WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


 

На правах рукописи

ГРОМЕНКО

Дмитрий Сергеевич

ОСОБЕННОСТИ ПАТОГЕНЕЗА 

ИДИОПАТИЧЕСКОЙ ПАТОЗООСПЕРМИИ

ПРИ МУЖСКОЙ ИНФЕРТИЛЬНОСТИ

14.00.16 – Патологическая физиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

доктора медицинских наук

Санкт-Петербург

2009

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научные консультанты:

доктор медицинских наук профессор  Фархутдинов Рафагат Равильевич

доктор медицинских наук профессор Галимов Шамиль Нариманович

Официальные оппоненты: 

доктор медицинских наук профессор Тюкавин Александр Иванович

доктор медицинских наук профессор Николаев Валентин Иванович

доктор медицинских наук профессор Митрейкин Владимир Филиппович

Ведущая организация ГОУ ВПО «Военно-медицинская академия им. С.М.Кирова»

Защита диссертации состоится  «___»_________2009 года в____ часов  на заседании диссертационного совета Д 208.089.02 при Государственном образовательном учреждении дополнительного профессионального образования «Санкт-Петербургская медицинская академия последипломного образования Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (191015, Санкт-Петербург, ул. Кирочная, д.41).

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке Академии (195196, Санкт-Петербург, Заневский пр., д. 1/82).

Автореферат разослан  «______»__________________2009 года.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук, доцент Г.Н. Горбунов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Около 15% супружеских пар во всем мире имеют проблемы с естественным наступлением беременности (Тиктинский О.Л., Михайличенко В.В., 1999). Удельный вес мужского фактора в бесплодном браке составляет не менее 40% (Кирпатовский  И.Д., 1995; Healy D.L., Trounson A.O., Andersen A.N., 1994). В последние десятилетия отмечается снижение активности сперматогенеза у мужчин в различных странах (Purvis K., 1992;  Farrow S., 1994; Irvine S., 1996; De Kretser D.M., 1998). Большинство авторов связывают ухудшение показателей репродуктивного здоровья мужчин с антропогенным загрязнением окружающей среды (Никитин А.И., 2005).

Нарушение гаметогенеза у мужчин, состоящих в бесплодном браке, несмотря на многообразие этиологических факторов, является звеном в патогенезе ограниченного числа типовых патологических процессов, которые клинически могут проявляться в виде различных заболеваний, что затрудняет выбор патогенетически обоснованной терапии и является причиной необоснованной полипрагмазии (Шупегин В.В., 2003). Примерно у 25% бесплодных мужчин причину патологии не находят. Во многом это объясняется недостаточной эффективностью стандартных методов исследования мужской половой сферы.

Выбор конкретных методов лечения мужского бесплодия затруднителен на сегодняшний день по нескольким причинам (Артифексов С.Б. и др., 2006):

  1. Наличие большого числа фармакологических средств, рекомендуемых для коррекции мужской инфертильности.
  2. Отсутствие патогенетических показаний к применению того или иного метода лечения, поскольку основанием  для применения фармакологических средств является патоспермия, но не вызвавшие её причины.
  3. Недостаточная изученность особенностей этиологии и патогенеза мужской         инфертильности и наличие нескольких возможных причин патоспермии у одного мужчины.

Главной задачей андрологии является не поиск новых фармакологических препаратов, а углубленный анализ причин формирования инфертильности у мужчин в каждом конкретном случае в целях подбора патогенетически оправданной терапии (Артифексов С.Б.  и др., 2006).

В последние годы особое внимание уделяется влиянию свободнорадикального окисления (СРО) на мужскую половую функцию. С одной стороны избыток свободных радикалов и вызванный ими окисли­тельный стресс может отрицательно влиять на сперматогенез, а с другой - нормальное функционирование сперма­тозоидов требует присутствия физиологических ко­личеств активных форм кислорода (АФК) (Aitken R.J., Fisher Н., 1994; Aitken R.J., 1995). В норме сперматозоиды защищены от окислительного стресса ферментами антиоксидантной системы, регулирующей концентрацию АФК. АФК в избыточном количестве могут инициировать нарушения в сперматозоидах путем индукции оксидативного повреждения клеточных липидов, протеинов и ДНК, что является одним из механизмов патогенеза мужского бесплодия (Griveau J.F., Le Lannou D., 1997; Kemal Duru N., Morshedi M., Oehninger S., 2000). Наблюдается корреляция между генерацией АФК и антиоксидантной активностью спермоплазмы и сочетанием нарушения данных показателей с мужским бесплодием (Sharma R.K., Pasqualotto F.F., Nelson D.R. et al., 1999). Идеальным способом, позволяющим получить представление о процессах СРО, непосредственно обнаруживая свободные радикалы, является регистрация хемилюминесценции (ХЛ), возникающей при рекомбинации радикалов (Фархутдинов Р. Р.,1988; Фархутдинов Р.Р., Лиховских В.А., 1995). Исследуя ХЛ биосубстратов, можно судить о СРО в органах и тканях.

Расшифровка соответствующих патогенетических механизмов мужского бесплодия и, в конечном итоге, выработка рациональной терапии – одна из наиболее актуальных задач современной андрологии.

Цель исследования

Определить особенности патогенеза идиопатической патозооспермии и их взаимосвязь с процессами свободнорадикального окисления в условиях экзогенных воздействий токсических факторов.

Задачи исследования

  1. Определить частоту встречаемости патоспермии в структуре бесплодного брака на территории Республики Башкортостан.
  2. С учетом особенностей экологической обстановки в регионе оценить влияние техногенной нагрузки и уровня репротоксикантов в биологических жидкостях на развитие патоспермии.
  3. Изучить процессы свободнорадикального окисления в сперме мужчин, состоящих в бесплодном браке.
  4. Сравнить активность процессов свободнорадикального окисления и содержание репротоксикантов класса диоксинов и диоксиноподобных соединений в сперме инфертильных мужчин.
  5. Изучить связи между развитием патоспермии и уровнем свободнорадикального окисления в гонадах и сперме лабораторных животных при хроническом воздействии репротоксикантов класса полихлорированных бифенилов (совтол).
  6. В эксперименте на животных оценить возможность использования природных антиоксидантов для предупреждения развития патоспермии, вызванной нарушением свободнорадикального окисления в репродуктивных органах.
  7. Определить влияние криоконсервации, применяемой для создания банка половых клеток, на процессы свободнорадикального окисления в сперме животных.
  8. На основе полученных данных разработать комплекс диагностических и организационно-профилактических мероприятий для внедрения в практическое здравоохранение с целью охраны мужского репродуктивного здоровья.

Научная новизна исследования

Выявлены особенности этиологии и патогенеза мужской инфертильности при идиопатических формах бесплодия. Установлено, что при мужской инфертильности, развившейся на фоне действия стойких органических загрязнителей, происходит снижение антиокислительной активности спермоплазмы при незначительном увеличении генерации активных форм кислорода морфологически или функционально неполноценными сперматозоидами.

Определено содержание диоксинов и диоксиноподобных соединений в пересчете на токсические эквиваленты (ТЭ/TEQ ВОЗ) в суммарных пробах спермы мужчин, проживающих в индустриальных городах Республики Башкортостан. Выявлена прямая зависимость между содержанием диоксинов и диоксиноподобных соединений в сперме и развитием патозооспермии.  На экспериментальных моделях выявлено влияние репротоксикантов класса ПХБ на сперматогенез и предложена схема развития патологического процесса. Впервые изучены процессы свободнорадикального окисления при криоконсервации спермы.  Определены новые подходы к патогенетическому лечению мужского бесплодия с учетом роли свободнорадикального окисления, заключающиеся в проведении рациональной антиоксидантной терапии, коррекции интенсивности генерации активных форм кислорода. В эксперименте на животных обосновано применение лечебных мероприятий при нарушении фертильности в условиях хронического оксидантного стресса.

Практическая значимость работы

Разработаны критерии для выделения групп повышенного риска по развитию мужской инфертильности. В результате проведенных исследований внедрен в практику экспресс-метод оценки состояния свободнорадикального окисления в эякуляте, заключающийся в определении интегральных показателей суммарной антиокислительной активности спермоплазмы в модельной системе, генерирующей активные формы кислорода, и спонтанного люминолзависимого свечения эякулята.

Разработаны патогенетически обоснованные показания к применению антиоксидантной терапии мужского бесплодия с учетом причин, приведших к развитию патоспермии. Результаты проведенных исследований по уровню патоспермии в регионах Республики Башкортостан способны оказать содействие практическому здравоохранению в планировании медицинской помощи по охране репродуктивного здоровья мужчин.

