WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

 

На правах рукописи

РАЕВ

Михаил Борисович

НЕИНСТРУМЕНТАЛЬНЫЕ ИММУНОДИАГНОСТИЧЕСКИЕ СИСТЕМЫ

НА ОСНОВЕ УГЛЕРОДНЫХ НАНОЧАСТИЦ

14.00.46 клиническая лабораторная диагностика,

14.00.36 аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Санкт-Петербург 2008

Работа выполнена в Институте экологии и генетики микроорганизмов

Уральского Отделения Российской академии наук, г. Пермь

Научные консультанты:

академик РАН, академик РАМН,

д.м.н., профессор  Черешнев Валерий Александрович

доктор медицинских наук Шмагель Константин Владимирович        

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук  профессор  Зыбина Наталья Николаевна

доктор медицинских наук профессор Серебряная Наталья Борисовна

доктор медицинских наук профессор Климович Владимир Борисович

Ведущая организация:

ГОУ ВПО Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И.П.Павлова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию МЗСР РФ

Защита состоится «24» апреля 2008  г. в 14.00 часов на заседании диссертационного совета Д 205.001.01 при Федеральном государственном учреждении здравоохранения «Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины  имени  А.М. Никифорова» МЧС России  (194044, Санкт-Петербург, ул. Лебедева, 4/2)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного учреждения здравоохранения «Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины имени А.М. Никифорова» МЧС России (194044, Санкт-Петербург, ул. Лебедева, 4/2).

Автореферат разослан «___» _____________2008 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

д.м.н.  профессор                                                                 Алексанин  С.С.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В современной аналитической практике разрабо­тан ряд методов иммуноанализа, каждый из которых условно можно разделить на три стадии: формирование специфического комплекса антиген-анти­тело, введение в него метки и ее регистрация тем или иным спо­собом. К таким методам можно отнести радиоиммунологический ана­лиз [Yallow, Berson, 1959], иммуноферментный анализ [Engvall, Perlmann, 1971, 1972, Weemen, Schuurs, 1971, Rubinstein et al., 1972], био- и хемилюминесцентные иммуноанализы [Woodhead, Weeks, 1985, Ullman et al., 1996], флюориметрический анализ [Frank, 1978, Frengen et al., 1993] и его микрообъемные модификации [Swartzmann et al., 1999, Zuck et al., 1999, Martens et al., 1999], анализ проточной цитометрией [Fulwyler, 1976, Cook, Irving, 1989, Frengen et al., 1993, McHugh, 1994]. Все перечисленные методы обладают рядом положительных качеств: универсальностью, т.е. позволяют определять любое соединение, против которого воз­можно получить специфические антитела, избирательностью и специ­фичностью, высокой чувствительностью. Однако наряду с досто­инствами, у них есть некоторые недостатки. В частности, опасность для здоровья, связанная с использованием изотоп­ных меток в радиоиммунологических исследованиях (РИА), токсичные и канцерогенные свойства хромогенных субстратов, применяемых в иммуноферментном анализе (ИФА). Кроме того, ряд методов зависит от сложной и дорогостоящей регистрирующей аппаратуры, обладает трудоемкостью и относительной длительностью исполнения (РИА, хемилюминесцентный и флуоресцентный, анализы, проточная цитометрия).

К настоящему времени достаточно хорошо известны системы анализа с прямым мечением специфичных по отношению к определяемому веществу (лиганду) аффинных соединений (ан­ти-лигандов) оптически плотными частицами или  цветными полимерами различной природы и размеров. Среди таких меток следует отметить латексы, в том числе цветные [Remington et al., 1983, Bangs, 1987, 1996, Lin You-chu et al., 1989, Gerber et al., 1990, Tarcha et al., 1990], эритроциты [Guesdon, Avrameas, 1980, Плаксин, 1986], неметаллические коллоиды серы, селена, теллура [Spallholz, 1982, Yost et al, 1989, Russel et al, 1989], оксиды металлов [Akzo, 1980, Zelikman, Hjerten, 1988], полимеризованные коллоидные красители, [Snowden, Hommel, 1991], гидрофобные красители [Gribnau et al., 1985, Anderson, 1988, Rounds, 1988], коллоидное золото [Moeremans et al., 1984, Egger, Bienz, 1987., Roth, Heitz, 1989, Chakraborty at al., 1990, Martin et al., 1990]. Использование данных меток позволяет визуально определять присутствие лиганда как в гомогенных системах анализа (без раз­деления реагирующих компонентов), так и в многочисленных гете­рогенных системах. К первой группе можно отнести агглютинацию до­вольно крупных частиц (с размерами от 0,2 до нескольких микро­метров) или изменение спектральных характеристик (цвета) специ­фически агглютинирующих коллоидов. Ко второй – системы, основанные на эритроиммуноадсорбции и, более широко, на седиментационно-адсорбционном (иммуно)анализе; дот-, Вестерн-, Сау­зерн-, Нозерн-блоттинге; иммуно- и гибридофильтрации (flow-through анализах), иммунохроматографии (иммуномиграции) и ряде других процедурных аранжировках, результат которых оценивают по окрашиванию зоны специфического связывания лиганда на непористом или пористом твердофазном носителе. Несмотря на возможность количественной регистрации с использованием простых колориметров, рефлектометров, денситометров, основным преи­муществом перечисленных методов является прямое визуальное опре­деление лиганда, что условно выделяет их в группу так называемых безинструментальных методов.

Основными недостатками отмеченных методов являются неудовлетворительная надежность систем анализа и плохая воспроизводимость результатов, обусловленные слабой стабильностью диагностических реагентов, а также относительно низкая чувствительность, связанная с невысокой хромофорностью используемых в качестве меток частиц.

Решение перечисленных проблем получило свою реализацию в работах, в которых в качестве меток детектирующих реагентов применили частицы коллоидного углерода [Плаксин и др., 1991, 1994, 1997]. Основным моментом этих разработок стала двухэтапная технологическая схема синтеза углеродных конъюгатов, предусматривающая ковалентное связывание аффинных соединений с частицами углерода. Решение коснулось сразу двух аспектов проблемы. Черный цвет углеродных частиц обеспечил максимальную из существующих в природе хромофорность меток, а ковалентный характер связи аффинных соединений с ними – максимальную прочность структуры диагностикума.

       Важным результатом разработанной технологии явилось получение устойчивой гетерогенной системы, обладающей одновременно свойствами истинного раствора и суспензии, названной авторами «суспензоидом». Частицы углерода размерами 162 нм, обладающие реальной поверхностью и находящиеся в водной фазе, не оседали и не всплывали под действием обычной гравитации.

Однако двухэтапный метод конъюгирования отягощен рядом технологических сложностей. В первую очередь это касается необходимости проведения двух хроматографических процедур: освобождение от избытка сорбируемого полимера и бифункционального реагента на первом этапе, и, как следствие, необходимость концентрирования, за которым вновь следует процедура хроматографического удаления несвязавшихся молекул анти-лиганда. Подобная многоэтапность не только удлиняет описанный способ, но и делает его трудоемким, мало технологичным, затратным. Кроме того, использование в качестве сорбируемого с целью пептизации поверхности углеродных частиц инертного белка – бычьего сывороточного альбумина (БСА) ограничивает количество связываемого аффинного соединения, что, в конечном итоге, накладывает ограничения на уровень чувствительности стереоспецифического анализа, проводимого с использованием таких конъюгатов.

       Вместе с тем, сконструированные модели тест-систем на основе полученных реагентов в полной мере продемонстрировали перспективные возможности применения углеродных конъюгатов для создания аналитических систем, пригодных для диагностического тестирования.

Цель настоящей работы - разработка универсальной технологии одноэтапного синтеза диагностических реагентов с использованием углеродных наночастиц и конструирование на ее основе систем безинструментально­го иммуноанализа.

Основные задачи исследования:

1. Разработать технологию синтеза углеродных диагностикумов, предусматривающую одноэтапное конъюгирование аффинных соединений с наночастицами коллоидного углерода.  Изучить стабильность полученных конъюгатов.

2. Обосновать универсальную систему диагностического тестирования, основанную на определении иммуноглобулинов класса G с использованием в качестве аффинного соединения белка G стрептококка и оценить ее основные аналитические параметры.

3. Обосновать системы иммуноаналитического определения различных лигандов в различных процедурных аранжировках.

4. Разработать методы аналитического тестирования на основе биотин-стрептавидинового взаимодействия.

Научная новизна и теоретическая значимость исследования. Впервые разработана одноэтапная технологическая схема ковалентного конъюги­рования аффинных соединений с гидрофобными наночастицами коллоидного углерода, пригодная для промышленного внедрения, позволившая химически инертному углероду стать прочно связанным с биологическими макромолекулами. Компактность и универсальность разработанной технологии, подбор оптимальных параметров синтеза и технологических приемов позволили в условиях использования лабораторной модели технологической установки получить объем диагностических реагентов, обеспечивающий проведение до 300000 определений в год. Технологический процесс можно легко масштабировать, не опасаясь негативных последствий, которыми, как правило, сопровождаются любые действия, связанные с переносом лабораторной схемы в условия реального производства.

Впервые предложен и апробирован оригинальный и эффективный способ получения углеродных частиц с высокой степенью стандартизации по размерам. 

Полученные данные дополняют современный биотехнологический арсенал методов принципиально новой технологией, позволяющей получать устойчивые водные суспензии гидрофобных наночастиц, поверхность которых может быть надежно модифицирована практически любыми соединениями, имеющими в своей структуре хотя бы одну свободную аминогруппу. Технология синтеза диагностикума и способы анализа с использованием синтезируемых углеродных реагентов защищена патентами РФ № 2089212 от 10.09.1997, № 2268471 от 20.01.2006, № 2283131 от 10.10.2006, № 2302424 от 10.07.2007. Кроме того, получены положительные решения о выдаче патентов на изобретения по заявкам № 20051128104/15(031560) от 05.02.2007, № 2007103808/15(004097) от 30.10.2007 и № 2007100406/15(000429) от 09.10.2007.

Использование разработанной технологии позволило получить устойчивые диагностические реагенты, которые характеризуются стабильностью в течение длительного времени, даже в условиях значительного отклонения от оптимальных параметров хранения. Это составило основу надежности тест-систем, конструируемых с использованием углеродных конъюгатов.

Привлекательные с позиций надежности и стабильности характеристики полученных реагентов позволили существенно упростить процедурное оформление анализов без ущерба для аналитических параметров готовых тест-систем.

Разработка технологии одноэтапного синтеза углеродных конъюгатов позволила повысить чувствительность определения различных лигандов в разных форматных аранжировках анализа.

Впервые на углеродных конъюгатах продемонстрированы преимущества систем анализа, эксплуатирующих уникальные свойства биотин-стрептавидинового взаимодействия, как в аспекте универсальности детекции, так и в возможности амплифицированного усиления результата аналитического исследования, повышающего чувствительность определения.

Практическая значимость исследования.        

       Разработанные методические подходы в сфере конструирования неинструментальных  аналитических систем могут служить основой для создания широкого спектра разнообразных наборов, пригодных для диагностического тестирования. Это могут быть системы анализа для клинико-лабораторных исследований, для экспресс диагностики в кабинете врача по принципу «один пациент - один тест», для скрининговых исследований в чрезвычайных ситуациях, для работы бригад скорой помощи, домашние тесты, полевые – в условиях экспедиционных отрядов и армейских подразделений. Быстрые и надежные, а вместе с тем, чрезвычайно простые в использовании, тесты могут найти свое применение в пищевой промышленности, в криминалистике, в ветеринарии и растениеводстве для оснащения не только контрольных лабораторий, но и фермерских хозяйств и т.д. В условиях исследовательских лабораторий наличие подобных диагностических инструментов может обеспечить возможность самостоятельного конструирования актуальных тест-систем. Например, достаточно иметь конъюгат белка G с углеродом, чтобы при необходимости сконструировать систему обнаружения и идентификации любых иммуноглобулинов. Это бывает весьма актуально там, где проводятся работы, связанные с выделением и очисткой белковых соединений из различных биологических материалов. То же касается и стрептавидинового конъюгата, как универсального детектирующего реагента, способного обнаружить любой лиганд при одном лишь условии – наличии соответствующего биотинилированного анти-лиганда. 

