WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

 

На правах рукописи

САВОЧКИНА

Альбина Юрьевна

НЕЙТРОФИЛЬНЫЕ ВНЕКЛЕТОЧНЫЕ ЛОВУШКИ:

МЕХАНИЗМЫ ОБРАЗОВАНИЯ, МЕТОДЫ ОБНАРУЖЕНИЯ,

БИОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ

14.03.09 – клиническая иммунология, аллергология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

доктора медицинских  наук

Челябинск 2012

Работа выполнена в научно-исследовательском институте иммунологии и на кафедре микробиологии, вирусологии, иммунологии и клинической лабораторной диагностики Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Челябинская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Научный консультант:

член-корреспондент РАМН, Заслуженный деятель науки РФ

доктор медицинских наук,

профессор

Долгушин Илья Ильич

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук,

профессор

Ярилин Александр Александрович

доктор медицинских наук,

профессор

Смолягин Александр Иванович

доктор медицинских наук

профессор

Аклеев Александр Васильевич

Ведущая организация: Институт иммунологии и физиологии УрО РАН, г. Екатеринбург

Защита состоится  «--» февраля 2012 года в 10.00 часов на заседании диссертационного совета Д  208.117.03 при Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Челябинская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации по адресу: 454092, г. Челябинск, ул. Воровского, 64

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Челябинская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Автореферат разослан «--»  января 2012 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

доктор медицинских наук Латюшина Л.С.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования

Нейтрофильные гранулоциты являются самыми многочисленными из лейкоцитов. Они имеют короткую продолжительность жизни, их количественный гомеостаз в периферической крови постоянно поддерживается притоком из костного мозга. Нейтрофилы играют очень важную роль в антимикробных реакциях врожденного иммунитета [Nathan C., 2006].

Нейтрофил оснащен богатым набором рецепторов, которые позволяют чутко и дифференцированно реагировать на малейшие изменения окружающей среды [Ковальчук Л.В. и др., 2005; Семенов Б.Ф., Зверев В.В., 2007; Hoffmann J.A. еt аl., 1999; Hoffmann J.A. еt аl., 2003]. Подготовленный нейтрофил может оказывать свое действие на объект, вызвавший его активацию, одним из двух способов: во-первых, фагоцитировать и уничтожать его в фаголизосомах, во-вторых, выделять наружу бактерицидные продукты, которые представляют собой содержимое гранул [Долгушин И.И., Бухарин О.В., 2001].

Открытие V. Brinkmann и соавт. в 2004 г. нейтрофильных внеклеточных ловушек (НВЛ) и установление их антимикробного эффекта, как важнейшего звена врожденного иммунитета, безусловно, является началом нового этапа в понимании жизненного цикла и функции нейтрофильных гранулоцитов.

Формирование внеклеточных ловушек может осуществляться только активными нейтрофилами. Эффект антимикробных веществ, входящих в состав НВЛ во внеклеточном пространстве усиливается в структурах НВЛ [Parseghian M.H., Luhrs K.A., 2006; Brinkmann V., Zychlinsky A., 2007].

Данные литературы свидетельствуют о том, что новому механизму защиты, осуществляемому нейтрофильными гранулоцитами, уделяется очень большое внимание [Brinkmann V. et al., 2004; Urban C.F. еt аl., 2006; Brinkmann V., Zychlinsky A., 2007; Fuchs, T.A. еt аl., 2007; Steinberg B.E., Grinstein S., 2007; Neeli I. еt аl., 2009; Florian H. Pilsczek еt аl., 2010]. Несмотря на многочисленные исследования в данной области, очень много вопросов остаются не раскрытыми. До конца не ясны механизмы формирования НВЛ, система внутриклеточных взаимодействий при формировании НВЛ, условия внешней и внутренней среды необходимые для образования нейтрофилами внеклеточных ловушек, их эффективность по отношению к различным патогенам, методы обнаружения НВЛ и их применение в клинической и диагностической практике.

Цель исследования

Изучить механизмы формирования нейтрофильных внеклеточных ловушек, разработать методы их обнаружения в различных биологических жидкостях в норме и при патологии.

Задачи исследования

  1. Сравнить различные способы окраски внеклеточных ловушек, образуемых нейтрофилами, выделенными из периферической крови.
  2. Определить оптимальные условия инкубации in vitro для формирования внеклеточных ловушек нейтрофилами, выделенными из периферической крови.
  3. Изучить влияние различных экзогенных факторов микробной и немикробной природы на процесс образования внеклеточных ловушек нейтрофилами, выделенными из периферической крови.
  4. Оценить in vitro влияние различных эндогенных факторов (плазма, сыворотка крови, комплемент, специфические иммуноглобулины) на формирование внеклеточных ловушек нейтрофилами, выделенными из периферической крови.
  5. Изучить участие цитоскелета, кальциевых каналов, энергетического обмена и мембраны нейтрофила в процессе образования нейтрофильных внеклеточных ловушек.
  6. Разработать метод обнаружения нейтрофильных внеклеточных ловушек в мукозальных секретах.
  7. Провести сравнительный анализ захвата и киллинга микроорганизмов нейтрофилами в процессе фагоцитоза и образования внеклеточных ловушек, а также определить зависимость эффективности нейтрофильных внеклеточных ловушек от её морфологических характеристик.
  8. Оценить информативность предлагаемых методов обнаружения нейтрофильных внеклеточных ловушек в различных биологических жидкостях в норме и при патологии.

Научная новизна

В работе определены оптимальные условия инкубирования нейтрофилов для их активации и формирования НВЛ in vitro. Установлено, что оптимальное время инкубации составляет 30 минут, а температура 37°С. Показано, что факторы микробной и немикробной природы: Lactobacterium spp. и Bifidumbacterium spp., E. coli (штамм М-17), S. аureus, грибы рода Candida, форбол-12-миристат-13-ацетат (ФМА), липополисахарид (ЛПС), пирогенал, вакцина «Солкотриховак», циклоферон, бестим индуцируют образование НВЛ.

Изучено формирование внеклеточных ловушек нейтрофилами цельной крови, лейкоцитарной взвеси и нейтрофилами, выделенными на двойном градиенте фиколла-верографина. Показано, что нейтрофилы цельной крови и лейкоцитарной взвеси в норме не образуют НВЛ не зависимо от концентрации активатора. Определена роль сыворотки, плазмы, комплемента и специфических иммуноглобулинов в формировании внеклеточных ловушек нейтрофилами. Установлено, что аутологичные сыворотка и плазма крови, независимо от присутствия в них специфических иммуноглобулинов и комплемента, оказывают ингибирующее действие на внеклеточный выброс ДНК нейтрофилами, выделенными из периферической крови. Комплемент сыворотки морской свинки оказывает стимулирующее дозозависимое действие на секрецию нейтрофильной ДНК. Специфические иммуноглобулины не влияют на формирование НВЛ, в то же время, они усиливают фагоцитарную активность нейтрофилов.

Определено участие цитоскелета, кальциевых каналов, энергетического обмена и мембраны нейтрофила в процессе формирования НВЛ. Показано, что перечисленные ультраструктуры нейтрофила задействованы в образовании НВЛ.

Разработан способ обнаружения нейтрофильных внеклеточных ловушек в мукозальных секретах. Используя данный способ впервые изучены морфология и эффективность НВЛ. Установлено, что эффективность НВЛ, зависит от ее морфологических характеристик.

Разработаны новые методы определения НВЛ в агарозном геле и на спектрофатометре.

Впервые проведен сравнительный анализ количества НВЛ в различных биологических жидкостях. Показано, что острый инфекционный процесс стимулирует повышенный выброс нейтрофильной ДНК во внеклеточное пространство.

Теоретическая и практическая значимость работы

Результаты исследования расширяют знания о физиологии нейтрофильных гранулоцитов, их функциональных возможностях, механизмах формирования НВЛ. Разработанный метод изучения образования НВЛ в агарозном геле позволяет моделировать условия существования нейтрофилов в мукозальных секретах.

Полученные данные вносят существенный вклад в понимание роли НВЛ в антимикробных реакциях врожденного иммунитета.

Данные о стимуляции или блокаде образования нейтрофилами внеклеточных ловушек веществами, влияющими на элементы цитоскелета, мембрану нейтрофилов, кальциевые каналы и энергетический обмен, могут быть использованы для поиска новых подходов к фармакологической коррекции защитных реакций, связанных с формированием НВЛ.

Разработанные методы обнаружения НВЛ открывают новые возможности для диагностики различных заболеваний, оценки тяжести течения болезней и эффективности их лечения.

Положения, выносимые на защиту

  1. Разработанные методы обнаружения НВЛ в периферической крови и мукозальных секретах, могут быть использованы для оценки функционального статуса нейтрофилов и диагностики дефектов врожденного иммунитета.
  2. Элементы цитоскелета, кальциевые каналы, энергетический обмен и мембрана нейтрофилов вовлечены в процесс формирования НВЛ.
  3. Нейтрофилы чистой фракции, цельной крови и лейкоцитарной взвеси по-разному отвечают образованием НВЛ на стимуляцию различными активаторами. Сыворотка и плазма крови подавляют образование нейтрофилами внеклеточных ловушек.
  4. Внеклеточный захват и киллинг микроорганизмов, осуществляемый нейтрофильными гранулоцитами является, процессом более эффективным, чем фагоцитоз.

Внедрение результатов исследования

Результаты исследований внедрены в лабораторную диагностику НИИ иммунологии ГБОУ ВПО «Челябинская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития России, в Институт экологии и генетики микроорганизмов УроРАН, г. Пермь и используются в учебном процессе на кафедрах микробиологии, вирусологии, иммунологии и клинической лабораторной диагностики, акушерства и гинекологии ГБОУ ВПО «Челябинская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития России.