Основные положения, выносимые на защиту:

  1. Частота патоспермии в структуре бесплодного брака на территории Республики Башкортостан составляет 70,25%.
  2. В структуре мужского бесплодия идиопатические формы встречаются с частотой 45,3%.
  3. Хемилюминесцентные методы исследования позволяют выявить нарушения равновесия между продукцией активных форм кислорода и системой антиокислительной защиты в сперме мужчин.
  4. При идиопатической форме патозооспермии в регионах с повышенным риском экзогенного воздействия токсических факторов наблюдается уменьшение защитных свойств спермоплазмы в виде снижения уровня суммарной антиокислительной активности наряду с повышением образования АФК морфологически или функционально неполноценными сперматозоидами.
  5. Содержание диоксинов и диоксиноподобных соединений в пересчете на токсические эквиваленты (ТЭ/TEQ ВОЗ) в суммарных пробах спермы мужчин, проживающих в индустриальных городах Республики Башкортостан, превышает соответствующие уровни в крови у тех же мужчин.
  6. Одним из механизмов, приводящих к развитию патоспермии при действии стойких органических загрязнителей, является нарушение процессов свободнорадикального окисления. Данные изменения проявляются в виде снижения уровня суммарной антиокислительной активности в тестикулярной ткани, что приводит к ранней активации и незрелости сперматозоидов, и, как следствие, морфологическим изменениям половых клеток и снижению их функциональных характеристик.
  7. Выявление патогенетических механизмов бесплодия, связанных с нарушением равновесия процессов свободнорадикального окисления в сперме и приведших к развитию идиопатической патозооспермии, позволяет обосновать тактику лечения, направленную на коррекцию патологического процесса.

Вклад автора в проведенное исследование

  Автору принадлежит идея оценки состояния свободнорадикального окисления семенной жидкости для оценки мужской инфертильности,  им разработаны и внедрены в практику методы исследования спермы, основанные на регистрации хемилюминесценции. Автором лично осуществлено ведение большинства пациентов и проведена экспериментальная часть исследования, проведена статистическая обработка и анализ материала.

Апробация работы

Материалы диссертации доложены на всероссийской конференции «Научные аспекты экологических проблем России» (Санкт-Петербург, 2001г.),VII и VIII конференциях Российской ассоциации репродукции человека (Саратов, 2001г.; Екатеринбург, 2002г.), международном к конгрессе «Новые медицинские технологии», г. Санкт-Петербург, 2001г., секционном заседании «Репродуктивное здоровье мужского населения РБ» съезда врачей акушеров-гинекологов и педиатров Республики Башкортостан, г.Уфа, 2001г., I Всероссийской научной конференции с международным участием «Влияние загрязнения окружающей среды на здоровье человека» (Новосибирск, 2002г.), XII Международной конференции «Репродуктивные технологии сегодня и завтра» (Санкт-Петербург, 2003г.), I, II, III и IV Российских научных форумах «Мужское здоровье и долголетие» (Москва, 2003-2006гг.), заседании общества урологов Республики Башкортостан (Уфа, 2004-2005гг.), научно-практической конференции «Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека», г. Смоленск, 2005г., II конгрессе Профессиональной Ассоциации андрологов России (Сочи, 2006г.).

Внедрение результатов исследования в практику

Экспресс-метод оценки состояния свободнорадикального окисления в эякуляте внедрен в практику Республиканской клинической больницы им. Г.Г.Куватова. Разработанный метод  используется для диагностики и определения тактики лечения мужского бесплодия в Республиканской клинической больнице им. Г.Г.Куватова и Республиканском перинатальном центре. Материалы, полученные в диссертации, введены в учебную программу и включены в курс лекций для студентов и курсантов института последипломного образования Башкирского государственного медицинского университета. Результаты исследования послужили основой экспертных материалов для разработки Закона Республики Башкортостан «О внесении изменений в Закон Республики Башкортостан «Об охране семьи, материнства, отцовства и детства в Республике Башкортостан».

Публикации

По теме диссертации опубликовано 45 печатных работ, наиболее значительные из них приведены в автореферате, получено 2 патента РФ на изобретения.

Объём и структура диссертации

Работа изложена на 247 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы. Диссертация иллюстрирована 27 таблицами, 42 рисунками. В библиографический указатель включено 499 источников литературы, из которых 178 – отечественных и 321 – зарубежных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы  исследования

В данной работе, в соответствии с поставленной целью и задачами, были выделены следующие основные этапы исследования (табл. 1).

Таблица 1

Общая характеристика и объем проведенного исследования

Этапы и задачи исследования

Объект и объем исследования

Методы исследования

Клинический раздел работы

1

Анализ показателей семенной жидкости мужчин, состоящих в бесплодном браке и проживающих в РБ

Семенная жидкость 4000

мужчин

Стандартный лабораторный анализ семенной жидкости

2

Сравнительная оценка патоспермии с

уровнем удельного выброса

загрязняющих

веществ

Семенная жидкость 2810

мужчин  с

патоспермией

Статистическая обработка полученных данных

(параметрическая

корреляция Пирсона)

3

Определение уровня диоксинов и диоксиноподобных веществ в семенной жидкости мужчин в промышленных городах РБ

Семенная жидкость 565 жителей промышленных городов РБ

Стандартный лабораторный анализ семенной жидкости. Комбинированный метод, включающий высокоэффективную газовую хроматографию с хроматомасс-спектрометрией высокого разрешения

4

Клинико-лабораторное обследование мужчин с нормозооспермией и идиопатической патозооспермией, состоящих в бесплодном браке

4 группы пациентов по 30 человек в каждой, сформированных с учетом уровней репротоксикантов

в эякуляте, полученных на предыдущем этапе, и показателей спермограммы

Физикальное и  общеклиническое обследование пациентов.

Стандартный лабораторный анализ семенной жидкости.

Исследование хемилюминесценции (ХЛ) семенной жидкости.

Статистическая обработка полученных данных 

Продолжение табл. 1

Этапы и задачи исследования

Объект и объем исследования

Методы исследования

Лабораторный раздел работы

1

Экспериментальное моделирование

воздействия ПХБ на сперматогенез и процессы СРО в семенниках лабораторных

животных; изучение

действия препарата, влияющего на СРО и функциональную

активность половых клеток, при

хроническом

оксидативном стрессе

90 белых

(30 самцов,

60 самок)

беспородных крыс, разделенных на три группы с учетом поставленных задач

Оценка плодовитости затравленных животных.

Изучение морфологии сперматозоидов при помощи дифференциальной окраски клеток; гистологические изучение

семенников исследуемых

животных.

Исследование люминолзависимой и Fe2+индуцированной ХЛ гомогенатов тестикул и придатков, лекарственного препарата и отравляющего

вещества


2

Изучение влияния криоконсервации на процессы СРО в семенной жидкости

Семенная

жидкость,

полученная от 8

племенных

быков

Регистрация люминолзависимой ХЛ, Fe2+индуцированной ХЛ семенной жидкости, клеток и спермоплазмы


3

Анализ результатов, для оценки фертильности

90 белых беспородных крыс; семенная жидкость, полученная от 8 племенных быков

Статистическая обработка данных  с использованием t-критерия Стьюдента, сравнение показателей ХЛ и морфологических характеристик семенников, семенной жидкости исследуемых животных

С целью выявления патогенетических механизмов в условиях экзогенных воздействий было проведено изучение параметров СРО в семенной жидкости. Предварительно обследовано 4000 мужчин с 2002 по 2005 годы включительно, обратившихся в Республиканскую клиническую больницу им. Г.Г.Куватова и Республиканский перинатальный центр по проблеме бесплодия в браке. Проведено сопоставление уровней патозооспермии и удельного выброса загрязняющих веществ, приходящегося на единицу площади (по данным Государственного доклада «О состоянии окружающей природной среды Республики Башкортостан в 2000 году»).

Для определения в сперме уровня диоксинов исследована группа из 565 человек в возрасте 26-40 лет, проживающих в промышленных городах Башкирии (Уфа, Стерлитамак, Салават, Туймазы, Ишимбай, Октябрьский). Анализ суперэкотоксикантов производился с помощью комбинированного метода, сочетающего высокоэффективную газовую хроматографию с хроматомасс-спектрометрией высокого разрешения. Система измерения HRGC/HRMS состояла из хроматографа «Carlo Erba 8035» (Италия), хроматомасс-спектрометра «Autospec-Ultima VG» (Великобритания) и колонки DB-5 MS 60 м («J&W Scientific»). Контроль степени извлечения, уровня очистки и калибровки системы измерения был выполнен в соответствии с методикой Агентства США по  охране окружающей среды (USEPA 1613) (EPA Method 1613. Tetra-through octa-chlorinated dioxins and furans by isotope dilution HRGC/HRMC., 1994). Поскольку суперэкотоксиканты в наибольшей степени накапливаются в липофильных матрицах, все результаты даны в пересчете на содержание липидов в образцах эякулята. Были сформированы 4  группы наблюдения. Каждая группа включала 30 человек, удовлетворяющих критериям отбора и исключения. Состав всех групп был однороден по возрасту, материально-бытовым условиям, обеспеченности квалифицированной медицинской помощью, продолжительности проживания в данном районе, а также здоровью и социальному положению.

Возраст пациентов колебался от 20 до 45 лет. Средний возраст мужчин в I группе составил 31,2±0,8 лет, во II группе  - 30,3±0,8 лет, в III группе  - 30,7±1,0 лет, в IV группе – 31,8±1,0 лет. Все обследованные мужчины состояли в бесплодном браке от 1 года до 10 лет. Первичное бесплодие было у 105 пациентов (87,5%), вторичное бесплодие выявлялось у 15 (12,5%) мужчин.

Всем пациентам проведено комплексное клинико-лабораторное обследование с применением инфекционного скрининга (путем полимеразной цепной реакции), гормональных методов диагностики (определение фолликулостимулирующего гормона, тестостерона, пролактина), трансректального ультразвукового исследования предстательной железы и семенных пузырьков, допплерографии сосудов мошонки. Всем пациентам проводились общеклинические исследования эякулята, включающие оценку семенной жидкости, полученную после периода полового покоя.