  Внедрение в практику. Результаты работы используются в практической деятельности лаборатории экологической иммунологии Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН при оценке иммуноглобулиновой контаминации препаратов выделяемых белков фетоплацентарного комплекса, при оценке уровня сероконверсии в период иммунизации экспериментальных животных, в экспериментально-производственной работе филиала ФГУП НПО «Микроген» «Пермский НПО «БИОМЕД», в работе Института новых медицинских технологий (г.Краснокамск), в учебном процессе на биологическом факультете Пермского госуниверситета.        

Основные положения, выносимые на защиту

1.  Разработанная технология одноэтапного конъюгирования различных аффинных соединений с частицами коллоидного углерода позволяет получать детектирующие реагенты прочной ковалентной структуры за счет единовременного процесса пептизации, активации и связывания всех компонентов диагностикума. Получаемые конъюгаты устойчивы при хранении в течение длительного времени даже в условиях отклонения температуры окружающей среды от оптимальной.

2. Получение стабильных конъюгатов на основе углеродных наночастиц дает возможность конструировать широкий спектр систем анализа, как с высокой степенью  универсальности, так и с узко направленными задачами определения конкретных лигандов, отвечающих основным требованиям, предъявляемым к диагностическим системам: высокие чувствительность и специфичность, воспроизводимость, надежность, простота, оперативность.

3. Использование в конструкции аналитических систем уникальных свойств биотин-стрептавидинового взаимодействия приводит к существенному усилению чувствительности определения при создании широкого спектра диагностических тест-систем на основе наночастиц углерода.

Связь работы с крупными программами.  Работа проводилась в течение 1991-2007 гг. в соответствии с планом НИР ИЭГМ УрО РАН (номер госрегистрации темы НИР 01.9.00.017989), а также в рамках федеральной программы «Старт 05».

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на LXII сессии общего собрания Академии медицинских наук СССР, Москва, 1991, на Международном симпозиуме «Проблемы загрязнения окружающей среды, токсикология», Пермь-Москва, 1991, на Всероссийской конференции «Актуальные проблемы теоретической и прикладной иммунологии», Пермь, 1994, на Международном симпозиуме «Загрязнение окружающей среды, токсикология и эпидемиология», Москва-Пермь, 1993, на Международной конференции по иммунореабилитации, Сочи, 1994, на Международном симпозиуме ICACI XV-EAACI'94, Стокгольм, Швеция, 1994, на Международной конференции по нейроиммунным взаимодействиям и загрязнению окружающей среды (ICONE’95), Санкт-Петербург, 1995, на XIII-м Ленсфилдском международном симпозиуме по стрептококку и стрептококковым заболеваниям, Париж, Франция, 1996, на Выставке достижений Российской биотехнологии, Берлин, Германия, 1996, на 4-м Российском Национальном Конгрессе «Человек и лекарства», Москва, 1997, на Международной конференции AAAAI/AAI/CIS, Сан-Франциско, США, 1997, на Конгрессе  FASEB, США, 1998, на Международной конференции по загрязнению окружающей среды (ICEP’98), Москва, 1998, на Ежегодном собрании профессиональных ученых, Экспериментальная биология 98, Сан-Франциско, Калифорния, США, 1998, на Международном семинаре «Научно-технический потенциал Западного Урала в конверсии военно-промышленного комплекса», ISTC, Perm, Russia, 2001, на I-II конференциях иммунологов Урала, Екатеринбург, 2001, Пермь, 2002, на Всероссийском съезде иммунологов России, Екатеринбург, Россия, 2004, на IX Всероссийском научном Форуме с международным участием имени академика В.И.Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге. Молекулярные основы иммунорегуляции, иммунодиагностики и иммунотерапии», 2005, на Всероссийском научном  симпозиуме «Цитокины, стволовая клетка, иммунитет», Новосибирск, 2005, на IV, V и VI конференциях иммунологов Урала, Уфа, 2005, Оренбург, 2006, Ижевск, 2007, на Российской научно-практической конференции «Современные технологии в иммунологии: иммунодиагностика и иммунотерапия», Курск, Россия, 2006,  на 2-й Республиканской конференции «Иммунология репродукции: теоретические и клинические аспекты», Сочи, 2007.

Публикации. Материалы диссертации обобщены в 64 печатных работах, из них: 13 статей, включая 5 статей в журналах по перечню ВАК Минобрнауки РФ, 4 патента РФ на изобретение и 3 положительных решения о выдаче патентов РФ.

Объем и структура работы.  Работа изложена на 217 страницах, содержит 8 таблиц и 36 рисунков, состоит из введения, литературного обзора, материалов и методов, 4 глав собственных исследований, обсуждения и выводов. Список литературы включает 419 источников, в том числе: 50 на русском и 369 на английском языках.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Материалы. Растворы всех использованных в работе реагентов готовились на деионизированной воде с сопротивлением не менее 18 Мом. Были использованы реагенты: хлорид натрия, гидрофосфат натрия, дигидрофосфат натрия, бы­чий сывороточный альбумин, азид натрия, додецилсульфат натрия, карбонат и бикарбонат натрия, сахароза производства фирмы Sigma (США); углерод, полученный по собственной технологии; толуол, гептан, гексан, диметилформамид производства Реахим (Россия), 4-Cl-1-нафтол фирмы Sigma (США); Твин-20 про­изводства фирмы Ferak (ФРГ); хорионический гонадотропин человека (ХГЧ), моноклональные антитела AB 0422 клона 1058 против -субъединицы ХГЧ, моноклональные антитела AB 0420 клона 1001 против -субъединицы ХГЧ, антитела к стрептококку группы А (СГА), конъюгат козлиных антител к стрептококку гр. А с HRP производства фирмы Binax (США); антистрептококковая кроличья референс-сыворотка фирмы Wellcome (Великобритания); группоспецифическая лиофилизированная ослиная антистрептококковая сыворотка НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи, кроличья антистрептококковая сыворотка, литический комплекс из Streptomyces levoris 96, культура клеток стрептококка гр. А штамма № 6/49 типа М29 Пражской коллекции культур были получены в лаборатории стрептококковых инфекций ММА им. И.М.Сеченова, группоспецифический полисахарид стрептококка группы А, конъюгированный с бычьим сывороточным альбумином (АПСХ-БСА) был любезно предоставлен научным сотрудником НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи к.х.н. В.А.Кульшиным, се­фароза 6В-CL производства фирмы Pharmacia Fine Chemicals (Швеция); рекомбинантный белок G (Protein G from Streptococcus sp. Recombinant) фирмы Sigma (США); стандартные панели сывороток, содержащих антитела к вирусу иммунодефицита человека (ВИЧ-1) в низких концентрациях серий 006, 007 и 008 и стандартная па­нель сывороток, не содержащих антитела к вирусу иммунодефицита человека (ВИЧ) серии 004 производства НПО "Вектор" (Россия); антиботулинические и антистолбнячные антитела были выделены из коммерческих препаратов специфических антисывороток; ботулинический и столбнячный анатоксины получены из ГИСКа им. Л.А.Тарасевича; альфа-фетопротеин (АФП) и поликлональные антитела к АФП получены в ходе выполнения совместной работы с Институтом новых медицинских технологий, г. Краснокамск (ген. директор К.Ю. Новиков), моноклональные антитела к трофобластическому -1-гликопротеину (ТБГ) и ТБГ получены самостоятельно; стрептавидин, стрептавидин, меченый пероксидазой хрена, N-гидроксисукцинимидный эфир аминокапроид­биотина производства ИЦПП "Пептос" (Россия); рекомбинантные поли­пептиды, продукты генов "envI", "envII", "gagI", "polI", контрольные сыворотки, содержащие антитела к ВИЧ-1 и ВИЧ-2, контрольная сыворотка крови человека, не содержащая антитела к ВИЧ производства БТК "Биосер­вис" (Россия), IgG человека, кролика, мыши, антитела овцы против IgG кролика, антитела кролика против  IgG человека производства Sigma (США).

В качестве основы для конструирования твердофазных реагентов использовали различные полимерные материалы: непористые, изготовленные из полистирола, пористые – из нитроцеллюлозы. В частности: планшеты для серийных разведений из белого полистирола про­изводства фирмы Linbro (США); нитроцеллюлозные мембраны 0,45 мкм BA-85, 5,0 мкм AE-98 производства фирмы Schleicher & Schuell (ФРГ), LC 5 мкм и 10 мкм производства Millipore (США), Trans-Blot Transfer Medium, Pure Nitrocellulose Membrane 0,45 мкм, Био-Рад (США); диализные мешки Visking Dialysis Tubing производства фирмы Serva (Германия).

В работе использовали следующие буферные растворы:

1. 0,15 М раствор NaCl, забуференный 0,015М Na-фосфатами, pH 7,25 (ЗФР);

2. ЗФР с 0,05% Твина 20 (ЗФРТ);

3. 0,02 М комплексирующий карбонатно-бикарбонатный буфер, pH 9,6 (КББ);

4. 0,1 М карбонатно-бикарбонатный буфер, pH 8,6.

5. Блокирующий раствор – ЗФРТ, содержащий 1% казеина (ЗФРТ-К)

Методы

1. Биотинилирование антител проводили по Goding J.W. [1980].

К 0,9 мл раствора антител в концентрации 1 мг/мл, предварительно от­диализованного в течение 12 часов против 0,1 М карбонатно-бикар­бонатного буфера pH 8,6, добавляли 0,1 мл ДМСО, содержащего 0,1 мг N-гидроксисукцинимидного эфира аминокапроидбиотина. После четырех часов инкубации при комнатной температуре диализовали против ЗФР, содержащего 0,1% азида натрия, с целью удаления нес­вязавшегося эфира биотина при +4оС в течение 12-14 часов.

Биотинилирование БСА проводили по аналогичной схеме.

2. Проявление пероксидазы в дот-ELISA проводили с использова­нием субстратной смеси следующего состава:

3,5 мл 0,05 М Трис-НCl с 0,15 М NaCl pH 7,5;

1,5 мл 4-Cl-1-нафтол (10 мг/мл этилового спирта);

16 мкл 3% перекись водорода.

3. Ферментную детекцию при определении антител к ВИЧ-1 и ВИЧ-2 проводили реагентами из набора "Блот-ВИЧ" БТК "Биосервис" (Россия) по инструкции производителя.

4. Концентрирование проводили в диализных мешках в сухом Фиколле 400 производства Serva (Германия).

5. Определение белка проводили по Bradford M.M. [1976].

6. Гетерогенность реагентов оценивали электрофоретически в ПААГ  [Laemmly V.K., 1970]  и по результатам HPLC на хроматографе Hitachi JC 400 с колонкой TSK G2000SW (Япония) по рекомендации производителя.

7. Очистку иммуноглобулинов осуществляли гель-хроматографией на колонке 2,6 см х 80 см (LKB, Швеция). В качестве носителя использовали Сефакрил S-300 Pharmacia Fine Chemicals (Швеция).

8. Ультразвуковую дезинтеграцию частиц углерода производили на дезинтеграторе УЗДН-2М (Россия) при частоте 22 кГц.

9. АФП получали из абортной крови по оригинальной технологии. Для этого кровь центрифугировали в течение 1 часа при 6000 g и наносили на сорбент: поликлональные антитела к АФП человека/сефароза. После нанесения и отмывки сорбента белок элюировали 0,1 М глицин-HCl буфером с рН 2,5 - 2,6, диализовали против физраствора и проводили негативную хроматографию на сорбенте поликлональные антитела к IgG человека/сефароза 4В с целью извлечения примесных иммуноглобулинов. Полученный препарат был электрофоретически гомогенен.

10. Поликлональные антитела получали иммунизацией коз (возраст 2-8 лет, масса 30-35 кг) препаратом АФП. Первичную иммунизацию проводили раствором АФП с полным адъювантом Фрейнда из расчета 0,3 мг/кг массы тела животного инъекцией в предлопаточный лимфатический узел и подкожно в область холки. Повторную иммунизацию проводили через три недели чистым АФП, который вводили внутривенно, подкожно и внутримышечно. Забор крови проводили через 4 недели.

Выделение антител из крови осуществляли аффинной хроматографией, которую проводили после центрифугирования и сульфатаммонийного фракционирования сыворотки крови иммунизированного животного. Фракцию, содержащую иммуноглобулины, наносили на сорбент АФП/сефароза CL-6B. После отмывки колонки антитела элюировали 0,1 М глицин-НCl буфером рН - 2,55, диализовали против забуференного физраствора и концентрировали до 10 мг/мл.

