WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

 

На правах рукописи

Казаченко Александр Викторович

ПРОТЕКТОРНАЯ И РЕГЕНЕРАЦИОННАЯ ТЕРАПИЯ ПРИ ОСТРОМ И ХРОНИЧЕСКОМ ПОВРЕЖДЕНИИ ПОЧКИ

14.00.40 – урология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора медицинских наук

МОСКВА

2009

Работа выполнена в ФГУ НИИ урологии Росмедтехнологий и в ФГУ НЦ  акушерства,  гинекологии  и  перинатологии  Росмедтехнологий  им.  М.В.Кулакова

Научные консультанты

доктор  медицинских наук, профессор

Дзеранов Николай Константинович

академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор Сухих Геннадий Тихонович

Официальные оппоненты

доктор медицинских наук, профессор

Винаров Андрей Зиновьевич

кафедра урологии Московской Медицинской Академии им. И.М.Сеченова

доктор медицинских наук, профессор

Зайцев Андрей Владимирович

кафедра урологии Московского государственного медико-стоматологического университета

доктор медицинских наук, профессор

академик Академии медико-технических наук РФ

Онищенко Нина Андреевна

заведующая лабораторией биотехнологий стволовых клеток ФНЦ Трансплантологии и искусственных органов имени академика В.И. Шумакова

Ведущая организация

ГОУ ДПО Российская медицинская академия последипломного образования Росздрава

Защита состоится « » _______________ 2009 г. в ____ часов на заседании диссертационного совета Д. 208.056.01 при ФГУ НИИ урологии Росмедтехнологий, 105425, Москва. 3-я Парковая, 51.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ НИИ урологии.

Автореферат разослан  «  » ___________ 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета 208.056.01, доктор медицинских наук

Т.С.Перепанова

Актуальность

Острое или хроническое нарушение функции почек вне зависимости от повреждающего фактора является тяжелым, нередко встречающимся состоянием, которое помимо инвалидизации, в ряде случаев создает и реальную угрозу жизни больного. В урологической практике нарушение функции почек встречается у пациентов после различных операций сопровождающихся ишемией органа, особенно при наличии исходных признаков почечной недостаточности, а также после операции на единственной почке. В первую очередь это можно связать с повреждением функционально активных паренхиматозных клеток органа в результате нарушения клеточного метаболизма и повреждения внутриклеточных мембранных структур в период ишемии и в раннем постишемическом периоде [Биленко М.В., 1989; Кирпатовский В.И. и соавт., 2003].

К развитию функциональной недостаточности почек приводят различные урологические заболевания, сопровождающиеся длительно текущим хроническим пиелонефритом с частыми периодами обострения, что неуклонно ведет к гибели почечной паренхимы, особенно в случае дополнительного ишемического повреждения почки в ходе оперативного вмешательства [Лопаткин Н.А. и соавт., 1996; Fugger R. et al., 1991; Lien Y.H. et al., 2003].

При развитии острой или хронической функциональной недостаточности почек (или почки) возникает необходимость поддержания или полной замены функции поврежденного органа путем применения эфферентных методов лечения. Однако, потребности в этих видах лечения, включая и трансплантацию почки, намного опережают возможности современной медицины, как в России, так и в других развитых странах, что требует более углубленного изучения патогенеза данного состояния и поиска альтернативных методов лечения [Лопаткин Н.А. и соавт., 1998; Шумаков В.И., 2005].

Многолетние исследования патогенеза ишемического повреждения почек привели к выводу о многофакторности этого процесса [Биленко М.В.,  1989; Fugger R. et al., 1991; Crompton M., 1999; Lien Y.H. et al., 2003; Gure A. et al., 2004]. Основными факторами считаются нарушение синтеза АТФ, повреждение клеточных мембран избыточным образованием активных форм кислорода с активацией мембраносвязанной фосфолипазы А2 и протеолитических лизосомальных ферментов, перераспределение ионов натрия, калия и кальция между клеткой и внеклеточной средой вследствие утраты барьерных свойств клеточных мембран, активация синтеза медиаторов воспаления и связанная с этим лейкоцитарная инфильтрация паренхимы почки. В последние годы большое значение придается усилению синтеза оксида азота – одного из центральных регуляторов клеточного метаболизма, способного при избыточной продукции взаимодействовать с супероксид анион радикалом с образованием высокотоксичного соединения – пероксинитрита. Особенно неблагоприятными могут быть последствия этого процесса при сопутствующем воспалении (пиелонефрит), что часто встречается в урологической практике.

В связи с этим проблема патогенеза ишемического повреждения почки и постишемической острой почечной недостаточности, роль оксида азота в этом процессе и его взаимосвязь с основными факторами клеточного повреждения является актуальной. Необходимо определить взаимодействие факторов ишемического повреждения при остром и хроническом пиелонефрите и влияние сопутствующего воспаления на толерантность почки к ишемии.

Современные технические возможности позволяют изучать состояние метаболизма непосредственно в живых клетках срезов различных тканей, в том числе и паренхимы почек, причем на уровне субклеточных органелл. При использовании метода сканирующей лазерной конфокальной микроскопии с окраской витальных срезов специфическими флуоресцентными зондами возможно оценивать функциональное состояние митохондрий и других клеточных органелл и определять активность патологических процессов, протекающих в клетках ишемизированного органа, а также выраженность индуцированных ими метаболических расстройств [Плотников Е.Ю. и соавт., 2005; 2007; Кирпатовский В.И. и соавт., 2006].

Знание механизмов ишемического повреждения поможет в разработке методов его профилактики и/или минимизации последствий. До настоящего времени основными методами противоишемической защиты являются локальное охлаждение и применение фармакологических препаратов, обладающих антиишемическим и антигипоксическим действием, однако, нередко их клиническая эффективность ограничена.

Перспективным может быть применение нового класса антиоксидантов (так называемые «митохондриально-ориентированные антиоксиданты»), способных избирательно накапливаться в функционирующих митохондриях в концентрации в 1000 раз превышающей их концентрацию в цитоплазме [Васильева А.К. и соавт., 2007; Антоненко Ю.Н. и соавт., 2008; Архипова Л.Т. и соавт., 2008]. К таким соединениям относятся конъюгаты производных пластохинона [10-(6-пластохинонил) децилтрифосфоний и 10-(6'-пластохинонил) децилродамин] и убихинона, синтезированные в НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского, Московского государственного университета. Доказана высокая антиоксидантная активность этих препаратов in vitro в модельных опытах и на клеточных культурах [Васильева А.К. и соавт., 2007; Скулачев В.П., 2007; Анисимов В.Н. и соавт., 2008; Агапова Л.С. и соавт., 2008]. Однако, на органном уровне эффективность этих соединений пока не изучена.

Другим принципиально новым направлением повышения противоишемической толерантности органов является тренировка  клеток к дефициту кислорода (гипоксическая тренировка организма и ишемическая тренировка органа). В литературе имеются сообщения о повышении устойчивости миокарда, почек и других органов к последующей ишемии после проведения нескольких сеансов дыхания газовой смесью, обедненной кислородом (10-12% О2), [Алешин М.А. и соавт., 1992; Кирпатовский В.И. и соавт., 1996]. Аналогичное действие оказывает кратковременное 2-3 кратное пережатие питающих орган кровеносных сосудов (на 3-5 минут) с периодами реперфузии, выполненными непосредственно перед основным периодом ишемии [Ingwall J.S. et al., 1984; Ogawa T. et al., 2001; Chatterjee P.K. et al., 2003; Hernandez D.J. et al., 2008; Jia R.P. et al., 2009]. Механизм данного эффекта окончательно неясен, что требует его дальнейшего изучения.

Принципиально новым и перспективным современным направлением исследований по сохранению функции поврежденных тканей и органов, в том числе и почки является клеточная терапия, в частности, использование различных типов стволовых клеток [Онищенко Н.А. и соавт., 2005; Черкашина Д.В., Петренко А.Ю., 2006; Brodie J.C., Humes H.D., 2005; Yokoo T. et al., 2008; Humphreys B.D. et al., 2008]. Проведенные в ряде стран исследования показали, что в процессе регенерации поврежденной почки принимают участие собственные кроветворные и мезенхимальные стволовые клетки костного мозга, которые обнаруживаются в различных почечных структурах [Ricardo S.D., Deane J.A., 2005; Lange C. et al., 2005; Ikarashi K. et al., 2005; Herrera M.B. et al., 2004]. Имеются данные по использованию экзогенных костномозговых клеток, которые вводили животным с острой почечной недостаточностью различного генеза, что способствовало ускоренному восстановлению нарушенных функциональных почечных показателей [Gupta S. et al., 2002; Kale S. et al., 2003; Morigi M. еt al., 2004; Togel F. et al., 2005; Behr L. et al., 2007; Choi S. et al., 2008]. Однако, до сих пор не установлены наиболее оптимальный тип стволовых клеток и лучший способ их ведения. Лишь в единичных публикациях описаны результаты клеточной терапии хронической почечной недостаточности, хотя имеются определенные указания на перспективность этого метода [Yokoo T. еt al., 2003; Baud L. еt al., 2005; Knudsen L.M. et al., 2005].  Все это определяет актуальность дальнейших исследований в этом направлении.

Цель исследования. Выявление клеточных механизмов повреждения почек в условиях ишемии и воспаления и оценка эффективности тренировочных методов, фармакологической, клеточной терапии для предотвращения функциональной почечной недостаточности.

