WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


 

На правах рукописи

Андаев Евгений Иванович

НАУЧНО-ОРГАНИЗАЦИОННЫЕ ОСНОВЫ ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКОГО  НАДЗОРА  ЗА  ПРИРОДНО-ОЧАГОВЫМИ И ОСОБО ОПАСНЫМИ ВИРУСНЫМИ ИНФЕКЦИЯМИ В ВОСТОЧ­НОЙ СИБИРИ 

14.00.30. - эпидемиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

доктора медицинских наук

Иркутск - 2009

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении здравоохранения «Иркутский ордена Трудового Красного Знамени научно – исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия  человека

Научный консультант:

Доктор биологических наук,

старший научный сотрудник Титенко Алексей Михайлович

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук,

профессор Малов Игорь Владимирович

Доктор медицинских наук Козлова Ирина Валерьевна

Доктор биологических наук  Чепурнов Александр Алексеевич

Ведущее учреждение: Федеральное государственное учреждение науки Государственный Научный Центр Вирусологии и Биотехнологии «Вектор»  Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Защита состоится «25»декабря 2009 г. в  «___» часов на заседании диссертационного совета Д 001.038.01 при Научном Центре проблем здоровья семьи и репродукции человека  СО РАМН  по адресу: 664025, г. Иркутск, ул. Карла Маркса, 3. Почтовый адрес: 664025, г. Иркутск, а/я 539

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке  Научного Центра проблем здоровья семьи и репродукции человека  СО РАМН

Автореферат разослан «______»_____________2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат медицинских наук,

старший научный сотрудник                                         В.М. Коган

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ



Актуальность исследований.  Эпидемиологический надзор и контроль за природно-очаговыми и особо опасными вирусными болезнями  в современных условиях приобретает особое значение в свете реализации стратегии борьбы с инфекционными болезнями, представленной в решениях саммита «Группы восьми» (2006г.), а также внедрения Международных медико-санитарных правил (ММСП, 2005 г.). Направления эпидемиологического надзора претерпевают изменения в связи с постановкой сложных задач по созданию глобальной сети надзора за возбудителями инфекционных болезней, способных к эпидемическому распространению, их раннему выявлению и разработкой ответных мер  (Постановление правительства РФ от 27.10.08 г. № 791 о Федеральной  целевой программе «Национальная система химической и биологической безопасности РФ (2009-2013 годы)», приказ Федеральной службы в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека № 88 от 17.03.08 г. «О мерах по совершенствованию мониторинга за возбудителями инфекционных и паразитарных болезней» и  ряд других изданных в последние годы нормативно-методических документов).  На чрезвычайную важность  слежения за природными очагами вирусных инфекций на территории России указывают, например,  беспрецедентные темпы роста заболеваемости клещевым энцефалитом (КЭ) в 90-е годы прошлого столетия; факты расширения ареала и роста численности клещей Hyalomma marginatum, что при отсутствии мониторинга привело к возникновению вспышки Крымской геморрагической лихорадки (КГЛ) в 1999 г. на юге России; сохраняющаяся высокая эпизоотическая активность природных очагов хантавирусов. Наблюдаются  изменения  вирулентности известных вирусов, а также проявление «новых и вновь возвращающихся инфекций»  (Аристова В.А. и др., 2001; Ткаченко Е.А. и др., 2001; Жукова Н.Г., 2002; Львов Д.К., 2002; Титенко А.М., 2004; Злобин В.И., 2004, 2005; Львов Д.К., Злобин, 2007; Локтев В.Б., 2007; Bries Т. et al., 2009).

В Восточной Сибири имеются природные очаги ряда вирусных  инфекций,  представляющих опасность для человека. По широте распространения, регистрируемой заболеваемости ведущее место занимает КЭ. Несмотря на многолетние исследования,  далеки от разрешения вопросы гетерогенности региональных популяций вируса КЭ  по  биологическим свойствам; происхождения и свойств  микст-штаммов; зависимости формы и тяжести клинического течения болезни от генотипа вируса; появления заболеваний КЭ с геморрагическими проявлениями; изменения географического распространения генотипов вируса КЭ; эволюции КЭ и эволюции возбудителя (Злобин В.И., Горин О.З., 1996; Борисов В.А. и др., 2002; Погодина В.В., 2005; Локтев В.Б. и др., 2007; Злобин В.И. и др., 2007; Погодина В.В. и др., 2007; Козлова И.В., 2008).

В пределах лесотундры, северной, средней и южной тайги распространены передаваемые комарами арбовирусы серогруппы Калифорнийского энцефалита (Инко, заяц-беляк, Тягиня), Батаи (Bunyaviridae), Гета (Togaviridae). С этими вирусами, особенно с вирусом Инко, связаны  сезонные  лихорадочные заболевания и доброкачественные  менингоэнцефалиты во второй половине лета (Горин О.З., 1994; Львов С.Д. и др., 1995; Злобин В.И., 1998; Чапоргина Е.А. и др., 2002).  Их роль в региональной заболеваемости и формировании популяционного иммунитета населения  Восточной Сибири,  а также  сведения  об экологии и местных биоценозах мало изучены. Этиология таких, как правило, спорадических заболеваний остается нераспознанной  врачами из-за нехарактерной клинической картины и отсутствия лабораторной диагностики.

Обнаружение вируса Западного Нила (ВЗН) в Западной Сибири позволяет предположить, что ВЗН значительно более широко циркулирует в России, чем считалось ранее (Львов Д.К., 2000; Локтев В.Б., 2003; Кононова Ю.В. и др., 2004, 2007, 2008). В Восточной Сибири заболевания лихорадкой Западного Нила (ЛЗН) не регистрируются, эпидемический потенциал природных очагов изучен  недостаточно и требует дополнительных исследований. 

При наличии данных о циркуляции хантавирусов среди диких мелких млекопитающих,  их роль  в инфекционной патологии человека на территории Восточной Сибири до сих пор недостаточно ясна.  Единичные вспышки и случаи заболевания людей геморрагической лихорадкой с почечным синдромом (ГЛПС) местного происхождения описаны на юге Якутии, в Омской области (Чернявский В.Ф., 1995; Чапоргина Е.А. и др., 2002; Якименко В.В., 2004). Углубленное изучение ареалов хантавирусов, структуры природных очагов и их значения в патологии человека в регионе весьма актуально.

Существует большая группа особо опасных вирусных инфекций, в том числе:  геморрагические лихорадки, вызываемые вирусами Эбола, Марбург, Ласса и новые инфекции: ТОРС, патогенный для человека вирус гриппа птиц H5N1, важных с точки зрения санитарной охраны территории. В связи с нарастанием эпидемического потенциала особо опасных инфекционных болезней,  задачи санитарной охраны территории региона требуют научно-обоснованного совершенствования  и должны быть скоординированы с положениями ММСП (2005 г.) (Прометной В.И., 2003; Федоров Ю.М., 2004; Онищенко Г.Г. и др., 2006, 2007; Черкасский Б.Л., 2008).

Важной составляющей частью эпидемиологического надзора является лабораторная диагностика (Черкасский Б.Л., 2001).  Усовершенствование и разработка методов лабораторной диагностики возбудителей особо опасных вирусных инфекций (ООВИ) приобретает особую актуальность в связи с существующей угрозой  их заноса на территорию страны (Дроздов С.Г., Сергиев В.П., 1984; Чепурнов А.А. и др., 2001; Титенко А.М., 2005).

Таким образом, постановка новых задач по мониторингу природно-очаговых вирусных инфекций в условиях глобального распространения инфекционных болезней, появления новых и «возвращающихся» инфекций и угроза заноса особо опасных вирусов на неэндемичные территории явились основанием для проведения данных исследований.

Цель исследования дать научное обоснование совершенствования эпидемиологического надзора в Восточной Сибири за природно-очаговыми  и особо опасными  вирусными инфекциями в условиях глобализации распространения инфекционных болезней.

Для достижения этой цели поставлены следующие задачи:

1. Разработать базу данных «ОСОБО ОПАСНЫЕ ВИРУСНЫЕ ИНФЕКЦИИ», и, используя ее,  дать оценку современной эпидемиологической ситуации в мире по контагиозным вирусным геморрагическим лихорадкам и некоторым особо опасным вирусным болезням и, в соответствии с ММСП (2005 г.), оценить их актуальность с точки зрения заноса  и формирования вторичных очагов на неэндемичных территориях Восточной Сибири.

2. Усовершенствовать методы  лабораторной диагностики особо опасных вирусов Марбург и Эбола (семейство Filoviridae)  для осуществления эпидемиологического надзора в системе санитарной охраны территории от завоза вызываемых ими  геморрагических лихорадок.

3. Создать базу данных «ПРИРОДНО-ОЧАГОВЫЕ ВИРУСНЫЕ ИНФЕКЦИИ, ЭНДЕМИЧНЫЕ ДЛЯ РОССИИ» и применить ее для эпидемиологической характеристики природно-очаговых вирусных инфекций на территории Восточной Сибири.

4. Для повышения качества эпидемиологического надзора  разработать алгоритм вирусологического мониторинга природных очагов КЭ, основанный на комплексном  использовании биологической изоляции (лабораторные животные, культура клеток), серологических  (ИФА, МФА) и молекулярно-генетических  методов с целью выявления наиболее широкого спектра циркулирующих в природном очаге вариантов вируса.

5. Изучить биологические и молекулярно-генетические свойства штаммов  вируса КЭ, изолированных от людей и иксодовых клещей в региональных природных очагах.

6. На основе комплексного серологического  мониторинга  природных очагов арбовирусных инфекций изучить популяционный иммунитет у населения и сельскохозяйственных животных  к  вирусам КЭ, Инко, Гета, Батаи, Западного Нила и хантавирусам на  территории Восточной Сибири и уточнить границы ареала хантавирусов.

7. Обосновать дифференцированный подход к эпидемиологическому надзору за природно-очаговыми и особо опасными вирусными инфекциями с учетом распределения их в группы разного уровня  эпидемиологической значимости для региона и наметить пути совершенствования эпидемиологического надзора.

Научная новизна работы: Впервые обоснован дифференцированный подход к эпидемиологическому надзору за природно-очаговыми и особо опасными вирусными инфекциями с учетом распределения их в группы разного уровня  эпидемиологической значимости для региона: 1) с регистрируемой заболеваемостью – КЭ, бешенство; 2) широко распространенные в регионе арбовирусные инфекции –  Инко, Батаи, зайца-беляка, Тягиня, Гета; 3) малоизученные, роль которых в патологии населения Восточной Сибири требует  уточнения – лихорадка Западного Нила, ГЛПС; 4) экзотические особо опасные вирусные инфекции  I-II групп патогенности, включенные в перечень, на которые распространяются правила санитарной охраны территории.

Анализ современной эпидемиологической ситуации показал, что за последние годы происходят существенные изменения эпидемических проявлений геморрагических лихорадок  Эбола, Марбург. Очевидна глобализация эпидемического процесса - масштабность, рост заболеваемости, сокращение интервалов между эпидемическими вспышками,  нарастание опасности заноса инфекции из очага на неэндемичные территории.  Проведена оценка вероятности заноса наиболее актуальных в плане санитарной охраны особо опасных вирусных инфекций на территорию Восточной Сибири и возможности формирования вторичных очагов.

На основании впервые полученных данных динамики экспрессии вирусспецифических антигенов Марбург и  Эбола в культуре клеток Vero оптимизирован непрямой метод флюоресцирующих антител. Впервые для выявления антител к вирусам Марбург и Эбола разработана тест-система клеточного иммуноферментного анализа. Впервые разработана реакция нейтрализации в культуре клеток для вируса Эбола.

Получены новые данные о генетической гетерогенности популяции вируса  клещевого энцефалита - показано, что структура популяции в Забайкальском крае сформирована на основе сибирского и дальневосточного генотипов с доминированием дальневосточного генотипа. Большинство изученных штаммов характеризуются высокой церебральной активностью для белых мышей.  Показано, что в очаге совместной циркуляции разных подтипов появляются микст-штаммы вируса КЭ; впервые в природных очагах в Приангарье и Забайкалье изолированы пять таких штаммов,  в которых сочетались генетические признаки сибирского и дальневосточного подтипов.

Впервые на основе комплексного изучения биологических и молекулярно-генетических свойств  штаммов вируса КЭ, выделенных от умерших в 1995-2003 гг. больных в Забайкальском крае,  показано, что  заболевания  обусловлены двумя самостоятельными подтипами вируса  – дальневосточным и сибирским. Приведены новые доказательства способности сибирского подтипа вызывать очаговые формы КЭ  с летальным исходом. Очаговые формы  связаны и с микст-штаммами вируса КЭ.

Впервые разработана и применена комплексная система изоляции и типирования вируса КЭ из иксодовых клещей, включающая применение ИФА, новорожденных белых мышей (НБМ) и культуру клеток (КК) при различных температурных режимах культивирования, ОТ-ПЦР и генотипирование.

Получены новые сведения о территориальной неоднородности проявления природных очагов  «комариных» арбовирусных инфекций – активность циркуляции вируса  Инко выше на северных территориях региона. Показано наличие у населения Восточной Сибири иммунной прослойки к вирусу Западного Нила  (в среднем 3,3 %). Установлено, что антитела к ВЗН в крови пациентов с поражением нервной системы обнаруживаются  достоверно с более высокой частотой, чем среди других амбулаторных больных и обследованного населения. Значительно расширилось представление об ареале хантавирусов и их носителей на территории Восточной Сибири. Доминирующими носителями в Восточной Сибири являются: для таежной зоны в Республике Саха-Якутия  – красная и красно-серая полевки;  для степной зоны, чередующейся  с участками соснового леса и березняка с кустарником в Иркутской области – узкочерепная полевка, полевка экономка;  для степной зоны в Забайкальском крае – узкочерепная полевка и джунгарский хомячок.

Теоретическая значимость работы: Результаты анализа современных эпидемиологических особенностей особо опасных вирусных инфекций дают  теоретическое обоснование их актуальности  с точки зрения риска заноса и возможности распространения на неэндемичные территории. Теоретический интерес представляют также данные о микст-штаммах вируса КЭ, содержащих генетический материал двух подтипов – дальневосточного и сибирского. В теоретическом аспекте сведения о штаммах сибирского подтипа, вызывающих очаговые формы с летальным исходом, могут внести свой вклад в изучении патоморфоза КЭ. Комплексный подход к серологическому мониторингу природных очагов арбовирусов, основанный на одновременном скрининге широкого спектра вирусов, дает теоретическую основу для организации эпидемиологического надзора за ними.

Практическое значение работы: Созданные базы данных «ОСОБО ОПАСНЫЕ ВИРУСНЫЕ ИНФЕКЦИИ», «ПРИРОДНООЧАГОВЫЕ ВИРУСНЫЕ ИНФЕКЦИИ, ЭНДЕМИЧНЫЕ ДЛЯ РОССИИ» могут быть использованы для оценки распространения особо опасных вирусных  инфекционных болезней в мире, возможности завоза болезней на территорию региона и их распространения, состояния природных очагов особо опасных вирусов, эндемичных для региона, а также для характеристики возбудителей по биологическим свойствам, методам лабораторной диагностики, профилактики и лечения.