Апробация работы

Основные положения работы доложены и обсуждены на: IX съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2007); VIII конгрессе “Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии” (Москва, 2007); национальной конференции “Аллергология и клиническая иммунология – междисциплинарные проблемы” (Москва, 2008); объединенном иммунологическом форуме (Санкт-Петербург, 2008); конференции, посвященной 10-летию Южно-Уральского научного центра РАМН (Челябинск, 2008); VI Российской научной конференции «Персистенция микроорганизмов» (Оренбург, 2009); X Международном конгрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии» (Казань, 2009); X Всероссийском научном Форуме имени академика В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге: Молекулярные основы иммунорегуляции, иммунодиагностики и иммунокоррекции» (г. Санкт-Петербург, 2009); VII итоговой научно-практической конференции молодых ученых ЧелГМА (Челябинск, 2009); II международной научно-практической конференции молодых ученых (Челябинск, 2011); IX Российской конференции иммунологов Урала (Челябинск, 2011).

Структура и объем диссертации

Работа изложена на 221 страницах текста, иллюстрирована 46 таблицами, 11 рисунками. Состоит из введения, обзора литературы, главы с описанием материалов и методов исследования, восьми глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы, содержащего 289 источников, в том числе 112 отечественных и 177 зарубежных.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 34 научных работ, в том числе 25 из перечня изданий, рекомендованных ВАК РФ. Издана монография «Нейтрофильные ловушки и методы оценки функционального статуса нейтрофилов» и получен патент.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Для достижения поставленной цели за период  с  2007 по 2011 год на базе научно-исследовательского института иммунологии и кафедры микробиологии, вирусологии, иммунологии и клинической лабораторной диагностики ЧелГМА было проведено обследование 162 практически здоровых женщин. В эту группу вошли здоровые пациентки, возраст которых составил от 18 – 35 лет. Критериями включения явились: добровольное согласие на обследование; первая фаза менструального цикла; отсутствие приема гормональных препаратов.

В наше исследование были включены также 30 женщин с воспалительными заболеваниями нижнего отдела репродуктивного тракта (острым цервицит, острый вагинит), которые находились на лечении в женской консультации ГКБ №2 и №8, диагноз этим пациенткам выставлял врач акушер-гинеколог и 13 больных, находившихся на лечении в отделении реанимации и интенсивной терапии №5 ГБУЗ Челябинской областной клинической больницы с сепсисом, развившимся на фоне гнойной хирургической инфекции. Диагноз выставлялся в соответствии с МКБ-X (1995).

Материалом для исследования нейтрофилов служили периферическая кровь, лейкоцитарная взвесь, чистая фракция нейтрофилов, цервикальная и вагинальная слизь.

Кровь забирали в центрифужную пробирку с 1 мл раствора гепарина (в разведении 10-15 ед. гепарина в 1 мл изотонического раствора хлорида натрия).

Лейкоцитарную взвесь получали из гепаринизированной крови после седиментации эритроцитов, обогащенную лейкоцитами плазму крови (лейкоцитарную взвесь) собирали стерильным наконечником в чистые стерильные пробирки.

Для выделения нейтрофилов 2 мл гепаринизированной крови смешивали с 3 мл стерильного физиологического раствора, полученную смесь наслаивали на градиент плотности стерильных растворов фиколла-верографина (Pharmacia, Sweden; Spofa, CSSR). Плотность верхнего слоя градиента составляла 1,075-1,077, нижнего – 1,093-1,095. Через 40 минут центрифугирования при 1500 оборотах в минуту на границе между градиентами образовывалось кольцо гранулоцитов с чистотой 98-100%, которое отмывали от градиента стерильным физиологическим раствором дважды по 5 минут, после чего клетки доводили до концентрации 5х106 /мл.

Нейтрофилы, выделенные из периферической крови окрашивали с помощью 0,04% раствором акридинового оранжевого. Полученные результаты оценивали в люминесцентном микроскопе, используя при этом фильтры, которые обеспечивают возбуждающий свет с длиной волны не более 490 нм и эмиссию с длинной волны 520 нм. В суспензии подсчитывали число нейтрофилов с сегментированным ядром, клеток с недифференцированным ядром и нейтрофильных внеклеточных ловушек, которые пересчитывали на 100 клеток. Полученные результаты выражали в процентах.

Инактивацию естественного комплемента проводили путем прогревания плазмы или сыворотки крови на водяной бане при температуре 56оС в течение 30 минут [Мирахмедов У.М., Резникова Л.С., 1975]. Для влияния гетерогенного комплемента использовали сухого комплемент (ФГУП «НПО „Микроген“», г.Пермь). Концентрацию препарата подбирали, учитывая нормальные значения активности комплемента в организме человека, в перерасчете на 1 миллилитр клеточной взвеси.

Истощение сыворотки и плазмы по специфическим иммуноглобулинам проводили по методу Маянского А.Н. и соавторов (1982). Для этого использовали кровь лиц с подтвержденным повышенным содержанием антител класса IgG к С. albicans, которое устанавливалось с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) (Кандида-IgG-ИФА-БЕСТ, г. Новосибирск-117). К осадку С. albicans (штамм 601) (1х109 клеток/мл) добавляли 0,5 мл свежей сыворотки крови, инкубировали в режиме, исключающем активацию комплемента, при +4°С в течение 30 минут, при этом встряхивая каждые 5 минут [Маянский А.Н. и др., 1982]. Затем центрифугировали при 1500 об/мин в течение 10 минут и использовали в опытах как истощенную по специфическим иммуноглобулинам сыворотку, так и опсонизированную С. albicans (штамм 601).

Определение внеклеточных ловушек, образованных нейтрофилами, выделенными из периферической крови проводили при инкубации нейтрофилов в физиологическом растворе и с индукторами микробной и немикробной природы. Для активации нейтрофильных гранулоцитов использовали различные концентрации трехкратно отмытой от питательной среды взвеси суточных культур контрольных моноштаммов S. aureus («Cowan 209»), Е. coli (штамм М-17), Lactobacterium spp. (препарат "Лактобактерин сухой", фирма "ИмБио", г. Нижний Новгород), Bifidobacterium spp. (препарат "Бифидумбактерин сухой", ЗАО "Экополис", г.Ковров) и С. albicans (штамм 601). По стандарту мутности БАК — 10 (ООО "Ормет", г. Екатеринбург) получали  концентрацию 1 млрд. микробных тел в 1мл (1х109/мл) [Иммунологические методы…, 1981], затем разводили в 10 и в 100 раз. Таким образом, были получены концентрации бактерий 1х109/мл, 1х108/мл и 1х107/мл. Затем, в зависимости от цели исследования, 1 мл взвеси нейтрофилов, выделенных на двойном градиенте фиколла-верографина и доведенных до концентрации 5х106 клеток/мл, 1 мл цельной гепаринизированной крови или 1 мл лейковзвеси инкубировали при температуре +370С в течение 30 минут в присутствии 0,1 мл взвеси микроорганизмов доведенных до определенной концентрации. В качестве активатора немикробного происхождения использовали форбол-миристат ацетат (ФМА) (Fluka, США) в концентрации 7,5 µМ/мл, который относится к группе форболовых эфиров. Для контроля 1 мл взвеси нейтрофилов, выделенных на двойном градиенте фиколла-верографина и доведенных до концентрации 5х106 клеток/мл, 1 мл цельной гепаринизированной крови или 1 мл лейковзвеси, инкубировали в присутствии физиологического раствора, в тех же условиях.

Кроме культур микроорганизмов для эксперементального исследования использовали лекарственные средства: Циклоферон (ООО «НТФФ «ПОЛИСАН»», г.Санкт-Петербург, Россия), Пирогенал (Филиал «Медгамал» ГУ НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН, г. Москва, Россия), Солкотриховак (Valeant Parmaceuticals Switzerland GmbH, Швейцария), и Бестим (ФГУП ГосНИИ особо чистых биопрепаратов ФМБА, г. Санкт-Петербург, Россия). Данные препараты использовали в концентрациях, соответствующих разовой терапевтической дозе для человека [Каркищенко Н.Н. и др., 2001], в перерасчете на 1 миллилитр взвеси нейтрофилов, выделенных на двойном градиенте фиколла-верографина.

Оптимальный режим инкубации определяли следующим образом: нейтрофилы, выделенные из периферической крови, активировали взвесью грибов рода Candida albicans (штамм 601), в концентрации 1х108/мл или активатором немикробного происхождения ФМА (Fluka, США) в концентрации 7,5 µМ/мл., при различных температурных режимах: 4С, 22С, 37С и 56С, в течении 10 мин., 20 мин., 30 мин., 40 мин., и 60 мин. Материал наносили на предметное стекло, высушивали, фиксировали 96 % этиловым спиртом и окрашивали 0,04 % раствором акридинового оранжевого.

Для определения участия цитоскелета, кальциевых каналов, энергетического обмена и мембран нейтрофилов в процессе формирования ими внеклеточных ловушек использовали следующие препараты: цитохалазин и колхицин – блокаторы цитоскелета; верапамил – блокатор кальциевых каналов; циклогексидин – блокатор синтеза белка; преднизалон – мембраностабилизирующий препарат. Для этого нейтрофилы, выделенные из периферической крови, активировали взвесью ЛПС и добавляли перичисленные препараты: цитохалазин или колхицин («Sigma» США), в концентрации 1 мкг/мл, циклогексимид («AppliChem», Германия), в концентрации 16 мкг/мл [Махрова, Т.В., 2004; Свиридов М.А., 2008], верапамил (Верофарм, г. Белгород, Россия) и преднизолон (Никомед, Австрия) в концентрации, соответствующей средней терапевтической дозе [Каркищенко Н.Н. и др., 2001]. При этом использовали несколько контролей: К1 – нейтрофилы инкубированные в присутствии физиологического раствора; К2 – нейтрофилы, активированные ЛПС. Все пробирки инкубировали в одинаковых условиях – при 370С в течение 30 минут. Материал наносили на предметное стекло, высушивали, фиксировали 96 % этиловым спиртом и окрашивали 0,04 % раствором акридинового оранжевого.

