WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


 

На правах рукописи

БАРЫШЕВА
Ольга Юрьевна

ОПТИМИЗАЦИЯ ДИАГНОСТИКИ, ОЦЕНКИ ЭФФЕКТИВНОСТИ ЛЕЧЕНИЯ И ПРОГНОЗА ПРИ ИММУНОВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ (РЕВМАТОИДНОМ АРТРИТЕ, СИСТЕМНОЙ КРАСНОЙ ВОЛЧАНКЕ, ХРОНИЧЕСКОМ ГЛОМЕРУЛОНЕФРИТЕ)

специальность 14.00.05 – «внутренние болезни»

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора медицинских наук

Петрозаводск, 2009

Диссертация выполнена на кафедре госпитальной        терапии Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Петрозаводский государственный университет» (ПетрГУ)

Научный консультант:  доктор медицинских наук, доцент
  Везикова Наталья Николаевна

Официальные оппоненты:   доктор медицинских наук, профессор

  Дуданова Ольга Петровна

  доктор медицинских наук, профессор

Шишкин Александр Николаевич

доктор медицинских наук, профессор
  Коршунов Николай Иванович

Ведущая организация:

Российский государственный медицинский университет

Защита состоится «___  » _______ 2009 г. в ___часов на заседании диссертационного Совета Д 212.190.05 при ГОУ ВПО «Петрозаводский государственный университет» (185910, Петрозаводск, пр. Ленина, 33).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Петрозаводский государственный университет» по адресу 185910, Петрозаводск, пр. Ленина, 33

Автореферат разослан «____» _____________ 2009 г.

Ученый секретарь
диссертационного Совета,
кандидат медицинских наук,
доцент       Т. А. Карапетян

Общая характеристика диссертации

Актуальность проблемы

Иммуновоспалительные заболевания представляют собой группу заболеваний, характеризующихся глубокими нарушениями иммунного гомеостаза, выражающимися в развитии иммунорегуляторного дисбаланса, угнетении супрессорной и увеличении хелперной активности Т-лимфоцитов, активации В-лимфоцитов, гиперпродукции антител самой различной специфичности и образовании иммунных комплексов. Все заболевания, входящие в эту группу, имеют ряд общих черт, таких как неизвестность этиологии, общность патогенеза, сходство морфологических проявлений, многосистемный характер поражения, хроническое течение с периодами обострения и ремиссии, обострение под влиянием неспецифических воздействий (инфекция, инсоляция, вакцинация и др.), лечебный эффект иммуносупрессивных средств (глюкокортикостероиды, цитостатические иммунодепрессанты). Прогноз при заболеваниях данной группы всегда серьезный, а известные варианты терапии не всегда эффективны. В связи  с этим продолжаются поиски наиболее оптимальных схем диагностики и лечения заболеваний, а также уточнение факторов риска неблагоприятного течения заболеваний и возможности их коррекции [Быковская С.Н., 2005; Караулов А.В., 1999; Короткова И.Ю., 2007; Мазуров В.И., 2001, 2005; Тареева И.ЕП., 2000].

С этой точки зрения большой интерес представляет изучение активности апоптоза иммунокомпетентных клеток  - механизма, который организм использует для освобождения от чужеродных клеток, клеток с дефектным генетическим аппаратом, аутоагрессивных лимфоцитов, “отработавших” клеток иммунной системы - и возможности использования для оптимизации диагностики, лечения и оценки прогноза при иммуновоспалительных заболеваниях [Белушкина Н.Н., 1998; Бережков Н.В., 1990; Григорьев М.Ю., 2003; Залесский В.Н. и др., 2001; Коршунов А.М. и др., 1998; Кухта В.Е. и др., 2004].

Внимание к апоптозу как возможному механизму развития и поддержания патологического процесса при ревматоидном артрите обусловлено современными представлениями о патофизиологии и патоморфологии заболевания. При данном заболевании выявлена более низкая апоптотическая активность синовиальных фибробластов и макрофагов, с чем связана характерная пролиферация синовиальной ткани и развитие паннуса [Богданов А.Н. и др., 2005, 2006; Duffy T. et al., 2001; Emery. P. et al., 1997; Itoh K. et al., 2004; Panayi, G.S. et al., 2001; Ponchel F. et al., 2002; Slot O. et al., 2002].

Гораздо меньшее количество работ посвящено изучению активности апоптоза иммунокомпетентных клеток, в том числе, лимфоцитов, как синовиальных, так и циркулирующих, и факторов, модулирующих их апоптотическую активность (Багринцева К.М. и др., 1998: Веникова М.С., 1984; Волкова Т.О. и др., 2004]. Имеющиеся данные отражают главным образом иммунологические характеристики программированной клеточной гибели in vitro без учета активности, течения заболевания и проводимой терапии.

В настоящее время фактор некроза опухоли , являющийся одним из основных участников патогенеза иммуновоспалительных заболеваний, в частности, ревматоидного артрита, рассматривается и как регулятор апоптоза с разнонаправленными эффектами от апоптотической гибели до стимуляции клеточной пролиферации и дифференцировки, при этом результат воздействия фактора некроза опухоли на клетку зависит от типа рецептора и внутриклеточных механизмов реализации сигнала. Также выявлено отрицательное влияние интерлейкина 6 на активность апоптоза синовиальных фибробластов [Ярилин А.А., 1996: Duffy T. et al., 2001; Panayi G.S. et al., 2001].

Данные об активности апоптоза при системной красной волчанке противоречивы [Григорьев М.Ю., 2003; Гусева Н.Г., 2004; Graninger W.B. et al., 2000; Rosen A. et al., 1999; Salmon M. et al., 1999]. С одной стороны, системная красная волчанка отнесена к заболеваниям с угнетенным апоптозом, так как при данном заболевании усилена выработка растворимого Fas-рецептора, а также выявлено, что для включения активационного апоптоза необходимо на 2 порядка больше клеток-индукторов. Однако, прямые нарушения экспрессии Fas-рецептора и Bcl-2 не обнаруживаются и in vitrо регистрируется усиление апоптоза лимфоцитов.

Большой интерес представляют данные о роли апоптоза в развитии различного рода нефропатий, прогрессирование которых характеризуется клеточной пролиферацией с накоплением внеклеточного матрикса и последующим сморщиванием ткани [Белушкина Н.Н.  и др., 1998; Бережков Н.В., 1990; Григорьев М.Ю. и др., 2003; Коршунов А.М. и др., 1998; Кухта В.Е. и др., 2004; Перевезенцева Ю.Б., 2001; Цаликова Ф.Д. 1999; Ярилин А.А. 1996, 1998; Thompson C.B, 1995]. Известно также, что циклоспорин и глюкокортикостероиды вызывают апоптоз так называемых митоген-активируемых мононуклеаров, причем, эта способность коррелирует с их иммунодепрессивной активностью [Перевезенцева Ю.Б., 2001; Цаликова Ф.Д. 1999].

Изучение механизмов регуляции различных этапов апоптоза позволяет определенным образом воздействовать на его отдельные этапы с целью их регуляции или коррекции. Через индукцию апоптоза осуществляется действие большинства цитотоксических химиопрепаратов, антиметаболитов нуклеиновых кислот, ингибиторов топоизомераз, и результатом воздействия этих препаратов  является включение в клетках опухоли программы апоптоза. Дальнейшее повышение эффективности терапии заболеваний, в частности иммуносупрессивной терапии, связано с более детальным изучением ее биологических основ [Астрелина, Т.А. и др., 2002; Владимирская Е.Б., 2001, 2002; Волкова Т.О. и др., 2004, 2006].

В связи с этим представляет интерес вопрос влияния иммуносупрессивной терапии на активность апоптоза лимфоцитов и зависимость эффективности иммуносупрессивной терапии от исходной активности апоптоза лимфоцитов. Не исключается возможность прогнозирования эффективности цитостатических средств на основании результатов изучения программированной клеточной гибели. Более активное исследование влияния иммуносупрессивных препаратов на апоптоз поможет объяснить различную чувствительность пациентов к имеющимся лекарственным средствам [Каратеев Д.Е., 2003; Тареева И.Е., 2000; Робинсон М.В. и др., 1991].

Цель исследования

Изучить активность апоптоза периферических лимфоцитов и его влияние на течение, эффективность терапии с клинико-экспериментальной оценкой и прогноз при заболеваниях  иммуновоспалительного генеза - ревматоидном артрите, системной красной волчанке, хроническом гломерулонефрите.

Задачи исследования

  1. Изучить активность апоптоза периферических лимфоцитов при различных иммуновоспалительных заболеваниях - ревматоидном артрите, системной красной волчанке, хроническом гломерулонефрите.
  2. Провести сравнительный анализ активности апоптоза периферических лимфоцитов при различных иммуновоспалительных заболеваниях.
  3. Выявить корреляционные связи между активностью апоптоза лимфоцитов и активностью основных цитокинов (интерлейкина 2, интерлейкина 6, фактора некроза опухоли ) при иммуновоспалительных заболеваниях.
  4. Изучить in vitro влияние иммуносупрессивных препаратов (метилпреднизолона, метотрексата, циклофосфамида) на активность апоптоза циркулирующих лимфоцитов при ревматоидном артрите, системной красной волчанке, хроническом гломерулонефрите.
  5. Изучить динамику активности апоптоза периферических лимфоцитов на фоне иммуносупрессивной терапии ревматоидного артрита, системной красной волчанки, хронического гломерулонефрита.
  6. Определить прогностическую значимость исходной активности апоптоза циркулирующих лимфоцитов при ревматоидном артрите, системной красной волчанке, хроническом гломерулонефрите.
  7. Определить факторы риска неэффективности иммуносупрессивной терапии при ревматоидном артрите, системной красной волчанке, хроническом гломерулонефрите, а также факторы риска развития люпус-нефрита у больных системной красной волчанкой.
  8. Разработать принципы выбора варианта иммуносупрессивной терапии в зависимости от исходной активности апоптоза циркулирующих лимфоцитов.

Научная новизна исследования

В ходе исследования изучена активность апоптоза лимфоцитов при ревматоидном артрите, системной красной волчанке и хроническом гломерулонефрите. Проведен сравнительный анализ активности апоптоза лимфоцитов при данных заболеваниях, различающихся патогенетическими механизмами, распространенностью и преимущественной локализацией патологического процесса, выявлены различия в интенсивности апоптоза при этих заболеваниях.

Впервые методом флуоресценции определена активность каспаз и степень реализации программированной клеточной гибели в виде разрывов ДНК при иммуновоспалительных заболеваниях со сравнительной оценкой показателей при различных стадиях, длительности течения и активности заболевания, наличия функциональной недостаточности. Обнаружена связь нарушений апоптоза периферических лимфоцитов с активностью и длительностью течения заболеваний.

Изучена связь между активностью апоптоза лимфоцитов и активностью фактора некроза опухоли , интерлейкина 2, интерлейкина 6, которые имеют важное значение как в развитии и течении заболеваний, так и в осуществлении процессов программированной клеточной гибели. 

Выявлена связь между активностью медь/цинк-зависимой супероксидидсмутазы, отражающей активность хронических воспалительных заболеваний и являющейся средством ранней диагностики нефропатии, и активностью апоптоза периферических лимфоцитов.

Изучено влияние наиболее широко используемых иммуносупрессивных препаратов – метилпреднизолона, метотрексата и циклофосфана – на активность апоптоза лимфоцитов in vitro, выявлено стимулирующее влияние этих иммуносупрессивных препаратов на процессы апоптоза лимфоцитов. 

В работе впервые исследована динамика интенсивности программированной гибели периферических лимфоцитов на фоне проводимого лечения иммуносупрессивными препаратами в течение 2-5 лет, а при ревматоидном артрите и на фоне терапии современным биологическим агентом – инфликсимабом. Выявлено коррегирующее влияние эффективной базисной терапии в отношении ассоциированного с воспалительной активностью изменения активности реализации апоптоза.

