WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


 

На правах рукописи

КАЛЕНИКОВА Елена Игоревна



ОЦЕНКА КАЧЕСТВА И ЭФФЕКТИВНОСТИ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ДОБАВОК С КОЭНЗИМОМ Q10


Специальности: 15.00.02 – фармацевтическая химия, фармакогнозия

  14.00.25 – фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ

Диссертации на соискание ученой степени

доктора фармацевтических наук

Москва – 2009 г.

Работа выполнена в Московском государственном университете имени М.В.Ломоносова.

Научные консультанты:

академик РАМН, доктор фармацевтических наук, профессор

Арзамасцев Александр Павлович

доктор медицинских наук, профессор Медведев Олег Стефанович


Официальные оппоненты:

доктор фармацевтических наук,

профессор  Белобородов Владимир Леонидович

доктор медицинских наук,

профессор Жердев Владимир Павлович        

доктор фармацевтических наук Чистяков Виктор Владимирович        

Ведущая организация - ОАО «Всероссийский научный центр по безопасности биологически активных веществ»

Защита состоится «__»_______ _2009 г. в 1400 ч на заседании

Диссертационного Совета Д.208.040.09 при Московской Медицинской Академии им. И.М.Сеченова (119019, Москва, Никитский бульвар, д.13).

С диссертацией можно ознакомиться в Фундаментальной библиотеке ММА им. И.М.Сеченова (117998, Москва, Нахимовский проспект, д.49).

Автореферат разослан «___»___________2009 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета Д.208.040.09

доктор фармацевтических наук

профессор Садчикова Наталья Петровна

ВВЕДЕНИЕ



Актуальность:

Согласно существующим международным требованиям, любое оригинальное и воспроизведенное лекарственное средство должно соответствовать следующим критериям: эффективность, безопасность, качество. Это в равной степени следует отнести и к БАД, требования к которым в современных условиях постоянно возрастают. Надлежащий уровень качества обеспечивается соответствующим нормативным документом, отражающим как общие подходы к контролю качества и стандартизации, так и показатели, которые определяются предполагаемым медицинским применением лекарственного средства или БАД.

Достижения молекулярной биологии и биохимии открывают новые возможности лечения заболеваний с учетом патофизиологических механизмов, протекающих на уровне клеточных и субклеточных структур. В основе ведущих метаболических процессов лежат окислительно-восстановительные реакции. Среди них особую роль играют свободнорадикальные реакции, ведущие к образованию перекисных соединений. Активация процессов свободнорадикального окисления вследствие дисбаланса в системе «прооксиданты-антиоксиданты» и последующие изменения в клетках, тканях и системах организма получили название окислительного стресса. Усиление деструктивных процессов при окислительном стрессе может являться патогенетическим фактором заболевания, даже не будучи основной причиной его развития.

Однако сегодня нет единого мнения о биологической роли окислительных реакций с участием свободных радикалов кислорода. Большинство исследователей считают активные формы кислорода важными регуляторами клеточных процессов и ключевым элементом программ дифференцировки, пролиферации и апоптоза клеток. Развитие патологических процессов связано с изменением клеточных программ, следовательно, развитие многих заболеваний определяется балансом прооксидантов и антиоксидантов. Отношение к последним в современной научной литературе варьирует от полного игнорирования и даже отрицания до ожиданий излечения от всех болезней и продления жизни [Е.Б. Меньшикова  с соавт., 2008]. В таких случаях важнейшим критерием истины должна стать практика, но пока и она не дала однозначных ответов на многие вопросы.

Среди использующихся в медицинской практике наиболее перспективным антиоксидантом является убихинон (коэнзим Q10, CoQ10) – вещество эндогенной природы, обязательный компонент мембран митохондрий, лизосом, аппарата Гольджи, плазматических мембран.

Струкурная формула коэнзима Q10 (2,3-диметокси-5-метил-6-декапренил-1,4-бензохинон).

Коэнзим Q10 в митохондриях участвует в синтезе АТФ как переносчик электронов, сопрягающий процессы электронного транспорта и окислительного фосфорилирования. В то же время, убихинон – единственный липидорастворимый антиоксидант, синтезирующийся в клетках животных и человека. Еще одно уникальное свойство CoQ10 – постоянная регенерация его окисленной формы с помощью ферментных систем организма и антиоксидантов неферментной природы - аскорбата, -токоферола (-TOC), возвращающая ему антиоксидантную активность (схема 1).

Схема 1. Взаимопревращения окисленной и восстановленной форм убихинона.

По результатам многих клинических исследований CoQ10 рекомендован в качестве дополнительной терапии при хронической сердечной недостаточности, кардиомиопатии, стенокардии, гипертонии, инфаркте миокарда, атеросклерозе; имеются данные о его эффективности при мигрени, болезни Паркинсона, латеральном амиотрофическом склерозе, астме, диабете, почечной недостаточности. Наибольшее число клинических исследований CoQ10 посвящено сердечной недостаточности, однако окончательный вывод о его эффективности при этом заболевании еще не сделан. Актуально проведение дальнейших исследований, направленных, с одной стороны, на выявление препаратов, обладающих максимальной биодоступностью и способных пополнить эндогенные уровни в крови и сердечной мышце, а с другой – на более глубокое понимание патогенетических механизмов (на уровне ткани и клетки) как потенциальных объектов фармакологического воздействия CoQ10.

На мировом фармацевтическом рынке CoQ10 повсеместно доступен в виде биологически активных добавок к пище и лишь в нескольких странах – как активное вещество в составе лекарственных препаратов. Российский современный фармацевтический рынок изобилует предложениями CoQ10-содержащих БАД зарубежного и отечественного производства. Широкая и навязчивая реклама БАД к пище, проводимая средствами массовой информации, приводит к росту их неконтролируемого потребления. Эта ситуация обязывает повышать уровень требований к безопасности и качеству биологически активных добавок, которые на сегодняшний день регламентируются техническими условиями в соответствии с требованиям «Руководства по методам контроля качества и безопасности биологически активных добавок к пище» (Руководство Р 4.1.1672-03). На основании требований Руководства количественный анализ CoQ10 в БАД осуществляется методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с детектированием по поглощению в ультрафиолетовой области спектра. Недостаточная чувствительность определения и условия пробоподготовки ограничивают применение этой методики образцами с высоким содержанием CoQ10, то есть лекарственными препаратами и БАД.

Безопасность БАД на основе CoQ10 контролируется по критериям, предъявляемым к продуктам питания: содержанию токсичных элементов (тяжелых металлов), пестицидов и радионуклидов. Между тем, содержащиеся в БАД активные компоненты могут вызывать терапевтические эффекты и иметь побочные; вещества эндогенной природы при длительном приеме могут оказывать влияние на уровень их синтеза в тканях организма, приводя к формированию небезопасного эффекта отмены. Кроме того, Руководство не предусматривает стандартизации БАД и не требует подтверждения их фармакологической эффективности, что имеет первостепенное значение в случае медицинского применения.

Целью данного исследования явилась комплексная оценка качества  и эффективности БАД с CoQ10 для обоснования их применения в качестве кардиопротекторов.

Достижение поставленной цели осуществлялось последовательным решением следующих задач:

  1. Разработать ВЭЖХ-методики определения CoQ10 в БАД  на основе CoQ10 для оценки их качества и стандартизации.
  2. Разработать ВЭЖХ-методики определения коэнзимов Q9, Q10 и -TOC в тканях крыс (плазме/сыворотке крови, миокарде, головном мозге) для изучения фармакокинетики БАД на основе CoQ10 при однократном и хроническом введении, а также тканевого содержания коэнзимов Q и -TOC при патологии миокарда.
  3. Провести сравнительное изучение фармакокинетики CoQ10 у крыс после однократного введения внутрь порошка субстанции и различных БАД серии «Кудесан» (раствора и таблеток).
  4. Изучить влияние хронического введения БАД «Кудесан» и его отмены на содержание коэнзимов Q и -TOC в плазме крови и миокарде крыс.
  5. Разработать методику определения уровня гидроксильных радикалов в ткани миокарда in vivo с помощью ВЭЖХ с электрохимическим детектированием и микродиализа миокарда для оценки интенсивности окислительных процессов.
  6. Определить уровень гидроксильных радикалов в ткани миокарда при патологических состояниях:

- в гипертрофированном миокарде крыс с наследственной артериальной гипертензией (линия SHRSP);

- в миокарде крыс (Wistar) при острой региональной ишемии и последующей реперфузии

для патогенетического обоснования антиоксидантной терапии.

  1. Оценить уровни коэнзимов Q и -TOC в плазме и гипертрофированном миокарде:

- крыс различных возрастов с наследственной артериальной гипертензией;

- в постинфарктном ремоделированном миокарде нормотензивных крыс

для патогенетического обоснования применения CoQ10 в качестве кардиопротектора.

  1. Оценить кардиопротекторные эффекты БАД «Кудесан» при хроническом введении крысам с наследственной артериальной гипертензией линии SHRSP и крыс Wistar с инфарктом миокарда.

Научная новизна

Разработаны методики определения CoQ10 в БАД: растворе солюбилизированной субстанции CoQ10, таблетках микрокапсулированного CoQ10, плазме крови, тканях мозга и миокарда с применением ВЭЖХ с электрохимическим детектированием, позволяющие одновременно проводить определение CoQ9 и -TOC.

Изучена фармакокинетика CoQ10 в порошке, растворе солюбилизированной субстанции и таблетках микрокапсулированной субстанции. Доказаны фармакокинетические преимущества модифицированных субстанций CoQ10. Для раствора солюбилизированного CoQ10 выявлена способность при хроническом введении внутрь повышать уровни в миокарде.

Обнаружен эффект отмены CoQ10: падение концентраций в миокарде через 2 недели после прекращения длительного введения внутрь.

Впервые проведена сравнительная оценка содержания коэнзимов Q9, Q10 и -TOC в плазме крови, гипертрофированном миокарде и головном мозге крыс с наследственной артериальной гипертензией различного возраста относительно тканей нормотензивных животных. Выявлена взаимосвязь плазменных и миокардиальных уровней CoQ10 со степенью гипертрофии левого желудочка.

Впервые выявлено снижение содержания коэнзимов Q9, Q10 и -TOC в гипертрофированном постинфарктном миокарде после хронической окклюзии коронарной артерии. Обнаружена сильная корреляционная зависимость между размером инфаркта и концентрациями коэнзимов Q в плазме крови.