Изучение процессов генерации АФК спермы при нормо- и патозооспермии было выполнено у всех пациентов исследуемых групп по разработанной методике комплексного исследования состояния генерации АФК в сперме (патенты на изобретения № 2278382 от 20.06.2006г. и № 2272291 от 20.03.2006г., соавт.: Фархутдинов Р.Р., Галимов Ш.Н., Шемагонов Д.В.).

С целью изучения интенсивности свободнорадикальных процессов и антиокислительной активности проводился хемилюминесцентный анализ спермы. Регистрацию  ХЛ эякулята проводили на аппарате «Хемилюминомер – 003» с компьютерным обеспечением. Об интенсивности люминолзависимой ХЛ судили по ряду параметров, в первую очередь, по светосумме и максимальной амплитуде свечения, которые соответствовали скорости образования АФК. Перед измерением свечения определенный исследуемый объем спермы смешивали  с 2 мл физиологического раствора, содержащего люминол (5-амино-2,3-дигидро-1,4-фталазиндион) в конечной концентрации 10-5 М, и помещали в  светоизолированную камеру прибора. Тщательно перемешивали и вели запись ХЛ при 37 °C в течение 5 мин.

Для оценки антиокислительной активности 0,1 мл спермоплазмы добавляли к модельной системе. В качестве модельной системы использовали 20 мл фосфатного буфера (KH2PO4 – 20 mM, KCl – 105 mM, рН 7,45) с цитратом (50 mM) и люминолом (10-5 M). В течение 10 секунд записывали темновой ток, после чего вносили инициатор образования АФК – 1 мл 50 mM раствора сернокислого железа (FeSO47H2O). Конечная концентрация FeSO4 в среде инкубации составляла 2,5 mM. Запись свечения проводили в течение 5 минут при постоянном перемешивании.  При оценке Fe2+-индуцированной ХЛ определяли величину спонтанного свечения, продолжительности латентного периода от момента введения ионов железа до начала развития медленной вспышки.  Также оценивали амплитуды быстрой и медленной вспышек.

С целью определения источника АФК в эякуляте проводили разделение клеток спермы в градиенте плотности.

Опыты выполнены на 90 белых беспородных крысах репродуктивного возраста массой 200-260 г (30 самцов и 60 самок). Моделью отравления было выбрано пероральное введение полихлорированных бифенилов (ПХБ) – раствора «Совтол». Хроническая интоксикация подопытных животных первой группы (10 самцов) моделировалась введением раствора «Совтол» в течение 3 месяцев в суммарной дозе 0,3 г/кг (0,05 LD50).

Вторую группу составили животные (10 самцов), которым на фоне проведения затравки в дозировке, аналогичной с первой группой, дополнительно в желудок вводили комплекс биофлавоноидов прополиса в виде биологически активной добавки «ПропоФлан» (Свидетельство о государственной регистрации № 77.99.23.3.У.5621.11.04. от 10.11.2004; ТУ 9354-002-55832354-04), изготовленной в ЗАО «Фармацевтическая компания «БИОНОРМ», Россия, в дозировке 30 мг/кг. Препарат разработан с целью патогенетической коррекции нарушений мужской репродуктивной функции (Галимов Ш.Н., Мухамедзянов Р.М., 2005). Антиокислительную активность препарата оценивали в модельных системах, генерирующих АФК и ПОЛ, при добавлении «ПропоФлана» к липидам, полученным из куриного желтка, содержащего липопротеиновые комп­лексы, сходные с липидами крови (Фархутдинов Р.Р., Тевдорадзе С.И., 2005).

Контрольной группе животных (10 самцов) вводили в желудок взамен «Совтола» физиологический раствор (0,9% раствор хлорида натрия).

Проводили оценку оплодотворяющей способности самцов крыс, для чего их подсаживали к интактным самкам (по 2 самки на самца). Вычисляли 3 основных показателя, дающих количественную характеристику гонадотропных эффектов токсиканта: индекс фертильности = (число беременных самок/общее число самок) х100; индекс гестации = (число родивших самок/число беременных самок) х100; индекс плодовитости = число родившихся крысят/число родивших самок  (Куценко С.А., 2004).

Оценивали состояние сперматогенеза, жизнеспособность сперматозоидов, интенсивность свободнорадикальных процессов и антиокислительной активности. Выполнялась дифференциальная окраска  сперматозоидов с последующей оценкой строгой морфологии, исследовалось содержание ТБК-активных продуктов в семенниках животных (Владимиров Ю.А., 1972).

Исследование процессов свободнорадикального окисления до и после криоконсервации спермы было проведено на материале, полученном от  племенных быков-производителей Уфимского племенного хозяйства. Исследовали люминолзависимую и Fe2+-индуцированную хемилюминесценцию по Владимирову Ю.А. (1989).

Статистическая обработка полученных результатов проводилась на персональном компьютере с применением программного обеспечения Microsoft Excel (Microsoft corp., 2003), Statistica Inc Ver. 7 (StatSoft, STATISTICA for Windows). Степень взаимосвязи между признаками оценивали по Пирсону. В качестве описательных статистик использованы средняя (М) и ошибка средней (m). Исследуемые группы сравнивались при помощи t-критерия Стьюдента для независимых переменных после выполнения следующих условий: нормальность распределения (тест Лильефорса) и равенства дисперсий обеих выборок.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Анализ параметров семенной жидкости у мужчин с бесплодием

В предварительном исследовании были представлены жители всех 54 районов Республики Башкортостан. За 2002 год были проанализированы данные 1341 мужчины, что составило 33,5% от общего количества обследованных пациентов в данном исследовании, за 2003 год  - 977 (24,4%), за 2004 год – 1269 (31,7%), за 2005 год -  413 (10,3%). Основные показатели спермограмм по годам наблюдений представлены в таблице 2.

Таблица 2

Параметры семенной жидкости у мужчин за 2002-2005 годы (n=4000)

Показатели эякулята

Год

(число наблюдений)

2002

(n=1341)

2003

(n=977)

2004

(n=1269)

2005

(n=413)

Объем эякулята, мл

3,3±0,04

3,2±0,05*

3,3±0,04

3,3±0,08

рН

7,6±0,01

7,7±0,01***

7,2±0,01***

7,4±0,01***

Концентрация сперматозоидов, млн/мл

32,7±0,80

28,5±0,83***

58,8±1,57***

63,9±2,83

Подвижность сперматозоидов,

%

категории «А»

29,3±0,53

22,4±0,48***

27,7±0,57***

26,8±0,92

категории «B»

12,8±0,29

14,4±0,31***

9,9±0,18***

10,5±0,29

категории «C»

14,4±0,35

21,6±0,41***

18,5±0,36***

21,5±0,65***

категории «D»

36,3±0,55

31,6±0,55***

36,3±0,47***

33,2±0,79***

Морфологически полноценные формы, %

40,8±0,51

52,2±0,73***

50,9±0,60

40,8±1,73***

Клетки сперматогенеза, млн/мл

0,33±0,01

0,6±0,03***

0,1±0,01***

0,15±0,03

Лейкоциты, млн/мл

0,2±0,01

0,2±0,02**

0,2±0,02

0,3±0,03

Примечание: здесь и далее * - р<0,05; ** - р<0,01; ***- р<0,001 в сравнении с предыдущим годом

При анализе данных о количестве, морфологии и подвижности мужских половых клеток за 2002-2005 годы в Республике Башкортостан у пациентов, состоящих в бесплодном браке, было отмечено возрастание концентрации сперматозоидов при ухудшении подвижности (за счет уменьшения фракции «В»). Из 4000 обследованных мужчин с бесплодием у 2810 человек была выявлена патозооспермия, что составило 70,25% (рис.1). Примечательным является тот факт, что выявляемый уровень азооспермии в среднем составляет 8%, это соответствует литературным данным.

Прирост  патозооспермии обусловлен, прежде всего, увеличением количества субфертильных эякулятов, отклонения в которых близки к нормативным значениям, о чем свидетельствуют уровни подвижности и морфологических характеристик сперматозоидов. Это наводит на мысль о возможной обратимости данных изменений.

  Рис.1. Уровни общей патоспермии и азооспермии за период наблюдения

Для определения характера распределения патоспермии по районам Республики Башкортостан проведен подробный анализ всех случаев. С целью выявления причин патозооспермии были  проанализированы заключительные диагнозы по данным амбулаторных карт (рис.2).

Рис. 2. Причины бесплодия по заключительным диагнозам

Из представленных данных обращает на себя очень высокий процент идиопатического бесплодия (идиопатическая олигозооспермия, астенозооспермия, тератозооспермия  - 45,3%) у мужчин с патоспермией, что можно объяснить или несовершенством диагностического поиска, или имеющимися экзогенными воздействиями, вызывающими изолированную патоспермию. Исходя из этого, проведена оценка взаимосвязи развития патологии детородной функции у мужчин с экологической обстановкой в районах Республики Башкортостан.