Вирусологический мониторинг природного очага на основе предложенного комплексного подхода к выделению вируса позволяет изолировать большее количество штаммов и получить близкую к реальности картину циркулирующих гетерогенных вариантов вируса КЭ, что важно при разработке протективных и диагностических препаратов.  Полученные  данные о том, что из клещей I. persulcatus, давших отрицательный результат в ИФА, можно изолировать вирулентные для белых мышей штаммы вируса КЭ (16,2 %), доказывают необходимость включения в экспресс-диагностику КЭ дополнительных методов в центрах профилактики клещевых инфекций.

Сведения о штаммах вируса КЭ, содержащих генетический материал двух подтипов – дальневосточного и сибирского,  послужили основой для усовершенствования лабораторной  диагностики, позволяющей выявлять разными молекулярно-генетическими методами микст-штаммы, отличающиеся количественным соотношением генетического материала  разных подтипов вируса. 

Сформирована коллекция из 164 штаммов вируса КЭ, выделенных от людей, клещей  и мелких млекопитающих, которая, с учетом обширной коллекции штаммов Иркутского НИПЧИ Сибири и Дальнего Востока,  в дальнейшем  позволит изучать эволюцию популяции вируса КЭ в хронологическом и территориальном аспектах в условиях меняющейся экологической и эпидемиологической обстановки.

Данные по экспрессии антигенов вирусов Марбург и Эбола в культуре клеток позволяют оптимизировать процесс  приготовления слайд-антигенов и правильно оценивать результаты выявления антигенов вирусов Эбола и Марбург в инфицированных клетках методом флуоресцирующих антител. Разработанный метод клеточного  ИФА может быть применен при выявлении антител к вирусам Эбола и Марбург в сыворотках крови.  Выявление у зараженных вирусом Эбола морских свинок вируснейтрализующих антител дает основания для разработки вакцин и специфических противовирусных иммунопрепаратов. На моделях геморрагических лихорадок Эбола и Марбург разработана схема лабораторной диагностики этих инфекций, позволяющая при исследовании материала выявлять как вирулентные, так и слабовирулентные варианты вирусов и проводить их идентификацию. Схема отработана в лабораторных условиях и испытана на практике при обследовании больной М. из г. Корсакова с диагнозом «геморрагическая лихорадка Марбург?».

  Результаты исследований нашли отражение в приведенных ниже документах:

1. Методические рекомендации по проверке герметичности боксов биологической защиты и эффективности работы бактериальных фильтров в системе вентиляции. Утверждены заместителем Председателя Госкомсанэпиднадзора России.  № 01-19/41-17 от 17.03.96 г. 

2. Методическое пособие по лабораторной диагностике возбудителей геморрагических лихорадок Эбола и Марбург. Утверждено заместителем Председателя Госкомсанэпиднадзора России. № 01-19/35-17 от 17.03.96 г.

3. Руководство по специальной подготовке специализированных противоэпидемических бригад для работы в чрезвычайных ситуациях. Утверждено Первым заместителем Министра здравоохранения РФ, Главным государственным санитарным  врачом  Российской  Федерации 31.01.99 г.

4. Методические указания «Организация, обеспечение и оценка противоэпидемической готовности медицинских учреждений к проведению мероприятий в случае заноса особо опасных инфекций, контагиозных вирусных геморрагических лихорадок, инфекционных болезней неясной этиологии, представляющих опасность для населения Российской Федерации и международных сообщений». Представлены для утверждения в экспертный совет Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (октябрь 2009 г.).

5. Методические указания «Организация и проведение первичных мероприятий в случае выявления больного (трупа), подозрительного на заболевания инфекционными болезнями, вызывающими чрезвычайные ситуации в области санитарно-эпидемиологического благополучия населения». Представлены для утверждения в экспертный совет Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (октябрь 2009 г.).

6.  Созданы и зарегистрированы в Федеральной службе по интеллектуальной собственности, патентам и товарным знакам базы данных «ОСОБО ОПАСНЫЕ ВИРУСНЫЕ ИНФЕКЦИИ (ООВИР), «ПРИРОДНО-ОЧАГОВЫЕ ВИРУСНЫЕ ИНФЕКЦИИ, ЭНДЕМИЧНЫЕ ДЛЯ РОССИИ». Свидетельства о регистрации № 200560252 от 5 октября 2005 г., № 2008620011 от 9 января 2008 г. соответственно.

7. Руководство по диагностике особо опасных вирусных геморрагических лихорадок. Утверждено директором Иркутского НИПЧИ Сибири и ДВ 2.03.83 г.

8. Руководство по противоэпидемическому режиму работы с особо опасными вирусами I группы. Иркутск, 1991. Утверждено директором Иркутского НИПЧИ Сибири и ДВ 15.07.1991 г.

9. «Методические рекомендации по выявлению антител к вирусу КЭ методом клеточного иммуноферментного анализа». Утверждены директором Иркутского НИПЧИ Сибири и ДВ 9.07.1998 г.

10. Редко регистрируемые и малоизученные природно-очаговые вирусные инфекции в Восточной Сибири (информационно-методическое письмо). Утверждено директором Иркутского НИПЧИ Сибири и ДВ 24.04.2003 г.

11. Создание информационной  базы данных для характеристики и анализа эпидемической ситуации в мире по особо опасным вирусным инфекциям (методические рекомендации). Утверждены директором Иркутского НИПЧИ Сибири и ДВ 27.06. 2005 г.

Материалы диссертационной работы были использованы при подготовке практического руководства «Лабораторная диагностика опасных инфекционных болезней» / Под ред. академика РАМН, профессора Г.Г. Онищенко и чл-корр. РАМН, профессора В.В. Кутырева. – М.: Издательства «Медицина»,  «Шико», 2009. – 472 с.,  используются при чтении лекций в Иркутском научно-исследовательском противочумном институте Сибири и Дальнего Востока на курсах первичной специализации и повышения квалификации врачей и биологов по особо опасным инфекциям, а также на курсах подготовки специалистов региональных управлений Роспотребнадзора Сибири и Дальнего Востока по международным медико-санитарным правилам (2005 г.) и санитарной охране территории Российской Федерации.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. База данных «ОСОБО ОПАСНЫЕ ВИРУСНЫЕ ИНФЕКЦИИ» для оценки распространения особо опасных вирусных  инфекционных болезней в мире, их актуальности с точки зрения возможности заноса на территорию региона и формирования вторичных очагов.  Усовершенствованные  методы  лабораторной диагностики геморрагических лихорадок Марбург и Эбола  для осуществления эпидемиологического надзора за ними в системе санитарной охраны территории.

2. Из природно-очаговых вирусных инфекций в Восточной Сибири регистрируется заболеваемость только КЭ и бешенством. Динамика заболеваемости КЭ в Восточной Сибири за изучаемый период, характеризующаяся отчетливыми  пиками подъема (1992, 1996, 1999 и 2001) и снижения (1993, 1997 и 2000 гг.). Тенденция к снижению уровня заболеваемости после 1999 г. Снижение среднемноголетнего показателя  во всех субъектах  Западной  Сибири (за исключением Республики Алтай) и увеличение в субъектах Восточной Сибири  от  1,5 до 7,5  раз.

3. Разработанный алгоритм вирусологического мониторинга природного очага, позволяющий выявлять более широкий спектр гетерогенных по чувствительности к системам изоляции вариантов вируса КЭ. Генетическое разнообразие популяции вируса КЭ на территории Прибайкалья и Забайкалья:  изолированные штаммы вируса сибирского и дальневосточного подтипов, а также микст-штаммы содержат генетический материал обоих генотипов. Доказательства способности сибирского подтипа вызывать очаговые формы болезни с летальным исходом.

4. На большинстве обследованных территорий Восточной Сибири существуют природные очаги  арбовирусов  Инко, Гета, Батаи  с территориальной  неоднородностью проявления по уровню иммунной прослойки у населения и сельскохозяйственных животных. Данные серологического мониторинга, свидетельствующие о циркуляции возбудителя лихорадки Западного Нила. Уточнение представления об ареале хантавирусов в Восточной Сибири.

5.  Дифференцированный подход к эпидемиологическому надзору за природно-очаговыми  и особо опасными вирусными инфекциями, заключающийся в распределении  их в группы разного уровня эпидемиологической значимости для региона на основе анализа эпидемиологических данных, результатов вирусологического и серологического мониторинга. Пути повышения эффективности эпидемиологического надзора, заключающиеся в оптимизации  вирусологического, серологического, молекулярно-генетического  мониторинга природных очагов и  мероприятий по санитарной охране территории от заноса особо опасных вирусных инфекций.

Апробация материалов диссертации. Материалы диссертации были представлены на следующих научных конференциях: «Генетика  и биохимия вирулентности  возбудителей особо опасных инфекций». – Волгоград, 1992; International  Scientific conference «Tick-borne viral, rickettsial and  bacterial infections». – Irkutsk,1996; научно-практической конференции, посвященной 100-летию образования противочумной службы России. – Саратов, 1997; 5-th International Potsdam Symposium on Tick-borne Diseases «Tick-borne Encephalitis and Lyme Borreliosis». – Berlin, Germany, 1999; международной научной конференции «Проблемы биологической  и экологической безопасности». – Оболенск, 2000; международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы обеспечения здоровья международных путешественников». – Улан-Удэ, 2001; 6-th International Potsdam Symposium on Tick-borne Diseases. – Berlin, Germany, 2001; международной научно-практической конференции «Прикладная экология Севера. Опыт проведенных исследований. Современное состояние и перспективы». – Якутск, 2003; Президиуме Восточно-Сибирского научного Центра Сибирского отделения РАМН. –  Иркутск, 2004; конференции, посвященной 70-летию Противочумного центра «Противочумные учреждения России и их роль в обеспечении эпидемиологического благополучия населения страны». –  Москва, 2004; научно-практической конференции с международным участием «Современная ситуация и перспективы борьбы с клещевыми инфекциями в ХХI веке». – Томск, 2006; VII Межгосударственной  научно-практической конференции государств-участников СНГ «Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении и санитарная охрана территории государств - участников Содружества Независимых Государств». – Оболенск, 2006;  научно-практической конференции «Современные аспекты эпидемиологического надзора за особо опасными инфекционными заболеваниями на юге России». – Ставрополь, 2007; VIII Межгосударственной  научно-практической конференции государств-участников СНГ «Международные медико-санитарные правила и реализация глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями в государствах-участниках Содружества Независимых  Государств». – Саратов, 2007;  Юбилейной конференции, посвященной 70-летию открытия клещевого энцефалита. –  Владивосток, 2007;  Всероссийской научной конференции «Современные научные и прикладные аспекты клещевого энцефалита (к 70-летию открытия вируса клещевого энцефалита)». – Москва, 2007; IХ Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Современные технологии в реализации глобальной стратегии борьбы с инфекционными заболеваниями на территории государств-участников СНГ». – Волгоград, 2008; Международной  научно-практической конференции «Перспективы сотрудничества государств – членов ШОС в противодействии угрозе инфекционных болезней». – Новосибирск, 2009;  научных конференциях Иркутского противочумного института. В завершенном виде работа доложена на научной конференции Иркутского НИПЧИ Сибири и Дальнего Востока 6 августа 2009 г.

Публикации. Работа выполнялась в рамках пяти научных тем (№№ ГР: 01.8.80009517; 01.9.30009498; 01.9.80010187; 01.9.80010188; 0120.0503361), выполненных при непосредственном участии соискателя в качестве исполнителя, ответственного исполнителя и руководителя. По теме диссертации опубликовано 65 работ, в том числе 11 – в журналах, рекомендованных ВАК, 3 – в международных журналах.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 7 глав собственных исследований, заключения и выводов. Список литературы содержит  398 источников, в том числе 205 работ зарубежных и 193 работы отечественных авторов. Работа изложена на 332 страницах, иллюстрирована 41 таблицей и 40 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

  Материалы. Сведения о заболеваемости особо опасными вирусными болезнями взяты из сводок ВОЗ, научных публикаций, в сети Интернет с помощью специализированных поисковых программ Pub Med Search, Bio Med Net, OPAC-R, Current Option Online, Elsevier Trends Journal, ASM Journal Online и др. Рефераты и оригинальные статьи систематизированы по основным группам и видам вирусов. Информация заложена в разработанные нами электронные базы данных, включающие более 6 тысяч источников. Данные о заболеваемости КЭ с 1988-1997 гг. получены из региональных центров Госсанэпиднадзора (Алтайский, Красноярский, Забайкальский края; Республики Алтай, Бурятия, Тыва, Хакасия; Кемеровская, Новосибирская, Омская, Томская и  Иркутская области) по разработанной нами форме, включающей сведения: абсолютный и интенсивный показатели заболеваемости; структура заболевших по полу, возрасту, принадлежность к месту жительства (город/село); вакцино- и иммунопрофилактика; численность и вирусофорность клещей. С 1998 по 2005 гг. использованы официальные данные  ежегодной статистической отчетности по инфекционной заболеваемости. Эпидемиологический анализ по КЭ в г. Иркутске и Иркутской области основан на годовых статистических отчетных материалах (Ф. № 85 «Отчет о движении инфекционных заболеваний»), первичной документации (Ф. № 357 «Карта эпидемиологического обследования очага инфекционного заболевания») Управления Роспотребнадзора по Иркутской области.

Информация по международным пассажирским перевозкам получена из управлений  Роспотребнадзора  по территориям региона.

Общее количество собранного на пяти административных территориях Восточной Сибири – Иркутской области, бывшем Усть-Ордынском Бурятском автономном округе (УОБАО), Республиках Саха (Якутия) и Бурятия, Забайкальском и Красноярском краях и исследованного полевого материала представлено в таблице 1.

Таблица 1

Общее количество исследованного полевого материала

Вид материала

Количество проб

Секционный материал от умерших людей с диагнозом  «клещевой энцефалит»

14

Сыворотки крови населения  (пациенты больниц, поликлиник, амбулаторий, здоровые лица)

2722

Сыворотки крови сельскохозяйственных животных

1678

Материал от диких теплокровных животных

1546

Иксодовые клещи, собранные с растительности

12597

В работе использовали музейные штаммы следующих вирусов:  клещевого энцефалита (штаммы Софьин, Айна/1448, 256); Инко -  штамм 620; Гета -  штамм 2925; Батаи - штамм 2513; Марбург - штамм Voege (ГКВ № 886);  Эбола - Заирский штамм (ГКВ № 885). Клеточные культуры: СПЭВ, Vero, Vero Е6, BGM.

Методы. Для рассмотрения сведений по эпидемиологическим проявлениям нозологических форм особо опасных вирусных инфекций составлены аналитические обзоры по общему плану с учетом разработанных нами критериев и признаков, позволяющих оценить важность той или иной вирусной инфекции с точки зрения санитарной охраны территории. По опубликованным материалам проведен ретроспективный анализ заболеваемости ООВИ в эндемичных странах и регионах. Проанализированы материалы официальной статистики по заболеваемости особо опасными вирусными инфекциями в Российской Федерации.





Для проведения сравнительного анализа заболеваемости КЭ были  проанализированы данные в целом по Российской Федерации и субъектам Сибирского федерального округа. Оценка основных эпидемиологических проявлений КЭ (интенсивность, динамика, пространственная характеристика, структура) проведена на основе общепринятых методов эпидемиологического анализа (Савилов Е.Д. и др., 1993; Зуева Л.П., Яфаев Р.Х., 2005).  Территориальное распределение заболеваемости оценивали путем ранжирования средних за 18 лет показателей по субъектам СФО с нанесением на схему.