Разработана ВЭЖХ-методика определения гидроксильных радикалов в ткани миокарда in vivo, обладающая наибольшей чувствительностью из приведенных в литературе аналогов. На примере спонтанно гипертензивных крыс SHRSP впервые выявлены повышенные уровни гидроксильного радикала как одна из причин сниженной устойчивости гипертрофированного миокарда к ишемии и установлена их прямая взаимосвязь со степенью гипертрофии сердечной мышцы. Доказано усиление генерации гидроксильных радикалов во время эпизодов реперфузии ишемического прекондиционирования миокарда. Показано, что ишемическое прекондиционирование сокращает продолжительность реперфузионного выброса гидроксильных радикалов в миокарде крысы после региональной ишемии, что может являться одной из причин многократного сокращения размера зоны повреждения.

Показан кардиопротекторный эффект CoQ10 при длительном введении внутрь на различных экспериментальных моделях гипертрофии миокарда: при развитии первичной артериальной гипертензии у спонтанно гипертензивных крыс и у животных с хроническим инфарктом миокарда. Обнаружено, что выраженность эффекта взаимосвязана с концентрациями CoQ10 в плазме крови и миокарде.

Теоретическая и практическая значимость

  • Методики определения CoQ10 на основе ВЭЖХ могут использоваться для его количественного определения в различных композициях, применяемых в качестве БАД и лекарственных препаратов. Высокая чувствительность разработанной методики определения CoQ10 в биологических объектах позволяет применять ее для изучения фармакокинетики при проведении доклинических и клинических испытаний.
  • Методика определения уровня гидроксильных радикалов в ткани in vivo на основе микродиализа миокарда и ВЭЖХ предоставляет возможность экспериментальной прижизненной оценки окислительного статуса тканей. Возможность мониторинга тканевых уровней гидроксильного радикала позволяет в фармакологическом эксперименте оценивать on-line эффективность мер, направленных на ограничение генерации активных форм кислорода. 
  • Доказана патогенетическая значимость усиленной генерации активных форм кислорода и сниженных миокардиальных уровней CoQ10 при острых и хронических патологических состояниях миокарда. Выявленный дисбаланс между прооксидантными и антиоксидантными факторами существенно дополняет представление о патогенетической роли окислительного стресса при сердечно-сосудистых заболеваниях.
  • Доказана кардиопротекторная эффективность CoQ10 в составе БАД «Кудесан» раствор на различных моделях гипертрофии миокарда. Полученные результаты являются теоретическим основанием для проведения полного доклинического изучения CoQ10 и решения вопроса о создании лекарственных средств на его основе.
  • Впервые выявленный для CoQ10 эффект отмены требует пересмотра отношения к нему как абсолютно безопасному фармакологическому агенту. Возможность резкого снижения содержания CoQ10 в миокарде ниже нормальных значений после прекращения его приема обязывает с крайней осторожностью применять высокие дозы CoQ10 и диктует необходимость разработки фармакокинетически обоснованных безопасных режимов дозирования.

Материалы диссертации доложены и обсуждены на 13 всероссийских (18 докладов) и 13 международных (23 доклада) съездах, конференциях, симпозиумах, конгрессах.

Публикации:

По теме диссертации опубликовано 56 печатных работ, из них 15 статей, в  том числе 13 – в ведущих рецензируемых отечественных журналах.

Объем и структура работы:

Диссертация состоит из семи частей: введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей 4 главы, заключения, выводов, списка цитируемой литературы и трех приложений. Диссертация изложена на 196 страницах, содержит 66 рисунков и 25 таблиц. Список литературы представлен 205 наименованиями, из которых 192 – зарубежных.

Основные положения, выносимые на защиту:

  • Обоснование применения CoQ10 для кардиопротекции по результатам изучения прооксидантных и антиоксидантных характеристик гипертрофированного миокарда.
  • Оценка качества БАД по содержанию CoQ10 методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с электрохимическим детектированием.
  • Результаты изучения фармакокинетики CoQ10 в составе различных БАД серии «Кудесан»: «Кудесан» раствор, таблетках «Кудесан форте», жевательных таблетках «Кудесан для детей» для разработки эффективных и безопасных режимов дозирования.
  • Оценка эффективности БАД «Кудесан» как кардиопротектора при гипертрофии миокарда различного генеза.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснована актуальность темы, сформулированы цель, задачи и основные положения диссертационной работы.

Данная работа посвящена комплексной оценке качества и эффективности БАД отечественного производства на основе высокотехнологичных субстанций коэнзима Q10: солюбилизированной и микрокапсулированной. В диссертации представлены результаты исследований фармацевтических, фармакокинетических, патофизиологических и фармакологических факторов, обосновывающие и доказывающие способность коэнзима Q10 как терапевтического агента оказывать защитное действие на сердечную мышцу. Основным аналитическим инструментом для изучения объектов исследования (субстанции и БАД на основе коэнзима Q10, образцов плазмы, сыворотки крови, тканей миокарда и мозга, микродиализатов миокарда крыс) послужила ВЭЖХ в сочетании с электрохимическим детектированием. В исследовании использованы современные экспериментальные методы и подходы: микродиализ миокарда in vivo в сочетании с on-line анализом образцов диализата, модели острого и хронического инфаркта миокарда, наследственной артериальной гипертензии (крысы линии SHR и SHRSP), региональной ишемии-реперфузии и ишемического прекондиционирования миокарда, морфологические исследования с применением световой и электронной микроскопии.

Обзор литературы включает сведения об истории открытия и изучения коэнзима Q10, современные представления о путях его биосинтеза и биохимических функциях, описание физико-химических свойств убихинонов. Подробно изложены существующие методы количественного определения коэнзимов Q (электрохимические, спектрофотометрические, хроматографические в сочетании с  различными принципами детектирования) и способы пробоподготовки объектов со сложной матрицей. Приводятся данные о результатах применения коэнзима Q10 в лечении сердечно-сосудистых заболеваний. Особое внимание уделено анализу литературы по фармакокинетике коэнзима Q10: механизмам его абсорбции и транспорта, содержанию в тканях эндогенного и распределению экзогенного липида, фармакокинетическим параметрам.

Первая глава экспериментальной части посвящена разработке методик количественного определения коэнзима Q10 и -TOC в БАД и образцах тканей: плазме крови, миокарде, головном мозге. Объектами исследования были БАД «Кудесан» раствор, таблетки «Кудесан форте» и «Кудесан для детей» (ЗАО «Аквион»). Методика включает следующие этапы: 1) подготовку образца (разведение, измельчение, гомогенизацию); 2) экстракцию; 3) упаривание экстракта и перерастворение; 4) восстановление убихинона до убихинола; 5) хроматографическое ВЭЖХ-разделение и 6) количественный анализ электрохимическим методом.

Для экстракции коэнзима Q10 и -TOC из анализируемых объектов была выбрана смесь 96% этанол:гексан (2:5). После экстракции и упаривания гексановой фракции сухой остаток перерастворяли в этаноле и восстанавливали окисленный коэнзим Q10 добавлением раствора NaBH4 в этаноле. Хроматографический анализ проводился в обращено-фазовом режиме на колонке 150х4,6 мм с сорбентом С18, 5м. Детектирование осуществляли по потенциалу окисления восстановленной формы коэнзима Q10 на электрохимическом детекторе «Coulochem II» с аналитической ячейкой  модели 5011 (США) при напряжениях на первой и второй паре электродов –50 и +350 мВ соответственно (рис. 1).

Определение проводили методом внешнего стандарта по калибровочным функциям, построенным для стандартных разведений CoQ10 в этаноле. Предел обнаружения CoQ10 – 0,1 нг. БАД «Кудесан» раствор и таблетки содержали в качестве второго действующего вещества -токоферола ацетат, определение которого в БАД не проводилось из-за отсутствия у него электрохимической активности.

Рис.1. Хроматограммы стандартного раствора коэнзима Q10 до (1) и после внесения NaBH4 (2, 3).

Разработанная методика позволила провести количественное определение содержания CoQ10 в БАД серии «Кудесан». Результаты определения представлены в табл. 1. Как следует из данных табл. 1, содержание CoQ10  во всех трех формах БАД соответствовало заявленной дозировке, находясь в пределах допустимых ТУ отклонений.        

Таблица 1

Результаты определения CoQ10 в БАД серии «Кудесан»

Объект исследования

Содержание

по сертификату

Пределы отклонений по ТУ

Найдено,

мг/мл, табл

Сред.±ст.откл

Найдено,

% от дозировки

Сред.±ст.откл.

«Кудесан» раствор

27,9 мг/мл

(сер. 521207)

27-33 мг/мл

27,5±0,50

92±2

(n=6)

«Кудесан форте»

таблетки

29,0 мг/табл

(сер. 030907)

25,5-34,5 мг

28,8±1,1

96±3,7

(n=10)

«Кудесан для детей»

таблетки

8,1 мг/табл

(сер. 120907)

6,37-8,63 мг

7,9±0,5

105±7

(n=10)

Условия хроматографирования обеспечивали полное разделение CoQ10, CoQ9 и -TOC, необходимое при анализе образцов тканей человека и животных, содержащих гомологи убихинона (рис.2-4). Применительно к образцам биоматериала разработанная методика обеспечивала высокую чувствительность (предел обнаружения CoQ10, CoQ9 – 0,1 нг, -TOC – 0,01 нг) и правильность определения (96-99%).





Рис. 2. Хроматограммы экстракта плазмы крови крысы до (1) и после (2) внесения NaBH4; чувствительность детектора – 500 нА (1, 2). Повторное внесение образца: чувствительность 100 нА (3).

Рис. 3. Хроматограммы экстракта миокарда крысы до (1) и после внесения NaBH4: неполное восстановление (2); полное восстановление CoQ9 и CoQ10 (3,4) .

Рис. 4. Хроматограммы экстракта головного мозга крысы до (1) и после внесения NaBH4 (2); после повторного внесения для контроля полноты восстановления  CoQ9 и CoQ10 (3).

Во второй главе представлены результаты изучения фармакокинетики CoQ10 при однократном и повторяющемся длительном введении внутрь различных БАД серии «Кудесан». CoQ10 является липофильным соединением с малой растворимостью, поэтому содержащие его фармацевтические продукты характеризуются низкой биодоступностью. На степень всасывания вещества наибольшее влияние оказывают физико-химические свойства его субстанции (физическое состояние, степень дисперсности и т.д.) и состав препарата. На сегодня опубликованы лишь единичные исследования, посвященные изучению фармакокинетики субстанции и препаратов  (или БАД)  на основе CoQ10.

