнь Альцгеймера и старение: от нейробиологии к терапии, 1999, Москва; на 5th Int. Conf. on  Neuroprotective Agents, 2000, Lake Tahoe, Calofornia, USA; на III Российской конф., посвящ. 100-летию со дня рождения проф. Э.Я.Штернберга, 2003, Москва; на Конф. «Фундаментальные науки-медицине». Росс. Акад. Наук, Москва,  2003; на XVIIth Int. Symposium on Medicinal Chemistry, 2004, Copenhagen, Denmark & Malmo, Sweeden; на Conference en Neurobiologie Ladislav Tauc: the World of Synapse: Molecular Basis, Pathology and Drug Discovery, 2004, Gif-sur-Yvette, France; на Симпозиуме «Современное состояние исследований, диагностики и терапии нейродегенеративных заболеваний (болезни Альцгеймера, Паркинсона и др.), 2005, Москва; на 7th Int. Conference “Alzheimer’s and Parkinson’s Diseases”, Sorento, Italy, 2005; на XIV European Bioenergetics  Conference, 2006, Moscow; на 8th Int. Symposium on Neurobiology and Neuroendocrinology of Aging, Bregenz, Austria, 2006; на 10th Int. Conf. on Alzheimer’s Disease and Related Disorders, Madrid, Spain, 2006; на III съезде фармакологов России «Фармакология – практическому здравоохранению», 2007, С-Петербург; на конференции «Орг. химия для медицины», 2008, Черноголовка.

Публикации: по теме диссертации опубликовано 40 печатных работ, в том числе 14 статей в периодических изданиях, рекомендованных ВАК; получено 8 патентов на изобретения.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 5-ти глав, посвященных описанию материала, методов и результатов исследования, обсуждению результатов, выводов, а также списка использованных 485 источников литературы, включающего 68 работ отечественных и 417 работ зарубежных авторов. Работа изложена на 280 страницах машинописного текста, содержит 36 таблиц и 85 рисунков. 

Материалы и методы исследования

Исследованы новые соединения 3-х химических классов. Ациклические изотиомочевины были условно разделены на два класса: дибензиламины (N, S-замещенные N'-1-[(гетеро)арил] -N'-[(гетеро)арил] метилизотиомочевины), и алкилизотиомочевины (S-замещенные N-1-[(гетеро)арил]алкил-N’-1-[(гетеро)арил] алкилизотиомочевины), синтезированные к.х.н. А.Н. Прошиным (ИФАВ РАН); N,N'-замещенные 3,7-диазабицикло[3.3.1]нонаны и производные пирролидинового ряда (аналоги АМПАкина BDP), синтезированы на кафедре органической химии МГУ им. М.В. Ломоносова М.И. Лавровым (Зав. кафедрой -  академик РАН Н.С. Зефиров).

Исследованы эндогенные вещества: дельта-пептид сна (DSIP) (кат. № 150793, ICN), уридин (кат. № U3750, “Sigma”), мурамиловые пептиды (MDP) (кат. № A9519, “Sigma”), интерлейкин-1 (IL-1) (кат. № 195774, ICN), кортикотропин-подобный промежуточный лобный пептид (CLIP) (кат. № 152723, ICN), холецистокинин (CCK-4) (кат. № 154544, ICN), соматостатин (кат. № 195505, ICN); производные арахидоновой и докозагексаеновой кислот: амиды арахидоновой (AК) кислоты с дофамином - анандамид (AК-ДA), и этаноламином (AК-ЭA), амид докозогексаеновой кислоты (ДГК) с дофамином (ДГК-ДA),  и эфиры ДГК с этиленгликолем (ДГК-ЭГ) и нитроэтиленгликолем (ДГК-НЭГ). Производныe АК и ДГК синтезированы д.х.н., проф. В.В. Безугловым  (Институт Биоорганической Химии РАН) и к.х.н. И.В. Серковым (ИФАВ РАН); производные глутаминовой кислоты - фосфорсодержащие аминокарбоновые кислоты – 2-амино-5-фосфонопентановая (АР5) и 2-амино-7-фосфоногептановая (АР7) кислоты, синтезированные к.х.н. В. В. Рагулиным  (ИФАВ РАН).

В качестве препаратов сравнения исследованы лекарственные средства:   димебон (субстанция, ООО “Органика”), мемантин (М9292, “Sigma”), такрин (№ 154198, ICN), и соединения: циклотиазид (C9847, “Sigma”) и МК-801 (M107, Sigma”).

  Для  создания  на животных экспериментальной модели болезни Альцгеймера использовали нейротоксин AF64A – (1-этил-1[2-гидроксиэтил]азиринидиум хлорид (“Bachem”).

  Эксперименты в тесте «Условный рефлекс активного избегания» проведены на 160 крысах самцах популяции Вистар массой 240-280 г.

Эксперименты в тесте «Узнавания новой локализации объекта»  проведены на  440 мышах самцах линии C57Bl/6 в возрасте 3-4 месяца.

Эксперименты в тесте «Открытое поле» проведены на 30 мышах самках линии C57Вl/6 в возрасте 27 месяцев.

Хронический эксперимент по изучению переносимости димебона при его длительном применении проведен на 98 мышах-самках  линии С57Bl/6 возраста 21 месяц.

Все животные содержались в виварии ИФАВ РАН в стандартных условиях. Световой цикл состоял из 12 часов дня и 12 ночи, день начинался в 6 часов и заканчивался в 18 часов. 

Животные получали комбикорм ПК-120-1 для лабораторных крыс и мышей (экструдированный). Сертификат соответствия № POCC RU. ПР15. В11046.

ГОСТ  Р50258-92.

Для измерения трансмембранных токов исследуемых нейронов Пуркинье мозжечка головного мозга крыс и нейронов коры головного мозга крыс, а также культивируемых нейронов гиппокампа крыс нами использован электрофизиологический метод patch-clamp в конфигурации whole cell (Hamill et al., 1980).

Нейроны Пуркинье выделяли из мозжечков 12-16 дневных крыс популяции Вистар. Для выделения использовали модифицированный метод  Kaneda et al., (1988). Для выделения нейронов коры головного мозга использовали тот же метод  с той лишь разницей, что возраст крыс составлял 7-9 дней, и время инкубации с ферментами составляло 14-16 минут в зависимости от возраста животных.

Культуральные нейроны получали из гиппокампов новорожденных крыс (1-2 суток) способом трипсинизации с последующим пипетированием. Культуральные клетки приготовлялись к.б.н. Н.Н. Лермонтовой и н.с. Т.П. Серковой (ИФАВ РАН).

Для получения трансмембранных токов производили активацию АМРА (-амино-3-гидрокси-5-метил-4-изоксазолпропионовая кислота) рецепторов аппликацией растворов агонистов этих рецепторов -  каиновой кислоты (КК) или глутаминовой кислоты, активацию NMDA рецепторов - аппликацией растворов агониста этих рецепторов N-метил-D-аспартата (NMDA) методом быстрой суперфузии растворов.

  Для отведения токов использовали боросиликатные микроэлектроды (сопротивление 2,5 – 5,5 мОм). Для регистрации токов использовали прибор EPC-9 (HEKA, Germany). Запись токов осуществлялась при помощи лицензионной программы Pulse (HEKA) на жесткий диск компьютера Pentium-3. Обработка результатов осуществлялась при помощи программы Pulsefit (HEKA).

Экспериментальная модель БА на крысах создавалась внутрижелудочковой инъекцией нейротоксина AF64A, который вызывает селективное разрушение ацетилхолиновых синаптических окончаний с последующей деградацией нейронов и снижением содержания ацетилхолиновых маркеров в гиппокампе и коре головного мозга крыс (Fisher, Hanin, 1986; Walsh, Opello, 1994; Lermontova et al., 1998). Под эфирным наркозом в стереотаксисе крысам в боковые желудочки мозга инъецировали 3 нмоль AF64A в 3 мкл искусственной спино-мозговой жидкости, контрольным крысам вводили 3 мкл искусственной спино-мозговой жидкости.

  Действие эндогенных гормонов и пептидов на пресинаптические глутаматные рецепторы определяли при помощи метода захвата 45Са2+ в синаптосомы коры мозга крыс при стимуляции глутаматом и NMDА. Синаптосомы коры мозга крыс выделяли по стандартной методике Хайоша (Hajosh, 1975)  из коры мозга новорожденных крысят  (9-10 дней) популяции Вистар. Данные эксперименты проводили совместно с н.с. Л.Н. Петровой (ИФАВ РАН).

Исследования по оценке «Условного рефлекса активного избегания» (УРАИ)  проведены на крысах с экспериментальной моделью БА по методу Т.А. Ворониной, Р.У. Островской (2005). На следующий день после операции крысам первой группы внутрибрюшинно вводили исследуемые вещества –  димебон  или IP5051 – в соответствующих дозах и это введение осуществляли ежедневно в течение 12 - 14 дней. Другой группе крыс с холинотоксином AF64A давали физраствор из расчета 0,1 мл/кг веса.  Группам сравнения с холинотоксином AF64A вводили антихолинэстеразный препарат такрин или блокатор NMDA рецепторов мемантин. Контрольной интактной группе крыс внутрибрюшинно в течение всего времени эксперимента вводили физраствор. Все крысы в двухкамерной клетке типа Shuttle-box обучались избегать болевого раздражения, подаваемого через электрифицированный пол. Данные эксперименты проводили совместно с к.х.н. Н.В. Лукояновым и к.б.н. Н.Н. Лермонтовой (ИФАВ РАН).