В конце 80-х годов прошлого века Башкортостан входил в пятерку регионов России, лидирующих по выбросам загрязняющих веществ в атмосферу и в десятку - по сбросам загрязненных стоков. Сегодня республика по выбросам в атмосферу  и сбросам загрязняющих веществ находится во втором десятке среди субъектов Федерации. Все районы РБ были условно разделены на относительно «благополучные» (с удельным выбросом загрязняющих веществ, приходящимся на единицу площади от 0 до 2000 кг/га (удовлетворительный), 2000-4000 (напряженный)), и на относительно «неблагополучные» (где аналогичный показатель колеблется в диапазоне 4000-8000 кг/га (критический), 6000-8000 кг/га (экологически чрезвычайная ситуация), 8000 и более кг/га (экологическое бедствие)). Параметры приведены из Государственного доклада «О состоянии окружающей природной среды Республики Башкортостан в 2000 году», в последующих ежегодных докладах (2001-2004гг.) эти данные не анализировались.

По данным многих авторов обследование различных групп населения в регионах, подверженных и не подверженных воздействию токсинов и веществ, загрязняющих окружающую среду, выявило стойкую тенденцию к снижению концентрации сперматозоидов (Aitken R., Sawyer D., 2003). В табл. 3 представлены данные об удельном выбросе загрязняющих веществ по районам РБ наряду с уровнем патозооспермии. Большинство районов РБ относится к относительно «благополучной» зоне – 35 районов (64,8%). Сравнение показателей патологии репродуктивной функции мужчин с массой выбрасываемых загрязняющих веществ, приходящейся на единицу площади, не выявило корреляционной связи ни по уровню патозооспермии (R = - 0,0283, p = 0,84),  ни по уровню астенозооспермии (R = - 0,0559, p = 0,69), ни по уровню олигозооспермии (R = 0,2699, p = 0,05), ни по уровню тератозооспермии (R = 0,0329, p = 0,81).

Таблица 3 

Частота встречаемости патозооспермии и масса выбрасываемых загрязняющих веществ, приходящаяся на единицу площади, в Республике Башкортостан  (n=2810)

Районы РБ

Уровень

патозоо-

спермии

Удельный

выброс

(кг/га)

Районы РБ

Уровень

патозоо-

спермии

Удельный

выброс

(кг/га)

1

Абзелиловски

64,0

2000-4000

28

Ишимбайский

75,3

0-2000

4,1

2

Альшеевский

63,4

6000-8000

29

Калтасинский

54,5

4000-6000

4,5

3

Архангельский

80,0

0-2000

30

Караидельский

80,0

0-2000

8,0

4

Аскинский

77,3

0-2000

31

Кармаскалинский

66,0

8000 и >

14,9

5

Аургазинский

74,4

0-2000

32

Кигинский

77,8

0-2000

11,1

6

Баймакский

76,4

0-2000

33

Краснокамский

59,8

8000 и >

5,6

7

Бакалинский

78,1

4000-6000

34

Кугарчинский

72,2

0-2000

0,0

8

Балтачевский

53,8

2000-4000

35

Кушнаренковский

77,3

6000-8000

9,1

9

Белебеевский

75,3

2000-4000

36

Куюргазинский

76,9

8000 и >

11,5

10

Белокатайский

50,0

2000-4000

37

Мелеузовский

72,2

2000-4000

0,0

11

Белорецкий

61,9

0-2000

38

Мечетлинский

60,0

0-2000

0,0

12

Бижбулякский

78,9

2000-4000

39

Мишкинский

64,7

0-2000

5,9

13

Бирский

67,3

4000-6000

40

Миякинский

74,3

0-2000

2,9

14

Благоварский

66,7

6000-8000

41

Нуримановский

75,0

0-2000

10,0

15

Благовещенский

67,5

8000 и >

42

Салаватский

70,4

2000-4000

11,1

16

Буздякский

77,8

8000 и >

43

Стерлибашев

46,7

0-2000

0,0

17

Бураевский

65,0

0-2000

44

Стерлитамакский

78,6

8000 и >

10,7

18

Бурзянский

89,5

0-2000

45

Татышлинский

75,0

0-2000

0,0

19

Гафурийский

72,0

2000-4000

46

Туймазинский

72,6

4000-6000

4,8

20

Давлекановский

71,8

8000 и >

47

Уфимский

68,4

8000 и >

7,4

21

Дуванский

81,0

2000-4000

48

Учалинский

62,5

0-2000

5,0

22

Дюртюлинский

72,0

8000 и >

49

Федоровский

60,0

0-2000

23

Ермекеевский

91,7

0-2000

50

Хайбуллинский

61,1

0-2000

22,2

24

Зианчуринский

68,4

0-2000

51

Чекмагушевский

90,9

2000-4000

15,2

25

Зилаирский

80,0

0-2000

52

Чишминский

63,8

6000-8000

14,9

26

Иглинский

76,5

2000-4000

53

Шаранский

77,8

8000 и >

5,6

27

Илишевский

94,7

2000-4000

54

Янаульский

79,4

8000 и >

8,8

С целью определения возможных репротоксических воздействий на мужское население Башкортостана было проведено дальнейшее исследование (оценка влияния на сперматогенез стойких органических загрязнителей) с учетом особенностей региона. Содержание диоксинов и диоксиноподобных соединений в пересчете на токсические эквиваленты (ТЭ/TEQ ВОЗ) в суммарных пробах спермы мужчин, проживающих в индустриальных городах, находилось в пределах от 56,7 до 823,7 пг/г липидов и составило в среднем 262,4 пг/г(данные представлены в таблице 4), при соответствующих уровнях в крови тех же мужчин от 67 до 324 пг/г.

Таблица 4

Содержание ПХДД/ПХДФ в сперме жителей

некоторых промышленных городов (пг ТЭ-ВОЗ/г липидов)

Поллютант

Город

Уфа

Стерли-тамак

Салават

Ишим-бай

Туйма-зы

Благо-вещенск

Октябрь-ский

ТХДД

9,7

9,2

14,9

0

0

0

0

ПнХДД

25,9

19,0

29,7

1,3

1,0

7,5

451,3

∑ГкХДД

4,8

1,8

6,9

0,9

1,4

5,0

11,7

ГпХДД+ОХДД

1,0

1,0

1,0

0,6

0,1

3,8

4,3

ТХДФ+ ПнХДФ

40,5

19,2

56,4

79,4

135,1

276,1

285,9

∑ГкХДФ

19,8

5,2

23,8

53,9

43,6

92,6

67,7

ГпХДФ+ ОХДФ

3,0

1,3

3,2

3,1

1,3

8,0

10,0

Всего:

104,7

56,7

135,9

139,2

182,5

393,0

823,7

В среднем

262,4

ГкХДД –  гексахлордибензо-п-диоксин

ОХДД – октахлордибензо-п-диоксин


ГпХДД – гептахлордибензо-п-диоксин

ОХДФ – октахлордибензофуран


ГкХДФ – гексахлордибензофуран

ПнХДД – пентахлордибензо-п-диоксин


ГпХДФ – гептахлордибензофуран

ПнХДФ – пентахлордибензофуран


ТХДД – тетрахлордибензо-п-диоксин


Результаты исследования состояния репродуктивной функции жителей промышленных городов приведены в табл. 5. Сравнительный анализ качественных и количественных характеристик эякулята выявил ряд важных особенностей показателей спермограмм жителей индустриальных городов. Фактически у двух третей мужчин, включенных в группу наблюдения, имелся тот или иной вид патологии спермограммы. Так, в среднем по выборке доля подвижных сперматозоидов составляла 47,8 %, что несколько ниже рекомендованных значений, а в целом у жителей четырех из шести обследованных городов величина этого показателя не соответствовала норме. Практически те же изменения – на нижней границе нормативных значений – были характерны для другого параметра качества сперматозоидов – доли морфологически измененных клеток.

Таблица 5

Показатели эякулята и уровень патозооспермии у обследованных мужчин –

жителей промышленных городов (n=565)

 

Города РБ

Показатели

эякулята

Уфа

Стерлитамак

Салават

Ишимбай

Туймазы

Благовещенск

Октябрьский

Число наблюдений

222

126

58

34

59

33

33

Объем, мл

3,1±

0,45

3,3±

0,58

3,6±

0,52

2,6±

0,49

3,7±

0,62

3,0±

0,45

3,0±

0,51

Концентрация сперматозоидов,

млн/мл

40,7±

5,2

38,8±

4,3

30,5±

5,6

45,2±

7,3

40,9±

6,3

34,7±

4,2

33,8±

5,1

Подвижность категории «а»+«б», %

53,2±

4,6

49,9±

4,1

43,8±

6,0

52,4±

5,8

41,4±

5,4

44,3±

3,6

45,9±

4,8

Морфологически измененные формы, %

40,5±

3,8

41,0±

5,8

43,9±

5,3

34,4±

6,0

38,3±

4,1

42,1±

3,2

40,5±

5,6

Патозооспермия,%

14,9

7,9

19,0

20,6

16,9

27,3

27,3

Далее был проведен анализ зависимости процента патозооспермии от поллютанта. Выявлена прямая зависимость между содержанием диоксинов и диоксиноподобных соединений в сперме и развитием патозооспермии (R=0,78, p=0,040).

Феномен загрязнения спермы диоксинами служит доказательством взаимосвязи между состоянием окружающей среды и изменениями репродуктивной функции и демонстрирует ценность данных маркеров как индикаторов влияния средовых и производственных факторов. Большая вариабельность показателей спермограммы у мужчин с бесплодием, наличие нормальных показателей спермограммы и в то же время неспособность мужчин к оплодотворению, заставляет искать дополнительные критерии для оценки качества сперматозоидов и спермоплазмы.