Задачи исследования

  1. Разработать методики моделирования острой и хронической функциональной недостаточности почек разной степени выраженности, обусловленной ишемией почки, прогрессирующим течением хронического пиелонефрита или дозированным уменьшением функционирующей паренхимы почки.
  2. Провести сравнительное изучение выраженности функциональных, морфологических и метаболических изменений, включая митохондриальную дисфункцию, продукцию активных форм кислорода и оксида азота, и определить их роль в механизме функциональных расстройств почки, вызванных тепловой или холодовой ишемией.
  3. Изучить протекторный эффект новых противоишемических фармакологических средств, направленных на защиту митохондрий, при постишемической острой почечной недостаточности и провести сравнительную оценку их эффективности с уже апробированными в клинике фармакологическими препаратами.
  4. Провести сравнительный анализ тренировочных методов профилактики постишемической острой почечной недостаточности (гипоксическая тренировка организма, ишемическая тренировка почки) с оценкой их  эффективности.
  5. Изучить роль сопутствующего пиелонефрита в толерантности почки к ишемии.
  6. На клиническом материале изучить метаболические изменения в паренхиме ишемизированных почек методом лазерной конфокальной микроскопии и сопоставить полученные результаты с данными экспериментальных исследований.
  7. Оценить в эксперименте эффективность терапии хронической функциональной недостаточности и постишемической острой почечной недостаточности с использованием фетальных культивированных костномозговых мезенхимальных стволовых клеток и суммарной культуры клеток почки человека.
  8. Провести сравнительное изучение динамики функциональных показателей поврежденной почки при клеточной терапии острой и хронической функциональной недостаточности почек у животных в зависимости от пути введения клеток.
  9. Оценить эффективность клеточной терапии хронического пиелонефрита у животных с использованием морфологических и функциональных методов исследования.
  10. Разработать рекомендации для клинического использования методов протекторной и регенерационной терапии поврежденной почки.

Научная новизна

Показана ведущая роль в ранних постишемических расстройствах функции почек митохондриальной дисфункции, активных форм кислорода и оксида азота, а также изучено влияние на них разных методов противоишемической защиты.

Выявлено, что протекторный эффект тренировочных методов противоишемической защиты почки (ишемическая и гипоксическая тренировка) обусловлен функциональным состоянием митохондрий, а  именно различной степенью продукции ими активных форм кислорода и оксида азота.

Доказана взаимосвязь прижизненных постишемических изменений, выявленных при конфокальной микроскопии и магнитно-резонансной томографии, с функциональным состоянием почек при различных сроках,  вариантах ишемии и способах противоишемической защиты.

Доказана высокая эффективность протекторного действия новых противоишемических фармакологических средств, в том числе хлорида лития и митохондриально-ориентированных антиоксидантов «SkQ-1», «SkQR» (являющихся трансмембранно проникающими катионами), направленных на защиту митохондрий при постишемической острой почечной недостаточности разной степени тяжести.

Определена роль сопутствующего хронического пиелонефрита в толерантности почки к ишемии и в эффективности противоишемической защиты и доказано, что в отличие от острого пиелонефрита хроническое воспаление почки существенно не снижает ее противоишемическую толерантность.

В эксперименте продемонстрированы возможности сохранения и улучшения функции поврежденной почки за счет стимуляции регенерационных процессов введением костномозговых мезенхимальных стволовых клеток и прогениторных фетальных клеток почки человека при острой постишемической почечной недостаточности и хронической функциональной недостаточности почек.

Доказана зависимость эффективности клеточной терапии от пути введения (внутривенный или интрапаренхиматозный) и вида используемых клеток.

Выявлено кратковременное влияние клеточной терапии культивированными фетальными костномозговыми мезенхимальными стволовыми клетками на течение хронического пиелонефрита проявляющееся в большей степени в улучшении функции почки и в меньшей степени в подавлении воспалительного процесса. 

Практическая значимость работы

Разработана воспроизводимая экспериментальная модель хронического пиелонефрита с развитием хронической функциональной недостаточности почек, позволяющая изучать различные аспекты патогенеза и терапии данного патологического процесса.

Проведена количественная оценка выраженности расстройств функции почки, характеризующих тяжесть острой почечной недостаточности после тепловой и холодовой ишемии разной длительности, что имеет важное значение для разработки более эффективных вариантов противоишемической защиты почки.

Обоснована в эксперименте методика проведения ишемической тренировки почки с целью профилактики ишемического повреждения при длительных (более 40 минут) сроках интраоперационной ишемии почки, рекомендуемая для клинической апробации.

Доказана возможность и целесообразность клинического применения новых фармакологических средств – митохондриально-ориентированных антиоксидантов («SkQ-1» «SkQR») являющихся трансмембранно проникающими катионами, и лития хлорида в качестве препаратов для противоишемической защиты почки.

Установлена целесообразность клинического применения культивированных фетальных костномозговых мезенхимальных стволовых клеток и суммарной культуры почечных клеток человека для лечения пациентов с острой постишемической и хронической функциональной недостаточностью почек. Доказана более высокая эффективность костномозговых мезенхимальных стволовых клеток при их интрапаренхиматозном введении.

Показана целесообразность дальнейших исследований по использованию культивированных фетальных костномозговых мезенхимальных стволовых клеток для лечения хронического пиелонефрита с обращением особого внимания на методы усиления их противовоспалительного действия.

Основные положения выносимые на защиту

1. При ишемии почки основными источниками активных форм кислорода и оксида азота, запускающих каскад мембранно-деструктивных реакций, являются функционально неполноценные митохондрии эпителиальных клеток почечных канальцев, что предопределяет необходимость целенаправленной их защиты от ишемического повреждения.

2. Новые направления противоишемической защиты почек с использованием митохондриально-ориентированных антиоксидантов, хлорида лития и тренировочных методов обладают высокой эффективностью и потенциально могут быть использованы в клинической практике.

3. Клеточная регенерационная терапия с использованием фетальных стволовых и прогениторных клеток способствует улучшению функции поврежденных почек при острой постишемической и хронической почечной недостаточности, а также уменьшает выраженность функциональных расстройств при хроническом пиелонефрите.

Связь с планом научно-исследовательской работы института и отраслевыми программами

Диссертация выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ ФГУ «НИИ урологии Росмедтехнологий», регистрационный номер 0120.0807026; Межведомственного Научного совета по уронефрологии № 24.08 РАМН и Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации.

Внедрение результатов исследования в клиническую практику

Разработанные принципы тренировочных методик профилактики постишемических функциональных расстройств, антиоксидантной фармакологической противоишемической защиты и использования стволовых клеток могут быть рекомендованы для дальнейшего клинического исследования.

Апробация работы

Результаты диссертационной работы были представлены на международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино 2005; 2007), международной конференции “Ломоносов” (Москва, 2007), IV Съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008), международном симпозиуме «От экспериментальной биологии к превентивной и интегративной медицине» (Судак, 2008), IV Всероссийском съезде трансплантологов (Москва, 2008), Российской научной конференции с международным участием «Фундаментальные исследования в уронефрологии» (Саратов, 2009).

Публикации

По теме диссертации опубликованы 45 научных работ, в том числе 15 в рецензируемых изданиях, 3 в зарубежных и 22  тезиса докладов.

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа изложена на 348 страницах машинописного текста, состоит из введения, главы посвященной материалу и методам, 3 глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка цитируемой литературы, включающей 82 работы отечественных и 225 зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 26 таблицами и  113 рисунками.

Материал и методы исследования

Экспериментальные исследования были выполнены на 276 животных. 252 белых беспородных крысах и 24 половозрелых кроликах породы Шиншилла.

Уточнение механизма ишемического повреждения почки при различных вариантах моделирования, изучение и сравнительную оценку  различных методов противоишемической защиты почки, исследование возможности применения стволовых костномозговых мезенхимальных и почечных клеток плода человека в лечении острой постишемической, хронической почечной недостаточности и сопутствующего хронического пиелонефрита проводили посредством конфокальной микроскопии, биохимических методов исследования (функции и метаболизма), магнито-резонансной томографии и морфологического исследования.

Стволовые клетки человека получали в Научном Центре акушерства, гинекологии и перинатологии им. М.В. Кулакова. Почечные клетки-предшественники (ПК) выделяли из почек, а мезенхимальные стволовые клетки костного мозга (КМ-МСК) – из костного мозга трубчатых костей плодов человека 8-12 недель гестации, полученных в результате медицинского аборта. Первичную непассированную культуру клеток вводили экспериментальным животным в паренхиму почки или внутривенно в количестве 1,5 млн. С целью визуализации клеток после трансплантации использовали прижизненное их окрашивание цитоплазматическим флуоресцентным зондом Calcein-AM.

Микроскопическое изучение витальных срезов почки проводилось на конфокальном микроскопе LSM510 («Carl Zeiss» Германия) с фирменным программным обеспечением. Срезы окрашивались специфичными флуоресцентными красителями. Для изучения трансмембранного потенциала (Δψ) митохондрий клеток использовали этиловый эфир тетраметил-родамина (TMRE, Invitrogen, США),  накапливающийся в митохондриях в соответствии с величиной Δψ.

В качестве зонда на активные формы кислорода (АФК) использовался 2,7-дихлорфлуоресцеин в виде мембран-проникающего диацетатного эфира (DCF, Invitrogen, США).