Изучение действия веществ на память осуществляли с помощью теста узнавания объекта (“Object recognition test”) по методу (Gaffan, 1992; Kolb et al., 1994; Steckler et al., 1998). Эксперименты проводили в камере наблюдения, которая  изготовлена из непрозрачного органического стекла белого цвета размером  48х38х30 см. В качестве объектов обследования использовали стеклянные флаконы коричневого цвета  диаметром 2,7 см и высотой 5,5 см. За 2 – 3 мин. до помещения животного  камеру и объекты обследования протирали  85% спиртом. Животных  всегда  помещали в центр камеры. Исследуемые вещества вводили внутрижелудочно за 1 час до тренировки. Контрольным животным вводили эквивалентный объем  растворителя. Данные эксперименты проводили совместно с к.м.н. Б.К. Безноско (ИФАВ РАН).

  Для определения двигательной активности животных, их эмоционального состояния и ориентировочно-исследовательской реакции использовали тест открытого поля по методу Т.А. Ворониной, С.Б. Середенина (2005). Данные эксперименты проводили совместно с к.м.н. Б.К. Безноско (ИФАВ РАН).

  Состояние органов и тканей животных в длительном эксперименте оценивали с помощью гистологического метода. Для этого у павших животных и у животных в агональном состоянии забирали кусочки из внутренних органов и тканей. Материал фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина, после гистологической проводки заливали в парафин. Гистологические срезы толщиной 4-5 мкм окрашивали гематоксилином и эозином. Данные эксперименты проводили совместно с проф. Л.М. Михалевой (ГУ НИИ морфологии человека РАМН).

  Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием статистического пакета программы Microsoft Excell (версия Windows XP). Представлены средние арифметические и их доверительные интервалы (M±m). Достоверность различий определяли по t-критерию Стьюдента. Достоверными принимали различия при р0,05. Построение графиков осуществляли также с помощью программы Microsoft Excell.

  РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Изучение влияния эндогенных физиологически активных веществ и их

синтетических производных на функциональное состояние АМРА и 

  NMDA рецепторов

Фундаментальные исследования, проведенные электрофизиологическим методом patch-clamp на свежевыделенных нейронах коры и гиппокампа головного мозга крыс  в конце 80-х годов, показали, что в разных нейронах ответы на агонист NMDA рецепторов NMDA, его эндогенный лиганд хинолиновую кислоту (ХК), соагонист глицин и конкурентные антагонисты АР5 и АР7 существенно варьировали. Обнаружено 4 типа нейронов, в которых сочетания ответов на эти вещества имели устойчивый характер, но существенно отличались друг от друга (Grigoriev et al., 1991а, 1991б; Григорьев и др., 1992, Григорьев, 1993а; 1993б). В нейронах 1 типа возможность генерации токов NMDA и ХК полностью зависела от наличия глицина, АР5 полностью подавляла NMDA- и ХК-активируемые токи, АР7 блокировала токи только на 60%; в нейронах 2 типа NMDA и ХК вызывали одинаковые токи, которые не зависели от наличия глицина, АР5 и АР7 полностью блокировали токи NMDA  и ХК с глицином и без него; в нейронах 3 типа NMDA  и ХК вызывали одинаковые токи, которые глицин существенно потенцировал, АР5 и АР7 обе почти одинаково блокировали токи обоих агонистов на 40-70%; в нейронах 4 типа NMDA  и ХК без глицина вызывали разные токи, глицин изменял ток NMDA, но не влиял на ток ХК, АР5 не влияла на токи ХК, но блокировала изменение тока NMDA, АР7 блокировала прибавку тока, которую давал глицин, и частично подавляла ток без глицина.

Одновременно в ведущих лабораториях мира методами молекулярной биологии были выделены mРНК субъединиц NMDA рецепторов. Было установлено, что имеются два основных типа субъединиц: NR1 и NR2, но субъединиц NR2 имеется 4 подтипа – NR2A, NR2B, NR2C и NR2D (Holmann, Heineman, 1994). Полученные методом реконструкции 4 типа NMDA рецепторов, состоящие из двух NR1 и двух каких-либо NR2(Х) субъединиц имели существенные отличия в своих функциональных и фармакологических свойствах (Buller et al., 1994; Chazot et al., 1994; Monyer et al., 1994; Laurie, Seeburg, 1994; Kendrick et al., 1996; Buller, Monaghan, 1997). В то же время имелось значительное сходство в реакциях этих разнородных NMDA рецепторов с

данными, полученными нами.

Таким образом, полученные нами результаты, наряду с данными других исследователей, послужили основанием для идентификации 4-х основных типов NMDA рецепторов в нейронах головного мозга млекопитающих, что явилось фундаментом для последующего синтеза избирательных и терапевтически перспективных лигандов этих рецепторов.

С целью установления механизмов эндогенной регуляции когнитивных и нейродегенеративных процессов было изучено влияние ряда эндогенных пептидов на АМРА и NMDA рецепторы.

Электрофизиологические эксперименты на нейронах гиппокампа показали, что кортикотропин-подобный промежуточный лобный пептид (CLIP) вызывает потенциацию ответов АМРА рецепторов в широком диапазоне концентраций (рис. 1). Кроме того, CLIP блокирует ответы постсинаптических NMDA рецепторов, и в определенном диапазоне концентраций блокирует пресинаптические NMDA рецепторы. Особенностью действия CLIP на пресинаптические NMDA рецепторы является то, что он вызывает их блокаду только в очень низких концентрациях – 10-14–10-11 М.

 

Рис. 1. Влияние CLIP на NMDA (1) и КК (2)  - активируемые токи в культивируемых нейронах гиппокампа крыс.

Примечание: по оси абсцисс – логарифм концентраций CLIP в Молях, по оси ординат – амплитуда токов по отношению к контролю %. 

Соматостатин блокирует постсинаптические NMDA рецепторы, но активирует АМРА рецепторы практически во всем диапазоне концентраций (рис. 2). Это хорошо согласуется с его противосудорожным действием и участием в процессах памяти (Matsuoka et al., 1994). Соматостатин также блокирует вход кальция, который вызывается активацией пресинаптических NMDA рецепторов, что подтверждает ранее полученные результаты о блокаде им входа кальция в пресинаптические терминали (Boehm, Betz, 1997).

Рис. 2. Влияние соматостатина на KK- (1) и NMDA (2) - активируемые токи в культивируемых нейронах гиппокампа крыс.

Примечание: по оси абсцисс – логарифм концентраций соматостатина в Молях, по оси ординат – амплитуда токов по отношению к контролю в % (контроль=100%).

Установлено, что дельта-сон-вызывающий пептид (DSIP) блокирует постсинаптические NMDA рецепторы. Определенный интерес имеют установленные нами различия в действии DSIP на постсинаптические NMDA рецепторы в нейронах коры и гиппокампа. Начиная с концентрации  DSIP  1х10-13 М, величина ответов в нейронах коры составляет в среднем 40% от контрольных величин. В нейронах гиппокампа его действие несколько отличается: блокирующий эффект наблюдается с концентраций DSIP на порядок выше – 1х10-12 М – и имеет волнообразный характер. Установлено, что DSIP также оказывает ингибирующее действие на пресинаптические NMDA рецепторы. В то же время DSIP не влияет на ответы АМРА рецепторов.

Уридин вызывал значительную, но не полную блокаду постсинаптических NMDA рецепторов и практически полную концентрационно-зависимую блокаду пресинаптических NMDA рецепторов. Учитывая сомногенное действие уридина, можно предположить, что он играет важную роль в процессах общего торможении ЦНС, и также нейропротекторную роль во время сна (Kimura et al., 2001). Обнаружен небольшой потенцирующий эффект уридина на АМРА рецепторы, но пока не установлена его роль в когнитивных процессах.

Мурамиловые дипептиды (MDP) в наших экспериментах потенцировали АМРА и блокировали NMDA рецепторы. Холестокинин (ССК-4) блокировал захват кальция в узком диапазоне доз -  (1х10-9 – 1х10-7 М) и в этом отношении его действие похоже на действие интерлейкина 1- (IL1-), только последний был на 2 порядка активнее. Эти данные говорят о том, что оба эти вещества в узком диапазоне доз способны модулировать пресинаптические NMDA рецепторы и тем самым нервную возбудимость и пластичность.

  Проведенные исследования показали, что производные АК и ДГК в низких концентрациях, в отличие от самих кислот, способны влиять на ответы АМРА рецепторов. AК-ДА, ДГК-ДА и ДГК-ЭГ способны заметно потенцировать трансмембранные токи, вызываемые активацией АМРА рецепторов. ДГК-НЭГ, напротив, вызывает угнетение токов АМРА рецепторов. Полученные результаты  подтверждают, что модификация молекулы эндогенного вещества может привести к весьма существенному изменению спектра его физиологической активности.

Наибольший интерес представляют данные о действии CLIP, который оказывает стимулирующее влияние на память во время фазы парадоксального сна, на глутаматные рецепторы (Seidenbecher et al., 1993;  Wetzel et al., 2003; Ambrosini et al., 2001; Wetzel et al., 1994), а также соматостатина. Нами впервые установлено, что CLIP и соматоститин потенцируют АМРА рецепторы и блокируют NMDA рецепторы в широком диапазоне концентраций (6 порядков), что является крайне важным для проявления их память-стимулирующего эффекта. Полученные результаты расширяют наши знания о том, как эндогенные соединения могут осуществлять регуляцию когнитивных процессов. Один из таких механизмов может заключаться в модуляции АМРА и NMDA рецепторов.

Анализ полученных результатов в данном разделе работы позволяет заключить, что исследованные эндогенные пептиды играют важную роль в регуляции глутаматергической медиаторной системы мозга. Они действуют в крайне низких концентрациях, начиная с концентрации 1х10-14 М, концентрационно зависимо и обратимо, что говорит об исключительной специфичности соответствующих рецепторов. Диапазон оказываемого ими влияния на ответы постсинаптических глутаматных рецепторов достаточно узок и, как правило, не превышает 60-70% изменения от уровня контрольных значений.