Проанализировано количество международных  пассажирских перевозок в динамике воздушным, железнодорожным и автомобильным транспортом из стран, эндемичных по различным опасным вирусным инфекциям. Территориальное распределение степени опасности заноса  болезней, в отношении которых необходимы мероприятия по санитарной охране территории, оценивали путем ранжирования показателей в баллах по шести субъектам Восточной Сибири с нанесением на схему. Показатели включали наличие: международного аэропорта, железнодорожного узла с пунктами пропуска через государственную границу, международного автомобильного пункта пропуска через государственную границу, приграничной территории, пассажиропотока из эндемичных стран; численность населения.

Для обработки, анализа и хранения информации разработаны и  созданы информационные базы данных ОСОБО ОПАСНЫЕ ВИРУСНЫЕ ИНФЕКЦИИ (ООВИР) и ПРИРОДНО-ОЧАГОВЫЕ ВИРУСНЫЕ ИНФЕКЦИИ, ЭНДЕМИЧНЫЕ ДЛЯ РОССИИ на персональном компьютере на основе программы Microsoft Access TM 97/2000/XP © Microsoft Сo.

Для изучения гуморального иммунитета людей и сельскохозяйственных животных к вирусу КЭ, арбовирусам  Инко, Гета и Батаи применяли  реакцию нейтрализации (РН) в  культуре клеток СПЭВ с постоянной  дозой вируса –  100  ТЦПД 50. 

       Для изоляции вируса КЭ из иксодовых клещей применили разработанный нами комплексный подход: положительные в ИФА суспензии клещей исследовали параллельно на беспородных 1-2 дневных новорожденных белых мышах и в культуре клеток при температурах культивирования 37 и 28 оС. Отрицательные в ИФА суспензии клещей  объединяли в пулы по 5-10 экз. и исследовали параллельно на НБМ и в КК СПЭВ или Vero при температурах культивирования 37 и 28 оС. За 1995-1998 гг. изучения очагов клещевого энцефалита в четырех районах Иркутской области нами выделено 130 штаммов от иксодовых клещей: I. persulcatus (123), Dermacentor silvarum (2) и D. nuttalli (5). Идентификацию выделенных агентов проводили методом ИФА (мозг) и НМФА (культура клеток).

Биологические свойства штаммов вируса КЭ  изучали на беспородных белых мышах массой 6-8 и 20-25 г. Для оценки нейровирулентности штаммов и их инвазивных свойств животных массой 6-8 г заражали двумя способами: внутримозговым, и подкожным. Титр вируса подсчитывали по методу Рида и Менча (Reed L.J, Muench, H., 1938) и выражали в ЛД50/мл.  Инвазивные свойства оценивали по индексу инвазивности (ИИ).  Гемагглютинирующую активность штаммов оценивали в реакции гемагглютинации с эритроцитами гуся в диапазоне рН 5,8-6,2. Всего  за период выполнения  работы использовано следующее количество  лабораторных животных: НБМ – 28064; белые беспородные мыши массой: 6-8 г – 2340, массой 20-25 г  - 2025 экз.

В экспериментах с вирусами Марбург и Эбола использовали 980 нелинейных морских свинок массой 150-170, 200-250, 350-400 г.  Для иммунизации (8 схем) применяли морских свинок массой от 200  до 350-450 г.

Титрование вирусов КЭ, Инко, Гета, Батаи, Марбург, Эбола  по ЦПД  проводили в 96-луночных планшетах фирмы "Linbro" в культуре клеток Vero или СПЭВ. Титрование вирусов Марбург и Эбола по бляшкообразованию проводили под агаровым покрытием следующего состава: агар Purified «Difco» - 1,00 г, сухая среда МЕМ – Autopow «Flow» – 0,96 г, L-глутамин «Flow» – 300 мг, СПК «Serva» –  256 мг, DEAE-dextran «Sigma» – 25 мг, гентамицин «Flow» – 10 мг, вода деионизованная  – до 100 мл.

Серийные пассажи вирусов Марбург и Эбола приводили в стационарной культуре клеток Vero, выращенной в полистироловых флаконах № 25 и № 75 фирмы «Linbro». 

       Для изучения динамики экспрессии вирусспецифических антигенов вирусов Марбург и Эбола использовали двухсуточный монослой клеток Vero, выращенных на покровных стеклах, помещенных в лунки 24-луночных планшетов фирмы «Flow».

Для обнаружения антигена вируса КЭ в клещах использовали собственные экспериментальные серии тест-системы для ИФА и коммерческую производства ФГУП НПО «Микроген», Томск.

Антиген хантавирусов (ГЛПС) выявляли с помощью ИФА (тест-система «Хантагност» предприятия Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им М.П. Чумакова РАМН, Москва).

  Непрямой метод флюоресцирующих антител применяли для выявления  вирусспецифических антител в сыворотках крови людей и животных, экспериментально инфицированных животных, а также для идентификации агентов, изолированных из полевого материала. Слайд-антигены  готовили  из инфицированной соответствующим вирусом клеточной культуры (СПЭВ, Vero,  BGM,) по методике, сходной с описанной H. Wulff and J.V. Lange (1975).

Антитела к хантавирусам (ГЛПС) в сыворотках крови  людей определяли в НМФА с культуральным поливалентным диагностикумом (предприятие Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им М.П. Чумакова РАМН, Москва).

Антитела к вирусу Западного Нила  в сыворотках крови людей определяли методом ИФА на на тест-системе ЗАО «ЭКОлаб»  (г. Электрогорск, Московская область).

Вируснейтрализующую активность иммунных сывороток морских свинок к вирусу Эбола определяли методом редукции бляшек в культуре клеток BGM.

Полимеразная цепная реакция.  РНК из клещей экстрагировали с помощью следующих наборов реагентов: универсальный набор для выделения нуклеиновых кислот («Клинбиотех-М»), РИБО-золь («АмлиСенс») в соответствии с инструкцией изготовителя. Праймеры к вирусу КЭ синтезированы С.И. Беликовым в Лимнологическом институте СО РАН (Иркутск) на основе анализа опубликованных последовательностей генома этого вируса:  CCATTTGGCATTTGGAC (праймер R1(1663) правый), позиции 240-243; GTCGTGAACGTGTTGAGA (праймер L2  (1664) левый), позиции 83-101. Обратную транскрипцию для получения к-ДНК проводили с наборами  «PEBEPTA-R-100» («АмплиСенс») и «Acces RT-PCR System» для обратной транскрипции и ПЦР (фирмы «Promega»). Амплификацию проводили с универсальным набором ПЦР («Клинбиотех-М») на циклере «Терцик» МС2 фирмы «ДНК-Технология». Ампликоны разделяли методом электрофореза в 2 % агарозном геле (“Sigma” США) в ТВЕ буфере с бромидом этидия в концентрации 0,3 мкг/мл. РНК хантавирусов определяли с помощью набора АмплиСенс Hantavirus производства ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора в соответствии с инструкцией изготовителя.

Генотипирование вируса клещевого энцефалита  выполнили на базе ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора  совместно с  н.с. Л.С. Карань путем применения трех методов: ПЦР в режиме реального времени с гибридизационно-флюоресцентной детекцией с генотипоспецифическими зондами; секвенирование фрагмента гена белка Е длиной 211 нуклеотидных оснований, содержащего маркерную аминокислоту в 206 позиции; анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (Карань Л.С. и др., 2006,2007). Всего генотипирован 61 штамм (из них 47 изолированы из таежных клещей и 14 из секционного материала от умерших людей).

Статистическая обработка материалов исследований. Инфекционный титр вирусов в экспериментах на клеточных культурах и лабораторных животных вычисляли общепринятым методом Рида и Менча (1938). Статистическую обработку материала проводили в соответствии с общепринятыми методами биологической статистики (среднее значение и стандартная ошибка, регрессионный и корреляционный анализы) (Савилов Е.Д. и др., 1993). Различия между двумя группами по средним показателям оценивались с применением критерия Стьюдента. Расчеты проведены с применением прикладной программы Microsoft “Exel” 2007.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Анализ заболеваемости природно-очаговыми и особо опасными  вирусными инфекциями с применением сформированных баз данных

Из всего многообразия опасных для человека трансмиссивных вирусных инфекций в Восточной Сибири имеются природные очаги, экологически связанные с вирусами: КЭ, бешенства,  Инко, Гета, Батаи, Западного Нила, хантавирусами.  Из них регистрируется заболеваемость только КЭ и бешенством. В таблице 2 суммированы сведения по природно-очаговым вирусным инфекциям, существующим в Восточной Сибири, а также по некоторым особо опасным вирусным инфекциям, для которых сохраняется угроза заноса на территорию региона. Разбивка вирусных инфекций на четыре группы  позволит в дальнейшем подойти к обоснованию различных подходов при организации эпидемиологического надзора за ними в Восточной Сибири.

Таблица 2

Природно-очаговые вирусные инфекции в Восточной Сибири и особо опасные вирусные инфекции, актуальные в плане санитарной охраны

территории региона

Груп-пы

Нозологическая форма

Регистрируемая заболеваемость людей в Восточной Сибири (в абс. числах за 2000-2005 гг.)

Результаты лабораторных исследований

1

Клещевой энцефалит

Бешенство

9861

1 случай*

+

+

2

Инко

Гета

Батаи

-

-

-

+

+

+

3

ГЛПС

Лихорадка Западного Нила

- (?)

-

+

+

4

Контагиозные  вирусные геморрагические лихорадки (Марбург, Эбола, Ласса), Крымская  геморрагическая лихорадка, лихорадки желтая, денге, долины Рифт, оспа обезьян, ТОРС, высокопатогенный для человека грипп птиц

-

-

Примечание: * - Красноярский край, 3 случая в Западной Сибири - Омской, Новосибирской областях и Алтайском крае; + - подтверждено лабораторными исследованиями; - не регистрируется, не подтверждено лабораторными исследованиями.

Заболеваемость природно-очаговыми вирусными инфекциями в Восточной Сибири. На Сибирский федеральный округ (СФО) (16 административных  территорий), где проживает около 14 % населения России, приходится до 50–60 % заболеваемости КЭ в стране. В том числе на Восточную Сибирь – 28,8 %, на Западную – 25,2 % (данные за 2000-2005 гг.). Восточно-Сибирский регион по сравнению с Западно-Сибирским  характеризуется более высокими показателями заболеваемости. Если до 1994 г. превалировала заболеваемость в Западной Сибири (исключение составляет 1989 г.), то с 1994 г. ситуация изменилась – заболеваемость в Восточной Сибири с положительной динамикой превысила заболеваемость в Западно-Сибирском регионе. В траектории кривой динамики заболеваемости (рис.1.) за этот период  просматриваются два носящие циклический характер временных периода, которые отличались друг от друга по  динамике эпидемического процесса. Первый (1988-1999 гг.) характеризуется возрастающей динамикой заболеваемости на рассматриваемых территориях со среднемноголетним темпом прироста от 7,4 (Омская область) до 136,9 % (Республика Тыва). Второму (после 1999 г.)  периоду свойственен постепенный спад заболеваемости, характерный как для Западной, так и Восточной Сибири. При этом среднемноголетний показатель  во всех субъектах  Западной  Сибири (за исключением Республики Алтай) снизился, а в субъектах Восточной Сибири  увеличился от  1,5 до 7,5  раз.  В СФО число случаев в год в среднем (1988-2005 гг.) достигает 3 тыс., показатель заболеваемости равен 13,7 %ооо, в том числе в Западной Сибири он составляет 12,3 %ооо, в Восточной – 15,7 %ооо. Заболевания регистрируются на всех территориях за исключением Таймырского и Эвенкийского автономных округов. Показатели заболеваемости на 100 тыс. населения в 4 раза выше, чем по России в целом. 

 

Рис. 1. Заболеваемость клещевым энцефалитом в Российской Федерации,  Западной и Восточной Сибири на 100 тыс. населения (1988-2005 гг.)

На основании эпидемиологического анализа уровня заболеваемости нами определены следующие группы территорий: с высоким уровнем забо-леваемости, превышающем среднефедеральный показатель более чем в 4-10 раз (Томская область, Красноярский край, УОБАО, Республики Алтай и Хакасия);  со средним уровнем заболеваемости, превышающем показатель в 2-3 раза (Республика Тыва, Новосибирская, Кемеровская, Иркутская области, Республика Бурятия и Алтайский край);  территории с заболеваемостью на уровне среднефедерального показателя или ниже (Агинский Бурятский а.о., Омская и Читинские области); и территории, где заболеваемость  не регистрируется (Таймырский и Эвенкинский а.о.).

Наивысший показатель заболеваемости КЭ (29,1 %ооо) за всю историю наблюдений для Восточной Сибири зафиксирован в 1999 г.  Максимальных значений показатель достигал в Красноярском крае (52,8 %ооо), Республике Хакасия (39,2 %ооо), Иркутской области (20,3 %ооо) в 1999 г.  В Республике Бурятия – в 2001 г. (20,5 %ооо),  УОБАО – в 2003 г. (26,7 %ооо), Агинском Бурятском а.о. – в 2001 г. (10,1 %ооо), Читинской области – в 2002 г. (9,8 %ооо). Начиная с 2002 г. как в России, так и на большинстве территорий Сибири зарегистрировано продолжающееся  снижение заболеваемости.

Для КЭ в Восточной Сибири в современный период характерны следующие эпидемиологические особенности: 1) возрастание доли Восточной Сибири в заболеваемости в СФО; 2) высокий уровень и темп роста заболеваемости до 1999-2002 гг.;  3) устойчивая, относительно высокая заболеваемость циклического характера  в одном и том же регионе при увеличении среднемноголетнего показателя (после 1999 г.) во всех субъектах от 1,5 до 7,5 раз, тогда как в Западной Сибири этот показатель снизился; 4) расширение нозоареала и изменение структуры заболеваемости за счет вовлечения городских жителей (до 60-80 %); 5) наряду с ростом заболеваемости имеет место тенденция к более легким формам  клинической картины болезни – превалируют лихорадочные и стертые формы, снижается количество менингеальных и паралитических форм; 6) в связи с антропогенной трансформацией биоценозов пригородные территории характеризуются высокой численностью и вирусофорностью иксодовых клещей: наибольшая зараженность голодных клещей, собранных с растительности,  отмечена в Республике Хакасия (13,2-19,7, а на  ряде территорий достигала 22-28 %%),  в Читинской области (15,4 %). Средние показатели характерны для Омской (6,5-8,2), Томской  (3,1-6,1) и Кемеровской (2,0-4,0 %%) областей.  Вирусофорность клещей в Новосибирской области,  Алтайском и Красноярском краях заметно ниже средней - соответственно 1,4-2,1; 0,2-1,0 и 0,6-1,2 %%; 7) отмечается увеличение числа лиц, обратившихся с покусами, обусловленное возросшим посещением горожанами пригородных лесных зон.

Если проблемы КЭ и бешенства достаточно хорошо изучены, то скры-тый характер эпидемического процесса при передаваемых комарами арбо-вирусных инфекциях, заболеваемость которыми  не диагностируется на уровне лечебно-профилактических учреждений,  подчеркивает трудность осуществления эпидемиологического надзора за этой группой инфекций, оценки и реальной значимости этих вирусов в патологии человека в Восточной Сибири. 

На территориях  административных субъектов Западной Сибири, грани-чащих с Восточно-Сибирским регионом, существуют природные очаги лихорадки Западного Нила (Новосибирская область), хантавирусов (Омская область, Таймырский а.о., Алтайский край), омской геморрагической лихорадки (ее сравнительно ограниченный нозоареал не выходит за пределы лесостепи Западной Сибири, и заболеваемость отмечена в Омской, Новосибирской, Тюменской и Курганской областях).