11. Моноклональные антитела к ТБГ получали из культуральной среды гибридомы BAP3 (лаборатория клеточных культур, зав. лаб. Орит Лейтер, центр биологических исследований Вейцмана, Израиль). Для этого среду, содержащую антитела, наносили на сорбент белок G/сефароза FF. После отмывки сорбента антитела элюировали 0,1 М глицин-HCl буфером (рН 2,6) и диализовали против ЗФР. 

12. ТБГ получали из сыворотки крови беременных женщин на сроках беременности свыше 37 недель по оригинальной технологии. Для этого сыворотку крови, предварительно фракционированную сульфатом аммония, наносили на сорбент моноклональные антитела к ТБГ/сефароза CL-4B. Элюцию проводили как описано выше. Полученный препарат после диализа доочищали на колонке с противовидовыми анти-лигандами.

13. Сорбент моноклональные антитела к ТБГ/сефароза CL-4B получали конъюгацией полученных антител с бромцианактивированной сефарозой CL-4B по методике производителя (Pharmacia Fine Chemicals, Швеция).

14. Детектирующие реагенты, полученные и использованные в работе представлены в таблице 1.

Таблица 1

ОБЩЕЕ КОЛИЧЕСТВО ПРОВЕДЕННЫХ ОДНОЭТАПНЫХ СИНТЕЗОВ

№ п/п

Аффинное соединение, конъюгированное с углеродными частицами

Количество синтезов

1

Стрептавидин

24

2

G белок

13

3

Моноклональные антитела к ХГЧ

8

4

Биотинилированный БСА

2

5

Поликлональные антитела к АФП

3

6

Поликлональные антитела к СГА

3

7

Моноклональные антитела к ТБГ

1

15. Объекты исследования и число проведенных определений представлены в таблице 2.

Таблица 2

ОБЩЕЕ КОЛИЧЕСТВО ИССЛЕДОВАННЫХ ОБРАЗЦОВ И ПРОВЕДЕННЫХ ОПРЕДЕЛЕНИЙ

№ п/п

Объект определения

Среда определения

Кол-во образцов/число определений

1

Антитела к ВИЧ-1

Сыворотка крови

202/2626

2

Антитела к ВИЧ-2

Сыворотка крови

12/156

3

Антитела к ВИЧ-1

Стандартная панель ВИЧ-1 позитивных сывороток

3/39

4

Антитела к ВИЧ-1 и ВИЧ-2

Донорская сыворотка

114/1482

5

ХГЧ

Моча беременных женщин

58/464

6

ХГЧ

Стандарт фирмы Binax (США)

1/136

7

Антитела к стрептококкам гр.А

Кроличья антистрептококковая сыворотка из лаборатории стрептококковых инфекций ММА им. И.М.Сеченов

1/60

8

Антитела к стрептококкам гр.А

Группоспецифическая лиофилизированная ослиная антистрептококковая сыворотка НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи

1/30

9

Антитела к стрептококкам гр.А

Антистрептококковая кроличья референс-сыворотка фирмы Wellcome (Великобритания)

1/130

10

АПСХ-БСА

НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи

1/81

11

АПСХ

Культура клеток стрептококка гр. А штамма № 6/49 типа М29 Пражской коллекции культур

1/48

12

АПСХ

Смыв с мазка из зева

34/102

13

ХГЧ

Сыворотки крови беременных женщин

18/144

14

АФП

Сыворотки крови беременных женщин

18/54

15

ТБГ

Сыворотки крови беременных женщин

18/18

16

Поликлональные антитела к АФП

Сыворотки иммунизированных коз

4/24

17

Столбнячный анатоксин

НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи

1/15

18

Ботулинический анатоксин

НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи

1/15

19

IgG человека

Стандарт фирмы Sigma (США)

1/220

20

IgG кролика

Стандарт фирмы Sigma (США)

1/78

21

IgG мыши

Стандарт фирмы Sigma (США)

1/78

22

Кроличьи антитела к IgG человека

Референс-стандарт фирмы Sigma (США)

1/130

23

Биотинилированный БСА

Синтезирован самостоятельно

11/240

24

IgG человека

Моча урологических больных

32/192

Технологическое решение задачи разработки метода одноэтапного конъюгирования аффинных соединений с углеродной меткой.

В качестве источника частиц углерода использовали аморфный углерод, который получали в виде сажи путем конденсирования из пламени горящего толуола на стеклянной поверхности. Собранный материал подвергали тщательной отмывке комплексом органических растворителей до исчерпывающего удаления продуктов неполного окисления углеводорода. Углерод суспендировали в 10-ти кратном по весу количестве толуола и кипятили  в колбе с обратным холодильником в течение 30 минут, остужали, отфильтровывали на фильтре Шотта. Далее процедуру повторяли 5 раз без нагревания до полного исчезновения окраски в растворителе, после чего отфильтрованный углерод пятикратно отмывали при  комнатной температуре диметилформамидом и гексаном. Подобная процедура приводила к полному обесцвечиванию про­текающего через очищаемый углерод растворителя каждого вида. Выбор используемых растворителей осуществляли на основании экспериментальных данных, сравнивая эффективность отмывки отдельных проб различными реагентами. Посредством высушивания под вакуумом ко­нечный продукт освобождали от следов связанных орга­нических растворителей и дополнительно прокаливали до постоянно­го веса в сухожаровом шкафу при 200-300оС в течение 12-24 часов. Получаемый подобным способом чистый аморфный углерод представля­л собой матово-черный лиофильный порошок, нераство­римый в доступных известных растворителях.

В процессе получения суспензии углеродных частиц к 2-х процентному раствору белка G в ЗФР добавляли аморфный углерод до конечной концентрации 5% в условиях вихревого перемешивания на магнитной мешалке. Использовали магнитный перемешивающий элемент, выполненный в виде «турбинки», что обеспечивало дополнительную гомогенизацию получаемой суспензии. Время, необходимое для полной пептизации частиц при комнатной температуре, составляло 30-36 часов. Полученную суспензию озвучивали в ультразвуковом дезинтеграторе. Условия ультразвуковой обра­ботки суспензии (частота и мощность, количество и продол­жительность циклов озвучивания) подбирали таким образом, чтобы обрабатываемый материал при одновременном (возможном) охлаждении не разогревался до температуры свыше 40оС. Полученный в ре­зультате эффективной ультразвуковой дезинтеграции суспензоид центрифугировали при 6000 g в течение 5-ти минут с целью удаления оставшихся относительно крупных частиц. В суспензию пептизированных белком G частиц углерода на роторном встряхивателе вносили равный объем 25% глутарового альдегида. Процесс конъюгирования проводили в течение 1 часа 40 минут при комнатной температуре и интенсивном перемешивании, после чего реагент центрифугировали при 6000 g и освобождали от избытка глутарового альдегида и несвязавшегося анти-лиганда гель-фильтрацией на колонке с Сефарозой CL-6B.

Фракции, вышедшие в холостом объеме и содержащие конъюгат, объединяли и добавляли БСА и глицерин до конечных кон­центраций, соответственно 1% и 20%. В качестве консерванта во всех растворах присутствовал азид натрия в конечной концентрации 0,1%.

Конъюгаты углеродных частиц со стрептавидином получали аналогичным способом.

Синтезы углеродных конъюгатов, аффинными соединениями которых являлись антитела к ХГЧ, стрептококку группы А и АФП, включали предварительную процедуру дополнительной очистки «пришиваемых» анти-лигандов гель-хроматографией на Сефакриле S-300, после чего схема синтеза, в том числе антител к ТБГ в качестве «пришиваемого» анти-лиганда, не отличалась от описанной выше. Условная схема получаемой в результате частицы представлена на рис.1.

Таким образом, результатом разработки одноэтапной технологии синтеза углеродных конъюгатов явились, как минимум, два обстоятельства. С одной стороны, произошло существенное упрощение технологического процесса, которое привело к сокращению не менее, чем в два раза времени синтеза диагностических реагентов, существенному снижению трудоемкости и затратности их получения. С другой, – использование аффинного соединения в качестве пептизирующего полимера неизбежно приводит к увеличению удельного количества его эффекторных групп, связываемых с меткой, следствием чего можно ожидать повышение чувствительности определения лигандов  в сконструированных системах аналитического тестирования. Разработанная технология была воспроизведена в 54-х синтезах различных конъюгатов. Схемы синтезов представлены на рис. 2.

Проведенные эксперименты показали, что длина волны спектрофотометра, равная 450 нм, при измерении OD углеродного суспензоида наиболее демонстративна с точки зрения удобства формализации оптической оценки реагента. Рабочая концентрация конъюгата составила 0,03%. Определяя оптическую плотность получаемого реагента, вычисляли титр (рабочее разведение), при котором использовали диагностикум в системах анализа.

Стабильность получаемых реагентов изучали на примере конъюгата стрептавидин-углерод, синтезированного по одноэтапной схеме в 1997 году. Его хранение осуществляли в бытовом холодильнике (температура от +4оС до +8оС) в герметично закрывающемся стеклянном флаконе. В процессе хранения часть образцов диагностикумов помещали на две недели в условия комнатной температуры (+22оС)  с усредненной периодичностью один раз в два месяца. Аналитическую эффективность детекции оценивали по определению биотинилированного БСА, нанесенного на нитроцеллюлозную мембрану 0,45 мкм из разведений кратных десяти. Параллельно  осуществляли детекцию конъюгатом, синтезированным ex tempore. Результаты сравнительного анализа представлены на рис. 3.

Как показывают результаты исследования, десятилетний срок хранения детектирующих реагентов при температурах бытового холодильника не оказывает заметного влияния на эффективность системы аналитического определения соответствующих лигандов даже при условиях кратковременного отклонения от оптимального режима. Чувствительность определения во всех вариантах составила 10 нг/мл.

Универсальность, как основной принцип детекции в структуре серологического анализа, сконструированного на основе углеродного конъюгата с G белком.

В первую очередь, важен тот факт, что G белок, выделенный в свое время из стрептококка G148, обладает чрезвычайно ярко выраженным сродством к Fc-фрагментам молекул IgG большинства млекопитающих, вовлеченных, так или иначе, в научно-исследовательскую сферу деятельности человека. Это послужило основанием для создания ряда аффинных сорбентов для специфического выделения и очистки иммуноглобулинов класса G, что нашло свое отражение в очистке антител, как одной из стадий реализации гибридомной технологии. Однако было бы совершенно неоправданно пройти мимо описанных свойств G белка, имея ввиду их использование в диагностике. Особенно важно подчеркнуть, что для самого G белка не играет никакой роли ни видовая принадлежность, ни способ получения, ни источник связываемых иммуноглобулинов.

Прямое определение IgG. На нитроцеллюлозную мембрану с размером пор 0,45 мкм при помощи приспособления «BIO-DOT Apparatus» (BIO-RAD, США) наносили IgG человека, из серийных двукратных разведений. После подсушивания мембраны и 30-ти минутной инкубации в блокирующем растворе, в качестве которого использовали забуференный фосфатами физраствор, содержащий 0,05% Твина-20 и 1% казеина (ЗФРТ-К), мембрану инкубировали в течение 15 минут в растворе описываемого конъюгата. Параллельно осуществляли детекцию аналогичным конъюгатом, но полученным в результате двухэтапного синтеза. Результаты сравнительного определения, подтвержденные в ходе исследования аналитических параметров 13-ти конъюгатов G-белка с углеродными частицами, представлены на рис.4.

Результаты определения подтверждают предположение о том, что технология одноэтапного синтеза углеродных конъюгатов приводит к повышению чувствительности систем детекции. Реальным объяснением полученного эффекта может быть прогнозированное увеличение числа связывающих центров, включенных в активную поверхность углеродных частиц, составляющих диагностический реагент.