Для выявления продукции оксида азота (NO) в клетках почки, срезы инкубировали в среде содержащей 4,5-диаминофлуоресцеина в виде диацетатного эфира (DAF-2, Invitrogen, США).

Для визуализации TMRE использовали возбуждающий лазер 543 нм и измеряли флуоресценцию в диапазоне 560-590 нм. Красители DCF и DAF-2 возбуждали аргоновым лазером при 488 нм с эмиссией флуоресценции при 505 - 530 нм.

Магниторезонансное исследование почек крыс проводили интраоперационно в различные сроки ишемического и реперфузионного воздействия на аппарате BioSpec 70/30 (Bruker, Germany) с индукцией магнитного поля 7 Тл и градиентной системой 105 мТл/м.

Клиническая часть исследования включает анализ результатов обследования 40 больных (21 женщина, 19 мужчин) оперированных по поводу коралловидного нефролитиаза или паренхиматозной опухоли почки без применения и с использованием различных способов противоишемической защиты (локальное охлаждение почки, фармакологические препараты). Оценка результатов исследования основывалась на данных активности в моче маркерных ферментов деструкции эпителия почечных канальцев (фермента щеточной каемки -глутамил транспептидазы – ГГТП и лизосомального фермента нейтральной α-глюкозидазы – НАГ), показателях динамической нефросцинтиграфии с 131I-гиппураном (250 - 300 мкКи/кг) и конфокальной микроскопии биопсийного материала (паренхимы почки) взятого в начале и конце периода ишемии.

Результаты собственных исследований и их обсуждение

Прежде, чем приступить к изучению новых методов противоишемической защиты почки, мы провели исследование клеточных механизмов  повреждения и адаптации почки в условиях ишемии и воспаления с использованием современных возможностей прижизненного исследования структуры и метаболизма органа, метода конфокальной микроскопии с использование флуоресцентных зондов позволяющих оценить состояние трансмембранного потенциала митохондрий (зонд TMRE), активности синтеза оксида азота (зонд DAF-2) и активных форм кислорода (зонд DCF).

Проведенные исследования по изучению механизмов ишемического повреждения почки при различных сроках ишемии показали, что именно митохондрии клеток почечных канальцев играют основную роль в обеспечении сохранения функциональной полноценности органа, а степень их повреждение напрямую зависит от длительности ишемического воздействия (рис. 1).

 

 

А  Б В

Рис. 1. Конфокальная микроскопия витальных срезов почки крысы (окраска TMRE). А – интактной почки; Б – после 40 минут ишемии; В – после 90 минут ишемии. 

При этом в ишемическом повреждении почки значительную роль играет именно митохондриальная продукция активных форм кислорода (рис. 2) и оксида азота (рис. 3, 4), которые являются инициаторами окислительного и токсического повреждения клеточных структур.

  А Б  В

Рис.2. Конфокальная микроскопия витальных срезов почки крысы после 40-минутной ишемии и реперфузии. Окраска зондом А – DCF; Б – TMRE; В -  совместное окрашивание зондом  DCF и TMRE. Активные формы кислорода генерируются как в митохондриях с сохраненным трансмембранным потенциалом (желтое свечение), так и в митохондриях, его утративших (не накапливающих TMRE) (зеленое свечение).

  А  Б  В

Рис. 3. Конфокальная микроскопия витальных срезов почки после 40-минутной ишемии и реперфузии. Окраска зондом А – DAF-2; Б – TMRE; В -  совместное окрашивание зондом  DAF-2 и TMRE. Оксид азота образуется в митохондриях эпителия почечных канальцев с сохраненным трансмембранным потенциалом (желтое свечение). Клубочек в процессе образования оксида азота не участвует.

Рис. 4. Распределение свечения TMRE и DAF-2 в клетках эпителия одного почечного канальца при 40-минутной ишемии и реперфузии. Пики интенсивности свечения обоих красителей совпадают, подтверждая, что основным источником генерации оксида азота являются митохондрии.

Таким образом, в сочетании с утратой способности к адекватному ресинтезу АТФ в раннем постишемическом периоде состояние митохондриального аппарата клеток может быть ключевым моментом, определяющим сохранность клеток почки после ишемического воздействия.

В дальнейшем наша работа была условно разделена на изучение и поиск возможных протекторных и регенерационных методов защиты почки от ишемического повреждения. В обоих разделах нами были использованы методики исследований позволяющие оценить происходящие функциональные и метаболические изменения в ишемизированных почках, в том числе конфокальная микроскопия с флуоресцентными зондами, магнито-резонансная томография, а также морфологические, биохимические и радиоизотопные методы исследования.

В клинической практике многие урологические заболевания сопровождаются развитием острого и хронического воспалительного процесса в почке, который в свою очередь, может оказывать влияние на выраженность постишемических функциональных расстройств.

Проведенное нами экспериментальное исследование показало, что острый пиелонефрит значительно ухудшает функциональное и метаболическое состояние почки в раннем постишемическом периоде, которое проявляется выраженной активацией процессов перекисного окисления липидов и достоверным снижением показателей клиренса креатинина и реабсорбции натрия (табл. 1) с этим в данных условиях значительно возрастает опасность развития функциональной недостаточности оперированной почки.

Таблица 1. Влияние  острого пиелонефрита  и  тепловой  ишемии на  функциональные

  показатели почек (кролика) 

Показатель

Интактные почки

Почки с острым пиелонефритом

без ишемии

Тепловая 40-минутная ишемия

Без инфекции

На фоне острого пиелонефрита

Диурез

(мл/мин)

0,24+0,4

0,06+0,01***

0,14+0,02*

0,02+0,01***

Клиренс креатинина (мл/мин)

3,45+0,31

2,07+0,26*

0,59+ 0,11***

0,73+0,15***

Реабсорбция натрия (%)

97+2

92+1*

83+2**

67+3***

Реабсорбция натрия (мЭкв/мин)

0,46+0,03

0,27+0,03*

0,07+0,01***

0,06+0,01***

Достоверность различий по отношении к интактным почкам: *- р >0,05 ; **- р >0,01; ***- р >0,001.

В то же время хронический пиелонефрит вне стадии обострения практически не влияет на выраженность постишемических функциональных расстройств (табл. 2), так как по всей видимости сохранившиеся функционально полноценные канальцы обладают повышенной устойчивостью к действию такого патогенного фактора, как острая тепловая ишемия. Механизм этого явления для нас остался неясным и требует дополнительного более углубленного исследования.

Таблица 2. Влияние хронического пиелонефрита и тепловой ишемии на функциональные 

показатели почек (крысы)

Показатель

Интактные

животные

Хронический пиелонефрит

Тепловая ишемия (40 минут)

Без инфекции

Хронический пиелонефрит

Выживаемость

100%

100%

100%

100%

Диурез (мл/сутки)

15,6 + 3,2

15,5 + 2,8

14,8 + 1,9

18,2 + 3,4

Креатинин крови (мкмоль/л)

59 + 3

65 + 2

55 + 2

67 + 2

Мочевина крови (моль/л)

5,9 + 0,3

8,1 + 0,2*

6,7 + 0,2

7,9 + 0,3

Клиренс креатинина (мл/мин/кг)

2,92 + 0,19

1,86 + 0,14*

2,87 + 0,11

2,8 + 0,19

Реабсорбция натрия  (%)

99,5 + 0,1

99,3 + 0,12

99,4 + 0,1

99,2 + 0,1

Примечание: Достоверность разницы результатов: * - р < 0,05 по сравнению с интактными животными.

Если подходить к полученным результатам с практической точки зрения то можно предположить, что при операциях на почке, требующих пережатия почечных сосудов, у больных с пиелонефритом фактором риска существенного ухудшения функционального состояния органа после операции является только активный воспалительный процесс. В латентной стадии или в стадии ремиссии хронический пиелонефрит не утяжеляет функциональное состояние почки после вынужденной ее интраоперационной ишемии.

Следующим разделом нашей работы явилось изучение различных протекторных методов защиты почки от ишемического повреждения.

Одним из широко распространенных в клинической практике методов профилактики ишемического повреждения почки является ее локальное охлаждение, используемое в двух возможных вариантах – холодовая перфузия почки и как более простой вариант - методика наружного охлаждения органа, заключающаяся в интраоперационном обкладывания почки крошкой льда, что позволяет снизить ее температуру до +14 – +180С. Мы в эксперименте исследовали происходящие метаболические процессы при обеих методиках холодовой защиты органа, а в клинике изучили именно эффективность методики наружного охлаждения почки у пациентов, которым выполняли резекцию почки.

Результаты экспериментов показали, что после 40 минут ишемии в условиях локальной гипотермии (+14 - +160С), в отличие от тепловой ишемии той же длительности, основные показатели, характеризующие функциональное состояние почки (клиренс креатинина и канальцевая реабсорбция натрия) изменялись незначительно и быстро приходили к нормальным значениям (рис. 5).   

Рис. 5. Динамика показателей клиренса креатинина (А) и реабсорбции натрия (Б) у кроликов после тепловой и холодовой локальной и перфузионной 40-минутной ишемии.

Таким образом, проведенные нами эксперименты показали определенные противоишемические возможности локальной гипотермии при интраоперационной защите почек.