Впервые оценена возможность использования показателей активности апоптоза периферических лимфоцитов в качестве прогностических факторов течения иммуновоспалительных заболеваний и эффективности лечения иммуносупрессивными препаратами.


Теоретическая и научно-практическая значимость работы

Полученные результаты позволяют оценить характер изменений активности апоптоза при заболеваниях иммуновоспалительного генеза - ревматоидном артрите, системной красной волчанке, хроническом гломерулонефрите. В ходе исследования выявлено, что количество разрывов ДНК и активность каспаз 8, 6, 4, определяемые в динамике методом флуоресценции как показатели интенсивности апоптоза, могут быть использованы в комплексе с традиционными клинико-лабораторными данными для оценки активности заболеваний и прогноза.

В работе показана способность базисных иммуносупрессивных препаратов индуцировать программированную гибель периферических лимфоцитов. Знание исходной активности апоптоза лимфоцитов позволяет решить вопрос о варианте иммуносупрессивной терапии, ее интенсивности, а исследование активности апоптоза периферических лимфоцитов в динамике может указать на необходимость коррекции проводимой терапии.

Внедрение результатов исследования

Результаты исследования внедрены в практическую деятельность ГУЗ «Республиканская больница им. В.А. Баранова» (Республика Карелия, г. Петрозаводск). Материалы диссертации используются в учебном процессе для студентов и клинических ординаторов на кафедре госпитальной терапии медицинского факультета Петрозаводского государственного университета, а также при повышении квалификации врачей терапевтов и ревматологов Республики Карелия на факультете повышения квалификации медицинских работников Петрозаводского государственного университета.

Апробация результатов исследования

Основные положения диссертации были доложены и обсуждены на Конгрессе ревматологов России (Саратов, 2003), IV съезде ревматологов России (Казань 2005), второй, третьей, четвертой, пятой, шестой, седьмой Северо-западных конференциях по ревматологии (Петрозаводск, 2002; Псков, 2003; Великий Новгород, 2004; Санкт-Петербург, 2005; Петрозаводск, 2006; Вологда, 2007), Республиканских научно-практических конференциях терапевтов (Петрозаводск 2002, 2004, 2006, 2007).

Положения, выносимые на защиту

  1. Активность апоптоза периферических лимфоцитов повышена при заболеваниях иммуновоспалительного генеза – ревматоидном артрите, системной красной волчанке, хроническом гломерулонефрите.
  2. Интенсивность апоптоза периферических лимфоцитов зависит от активности, давности, системности иммуновоспалительных заболеваний.
  3. Интенсивность апоптоза периферических лимфоцитов коррелирует с активностью фактора некроза опухоли , интерлейкина 2, интерлейкина 6, медь/цинк-зависимой супероксиддисмутазы и отражает активность иммуновоспалительных заболеваний.
  4. Метилпреднизолон, метотрексат и циклофосфан in vitro оказывают стимулирующее влияние на активность апоптоза периферических лимфоцитов.
  5. Эффективная иммуносупрессивная терапия достоверно усиливает апоптоз периферических лимфоцитов при иммуновоспалительных заболеваниях.
  6. Исходная активность апоптоза лимфоцитов может быть использована при выборе варианта терапии.
  7. Исходная активность апоптоза лимфоцитов наряду с признаками высокой активности заболеваний может быть использована как прогностический фактор течения иммуновоспалительных заболеваний.

Публикации и поддержка исследований

По теме диссертации опубликована 41 печатная работа (из них 8 – в ведущих рецензируемых журналах и изданиях, определенных ВАК).

Диссертационная работа была выполнена в рамках ФЦНТП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники» на 2002-2006 годы по мероприятию 1.9 «Проведение молодыми учеными научных исследований по приоритетным направлениям науки, высоких технологий и образования» («Развитие инфраструктуры» IV очередь – Молодые ученые), гос. контракт № 02.442.11.7392, шифр 2006-РИ-19.0/001/585 «Изучение активности апоптоза лимфоцитов при иммуновоспалительных заболеваниях на модели ревматоидного артрита, системной красной волчанки и хронического гломерулонефрита», поддержана грантом Президента Российской Федерации для молодых российских ученых и ведущих научных школ Российской Федерации на выполнение научных исследований № МК-1814.2004.7 «Изучение активности программированной клеточной гибели лимфоцитов в дебюте ревматоидного артрита, системной красной волчанки и хронического гломерулонефрита», Программой Росбразования «Университеты России» УР.11.01.009 «Роль программированной клеточной гибели лимфоцитов в патогенезе и лечении ревматоидного артрита».

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 343 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, шести глав собственных наблюдений, обсуждения полученных результатов, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, включающего 374 источника, из них 158 отечественных и 216 иностранных работ. Диссертация иллюстрирована 184 рисунками и 75 таблицами.

Содержание работы

Материалы и методы исследования

В исследование включено 357 человек, из них 172 больных ревматоидным артритом (РА), 85 больных системной красной волчанкой (СКВ) и 75 больных хроническим гломерулонефритом (ХГН), 25 здоровых доноров. Все больные на момент включения в исследование обследовались и лечились в ревматологическом или нефрологическом отделении Республиканской больницы (Карелия, г. Петрозаводск), в контрольные сроки – в Республиканской поликлинике, ревматологическом или нефрологическом отделении.

Всем больным РА и СКВ диагноз устанавливался на основании диагностических критериев РА и СКВ Американской коллегии ревматологов (АРА). Диагноз ХГН у 40 больных (53,3%) устанавливался морфологически, у остальных больных на основании характерных для заболевания клинических синдромов. 

В ходе исследования у больных РА оценивались параметры суставного синдрома, стадия патологического процесса, степень общей активности, у больных СКВ – вариант течения заболевания, степень активности, наличие поражения почек, почечной недостаточности, у больных ХГН – клинический и морфологический вариант заболевания, степень активности, наличие почечной недостаточности.

Клинические методы исследования

Оценка общего суставного синдрома у больных РА клинически проводилась по следующим параметрам: суставной индекс Ричи (СИР), общий счет болезненных суставов (СБС), общий счет припухших суставов (СПС), утренняя скованность (УС), оценка выраженности боли пациентом с использованием визуальной аналоговой шкалы (ВАШ) в покое и при физической нагрузке, для оценки общей активности заболевания использовался комбинированный индекс Disease Activity Score  (DAS4). Для оценки эффективности терапии использовалось динамика индекса  DAS 4 cогласно рекомендациям EULAR.

При СКВ и ХГН больные исследованы клинически по стандартам осмотра больных терапевтического профиля без использования специальных методов исследования.

У больных СКВ для оценки активности заболевания рассчитывался индекс SLEDAI (Systemic lupus erythematosus disease activity index) по сумме баллов в зависимости от наличия поражения органов и систем. Возможная максимальная сумма баллов 105. При уменьшении индекса SLEDAI на 6 баллов констатировалось улучшение, при увеличении на 8 баллов – ухудшение течения заболевания.

Лабораторные методы исследования

Всем больным выполнялось исследование клинического анализа крови, общего анализа мочи, определение уровня общего белка с помощью прецизионного рефрактометра, белковых фракций с использованием диагностического набора для электрофоретического разделения белков сыворотки крови на агарозе “Cormay gel protein”, С-реактивного белка (СРБ) методом иммуноферментного анализа (ИФА), креатинина реакцией Иоффе, мочевины УФ-кинетическим уреазным методом, циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) методом фотометрии. У больных РА и ряда больных СКВ исследовался уровень ревматоидного фактора (РФ) методом ИФА. У больных СКВ дополнительно исследовались антитела к ДНК непрямым твердофазным иммуноферментным методом (ELISA) с использованием тест-систем фирмы “Orgentec” и оценкой на многофункциональном анализаторе Victor II (Pribori Oy, Финляндия), у ряда больных определялся титр антинуклеарного фактора (АНФ) иммунофлуоресцентным методом. У больных СКВ с наличием нефрита и больных ХГН сульфосалициловым методом исследовалась суточная протеинурия, рассчитывалась скорость клубочковой фильтрации по формуле Cockoft-Golt.

Определение уровня интерлейкина 2 (ИЛ-2), интерлейкина 6 (ИЛ-6), фактора некроза опухолей (ФНО ), sFas-лиганда (sFas-L), Cu/Zn супероксиддисмутазы (Cu/ZnСОД) проводилось на сенсорном иммуноферментном анализаторе Sunrise (TECAN Austria GmbH) с использованием тест-систем фирмы “Biosourse Europe S.A.”, Бельгия при определении ИЛ-2, ИЛ-6, ФНО-, Cu/ZnСОД и тест-системы фирмы “Bender Medsystems”, Австрия при определении sFas-L. Минимально определяемыми концентрациями согласно методикам измерений были для ИЛ-2 5,1 пг/мл, для ИЛ-6 2 пг/мл, для ФНО- 1,7 пг/мл, для sFas-L 0,1 нг/мл, для Cu/ZnСОД 0,07 нг/мл. Показатели ниже уровня детекции принимались равными 0.

Исследование активности апоптоза периферических лимфоцитов

Выделение циркулирующих Лф производилось из гепаринизированной крови в двойном градиенте плотности фиколл-верографина 1,077 и 1,092 г/мл с первоначальным центрифугированием в течение 40 мин при скорости 1500 об/мин с последующим центрифугированием в течение 5 мин при 400 об/мин в градиенте перколла 1,060 г/мл.

Определение характера повреждений ДНК (1- и 2-нитевые разрывы) проводили флуоресцентным методом по изменению параметров флуоресценции двух ДНК-тропных красителей: бромистого этидия (EtBr) (“Sigma”, США) и 4’, 6-диамидино-2-фенилиндола (DAPY) (“Serva”, США) (Иванов, 1992; Анисимов, Болотников, 1999). Измерения проводили на приборе ФМ-Ц-2 (ЛФ ВНИИМП, Россия. Определение активности каспаз (К) проводили флуоресцентным методом с использованием специфических субстратов, меченных флуоресцентной меткой (7-амино-4-трифлуорометилкумарин – AFC) (“BioRad”, США), детектируемой по изменению флуоресценции или оптической плотности. Определение количества отщепленного AFC проводили на СФ=46 (ЛОМО, Россия) при = 395 нм через 30, 60, 90, 120, 150, 180 мин после начала реакции.

Инструментальные методы исследования

Всем больным РА проводилась рентгенография суставов кистей и/ или стоп для определения стадии заболевания согласно классификации Steinbroker. Всем больным СКВ и ХГН проводилось ультразвуковое исследование почек. Дополнительно к вышеперечисленным методам исследования всем больным выполнялось ЭКГ, по показаниям - рентгенологическое исследование органов грудной полости.

Морфологические методы исследования.

Больным СКВ с поражением почек и больным ХГН выполнялась диагностическая нефробиопсия под контролем УЗИ. У всех больных было получено информированное согласие на проведение данного метода обследования. Полученные кусочки (размером 3-4•3-4 мм) фиксировались в течение суток в 1% растворе нейтрального формалина с последующей проводкой и заливкой в парафин общепринятым способом, затем срезы окрашивались гематоксилин-эозином, толлуидиновым синим, на фибрин по Вейгерту и проводилась ШИК-реакция с последующей микроскопией полученных препаратов в гистологической лаборатории ГУЗ “Республиканская больница им. В.А. Баранова”.

Исследование активности апоптоза лимфоцитов периферической крови in vitro под влиянием метилпреднизолона, циклофосфана.

У 25 больных РА, 20 больных СКВ и 20 больных ХГН in vitro исследовали влияние иммуносупрессивных препаратов на активность А Лф. Первоначально определяли исходную активность А Лф. Затем обрабатывали Лф больных, каждая проба в количестве 2х106 Лф, в течение 14 часов в зависимости от заболевания иммуносупрессивными препаратами: при РА – в первой пробе - метилпреднизолоном (концентрация 100 мкМ), во второй пробе - метотрексатом (концентрация 10 мкг/мл), в третьей пробе  первоначально метилпреднизолоном, в последущем меторексатом в указанных концентрациях; при СКВ и ХГН -  в первой пробе - метилпреднизолоном (концентрация 100 мкМ), во второй пробе – циклофосфаном (концентрация 10 мкг/мл), в третьей пробе  первоначально метилпреднизолоном, в последущем циклофосфаном в указанных концентрациях. После окончания времени инкубации во всех пробах повторно определяли активность К и количество разрывов ДНК.