Определение антител к ВИЧ-1 и 2 в варианте сэндвич-анализа. В качестве твердофазных реагентов для определения использовали нитроцеллюлозные полоски с нанесенными в виде поперечных линий анти-лигандами – рекомбинантными вирусоспецифическими белками, продуцируемыми генами envI, gagI, polI и envII; и контрольными антигенами – внутренний отрицательный контроль – рекомбинант, не содержащий антигенных детерминант к ВИЧ-1 и 2, и внутренний положительный контроль – сыворотка против IgG человека. В качестве исследуемых образцов использовали смесь сывороток больных СПИДом с верифицированной инфекцией ВИЧ-1 и ВИЧ-2, которую предварительно двукратно разводили в ЗФРТ-К, начиная с разведения 1/250. Готовые полоски (две серии по 11 полосок) помещали в исследуемые образцы и после 30-ти минутной инкубации промывали ЗФРТ трижды по 2 минуты. Детекцию проводили двумя диагностикумами: конъюгатом G белка с частицами углерода, полученным в результате одноэтапного синтеза, и ферментным конъюгатом (рис. 5).

Результаты сравнительного определения наглядно демонстрируют преимущества неферментной детекции, чувствительность которой в 4-8 раз превышает ферментную. Дело в том, что ферментная детекция предусматривает реакцию, катализируемую пероксидазой хрена, в ходе которой преципитирующий субстрат 4-Cl-1-нафтол приобретает синюю окраску. Интенсивность окрашивания (цветность) продукта реакции значительно уступает хромогенности частиц коллоидного углерода, а это неизбежно сказывается на чувствительности определения.

О высокой чувствительности и специфичности определения свидетельствует тот факт, что в ходе детекции 202-х ВИЧ-1-позитивных сывороток, 12-ти ВИЧ-2-позитивных сывороток, трех стандартных панелей сывороток содержащих антитела к ВИЧ-1 ГИСКа им. Л.А Тарасевича  и 114-ти ВИЧ-негативных сывороток, полученных из банка донорской крови, тринадцатью конъюгатами G белка с частицами углерода не было получено ни одного ложноотрицательного или ложноположительного результата.

Определение антител к стрептококку группы А (СГА). В качестве иммуносорбентов использовали полоски нитроцеллюлозы с сорбированными на них в качестве анти-лиганда АПСХ-БСА из раствора с концентрацией 0,1 мг/мл ЗФР дотами по 3 мкл, кроличьими IgG (внутренний положительный контроль) и БСА (внутренний отрицательный контроль), нанесенными из раствора с концентрацией 0,1 мг/мл ЗФР. Подсушенные после нанесения анти-лигандов полоски блокировали в ЗФРТ-К в течение 30 минут при 37оС, промывали в ЗФРТ и вновь высушивали. Полученные описанным способом твердофазные реагенты инкубировали в растворах с известной концентрацией антистрептококковых антител, разведенных с шагом 2 в ЗФРТ, начиная с 50 нг/мл, в течение 30 минут, после чего  осуществляли детекцию углеродным конъюгатом с G белком. Результаты анализа представлены на рис. 6.

Чувствительность определения, как следует из результатов анализа, составила 0,38 нг/мл. О высокой специфичности системы анализа свидетельствует отсутствие  как ложноотрицательных (все точки положительного контроля визуализированы в ходе определения), так и отсутствие ложноположительных  (отсутствие связывания углеродного конъюгата в зонах сорбции БСА) результатов. Результаты определения воспроизведены в ходе тестирования тринадцати синтезированных конъюгатов.

Универсальный набор для определения IgG. Проведенные исследования позволили разработать универсальный набор, предназначенный для самостоятельного конструирования в условиях научно-исследовательских лабораторий необходимые тест-системы, способные определять любые IgG в зависимости от интересов и потребностей исследователей. В состав набора входят:

  1. Конъюгат G белка с частицами коллоидного углерода.
  2. 10-ти кратный концентрат ЗФРТ-К.
  3. Полоски нитроцеллюлозы с отмеченными зонами нанесения анти-лигандов и нанесенными IgG кролика (в качестве внутреннего положительного контроля) и БСА (в качестве внутреннего отрицательного контроля).

Инструкция по применению сводится к рекомендации нанести соответствующий антиген из раствора с концентрацией 10-100 мкг/мл каплей объемом 3-5 мкл в отмеченную на полоске зону, подсушить в течение 15-20 минут и выдержать 30 минут в разведенном предварительно ЗФРТ-К. Полученные таким образом иммуносорбенты проинкубировать в течение 30 – 60 минут в исследуемой пробе и после 3-х кратной промывки в ЗФРТ осуществить детекцию, выдержав полоски в течение 15 минут в растворе конъюгата. Можно самостоятельно сконструировать практически любую тест-систему определения антител, относящихся к иммуноглобулинам класса G при условии наличия соответствующих антигенов. Но даже при отсутствии соответствующих антигенов, образцы можно напрямую сорбировать на нитроцеллюлозные полоски и осуществлять детекцию описанным способом, учитывая, что детекции будут подвергнуты все IgG, находящиеся в исследуемой пробе. Таким образом, конъюгат G белка стрептококка с наночастицами коллоидного углерода представляет собой универсальный инструмент, применение которого для прямой визуализации (детекции) специфических лигандов и взаимодействий с участием иммуноглобулинов G отвечает всем требованиям корректной диагностики, реализуя основные качественные характеристики: чувствительность, специфичность, воспроизводимость, надежность, наглядность, доступность, безопасность и др.

Иммуноаналитические системы определения хорионического гонадотропина человека (ХГЧ)

Иммунохроматографическое определение ХГЧ. Для конструирования систем иммунохроматографического определения ХГЧ  в качестве детектирующего реагента использовали конъюгат углеродных частиц с моноклональными антителами к  -субъединице гормона. На твердой фазе, в качестве которой применяли нитроцеллюлозные пластинки размером 20х80 мм с диаметром пор 5,0 мкм, сорбировали в виде поперечных линий моноклональные антитела к  -субъединице гормона из раствора с концентрацией 1,0 мг/мл ЗФР и сам гормон в качестве внутреннего положительного контроля в концентрации 50000 МЕ/л.  После полного высыхания нанесенных анти-лигандов пластинки блокировали в растворе ЗФРТ-К в течение 30 минут и подсушивали при 37оС, промывали ЗФРТ и вновь высушивали. Подготовленные подобным образом иммуносорбенты наклеивали на прозрачный поливинилхлоридный толстый скотч. Верхнюю границу такой пластинки при помощи того же скотча плотно соединяли с впитывающим элементом (полоска толстой крупнопористой целлюлозной фильтровальной бумаги размером 40х80 мм), нижнюю – с таким же элементом, но размерами 10х80 мм, в качестве нижней контактной зоны. Полученную конструкцию нарезали на полоски шириной 4 мм.

В роли исследуемого образца использовали стандарт ХГЧ, разведенный в ЗФРТ, контролем служила моча здорового мужчины. Нижние контактные элементы хроматографических полосок опускали в подготовленные пробы, смешанные предварительно с равным объемом конъюгата, на 5-7 секунд, после чего их переносили на то же время в раствор ЗФРТ. Схема работы аналитической системы представлена на рис. 7.

За счет сил капиллярного всасывания раствор, содержащий гормон и детек­тирующий реагент, поднимался по полоскам со скоростью около 1,5 см/мин. Через 2-3 минуты результаты анализа определяли визуально по наличию (положительный результат) или отсутствию (отрица­тельный результат) связывания суспензоидного конъюгата в зоне иммобилизации первых антител (черные полосы на светло-сером фо­не). Свидетельством корректно проведенного анализа являлась черная полоса в зоне иммобилизации внутреннего положительного контроля (рис. 8).

Приведенные результаты иммунохроматографического определения ХГЧ демонстрируют высокий уровень чувствительности за счет использования в качестве детектирующего реагента частиц коллоидного углерода, конъюгированных с антителами к ХГЧ. Об этом свидетельствует окрашивание в зоне иммобилизации первых антител к ХГЧ при исследовании пробы, содержащей гормон в концентрации 10 МЕ/л. О высокой специфичности анализа говорит отсутствие окрашивания на поверхности иммуносорбента в условиях отрицательного контроля. Полученные результаты были воспроизведены при исследовании аналитических свойств восьми синтезированных диагностикумов.

Сам по себе результат определения 10 МЕ/л говорит о привлекательных аналитических характеристиках разработанной системы диагностики. Ни одна из представленных на нашем рынке систем определения ХГЧ, выполненных в аранжировке иммунохроматографии, не обладает чувствительностью выше 20-25 МЕ/л. Более того, качество этих систем оставляет желать лучшего, о чем свидетельствует рис. 9.

Автором не ставилась задача исследовать аналитические параметры и оценить достоинства или недостатки реализуемых на отечественном рынке систем экспрессной диагностики беременности. Выборка из аптечной сети была случайной. Анализируя полученные результаты, корректной можно считать работу только трех из восьми проверенных диагностикумов.

Иммунофильтрационное определение ХГЧ. Для осуществления иммунофильтрационного (называемого также проточно-адсорбционным) способа определения ХГЧ использовали те же иммунореагенты, что и в иммунохроматографии. Приспособле­нием для осуществления данного способа являлся пластиковый ци­линдр с заглубленным отверстием в верхней части, заполненный крупнопористой хроматографической бумагой в качестве впитывающего элемента, с помещаемыми сверху опорным диском из крупнопористого полипропилена и иммуносорбентом (рис.10), который готовили, сор­бируя на нитроцеллюлозном мембранном фильтре с диаметром пор 5 мкм связывающие моноклональные антитела к -субъединице гормона в виде вертикальной линии из раствора с концентрацией 1,0 мг/мл ЗФР и сам гормон в качестве внутреннего положительного контроля в виде горизонтально пересекающей линии из раствора с концентрацией 50000 МЕ/л.

Высушенные после нанесения анти-лигандов мембраны блокировали,  инкубируя в ЗФРТ-К 1 час при комнатной температуре, после чего отмывали ЗФРТ и вновь высушивали таким же образом.

В ходе анализа в отверстие крышки вносили 0,5 мл ЗФРТ для смачивания иммуносорбента. Затем - 0,5 мл предварительно подготовленной пробы, представляющей собой смесь равных объемов исследуемого образца (моча беременных женщин или здоровых мужчин) и  конъюгата углеродных частиц с моноклональными антителами к  -субъединице гормона в двукратном от рабочего разведении. После впитывания последней вносили 1 мл ЗФРТ для промывки поверхности мембраны. Время анализа 1,5 – 2 минуты. Результаты представлены на рис. 11.

Наличие «+» на поверхности мембраны свидетельствует о присутствии в пробе ХГЧ, «-» - об отсутствии гормона и корректно проведенном анализе.

Несомненным удобством аранжированного подобным образом анализа является его простота и наглядность. По сути, в наборе для реализации такого анализа должны присутствовать только ячейки с подготовленным иммуносорбентом, флакон с конъюгатом и одноразовые пластиковые пипетки, при помощи которых  последовательным набором осуществляется смешивание исследуемого образца с конъюгатом и внесение готового раствора в ячейку. Для промывки иммуносорбента используется капельница с ЗФРТ. Все восемь синтезированных конъюгатов продемонстрировали корректный результат при исследовании 58-ми образцов мочи беременных женщин. В ходе исследования 42 образцов мочи здоровых мужчин ложноположительных результатов не наблюдали.

Дот-форматная аранжировка аналитической процедуры полуколичественного определения ХГЧ. Аранжирование определения ХГЧ в формате дот-иммуноанализа позволило разработать полуколичественный метод. Использовали уже описанное приспособление для нанесения проб на пористую мембрану «BIO-DOT Apparatus» (BIO-RAD, США). Условием проведения анализа являлась необходимость серийного разведения исследуемой пробы и сравнение последней визуализируемой точки со стандартом в известной концентрации. В качестве иммуносорбента использовали  нитроцеллюлозную мембрану с размерами пор 5,0 мкм с нанесенными анти-лигандами: моноклональными антителами к -субъединице гормона, сам гормон из раствора с концентрацией 50000 МЕ/л в качестве внутреннего положительного контроля и ФСГ в качестве внутреннего отрицательного контроля. После полного высушивания нанесенных анти-лигандов мембрану блокировали, как описано выше, и вносили в лунки образцы референсных и исследуемых проб объемом по 100 мкл. В контрольные лунки вносили ЗФРТ. После полного прохождения образцов сквозь иммуносорбент осуществляли детекцию, инкубируя мембрану в растворе конъюгата моноклональных антител против -субъединицы ХГЧ с углеродом в течение 15

минут. Результат оценивали после 3-х кратной промывки мембраны ЗФРТ (рис. 12).