Сравнительная оценка фармакокинетики и биодоступности CoQ10 после однократного введения внутрь проводилась для порошка, солюбилизированной субстанции в составе БАД «Кудесан» раствор, микрокапсулированной субстанции CoQ10 в составе  таблеток «Кудесан форте» и «Кудесан для детей». Исследование выполнено на бодрствующих взрослых самцах крыс Wistar с имплантированными катетерами в бедренной артерии для отбора проб крови. Порошок и измельченные таблетки вводили в желудок через зонд в виде взвеси в 0,2% геле метилцеллюлозы (в/о) в пропорции 1мг CoQ10/100мкл; «Кудесан» раствор разводили дистиллированной водой до той же концентрации. Пробы крови отбирали в течение 2-х суток после введения. Чувствительность методики определения – 10 нг CoQ10  в мл плазмы (рис. 5).

Прирост содержания CoQ10 в плазме крови крыс после введения порошка субстанции и трех БАД приведен на рис. 6.

Рис. 5. Хроматограмма экстрактов плазмы крови крысы до (А) и через 2 часа после (В) введения внутрь CoQ10 (10 мг/кг).

Рис. 6. Кинетические кривые зависимости концентрация-время при введении CoQ10 внутрь в составе БАД серии «Кудесан» (10 мг CoQ10/кг). Приведены усредненные концентрации по 7 животным.

Определены и рассчитаны модельно независимым методом основные фармакокинетические параметры, приведенные в табл. 2: С max -  максимальная концентрация CoQ10 в плазме, T max  - время ее достижения, AUC0-48 – площадь под кривой «концентрация-время», Cmax/AUC0-48 – относительная скорость всасывания. Для раствора и таблеток солюбилизированного CoQ10 относительно порошка субстанции рассчитывали: f - относительную биодоступность, определяемую отношением AUCo-t,T/AUCo-t,R, и f′ - относительную степень всасывания, определяемую отношением Cmax,T/Cmax,R.

Таблица 2

Фармакокинетические параметры CoQ10 (среднее значение±станд. отклонение)

Порошок CoQ10

«Кудесан» раствор

Таблетки

«Кудесан форте»

Таблетки

«Кудесан для детей»

AUC0-48 (мкг*час/мл)

2,6±0,3

6,9±0,8

19,4±4,1#*

8,5±2,3#&

С max  (нг/мл)

199±27

654±48#

615±99#

363±54#*&

T max  (час)

4,3±0,5

3,3±0,3

14,6±3,4#*

9,3±2,6

Cmax/AUC0-48

(час-1)

0,081±0,014

0,103±0,014

0,035±0,004#*

0,051±0,008*

(%)

364

734

325

f (%)

329

309

182

# - значимые отличия от порошка субстанции;

* - значимые отличия от «Кудесан» раствор;

& - значимые отличия от таблеток «Кудесан форте».

Данные табл. 2 и рис. 6 наглядно демонстрируют фармакокинетические преимущества модифицированных субстанций CoQ10 в составе БАД: многократно более высокие значения Cmax, AUC0-48, f’, и f. Наибольшие значения AUC0-48 и, соответственно, относительной биодоступности CoQ10 в составе БАД «Кудесан форте» могут быть следствием пролонгированного всасывания за счет микрокристаллической целлюлозы в составе таблеток. Солюбилизированная форма CoQ10 обеспечивает наиболее высокие значения максимальной концентрации при наименьшем времени их достижения и наибольшую относительную степень всасывания при максимальной относительной скорости всасывания. 

Кинетические кривые коэнзима Q10 (после введения порошка жирорастворимой субстанции, раствора солюбилизированной субстанции или измельченных таблеток) у нескольких животных имели дополнительные пики концентраций, наблюдавшиеся в интервале от 7 до 24 часов после введения вещества (рис. 7). Известно, что жирорастворимый коэнзим Q10 после всасывания в кишечнике захватывается из циркуляции гепатоцитами. Дополнительные пики концентраций коэнзима Q10 являются отражением феномена энтерогепатической циркуляции и/или повторного выброса из печени в кровоток. Ломаный характер кинетических кривых после первого пика концентрации исключил возможность корректного расчета константы элиминации.

Рис. 7. Индивидуальные кинетические кривые коэнзима Q10 с дополнительным максимумом концентраций.

Данные литературы свидетельствуют о том, что превентивный однократный прием CoQ10 не оказывает выраженного защитного действия на миокард, подвергшийся острой ишемии и/или окислительному стрессу. Причина, по-видимому, кроется в том, что кратковременного повышения концентраций коэнзима Q10 в крови недостаточно: необходимо пополнение его содержания в тканях миокарда. Для оценки такой возможности нами была изучена динамика концентраций CoQ10 и CoQ9 в сыворотке крови и миокарде крыс при хроническом энтеральном введении CoQ10 и после его прекращения. Фармакокинетические преимущества CoQ10 в составе БАД «Кудесан» раствор, наименьшая вариабельность концентраций и удобство воспроизводимого точного дозирования при введении внутрь определили выбор этой формы для проведения исследования.

БАД «Кудесан» раствор в дозе CoQ10 10 мг/кг или равный объем растворителя вводили животным ежедневно внутрь, утром, натощак в течение 6 недель. Образцы сыворотки и миокард левого желудочка получали спустя 3-4 часа после очередного введения, т. е. в интервал времени, соответствующий максимальным концентрациям CoQ10 в крови. Концентрации CoQ10 и CoQ9 в сыворотке крови и миокарде на фоне введения БАД и после его отмены приведены в табл. 3 и на рис. 8-9. Согласно представленным данным, через 3 и 6 нед введения БАД «Кудесан» концентрации CoQ10 в сыворотке в 8 и 15 раз превышали значения в контрольных группах. После отмены препарата через 2 нед уровни в сыворотке оставались в три раза выше, чем в контрольной группе, и уравнялись спустя еще 4 нед. Через две недели после прекращения введения содержание CoQ10 в сыворотке оставалось в три раза выше, чем в контрольной группе, и только через 6нед. после отмены введения разница между контрольными и опытными группами исчезала (табл. 3).

Таблица 3

Содержание CoQ10 и CoQ9 в сыворотке крови крыс через 3 и 6 нед  введения внутрь БАД «Кудесан» раствор и спустя 2 и 6 нед после его отмены (среднее значение±станд. отклонение)

Группы крыс, количество в группе

3 нед  введения

6 нед введения

2 нед после отмены

6 нед после

отмены

CoQ10

нг/мл

контрольные (22)

119±21

(5)

68±37

(5)

62±19

(6)

53±24

(6)

получавшие «Кудесан» (30)

943±480*

(6)

1084±649*

(8)

170±101*

(8)

86±20

(8)

CoQ9

нг/мл

контрольные (22)

858±131

(5)

380±184

(5)

449±92

(6)

359±214

(6)

получавшие «Кудесан» (30)

547 ±267

(6)

547 ±181

(8)

545 ±111

(8)

465 ±155

(8)

* - значимые различия с параллельной контрольной группой, p<0,05.

Уровни CoQ9 в сыворотке крови на фоне введения БАД и после его прекращения незначительно превышали контрольные значения. Характерно, что при этом они были постоянны, как бы «нормализованы» и лишь немного снизились через 6 недель после отмены. Причиной подобной стабильности может являться депо препарата в печени, образующееся при регулярном введении достаточно высокой дозы CoQ10. Известно, что после абсорбции в желудочно-кишечном тракте CoQ10 захватывается тканями печени и затем высвобождается в плазму крови для последующего включения в липопротеиды различной плотности. Возможно, что в печени происходит конверсия поступившего CoQ10 в CoQ9 и накопление последнего. Постепенное же высвобождение накопившегося CoQ9 может поддерживать в сыворотке его постоянный уровень, не зависящий от динамики концентраций CoQ10.

В миокарде крыс спустя 3 и 6 недель приема препарата содержание CoQ10 возросло примерно на 40-60% относительно соответствующих контрольных животных. Отмена препарата привела через 2 недели к резкому снижению миокардиальных уровней CoQ10 (более чем в 3 раза), составлявших уже лишь 38% относительно контрольной группы. Через 6 недель после прекращения введения содержание CoQ10 в миокарде крыс, получавших препарат, восстановилось до уровня равновозрастной контрольной группы (рис. 8).

Рис. 8. Изменение содержания коэнзима Q10 в миокарде крыс в течение 6-ти недель введения коэнзима Q10 и 6-ти недель после его отмены. По оси ординат – разница  с контрольной группой, принятой за 100%.

* - значимость различий с равновозрастной контрольной группой.

Рис. 9. Изменения содержания коэнзима Q9 в миокарде левого желудочка крыс в течение 6-ти недель введения коэнзима Q10 и 6-ти недель после его отмены. По оси ординат – разница с контрольной группой, принятой за 100%.

* - значимость различий с равновозрастной контрольной группой.

Падение содержания CoQ10 в миокарде (ниже значений контрольной группы) после прекращения введения свидетельствует о наличии эффекта отмены для данной дозы. Регулярное поступление CoQ10 извне, приводящее к повышению концентрации CoQ10 в крови и миокарде, по-видимому, подавляло его биосинтез, на восстановление нормального уровня которого после отмены препарата потребовалось около 6 недель.

Миокардиальные уровни CoQ9 через 3 и 6 недель введения БАД оказались выше, чем в соответствующих контрольных группах. Через 2 недели после прекращения введения содержание CoQ9 в миокарде упало до значений ниже чем в контрольной группе; спустя еще 4 недели содержание CoQ9 практически нормализовалось (рис. 9).

У крыс объединенной контрольной группы обнаружена отрицательная корреляционная взаимосвязь между содержанием каждого из коэнзимов Q в сыворотке крови и в миокарде (рис. 10), свидетельствующая об отсутствии в норме поступления коэнзимов Q из крови в ткани сердца.

Рис. 10. Соотношение концентраций коэнзимов Q в сыворотке крови с концентрациями в миокарде крыс объединенной контрольной группы

Длительное введение экзогенного CoQ10 в составе БАД «Кудесан» приводило к  подъему его концентрации в крови и инверсии коэффициента корреляции: формировалась усиливающаяся от 3-й к 6-й неделе положительная взаимосвязь между сывороточными и миокардиальными уровнями CoQ10, отражающая его концентрационно-зависимое поступление из крови в миокард. После прекращения введения коэффициенты корреляции резко снижались, возвращаясь в сторону отрицательных значений (табл.  3).