Таким образом, выявленные параметры модуляции АМРА и NMDA рецепторов эндогенными веществами, в первую очередь CLIP и соматостатином, дают ориентиры для поиска и отбора синтетических соединений в качестве потенциальных терапевтических препаратов. На их основе были разработаны направления синтеза новых соединений в нескольких химических классах.

  Изучение влияния новых химических соединений на функциональное

состояние АМРА и NMDA рецепторов

       В результате направленного синтеза в ИФАВ РАН и на кафедре органической химии МГУ им. М.В. Ломоносова были синтезированы новые вещества в трех химических классах, которые были изучены на их способность модулировать ответы АМРА и NMDA рецепторов нейронов ЦНС.

Изучение влияния производных дибензиламинов

  Действие веществ на АМРА рецепторы. Показано, что большая часть соединений этого класса потенцирует токи АМРА рецепторов, но с разной степенью эффективности. Результаты исследований действия веществ на КК-вызванные токи в нейронах Пуркинье представлены в таблице 1.

Табл. 1. Влияние новых производных дибензиламинов на КК-вызванные токи в нейронах Пуркинье мозжечка крыс. В колонках – амплитуды токов в % при действии соответствующей концентрации вещества (M±m).

№ п/п

Шифр

  Концентрация веществ

10-7М

2х10-7М

5х10-7М

10-6М

10-5М

3х10-5М

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

21

22

23

24

25

26

27

28

29

30

31

32

33

34

35

36

37

38

39

40

41

42

IP5051J

IP5051Cl

IP5051Br

IP6016

IP6024

IP6025

IP9011

IP9039

IP9095

IP9117

IP9118

IP9120

IP9121

IP9122

IP9125

IP9126

IP9127

IP9128

IP9129

IP9143

IP9152

IP9153

IP9200

IP9223

IP9225

IP9236

IP9238

IP9240

IP9241

IP9242

IP9255

IP9260

IP9262

IP9263

IP9266

IP9267

IP9268

IP9269

IP9270

IP9271

IP9275

IP9276

100

100

100

100

100

100

100

-

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

104

100

100

100

100

100

100

169

100

100

100

130

100

120

130

100

100

200

-

-

-

-

-

-

145±35

100

105

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

130±5

130±5

130±5

-

-

-

155±25

150±15

105

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

165±10

165±10

165±10

145±5

160±10

100

145±25

130±5

105

100

100

120±10

110±5

125±10

100±5

180±10

100

100

100

100

210±10

220±20

100

100

170±10

100

124±5

139±10

119±5

125±5

100

173±5

160±20

200±20

180±15

140±15

135±5

260±5

170±10

100

115±5

143±15

550±35

550±25

550±25

260±15

285±25

100

100

100

105

100

100

160±20

140±15

170±20

125±5

250±20

100

100

100

100

245±20

280±30

100

100

210±15

100

150±15

180±25

140±10

360±45

100

164±15

560±45

810±130

210±20

178±22

470±10

330±10

185±10

160±5

300±45

142±10

1050±55

1050±55

1050±45

295±35

350±45

100

100

100

100

100

100

290±35

210±30

310±35

145±15

250±30

100

100

100

100

275±35

320±40

100

100

-

100

150±15

215±40

180±25

700±95

100

125±20

800±70

910±95

275±25

200±29

770±15

360±15

350±150

380±10

615±65

135±8

Примечание: амплитуда контрольных токов взята за 100%.

На рисунке 3 приведены графики влияния некоторых представителей производных дибензиламинов на каинат-вызванные токи, демонстрирующие диапазон их активности как потенциаторов АМРА рецепторов.

На основании анализа полученных данных определено наиболее активное соединение. Этим соединением оказалось IP5051, вызывающее наибольшую потенциацию АМРА рецепторов.

Проведенные исследования показали, что циклотиазид (ЦТ) – модельный потенциатор АМРА рецепторов, блокирующий их десенситизацию, и соединение IP5051 оказывают на КК-вызванные токи аналогичное действие. Графики зависимости концентрация - ответ для КК, и для КК в присутствии  30 мкМ ЦТ или IP5051 (рис. 4) показывают, что оба соединения  вызывают непараллельный сдвиг кривой концентрация-ответ для КК в диапазоне концентраций последней от 10 до 4000 мкМ. Ответы в присутствии IP5051 были немного больше, чем в

присутствии ЦТ.

Практически полное сходство действия ЦТ и IP5051 на ответы, вызываемые активацией АМРА рецепторов в нейронах Пуркинье (рис. 4), позволяет сделать вывод, что в основе механизма потенцирующего действия IP5051 лежит блокада десенситизации АМРА рецепторов.

Рис. 3. Действие некоторых производных дибензиламинов  на КК-вызванные токи в  нейронах  Пуркинье мозжечка крыс. Соединения: 1 – IP5051, 2 – IP9242, 3 –  IP9122, 4 – IP9260, 5 – IP9128.

Примечание: по оси абсцисс – логарифм концентраций веществ в Молях, по оси ординат – амплитуда токов по отношению к контролю в %.

Рис. 4. Влияние ЦТ и соединения IP5051 на зависимость концентрация - ответ для токов, вызванных аппликацией КК в нейронах Пуркинье.

Примечание: Ответы нормализованы к ответам, вызываемым аппликацией максимально использованной концентрации КК - 4 мМ для соответственно контроля () (принятом за 1) и в присутствии 30 мкМ ЦТ () и IP5051 ().

Действие соединения IP5051 на NMDA рецепторы в нейронах коры головного мозга крыс. Установлено, что IP5051 блокирует токи, вызываемые активацией NMDA рецепторов. По степени чувствительности NMDA-активируемых токов к действию IP5051 и характеру вызываемой им блокады NMDA рецепторов исследованные нейроны коры головного мозга крыс были разделены на 2 группы.

  Соединение IP5051 в нейронах 1 группы (n=5) блокировало ответы NMDA рецепторов в низких концентрациях. Важной особенностью действия IP5051 в

этих нейронах явилось то, что более эффективно оно блокировало токи большей амплитуды. IC50 соединения IP5051 для блокады токов различной амплитуды были неодинаковы и тем меньше, чем больше были NMDA-активируемые токи. Для максимальных токов в наших экспериментах IC50  равнялась 0,4±0,15х10-6 М. Для самых маленьких токов IC50  равнялась 2,1±0,4х10-6 М (рис. 5).

Рис. 5. Блокада соединением IP5051 NMDA-вызванных токов в нейронах 1 группы коры головного мозга крыс.

Примечание: 1- контроль, 2-6 – концентрации IP5051– 0,5 мкM, 1,0 мкM, 2,0 мкM, 10,0 мкM и 30,0 мкM соответственно.

Соединение IP5051 в нейронах 2 группы (n=13) вызывало блокаду NMDA-активированных токов в гораздо более высоких концентрациях. Характер блокирующего действия в этих нейронах также существенно отличался от действия IP5051  в  нейронах  1  группы.  Величина блокирующего эффекта не зависела от амплитуды NMDA-активированных токов. IC50 соединения IP5051 в этой группе нейронов составляет примерно 2,3х10-5 М.

Изучение влияния производных алкилизотиомочевины

Действие веществ на АМРА рецепторы. Только два соединения данного класса веществ – IP9040 и IP9150 потенцировали токи АМРА рецепторов. Особенностями действия этих веществ на токи АМРА рецепторов являются небольшие величины потенцирующего  эффекта – максимум 170% от контроля – и обращение потенцирующего эффекта на противоположный при дальнейшем увеличении концентрации веществ (табл. 2).

Табл. 2. Влияние новых производных алкилизотиомочевины на каинат-вызванные токи в нейронах Пуркинье мозжечка крыс.

№п/п

Шифр

IP

10-9 М

10-8 М

3х10-8 М

10-7 М

5х10-7 М

10-6 М

10-5 М

3х10-5 М

1

2

3

4

5

6

7

8

9

IP9040

IP9130 IP9131 IP9132 IP9133 IP9134 IP9135 IP9142 IP9150

-

-

-

-

-

-

-

-

107±2

100

-

-

-

-

-

-

-

165±22

136±5

-

-

-

-

100

-

-

-

137.5±4 

102

105

100

100

107 

100

100

127±9

148±6

-

-

-

-

-

-

-

-

121±3 

105

110

100

100

105

100

100

100 ±10

57±7

83

92

98

100

80

100

100

90

38±9

-

-

-

-

-

-

-

85

Примечание: амплитуда контрольных токов взята за 100%. Вверху – концентрации веществ в молях. В колонках – амплитуды токов в % к контрольным значениям при действии соответствующей концентрации вещества (M±m). Амплитуда контрольных токов взята за 100%.

  Действие веществ на NMDA рецепторы. Установлено, что соединение IP9040 во всех исследованных нейронах коры головного мозга (n=7) одинаково блокирует NMDA-активируемые токи независимо от их амплитуды. IC50 для IP9040 составила 0,8±0,2х10-6 М. Соединение IP9150 аналогичным образом блокировало токи NMDA рецепторов. IC50  для IP9150 – 1,5±0,5х10-6 М (n=4).

  Изучение влияния производных N,N'-замещенных 3,7-диазабицикло

[3.3.1] нонанов на функциональное состояние АМРА  рецепторов

На основании компьютерного моделирования на кафедре органической химии МГУ были предсказаны и синтезированы новые производные, в качестве потенциаторов АМРА рецепторов, относящиеся к классу 3,7-диазабицикло[3.3.1]нонанов. Их структура представляет собой как бы сдвоенную молекулу АМРАкина BDP, что, по замыслу авторов, должно существенно усилить потенцирующие свойства соединений (Тихонова и др., 2004).

Действие обоих веществ на АМРА рецепторы имело куполообразную форму: низкие концентрации увеличивали токи, а большие наоборот - блокировали их (рис. 6). Оба соединения не влияли на NMDA-вызванные токи в нейронах коры головного мозга крыс в концентрациях 1х10-7 М – 3х10-5 М.