Результаты анализа, представленные на рис. 12, демонстрируют чувствительность определения 5 МЕ/л. Визуализируемой на  этом уровне точке референса соответствует точка разведения исследуемого образца 1:104, из чего следует, что исходное содержание гормона было равно 50000 МЕ/л. Аналогичные результаты были продемонстрированы всеми восемью синтезированными конъюгатами. Таким образом, разработанная схема дот-иммуноанализа, вполне пригодна для полуколичественного определения любых лигандов при условии наличия референсных образцов. Возможность количественной формализации результатов анализа в существенной степени приближает удобную в процедурном отношении, чувствительную и надежную в плане аналитических возможностей диагностическую сферу медико-биологических исследований к пользователям, удаленным от крупных центров, оснащенных современным оборудованием.

Описанные для определения ХГЧ форматные аранжировки: иммунохроматография, иммунофильтрация и дот-иммуноанализ могут быть реализованы в конструировании любых систем, имеющих такое же форматное оформление. Речь идет о подготовке твердофазного реагента (иммуносорбента) описанным способом, контакте его с исследуемым объектом (кровь, сыворотка, моча, экстракт, слюна, слеза и т.д.) и детекции соответствующим специфическим диагностикумом. Определяющими оценочными факторами с позиции целесообразности того или иного процедурного оформления являются порог диагностически значимого результата и индивидуальные свойства компонентов диагностической системы, способные или неспособные реализовывать требуемые аналитические характеристики,  в первую очередь, аффинность антител, структурная организация молекул, характер возможной контаминации. Что же касается самой углеродной метки, то и ее физико-химические параметры, и технология синтеза конъюгатов надежно гарантируют воспроизводимые качественные характеристики диагностикумов, обеспечивающие возможность их применения в любых процедурных аранжировках.

Прямое дот-иммуноаналитическое определение стрептококка группы А. В качестве детектирующего реагента использовали конъюгат кроличьих антистрептококковых антител с частицами коллоидного углерода. Системой сравнения служила детекция ферментным конъюгатом кроличьих антител к стрептококку гр. А с пероксидазой хрена и проявлением результатов анализа с 4-хлор-1-нафтолом в стандартных условиях. На полоски нитроцеллюлозы с диаметром пор 0,45 мкм наносили АПСХ-БСА из серийных разведений в ЗФР дотами по 3 мкл и БСА в качестве отрицательного контроля. После высушивания нанесенных лигандов и блокирования поверхности полосок растворе ЗФРТ-К их обрабатывали

сравниваемыми системами детекции (рис. 13).

Преимущество неферментной детекции подтверждается, прежде всего, в два раза более высокими показателями чувствительности. Отсутствие стадии субстратного проявления делает процедуру анализа более оперативной, упрощает ее, исключает вредность контакта с токсичным субстратом ферментной реакции. Подобного рода система анализа, позволяющая в течение часа в кабинете врача или в условиях обычной клинической лаборатории определить наличие СГА в мазке больного с чувствительностью 40-80 нг/мл, могла бы стать действенным инструментом в первичной диагностике инфекции. Представленная модель аналитической системы демонстрирует преимущества и принципиальную возможность определения СГА углеродным конъюгатом, воспроизведенную в трех синтезах. В реальной аналитической практике возникает методическая проблема, связанная с подготовкой исследуемой пробы (лизис клеточной стенки бактерии), которая могла бы служить серьезным препятствием на пути внедрения описываемой диагностической системы в качестве оперативного инструмента. Существующее решение этой проблемы было апробировано в ходе разработки сэндвич-варианта дот-иммуноаналитической системы определения СГА.

Дот-иммуноаналитическое определение стрептококка гр. А в варианте сэндвич-анализа. Сравниваемые системы детекции были те же, что и при прямом сравнении определения АПСХ. На нитроцеллюлозные полоски сорбировали антитела к стрептококку гр. А дотами по 3 мкл из раствора с концентрацией 1 мг/мл ЗФР и АПСХ-БСА в качестве внутреннего положительного контроля (К+) в той же концентрации. Полоски обрабатывали в блокирующем растворе по описанной выше схеме. Исследуемыми образцами служили клеточные лизаты с известным содержанием клеток в исходных пробах. Лизаты получали методом, разработанным в лаборатории стрептококковых инфекций ММА им. И.М. Сеченова [Шмакова и др., 1991]. Подготовленные иммуносорбенты инкубировали с анализируемыми образцами в течение 30 минут при комнатной температуре, после чего отмытые в ЗФРТ полоски детектировали ферментным и углеродным конъюгатами. Результаты сравнительного анализа представлены на рис. 14.

В представленном варианте анализа чувствительность неферментного определения стрептококка группы А составила 104 клеток/мл, что существенно превышает чувствительность ферментного определения и соответствует рекомендациям ВОЗ, согласно которым данный показатель является необходимым порогом диагностически значимой чувствительности методов, особенно экспрессных,  и позволяет проводить идентификацию СГА непосредственно в мазке из зева.

Дот-иммуноаналитическое определение АФП и ТБГ в сыворотке крови беременных женщин. Форматная аранжировка определения АФП и ТБГ фактически повторяет таковую, разработанную для полуколичественного определения ХГЧ, описанную выше. В процедуре подготовки твердофазного реагента, как и в ходе анализа, также использовали приспособление для нанесения проб на пористую мембрану. Анализировали образцы, полученные в результате серийного разведения исследуемой пробы (сыворотка крови беременной женщины в сроке 16 недель) в прямом сравнении с последней визуализируемой точкой раститрованного с шагом 2 референс-стандарта АФП. На нитроцеллюлозную мембрану с размерами пор 5,0 мкм наносили  аффинноочищенные козьи поликлональные антитела к АФП из раствора с концентрацией 0,1 мг/мл в ЗФР объемом 20 мкл, сам белок в качестве внутреннего положительного контроля (К+) и БСА в качестве отрицательного контроля (К-). После полного высушивания нанесенных анти-лигандов мембрану блокировали, и в лунки вносили образцы референсных и исследуемых проб объемом по 100 мкл. В контрольные лунки вносили ЗФРТ. После полного прохождения образцов сквозь твердофазный реагент осуществляли детекцию, инкубируя мембрану в растворе конъюгата поликлональных антител против АФП с углеродом в течение 15 минут. Результат оценивали после 3-х кратной промывки мембраны ЗФРТ (рис.15).

Чувствительность определения АФП в представленном варианте анализа составила 10 нг/мл. Из этого следует, что концентрация АФП с учетом разведения в исследуемом образце составляла около 40 нг/мл. Полученный результат согласуется с имеющимися данными, свидетельствующими о том, что медиана концентрации АФП в материнской сыворотке при сроке беременности 16 недель составляет  41 нг/мл (33 МЕ/мл) [Решетников, 2004, Tabor et al., 1987].

Для определения ТБГ в сыворотке крови (беременность 16 недель) на мембрану наносили моноклональные антитела к ТБГ в той же концентрации и таким же образом, что и в описанном определении АФП. В качестве контролей использовали сам белок – «К+» и АФП – «К-». В ходе анализа в лунки вносили образцы референсного белка, раститрованного с шагом 10 параллельно с исследуемыми образцами в аналогичном разведении. Детекцию осуществляли конъюгатом моноклональных антител к ТБГ с частицами углерода (рис.16).

Чувствительность определения ТБГ в системе дот-иммуноаналитического исследования составила  1,0 нг/мл. Следовательно, с учетом разведения концентрация определяемого белка в исследуемой пробе находилась в диапазоне от 10 до 100 мкг/мл. Согласно  литературным данным, среднее значение нормы ТБГ в материнской сыворотке при сроке беременности 16 недель составляет 48 мкг/мл [Богданович и др., 2004].

Безусловно, с позиций количественной формализации результатов, полученную точность определения трудно назвать удовлетворительной, отсюда и квалификация разработанного метода как полуколичественного. Однако следует отметить, что для увеличения точности оценки результатов достаточно использовать более дробное разведение референсного и исследуемого материала.

Возможность количественной формализации получаемых результатов (даже с точки зрения оценки динамического «больше-меньше») может иметь особое значение при анализе парных проб, когда исследования одного и того же параметра осуществляются через определенные временные промежутки (1-2 недели). Разработанная система анализа может служить надежным инструментом, позволяющим динамически следить за концентрацией ТБГ, отсутствие прироста которого при еженедельном определении позволяет диагностировать наличие плацентарной недостаточности. 

Полуколичественная оценка процесса сероконверсии в ходе получения специфических антител. Известна важность контроля за процессом выработки антител при иммунизации лабораторных животных. Наиболее широко используемым методом в современной лабораторной практике, является метод двойной радиальной иммунодиффузии в геле [Оухтерлони, 1949]. Метод достаточно демонстративный, но занимает слишком много времени, малочувствителен и страдает определенным субъективизмом в оценке результатов. Этих недостатков лишена дот-иммуноаналитическая система определения антител с использованием уже описанного углеродного конъюгата с G белком.

На нитроцеллюлозную мембрану с размерами пор 5,0 мкм при помощи устройства «Био-Дот» наносили  АФП из раствора с концентрацией 0,1 мг/мл ЗФР объемом 20 мкл, в качестве внутреннего положительного контроля – IgG козы, в качестве внутреннего отрицательного контроля - БСА. После полного высушивания нанесенных анти-лигандов мембрану блокировали, как описано выше, и вносили в лунки образцы референсных и исследуемых проб объемом по 100 мкл. Референсные пробы – разведения козьих анти-АФП антител с известной концентрацией в ЗФР, исследуемые – разведения сыворотки крови иммунизированной козы. В контрольные лунки вносили ЗФРТ. После полного прохождения образцов сквозь иммуносорбент осуществляли детекцию, инкубируя мембрану в растворе конъюгата G белка с частицами углерода в течение 15 минут. Результат оценивали после 3-х кратной промывки мембраны ЗФРТ (рис.17).

Время проведения анализа, если не считать время подготовки иммуносорбента, – 25 минут, чувствительность определения – 10 пг/мл. Анализируя полученные результаты, можно рассчитать примерную концентрацию антител в исследуемой сыворотке. Последняя визуализируемая точка, равная 10 пг/мл, в ряду разведений сывороток соответствует разведению 1:107.  Из этого следует, что концентрация антител  в исследуемой сыворотке составляет 0,1 мг/мл.

Описанную систему анализа легко адаптировать для определения практически любых антител в любом биологическом материале. Отсюда возможность разработки систем простого и надежного контроля за эффективностью процессов вакцинации человека и животных. Это могло бы найти свое применение в ветеринарии, особенно в условиях угрозы эпидемического кризиса.

Биотин-стрептавидиновые взаимодействия в иммунодиагностике.

Универсальность уже описанных систем детекции стереоспецифических взаимодействий, основанных на использовании в качестве аффинного соединения конъюгата G белка бесполезна, когда единственным способом связывания определяемого лиганда с твердой фазой является использование специфических антител. Решение проблемы в виде синтеза конъюгата  с использованием вторых антител, конъюгированных с частицами углерода  при этом не всегда возможно по ряду вполне определенных причин, чаще всего - экономических. На наш взгляд, уместно использование уникальных способностей биотина и стрептавидина. Стрептавидин - белок, вырабатываемый Streptomyces avidinii, обладающий очень высоким сродством к биотину, благодаря наличию в структуре его молекулы четырех центров связывания. Наиболее стандартное применения этого белка - выявление биотинилированной ДНК в методе нерадиоактивной гибридизации in situ, где обычно он используется в комплексе с флуоресцентной или ферментной меткой. Однако биотинилировать можно не только ДНК. Используя N-гидроксисукцинимидный эфир аминокапроидбиотина, можно легко биотинилировать практически любые белки, в том числе и антитела. Именно такие биотинилированные зонды мы использовали в системах диагностики, где в качестве универсального детектирующего реагента применяли уже упомянутый конъюгат стрептавидина с углеродными частицами, синтезированный по описанной для G белка одноэтапной схеме.