Полученные экспериментальные данные были подтверждены проведенным пилотным клиническим исследованием, которое заключалось в изучении состояния митохондриального аппарата в биоптатах почки, взятых у больных во время операций (резекция почки) в начале и конце периода ишемии.

У пациентов, которым проводили локальное охлаждение почки имело место более выраженное сохранение функциональной полноценности митохондриального аппарата почечных канальцев (интенсивность флуоресценции TMRE) (рис. 6 А) и уменьшение окислительного стресса за счет подавления продукции свободных радикалов кислорода (флуоресценция DCF) (рис. 6 Б) по сравнению с группой пациентов, где операцию проводили в условиях тепловой ишемии почки.

Рис. 6. Динамика интенсивности флуоресценции TMRE (А) и DCF (Б) в зависимости от вида (тепловая или холодовая) ишемии почки оперированных пациентов.

Механизм протективного действия на почку умеренной (+14 - +160С) гипотермии вероятно всего обусловлен снижением интенсивности клеточного метаболизма и замедлением развития процессов ишемического расстройства обмена веществ, а также повреждения мембранного аппарата клеток. Изученные нами сроки допустимого выключения почки из кровотока вполне могут устраивать урологов при некоторых ситуациях, когда не требуется длительного прерывания почечного кровотока, например, при секционной или парциальной нефролитотомии с удалением  камней почек, при резекции почки.

Другим перспективным направлением профилактики ишемического повреждения почки, потенциально применимым в клинической практике, являются тренировочные методы. В частности нами было проведено исследование влияния ишемической тренировки (ИТ) почки и интервальной нормобарической гипоксической тренировки (ИНГТ) организма на выраженность постишемических метаболических и функциональных расстройств почки.

При анализе результатов проведенного исследования, можно отметить, что как ишемическая, так и гипоксическая тренировки способствуют повышению резистентности почек к ишемическому повреждению, проявляющееся в сохранении функциональных показателей почки на значениях, близких к норме (табл. 3), а также в меньшей активации продукции активных форм кислорода и оксида азота, а также в сохранении высокого потенциала митохондрий (рис. 7).

Таблица 3. Влияние ишемической тренировки почки и гипоксической тренировки организма на функциональные показатели ишемизированной (40 минут) почки (крысы).

Показатель

Интактные крысы

40 минут ишемии

ИНГТ + 40 минут ишемии

ИТ + 40 минут ишемии

Выживаемость

100%

100%

100%

100%

Диурез

(мл/сутки)

15,6 + 3,2

15,3 + 2,6

12,8 + 2,2

7,3 + 0,7

Креатинин крови (мкмоль/л)

59 + 3

62 + 4

64 + 3

65 + 2

Натрий крови

(ммоль/л)

137 + 2

141 + 2

136 + 2

138 + 1

Калий крови (ммоль/л)

4,6 + 0,1

4,4 + 0,2

5,3 + 0,2*,#

5,1 + 0,1*,#

Клиренс креатинина (мл/мин/кг)

2,92 + 0,19

2,09 + 0,21*

2,37 + 0,23

2,71 + 0,18#

Реабсорбция натрия (%)

99,5 + 0,1

97,7 + 0,2*

98,9 + 0,2 #

99,9 + 0,1 #

Примечание: Достоверность разницы результатов:  * - р <0,05 по сравнению с интактными животными; #  - р  <0,05 по сравнению с ишемией без тренировки.

Рис. 7. Интенсивность флуоресценции зондов TMRE, DCF, DAF-2 в эпителии почечных канальцев после 40 минутной тепловой ишемии с тренировкой и без нее.

Результаты этих экспериментов показали, что ведущими клеточными механизмами повышения толерантности почки к ишемии при гипоксической тренировке является сохранение энергопродуцирующей активности митохондрий в сочетании с большей сбалансированностью возможностей антиоксидантной защиты клеток и интенсивности продукции активных радикалов, а в случае ишемической тренировки это подавление избыточной продукции оксида азота в раннем постишемическом периоде, что также ведет к сохранению функциональной полноценности митохондрий и их АТФ-синтезирующей активности. Полученные нами данные о достоверном уменьшении синтеза оксида азота в раннем реперфузионном периоде при ишемической тренировки, при недостоверном влиянии на продукцию радикалов кислорода, в сочетании с высокой сохранностью функции почки в постишемическом периоде, возможно, свидетельствует о большей значимости избытка оксида азота в патогенезе ишемического повреждения, чем избытка кислородных радикалов, которые могут быть нейтрализованы антиоксидантной системой при достаточной ее мощности.

Неудовлетворенность эффективностью существующих на сегодня медикаментозных средств противоишемической защиты, заставляет проводить поиск новых препаратов. Так нами было исследовано противоишемическое действие лития хлорида, являющегося ингибитором фермента киназа-3-гликогенсинтазы (GSK-3), на котором замыкается ряд защитных сигнальных метаболических путей.

При этом было выявлено, что противоишемическая эффективность лития хлорида напрямую зависит от длительности ишемического воздействия на почку. При ишемии почки длительностью 60 минут и меньше лития хлорид оказывал выраженное протекторное действие, проявляющееся в сохранении активной флуоресценции митохондрий канальцевого эпителия и его морфологической структуры, а также в сохранении показателей мочевины крови, клиренс креатинина и реабсорбции натрия на уровне нормальных значений. В тоже время увеличение тепловой ишемии на срок более 60 минут значительно снижало эффективность действия данного препарата. В частности выживаемость животных снижалась в 2 раза, на фоне значительного угнетения показателей функции почки, но все же они были выше по сравнению с контролем (табл. 3).

Однако, следует учитывать, что в урологической практике ишемия почки такой длительности (90 минут и более), как правило, встречается лишь при ауто- или аллотрансплантации почки, однако в этих случаях всегда используют другие методы противоишемической защиты (охлаждение и промывание консервирующим раствором). По-видимому, включение в этот комплекс препаратов лития поможет в большей степени защитить почку от ишемического повреждения.

Таблица 3. Влияние хлорида лития на функцию почки после различных сроков ее тепловой ишемии.

Показатель

Интактные

животные

60 мин. Ишемия – 3 сут.

90 мин. Ишемия – 3 сут.

90 мин. Ишемия – 7 сут.

Контроль

Литий

Контроль

Литий

Контроль

Литий

Выжива-емость

100%

100%

100%

20%

100%

0%

50%

Креатинин крови (мкмоль/л)

59 ± 3

145±11***

110±9***,Х

600

445±32***,ХХ

-

102±9***

Клиренс креатинина (мл/мин/кг)

2,92 ± 0,19

0,81±0,11***

3,63±0,34ХХХ

0,02

0,26±0,03***,Х

-

2,49±0,27

Реабсорбция натрия (%)

99,52 ± 0,06

99,11±0,08*

99,24±0,12

75,34

94,18±0,13***,Х

-

98,66±0,20***

Примечание: *, **, *** - р < 0,05, p <0,01 и p < 0,001 по сравнению с интактными крысами;

-  х, хх и ххх - р < 0,05, p <0,01 и p < 0,001 по сравнению с ишемией без введения лития.

Таким образом, результаты наших экспериментальных исследований продемонстрировали перспективность использования хлорида лития для противоишемической защиты почки. Целесообразно продолжить исследования с фармакопейными препаратами лития с целью возможного их использования в клинической практике.

Предварительный анализ данных проведенного, нами исследованная показал, что для профилактики острой постишемической почечной недостаточности важно обеспечить сохранение функциональной полноценности именно митохондрий клеток канальцев ишемизированной почки. На сегодня традиционно применяемые для этой цели являются препараты из группы антиоксидантов, при этом они, оказывая определенное протекторное действие, не могут в достаточной степени решить эту задачу.

В связи с этим, следующим этапом нашего исследования явилось исследование принципиально новой группы препаратов – митохондриально-ориентированных антиоксидантов – синтезированных в  Институте физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского, Московского государственного университета. Отличительной особенностью данной группы препаратов является их способность к избирательному накоплению в митохондриях в концентрации 1000-кратно превышающей концентрацию этих веществ в цитоплазме клетки.

Мы изучили эффекты 2 митохондриально-ориентированных антиоксидантов из этой группы препаратов - 10-(6-пластохинонил) децилтрифосфония (SkQ-1), 10-(6-пластохинонил) децилродамина (SkQR). Антиоксиданты вводили животным внутрибрюшинно за 24 часа до предполагаемой ишемии почки, так как данный срок введения используемых препаратов по результатам наших исследований являлся оптимальным для оказания их наибольшего антирадикального эффекта.

При сравнительной оценке противоишемического действия этих атиоксидантов было отмечено, что оба препарата увеличивают выживаемость экспериментальных животных после 90-минутной ишемии единственной почки с 18% до 90-95%, а по данным биохимического исследования эффективность SkQR оказалась несколько выше, чем SkQ-1 за счет большего защитного эффекта в отношении сохранности канальцевого аппарата почки, что проявилось в предупреждении нарушения реабсорбции натрия и уменьшении степени полиурии (рис. 8).

Рис. 8. Изменения показателей концентрации креатинина в крови (А) и клиренса креатинина (Б), после 90 минут ишемии единственной левой почки крысы.

При этом доза в 200 нмоль/кг оказалась более эффективной, чем доза 1 мкмоль/кг, что совпадало с выраженностью антирадикальной активности препарата.