Для подтверждения внекаспазного пути активации А Лф 25 больных РА в количестве 2х106  инкубировали в присутствии ингибитора К ZVAD в концентрации 50 мкМ в течение 1 ч при 37 °С с последующей обработкой метотрексатом в концентрация 10 мкг/мл и определением активности К и количества разрывов ДНК. Также Лф 15 больных ХГН  в количестве 2х106 инкубировали в присутствии ингибитора К ZVAD в концентрации 50 мкМ в течение 1 ч при 37 °С с последующей обработкой циклофосфаном в концентрация 10 мкг/мл и определением активности К и количества разрывов ДНК.

Статистическая обработка результатов.

Результаты исследования были занесены в таблицу формата Microsoft Excel 2003, затем проводилась статистическая обработка данных при помощи пакета программ Statistica 6.0. Перед началом статистической обработки распределения значений количественных признаков были проверены на нормальность. Проведенный анализ показал, что все количественные признаки имеют нормальное распределение. Определялись средние величины [M+m], достоверность различия средних значений в группах  по критерию Стьюдента (t), по критериям знаков и Манна-Уитни для малых выборок. Наличие достоверных различий между группами (p<0,001, p<0,01, p<0,05) обозначено в таблицах знаком *. Изучена теснота связи (корреляция) между клиническими, лабораторными, инструментальными показателями при помощи коэффициента корреляции Пирсона (коэффициент парной корреляции). Влияние отдельных факторов риска (количественных и качественных) на результаты лечения определяли в регрессионном анализе по величине риска отсутствия улучшения, выражавшемся в отношении шансов. Данный показатель отражает во сколько раз риск невозможности достичь улучшения от проводимой базисной терапии выше у пациента с определенным фактором риска по сравнению с тем, у кого этот фактор не определяется.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Изучение активности апоптоза периферических лимфоцитов при заболеваниях иммуновоспалительного генеза ревматоидном артрите, системной красной волчанке, хроническом гломерулонефрите

Для решения поставленных целей и задач исследовано 172 больных достоверным РА, диагностированным на основании критериев Американской коллегии ревматологов, 129 женщин (75%), 43 мужчины (25%), средний возраст составил 47,4 ± 12,2 лет (максимально 71 год, минимально 19 лет), давность заболевания 43,1±19,7 мес (максимально 8 лет), из них давность заболевания до 6 мес включительно имела место у 45 (26,2%) пациентов, от 6 мес до 1 года – у 62 (36,1%) от 1 года до 2 лет – у 22 (12,8%), от 2 до 5 лет – у 18 (10,5%) и более 5 лет – у 25 (14,4%) . У 75 больных (43,6%) на момент включения в исследование заболевание диагностировано впервые. У 150  пациентов (87,2%) имел место полиартрит, у 22 (12,8 %) – олигоартрит. Серопозитивный вариант РА имел место в 114 случаях (66,3 %), серонегативный – в 58 (33,7 %). I рентгенологическая стадия была диагностирована у 38 пациентов (22,1%), II – у 48 (27,9%), III – у 38 (22,1%), IV – у 14 (8,1%), у 34 (19,8%) не было выявлено патологических изменений на выполненных рентгенограммах. Активность заболевания определялась согласно критериям, рекомендованным Ассоциацией ревматологов России (АРР), а также по уровню индекса DAS4 согласно критериям EULAR. Наибольшее количество больных составили пациенты с умеренной (76 пациентов (44,2%) по критериям АРР и 77 (44,8%) по критериям EULAR) и высокой (59 пациентов (34,3%) по критериям АРР и 58 (33,7%) по критериям EULAR) степенью активности заболевания. У 37 пациентов (21,5%) и по критериям АРР, и по критериям EULAR была констатирована минимальная степень активности патологического процесса.  У всех больных имела место функциональная недостаточность различной выраженности – у 51 пациента (29,7%) I степени, у 62 (36,1%) – II, у 45 (26,2%) – III, у 14 (8,0%) – IV. Системные проявления заболевания отмечены у 105 больных (61,1%).

В исследование включено 85 больных достоверной СКВ, диагностированной на основании критериев Американской коллегии ревматологов, 76 женщин (89,4%), 9 мужчин (10,6%), средний возраст составил 39,1±14,2 лет (максимально 73 года, минимально 16 лет), давность 7,4±6,7 года (максимально 27 лет). У 16 пациентов (18,8%) СКВ диагностирована впервые. У 4  пациентов (4,7%) имело место острое течение заболевания, у 65 (76,5%) – подострое, у 16 (18,8%) – хроническое. У 20 (23,5%) больных имела место минимальная активность заболевания, у 34 (40%) – умеренная, у 31 (36,5%) - высокая. Люпус-нефрит имел место в 38 случаях (44,7 %), в 10 из них (26,3%) верифицированный морфологически, у 5 больных имела место хроническая почечная недостаточность, у 1 больной – в терминальной стадии, в последующем больная получала терапию хроническим гемодиализом. В меньшем проценте случаев встречался полисерозит (у 22 больных), нейролюпус (у 19 пациентов), антифосфолипидный синдром (у 18 больных). Особое внимание в работе уделено группе больных СКВ с наличием люпус-нефрита. 

В исследование включено 75 больных ХГН, 50 мужчин (66,7%), 25 женщин (33,3%), средний возраст составил 34,3±14,5 лет (максимально 63 год, минимально 17 лет), давность 4,6±7,1 года (максимально у 1 больного 36 лет). У 48 больных (64 %) на момент включения в исследование заболевание диагностировано впервые. В исследование были включены больные только с активными вариантами ХГН. У 46 пациентов (61,3%) имел место нефротический вариант заболевания, у 20 (26,7%) - смешанный вариант (нефротический синдром, артериальная гипертензия), у 9 (12%) – нефритический синдром. У 40 больных (53,3%) выполнялась нефробиопсия, по результатам которой у 26 больных (34,7%) имел место мезангиопролиферативный вариант заболевания, у 14 (18,6%) – мембранозная нефропатия, у 6 (8%) – экстракапиллярый гломерулонефрит с полулуниями. У 46 больных (61,3%) функция почек была сохранена, у 29 (38,7%) имела место почечная недостаточность различной степени выраженности – у 14 (18,7%) – I, у 9 (12%) – II, у 6 (8%) – III по классификации С.И. Рябова.

Изучена активность К 8, К 6, К 4 и количество 1- и 2-нитевых разрывов ДНК в целом в группах больных РА, СКВ и ХГН на момент включения в исследование в сравнении с контрольной группой здоровых доноров. Результаты представлены в таблице 1 и на рисунке 1.

Реализация программированной клеточной гибели лимфоцитов в виде 1- и 2-нитевых разрывов ДНК оказалась достоверно выше при всех изучаемых иммуновоспалительных заболеваниях по сравнению со здоровыми донорами, что представлено на рисунке 1.

* - – различия достоверны при сравнении с группой контроля (* - р < 0,05, ** - p < 0,01, *** - p < 0,001)

°– различия достоверны при сравнении между группами больных с различными заболеваниями (° - р < 0,05)

Рисунок 1 – Количество 1- и 2-нитевых разрывов ДНК при РА, СКВ и ХГН

Процесс А осуществляется посредством последовательной активации каскада К. Активность исследуемых К при изучаемых заболеваниях представлена в таблице 1. К 8  - активатор эффекторных К и эффекторная К 6 достоверно более активны при всех изучаемых заболеваниях по сравнению с контрольной группой. К 4 также имеет достоверно более высокую активность, что наиболее вероятно связано не только с ее участием в процессе А, но и с ее ролью активатора цитокинов.

Таблица 1 - Активность К 8, К 6, К 4 и количество разрывов ДНК при РА, СКВ и ХГН

Показатель

РА

СКВ

ХГН

Контрольная группа

К 8, мин от начала реакции

30

0,0027±0,0011**°°

0,0032±0,0012***

0,0034±0,0010**

0,0019±0,0007

60

0,0044±0,0012°°

0,0050±0,0015

0,0052±0,0014

0,0042±0,0011

90

0,0060±0,0011°

0,0067±0,0028

0,0064±0,0015

0,0059±0,0008

120

0,0075±0,0014**°

0,0085±0,0028**

0,0082±0,0022*

0,0069±0,0008

150

0,0093±0,0017**°

0,0110±0,0038**

0,0109±0,0040*

0,0088±0,0006

180

0,0128±0,0033***°

0,0144±0,0054***

0,0145±0,0064**

0,0098±0,0007

К 6, мин от начала реакции

30

0,0027±0,0012

0,0031±0,0010

0,0028±0,0012

0,0021±0,0008

60

0,0045±0,0015

0,0047±0,0014

0,0046±0,0011

0,0047±0,0014

90

0,0061±0,0017**

0,0066±0,0028**

0,0060±0,0014**

0,0058±0,0008

120

0,0074±0,0016**

0,0081±0,0029***°°

0,0074±0,0019**

0,0068±0,0008

150

0,0094±0,0021**

0,0101±0,0032**

0,0098±0,0026*

0,0084±0,0005

180

0,0122±0,0031***

0,0127±0,0041***

0,0131±0,0047**

0,0102±0,0008

К 4, мин от начала реакции

30

0,0048±0,0025***

0,0056±0,0030***°°

0,0048±0,0025***

0,0024±0,0005

60

0,0131±0,0066***°°

0,0170±0,0083***

0,0191±0,0057***

0,0052±0,0009

90

0,0297±0,0383***

0,0296±0,0172***

0,0311±0,0126***°

0,0064±0,0008

120

0,0420±0,0167***

0,0445±0,0210***

0,0474±0,0199***

0,0074±0,0008

150

0,0594±0,0172***

0,0621±0,0211***

0,0616±0,0233***

0,0088±0,0007

180

0,0813±0,0207***

0,0725±0,0313***

0,0805±0,0196***

0,0096±0,0005

* – различия достоверны при сравнении с группой контроля (* - р < 0,05, ** - p < 0,01, *** - p < 0,001)

°– различия достоверны при сравнении между группами больных с различными заболеваниями (° - р < 0,05, °° - р < 0,01)

При сравнении активности А Лф при изучаемых заболеваниях выявлено, что активность К 8 несколько ниже при РА по сравнению с СКВ и ХГН при сравнимой активности К 6, К 4 и количеству разрывов ДНК. Отсутствие значимых различий в активности А Лф при различных иммуновоспалительных заболеваниях позволяет предположить более важную роль активности патологического процесса, а не его распространенности.

Процесс А запускается в момент взаимодействия специфического рецептора и его лиганда. Наиболее изученным из индукторов клеточной гибели является Fas-лиганд, вызывающий при взаимодействии со специфическим рецептором Fas/АРО/CD95 А клетки. Растворимый FasL (sFasL) представляет собой фракцию FasL, которая не связана с клетками, циркулирует в крови и может быть определена иммуноферментным методом. В связи с важной ролью FasL в протекании процессов А проведено сравнение активности изучаемых К и количества разрывов ДНК раздельно у sFasL-позитивных и у sFasL-нетагивных больных РА, СКВ, ХГН. Выявлено, что как среди серопозитивных, так и среди серонегативных по sFasL больных, достоверно более высокая активность К 8 и К 6 наблюдается при ХГН, минимальная – при СКВ. Активность К 4 среди серопозитивных по sFasL больных достоверно более высока у больных СКВ и сравнима при РА и ХГН. Активность К 4 среди серонегативных по sFasL больных наименьшая у больных ХГН и сравнима при РА и СКВ. Количество разрывов ДНК у серопозитивных по sFasL больных при РА, СКВ и ХГН не имеет достоверных различий, тогда как у серонегативных по sFasL больных отмечается достоверно большее количество 1-нитевых разрывов ДНК при ХГН при их меньшем и сравнимом количестве при РА и СКВ. Полученные данные позволяют предполагать различную долю участия sFasL в реализации процессов А при различных иммуновоспалительных заболеваниях.

