WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

 

На правах рукописи

КАЩЕЕВА

Татьяна Константиновна

ПРЕНАТАЛЬНЫЙ БИОХИМИЧЕСКИЙ  СКРИНИНГ

СИСТЕМА, ПРИНЦИПЫ, КЛИНИКОДИАГНОСТИЧЕСКИЕ КРИТЕРИИ, АЛГОРИТМЫ

14.00.46 – клиническая лабораторная диагностика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Санкт-Петербург – 2009

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта  Северо-Западного отделения  РАМН

Научный консультант:

заслуженный деятель науки РФ

член-корреспондент РАМН

доктор медицинских наук профессор        Баранов  Владислав  Сергеевич        

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук профессор Слозина Наталия Михайловна

доктор биологических наук профессор  Золотухина Татьяна Владимировна

доктор медицинских наук профессор Козлов Антон Владимирович

Ведущая организация:

ГОУ ВПО Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова Росздрава

Защита состоится 8 октября 2009 г. в 14 часов на заседании диссертационного совета  Д 205.001.01 при Федеральном государственном учреждении здравоохранения «Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины им. А.М. Никифорова» МЧС России по адресу: 194044, Санкт-Петербург, ул. Лебедева, д.4/2

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного учреждения здравоохранения «Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины им. А.М.Никифорова» МЧС России

Автореферат разослан  «…..»  ………..2009 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета                                                М.В.Санников        

                       ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Профилактика рождения детей с наследственной и врожденной  патологией  является  главной задачей службы пренатальной диагностики (ПД). При этом внимание сосредоточено на  выявлении болезни Дауна как наиболее распространенной хромосомной патологии, совместимой не только с живорождением, но и приводящей к тяжелой инвалидизации в постнатальном периоде.  Известно, что риск рождения ребенка с синдромом Дауна (СД) увеличивается с возрастом женщины. Однако  2/3 детей с синдромом Дауна рождаются у матерей моложе 35 лет, поскольку подавляющее число (92 % по итогам 2006 г.) родов приходится именно на эту группу беременных. В настоящее время эффективным методом формирования групп высокого риска для ПД хромосомных болезней является комплексный ультразвуковой (УЗ) и биохимический скрининг (БС) [Баранов В.С. и др., 2002; Юдина Е.В., Медведев М.В., 2002]. В зарубежной литературе достаточно полно освещены вопросы проведения и эффективности (как с медицинской, так и с экономической точки зрения) биохимического скрининга во втором триместре беременности [Benn Р., 2002]. Наибольшая эффективность скринирующих программ, основанных на статистическом анализе большого числа  косвенных признаков патологии плода,  достигается при максимальном охвате беременных, при так называемом  тотальном (массовом) обследовании [Николаидес К., 2007].  Отдельные отечественные работы касаются биохимического скрининга во 2-м триместре [Золотухина Т.В. и др., 1994, 1998]. Однако массовый скрининг беременных с целью формирования группы высокого риска хромосомной патологии в городах РФ только начинает проводиться, и параметры распределения уровня маркерных белков сыворотки крови для дифференциации нормы и патологии среди беременных РФ неизвестны. Использование  результатов БС  беременных, находящихся в иных географических и социальных условиях, приводит  к увеличению группы риска или к снижению чувствительности метода. Важным аспектом биохимического скрининга является то, что отклонения маркерных белков могут служить прогностическим признаком неблагоприятного течения беременности. Следовательно, массовый  БС беременных в соответствующие сроки позволяет выявлять женщин группы высокого риска не только по хромосомным болезням у плода, но и по акушерской патологии [Гагарина А.В. и др., 2005; Crossley J.A. et al., 2006].

Результаты скрининговых исследований в 1 триместре беременности, хотя и обсуждаются в литературе более 10 лет,  носят противоречивый характер и в разных зарубежных центрах их эффективность оценивается по-разному [Wald N.J. et al., 1997; Cuckle H., van Lith J.M., 1999]. В РФ массовый скрининг в 1 триместре беременности не проводится. Рекомендации, тактика  и оптимальные условия проведения биохимического скрининга в 1 триместре и комбинированного биохимического и  ультразвукового скрининга не разработаны.  Нормативные значения и параметры  распределений биохимических маркеров 1 триместра для беременных РФ и, в частности, Северо-Западного региона России отсутствуют [Некрасова Е.С. и др., 2003; 2005].

Таким образом, данные, имеющиеся в литературе, носят фрагментарный, иногда противоречивый  характер, а рекомендации по организации и проведению биохимического скрининга не конкретизированы. До сих пор не разработана система массового биохимического скрининга, объединяющая усилия специалистов разного профиля в мониторинге беременных и решении проблемы профилактики врожденных пороков развития (ВПР), что и определяет актуальность  исследования.

Цель исследования: разработать систему, принципы, клинико-диагностические критерии и алгоритмы пренатального биохимического скрининга, эффективного для выявления женщин группы высокого риска  по рождению детей с ВПР и/или хромосомными болезнями, а также по осложненному течению беременности.

Задачи исследования:

  1. Разработать клинико-диагностические критерии проведения пренатального биохимического скрининга при сроке  9-13 и 15-17 недель беременности.
  2. Предложить алгоритмы обследования беременных с помощью разработанных критериев и показать их эффективность при формировании групп высокого риска  врожденных  пороков развития плода.
  3. Разработать систему пренатального биохимического скрининга беременных с использованием автоматизированных программ расчета индивидуального риска рождения ребенка с синдромом Дауна.
  4. Сравнить эффективность  массового биохимического скрининга 1-го и 2-го триместров беременности  и определить оптимальные алгоритмы взаимодействия ЛПУ первичного звена и специалистов медико-генетической службы при  обследовании  беременных, в зависимости от  срока постановки пациентки  на учет в женскую консультацию.
  5. Провести клинические испытания разработанных отечественных тест-систем для определения маркерных сывороточных белков  и определить параметры распределения их уровней для использования  в пренатальном биохимическом скрининге.
  6. Разработать  и внедрить автоматизированную программу расчета риска синдрома Дауна у плода по результатам  исследования биохимических маркеров  при сроке  9–13 и/или 15–17 недель беременности и ультразвуковых  маркеров  в 11–13 недель  с расчетом суммарного индивидуального риска.
  7. Проанализировать корреляцию  уровня  сывороточных маркеров в  скрининговые сроки с различными осложнениями течения беременности у пациенток с нормальным кариотипом плода.

Научная новизна и теоретическая значимость. Впервые в массовом скрининге определены параметры распределения содержания альфа-фетопротеина (АФП) и хориального гонадотропина человека (ХГЧ) во 2-м триместре беременности в норме и при синдроме Дауна у плода для жительниц РФ. Разработаны  собственные клинико-диагностические критерии  биохимического скрининга на содержание АФП и ХГЧ с использованием оригинальной программы автоматизированного расчета риска. Впервые изучены параметры распределения  уровня плазменного ассоциированного с беременностью белка А (РАРР-А) и  свободной -субъединицы ХГЧ (своб. -ХГЧ)  в крови беременных РФ в норме и при синдроме Дауна у плода. Показана эффективность использования комбинированного ультразвукового и биохимического скрининга при сроке  9-13 недель для выявления беременных высокого риска рождения детей с  синдромом Дауна. Предложена  автоматизированная программа расчета индивидуального риска, основанная на принципе использования имеющихся у беременной результатов скрининговых исследований в 1-м и 2-м триместрах беременности для определения суммарного риска рождения ребенка с синдромом Дауна.  Предложена оригинальная формула расчета суммарного риска беременной по результатам скрининга в 1-м и 2-м триместрах. Разработан  алгоритм поэтапного (контингентного) пренатального скрининга с уточнением индивидуального риска по результатам исследования АФП и ХГЧ у беременных с пограничными результатами комбинированного скрининга в 1-м триместре.

Практическая значимость. Разработана методика получения нормативных значений для тест-систем различных производителей  и впервые получены медианы АФП, ХГЧ во 2-м триместре беременности  для жительниц России  с применением реагентов основных зарубежных поставщиков.  Нормативные значения и параметры распределения исследованных сывороточных маркеров могут служить основой для внедрения биохимического скрининга с целью профилактики ДЗНТ и синдрома Дауна в практику работы медико-генетических консультаций и клинико-диагностических лабораторий РФ. Разработанные клинико-диагностические критерии и алгоритмы  взаимодействия лечебно-профилактических учреждений первичного звена, медико-генетической службы и Федерального медико-генетического центра при проведении массового биохимического скрининга беременных могут применяться в различных по численности населения регионах. Предлагаются  разные формы организации скрининга в зависимости от числа лабораторий, их оснащенности и удаленности от кабинета генетика и центра пренатальной диагностики. Предложенные упрощенная и автоматизированная  методики  расчета суммарного индивидуального риска рождения ребенка с синдромом Дауна могут применяться в соответствии с диагностическими возможностями  лабораторий или  центров  медико-генетической службы.

Внедрение в практику. Результаты работы более десяти лет используются в практической деятельности лаборатории пренатальной диагностики наследственных и врожденных болезней человека НИИАГ им. Д.О.Отта СЗО РАМН (Санкт-Петербург), Санкт-Петербургского городского диагностического центра (медико-генетического), а также в работе Медико-генетической консультации г. Петрозаводска. С помощью разработанных программных средств осуществляется массовый биохимический скрининг  беременных гг. Норильска, Благовещенска, Тверской и Калининградской областей. Результаты работы используются также отдельными лабораториями  и  диагностическими  центрами ряда других городов РФ. 

Положения, выносимые на защиту:

1.  Проведение  массового биохимического скрининга в 15-17 недель беременности позволяет эффективно сформировать группу женщин высокого риска по рождению детей с некоторыми  пороками развития и/или синдромом Дауна у плода.  Высокая чувствительность выявления синдрома Дауна (до 74%) определяется  корректностью установления нормативных значений и параметров распределения уровня сывороточных маркеров для жительниц  обследуемого  региона. 

2.  Биохимический скрининг с расчетом индивидуального риска рождения ребенка с синдромом Дауна в  9-13 недель беременности в полтора раза повышает чувствительность выявления  плодов с синдромом Дауна у беременных моложе 35 лет по сравнению со скринингом во 2-м триместре.  Общая чувствительность комбинированного скрининга превышает 90% и определяется корректностью оценки сроков беременности, установления  нормативных значений (медиан) и параметров распределения биохимических (РАРР-А, своб. -ХГЧ) и ультразвуковых маркеров – толщины воротникового пространства (ТВП).

3. Взаимодействие специалистов УЗД, медико-генетической службы и стандартизация определения срока беременности и величины ТВП приобретает особое значение  в  1-м триместре в  связи со значительной корреляцией содержания биохимических маркеров и срока беременности.

4. Постоянный контроль девиации нормативных значений (медиан)  биохимических маркеров, их корректировка при необходимости  и анализ всех случаев пре- и постнатального выявления синдрома Дауна являются обязательными элементами системы мониторинга беременных и определяют качество биохимического скрининга. 

Апробация работы  и публикация материалов исследования.

По теме диссертации опубликовано  65 работ,  среди них 2 главы в монографиях, 7 учебно-методических пособий и руководств  для врачей и специалистов по  лабораторной диагностике и  24 статьи, включая 9  статей в изданиях, определенных перечнем ВАК.

Результаты исследований доложены и обсуждены на расширенном заседании коллектива лаборатории пренатальной диагностики НИИАГ им. Д.О. Отта РАМН, на 1 и 3 съездах медицинских генетиков России (Курск, 1994; Москва, 1997); на Международном форуме «Мать и дитя» (Москва, 2001, 2003, 2005); на  Всероссийской научно-практической конференции «Современные достижения клинической генетики» (Москва, 2003); на II Международном конгрессе «Невский радиологический форум-2005» (Санкт-Петербург, 2005);  на научно-практической конференции по профилактике ВПР в Кемеровской области (Кемерово, 2005); на  Всероссийской конференции с международным участием по пренатальному скринингу  (Санкт-Петербург, 2006); на Всероссийской конференции по перинатальному скринингу и пренатальной диагностике (Санкт-Петербург, 2007); на 2-м Российском Форуме «Здоровье детей: профилактика социально-значимых заболеваний» (Санкт-Петербург, 2008); на научном семинаре главных акушеров-гинекологов Тверской области (Тверь, 2008); на международном научно-практическом симпозиуме «Современные достижения в пренатальной диагностике» (Донецк, 2008); на научно–практической конференции «Профилактика врожденной и наследственной патологии у детей», посвященной 20-летию МГК  ГУЗ «Республиканская больница им. В.А. Баранова»  МЗ и СР Республики Карелия  (Петрозаводск,  2008);  на IV съезде медицинских генетиков Украины (Львов,  2008);  на 2-ой конференции по пренатальной диагностике PECO-EUCROMIC (Будапешт, 1997; Прага, 1999); на Международном семинаре по клинической генетике (Афины, 2004);  на Международных Европейских и Всемирных съездах по  генетике человека (Вена, 2001; Бирмингем, 2003; Мюнхен, 2004; Ницца, 2007; Барселона, 2008; Ванкувер, 2008);  на  6, 7 и 8-м Международных конгрессах IDSSG  (Лондон,  2003; Амстердам,  2006; Ванкувер, 2008).