Прирост уровней CoQ9 в сердечной мышце в результате введения CoQ10, по-видимому, являлся результатом метаболической трансформации последнего, а не поступления CoQ9 из крови, так как изменение содержания CoQ9 в миокарде происходило однонаправлено с CoQ10 при неизмененных концентрациях CoQ9 в сыворотке.

Таблица 3

Взаимосвязь содержания CoQ10 и CoQ9 между сывороткой крови и миокардом крыс

Группы крыс (количество в группе)

Коэффициент корреляции

CoQ10 в сыворотке vs

CoQ10 в миокарде

CoQ9 в сыворотке vs

CoQ9 в миокарде

Объединенная контрольная (22)

-0,502

-0,466

3 недели введения CoQ10 (6)

0,573

0,754

6 недель введения CoQ10 (8)

0,615

0,552

2 недели после отмены (8)

0,135

0,264

6 недель после отмены (8)

0,005

-0,145

Таким образом, при ежедневном введении CoQ10 внутрь в дозе 10 мг/кг в составе БАД «Кудесан» Сmax в сыворотке крови многократно превышает фоновые концентрации CoQ10; достоверно возрастает и его содержание в миокарде. Поступление экзогенного убихинона, вероятно, приводит к подавлению его биосинтеза, что объясняет факт резкого падения содержания CoQ10 и CoQ9 в миокарде через 2 недели после прекращения введения БАД. Нормализация тканевого уровня CoQ10 и CoQ9 происходила не ранее, чем через 6 недель после прекращения введения.

Третья глава экспериментальной части предоставляет доказательства патогенетической роли усиленной генерации активных форм кислорода (АФК) в ишемическом-реперфузионном повреждении миокарда и процессах ремоделирования сердечной мышцы как основание для исследования  антиоксидантов на наличие кардиопротекторной эффективности.

Самый короткоживущий и наиболее агрессивный из всех кислород-содержащих радикалов – гидроксильный радикал (ОН•). Он способен реагировать с биомолекулами большинства классов соединений с константой скорости 109-1010 М/сек и не имеет специфичного эндогенного антиоксиданта. Именно избыток ОН• инициирует перекисное окисление липидов, каскадный характер которого приводит к развитию патологических процессов на уровне клетки и ткани.

Для определения in vivo тканевого уровня OH• была разработана методика, сочетающая микродиализ миокарда раствором Рингера с салициловой кислотой, и ВЭЖХ-анализ содержания в диализате 2,3-дигидроксибензойной кислоты (2,3-ДГБК) – специфического продукта гидроксилирования салицилата:

  2,5-ДГБК 40%  2,3-ДГБК 49% пирокатехин 11%

Схема 2. Продукты биотрансформации салициловой кислоты.

Микродиализ проводили с помощью линейного диализного волокна, прошитого в стенку миокарда левого желудочка наркотизированных животных с открытой грудной клеткой (рис. 11). После имплантации диализатор перфузировали раствором Рингера не менее 1 ч, а затем раствором Рингера с салициловой кислотой до установления стабильного уровня 2,3-ДГБК. Пробы диализата собирали непрерывно 5- или 10-минутными порциями и анализировали on-line ввиду нестабильности салицилата и возможности завышения уровней 2,3-ДГБК.

Рис. 11. Расположение лигатуры (1) на ветви

левой нисходящей коронарной артерии и

диализатора (2), прошитого в миокард

левого желудочка крысы.

Хроматографический анализ проводили в обращеннофазовом изократическом режиме элюентом, содержащим К-дигидрофосфатный буферный раствор (рН 2,5), лимонную кислоту, Na2ЭДТА, октилсульфонат натрия и 11% (об/об) метанола. Электрохимическое детектирование осуществляли при потенциалах -40 мВ на первом и +350 мВ на  втором, измерительном электроде. Предел обнаружения для 2,3-ДГБК - 2 пг.

Рис.12. Хроматограмма диализата миокарда до ишемии (А) и при реперфузии (В). 1- 2,5-ДГБК; 2 – 2,3-ДГБК; 3 – салициловая кислота. Колонка HR-80 С18, 80 х 4,6 мм, 3 м (ESA, США).

Мониторинг фонового уровня ОН• в гипертрофированном миокарде спонтанно-гипертензивных крыс SHRSP показал, что интенсивность генерации ОН• увеличена относительно нормотензивных крыс Wistar, WKY (рис. 13) и прямо взаимосвязана со степенью гипертрофии левого желудочка (рис. 14). 

 

Рис. 13. Средние и индивидуальные

значения уровня 2,3-ДГБК в диализате

миокарда крыс линий WKY, Wistar и SHRSP 

(% к содержанию в перфузионном растворе).

Рис. 14. Взаимосвязь cредниx

индивидуальных значений

уровня 2,3-ДГБК в диализате

миокарда со степенью

гипертрофии ЛЖ SHRSP.

Динамику уровня ОН• при ишемии-реперфузии изучали у крыс SHRSP и Wistar. Региональная ишемия миокарда создавалась 30-минутной перевязкой нисходящей ветви левой коронарной артерии (рис. 11); 60-минутная реперфузия стартовала после снятия лигатуры (рис. 15).

Рис. 15. Уровни 2,3-ДГБК

в диализате миокарда крыс

линий SHRSP (1) и Wistar (2)

(% к содержанию в

перфузионном растворе).

Значимые различия:

&- с фоновым уровнем

в группе,

*- между группами SHRSP

и Wistar.

Показано, что суммарный ишемический и реперфузионный выброс ОН• в миокарде SHRSP положительно коррелировал с фоновым уровнем генерации и был в 1,6 раза больше, чем у крыс Wistar (рис. 16,17). Величина зоны некроза в гипертрофированном миокарде SHRSP оказалась на 40% больше, чем у Wistar, при равных размерах зоны риска (рис. 18).

Рис. 16. Количество 2,3-ДГБК

в диализате миокарда крыс

линий Wistar (1) и SHRSP (2)

до, во время ишемии и при

реперфузии.

Значимость различий

между группами:

*p = 0,02; ** p ≤ 0,0002.

Рис.17. Взаимосвязь cредниx

фоновых уровней ОН• в

диализате SHRSP с суммарным

выбросом ОН• при реперфузии

(r = 0,752, p < 0,05).

Рис. 18. Величина зоны риска

(отношение зоны ишемии ко всему

миокарду ЛЖ, %) и зоны некроза

(отношение зоны некроза к зоне

ишемии, %) в миокарде крыс линий

Wistar (1) и  SHRSP (2).

Значимость различия

между группами: *  p < 0,005.

Полученные результаты доказали меньшую устойчивость гипертрофированного миокарда SHRSP к острому окислительному стрессу. Факторами большего некротического повреждения могут являться, с одной стороны, выявленный усиленный выброс АФК, а с другой - дефицит в системе 2-й линии антиоксидантной защиты гипертрофированной ткани.

 

Известно, что ишемическое прекондиционирование миокарда (ИП) способно ограничить повреждение сердечной мышцы, вызванное последующими ишемией и реперфузией. Предварительное введение антиоксидантов предотвращает развитие эффекта ИП и АФК рассматриваются как  возможный эндогенный фактор развития резистентности. На очередном этапе исследований оценивали влияние ИП миокарда на тканевые уровни ОН• на протяжении ИП, региональной ишемии и реперфузии.

Рис. 19. Уровни 2,3-ДГБК (M±SE) в диализатах миокарда крыс двух групп. - животные с 30-мин ишемией (n=6); – животные с ИП  перед 30-минутной ишемией (n=5). 

# - p<0,05 по сравнению с фоновым уровнем в группе с 30-минутной шемией;

* - p<0,05 по сравнению  с фоновым уровнем в группе ИП;

&- p<0,05 между руппами.

Мониторинг уровня 2,3-ДГБК выявил всплески генерации ОН• на кратких эпизодах реперфузии ИП (рис.19), подтверждающие гипотезу о роли АФК как эндогенного фактора развития резистентности миокарда к ишемическому воздействию. Действительно, оказалось, что ИП предотвращает ишемический и приводит к сокращению продолжительности реперфузионного выброса ОН•, что сопровождалась 5-кратным уменьшением размера зоны некроза (табл. 4).

Результаты проведенного в очаге ишемии-реперфузии мониторинга уровня ОН• в гипертрофированном миокарде крыс выявили прямую связь между интенсивностью генерации ОН• и размером очага некроза. Обнаруженное усиленное образование ОН• определило дальнейшую задачу исследований: изучение содержания антиоксидантов 2-й линии защиты - CoQ и -TOC в тканях миокарда с повышенным оксидантным статусом и кардиопротекторной эффективности ведения экзогенного CoQ10 в составе БАД «Кудесан».

Таблица 4

Характеристики уровней гидроксильного радикала в миокарде крыс при реперфузии после 30-минутной ишемии и степени повреждения миокарда (среднее значение±стандартное отклонение)

Группа с 30-мин ишемией

Группа с ИП

Максимальный выброс ОН·, % к фону

214±18

237±51

Время максимального реперфузионного выброса, мин

15-20

5-10

Продолжительность усиленной генерации ОН·, мин

Более 60

15

Размер зоны риска, % ко всему миокарду левого желудочка

52,5±2,2

46,6±2,5

Размер зоны некроза, % к зоне риска

30,8±3,3

5,4±1,4*

*- значимость отличий от группы без ишемического прекондиционирования, p<0,0001.

В четвертой главе оценивается антиоксидантный статус миокарда и других тканей SHRSP относительно крыс WKY, а также постинфарктного гипертрофированного миокарда крыс Wistar по содержанию коэнзимов Q и -TOC. Представлены результаты длительного введения внутрь БАД «Кудесан» раствор - свидетельства его защитного действия на миокард. 

Гипертензивные животные SHRSP всех исследованных возрастных групп имели повышенное артериальное давление и гипертрофию левого желудочка сердца; индекс массы правого желудочка SHRSP не отличался от равновозрастных крыс WKY. Содержание CoQ9, CoQ10 и -TOC в плазме крови, миокарде и головном мозге определяли у крыс SHRSP в возрасте 6, 12, 24 и 50 недель (рис. 20). В плазме крови SHRSP относительно WKY к 12-недельному возрасту снижается содержание CoQ10, в головном мозге - CoQ9. В гипертрофированном ЛЖ SHRSP всех возрастных групп выявлен дефицит CoQ10, CoQ9 и -TOC. Наименее страдает содержание CoQ в ЛЖ самых молодых животных, располагающем 4-кратным избытком -TOC. В ПЖ при отсутствии гипертрофических изменений уровни CoQ10 были снижены у 12-недельных крыс,  CoQ9 – с возраста 24 недели. Достаточные уровни CoQ в ПЖ 6-недельных животных, возможно, поддерживаются 10-кратным избытком -TOC, содержание которого падает до возрастной нормы к 12 неделям жизни при одновременном развитии дефицита CoQ.