Для сравнения эффективности действия митохондриально-ориентированных антиоксидантов с используемыми в клинике препаратами, мы в эксперименте сопоставили и оценили степень защиты препарата SkQR в дозе 200 нмоль и комплекса протиовоишемических препаратов пентоксифиллина  и -токоферола, эффективность которых доказана в клинических условиях у пациентов оперированных по поводу коралловидного нефролитиаза с пережатием почечных сосудов. Использование данного комплекса препаратов в клинике приводило к уменьшению выраженности ишемического повреждения почечных канальцев проявляющееся в ускорении нормализации гиперферментурии маркерных ферментов деструкции эпителия почечных канальцев (фермента щеточной каемки -глутамил транспептидазы – ГГТП (рис. 9) и лизосомального фермента нейтральной -глюкозидазы – НАГ) в раннем послеоперационном периоде (рис. 10), а также в сохранении дефицита секреции  I131-гиппурана на дооперационном уровне (49±3% и 48±2% соответственно), тогда как у больных, оперированных без фармакологической защиты этими препаратами (контрольная группа), функция оперированной почки в этот же период достоверно ухудшалась (44±2 и 60±3% соответственно).

 

Рис. 9. Динамика активности -глутамил транспептидазы в моче пациентов контрольной и исследуемой групп в послеоперационном периоде.

Рис. 10. Динамика активности нейтральной -глюкозидазы в моче пациентов контрольной и исследуемой групп в послеоперационном периоде.

При сравнительном экспериментальном исследовании групп животных с применением препарата SkQR и комплекса препаратов пентоксифиллин и -токоферол была показана более высокая эффективность митохондриально-ориентированного антиоксиданта, что проявлялось в лучшей сохранности функциональных показателей ишемизированной почки (табл. 4).

Поскольку комплекс (-токоферол и пентоксифиллин) доказал свою клиническую эффективность, можно полагать, что SkQR имеет существенные перспективы внедрения в клинику при условии доведения его до категории фармакопейного препарата, разрешенного для клинического применения.

Новым направлением в поддержании функции поврежденной почки, как при остром, так и при хроническом ее повреждении, является стимуляция регенераторных процессов в органе с использованием клеточных технологий, в том числе стволовых клеток. Проведение исследований в этом направлении и явилось следующим этапом нашей работы.

 

  Таблица 4. Влияние 90 минутной тепловой ишемии на выживаемость, биохимических и функциональных  показателей почек крысы (на 3-и  и

  7-е сутки после ишемии) в условиях защиты SkQR и комплекса (-токоферол и пентоксифиллин)

Показатель

Интактные

животные

90-минутная ишемия 

3-и сутки

90-минутная ишемия

7-е сутки

Контроль

SkQR

-токоферол +

пентоксифиллин

Контроль

SkQR

-токоферол +

пентоксифиллин

Выживаемость

100%

20%

100%

100%

0%

100%

100%

Диурез (мл/сутки)

15,6 ± 3,2

21

10,2±2,2

17,4±2,4

-

12,1±1,7

16,2±1,8

Креатинин крови (мкмоль/л)

59 ± 3

600

196±21

313±27*

-

88±7

109±11

Мочевина крови (моль/л)

6,9±0,3

24,2

26,1±2,1

23,5±1.9

-

11,8±0,7

13,2±1,0

Клиренс креатинина (мл/мин/кг)

2,92 ± 0,19

0,02

0,86±0,04

0,39±0,06**

-

1,58±0,05

1,19±0,04*

Реабсорбция натрия  (%)

99,52 ± 0,06

75,34

99,63±0,02

95,2±0,06***

-

99,87±0,02

99,26±0,06**

Реабсорбция кальция (%)

95,42±0,03

54.56

81,23±0,12

80,14±0,18**

-

88,43±0,09

87,11±0,10***

АСТ крови (МЕ/л)

14±2

145

43±4

62±5

-

91±5

104±6

АЛТ крови (МЕ/л)

7±1

133

20±2

22±3

-

25±2

28±2

ЛДГ крови (МЕ/л)

145±11

944

86±4

215±17**

-

57±2

220±9***

АСТ мочи (МЕ/сут)

0,156±0,013

0,613

0,372±0,036

0,241±0,031

-

0,141±0,011

0,233±0,014*

АЛТ мочи (МЕ/сут)

0,078±0,006

0,349

0,120±0,014

0,182±0,016*

-

0,065±0,06

0,102±0,08*

ЛДГ мочи (МЕ/сут)

0,176±0,014

0,663

0,382±0,043

0,118±0,014*

-

0,316±0,031

0,378±0,040

*,**, *** - достоверность разницы результатов по сравнению с группой животных с SkQR р< 0,05, р <0,01, р <0,001 соответственно.

В своем исследовании мы использовали культивированные фетальные костномозговые мезенхимальные стволовые клетки (КМ-МСК) и культивированные клетки фетальной почки (ПК), предоставленные нам сотрудниками ФГУ НЦ акушерства, гинекологии и перинатологии им. Кулакова (дир. – акад. РАМН Г.Т.Сухих).

Экспериментальная оценка эффективности клеточной терапии была проведена в группах животных при моделировании постишемической острой почечной недостаточности, хронической почечной недостаточности и хронического пиелонефрита. Введение стволовых и прогениторных клеток осуществляли внутривенно и в паренхиму почки.

В опытах с моделированием острой почечной недостаточности введение мезенхимальных костномозговых стволовых клеток непосредственно в паренхиму органа полностью предупреждало послеоперационную гибель животных (рис. 11) и способствовало быстрой нормализации показателей клиренса креатинина (рис. 12), в то время как инъекция в ишемизированную почку культуры почечных клеток оказалась малоэффективной.

Рис. 11. Смертность крыс от уремии после 90-минутной тепловой ишемии при постишемическом интрапаренхиматозном введении культивированных фетальных мезенхимальных костномозговых клеток и суммарной культуры фетальных почечных клеток человека в сравнении с контрольным введением физиологического раствора.

Рис. 12. Динамика показателей клиренса креатинина у крыс после 90-минутной ишемии единственной почки и введения в паренхиму почки культивированных фетальных стволовых мезенхимальных костномозговых клеток и суммарной культуры фетальных почечных клеток человека.

Мезенхимальные клетки введенные внутривенно также обеспечивали наибольшую выживаемость животных по сравнению с другими группами (рис. 13). Введение почечных клеток обеспечивало 50% выживаемость, но при этом имело место более быстрое восстановление функциональных показателей ишемизированной почки у выживших крыс (рис. 14).

Рис. 13. Смертность крыс от уремии после 90-минутной тепловой ишемии при постишемическом внутривенном введении культивированных фетальных мезенхимальных костномозговых клеток и суммарной культуры фетальных почечных клеток человека в сравнении с контрольным введением физиологического раствора.

Рис. 14. Динамика показателей клиренса креатинина у крыс после 90-минутной ишемии единственной почки и внутривенного введения культивированных фетальных стволовых мезенхимальных костномозговых клеток и суммарной культуры фетальных почечных клеток человека.

При моделировании хронической почечной недостаточности интрапаренхиматозное введении обоих типов клеток оказывало достаточно ранний (4 - 11 сутки) и стойкий положительный эффект который наблюдался до 1,5 месяцев и проявлялся в нормализации всех исследуемых функциональных показателей (рис. 15-17).

Рис. 15. Динамика показателей креатинина крови у крыс с хронической почечной недостаточностью после введения в паренхиму почки культивированных фетальных стволовых мезенхимальных костномозговых клеток и суммарной культуры фетальных почечных клеток человека.

Рис. 16. Динамика показателей клиренса креатинина у крыс с хронической почечной недостаточностью после введения в паренхиму почки культивированных фетальных стволовых мезенхимальных костномозговых клеток и суммарной культуры фетальных почечных клеток человека.

Рис. 17. Динамика показателей реабсорбции натрия у крыс с хронической почечной недостаточностью после введения в паренхиму почки культивированных фетальных стволовых мезенхимальных костномозговых клеток и суммарной культуры фетальных почечных клеток человека.

Внутривенное введение обоих типов клеток животным с хронической почечной недостаточностью также оказывало положительное действие. Но эффект развивался более медленно. Так нормализация основных функциональных показателей происходила через 2 недели в опытах с культурой почечных клеток и через 1 месяц в опытах с костномозговыми мезенхимальными стволовыми клетками и держалась на субнормальных значениях более 2-3 месяцев (рис. 18-20).

Рис. 18. Динамика показателей креатинина крови у крыс с хронической почечной недостаточностью после внутривенного введения культивированных фетальных стволовых мезенхимальных костномозговых клеток и суммарной культуры фетальных почечных клеток человека.

Рис. 19. Динамика показателей клиренса креатинина у крыс с хронической почечной недостаточностью после внутривенного введения культивированных фетальных стволовых мезенхимальных костномозговых клеток и суммарной культуры фетальных почечных клеток человека.

Рис. 20. Показатели реабсорбции натрия у крыс с хронической почечной недостаточностью после внутривенного введения культивированных фетальных стволовых мезенхимальных костномозговых клеток и суммарной культуры фетальных почечных клеток человека.

Проведенное нами гистологическое исследование выявило, что при острой почечной недостаточности введение стволовых клеток предупреждало развитие выраженной гидропической дистрофии и некроза эпителиоцитов почечных канальцев (рис. 21) с появлениями участков паренхимы с морфологическими признаками сохраненной функциональной активности (рис. 22). При хронической почечной недостаточности клеточная терапия приводила к уменьшению степени склероза интерстиция и уменьшению выраженности кальцификации погибших почечных канальцев.