Связь с темами НИР. Исследование выполнялось в соответствии с плановой тематикой научно-исследовательских работ ГУ НИИАГ им. Д.О.Отта РАМН (рег. № 0120.0  602510).

Личный вклад автора.  Автором  лично выполнены  биохимические исследования содержания  сывороточных маркеров в  крови более 10 тысяч пациенток в 1 и 2-м триместрах;  разработаны нормативные значения уровня  шести сывороточных маркеров у беременных;  собраны коллекции образцов крови пациенток с известными сроками и исходами беременности для  установления нормативных значений маркеров;  проведены  клинические испытания  отечественных реагентов; выполнена статистическая обработка, анализ полученных  данных  и обобщение результатов исследований; разработаны алгоритмы пренатального биохимического скрининга беременных в 1-м и 2-м триместре; условия проведения биохимического скрининга в диагностических центрах, не входящих в медико-генетическую службу города; поставлены задачи по созданию и предложены алгоритмы автоматизированных программ  расчета индивидуального риска  рождения ребенка с синдромом Дауна для различных сочетаний биохимических и ультразвуковых маркеров, определенных до 18 недель беременности. 

       Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 306 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 4 глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы и приложений. Работа иллюстрирована 101 таблицей и 30 рисунками. Список литературы содержит 355 наименований, в том числе 40 отечественных  и  315 иностранных источников.

СОДЕРЖАНИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

  1. Материалы и методы

       Для решения задач, поставленных в настоящей работе, использован  весь арсенал методов,  применяемых в пренатальной диагностике  для отбора беременных женщин групп высокого риска врожденной и наследственной (хромосомной) патологии у детей и набор специальных лабораторных методов исследования. Последние включали  следующие основные  методы:

  1. Биохимическое, иммунохимическое, иммунофлуоресцентное исследование эмбриональных маркерных сывороточных белков. 
  2.   Методы ультразвуковой диагностики (ультразвуковая фетометрия).
  3. Цитогенетические методы исследования  биоптатов  хориона и плаценты, полученных при помощи хорионбиопсии, плацентобиопсии, или образцов пуповинной крови, полученных с помощью кордоцентеза.

       В работе применялись математические методы расчета риска рождения ребенка с болезнью Дауна и методы  статистической обработки результатов.

  Материалом для исследования служили образцы венозной крови  63463 беременных, взятые у пациенток  в сроке  14 недель 0 дней – 20 недель 6 дней  в  женских консультациях и  в  НИИАГ им. Д.О.Отта РАМН по направлению врача-генетика в рамках биохимического скрининга на наличие хромосомной патологии и врожденных пороков развития плода в 2000-2003 гг.  80 % исследований проводилось в биохимической лаборатории  Санкт-Петербургского городского диагностического центра (медико-генетического). 20 %  исследований крови беременных осуществлялось в лаборатории пренатальной диагностики наследственных заболеваний человека НИИАГ им. Д.О.Отта РАМН. Для установления медиан содержания  сывороточных маркеров в 1 триместре беременности исследовались 5720 образцов венозной крови пациенток в сроке 8 недель 0 дней – 13 недель 6 дней беременности, наблюдавшихся в НИИАГ им. Д.О.Отта РАМН в 2003–2007 гг., и  2748 образцов венозной крови пациенток, обследованных в рамках биохимического скрининга в 9–13 недель беременности в Санкт-Петербургском городском диагностическом центре (медико-генетическом).

        Клинические  исследования  уровня сывороточных маркеров в образцах крови с использованием различных тест-систем осуществлялись в лаборатории пренатальной диагностики наследственных заболеваний человека НИИАГ им. Д.О.Отта в 2007-2008 гг. Использовались  образцы свежей венозной крови, а также аликвоты образцов, измеренных в ходе пренатального биохимического скрининга, хранившиеся при -20°-70С  не более 6 месяцев и  размороженные не более 2-х раз. Концентрацию АФП и ХГЧ определяли твердофазным иммуноферментным методом с использованием тест-систем  «ИФА-АФП-1» и «ГонадотропинИФА-ХГЧ-1», производства ООО «Алкор Био» (Санкт-Петербург). Определение содержания инг А проводилось с помощью тест-систем Inhibin A ELISA DSL-10-28100, НЭ - с помощью тест-систем  Estriol uncon  ELISA DSL-10-3700 производства  США, поставщик группа компаний «Биохиммак» (Москва).  Определение АФП, общего ХГЧ, плазменного ассоциированного с беременностью белка А (РАРР-А) и свободной бета-субъединицы ХГЧ осуществляли также методом ИФА с помощью тест-систем ООО «Хема» (Москва). Определение  содержания  свободной бета-субъединицы хориального гонадотропина, НЭ и  РАРР-А проводили твердофазным двухсайтовым иммунофлуоресцентным методом с применением непрямой сендвич-методики  с использованием  тест-систем DELFIA free-beta-HCG, DELFIA Unconjugated Estriol  и  DELFIA РАРР-А производства  Wallac/Perkin Elmer Life and Analytical Sciences, Финляндия (поставщик фирма «Приборы», Москва). Определение концентрации своб. –ХГЧ, РАРР-А и НЭ по стандартной калибровочной кривой проводили с использованием автоматической программы «MultiCalc». Уровни маркеров выражали в единицах МоМ путем деления измеренного значения на медиану для данного срока беременности. Для приготовления препаратов метафазных хромосом клеток плода использовали «прямой» метод, разработанный в Лаборатории пренатальной диагностики наследственных и врожденных болезней человека НИИАГ им. Д.О.Отта РАМН [Кузнецова Т.В. и др., 2006]. Постнатальное кариотипирование  детей с СД проводилось стандартным методом цитогенетического анализа лимфоцитов периферической крови новорожденных в цитогенетической лаборатории СПбДЦ(МГ) и  НИИАГ им. Д.О.Отта РАМН. Все фетометрические исследования проведены на ультразвуковых диагностических приборах  фирмы  «ALOKA» (Япония) модели SSD-2000, оснащенных всеми типами датчиков, используемых в акушерских исследованиях. Все измерения проводились в соответствии с  положениями Приказа  МЗ РФ № 457 от 28.12.2002  и рекомендациями Фонда фетальной медицины [Николаидес К., 2007]. 

Риск рождения ребенка с синдромом Дауна во 2-м триместре рассчитывался с помощью оригинальной программы  «Программа мониторинга синдрома Дауна», разработанной в Санкт-Петербурге в 1999-2000 годах при поддержке ООО «Алкор Био» специалистами ООО «Интеллектуальные программные системы» (Санкт-Петербург) совместно со специалистами лаборатории пренатальной диагностики НИИАГ им. Д.О.Отта  РАМН и  применяющейся в медико-генетической службе города с  2001 года.  Во 2-м триместре к группе беременных  высокого риска рождения детей с хромосомной патологией относили пациенток при риске более  чем 1 на 360 (0,28 %) [Кащеева Т.К. и др., 2002].  В группу риска по наличию хромосомной патологии плода были включены и женщины, у которых отмечалось одновременное снижение содержания обоих сывороточных белков более чем  в два раза относительно нормы.

Для расчета риска рождения ребенка с хромосомной патологией  с учетом возраста матери, данных анамнеза, УЗИ и концентрации обоих сывороточных белков в 1 триместре  использовалась программа «Life Cycle» (Wallac/Perkin Elmer Life & Analytical  Science, Turku, Finland), поставщик ООО «Приборы» (Москва). К группе беременных высокого риска рождения детей с хромосомной патологией относили пациенток при риске более чем 1 на 250.  В группу риска по наличию хромосомной патологии плода были включены также женщины, у которых отмечалось одновременное снижение обоих сывороточных белков более чем  в два раза относительно нормы.  Результаты исследования обработаны на IBM PC  Pentium 4 при помощи программы SPSS 16.        Сравнение различных данных проведено с использованием критерия Стъюдента, Колмогорова-Смирнова и Пирсона (χ2). Различия признаков считались достоверными при 95% уровне значимости (p<0,05). Взаимосвязи различных признаков определяли при помощи корреляционного анализа, оценку значимости которого проводили при помощи общепринятых таблиц. При анализе зависимости различных показателей использовали линейные и нелинейные методы множественного регрессионного анализа.  Определение вклада каждого маркера в дифференциацию нормы  и  патологии проводили методом дискриминантного анализа.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

       1. Медианы содержания  АФП и ХГЧ в крови жительниц Санкт-Петербурга в норме были уточнены по результатам  исследования  более 50 тысяч образцов крови  пациенток  при сроке 14–20 недель беременности. В таблицах  1 и 2 приведены параметры распределения относительной концентрации сывороточных маркеров  во 2-м триместре беременности в норме. В 1999-2000 годах  в ГУ НИИАГ им. Д.О. Отта РАМН совместно c ООО «Мединформатика» (в настоящее время ООО «Интеллектуальные программные системы» (Санкт-Петербург)) была  разработана и внедрена оригинальная компьютерная программа автоматического расчета риска болезни Дауна у плода («Программа мониторинга синдрома Дауна», ПМСД) по результатам скрининга уровня АФП и ХГЧ во 2-м триместре  у беременных Санкт-Петербурга. Алгоритм обследования (рис. 1) основан на  подсчете отношения правдоподобия, то есть  вероятности,  что результаты данной беременной принадлежат к нормальному распределению маркеров, а не к распределению для плодов с СД.  Отношение правдоподобия вычисляется следующим образом:  частоту встречаемости данного уровня маркера  в  распределении для плодов с СД делят на  частоту встречаемости  данного уровня в крови беременных с нормальным кариотипом плода. Распределение уровня сывороточного маркера в норме и распределение того же маркера при СД у плода характеризуются двумя параметрами: положением максимума распределения (медианой - М) и «шириной» распределения (стандартным отклонением - СО), разница между нормой и патологией определяется сдвигом медиан. Вычисление индивидуального риска возможно только после определения параметров распределений. Распределения уровня АФП (МоМ) и ХГЧ (МоМ) были предварительно построены для каждой недели беременности в используемом диапазоне сроков и после их логарифмической трансформации были определены параметры  нормальных значений  маркеров (рис. 2).

Таблица 1. Медианы содержания АФП и стандартное отклонение натурального логарифма АФП (МоМ) в крови беременных Санкт-Петербурга с 14 по 20-ю неделю беременности.

Срок беременности (нед.)

АФП (нг/мл)

Стандартное отклонение

ln АФП (MoM)

Число

образцов

14

33,22

0,4270

3112

15

37,71

0,4056

17502

16

42,57

0,4032

22734

17

48,48

0,3991

12521

18

52,63

0,4194

4950

19

55,36

0,4405

1483

20

56,90

0,5081

506

Среднее значение

0,4290

Таблица 2. Медианы содержания ХГЧ, коэффициенты корреляции и стандартное отклонение натурального логарифма ХГЧ (МоМ) в крови беременных СПб с 14 по 20-ю неделю беременности.

Срок беременности (нед.)

ХГЧ (ед/мл)

Коэффициенты

корреляции с АФП

Стандартное отклонение

ln ХГЧ (MoM)

Число

образцов

14

55,42

0,0170

0,6020

3112

15

48,11

0,0501

0,5795

17502

16

41,01

0,0962

0,5779

22734

17

34,67

0,1169

0,5800

12521

18

31,15

0,0722

0,6053

4950

19

29,13

0,0004

0,6451

1483

20

29,00

0,0000

0,6764

506

Среднее значение

0,0589

0,6095

Ниже приведены величины  стандартного отклонения (СО) для АФП и ХГЧ, полученные в нашем исследовании. Рядом указаны величины СО, применяемые в расчетах риска в Англии [Cuckle et al., 1995] (табл. 3). Ввиду однородности  населения Санкт-Петербурга в 1997 году параметр «этническая принадлежность» не вводили. Во второй версии программы в 2008 году авторами введена возможность учета этнического фактора в связи с растущим  числом обращений  беременных  иного происхождения (в основном азиатского). Из  литературных  данных следует, что у беременных других рас существуют смещения медиан сывороточных маркеров относительно европейских нормативных значений [Wald N.J. et al., 1998].  По мере исследования образцов крови беременных других этнических групп необходимо уточнять поправки и наличие смещения в среднем уровне сывороточных маркеров. 