 

Рис. 20.  Содержание коэнзимов Q10 (а), Q9 (б) и –TOC (с) в правом (ПЖ) и левом (ЛЖ) желудочках сердца SHRSP относительно WKY.

* - значимые различия абсолютных уровней между WKY и SHRSP.

 

У молодых SHRSP в возрасте 6-ти недель, на раннем этапе развития гипертрофии миокарда, индекс массы ЛЖ был прямо пропорционален концентрации CoQ10 в плазме крови (r=0,944; p<0,05) и обратно пропорционален содержанию CoQ10 в миокарде (r=-0,658; p<0,05) (рис.21).

Рис. 21. Зависимость индекса массы от содержания CoQ10 в плазме крови и миокарде левого желудочка 6-недельных крыс SHRSP.

Пополнение содержания CoQ10 в миокарде SHRSP для изучения возможности ограничения развития гипертрофии достигалось введением внутрь БАД «Кудесан» раствор (10 мг CoQ10, 1,5 мг -TOC /кг в день) с 6-й по 12-ю неделю жизни. Содержание коэнзимов Q и -TOC измеряли в плазме, миокарде и головном мозге животных через 17-19 часов после последнего введения БАД. Плазменные уровни CoQ10 были в 3,5 раза выше по сравнению с контрольными животными (44+/-7.6 vs 13.7+/-0.9 нг/мл соответственно, p<0.0001). Данные табл. 5 подтверждают способность БАД «Кудесан» при приеме внутрь повышать содержание CoQ10 в миокарде SHRSP; одновременно происходил подъем уровней CoQ9 и -TOC относительно нелеченных животных. Тот же эффект  наблюдался и в миокарде ПЖ при отсутствии изменений CoQ10 и CoQ9 в головном мозге.

Таблица 5

Содержание коэнзимов Q и -TOC в миокарде ЛЖ у 12-недельных крыс WKY, SHRSP и SHRSP, получавших БАД «Кудесан» раствор в течение 6-ти недель (среднее значение ± стандартное отклонение)1

Группы крыс,

количество в группе

CoQ9,

мкг/г

CoQ10,

мкг/г

–TOC,

мкг/г

WKY (9)

159±9,1

8,1±0,44*

8,5±2,14

SHRSP (7)

168±12,7

7,1±0,54#

9,8±1,41

SHRSP+Q (8)

185±7,4*#

8,0±0,41*

13,0±1,7*#

1- количественное определение проводили в цельных гомогенатах миокарда.

* - значимые отличия от группы SHRSP, p0,01;

# - значимые отличия от группы WKY, p0,01.

Таблица 6

Показатели артериального давления, частоты сердечных сокращений и гипертрофии ЛЖ у 12-недельных крыс WKY, SHRSP и SHRSP, получавших БАД «Кудесан» раствор в течение 6-ти недель (среднее значение ± стандартное отклонение)

Группы крыс, количество в группе

АД,

мм рт. ст.

ЧСС,

уд./мин

Индекс массы ЛЖ,

г/кг

WKY (11)

127±19*

331±45*

2,39±0,11*

SHRSP (7)

210±24#

380±27

3,00±0,25

SHRSP + Q (8)

194±48#

357±48

2,85±0,16#

* - значимые отличия от группы SHRSP, p0,01.

# - значимые отличия от группы WKY, p0,01.

Небольшое снижение среднегруппового АД и индекса массы ЛЖ в леченной группе не было статистически значимым. Более четким было снижение ЧСС, приведшее к сближению среднегрупповых значений с контрольной группой WKY (табл. 6).

Рис. 22. Взаимосвязь степени гипертрофии левого желудочка SHRSP и содержания коэнзимов Q в миокарде ЛЖ. А – группа SHRSP; Б – группа SHRSP+Q. Коэффициенты корреляции: для А1 r=-0,859 (p<0,05), А2 r=-0,936 (p<0,01); для Б1 r=-0,746 (p<0,05), Б2 r=-0,819 (p<0,05).

В обеих группах гипертензивных животных индекс массы ЛЖ был обратно пропорционален содержанию в миокарде CoQ10 и CoQ9 (рис. 22). Иными словами, степень гипертрофии миокарда ЛЖ была меньше у животных с более высоким тканевым содержанием коэнзимов Q.

Выраженность признаков гипертрофии миокарда на тканевом уровне оценивали микроскопически с помощью светового микроскопа Leitzt (Германия) и электронного микроскопа Philips CM-10 (Голландия).

При светооптическом исследовании миокарда обеих групп SHRSP наблюдали однотипные структурные изменения: увеличение размеров кардиомиоцитов и их ядер, полиморфизм последних, разрывы мышечных волокон, разобщенность клеток и увеличение межклеточных пространств, дезорганизацию миофибрилл, утрату клетками поперечной исчерченности, кровоизлияния. Деструктивные изменения были выражены и в сосудах, особенно в крупных. Просветы сохранившихся капилляров были, как правило, расширены, часто со стазом эритроцитов. В межклеточных пространствах встречались очаги образования соединительной (рубцовой) ткани.

Гипертрофия миокарда, будучи процессом компенсаторно-приспособительным, сочетает деструктивные изменения с регенераторными – приспособительными реакциями, которые легче обнаружить в ткани на ультраструктурном уровне. При электронно-микроскопическом исследовании сердец SHRSP, не получавших БАД, в кардиомиоцитах наблюдали увеличение размеров ядер и деструктивные изменения: расширения околоядерного пространства, разрывы и фрагментацию миофибрилл. Митохондрии располагались хаотично, большая часть была с разрушенным матриксом: частичное или почти полное отсутствие крист, концентрическая, дугообразная или иная формы у сохранившихся. Деструктивные изменения в миокарде этих животных носили выраженный, тотальный характер; признаков компенсаторно-приспособительных реакций не было обнаружено.

Изучение ультраструктуры сердечной мышцы левого желудочка SHRSP, получавших «Кудесан», также показало выраженные деструктивные изменения в ее клетках (разрушение миофибрилл, хаотичное расположение митохондрий, и др.) и сосудах. Однако процессы деструкции не носили столь тотального характера, как в миокарде нелеченных животных. Часть кардиомиоцитов сохраняла миофибриллы с правильной поперечной исчерченностью и цепочечное расположение митохондрий, свойственное этим клеткам в норме. Присутствовали признаки компенсаторно-приспособительных реакций: ядра кардиомиоцитов нередко имели фестончатую форму, увеличивающую поверхность ядра и свидетельствующую об активации его функции; сохранившие свое строение капилляры прилежали к сарколемме миоцитов, осуществляя таким образом тесный контакт с ними, что необходимо для обеспечения нормального обмена веществ в клетках (рис. 23).

Таким образом, у крыс, получавших CoQ10, гипертрофия миокарда носила компенсаторно-приспособительный характер. Проведенное комплексное исследование позволяет сделать вывод, что БАД «Кудесан» оказывает кардиопротекторное действие на миокард спонтанно гипертензивных крыс, так как его применение предотвратило развитие дегенеративных, необратимых структурных изменений за период наблюдения.

Рис 23. Компенсаторно-приспособительные реакции в миокарде крыс линии SHRSP, получавших «Кудесан»: a - Капилляр, образованный эндотелиальной клеткой с ядром, вдающимся в его просвет. Сарколемма кардиомиоцита имеет небольшие выступы, тесно прилежащие к стенке капилляра. Сохраненная правильная поперечная исчерченность миофибрилл кардиомиоцита, гиперплазия митохондрий.  Увеличение х 7800. b - Ядро кардиомиоцита с дисперсным расположением гетерохроматина; большая часть мембраны ядра имеет фестончатую форму. К ядру тесно прилежат миофибриллы с расположенными между ними митохондриями. Увеличение х18000.

Следующей задачей было изучение содержания CoQ в гипертрофированном постинфарктном миокарде крыс и определение эффективности введения CoQ10 в БАД «Кудесан» (в дозе CoQ10 10 мг/кг в сутки в течение 3 нед до окклюзии и 3 нед после) для ограничения процессов постинфарктного ремоделирования миокарда. Инфаркт миокарда создавали у крыс Wistar хронической окклюзией левой нисходящей коронарной артерии; при ложной операции лигатуру, накладываемую на коронарную артерию, не затягивали, не создавая препятствий для коронарного кровообращения. Через 3 недели после операции, спустя более 18 часов после последнего введения «Кудесана» определяли индекс массы желудочков сердца и величину инфаркта, отбирали пробы плазмы и миокарда внеинфарктной зоны.

Хроническая окклюзия коронарных артерий приводила к формированию зоны инфаркта (27,8±12,1% всей площади поверхности ЛЖ), развитию гипертрофии ЛЖ (индекс массы ЛЖ: 2,38±0,27 г/кг по сравнению с 1,92±0,13 г/кг у ложно-оперированных животных, p<0,0001) и не влияла на индекс массы ПЖ (0,69±0,23 г/кг у постинфарктных и 0,59±0,15 г/кг у ложно-оперированных крыс). В группе животных, получавших «Кудесан», размер зоны некроза (16,2±8,1%) и гипертрофия ЛЖ (2,18±0,24 г/кг) были меньше (p<0,05), чем в нелеченой группе.

Рис. 24. Зависимость между размером зоны некроза и концентрациями в плазме CoQ10 (3; r=-0,839, p<0,01) и CoQ9 (1; r=-0,723,  p< 0,05) у постинфарктных крыс. 1 и 3 – животные, получавшие «Кудесан».

В группе животных, получавших БАД, обнаружена отрицательная взаимосвязь размера зоны некроза с плазменными концентрациями CoQ10 (r=-0,839, p<0,01) и CoQ9 (r=-0,723, p<0,05) (рис. 24). У постинфарктных животных, не получавших препарат, размер зоны некроза и индекс массы ЛЖ не зависели от содержания CoQ. Ни в одной группе не было выявлено корреляционных связей содержания α-токоферола со степенью ишемического повреждения миокарда.

Морфологическое исследование на светооптическом уровне показало, что у животных, получавших «Кудесан», происходит более раннее и интенсивное формирование рубцовой ткани (рис 25 d). Электронная микроскопия позволила выявить, что компенсаторно-приспособительные процессы, развивающиеся в постинфарктном миокарде на ультраструктурном уровне, в обеих группах животных были однотипны и имели одинаковую направленность (рис. 25 a,b).