Рис. 6. Влияние производных N,N'-замещенных 3,7-диазабицикло[3.3.1] нонанов на каинат-вызванные токи в нейронах Пуркинье мозжечка крыс.

Примечание: 1 – XXX-1, 2 –  ХХХ-2. Амплитуда контрольных токов принята за 100%. По оси абсцисс – логарифм концентрации веществ в молях, по оси ординат - % амплитуды ответов к контролю, принятом за 100%.

       По своей  активности в потенцировании АМРА рецепторов соединение ХХХ-2 является “абсолютным рекордсменом”: концентрация 10-11 М является наименьшей из известных в настоящее время, в которой вещества - позитивные модуляторы АМРА рецепторов - способны вызывать потенциацию АМРА рецепторов. Как недавно установлено, процесс десенситизации предотвращается встраиванием двух молекул потенциатора АМРА рецепторов в межщелевое пространство между двумя S1S2 “петлями”, образующими димер АМРА рецептора (Jin et al., 2005). Молекулы соединений ХХХ-1 или ХХХ-2, представляя собой производные сдвоенных молекул АМРАкина BDP, по-видимому, способны более эффективно, чем одиночные молекулы потенциатора, встраиваться в это пространство, предотвращая поворот димера.

  Изучение влияния соединений серии ОСЛМ  (производных BDP) на

функциональное состояние АМРА рецепторов.

Два соединения из синтезированного ряда – ОСЛМ-4 и ОСЛМ-8 –  оказались активнее на 3 порядка исходного соединения BDP в потенциации токов АМРА рецепторов (рис. 7). Другие соединения  этого ряда не  показали

Рис. 7. Действие ОСЛМ-4 (1), ОСЛМ-8 (2) и BDP (3) на КК-вызванные токи в

нейронах Пуркинье мозжечка крыс.

Примечание: по оси абсцисс – логарифм концентрации веществ в молях, по оси ординат - % амплитуды ответов к контролю, принятом за 100%.

способности потенцировать КК-вызванные токи. Все исследованные соединения, кроме BDP, приобрели свойство при увеличении концентрации блокировать КК-вызванные токи.

Таким образом, среди новых производных дибензиламинов,  алкилизотиомочевины и N,N'-замещенных 3,7-диазабицикло[3.3.1]нонанов выявлены соединения, которые обладают свойствами позитивных модуляторов АМРА рецепторов. Ранее подобная активность для представителей данных химических классов показана не была. Изучение механизма действия новых соединений на АМРА рецепторы показало, что потенциация ответов АМРА рецепторов происходит аналогично действию ЦТ, т.е. за счет уменьшения их десенситизации.

Другой важнейшей особенностью некоторых представителей производных дибензиламинов и алкилизотиомочевины является их способность неконкурентно блокировать NMDA рецепторы наряду с потенциацией  АМРА рецепторов.

  Изучение процесса блокады NMDA рецепторов соединением IP5051 показало, что в разных нейронах оно блокирует рецепторы различными механизмами. Один из механизмов, по-видимому, заключается в блокаде NMDA рецепторов, содержащих NR2B субъединицы. Такое предположение можно сделать, сравнивая блокаду NMDA рецепторов в нейронах 1 группы с литературными данными, полученными при изучении действия ифенпродила на ответы NMDA рецепторов, содержащих NR2B субъединицы (Kew et al., 1996) (Ифенпродил – прототипический антагонист NR2B субъединицы NMDA рецепторов). Имеется практически полная аналогия в характере блокирующего действия IP5051 и ифенпродила (рис. 8). 

                       А                                                Б

Рис. 8. Сравнение блокирующего действия соединения IP5051 на токи NMDA рецепторов в нейронах 1 группы и ифенпродила на токи NR2B-содержащих NMDA рецепторов (из Kew et al., 1996).

Примечание:  – маленькие  токи, – большие токи. По оси абсцисс – логарифм концентрации IP5051 (А) и ифенпродила (Б), по оси ординат –

величина блокирующего действия соединений в %, полная блокада – 100%.

В нейронах 2 группы IP5051 связывается, по-видимому, только с участком связывания МК-801 (блокатор ионного канала NMDA рецептора с очень медленной скоростью диссоциации) в ионном канале NMDA рецептора, но в

гораздо более высоких концентрациях, чем в нейронах 1 группы. Вероятно, что и характер этого связывания сходен с характером блокирующего действия МК-801, о чем говорит длительное время отмывки МК-801 и IP5051 в больших концентрациях.

       Соединение IP9040 также блокирует NMDA рецепторы. Вероятно, IP9040 блокирует NMDA рецепторы только путем блокады ионного канала NMDA

рецептора, но характер этой блокады существенно отличается от блокады, вызываемой IP5051 в нейронах 2 группы. Сравнительный анализ блокирующего действия IP9040 и мемантина позволяет предположить, что оно осуществляется аналогично, по механизму быстрой диссоциации с рецептором, поскольку и мемантин и соединение IP9040 отмывались одинаково быстро, в течение 2-3-х минут.

Изучение фармакологической активности соединений-лидеров на моделях

  хронических нейродегенеративных заболеваний и в поведенческих тестах

Целью данной серии экспериментов было установить возможную связь между параметрами изменения ответов АМРА рецепторов в нейронах головного мозга при действии соединений и влиянием этих соединений на обучение и память экспериментальных животных. Для достижения этой цели определено влияние наиболее активных новых и модельных соединений на обучение и память как нормальных животных, так и животных с экспериментальной моделью БА.

Изучено влияние соединения IP5051 на обучение и память животных с

экспериментальной моделью БА в тесте УРАИ. В таблице 3 представлены результаты измерения количества правильных переходов во время обучения животных.

Табл. 3. Процент “правильных” переходов крыс в другую камеру во время подачи условного сигнала; последние 15 сигналов -  при действии соединения IP5051.

Группы

Контроль

AF64A

AF64A+ IP5051

1,0 мг/кг

AF64A+ IP5051

5,0 мг/кг

Процент правильных переходов

78 ± 5

р < 0,001

37 ± 6,5

67 ± 6

р < 0,05

85 ± 7

р < 0,001

  Примечание: достоверность рассчитывали по сравнению с группой животных

  с AF64A.

Через 24 часа крыс повторно помещали в установку и замеряли количество “правильных” переходов в другую камеру при подаче 25 сигналов. В расчет брали 5 последних  сигналов. Тем самым было определено влияние IP5051 на память животных (табл. 4).

Табл. 4. Процент “правильных” переходов крыс в другую камеру во время подачи условного сигнала – последние 5 сигналов -  при действии соединения IP5051 (влияние на память).

Группы

Контроль

AF64A

AF64A+ IP5051

1,0 мг/кг

AF64A+ IP5051

5,0 мг/кг

Процент правильных переходов

66 ± 8

Р < 0,05

28 ± 7

68 ± 7

р < 0,05

88 ± 6

р < 0,05

Примечание: достоверность рассчитывали по сравнению с группой животных с AF64A.

В результате исследования установлено, что IP5051 в дозах 1,0 и 5,0 мг/кг достоверно улучшало количество  “правильных” переходов как во время обучения, так и во время воспоминания у животных с экспериментальной

моделью БА.

Влияние новых и модельных веществ на обучение и память интактных

животных было изучено в тесте узнавания новой локализации объекта. При тестировании через 48 часов после тренировки контрольные животные  затрачивали на обследование объекта в известной и новой локализации  одинаковое количество времени, т.е. они воспринимали  объекты в обоих местах как новые. Животные, которым вводили IP5051 в дозах 0,05 и 0,1 мг/кг, затрачивали на обследование объекта в новой локализации достоверно больше времени, чем на обследование в старой, а результаты животных, получивших дозу 0,5 мг/кг (р=0,051), находятся на границе достоверности (рис. 9). Исследование соединения IP9268 показало, что только животные, получившие оединение в дозе 5,0 мг/кг, помнят расположение объектов (рис. 10).        Животные, получившие другие соединения: IP9150 в дозах 0,05 – 2,0 мг/кг; IP9040 в дозах 0,1 -1,0 мг/кг;  ХХХ-1 в дозе 0,1 мг/кг; ХХХ-2 в дозе 0,01 мг/кг; ОСЛМ-4 в дозе 0,1 мг/кг; BDP в дозах 1,0 и 2,0 мг/кг помнят расположение объектов.

Рис. 9. Влияние соединения IP5051 на память в тесте узнавания новой локализации известного объекта.

Примечание: ряд 1- контроль, ряд 2 - IP5051. Дозы IP5051 -  в мг/кг.

Проведенные исследования показали, что соединения, которые потенцируют токи АМРА рецепторов, улучшают память животных в

 

Рис. 10. Влияние соединения IP9268 на продолжительность обследования объекта в известной и новой локализации.

поведенческих экспериментах. Однако, не во всех случаях имелась прямая связь между величиной потенцирующего эффекта ответов АМРА рецепторов веществом и величинами доз, в которых это вещество оказывает когнитивно-стимулирующее действие. Хотя для некоторых соединений одного химического класса такая связь прослеживалась, в других случаях наблюдалось явное противоречие. Например, соединения ХХХ-1 и ХХХ-2 отличаются по своей активности в качестве потенциаторов АМРА рецепторов в 10 раз. В качестве стимуляторов памяти ХХХ-2 также активнее ХХХ-1 в 10 раз. Однако, для другой пары веществ наблюдается совсем иная картина: соединения IP5051 и IP9268 вызывают почти одинаковую потенциацию АМРА рецепторов (1050% и 770% соответственно при 3х10-5М), но в поведенческих экспериментах первое соединение было в 100 раз активнее, чем второе. В поисках ответа на вопрос за счет чего возникает такая большая разница в эффективных дозах этих веществ, обратим внимание на то, что IP5051 дополнительно блокирует NMDA рецепторы. Может ли блокада NMDA рецепторов вносить свой вклад в проявление когнитивно-стимулирующего действия вещества? Исследование механизма действия  димебона  –  лекарственного препарата,  который  обладает  высоким нейропротекторным и когнитивно-стимулирующим действием (Bachurin et al., 2001a; Doody et al., 2008) позволило  предложить ответ на этот вопрос.