Проведен анализ зависимости активности А Лф от особенностей заболевания – при РА от варианта, активности, длительности, стадии, наличия внесуставных проявлений, наличия и выраженности функциональной недостаточности, при СКВ от варианта течения, давности, активности, наличия нефрита. 

Выявлена более высокая активность К и количества разрывов ДНК у больных серопозитивным вариантом РА, с высокой активностью заболевания, при наличии внесуставных проявлений заболевания. Убедительных различий в активности изучаемых К и количестве разрывов ДНК при различных рентгенологических стадиях заболевания не отмечено.

Выявлено, что у больных “ранним РА” (давность заболевания не более 6 мес) имеет место снижение активности К 8 и 6 и количества разрывов ДНК не только по сравнению с больными “неранним РА”, но и по сравнению с группой контроля (результаты представлены на рисунке 2), что может свидетельствовать о депрессии процессов программированной клеточной гибели в дебюте заболевания, что, возможно, и является предрасполагающим фактором для развития РА.

*- различия достоверны при сравнении между группами (p<0,05)

Рисунок 2 - Количество разрывов ДНК при РА в зависимости от давности заболевания

При СКВ выявлена более высокая активность К и количества разрывов ДНК при подостром течении заболевания по сравнению с хроническим течением заболевания. Выявлена более высокая активность К и большее количество разрывов ДНК при высокой активности заболевания по сравнению как с контрольной группой, так и с группами больных с минимальной и умеренной активноcтью заболевания. При впервые диагностированной СКВ в сравнении с ранее диагностированным заболеванием выявлена достоверно более высокая активность К 8 и К 6 и большее количество 1-нитевых разрывов ДНК при сравнимой активности К 4 и количестве 2-нитевых разрывов ДНК. Активность всех исследуемых каспаз и количество разрывов ДНК были достоверно выше в обеих исследуемых группах по сравнению с группой контроля.

Выявлена более высокая активность апоптоза лимфоцитов у больных СКВ с поражением почек по сравнению с больными без люпус-нефрита (результаты представлены на рисунке 3).

*- различия достоверны при сравнении между группами (p<0,05)

Рисунок 3 - Количество разрывов ДНК при СКВ в зависимости от наличия люпус-нефрита

При РА и СКВ выявлена достоверная прямая зависимость между активностью К 8 и 6 (при РА r=от 0,259 до 0,748, p< от 0,05 до 0,001, при СКВ r=от 0,320 до 0,937, p< от 0,05 до 0,001 ), а также между активностью К 8 и 6 и количеством разрывов ДНК (при РА r=от 0,268 до 0,397, p< от 0,05 до 0,001, при СКВ r=от 0,345 до 0,463, p< от 0,05 до 0,01), что подтверждает последовательную активацию этих К, реализующихся в конечном итоге в виде разрывов ДНК. Выявлено, что К 4 имеет достоверную отрицательную корреляционную связь с К 8, К 6 (при РА r=от -0,257 до -0,440, p< от 0,05 до 0,01, при СКВ r=от -0,225 до -0,324, p< от 0,05 до 0,01) и количеством разрывов ДНК (при РА r=от -0,226 до -0,395, p< от 0,05 до 0,001, при СКВ r=от -0,310 до -0,679, p< от 0,05 до 0,001), что может свидетельствовать об участии К 4 в ингибировании А.

При РА выявлена достоверная положительная корреляционная связь между активностью К 8 и СПС (r=0,162-0,273, p<0,05), выраженностью боли по ВАШ (r=0,180, p<0,05), длительностью УС (r=0,227-0,231, p<0,05), уровнем СРБ (r=0,163-0,233, p<0,05), -глобулинов (r=0,237-0,249, p<0,05), РФ (r=0,267, p<0,05), ЦИК (r=0,191-0,278, p<0,05), достоверная положительная корреляционная связь между активностью К 6 и СИР (r=0,227, p<0,05), уровнем СРБ (r=0,168-0,268, p<0,05), -глобулинов (r=0,262-0,347, p<0,05-0,01), фибриногена (r=0,291-0,309, p<0,05-0,01), РФ (r=0,170-0,303, p<0,05-0,01), ЦИК (r=0,161-0,308, p<0,05-0,01), достоверная положительная корреляционная связь между активностью К 4 и СПС (r=0,167-0,273, p<0,05), СИР (r=0,160-0,243, p<0,05), выраженностью боли по ВАШ (r=0,167, p<0,05), уровнем СРБ (r=0,164-0,290, p<0,05), -глобулинов (r=0,254-0,305, p<0,05-0,01), фибриногена (r=0,248-0,311, p<0,05-0,01), РФ (r=0,270-0,287, p<0,05), ЦИК (r=0,256-0,306, p<0,05-0,01), достоверная положительная корреляционная связь между количеством разрывов ДНК и всеми изучаемыми показателями клинической активности РА (СБС, r=0,259-0,296, p<0,05, СПС, r=0,244-0,247, p<0,05, СИР, r=0,271-0,162, p<0,05, выраженностью боли по ВАШ, r=0,248-0,268-0,278-0,162, p<0,05, длительностью УС, r=0,256-0,262, p<0,05), а также уровнем СРБ (r=0,255-0,278, p<0,05), -глобулинов (r=0,236, p<0,05), РФ (r=0,268-0,271 p<0,05), ЦИК (r=0,254-0,308, p<0,01).

При СКВ выявлена достоверная положительная корреляционная связь между активностью К 8 и уровнем антител к ДНК (r=0,236, p<0,05), уровнем ЦИК (r=0,322, p<0,05), достоверная положительная корреляционная связь между активностью К 6 и уровнем -глобулинов (r=0,247, p<0,05), ЦИК (r=0,228, p<0,05), достоверная положительная корреляционная связь между активностью К 4 и уровнем СОЭ (r=0,215-0,219, p<0,05), антител к ДНК (r=0,250-0,269, p<0,05), -глобулинов (r=0,216-0,228, p<0,05), ЦИК (r=0,292-0,371, p<0,05), достоверная положительная корреляционная связь между количеством разрывов ДНК и уровнем СОЭ (r=0,189, p<0,05), антител к ДНК (r=0,251-0,391, p<0,05, 0,001), -глобулинов (r=0,247, p<0,05), ЦИК (r=0,220, p<0,05), достоверная отрицательная корреляционная связь между активностью всех исследуемых К и количества разрывов ДНК с выраженностью анемии (r= от -0,225 до -0,366, p<0,05, 0,01). Выявлена достоверная корреляционная связь между активностью К 4 и наличием люпус-нефрита (на 30 - r=0,403, р<0,01, на 60 - r=0,391, р<0,05, на 180 - r=0,395, р<0,01).

Полученные корреляционные зависимости подтверждают существование взаимосвязи между активностью патологического процесса и активностью программированной клеточной смерти. 

2. Изучение взаимосвязи между активностью апоптоза периферических лимфоцитов и активностью ФНО-, ИЛ-2, ИЛ-6 при заболеваниях иммуновоспалительного генеза

Активность ФНО-а определяли у 80 больных РА, 27 больных СКВ и 17 больных ХГН, активность ИЛ-2 – у 44 больных РА, 24 больных СКВ и 15 больных ХГН и активность ИЛ-6 – у 25 больных РА, 20 больных СКВ и 15 больных ХГН на момент включения больных в исследование. Результаты представлены на рисунках 4-6. При всех заболеваниях выявлено достоверное (p<0,001) повышение активности всех изучаемых цитокинов, при этом достоверно наиболее высокая активность ФНО-а и ИЛ-2 и, в особенности, ИЛ-6 отмечается при РА в сравнении с СКВ и ХГН. Наиболее вероятно, что именно различная активность ФНО-а, ИЛ-2 и ИЛ-6 и определяет особенности протекания процессов А Лф при различных иммуновоспалительных заболеваниях.

*- различия достоверны при сравнении между группами больных с различными заболеваниями (* - p<0,05, *** - p<0,001)

Рисунок 4 - Активность ФНО-а, ИЛ-2 и ИЛ-6 при РА, СКВ и ХГН

При проведении корреляционного анализа при РА выявлена достоверная положительная корреляционная связь между уровнем ИЛ-2 и индексом активности РА DAS4 (r=0,400, p<0,05), СПС (r=0,371, p<0,05), выраженностью боли по ВАШ (r=0,385, p<0,05), длительностью УС (r=0,501, p<0,01), уровнем СОЭ (r=0,384, p<0,05), между уровнем ИЛ-6 и индексом активности РА DAS4 (r=0,405, p<0,05), СПС (r=0,411, p<0,01), длительностью УС (r=0,403, p<0,05), уровнем -глобулинов (r=0,355, p<0,05), между уровнем ФНО и индексом активности РА DAS4 (r=0,433, p<0,01), СИР (r=0,413, p<0,05), выраженностью боли по ВАШ (r=0,421, p<0,01), уровнем СОЭ (r=0,411, p<0,05), что подтверждает связь между активностью заболевания и активностью изучаемых цитокинов.

При РА также выявлена достоверная положительная корреляционная связь между активностью К 8, К 6, К 4, количеством разрывов ДНК и активностью ИЛ-2 (r=от 0,294 до 0,389, p<от 0,05 до 0,001), ИЛ-6 (r=от 0,223 до 0,396, p<от 0,05 до 0,001), ФНО- (r=от 0,300 до 0,399, p<от 0,05 до 0,001), что также подтверждает наличие тесной связи между активностью заболевания и активностью процессов программированной смерти клеток, в том числе периферических Лф.

При обследовании больных РА в динамике выявлена достоверная положительная корреляционная связь между исходной активностью К 8 на 180' и активностью ФНОа через 6 мес (r=0,416, p<0,01), активностью ИЛ-6 через 6 мес (r=0,369, p<0,05), исходным количеством 1-нитевых разрывов ДНК и активностью ФНОа через 6 мес (r=0,316, p<0,05), исходным количеством 2-нитевых разрывов ДНК и активностью ФНОа через 6 мес (r=0,401, p<0,05), активностью ИЛ-6 через 6 мес (r=0,368, p<0,05). При длительности наблюдения за больными 1 год и более выявлена отрицательная корреляционная связь между исходным количеством 1-нитевых разрывов ДНК и активностью ФНОа в динамике (r=-0,400, p<0,05), активностью ИЛ-6 в динамике (r=-0,319, p<0,05), исходным количеством 2-нитевых разрывов ДНК и активностью ФНОа в динамике (r=-0,481, p<0,01).

При динамическом обследовании больных с люпус-нефритом выявлена достоверная отрицательная корреляционная связь между исходной активностью К 8 на 60, 90, 120, 180' и активностью ФНО- через 2 года (r=-0,580, р<0,05, r=-0,593, р<0,05, r=-0,704, р<0,01, r=-0,528, р<0,05, r=-0,542, р<0,05 соответственно), между исходной активностью К 6 на 90, 120, 150, 180' и активностью ФНО- через 2 года (r=-0,682, р<0,01, r=-0,742, р<0,01, r=-0,633, р<0,01, r=-0,658, р<0,01 соответственно), между исходным количеством 1-нитевых разрывов ДНК и активностью ФНО- через 2 года (r=-0,544, p<0,05) и достоверная положительная корреляционная связь между исходной активностью К 4 на 90, 120, 150, 180' и активностью ФНО- через 2 года (r=0,634, р<0,01, r=0,599, р<0,01, r=0,547, р<0,05, r=0,513, р<0,05 соответственно). Кроме того, выявлена достоверная отрицательная корреляционная связь между исходной активностью К 8 на 180' и активностью ИЛ-6 через 1 год (r=0,456, p<0,05), исходным количеством 2-нитевых разрывов ДНК и активностью ИЛ-6 через 1 год (r=0,486, p<0,05).