Рис. 25.  Микроскопия постинфарктного миокарда крыс, получавших «Кудесан»:  а – образование «арок» сарколеммой кардиомиоцита; заключенные в них митохондрии имеют разрушающиеся кристы; гиперплазия митохондрий. Увеличение Х17800. b – атипичное ядро кардиомиоцита с глубокими инвагинациями ядерной мембраны и тесно прилежащими митохондриями, полиморфизм, гипертрофия и деструкция митохондрий. Увеличение Х13200.

c – гипертрофия, гиперплазия и деструкция митохондрий; разрушение сарколеммы и миофибрилл. Прилегающая стенка сосуда имеет выраженную извитость эндотелия с развитой гранулярной цитоплазматической сетью. Сохранен базальный слой сосуда. Увеличение Х17800. d – формирование рубца: цитоплазма фибробластов представлена главным образом гранулярной цитоплазматической сетью, большая часть канальцев которой расширена до образования щелей и лакун, имеющих открытый выход во внеклеточное пространство; большие скопления коллагеновых фибрилл вокруг фибробластов. Ядро фестончатой формы с хаотичным расположением гетерохроматина. Увеличение Х7800.

Однако в группе крыс, получавших «Кудесан», процессы внутриклеточной регенерации, наиболее ярко проявившиеся в развитии гипертрофии и гиперплазии митохондрий (рис. 25 a,с), а также интенсивность образования соединительной ткани и активная реакция со стороны микрососудов (расширение их просветов, увеличение размеров эндотелиоцитов и их ядер) были более выраженными.

Результаты морфометрического, морфологического и аналитического исследований позволили получить комплексную характеристику постинфарктного миокарда крыс. Хроническая окклюзия коронарных артерий приводила к формированию очага некроза и развитию компенсаторной гипертрофии миокарда ЛЖ. В постинфарктном миокарде наблюдались деструктивные изменения (разрывы мышечных волокон, дезорганизация миофибрилл, деструкция митохондрий, утрата кардиомиоцитами поперечной исчерченности, разрушение сосудов) наряду с компенсаторно-приспособительными процессами: гипертрофией кардиомиоцитов, стромальных элементов, митохондрий, гиперплазией митохондрий, реакцией микрососудов, формированием рубцовой ткани (рис. 25).

Таблица 7

Содержание CoQ9, CoQ10 и -TOC в миокарде ЛЖ и плазме крыс различных экспериментальных групп (среднее значение ± стандартное отклонение)1

Содержание

Ложно-

оперированные

крысы

Постинфарктные нелеченые крысы

Постинфарктные крысы,

получавшие «Кудесан»

В миокарде ЛЖ,

мкг/г сырой ткани

(n=7)

(n=12)

(n=10)

CoQ9

129,5 ± 23,8

71,6 ± 27,4*

100,3 ± 23,0#  **

CoQ10

7,26 ± 1,5

4,16 ± 1,65*

5,39 ± 1,41#  ***

α-TOC

0,82 ± 0,19

0,49 ± 0,37***

0,33 ± 0,18*

В плазме, нг/мл

(n=7)

(n=12)

(n=7)

CoQ9

291,4 ± 63,7

246,0 ± 66,6

380,6 ± 149,9

CoQ10

15,2 ± 5,3

14,4 ± 3,64

40,5 ± 22,0#  ***

α-TOC (мкг/мл)

1,9 ± 0,57

1,5 ± 0,49

2,13 ± 0,20# #

1 – количественное определение проводили в цельных гомогенатах миокарда.

Вероятность ошибки:

*  p<0,001 по отношению к ложно-оперированным.

**  p<0,01 по отношению к ложно-оперированным.

***  p<0,05 по отношению к ложно-оперированным.

# p<0,05 по отношению к постинфарктным нелеченым.

#  # p<0,01 по отношению к постинфарктным нелеченым.

Следствием перенесенного инфаркта было существенное снижение содержания антиоксидантов во внеинфарктном миокарде ЛЖ (CoQ10 – на  43%, CoQ9 - на 45%, α-TOC - на 35%, табл. 7). Оказалось, что постинфарктное истощение антиоксидантного резерва характерно лишь для гипертрофированного миокарда ЛЖ, тогда как в не гипертрофированном ПЖ содержание CoQ не изменялось.

Выявленный дефицит CoQ и α-TOC в постинфарктном миокарде обосновывал попытку их использования в качестве кардиопротекторов. Очевидно, что плазменные уровни убихинона сильно варьируют в зависимости от времени с момента его введения. В нашем исследовании образцы плазмы забирали во второй половине междозового интервала, когда концентрации убихинона были близки к минимальным, циркулирующим в крови наибольшую часть суток. Эти значения более чем в 2 раза, а содержание α-TOC – на 13% превышали концентрации  в миокарде нелеченых постинфарктных животных.

Наличие сильной обратной взаимосвязи плазменных концентраций коэнзимов Q с размером зоны некроза свидетельствует о способности повышенных концентраций CoQ10 уменьшать степень ишемических повреждений миокарда. Длительное предварительное и продолжающееся после окклюзии введение БАД «Кудесан» позволяло сохранить более высокие уровни CoQ в постинфарктном миокарде при неизменном уровне α-TOC (табл. 7) и обеспечивало ему повышенную устойчивость к последующему ишемическому окислительному стрессу: сокращение зоны некроза и снижение индекса массы постинфарктного ЛЖ.

Только у леченых животных обнаружена достоверная корреляция между размером зоны некроза и концентрациями CoQ в плазме. Иными словами, чем выше содержание CoQ в плазме, тем меньше размер некротического повреждения в миокарде. Так как именно повышенные концентрации CoQ в плазме являются источником пополнения пула в миокарде за счет экзогенного убихинона, можно предположить, что более высокие концентрации в плазме обеспечивают и большее его поступление в миокард. Очевидно, что CoQ представляют лишь одно звено в многокомпонентной системе, обеспечивающей компенсаторные процессы в постинфарктном миокарде. Расход CoQ в условиях ишемического окислительного стресса зависит и от состояния других элементов антиоксидантной защиты ткани. В результате концентрации CoQ, измеренные в конце эксперимента, не были строго пропорциональны степени повреждения миокарда.

Таким образом, повышенное содержание CoQ в плазме крови и миокарде как результат введения экзогенного убихинона в составе БАД «Кудесан» способно увеличить выживаемость клеток миокарда в условиях ишемии. У животных, получавших «Кудесан», происходило более раннее и интенсивное формирование рубцовой ткани; процессы внутриклеточной регенерации были более выраженными. В результате размер зоны некроза и, как следствие, индекс массы ЛЖ уменьшались.

*  *  *

Итогом проведенных исследований является комплексная оценка БАД на основе коэнзима Q10 по критериям качества и эффективности. Соответствие важнейшего показателя качества – количественного содержания активного компонента (СоQ10)  требованиям нормативной документации позволило изучить и сравнить фармакокинетические характеристики нескольких БАД, содержащих модифицированные субстанции коэнзима Q10, и определить их относительную биодоступность. Доказана способность БАД «Кудесан» при длительном приеме внутрь увеличивать содержание коэнзима Q10 в сердечной мышце, тем самым повышая устойчивость миокарда к острым и хроническим ишемическим состояниям. Выявленная взаимосвязь тканевых уровней коэнзима Q10 и степени патологических изменений миокарда (индекса массы желудочка сердца, размера зоны некроза) придает особое значение обнаруженному эффекту отмены: резкое снижение миокардиальных уровней СоQ10 чревато снижением устойчивости к повышенным нагрузкам и эпизодам ишемии. При разработке безопасных, фармакокинетически обоснованных режимов дозирования целесообразно использование разработанной высокочувствительной и специфичной методики количественного определения убихинона в плазме крови и миокарде.

Комплексный анализ полученных результатов позволил охарактеризовать особенности окислительно-восстановительного статуса гипертрофированного миокарда. Повышенный уровень наиболее агрессивного из АФК - гидроксильного радикала и, одновременно, сниженное содержание коэнзимов Q представляются в свете полученных данных звеньями одной цепи, ведущей к развитию и прогрессированию процессов ремоделирования сердечной мышцы, и основанием для применения коэнзима Q10 в терапевтических целях.

Прямая взаимосвязь индивидуальных эндогенных уровней коэнзимов Q с -TOC в плазме крови и миокарде свидетельствует об их совместном функционировании как антиоксидантов. Введение экзогенного коэнзима Q10 и -токоферола в составе БАД «Кудесан» повышает содержание спарринг-партнеров и приводит к временному нарушению равновесия между ними, на гармонизацию которого требуется несколько недель. Этот факт может отчасти объяснить отсроченное проявление эффектов коэнзима Q10 при хроническом приеме. Впервые обнаруженный эффект отмены коэнзима Q10 - снижение миокардиальных уровней ниже контрольных значений - сопровождался снижением и уровней -токоферола. Восстановление нормального содержания и соотношения обоих антиоксидантов в сердечной мышце протекало на протяжении месяца.

Однако, и у спонтанно гипертензивных, и у постинфарктных животных степень патологических изменений миокарда коррелировала с содержанием коэнзима Q, но не -токоферола. Этот факт подчеркивает уникальный терапевтический потенциал коэнзима Q10, выполняющего двуединую фунцию: обеспечения переноса электронов для достаточного синтеза макроэргических фосфатов и детоксикации избытка свободных радикалов. Уменьшение выраженности патологии миокарда в результате повышения тканевого содержания коэнзимов Q доказывает наличие обратной связи и обосновывает использование коэнзима Q10 для кардиопротекции.