Прогностическая значимость для клинических испытаний результатов

  электрофизиологических и фармакологических исследований новых

  соединений на примере препарата димебон

Изучение влияния димебона на функциональное состояние АМРА рецепторов. Установлено, что димебон вызывает позитивную модуляцию ответов АМРА рецепторов в нейронах Пуркинье. Димебон приводил к увеличению каинат-вызванных токов на 16%, начиная с концентрации 2х10-7 М. В концентрации 5х10-7 М димебон вызывал потенциацию в среднем на 52%. Увеличение концентрации препарата не увеличивало потенциацию КК-вызванных токов. В диапазоне концентраций димебона 1х10-6 - 2х10-5 М потенциация токов составляла в среднем 42%. Дальнейшее увеличение концентрации димебона приводило к уменьшению потенцирующего эффекта, и в концентрации 4х10-5 – 5х10-5 М потенциация токов была равна нулю или ответы были даже меньше, чем в контроле (до - 6%). Таким образом, потенциация каинат-вызванных токов димебоном имеет куполообразную форму (рис. 11).

Сравнение действия димебона с действием ЦТ показало, что в основе потенцирующего влияния димебона на АМРА рецепторы лежит его способность снижать десенситизацию этих рецепторов.

Изучение влияния димебона на функциональное состояние NMDA рецепторов. Установлено, что димебон оказывает блокирующее действие на токи, вызываемые аппликацией NMDA  в нейронах (n=33) коры головного мозга крыс. По характеру этой блокады мы разделили исследованные нейроны коры на 2 группы. В  нейронах 1-й  группы (n=9) димебон в низких концентрациях блокировал NMDA-активируемые токи: IC50=7,7±1,4х10-6 М (рис. 12). В нейронах 2-й группы (n=24) димебон блокировал NMDA-активируемые токи в гораздо более высоких концентрациях: IC50 = 7,3±2,1х10-5 М.

Рис. 11. Действие димебона (1) и циклотиазида (2) на КК-вызванные токи в нейронах Пуркинье.

Примечание: по оси абсцисс – логарифм концентрация веществ в Молях. По оси ординат – амплитуда ответов в % по отношению  к контролю. Амплитуда токов в контроле взята за 100%. 

Препарат сравнения мемантин также оказывал блокирующее действие на NMDA-активируемые токи (n=23), отличавшееся от действия димебона. В нейронах 2-й группы по нашей классификации мемантин эффективно блокировал токи: IC50 =1,4±0,4х10-6 М. В нейронах 1-й группы мемантин менее эффективен: IC50=1,5±0,32х10-5 М (рис. 12).

Таким образом, оба препарата блокируют NMDA рецепторы, но действуют, вероятно, на разные их субъединицы и/или на разные участки рецептора. Наши опыты подтверждают, что мемантин действует как блокатор открытого состояния ионного канала NMDA рецептора, действующий по механизму быстрой диссоциации с рецептором. Одной из вероятных мишеней действия димебона, в отличие от мемантина, является участок связывания ифенпродила, локализованный на NR2B-субъединице NMDA рецептора. Сравнительный анализ результатов компьютерного 3d моделирования, проведенного на кафедре органической химии МГУ им. М.В. Ломоносова,показал, что димебон может достаточно эффективно взаимодействовать с участком связывания ифенпродила на N-концевом домене NR2B субъединицы (чему соответствует блокада NMDA рецепторов в низких концентрациях в нейронах 1 группы), но гораздо менее

Рис. 12. Действие димебона (А) и мемантина (Б) на NMDA-вызванные токи в нейронах 1 группы.

Примечание: 1- контроль, 2 - при добавлении в физ.раствор 10 мкМ димебона (А) и  20 мкМ мемантина (Б), 3 - ответы после 3 минут отмывки. Калибровка: вертикальная- 200 рА, горизонтальная – 2 сек.

эффективно взаимодействовать с участком связывания МК-801 внутри ионного канала NMDA рецептора (Тихонова, 2005; Tihonova et al., 2002) (блокада NMDA рецепторов в высоких концентрациях в нейронах 2 группы).

Изучение влияния димебона  на память в поведенческих экспериментах. Тест УРАИ выполнен на животных с экспериментальной моделью БА. Животные, у которых нейротоксином AF64A были разрушены холинергические нейроны, получали димебон в дозе 1,0 мг/кг в течение 12 дней. В результате исследования установлено, что димебон существенно уменьшает латентное время перехода крыс в другую камеру, что свидетельствует о его позитивном влиянии

на обучение и память экспериментальных животных (рис. 13, рис. 14).

Также изучено влияние димебона на память мышей в тесте узнавания известного объекта в новой локализации (рис. 15). В данном тесте димебон достоверно улучшает память мышей в дозах 0,01 – 0,15 мг/кг.

 

Рис. 13. Влияние димебона в дозе 1,0 мг/кг на латентное время перехода крыс в другую камеру после подачи условного сигнала сразу после обучения.

 

Рис. 14. Влияние димебона в дозе 1,0 мг/кг на латентное время перехода крыс в другую камеру после подачи условного сигнала после через 24 часа после обучения (влияние на память).

Исследование влияния димебона на функциональное состояние животных в  условиях длительного хронического применения. Мыши получали димебон в дозе 1,5 мг/кг в сутки в течение 15 месяцев. Через несколько месяцев эксперимента стало понятно, что димебон не только не оказывает каких-либо токсических эффектов на стареющих животных, но наоборот, вызывает улучшение их состояния. Число волосяных фолликулов на единице

Рис. 15. Влияние различных доз димебона на продолжительность обследования объекта в известной и новой локализации. Ряд 1- известная локализация, Ряд 2- новая локализация.

площади кожного лоскута по данным морфологических измерений составляло в среднем в контрольной группе 2,19±1,47  и 3,54±1,67 (р<0,04) в экспериментальной группе. Количество животных с катарактой также было больше в контрольной группе - до 26% (р 0,03158, начиная с возраста 26 месяцев). Чисто внешне животные опытной группе выглядели намного сохраннее, активнее, чем в контрольной группе.

Двигательная активность молодых животных  в возрасте 4-5 месяцев по числу пересеченных квадратов в тесте “открытое поле” составляла 59,5±6,16; старых контрольных животных – 9,17±4,27, старых животных, хронически  получающих димебон – 18,83±4,34 (р<0,05). Т.е. димебон существенно сохранял

двигательную активность старых животных.

Средние массы всех органов у животных экспериментальной группы были ближе к массам органов молодых животных. Они имели меньшие отклонения от  среднего значения, что также характерно для молодых животных и, по-видимому, связано с меньшим количеством органных патологий, значительно изменяющих массу того или иного органа.

Димебон увеличивал среднюю и максимальную продолжительность жизни животных. Наиболее показательно это проявилось в конце эксперимента: если сравнить количество живых мышей в каждой возрастной группе: 900, 950 и 1000 дней, то мы увидим, что если в группе 900 дней количество доживших животных опытной группы превышало таковых в контрольной только на 28% (р0,05), то в группе 950 дней уже в 2,5 раза (р<0,002), а в группе 1000 дней – в 4 раза (р<0,0001).

При микроскопическом изучении взятых в исследование органов и тканей животных обеих групп существенных изменений в их гистоструктуре не выявлено, за исключением миокарда и головного  мозга. В миокарде мышей контрольной группы определяются четкие изменения со стороны ядер кардиомиоцитов по типу кариорексиса и кариолизиса. Кроме того, определяются  очаги фрагментации  волокон. Вышеописанные изменения со стороны миокарда мышей опытной группы почти не наблюдаются. Микроскопическая характеристика вещества больших полушарий и мозжечка головного мозга мышей обеих групп соответствует нормальному строению. Однако у большинства животных контрольной группы, по сравнению с опытной, относящихся к одной возрастной группе, выявлен выраженный перицеллюлярный отек и разрежение вещества мозга.

Таким образом, проведенный эксперимент на старых животных – мышах-самках линии С57Bl/6 - показал, что димебон при его ежедневном пожизненном применении в течение 15 месяцев оказывает выраженное нейропротекторное и цитопротекторное действие. Димебон ни по одному показателю не проявил побочных токсических эффектов, что предполагает его безопасное использования на людях в течение продолжительного времени (Bachurin et al., 2007). На основании полученных результатов была подана заявка в Росздравнадзор для  получения разрешения медицинского применения димебона по новому назначению в качестве лекарственного средства для лечения болезни Альцгеймера и стимулятора когнитивных функций.

На основании разрешения Росздравнадзора в начале 2006 года начались клинические испытания димебона на 2-ой фазе в 10 центрах в России по инициативе американской компании Medivation. Испытания проводились по системе двойного слепого контроля. Терапевтическая эффективность оценивалась по шкалам  ADAS-cog и  CIBIC-plus по пяти параметрам, наиболее часто измеряемым при оценке больных БА.  По всем показателям были получены высокие достоверные отличия  от пациентов,  получающих плацебо (р<0,0001) статье (Doody et al., 2007a, б; Doody et al., 2008).

Полученные результаты свидетельствуют о высоких терапевтических, нейропротекторных и когнитивно-стимулирующих свойствах димебона, что позволяет использовать его в качестве эталона при отборе новых перспективных соединений. Сравнение параметров влияния на ответы АМРА и NMDA рецепторов и когнитивно-стимулирующих свойств димебона и новых соединений-лидеров позволит нам понять связь между этими свойствами веществ и оценить их прогностическое значение при поиске новых потенциальных лекарственных средств.