Показанием для применения инвазивной ПД с целью кариотипирования плода, являлся  риск выше, чем 1:360 (0,28%). В нашем алгоритме был выбран пороговый  риск, соответствующий риску рождения ребенка с СД у женщины, которая должна родить в  35 лет и 9 месяцев.

Рис. 1.  Схема обследования беременных Санкт-Петербурга  при сроке  15-18 недель на содержание АФП и ХГЧ.

  Таблица 3.  Среднее стандартное отклонение  десятичного логарифма АФП и ХГЧ (в единицах МоМ)  и коэффициенты корреляции, рассчитанные для нормальной беременности.

Санкт-Петербург (1997)

Cuckle et al. (1995)

Маркер

СО

Коэффициент корреляции

СО

Коэффициент корреляции

АФП

0,1774

0,0589

0,1650

0,1220

ХГЧ

0,2543

0,0589

0,2470

0,1220

       Как и следовало ожидать из сдвига распределений уровня маркеров в норме и патологии, при снижении порогового риска чувствительность возрастает (табл. 4), однако, одновременно возрастает и число ложноположительных результатов (ЛПР).  Таким образом, с целью повышения чувствительности скрининга до 74% мы заведомо пошли на увеличение числа ЛПР до 6,7%.

Таблица 4. Выявляемость плодов с синдромом Дауна в зависимости от порогового риска при  биохимическом скрининге в 15-18 недель беременности (N = 255)

Пороговый риск рождения ребенка с СД

Выявляемость (%)

(число выявленных плодов с СД / общее число плодов с СД у обследованных женщин)

1/360 (0,28 %)

74,5  (190/255)

1/250 (0,40 %)

63,9  (163/255)

1/200 (0,50%)

57,6  (147/255)

Единственным  способом оценки риска в массовом скрининге является автоматизированный расчет риска рождения ребенка с СД, учитывающий все  факторы, изменяющие концентрацию маркеров в крови беременных.  При создании программного средства применялись стандартные математические методы и полученные на первом этапе массового скрининга экспериментальные данные.

       Статистическая обработка результатов показала, что согласно критерию Колмогорова-Смирнова  распределение АФП (МоМ) в логарифмическом масштабе соответствует Гауссову закону  со средним значением логарифма АФП, равным 0,000 и медианой, равной  - 0,0135. Распределение ХГЧ так же соответствует нормальному закону, среднее значение логарифма ХГЧ равно  0,000 и медиана равна 0,001 (рис. 2). На рисунке  4 приведена  динамика медиан АФП и ХГЧ  при нормальном кариотипе плода по кварталам 2002-2003 годов  по результатам нашего исследования  для тест-систем производства ООО «Алкор Био» (Санкт-Петербург).  Каждая точка соответствует исследованию более 6500 образцов крови в квартал (диапазон - от 6501 до 7706 образцов).  Медиана АФП ведет себя достаточно стабильно: ее изменение ограничивается 2 - 5 %.  В то же время медиана  ХГЧ снизилась  в 1 квартале 2003 года до 0,875 МоМ. 

12

Рис. 2.  Распределение содержания  альфа-фетопротеина  (СО = 0,408) (1) и хорионического гонадотропина (СО = 0,585)  (2)  в крови беременных Санкт-Петербурга при сроке 14–20 недель в зависимости от логарифма относительного уровня маркера  в МоМ.

Рис. 3. Динамика медиан АФП  и ХГЧ  (в МоМ) по кварталам 2002–2003 гг.

       Это означает, что часть беременных с нормальным уровнем ХГЧ были идентифицированы  как имеющие повышенный уровень ХГЧ и, соответственно, больший риск СД. С другой стороны, во 2–3-ем квартале медиана повысилась на 5-12%, что привело к недооценке уровня ХГЧ. Такой размах колебаний медианы должен корректироваться специалистами экспертной лаборатории,  контролирующей проведение биохимического скрининга. 

       При измерении уровня АФП и ХГЧ в крови жительниц Санкт-Петербурга  с помощью пяти типов тест-систем было показано, что при сроке 14 и 19-20 недель медианы являются нестабильными и не могут использоваться для надежного расчета риска (рис. 4). Таким образом, следует сузить диапазон проведения биохимического скрининга сроками 15-18 недель. После установления отсутствия влияния трех циклов замораживания/оттаивания на уровень изучаемых сывороточных маркеров, мы применили для получения медиан следующий подход – определение содержания маркера проводилось как в свежих сыворотках, так и  в одно- или двукратно замороженных образцах из собранной коллекции с известными сроками беременности. Такой подход в 3-4 раза сокращает время  получения устойчивых нормативных значений  (устойчивые медианы требуют набора  до 300 образцов для каждой недели беременности). В диагностические сроки беременности (15-18 недель) медианы АФП, полученные на автоматическом анализаторе ARCHITECT I2000SR  значительно  отличаются от указанных  в инструкции величин, что не позволяет использовать последние в расчете риска СД у плода.

 

Рис. 4. Медианы АФП (МЕ/мл) для различных типов тест-систем при сроке  14 - 20 недель  беременности.

       Производитель также не предоставляет результатов исследования медиан ХГЧ для пренатального скрининга, говоря о необходимости  их самостоятельного изучения. Методами корреляционного анализа показано, что существует высокая корреляция между уровнем АФП и ХГЧ, измеренным с использованием ручных тест-систем ИФА («Алкор Био») и полученным с помощью реагентов для автоматического анализатора  ARCHITECT I2000SR (r = 0,8981, r2 = 0,8066;  p < 0,0001 для АФП  и r = 0,8910, r2 = 0,7047;  p < 0,0001 для ХГЧ) (рис. 5).

Рис. 5.  Корреляция уровня материнского сывороточного АФП (МЕ/мл), определенного с помощью тест-систем ИФА-АФП-1 ООО «Алкор Био» и реагентов для автоматического анализатора ARCHITECT I2000SR при сроке  15-18 недель беременности (n =645).

       2. Распределение содержания АФП и ХГЧ в крови беременных при синдроме Дауна у плода.  За 1997-2007 годы уровни АФП и ХГЧ были определены в  255 образцах сыворотки крови пациенток с синдромом Дауна у плода.  Патологический кариотип был в 172 случаях установлен пренатально  по результатам  инвазивной диагностики в лаборатории ПД  НИИАГ им. Д.О.Отта РАМН  и в 38 случаях –  в цитогенетической лаборатории СПбДЦ(МГ). В 98 случаях исследование крови матери проводилось  в скрининговые сроки,  но по разным причинам (отказ беременной от дальнейшего  обследования,  несвоевременная  явка к специалистам по  пренатальной диагностике и др.)  патологический кариотип (трисомия 21)  был выявлен постнатально.  Медиана АФП в крови матери для 255 случаев трисомии 21 у плода составила 0,7 МоМ,  ХГЧ – 2,19  МоМ. Распределение значений  АФП и ХГЧ при СД в нашем исследовании не удовлетворяет критериям Гауссова распределения, поэтому для его нормализации применяют логарифмическую трансформацию данных. В таблице 5 приведены параметры распределения логарифма АФП и ХГЧ  в единицах МоМ при СД у плода, показано, что в крови беременных Северо-Западного региона оно является Гауссовым (тест на нормальность положительный, критерий Колмогорова-Смирнова - более 0,05).

Таблица 5. Параметры распределения логарифма АФП (МоМ) и логарифма ХГЧ (МоМ)  при СД у плода  с 14 по 20  неделю беременности (n=255).

Характеристика

ln(АФП(МоМ))

ln(ХГЧ (МоМ))

Среднее значение  (M)

- 0,3322

0,7140

Медиана

- 0,3567

0,7419

Среднее квадратическое отклонение ()

0,5047

0,6072

95% доверительный интервал

(- 0,3946) – (- 0,2700)

0,6389 – 0,7891

Стандартная ошибка среднего ()

0,03179

0,03833

Максимальное значение

1,609

2,219

Минимальное значение

-2,303

- 0,8210

Критерий Колмогорова-Смирнова

0,05872

0,04882

Тест на «нормальность», р

> 0,1

> 0,1

       Мы не выявили  зависимости между возрастом матери и отклонениями  в уровне  АФП и ХГЧ  при  СД  у  плода  в  14–20 недель беременности.  Анализ результатов  показал, что во всех возрастных группах различия в  отклонениях медиан  АФП и ХГЧ  при СД  у плода во  2-м триместре беременности (табл.6)  не являются достоверными (р > 0,5).  Различия в отклонениях от нормы  уровня  АФП и ХГЧ (в МоМ) при сроках беременности от 14 до 20 недель в крови пациенток с СД у плода не являются достоверными (р > 0,1). Таким образом,  все результаты исследования  уровня АФП и ХГЧ в крови  матерей детей с СД могут быть объединены в единый массив.

Таблица 6. Содержание АФП и ХГЧ во 2-м триместре в крови беременных различных возрастных групп  при синдроме Дауна у плода.

Возраст (лет)

Число беременных

АФП (МоМ)

Диапазон  колебаний АФП

ХГЧ (МоМ)

Диапазон колебаний ХГЧ

17–24

43

0,63

0,35–2,07

1,75

0,5–6,90

25–29

48

0,70

0,30–2,2

2,58

0,44–6,11

30–34

47

0,61

0,10–1,60

1,93

0,70–5,9

35–38

50

0,67

0,31–3,6

2,21

0,6–7,2

39–42

50

0,79

0,2–2,3

2,03

0,56–6,4

43–47

14

0,65

0,30–5,0

2,04

0,46–6,9

всего

254

0,70

0,10–5,0

2,15

0,44–7,2

Исследование  255 образцов крови  беременных с синдромом Дауна у плода позволило определить  параметры и расстояние между вершинами распределений  уровня маркеров для  жительниц России в норме и при синдроме Дауна, которое используется в расчете индивидуального риска беременных.

       3. Содержание АФП и ХГЧ при других хромосомных аномалиях плода. В рамках биохимического скрининга 2-го триместра было определено содержание АФП и ХГЧ у 25 пациенток с синдромом Эдвардса (трисомия 18).  Медиана уровня  АФП при СЭ у плода  составила 0,7 МоМ, а медиана ХГЧ – 0,3 МоМ. Поскольку СЭ у плода практически всегда  сопровождается  выраженной внутриутробной  задержкой развития  и  МВПР, то  беременным с пониженным в два и более раза содержанием обоих маркеров  рекомендовали УЗИ 2-го уровня (в специализированном пренатальном центре). При выявлении хотя бы одного ультразвукового  маркера  хромосомной патологии или пороков развития плода  пациентки направлялись на кариотипирование клеток плода для исключения СЭ.

       Наибольшие отклонения уровня биохимических маркеров наблюдались при триплоидии. Триплоидия – хромосомное нарушение, при котором аномальный кариотип содержит дополнительный гаплоидный набор чаще – отцовских, реже - материнских хромосом. Во 2-м триместре беременности такой кариотип ассоциирован с задержкой внутриутробного развития, маловодием, пороками развития мозга, конечностей и др.  При гистологическом исследовании обнаруживаются патологические изменения формы и структуры ворсин хориона и плаценты, характерные для частичного пузырного заноса.  Следствием  этого является и характерный патологический уровень ХГЧ, одного из основных продуктов плаценты.  Медиана относительного  содержания АФП и ХГЧ в крови беременных с триплоидией у плода составляет 1,39 МоМ и 0,18 МоМ, соответственно.  Было установлено, что при триплоидии существует два варианта отклонений.  Наблюдается,  с одной стороны, повышенный уровень АФП и резко повышенный уровень ХГЧ,  и  с другой -  крайне низкие значения ХГЧ при нормальном или сниженном уровне АФП.  Было высказано предположение о том, что подобные различия можно объяснить материнским или отцовским происхождением добавочного гаплоидного набора [Spencer K. et al., 2003]. Проверка данного предположения осложняется малой  выборкой результатов исследования маркеров при выявлении триплоидии во 2-м триместре – всего 15 случаев  за  20 лет.