Влияние репротоксических факторов на процессы  свободнорадикального окисления в сперме мужчин с идиопатическим бесплодием

Для проведения исследования было сформировано 4 группы соматически здоровых, сексуально активных мужчин, состоящих в бесплодном браке:

I - Коренные жители районов с высоким уровнем содержания диоксинов и диоксиноподобных соединений в сперме с нормозооспермией на момент исследования;

II - Коренные жители районов с высоким уровнем содержания диоксинов и диоксиноподобных соединений в сперме с патозооспермией на момент исследования;

III - Коренные жители районов с низким уровнем содержания диоксинов и диоксиноподобных соединений в сперме с нормозооспермией на момент исследования;

IV - Коренные жители районов с низким уровнем содержания диоксинов и диоксиноподобных соединений в сперме с патозооспермией на момент исследования.

Патозооспермия, выявленная во второй и четвертой группах наблюдения, носила идиопатический характер. Достоверных различий по основным параметрам спермограммы между группами I и III (нормозооспермия в экологически неблагополучных и благополучных районах) и группами II и  IV (патозооспермия в экологически неблагополучных и благополучных районах) не было выявлено.

При исследовании люминолзависимой ХЛ семенной жидкости пациентов определяли уровень АФК, генерируемых половыми клетками (рис.3). Антиокислительные свойства спермоплазмы (Fe2+-индуцированная ХЛ)-  оценивали в процентах от величины угнетения свечения модельной системы, при добавлении к последней 0,1мл спермоплазмы (рис. 4.)

Рис. 3. Пример записи ЛЗХЛ эякулятов пациентов исследуемых групп. Нумерация кривых соответствует номеру группы (кривая I-IV)

  Рис. 4. Запись ХЛ модельной системы, генерирующей АФК (кривая М), и модельной системы, генерирующей АФК, с добавлением 0,1мл спермоплазмы пациентов I, II, III, IV групп (кривая I-IV)

Достоверных различий по показателю светосуммы, спонтанной светимости, максимальной светимости между всеми группами не было выявлено. Показатели ЛЗХЛ  по группам представлены в табл. 6. Обращает на себя внимание факт выявления низкой антиокислительной активности (29,1±1,96%) во второй группе наблюдения (группа с патозооспермией в регионе с неблагоприятной экологической обстановкой), причем наибольшая разница получена с группой III (38,3±2,43%), куда были включены пациенты с нормозооспермией, проживающие в относительно благополучных по экологической обстановке районах.

Таблица 6

Уровень ЛЗХЛ семенной жидкости в группах наблюдения (n=120)

Показатели ЛЗХЛ

Группы обследованных пациентов

I

группа

II

группа

III

группа

IV

группа

светосумма,

отн.ед.

6,6±1,99

12,0±2,08

6,6±1,85

9,5±1,87

спонтанная

светимость, отн.ед.

1,8±0,32

1,9±0,22

1,6±0,27

1,9±0,36

максимальная

светимость, отн.ед.

2,7±0,43

3,4±0,37

2,5±0,50

3,1±0,39

Также получены достоверные различия между I (31,4±1,69%) и III (38,3±2,43%) группами.  Данные различия свидетельствуют о том, что при идиопатической форме патозооспермии в регионе с повышенным риском экзогенного воздействия токсических факторов наблюдается снижение защитных свойств спермоплазмы в виде снижения уровня суммарной антиокислительной активности.

При сопоставлении данных, полученных при исследовании люминолзависимой ХЛ  и Fe2+-индуцированной ХЛ  в группах наблюдения, особенно обращает на себя внимание тот факт, что во второй группе наблюдения уровень светосуммы в исследуемых образцах спермы имел наивысшее значение при уменьшении угнетения свечения модельной системы, генерирующей АФК. Причем снижение уровня антиокислительной активности спермоплазмы у этих пациентов было более выражено. Таким образом, можно выдвинуть гипотезу о  влиянии экзогенных факторов на процессы свободнорадикального окисления в семенной жидкости, что проявляется в виде падения уровня  суммарной антиокислительной активности спермоплазмы и повышенного образования АФК морфологически или функционально неполноценными клетками, которое сочетается с развитием идиопатической патозооспермии.

Экспериментальные модели повреждающего действия экзогенных факторов на сперматогенез. Оценка влияния хронической интоксикации на сперматогенез и процессы свободнорадикального окисления

Для подтверждения гипотезы о нарушении процессов свободнорадикального окисления при действии стойких органических загрязнителей на половые клетки была проведена экспериментальная оценка влияния хронической интоксикации на сперматогенез белых крыс. Животные были разделены на три группы (первая, вторая и контрольная).

Предварительно было проведено изучение влияния на СРО «ПропоФлана» по изменению ХЛ при добавлении к модельной системе, генерирующей АФК (рис.5.), и к модели, в которой протекают реакции ПОЛ, содержащей липидно-белковые комплексы из гомогенизированного куриного желтка (рис.6.).

 

Рис.5. Антиокислительная активность «ПропоФлана»: 1 - запись ХЛ модельной системы, генерирующей АФК; 2 - запись ХЛ модельной системы, генерирующей АФК, с добавлением «ПропоФлана»

Рис.6. Влияние «ПропоФлана» на хемилюминесценцию желточных липопротеидов: 1 - контороль; 2 – контроль с добавлением 0,4мл «ПропоФлана»

Полученные данные свидетельствуют о высокой антиокислительной активности «ПропоФлана», препарат способен взаимодействовать с АФК и подавлять ПОЛ in vitro.

При ежедневном введении «Совтола» в течение 3 месяцев в суммар­ной дозе 0,05 LD50 величины индексов фертильности, гестации и плодовитости составили 20, 75 и 4,3 соответственно, что в 5, 1,3 и 2,1 раза меньше, чем в контрольной группе. Наименьшие изменения претерпевал показатель индекса гестации, несущий информацию преимущественно о способности к вынашиванию беременности. Во второй группе животных уменьшалось как число беременных и родивших са­мок, так и количество рожденных крысят, что сопровождалось сниже­нием величин индекса фертильности и плодовитости в 2 и 1,6 раза, соответственно. Индекс гестации не претерпевал изменений. Что касается соотношения полов крысят, то не удалось обна­ружить значительных сдвигов величины этого параметра.

Таким образом, продолжительное введение стойких органических загрязнителей приводит к развитию у половозрелых самцов крыс нарушения фертильности. Параллельное введение антиоксиданта «ПропоФлана» нивелирует отрицательный эффект «Совтола», увеличивая индексы фертильности, гестации и плодовитости.

После окончания затравки животные забивались. Сперматозоиды извлекали из хвостовой части придатка яичка после продольного его разрезания, дозированным вымыванием физиологическим раствором натрия хлорида в течение 2 мин. Концентрацию клеток в образцах доводили до 10 млн/мл, после чего проводилась дифференциальная окраска  сперматозоидов с последующей оценкой строгой морфологии. При оценке дифференциальной окраски сперматозоидов выявлялась  достоверно большая частота патоспермии (патология головки - 48,4±8,4%) в первой группе крыс по сравнению с группой контроля (патология головки - 21,3±2,4%)(данные представлены в табл. 7).

Во второй группе отмечалось относительное уменьшение патологических форм сперматозоидов по сравнению с первой группой, но различия не были достоверны ни с первой группой, ни с группой контроля.

Таблица 7

Уровень патоспермии в группах наблюдения

Показатели, %

I группа

II группа

контрольная

Патологические формы сперматозоидов

66,1±5,7*

51,7±3,3

43,3±3,3

Патология головки

48,4±8,4*

29,7±3,3

21,3±2,4

Патология шейки

9,2±3,5

14,0±1,2

10,9±1,1

Патология хвоста

8,5±2,1

8,0±0,3

11,1±1,3

Примечание: * - р< 0,05 по сравнению с контрольной группой

По уровню ТБК-АП не выявлено достоверной разницы при исследовании гомогенатов придатков яичек (I группа - 0,5±0,05 нМ/мг белка, II группа - 0,4±0,02 нМ/мг белка, контрольная группа - 0,4±0,01 нМ/мг белка) (рис. 7).

В то же время достоверная разница получена при исследовании ТБК-АП  в гомогенатах ткани  яичек: I группа - 0,4±0,04 нМ/мг белка, II группа - 0,2±0,01 нМ/мг белка (р<0,001 по сравнению с I группой), контрольная группа - 0,3±0,03 нМ/мг белка (р<0,05 по сравнению с I группой) (рис. 8). Таким образом, происходит накопление продуктов ПОЛ в тестикулярной ткани самцов крыс после воздействия репротоксиканта.

       

Рис.7. Уровень ТБК-АП в ткани придатка яичка крысы

Рис.8. Уровень ТБК-АП в ткани яичка крысы

Оценка люминолзависимой ХЛ гомогенатов семенников лабораторных животных не выявила разницы между исследуемыми группами. Образцы гомогенатов, полученные от интактных животных, отличались очень низкой скоростью образования АФК. Получены статистически достоверные различия по уровню светосуммы между первой (1,8±0,28 отн.ед.) и контрольной (0,9±0,18 отн.ед.) группами (р<0,05), что говорит об увеличении образования АФК в тестикулах животных, подвергнутых хронической затравке. В то же время достоверных различий между второй (1,1±0,15 отн.ед.) и контрольной (0,9±0,18 отн.ед.), а также второй (1,1±0,15 отн.ед.) и первой (1,8±0,28 отн.ед.) группами получено не было, хотя отмечалась тенденция к снижению скорости окислительных реакций после добавления крысам в рацион «ПропоФлана».