 

Рис. 21.  Вторые сутки после 90-минутной тепловой ишемии почки. Выраженная гидропическая дистрофия эпителия почечных канальцев с явлениями фокального колликвационного некроза эпителиоцитов (помечено стрелками). Окраска гематоксилином и эозином.  Ув. 400.

Рис. 22. Четвертые сутки после 90-минутной ишемии почки и интрапаренхиматозного введения культивированных фетальных стволовых мезенхимальных костномозговых клеток. Участки с повышенной функциональной активностью помечены стрелками. Окраска гематоксилином и эозином.  Ув. 100.

Исследование эффективности использования клеточной терапии (однократное интрапаренхиматозное введение культивированных фетальных стволовых мезенхимальных костномозговых клеток) у животных при моделировании хронического пиелонефрита выявило кратковременное уменьшение выраженности признаков воспалительного процесса в паренхиме органа (табл. 5), проявляющееся в кратковременном уменьшении лейкоцитурии и некотором уменьшении бактериурии в сочетании со стойкой (до 3 месяцев) нормализацией ее функционального состояния (уменьшение выраженности протеинурии, более высокие значения клиренса креатинина) (рис. 23).

Таблица 5.  Результаты исследования общего анализа мочи  у  крыс  с  индуцированным

хроническим пиелонефритом, до и в разные сроки после пересадки культивированных фетальных стволовых мезенхимальных костномозговых клеток.

Примечание. Достоверность различий по отношению к крысам до пересадки мезенхимальных клеток * - p<0,05.

Рис. 23. Динамика показателей клиренса креатинина у крыс с хроническим пиелонефритом после интрапаренхиматозного введения культивированных фетальных стволовых мезенхимальных костномозговых клеток.

Вероятно, однократное введение стволовых клеток не может полностью ликвидировать хроническое воспаление, и продолжающийся воспалительный процесс постепенно нивелирует активацию процессов регенерации, индуцированную введенными фетальными клетками. При экстраполяции полученных экспериментальных данных на человека можно ожидать достаточно длительный положительный эффект от клеточной терапии хронического пиелонефрита. Возможно, более эффективными окажутся повторные введения стволовых клеток. 

При изучении судьбы интрапаренхиматозно введенных культивированных фетальных стволовых мезенхимальных костномозговых клеток (меченых флуоресцентным зондом) при постишемической острой почечной недостаточности было выявлено, что уже через сутки введенные клетки распространяются по интерстициальному пространству на достаточно большое расстояние от места введения (рис. 24 А). Через 7 суток количество введенных клеток уменьшалось. Но оставшиеся клетки встречались в достаточно большом количестве на большом удалении от места введения и также располагались преимущественно в интерстиции (рис. 24 Б) и лишь единичные клетки проникали внутрь почечных канальцев (рис. 24 В).

 

 

А Б В

Рис. 24. Флуоресцентная микроскопия витальных срезов почки через 1 сутки (А) и 7 суток (Б, В) после 90-минутной тепловой ишемии почки и интрапаренхиматозного введения культивированных фетальных стволовых мезенхимальных костномозговых клеток, меченых кальцеином. Дополнительная окраска срезов флуоресцентным зондом TMRE. Диффузное распространение введенных клеток (зеленая флуоресценция) по интерстицию почки между почечными канальцами (красная флуоресценция). Окрашенная кальцеином клетка находится в стенке почечного канальца (В).

Эти данные совпадают с точкой зрения, находящей все большее распространение, что механизм действия стволовых клеток связан с их паракринным влиянием на окружающие их клетки. При этом рассматриваются два варианта их возможного действия. Первый связан с прямой стимуляцией регенерации сохранившейся эпителиальной выстилки почечных канальцев за счет выделения комплекса факторов роста и цитокинов, а также за счет уменьшения выраженности воспалительной реакции и/или системной иммуномодуляции [Togel F., 2005; Duffield J.B., 2005; Morigi M., 2004; Semedo P. et al., 2007; Bonventre J.V., 2007]. Есть предположение, что введенные экзогенные культивированные фетальные стволовые мезенхимальные костномозговые клетки могут менять микроокружение путем индукции дедифференцировки и пролиферации выживших канальцевых эпителиоцитов [Bussolati B. et al., 2006; 2007; Humphreys B.D. et al., 2006]. Не исключена возможность стимуляции введенными культивированными фетальными стволовыми мезенхимальными костномозговыми клетками резидентных прогениторных клеток почки, которые активно пролиферируя и подвергаясь дифференцировке в зрелые эпителиоциты и, возможно, в другие виды клеток, в свою очередь стимулируют регенерацию сохранившейся эпителиальной выстилки почечных канальцев [Baud L. еt al., 2005; Al-Awgati Q. еt al., 2006; Bussolati B. et al., 2006; 2007; Humphreys B.D. et al., 2007].

Выводы

1. Степень выраженности функциональной недостаточности почки напрямую зависит от глубины повреждения митохондриального аппарата клеток канальцевого эпителия, механизм которого заключается в утрате адекватного ресинтеза АТФ, повышенной продукции активных радикалов кислорода и оксида азота и определяется сроком и условиями ишемического воздействия.

2. Защитное действие умеренного локального охлаждения почки при 40-минутной ишемии связано с сохранением функциональной полноценности митохондриального аппарата клеток почечных канальцев и уменьшением окислительного стресса за счет подавления продукции активных форм кислорода. 

3. Острый пиелонефрит ухудшает функциональное состояние почки в постишемическом периоде преимущественно за счет повышенного образования активных форм кислорода и усиления процессов перекисного окисления мембранных липидов. При хроническом пиелонефрите сохранившиеся функционально полноценные нефроны обладают повышенной устойчивостью к действию острой тепловой ишемии, что обеспечивает незначительное ухудшение функции почек в постишемическом периоде.

4. В качестве средства противоишемической защиты митохондриально-ориентированные антиоксиданты (SkQ-1, SkQR) обладают преимуществом перед клинически апробированными препаратами пентоксифиллином и -токоферолом.

5. Противоишемический эффект лития хлорида наиболее выражен при ишемии не более 60 минут и связан с активацией клеточных адаптогенных механизмов, результатом чего является изменение характера и интенсивности синтеза и распределения оксида азота в митохондриях эпителия почечных канальцев.

6. Тренировочные методы противоишемической защиты почек (ишемическая тренировка почки или гипоксическая тренировка организма) позволяют достоверно повысить функциональную сохранность органа в постишемическом периоде за счет инициации предварительной адаптогенной перестройки клеточного метаболизма. Ишемическая тренировка почки более эффективна в предупреждении ишемического повреждения клубочкового и канальцевого аппаратов нефронов по сравнению с интервальной нормобарической гипоксической тренировкой организма. 

7. Клеточная терапия с использованием культивированных фетальных стволовых и прогениторных клеток человека является эффективным методом лечения хронической и острой почечной недостаточности путем стимуляции регенераторных процессов за счет паракринного действия экзогенно введенных клеток.

8. Введение фетальных мезенхимальных костномозговых клеток человека крысам с острой почечной недостаточностью предупреждало гибель животных от уремии и способствовало восстановлению функциональной полноценности органа как при интрапаренхиматозном введении, так и при их введении в системный кровоток. Внутривенное введение суммарной культуры фетальных почечных клеток крысам с острой почечной недостаточностью повышало выживаемость животных с 0 до 50% с быстрым восстановлением функции ишемизированной почки у выживших животных, тогда как интрапаренхиматозное введение этих клеток оказалось малоэффективно.

9. Внутривенное и интрапаренхиматозное введение как костномозговых мезенхимальных стволовых клеток, так и суммарной культуры почечных клеток крысам с хронической почечной недостаточностью способствует достоверному улучшению функционального состояния поврежденной почки, но при внутривенном введении положительный эффект развивается медленнее (в течение 2 - 4 недель), тогда как при внутрипочечном введении улучшение функциональных показателей происходит уже через 4 дня.

10. Однократное интрапаренхиматозное введение фетальных костномозговых мезенхимальных стволовых клеток при хроническом пиелонефрите приводит к стойкому улучшению функционального состояния почек за счет активации регенераторных процессов, при этом на активность воспалительного процесса оказывается кратковременный эффект.

11. Перспективными для клинического внедрения новыми методами защиты функционально неполноценной почки, способными улучшить ее функциональное состояние и предупредить развитие тяжелых осложнений, связанных с развитием острой или обострением хронической почечной недостаточности, являются методы гипоксической и ишемической тренировки, использование митохондриально-ориентированных антиоксидантов и клеточная терапия.