       Наши  исследования показали, что далеко не все хромосомные аномалии плода связаны с патологическими изменениями уровня сывороточных маркеров. Биохимический скрининг  2-го триместра эффективно формирует группу риска по СД, СЭ и триплоидии. Другие хромосомные аномалии выявляются с чувствительностью не более 30–40%.  Наибольшее число отклонений биохимических маркеров встречается у беременных с так называемым ограниченным  плацентарным мозаицизмом (ОПМ).  По результатам инвазивной пренатальной диагностики с 2001 по 2006 год  из 74 случаев выявления  мозаичного кариотипа в плаценте  был подтвержден  мозаичный кариотип  в крови плода (истинный мозаицизм) только в 2-х случаях (2,7%) [Кузнецова Т.В. и др., 2006]. Беременные с ОПМ вносят свой вклад в  ложноположительные результаты биохимического скрининга.

       4. Содержание неконъюгированного эстриола и ингибина А в  крови беременных в норме. Повышение эффективности биохимического скрининга может достигаться за счет повышения точности  методов исследования.  Например, можно снижать амплитуду  колебаний медиан, связанных с технологическим колебанием параметров тест-систем,  использовать более точные современные технологии определения концентрации маркерных белков.  Можно также  ввести в  исследования  дополнительные маркеры сыворотки крови, учет которых  приведет, с одной стороны,  к  повышению чувствительности скрининга, а с другой стороны - к снижению числа ложноположительных результатов.  При этом необходимо учитывать и экономическую составляющую биохимического скрининга – введение каждого маркера в систему массового скрининга существенно удорожает проведение профилактических мероприятий. В 1997 году  ввиду  отсутствия доступных коммерческих тест-систем  для определения неконъюгированного эстриола (НЭ) биохимический скрининг в Санкт-Петербурге  был организован  как двойной тест. По результатам проведения тройного теста  в зарубежных странах оценка роли НЭ в выявлении  плодов с СД неоднозначна. Сильная корреляция между АФП и НЭ, выявленная в ходе обследования, не позволяет рассчитывать на резкое  увеличение чувствительности.  Максимальное увеличение чувствительности скрининга при учете уровня НЭ достигало 4-5 %.  Однако позднее, с появлением работ, демонстрирующих снижение ЛПР до 0,5-1% в биохимическом скрининге с использованием квадро-теста, интерес к исследованию НЭ вернулся вновь. Уровень НЭ и ингА  для расчета медиан исследовали в сыворотке крови 348 беременных, наблюдавшихся в  НИИАГ им. Д.О.Отта  в сроке 14–18 недель в 2005–2007 годах. Из  результатов, полученных в нашей работе,  следует, что содержание  ингА  в крови пациенток с 15 по 18 неделю беременности  практически не зависит от срока. Данные, таким образом, подтверждают выводы предыдущих исследователей о том, что  учет уровня ингА в качестве дополнительного биохимического маркера не приводит к повышению числа ложноположительных результатов, связанных с неточным определением срока беременности. Корреляционный анализ (табл. 7) уровня сывороточных маркеров крови беременных при сроке  15-18  недель показал их слабую зависимость друг от друга.  Полученные в нашей работе предварительные медианы НЭ и ингА и корреляции позволяют начать пилотные исследования для оценки эффективности квадро-теста  в формировании группы беременных высокого риска по развитию преэклампсии.

Таблица 7.  Коэффициенты корреляции содержания сывороточных маркеров в крови беременных при сроке 14-20 недель (n = 348).

Маркеры

АФП

ХГЧ

НЭ

ингА

АФП

1

0,058

0,128

0,165

ХГЧ

0,058

1

- 0,027

0,51

НЭ

0,128

- 0,027

1

0,027

ингА

0,165

0,51

0,027

1

       5. Содержание биохимических маркеров  в крови пациенток в 9-13 недель беременности  в норме и при синдроме Дауна у плода. Измерение концентрации связанного с беременностью белка сыворотки крови А (РАРР-А) проводилось у 5855  беременных женщин при сроках беременности 8 недель 3 дня – 13 недель 6 дней. Была исследована зависимость  концентрации РАРР-А от  срока беременности. Распределение концентрации РАРР-А и своб. -ХГЧ в 1-м триместре беременности в норме и при синдроме Дауна у плода представлены на рисунках 7 и 8.

Рис. 6. Распределение уровня РАРР-А в крови беременных с 9-й по 13-ю недели при нормальном кариотипе  и при СД у плода в зависимости от логарифма относительного уровня (МоМ) (n = 5855 и n =  55).

        Согласно критерию Колмогорова-Смирнова распределение абсолютных значений уровня РАРР-А не является нормальным. Критериям нормального распределения полностью соответствует распределение относительных величин маркера после логарифмической транформации.

Рис. 7. Распределение уровня своб. -ХГЧ в крови беременных с 9-й по 13-ю недели при нормальном кариотипе  и при СД у плода в зависимости от логарифма относительного уровня (МоМ) (n = 5855 и n =  55).

       Ниже (рис. 8) приведены медианы РАРР-А в крови жительниц Петербурга в норме (1) и медианы производителя (2) (Wallac/Perkin Elmer).

       

Рис. 8.  Динамика содержания РАРР-А в крови беременных в норме (1)  при сроке 8 -13 недель и медианы производителя  (2).

       Всем  беременным, обследованным в нашей работе,  проводилось количественное измерение  ТВП плода для оценки нормативных значений этого показателя у жительниц Санкт-Петербурга         и его корреляции со сроком беременности.  Для исключения  дополнительных погрешностей, вносимых аппаратными сдвигами и  связанных с индивидуальными особенностями оператора, все морфометрические  исследования осуществлялись одним специалистом  на одном оборудовании.  На рисунке  10  представлены результаты 

Рис. 9. Распределение величины  ТВП плодов с нормальным кариотипом и с СД, измеренной у беременных Санкт-Петербурга  в зависимости от логарифма относительного уровня (МоМ) (n = 1672 и n = 55).

анализа  измерений ТВП у  1672  пациенток. «Сила» маркера определяется величиной сдвига вершины распределения в норме и при СД у плода, а число ложноположительных результатов – степенью перекрывания  нормального и патологического распределений. Стандартное отклонение логарифма ультразвукового маркера - 0,515 (95% ДИ: 0,487-0,543) значительно  ниже, чем у биохимических маркеров - 0,717 (95% ДИ: 0,569-0,864) и 0,663 (95% ДИ: 0,638-0,689).  Эти результаты демонстрируют, почему при добавлении в расчет риска ТВП в качестве дополнительного маркера  резко снижается число ЛПР (с 13,9% до 6,7%). Мы провели сравнение медиан ТВП, полученных при селективном  комбинированном скрининге жительниц Санкт-Петербурга в НИИАГ им. Д.О.Отта и СПбДЦ(МГ), анализируя базы данных каждого центра за последние два года.  Поквартальные колебания медиан ТВП (МоМ) в обоих случаях не превышали 3%, что говорит о высоком качестве ультразвукового скрининга в системе медико-генетической службы.  В группе пациенток, обследованных в 9-13 недель беременности в рамках комбинированного ультразвукового и биохимического скрининга 1 триместра беременности, было выявлено 55 случаев СД у плода. При анализе  отклонений содержания биохимических маркеров от нормы при трисомии 21 у плода в отличие от второго триместра была выявлена корреляция  со сроком беременности.  Наши исследования показали (табл. 8), что при СД отклонения содержания  РАРР-А в крови матери  в ранние сроки беременности выражены значительнее, чем в  13 недель беременности. Мы можем говорить только о тенденции, поскольку ввиду малого числа образцов различия не являются достоверными (р = 0,2732). Исследования в данном направлении необходимо продолжать  для  получения  статистически  достоверных  результатов.  Медиана

Таблица 8.  Содержание РАРР-А и своб. –ХГЧ в крови матери при СД у плода в зависимости от  срока беременности (n = 55).

Срок беременности (нед.)

РАРР-А (МоМ)

Своб.

-ХГЧ (МоМ)

Число

образцов

9-10

0,29

2,02

8

11

0,29

1,70

14

12

0,29

1,79

22

13

0,56

2,18

11

уровня РАРР-А  при СД у плода составила 0,33 МоМ, своб. -ХГ  - 1,81 МоМ, а ТВП – 1,79 МоМ.  Толщина воротникового пространства осталась неизвестной у восьми пациенток  с СД у плода, в  этих случаях указанная  величина отсутствовала в  протоколе УЗИ, либо УЗИ проводилось  в неинформативные для измерения ТВП сроки. ТВП плода с СД увеличивается в 1,79 раза по сравнению с нормой,  однако в 12 из 48  случаев (25%)  нормальные значения ТВП снижали риск, рассчитанный по  изменению уровня сывороточных маркеров.  В трех из них  комбинированный риск (0,36%; 0,189%; 0,154%) оказался ниже порогового (0,4%). Риск рождения ребенка с СД не был повышен при учете  изменения  только уровня биохимических маркеров в пяти случаях. Он составил 0,066; 0,253; 0,096; 0,306 и 0,123%. 

       Высокий риск  по биохимическому скринингу (то есть только по результатам исследования сывороточных маркеров без учета ТВП) –  более 1/250,  наблюдался у  629 беременных.  В обследуемой группе женщин при кариотипировании плода было выявлено 55 случаев трисомии 21.  Анализ  четырехпольных таблиц результатов биохимического скрининга в 1-м триместре показал, что чувствительность скрининга составила 90,9%  (95% ДИ 80,07 – 96,98).  Специфичность составила 89,8% (95% ДИ 88,95 – 90,54),  выявлен 1 случай СД  на 12–13 беременных из группы высокого риска, отрицательная предсказательная величина – 99,9%. Группа ложноположительных результатов составила  11%. Высокий риск по комбинированному (биохимическому и ультразвуковому)  скринингу с учетом ТВП наблюдался только у  378 беременных. В работе проанализированы результаты обследования 5720 беременных с помощью двух биохимических и одного ультразвукового маркера. Чувствительность комбинированного скрининга составила 94,55% (95% ДИ 84,88 – 98,86), специфичность составила 94,25% (95% ДИ 93,62 – 94,84), выявлен 1 случай СД  на 7–8 беременных из группы высокого риска, отрицательная предсказательная величина – 99,94%.  Группа ложноположительных  результатов составила 6,6 %. Важным моментом является значительно  более высокая  чувствительность скрининга СД  в 1-м триместре среди беременных моложе 35 лет.          Полученные нормативные значения в норме и при синдроме Дауна у плода, стандартные отклонения и коэффициенты корреляции легли в основу автоматизированной программы расчета риска по результатам комбинированного скрининга в 1-м триместре.

       В группе обследованных в 1 триместре беременных в 11 случаях результатом пренатального кариотипирования материала  плода явилось установление второго по частоте хромосомного нарушения – трисомии по 18 хромосоме (синдром Эдвардса). Медианы РАРР-А и своб. -ХГЧ при СЭ у плода снижены и  равны 0,2 МоМ.  Уровень обоих маркеров был снижен до 0,5 МоМ и более всего у 89 пациенток (3,42 %).  Согласно выбранному критерию (относительное снижение  обоих маркеров до 0,5 МоМ) СЭ выявляется в 72,7% случаев.

       6. Связь отклонений сывороточных маркеров и неблагоприятных исходов беременности. Патофизиологические механизмы изменения уровня материнского сывороточного АФП и ХГЧ при СД у плода находятся в стадии изучения.  Необъяснимое повышение уровня АФП  наблюдается  у 1-3 % обследованных при скрининге пациенток. Повышенный уровень одного или обоих маркеров  в ряде работ связывают с возникшими позднее осложнениями беременности. В крови 129 женщин с нормальным кариотипом плода  после биохимического скрининга в 15-18 недель измеряли уровни АФП и ХГЧ каждые 4 недели. Группы были сформированы по уровню отклонений АФП или ХГЧ в скрининговые сроки. Следует отметить, что у  88,2%  беременных,  имевших повышенные уровни  АФП в 15-18 недель, к 24-й неделе уровень АФП оставался повышенным, но затем сравнялся с остальными группами.  Анализ динамики  уровня АФП,  в связи с ростом  его содержания в группе сравнения и стабильностью среднего содержания АФП  в крови беременных 2-й группы, показал, что  достоверных различий в  уровне АФП при сроке после 24 недель не наблюдалось.  При сопоставлении исходов беременности обследуемых женщин было показано, что повышенное содержание АФП или ХГЧ в крови беременных в 15-18 недель является маркером раннего развития плацентарной недостаточности и последующей гипотрофии плода [Гагарина А.В. и др., 2002] .  Корреляционный анализ показал прямую зависимость между уровнем ХГЧ у пациенток в 20 и 28 недель беременности и наличием у них в дальнейшем гипотрофии новорожденного (r=0,972; p<0,006 и r=0,836; p=0,038, соответственно). Опыт массового биохимического скрининга во 2-м триместре  позволил нам предложить следующий алгоритм  ведения беременных с измененными МСБ (рис. 10). 