Эпидемиологическая ситуация в мире по контагиозным вирусным геморрагическим лихорадкам и некоторым особо опасным вирусным инфекциям и анализ их актуальности  для санитарной охраны территории Российской Федерации.  Нами проведен анализ некоторых наиболее значимых  особо опасных вирусных инфекций по признакам, отражающим глобализацию эпидемического процесса – возможности распространения между странами: динамика заболеваемости, тяжесть, летальность и масштабность вспышек; контагиозность и способность к эпидемическому распространению (табл. 3). Дана оценка  риска  заноса на территорию Восточной Сибири и возникновения  чрезвычайных ситуаций, возможности формирования в регионе  вторичных очагов в случае заноса возбудителя.

Таблица 3

Особо опасные вирусные инфекции, включенные в перечень для  санитарной охраны территории, и некоторые признаки, характеризующие

глобализацию эпидемического процесса

Нозологическая форма

Заболеваемость

в абс. числах

Летальность

Расширение ареала

Болезнь, вызванная вирусом Марбург

571 (1967-2008 гг.)

82,3 %  (средняя)

+

Болезнь, вызванная вирусом Эбола

2263 (1976-2009 гг.)

66,9 % (средняя)

+

Лихорадка Ласса

200-300 тыс. ежегодно

55-76 % (при отдельных вспышках)

+

Желтая лихорадка

111 (2006 г.)

7-55 % (Африка), 39-55 %  (Южная Америка)

+

Лихорадка денге

1,2 млн.  (1998 г.),

ежегодно десятки млн. человек

5 %

+

Лихорадка долины Рифт

1088 (Кения, Сомали, Танзания – 2006 г.)

23-45 %

+

Лихорадка Западного Нила

412 (Волгоградская обл., 1999-2000 гг.),

3000 (США, 2005 г.)

5,4 %

+

Крымская геморрагическая лихорадка

696 (в России с 2000 по 2006 гг.)

16-50 % и более

+

Тяжелый острый респираторный синдром (ТОРС)

8,4 тыс. (на август 2003 г.)

9,6 %

не регистрируется

Оспа

не регистрируется

Человеческий грипп, вызванный новым подтипом

421 случай (на 23.04.2009 г.) 

61%

+

Самым высоким уровнем летальности, достигающей  при отдельных вспышках 88-89 %, характеризуются контагиозные геморрагические лихорадки Марбург (ГЛМ) и Эбола (ГЛЭ).  Эпидемиологическими особенностями ГЛМ в последние годы являются:  продолжающееся расширение ареала – в начале нового столетия впервые в 2005 г. зафиксирована вспышка лихорадки Марбург в Анголе; регистрация заболеваний в природном очаге на протяжении ряда лет (Демократическая Республика Конго); появление  случаев завоза болезни в Европу и США (2008 г.); усиление тяжести болезни, обусловленное высоким уровнем летальности.  Средняя летальность при всех известных случаях составила 82,3 %. Отмечается тенденция сокращения интервалов между эпидемическими вспышками болезни с 8 лет (1967-1975 гг.) до 1 года. Значительно возросла масштабность вспышек: если раньше с 1975 по 1994 гг. зарегистрированы единичные случаи, то в 1998-2005 гг. выявлены сотни случаев. Наиболее масштабная вспышка с рекордным числом заболевших –374 – и летальностью 88 %  отмечена в Анголе в 2005 г.

Ситуация по ГЛЭ характеризуется расширением ареала (Габон, Уганда) и его выходом за пределы Африканского  континента; одновременным протеканием вспышек в трех странах:  ДРК, Габон и Уганда (2001 г.); регистрацией заболеваний в природном очаге на протяжении ряда лет (ДРК, Судан, Габон, Уганда); формированием природного очага в Габоне и Уганде.  Средняя летальность при всех известных случаях составила 66,9 %. Также установлена тенденция сокращения интервалов между эпидемическими вспышками болезни. В Уганде в 2008 г. выделен новый серотип вируса Эбола. В феврале-марте 2009 г. на Филиппинах отмечена эпидемическая вспышка среди свиней, изолирован вирус Эбола, штамм Рестон, который, по мнению экспертов ВОЗ, потенциально опасен для человека.

В эндемичных районах Центральной и Западной Африки лихорадка Ласса является причиной значительной заболеваемости – до 200-300 тыс. случаев в год. Важной особенностью геморрагических лихорадок является их контагиозность, что создает реальную опасность заноса инфекции из очага на неэндемичные территории и может привести к возникновению заболеваний.

Природные очаги желтой лихорадки (ЖЛ) в Южной Америке и на Африканском континенте и в настоящее время продолжают оставаться активными и периодически создают предпосылки для возникновения эндемичных вспышек этого заболевания.  В 2006 г. случаи ЖЛ официально зарегистрированы в шести странах Африки, где лабораторно подтверждено 25 случаев  (летальность 28 %), в  четырех странах Южной Америки (86 случаев, летальность 59 %). Лихорадка Долины Рифт недавно вызвала большие эпидемические вспышки в конце 2006 - начале 2007 гг. в Кении (684 случая заболеваний людей, летальность составила  23 %), Сомали (114 случаев, летальность – 45 %), Республике Танзания (290 случаев, летальность – 40 %). 

       В связи с ростом эпидемиологического потенциала многих особо опасных вирусных болезней и факторов, способствующих их  эпидемическому  распространению,  появлению  новых угроз (ТОРС, высокопатогенный грипп птиц,  свиной грипп), задачи санитарной охраны территории субъектов Восточной Сибири существенно расширяются.

       На основе анализа условий для формирования вторичных очагов ООВИ в случае их завоза на территорию Восточной Сибири установлено, что для контагиозных геморрагических лихорадок возможность формирования вторичных очагов в случае интродукции возбудителей на территорию Восточной Сибири очень мала, что обусловлено, прежде всего, климатическими условиями и отсутствием соответствующих видов носителей.

       В случае заноса в Восточную Сибирь природно-очаговых инфекций с трансмиссивным механизмом передачи больной человек опасности для окружающих не представляет, хотя возможно лабораторное заражение персонала лабораторий при работе с инфицированным материалом. Завоз на неэндемичные территории региона инфицированных переносчиков может привести к возникновению спорадических случаев заболеваний. Условия  для укоренения и образования вторичных очагов в случае интродукции возбудителей ЖЛ, лихорадок денге и долины Рифт в популяции кровососущих насекомых и возможных носителей в Восточной Сибири отсутствуют.

Наличие в России природных очагов Крымской геморрагической лихорадки и ЛЗН представляет целесообразность проведения по этим инфекциям мониторинговых исследований в Восточной Сибири с целью предотвращения интродукции возбудителей и предупреждения  формирования новых природных очагов, контроля видового состава кровососущих насекомых и возможного появления на территории новых видов.  В случае заноса ЛЗН имеются предпосылки активизации существующих  малоизученных  природных очагов с низкой эпидемической активностью или образование новых вторичных очагов.

Серологический мониторинг природных очагов арбовирусных инфекций

Серологический мониторинг природных очагов арбовирусных инфекций (клещевой энцефалит, Инко, Гета и Батаи). Трудности осуществления эпидемиологического надзора за арбовирусными инфекциями в Восточной Сибири, связанные с выявлением случаев заболеваний, обусловили применение комплексного подхода к серологическому мониторингу, основанному на одновременном скрининге широкого спектра арбовирусов. На его основе получены сведения об иммунной прослойке к арбовирусам у людей и сельскохозяйственных животных на различных административных территориях Восточной Сибири, различающихся по ландшафтно-климатическим условиям, что позволяет выделить их в зоны разного уровня риска (рис. 2 А и Б.);  дана оценка нап-

Рис. 2. Иммунная прослойка среди населения (А) и сельскохозяйственных животных (Б) в Иркутской области, Республиках Саха (Якутия), Бурятия, Красноярском крае к арбовирусам Инко, Гета и Батаи. Примечание:

-Инко; -  Гета; -  - Батаи; - КЭ. Показатель иммунной прослойки: 30 и выше; до30;  до 20; до 10 %%.

ряженности гуморального иммунитета к арбовирусам  у крупного рогатого скота (КРС) в разных природных очагах; изучена динамика естественной иммунизации у КРС, выпасавшегося в очагах арбовирусных инфекций.

При изучении популяционного иммунитета к арбовирусам у населения Иркутской области, Республик Саха, Бурятия и УОБАО повсеместно выявлена иммунная прослойка к вирусам КЭ, Инко, Гета и Батаи. Ее величина варьировала в разных административных субъектах, территориях и отдельных населенных пунктах и зависела от ландшафтно-климатических условий и численности кровососущих членистоногих.

Показано  наличие сочетанных природных очагов вирусов КЭ, Инко, Гета и Батаи  почти на всех обследованных территориях. Величина иммунной прослойки населения к вирусу КЭ в административных  субъектах находилась в пределах  21,5 % (Республика Бурятия) – 29,5 % (Иркутская область). Наибольший уровень наблюдали в Тункинском районе Республики Бурятия – 47,3 ± 2,9 %. Установлена  территориальная неоднородность проявления  активности арбовирусов.  Наиболее широко распространен вирус Инко, его активность выше на северных территориях региона. Более высокие показатели характерны для плоскогорных участков в пределах подзон средней и южной  тайги (Казачинско-Ленский и Усть-Илимский районы Иркутской области, пригородные зоны гг. Красноярск и Иркутск, Междуречье Алдана и Лены) с достаточно высокой численностью комаров родов Aedes  и Сulex. В каждом из административных субъектов можно выделить участки территорий, отличающихся по показателям иммунной прослойки. Наибольшая частота вируснейтрализующих антител у населения выявлена к вирусу  Инко (самый высокий уровень иммунной прослойки у населения Алданского улуса:  в разные годы он составлял 30,5 ± 4,0 - 50,3 ± 3,0 %%), а наименьшая – к  Гета (1,1 ± 0,7 % в Накынском улусе) и Батаи (0,7 ± 0,5 %) в Тункинском районе Республики Бурятия). На некоторых участках иммунная прослойка не установлена: к вирусу Батаи -  в Накынском улусе, Заларинском, Эхирит-Булагатском и Заларинском районах Иркутской области; к вирусу Гета  - в Баяндаевском районе. У КРС из Кяхтинского района (Республика Бурятия) не обнаружены антитела к вирусу Батаи.  Эпидпотенциал природных очагов вирусов  Батаи и Гета в таежном и таежно-степном ландшафтах исследованных районов Восточной Сибири значительно ниже. В тоже время процент серопозитивных  особей КРС к вирусам Гета и Батаи выше на юге Иркутской области. Впервые обнаружены вируснейтрализующие антитела  к вирусу КЭ у КРС в Усть-Кутском районе Иркутской области. Результаты серологического обследования населения и сельскохозяйственных животных в районах с различными ландшафтными и природно-климатическими условиями несколько различались, но в большинстве случаев коррелировали с численностью и особенностями состава переносчиков, что согласуется с экологическими предпосылками существования природных очагов арбовирусных инфекций. 

Изучение напряженности гуморального иммунитета к арбовирусам у КРС показали его неоднородность на разных участках (табл. 4) Наиболее высокие титры антител к вирусу Инко отмечены в Якутии в Междуречье Алдана и Лены – СГТ составил 5,83 ± 0,31. Достаточно высокий уровень СГТ отмечен и в пригородных зонах гг. Красноярск и Иркутск, причем СГТ  выше к вирусу Батаи. Здесь же выявлены наиболее высокие титры антител, в отдельных случаях достигавшие 1:1280 - 1:2560.

Таблица 4

Напряженность популяционного иммунитета в реакции нейтрализации  в (log 2) к арбовирусам у КРС с разных территорий Восточной Сибири

Арбовирусы

Территория 

Пригородная зона

г. Иркутска

Пригородная зона

г. Красноярск

Междуречье

Алдана и  Лены

Остров Ольхон

озера Байкал

абс.

СГТ*

абс.

СГТ

абс.

СГТ

абс.

СГТ

Инко

27

5,2 ± 0,1

9

5,5 ± 0,2

12

5,8 ± 0,3

5

4,5 ± 0,2

Гета

11

4,8 ± 0,1

5

5,3 ± 0,0

6

4,3 ± 0,0

4

5,0 ± 0,2

Батаи

25

5,9 ± 0,2

2

6,7 ± 0,6

12

4,8 ± 0,1

4

5,0 ± 0,2

КЭ

84

6,6 ± 0,2

20

7,9 ± 0,4

1

6,1±0,0

0

0

Примечание: СГТ – средний геометрический титр

Наше предположение о том, что результаты обследования телят могут  быть применены при изучении эпидемической активности очага в конкретный сезон, не подтвердилось. Изучение динамики естественной иммунизации у КРС, выпасавшегося в очаге арбовирусных инфекций, показало, что особенностью естественной иммунизации коров при контакте с вирусами КЭ, Инко, Гета и Батаи является непродолжительность сохранения вируснейтрализующих антител, уровень которых на протяжении осенне-зимних месяцев заметно уменьшается и может полностью утратиться.

С точки зрения эпидемиологического надзора за КЭ данные серологического обследования населения эндемичных территорий позволяют судить об активности природного очага и могут быть использованы при планировании профилактических мероприятий.

Серологическая разведка циркуляции возбудителей геморрагической лихорадки с почечным синдромом и лихорадки Западного Нила. Несмотря на наличие природных очагов хантавирусов, а, возможно, и вируса Западного Нила, их распространение на территории Восточной Сибири практически не изучено. С 1995 по 2008 гг. нами обследовано 1546 мелких млекопитающих более 20 видов, относящихся к трем отрядам, 6 семействам и 13 родам, отловленных на территориях  Красноярского и Забайкальского краев, Республик Саха (Якутия), Бурятия, УОБАО и Иркутской  области, расположенных в следующих ландшафтных зонах: таежной, смешанных и широколиственных лесов, лесостепной и степной. Анализ результатов обследования мелких млекопитающих в ИФА показал, что на территории Восточной Сибири антиген хантавирусов обнаружен у восьми видов мелких млекопитающих: красной и  красно-серой полевок (Республика Саха), узкочерепной полевки, полевки-экономки, азиатской лесной мыши, мыши полевой и серой крысы (Иркутская область), узкочерепной полевки и мыши домовой (Забайкальский край). В Иркутской области в пробах легких мелких млекопитающих, отловленных в 2006 г. в верховьях реки Умга (Заларинский район),  антиген  хантавирусов выявлен в среднем в 11,2 ± 3,3 % проб. Наибольший показатель зараженности наблюдали среди полевок-экономок - 16,6 ± 7,5 %. Довольно высокая частота зараженности  выявлена и у узкочерепных полевок -  11,36 ± 4,7 %. В двух пробах от узкочерепных полевок в ОТ-ПЦР обнаружена РНК  хантавирусов. В Забайкальском крае антиген хантавирусов выявлен в Забайкальском районе в легких двух видов грызунов – мыши домовой и узкочерепной полевки, РНК хантавирусов выявлена в одной пробе от джунгарского хомячка.