Определение столбнячного и ботулинического анатоксинов на непористой твердой фазе. В качестве основы твердофазного реагента использовали плоское дно лунок планшета, предназначенного для серийных разведений, изготовленного из белого полистирола фирмы Linbro (США). На дно лунок сорбировали антитела к столбнячному и ботулиническому анатоксинам дотами из капель по 5 мкл в концентрации 0,1 мг/мл в карбонатно-бикарбонатном буфере (КББ). После инкубации во влажной камере при температуре +37оС капли удаляли, а поверхность иммуносорбента промывали ЗФРТ. В качестве внутреннего положительного контроля в каждой лунке сорбировали биотинилированный БСА, в качестве отрицательного – IgG человека. В лунки вносили исследуемые образцы соответствующих анатоксинов в ЗФРТ в разведении, кратном двум и после 30-ти минутной инкубации и двукратной промывки - соответствующие биотинилированные антитела: в одном случае - к столбнячному, в другом – к ботулиническому анатоксинам. Время инкубации составляло 30 минут, после чего лунки промывали ЗФРТ и осуществляли детекцию конъюгатом стрептавидина с углеродом в течение 15 минут (рис.18).

Чувствительность анализируемой системы 10 и 100 нг/мл не может считаться достаточной для целей реальной диагностики. Однако следует учитывать тот факт, что емкость сорбции на непористой твердой фазе существенно ниже, чем на пористых мембранах, что в конечном итоге и ограничивает диагностические возможности систем анализа, сконструированных на основе непористых материалов. В то же время описываемый материал имеет несомненное достоинство в том, что абсолютно не требует процедуры блокирования своей поверхности после комплексирования с анти-лигандами. Многочисленными экспериментами доказано отсутствие какого бы то ни было неспецифического взаимодействия углеродных конъюгатов с поверхностью полистирольного планшета. Что касается исследования аналитических параметров определения, то они были воспроизведены в ходе тестирования 24-х стрептавидиновых конъюгатов. Демонстрируемая система тестирования при помощи стрептавидинового конъюгата позволяет прогнозировать реальную возможность конструирования такого же универсального инструмента, как и в случае с конъюгатом G белка с углеродными частицами. В системе аналитической процедуры достаточно сменить только твердофазный реагент и биотинилированные зонды, чтобы получить систему, способную определять практически любой лиганд, к которому возможно получение специфических антител. Что же касается возможностей повышения чувствительности определения, то можно выделить, как минимум, два направления. Первое предусматривает использование в качестве иммуносорбента пористых материалов с сорбированными на них анти-лигандами, второе - усиление результирующего сигнала, введением в систему детекции конъюгат биотина с углеродом.

В качестве примера универсальных возможностей разработанного метода можно представить экспресс-применение биотин-стрептавидинового конъюгата для дифференциальной детекции IgG.

В ходе выделения и очистки одного из белков фетоплацентарного комплекса человека с использованием двух аффинных сорбентов: козьи антитела против АФП и кроличьи антитела против IgG человека, конъюгированных с сефарозой, в получаемом препарате появилась контаминация, верифицированная как IgG. Для идентификации видопринадлежности иммуноглобулинов использовали две полоски нитроцеллюлозы с диаметром пор 0,45 мкм, на которые сорбировали контаминированные пробы и биотинилированный БСА (Bi-БСА) в качестве положительного контроля. После блокирования в стандартных для этой процедуры условиях, полоски инкубировали, в одном случае, с биотинилированными анти-кроличьими антителами, в другом – с биотинилированными анти-козьими антителами. После промывки иммуносорбентов осуществляли детекцию конъюгатом стрептавидин–углерод. Результаты анализа представлены на рис. 19. 

Из результатов анализа следует, что получаемый препарат был контаминирован кроличьими антителами, что свидетельствует об утечке лиганда с применяемой на стадии доочистки аффинной колонки. Положительный и отрицательный контроли убедительно продемонстрировали высокий уровень специфичности системы анализа. Подобный пример может служить демонстрацией универсальных способностей сконструированной системы детекции и прогнозировать возможность формирования универсального набора для конструирования систем анализа в условиях любой исследовательской лаборатории в зависимости от актуальных потребностей.

  Привлекательной стороной использования особенностей биотин-стрептавидинового взаимодействия явилась возможности усиления чувствительности детекции. Идея использования амплификации результирующего сигнала потребовала синтеза углеродного конъюгата с биотином в качестве аффинного соединения. Для этого в качестве исходного реагента использовали биотинилированный БСА. Схема одноэтапного синтеза ничем не отличалась от описанной технологии получения диагностикумов с G белком, стрептавидином, очищенными поли- и моноклональными антителами.

Для реализации идеи усиления результирующего сигнала на дно лунок полистирольного планшета сорбировали описанным способом биотинилированный БСА дотами из капель по 5 мкл из разведений кратных двум в КББ, начиная с 5 мкг/мл. После комплексирования в лунки вносили в одном случае конъюгат стрептавидин-углерод, в другом - смесь равных объемов конъюгатов стрептавидин-углерод и биотин-углерод (рис. 20).

Представленные результаты подтверждают возможность повышения чувствительности определения с использованием приема усиления результирующего сигнала введением в систему детекции биотинилированного углерода. Чувствительность определения в стандартных условиях составила 20 нг/мл, с усилением – 5 нг/мл. Механизм наблюдаемого усиления можно представить следующим образом. Частицы углерода связываются со специфическим иммунным комплексом на поверхности твердой фазы посредством взаимодействия стрептавидина на их поверхности с биотинилированным лигандом. В свою очередь, частицы углерода, поверхность которых модифицирована биотином, связываются с уже иммобилизованными частицами стрептавидинового диагностикума.

И те и другие частицы доступны для продолжения взаимных «контактов», осуществление которых приводит к амплифицированному увеличению числа связанных углеродных частиц в зоне сорбции специфических комплексов или молекул, что и способствует усилению результирующего сигнала. Кроме того, пространственная структура конъюгатов позволяет связываться с сорбированным на твердой фазе лигандом преформированного комплекса, образующегося в жидкой фазе реакционного объема.  В сочетании с использованием пористого материала для сорбции анти-лигандов описанный прием может существенно повысить чувствительность детекции. Данное предположение было наглядно подтверждено в варианте определения анти-человеческих антител при анализе кроличьей иммунной сыворотки  с целью оценки эффективности сероконверсии. Для проведения анализа поверхность нитроцеллюлозных полосок сенсибилизировали иммуноглобулинами G человека.  Использовали уже описанное приспособление «Био-Дот». В прибор устанавливали мембрану с диаметром пор 0,45 мкм  и в 6 рядов лунок вносили анти-лиганды по 20 мкл из раствора с концентрацией 1 мг/мл ЗФР. В качестве внутреннего положительного контроля использовали биотинилированный БСА, в качестве отрицательного – интактный БСА. После полного высушивания анти-лигандов полоски блокировали описанным способом и вновь высушивали. Подготовленный подобным образом иммуносорбент вновь помещали в прибор и вносили в нечетные ряды лунок по 0,2 мл растворов кроличьих антител против IgG человека с известной концентрацией от 50 мкг/мл до 5 пг/мл. В лунки четных рядов - образцы сыворотки иммунизированного кролика по 0,2 мл, разведенной в ЗФРТ с шагом 10. После полного прохождения образцов сквозь мембрану лунки промывали ЗФРТ 3-х кратно по 0,2 мл, после чего вносили в каждую лунку по 20 мкл биотинилированных анти-кроличьих антител в концентрации 1,0 мг/мл. В контрольные лунки вносили ЗФРТ. После двукратной промывки лунок ЗФРТ мембрану извлекали из прибора, вновь промывали и осуществляли детекцию в стандартной системе стрептавидиновым конъюгатом, описанной выше смесью конъюгатов стрептавидин-углерод и биотин-углерод и ферментным конъюгатом стрептавидин-пероксидаза хрена (рис.21).

Из результатов проведенных сравнительных анализов следует, что вариант совместного использования углеродных конъюгатов на основе стрептавидина и биотина позволяет существенно (в данном случае в 100 раз) повысить чувствительность определения.

Ферментная детекция, чувствительность которой равна чувствительности определения стрептавидиновым конъюгатом в стандартных условиях (без усиления), тем не менее, проигрывает по другим важным характеристикам. Прежде всего, обращает на себя внимание наличие слабого сигнала (фона) в зоне отрицательного контроля.  Факт вполне объяснимый тем обстоятельством, что ферментная метка, особенно пероксидазная, обладает способностью к неспецифическому связыванию, как с белками, так и с пористыми материалами на основе нитроцеллюлозы. Дело в том, что общепринятая технология получения пероксидазных конъюгатов [Tijssen, 1985]  предусматривает периодатное окисление фермента с последующим после конъюгирования восстановлением боргидридом натрия. Даже при самом незначительном от исчерпывающего отклонении в восстановлении окисленных форм фермента, что часто бывает в условиях масштабированного производства, появляются проблемы с фоном в ходе аналитических исследований.

Все описанные выше системы аналитического определения были либо направлены на детекцию иммунореактивных соединений, либо использовали иммунореактивные соединения в структуре аналитической аранжировки. Однако, если иметь ввиду более широкое понятие «стереоспецифический анализ», можно легко прогнозировать возможность разработки систем, основанных на принципах генно-гибридизационного и лиганд-рецепторного взаимодействий, в которых также есть место реализации достоинств углеродных конъюгатов.

ОБСУЖДЕНИЕ

Проведенные исследования наглядно продемонстрировали возможность получения надежных диагностикумов, эксплуатирующих уникальные природные свойства углеродных частиц. Химически индифферентный материал может быть вовлечен в физико-химическую перестройку, результатом которой является получение принципиально нового продукта – конъюгата инертных в отношении образования прочных химических связей углеродных частиц с различными биологически активными молекулами. Высокий уровень оптической контрастности (хромогенности) обеспечивает углеродной метке приоритетное положение в ряду любых цветных материалов, применяемых в диагностических системах. 

Разработанная одноэтапная технологическая схема синтеза углеродных конъюгатов, по существу, представляет собой простой и надежный способ  масштабного производства диагностикумов разной направленности. При этом, она объективно не зависит ни от условий производства, ни от уникального оборудования, требующего, как правило, дополнительных затрат на обслуживание и эксплуатацию. Смена производимого продукта не влечет за собой никаких технологических  изменений и связанных с этим материальных затрат, а вопросы масштабирования решаются простым изменением объема сорбента, участвующего в процессе хроматографии. 

Представленные результаты аналитического тестирования в полной мере демонстрируют основные привлекательные характеристики тест-систем, конструируемых с использованием углеродных конъюгатов. Высокая чувствительность за счет исключительной хромофорности углеродных частиц и максимального размещения активных групп на их поверхности  обеспечивают получение диагностически значимого результата. Высокая специфичность, подтвержденная отсутствием примеров неспецифического связывания, в основе которой лежат технологические решения, предусматривающие минимизацию неспецифических взаимодействий, отвергает возможность получения ложноположительного результата, который может стать причиной негативных последствий некорректного тестирования. Стабильность реагентов, обусловленная прочностью химических связей, что являющается следствием надежного конъюгирования аффинных соединений с частицами коллоидного углерода,  обеспечивает не только хорошую воспроизводимость результатов, но и возможность длительного и нетребовательного хранения. Это в равной степени касается и перспектив неограниченно долгого хранения результатов анализа, что бывает чрезвычайно важно в ситуациях, когда необходимо сравнение результатов исследований, разнесенных во времени.

Не меньшее значение имеет ряд процедурных удобств, свойственных сконструированным системам аналитического тестирования. Особенно это касается возможности создания экспрессных тест-систем. Такое качество, как простота исполнения анализа, освобождает от необходимости подготовки квалифицированных специалистов, что часто бывает серьезной проблемой в условиях небольших отдаленных от крупных центров медицинских пунктов и лабораторий. Наглядность и очевидность полученных результатов анализов предохраняют от неоднозначности и субъективизма в их трактовке, а оперативность исполнения позволяет сократить до минимума время адекватной реакции, особенно в случаях необходимости экстренного принятия мер интенсивной терапии. Все это может и должно стать основой для скорейшего доведения описанных и перспективных моделей аналитических систем до готового к использованию состояния и перехода к масштабному выпуску диагностических тест-систем углеродного происхождения.