Рис. 10. Алгоритм ведения беременных с нормальным кариотипом плода и измененными значениями МСБ во 2-м триместре.

При изолированном повышении АФП или ХГЧ более 2-х МоМ во 2-м триместре беременности рекомендуется проведение допплерометрии при сроке  24 недели [Гагарина А.В. и др., 2002].  В 8-13 недель беременности также существует выраженная  корреляция между низкими уровнями РАРР-А в крови матери и неблагоприятным исходом беременности. Содержание свободной -субъединицы ХГЧ меньше  связано с  неблагоприятным прогнозом течения беременности. Низкие значения своб. -ХГЧ,  главным образом, ассоциированы с хромосомной патологией плода и составляют всего 0,24 МоМ при СЭ у плода и еще более снижены при триплоидии,  но встречаются  достаточно редко - всего в 1,9% (112 случаев).

       7. Биохимический скрининг при многоплодной беременности и после применения методов вспомогательных репродуктивных технологий. При проведении  массового биохимического скрининга  во 2-м триместре в Санкт-Петербурге было исследовано 399 образцов крови  беременных с двойней.  Средний уровень АФП при двойне с нормальным кариотипом плода составил  2,15 МоМ (СО 0,5221; 95% ДИ: 1,669-2,635), а ХГЧ - 2,54 МоМ (СО 0,4251; 95% ДИ: 2,15 – 2,94). За 15 лет во 2-м триместре сывороточные маркеры были исследованы только в трех случаях СД у одного плода из двойни.  В последние годы увеличилось число многоплодных беременностей после применения методов вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ). В группе беременных после экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) выявлено снижение содержания маркеров, оно не достигает достоверного, но наблюдается тенденция к снижению уровня  АФП и ХГЧ  при беременности двойней после ЭКО. Содержание  НЭ в крови матери  при двойне не  зависит от применения  ВРТ.

        В 1-м триместре при беременности двойней с нормальным кариотипом (n = 59) средний уровень РАРР-А составил 2,45 МоМ, а своб. -ХГЧ – 2,32 МоМ, соответственно. За время исследований в 1-м триместре  нами были получены данные о содержании СМ 1-го триместра в крови 18 беременных после ЭКО. Все случаи относятся к одноплодной беременности с нормальным кариотипом плода. Средний уровень РАРР-А составил 1,37 МоМ, а своб.-ХГ – 1,53 МоМ. Ввиду малости выборки отклонения маркеров не являются достоверными. Группа  обследованных пациенток  является крайне неоднородной. Применявшиеся методы включали в себя  метод  ВРТ с применением донорской яйцеклетки, искусственной инсеминации и ИКСИ (внутриплазматический перенос сперматозоидов). Результаты исследования сывороточных маркеров  у жительниц Санкт-Петербурга и данные литературы свидетельствуют о значительно меньшем  влиянии применения  ЭКО на уровень маркеров в 1-м триместре беременности по сравнению с отклонениями маркеров 2-го триместра. Требуется значительное увеличение выборки для получения статистически достоверных результатов. Применение в расчетах риска рождения ребенка с СД поправочных коэффициентов на число плодов без учета снижения медиан у беременных с  использованием  ВРТ не является корректным. Многообразие методов ВРТ не позволяет использовать в программах расчетов универсальную коррекцию медиан сывороточных маркеров.  Таким образом, для профилактики СД у плода беременным после ЭКО рекомендуется проведение комбинированного скрининга в 1-м триместре.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ

       Эффективность пренатального  скрининга  оценивается по  практическим результатам. При биохимическом скрининге хромосомной патологии основным критерием эффективности  являются  результаты  кариотипирования плода. Непременным условием  оценки эффективности является совпадение характеристик обследованных пациентов и характеристик  популяции,  в которой планируется дальнейшее проведение массового скрининга. При большой  разнице в возрасте беременных исследуемых групп, оценки эффективности пренатального скрининга хромосомных аномалий у плода будут существенно  различаться.  Кроме того, эффективный скрининговый тест должен легко воспроизводиться в разных диагностических центрах и регионах. 

       Разработанные нами параметры для проведения комбинированного биохимического и ультразвукового скрининга при сроке 9-13 недель позволили достичь на практике  94% выявления плодов с СД при  величине ложноположительных результатов 6,6%. Среди беременных старше 35 лет в группу высокого риска  было отобрано 89% пациенток – положительные результаты получены у  40 из 45 беременных старше 35 лет с трисомией 21 у плода (истинноположительные результаты комбинированного скрининга). Среди молодых беременных (до 35 лет) у двух пациенток с трисомией 21 у плода не был выявлен  повышенный риск  по биохимическому скринингу в 9-13 недель.  Их «биохимический»  риск составил 1/395 = 0,253% и 1/1505 = 0,066%, но в связи с увеличением ТВП (до 1,84 МоМ и 4,77 МоМ, соответственно)  риск  по результатам комбинированного скрининга оказался выше порогового - 0,4%.  В целом, в молодой группе  было выявлено 12 из 12 возможных случаев СД (100%). Несмотря на небольшую выборку, наблюдается значительное повышение эффективности комбинированного скрининга в 1-м триместре среди молодых женщин (рис. 11). Резервы  увеличения эффективности массового комбинированного скрининга  состоят в стандартизации протоколов  УЗИ  в учреждениях первичного звена  и  измерении ТВП у всех беременных. В 2008 году у 15% пациенток, направленных на комбинированный скрининг 1-го триместра, величина ТВП отсутствовала  в направлении и/или  протоколе УЗИ в 10-13 недель беременности.

Рис. 11.  Чувствительность комбинированного скрининга (1) в 1 триместре  и  биохимического скрининга (2) во 2-м триместре  в разных возрастных группах.

       При проведении биохимического скрининга необходим четкий контроль клинико-диагностических критериев.  Любые изменения в реагентах или компонентах тест-систем, некорректное использование программных средств, различия в коэффициентах уравнений, выбранных для аппроксимации зависимости медиан от срока беременности, отражаются на относительном уровне маркеров, а, следовательно, на оценке индивидуального риска. Рассчитанные с помощью разных программ значения риска не должны совпадать с точностью до третьего знака после запятой, но хорошим критерием эффективности скрининга  служит размер группы ложноположительных результатов.  В  снижение эффективности скрининга вносят свой немалый вклад временные  колебания медиан маркера в МоМ, зависящие от стабильности производства реагентов и правильности установленных в программе нормальных значений и поправочных коэффициентов. При большой выборке на общей чувствительности скрининга в течение  года поквартальные колебания медиан не сказываются. При использовании  нескольких маркеров ошибка в расчете риска будет зависеть от комплекса погрешностей измерения каждого параметра и точности установления его медианы.  При колебаниях медианы в пределах  10 % в одном направлении индивидуальный риск беременной  меняется в 4 раза [Nix B. et al., 2007]. Если пределом  колебаний медианы установить величину 5%, то риск может измениться в 1,8 раза. Процесс контроля качества лабораторных исследований обычно ограничивается стандартными методами мониторинга самого исследования. Программы внешнего контроля  качества сегодня позволяют только оценить правильность исследования содержания гормональных и биохимических маркеров и не распространяются на параметры расчета, используемые в программах, с помощью которых оценивается риск рождения ребенка с СД. В итоге достоверные лабораторные результаты, полученные опытным врачом клинической лабораторной диагностики, могут оказаться совершенно непригодными при их неправильной интерпретации или неверно использованной программе оценки этих данных.  Динамика медиан  использованных маркеров была проанализирована вместе со специалистами лабораторной диагностики диагностического центра  и специалистами отдела контроля качества производителя. Мониторинг текущих медиан позволяет не только вовремя заметить дрейф средних значений, обнаружить, оценить и исключить наличие систематических лабораторных погрешностей, но и выявляет особенности поставляемых партий реагентов. Таким образом, анализ результатов массового скрининга за длительный период позволяет осуществить обратную связь лаборатории  с производителем и поднять уровень  качества технологического процесса  производства  реагентов.

       На эффективность профилактики ВПР влияет взаимодействие специалистов УЗД и медико-генетической службы  при проведении биохимического скрининга.  Как показано ранее,  основным фактором, влияющим на уровень сывороточных маркеров, является определение срока беременности на момент взятия образца крови для пренатального биохимического скрининга. Ошибка даже в 2-3 дня может сыграть серьезную роль в случае  получения  риска, лежащего  близко к пороговому значению. Определенные расхождения  в сроках существуют всегда.  Объясняется это несколькими причинами. Во-первых, разные типы ультразвуковых аппаратов имеют разную разрешающую способность и разную погрешность измерения. Во-вторых, даже на одном оборудовании  разные специалисты будут получать разные результаты. Это объективная реальность – существует определенный индивидуальный разброс в измерениях (в установке курсора, в угле установки датчика плоскости измерения и т.д.). Результаты будут хорошо воспроизводиться в одних и тех же руках, а по отношению к некоему «эталону» может быть минимальный, но отчетливый сдвиг. В-третьих, стандарты соответствия сроков беременности определенным размерам плода различны в оценках разных авторов. Наиболее  ярко это выражается в 1 триместре беременности. В программе расчета индивидуального риска «Life Cycle»  при внесении даты  УЗИ и копчико-теменного размера плода автоматически выбирается определенный срок  беременности. В процессе эксплуатации программного обеспечения мы встретились с несоответствием  срока беременности, который устанавливает специалист УЗИ по величине КТР,  сроку, который устанавливается в программе. Необходима стандартизация и согласование всех параметров УЗИ при проведении массового скрининга в регионе.

       На эффективность скрининга влияет выбор сроков исследования биохимических маркеров.  Анализ полученных баз данных методом дискриминантного анализа показал, что оптимальным сроком проведения скрининга в 1-м триместре является 11 недель. Эффективность комбинированного скрининга достигает также высокого уровня при его двухэтапном проведении: производится определение уровня РАРР-А и своб. –ХГ при сроке  9-10 недель, а окончательный расчет индивидуального риска осуществляется после измерения ТВП в 11-12  недель беременности. Во 2-м триместре  максимальный сдвиг между нормой и патологией наблюдается в 16 недель беременности.

       Для большинства беременных проведение  последовательного определения маркеров 1-го триместра, а через 3–4 недели 2-го триместра  избыточно. В основной массе обследованных в 1–м триместре женщин с результатами комбинированного риска рождения ребенка с СД  менее 1 на 1000 (0,1%) скрининг во 2-м триместре можно  проводить только с целью отбора беременных группы высокого риска по наличию ВПР у плода на основании определения  уровня сывороточного АФП. В настоящее время это исследование  утрачивает свою ценность по сравнению с высокой разрешающей способностью современной ультразвуковой  аппаратуры. 

       Из теории вероятности известно, что вероятность двух независимых событий равна произведению вероятностей осуществления каждого из этих событий. Как было показано, уровень АФП практически не коррелирует с уровнем ХГЧ в 14-20 недель беременности (r = 0,058). Аналогично и в 1-м триместре  уровень  РАРР-А  и свободной -субъединицы ХГЧ являются  независимыми переменными (r = - 0,028). Мы предположили, что уровни сывороточных маркеров 1-го и 2-го триместров так же являются независимыми переменными. При проверке данного предположения  были проанализированы уровни сывороточных маркеров у 629 беременных, которым  последовательно проводился комбинированный скрининг при сроке  9-13 недель  и биохимический скрининг при сроке  15-17 недель (табл.  9). Были рассчитаны коэффициенты корреляции всех определяемых сывороточных маркеров между триместрами. Для  точного расчета  отношения правдоподобия по всем маркерам с учетом их корреляции  необходимо пользоваться  более сложными математическими методами.  Эти методы были применены во второй версии  программы ПМСД.  В программе предусмотрен расчет индивидуального риска с учетом всех исследованных  у данной беременной сывороточных маркеров.  Новая версия программы создана для решения главной задачи  при консультировании беременной по результатам пренатального скрининга – уточнения  величины индивидуального риска пациентки. Мы полагаем, что исследования скрининговых маркеров в 1-м триместре, если они проведены в корректные сроки беременности, могут и должны использоваться наравне  с маркерами  2-го триместра для уточнения индивидуального риска рождения ребенка с СД.  Согласно нашему алгоритму,  следует также  ввести в программу для определения суммарного  риска  ультразвуковые маркеры, измеренные  в 1-м триместре.