Для определения внеклеточных ловушек в мукозальных секретах исследовали цервикальную и вагинальную слизь. Забор осуществляли с помощью специальной градуированной пипетки. Полученный секрет в количестве 0,1 мл вносят в 0,9 мл физиологического раствора, а затем полученную суспензию в количестве 0,1 мл смешивают с 0,1 мл сложного красителя, который готовят ex temporo в отдельной пробирке: 1 мл синьки Эванса в концентрации 1:8000 (окрашивает слизь и живые клетки в оранжевый цвет) смешивают с 1 мл  красителя Sytox Green в концентрации 1:500 (окрашивает мертвые клетки и внеклеточную ДНК в зеленый цвет), инкубируют в течение 5 минут в темноте. Из окрашенного, нативного материала готовят препарат «раздавленная капля». Учет проводят с помощью люминесцентного микроскопа, используя фильтры, обеспечивающие возбуждающий свет с длиной волны не более 490 нм и эмиссию с длиной волны 520 нм. При таком способе можно провести количественную оценку жизнеспособности нейтрофилов - погибшие клетки и внеклеточная ДНК окрашиваются в зеленый цвет за счет Sytox Green, а живые клетки и слизь окрашиваются в оранжевый цвет синькой Эванса. Нейтрофилы можно разделить на 4 группы:

1 группа объединяет жизнеспособные клетки оранжевого цвета;

2 группа включает клетки с зеленым ядром и ярко-оранжевой цитоплазмой (по-видимому, подвергшиеся апоптозу);

3 группа объединяет погибшие клетки зеленого цвета;

4 группа включает в себя свободнолежащие ярко-зеленые волокна, представляющие собой нити ДНК нейтрофила (нейтрофильные ловушки).

Данный способ окраски также позволяет оценить такие показатели, как активность и интенсивность поглощения микроорганизмов неизмененными нейтрофилами, а также показатели захвата микроорганизмов в нейтрофильные ловушки. С этой целью предложено рассчитывать следующие показатели.

Активность фагоцитоза – процент сегментированных нейтрофилов содержащих микроорганизмы в цитоплазме из 100 подсчитанных гранулоцитов.

Активность НВЛ – процент нейтрофильных внеклеточных ловушек,

захвативших микроорганизмы, из 100 подсчитанных сетеподобных структур.

Фагоцитарное число – среднее количество микроорганизмов, захваченных одним активным неизмененным нейтрофильным гранулоцитом.

Индекс НВЛ - среднее количество микроорганизмов, захваченных одной эффективной нейтрофильной внеклеточной ловушкой.

Отличительной особенностью предлагаемого нами метода окраски, является возможность определения жизнеспособности не только нейтрофильных гранулоцитов, но и микроорганизмов – активаторов.

При изучении препаратов, активированных различными микроорганизмами и окрашенных данным методом, мы обратили внимание, что не только нейтрофилы имеют разную окраску, но и микроорганизмы: погибшие микроорганизмы окрашиваются в зеленый цвет, а живые микроорганизмы - в ярко-оранжевый цвет за счет избирательного действия Sytox Green и фонового окрашивания синькой Эванса.

Для оценки эффективности и морфологии внеклеточных ловушек нейтрофилы, выделенные из периферической крови, активировали взвесью Candida albicans (штамм 601), затем окрашивали сложным красителем (Sytox Green и синька Эванса) и учитывали жизнеспособность захваченных микроорганизмов в люминесцентном микроскопе. При предложенном нами способе окраски убитые микроорганизмы окрашивались в зеленый цвет, а микроорганизмы, сохранившие свою жизнеспособность - в оранжевый. Мы считали общее число микроорганизмов, из них - количество живых и количество убитых микроорганизмов. Основываясь на полученных данных, рассчитывали процент эффективности НВЛ.

Для определения нейтрофильных внеклеточных ловушек в агарозном геле готовили стекла специальным способом: для этого на обезжиренное стекло наносили 1% раствор нормального агара высокой температуры плавления и низкой температуры плавления. Выделенную на двойном градиенте чистую фракцию нейтрофилов инкубировали при температуре +37°С в течение 30 минут в присутствии активаторов. Препарат помещали на 10 минут на лед, затем в стерильный раствор Хенкса при температуре 37°С на 30 минут. Далее стекла сушили, фиксировали и окрашивали используя флюорисцентный краситель Sytox Green, который наносили на фиксированный препарат. Учет проводили с помощью люминесцентного микроскопа.

Для определения нейтрофильных внеклеточных ловушек на спектрофотометре был использован модифицированный метод Шмидта – Трангаузера для количественного определения ДНК. Количество ДНК перерасчитывают по формуле:

ДНК (мкг/мл) = (Е 270 – Е 290) / 0,19 х 10,1 = (Е 270 – Е 290) х 53, 158

Статистические методы полученных данных проводили с использованием пакета прикладных компьютерных программ SPSS – 13.0.

Полученные  данные были обработаны методами дескриптивной статистики и представлены в виде средней арифметической и её стандартной ошибки (M±m). О достоверности межгрупповых различий судили с помощью непараметрических критериев Манна-Уитни, Вальда-Вольфовица и Колмогорова-Смирнова. Проверка статистических гипотез осуществлялась при критическом уровне значимости Р0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

На первом этапе исследования была отработана методика определения внеклеточных ловушек, образованных нейтрофилами, выделенными из периферической крови. Для этого был проведен сравнительный анализ различных способов окраски нейтрофилов чистой фракции для определения НВЛ. Были изучены фиксированные и нативные препараты чистой фракции нейтрофильных гранулоцитов, которые предварительно инкубировали в физиологическом растворе или с добавлением индуктора, затем окрашивали различными красителями: акридиновым оранжевым, Sytox Green, по Романовскому – Гимзе и проводили подсчет, учитывая все морфологические формы нейтрофилов: нейтрофилы с неизмененной морфологией, нейтрофилы с недифферинцированным ядром и НВЛ (таблица 1).

Анализ полученных данных показал, что для нейтрофилов чистой фракции все описанные методы окраски могут быть использованы для определения НВЛ.

После отработки методов окрашивания НВЛ в чистой фракции нейтрофилов, были проведены исследования с целью определения оптимальных условий культивирования нейтрофилов для выявления НВЛ. Для этого оценивали влияние температуры, длительности культивирования и различных индукторов на формирование внеклеточных ловушек нейтрофилами (таблица 2, 3, 4).

Таблица 1

Процентное содержание различных морфологических форм нейтрофилов при выбранных способах окраски

Способ окраски, вид микроскопии

Морфологические формы нейтрофилов (%)

Нейтрофилы с сегментирован-ным ядром

Нейтрофилы с недифференци-рованным ядром

Нейтрофильные внеклеточные ловушки

Акридиновый оранжевый, фиксированный препарат, люминесцентный микроскоп, n = 25

69,7 ± 1,31

23,2 ± 1,02

7,1 ± 0,46

Sytox Green, фиксированный препарат, люминесцентный микроскоп, n = 20

68,7 ± 1,21

23,6 ± 1,19

7,6 ± 0,62

Романовский-Гимзе, фиксированный препарат, световой микроскоп, n = 20

70,5 ± 1,14

23,1 ± 1,2

8,4 ± 0,48

Акридиновый оранжевый, нативный препарат, люминесцентный микроскоп, n = 25

67,4 ± 1,31

24,7 ± 1,18

7,8 ± 0,28

При анализе полученных данных было установлено, что процесс формирования НВЛ является температурозависимым: в диапазоне от 4 до 56С через 30 минут инкубации регистрируется закономерное увеличение частоты НВЛ в зависимости от повышения температуры. Минимальный выброс хроматина регистрируется при температуре 4С. Наибольшее количество внеклеточных ловушек, образованных нейтрофилами, было обнаружено при инкубации их в физиологическом растворе и с выбранными индукторами при температуре 56С. Стоит добавить, что достоверные отличия данного показателя, установлены при температуре 37С.

Таблица 2

Содержание внеклеточных ловушек, образованных нейтрофилами, выделенными из периферической крови при различном температурном режиме, (n = 15)

Группы

Температура, С

4

22

37

56

Нейтрофилы + физ. раствор

2,05 ± 1,12

7,20 ± 0,90*

8,70 ± 0,83*

28,00 ± 2,8

*/**/***

Нейтрофилы + ФМА

5,60 ± 0,78

13,7 ± 1,6*

22,20 ± 0,90

*/**

27,40 ± 0,80

*/**/***

Нейтрофилы + Candida albicans

(штамм 601)

7,40 ± 1,02

9,10 ± 0,81

25,00 ± 1,02

*/**

26,3 ±1,4

*/**

Примечание: p < 0,05

*  - отличие 4С от 22С, 37С, 56С,

**  - отличие  22С от 37С, 56С,

*** - отличие  37С, 56С.

Помимо температуры на образование внеклеточных ловушек влияет время инкубации нейтрофилов с индуктором. Нами были выбраны следующие временные интервалы: 10мин., 20 мин., 30 мин., 40 мин., 60 мин (таблица 3).