Изучение иммунитета к вирусу ГЛПС у населения региона (выборочно у населения Республики Саха (Якутия) и Бурятия (Кяхтинский район) показало отсутствие серопозитивных лиц. Серологическое обследование 108 жителей двенадцати деревень Заларинского района (Иркутская область) выявило трех (2,7 %) сероположительных на ГЛПС с титрами 1:32. Анализ проб сывороток крови, поступивших от 16 больных с подозрением на ГЛПС из лечебных учреждений гг. Иркутск,  Ангарск, Усть-Илимск, Чита и Улан-Удэ, показал наличие  антител к вирусу ГЛПС в титрах 1:128 у больного, прибывшего из Саратовской области и  1:1024 у проживающего в Забайкальском крае.

Результаты серологического обследования населения, проживающего на территории Восточной Сибири, свидетельствуют о циркуляции в регионе возбудителя лихорадки Западного Нила. Антитела обнаружены в среднем у 3 % населения, причем,  у пациентов неврологических стационаров достоверно чаще – у 12-18 %. Впервые обнаружены антитела к вирусу ЗН у населения в Алданском улусе (Республика Саха),  Эхирит-Булагатском районе УОБАО,  Заларинском районе Иркутской области, Прибайкальском, Баргузинском и Кяхтинском районах Республики Бурятия.

Для установления возможной роли вируса ЗН в инфекционной патологии населения в период активности кровососущих членистоногих в 2005-2007 гг. проведены сероэпидемиологические исследования среди больных, в том числе и амбулаторных, обратившихся за медицинской помощью с жалобами на высокую температуру, упорные головные боли и другие проявления, включая менингиты и энцефалиты. При исследовании в 2005 г. в опытную группу включены 65 больных, поступивших в апреле-июне для стационарного лечения в Иркутскую областную клиническую инфекционную больницу (ОКИБ) с подозрением на КЭ и другие нейроинфекции. Контрольную группу составили 78 пациентов поликлиник, обратившихся за медицинской помощью по поводу заболеваний, не связанных с поражением нервной системы. Частота положительных находок в ИФА к вирусу ЗН в опытной группе составила 12,3 ± 4,3 %, а в контрольной – 2,6 ± 1,8 % (р<0,05). Антитела к вирусу ЗН во всех случаях (кроме одного из поликлиники) обнаружены в сыворотках крови, не содержащих вируснейтрализующие антитела к вирусу КЭ. В одном случае выявлена сероконверсия к вирусу ЗН во второй сыворотке у больного с окончательным диагнозом ОРВИ.

В 2006 г. обследовано на наличие антител к вирусу ЗН еще 94 пациента ОКИБ с подозрением на КЭ, и положительный результат получен у 17 из них (18,0 ± 4,0 %). В контрольной группе (пациенты Центра профилактики клещевых инфекций, n = 112), антитела к вирусу ЗН обнаружены в 3,2 ± 1,7 %, что достоверно меньше, чем в группе пациентов инфекционной больницы (р<0,05).

В 2007 г. обследовано 92 пациента ОКИБ, поступивших в августе-сентябре. Сероположительными к вирусу ЗН оказались 14 (15,2 ± 3,7 %). В контрольной группе, состоящей из 95 жителей Заларинского района Иркутской области (сыворотки крови собраны в сентябре) антитела к вирусу ЗН обнаружены в трех пробах (3,1 ± 1,8 %), что также достоверно ниже, чем в группе пациентов ОКИБ (р<0,05).

Таким образом, у пациентов инфекционного стационара с неврологической симптоматикой антитела к ВЗН обнаруживались в 4-5 раз чаще, в сравнении с амбулаторными пациентами. Результаты наших исследований позволяют высказать предположение о  существовании в Восточной Сибири природных очагов ЛЗН и этиологической роли вируса ЗН в патологии населения.

Изучение свойств популяции вируса  кле­щевого энцефалита в региональных природных очагах 

Свойства штаммов вируса клещевого энцефалита, изолированых из иксодовых клещей (на примере Приангарья,  1995-1998 гг.) Одним из критериев, позволяющим выявить гетерогенность вирусной популяции, является способность вируса к репродукции в тех биологических системах, в которых он не размножался при первичной изоляции. Осуществляли это путем смены систем культивирования. Из ИФА-положительных клещей и ИФА-отрицательных пулов клещей были изолированы штаммы вируса КЭ, отнесенные в соответствии с применяемыми системами изоляции в семь групп. При выделении все изоляты (63) прошли два-три пассажа на культуре клеток или НБМ. Анализ результатов сме­ны систем культивирования показал, что изоляты, выделенные от клещей и пулов клещей только в культуре клеток при температуре 37 °С, не адаптировались к культуре клеток при 28 °С на

Таблица 5

Результаты перевода изолятов в системы, отличные от систем

первичной изоляции

Смена системы первичной изоляции

Изоляты из ИФА-положительных клещей

Изоляты из ИФА-отрицательных пулов клещей

Всего исследовано

Положительный результат

%

Всего исследовано

Положительный результат

%

КК с37 на 28 °С

9

0

0

4

0

0

КК с 37 °С на НБМ

14

7

50

11

5

45,4

КК с28 на 37 °С

10

0

0

6

0

0

КК с 28 °С на НБМ

23

9

39,1

13

2

15,4

Примечание: КК – культура клеток; НБМ – новорожденные белые мыши

протяжении трех пассажей, т.е. все они имеют селективное преимущество при размножении в клеточной культуре. Отрицательный результат получен и при переводе штаммов с 28 на 37 °С  (табл. 5).

При смене системы культивирования с культуры клеток на НБМ положитель­ный результат получен у 16 из 37 (43,2 %) ИФА-положительных и у семи из 24 (29,1 %) ИФА-отрицательных изолятов. Причем, при смене систем культивирования с культуры клеток на НБМ больше положительных результатов получено для штаммов, изолированных при 37 °С, чем при 28 °С.

За 1995-1998 гг. изучения очагов клещевого энцефалита в Иркутском, Ольхонском, Слюдянском и Эхирит-Булагатском районах Иркутской области нами выделено 130 штаммов от иксодовых клещей: /. persulcatus (123), D. silvarum (2) и D. nuttalli (5). У 25 штаммов изучена вирулентность вируса для беспородных белых мышей при внутримозговом и подкожном способах введения материала. При внутримозговом заражении показатели вирулентности варьировали в пределах 5,09-10,0 lg ЛД 50/мл и подкожном - 3,60-9,16 lg ЛД 50/мл  (титр 3,60 lg ЛД 50/мл выявлен только у одного штамм при внутримозговом заражении, титр 5,09 lg ЛД 50/мл  - у одного штамма при подкожном заражении). Индекс инвазивности  (ИИ) – в пределах 0,13-3,0 При экстраневральном введении высокая вирулентность (выше 8,0 lg  ЛД 50/мл) выявлена у 10 штаммов. ИИ у них находился в пределах 0,15-1,5 lg ЛД 50/мл - Средние ве­личины титров при церебральном заражении составили 8,12 ± 0,23, при перифе­рическом - 7,34 ± 0,28 lg ЛД 50/мл. Средний показатель ИИ = 0,77 ± 0,15. Таким образом, большинство (92 %) изученных штаммов высоковирулентны как при внутримозговом, так и подкожном введении вируса (ИИ <2,0), один штамм оказался  умеренно вирулентным (ИИ = 3,06).  Штаммы обладали выраженной гетерогенно­й гемагглютинирующей активностью, вызывая агглютинацию гусиных эритроцитов в условиях оптимума рН 6,2 при 4 °С в пределах 1:20-1:640.

Свойства штаммов вируса клещевого энцефалита, изолированных от людей, умерших от клещевого энцефалита (на примере Забайкальского края, 1995-2003 гг.). Для изучения этиологической структуры очаговых форм КЭ, заканчивающихся летальным исходом, в Забайкальском крае  впервые с применением молекулярно-биологических методов изучена представительная группа штаммов вируса КЭ, выделенных от 13 умерших  людей с энцефаломиелитической, менингоэнцефаломиелитической, менингополиомиелитической формами КЭ. Штаммы изолированы на НБМ, зараженных пробами из разных от­делов головного (11), спинного (1) мозга и трупной крови (1). Результаты изучения вирулентности для беспородных белых мышей массой 6-8 г показали, что большинство штаммов высоковирулентны как при внутримозговом, так и подкожном введении вируса (ИИ<2,0) и только один штамм (653) – умеренновирулентный (ИИ = 3,0). Различия в способности преодолевать гематоэнцефалитичесий барьер у изученных штаммов разных подтипов вируса КЭ не установлены. Штаммы независимо от подтиповой принадлежности агглюти­нировали эритроциты гуся в зоне рН 5,8-6,2. Титры гемагглютинина колебались от 1:40 до 1:1280. Преобладали штаммы со средними титрами. Исключение со­ставил штамм 102 (дальневосточный подтип), у которого отсутство­вали гемагглютинирующие свойства. Это один из немногочисленных антигенно-дефектных  изолятов вируса КЭ, с которыми связывают развитие серонегативных форм инфекции (Погодина В.В. и др., 1992). Все изученные штаммы проявляли цитопатическое действие на культуре клеток СПЭВ, но в то же время различались по сро­кам деструкции монослоя и степени его выраженности.

Молекулярно-генетическая характеристика штаммов вируса клещевого энцефалита. Нами охарактеризована структура  вирусной популяции в Приангарье по результатам ретроспективного генотипирования 47 изолятов  вируса КЭ, выделенных в 1995-2005 гг. из клещей, собранных  на территории  Иркутского (46) и Ольхонского (1 изолят) районов Приангарья и 1 штамма, выделенного  из пробы головного мозга от больной К., умершей от КЭ (Иркутская область).  Генотипирование штаммов  методом ПЦР в режиме реального времени с гибридизационно-флюоресцентной детекцией с генотипоспецифическими зондами показало абсолютное преобладание сибирского подтипа: из 47 изолятов 41 (87,2 %) принадлежит к сибирскому, два (4,2 %) – к дальневосточному подтипам и четыре (8,5 %)  содержат  смесь вирусов двух генотипов в различной концентрации – микст-штаммы (табл. 6).

Таблица 6

Результаты генотипирования штаммов вируса клещевого энцефалита, изолированных  из иксодовых клещей, собранных на территории Приангарья в 1995-2005 гг.

Место сбора клещей

Год

Количество генотипированных штаммов

Генотип

сибирский

дальне-

восточный

микст

Байкальский тракт

1995

20

17

1

2

1996

2

2

-

-

1997

4

2

1

1

1998

2

2

-

-

2005

9

9

-

-

Тихонова падь

1995

2

2

-

Голоустненский тракт

1995

2

2

-

-

1997

1

1

-

-

Утулик

1996

3

3

-

-

107 км. КБЖД

1995

1

1

-

-

Ольхонский район

1995

1

-

-

1

Всего (%)

47

41 (87,2 )

2 (4,2)

4 (8,5)

Полученные сведения являются новыми доказательствами ранее описанного (Верхозина М.М. и др., 2007) преимущественного распространения в Приангарье сибирского подтипа вируса КЭ.

В Забайкальском крае от больных, умерших от очаговых форм КЭ, изолировано 13 штаммов вируса. Генотипированием установлено наличие среди них штаммов вируса КЭ дальневосточного (8 штаммов) и сибирского (4 штамма) подтипов. Один штамм (штамм 29) охарактеризован как микст - содержал участки генома дальнево­сточного и сибирского подтипов. В результате впервые проведенного комплексного изучения биологических, в том числе и молекулярно-генетических свойств штаммов вируса КЭ, выделенных от умерших больных показано, что в Забайкальском крае заболевания КЭ обусловлены двумя самостоятельными подтипами вируса – дальневосточным и сибирским. Оба подтипа вызывают развитие очаговых форм болезни с летальным исходом. Очаговые формы связаны и с микст-штаммами вируса КЭ.

Таким образом, на основе генотипирования 61 штамма  охарактеризована структура популяции вируса КЭ, циркулирующего в Приангарье и Забайкалье в 1995-2005 гг. Структура популяции сформирована на основе сибирского и дальневосточного генотипов с абсолютным доминированием сибирского генотипа (87 %)  в Приангарье (Иркутский район) и напротив, доминированием в Забайкалье дальневосточного генотипа (61,5 %). Показано, что в очаге совместной циркуляции разных подтипов появляются микст-штаммы вируса КЭ, в которых сочетаются генетические признаки сибирского и дальневосточного подтипов; впервые в природном очаге в Приангарье изолированы четыре таких штамма, а в Забайкалье – один.

Совершенствование лабораторной диагностики природно-

очаговых и особо опасных вирусных инфекций

Вирусологический мониторинг  природного очага вируса клещевого энцефалита на основе комплексного применения методов первичной изоляции вируса из иксодовых клещей. Для повышения эффективности эпидемиологического надзора  нами разработан алгоритм вирусологического мониторинга природных очагов КЭ, основанный на комплексном  использовании биологической изоляции (лабораторные животные, культура клеток), серологических  (ИФА,  МФА) и молекулярно-генетических  методов с целью выявления наиболее широкого спектра циркулирующих в природном очаге вариантов вируса и оценки их эпидемиологической значимости. Такой подход отличается от применяемых другими исследователями, во-первых, исследованием как положительных, так и отрицательных в ИФА клещей, во-вторых, заражением клеточной культуры одновременно при двух температурных режимах (рис. 3.).

Из 3057 исследованных в ИФА клещей положительный результат получен в 165 пробах, что составило 5,4 ± 0,4 %. Из них в соответствии с применяемыми методами получено семь групп изолятов (табл. 7). Параллельно на НБМ и в КК удалось выделить 22,0 %, в КК  - 50,0 % и на НБМ - 27,9 % изолятов. При заражении КК получено в 1,8 раз больше изолятов, чем на НБМ, причем на КК при 37 оС их выделено несколько больше, чем при 28 оС. Получен только один изолят одновременно на НБМ и в КК при двух температурных режимах.  Следует отметить, что не из всех антигенсодержащих клещей удалось выделить вирус КЭ. Из 165 положительных в ИФА суспензий методами биологической пробы в различных системах изоляции выделено только 68 патогенных агентов (41,2 ± 3,8 %).

Рис. 3. Схема изоляции и типирования вируса клещевого энцефалита из клещей Ixodes persulcatus на основе комплексного применения методов первичной изоляции. Примечание: * - отрицательные в ИФА суспензии клещей объединены по 5-10 в пулы; НБМ – новорожденные белые мыши; КК – культура клеток

Таблица 7

Общее количество патогенных агентов (изолятов), выделенных в различных системах первичной изоляции из положительных и отрицательных в иммуноферментном анализе клещей Ixodes  persulcatus

Система первичной

изоляции

Количество выделенных патогенных агентов из:

ИФА-положительных клещей (n=165)

ИФА-отрицательных

клещей (n=382)

НБМ и КК при 37 и 28 оС

1 (1,5 %)

1 (1,6 %)

НБМ и КК при 37 оС

9 (13,2 %)

4 (6,4 %)

НБМ и КК при 28 оС

5 (7,3 %)

3 (4,8 %)

Всего на НБМ и КК

15 (22,0 %)

8 (12,8 %)

НБМ

19 (27,9 %)

26 (41,9 %)

КК при 37 и 28 оС

8 (11,8 %)

1 (1,6 %)

КК при 37 оС

14 (20,6 %)

12 (19,3 %)

КК при 28 оС

12 (17,6 %)

15 (24,2 %)

Всего на КК

34 (50 %)

28 (45,1 %)

Итого

68 (41,2 %)

62 (16,2 %)

Из 2892 отрицательных в ИФА суспензий приготовлено 382 пула. Из них на НБМ и КК в двух температурных режимах выделен один, параллельно на НБМ и КК при температуре культивирования 37 оС – 4, на НБМ и КК при 28 оС – 3, методом заражения НБМ – 26 изолятов. Параллельно в двух температурных режимах выделен один, при 37 оС – 12, при 28 оС – 15 изолятов. Таким образом, параллельно на НБМ и в КК выделено 12,9 % изолятов, на НБМ – 41,9 %  и в КК – 45,2 % изолятов. Особо следует отметить, что из отрицательных в ИФА проб удалось выделить 16,2 % изолятов. Таким образом, из 547 исследованных проб (включая 165 положительных проб и 382 отрицательных в ИФА пулов) выделено 130 изолятов, в том числе: в биопробе на НБМ – 45, на КК – 62, на КК и НБМ  – 23 изолята. Результаты исследований свидетельствуют о том, что широко применяемый при скрининговых исследованиях клещей как в природных очагах КЭ, так и в центрах профилактики клещевых инфекций метод ИФА не позволяет корректно оценивать их вирусофорность и показывают необходимость включения в экспресс-диагностику КЭ в центрах профилактики клещевых инфекций дополнительных методов.