Таблица 9.  Группы женщин с высоким риском рождения  ребенка с СД, сформированные на основании  разных критериев отбора. Все плоды имели нормальный  кариотип. 

№№

Критерии отбора

Всего

Моложе 35 лет

Старше 35 лет

n

%

n

%

n

%

1

Возраст

302

47%

0

0

302

47

2

Высокий биохимический риск  в 9-13 недель

170

26,4

28

8,20

148

49,00

3

Высокий риск по ТВП более 2,5 мм

26

4

22

6,50

4

1,30

4

Комбинированный риск

91

14,2

21

6,20

74

24,50

5

Биохимический риск в 15-18 недель

149

23,2

14

4,1

137

45,40

6

Суммарный сывороточный риск

120

18,7

13

3,8

102

35,4

7

Суммарный риск по 5 маркерам

76

11,80

13

3,80

62

20,8

Можно использовать только биохимические маркеры  1-го триместра (для тех пациенток, которые выполнили УЗИ для определения ТВП  вне скрининговых сроков или у которых не была  по каким-то причинам измерена  ТВП);  можно использовать все три показателя 1-го триместра. Риск рождения ребенка с СД, полученный в результате описанного расчета, был назван нами суммарным риском.  Такой многовариантный  подход к расчету суммарного риска в доступной нам литературе не обнаружен.  Расчет интегрального риска,  предложенный в 1999 году [Wald N.J. et al., 1999], жестко основан на результатах измерения ТВП и РАРР-А в 1-м триместре и  4-х биохимических маркеров (квадро-тест) – во 2-м. Упрощенный метод  оценки индивидуального риска беременной предложен нами для случая, когда беременная  проходила исследование в обоих скрининговых сроках и у нее есть результаты расчета риска рождения ребенка с СД  по каждому этапу. Наш опыт показывает, что основную роль в определении индивидуального риска играет точность установления срока беременности.  Все остальные поправочные  коэффициенты,  даже поправка на массу тела беременной, приводят к весьма  незначительному  изменению  величины конечного риска.  Тогда с некоторым приближением  можно воспользоваться следующим очень простым и логичным методом вычисления суммарного риска,  зная  величину риска по результатам комбинированного скрининга 1-го триместра  и биохимического скрининга 2-го триместра. 

       Вероятность рождения ребенка с СД, определяемая  в 1-м триместре,  представляет собой возрастной риск женщины, умноженный на отношение правдоподобия  с учетом уровня РАРР-А, своб. -ХГЧ и ТВП. Вероятность рождения ребенка с СД, определяемая  в 2-м триместре  равна возрастному риску этой же беременной, умноженному на отношение правдоподобия для маркеров 2-го триместра. Зная дату рождения беременной и, соответственно, ее  возрастной риск на момент родов (стандартно указывается в распечатке результатов 1-го триместра),  мы можем получить суммарный риск (CР) по следующей формуле:

CР = Р1* Р2/Рвозр;

где  Р1 и Р2 – риск, рассчитанный в 1-м и 2-м триместре беременности,  Рвозр- возрастной риск консультируемой беременной.

       Из данных таблицы 12 следует, что расчет суммарного риска ведет к сокращению размеров группы риска у беременных с нормальным кариотипом плода, то есть к  снижению числа необходимых  инвазивных процедур во 2-м триместре.  Проведенные расчеты показывают, что добавление новых независимых параметров в систему оценки риска  позволяет, действительно,  уточнить индивидуальный риск беременной.  Нам представляется, что необходимо быстрейшее внедрение  второй версии программы ПМСД, т.е. автоматизированного расчета, позволяющего использовать все данные обследования беременной в любой  комбинации:  АФП, ХГЧ, РАРР-А, своб. –ХГЧ и ТВП или АФП, ХГЧ и ТВП, если отсутствуют биохимические исследования в 9-13 недель.

Последняя ситуация типична для  Санкт-Петербурга, поскольку в ультразвуковом скрининге при сроке 11–14 недель участвует 87–90% беременных, а биохимический скрининг 1-го триместра охватывает 3728 беременных города (8 %  по итогам 2007 года).  Предлагаемый нами упрощенный расчет суммарного риска легко осуществим,  не требует доступа к  специальной программе расчета суммарного риска, а главное – таким методом  могут быть интерпретированы результаты скрининга в 1-м и 2-м триместре, проведенного в разных лабораториях.

       Одна из главных задач при создании универсального алгоритма скрининга  с включением измерения ТВП в 1-м триместре  - квалифицированный  подбор  опытных специалистов УЗД, способных обеспечить грамотное определение этой величины. С другой стороны, стоимость ультразвукового исследования заметно выше стоимости биохимического тестирования крови, тем не менее  многие УЗ аппараты используются  далеко не оптимальным образом.

       Новый способ проведения скрининга, так называемый  контингентный скрининг, призван разрешить эти проблемы. Впервые этот метод описали датские исследователи [Christiansen M. et al., 2005],  предложившие проводить УЗИ только тем беременным, у  которых определяется промежуточный  риск после исследования РАРР-А и своб. -ХГЧ в 10 недель беременности.  Подведение итогов 2008 года в Санкт-Петербурге показало, что только 17 % беременных с пограничным риском (от 0,1  до 0,4 %) нуждаются в уточнении риска и дополнительном обследовании с помощью скрининга 2-го триместра. Основная  группа обследованных  в 1-м триместре беременных (76 %),  может закончить биохимический скрининг в 13 недель  и нуждается только в плановом УЗИ при сроке 18-22 недели (рис. 12). Группе повышенного риска (риск 0,4% и более) рекомендуется инвазивная диагностика с возможностью раннего  выявления  90% плодов с СД. 

Рис. 12.  Алгоритм  контингентного скрининга с исследованием АФП и ХГЧ в группе беременных с пограничным (от 0,1 до 0,4%) риском.

       Предложенный  алгоритм контингентного скрининга беременных, по-видимому,  является в настоящее время оптимальным и с экономической точки зрения. 

В последнее десятилетие наблюдается значительное усложнение методов проведения скрининга, поскольку  стоит задача получить высокую чувствительность при существенном снижении числа ложноположительных результатов.

Основным  недостатком  даже хорошо оснащенных лабораторий  является отсутствие программ расчета риска по результатам  биохимического скрининга.  В Петербурге  специалисты лаборатории пренатальной диагностики НИИАГ им. Д.О.Отта  организовали взаимодействие с диагностическими  центрами (ДЦ), проводящими исследования  АФП и ХГЧ при беременности  с целью их участия в общегородском скрининге.  Осуществляется консультационная поддержка ДЦ, помощь в наработке собственных медиан для используемых реагентов и оборудования, обеспечивается расчет риска рождения ребенка с СД по собственным результатам с включением обследованных беременных в городскую базу биохимического скрининга. 

       Разработана оптимальная схема взаимодействия ФМГЦ, городских  ЛПУ и городских диагностических центров и лабораторий, вовлеченных в обследование беременных города.  Администрирующая роль лаборатории пренатальной диагностики НИИАГ им.Д.О.Отта РАМН сложилась исторически, в силу разработки и внедрения всех новых методик первоначально в стенах лаборатории, с последующей  передачей их  для массового использования в другие учреждения города.  Обмен информацией позволяет администратору скрининга контролировать динамику медиан всех лабораторий  с учетом применяемых тест-систем,  осуществлять анализ эффективности, чувствительности и числа ложноположительных результатов скрининга, исходов беременности, всех случаев рождения детей с СД, а также  корректировать при необходимости параметры расчета риска в применяемых программах.

       В настоящее время знания врачей акушеров-гинекологов учреждений первичного уровня  в области медицинской генетики и пренатальной диагностики крайне несовершенны. Но именно их действия лежат в  основе и определяют эффективность массового скрининга беременных.  Проведение выездных школ по теме «Актуальные вопросы профилактики ВПР» может помочь  коллегам из других регионов применить  наш  опыт сотрудничества со специалистами первичного звена для решения общих задач. Среди них  — получение достоверной и объективной информации; достижение максимальной преемственности в работе учреждений различного уровня и профиля; проведение ультразвуковых, биохимических, инвазивных исследований плода на современном научно-методическом уровне;  снижение необоснованных дополнительных исследований,  проблема эффективного использования существующей дорогостоящей аппаратуры;  возможности рационального планирования работы всех звеньев службы пренатальной диагностики, обеспечение ее специально подготовленными квалифицированными кадрами [Вахарловский В.Г. и др. 2007]. 

        Условия  обследования беременных, сложившиеся в различных регионах, требуют сочетания  разнообразных алгоритмов.  Совместно со специалистами ООО «Интеллектуальные программные системы» (Санкт-Петербург) нами разработаны несколько вариантов программ расчета риска рождения ребенка с СД. 1. Рабочее место врача-генетика (расчет риска по результатам разных лабораторий в относительных единицах).  2. Калькулятор риска для  пациенток небольшого диагностического центра (расчет риска по результатам одной лаборатории на собственных медианах с ведением учетного журнала). 3. Программы, создающие базу данных массового  биохимического скрининга (расчет риска по результатам одной лаборатории на собственных медианах с  возможностью статистической  обработки результатов, формирования отчетных документов и т.д.). Работа проводилась при поддержке отечественных производителей реактивов – ООО «Алкор Био» (Санкт-Петербург) и ООО «Хема» (Москва).

       Появление новых лабораторных технологий и оборудования, позволяющих провести биохимический анализ  в течение 20-30 минут, дало возможность  объединить УЗ и биохимические исследования  в одном  высокотехнологичном центре,  работающем по программе «Клиника одного дня» [Spencer K. et al., 2002]. Пока широкого применения на практике этот  алгоритм не нашел. По-видимому, его распространение сдерживает  высокая стоимость оборудования для срочного биохимического тестирования и невысокая доступность экспертного УЗИ, длительность цитогенетического анализа.  В настоящее время клиника одного дня рассматривается как одно из весьма перспективных направлений рациональной организации  всей службы пренатальной диагностики.

        Эффективное проведение  биохимического скрининга 2-го триместра является одним из факторов снижения перинатальной смертности в регионе. Мониторинг беременных с отклонениями сывороточных маркеров позволяет вовремя начать профилактику фетоплацентарной недостаточности. Нами не отмечено корреляции между высокими уровнями  РАРР-А в 8-13 недель беременности и неблагоприятными исходами и осложнениями беременности. Полученные результаты свидетельствуют о несомненной перспективности и необходимости дальнейшего изучения маркеров сыворотки крови беременных и корреляции их содержания с течением беременности с целью использования результатов пренатального скрининга в прогнозировании  и профилактике ее неблагоприятных исходов.

ВЫВОДЫ

1. При массовом биохимическом скрининге  беременных с использованием разработанных  нормативных критериев  и автоматических программ расчета риска в 15-18 недель  чувствительность скрининга достигает 72,4% при 6,7% ложноположительных результатов.

2.  Комбинированный биохимический и ультразвуковой скрининг  беременных в 9-13 недель с использованием разработанных нормативных критериев  и  автоматических  программ расчета риска  позволяет выявить до 94,5% плодов с СД при 6,6% ложноположительных результатов.

3. Дискриминантный анализ показал, что максимальные различия, выявляемые при биохимическом скрининге между нормой и патологией, наблюдаются  на 11-й неделе беременности в 1-м триместре беременности  и  на 16-й неделе - во втором.

4. Эффективность биохимического скрининга определяется корректностью  используемых медиан и параметров автоматизированного  расчета риска, соблюдением точных сроков проведения скрининговых мероприятий,  охватом и четким выполнением организационного алгоритма скрининга.

5. Применение тест-систем отечественного производства во 2-м триместре беременности с учетом разработанных для них клинико-диагностических критериев позволяет осуществлять массовый биохимический скрининг, эффективность которого соответствует международным нормам.