При анализе полученных данных установлено, что максимальное число НВЛ образуется через 30 и 40 мин., независимо от индуктора. При более длительной инкубации (60 мин.) число НВЛ значимо снижалось в сравнении со сроком инкубации 30 и 40 мин. Вероятно, это связано с разрушением НВЛ под действием ферментов, содержащихся в гранулах нейтрофилов.

Таблица 3

Содержание внеклеточных ловушек, образованных нейтрофилами, выделенными из периферической крови в зависимости от времени инкубации, (n = 15)

Группы

Время инкубации, минуты

10

20

30

40

60

Нейтрофилы + физ.раствор

3,20±0,53

4,90±0,35

8,70±0,83

*/**

8,60±0,91

*/**

5,80±0,36

*/***/#

Нейтрофилы + ФМА

5,60±0,70

15,3±1,3*

22,20±0,90

*/**

22,40±2,04*/**

17,0±1,4

*/***/#

Нейтрофилы + Candida albicans

(штамм 601)

5,40±0,43

17,20±0,81*

25,00±1,02

*/**

26,8±1,2

*/**

18,00±0,99

*/***/#

Примечание: p < 0,05

*  - отличие 10 мин. от 20 мин.,30 мин.,40 мин.,60 мин.

**  - отличие 20 мин. от 30 мин.,40 мин.,60 мин.

*** - отличие 30 мин. от 40 мин.,60 мин.

# - отличие 40 мин. от 60 мин.

Для того чтобы оценить влияние бактерий на формирование нейтрофильных внеклеточных ловушек были использованы культуры бактерий, обычно заселяющие слизистые оболочки человека непатогенные – Lactobacterium spp. и Bifidumbacterium spp., условно-патогенные грам-отрицательные – E. coli (штамм М-17), грам-положительные – S. aureus и грибы рода Candida. В качестве активатора немикробного происхождения - форбол-12-миристат-13-ацетат (ФМА). Помимо этого было оценено влияние на формирование внеклеточных ловушек нейтрофилами чистой фракции различных лекарственных средств, обладающих иммуномодулирующими свойствами (пирогенал, вакцина «Солкотриховак», циклоферон, бестим).

Полученные результаты представлены в таблице 4.

Таблица 4

Сравнительный анализ процентного содержания различных морфологических форм нейтрофилов, выделенных из периферической крови, при активации их различными индукторами, (n = 15)

Группы

Морфологические формы нейтрофилов, (%)

Нейтрофилы с сегментированным

ядром

Нейтрофилы с недифференциро-

ванным ядром

Нейтрофильные внеклеточные

ловушки

Нейтрофилы + физ. раствор

73,6 ± 0,93

20,0 ± 0,89

6,4 ± 0,68

Нейтрофилы + E. coli (штамм М-17)

67,6 ± 1,72*

17,6 ± 1,3*

14,8 ± 1,2*

Нейтрофилы + Lactobac-terium

spp.

62,8 ± 2,24*

20,8 ± 1,7

16,4 ± 1,7*

Нейтрофилы + Bifidobacterium spp.

65,9 ± 0,94*

19,2 ± 0,55

14,9 ± 0,62*

Нейтрофилы + S. aureus

(штамм 209)

68,1 ± 1,12*

18,40 ± 0,77*

13,4 ± 0,72*

Нейтрофилы + Candida albicans

(штамм 601)

57,1 ± 1,2*

17,90 ± 0,92*

25,00±1,02*

Нейтрофилы + ФМА

58,1 ± 1,4*

19,60 ± 0,76

22,2 ± 1,9*

Нейтрофилы + Пирогенал

54,4 ± 1,9*

21,1 ± 0,90

24,5 ± 1,66

Нейтрофилы + вакцина «Солкотриховак»

50,6±1,8*

26,2±1,9*

23,3±1,4*

Нейтрофилы + Циклоферон

51,0 ± 1,73*

26,1 ± 1,4*

22,5 ± 1,7*

Нейтрофилы + Бестим

60,2 ± 1,39*

18,60 ±0,74

21,20± 1,82*

Примечание: p < 0,05

*  - отличие контроля от выбранных индукторов

Анализ результатов показал, что все выбранные нами индукторы активируют нейтрофилы и индуцируют экструзию ДНК во внеклеточное пространство. Наиболее сильным из всех выбранных нами активаторов является Candida albicans (штамм 601).

Вероятно это связано с особенностями строения клеточной стенки грибов. Её основу образуют микрофибриллы, построенные из полисахаридов, главными из которых являются глюканы, маннаны и хитин [Маянский А.Н., 2006]. На поверхности нейтрофилов существует большое количество разнообразных рецепторов, в том числе манозные к мананам, дектин-1, лектин-подобный рецептор – для -глюканов [Bianchi M. еt аl., 2009; Yost C.C. еt аl., 2009].

Для более полного понимания механизмов формирования НВЛ было изучено участие цитоскелета, кальциевых каналов, энергетического обмена и мембран в данном процессе. Изменение формы клеток почти всегда предполагает участие цитоскелета. Функции нейтрофилов, такие как адгезия, миграция, фагоцитоз невозможны без участия актинового цитоскелета [Yan M еt аl., 2007]. Микротрубочки играют важную роль в транспорте клеточных органелл, включая лизосомы и гранулы, слиянии органелл с мембранами [Tapper H еt аl., 2002]. В связи с этим, представляло интерес определить роль цитоскелета в процессе формирования НВЛ. Для этого нейтрофилы, выделенные из периферической крови, инкубировали с цитохалазином (ЦХ), который является ингибитором актиновых филаментов или колхицином, который связывается с внутриклеточным белком тубулином в нейтрофилах, нарушает образование и функции микротрубочек. Для определения участия кальциевых каналов в процессе формирования НВЛ использовали верапамил – блокатор кальциевых каналов. Чтобы оценить роль энергетических процессов в формировании НВЛ использовали циклогексимид (ЦГ) – блокатор синтеза белка [Махрова Т.В., 2004; Свиридов М.А. 2008], а для выявления участия мембран в процессе формирования НВЛ использовали преднизолон, который обладает стабилизирующим действием на мембраны [Kawasaki S. et al., 1998; Wallwork B. et al., 2002] (таблица 5).

Установлено, что данные вещества блокируют формирование внеклеточных ловушек нейтрофилами, выделенными из периферической крови. На основании этого можно заключить, что микротрубочки, кальциевые каналы, энергетические процессы и мембрана участвуют в процессе формирования НВЛ.

Таблица 5.

Влияние цитохалазина, колхицина, верапамила, циклогексимида и преднизолона на формирование внеклеточных ловушек нейтрофилами, выделенными из периферической крови, (n = 15)

Группы

Морфологические формы нейтрофилов, %

Нейтрофилы с сегментированным ядром

Нейтрофилы с недифференциро-ванным ядром

Нейтрофильные внеклеточные ловушки

Контроль

К1

Нейтрофилы

+физ. раствор

64,33 ± 0,75

27,83 ± 1,01

7,67 ± 0,57

К2

Нейтрофилы

+ ЛПС

48,80±5,75**

23,40±3,34**

27,80±5,93**

Опыт

Нейтрофилы

+ ЛПС + ЦХ

77,20±4,91*

17,20±5,01*

5,40±2,52*

Нейтрофилы

+ ЛПС+

колхицин

75,60±5,41*

19,80±5,42*

4,6±1,08*

Нейтрофилы

+ ЛПС +

верапамил

84,20±5,88*

13,40±4,40*

2,40±1,60*

Нейтрофилы

+ ЛПС + ЦГ

71,40±9,78*

15,40±3,80*

13,20±6,22*

Нейтрофилы

+ ЛПС +

преднизолон

86,00±4,34*

11,00±2,83*

3,00±1,79*

Примечание: p < 0,05

*- отличие опыта от К1, К2

** - отличие К1 от К2

Механизм образования НВЛ до сих пор остается неясным, неизвестно когда происходят изменения цитоскелета при формировании НВЛ, каких внутриклеточных сигналов требует  гистоновая деиминация приводящая к изменениям цитоскелета [Neeli I. еt аl., 2009]. Можно предположить, что функция актиновых сетей в клетке может заключаться в том, чтобы выталкивать собственный хроматин через бреши в цитоплазматической мембране для формирования НВЛ.

Блокада кальциевых каналов приводит к снижению уровня внутриклеточного кальция, что, в свою очередь, нарушает процесс цитруллирования [Cuthbert G.L. еt аl., 2004; Proost P. еt аl., 2008; Remijsen Q. еt аl., 2011], за счет ингибирование PAD4, активация которого невозможна без участия кальция [Asaga H. еt аl., 2001; . Suzuki A. еt аl., 2004; Chang X. еt аl., 2005; Mastronardi F.G. еt аl., 2006; Anzilotti C. еt аl., 2010]. Необходимо отметить, что гистоновая цитруллинация является необходимым, но не единственным условием для формирования НВЛ [Neeli I. еt аl., 2008; Wang Y. еt аl., 2009].

Установлено, что преднизалон, блокирует образование внеклеточных ловушек нейтрофилами. По-видимому мембраностабилизирующее действие преднизолона на нейтрофил делает его невосприимчивым к внешним сигналам, а процесс формирования НВЛ может реализовываться только активными нейтрофильными гранулоцитами [Brinkmann V. еt аl., 2004].

На основании полученных нами результатов и имеющихся на сегодняшний день данных литературы [Brinkmann V. еt аl., 2004; Neeli I. еt аl., 2008; Wang Y. еt аl., 2009; Remijsen Q. еt аl., 2011] возможный механизм образования НВЛ может выглядеть следующим образом.