При исследовании Fe2+-индуцированной ХЛ гомогенатов семенников исследуемых групп крыс отмечено наличие антиокислительной активности в тестикулярной ткани контрольной группы животных, и прооксидантной активности ткани придатка (рис. 9). В группах животных, подвергшихся затравке, теряется антиокислительная активность тестикулярной ткани (рис.10).

       

Рис.9. Антиокислительная активность гомогенатов тканей семенника и придатка  крысы группы контроля: 1 - запись ХЛ модельной системы, генерирующей АФК; 2 - запись ХЛ модельной системы, генерирующей АФК, с добавлением гомогената тестикул; 3 - запись ХЛ модельной системы с добавлением гомогената придатка

Рис. 10. Антиокислительная активность гомогенатов тканей семенника и придатка  крысы первой группы: 1 - запись ХЛ модельной системы, генерирующей АФК; 2 - запись ХЛ модельной системы, генерирующей АФК, с добавлением гомогената тестикул; 3 - запись ХЛ модельной системы с добавлением гомогената придатка

Этот факт свидетельствует о том, что дозревание половых клеток в придатке здорового животного протекает при относительно высоком уровне продукции АФК и низкой суммарной антиокислительной активности, что, вероятно, является одним из факторов формирования нормальной функциональной активности зрелой половой клетки.

Антиокислительная активность, выявленная в ткани яичка, говорит о подавляющем действии данной системы на активность половых клеток, что позволяет полноценно сформировать еще незрелые сперматозоиды. В группе животных, подвергавшихся затравке, отмечена потеря антиокислительной активности гомогенатами тестикул при неизменном уровне Fe2+-индуцированной ХЛ в гомогенатах придатков. Гомогенат, полученный из тестикул животного, повергавшегося затравке, теряет  антиокислительную активность, а гомогенат придатка усиливает свечение модельной системы, генерирующей АФК. Достоверной разницы между первой и второй группами по уровню антиокислительной активности  получено не было.  Показатели Fe2+-индуцированной ХЛ в гомогенатах яичек и придатков яичек графически представлены на рис. 11.

Рис. 11. Антиокислительная активность гомогенатов тканей семенников и придатков  крыс в группах наблюдения (I, II и контрольная). За горизонтальную ось  с нулевым значением на данном рисунке принята светосумма модельной системы, генерирующей АФК

Таким образом, одним из механизмов, приводящих к развитию патоспермии при действии стойких органических загрязнителей, является нарушение процессов свободнорадикального окисления. Данные изменения проявляются в виде снижения уровня суммарной антиокислительной активности на уровне тестикул, что приводит к ранней активации и незрелости сперматозоидов, и, как следствие, морфологическим изменениям половых клеток и снижению их функциональных характеристик. То есть, дисбаланс между реакциями свободнорадикального окисления и антиокислительной ёмкостью клеток может быть ответственен за возникновение нарушений генеративной функции.

При исследовании морфологии семенников крыс срезы готовились отдельно из придатков и тестикулярной ткани. При оценке гистологических срезов полученных биоптатов учитывали диаметр канальцев, толщину собственной пластинки, высоту зародышевого эпителия. Наглядных различий по диаметру канальцев, толщине собственной пластинки, высоте зародышевого эпителия между всеми группами не  было замечено. Отсутствие структурных отклонений со стороны зародышевого эпителия в исследуемых группах свидетельствует о возможной обратимости патологического процесса после удаления поллютанта из тестикулярной ткани, то есть изменения носили функциональный характер. При исследовании ткани придатков отмечено расширение просвета канальцев вследствие сгущения секрета внутри канальца, что приводит к уплощению канальцевого эпителия и потере его многорядности в первой и второй группах животных. Данные изменения были видны при сравнении срезов с группой контроля, где диаметр канальцев в некоторых случаях в два раза меньше, по сравнению с канальцами крыс первой группы. Также обращало на себя внимание уменьшение высоты канальцевого эпителия в группе затравленных крыс.

Таким образом, на фоне хронической затравки диоксиноподобным соединением отмечено увеличение количества морфологически неполноценных клеток, сочетающееся с повышением генерации АФК в тестикулярной ткани и снижением уровня антиокислительной активности тканей яичка. О  высоком уровне процессов ПОЛ в яичке свидетельствует также увеличение уровня ТБК-активных продуктов, определяемого в тестикулярной ткани затравленных животных. Выявленные морфологические изменения не затрагивают клетки сперматогенного эпителия, что свидетельствует об обратимости наступивших изменений.

Сбалансированное соотношение уровня выработки АФК и антиокислительной активности на этапах развития половых клеток формирует полноценные сперматозоиды, обладающие способностью оплодотворять яйцеклетку. В яичке созревание сперматозоида происходит под антиоксидантной защитой. Затем сперматозоид проходит в придаток яичка, где антиоксидантная защита ослабевает и несомненную роль в дозревании клетки играет уровень АФК в придатке. Именно в придатке яичка сперматозоиды приобретают способность к самостоятельной генерации АФК, что играет важную роль в их оплодотворяющей способности (процесс капацитации и акросомальной реакции). А при снижении антиокислительной активности в яичке происходит раннее взаимодействие незрелых половых клеток со свободными радикалами, что приводит к преждевременному приобретению способности морфологически неполноценными клетками генерировать АФК.

Влияние криоконсервации на процессы свободнорадикального окисления

С целью изучения процессов свободнорадикального окисления, протекающих в сперме при воздействии резких температурных перепадов, проведено изучение люминолзависимой ХЛ и Fe2+-индуцированной ХЛ. Материалом для исследования послужила сперма, полученная от восьми племенных быков, т.е. эякулят с доказанной фертильностью. Проведена оценка люминолзависимой ХЛ после добавления криопротектора до и после криоконсервации.

Проведенные исследования не выявили достоверных различий по показателям люминолзависимой ХЛ при технически правильно выполненной криоконсервации. Сперматозоиды отличаются низким уровнем значения светосуммы и низкой амплитудой свечения, т.е. минимальной скоростью образования АФК как до, так и после криоконсервации. Из рис. 12 следует, что различий по уровню светосуммы свечения как интегрального показателя генерации АФК в сперме быков до  и после криоконсервации не наблюдается.

Рис. 12. Изменение светосуммы свечения в сперме быков до и после криоконсервации

Криоконсервация не повлияла на способность спермоплазмы подавлять свечение модельной системы, генерирующей АФК: после размораживания уровень антиокислительной активности оставался практически неизменным – 38% (до заморозки – 38,5%).

Правомерно утверждать, что отличительной особенностью метаболизма в семенной жидкости, полученной от быков – производителей, являются уравновешенность прооксидантных и антиоксидантных систем вне зависимости от воздействия крайне низких температур при последовательной методике замораживания с криопротектором. Данный факт позволяет рекомендовать криоконсервацию для более широкого использования в практической медицине.

С учетом вышеизложенного, разработан алгоритм диагностического поиска при бесплодии в браке, основанный на исследовании эякулята (рис.13). Таким образом, воздействие стойких органических загрязнителей играет важную роль в формировании мужской инфертильности. Одним из механизмов повреждающего действия является дисбаланс между прооксидантным и антиоксидантным звеньями СРО.  Разработанный экспресс-метод определения АФК в сперме, основанный на регистрации ХЛ, позволяет выявить изменения в эякуляте, вызванные оксидативным стрессом.

Спермограмма мужа

Диагностический поиск

Выяснение наличия

проф. вредностей и

экологической ситуации

Лечение основного

заболевания

       