6. Предложенная автоматизированная программа расчета суммарного риска позволяет оценить риск рождения детей с синдромом Дауна по результатам исследования от двух до семи  скрининговых маркеров и предусматривает  возможность  использования дополнительных биохимических и ультразвуковых маркеров.

7. Оригинальная формула суммарного расчета риска рождения ребенка с СД позволяет  снизить группу ЛПР и уточнить индивидуальный риск  при  наличии противоречащих друг другу результатов 1-го и 2-го триместра. 

8. Пониженные уровни РАРР-А и свободной бета-субъединицы ХГЧ в 9-13 недель беременности, так же как и  повышенные концентрации АФП и ХГЧ в 15-18 недель беременности, являются маркером раннего развития плацентарной недостаточности и других частых осложнений беременности.

9. Оптимальным вариантом скрининга является массовый комбинированный скрининг в 9-13 недель беременности с уточнением риска по уровню АФП и ХГЧ  в 15-17 недель для пациенток  с пограничными значениями индивидуального  риска от 0,1 до 0,4%, которые составляют не более 17%  обследованных.

10. Стандартизация биохимических и ультразвуковых исследований, контроль и  корректировка медиан, анализ исходов беременности, чувствительности и эффективности – обязательные условия  корректного применения пренатального биохимического скрининга.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Рекомендуется использовать разработанные нормативные значения и параметры распределения АФП, ХГЧ, РАРР-А и свободной  -субъединицы ХГЧ  в крови жительниц СЗФО для  пяти типов наиболее часто используемых в России реагентов как основу для внедрения  пренатального  скрининга в других городах РФ. 

2. Разработанный  алгоритм биохимического скрининга в 15-18 недель беременности  с использованием  автоматизированной программы расчета индивидуального  риска рождения ребенка с СД на основании анамнеза и измерения уровня АФП и ХГЧ в крови беременной может быть использован при проведении массового скрининга в разных по численности регионах. 

3.  Разработанный алгоритм биохимического скрининга в 9-13 недель беременности с использованием автоматизированной программы расчета индивидуального риска рождения ребенка с СД на основании анамнеза и измерния уровня РАРР-А  и  своб.бета-субъединицы ХГЧ  в крови беременной рекомендуется для повышения эффективности выявления хромосомной патологии плода.

4.  Предложенные программы расчета  риска рождения ребенка с СД  для диагностических центров с разным потоком беременных  – рабочее место врача-генетика – «Счетчик риска СД», «Калькулятор риска СД» для небольшой лаборатории  и автоматизированная база данных для массового биохимического скрининга могут быть основой для внедрения  селективного или массового биохимического скрининга в отдельных диагностических центрах страны.

5.  Оригинальный расчет суммарного риска рождения ребенка с СД рекомендуется использовать вручную или в автоматизированной программе, что позволит проводить скрининг как в 1-м, так и во 2-м триместре, а также уточнять индивидуальный риск  в случае противоречащих друг другу результатов  скрининга  1-го  и 2-ого триместров. 

СПИСОК РАБОТ,  ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

    • ИЗДАНИЯ, ОПРЕДЕЛЕННЫЕ ПЕРЕЧНЕМ ВАК

1. Вахарловский В.Г. Исследование содержания АФП в сыворотке крови беременных как критерия наличия врожденных пороков развития у плода / Вахарловский В.Г., Горбунова В.Н., Кащеева Т.К. // Акуш. и гин. — 1995. — Т. 4. — С. 22 – 25.