Табл. 5. Соотношение концентраций и доз веществ, в которых они потенцируют АМРА рецепторы, блокируют NMDA рецепторы в электрофизиологических экспериментах и улучшают память животных в тесте узнавания новой локализации объекта (УНЛО).

Соединение: название или шифр

Потенциация АМРА рецепторов (макс % к контролю)

Блокада NMDA рецепторов, IC50

Эффективные дозы в тесте УНЛО, мг/кг

Димебон

2х10-7 – 2х10-5 М

  (170%)

1) 7,7х10-6 М

2) 7,3х10-5 М

  0,01- 0,15

IP5051

5х10-7 – 5х10-5 М

  (1050%)

1) 0,4х10-6 М 

2) 2,3х10-5 М

0,05 – 0,5*

IP9268

1х10-6–3х10-5 М

(770%)

  Не действует

5,0

IP9150

1х10-9 –5х10-7 М

  (165%)

  1,5х10-6  М

  0,05 – 2,0

IP9040

3х10-8–10-6 М

  (148%)

  8,0х10-7  М

0,1 – 1,0 

Мемантин

Не действует

  1,4х10-6 М

  2,0 – 2,5

Примечание- доза 0,5 мг/кг находится на границе достоверности (р=0,51).

Четыре из представленных в табл. 5 соединений потенцируют АМРА рецепторы и одновременно блокируют NMDA рецепторы: димебон, IP5051, IP9150 и IP9040; одно соединение, IP9268, только потенцирует АМРА рецепторы, и не действуют на NMDA рецепторы. И препарат сравнения - мемантин, который только блокирует NMDA рецепторы. Все 4 вещества, которые потенцируют АМРА рецепторы и одновременно блокируют NMDA рецепторы, имеют, в отличие от “чистых” потенциаторов АМРА рецепторов, более низкие действующие дозы, в которых они улучшают память животных,  и более широкий диапазон эффективных доз.

Димебон блокирует, как было сказано выше, NR2B содержащие NMDA рецепторы. Таким же образом действует и соединение IP5051. Оба вещества улучшают память, начиная с низких доз, и имеют широкий диапазон эффективных доз. Вероятно, способность этих веществ блокировать NR2B содержащие NMDA рецепторы вносит важный вклад в проявление ими когнитивно-стимулирующих свойств, поскольку недавно было показано, что избирательные антагонисты NR2B содержащих NMDA рецепторов улучшают память животных (Higgins et al., 2005).

Известно, что блокада ионного канала NMDA рецептора веществом приводит к серьезным побочным поведенческим эффектам и ухудшает память животных, если осуществляется аналогично действию МК-801 (Filliat, Blanchet, 1995; Noda et al., 2001). Однако эта блокада может не иметь побочных эффектов, и даже наоборот, существенно улучшать память, если она осуществляется по механизму действия препарата мемантин (Parsons et al., 2007). Мемантин связывается с участком внутри ионного канала NMDA рецептора, но в отличие от МК-801, легко покидает его при деполяризации, если ионный канал открыт (Parsons et al., 1993; Frankiewicz et al., 1996). Приведенный выше анализ блокирующего действия соединения IP9040 показал, что оно блокирует NMDA рецепторы подобно мемантину, результатом чего может быть усиление его когнитивно-стимулирующих свойств.

Исходя из полученных результатов, можно заключить, что сочетание у одного вещества свойств потенциатора АМРА рецепторов и блокатора NMDA рецепторов по определенным механизмам является крайне важным фактором для проявления веществом высоких когнитивно-стимулирующих свойств при нейродегенеративных заболеваниях.

                               ЗАКЛЮЧЕНИЕ

       Таким образом, по результатам нашего исследования установлены оптимальные критерии модуляции глутаматных АМРА и NMDA рецепторов ЦНС для веществ, являющихся потенциальными препаратами для лечения нарушений когнитивных функций при нейродегенеративных заболеваниях. Изучение влияния на АМРА и NMDA рецепторы эндогенных пептидов: CLIP и соматостатина, играющих важную роль в механизмах памяти, показало, что они потенцируют токи АМРА и блокируют токи NMDA рецепторов. В результате изучения механизма действия на АМРА и NMDA рецепторы димебона установлено, что он потенцирует токи АМРА и блокируют токи NMDA рецепторов. Параметры его влияния на эти рецепторы существенно совпадают с параметрами влияния эндогенных стимуляторов памяти CLIP и соматостатина. Изучение действия новых веществ – производных дибензиламинов, алкилизотиомочевин, N,N'-замещенных 3,7-диазабицикло[3.3.1]нонанов,  пирролидинов (аналогов АМРАкина BDP), модельных соединений на АМРА и NMDA рецепторы, а также их влияния на память в различных поведенческих тестах показало, что наиболее эффективно влияют на память те соединения, которые способны одновременно потенцировать АМРА рецепторы и блокировать NMDA рецепторы. Важнейшим элементом является способность вещества блокировать NMDA рецепторы по одному из двух возможных механизмов: неконкурентная блокада ионного канала подобно действию мемантина по механизму быстрой диссоциации с рецептором, или блокада NR2B субъединиц содержащих NMDA рецепторов.

       В результате изучения действия веществ на АМРА и NMDA рецепторы на клеточном уровне были отобраны соединения- лидеры: IP5051, IP9040,7 IP9150 и ХХХ-2 (рис. 16). Все эти соединения (кроме ХХХ-2) потенцируют АМРА и блокируют NMDA рецепторы. В поведенческих экспериментах эти соединения оказывают наибольшее когнитивно-стимулирующее действие.

 

IP5051 IP9040 IP9150

 

XXX-2  димебон  Мемантин

Рис. 16. Строение соединений-лидеров и препаратов сравнения.

Принципы отбора наиболее перспективных соединений в ряду лигандов глутаматных рецепторов представлены на схеме на рисунке 17. Согласно этой схеме эффективность соединений «двойного» действия в улучшении когнитивных функций особенно при нейродегенеративных заболеваниях оказывается существенно выше, чем действие мемантина (другого антагониста NMDA рецепторов) или просто «чистого» потенциатора АМРА рецепторов.

Установлено соответствие механизма действия на АМРА- и NMDA рецепторы новых соединений-лидеров действию наиболее эффективного препарата для лечения БА димебона, и их общее соответствие действию эндогенных стимуляторов памяти CLIP и соматостатина.

Рис. 17. Соединения с «двойным» механизмом действия на глутаматные рецепторы в условиях БА или другого снижения когнитивных функций при увеличении синаптического “шума” и снижении относительной величины  “полезного сигнала”.

Примечание: 1 – блокада “шума” мемантином, 2 – потенциация ответа “чистым” потенциатором АМРА рецепторов (+ потенциация “шума”), 3 – влияние IP9040, IP5051 или димебона – потенциация ответа АМРАP + блокада “шума” NMDAР. Пре –  пресинаптический нейрон, Пост – постсинаптический нейрон. Глу – медиатор глутамат. АМРАР и NMDAP – соответствующие рецепторы.

Таким образом, система поиска препаратов для коррекции когнитивных нарушений при нейродегенеративных заболеваниях среди лигандов глутаматных рецепторов предполагает наличие у вещества способности потенцировать АМРА рецепторы и одновременно блокировать NMDA рецепторы по одному из двух механизмов: блокада ионного канала по механизму быстрой диссоциации с рецептором или блокада NR2B субъединицы, действуя на сайт связывания ифенпродила. Эффективность данного подхода подтверждена в поведенческих тестах и клинических испытаниях, и имеет высокую прогностическую ценность.

Выводы

1. Электрофизиологическим методом patch-clamp показано существование в коре и гиппокампе головного мозга млекопитающих четырех типов нейронов, которые содержат различные NMDA рецепторы, отличающихся по совокупности ответов на NMDA, хинолинат, глицин, АР5 и АР7.

2. Определены параметры и характер ответов АМРА и NMDA рецепторов на воздействие отдельных эндогенных пептидов, которые подтверждают участие некоторых из них (кортикотропин-подобный промежуточный лобный пептид, соматостатин) в формировании памяти и механизмах эндогенной нейропротекции.

3. Из изученных новых представителей двух классов химических соединений – ациклических производных изотиомочевины и N,N′-замещенных диазабициклононанов – отобраны наиболее активные соединения (IP5051, IP9040, IP9150 и ХХХ-2), обладающие свойствами эффективных позитивных модуляторов АМРА рецепторов.

4.  Установлено, что исследованные соединения, потенцирующие АМРА рецепторы,  улучшают обучение и память как интактных животных, так и животных с экспериментальной моделью болезни Альцгеймера в поведенческих тестах.

5. Установлено, что неконкурентная блокада NMDA рецепторов, осуществляемая или за счет блокады ионного канала по механизму быстрой диссоциации с рецептором, или за счет блокады NR2B субъединицы,  вносит существенный вклад в характер проявления соединением его когнитивно-стимулирующей активности и широты терапевтического действия.

6. Установлен механизм действия отечественного препарата димебон на АМРА и NMDA рецепторы, что явилось одним из оснований для  его медицинского применения по новому назначению в качестве лекарственного средства для лечения нейродегенеративных заболеваний (в частности, болезни Альцгеймера) и

стимулятора когнитивных функций.

7. Оптимальными критериями поиска препаратов для коррекции когнитивных нарушений при нейродегенеративных заболеваниях среди лигандов глутаматных рецепторов, являются их способность потенцировать АМРА рецепторы и одновременно блокировать NMDA рецепторы, что подтверждено в поведенческих тестах и клинических испытаниях, и имеет высокую прогностическую ценность.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Григорьев В.В. Гипервозбуждение, вызываемое возбуждающими аминокислотами и его фармакологическая коррекция [Текст] / В.В. Григорьев, В.А. Неманова, В.А. Рагулин // Глутаматные рецепторы. Тезисы I Всесоюзного совещания. Ленинград. – 1987. – С. 37.