Таким образом, комплексное использование  нескольких  методов изоляции оказалось более результативным и позволило выделить  из клещей больший спектр штаммов вируса комплекса КЭ с различными биологическими свойствами. Очевидно, что такие исследования могут проводить только научные учреждения.

Совершенствование методов лабораторной диагностики  геморрагических лихорадок  Марбург и Эбола. Изучена динамика антителообразования у морских  свинок, иммунизированных  культуральным вирусом (Марбург, Эбола) в дозе 104 БОЕ на животное. Через 1,5 месяца проводили реиммунизацию тем же материалом с полным адъювантом Фрейнда. Титры специфических антител в сыворотках крови определяли в НМФА и клеточном ИФА. Установлено, что через 16 дней после иммунизации антитела выявляются в высоких титрах: СГТ составил 7,00 ± 0,68  (НМФА) и 12,78 ± 0,58 (клеточный ИФА). После реиммунизации наблюдали статистически достоверное (р<0,05) увеличение титра специфических антител, которое превышало показатели после первой иммунизации. Высокие титры антител поддерживались или несколько увеличивались (33% животных) на протяжении еще 16 дней (срок наблюдения), СГТ в НМФА и клеточном ИФА составил 7,50 ± 0,22 и 13,50 ± 0,26 соответственно.

Через две недели после иммунизации титр специфических антител к вирусу Эбола у животных  составлял в НМФА 1:128- 1:1024, в клеточном ИФА – 1:1280-1: 51200. Высокий титр антител  сохранялся  до 34 дня, затем наблюдали его постепенное снижение. Реиммунизация приводила к увеличению иммунного ответа. Максимум антителообразования наблюдали так же, как и при иммунизации  вирусом Марбург – через 2 недели.

Для получения специфических сывороток нами испытаны восемь схем иммунизации животных, отличающихся  по срокам, способам и дозе введения материала, а также использованием адъюванта Фрейнда. Для вируса Марбург наилучшие результаты получены при трех схемах. Антисыворотки, полученные при этих схемах иммунизации, имели СГТ  8,02 ± 0,26;  8,27 ± 0,27 и 8,15 ± 0,32 соответственно. Для вируса Эбола наилучший результат получен при схеме № 4 – у 12 из 14 морских свинок выявлен в НМФА титр антител 1:1024 (СГТ равен 9,86 ± 0,10).

Проведена работа по оптимизации метода приготовления слайд-антигенов высокого качества: подобрана множественность заражения клеток и определены оптимальные сроки инкубации инфицированных культур. При множественности заражения 0,01 БОЕ/кл. и инкубации в течение 3 суток (для вируса Эбола) и  4 суток (Марбург) на слайд-антигенах выявляли специфические антигены в виде гранул разнообразных форм и размеров, локализующихся в цитоплазме. Изучена динамика экспрессии антигенов вирусов Марбург и Эбола при заражении клеток Vero с множественностью 10 БОЕ/кл. Показана возможность выявления в зараженных клеточных культурах вирусных антигенов при различных сроках ин­кубации, начиная сразу после адсорбции материала на клеточ­ном монослое. Полученные данные указывают, что на различ­ных этапах инфекции морфология вирусспецифических анти­генов, выявляемых в НМФА, может существенно различаться. Эти сведения необходи­мо учитывать при проведении лабораторной диагностики лихо­радок Марбург и Эбола, чтобы избежать ошибочных заключе­ний.

Разработан метод клеточного иммуноферментного анализа, который применили для выявления в сыворотках крови морских свинок антител к вирусам Марбург (n = 48) и Эбола  (n = 42).  Во всех  сыворотках выявлены антитела одновременно в клеточном ИФА и НМФА.  При анализе результатов использования двух методов титрования антисывороток к вирусам Марбург и Эбола наблюдалась корреляция:  коэффициент  корреляции для сывороток к вирусу Марбург составил 0,45,  к Эбола – 0,78. Титры антител в клеточном ИФА были выше, чем в НМФА в среднем в 50 раз.  Метод клеточного ИФА, обладая высокой чувствительностью, специфичностью и простотой исполнения,  позволяет проводить массовый скрининг сывороток.  Наиболее существенным достоинством метода  является то,  что для его постановки не требуется очищенный вирусный антиген. Это актуально при изучении особо опасных вирусов, так как  очистка вирусных антигенов должна проводиться в условиях максимальной биологической защиты, требующей дополнительных затрат. 

Нами разработан вариант реакции нейтрализации в культуре клеток BGM с применением минимальной тест-дозы вируса, который позволил впервые выявить нейтрализующие вирус Эбола (штамм Заир) антитела в сыворотках иммунизированных морских свинок.  В варианте РН с постоянной дозой вируса и сыворотки установили, что термоинактивированные иммунные сыворотки двух морских свинок в разведении 1:10 обеспечивают 100 % редукцию бляшек вируса Эбола. При исследовании 12 образцов сывороток иммунизированных животных выявлены сыворотки как с относительно высоким (1:180) , так и с низким (1:20) титром вируснейтрализующих антител. Обращает  на себя внимание тот факт, что ряд иммунных сывороток (в НМФА) не имеет нейтрализующих антител (титр менее 1:20). Существенного влияния схем иммунизации животных на титры вируснейтрализующих антител не отмечено. Эффект неспецифической нейтрализации обнаружили только в нормальных сыворотках морских свинок при 5-10 % их концентрации. Таким образом, разработанный нами вариант РН с применением минимальной тест-дозы вируса позволил впервые выявить нейтрализующие вирус Эбола (штамм Заир) антитела в сыворотках иммунизированных морских свинок. 

Схема лабораторной диагностики геморрагических лихорадок Эбола и Марбург. В связи с отсутствием нормативно-методических документов, регламентирующих лабораторно-диагностические исследования на эти возбудители, нами на основе  собственных наработок составлено «Методическое пособие по лабораторной диагностике возбудителей геморрагических лихорадок Эбола и Марбург». Схематично лабораторная диагностика геморрагических лихорадок Эбола и Марбург включает в себя комплекс исследований по выделению и идентификации вируса, а также по выявлению вирусспецифических антигенов и антител, которые можно реализовать в условиях максимальной биологической защиты. Данная схема апробирована в лабораторных условиях, а также применена при анализе материала в 1992 г. от больной М. из г. Корсакова с диагнозом «геморрагическая лихорадка Марбург?».

Совершенствование эпидемиологического надзора  за природно-очаговыми и особо опасными вирусными инфекциями

На основе  анализа эпидемиологических данных, данных литературы, результатов вирусологического и серологического мониторинга  нами обоснован дифференцированный подход и намечены пути совершенствования эпидемиологического надзора за природно-очаговыми и ООВИ  с учетом распределения их в группы разного уровня  эпидемиологической значимости для региона и требующих различных подходов при организации эпидемиологического надзора в Восточной Сибири (рис. 4.): I. С регистрируемой заболеваемостью – КЭ и бешенство; II. Широко распространенные в регионе арбовирусные инфекции: Инко, Батаи, зайца-беляка, Тягиня, Гета; III. Малоизученные, роль которых в патологии населения Восточной  Сибири  требует  уточнения – лихорадка Западного Нила, ГЛПС; IV. Экзотические особо опасные вирусные инфекции  I-II групп патогенности,  на которые распространяются правила санитарной охраны территории.

I. Результаты наших исследований позволяют наметить пути оптимизации эпидемиологического надзора за КЭ (рис. 5.) в соответствии с функциональными блоками эпидемиологического надзора (Черкасский Б.Л., 2001).

1. Функциональная структура контроля управляющих решений:  организация центров экспресс-диагностики и профилактики клещевых инфекций в наиболее неблагополучных районах субъектов региона; выделение зон наибольшего риска заражения населения с разработкой для каждой оптимальных специфических и неспецифических мер профилактики.

2. Статистический мониторинг: налаживание обмена на территориальном и региональном уровнях оперативной информацией между заинтересованными учреждениями, ведомствами по заболеваемости КЭ, результатам эпизоотологического мониторинга очагов.

 

Рис. 4.  Распределение природно-очаговых и особо опасных вирусных инфекций по группам в соответствии с уровнем их эпидемиологической значимости для территории Восточной Сибири

3. Вирусологический мониторинг: комплексный подход к изоляции вируса из  клещей в природном очаге, основанный на одновременном использовании систем индикации (ИФА), изоляции (белые мыши, культура клеток при 28 и 37оС) с последующим применением (выборочно) молекулярно-генетических методов (ОТ-ПЦР, генотипирование). Может быть применен только научно-исследовательскими учреждениями.

4. Паразитологический мониторинг: изучение вирусофорности клещей  по возможности во всех эндемичных районах субъектов региона с учетом мозаичности распределения  клещей на территории очага. Осуществляют  Центры гигиены и эпидемиологии в субъектах, научные учреждения, Читинская и Тувинская ПЧС.

5. Серологический мониторинг: анализ иммунологической структуры населения; изучение иммунной прослойки у КРС на участках территорий с разными рисками заражения КЭ. Может выполняться научными учреждениями.

6. Молекулярно-генетический мониторинг: применение в системе эпидемиологического надзора молекулярно-генетических методов позволяет уточнить роль разных подтипов вируса, а также политиповых штаммов в формировании региональных особенностей инфекционной патологии. Возможен при участии научных учреждений, в том числе центральных.

Рис.  5. Схема оптимизации эпидемиологического мониторинга в системе

эпидемиологического надзора за клещевым энцефалитом

       

II. Основные пути оптимизации эпидемиологического надзора за арбовирусными инфекциями, связанными с комарами: своевременное выявление и расследование случаев и вспышек сезонных лихорадок с менингитами и энцефалитами, дифференциация их от заболеваний, вызванных вирусами комплекса клещевого энцефалита  и других инфекций; активизация исследований на основе научно обоснованной региональной программы эколого-эпидемиологического мониторинга арбовирусов для получения данных о современном состоянии природных очагов арбовирусных инфекций на территории Восточной Сибири – уточнения ареала, изучения экологии возбудителей в разных ландшафтных зонах региона. Обследование КРС как «индикатора» активности природного очага арбовирусов.

III На территории Восточной Сибири заболеваемость лихорадкой Западного Нила и ГЛПС не регистрируется, поэтому эпидемиологический надзор со стороны службы Роспотребнадзора полностью отсутствует. Необходимо разработать программу эпидемиологической разведки, экологического, эпизоотологического мониторинга, а также обследования больных в летне-осенний период с остро лихорадочными заболеваниями без поражения и с поражением ЦНС в виде серозного менингита или менингоэнцефалита. В выполнении такой программы должны быть задействованы ФГУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии» в субъекте, научные учреждения.

Пути улучшения  эпиднадзора за ГЛПС в условиях Восточной Сибири мы видим в организации эпидемиологической разведки – выявлении и характеристике местных очагов хантавирусных инфекций, а также выявлении и тщательном обследовании больных с подозрением на ГЛПС. Прежде всего, следует дифференцировать местные и завозные случаи.

IV. Основная цель эпиднадзора за экзотическими особо опасными вирусными болезнями заключается в предотвращении случаев заноса на территорию региона и их дальнейшего распространения. Особую опасность для населения представляют геморрагические лихорадки Эбола, Марбург, Ласса, человеческий грипп, вызванный новым подтипом. Не исключена возможность их завоза на территорию нашего региона, особенно через международные аэропорты в гг. Иркутск, Красноярск, Улан-Удэ. 

Проведена оценка территории Восточной Сибири (на примере Красноярского, Забайкальского краев, Республик Хакасия, Тыва, Бурятия, Иркутской области) в отношении риска возможного завоза особо опасных вирусных болезней и эпидемиологического значения видов транспортного сообщения с эндемичными по ООВИ странами.  Санитарно-карантинный досмотр пассажиров и грузов организован в пунктах пропуска (санитарно карантинные пункты и отделения) через Государственную границу в аэропортах гг. Красноярск, Абакан, Иркутск, Братск, Улан-Удэ и Чита; на железнодорожных станциях Наушки Восточно-Сибирской железной дороги и Забайкальск  Забайкальской  железной дороги. На международных автомобильных пунктах пропуска в населенных пунктах Кяхта, Монды (Республика Бурятия), Забайкальск, Старый Цурухайтуй, Соловьевск, Верхний Ульхун, Олочи и Покровка (Забайкальский край), на автомобильных пунктах пропуска «Хандагайты», «Цаган-Тологой», «Шара-Суур» (Республика Тыва).

Для уточнения роли разных видов транспорта в Восточной Сибири проведен анализ международных пассажирских перевозок с учетом актуальных с точки зрения санитарной охраны территории от заноса вирусных инфекционных болезней. По имеющимся данным на территорию Иркутской области ежегодно воздушным транспортом прибывают около 70 тыс. человек, включая пассажиров и членов экипажей. Пассажиры  прибывали в разные годы из 23-32 стран Европы, 4-6 – Америки, 1-6 – Африки, 15-21 – Азии, Австралии с Океанией и Новой Зеландии. Ежегодно доля перевозимых пассажиров из эндемичных по лихорадке денге, желтой лихорадке и контагиозным вирусным геморрагическим лихорадкам (КВГЛ)  стран составляет соответственно 2,15; 0,015 и 0,002 % в структуре прибывших. В период с 2003 по 2007 гг. отмечается трехкратное нарастание объема пассажирских перевозок. Преобладают перевозки пассажиров из стран Европы и Азии. Среднемноголетнее число прибывших пассажиров из стран Европы  за период с 2002-2006 гг. составило 56231, а из стран Азии – 19627. На территорию региона из европейских стран возможен завоз ЛЗН, ГЛПС, Крымской геморрагической лихорадки и других болезней. Прибытие авиапассажиров из стран Азии (Япония, Китайская Народная Республика, Вьетнам, Индия, Индонезия, Малайзия, Сингапур, Таиланд, Австралия, Пакистан) связано с возможностью  заноса различных болезней, вызываемых особо опасными арбовирусами семейств Flaviviridae (японский энцефалит, лихорадка/геморрагическая лихорадка денге, киасанурская лесная болезнь), Bunyaviridae (ГЛПС, Крымская геморрагическая лихорадка), Paramyxoviridae (Хендра и Нипа), Orthomyxoviridae (грипп птиц H5N1), Picornaviridae (ТОРС).  Togaviridae (Чикунгунья). В международном аэропорту «Красноярск»  санитарно-карантинным отделением ежегодно досматривается в среднем 1100 воздушных судов  на международных линиях. Международными рейсами  прибывает в пределах 100 тыс. человек.