Эмпирическая Антиоксидантная  Эмпирическая

терапия терапия терапия

Рис. 13. Алгоритм диагностического поиска при бесплодии в браке

ВЫВОДЫ

  1. Структура бесплодного брака в Республике Башкортостан характеризуется высоким удельным весом мужского фактора, о чем свидетельствует ретроспективный анализ параметров семенной жидкости 4000 мужчин, выявивший аномальную частоту встречаемости патоспермии (более 70%). В последние годы эякулят обследованных мужчин характеризуется ухудшением морфофункциональных свойств сперматозоидов, что нашло отражение в снижении их подвижности и увеличении доли морфологически неполноценных форм.
  2. Региональной особенностью патозооспермии в Республике Башкортостан является высокий уровень случаев мужского бесплодия невыясненной этиологии (45,3% идиопатических форм), что может быть следствием недостаточной эффективности стандартных методов исследования и несовершенства системы оказания андрологической помощи.
  3. Существует прямая зависимость между содержанием диоксинов и диоксиноподобных соединений в сперме и развитием патозооспермии. Уровень диоксинов и диоксиноподобных соединений в пересчете на токсические эквиваленты в суммарных пробах спермы мужчин, проживающих на территории Республики Башкортостан, колеблется в высоких пределах - от 56,7 до 823,7 пг/г липидов.
  4. При идиопатической форме патозооспермии в регионах с повышенным уровнем экзогенного воздействия диоксинов и диоксиноподобных соединений у мужчин, состоящих в бесплодном браке, отмечается увеличение генерации активных форм кислорода морфологически и функционально неполноценными сперматозоидами, наряду с угнетением суммарной антиокислительной активности спермоплазмы, что является предпосылкой для снижения оплодотворяющей способности эякулята.
  5. В эксперименте на животных при действии диоксиноподобных соединений класса ПХБ (совтол) у крыс снижаются индексы фертильности, гестации и плодовитости, а также количество морфологически полноценных сперматозоидов, накапливаются продукты перекисного окисления липидов в тестикулярной ткани.
  6. Одним из механизмов, приводящих к развитию у лабораторных животных патоспермии при действии экополлютантов класса ПХБ, является нарушение процессов свободнорадикального окисления. Происходит снижение суммарной антиокислительной активности ткани тестикул, что сочетается с появлением в эпидидимисе морфологически и функционально неполноценных клеток, способных к генерации избыточного количества радикалов активных форм кислорода.
  7. Применение комплекса природных биофлавоноидов с высокой антиокислительной активностью предупреждает нарушение процессов  свободнорадикального окисления в репродуктивных органах лабораторных животных и сопровождается повышением индекса фертильности и плодовитости.
  8. Хемилюминесцентные методы исследования семенной жидкости  дают возможность оценить роль нарушения свободнорадикального окисления в возникновении инфертильности, и, наряду с традиционными способами диагностики, позволяют уточнить патогенез мужского бесплодия, что является предпосылкой для повышения эффективности коррекции патологии сперматогенеза, обусловленной оксидативным стрессом.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Высокая частота выявления мужской инфертильности и продолжающаяся тенденция к увеличению удельного веса мужского фактора в структуре бесплодного брака требует повышения эффективности оказания андрологической помощи:

  • в целях охраны репродуктивного здоровья и снижения уровня мужского бесплодия необходимо проведение обязательного регулярного уроандрологического обследования мальчиков, подростков и мужчин детородного возраста;
  • при профилактических медицинских уроандрологических исследованиях, наряду с традиционными методами диагностики, рекомендуется использование хемилюминесцентного анализа семенной жидкости. Изменения показателей хемилюминесценции  спермы при идиопатической патозооспермии свидетельствуют о возможном репротоксическом влиянии средовых и производственных факторов;
  • при трудоустройстве необходимо предоставление полной и достоверной информации о возможном отрицательном влиянии на репродуктивное здоровье негативных факторов, связанных с условиями труда;
  • мужчинам, контактирующим с репротоксическими факторами и не реализовавшим репродуктивную функцию, следует рекомендовать, по согласованию с работодателем, перевод в другие условия труда  сроком не менее чем на три месяца для восстановления сперматогенеза;
  • с целью сохранения собственного генофонда и его использования в последующем в репродуктивных целях необходимо гарантировать возможность криоконсервации спермы. Организовать банки для длительного хранения половых клеток в крупных промышленных центрах.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ

ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

  1. Туйгунов М.М. Гормональный статус мужчины и значение его исследования в урологической и андрологической практике / М.М.Туйгунов, А.Р.Мавзютов, В.З.Галимзянов, А.Г. Шмергельский, Д.С. Громенко // Сборник трудов Республиканской конференции, посвященной 65-летию кафедры общей хирургии.– Уфа, 2000. – С. 280-281.
  2. Громенко Д.С. Опыт оперативного лечения больных с обструктивной формой бесплодия / Д.С. Громенко, Г.В. Коржавин // Сборник трудов Республиканской конференции, посвященной 65-летию кафедры общей хирургии.– Уфа, 2000. – С. 207-208.
  3. Галимов Ш.Н. Методы оценки репродуктивной функции мужчин. Учебное пособие для студентов, практических врачей и курсантов ИПО / Ш.Н.Галимов, Д.С. Громенко, Ф.Х.Камилов, Э.Ф.Аглетдинов, Р.Р. Фархутдинов, Н.И.Симонова, В.И.Иваха.– Уфа: Здравоохранение Башкортостана.- 2001.– 48 с.
  4. Галимов Ш.Н. Экологические факторы и снижение риска репродуктивному здоровью в Республике Башкортостан: роль СМИ, перспективы сотрудничества / Ш.Н.Галимов, Э.Ф.Аглетдинов, Д.С.Громенко, Н.И.Симонова, В.И.Иваха // Экология. Бизнес. СМИ.: Сборник материалов Башкирской республиканской конф.- Уфа: НИИБЖДРБ, 2001. – С. 38-42.
  5. Громенко Д.С. Экспресс-метод определения состояния свободно-радикального окисления в сперме / Д.С.Громенко, Р.Р.Фархутдинов, Ш.Н.Галимов // Андрология и генитальная хирургия. –  М.- 2001.- Прил.– С.72.
  6. Галимов Ш.Н. Дефицит андрогенов у мужчин индустриальных городов Башкортостана: результаты обследования 2200 мужчин / Ш.Н.Галимов, Д.С.Громенко, Э.Ф.Аглетдинов, Э.Ф.Галимова, Ф.Х. Камилов // Андрология и генитальная хирургия.–  М.- 2002. - №3.– Прил.-  С. 128-129.
  7. Галимов Ш.Н. Диоксины и репродуктивное здоровье мужчин в РБ / Ш.Н.Галимов, Ф.Х.Камилов, Э.Ф.Аглетдинов, Д.С.Громенко, Х.Г.Валеева, А.П.Голощапов, В.И.Иваха, Н.И.Симонова, Д.Ш. Хамзина // Национальный план действий по экологически обоснованному управлению диоксинами/фуранами и диоксиноподобными веществами: Материалы Российской конференции. – СПб., 2002. – С. 92-96.
  8. Галимов Ш.Н. Идиопатические формы мужского бесплодия и свободнорадикальные процессы / Ш.Н. Галимов, Р.Р. Фархутдинов, Д.С. Громенко // Актуальные вопросы педиатрии, перинатологии и репродуктологии: Сб. научных трудов.- Нижний Новгород, 2002. – С. 108-109.
  9. Галимов Ш.Н. Chemiluminescent analysis of ejaculate as an informative screening test in reproductive toxicometry / Ш.Н. Галимов, Р.Р. Фархутдинов, Д.С. Громенко // Proceedings of Sixth International Nickel Conference. – Murmansk, 2002. – P. 94.
  10. Галимов Ш.Н. Окружающая среда и репродуктивное здоровье мужчин, проживающих в индустриальных городах РБ / Ш.Н.Галимов, Ф.Х.Камилов, Э.Ф.Аглетдинов, Д.С. Громенко, Э.Ф. Галимова // Актуальные вопросы охраны репродуктивного здоровья в медицине труда: Материалы Всероссийской конференции. – Самара, 2002. – С. 39-42.
  11. Галимов Ш.Н. Опыт  оценки риска репродуктивному здоровью мужчин в Республике Башкортостан / Ш.Н.Галимов, Ф.Х.Камилов, Э.Ф.Аглетдинов, Д.С. Громенко, Э.Ф. Галимова // Влияние загрязнения окружающей среды на здоровье человека: Материалы 1-ой Всероссийской научной конф. с международным участием. - Новосибирск, 2002. – С. 173-174.
  12. Галимов Ш.Н. Синдром андрогенной недостаточности как маркер  техногенного загрязнения среды обитания / Ш.Н.Галимов, Ф.Х.Камилов, Э.Ф.Аглетдинов, Д.С. Громенко, Х.Г.Валеева, А.П.Голощапов, В.И.Иваха // Проблемы репродукции. – 2002. – Т.8, №1. – С.46-50.
  13. Галимов Ш.Н. Стандартизация метода оценки хемилюминесценции эякулята. Новые возможности в диагностике мужского бесплодия / Ш.Н.Галимов, Э.Ф.Аглетдинов, Э.Ф.Галимова, Д.С. Громенко, Р.Р. Фархутдинов // Современные подходы к лечению бесплодия: Сб. научных трудов. – Екатеринбург, 2002. – С. 38.
  14. Галимов Ш.Н. Влияние препарата пропофлан на фертильность эякулята при идиопатическом бесплодии / Ш.Н.Галимов, Д.С. Громенко, Р.М.Мухамедзянов, О.В.Порядина, Э.Ф.Аглетдинов, Р.Р.Фархутдинов, Ф.Х. Камилов // Проблемы репродукции. – 2003. - №5. –  С.37.
  15. Галимов Ш.Н. Диоксины и диоксиноподобные соединения в сперме: реальная угроза? / Ш.Н.Галимов, Р.Р.Фархутдинов, З.К.Амирова, Э.Ф.Галимова, Д.С. Громенко // Материалы Всероссийской конференции по проблеме стойких органических загрязнителей, 28-29 октября 2002 г., Москва.– М.: Центр международных проектов, 2003. – С. 262-265.
  16. Галимов Ш.Н. Исчезающий пол: мужчина в зеркале эволюции и экологии / Ш.Н.Галимов, Э.Ф.Аглетдинов, Д.С. Громенко, А.З.Абдуллина, Э.Ф. Галимова // Мужское здоровье и долголетие: материалы российского научного форума. – М., 2003. – С. 44-45.
  17. Фархутдинов Р.Р. Мужская фертильность и генерация активных форм кислорода  в семенной жидкости / Р.Р.Фархутдинов, В.Н.Павлов, Д.С. Громенко, Л.Г. Козлова // Материалы Всероссийской конференции «Мужское здоровье», 19-21 нояб. 2003 г., Москва. – М.- С.14-15.
  18. Галимов Ш.Н. Среда обитания и репродуктивное здоровье мужчин// / Ш.Н.Галимов, Ф.Х.Камилов, Э.Ф.Аглетдинов, Д.С. Громенко // Влияние окружающей среды на формирование личности. Материалы Российской научно-практ. конф. – Уфа: Восточный университет, 2003. – С. 193-195.
  19. Галимов Ш.Н. Лечение мужского бесплодия: новый взгляд на старую проблему / Ш.Н. Галимов, Р.М. Мухамедзянов, Д.С. Громенко, Э.Ф.Галимова, Э.Ф.Аглетдинов, Ф.Х.Камилов // Материалы 2-го Российского научного форума «Мужское здоровье и долголетие», 17-19 февр. 2004, Москва.–  М.-
    С. 33-34.
  20. Громенко Д.С. Способ определения суммарной антиокислительной активности спермоплазмы для оценки мужской фертильности / Д.С. Громенко, Р.Р.Фархутдинов, Ш.Н. Галимов, Д.В. Шемагонов // Бюллетень Изобретения. Полезные модели. – 2006. - №17. – С. 445-446.
  21. Громенко Д.С. Способ регистрации активных форм кислорода в семенной жидкости для оценки фертильности / Д.С. Громенко, Р.Р. Фархутдинов, Ш.Н. Галимов, Д.В. Шемагонов // Бюллетень Изобретения. Полезные модели.– 2006. - №8. – С.674-675.
  22. Павлов В.Н. Терапия мужской инфертильности на аппаратном комплексе КАП-ЭЛМ-01 "Андро-Гин" / В.Н.Павлов, В.З.Галимзянов, Д.С.Громенко, Р.Р.Магадеев // Урология.- 2004.- № 6.- С. 34-37.
  23. Павлов В.Н. Генерация активных форм кислорода сперматозоидами в патогенезе мужского бесплодия / В.Н.Павлов, Р.Р.Фархутдинов, Д.С. Громенко, Р.Р. Садыков // Здравоохранение Башкортостана.– Спец. выпуск №3 .– Уфа.-2005. – С.155-158.
  24. Громенко Д.С. Использование метода регистрации хемилюминесценции эякулята для определения патоспермии / Д.С. Громенко, Р.Р. Фархутдинов // Сборник научных трудов 4-ой Национальной науч-практ. конф. с междунар. участием «Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека», 26-30 сент. 2005 г., Смоленск.-  С. 321-323.
  25. Павлов В.Н. Лечение мужского бесплодия у больных хроническим простатитом / В.Н.Павлов, В.З.Галимзянов, Д.С.Громенко, А.А.Измайлов, Л.М.Кутлияров // Здравоохранение Башкортостана. – Спец. выпуск №3 . – Уфа.- 2005. – С. 149-152.
  26. Павлов В.Н. Комплексное лечение урогенитальной инфекции у мужчин / В.Н.Павлов, В.З.Галимзянов, Д.С. Громенко, А.А. Казихинуров // Наука и практика. Лучшие медтехнологии России: Сб. ст.– М., 2005. - С. 69-72.
  27. Павлов В.Н. Разновидность патоспермии при повышенной способности к генерации сперматозоидами активных форм кислорода / В.Н.Павлов, Р.Р.Фархутдинов, Д.С. Громенко, Ш.Н. Галимов // Врачебное сословие.– М.- 2005. - №7. - С. 30-33.
  28. Галимов Ш.Н. Репродуктивное здоровье и окружающая среда: новые подходы и технологии / Ш.Н.Галимов, Р.Р.Фархутдинов, Т.В.Викторова, З.К.Амирова, Д.С. Громенко, Э.Ф.Галимова, Г.М.Исхакова // Материалы 3-го Российского научного форума «Мужское здоровье и долголетие», 16-18 февр. 2005 г., Москва.– М.- С. 47-48.
  29. Павлов В.Н. Терапия мужской инфертильности на комплексе аппаратом КАП ЭЛМ- 01 «Андро – Гин» / В.Н.Павлов, В.З.Галимзянов, Д.С. Громенко, Р.Р.Магадеев // Наука и практика. Лучшие медтехнологии России: Сб. ст.– М., 2005. - С. 229-235.
  30. Галимов О.В. Выявление активных форм кислорода в семенной жидкости при варикоцеле / О.В.Галимов, А.В.Кондрашов, Р.Р.Фархутдинов, Д.С.Громенко, Е.Ю.Калашникова, С.Р.Туйсин // Роль природных факторов и туризма в формировании здоровья населения. Материалы IV Российской научной конференции. - Уфа, 2006. - С. 57-58.
  31. Громенко Д.С. Генерация активных форм кислорода сперматозоидами в патогенезе мужского бесплодия / Д.С. Громенко, Р.Р. Фархутдинов, Ш.Н. Галимов // Эфферентная терапия. – 2006. – Т.12, № 1. – С.28-32.
  32. Громенко Д.С. Лечение идиопатического мужского бесплодия у пациентов с эректильными расстройствами / Д.С. Громенко, Ю.Ю. Громенко // Врачебное сословие.– М.- 2006. - №7. - С. 37-40.
  33. Павлов В.Н. Лечение мужчин с уретрогенной инфекцией, осложненных половыми расстройствами / В.Н.Павлов, В.З.Галимзянов, А.А.Казихинуров, Д.С. Громенко, А.А.Измайлов, Г.Н.Чингизова, А.А.Загидуллин // Мужское здоровье и долголетие. Материалы 4-го Российского научного форума. – М., 2006. – С. 98-99.
  34. Галимов Ш.Н. Медикаментозная терапия после ликвидации варикоцеле / Ш.Н.Галимов, Р.Р.Фархутдинов, Д.С. Громенко, З.Х.Хамзина // Мужское здоровье и долголетие. Материалы 4-го Российского научного форума.– М., 2006. – С. 31-32.
  35. Громенко Д.С. Оценка токсического действия полихлорированных бифенилов на репродуктивную функцию / Д.С.Громенко, Ш.Н.Галимов, Р.Р.Фархутдинов, Ю.Ю.Громенко // Роль природных факторов и туризма в формировании здоровья населения. Материалы IV Российской научной конференции.- Уфа, 2006. – С. 38-39.
  36. Галимов Ш.Н. Патогенез патоспермии при поражении придатков яичек у инфертильных мужчин / Ш.Н. Галимов, Р.Р. Фархутдинов, Д.С. Громенко, З.Х. Хамзина // Мужское здоровье и долголетие. Материалы 4-го Российского научного форума. – М., 2006. – С. 32.
  37. Громенко Д.С. Роль активных форм кислорода в формировании мужской инфертильности / Д.С. Громенко, Ш.Н. Галимов, Д.В. Шемагонов, Р.Р. Фархутдинов // Казанский медицинский журнал. – 2007. – Т.88, №4, Прил. - С. 23-24.
  38. Громенко Д.С. Гонадотоксическое действие полихлорбифенилов / Д.С. Громенко, Ш.Н. Галимов, З.К. Амирова, А.З. Абдуллина, Ю.Ю. Громенко, Э.Ф. Галимова // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2008.- Т.146, №7. – С. 76-79.
  39. Галимов Ш.Н. Спермотоксические свойства приоритетных загрязнителей окружающей среды класса полихлорбифенилов / Ш.Н. Галимов, Д.С. Громенко, А.З. Абдуллина, Э.Ф. Галимова // Медицина труда и промышленная экология. – 2008. - №10.- С. 31-33.
  40. Громенко Д.С. Воздействие биофлавоноидов прополиса на процессы липопероксидации в гонадах крыс при интоксикации хлорорганическими поллютатнтами / Д.С. Громенко, Ю.Ю. Громенко, Ш.Н. Галимов, Р.Р. Фархутдинов, Р.М. Мухаметзянов// Вопросы питания. - 2008. - №6. - С. 9-14.
  41. Божедомов В.А. Причины оксидативного стресса сперматозоидов / В.А. Божедомов, Д.С. Громенко, И.В. Ушакова, М.В. Торопцева, Ш.Н. Галимов, Е.Л. Голубева, Т.А. Охтырская, Л.А. Александрова, Г.Т. Сухих // Проблемы репродукции. – 2008. – №6. – С. 67-73.
  42. Громенко Д.С. Применение наукоемких технологий для оценки фертильности мужчин / Д.С. Громенко // Вестник новых медицинских технологий. – 2008. – Том XV, №4. – С. 118-120

ГРОМЕНКО ДМИТРИЙ СЕРГЕЕВИЧ

ОСОБЕННОСТИ ПАТОГЕНЕЗА

ИДИОПАТИЧЕСКОЙ ПАТОЗООСПЕРМИИ

ПРИ МУЖСКОЙ ИНФЕРТИЛЬНОСТИ

14.00.16 - Патологическая физиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

доктора медицинских наук

Формат 60x84 1/16. Бумага «Снегурочка».

Печать офсетная. Тираж 100 экз. Заказ № 435.

Отпечатано в типографии ООО «Штайм»

в полном соответствии с предоставленным оригиналом.

450005, Уфа, ул. 8 марта, 12/1. Тел. (347) 228-42-23







© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.