Процесс формирования НВЛ начинается с активации нейтрофила. Индукторы, в часности - трипептид формилметионил-лейцил-фенил-аланин (ФМЛФ) запускает НАФД-оксидазу, которая является клеточным мембрано-связанным мультимолекулярным ферментным комплексом, локализующимся на плазматической мембране и в некоторых органеллах. В тоже время, происходит активация протеинкиназы С (РКС), которая участвует в передаче широкого набора внешних сигналов. Это способствует образованию активных форм кислорода (АФК), которые, в свою очередь, индуцируют нейтрофильную эластазу и пептидил-аргинин-деиминазу – 4 (РАД-4), являющихся необходимыми для реализации цитруллинации, приводящей к деконденсации хроматина.

При индукции нейтрофилов активируется также другая сигнальная система - фосфатидилинозитол-3-киназа (PI3K) / серин-треонин киназа (АКТ) / серин треониновая протеинкиназа, мишень для рапамицина (mTOR), отвечающая за синтез белка, функцию микротрубочек и аутофагию, которые участвуют в дезинтеграции и разрыве мембраны.

Все перечисленные звенья занимают очень важное место в процессе формирования внеклеточных ловушек нейтрофилами и нарушение одного из этих звеньев блокирует образование НВЛ.

Нейтрофильные гранулоциты, содержащиеся в крови, тканях и на поверхности слизистых оболочек могут обладать не одинаковыми свойствами и отвечать по разному на действие различных индукторов. Изначально была исследована способность образовывать ловушки у нейтрофилов цельной крови без предварительного их выделения на градиенте плотности фиколла-верографина (таблица 6).

Установлено, что нейтрофилы, содержащиеся в цельной крови, не образуют НВЛ после активации их всеми исследуемыми индукторами. Было предположено, что при работе с цельной кровью концентрация микроорганизмов (1х108клеток/мл), которая обычно используется для активации клеток, предварительно выделенных из периферической крови могла быть недостаточной для индукции нейтрофилов, содержащихся в цельной крови.

Таблица 6

Оценка формирования внеклеточных ловушек нейтрофилами цельной крови, при активации их различными микроорганизмами, (n = 15)

Группы

Морфологические формы нейтрофилов, %

Нейтрофилы с сегментирован-ным ядром

Нейтрофилы с недифференциро-ванным ядром

Нейтрофильные внеклеточные ловушки

Цельная кровь + физ. раствор

85,2±1,38

8,68±0,83

5,9±1,02

Цельная кровь +

E. coli (штамм М-17)

84,49±1,6

9,02±0,81

6,38±0,7

Цельная кровь + Lactobacterium spp.

83,8±1,41

8,8±0,92

7,51±1,43

Цельная кровь + Bifidobacterium spp

83,92±0,9

9,42±0,6

7,2±0,63

Цельная кровь + S. аureus (штамм 209)

85,2±1,6

8,8±0,7

6,0±1,12

Цельная кровь +

C. albicans (штамм 601)

82,1±1,32

9,03±0,84

6,51±0,72

В связи с этим была изучена зависимость «доза-эффект», где в качестве активатора использовали C. albicans в концентрациях: 1х107/мл, 1х108/мл и 1х109/мл (таблица 7).

Установлено, что при увеличении количество микроорганизмов число ловушек, образующихся нейтрофилами цельной гепаринизированной крови, было таким же низким, как у неактивированных нейтрофилов и достоверно не отличалось ни в одной пробе, независимо от концентрации C. albicans. На основании полученных данных, можно сделать вывод, что нейтрофилы цельной крови в норме не образуют внеклеточные ловушки.

Учитывая результаты нашего исследования, было высказано предположение, что в цельной крови содержатся факторы, ингибирующие образование НВЛ. Для конкретизации факторов, содержащихся в цельной крови, ингибирующих формирование НВЛ, было проведено несколько серий экспериментов. Для исключения влияния на этот процесс эритроцитов, были проведены исследования с лейкоцитарной взвесью (таблица 8).

Таблица 7

Оценка формирования внеклеточных ловушек нейтрофилами цельной крови, при активации их C. albicans в различных концентрациях,

(n = 15)

Группы

Морфологические формы нейтрофилов, %

Нейтрофилы с сегментированным ядром

Нейтрофилы с недифференциро-ванным ядром

Нейтрофильные внеклеточные ловушки

Цельная кровь + физ. раствор

85,2±1,38

8,68±0,83

5,9±1,02

Цельная кровь + C.albicans,

1х107/мл

82,2±0,9

10,9±0,48

6,9±0,61

Цельная кровь + C.albicans,

1х108/мл.

82,1±1,32

9,03±0,84

6,51±0,72

Цельная кровь + C.albicans,

1х109/мл

85,0±1,72

9,1±0,93

5,9±0,69

Таблица 8

Оценка формирования внеклеточных ловушек нейтрофилами лейкоцитарной взвеси, при активации их C. albicans в различных концентрациях, (n = 15)

Группы

Морфологические формы нейтрофилов, %

Нейтрофилы с сегментированным ядром

Нейтрофилы с недифференциро-ванным ядром

Нейтрофильные внеклеточные ловушки

Лейкоцитарная взвесь +

физ. раствор

82,4±0,91

11,8±0,89

5,8±0,48

Лейкоцитарная взвесь + C.albicans,

1х107/мл

81,8±1,29

12,09±1,22

6,2±0,73

Лейкоцитарная взвесь + C.albicans,

1х108/мл.

82,1±1,44

11,7±1,61

6,2±0,64

Лейкоцитарная взвесь + C.albicans,

1х109/мл

81,9±1,76

11,8±1,71

6,3±0,66

Установлено, что седиментация эритроцитов не влияет на образование НВЛ. Следовательно ингибирующие факторы крови имеют гуморальную природу.

Учитывая важную роль комплемента и иммуноглобулинов в регуляции фагоцитирующей функции нейтрофилов [Азов Н.А., Маянский А.Н., 1985; Гомберг М.А. и др., 2000; Долгушин И.И., Бухарин О.В., 2001; Hussain L.F. et al., 1995; Reid M.F., 1995], важно было оценить влияние сыворотки, плазмы крови, а также комплемента и специфических иммуноглобулинов на формирование нейтрофилами внеклеточных ловушек (таблица 9).

Установлено, что аутологичные сыворотка и плазма крови in vitro оказывают стабилизирующее действие на нейтрофилы и способны блокировать формирование ими внеклеточных ловушек, даже при добавлении индуктора. Аутологичный комплемент не оказывает существенного влияния на процесс формирования НВЛ. Аутологичная сыворотка и плазма крови, независимо от присутствия в них специфических иммуноглобулинов, блокирует секрецию ДНК во внеклеточное пространство, нейтрофилами, выделенными из периферической крови.

Таблица 9

Оценка влияния аутологичных сыворотки, плазмы крови, комплемента и специфических иммуноглобулинов на формирование внеклеточных ловушек нейтрофилами, выделенными из периферической крови, (n = 15)

Группы

Морфологические формы нейтрофилов, %

Нейтрофилы с сегментирован-ным ядром

Нейтрофилы с недифференциро-ванным ядром

Нейтрофильные внеклеточные ловушки

Контроль

К1

Нейтрофилы

+физ. раствор

61,9 ± 1,31

24,81 ± 1,19

7,2 ± 0,18

К2

Нейтрофилы + C. albicans

51,7 ± 1,72

24,08 ± 1,31

26,29 ± 1,41

К3

Нейтрофилы + сыворотка крови

70,08 ± 0,69

22,71 ± 0,76

7,21 ± 0,89

К4

Нейтрофилы +плазма крови

76,01 ± 1,25

16,02 ± 0,71

7,82 ± 0,81

Опыт

Нейтрофилы + C. albicans +

сыворотка крови

68,07 ± 0,91**

24,20 ± 1,12

6,8 ± 0,42**

Нейтрофилы + C. albicans +

плазма крови

72,04 ± 1,93**

22,06 ± 1,58#

5,91 ± 0,77**

Нейтрофилы + C. albicans + сыворотка крови, прогретая при560С

67,01 ± 1,44**

25,23 ± 0,81

7,78 ± 0,68**

Нейтрофилы + C. albicans + плазма крови, прогретая при 560С

74,47 ± 0,47**

21,02 ± 0,68#

4,57 ± 0,37**

Нейтрофилы + C. albicans +

сыворотка крови, истощенная по специф.gG

69,2 ± 1,38**

24,01 ± 0,78

(К4*)

6,9 ± 0,81**

Нейтрофилы + C. albicans + плазма крови, истощенная по специф.gG

65,7 ± 2,49**

27,00 ± 2,41#

7,3 ± 0,71**

Примечание: p < 0,05

*- отличие опыта от К1

** - отличие опыта от К2,

*** - отличие опыта от К3

# - отличие опыта от К4

Гетерологичный комплемент усиливает выброс нейтрофильной ДНК во внеклеточное пространство, декомплементация сыворотки морской свинки приводит к ослаблению этого действия (таблица 10).

Таблица 10

Оценка формирования внеклеточных ловушек нейтрофилами, выделенными из периферической крови, при влиянии гетерогенного комплемента, (n = 15)

Группы

Морфологи

ческие формы

нейтрофилов, (%)

Опыт

Контроль

Нейтрофилы +

комплемент, прогретый при 56°С

Нейтрофилы +

физ. раствор

Нейтрофилы +

комплемент 400 МЕ/мл

Нейтрофилы с сегментированным ядром

42,1 ± 1,21*

61,9 ± 1,31

6,4 ± 0,91**

Нейтрофилы с недифференцированным ядром

29,3 ± 1,49*

24,81 ± 1,19

19,5 ± 1,68**

Нейтрофильные внеклеточные ловушки

28,6 ± 1,58*

7,2 ± 0,18

74,1 ± 1,87**

Примечание: p < 0,05

*- отличие опыта от контроля

** - отличие контролей между собой

Это позволяет предполагать, что усиливающий эффект сыворотки морской свинки в этих опытах может быть связан не только с действием белков системы комплемента, но и с эффектом любого гетерогенного белка.