Санитарный контроль международных пассажирских железнодорожных перевозок осуществляется в пунктах пропуска через Государственную границу РФ на пограничных железнодорожных станциях Забайкальск (Забайкальский край) и Наушки (Республика Бурятия). Общее количество прибывших на ст. Наушки  пассажиров из КНР, Монголии, в том числе и российских граждан, ежегодно составляет 42864-45021 человек. На станции Забайкальск основные перевозки связаны с передвижением грузов, ежегодный объем составляет 470 тыс. контейнеров.

Автомобильные перевозки. Рассматривая потенциальную возможность заноса особо опасных инфекционных болезней разными видами транспорта, следует отметить, что число пассажиров, ежегодно прибывающих на территорию Восточной Сибири через международные автомобильные пункты пропуска (МАПП) из КНР и Монголии, превышает количество авиапассажиров, прибывающих из Европы, Азии, Африки, Америки и Австралии в аэропорты гг. Красноярск, Иркутск, Братск, Абакан, Чита и Улан-Удэ. Так, через шесть МАПП, расположенных в Забайкальском крае на Государственной границе  с КНР и Монголией,  ежегодно передвигается более 1,5 млн человек и 300 тысяч транспортных средств. Географическое расположение Забайкальского края и Республики Бурятия определяет особую важность организации мероприятий по санитарной охране. Территория Забайкальского края на протяжении полутора тысяч километров граничит с КНР и Монголией. В сопредельных странах практически ежегодно регистрируются заболевания чумой, холерой, но мы не располагаем сведениями по заболеваемости ООВИ. Известно о существовании природных очагов ГЛПС, бешенства и некоторых других инфекций. В 2003 г. в Китае  зарегистрирована эпидемическая вспышка неизвестного ранее заболевания – ТОРС, регистрируются заболевания людей гриппом птиц. При ухудшении эпидемиологической ситуации по этим болезням существует вероятность их завоза на территорию Забайкалья.

Нами проведено эпидемиологическое  ранжирование территории Восточной Сибири по степени риска завоза и распространения ООВИ. В качестве основных критериев эпидемиологических рисков для ранжирования  территории были выбраны следующие: 1. Наличие международного аэропорта; 2. Наличие железнодорожного сообщения с зарубежными странами; 3. Наличие МАПП; 4. Наличие приграничной территории; 5. Наличие пассажиропотока из эндемичных  по ООВИ стран; 6. Численность населения. Для оценки риска применили метод Е.Б. Куренкова (2006) в нашей модификации. Величину риска завоза ООВИ  определяли по результирующей сумме баллов всех критериев. Использовали три градации балльной системы: высокий уровень (более 30 баллов), средний (20-30 баллов), низкий (меньше 20 баллов). Максимальная величина риска завоза – 40 баллов. Результаты ранжирования территории Восточной Сибири по степени риска завоза и распространения ООВИ представлены на рис. 6. Ранжирование территории (Красноярский, Забайкальский края, Республики Хакасия, Тыва, Бурятия и Иркутская область) показало, что наибольшему риску  завоза ООВИ подвержены Забайкальский край и Республика Бурятия, имеющие общую границу с КНР и Монголией. На территорию Забайкальского края и Республики Бурятия наиболее вероятен занос ТОРС, бешенства, а также гриппа птиц Н5N1 автомобильным и железнодорожным транспортом в пунктах пропуска на границе с КНР. Примерно одинаковый риск имеют Красноярский край и Иркутская область, так как на их территорию прибывают авиапассажиры

Рис. 6. Ранжирование территории Восточной Сибири в баллах (от 15 до 40) по риску завоза и распространения особо опасных и природно-очаговых вирусных болезней

из-за рубежа, в том числе и из эндемичных по ООВИ стран. Возможен завоз геморрагических лихорадок и других опасных инфекций. В Республике Тыва риск связан с завозом природно-очаговых вирусных инфекций из Монголии (в основном бешенства). В Республику Хакасия возможен завоз воздушным транспортом неэндемичных для региона инфекций пассажирами, прибывающими из европейской  части страны.

Однако проблема санитарной охраны территории региона осложняется следующими положениями: недостаточным оснащением и кадровым обеспечением лабораторной базы, отсутствием сертифицированных диагностических тест-систем на особо опасные вирусные инфекции.  Важным является корректировка региональных программ по санитарной охране территории субъектов региона в связи с проводимыми Федеральной службой Роспотребнадзора мероприятиями: созданием единой трехуровневой системы мониторинга, индикации и диагностики инфекционных болезней территориального,  регионального и федерального уровней; укреплением материально-технической базы лабораторий, оснащением их необходимым оборудованием для проведения мониторинга возбудителей инфекционных болезней с едиными требованиями к методам лабораторной диагностики; пересмотром нормативно-методических документов по мониторингу инфекционных болезней.

Заключение

       Таким образом, по результатам проведенных исследований впервые научно обоснована необходимость дифференцированного подхода к эпидемиологическому надзору за природно-очаговыми и особо опасными вирусными инфекциями в соответствии с уровнем их  эпидемиологической значимости для территории  Восточной Сибири. Для каждого уровня определены нозологические формы вирусных инфекционных болезней, по которым проведены исследования, отраженные в данной работе  и намечены пути оптимизации эпидемиологического надзора:

       1.  Клещевой энцефалит

  • На основе анализа отчетных данных, собственных данных мониторинга природных очагов КЭ дана характеристика эпидемиологической ситуации по КЭ в Восточной Сибири, что может быть использовано при планировании противоэпидемических и профилактических мероприятий.
  • Для повышения эффективности эпидемиологического надзора впервые разработана и применена комплексная система изоляции вируса КЭ из иксодовых клещей, включающая применение ИФА, новорожденных белых мышей, культуру клеток при различных температурных режимах культивирования  и типирование.
  •   Существенно расширены представления о структуре популяций и степени вариабельности вируса КЭ в природных очагах  Приангарья и  Забайкалья. Изучены биологические и молекулярно-генетические свойства штаммов  вируса КЭ, изолированных от людей и иксодовых клещей в региональных природных очагах. Установлено, что вирус КЭ сибирского подтипа вызывает в Забайкальском крае очаговые формы болезни с летальным исходом. Изолированы штаммы вируса КЭ, содержащие генетический материал двух подтипов – дальневосточного и сибирского.

  2. Арбовирусные инфекции Инко, Гета и Батаи

  •   На основе данных серологического мониторинга оценен уровень иммунной прослойки у населения и сельскохозяйственных животных на  территории Восточной Сибири.
  •   Установлена  территориальная неоднородность проявления  природных очагов  арбовирусных инфекций. Показано, что крупный рогатый скот является индикатором интенсивности циркуляции арбовирусов с  точной привязкой к местности.

3. Лихорадка Западного Нила, ГЛПС

  •   Эпидемиологический надзор учреждениями Роспотребнадзора за ЛЗН отсутствует. Результаты серологического обследования населения Восточной Сибири свидетельствуют о циркуляции в регионе возбудителя лихорадки Западного Нила. Антитела к ВЗН в крови пациентов с поражением нервной системы обнаруживаются  достоверно с более высокой частотой, чем среди других амбулаторных пациентов и населения.
  • ГЛПС. Поучены новые данные об ареале циркуляции хантавирусов и носителей на территории Восточной Сибири. Установлены  доминирующие носители хантавирусов для таежной зоны в Республике Саха (Якутия),  для степной зоны, чередующейся  с участками соснового леса и березняка с кустарником в Иркутской области, степной зоны в Забайкальском крае. 

4. Экзотические особо опасные вирусные инфекции  I-II групп патогенности,  на которые распространяются правила санитарной охраны территории

  • Сформированы базы данных «ОСОБО ОПАСНЫЕ ВИРУСНЫЕ ИНФЕКЦИИ», «ПРИРОДНООЧАГОВЫЕ ВИРУСНЫЕ ИНФЕКЦИИ, ЭНДЕМИЧНЫЕ ДЛЯ РОССИИ»; на их основе проанализирована современная эпидемиологическая ситуация  в мире по контагиозным вирусным геморрагическим лихорадкам и некоторым особо опасным вирусным болезням  и,  в соответствии с ММСП (2005 г.), оценена их актуальность с точки зрения завоза  и формирования вторичных очагов на территории региона.
  • Усовершенствованы методы лабораторной диагностики геморрагических лихорадок Марбург и Эбола для оптимизации санитарной охраны территории от их заноса.
  • На примере Красноярского, Забайкальского краев, Республик Хакасия, Тыва, Бурятия, Иркутской области проведена оценка эпидемиологического значения видов транспортного сообщения с эндемичными по ООВИ странами и ранжирование территории в отношении риска возможного заноса особо опасных вирусных болезней.

ВЫВОДЫ

1. На основе  анализа эпидемиологических данных, результатов вирусологического и серологического мониторинга  обоснован дифференцированный подход и намечены пути совершенствования эпидемиологического надзора за природно-очаговыми и особо опасными вирусными инфекциями  с учетом распределения их в группы разного уровня  эпидемиологической значимости для региона.

2. Современная эпидемиологическая ситуация в мире по контагиозным вирусным геморрагическим лихорадкам характеризуется глобализацией эпидемического процесса, обусловливающей рост заболеваемости и масштабность вспышек, сокращение интервалов между эпидемическими вспышками; рост эпидемического потенциала лихорадок Западного Нила, долины Рифт, денге, КГЛ, оспы обезьян, патогенного для человека гриппа птиц. В соответствии с ММСП (2005 г.) дана оценка их актуальности с точки зрения завоза  и возможности формирования вторичных очагов на территории Восточной Сибири.

3. Усовершенствованы методы  лабораторной диагностики  особо опасных геморрагических лихорадок Марбург и Эбола, позволяющие выявлять вирусспецифические антитела, выделять и идентифицировать вирусы Марбург и Эбола из исследуемого материала.

4. В Восточной Сибири основные особенности эпидемиологических проявлений КЭ заключаются в  устойчивой, относительно высокой заболеваемости с подъемами циклического характера (максимальные показатели зарегистрированы в 1999-2002 гг.),  значительных изменениях в уровнях и структуре заболеваемости, возросшей доли Восточной Сибири в заболеваемости в Сибирском федеральном округе.

5. Разработан алгоритм вирусологического мониторинга природного очага КЭ, основанный на комплексном  использовании систем биологической изоляции вирусов (параллельно на белых мышах и культуре клеток при двух температурных режимах), серологических  (ИФА,  МФА) и генетических  методов, который позволяет выявить более широкий спектр циркулирующих в природном очаге вариантов вируса и оценить их эпидемиологическую значимость.

6.  Штаммы вируса КЭ, изолированные в Прибайкалье и Забайкалье (1995-2003 гг.) гетерогенны по вирулентности и нейроинвазивности в  экспериментах на белых мышах. Впервые установлено, что в Забайкальском крае  формирование очаговых форм клещевого энцефалита с летальным исходом обусловлено  сибирским и дальневосточными подтипами. Впервые обнаружены микст-штаммы вируса КЭ, содержащие участки генома дальневосточного и сибирского подтипов.

7. По результатам серологического мониторинга населения и сельскохозяйственных животных установлено  наличие иммунной прослойки с территориальной неоднородностью к арбовирусам КЭ, Инко, Гета и Батаи на большинстве обследованных территорий Восточной Сибири, отличающихся по ландшафтным и климатическим характеристикам.  Наиболее широко распространены вирусы Инко и КЭ. Показано, что крупный рогатый скот является индикатором интенсивности циркуляции арбовирусов с  точной привязкой к местности.

8. Среди населения Восточной Сибири выявлена иммунная прослойка к вирусу Западного Нила. Антитела к вирусу Западного Нила впервые обнаружены в ряде  районов Республик Саха (Якутия), Бурятия, УОБАО,  Иркутской области. Установлено, что антитела к вирусу Западного Нила в крови пациентов с поражением нервной системы выявляются  достоверно с более высокой частотой, чем среди других амбулаторных больных.

9. В результате проведенных исследований значительно расширилось представление об ареале хантавирусов и их носителей на территории Восточной Сибири. Антиген хантавирусов обнаружен у восьми видов мелких млекопитающих: красной и  красно-серой полевок (Республика Саха), узкочерепной полевки, полевки-экономки, азиатской лесной мыши, мыши полевой и серой крысы (Иркутская область), узкочерепной полевки и мыши домовой (Забайкальский край). РНК хантавирусов обнаружена в пробах от узкочерепной полевки (Иркутская область), джунгарского хомячка (Забайкальский край).

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Вирулентность филовирусов (Марбург и Эбола) в эксперименте и лабораторная  диагностика этих инфекций / А.М. Титенко, С.С. Новожилов, Е.И. Андаев и др. // Генетика  и биохимия вирулентности  возбудителей особо опасных инф.: Тез. докл. Волгоград, 21-22 окт. 1992 г. - Волгоград, 1992. – С. 169.

2. Вируснейтрализующие антитела в сыворотках морских свинок, иммунизированных вирусом Эбола  (штамм Заир) / С.С. Новожилов, А.М. Титенко, Т.И. Борисова, Е.И. Андаев и др.; Иркут. н.-и. противочумн. ин-т. Сибири  и ДВ. - Иркутск, 1992. – 14 c. – Деп.: ВИНИТИ 22.05.92; № 1699-В92.

3. Клеточный  иммуноферментный метод  анализа специфических антител к вирусам Марбург и Эбола / А.М. Титенко, Е.И. Андаев, Р.И. Ишбаева и др.; Иркут. н.-и. противочумн. ин-т Сибири и ДВ. - Иркутск, 1992. – 10 c. – Деп.: ВИНИТИ 22.05.92; №1698-В92.

4. Культивирование вируса Марбург в клетках  Vero / А.М. Титенко, Т.И Борисова, Е.И. Андаев и др.: Иркут. н.-и. противочумн.  ин-т  Сибири и ДВ. - Иркутск, 1992. – 13 c. – Деп.: ВИНИТИ 22.05.92; №1897-В92.

5. Получение и характеристика иммунных сывороток к вирусам Марбург и Эбола / Е.И. Андаев, Е.В. Куликова, С.С. Новожилов и др.; Иркут. н.-и. противочумн. ин-т Сибири и ДВ. - Иркутск, 1992. – 12 c. – Деп.: ВИНИТИ 22.05.92; № 1697-В92.

6. Репродукция вируса Эбола в клеточных культурах / А.М. Титенко, С.С. Новожилов, Е.И. Андаев и др. // Вопр. вирусол. – 1992. – № 2. – С. 110-113.

7. Динамика антителообразования у морских свинок, инфицированных  вирусами  Марбург и Эбола / Е.И. Андаев, С.С. Новожилов, А.М. Титенко и др. // Сб. науч. работ, посвящ. 70-летию образования санэпидслужбы Иркут. обл. – Иркутск, 1993. – С.77-78.

8. Альтернативные методы прямой изоляции вируса клещевого энцефалита из клещей  Ixodes persulcatus / А.М. Титенко, Е.В. Куликова, … Е.И. Андаев и др. // Междунар.  науч. конф. «Вирусные, риккетсиозные и  бактериальные инфекции, переносимые клещами» 24-26 сент. 1996 г.: Тез. докл. – Иркутск, 1996. – С. 34-35.