  1. Биохимические маркеры нарушения развития мозга плода человека / Арутюнян А.В., Павлова Н.Г., Константинова Н.Н., Павленко А.В., Кащеева Т.К., Лызлова Л.В., Козина Л.С., Русина Е.И., Михайлов А.В., Шелаева Е.В. // Нейрохимия. — 1996. — Т. 13, № 3. — С. 187 – 193.
  2. Исследование маркерных сывороточных белков в пренатальной диагностике хромосомных болезней / Карева И.В. , Кащеева Т.К. , Вахарловский В.Г. , Кузнецова Т.В., Айламазян Э.К., Баранов В.С. // Ж. акуш. жен. болезн. — 1998. — Вып. 3 – 4. — С. 15 – 21.
  3. Гагарина А.В.  Гемодинамические параметры в функциональной системе мать-плацента-плод у женщин, имевших повышенные уровни альфа-фетопротеина и хорионического гонадотропина во втором триместре беременности / Гагарина А.В., Павлова Н.Г., Кащеева Т.К. // Ж. акуш. жен. болезн. — 2002. — Вып. 4 — С. 22 – 26.
  4. Анализ случаев рождения детей с болезнью Дауна в Санкт-Петербурге в 1997-2006 гг. / Кащеева Т.К., Лязина Л.В., Вохмянина Н.В., Кузнецова Т.В., Романенко О.П., Баранов В.С.  // Ж. акуш. жен. болезн. 2007. — Т. LVI, Вып. 1. — С. 11 – 15.
  5. Кащеева Т.К. Перспективы использования дополнительных сывороточных маркеров в биохимическом скрининге беременных // Ж. акуш. жен.  болезн. — 2007. — Т. LVI, Вып. 1. — С. 104 – 109.
  6. Внедрение алгоритма комбинированного скрининга хромосомной патологии плода в 1 триместре беременности. Опыт работы за 4 года / Некрасова Е.С., Николаева Ю.А., Кащеева Т.К., Кузнецова Т.В., Баранов В.С.  // Ж. акуш. жен.  болезн. — 2007 . — Т. LVI, Вып. 1. — С. 28 – 34.
  7. Об обмене опытом в области пренатальной диагностики врожденных и наследственных заболеваний / Вахарловский В.Г., Кащеева Т.К., Иванова Е.В. Ахмадуллина М.К., Крюкова Н.И., Марданова А.К. //  Ж. акуш. жен. болезн. — 2007. —  Т. LVI, Вып. 1. — С. 153 – 155.
  8. Кащеева Т.К. Биохимический скрининг маркерных белков в сыворотке крови  беременных (лекция) // Клин. лаб. диагн. — 2008. — Т.2. — С. 36 – 42.
    • МОНОГРАФИИ  И  ГЛАВЫ В МОНОГРАФИЯХ
  9. Кащеева Т.К. Биохимический скрининг маркерных белков при беременности / Кащеева Т.К. // Пренатальная диагностика наследственных и врожденных болезней /Ред. Э.К. Айламазян,  В.С. Баранов. — М.: МЕДпресс-информ, 2006. — С. 125 – 171.
  10. Лабораторные методы в пренатальной диагностике / Баранов В.С., Кузнецова Т.В., Иващенко Т.Э., Кащеева Т.К. // Основы пренатальной диагностики / Ред. Юдина Е.В., Медведев М.В. — М.: РАВУЗДПГ, Реальное Время, 2002. — С. 122 – 152. 
  • МЕТОДИЧЕСКИЕ ПОСОБИЯ И РУКОВОДСТВА
  1.   Пренатальная диагностика / Баранов В.С., Горбунова В.Н., Кузнецова Т.В., Иващенко Т.Э., Кащеева Т.К. // Медицинская лабораторная  диагностика (программы и алгоритмы). Т.2. / Ред. А.И. Карпищенко. — СПб.: Интермедика, 1997. — С. 180 – 201.
  2. Кащеева Т.К. Амниотическая жидкость / Кащеева Т.К., Горбунова В.Н., Баранов В.С. // Медицинская лабораторная  диагностика (программы и алгоритмы), Т.2.  / Ред. А.И. Карпищенко. — СПб.: Интермедика, 1997. — С. 250 – 260.
  3. Пренатальная диагностика в акушерстве: современное состояние, методы, перспективы: метод. пособие / Баранов В.С., Кузнецова Т.В., Вахарловский В.Г., Иващенко Т.Э., Кащеева Т.К., Асеев М.В., Коротеев А.Л.  —  СПб.: Изд-во Н-Л, 2002. —  64 с.
  4. Принципы организации и состояние пренатальной диагностики наследственных болезней в Санкт-Петербурге / Баранов В.С., Кузнецова Т.В., Иващенко Т.Э., Кащеева Т.К., Асеев М.В., Коротеев А.Л. Вахарловский В.Г., Некрасова Е.С., Романенко О.П., Воронин Д.В., Вохмянина Н.В. // Частота, диагностика, профилактика наследственных болезней и врожденных пороков развития в Санкт-Петербурге: метод. рекомендации / Ред. Красильников И.А. — СПб, 2004. — С. 37 – 70. 
  5. Алгоритмы  пренатальной  диагностики  в  Санкт-Петербурге / Баранов В.С., Кузнецова Т.В., Иващенко Т.Э., Кащеева Т.К., Асеев М.В., Коротеев А.Л., Вахарловский В.Г., Некрасова Е.С., Романенко О.П., Воронин Д.В., Вохмянина Н.В./ Молекулярно-биологические технологии в медицинской практике. — Вып. 5. — Новосибирск: Альфа-Виста, 2004. — С. 81 – 109.
  6. Пренатальная диагностика в акушерстве / Баранов В.С., Кузнецова Т.В., Иващенко Т.Э., Кащеева Т.К., Вахарловский В.Г., Коротеев А.Л.  // Молекулярно-биологические технологии в медицинской практике /  Ред. А.Б. Масленников. — Вып. 5 . —  Новосибирск.: Альфа Виста. — 2004. —  С. 29 – 80.
  7. Cовременные алгоритмы пренатальной  диагностики наследственных болезней: метод. пособие / Баранов В.С., Кузнецова Т.В., Иващенко Т.Э., Кащеева Т.К., Николаева Ю.А., Вахарловский В.Г., Асеев М.В., Коротеев А.Л., , Некрасова Е.С., Кречмар М.В.,  Романенко О.П., Воронин Д.В., Вохмянина Н.В. —  СПб.: Изд-во Н-Л, 2009. —  130 с.
  • СТАТЬИ И ТЕЗИСЫ ДОКЛАДОВ И СТАТЕЙ
  1. Кащеева Т.К. Биохимические методы пренатальной диагностики дефектов невральной трубки плода / Кащеева Т.К., Лебедев В.М. // Тезисы докладов ХIХ научной сессии, посвященной памяти профессора Д.О.Отта. — Л, 1990. — С. 52 – 53.
  2. О скринировании беременных на содержание альфа-фетопротеина в крови / Горбунова В.Н., Вахарловский В.Г., Кащеева Т.К. [и др.] // Мат. ХХ научной сессии НИИАГ им. Д.О.Отта. — Л., 1991. — С. 42 – 45.
  3. Вахарловский В.Г Изменения уровня альфа-фетопротеина в крови беременных при врожденной патологии у плода / Вахарловский В.Г., Кащеева Т.К., Романова Л.В. // 2-й Съезд педиатров и акушеров-гинекологов Молдовы. Кишинев. — 1993. — С. 87.
  4. Возможные маркеры нарушения развития ЦНС в антенатальный период при анэнцефалии / Арутюнян А.В., Павлова Н.Г., Константинова Н.Н., Павленко А.В., Кащеева Т.К., Лызлова Л.В., Козина Л.С., Русина Е.И., Михайлов А.В., Шелаева Е.В.  // Тезисы докладов ХХIII научной сессии НИИАГ РАМН им. Д.О.Отта / Ред. Э.К.Айламазян. — СПб, 1994. — С. 32 – 35.
  5. Кащеева Т.К. Некоторые белки амниотической жидкости в пренатальной диагностике врожденных пороков и муковисцидоза плода / Кащеева Т.К., Горбунова В.Н., Баранов В.С. //Тезисы докладов Первого (третьего) Росс. съезда мед. генет. — М, 1994. — С. 29 – 30.
  6. О ранней /пренатальной/ диагностике заболеваний нервной системы у детей / Вахарловский В.Г., Кащеева Т.К., Водейко Г.М., Романенко О.П., Баранов В.С. // Организационные и клинические проблемы детской неврологии. Тезисы докл. — М.: изд-во АО  Руссомед, 1994. — С. 46 – 48.
  7. Пренатальная диагностика хромосомных и моногенных заболеваний у плода / В.С.Баранов, М.В.Асеев, Т.Э.Иващенко, Т.К.Кащеева, Т.В.Кузнецова, В.Г.Вахарловский  // «Угрожающие состояния плода и новорожденного. Новые технологии в диагностике и лечении». 1-ый съезд Росс. асс. специалистов перинатальной медицины. Тезисы. 1995. Суздаль. С.276.
  8. Пренатальная диагностика врожденных заболеваний в Петербурге / В.Г.Вахарловский, М.В.Асеев, Т.Э.Иващенко, Т.В.Кузнецова, Т.К.Кащеева, В.С.Баранов  // 2 Съезд медицинских генетиков Украины. Материалы. Львов.-1995. С.31.
  9. Кащеева Т.К. Биохимические сывороточные маркеры в формировании групп высокого риска рождения детей с хромосомными нарушениями и пороками развития плода / Кащеева Т.К., Вахарловский В.Г. // 2 Съезд медицинских генетиков Украины. Материалы. Львов. — 1995. — С.75.
  10. Клинические признаки болезни Дауна у плода / Вахарловский В.Г., Кащеева Т.К., Кузнецова Т.В., Макеев Е.Ю., Баранов В.С. // Актуальные вопросы физиологии и патофизиологии репродуктивной функции женщины. — СПб, 1995. — С. 49 – 50.
  11. Кащеева Т.К.  Исследование белков сыворотки крови беременных и формирование групп высокого риска патологии у плода / Кащеева Т.К., Вахарловский В.Г., Финберг Н.Г. // Генофонд населения Санкт-Петербурга и прогнозирование его динамики. Тезисы докл. — СПб, 1996. — С. 27 – 28.
  12. BB-Isoform of creatine kinase in amniotic fluid as a marker of brain development disorders / Arutjunyan A.V., Pavlova N.G., Konstantinova N.N., Pavlenko A.V., Kascheyeva T.K., Lyzlova L.V., Kosina L.S., Rusina E.I., Mikhailov A.V., Shelayeva E.V.  / In: A. Teelken, J. Korf  Neurochemistry: cellular, molecular, and clinical aspects. Eur. Soc. Neurochem.  Springer, 1997. — P. 457 – 460. 
  13. Prenatal biochemical screening in S.-Petersburg federal medical center / Kascheeva T.K., Vakharlovsky V.G., Kuznetzova T.V., Baranov V.S.// 2-nd PECO-EUCROMIC Conference on Prenatal Diagnosis. Budapest. Hungary. June 1-4, 1997. — P. 56.
  14. Исследование содержания альфа-фетопротеина и хорионического гонадотропина в крови матери, опыт селективного скрининга / Кащеева Т.К., Вахарловский В.Г., Финберг Н.Г.,  Кузнецова Т.В., Баранов В.С. /Медико-генетическое консультирование в профилактике наследственных болезней. Росс. научно-практ. конф. / Сб. тезисов докл. стенд. сообщ. — М, 1997. — С. 141 – 142.
  15. Особенности исследования сывороточных маркеров у беременных Санкт-Петербурга / Кащеева Т.К., Вахарловский В.Г., Кузнецова Т.В., Акопова Ю.В., Гусева М.Е., Карева И.В., Баранов В.С. // V Съезд Росс. Асс. ультразвуковой диагностики в перинатологии и гинекологии. СПб. — 1998. — С.74.
  16. Кащеева Т.К. Опыт селективного скрининга  маркерных  сывороточных белков / Кащеева Т.К., Вахарловский В.Г., Кузнецова Т.В., Баранов В.С.  // Современные  медицинские технологии. — Новосибирск: Альфа-Виста, 1999. — С. 281–282.
  17. Paykacheva Yu.A. Prognostic significance of HCG measurements in IVF program / Paykacheva Yu.A., Kascheeva T.K., Korsak V.S. // Ж. акуш. жен. болезн. — 1999. — Т. XLVIII, Suppl.1. — P. 76.
  18. Кащеева Т.К. Использование сывороточных маркеров  в оценке риска хромосомных нарушений у  плода и патологического течения беременности / Кащеева Т.К., Вахарловский В.Г., Пайкачева Ю.А /Второй (Четвертый) Росс. съезд мед. генетиков; тезисы докл., ч.2. — Курск, 2000. — С. 139 — 140.
  19. Кащеева Т.К. Синдром Дауна у плода после экстракорпорального оплодотворения / Кащеева Т.К., Вахарловский В.Г. // Проблемы репродукции. — 2000. — № 3. — С. 77–78.
  20. Kascheeva T. Serum markers in pregnancy after in vitro fertilization / Kascheeva T., Vakharlovsky V., Paikacheva Yu., Arzhanova O. // Eur. J. Hum. Genet. — 2001. — V. 9, Suppl. 1. —  P. 228. 
  21. Клинические особенности синдрома Эдвардса у плода / Вахарловский В.Г., Кащеева Т.К., Кузнецова Т.В., Гусева М.Е., Акопова Ю.В., Баранов В.С. //Акушерство и гинекология. Достижения и пути развития в ХХI веке. Сб. научных трудов. — 2002, СПб. — С. 35-39.
  22. Некрасова Е.С. Комбинированный ультразвуковой и биохимический скрининг хромосомной патологии плода в первом триместре беременности / Некрасова Е.С., Кащеева Т.К., Коротеев А.Л. // Мед. генет. — 2003. — Т. 10. — С. 430.
  23. Белки в пренатальной диагностике врожденных и наследственных заболеваний человека / Кащеева Т.К. [и др.] // Материалы 3-й научн. конф. «Белки – маркеры патологических состояний». Астрахань. — 2003.  — С. 7 – 8.
  24. Kascheeva T.  Pecularities of biochemical markers fluctuation in 130 Down syndrome cases / Kascheeva T., Vakharlovsky V., Baranov V., Vokhmyanina N. // Eur.J.Hum.Genet. — 2003. — V.11, Suppl.1. — P.150. 
  25. Maternal serum markers in North-West Russia / Kascheeva T., Vakharlovsky V., Vokhmyanina N., Kuznetzova T., Romanenko O., Baranov V. //Down’s screening news.-  2003.- V.10, N2. - P.30-31.
  26. Prenatal first trimester screening  in Saint-Petersburg / Kascheeva T., Nekrasova E., Koroteev A., Kuznetzova T., Baranov V. // Eur. J. Hum.Genet. — 2004. — V.12. Suppl. 1. — P.157.
  27. Опыт биохимического скрининга маркерных сывороточных белков у беременных Санкт-Петербурга (1997–2002) / Кащеева Т.К.,  Вахарловский В.Г., Гусева М.Е.,  Вохмянина Н.В., Романенко О.П. //  Пренатальная диагностика. — 2004. — Т. 3, № 2. — С. 94 – 98.
  28. Биохимический скрининг маркерных сывороточных белков у беременных / Кащеева Т.К., Вахарловский В.Г., Гусева М.Е., Некрасова Е.С., Вохмянина Н.В., Романенко О.П. // Медико-генетическая служба  Санкт-Петербурга. К 35-летию организации медико-генетического центра. — СПб, 2004. — С. 188 – 194.
  29. Вахарловский В.Г. Риск болезни Дауна у плода в зависимости от возраста матери / Вахарловский В.Г., Кащеева Т.К., Баранов В.С. //  Современные проблемы формирования здоровья человека в перинатальном периоде и детском возрасте / Ред. Н.П.Шабалов. — СПб, 2004. — С. 52 – 54. 
  30. Prenatal Biochemical Screening  In Saint-Petersburg / Kascheeva T., Vakharlovsky V., Vokhmyanina N., Kuznetzova T., Romanenko O., Baranov V. // 12-th Int. Clinical Genetics Seminar. 2004. Athens. Greece. Abstracts. P. 30-31.
  31. First results combined ultrasound and biochemical screening of fetal chromosomal disorders  in the first trimester of pregnancy in Russia / Nekrasova E., Kascheeva T., Koroteev A., Kuznetzova T., Baranov V. // 12-th Int. Clinical Genetics Seminar. 2004. Athens. Greece. Abstracts. P. 29.
  32. Пренатальная диагностика в акушерстве / Баранов В.С., Кузнецова Т.В., Иващенко Т.Э., Кащеева Т.К., Вахарловский В.Г., Коротеев А.Л. / Молекулярно-биологические технологии в медицинской практике. Вып.5.- Новосибирск: Альфа-Виста, 2004.— С. 81 – 109.
  33. Алгоритмы пренатальной диагностики в Санкт-Петербурге / Баранов В.С., Кузнецова Т.В., Иващенко Т.Э., Кащеева Т.К., Асеев М.В., Коротеев А.Л., Вахарловский В.Г., Некрасова Е.С., Романенко О.П., Воронин Д.В., Вохмянина Н.В. / Молекулярно-биологические технологии в медицинской практике. Вып.5. — Новосибирск: Альфа-Виста, 2004.— С. 29 – 80.
  34. Кащеева Т.К. Первый опыт комбинированного биохимического и ультразвукового скрининга в 1-м триместре беременности / Кащеева Т.К., Некрасова Е.С. // Лабораторная диагностика. — 2004. — Т. 3. —С. 24 – 25. 
  35. Кащеева Т.К. О соблюдении принципов проведения биохимического скрининга беременных в Санкт-Петербурге / Кащеева Т.К., Вахарловский В.Г., Баранов В.С. // Лаборатория. — 2005. — № 2. — С. 16.
  36. Кащеева Т.К. Первый опыт комбинированного скрининга в 1-м триместре беременности / Кащеева Т.К., Некрасова Е.С. // Терра медика. — 2005. —Т.2. — С. 12 – 14.
  37. Kascheeva T.K.The 1st and  the 2nd trimesters  DS-screening in Saint-Petersburg / Kascheeva T.K., Nikolaeva Yu.A., Krechmar M.V., Nekrasova E.S. // The 7-th Int. Congress of Int. Down Syndrome Screening Group. Abstracts. Amsterdam. — 2006. — P.24.
  38. Down’s syndrome screening in Saint-Petersburg. Ten years experience (1997-2006) / Kascheeva T.K., Nikolaeva Y.A., Vokhmyanina N.A. et al. // Eur. J. Hum. Genet. — 2007. — V.15,  Suppl.1. — P.134. 
  39. Кащеева Т.К. Современное состояние  пренатального биохимического скрининга // Клин.-лабор. консилиум. — 2007. — №15. — С. 37 – 41.
  40. Кащеева Т.К. Риск рождения ребенка с синдромом Дауна в случае исследования крови матери  в первом и во втором триместре беременности / Кащеева Т.К., Николаева Ю.А., Кузнецова Т.В., Баранов В.С.  // Современные  медицинские технологии  / Ред. Масленников А.Б.; Вып. 12.; Новосибирск: Альфа-Виста Н. — 2008. — С. 170 – 178.
  41. Кащеева Т.К. Пренатальный биохимический скрининг и автоматизированный расчет риска патологии плода / Кащеева Т.К.,  Баранов В.С.,  Полынцев Д.Г., Кубайчук А.Б. // Справ. зав. КДЛ. — 2008. — № 8. — С. 24 – 28.
  42. Кащеева Т.К. Использование  программ  пренатального скрининга – возможности и перспективы / Кащеева Т.К., Ивашкина С.Г., Денисова О.В., Гордеев А.С. // Справ. зав. КДЛ. — 2008. — Т.  10. — С.27 – 34.
  43. Пренатальный биохимический скрининг  в Санкт-Петербурге (1997-2007) / Кащеева Т.К., Николаева Ю.А., Кречмар М.В., Вохмянина Н.В., Романенко О.П., Баранов В.С. //  Сб. материалов IV съезда медицинских генетиков Украины. Львов. — 2008. — С.32.
  44. Кащеева Т.К. Упрощенный метод расчета индивидуального риска рождения ребенка с синдромом Дауна по результатам пренатального скрининга в 1 и 2-м триместрах // Клин.-лабор. консилиум. — 2008. — Т. 5. — С. 33 – 37.
  45. Sequential and Integrated prenatal screening for Down syndrome / Kascheeva T.K., Nikolaeva Y.A., Kuznetzova T.V., Baranov V.S. // Eur.J.Hum.Genet.—2008.—V.16,Suppl.2.—P.174. 
  46. Correction of individual risk estimation for prenatal  Down syndrome screening  in Saint-Petersburg / Kascheeva T.K.,  Nikolaeva Y.A., Krechmar M.V., Baranov V.S. // IDSSG. 8-th Int.Congress. 2008. Abstracts book. Vankouver, Canada. P.22-23.
  47. Prenatal biochemical screening  in Saint-Petersburg / Kascheeva T.,  Nikolaeva Yu., Koroteev A., Vokhmyanina N., Kuznetzova T., Romanenko O., Baranov V.  // Prenat. Diagn. — 2008. — V.28, S.1. — S.60.



© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.