Описанные конкретные системы аналитического определения различных лигандов никоим образом не исчерпывают возможности применения, как разработанной технологии, так и спектра конструируемых на ее основе систем детекции. Все описанные аналитические модели и различным образом аранжированные форматные процедуры определения принципиально отличающихся лигандов служат лишь демонстрацией некоторых возможностей применения детектирующих реагентов, синтезированных на основе частиц углерода. Более того, представленные примеры и те, которые представляют собой лабораторные модели, и те, которые используются в реальной лабораторной аналитической практике (идентификация IgG, оценка уровня сероконверсии), могут быть отнесены к группе, так называемых, неинструментальных методов исследования. Но неинструментальность не является основной целью представляемого направления научных исследований, а потому, не ставится автором в ряд необходимых процедурных характеристик, оценивающих основные параметры сконструированных тест-систем с позиции их привлекательности. Есть все основания, в том числе и экспериментальные, полагать, что описанные диагностические реагенты могут быть с успехом использованы в разработке инструментально аранжированных методов, в частности, турбидиметрического анализа с использованием спектрофотометрии для формализации получаемых результатов и плашечного варианта твердофазного анализа с детекцией результатов в планшетном фотометре. Очевидно, что это позволит существенно модифицировать целый ряд диагностических методов исследования, находящихся в арсенале клинических лабораторий, но это уже цель будущих исследований. 

Необходимо отметить, что не все представленные аранжировки аналитических систем являются совершенными и технологичными. Нельзя, например, надеяться на то, что в любой лаборатории найдется прибор «Био-Дот» для нанесения образцов на мембрану и осуществления анализа. Отсюда - необходимость в дальнейшей разработке различных форматных аранжировок и процедурных приемов, основанных на использовании описанных свойств углеродных конъюгатов.

Таким образом, разработанная технология синтеза конъюгатов углеродных наночастиц может стать основой для конструирования широкого спектра эффективных систем для упрощенного диагностического тестирования, способных существенно расширить диапазон и повысить уровень информативной ценности и надежности фундаментальных и прикладных аналитических исследований в биологии, медицине, криминологии, сельском хозяйстве и т.д. Привлекательные характеристики таких тест-систем с успехом могут быть реализованы в разнообразных  "один пациент-один тест" набо­рах для амбулаторных, пребольничных и больничных анализов, вклю­чая срочные клинические и эпидемические ситуации, в массовых "домашних" системах, пригодных для индивидуального ис­пользования, в полевых условиях работы экспедиционных групп и службы воинских подразделений, в экстренных ситуациях работы бригад скорой помощи и отрядов МЧС. Ими могут быть укомплектованы все ветеринарные службы: от клинических ветлабораторий до сельских ветпунктов, мобильные аптечки, необходимые в повседневной практике сельскохозяйственного производства. Главное преимущество разработанной технологии, заключается в ковалентном механизме конъюгирования биореагентов и углеродных частиц, что способно обеспечить перспективу разработки и широкое внедрение диагностикумов, сконструированных на ее основе.

ВЫВОДЫ:

1. Разработана одноэтапная технология синтеза белково-углеродных конъюгатов, предусматривающая гидрофилизирующую пептизацию углеродных наночастиц аффинным соединением, активацию гомобифункциональным реагентом и конъюгирование, осуществляемые единовременно. Эффективность разработанной технологии воспроизведена в 54-х синтезах.

2. Получаемые конъюгаты могут сохранять свои аналитические и эксплуатационные свойства в условиях хранения при +4оС - +8оС в течение 10-ти лет. Кратковременные (2 недели) отклонения в сторону повышения температуры хранения до +22оС не вызывают негативного влияния на свойства диагностикумов.

3. Обоснована универсальная система определения иммуноглобулинов класса G человека и животных, позволяющая с высокой чувствительностью и специфичностью определять любые лиганды, обладающие сродством к G белку стрептококка, использованного в качестве аффинного соединения диагностикума.

4. Обоснованы системы иммуноаналитического определения ХГЧ, стрептококков группы А, альфа-фетопротеина и трофобластического -1-гликопротеина человека на основе антител. Охарактеризованы их аналитические параметры. Показана возможность качественного и полуколичественного определения лигандов в различных аранжировках: дот-анализ, иммунохроматография и иммунофильтрация.

5. Разработаны и апробированы универсальные методы определения различных лигандов (столбнячного и ботулинического анатоксинов, антител), основанные на свойствах и возможностях биотин-стрептавидинового взаимодействия, позволяющие различным образом аранжировать формат анализа. Показана возможность усиления результирующего сигнала, приводящая к увеличению чувствительности определения в 4 - 100 раз.

Практические рекомендации

  1. Рекомендовать научно-производственным подразделениям, работы которых связаны с выделением и очисткой биологических макромолекул из биоматериалов, использовать углеродные тест-системы для определения IgG. Это позволит иметь постоянную оперативную информацию о контаминированности материала. Кроме того,  станет возможным простой и достоверный контроль  состояния сорбентов в случаях применения аффинной хроматографии.
  2. Рекомендовать специалистам в области экспериментальной иммунологии  и ветеринарии использовать системы определения IgG для наблюдения за степенью сероконверсии при иммунизации животных в процессах получения антител, а также для оценки эффективности вакцинации.
  3. Рекомендовать специалистам Роспотребнадзора использовать системы экспрессного определения для оценки качества воды и пищевых продуктов.
  4. Рекомендовать научно-исследовательским лабораториям использование углеродных конъюгатов при конструировании систем анализа, основанных на принципах иммунного блоттинга, как более стабильных реагентов по сравнению с ферментными диагностикумами.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Статьи в журналах по перечню ВАК Минобрнауки РФ.

1. Кеворков Н., Черешнев В., Бахметьев Б., Раев М., Шилов Ю., Ширшев С., Шмагель К., Демаков В., Тузанкина И., Осипенко А., Королевская Л., Дианова Д., Черешнева М., Старкова Е., Ширшева И. Физиология иммунной системы и экология // «Иммунология».-2001. - №3. - С.12-16.

2. Раев М.Б., Орлова Е.Г., Горбунова О.Л., Красных М.С. Конструирование и применение универсальной тест-системы с использованием неферментных диагностикумов для безинструментального оценки уровня специфических антител // Биотехнология.- 2006.- №1.- С. 84-88.

3. Раев М.Б. Частицы коллоидного углерода в качестве меток диагностических реагентов // Вестник уральской медицинской академической науки.- 2006.- №3(1).- С.202 – 205.

4. Королевская Л.Б., Шмагель К.В., Раев М.Б., Николаева А.М. Определение размера и концентрации циркулирующих иммунных комплексов, дифференцированных по изотипам иммуноглобулинов // Вестник уральской медицинской академической науки. - 2006. - №3(1). - С.107-109.

5. Раев М.Б. Частицы коллоидного углерода в системах неинструментальной диагностики // Клиническая и лабораторная диагностика. – 2008. - №2. - С.44-49.

Статьи в журналах, сборниках, методические рекомендации для врачей.

6. Rayev М., Ambrosov I, Briko N. A novel method for the serodiagnosis of group A streptococcal antibodies. // Streptococci and the Host. Ad. Thea Horaud at al. Advances in Experimental medicine and biology.-Plenum Press, New York and London. - 1997. - V.418. - Р.327-329.

7. Ambrosov I, Rayev М., Briko N. A novel method for the primary diagnosis of group A streptococci from clinical specimens. // Streptococci and the Host. Ad. Thea Horaud at al. Advances in Experimental medicine and biology.-Plenum Press, New York and London. - 1997. - V.418. - Р.323-325,

8. Бахметьев Б., Шилов Ю., Ширшев С., Кеворков Н., Черешнев В., Раев М. Особенности функционирования иммунной системы у работников нефтяной отрасли в регионах проведения технологических подземных ядерных взрывов // Сб. научных работ «Проблемы экспериментальной физиологии». Москва-Екатеринбург. - 1997. - С.169-179. 

9. Кеворков Н., Черешнев В., Бахметьев Б., Раев М., Шилов Ю., Ширшев С.,  Шмагель К., Демаков В., Тузанкина И., Осипенко А., Королевская Л., Дианова Д., Черешнева М., Старкова Е., Ширшева И. Физиология иммунной системы и экология // ВИНИТИ Новости науки и техники, Серия: Медицина. Аллергология, астма и клиническая иммунология.-2000.- №8.-С.21-27.

10. Кеворков Н., Черешнев В., Бахметьев Б., Раев М., Шилов Ю., Ширшев С., Шмагель К., Демаков В., Королевская Л., Старкова Е., Ширшева И. Промышленное загрязнение окружающей среды и иммунная система // «Клиническая и прикладная иммунология». - 2001. - №1. - С.147-152.

11. Раев М., Плаксин Д., Кеворков Н., Черешнев В. Разработка новых тест-систем для неинструментального определения антител к ВИЧ-1 и ВИЧ-2. (Новый биотехнологический подход к диагностике) // Сборник «Научно-технический потенциал Западного Урала в области конверсии военно-промышленного комплекса». ISTC.-2001.-С.333-337.

12. Бахметьев Б.А., Кеворков Н.Н., Королевская Л.Б., Лихачева Н.С., Лопатина В.А., Молчанова Н.Н., Раев М.Б., Старкова Е.А., Шилов Ю.И., Ширшев С.В., Ширшева И.В., Харитонова А.В., Перевозчикова Н.Н.,  Езова Е.А., Токмакова О.Г. Основные показатели иммунограммы детей и взрослых Пермской области // Справочно-методический материал для врачей, Пермь.-2002.

13. Раев М.Б., Шмагель К.В., Черешнев В.А. Использование наночастиц углерода в иммунодиагностике // Вестник уральской медицинской академической науки. – 2007.-№3(17). - С.59-62.

Патенты

14. Плаксин Д., Раев М., Громаковская Е. Метод стереоспецифического анализа и метод получения конъюгата для стереоспецифического анализа. Патент РФ № 2089212 от 10.09.1997.

15. Раев М.Б., Плаксин Д.Ю. Способ определения иммунореактивных соединений. Патент РФ № 2268471от 20.01.2006.

16. Родионов С.Ю., Раев М.Б., Орлова Е.Г. Способ получения препарата альфа-фетопротеин сухой. Патент РФ № 2283131 от 10.09.2006.

17. Раев М.Б. Способ выделения и очистки альфа-фетопротеина. Патент РФ № 2302424 от 10.07.2007.

18. Раев М.Б. Способ получения конъюгата для стереоспецифического анализа. Положительное решение от 05.02.2007 о выдаче патента на изобретение по заявке № 20051128104/15(031560).

19. Раев М.Б., Шмагель К.В., Раев А.Б., Черешнев В.А., Демаков В.А., Бахметьев Б.А. Способ выделения и очистки трофобластического -1-гликопротеина. Положительное решение от 09.11.2007 о выдаче патента на изобретение по заявке № 2007100406/15(000429).

20. Раев М.Б. Способ защиты и стабилизации твердофазных реагентов иммуноаналитических систем. Положительное решение от 30.10.2007 о выдаче патента на изобретение по заявке № 2007103808/15(004097).

Тезисы докладов и статей.

21. Плаксин Д., Раев М., Громаковская Е. Новые системы детекции стереоспецифических взаимодействий с использованием водонерастворимых красителей // Тез. докл. на международном симпозиуме «Проблемы загрязнения окружающей среды, токсикология», Пермь-Москва, 16-26 июля, 1991, стр. 246-247.

22. Плаксин Д., Громаковская Е., Раев М., Якунина Н., Коваленко В., Товер А., Трифонов В., Павлова И. Новые подходы к неинструментальной экспресс диагностике // LXII Сессия общего собрания Академии мед. наук СССР, Москва, 19-23 марта, 1991.

23. Бахметьев Б.А Шилов Ю.И., Ширшев С.В., Евдокимова И.В., Леденцов В.В., Раев М.Б., Кокшаров С.И. Иммунологическая оценка критерий экологических групп риска детей // Тез. докл. международного симпозиума «Загрязнение окружающей среды, токсикология и эпидемиология». Москва-Пермь, 11-19 мая, 1993, стр. 126-127.

24. Черешнев В., Кеворков Н., Бахметьев Б., Раев М., Шилов Ю., Ширшев С. Вторичный иммунодефицит, индуцированный неблагоприятными условиями окружающей среды // Тез. докл. ICACI XV-EAACI'94, Стокгольм, Швеция, 1994, стр.1281.