Практические рекомендации

  1. Разработанная модель развития хронической почечной недостаточности у крыс может быть рекомендована для широкого применений в исследованиях, связанных с изучением механизмов развития хронической почечной дисфункции и разработки методов лечения этого состояния.
  2. Метод лазерной конфокальной микроскопии рекомендуется для изучения патогенеза функциональных нарушений органов мочеполовой сферы, в том числе и в клинической практике, поскольку он дает возможность исследовать  морфологические и биохимические изменения в живой ткани, что, безусловно обладает существенными преимуществами перед традиционными биохимическими исследованиями.
  3. Целесообразна дальнейшая разработка тренировочных методов противоишемической защиты почки (гипоксическая тренировка организма или ишемическая тренировка почки) для их применения в клинической практике с целью профилактики развития почечной недостаточности после операций на почке, требующих пережатия почечных сосудов, при исходно выраженном функциональном дефиците.
  4. Для профилактики постишемических функциональных расстройств почки  целесообразно использование фармакологических препаратов с противоишемическим действием, особенно в сочетании с локальным охлаждением органа. Дальнейшие перспективы связаны с разработкой методики применения митохондриально-ориентированных антиоксидантов, эффективность которых по данным экспериментальных исследований выше, чем у традиционных антиоксидантов.
  5. Активный воспалительный процесс в почке является фактором риска развития почечной недостаточности в послеоперационном периоде, что требует по возможности перевода воспаления в фазу ремиссии, которая существенно не влияет на противоишемическую резистентность почки.
  6. Результаты экспериментальных исследований свидетельствуют о перспективности и необходимости продолжения работы в области клинического использования фетальных стволовых и прогениторных клеток. 