При проведении сравнительного анализа способности нейтрофильных гранулоцитов к фагоцитозу C. albicans (штамм 601) – контрольного образца и C. albicans (штамм 601), предварительно опсонизированной специфическими IgG (таблица 11), установлено, что контрольный образец Candida albicans (штамм 601) и опсонизированная Candida albicans (штамм 601) по-разному фагоцитируются нейтрофилами. В пробах с опсонизированной Candida albicans (штамм 601) было отмечено значительное увеличение всех показателей фагоцитарной функции нейтрофилов. Таким образом, специфические иммуноглобулины не обладают опсоническим действием на формирование НВЛ, в то же время, очевидно стимулирующее влияние опсонинов на фагоцитарную активность нейтрофилов.

Таблица 11

Оценка влияния опсонизированной C. albicans и контрольного образца C. albicans (штамм 601) на способность к фагоцитозу нейтрофилов, выделенных из периферической крови, (n = 15)

Показатели фагоцитоза

Вид микроорганизма

Контрольный образец C. albicans

Опсонизированная

C. albicans

Активность фагоцитоза

(%)

46,05 ± 0,98

75,91± 2,76*

Интенсивность фагоцитоза

(у.е.)

0,98 ± 0,06

4,18 ± 0,24*

Фагоцитарное число

(у.е.)

2,22 ± 0,08

5,58 ± 0,21*

Примечание: p < 0,05

*- отличие контрольный от опсонизированного образца Candida albicans (штамм 601)

По-видимому, присутствие в крови ингибиторов образования НВЛ имеет огромный биологический смысл – образование нейтрофильных внеклеточных ловушек не должно происходить в кровяном русле, поскольку может привести к окклюзии мелких сосудов хлопьями ДНК. Это не противоречит данным других исследователей, которые не регистрировали повышение формирования НВЛ в печеночных синусах, за исключением случая выраженной эндотоксемии [Clark S.R. et аl., 2007].

Нейтрофилы из периферической крови мигрируют в ткани и в секреты слизистых оболочек, где и осуществляют свои основные функции. Образование НВЛ - это механизм защиты, работающий в тканях и на поверхности слизистых оболочек. Скорее всего, формирование внеклеточных ловушек является одним из важных механизмов участия нейтрофила в противоинфекционной защите именно слизистых оболочек [Долгушин И.И., Бухарин О.В., 2001].

На сегодняшний день не разработаны методы определения НВЛ в мукозальных секретах. Технические приемы, используемые для детекции ловушек, образованных нейтрофилами крови не могут быть применены при работе с секретами слизистых оболочек. Главное препятствие заключается в том, что существующие методы не позволяют дифференцировать нейтрофильную ДНК от слизи.

В связи с вышеизложенным, возникла необходимость разработки метода обнаружения НВЛ в секретах слизистых оболочек. Сущность предлагаемого нами способа окраски заключается в одновременном использовании двух красителей: селективного красителя Sytox Green [Invitrogen, США] для окрашивания внеклеточных волокон ДНК и ядер погибших клеток и синьки Эванса для фонового окрашивания нативного препарата (живые клетки и слизь). При этом можно провести количественную оценку жизнеспособности нейтрофилов, так как при данном способе клетки окрашиваются дифференцированно - погибшие клетки и внеклеточная ДНК - в зеленый цвет за счет Sytox Green, а живые клетки и слизь - в оранжевый цвет синькой Эванса.

Разработанный нами метод окраски позволяет оценить все морфологические формы нейтрофильных гранулоцитов, идентифицировать НВЛ от слизи, которая присутствует в мукозальных секретах, а также определить не только количество захваченных микроорганизмов неизмененными нейтрофилами и НВЛ, но и эффективность их киллинга.

Установлено, что активность НВЛ достоверно выше активности фагоцитоза, а среднее количество микроорганизмов, попавших в нейтрофильную внеклеточную ловушку, значительно превышает количество микробов, захваченных активным нейтрофилом с неизмененной морфологией. При оценке жизнеспособности C. albicans (штамм 601), захваченных нейтрофильными гранулоцитами и НВЛ, установлено, что внеклеточный киллинг микроорганизмов значительно выше, чем фагоцитоз.

Таким образом, разработанный метод расширяет возможности изучения функционального статуса нейтрофильных гранулоцитов, как одного из главных звеньев врожденного иммунитета, и позволяет сравнить эффективность внутриклеточного и внеклеточного механизма уничтожения патогенов нейтрофилами.

В ходе нашего исследования по изучению НВЛ были использованы микроскопические методы их обнаружения. Наше внимание привлек тот факт, что НВЛ могут иметь различную морфологию. Представляло интерес исследовать взаимосвязь между эффективностью НВЛ и ее морфологическими характеристиками. Для уточнения этого вопроса при оценке морфологии НВЛ с помощью программы Видеотест – Морфология 5.1. (Санкт-Петербург), учитывали следующие параметры: площадь, периметр, длину, ширину, средний размер, оптическую плотность, изрезанность, а также определяли эффективность НВЛ. Основываясь на этих данных, был рассчитан «средний» процент эффективности НВЛ, т.е. показатель, характеризующий способность НВЛ инактивировать C. albicans, он составил 68,94 %. Условно мы разделили НВЛ на высокоэффективные, в которых погибало более 70 %, из захваченных микроорганизмов и менее эффективные, которые инактивировали меньше 70 %, от общего числа поглощенных C. albicans. На основании проведенных исследований была установлена зависимость эффективности ловушек от морфологических показателей НВЛ (таблица 12).

Из таблицы следует, что при увеличении размера и изрезанности, а также уменьшении оптической плотности НВЛ, ее эффективность снижается.

Таблица 12

Сравнительный анализ морфологических показателей нейтрофильной внеклеточной ловушки, в зависимости от ее эффективности

Показатели

Нейтрофильные внеклеточные ловушки

Высокоэффективные НВЛ (n = 130)

Менее эффективные НВЛ (n = 70)

Площадь, µm*µm

136,42±18,86

140,65±27,51

Периметр, µm

58,35±3,26

100,41±6,77*

Длина, µm

18,85±1,15

29,98±2,14*

Ширина, µm

13,00±0,88

13,35±2,12

Средний размер, µm

15,93±0,82

21,67±1,01*

Оптическая плотность, у.е.

0,42±0,06*

0,27±0,01

Изрезанность, у.е.

0,13±0,02

0,27±0,04*

Примечание: p < 0,05

*- отличие высокоэффективных от менее эффективных НВЛ

Таким образом, проведенные нами исследования свидетельствуют о том, что внеклеточный механизм уничтожения микроорганизмов с помощью внеклеточных ДНК-овых сетей является функцией не только альтернативной фагоцитозу, но и более эффективной.

Следующей задачей нашей работы, была клиническая апробация методов обнаружения НВЛ, разработанных на экспериментальных моделях.

Одну из таких клинических групп составили пациенты с с сепсисом, развившимся на фоне гнойной хирургической инфекции.

НВЛ определяли не в популяции нейтрофилов, предварительно выделенных из периферической крови, а в нефракционированной цельной крови.

Полученные данные свидетельствуют о том, что при сепсисе, в отличие от здоровых пациентов, в крови обнаруживается значительное количество НВЛ (таблица 13).

Таблица 13

Содержание различных морфологических форм нейтрофилов в периферической крови в норме и при патологии, (M ± m)

Морфологические формы нейтрофилов, %

Группы

Здоровые

n = 10

Больные сепсисом

n = 13

Нейтрофилы с сегментоядерным ядром

92,60 ± 0,81

56,40 ± 2,29*

Нейтрофилы с недифференцированным ядром

5,00 ± 0,71

19,0 ± 1,0*

Нейтрофильные внеклеточные ловушки

2,40 ± 0,51

24,60 ± 1,51*

Примечание: р<0,05;

*- отличие группы здоровых от группы больных сепсисом

Эти данные согласуются с результатами, полученными другими авторами у больных с септическим артритом и полиорганной недостаточностью.

Важно было оценить эффективность разработанного нами метода обнаружения НВЛ в мукозальных секретах при воспалительных процессах. Среди воспалительных заболеваний репродуктивного тракта женщин наиболее часто встречающейся формой является цервицит [Русакевич П.С., 2000; Серов В.Н., Прилепская Л.А., 2000].

Многочисленные исследования [Ларсен Б., 1988; Медведев Б.И., Долгушина В.Ф., 1993; Дергачева Т.И. и др., 1999; Кира Е.Ф., 2001; Гольцфарб В.М., 2005; Андреева Ю.С., 2005; Батурина И.Л., 2010; Орнер И.Ю., 2010] по изучению механизмов антимикробной резистентности слизистых оболочек показывают, что именно нарушения в локальном иммунном комплексе этих барьерных тканей во многом предопределяют исходы воспалительного процесса, а возникающие при этом взаимосвязанные нарушения мукозального иммунитета способствуют рецидивирующему течению и хронизации воспалительного процесса [Кононов А.В., 1999; Смольникова Л.А., 1999; Сахарова В.В., 2000; Новиков А.И., 2002].

Полученные в работах В.Ф. Долгушиной (1991) и Л.Ф. Телешевой (2000) данные во многом вносят ясность в понимание взаимосвязи факторов системного и местного иммунитета при воспалительных заболеваниях гениталий. Проведенные исследования свидетельствуют о присутствии в цервикальной и вагинальной слизи женщин с генитальной инфекцией иммуноглобулинов, цитокинов, компонентов комплемента, лизоцима, реактантов острой фазы, а также функционально активных нейтрофильных гранулоцитов.