При ХГН выявлена достоверная отрицательная корреляционная связь между исходной активностью К 8 на 30, 60, 90, 120, 180' и активностью ФНО- через 2 года (r=-0,571, р<0,05, r=-0,581, р<0,05, r=-0,595, р<0,05, r=-0,706, р<0,01, r=-0,529, р<0,05, r=-0,544, р<0,05 соответственно), между исходной активностью К 6 на 90, 120, 150, 180' и активностью ФНО- через 2 года (r=-0,684, r=-0,741, r=-0,635, r=-0,659, р<0,01 соответственно), между исходным количеством 1-нитевых разрывов ДНК и активностью ФНО- через 2 года (r=-0,546, p<0,05) и достоверная положительная корреляционная связь между исходной активностью К 4 на 90, 120, 150, 180' и активностью ФНО- через 2 года (r=0,635, р<0,01, r=0,599, r=0,549, r=0,513, р<0,05 соответственно). Кроме того, выявлена достоверная отрицательная корреляционная связь между исходной активностью К 8 на 180' и активностью ИЛ-6 через 2 года (r=0,456, p<0,05), исходным количеством 1-нитевых разрывов ДНК и активностью ИЛ-6 через 2 года (r=0,477, p<0,05).

3. Влияние иммуносупрессивных препаратов на активность апоптоза периферических лимфоцитов in vitro при иммуновоспалительных заболеваниях

При проведении клинико-экспериментальной части исследования in vitro выявлено, что при РА в периферических Лф под влиянием только Мп происходит активация К 8 и К 6, увеличивается количество разрывов ДНК, при этом активность К 4 уменьшается. Под влиянием только Mtx происходит еще более выраженная активация К 8 и К 6, в большей степени увеличивается количество разрывов ДНК и снижается активность К 4 по сравнению с влиянием только Мп. Наиболее выраженная активация К 8, К 6, увеличение количества разрывов ДНК и снижение активности К 4 наблюдается при сочетанном воздействии  Мп и Mtx на периферические Лф, что наиболее вероятно связано с различными механизмами активации А клеток под влиянием этих иммуносупрессивных препаратов.

При СКВ и ХГН выявлено, что после обработки Лф только Мп происходит достоверное повышение активности К8 и, в несколько меньшей степени, К6. Воздействие Цф также активирует каспазы, однако, в меньшей степени по сравнению с Пн. При комбинированном воздействии Мп и в последующем Цф наблюдается наиболее выраженное и достоверное как по отношению к исходным показателям, так и по отношению к действию только Мп или только Цф, повышение активности как К8, так и К6. Активация К реализуется в увеличении количества разрывов ДНК, как 1-нитевых, так и 2-нитевых, что также наиболее выражено при комбинированном воздействии Мп и Цф и менее выражено при воздействии этими препаратами по отдельности. Снижение активности К4 отражает общее противовоспалительное действие, оказываемое Мп и Цф, и еще раз подтверждает связь между активностью воспалительного процесса и активностью А Лф.

В серии опытов с использованием ингибитора К показано, что активность К 8 и К 6 в присутствии ингибитора К достоверно ниже, чем их исходная активность и активность после воздействия Mtx. При РА активность К 4 в присутствии ингибитора К достоверно ниже исходного уровня и несколько выше активности К 4 после влияния Mtx (p<0,05). При СКВ активность К 4 в присутствии ингибитора К достоверно не отличается ни от исходного уровня, ни от активности К 4 под влиянием Цф. Однако, количество разрывов ДНК, прежде всего 1-нитевых, под влиянием Mtx при РА и Цф при СКВ в присутствии ингибитора К достоверно выше, чем исходный уровень количества разрывов ДНК, а при СКВ выше и чем количество разрывов ДНК после обработки Цф (p<0,01), что может быть обусловлено существованием альтернативных каспазному путей активации А клеток. 

4. Влияние иммуносупрессивных препаратов на активность апоптоза периферических лимфоцитов in vivo при иммуновоспалительных заболеваниях

Больные после включения в исследование получали разнообразную иммуносупрессивную терапию. Изучена активность А Лф в зависимости от варианта иммуносупрессивной терапии, ее длительности (при РА в течение 6 мес, 1 года, 2 лет, 3 лет, 4 лет, 5 лет и более, при СКВ и ХГН – в течение 1 и 2 лет).

При РА через 6 мес обследовано 172 пациента (100%), через 1 год – 160 (93%), через 2 года – 150 (87,2%), в интервале через 2-5 лет от начала исследования – 143 (83,1%) и при длительности наблюдения более 5 лет -  127 (73,8%). На начало исследования и в течение первых 6 мес 155 пациентов (90,1% от включенных в исследование больных РА) получали “базисную” терапию, через 1 год - 143 пациента (89,4%), через 2 года – 133 (88,7%), в интервале 2-5 лет от начала исследования – 126 (88,1%) и при длительности исследования более 5 лет – 110 больных (86,6%).  Более половины пациентов больных получали “базисную” терапию Mtx (в разные сроки от 56,4% до 60,8%), остальные пациенты получали терапию CC (в разные сроки от 25,5% до 27,3%), ЛФ (6 пациентов в течение 2 лет, 1 пациентка в течение 1 года), инфликсимабом (7 пациентов).  После включения в исследование 17 больных по различным причинам (отдаленность проживания, наличие противопоказаний, нежелание пациента) не получали адекватной базисной терапии.

Выявлено, что “базисные” препараты оказывают различное влияние на активность А Лф при РА, кроме того направленность влияния зависит от длительности терапии. Так, при длительности терапии в течение 6 мес и СС, и Лф, и Mtx оказывают подавляющее действие на активность К 8 и 6. В последующем у СС и Лф сохраняется супрессивная активность относительно А Лф, тогда как Mtx оказывает стимулирующее действие на К, что реализуется в увеличении количества 1-нитевых разрывов ДНК. Видимо, различия во влиянии на активность А Лф связаны с различными механизмами действия препаратов и с различной степенью их влияния на активность самого РА, т.к. показано, что у больных, не получавших базисной терапии и у больных, получавших терапию СС и Лф отмечается повышение активности К 4, коррелирующей с активностью патологического процесса в отличие от больных, получавших терапию Mtx и имеющих в динамике снижение активности К 4. Разнонаправленные изменения активности показателей А Лф на фоне терапии инфликсимабом могут свидетельствовать об участии не только ФНО- в регуляции активности процессов А, но и других биологически активных веществ, на которые влияние инфликсимаба не распространяется или распространяется в меньшей степени. Также выявлено, что выраженность и направленность влияния терапии на активность А Лф зависит не только от варианта терапии, но и от наличия ответа на проводимую терапию.

У пациентов, отвечающих на базисную терапию вне зависимости от ее варианта, через 6 мес отмечена достоверно более высокая активность К8 и К 6 и достоверное большее количество разрывов ДНК (представлено на рисунке 5) при меньшей активности К 4, что, вероятно, обусловлено снижением активности самого заболевания в результате эффективной терапии. Подобная закономерность сохраняется через 1 и 2 года от начала базисной терапии. При более длительном сроке от момента начала базисной терапии достоверной разницы в активности А Лф между пациентами, отвечающими и не отвечающими на терапию, не выявлено. 

*- различия достоверны при сравнении между группами (* - p<0,05, ** - p<0,01)

Рисунок 5 – Количество разрывов ДНК при РА через 6 мес в зависимости от ответа на терапию

Все больные СКВ после включения в исследование получали иммуносупрессивную терапию. Больные с органными поражениями получали преимущественно комбинированную иммуносупрессивную терапию (45 пациентов, 52,9%) – ГКС (Пн) и цитостатическими иммунодепрессантами (Цф или Аза), при наличии люпус-нефрита предпочтение отдавалось Цф. Ряд пациентов с хроническим или подострым течением и минимальной активностью заболевания получали монотерапию (16 пациентов, 18,8%) ГКС (Пн, 9 - 10,6%) или Ах (делагилом, 2 -  2,3% или плаквенилом, 5 – 5,9%). 

Все больные (100%) были обследованы через 1 и 2 года от момента включения в исследование. Эффект терапии оценивался по динамике индекса SLEDAI. При уменьшении индекса SLEDAI на 6 баллов констатировалось улучшение, при увеличении на 8 баллов – ухудшение течения заболевания. Отсутствие эффекта от терапии было констатировано через 1 год от начала терапии у 8 пациентов (9,4%), через 2 года – у 9 (10,6%). 

Выявлено, что ГКС как в варианте монотерапии, так и к комбинации с Цф и еще в большей степени с Аза способны активировать процессы А Лф, при этом наибольшую подавляющую активность на К 4 оказывает терапия Цф в комбинации с Пн. Терапия Ах не оказывает существенного влияния на активность А Лф. Выраженность влияния иммуносупрессивной терапии на активность А Лф зависит не только от ее варианта, но и от наличия эффекта от проводимой терапии.

48 пациентов (64%) с впервые диагностированным ХГН до включения в исследование терапии, в том числе, иммуносупрессивной терапии, не получали. 27 больных (36%) ранее получали терапию ИАПФ, иммуносупрессивную терапию, из них 10 больных (13,3%) только Цф, 8 (10,7%) – только ГКС (Пн или метилпреднизолон в средней дозе 0,75 мг/кг веса в сутки), 9 (12%) – комбинированную терапию Цф и ГКС, суммарная доза Цф в среднем 8 г. Длительность монотерапии Цф продолжалась в среднем 1,2±0,4 года при средней достигнутой суммарной дозе 9, 3±3,4 г. ГКС назначались в средней дозе 45-60 мг/сут в течение 4-6 недель с последующим постепенным снижением дозы до полной отмены при отсутствии признаков активности заболевания, длительность терапии ГКС составила в среднем 5,2±2,8 мес. При комбинированной иммуносупрессивной терапии Цф назначался или одномоментно с ГКС, или присоединялся позднее при недостаточной эффективности начатой терапии ГКС. Иммуносупрессивная терапия не проводилась пациентам при наличии почечной недостаточности, тяжелой артериальной гипертензии, плохой переносимости Цф, наличии побочных эффектов иммунносупрессивной терапии. 

Эффективность терапии оценивалась по купированию нефротического синдрома, гематурии, нормализации функции почек. Проводимая терапия оказалась неэффективна у 7 пациентов (9,3%), из них 5 получали комбинированную терапию Пн и Цф, 2 – монотерапию Цф. 

Выявлено, что проводимая при ХГН иммуносупрессивная терапия как в варианте монотерапии Цф и, в меньшей степени, Пн, так и в большей степени в варианте комбинации Пн и Цф способна активизировать процессы А Лф. При этом выраженность активирующего влияния зависит как от варианта иммносупрессивной терапии, так и от наличия ответа на проводимую терапию.

5. Прогностическая значимость исследования апоптоза периферических лимфоцитов при иммуновоспалительных заболеваниях

Для уточнения влияния активности А Лф на течение иммуновоспалительных заболеваний, его прогностической значимости проведен корреляционный анализ между показателями активности А Лф и показателями активности изучаемых заболеваний в динамике в контрольные сроки исследования (через 6 мес, 1 год, 2 года, 2-5 лет, более 5 лет от начала исследования).

При РА через 6 мес от начала исследования выявлена достоверная положительная корреляционная связь между исходными показателями активности А Лф и показателями активности РА в динамике (К 8 на 90' и длительность УС r=0,244, p<0,05, К 6 на 30' и индексом DAS4 r=0,300, p<0,05).

В последующем в более отдаленные сроки от начала исследования (через 1 год и в последующем) выявлена достоверная отрицательная корреляционная связь между показателями исходной активности А Лф и показателями активности РА в динамике. Так, корреляция между количеством 2-нитевых и 1-нитевых разрывов ДНК и индексом DAS4 через 1 год от начала исследования составила r=-0,445, p<0,05 и r=-0,338, p<0,05 соответственно, между СПС и К 8 на 30' - r=-0,278, p<0,05, между СБС и К 8 на 150' - r=-0,229, p<0,05, между СБС и К6' на 120 - r=-0,243, p<0,05. Отмечены множественные отрицательные корреляционные связи между исходной активностью К 8 и 6, количеством разрывов ДНК и уровнем СРБ в динамике (r= от -0,331 до -0,525 для разных показателей активности А Лф, p<0,05).