9. Результаты исследований на арбовирусные инфекции и боррелиоз в Прибайкалье / Е.И. Андаев, Е.В. Куликова, А.Г. Трухина и др. // Материалы науч.-практ. конф., посвящ. 100-летию образования противочумн. службы России (16-18 сент. 1997 г.). – Т.1. – Саратов, 1997. - С.5.

10. Результаты серологического обследования населения  Республики Саха (Якутия) на инфекции, связанные с иксодовыми клещами / А.Д. Ботвинкин, Т.И. Борисова, Е.И. Андаев и др. // Вопр. регион. гигиены, санитарии и эпидемиологии: Республ. сб. науч. работ: Тез. докл. науч.-практ. конф. 12-13 ноября 1997 г. – Якутск, 1997. – Вып. 4. - С. 230-231.

11. Вирусы  Марбург и Эбола: биологические свойства и разработка методов лабораторной диагностики / А.М Титенко, Е.И. Андаев, Е.В. Куликова, Т.И. Борисова // Журн. инфекц. патологии. – Иркутск, 1998. – Т.5, № 4. – С.75-79.

12. Культивирование вируса Марбург в клетках Vero / А.М. Титенко, Т.И. Борисова, Е.И. Андаев, Е.В. Куликова // Журн. инфекц. патологии. – Иркутск,  1998. – Т.5, № 4. – С. 80-82.

13. Титенко А.М. Актуальные проблемы санитарной охраны территории от завоза и распространения новых и вновь возникающих вирусных инфекций человека / А.М. Титенко, Е.И. Андаев  // Журн. инфекц. патологии. – Иркутск, 2001. – Т. 8, № 2-3. – С. 32-43.

14. Титенко А.М. Динамика экспрессии антигенов вирусов Марбург и Эбола в инфицированных клетках Vero / А.М. Титенко, Е.И. Андаев, Т.И. Борисова  // Вопр. вирусол. – 2001. – № 6. – С. 43-45.

15. Определение вирусофорности клещей Ixodes persulcatus при мониторинге территорий, эндемичных для клещевого энцефалита / А.М. Титенко, С.В. Бахум, Е.И. Андаев и др. // Ветеринарная патология. – 2002. – № 2. – С. 115-119.

16. Титенко А.М. Определение специфических антител к вирусам Эбола и Марбург методом  клеточного иммуноферментного анализа / А.М. Титенко, Е.И. Андаев, Борисова Т.И. // Биотехнология. – 2002. – № 2. – С. 75-78.

17. Титенко А.М. Санитарная охрана территории от завоза и распространения вирусных инфекций. Сообщение 2. Критерии для анализа нозологических форм / А.М. Титенко, А.Д. Ботвинкин, Е.И. Андаев // Пробл. особо опасных инфекций: Сб. науч. трудов / Под ред. В.В. Кутырева. – Саратов, 2003. – Вып. 85. – С. 41-49.

18. Андаев Е.И. Эпидемиологический надзор за особо опасными вирусными инфекциями в Восточной Сибири / Е.И. Андаев, А.М. Титенко, А.Д. Ботвинкин  // Бюл. ВСНЦ СО РАМН. – Иркутск, 2004. – № 1, Т.3. – С. 79-85.

19. Результаты серологических исследований на арбовирусы в районах Восточной Сибири, отличающихся по природно-климатическим условиям / Е.И. Андаев Е.И., С.В. Бахум, Т.И. Борисова и др. // Бюл. ВСНЦ СО РАМН. – Иркутск, 2004. – № 1, Т. 2. – С. 16-21.

20. Титенко А.М. Оценка вероятности завоза контагиозных особо опасных вирусных инфекций на территорию Российской Федерации / А.М. Титенко, Е.И. Андаев // Противочумные учреждения России и их роль в обеспечении эпид. благополучия населения страны: Материалы конф., посвящ. 70-летию Противочумного центра. – М., 2004. – С. 221-224.

21. Эффективность альтернативных методов изоляции вируса клещевого энцефалита из клещей Ixodes persulcatus/ А.М. Титенко,  С.В. Бахум, Е.И. Андаев и др. // Бюл. ВСНЦ СО РАМН. – Иркутск, 2004. – № 1, Т. 2.– С. 162-165.

22. Выявление циркуляции вируса  Западного Нила и хантавирусов на  территории Иркутской области и Республики Бурятия / Е.И. Андаев, Т.И. Борисова, В.Б. Казанова и др. // Чрезвычайные ситуации междунар. значения в общественном здравоохранении и сан. охрана территории государств - участников СНГ: Материалы VII Межгосударств. науч.-практ. конф. государств-участников СНГ. 3-5 окт. 2006 г. - Оболенск, 2006. - С. 14-15.

23. Мониторинг популяций вируса клещевого энцефалита в таежных клещах пригородной зоны г. Иркутска / Е.И. Андаев, А.Г. Трухина, Т.И. Борисова и др. // Проблемы прогнозирования чрезвычайных ситуаций: Тез. докл. VI науч.-практ. конф. – Пос. Никола Иркутской обл., 5-7 сентября 2006 г. – Иркутск, 2006. - С. 6-8.

24. Нейтрализующие антитела к вирусу клещевого энцефалита и передаваемым комарами арбовирусам Инко, Гета и Батаи в сыворотках крови населения Республики Бурятия / Е.И. Андаев, Т.И. Борисова, Р.С. Шобоева и др. // Современная ситуация и перспективы борьбы с клещевыми инфекциями в XXI веке: Тез. докл. Всерос.  науч.-практ. конф., 14-15 февраля 2006 г. – Томск, 2006. – С. 15-17.

25. Серологическое обследование на арбовирусы людей и сельскохозяйственных животных в Республике Бурятия / Е.И. Андаев, Т.И. Борисова, А.Д. Ботвинкин и др. // Бюл. ВСНЦ СО РАМН. – 2006. –  № 2. – С. 161–164.

26. Титенко А.М. Роль особо опасных вирусных инфекций в возникновении чрезвычайных ситуаций в общественном здравоохранении, имеющих международное значение / А.М. Титенко, Е.И. Андаев  // Чрезвычайные ситуации междунар. значения в общественном здравоохранении и сан. охрана территории государств - участников СНГ: Материалы VII Межгосударств. науч.-практ. конф. государств-участников СНГ. 3-5 окт. 2006 г. - Оболенск, 2006. - С. 62-63.

27. Энцефалиты и менингиты неустановленной этиологии в Иркутской области. Анализ статистических данных / Т.С. Прокопчук, А.Д. Ботвинкин, … Е.И. Андаев и др. // Омский научный вестник. – 2006. – №1 (35). – С. 83-85.

28. Этиология очаговых форм клещевого энцефалита с летальными исходами в Читинской области / Е.И. Андаев, А.Г. Трухина, Л.С. Карань и др. // Медицинская вирусология.Труды Ин-та полиомиелита и вирусных энцефалитов им М.П. Чумакова. - Том ХХIII. – М., 2006. – С. 75-77.

29. Андаев Е.И. Изучение клещевого энцефалита и других арбовирусных инфекций в Иркутском противочумном институте / Е.И. Андаев, А.Г. Трухина, Т.И. Борисова // Бюл. ВСНЦ СО РАМН. – 2007. –  № 3 (55). Приложение. – С. 74–78.

      30. Андаев Е.И. Санитарная охрана территории от завоза и распространения особо опасных вирусных инфекций. Сообщение 4. Желтая лихорадка / Е.И. Андаев, А.М. Титенко, О.В. Мельникова // Пробл. особо опасных инфекций: Сб. науч. трудов / Под ред. В.В. Кутырева. - Саратов, 2007. – Вып. 94 (2). – С. 11-15.

31. Геоинформационные технологии в мониторинге заболеваемости клещевым энцефалитом в верхнем Приангарье / С.И. Мясникова, Е.И. Андаев, Е.А. Сидорова и др. // Материалы XIII науч. совещания географов Сибири и Дальнего Востока (Иркутск, 27-29 ноября 2007 г.) – Т.1. – Иркутск: Изд-во Ин-та географии им В.Б. Сочавы СО РАН, 2007. – С. 168-169.

32. Изучение циркуляции вируса геморрагической лихорадки с почечным синдромом на территории Восточной Сибири / Е.И. Андаев, Т.И. Борисова, Е.А. Сидорова и др. // Международные медико-сан. правила и реализация глобальной стратегии борьбы с инфекц. болезнями в государствах-участниках СНГ:  Материалы VIII Межгосударств.  науч.-практ. конф. государств – участников СНГ (25-26 сентября 2007 г., Саратов). - Саратов, 2007. – С.15-17.

33. Клещевой энцефалит в Читинской области и этиология очаговых форм с летальным исходом / Е.И. Андаев, А.Г. Трухина, Л.С. Карань и др. // Бюл. СО РАМН. – 2007. – № 4 (126). – С. 60-65.

34. Сидорова Е.А. Клинико-эпидемиологический анализ заболеваемости клещевым энцефалитом в г. Иркутске (1995-2006 гг.) / Е.А. Сидорова, Е.И. Андаев, А.М. Антонова // Совр. аспекты эпид. надзора за особо опасными инфекц. заболеваниями на юге России: Материалы науч.-практ. конф. (21-22 марта 2007 г., г. Ставрополь). – Ставрополь, 2007. - Часть II – C. 110-112.

35. Структура популяционного иммунитета к вирусу клещевого энцефалита населения Иркутской области / А.Г. Трухина, Е.И. Андаев, Т.И. Борисова Сидорова и др. // Совр. научн. и прикладные аспекты клещевого энцефалита (к 70-летию открытия вируса клещевого энцефалита): Тез. докл. Всерос. науч. конф. 15-16 ноября 2007 г., Москва. – М., 2007. – С. 125-127.

36. Структура популяции вируса клещевого энцефалита в Иркутской области / А.Г. Трухина, Е.И. Андаев, Т.И. Борисова и др. // Мед. вирусология. Труды Ин-та полиомиелита и вирусных энцефалитов им М.П. Чумакова. - Том ХХIV. – М., 2007. – С. 81-87.

37. Эволюция клещевого энцефалита и проблема эволюции возбудителя / В.В. Погодина, Л.С. Карань, … Е.И. Андаев и др. //  Вопр. вирусол. – 2007. – № 5. – С. 16-21.

38. Андаев Е.И. Санитарная охрана территории от завоза и распространения особо опасных вирусных инфекций. Сообщение 5. Лихорадка Ласса / Е.И. Андаев, О.В. Мельникова, А.М. Титенко // Пробл. особо опасных инфекций: Сб. науч. трудов / Под ред. В.В. Кутырева. – Саратов, 2008. – Вып. 95 (1). – С. 17-22.

39. Неоднородность популяции вируса клещевого энцефалита в природных очагах Читинской области / Е.И. Андаев, А.Г. Трухина, Т.И. Борисова и др. // Sci. J. – Ulaanbaatar, 2008. – N16. – P. 245- 250.

40. Результаты генотипирования штаммов вируса клещевого энцефалита, выделенных от таежных клещей в Приангарье / Е.И. Андаев, А.Г. Трухина, Т.И. Борисова и др. // Совр. технологии в реализации глобальной стратегии борьбы с инфекц. болезнями на территории государств-участников СНГ: Материалы IX Межгосударств.  науч.-практ. конф., - Волгоград, 2008. – С. 21-22.

41. Результаты обследования сочетанного природного очага вирусных и бактериальных зоонозов на территории Заларинского района  Иркутской области / Е.И.  Андаев, М.В.  Чеснокова, Т.И. Борисова и др.  // Журн. инфекц. патологии. – Иркутск, 2008. – Т.15, № 1-4. – С. 18-21.

42. Серологическое обследование жителей Восточной Сибири на антитела к вирусу Западного Нила (2005-2007 гг.) / Е.И. Андаев, Т.И. Борисова, А.Д. Ботвинкин и др. // Диагностика, лечение и профилактика опасных и особо опасных инфекц. заболеваний. Биотехнология: Материалы Всерос. науч.- конф., посвящ. 80-летию со дня основания ФГУ «48 ЦНИИ Минобороны России» (20-21 ноября 2008 г, г. Киров). – Киров, 2008. – С. 227.

43. Серологическое обследование на арбовирусы крупного рогатого скота в Иркутской области / Е.И.  Андаев, Т.И. Борисова, Н.И.  Ковалькова и др. // Ветеринария. – 2008. - №8. – С. 15-17.

44. Эпидемиологическая обстановка по клещевому энцефалиту, ее прогноз и основные направления профилактических мероприятий в регионах Сибири / А.Я. Никитин, С.В. Балахонов, Е.И. Андаев и др. // Пробл. особо опасных инфекций. – 2008. – Вып. 98 (4). – С. 21-24.

       45. Мониторинг природно-очаговых инфекций в приграничных территориях Забайкалья (РФ) и Маньчжурии (КНР) в свете реализации решений совещания государств – членов ШОС / С.В. Балахонов, С.Э. Лапа, …Е.И. Андаев и др. // Перспективы сотрудничества государств – членов ШОС в противодействии угрозе инфекц. болезней: Тез. докл. междунар. науч.-практ. конф. (14-15 мая 2009 г., Новосибирск, Россия). - Новосибирск, 2009. – С. 58-61.

46. Titenko A.M. Tick-borne encephalitis epidemiology in some provinces of Siberia / A.M. Titenko, A.D. Botvinkin, E.I. Andaev  // Zent. Bakteriol. – 1999. – Vol. 289. – P. 595-604.

47. Antibodies to arboviruses in cattle as an indicator of virus activity / А.М. Titenko, S.V. Bakhum, … E.I.  Аndaev et al. // J. Med. Microbiol. – 2002. – Vol. 291, N. 33. - Suppl. – P. 178.

48. Titenko A.M. Tick-borne diseases in the Lake Baikal region / A.M. Titenko, A.D. Botvinkin, E.I.  Andaev // Int. J. Med. Microbiol. – 2002. – Vol. 291, № 33. - Suppl. – P. 187.

      49. The integrated approach to definition of tick-borne encephalitis virus in ticks Ixodes persulcatus / A.M. Titenko,  C.V. Bakhum, E.I. Andaev et al. // Sci. J. – Ulaanbaatar, 2003. – N. 11. – P. 208-213.

СПИСОК УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ

БОЕ

- бляшкообразующие единицы

ВЗН

- вирус Западного Нила

ГЛМ

- геморрагическая лихорадка Марбург

ГЛПС

- геморрагическая лихорадка с почечным синдромом

ГЛЭ

- геморрагическая лихорадка Эбола

ДРК

- Демократическая Республика Конго

ЖЛ

- желтая лихорадка

ИИ

- индекс инвазивности

ИФА

- иммуноферментный анализ

КГЛ

- Крымская геморрагическая лихорадка

КК

- культура клеток

КРС

- крупный рогатый скот

КЭ

клещевой энцефалит

ЛЗН

- лихорадка западного Нила

МАПП

- международный автомобильный пункт пропуска

ММСП

- международные медико-санитарные правила

МФА

- метод флуоресцирующих антител

НБМ

- новорожденные белые мыши

НМФА

- непрямой метод флуоресцирующих антител

ООВИ

- особо опасные вирусные инфекции

ОТ-ПЦР

- обратная транскрипция-полимеразная цепная реакция

РН

- реакция нейтрализации инфекционности вируса

РНК

- рибонуклеиновая кислота

СГТ

- средний геометрический титр антител

СФО

- Сибирский федеральный округ

ТОРС

- тяжелый острый респираторный синдром

 





© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.