2. Григорьев В.В. Исследование противосудорожной активности антагонистов глутаматных рецепторов в ряду фосфорсодержащих аминокарбоновых кислот [Текст] / В.В. Григорьев, B.B. Рагулин, B.A. Неманова, E.H. Цветков // Хим.-фарм.  Ж. – 1988. – № 3. – С. 275-277.

3. Grigoriev V.V. Specific and functional differences of  NMDA receptors [Текст] / V.V. Grigoriev, V.A. Nemanova, S.O. Bachurin // Proc. 7-th Conference of European  Neurochemichal Society.  Sweden, Stockholm. – 1988. – P. 143.

4. Григорьев В.В. Гиперактивность и судороги, вызываемые возбуждающими аминокислотами, и их фармакологическая коррекция [Текст] / В.В. Григорьев, В.А. Неманова; редкол. "Бюлл. Экспер. Биол. Мед". – М., – 1988. – 5 с. – Деп. В ВИНИТИ № 3469-В88.

5. Григорьев В.В. Фармакологические и функциональные различия NMDA-рецепторов у мышей и крыс [Текст] / В.В. Григорьев, В.В. Рагулин, Е.Н. Цветков // Синтез, фармакол. и клин. аспекты нов. психотр. и серд. сосуд. вещ-в. Тезисы межреспубликанской конференции., Волгоград., – 1989. – C. 73.

6. Григорьев В.В. Фосфорсодержащие аминокислоты – новый класс  противосудорожных веществ [Текст] / В.В. Григорьев, В.А. Неманова, В.В.  Рагулин, Е.Н. Цветков // Материалы XIY Менделеевского съезда. Москва.– 1989. – C. 175.

7. Григорьев В.В. Видовые и функциональные различия NMDA рецепторов

[Текст] / В.В. Григорьев, В.А. Неманова // Бюлл. экспер. Биол. Мед. – 1989. –  № 9. – С. 299-302.

8. Grigoriev V.V. The action of glycine and competitive antagonists on NMDA-induced currents in the rat cortical neurons [Текст] / V.V. Grigoriev, V.V. Ragulin, S.O. Bachurin // Proc. of 13rd International Congress of International Society for Neurochemistry, Australia, Sydney. – 1991а. – P. 218.

9. Grigoriev V.V. Different influence of competitive antagonists (AP5 and AP7) on NMDA  responses in rat and mice hippocampal neurons [Текст] / V.V. Grigoriev, V.A. Nemanova, V.V. Ragulin, S.O. Bachurin // Abstacts of 3rd International Congress of Comparative Physiology and Biochemistry, Tokyo. – 1991b. – P. 95.

10. Григорьев В.В. Видовые различия в действии конкурентных антагонистов NMDA-рецепторов в нейронах гиппокампа мышей и крыс [Текст] / В.В. Григорьев, В.А. Неманова, В.В. Рагулин // Докл.  РАН. – 1992.– Т. 326, № 4.– С. 742-745.

   11. Григорьев В.В. Действие NMDA и хинолиновой кислоты на нейроны коры головного мозга крыс. [Текст] / В.В. Григорьев // Докл. РАН. – 1993. – Т. 330, № 5. – С. 646-648.

12. Григорьев В.В. Общие рецепторы аспартата и хинолиновой кислоты,  отличные от NMDA-рецепторов, на некоторых нейронах коры головного мозга крыс. [Текст] / В.В. Григорьев // Нейрофизиология/Neurophysiology. – 1993. – Т. 1, № 4. – С. 264-266.

13. Bachurin S.O. Directed selection of novel neuroprotectors for Alzheimer’s desease treatment [Текст] / Bachurin S.O., Afanas’ev A.Z., Grigoriev V.V., Lermontova N.N., Lukoyanov N.V., Tkachenko S.E., Zefirov N.S. // J. Neurochem. –  1997. – V. 69, Suppl. P. 48B.

14. Bukatina E.E. Medicine for treatment of  Alzheimer’s desease [Текст] / E.E. Bukatina, A.Z. Afanasiev, S.O. Bachurin, V.V. Grigoriev, I.V. Grigorieva, S.E. Tkachenko, M.A. Yurovskaya, N. S. Zefirov // Proc. of the 4-th Congress of European Society for Clinical  Neuropharmacology, Eilat, Israel. –  1997. – P. 66.

15. Bachurin, S.O. Cognition enhancing  properties of  antihistamine drug Dimebon. [Текст] / S.O. Bachurin, E.E. Bukatina, V.V. Grigor’ev, I.V. Grigor’eva, Yu.J. Ivanov,  N.V. Lukoyanov, S.E. Tkachenko, N.S.  Zefirov // Neurobiology of Aging. – 1998. – Vol. 19, № 4S. – P. 180.

16.  Grigoriev V.V. Isothiouronium derivative potentiates kainate - induced currents in Purkinje neurons of rat cerebellum. [Текст] / V.V. Grigoriev, O.A. Drany, A. N. Proshin, S.E. Tkachenko, S.O. Bachurin // Proc. 9-th International Congress of the Czech and Slovak Neurochemichal Society, Martin, Slovakia. – 1998. – P. 46.

17. Григорьев В.В. Потенциация АМРА/Каинатных рецепторов как возможный механизм усиления когнитивных функций и памяти у лабораторных животных на модели хронической частичной депривации холинэргической системы ЦНС. [Текст] / В.В. Григорьев, О.А. Драный, С.О. Бачурин // Материалы 2-й Российской  конференции «Болезнь Альцгеймера и старение: от нейробиологии к терапии», 18-20 Октября 1999 г., - М., 1999. – C. 141-142.

18. Bachurin S.O. Isothiouronium derivative potentiates Ampa/kainate - induced currents in rat cerebellar Purkinje neurons [Текст] / S.O. Bachurin, V.V. Grigoriev, O.A. Drany, A. N. Proshin, S.E. Tkachenko // J. Neurochem. – 1999. – Vol. 73, Suppl. S143D.

19. Bachurin S. Antihistamine agent Dimebon as novel neuroprotector and cognition enhancer [Текст] / S. Bachurin, E. Bukatina, N. Lermontova, S. Tkachenko, A. Afanasiev, V. Grigoriev, I. Grigorieva, Yu. Ivanov, S. Sablin, N. Zefirov // Abst. 5th Int. Conference on  Neuroprotective Agents, Sept. 17-21, 2000, Lake Tahoe, Calofornia, USA. – 2000. – P. 249

20. Bachurin S. Neuroprotective and cognition enhancing properties of MK-801 flexible analogs: structure-activity relationships [Текст] / S. Bachurin, S. Tkachenko, I. Baskin, N. Lermontova, L. Petrova, A. Ustinov, A. Proshin, V. Grigoriev, N. Lukoyanov, V. Palyulin, N. Zefirov // Abst. 5th Int. Conference on Neuroprotective Agents, Sept. 17-21, 2000, Lake Tahoe, Calofornia, USA. – 2000. – P. 251

21. Bachurin S. Neuroprotective and cognition enhancing properties of MK-801 flexible analogs. Structure-activity relationships [Текст] / S. Bachurin, S. Tkachenko, I. Baskin, N. Lermontova, T. Mukhina, L. Petrova, A. Ustinov, A. Proshin, V. Grigoriev, N. Lukoyanov, V. Palyulin, N. Zefirov // Ann. N.Y Acad. Sci. – 2001. –  Vol. 939. – P. 219-235.

22. Bachurin S. Antihistamine agent Dimebon as novel neuroprotector and cognition enhancer [Текст] / S. Bachurin, E. Bukatina, N. Lermontova, S. Tkachenko, A. Afanasiev, V. Grigoriev, I. Grigorieva, Yu. Ivanov, S. Sablin, N. Zefirov // Ann. N.Y Acad. Sci. – 2001. – Vol. 939. – P. 425-435.

23. Григорьев В.В. Сравнительное исследование механизма действия препаратов Димебона и Мемантина на АМРА-  и NMDA-подтипы глутаматных рецепторов нейронов головного мозга крыс [Текст] / В.В. Григорьев, О.А. Драный, Е.А. Кустова, С.О. Бачурин // Болезнь Альцгеймера и старение. Материалы III Российской конф., посвященной 100-летию со дня рождения проф. Э.Я.Штернберга., 23-24 апреля 2003 г., Москва. – 2003. – С. 178-182.

24. Григорьев В.В. Сравнительное исследование механизма действия препаратов Димебона и Мемантина на АМРА- и NMDA-подтипы глутаматных рецепторов нейронов головного мозга крыс [Текст] / В.В. Григорьев, О.А. Драный, С.О. Бачурин // Бюлл. Экспер. Биол. Мед. – 2003. – Т. 136, № 11. – С. 535-538.

25. Зефиров Н.С. Направленный поиск и создание новых лекарственных средств для лечения болезни Альцгеймера на основе специфических модуляторов активности глутаматных рецепторов ЦНС [Текст] / Н.С. Зефиров, В.В. Григорьев, В.А. Палюлин, И.Г. Тихонова, И.И. Баскин, С.О. Бачурин // Тез. Конф. «Фундаментальные науки-медицине». Росс. Акад. Наук, Москва. –  2003. – C. 156-158.

26. Bachurin S. Focused Design, Synthesis and Study of  Novel Neuroprotectors and Cognition-Enhancers in Series of Glutamate Receptors Ligands [Текст] /S. Bachurin, I. Baskin, V. Grigoriev, V. Palyulin, A. Proshin, I. Tikhonova, S. Tkachenko, G. Vankin, N. Zefirov // Abstr. XVII-th Int. Symposium on Medicinal Chemistry,  2004, Copenhagen, Denmark & Malmo, Sweeden, Drugs of the Future. – 2004. – V.29, Suppl. A. – Р. 296.