В связи с вышеизложенным интересно было оценить помимо фагоцитарной функции, способность к образованию НВЛ у нейтрофильных гранулоцитов мукозальных секретов.

Было установлено, что воспаление нижнего отдела гениталий, приводит к повышенному выделению хроматина нейтрофильными гранулоцитами секретов слизистых оболочек репродуктивного тракта женщин. Эти результаты подтверждают данные других авторов об образовании внеклеточных ловушек нейтрофилами мукозальных секретов. В частности, в мокроте у больных с муковисцидозом содержится большое количество внеклеточных сетей [Lee W.L., Grinstein S. et al, 2004; Wartha F et al, 2007]. Терапия ингаляционными препаратами, содержащим ДНК-азу, уменьшает симптомы муковисцидоза и улучшает легочную функции [Fuchs H.J. et al, 1994].

Полученные результаты позволяют утверждать, что разработанные нами методы доступны и просты в исполнении и могут быть использованы для более полной оценки функционального статуса нейтрофильных гранулоцитов в клинической лабораторной диагностике.

В работе также представлены результаты разработки новых методов обнаружения НВЛ: в агарозном геле и на спектрофотометре. Для метода обнаружения НВЛ в агарозном геле мы преследовали цель создать для нейтрофилов, выделенных из периферической крови на двойном градиенте фиколла-верографина, условия приближенные к среде слизистых оболочек. В геле хрупкие и быстро разрушающиеся структуры НВЛ способны сохраняться длительное время. Разработанный способ обнаружения НВЛ в агарозном геле имеет существенные преимущества перед другими методами, так как образованные внеклеточные ловушки нейтрофилами, выделенными из периферической крови и помещенными в гель агарозы, сохраняются в течение всего времени исследования, в то время как в растворе происходит разрушение НВЛ под действием содержимого гранул нейтрофила. Это позволяет более полно оценить кинетику процесса формирования внеклеточных сетей нейтрофильными гранулоцитами.

Нами был разработан также аппаратный метод индикации нейтрофильной ДНК в цельной периферической крови с использованием спектрофотометра. Анализ полученных данных показал, что количество внеклеточной ДНК, которое определяли в периферической крови у больных сепсисом, в два раза превышает ее уровень у здоровых пациентов, при этом, данные о количестве внеклеточной ДНК, полученные на спектрофотометре, совпадают с результатами микроскопического учета числа НВЛ. После доработки этот метод можно будет использовать для определения НВЛ в клинической практике.

Таким образом, образование нейтрофильных внеклеточных ловушек – является важной функцией нейтрофилов, которая наряду с эндоцитозом во многом определяет эффективность антимикробных реакций этих клеток. Обнаружение НВЛ в различных биологических жидкостях организма с помощью разработанных методов может позволить более полно оценить состояние врожденного иммунитета, и открывает перспективы для диагностики различных патологических состояний и тяжести их течения.

ВЫВОДЫ

  1. Методы окраски по Романовскому-Гимзе, акридиновым оранжевым и с помощью Sytox green позволяют определить внеклеточные ДНК-ловушки, образованные нейтрофилами, выделенными из периферической крови.
  2. Оптимальным режимом инкубации нейтрофилов, выделенных из периферической крови, для формирования внеклеточных ловушек, является температура – 37°С, длительность инкубации – 30 мин.
  3. Экзогенные факторы микробной природы (Lactobacterium spp.; Bifidumbacterium spp.; Escherichia coli (штамм М-17); Staphylococcus аureus; Candida albicans (штамм 601)), факторы немикробной природы (форбол-миристат-ацетат) и иммунологические препараты (пирогенал, вакцина «Солкотриховак», циклоферон, бестим) индуцируют формирование in vitro внеклеточных ловушек нейтрофилами, выделенными из периферической крови. Наиболее сильным индуктором нейтрофильных внеклеточных ловушек из исследуемых микроорганизмов являются Candida albicans (штамм 601).
  4. В периферической крови здоровых людей имеются гуморальные факторы, подавляющие образование внеклеточных ловушек нейтрофилами у здоровых людей. Аутологичная плазма и сыворотка крови, истощенные по антителам и инактивированные при температуре 56С, сохраняют свойства подавлять формирование НВЛ. Аутологичные эритроциты, комплемент и иммуноглобулины существенно не влияют на процесс образования нейтрофильных внеклеточных ловушек.
  5. Инкубация нейтрофилов с блокаторами цитоскелета (цитохалазином и колхицином), кальциевых каналов (верапамилом), синтеза белка (циклогексидином) и с мембраностабилизирующими препаратами подавляет формирование нейтрофильных внеклеточных ловушек.
  6. Одновременное использование двух красителей (синьки Эванса и Sytox green) позволяет идентифицировать нейтрофильные внеклеточные ловушки в мукозальных секретах, дифференцировать ДНК нейтрофилов от слизи, а также учитывать активность и эффективность фагоцитоза и внеклеточного захвата микроорганизмов нейтрофильными ловушками.
  7. Разработанный метод определения нейтрофильных внеклеточных ловушек в агарозном геле, позволяет длительно сохранять хрупкие волокна нейтрофильной ДНК, а спектрофотометрический метод дает возможность оптимизировать и упростить учет результатов исследования.
  8. Формирование нейтрофильных внеклеточных ловушек является защитным эффективным механизмом. Количество микроорганизмов, захваченных и убитых нейтрофильной внеклеточной ловушкой превосходит аналогичные показатели при фагоцитозе. Эффективность нейтрофильных внеклеточных ловушек зависит от их размера, оптической плотности и изрезанности.
  9. Разработанные методы обнаружения нейтрофильных внеклеточных ловушек могут быть использованы в клинической практике для оценки функционального статуса нейтрофилов.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

  1. Определение внеклеточных ловушек, образованных нейтрофилами, выделенными из периферической крови, рекомендуется  использовать для оценки функционального статуса нейтрофильных гранулоцитов  пациентов.
  2. Окрашивание препаратов можно проводить по Романовскому-Гимзе, акридиновым оранжевым и с помощью Sytox green, в зависимости от реактивов и оборудования, имеющегося в лаборатории.
  3. Для оценки эффективности фагоцитоза и нейтрофильных внеклеточных ловушек рекомендуется использовать метод с применением двух красителей: синьки Эванса и Sytox green.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