25. Плаксин Д., Раев М., Громаковская Е. Новые реагенты для неинструментального стереоспецифического анализа на основе суспензоидных углеродных частиц // Тез. докл. конференции «Актуальные проблемы теоретической и прикладной иммунологии», Пермь, 1994.

26. Черешнев В., Кеворков Н., Бахметьев Б., Раев М., Шилов Ю., Ширшев С., Ширшева И., Леденцов В. Иммунные изменения у работников нефтяной отрасли в регионах проведения подземных ядерных взрывов // Intern. J. Immunorehabilitation, 1994,  № 1. 

27. Черешнев В., Бахметьев Б., Кеворков Н., Раев М., Шилов Ю., Ширшев С., Ширшева И. Иммунологические последствия подземных ядерных взрывов. Урал атомный: наука, промышленность, жизнь // Тез. докл. II Международного симпозиума, Екатеринбург, Ин-т промышленной экологии Уральского отделения РАН, 1994, С. 53-54.

28. Раев М. Тест-система для определения антител к ВИЧ–1,2 // Тез. докл. конференции «Актуальные проблемы теоретической и прикладной иммунологии», Пермь, 1994.

29. Chereshnev V., Kevorkov N., Bachmetyev B., Rayev M.B., Shilov Ju., Shirshev S. Secondary immunodeficiency induced by unfavourable environmental conditions. // Allergy & Clinical Immunology News, Suppl. № 2, 1994, P.195.

30. Черешнев В., Кеворков Н., Бахметьев Б., Раев М., Шилов Ю., Ширшев С. Иммунореабилитация экологических вторичных иммунодефицитных состояний // Intern. J. Immunorehab, 1995, № 1,

31. Черешнев В., Бахметьев Б., Кеворков Н., Раев М., Шилов Ю., Ширшев С., Ширшева И., Леденцов В. Иммунные и гематологические изменения у работников нефтяной отрасли в регионах проведения подземных ядерных взрывов // Тез. докл. XII Российской научной конференции, Челябинск, 1995, С. 115.

32. В.Черешнев, Н.Кеворков, Б.Бахметьев, М.Раев, Ю.Шилов, С.Ширшев.

Иммунореабилитация экологических вторичных иммунодефицитных состояний. Intern. J. Immunorehab, 1995, № 1.

33. Черешнев В., Кеворков Н., Бахметьев Б., Шилов Ю., Ширшев С., Раев М. Экологически стимулированный вторичные иммунодефицитные состояния // Международная конференция по нейроиммунным взаимодействиям и окружающая среда (ICONE”95), 17-24 июля, Санкт-Петербург, 1995, стр.102.

34. Раев М., Амбросов И., Брико Н. Новый метод прямой диагностики стрептококка гр.А. // Тез. докл. XIII Лэнсфилдского международного симпозиума по стрептококку и стрептококковым заболеваниям, Париж, Франция, 1996, С. 258.

35. Амбросов И., Раев М., Брико Н. Новый метод для серодиагностики стрептококка гр. А // Тез. докл. XIII Лэнгсфилдского международного симпозиума по стрептококку и стрептококковым заболеваниям, Париж, Франция, 1996, С.259.

36. Черешнев В., Бахметьев Б., Кеворков Н., Раев М., Шилов Ю., Ширшев С., Токмакова О. Влияние неблагоприятных условий окружающей среды на взаимоотношения возраста и иммунной системы детей // Тез. докл. 5  EFIT’96. Иерусалим, Израйль,1996.

37. Черешнев В., Бахметьев Б., Кеворков Н., Раев М., Шилов Ю., Ширшев С. Иммунологические критерии для оценки состояния здоровья населения при выраженной антропогенной нагрузке // Тез. докл. 2 конф. “Sustainable development: System analysis in Ecology”. Севастополь, Украина, 1996.

38. Раев М., Плаксин Д., Громаковская Е., Амбросов И. Тест-система для определения антител к ВИЧ-1 и ВИЧ-2 // Тез. докл.  AAAAI/AAI/CIS Joint Meeting. San Francisco, USA, 21-26 февраля, 1997.

39. Раев М., Плаксин Д., Громаковская Е., Амбросов И. Метод неинструментального стереоспецифического анализа на основе водонерастворимых цветных красителей // Доклад на 4м Национальном конгрессе «Человек и лекарства», Москва, 1997, С. 286-287 

40. Черешнев В., Бахметьев Б., Кеворков Н., Раев М., Шилов Ю., Ширшев С. Исследование иммунной системы в сочетании с оценкой экологического влияния на человека // Доклад на 1м Национальном конгрессе Российской ассоциации аллергологов и клинических иммунологов, Москва, 1997, С.345.

41. Черешнев В., Бахметьев Б., Кеворков Н., Раев М., Шилов Ю., Ширшев С. Значение мониторинга иммунной системы для предупреждения ее функциональных нарушений в регионах промышленных // XIIIя Российская научная конференция, Челябинск, 1997, С.182-183.

42. Черешнев В., Кеворков Н., Бахметьев Б., Шилов Ю., Ширшев С., Раев М., Королевская Л., Дианова Д., Черешнева М., Старкова Е. Вторичные экологически обусловленные иммунодефициты. // Фридмановские чтения. Тез. докл. Всероссийской научной конференции, Пермь, 1988, сС. 142-143.

43. Кеворков Н., Черешнев В., Бахметьев Б., Раев М., Шилов Ю., Ширшев С., Королевская Л., Дианова Д., Черешнева М., Старкова Е. Принципы иммунокоррекции вторичных иммунодефицитов // 2я Национальная конференция российской ассоциации аллергологов и клинических иммунологов, Москва, 1998.

44. Кеворков Н., Черешнев В., Бахметьев Б., Раев М., Шилов Ю., Ширшев С., Королевская Л., Дианова Д., Черешнева М., Старкова Е. Влияние выраженной антропогенной нагрузки на функционирование иммунной системы населения // Тез. докл. 2й Международной конференции к 100-летию НПО «Биомед», Пермь, 1998. 

45. Кеворков Н., Черешнев В., Бахметьев Б., Раев М., Шилов Ю., Ширшев С., Королевская Л., Дианова Д., Черешнева М., Старкова Е. Иммунотерапия и иммунореабилитация при вторичных иммунодефицитах // Тез. докл. Международной конференции «Загрязнение окружающей среды», Москва, 1998.

46. Бахметьев Б., Раев М., Старкова Е., Кеворков Н. Новый метод идентификации CD-положительных клеток // The FASEB Journal, 1998, т.12, № 4, часть 1, стр. A617.

47. Раев М., Плаксин Д., Громаковская Е. Многоцелевой стереоспецифический анализ на основе водонерастворимых цветных красителей // The FASEB Journal, 1998, т.12, № 4, часть 1, стр. A915.

48. Кеворков Н., Черешнев В., Бахметьев Б., Раев М., Шилов Ю., Ширшев С., Королевская Л., Старкова Е., Черешнева М., Тендрякова С. Экологически индуцированные иммунные нарушения // Тез. докл. IIIй Междунар. конгресс по патофизиологии. Лахти,  Финляндия, 1998.

49. Кеворков Н., Черешнев В., Бахметьев Б., Раев М., Шилов Ю., Ширшев С. Экология и иммунитет – патофизиологические аспекты // IIй Российский конгресс по патофизиологии, Москва, 2000, С.158.

50. Кеворков Н., Черешнев В., Бахметьев Б., Шилов Ю., Ширшев С., Раев М. Экология и иммунитет. // Аллергология и иммунология. 2000, Т.2, №3, С.11.

51. Раев М., Плаксин Д., Кеворков Н. Неферментная система визуализации в неинструментальной диагностике // Доклад на Iй конференции иммунологов Урала. Екатеринбург, Россия, 2001.

52. Раев М.Б., Плаксин Д.Ю., Громаковская Е.Т.. Безинструментальные методы неферментного стереоспецифического анализа // Тез. докл. на II конференции иммунологов Урала. Пермь, Россия, 2002.

53. Гупалова Т.В.,.Палагнюк В.Г, Раев М.Б., Тотолян А.А. Быстрый метод оценки микроальбуминурии // Тез. 15 IFCC-FESCC European Congress of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. 22 National Congress of the Spanish Society of Clinical Biochemistry and Molecular Pathology, Euromedlab Barcelona, Испания, 2003, С.156.

54. Раев М.Б., Орлова Е.Г.,.Красных М.С, Горбунова О.Л., Родионов С.Ю. Сравнительная оценка методов определения специфических антител к альфа-фетопротеину в сыворотке иммунизированных коз // «Медицинская иммунология», С.-Петербург, 2005, т.7, №2-3, С.279.

55. Раев М.Б.,  Горбунова О.Л., Красных М.С., Орлова Е.Г., Родионов С.Ю. Сравнительный анализ использования линейного и градиентного ПААГ на примере исследования электрфоретической чистоты альфа-фетопротеина // «Цитокины и воспаление», Новосибирск, 2005, т.4, №2, С.76-77.

56. Крапивина О.А., Родионов С.Ю., Ханжин С.К., Раев М.Б., Горбунова О.Л., Красных М.С., Орлова Е.Г. Особенности иммунизации коз для получения антител против альфа-фетопротеина человека в процессе серийного производства препарата «Профеталь» // «Цитокины и воспаление», Новосибирск, 2005, т.4, №2, С.119.

57. Раев М.Б., Зайцева А.В., Хорошева Л.Р., Суховая Д.А., Горбунова О.Л., Красных М.С., Орлова Е.Г., Родионов С.Ю. Проблемы иммуноаффинной очистки альфа-фетопротеина и методы негативной иммуносорбции как способ их решения // «Цитокины и воспаление»,  Новосибирск, 2005, т.4, №2, С.122.

58. Раев М.Б., Горбунова О.Л., Красных М.С., Орлова Е.Г., Родионов С.Ю. Оценка чувствительности различных методов определения специфических антител к альфа-фетопротеину в сыворотке иммунизированных коз // «Цитокины и воспаление»,  Новосибирск, 2005, т.4, №2, С.122-123.

59. Раев М.Б., Суховая Д.А., Хорошева Л.Р., Зайцева А.В., Родионов С.Ю. К вопросу о способах синтеза иммуносорбентов для аффинной хроматографии белков фетоплацентарного комплекса // «Цитокины и воспаление», Новосибирск, 2005, т.4, №2, С.123.

60. Раев М.Б., Горбунова О.Л., Красных М.С., Орлова Е.Г., Родионов С.Ю. Использование безинструментальных тест-систем для определения уровня специфических антител  // «Цитокины и воспаление», Новосибирск, 2005, т.4, №2, С. 123.

61. Шур Н.Н., Тараненко Л.А., Черешнев В.А., Родионов С.Ю., Орлова Е.Г., Раев М.Б., Сибиряк С.В.  Динамика иммунологических показателей у больных злокачественными опухолями при комбинированной и монотерапии препаратом «Профеталь» // Предварительные результаты. «Иммунология Урала», Уфа, 2005, № 1(4), С.159-161.

62. Раев М.Б., Орлова Е.Г., Горбунова О.Л., Красных М.С. Разработка универсальной тест-системы с использованием неферментного диагностикума для безинструментального определения уровня специфических антител // «Иммунология Урала», Уфа, 2005, № 1(4), С.192-194.

63. Раев М.Б. Универсальный подход к конструированию систем безинструментальной диагностики // Материалы Российской научно-практической конференции «Современные технологии в иммунологии: иммунодиагностика и иммунотерапия», Russian Journal of Immunology, Курск, 2006, V.9, №3, С.171.

64. Раев М.Б. Качественное и полуколичественное определение белков репродукции методами неинструментальной диагностики // Russian Journal of Immunology, Сочи, 2007, V.9, supl. 4, Р.136-137.

Автор выражает искреннюю благодарность всем участникам работы, чей вклад адекватно отражен в совместных публикациях. Глубокую благодарность и безграничную признательность автор выражает своему Учителю – профессору, заслуженному деятелю науки РФ, д.м.н. Николаю Николаевичу Кеворкову Особую признательность и благодарность автор выражает своему первому руководителю, автору идеи и инициатору темы углеродных конъюгатов, к.м.н. Дмитрию Юрьевичу Плаксину, без которого бы эта работа не состоялась.






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.