ВЫВОДЫ

  1. Разработана ВЭЖХ-методика разделения и высокочувствительного электрохимического определения коэнзимов Q9, Q10 и -TOC,  применимая для анализа лекарственных форм, содержащих солюбилизированный и микрокапсулированный коэнзим Q10, а также плазмы/сыворотки крови, миокарда и нервной ткани.
  2. Доказаны преимущества по биодоступности наноразмерных субстанций (солюбилизированного и микрокапсулированного CoQ10) относительно порошка жирорастворимой субстанции. Изучена фармакокинетика CoQ10 для порошка субстанции, раствора солюбилизированного CoQ10 и таблеток микрокапсулированного CoQ10.
  3. Изучено влияние длительного 6-недельного введения per os БАД «Кудесан» раствор, содержащего солюбилизированный CoQ10 и -TOC, на их уровни в плазме и миокарде крыс: показана возможность увеличения содержания CoQ10 и -TOC в сердечной мышце и сопряженное повышение уровней CoQ9.
  4. Выявлен эффект отмены CoQ10 после длительного применения внутрь, проявившийся через 2 недели в снижении миокардиальных уровней коэнзимов Q и и -токоферола ниже контрольных значений.
  5. Разработана ВЭЖХ-методика определения уровня гидроксильных радикалов (ОН•) в ткани миокарда in vivo, базирующаяся на микродиализе миокарда раствором салицилата натрия и высокочувствительном электрохимическом детектировании в диализатах продуктов гидроксилирования салицилата. Представленная методика позволяет отслеживать уровень генерации ОН• на протяжении нескольких часов.
  6. Выявлен повышенный уровень ОН• в гипертрофированном миокарде животных с наследственной артериальной гипертензией и в миокарде крыс при острой ишемии-реперфузии. При патологических состояниях миокарда интенсивность генерации ОН• в ткани была пропорциональна выраженности патологии: при гипертрофии миокарда - индексу массы, при ишемии-реперфузии – размеру некротического повреждения.
  7. Выявлено истощение содержания антиоксидантов - коэнзимов Q и -TOC в постинфарктном гипертрофированном миокарде крыс. В миокарде крыс с наследственной артериальной гипертензией выявлен дефицит коэнзимов Q: уже в 6-недельном возрасте для обоих желудочков сердца спонтанно-гипертензивных животных были характерны сниженные уровни CoQ и повышенные уровни -TOC; дефицит CoQ10 увеличивался с возрастом, а уровни -TOC снижались до возрастной нормы к 24-й неделе жизни.
  8. Выраженность гипертрофии миокарда у молодых (6 месячных) спонтанно-гипертензивных крыс - индекс массы левого желудочка положительно коррелировал с уровнями CoQ в плазме и отрицательно – с их содержанием в миокарде. Не выявлено взаимосвязи индекса массы гипертрофированного левого желудочка с плазменными или миокардиальными уровнями -TOC.
  9. Установлен кардиопротекторный эффект БАД «Кудесан» у крыс с наследственной артериальной гипертензией. Хроническое введение приводило к повышению его содержания в сердечной мышце при сохранении обратной связи с индексом массы левого желудочка, что сопровождалось замедлением деструктивных и активизацией регенераторных  процессов в гипертрофированном миокарде.
  10. Установлен кардиопротекторный эффект БАД «Кудесан» при инфаркте миокарда. Хроническое предварительное и продолжающееся после инфаркта введение внутрь БАД «Кудесан» раствор повышало уровни коэнзимов Q в сердечной мышце и одновременно ограничивало размер зоны некроза и постинфарктную гипертрофию миокарда. Наличие сильной обратной взаимосвязи плазменных концентраций коэнзимов Q с величиной зоны некроза подтверждает причинную роль повышенных тканевых уровней CoQ в ограничении ишемических повреждений миокарда.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