  1. Долгушин, И.И. Нейтрофилы регулируют формирование микробиоценоза слизистых оболочек/ И.И. Долгушин, Ю.С. Андреева, Е.А. Мезенцева, А.Ю. Савочкина, Е.В. Плеханова, М.А. Свиридов, М.В Пешикова // Медицинская иммунология. 2006. Т. 8, № 2-3. С. 135-136.
  2. Телешева, Л.Ф. Некоторые показатели иммунной системы у женщин с пороками развития плода / Л.Ф. Телешева, Никушкина К.В., Блинов А.Ю., Савочкина А.Ю., Тупиков В.А., Мезенцева Е.А. // Материалы конференции, посвященной 25-летию ЦНИЛ ЧелГМА “Новые лабораторные технологии в диагностике и лечении заболеваний человека”. — Челябинск, 2006. — С. 144 – 146.
  3. Савочкина, А.Ю. Сравнительный анализ уровня пероксидазы нейтрофилов периферической крови и цервикальной слизи / А.Ю. Савочкина, Ю.С. Андреева, Е.В. Плеханова // Материалы IX съезда всероссийского науч.-практ. о-ва эпидемиологов, микробиологов и паразитологов: в 3-х т. – М.: Санэпидмедиа, 2007. – Т. 2. – С.129.
  4. Долгушин, И.И. Влияние нейтрофилов и продуктов их секреции на факторы, участвующие в формировании колонизационной резистентности  / И.И. Долгушин, Ю.С. Андреева, М.А. Свиридов, А.Ю. Савочкина, Е.А. Мезенцева, Е.В. Плеханова, А.Н. Скороходов, В.В. Чванов, Л.Ф. Телешева, С.И. Марачев, Д.Н. Матвеева, В.А.Тупиков // Медицинская иммунология.   2007. Т. 9, № 2-3. С. 133-134.
  5. Долгушин, И.И. Нейтрофильные гранулоциты слизистых оболочек / И.И. Долгушин, Ю.С. Андреева, Е.А. Мезенцева, Е.В. Плеханова,  А.Ю. Савочкина, М.А. Свиридов, Д.Н. Матвеева // Российский иммунологический журнал. 2008. Т. 2 (11), № 2-3. С. 246.
  6. Долгушин, И.И. Определение роли представителей флоры генитального тракта здоровых женщин в индукции апоптоза нейтрофилов / И.И. Долгушин, Ю.С. Андреева, Е.В. Плеханова, А.Ю.Савочкина // Российско-чешский медицинский форум: сб. науч. тр. – Челябинск, 2008. – С. 53-55.
  7. Долгушин, И.И. Формирование микробиоценоза слизистых оболочек контролируется нейтрофилами / И.И. Долгушин, Ю.С.Андреева, М. А. Свиридов, Е.А. Мезенцева, А.Ю. Савочкина // Российский аллергологический журнал. 2008. №1, прил. 1. С. 94-95.
  8. Долгушин, И.И. Нейтрофильные ловушки / И.И. Долгушин, Ю.С. Андреева, А. И. Рыжкова, Е.А. Мезенцева, Е.В. Плеханова,  А.Ю. Савочкина, М.А. Свиридов, Д.Н. Матвеева, А.Н. Скороходов // Российский иммунологический журнал. 2008. Т.2(11), №2-3. С. 127.
  9. Савочкина, А.Ю. Иммунологические показатели в диагностике воспалительных заболеваний репродуктивного тракта женщин / А.Ю. Савочкина, Ю.С. Андреева, И.И. Долгушин, Л.Ф. Телешева, Е.А. Мезенцева, К.В. Никушкина, О.С. Абрамовских, Е.В. Плеханова, М.А. Свиридов, С.И. Марачев, А.И. Рыжкова // Вестник новых медицинских технологий. 2009. № 1. С. 77-79.
  10. Андреева, Ю.С. Грибы рода Candida стимулируют образование нейтрофильных внеклеточных ловушек / Ю.С. Андреева, И.И. Долгушин, А.Ю. Савочкина, А.И. Рыжкова  // Медицинская иммунология.   2009. Т. 11, № 4-5. С. 301.
  11. Савочкина, А.Ю. Использование иммунологических показателей в дифференциальной диагностике хронических воспалительных заболеваний репродуктивного тракта женщин / А.Ю. Савочкина, Ю.С. Андреева, Л.Ф. Телешева, С.И. Марачев, В.Ф. Долгушина // Вестник Уральской академической науки.   2009. № 2/1. С. 292-293.
  12. Савочкина, А.Ю. Методы определения и биологическая роль нейтрофильных ловушек / А.Ю. Савочкина, Ю.С. Андреева, И.И. Долгушин // Вестник Уральской академической науки.   2009. № 2/1. С. 335-336.
  13. Андреева, Ю.С. Солкотриховак стимулирует образование нейтрофильных внеклеточных ловушек / Ю.С. Андреева, А.Ю. Савочкина, И.И. Долгушин // Вестник Уральской академической науки. 2009. № 2/1. С. 196-197.
  14. Андреева, Ю.С. Нейтрофильные внеклеточные ловушки образуются in vitro под действием циклоферона / Ю.С. Андреева, А.Ю. Савочкина, И.И. Долгушин, А.И. Рыжкова // Вестник Уральской академической науки. 2009. № 2/1. С. 14-15.
  15. Долгушин, И.И. Влияние вакцины Солкотриховак на образование нейтрофильных внеклеточных ловушек / И.И. Долгушин, Ю.С. Андреева, А.И. Рыжкова, А.Ю. Савочкина, Е.А. Мезенцева, К.В. Никушкина, О.С. Абрамовских, С.И. Марачев, Д.Н. Матвеева // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 2009. № 4. С. 53-55.
  16. Мезенцева, Е.А. Влияние непатогенных и условно-патогенных представителей нормофлоры слизистых оболочек на секрецию нейтрофилами антимикробных продуктов и цитокинов / Е.А. Мезенцева, Ю.С. Андреева, И.И. Долгушин, А.Ю. Савочкина, К.В. Никушкина, О.С. Абрамовских, Е.В. Плеханова, М.А. Свиридов, С.И. Марачев, А.И. Рыжкова // Вестник новых медицинских технологий. 2009. Т. XVI, № 2. С. 16-17.
  17. Долгушин, И.И. Бактерии стимулируют образование нейтрофильных внеклеточных ловушек: материалы X Международного конгресса «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии» / И.И. Долгушин, Ю.С. Андреева, А.Ю. Савочкина // Казань. – 2009. – С. 282.
  18. Рыжкова, А.И. Влияние различных концентраций препарата «Солкотриховак» на образование нейтрофильных внеклеточных ловушек / А.И. Рыжкова, И.И. Долгушин, Ю.С. Шишкова, А.Ю. Савочкина // Материалы VII итоговой науч.-практ.  конф. молодых ученых ЧелГМА. – Челябинск,  2009. – С. 115-117.
  19. Рыжкова, А.И. Образование нейтрофильных внеклеточных ловушек в чистой фракции нейтрофилов и в цельной крови под влиянием грибов рода Candida / А.И. Рыжкова, Ю.С. Шишкова, А.Ю. Савочкина // Материалы VII итоговой науч.-практ.  конф. молодых ученых ЧелГМА. - Челябинск,  2009. – С. 117-120.
  20. Долгушин, И.И. Нейтрофильные ловушки: методы определения, биологическая роль / И.И. Долгушин, Ю.С.Андреева, А.Ю. Савочкина, А.И. Рыжкова, В.А. Маркова, Н.А. Васильева // Медицинская наука и образование Урала. 2009. № 3. С. 10-12.
  21. Шишкова, Ю.С. Влияние препарата «Пирогенал» на образование нейтрофильных внеклеточных ловушек / Ю.С. Шишкова, А.Ю. Савочкина, А.И. Рыжкова, Е.А. Мезенцева // Медицинская наука и образование Урала. 2009. № 3. С. 23-25.
  22. Долгушин, И.И. Методы обнаружения нейтрофильных ловушек / И.И. Долгушин, Ю.С.Шишкова, А.Ю. Савочкина // Аллергология и иммунология. 2009. Том 10, № 3. С. 458-462.
  23. Долгушин, И.И. Методы оценки функционального статуса нейтрофилов / И.И. Долгушин, Ю.С.Шишкова, А.Ю. Савочкина, Л.Ф. Телешева, В.Ф. Долгушина // Челябинск: Изд-во «Челябинская государственная медицинская академия», 2009. – 106 с.
  24. Савочкина, А.Ю. Сравнительный анализ внутри- и внеклеточного захвата нейтрофилами периферической крови Candida albicans в зависимости от опсонизации специфическими антителами Ig G / А.Ю. Савочкина, И.И. Долгушин, А.И. Рыжкова, Ю.С. Шишкова // Вестник Уральской медицинской академической науки. 2010.   №2/1 (29). С.30-31.
  25. Долгушин, И.И. Влияние плазмы и сыворотки на формирование нейтрофильных внеклеточных ловушек / И.И. Долгушин, А.И. Рыжкова, А.Ю. Савочкина, Ю.С. Шишкова, М.А. Свиридов, К.В. Никушкина, Т.Г. Бондаренко // Вестник Уральской медицинской академической науки. 2010.   №2/1 (29). С.68-69.
  26. Долгушин, И.И. Технологии определения и роль нейтрофильных внеклеточных ловушек в антимикробной защите / И.И. Долгушин, Ю.С. Шишкова, А.Ю. Савочкина, А.И. Рыжкова, И.В. Курносенко, В.П. Евтушенко // Вестник РАМН. 2010. № 4. С. 26 30.
  27. Долгушин, И.И. Влияние вакцины «солкотриховак» на неспецифические факторы защиты репродуктивного тракта женщин / И.И. Долгушин, А.И. Рыжкова, А.Ю. Савочкина // Российский иммунологический журнал. 2010. Т.4 (13), № 4. С. 431-432.
  28. Бондаренко, Т.Г. Влияние эстрадиола на способность нейтрофилов к образованию внеклеточных ловушек / Т.Г. Бондаренко, А.Ю. Савочкина, Ю.С. Шишкова, Пегушина И.В. // Вестник Уральской медицинской академической науки. 2011.   №2/1 (35). С.14-15.
  29. Маркова, В.А. Формирование внеклеточных ловушек нейтрофилами слюны у здоровых женщин / В.А. Маркова, И.И. Долгушин, А.Ю. Савочкина, Ю.С. Шишкова // Вестник Уральской медицинской академической науки. 2011.   №2/1 (35). С.44-45.
  30. Бондаренко, Т.Г. Влияние эстрадиола на способность нейтрофилов и моноцитов к образованию внеклеточных ловушек / Т.Г. Бондаренко, А.Ю. Савочкина, Ю.С. Шишкова // Материалы II Международной (IХ итоговой) научно-практической конференции молодых ученых. – 2011. – С. 22-24.
  31. Долгушин, И.И. Нейтрофильные ловушки и методы оценки функционального статуса нейтрофилов / И.И. Долгушин, Ю.С.Андреева, А.Ю. Савочкина – М.: Издательство РАМН, 2009. – 208 с.
  32. Пат. № 2431836 Рос. Федерация Способ выделения нейтрофильных гранулоцитов из периферической крови / И.И. Долгушин, А.И. Рыжкова, А.Ю. Савочкина, Ю.С.Андреева (Российская Федерация). - № 2010105891; заявл. 18.02.2010; опубл. 20.10.2011, Бюл. № 29. 5с.
  33. Маркова, В.А. Формирование внеклеточных ловушек активированными и неактивированными нейтрофилами слюны у здоровых женщин в I и II фазу менструального цикла / В.А. Маркова, А.Ю. Савочкина, И.В. Пегушина, Ю.С. Шишкова // Вестник Уральской медицинской академической науки. 2011.   №4/1 (38). С.141.
  34. Смирнова, Т.Г. Образование внеклеточных ловушек нейтрофилами, выделенными из периферической крови, под влиянием эстриола / Т.Г. Смирнова, А.Ю. Савочкина, И.И. Долгушин, Ю.С. Шишкова // Вестник Уральской медицинской академической науки. 2011.   №4/1 (38). С.152-153.

На правах рукописи

САВОЧКИНА

Альбина Юрьевна

НЕЙТРОФИЛЬНЫЕ ВНЕКЛЕТОЧНЫЕ ЛОВУШКИ:

МЕХАНИЗМЫ ОБРАЗОВАНИЯ, МЕТОДЫ ОБНАРУЖЕНИЯ,

БИОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ

14.03.09 – клиническая иммунология, аллергология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

доктора медицинских  наук

Челябинск – 2012

Подписано в печать  --.--.2012 г. Отпечатано в типографии  ПРИНТМЕД

--.--.2012 г. Формат 6084 1/16.  Гарнитура Times New Roman Cyr. Бумага офсетная. Печать на ризографе. Объем 2 усл. п.л. Тираж 100 экз.




© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.