При сроке наблюдения за больными в течение 2 лет также сохраняется отрицательная корреляция между исходной активностью К 8 и 6 и активностью РА. Так, корреляция между К 8 на 30' и индексом DAS 4 составила r=-0,354, p<0,05, между К 8 на 60' и индексом DAS 4 - r=-0,369, p<0,01, между К 8 на 120' и длительностью УС - r=-0,228, p<0,05, между К 6 на 90' и длительностью УС - r=-0,232, p<0,05, между К 6 на 60' и СБС - r=-0,236, p<0,05.

Через 2-5 лет от начала исследования корреляция между исходным количеством 2-нитевых и 1-нитевых разрывов ДНК и индексом DAS4 в динамике составила r=-0,341, p<0,05 и r=-0,346, p<0,05 соответственно. Также отмечены отрицательные корреляционные связи между активностью К 8 и К 6 и индексом DAS 4 (r= от -0,300 до -0,425 для разных показателей активности А Лф, p<0,05), активностью К 6 на 180' и длительностью УС (r= -0,398, p<0,05), активностью К 8 на 180' и СБС (r= -0,286, p<0,05), активностью К 6 на 30' и 60' и выраженностью боли по ВАШ (r= -0,419 и r= -0,334 соответственно, p<0,05), количеством 2- и 1-нитевых разрывов ДНК и уровнем СРБ (r= -0,396 и r= -0,391 соответственно, p<0,05).

Таким образом, при сроке наблюдения за больными до 6 мес выявлена прямая зависимость между исходной активностью А Лф и динамикой активности РА. В последующем при более длительном наблюдении за больными в течение 1 года и более отмечается обратная зависимость между исходной активностью А Лф и динамикой активности РА. Следовательно, более высокая исходно активность А Лф может определить менее активное течение заболевания в отдаленные сроки, а подавление А Лф может являться прогностически неблагоприятным признаком.

Необходимо отметить, что также выявлены корреляционные связи между исходной активностью А Лф и уровнем Нв и эритроцитов в динамике. Так, через 6 мес корреляция между К 6 на 60' и уровнем Нв составила r=-0,240, p<0,05, через 2 года корреляция между К 8 на 180' и уровнем Нв и эритроцитов была r=-0,297, p<0,05 и r=-0,383, p<0,01 соответственно, через 2-5 лет между К 6 на 180' и уровнем эритроцитов r=-0,306, p<0,05. Вероятно, более высокая активность К и более высокая активность РА определяют наличие и выраженность анемии при сроке наблюдения за больными до 6 мес. В последующем по мере подавления активности заболевания и нормализации процессов А Лф происходит восстановление уровня Нв и эритроцитов и ликвидируется анемия.

При проведении корреляционного анализа между исходной активностью А Лф и активностью А Лф в динамике в контрольные сроки при РА выявлены отрицательные корреляционные связи между исходной активностью К 8 и активностью К 8 в динамике (r=от -0,287 до -0,626, p<0,05 или p<0,01), а также К 6 (r=от -0,265 до -0,471, p<0,05 или p<0,01), К 4 (r=от -0,265 до -0,658, p<0,05 или p<0,01) и количеством разрывов ДНК (r=от -0,323 до -0,568, p<0,05 или p<0,01) в динамике. Аналогичная зависимость выявлена между исходной активностью К 6 и активностью К 6 в динамике (r=от -0,269 до -0,595, p<0,05), а также количеством разрывов ДНК в динамике (r=от -0,365 до -0,417, p<0,05). Выявлена достоверная положительная корреляционная связь между исходной активностью К 4 и активностью К 4 в динамике (r=от 0,247 до 0,652, p<0,05 или p<0,01), при этом отмечена достоверная отрицательная корреляционная связь между исходной активностью К 4 и количеством разрывов ДНК в динамике (r=от -0,277 до -0,568, p<0,05 или p<0,01). Выявлена достоверная отрицательная корреляционная связь между исходным количеством разрывов ДНК и количеством разрывов ДНК в динамике (r=от -0,311 до -0,581, p<0,05 или p<0,01), а также между количеством разрывов ДНК исходно и активностью К6 в динамике через 2 года (r=от -0,303 до -0,471, p<0,05) и активностью К 4 в динамике через 6 мес и 1 год (r=от -0,369 до -0,587, p<0,05 или p<0,01).

Для уточнения выраженности влияния исходной активности А Лф и исходной активности РА на эффективность терапии проведен регрессионный анализ с оценкой риска отсутствия улучшения по критериям EULAR. Полученные результаты представлены в таблице 2.

Таблица 2. Факторы риска отсутствия эффекта на терапию при РА

Фактор риска

ОШ

р

DAS4 более 2,4

5,44

0,0079

С-реактивный белок более 96 мг/л

3,23

0,0077

Ревматоидный фактор более 256 МЕ/мл

2,93

0,0099

Фактор некроза опухоли-α более 17 пг/мл

1,82

0,0167

Интерлейкин-6 более 20 пг/мл

1,34

0,0067

СОД более 70 нг/мл

1,27

0,0974

Наличие системных проявлений РА

1,20

0,0346

Наличие совместно сниженной активности К 8 на 180', К 6 на 180', количества 2- и 1-нитевых разрывов ДНК менее М± в контрольной группе 

1,20

0,0467

СОЭ > 45 мм/ч

1,19

0,0332

Повышенная активность К 4 на 180' (менее М± в контрольной группе)

1,18

0,0445

Сниженное количество 1-нитевых разрывов ДНК (менее М± в контрольной группе)

1,13

0,0099

Сниженная активность К 8 на 180' (менее М± в контрольной группе)

1,07

0,0167

Сниженная активность К 6 на 180' (менее М± в контрольной группе)

1,06

0,0344

Сниженное количество 2-нитевых разрывов ДНК (менее М± в контрольной группе)

1,03

0,0267

При СКВ выявлена достоверная корреляционная связь между исходной активностью К 8 и К 6 и показателями активности СКВ в динамике. Так, коэффициент корреляции между исходной активностью К 8 на 120 и 180' и уровнем СОЭ через 1 год от  начала исследования составил -0,353 и -0,363 соответственно (p<0,05), между исходной активностью К 6 на 30' и уровнем ЦИК через 1 год – r=-0,360, p<0,05,  исходной активностью К 6 на 60' и уровнем антител к ДНК через 1 год – r=-0,340, p<0,05. Выявлена достоверная положительная корреляционная связь между исходной активностью К 8 и К 6 и количеством эритроцитов и лейкоцитов в динамике (r= от 0,308 до 0,375, p<0,05). Выявлена достоверная положительная корреляционная связь между исходной активностью К 4 и уровнем АНФ и антител к ДНК через 1 год (r=0,393 и 0,392 соответственно, p<0,05), достоверная отрицательная корреляционная связь между исходной активностью К 4 на 120 и 180' и количеством лейкоцитов через 1 год (r=-0,362 и -0,353 соответственно, p<0,05). Выявлена достоверная отрицательная корреляционная связь между исходным количеством 1-нитевых разрывов ДНК и индексом SLEDAY и уровнем антител к ДНК через 1 год (r=-0,379 и -0,358 соответственно, p<0,05), достоверная положительная корреляционная связь между исходным количеством 2-нитевых разрывов ДНК и уровнем лейкоцитов через 1 год (r=0,367, p<0,05). Выявлена достоверная положительная корреляционная связь между таким показателем активности волчаночного нефрита как суточная протеинурия через 1 год  и исходным уровнем К 4 на 120 и 180' (r=0,330, p<0,05 и r=0,460, p<0,01 соответственно) и достоверная отрицательная корреляционная связь между выраженностью суточной протеинурии через 1 год и исходным количеством 2-нитевых разрывов ДНК (r=-0,350, p<0,05), уровнем СКФ через 1 год и количеством 2-нитевых разрывов ДНК (r=-0,360, p<0,05), уровнем СКФ через 1 год и исходной активностью К 4 (r=-0,370, p<0,05).

Отмечена достоверная корреляционная связь между исходной активностью К 8 и уровнем антител к ДНК, выраженностью суточной протеинурии, СКФ через 2 года (r=-0,453, -0,390, -0,407 соответственно, p<0,05), исходной активностью К 6 и уровнем АНФ, антител к ДНК и СКФ через 2 года (r=-0,396, -0,418, -0,399 соответственно, p<0,05), исходной активностью К 4 и индексом SLEDAY, уровнем Нв, лейкоцитов, СОЭ, антител к ДНК, суточной протеинурии (r=0,353, -0,390, -0,391, -0,389, 0,573, 0,411 соответственно, p<0,05 или p<0,01) через 2 года, исходным количеством 2-нитевых разрывов ДНК и уровнем антител к ДНК и СКФ через 2 года (r=-0,462 и -0,456 соответственно, p<0,05), исходным количеством 1-нитевых разрывов ДНК и уровнем СОЭ через 2 года (r=-0,393, p<0,05).

При СКВ выявлены множественные значимые достоверные связи между исходной активностью К 8 и активностью К 8 в динамике, исходной активностью К 8 и активностью К 6 в динамике, исходной активностью К 6 и активностью К 6 в динамике, исходной активностью К 6 и активностью К 8 в динамике, исходной активностью К 4 и активностью К 4 в динамике (r= от 0,302 до 0,961, p от <0,01 до <0,001), между исходной активностью К 8 и К 6 и количеством 1- и 2-нитевых разрывов ДНК в динамике (r= от 0,317 до 0,510, p<0,05 или <0,01), между исходным количеством 1- и 2-нитевых разрывов ДНК и активностью К 8, 6 в динамике (r= от 0,316 до 0,463, p<0,05), исходным количеством разрывов ДНК и активностью К 4 в динамике (r= от -0,310 до -0,397, p<0,05), исходным количеством разрывов ДНК и количеством разрывов ДНК в динамике (r= от 0,375 до 0,697, p от <0,01 до 0,001).

В течение всего времени наблюдения за больными у 8 пациентов, не имевших люпус-нефрита в дебюте заболевания, диагностировано его развитие. При анализе частоты развития люпус-нефрита в группах больных с разной активностью А Лф на момент включения больных в исследование выявлено, что у 7 пациентов из этой группы исходно отмечалась сниженная относительно контрольной группы активность А Лф (рисунок 6). Полученные результаты еще раз подтверждают негативную роль депрессии А Лф в дебюте заболевания.

Рисунок 6. Влияние исходной активности А Лф на развитие люпус-нефрита при СКВ

Известно, что высокие концентрации Cu/ZnСОД в биологических жидкостях организма имеет диагностическую ценность для измерения активности различных болезней, в том числе нефропатии, является средством ранней диагностики нефропатии, а также контроля лечения хронического воспаления. В группах больных с развившимся люпус-нефритом и при его отсутствии как в дебюте СКВ, так и в дальнейшем (количество больных 15 человек), проанализирована исходная активность Cu/ZnСОД. Выявлено, что уровень Cu/ZnСОД на момент включения больных в исследование был достоверно выше у больных, у которых при динамическом наблюдении был диагностирован люпус-нефрит по сравнению с больными без волчаночного нефрита (102,1±9,15 vs 54,0±12,7 нг/мл, p<0,01).

Для уточнения выраженности влияния исходной активности А Лф и исходной активности СКВ на эффективность терапии проведен регрессионный анализ с оценкой риска отсутствия улучшения по динамике индекса SLEDAY. Полученные результаты представлены в таблице 3.