Список публикаций по теме диссертации

  1. Казаченко А.В. Интервальная нормобарическая гипоксическая тренировка в профилактике интраоперационного  ишемического повреждения почек: Экспериментальная урология. Общие вопросы патологии: Сб.н.трудов НИИ урологии / А.В. Казаченко, Е.А Коваленко, В.И.  Кирпатовский.- М.: 1996.- с.163-169.
  2. Казаченко А.В. Интервальная нормобарическая гипоксическая тренировка в профилактике интраоперационного ишемического повреждения почек кроликов / А.В. Казаченко, В.И.  Кирпатовский, Э.К. Яненко, Е.А. Коваленко // Hypoxia Medical J.- 1996. - № 1. – с. 4-8.
  3. Казаченко А.В. Диагностика и профилактика ишемического повреждения почек при оперативном лечении коралловидного нефролитиаза: Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук / А.В. Казаченко. - 1996.-  с .31.
  4. Казаченко А.В. Резистентность почки к тепловой ишемии и  эффективность противоишемической защиты при сопутствующем активном воспалительном процессе в почке: Экспериментальная урология. Общие вопросы патологии: Сб.н.трудов  НИИ  урологии / А.В. Казаченко, Э.К. Яненко, В.И. Кирпатовский, С.А. Голованов, Р.М. Сафаров. –М.: 1996.- с. 56-62.
  5. Казаченко А.В. Эффективность противоишемической защиты почки пентоксифиллином  и альфа-токоферолом: «Экспериментальная урология. Общие вопросы патологии»: Сб.н.трудов НИИ урологии  / А.Ф. Даренков,  В.И. Кирпатовский,  Э.К. Яненко, А.В. Казаченко, В.И. Борисик.  - М.: 1996.-  с. 153-163.
  6. Казаченко А.В. Резистентность почки к тепловой ишемии и эффективность противоишемической  защиты при сопутствующем активном воспалительном процессе в почке (экспериментальное исследование) : Материалы Пленума правления  Всероссийского общества урологов / Э.К. Яненко, А.В. Казаченко, С.А. Голованов.-  Екатеринбург: 1996. -с.222-223.
  7. Казаченко А.В.  Фармакологическая профилактика ишемического повреждения почек при оперативном  лечении коралловидного нефролитиаза : Тезисы докладов / Э.К. Яненко, А.В. Казаченко, В.А. Ноева.-  Бишкек: 1998.- с.91-92.
  8. Казаченко А.В. Сравнительное исследование повышения противоишемической резистентности почек с помощью адаптационной гипоксической тренировки и медикаментозной терапии / В.И.  Кирпатовский, А.В. Казаченко, Э.К. Яненко, Е.А. Коваленко, С.А. Голованов // Бюллютень экспериментальной биологии и медицины.-  1999.- №6.- с. 734-739.
  9. Казаченко А.В.  Современные методы коррекции нарушений микроциркуляции почек при оперативном лечении мочекаменной болезни: Пособие для врачей / Э.К. Яненко, В.И. Кирпатовский, А.В. Казаченко.- М.: 1999.- с. 6.
  10. Казаченко А.В.  Внутривенная клеточная терапия острой и хронической почечной недостаточности в эксперименте / В.И. Кирпатовский, А.В. Казаченко, Е.Ю. Плотников, М.В. Марей, Р.А. Мусина, О.Н. Надточий, Т.А. Конькова, В.В. Дрожжева, Г.Т. Сухих // Клеточные технологии в биологии и медицине.-2001.- № 1.-с. 52-57.
  11. Казаченко А.В. Показатели ПОЛ и ферменты мочи в оценке степени тяжести  интраоперационного повреждение почки: Материалы X Всероссийского съезда урологов / Э.К. Яненко, Н.К. Дзеранов, В.И. Кирпатовский, А.В. Казаченко.- М.: 2002.- с. 649-650.
  12. Казаченко А.В. Сравнительная характеристика диагностики выраженности ишемического повреждения почки по показателям активности перекисного окисления липидов в крови и моче и уровню ферментурии: Сборник научных трудов НИИ урологии / Э.К. Яненко, В.И. Кирпатовский, А.В. Казаченко, С.А. Голованов, В.А. Ноева.- М.: 2002.- с. 14-22.
  13. Казаченко А.В. Современные представления о клеточных механизмах противоишемической резистентности почки и возможностях интраоперационной противоишемической защиты: Обзор литературы / В.И. Кирпатовский, А.В Казаченко, О.Н. Надточий, В.А. Ноева // ВИНИТИ РАН. - 2003.- с. 39.
  14. Казаченко А.В. Резистентность почки к ишемическому повреждению и клеточные механизмы адаптации / В.И. Кирпатовский, А.В. Казаченко, Э.К. Яненко // Урология.- 2004.- № 2.- с. 72-77.
  15. Казаченко А.В. Участите митохондрий в апоптозе клеток почки, индуцированном ишемией/реперфузией / Е.Ю. Плотников, М.Ю. Высоких, А.В. Казаченко, В.И. Кирпатовский, Д.Б. Зоров // Депон. в ВИНИТИ.-2004.-т.12.- № 1638.
  16. Казаченко А.В. Митохондриальная регуляция продукции активных форм кислорода и азота в клетках почки крысы при ишемии/реперфузии / Е.Ю. Плотников, М.Ю. Высоких, Д.В. Цвиркун, А.В. Казаченко, В.И. Кирпатовский, Д.Б. Зоров //  Доклады академии наук.- 2005.-т. 400. -№ 5.- с. 1-4.
  17. Казаченко А.В. Участие митохондрий в окислительном стрессе при ишемии/реперфузии почки: Тезисы международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» / Е.Ю. Плотников, А.В. Казаченко, М.Ю. Высоких, В.И. Кирпатовский, Д.Б. Зоров.- 2005.- с. 271-274.
  18. Kazachenko A.V. Mitochondrial role in oxidative stress under ischemia/reperfusion in the rat kidney / E.Y. Plotnikov, A.V. Kazachenko, M.Y. Vyssokikh, V.I. Kirpatovsky, D.B. Zorov // Biochim Biophys Acta. Bioenergetics. EBEC Short Reports. - 2005.- vol. 14.- № 1757.- р. 477.
  19. Казаченко А.В. Роль генерации митохондриями активных форм кислорода и оксида азота в постишемических расстройствах функции почки / В.И. Кирпатовский, Е.Ю. Плотников, А.В. Казаченко, С.А. Голованов, Е.В. Сыромятникова, М.Ю. Высоких, Д.Б.  Зоров //  Урология.-2006.-№ 4.-с. 19-23.
  20. Казаченко А.В.  Функциональные последствия интрапаренхиматозного введения фетальных стволовых клеток и прогениторных клеток человека при хронической и острой почечной недостаточности у крыс / В.И. Кирпатовский,  А.В. Казаченко, Е.Ю. Плотников, М.В. Марей, Р.А. Мусина, Т.А. Конькова, В.В. Дрожжева, О.Н. Надточий, Г.Т. Сухих // Клеточные технологии в биологии и медицине. - 2006.- № 2.- с. 70-76.
  21. Казаченко А.В. Использование лазерной конфокальной микроскопии для витального исследования биохимических процессов в ткани почек: Материалы XI Всероссийского съезда урологов / А.В. Казаченко, Е.Ю. Плотников, В.И. Кирпатовский, Т.А. Бойко, Д.Б. Зоров.- М.: 2007.-с.471.
  22. Казаченко А.В.. Перспективы использования стволовых клеток в лечении острой и хронической почечной недостаточности / В.И. Кирпатовский, А.В. Казаченко, О.Н. Надточий // Урология.-2007.- № 6. - с. 82-87.
  23. Казаченко А.В.  . Влияние ишемической и гипоксической тренировки на состояние митохондрий и функцию ишемизированных почек / В.И. Кирпатовский, А.В. Казаченко, Е.Ю. Плотников, Т.А. Конькова, В.В. Дрожжева, Д.Б. Зоров // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины .-2007.-т. 143.- № 1.- с. 112-116.
  24. Казаченко А.В. Оксид азота как медиатор адаптогенных и цитотоксических эффектов при ишемии почки / В.И. Кирпатовский, А.В. Казаченко, О.Н. Надточий //  Урология.-2007.- № 1.-с. 71-75.
  25. Казаченко А.В.  Применения клеточных технологий для лечения хронической  почечной недостаточности (экспериментальная работа) / Н.А. Лопаткин, В.И. Кирпатовский, А.В. Казаченко, Е.Ю. Плотников, М.В. Марей, В.В. Дрожжева, Г.Т. Сухих // Урология.-2007.- № 3.- с. 3-7.
  26. Казаченко А.В. Механизмы развития почечной недостаточности при ишемии/реперфузии и способы ее предотвращения: Тезисы международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» / Е.Ю. Плотников, А.К. Васильева, А.В. Казаченко, В.И. Кирпатовкский, Д.Б. Зоров.- 2007.- с. 375-377.
  27. Казаченко А.В. Механизмы развития почечной недостаточности при ишемии/реперфузии и способы ее предотвращения: Тезисы 11-ой Пущинской конференции молодых ученых “Биология — наука 21-го века” / А.К. Васильева, Е.Ю. Плотников, А.В. Казаченко, В.И. Кирпатовский, Д.Б. Зоров.-2007.-с. 234.
  28. Казаченко А.В.  Возможности использования фетальных соматических стволовых и прогениторных клеток в терапии острой почечной недостаточности / Г.Т. Сухих, В.И. Кирпатовский, А.В. Казаченко, Е.Ю. Плотников // Здравоохранение и медицинские технологии.-2007.- №1.-с. 12-15.
  29. Казаченко А.В. Терапевтический эффект трансплантации стволовых и прогениторных клеток человека крысам с хронической и острой почечной недостаточностью : Материалы XI Всероссийского съезда урологов / В.И. Кирпатовский, А.В. Казаченко, Е.Ю. Плотников, С.А. Голованов, В.В. Дрожжева, Г.Т. Сухих.- М.: 2007.-с.473.
  30. Kazachenko A.V.The role of mitochondria in oxidative and nitrosative stress during ischemia/reperfusion in the rat kidney / E.Y Plotnikov, A.V. Kazachenko, M.Y. Vyssokikh, A.K. Vasileva, D.V. Tcvirkun, N.K. Isaev, V.I. Kirpatovsky, D.B. Zorov // Kidney International.- 2007.-  vol.72.- № 12.-p.1493–1502.
  31. Kazachenko A.V.  Glycogen synthase kinase-3 inhibitors Li+ and insulin prevent mitochondrial dysfunction and cell death in rat kidney after ischemia/reoxygenation (I/R) / A.K. Vasileva, E.Y. Plotnikov, A.V. Kazachenko, V.I. Kirpatovsky, D.B. Zorov  // FEBS J.- 2007.-vol  274.- № S1.- p. 205.
  32. Казаченко А.В.  Производное пластохинона, адресованное в митохондрии, как средство, прерывающее программу старения. Терапия некоторых старческих патологий, опосредованных АФК (сердечной аритмии, инфарктов сердца и почки и инсульта головного мозга) / Л.Е. Бакеева, И.В. Барсков, М.В. Егоров, Н.К. Исаев, В.И. Капелько, А.В. Казаченко, В.И. Кирпатовский, С.В. Козловский, В.Л. Лакомкин, С.В. Левина, О.И. Писаренко, Е.Ю. Плотников, В.Б. Сапрунова, Л.И. Серебрякова, М.В. Скулачев, Е.В. Стельмашук, И.М. Студнева, О.В. Цкитишвили, А.К. Васильева, И.В. Викторов, Д.Б. Зоров, В.П. Скулачев //  Биохимия.- 2008.-т. 73.-№12.-с.1607-1621.
  33. Казаченко А.В. Влияние митохондриально-ориентированных антиоксидантов на экспериментальную острую почечную недостаточность: Международный междисциплинарный симпозиум «От экспериментальной биологии к превентивной и интегративной медицине» / Е.Ю. Плотников,  А.В. Казаченко, В.И. Кирпатовский, А.К. Васильева, Д.Б. Зоров.- Судак: 2008.-  с. 109-110.
  34. Казаченко А.В. Оценка функциональных последствий интрапаренхиматозного введения фетальных стволовых клеток человек при ОПН у крыс : Сборник трудов I пленума Научного Общества урологов Узбекистана / А.В. Казаченко, В.И.Кирпатовский, Е.Ю.Плотников, Г.Т.Сухих.- Ташкент: 2008.- с.348-350.
  35. Казаченко А.В. Восстановление функции почки при интрапаренхиматозном и внутривенном введении стволовых и прогениторных клеток при хронической и острой почечной недостаточности: Международный междисциплинарный симпозиум «От экспериментальной биологии к превентивной и интегративной медицине» / А.В. Казаченко, В.И. Кирпатовский, Е.Ю. Плотников, М.В. Марей,  Ю.В. Кудрявцев, Т.Г. Хряпенкова, Д.Б. Зоров, Г.Т. Сухих.- Судак: 2008.-с. 68-69.
  36. Казаченко А.В. Роль активных форм кислорода и азота в патогенезе острой почечной недостаточности: Тезисы IV Съезда Российского общества биохимиков и молекулярных биологов / Е.Ю. Плотников, А.А. Чупыркина, А.К. Васильева, А.В. Казаченко, В.И. Кирпатовский, Д.Б. Зоров.- Новосибирск: 2008.- с. 474.
  37. Казаченко А.В. Терапия острой и хронической почечной недостаточности ксеногенными фетальными стволовыми и прогениторными клетками в эксперименте: Тезисы IV Всероссийского съезда трансплантологов / В.И. Кирпатовский, А.В. Казаченко, Е.Ю. Плотников, М.В. Марей,  Р.А. Мусина, Д.Б. Зоров, Г.Т. Сухих.- М.: 2008.- с.248-249.
  38. Казаченко А.В. Трансплантация фетальных стволовых и прогениторных клеток человека крысам с хронической и острой почечной недостаточностью : Сборник трудов I пленума Научного Общества урологов Узбекистана / В.И. Кирпатовский, А.В. Казаченко, Е.Ю. Плотников, О.Н. Надточий, Г.Т. Сухих.-  Ташкент: 2008.- с.350-351.
  39. Казаченко А.В. Функциональный эффект трансплантации фетальных стволовых и прогениторных клеток человека крысам с хронической и острой функциональной недостаточностью почек: Материалы Межрегиональной конференции «Современные вопросы урологии, андрологии, репродуктивной медицины» / А.В. Казаченко, В.И. Кирпатовский, Н.К. Дзеранов, Е.Ю. Плотников.-Новосибирск:2008.-  с. 121-122.
  40. Kazachenko A.V. The role of reactive oxygen and nitrogen species in the pathogenesis of acute renal failure / E.Y. Plotnikov, A.A. Chupyrkina, A.K. Vasileva, A.V. Kazachenko, V.I. Kirpatovsky, D.B. Zorov // Biochim Biophys Acta. Bioenergetics. EBEC Short Reports.-2008.- № 1777.- р. 58-59.
  41. Казаченко А.В. Использование лазерной конфокальной микроскопии для изучения патогенеза ишемического повреждения почки. Фундаментальные исследования в уронефрологии: Российский сборник научных трудов с международным участием / А.В. Казаченко, В.И. Кирпатовский, Ю.В. Кудрявцев, Е.В. Сыромятникова, Е.Ю. Плотников, Д.Б. Зоров; под редакцией член-корр. РАМН, проф. П.В. Глыбочко. – Саратов: Изд-во СГМУ, 2009.-с. 328-329.
  42. Казаченко А.В. Использование митохондриально-ориентированных антиоксидантов для профилактики постишемической острой почечной недостаточности. Фундаментальные исследования в уронефрологии: Российский сборник научных трудов с международным участием / В.И. Кирпатовский, Н.К. Дзеранов, А.В. Казаченко, С.А. Голованов, В.В. Дрожжева, Е.Ю. Плотников, Д.Б. Зоров; под редакцией член-корр. РАМН, проф. П.В. Глыбочко. – Саратов: Изд-во СГМУ, 2009.-с. 331-332.
  43. Казаченко А.В. Использование фетальных костномозговых мезенхимальных стволовых клеток в терапии острой и хронической почечной недостаточности в эксперименте. Фундаментальные исследования в уронефрологии: Российский сборник научных трудов с международным участием / О.И. Аполихин, В.И. Кирпатовский, А.В. Казаченко, Ю.В. Кудрявцев, С.А. Голованов, О.Н. Надточий, Е.Ю. Плотников, М.В. Марей, Р.А. Мусина, Д.Б. Зоров, Г.Т. Сухих; Под редакцией член-корр. РАМН, проф. П.В. Глыбочко. – Саратов: Изд-во СГМУ, 2009.-с. 321.
  44. Казаченко А.В. Механизм действия и противоишемическая эффективность хлористого лития / А.В. Казаченко, Н.К. Дзеранов, Е.Ю. Плотников, С.А. Голованов, Д.Б. Зоров, В.И. Кирпатовский //  Урология.-2009.- № 4.-с. 19-24.
  45. Казаченко А.В. Морфологические изменения в почках крыс с острой постишемической почечной недостаточностью после внутрипочечного введения фетальных мезенхимальных стволовых клеток костного мозга человека / Ю.В. Кудрявцев, В.И. Кирпатовский, Е.Ю. Плотников,  А.В. Казаченко, М.В. Марей, Т.Г. Хряпенкова, Д.Б. Зоров, Г.Т. Сухих //  Клеточные технологии в биологии и медицине.-2009.- № 1.-с. 3-9.



© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.