27. Grigoriev V.V. Effect of Delta Sleep Inducing Peptide on NMDA and GABA

Evoked Ion Currents in Cortical, Cerebellar and Hippocampal Neurons [Текст] /  V.V. Grigoriev, A.E. Redkozubov, E.A. Kustova, T.A. Ivanova, S.O. Bachurin // Abstr. Conference en Neurobiologie Ladislav Tauc. The World of Synapse: Molecular Basis, Pathology and Drug Discovery. 2004. Gif-sur-Yvette, France. P. 48.

28. Grigoriev V.V. Mechanism of action of new cognition-enhancing agent IP5051 on glutamate  receptors [Текст] / V.V. Grigoriev, S.O. Bachurin, A.N. Proshin, V.A. Palulin, N.S. Zefirov // 7th International Conference “Alzheimer’s and Parkinson’s Diseases”, 2005, Sorento, Italy, – 2005. – Р. 95.

29. Бачурин С.О. Роль глутаматных рецепторов в развитии и лечении болезни Альцгеймера [Текст] / С.О. Бачурин, В.В. Григорьев, Т.А. Иванова, Е.А. Кустова, А.Н. Прошин // Симпозиум «Современное состояние исследований, диагностики и терапии нейродегенеративных заболеваний (болезни Альцгеймера, Паркинсона и др.) 17-18 ноября 2005г, Москва.– 2005.– C. 99-104.

30. Петрова Л.Н. Влияние интерлейкина -1 на NMDA-индуцированный захват 45Са2+ в синаптосомы коры мозга крыс [Текст] / Л.Н. Петрова, В.В. Григорьев, С.О. Бачурин // Бюлл. Экспер. Биол. Мед. – 2005. – Т. 140, № 12. – С. 645-646.

31. Shevtsova E.P. Dimebon as mitoprotective and antiaging drug [Текст] / E.P. Shevtsova, V.V. Grigoriev, E.G. Kireeva, I.V. Koroleva, S.O. Bachurin //  Biochimica et Biophysia Acta. – 2006. – V.14. – P. 454.

32. Григорьев В.В. Действие дельта-сон-вызывающего пептида (DSIP) на пре- и  постсинаптические глутаматные и постсинаптические ГАМК рецепторы в нейронах коры, гиппокампа и мозжечка головного мозга крыс [Текст] / В.В. Григорьев, Т.А. Иванова, Е.А. Кустова, Л.Н. Петрова, Т.П. Серкова, С.О. Бачурин // Бюлл. Экспер. Биол. Мед. – 2006. –  Т. 142, № 8. – С. 149-151.

33. Серков И.В. Действие производных докозогексаеновой кислоты на АМРА рецепторы в нейронах Пуркинье [Текст] / И.В. Серков, В.В. Григорьев, Т.А. Иванова, Н.М. Грецкая, В.В. Безуглов, С.О. Бачурин // Докл. РАН. – 2006. – Т. 411, № 3. – С. 1-2.

34. Гарибова Т.Л. Эффект нооглютила на поведение и память мышей линии  SAM (Senescence-аccelerated mouse) с генетически детерминированным ускоренным старением [Текст] / Т.Л. Гарибова, Т.А. Воронина, С.А. Литвинова, В.В. Григорьев, С.О. Бачурин // Экспер. Клинич. Фармак. – 2007. – Т. 70, № 4. – С. 3-6.

35. Bachurin S. Anti-aging properties of dimebon. Relation to mitochondrial permeability inhibition [Текст] / S. Bachurin, V. Grigoriev, E. Shevtsova, I. Koroleva, L. Dubova, E. Kireeva // Experimental Gerontology. – 2007. – Vol. 42, N 1-2. – P. 142.

36. Гарибова Т.Л. Изучение влияния нооглютила на поведение и память мышей линии  SAM(Senescence-аccelerated мouse) с генетически детерминированным ускоренным  старением [Текст] / Т.Л. Гарибова, Т.А. Воронина, С.А. Литвинова, В.В. Григорьев, С.О. Бачурин // Тезисы III Съезда фармакологов, 23-27 сентября 2007 г., С-Петербург. – С-Пб., 2007. – Т. 1. – № 1654.

37. Безноско Б.К. Влияние позитивных модуляторов АМРА рецепторов на обучение и память экспериментальных животных [Текст] / Б.К. Безноско, В.В. Григорьев, Т.А. Иванова, И.В. Королева, М.И. Лавров, А.Н. Прошин, С.О. Бачурин // Тезисы III Съезда фармакологов, 23-27 сентября 2007 г., С-Петербург. – С-Пб., 2007. – Т. 1. – № 1654.

38. Григорьев В.В. Действие производных арахидоновой и докозогексаеновой кислот на АМРА рецепторы в нейронах Пуркинье [Текст] / В.В. Григорьев, И.В. Серков, Т.А. Иванова, Н.М. Грецкая, В.В. Безуглов, С.О. Бачурин // Тезисы III Съезда фармакологов, 23-27 сентября 2007 г., С-Петербург. – С-Пб., 2007. – Т. 1. – № 1654.

39. Григорьев В.В. Действие мурамиловых дипептидов на постсинаптические ГАМК-, NMDA- и AMPA-рецепторы и пресинаптические NMDA–рецепторы головного мозга крыс [Текст] / В.В. Григорьев, Л.Н. Петрова, А.В. Габрельян, Т.А. Иванова // Бюлл. экспер. биол. мед. – 2008. – № 9. – С. 247-249.

40. Григорьев В.В. Действие кортикотропин-подобного промежуточного лобного пептида на пре- и постсинаптические глутаматные и постсинаптические ГАМК-рецепторы в нейронах головного мозга крыс [Текст] / В.В. Григорьев, Л.Н. Петрова, Т.А. Иванова, А.В. Габрельян, Т.П. Серкова // Тез. Конф. Органическая химия для медицины, Черноголовка. – 2008. – С. 61.

ПАТЕНТЫ НА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. А. с. Способ получения -галогеналкилфосфонатов / В.В. Рагулин, В.В. Григорьев, Е.Н. Цветков (СССР). –  № 1410489 от 15.03.1988.

2. Патент РФ № 2106864 от 20.03.1998. Средство для лечения болезни Альцгеймера / Н.С. Зефиров, А.З. Афанасьев, С.В. Афанасьева, С.О. Бачурин, Е.Е. Букатина, С.Е. Ткаченко, В.В. Григорьев, И.В. Григорьева, В.П. Четвериков, М.А. Юровская.

3. Патент РФ № 2140417 от 1999. Производные гидрированных  пиридо[4,3-b]индолов, способы их получения / Н.С. Зефиров, А.З. Афанасьев, С.В. Афанасьева, С.О. Бачурин, С.Е. Ткаченко, В.В. Григорьев, М.А. Юровская.

4. US Patent 6,187,785 B1; Agent for Treating Neurodegenerative Disorders. 13.02. 2001 / N.S. Zefirov, A.Z Afanas'ev, S.V. Afanas'eva, S.O. Bachurin, E.E. Bukatina, I.V. Grigor'eva, S.E. Tkachenko, V.V. Grigor'ev, M.A. Yurovskaya, V.P. Chetverikov.

5. European Patent № 0 876 818 B1 (Pub.18.12.2002, Bull.2002/51). Agent for Treating Neuro-Degenerative Disorders. N.S. Zefirov, A.Z. Afanas'ev, S.V. Afanas'eva, S.O. Bachurin, S.E. Tkachenko, V.V. Grigor'ev, M.A. Yurovskaya, V.P. Chetverikov, E.E. Bukatina, I.V. Grigor'eva.

6. Патент РФ № 2252936 от 27.05.2005. S-замещенные  N-1-[(гетеро)арил]алкил-N’-[(гетеро)арил] алкилизотиомочевины, способ их получения, фармацевтическая композиция, способ изучения глутаматэргической системы, способы лечения (варианты) / С.Е. Ткаченко, А.Н. Прошин, М.Э. Дмитриев, Н.Н. Лермонтова, В.В. Григорьев, С.О. Бачурин, Н.С. Зефиров.

7. Патент РФ № 2333211 от 10.09.2008. N,N'-замещенные 3,7-диазабицикло[3.3.1]нонаны, обладающие фармакологической активностью,  фармацевтические композиции на их основе и способ их применения / С.О. Бачурин, В.В. Григорьев, Н.С. Зефиров, М.И. Лавров, В.Л. Лаптева, В.А. Палюлин.

8. Патент РФ № 2334514 от  27.09.2008. Средство для улучшения когнитивных функций и памяти на основе гидрированных пиридо(4,3-b)индолов (варианты), фармакологическое средство на его основе и способ его применения / С.О. Бачурин, С.И. Гаврилова, В.В. Григорьев, Б.К. Безноско, Н.С. Зефиров.

Список сокращений

АК – арахидоновая кислота

АКТГ – адренокортикотропный гормон

AMPA –  -амино-3-гидрокси-5-метил-4-изоксазолпропионовая кислота

AP5 – 2-амино-5-фосфонопентановая кислота

AP7 – 2-амино-7-фосфоногептановая кислота

БА – болезнь Альцгеймера

ДГК– докозогексаеновая кислота

DSIP – дельта-сон-вызывающий пептид

IL-1 – цитокин полипептид интерлейкин-1

КК – каиновая кислота

MDP – мурамиловые дипептиды

MCI – mild cognitive impairment (мягкое когнитивное снижение)

mРНК –  матричная РНК - рибонуклеиновая кислота

NMDA – N-метил-D-аспартат

NR – субъединица NMDA рецептора

CLIP – кортикотропин-подобный промежуточный лобный пептид

CCK-4 – холецистокинин

УНЛО – тест узнавания объекта в новой локализации

УРАИ – условный рефлекс активного избегания

ЦТ – циклотиазид




© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.