Таблица 3. Факторы риска отсутствия эффекта на терапию при СКВ

Фактор риска

ОШ

р

SLEDAY более 12 баллов

3,41

0,0090

Антитела к ДНК более 80 МЕ/мл

2,13

0,0082

Фактор некроза опухоли-α более 8,5 пг/мл

1,78

0,0377

Наличие волчаночного нефрита в дебюте

1,33

0,0461

Выполнение нефробиопсии через 6 мес и более от дебюта нефритического мочевого осадка

1,31

0,0099

Наличие совместно сниженной активности  К 8 на 180', К 6 на 180', количества 2- и 1-нитевых разрывов ДНК менее М± в контрольной группе 

1,28

0,0267

СОЭ > 40 мм/ч

1,27

0,0333

Наличие гематурии в дебюте

1,26

0,0167

Повышенная активность К 4 на 180' (менее М± в контрольной группе)

1,25

0,0433

Сниженное количество 2-нитевых разрывов ДНК (менее М± в контрольной группе)

1,23

0,0330

Сниженная активность К 8 на 180' (менее М± в контрольной группе)

1,17

0,0167

Сниженная активность К 6 на 180' (менее М± в контрольной группе)

1,16

0,0440

Сниженное количество 1-нитевых разрывов ДНК (менее М± в контрольной группе)

1,09

0,0167

Также проведен регрессионный анализ с оценкой риска развития волчаночного нефрита, результаты представлены в таблице 4. Повышенный риск развития волчаночного нефрита имеют больные с высокой активностью СКВ в дебюте заболевания и сниженной активностью А Лф.

Таблица 4. Факторы риска развития волчаночного нефрита при СКВ

Фактор риска

ОШ

р

SLEDAY более 12 баллов

4,56

0,0013

Антитела к ДНК более 80 МЕ/мл

4,03

0,0367

СОД более 70 нг/мл

3,25

0,0555

Фактор некроза опухоли-α более 8,5 пг/мл

2,63

0,0171

Наличие совместно сниженной активности  К 8 на 180', К 6 на 180', количества 2- и 1-нитевых разрывов ДНК менее М± в контрольной группе 

2,20

0,0067

Повышенная активность К 4 на 180' (менее М± в контрольной группе)

1,18

0,0289

Сниженное количество 2-нитевых разрывов ДНК (менее М± в контрольной группе)

1,13

0,0267

Сниженное количество 1-нитевых разрывов ДНК (менее М± в контрольной группе)

1,09

0,0344

Сниженная активность К 8 на 180' (менее М± в контрольной группе)

1,07

0,0467

Сниженная активность К 6 на 180' (менее М± в контрольной группе)

1,06

0,0444

При ХГН выявлена достоверная корреляционная связь между активностью К 8 и К 6 и критериями активности ХГН в динамике. Так, коэффициент корреляции между исходной активностью К 8 на 180' и уровнем СОЭ через 1 год от  начала исследования составил -0,495 (p<0,05), между исходной активностью К 6 на 90' и уровнем -глобулинов через 1 год – r=-0,498, p<0,05. Выявлена достоверная положительная корреляционная связь между исходной активностью К 6 на 150' и 180' и количеством эритроцитов в динамике через 1 год (r= от 0,503 до 0,544, p<0,05). Выявлена достоверная положительная корреляционная связь между исходной активностью К 4 на 180' и уровнем СОЭ через 1 год (r=0,593, p<0,05), достоверная отрицательная корреляционная связь между исходной активностью К 4 на 120' и 180' и количеством эритроцитов через 1 год (r=-0,492 и -0,473 соответственно, p<0,05). Выявлена достоверная отрицательная корреляционная связь между исходным количеством 1-нитевых разрывов ДНК и уровнем СОЭ через 1 год (r=-0,497, p<0,05), достоверная положительная корреляционная связь между исходным количеством 2-нитевых разрывов ДНК и уровнем эритроцитов через 1 год (r=0,486, p<0,05). Выявлена достоверная положительная корреляционная связь между выраженностью суточной протеинурии через 1 год  и исходным уровнем К 4 на 150' и 180' (r=0,530, p<0,05 и r=0,560, p<0,01 соответственно) и достоверная отрицательная корреляционная связь между выраженностью суточной протеинурии через 1 год и исходным количеством 2-нитевых разрывов ДНК (r=-0,532, p<0,05), уровнем СКФ через 1 год и количеством 2-нитевых разрывов ДНК (r=-0,536, p<0,05), уровнем СКФ через 1 год и исходной активностью К 4 (r=-0,472, p<0,05).

Отмечена достоверная отрицательная корреляционная связь между исходной активностью К 8 на 30' и 180' и уровнем СОЭ через 2 года (r=-0,518 и -0,517 соответственно, p<0,05), исходной активностью К 6 на 30' и уровнем -глобулинов через 2 года (r=-0,506, p<0,05), исходной активностью К 4 на 180' и количеством эритроцитов и уровнем Hb (r=-0,634, p<0,01 и -0,606, p<0,05 соответственно), исходной активностью К 4 на 180' и уровнем СКФ через 2 года (r=-0,647, p<0,01),  исходным количеством 1-нитевых разрывов ДНК и выраженностью суточной протеинурии, уровнем СКФ через 2 года (r=-0,533 и -0,539 соответственно, p<0,05). Выявлена достоверная положительная корреляционная связь между исходной активностью К 4 на 120' и уровнем -глобулинов через 2 года (r=0,497, p<0,05), исходной активностью К 4 на 180' и выраженностью суточной протеинурии через 2 года (r=0,519, p<0,05).

Выявлены множественные значимые достоверные связи между исходной активностью К 8 и активностью К 8 в динамике, исходной активностью К 8 и активностью К 6 в динамике, исходной активностью К 6 и активностью К 6 в динамике, исходной активностью К 6 и активностью К 8 в динамике, исходной активностью К 4 и активностью К 4 в динамике (r= от 0,475 до 0,760, p от <0,05 до <0,001), между исходной активностью К 8 и К 6 и количеством 1- и 2-нитевых разрывов ДНК в динамике (r= от 0,491 до 0,656, p<0,05 или <0,01), между исходным количеством 1- и 2-нитевых разрывов ДНК и активностью К 8, 6 в динамике (r= от 0,499 до 0,591, p<0,05), исходным количеством разрывов ДНК и активностью К 4 в динамике (r= от -0,485 до -0,560, p<0,05), исходным количеством разрывов ДНК и количеством разрывов ДНК в динамике через 2 года (r= 0,507 - 0,580, p <0,05). Более тесная связь выявлена между исходными показателями и показателями в динамике через 2 года по сравнению с теснотой связи между исходными показателями и показателями через 1 год от начала исследования.

Для уточнения выраженности влияния исходной активности А Лф и исходной активности ХГН на эффективность терапии проведен регрессионный анализ с оценкой риска отсутствия улучшения по динамике суточной протеинурии и уровня СКФ. Полученные результаты представлены в таблице 5.

Таблица 5. Факторы риска отсутствия эффекта на терапию при ХГН

Фактор риска

ОШ

р

СКФ < 70 мл/мин в дебюте заболевания

2,45

0,0098

Наличие гематурии в дебюте заболевания

2,33

0,0199

СОЭ > 40 мм/ч

2,01

0,0123

Наличие совместно сниженной активности  К 8 на 180', К 6 на 180', количества 2- и 1-нитевых разрывов ДНК менее М± в контрольной группе 

1,33

0,0198

Повышенная активность К 4 на 180' (менее М± в контрольной группе)

1,24

0,0345

Фактор некроза опухоли-α более 8,5 пг/мл

1,22

0,0435

Сниженное количество 2-нитевых разрывов ДНК (менее М± в контрольной группе)

1,19

0,0237

Сниженная активность К 8 на 180' (менее М± в контрольной группе)

1,16

0,0267

Сниженная активность К 6 на 180' (менее М± в контрольной группе)

1,15

0,0244

Сниженное количество 1-нитевых разрывов ДНК (менее М± в контрольной группе)

1,11

0,0099

Согласно полученным результатам, на эффективность терапии иммуновоспалительных заболеваний (РА, СКВ, ХГН) в большей степени оказывает влияние активность самого заболевания, однако снижение исходной активности А Лф также вносит свой негативный вклад в достижение эффекта от терапии, а, следовательно, и в прогноз для больных. 

В заключение хочется сказать, что современный уровень развития медицины требует индивидуального подхода к диагностике, лечению заболеваний и оценке прогноза. При иммуновоспалительных заболеваниях, таких, как РА, СКВ, ХГН, часто встречающихся в клинике внутренних болезней, эта проблема еще не решена в той мере, которая удовлетворяла бы врачей. Очевидно, что необходимо продолжить поиски новых способов решения это задачи, что позволило бы повысить эффективность лечения и улучшить прогноз при таких этих серьезных заболеваниях, попытка чего и была сделана в данной работе.

Выводы

  1. Определение активности апоптоза периферических лимфоцитов у больных иммуновоспалительными заболеваниями – ревматоидным артритом, системной красной волчанкой, хроническим гломерулонефритом - имеет важное значение для диагностики, оценки эффективности терапии и прогноза.
  2. При ревматоидном артрите, системной красной волчанке, хроническом гломерулонефрите имеет место более интенсивный апоптоз лимфоцитов периферической крови по сравнению со здоровыми донорами, при этом степень активизации коррелирует с показателями активности заболеваний.
  3. Повышенная продукция ФНО-, интерлейкина 2, интерлейкина 6, растворимого Fas-лиганда, Cu/Zn супероксиддисмутазы оказывает стимулирующее влияние на активность апоптоза периферических лимфоцитов.
  4. Активность апоптоза периферических лимфоцитов снижена у больных “ранним” ревматоидным артритом и не зависит от давности СКВ и ХГН и повышена у больных СКВ с наличием люпус-нефрита в сравнении с больными без поражения почек.
  5. Метотрексат, циклофосфамид и метилпреднизолон in vitro активируют апоптоз периферических лимфоцитов.
  6. Эффективная иммуносупрессивная терапия способна корригировать  имеющиеся изменения активности апоптоза периферических лимфоцитов.
  7. Исследование активности апоптоза периферических лимфоцитов позволяет прогнозировать эффект назначаемой базисной терапии у больных иммуновоспалительными заболеваниями.
  8. Снижение исходной активности апоптоза периферических лимфоцитов является фактором риска недостаточного ответа на терапию при иммуновоспалительных заболеваниях (РА, СКВ, ХГН), а также фактором риска развития волчаночного нефрита.