    1. Городецкая Е.А., Каленикова Е.И., Мурашев А.Н., Медведев О.С. Уровни гидроксильного радикала, коэнзима Q и альфа-токоферола в гипертрофированном миокарде крыс SHRSP// Сборник статей международной научной конференции "Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биосистем". Минск, Беларусь, 21-23 июня 2006 г. Минск, 2006. С.168-169.
    1. Городецкая Е.А., Каленикова Е.И., Мурашев А.Н., Рууге Э.К., Медведев О.С. Ежедневный прием Кудесана повышает содержание коэнзима Q в миокарде и альфа-токоферола в головном мозге спонтанно-гипертензивных крыс// Тезисы докладов XII Российского национального конгресса «Человек и лекарство». Москва, 18-22 апреля 2005. М., 2005. С.654.
    1. Городецкая Е.А., Каленикова Е.И., Мурашев А.Н., Рууге Э.К., Медведев О.С. Микродиализ миокарда in vivo для оценки фонового уровня генерации свободных радикалов кислорода// Тез. докл. Х Российского национального конгресса «Человек и лекарство». Москва, 2003. С.707-708.
    1. Городецкая Е.А., Каленикова Е.И., Мурашев А.Н., Рууге Э.К., Медведев О.С. Мониторинг уровня гидроксильных радикалов in vivo в миокарде крысы// Фундаментальные проблемы фармакологии. Сборник тезисов 2-го Съезда Российского Научного Общества фармакологов. 2003. С. 137.
    1. Городецкая Е.А,. Каленикова Е.И., Мурашев А.Н., Рууге Э.К., Медведев О.С. Нарастающий с возрастом дефицит коэнзима Q в гипертрофированном миокарде гипертензивных крыс// Сборник трудов 4-й научно-практической конференции с международным участием «Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека». Смоленск, 26-30 сентября 2005 г. Смоленск, 2005. С.136-137.
    1. Городецкая Е.А., Каленикова Е.И. Образование гидроксильных радикалов в миокарде крысы после экспериментальной ишемии различной длительности// Бюл. эксперимен. биологии и медицины. 2001. Т.131, №6. С.629-632.
    1. Городецкая Е.А., Каленикова Е.И., Фоминых М.Ф., Пупкова Т.Н., Мурашев А.Н., Медведев О.С. Возрастные изменения в системе антиоксидантной защиты гипертрофированного миокарда крысы// Рос. физиол. журн. им. И.М.Сеченова. 2004. Т.90, №8. С. 428-429. (Тезисы докладов съезда физиологов России, Екатеринбург)
    1. Городецкая Е.А., Шашурин Д.А., Каленикова Е.И. Профилактический прием коэнзима Q10 ограничивает постинфарктные зону некроза и гипертрофию миокарда у крыс// Тезисы докладов XI Российского национального конгресса «Человек и лекарство». Москва, 2004. С.779-780.
    1. Гудков Л.Л., Шумаев К.Б., Каленикова Е.И., Губкина С.А., Ванин А.Ф. Антиокисдантное и прооксидантное действие доноров оксида азота и метаболитов// Биофизика. 2007. V.52, N3. P.503-509.
    1. Каленикова Е.И., Городецкая Е.А., Колокольчикова Е.Г., МурашевА.Н., Медведев О.С. Введение коэнзима Q10 защищает гипертрофированный миокард спонтанно гипертензивных крыс// 5-я национальная научно-практическая конференция с международным участием «Активные формы кислорода, оксид азота и здоровье человека». – Смоленск, 2007.– с.165-166.
    1. Каленикова Е.И., Городецкая Е.А., Колокольчикова Е. Г., Шашурин Д.А., Медведев О.С. Повышение тканевых уровней коэнзима Q ограничивает процессы постинфарктного ремоделирования миокарда// Тезисы докладов III Съезда биофизиков России. Воронеж, 2004. С.528-529.
    1. Каленикова Е.И., Городецкая Е.А., Колокольчикова Е.Г., Шашурин Д.А., Медведев О.С. Хроническое введение коэнзима Q10 ограничивает постинфарктное ремоделирование миокарда у крыс// Биохимия. 2007. Т.72, №3. С.407-415.
    1. Каленикова Е.И., Городецкая Е.А., Коновалова Г.Г., Медведев О.С., Рууге Э.К., Ланкин В.З. Влияние длительного введения и последующей отмены коэнзима Q10 на его содержание в миокарде и сыворотке крови крыс// Фармация. 2009. N 2. C. 42-44.
    1. Каленикова Е.И., Городецкая Е.А., Маджумдер И.С., Сюткин В.Е. Эффекты коэнзима Q10 на окислительный стресс и состояние ангедонии у крыс, леченых пегилированным интерфероном-альфа. 5-я национальная научно-практическая конференция с международным участием «Активные формы кислорода, оксид азота и здоровье человека».   Смоленск, 2007. C.105-106.
    1. Каленикова Е.И., Городецкая Е.А., Медведев О.С. Биодоступность коэнзима Q10 в различных лекарственных формах// Химико-фармацевтический журнал. 2009. T. 43, № 8. С.41-44.
    1. Каленикова Е.И., Городецкая Е.А., Медведев О.С. Избыточная генерация активных форм кислорода и истощение антиоксидантного резерва в ишемизированном миокарде крыс// Кардиоваскулярная терапия и профилактика. 2008. T.7, №6. C.160.
    1. Каленикова Е.И., Городецкая Е.А., Медведев О.С. Фармакокинетика коэнзима Q10.// Бюл. эксперимент. биологии и медицины. 2008. Т.146, №9. С.288-291.
    1. Каленикова Е.И., Городецкая Е.А., Медведев О.С. Фармакокинетика кознзима Q10// Кардиоваскулярная терапия и профилактика. 2008. Т.7, №6. C.161.
    1. Каленикова Е.И., Городецкая Е.А., Медведев О.С. Фармакокинетика кознзима Q10// Рос.  мед. жур. 2008. T.16, №5. C.338-340.
    1. Каленикова Е.А., Городецкая Е.А., Мурашев А.Н., Рууге Э.К., Медведев О.С. Гипертрофированный миокард менее устойчив к ишемии: роль свободных радикалов кислорода// Тез. докл. X Российского национального конгресса «Человек и лекарство». Москва, 2003. С.719.
    1. Каленикова Е.И., Городецкая Е.А., Мурашев А.Н., Рууге Э.К., Медведев О.С. Коэнзим Q в мозге спонтанно-гипертензивных и нормотензивных крыс различного возраста// Сборник трудов 4-й научно-практической конференции с международным участием «Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека». Смоленск, 26-30 сентября 2005 г. Смоленск, 2005. С.274-275
    1. Каленикова Е.И., Городецкая Е.А., Мурашев А.Н., Рууге Э.К., Медведев О.С. Роль свободных радикалов кислорода в повышенной чувствительности гипертрофированного миокарда крысы к ишемии// Биохимия. 2004. Т.69, № 3. С.386-392.
    1. Каленикова Е.И., Городецкая E.A., Мурашев А.Н., Рууге Э.К.,Медведев О.С. Усиленная продукция гидроксильных радикалов в гипертрофированном миокарде крысы: микродиализное исследование in vivo// Биофизика. 2003. Т.48, N1. C.97-103.
    1. Каленикова Е.И., Городецкая Е.А., Шашурин Д.А., Медведев О.С. Избыточная генерация активных форм кислорода и истощение антиоксидантного резерва в ишемизированном миокарде// Сборник статей международной научной конференции "Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биосистем". Минск, Беларусь, 21-23 июня 2006 г. Минск, 2006. С.194-196.
    1. Каленикова Е.И., Городецкая Е.А., Шашурин Д.А., Рууге Э.К. Убихинон и гипертрофия миокарда//Тез. докл. Третьей всероссийской с международным участием школы-конференции по физиологии кровообращения. Москва, 2004. С.31.
    1. Лакомкин В.Л., Коновалова Г.Г., Каленикова Е.И., Заббарова И.В., Каминный А.И., Тихазе А.К., Ланкин В.З., Рууге Э.К., Капелько В.И. Изменение антиоксидантного статуса миокарда под влиянием коэнзима Q10 npи окислительном стрессе// Биохимия. 2005. Т.70, вып.1. №2. С.97-104.
    1. Лакомкин В.Л., Коновалова Г.Г., Каленикова Е.И., Заббарова И.В., Тихазе А.К., Цыплёнкова В.Г., Ланкин В.З. Защита коэнзимом Q миокарда крыс при окислительном стрессе, индуцируемом пероксидом водорода// Биохимия. 2004. Т.69, №5. С.639-646.
    1. Лакомкин В.Л., Коновалова Г.Г., Каленикова Е.И., Заббарова И.В., Цыплёнкова В.Г., Тихазе А.К., Ланкин В.З., Рууге Э.К., Капелько В.И. Влияние убихинона на сократительную функцию и антиоксидантный статус миокарда при наследственной гипертонии у крыс// Кардиология. 2006, №5. C.54-62.
    1. Лакомкин В.Л., Цыпленкова В.Г., Каленикова Е.И., Заббарова И. В., Коновалова Г.Г. Длительный прием убихинона защищает сердце от последствий окислительного стресса// Кардиоваскулярная терапия и профилактика. 2003. Т.2, № 3. С.185. (Материалы Российского национального конгресса кардиологов «От исследований к стандартам лечения».Москва, 7-10 октября 2003)
    1. Поварова О.В., Гарибова Т.Л., Каленикова Е.И., Галаева И.П., Крайнева В.А., Медведев О.С., Воронина Т.А. Влияние фенил-/-бутилнитрона (PBN), мексидола и нооглютила на зону ишемического поражения мозга и память крыс после окклюзии средней мозговой артерии// Экспериментальная и клиническая фармакология. 2004. Т. 67,№1. С.3-6.
    1. Поварова О.В., Каленикова Е.И., Ганьшина Т.С., Мирзоян Р.С., Медведев О.С. Окислительный стресс и нейропротекция при ишемическом инсульте: эффект а-фенил-Т-бутилнитрона и комплекса пирролидона-2 с пироглютаминовой кислотой// Фундаментальные проблемы фармакологии. Сборник тезисов 2-го Съезда Российского Научного Общества фармакологов. 2003. С.88.
    1. Поварова О.В., Каленикова Е.И., Городецкая Е.А., Медведев О.С. Антиоксиданты как нейропротекторы при ишемическом инсульте// Экспериментальная и клиническая фармакология. 2003. T.66, N3. C.69-73.
    1. Поварова О.В., Каленикова Е.И., Городецкая Е.А., Медведев О.С. Длительное профилактическаое введение коэнзима Q10 защищает головной мозг от ишемического повреждения// 5-я национальная научно практическая конференция с международным участием «Активные формы кислорода, оксид азота и здоровье человека».   Смоленск, 2007. C.341-342.
    1. Поварова О.В., Каленикова Е.И., Медведев О.С. Локальная ишемия головного мозга и коэнзим Q// Тезисы докладов XI Российского национального конгресса «Человек и лекарство». Москва, 2004. С.822.
    1. Чазов Е.И., Каленикова Е.И., Городецкая Е.А. Мониторинг гидроксильных радикалов in vivo в миокарде крысы при ишемии-реперфузии: эффект ишемического прекондиционирования// Доклады Академии наук. 2001. Т.380, №6. С.840-843.
    1. Gorodetskaya E., Kalenikova E., Kolokolchikova E., Murashev A., Medvedev O. Protective effects of coenzyme Q10 supplementation on hypertrophied myocardium of spontaneously hypertensive rats// Journal of Hypertension. 2007. V.25, Suppl.2. S121.
    1. Gorodetskaya E., Kalenikova E., Medvedev O. Increase of coenzyme Q10 level in rat myocardium after single administration of nanotechnologically prepared coenzyme Q10.  Конгресс Европейского общества по изучению гипертонии, Милан, Италия, июнь 2009 (ESC Congress)// Journal of Hypertension. 2009. Suppl. 4. S139.
    1. Gorodetskaya E.A., Kalenikova E.I., Murashev A.N., Medvedev O.S. Increased Hydroxyl Radical Generation and Deficit of Coenzyme Q in Myocardium of SHRSP// Physiological Research. 2008. V.57, № 3. P. 43P. (Proceeding of the 13th International SHR Symposium, June 20-22, 2008, Prague, Czech Republic)
    1. Gorodetskaya E.А., Kalenikova E.I., Murashev A.N., Medvedev O.S. The deficit of coenzyme Q in hypertrophied myocardium of the rats with arterial hypertension// Journal of Hypertension. 2005. S355-S356. (Abstract Book of Fifteenth European Meeting on Hypertension, Milan, Italy, June 17/21, 2005)
    1. Gorodetskaya E.A., Kalenikova E.I., Murashev A.N., Ruuge E.K., Medvedev O.S. Increased level of oxygen free radicals in rat hypertrophied myocardium (in vivo study by microdialysis with salicylate)// Тезисы докладов международного симпозиума "Reactive Oxygen and Nitrogen Species: Diagnostic, Preventive, and Therapeutic Values". СПб., 2002. С. 146.
    1. Gorodetskaya E.A., Shashurin D.A., Kalenikova E.I. Decreased coenzyme Q content in postinfarct myocardium// International conference «Reactive oxygen and nitrogen species, antioxydants and human health». Smolensk, 2003. P.58. – (Work collection)
    1. Kalenikova E., Gorodetskaya E., Kolokolchikova E., Murashev A., Medvedev O. The improvement of postinfarct myocardium remodeling by coenzyme Q10 supplementation// Journal of Hypertension 2007. V.25, Suppl.2. S121-S122.
    1. Kalenikova E.I., Gorodetskaya E.A., Medvedev O.S. In vivo monitoring of oxygen free radicals level in rat myocardium: effect of ischemic preconditioning// Тезисы докладов междунар. симпозиума "Reactive Oxygen and Nitrogen Species: Diagnostic, Preventive, and Therapeutic Values". СПб., 2002. С.152.
    1. Kalenikova E., Gorodetskaya E., Medvedev O. The pharmacokinetic of nanotechnologically prepared coenzyme Q10. Конгресс Европейского общества по изучению гипертонии, Милан, Италия, июнь 2009 (ESC Congress)// Journal of Hypertension. 2009. Suppl. 4. S139.
    1. Kalenikova E.I., Gorodetskaya E.А., Murashev A.N., Medvedev O.S. Coenzyme Q and a-tocopherol in braine of spontaneously hypertensive stroke-prone rats during aging// Journal of Hypertension. 2005. S233-S234. (Abstract Book of Fifteenth European Meeting on Hypertension, Milan, Italy, June 17/21, 2005)
    1. Kalenikova E.I., Gorodetskaya E.A., Murashev A.N., Medvedev O.S. Depletion of Coenzyme Q Content in Myocardium of SHRSP During Aging. Physiological Research. 2008. V.57, № 3. P. 48P. (Proceeding of the 13th International SHR Symposium, June 20-22, 2008, Prague, Czech Republic)
    1. Kalenikova E.I., Gorodetskaya E.A., Murashev A.N., Ruuge E.K. Coenzyme Q and a-tocopherol in rat brain during aging and after long-term coenzyme Q and a-tocopherol containing nutrient supplementation// European Neuropsychopharmacology. April 2005. V.15. Suppl.2. P.206. (Abstracts of 8th ECNP Regional meeting. April 14-16, Moscow, Russia)
    1. Kalenikova E.I., Gorodetskaya Е.А., Murashev A.N., Ruuge E.K. Elevated hydroxyl radical generation in hypertrophied myocardium of SHR-SP estimated in vivo by microdialysis with salicylate// American Journal of Hypertension. 2002. V.15, N4(Part2). P.147A-148A.
    1. Kalenikova E.I., Gorodetskaya E.A., Murashev A.N., Ruuge E.К. Hypertrophied myocardium is more sensitive to oxydative stress// Abstract Book of Thirteen European Meeting on Hypertension. Milan, 2003. S.142.
    1. Kalenikova E.I., Gorodetskaya E.А., Murashev A.N., Ruuge E.К., Medvedev O.S. Increased damage of hypertrophied myocardium induced by ischemia and reperfusion// International conference «Reactive oxygen and nitrogen species, antioxydants and human health». Smolensk, 2003. Work collection, P. 60.
    1. Lakomkin V.L., Zabbarova I.V., Kalenikova E.I., Tsyplenkova V.G., Ruuge E.K. Effects of coenzyme Q10 enriched diet on deterioration of contractility, mitochondrial function and structure of cardiac muscle caused by oxydative stress//  International conference «Reactive oxygen and nitrogen species, antioxydants and human health». Smolensk, 2003. Work collection, P.64.
    1. Povarova O.V., Kalenikova E. I., Medvedev O.S. Acute focal cerebral ischemia and coenzyme Q// European Neuropsychopharmacology. April 2005. V.15, Suppl.2. P.244. (Abstracts of 8th ECNP Regional meeting. April 14-16, Moscow, Russia)
    1. Povarova O.V., Kalenikova E.I., Medvedev O.S. Acute focal cerebral ischemia: oxydative stress and neuroprotection (phenyl-tert-butyl-nitrone)// International conference «Reactive oxygen and nitrogen species, antioxydants and human health». Smolensk, 2003. Work collection, P.122-123.
    1. Povarova O.V., Kalenikova E.I., Medvedev O.S. Coenzyme Q in rat brain after acute cerebral stroke// Restorative Neurology and Neuroscience. 2002. V. 20, N6. P.286. (Abstracts of the 3r Magdeburg Symposium Neuroprotection and Neurorepair)
    1. Ruuge E.K., Gorodetskaya E.A., Kalenikova E.I., Medvedev O.S. Effect of ischemic preconditioning on oxygen radical production in myocardium: a microdialysis study with salicylate// European Heart J. 2002. V.4, Suppl. Aug. P. 637.
    1. Ruuge E.K., Kalenikova E.I., Gorodetskaya E.A., Murashev A.N. Increased production of reactive oxygen species in hypertrophied myocardium: in vivo study by microdialysis technique// European Heart J. 2002. V.4, Suppl. Aug. P.671.





© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.