практические рекомендации

    1. Определение реализации апоптоза периферических лимфоцитов в виде количества разрывов ДНК в сочетании с исследованием активности каспаз 8,6,4 методом флуоресценции может быть использовано для оценки активности иммуновоспалительных заболеваний (ревматоидного артрита, системной красной волчанки, хронического гломерулонефрита), а также прогноза и эффективности базисной терапии в дополнение к традиционным клинико-лабораторным данным.
    2. Наличие исходно сниженной активности апоптоза периферических лимфоцитов при РА также, как и высокая степень активности заболевания, повышение уровня ФНО-, ИЛ-6, Сu/ZnСОД, являются показаниями для активизации терапии.
    3. При исходно сниженной активности апоптоза периферических лимфоцитов при РА препаратом выбора является метотрексат, но не сульфасалазин и лефлюномид.
    4. Наличие исходно сниженной активности апоптоза периферических лимфоцитов при СКВ, также, как и высокая степень активности заболевания, повышение уровня ФНО-, наличие волчаночного нефрита в дебюте, гематурии, является показанием для более активной иммуносупрессивной терапии, предпочтительна комбинация ГКС и цитостатических иммунодепрессантов.
    5. Определение уровня Сu/ZnСОД, ФНО- показано больным СКВ для уточнения риска развития волчаночного нефрита.
    6. Наличие исходно сниженной активности апоптоза периферических лимфоцитов при ХГН также, как и гематурии в дебюте, ускорения СОЭ, повышения уровня ФНО-, является показанием для более активной иммуносупрессивной терапии, предпочтительна комбинация ГКС и цитостатических иммунодепрессантов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ
ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

  1. Варга О.Ю. Игнатьев В.К., Везикова Н.Н., Марусенко И.М. Роль апоптоза лимфоцитов в патогенезе ревматоидного артрита // Материалы II Северо-Западной научно-практической конференции по ревматологии, Петрозаводск, 2002. -  С. 16-18.
  2. Хейфец Л.М., Варга О.Ю. Нарушения липидного обмена при хроническом гломерулонефрите // Сборник трудов X ежегодного Санкт-Петербургского нефрологического семинара, Санкт-Петербург, 2002. - С. 216-219.
  3. Варга О.Ю. Игнатьев В.К., Везикова Н.Н., Марусенко И.М. Апоптоз лимфоцитов при ревматоидном артрите // Научно-практическая ревматология. – 2002.-№4.- С. 80.
  4. Варга О.Ю. Игнатьев В.К., Везикова Н.Н., Марусенко И.М. Активность программированной клеточной гибели лимфоцитов при раннем ревматоидном артрите // Актуальные проблемы современной ревматологии. Сборник научных работ, Волгоград, 2002. - С. 25-26.
  5. Везикова Н.Н., Игнатьев В.К., Марусенко И.М., Варга О.Ю. Распространенность ревматоидного артрита и остеоартроза в Республике Карелия // Научно-практическая ревматология. – 2003. - №2. - С. 85-86.
  6. Варга О.Ю., Игнатьев В.К., Везикова Н.Н., Марусенко И.М., Волкова Т.О.Программированная клеточная гибель лимфоцитов при раннем ревматоидном артрите // Научно-практическая ревматология. Приложение к №2 2003 г. Тезисы Конгресса ревматологов России, Саратов, 2003. - С. 21.
  7. Хейфец Л.М., Варга О.Ю., Стратегопуло В.А., Лютая Е.А., Рачкова Л.М. Выраженность системного остеопороза у больных хроническим гломерулонефритом в додиализном периоде хронической почечной недостаточности // Актуальные вопросы нейропедиатрии. Тезисы докладов научно-практической конференции, Петрозаводск, 2003. - С. 79-80.
  8. Варга О.Ю., Игнатьев В.К., Везикова Н.Н., Марусенко И.М. Активность каспаз 4, 6, 8 лимфоцитов при ревматоидном артрите // Материалы Третьей Северо-Западной конференции по ревматологии, Псков, 2003. - С. 11-12.
  9. Варга О.Ю., Игнатьев В.К., Герасимов А.А., Везикова Н.Н., Марусенко И.М. Остеогенон в лечении системного остеопороза при ревматоидном артрите и хронической почечной недостаточности // Тезисы Российского конгресса по остеопорозу, Москва, 2003. - С. 144.
  10. Хейфец Л.М., Варга О.Ю., Игнатьев В.К. Остеопороз у больных хроническим гломерулонефритом в додиализном периоде хронической почечной недостаточности // Тезисы Российского конгресса по остеопорозу, Москва, 2003. - С. 116.
  11. Герасимов А.А., Игнатьев В.К., Варга О.Ю. Минеральная плотность костной ткани при ревматоидном артрите // Тезисы III конференции молодых ученых России с международным участием, Москва, 2004. - С. 282-283.
  12. Герасимов А.А., Игнатьев В.К., Варга О.Ю. Минеральная плотность костной ткани при ревматоидном артрите и остеоартрозе // Научно-практическая ревматология. – 2004. - №2. - С. 126.
  13. Хейфец Л.М., Варга О.Ю., Стратегопуло В.А., Лютая Е.А., Рачкова Л.М. Распространенность и выраженность нарушений фосфорно-кальциевого обмена у больных хроническим гломерулонефритом (ХГН) в додиализном периоде хронической почечной недостаточности // Сборник трудов XII ежегодного Санкт-Петербургского нефрологического семинара,  Санкт-Петербург, 2004. - С. 79.
  14. Герасимов А.А., Игнатьев В.К., Варга О.Ю., Балашов А.Т., Кондричина С.Н. Распространенность и факторы риска системного остеопороза при ревматоидном артрите и остеоартрозе // Материалы III научно-практической конференции с международным участием “Болезнь Ходжкина”, Петрозаводск, 2004. - С. 86-87.
  15. Хейфец Л.М., Варга О.Ю., Стратегопуло В.А., Лютая Е.А., Рачкова Л.М., Мадани С., Балашов А.Т., Кондричина С.Н. Рентгеновская костная денситометрия в диагностике вторичного остеопороза у больных в додиализной стадии хронической почечной недостаточности // Материалы III научно-практической конференции с международным участием “Болезнь Ходжкина”, Петрозаводск, 2004. - С. 128-130.
  16. Варга О.Ю., Игнатьев В.К., Хейфец Л.М., Волкова Т.О. Программированная клеточная гибель лимфоцитов как критерий активности и эффективности терапии при системной красной волчанке и хроническом гломерулонефрите // Материалы III научно-практической конференции с международным участием “Болезнь Ходжкина”, Петрозаводск, 2004. - С. 132-134.
  17. Варга О.Ю., Игнатьев В.К., Хейфец Л.М., Везикова Н.Н., Марусенко И.М., Волкова Т.О. Программированная клеточная гибель лимфоцитов при ревматоидном артрите, системной красной волчанке и хроническом гломерулонефрите // Материалы IV конференции по ревматологии Северо-Западного федерального округа, Великий Новгород, 2004. - С. 36-38.
  18. Хейфец Л.М., Варга О.Ю., Стратегопуло В.А., Лютая Е.А., Рачкова Л.М., Мадани С. Распространенность и выраженность снижения минеральной плотности костной ткани у больных в додиализной стадии хронической почечной недостаточности // Материалы IV конференции по ревматологии Северо-Западного федерального округа, Великий Новгород, 2004. - С. 159-161.
  19. Варга О.Ю., Игнатьев В.К., Хейфец Л.М., Волкова Т.О. Программированная клеточная гибель лимфоцитов при системной красной волчанке // Научно-практическая ревматология. -  2004. - №4. - С. 7.
  20. Игнатьев В.К., Марусенко И.М., Везикова Н.Н., Варга О.Ю. Ревматология в Карелии // Научно-практическая ревматология. - 2004. - №3. - С. 99-101.
  21. Варга О.Ю. Значение апоптоза в патогенезе и лечении заболеваний // Материалы научно-практической конференции “Петрозаводские педиатрические чтения-II: диагностика в педиатрии”, Петрозаводск, 2005. - С. 15-16.
  22. Варга О.Ю., Игнатьев В.К., Марусенко И.М., Везикова Н.Н. Влияние метилпреднизолона и циклофосфана на активность программированной клеточной гибели лимфоцитов in vitro при системной красной волчанке // Научно-практическая ревматология. – 2005. - №3. - С. 25.
  23. Герасимов А.А., Игнатьев В.К., Варга О.Ю. Остеопороз при ревматоидном артрите и остеоартрозе // Научно-практическая ревматология. - 2005. - №3. - С. 29.
  24. Герасимов А.А., Игнатьев В.К. Варга О.Ю. Остеопороз в Республике Карелия. Минеральная плотность костной ткани при ревматоидном артрите и остеоартрозе // Медицинский академический журнал. - 2005. - №2. - Приложение 6. - С. 187-190.
  25. Игнатьев В.К., Хейфец Л.М., Везикова Н.Н., Марусенко И.М., Кузнецова Т.Ю., Варга О.Ю. Ревматология в Карелии: достижения и перспективы // Медицинский академический журнал. – 2005. - №2. - Приложение 6. - С. 195-198.
  26. Варга О.Ю., Рябков В.А., Хейфец Л.М. Влияние метотрексата на активность апоптоза лимфоцитов при ревматоидном артрите // Материалы V Северо-западной конференции по ревматологии, Санкт-Петербург. - 2005. - С.30-31.
  27. Варга О.Ю., Игнатьев В.К. Апоптоз лимфоцитов при ревматоидном артрите // Медицинский академический журнал. – 2005. - №3. - Приложение 7. - С.11-16.
  28. Варга О.Ю., Рябков В.А., Хейфец Л.М. Прогностическая значимость активности апоптоза лимфоцитов при ревматоидном артрите // Медицинский академический журнал. - 2005. - №3. - Приложение 7. -  С.16-18.
  29. Хейфец Л.М., Варга О.Ю. Выраженность и темпы прогрессирования снижения минеральной плотности костной ткани у больных хронической почечной недостаточностью в преддиализной стадии // Тезисы II Российского конгресса по остеопорозу, Ярославль, 2005. - С. 170.
  30. Варга О.Ю., Везикова Н.Н., Марусенко И.М. Остеогенон в лечении переломов лучевой кости при вторичном остеопорозе // Тезисы II Российского конгресса по остеопорозу, Ярославль, 2005. - С.116.
  31. Варга О.Ю., Хейфец Л.М., Волкова Т.О., Кручек М.М. Активность апоптоза лимфоцитов при хроническом гломерулонефрите // Нефрология и диализ. - 2006. - №2. - С. 151-157.
  32. Варга О.Ю., Рябков В.А. Что такое апоптоз и что дает знание о нем // Экология человека. - 2006. - №7. - С. 28-32.
  33. Варга О.Ю., Хейфец Л.М., Стратегопуло В.А., Лютая Е.А., Рачкова Л.М. Уровень sFas-лиганда, интерлейкинов 2, 6 и фактора некроза опухолей при хроническом гломерулонефрите // Материалы III научной конференции с междануродным участием “Интервенционная радиология”, Петрозаводск, 2006. - С. 102-103.
  34. Рябков В.А., Варга О.Ю. Влияние активности ревматоидного артрита на качество жизни больных и показатели липидного спектра // Материалы III научной конференции с международным участием “Интервенционная радиология”, Петрозаводск, 2006. - С. 113-115.
  35. Варга О.Ю., Хейфец Л.М., Волкова Т.О. Прогностическая значимость активности апоптоза лимфоцитов при системной красной волчанке // Материалы VI Северо-западной  конференции по ревматологии, Петрозаводск, 2006. - С.43-45.
  36. Рябков В.А., Варга О.Ю. Взаимосвязь между активностью заболевания, активностью апоптоза периферических лимфоцитов и нарушениями липидного обмена при ревматоидном артрите // Материалы VI Северо-западной  конференции по ревматологии, Петрозаводск, 2006. - С.164-165.
  37. Варга О.Ю., Рябков В.А. Влияние основных цитокинов на активность апоптоза циркулирующих лимфоцитов при ревматоидном артрите // Материалы VI Северо-западной  конференции по ревматологии, Петрозаводск, 2006. - С.166-167.
  38. Варга О.Ю., Игнатьев В.К.,  Рябков В.А., Волкова Т.О., Кручек М.М. Активность программированной клеточной гибели лимфоцитов при ревматоидном артрите // Терапевтический архив. - 2006. - №6. - С. 14-19.
  39. Варга О.Ю. Уровень sFas-лиганда (sFas-L), фактора некроза опухолей   (ФНО ), интерлейкинов 2 (ИЛ-2) и 6 (ИЛ-6) при системной красной волчанке (СКВ) // Научно-практическая ревматология. - 2007. -  №2. - С.102
  40. Везикова Н.Н., Рябков В.А., Марусенко И.М., Варга О.Ю. Качество жизни пациентов как показатель эффективности терапии // Научно-практическая ревматология. - 2007. - №2. - С.102
  41. Варга О.Ю. Влияние метилпреднизолона и циклофосфана in vitro на активность апоптоза лимфоцитов периферической крови при системной красной волчанке // Российский биомедицинский журнал Medline.ru. - 2007. - Т 8. - С. 518-525.

Подписано в печать
Формат 60х84 1/16. Бумага офсетная.
1 уч.-изд. л. Тираж 100 экз. Изд. № 121

Государственное образовательное учреждение
высшего профессионального образования
ПЕТРОЗАВОДСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

Типография Издательства ПетрГУ
185910, г. Петрозаводск, пр. Ленина, 33






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.