WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


 

На правах рукописи

Шеина Наталья Ивановна

НАУЧНО-МЕТОДИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ГИГИЕНИЧЕСКОГО НОРМИРОВАНИЯ И ОЦЕНКИ ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО РИСКА ВОЗДЕЙСТВИЯ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ШТАММОВ МИКРООРГАНИЗМОВ

14.00.50 Медицина труда

 

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Москва 2008

Работа выполнена в ГОУ ВПО Российский государственный медицинский университет Росздрава

Научный консультант

доктор медицинских наук, 

профессор Н.Г. Иванов 

Официальные  оппоненты:

Заслуженный деятель науки РФ

академик РАМН, 

доктор медицинских наук

профессор Н.В. Русаков

Доктор биологических наук

профессор Л.А. Румянцева 

Доктор медицинских наук  Т.А. Ткачева

Ведущая организация: ГОУ ВПО Московская медицинская академия им. И.М. Сеченова Росздрава

Защита состоится  29 сентября 2008 г. на заседании диссертационного совета Д.001.012.01 при ГУ Научно-исследовательском институте медицины труда РАМН по адресу: 105275  Москва, проспект Буденного, д.31

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ медицины труда РАМН.

Автореферат разослан «_______» ________________ 2008 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор биологических наук  Н.Б. Рубцова 

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы Биотехнология стала одним из главных научно-практических направлений ХХI века, определяющих уровень  мировой экономики. Мировой рынок биотехнологической продукции оценивается более чем в 150 млрд. долларов в год. Развитие биотехнологии является стратегической задачей России, необходимой для обеспечения ее статуса экономически развитой державы (из Национальной программы по развитию биотехнологии 2006-2012гг.).

Прогресс биотехнологии во многом обусловлен потребностями рынка, увеличением спроса на питание, медикаменты и энергоресурсы. При этом биотехнологическая промышленность отличается высокой рентабельностью и технологичностью микробиологического синтеза.

Продукция, полученная с помощью методов промышленной биотехнологии, имеет выход практически во все отрасли народного хозяйства: медицина (гормоны, вакцины, ферменты, диагностические системы), сельское хозяйство (кормовой белок, аминокислоты, средства защиты растений и животных), химическое производство (полисахариды, биодеградируемые материалы, биокатализ), энергетика (биогаз, биодизель), экология (биоремедиация, сохранение биоразнообразия) и др.

Многочисленные данные литературы свидетельствуют о том, что биотехнологические штаммы микроорганизмов представляют серьезную опасность как для человека, так и для объектов окружающей среды [Т.Г. Омельянец, 1981, Р.М. Баширова, 1989, В.И. Немыря, 1989, Г.А. Багдасарьян, И.З.Зельцер, 1991, Г.М. Трухина, 1993, Ю.П. Пивоваров, В.В. Королик, 1994, Л.М. Соседова, В.С. Рукавишников, 2003, Н.П. Сергеюк, 2004 и др.].

В условиях интенсификации биотехнологического производства на фоне новой социально-экономической ситуации в стране возрастает роль профилактической медицины, осуществляющей охрану здоровья работающих и населения.  Гигиеническое нормирование вредных химических и биологических загрязнителей окружающей среды – основное звено в ряду мер, обеспечивающих безопасность на производстве и в быту [Г.Г. Онищенко, 1997, Н.Ф. Измеров, 2002, 2006, Ю.А. Рахманин, 2005, Н.В. Русаков и др., 2006].

В программе «Здоровье работающих России» в рамках Межведомственного совета РАМН «Медико-экологические проблемы здоровья работающих» одним из актуальных направлений научных исследований признается разработка системы гигиенической регламентации факторов производственной среды и трудового процесса с позиции методологии оценки риска.

Токсикологические исследования промышленных микроорганизмов стали развиваться в 70-80 гг. прошлого столетия с учетом опыта изучения химических веществ в воздухе рабочей зоны и других средах [И.В. Саноцкий, И.П. Уланова, 1986, И. В. Саноцкий, 1994, М.А. Пинигин, 1997, Г.Н. Красовский, 1998, Н.В.Русаков, 2003]. В настоящее время система химической безопасности  успешно развивается на основе методологии оценки риска [Г.Г. Онищенко, 1997, Н.Ф. Измеров, 1997, С.М. Новиков, 1996, 1997, Н.Н. Молодкина и др., 1996, А.И. Халепо, 2001, Н.Ф. Измеров, Э.И. Денисов, 2003].

Перспективность применения в России методологии оценки риска, диктует необходимость ее дальнейшей разработки, развития и приведения в соответствие с требованиями, принятыми в нашей стране,  и в отношении микробиологического фактора промышленного производства.  Указанное особенно актуально в связи с данными о том, что гигиенические нормативы для ряда промышленных микроорганизмов (род Candida) не обеспечивают безопасность человека в условиях производства [Л.М. Соседова, В.С. Рукавишников, 2003 и др.].

Следует признать, что методический уровень и рекомендованный объем исследований по нормированию биологических загрязнителей не отвечают требованиям современной гигиены и не обеспечивают эффективной защиты здоровья работающих и  населения в условиях интенсификации биотехнологической промышленности и постоянно расширяющейся номенклатуры штаммов. Не разработаны гигиеническая классификация промышленных микроорганизмов  и подходы к оценке их профессионального риска, требует существенного улучшения программа исследований по обоснованию гигиенических нормативов биотехнологических штаммов в  различных средах (воздух, вода).

Выше изложенное определило цель и задачи настоящего исследования.

Цель: научное обоснование и развитие методологии исследований токсичности, опасности, характера вредного действия промышленных микроорганизмов и установления безопасных уровней их содержания в объектах производственной и окружающей среды для обеспечения профилактических мероприятий по предупреждению их неблагоприятного воздействия.

       Для решения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

  1. исследовать зависимость  характера вредного действия промышленных микроорганизмов от их таксономического положения при длительном ингаляционном и энтеральном пути поступления путем регистрации общетоксического и специфических (иммунотропного и  дисбиотического)  эффектов
  2. разработать гигиеническую классификацию промышленных микроорганизмов на основе изучения характера и выраженности их неблагоприятного действия и гармонизировать ее с рекомендациями международных организаций (ЕФБ, FAO, OECD)
  3. усовершенствовать  программу исследований по обоснованию гигиенических нормативов в воздухе рабочей зоны и атмосферном воздухе и составить перечень приоритетных промышленных микроорганизмов на основе критериального комплекса показателей иммунотропного и сенсибилизирующего действия
  4. разработать научно обоснованные подходы к оценке профессионального микробиологического риска в условиях несоблюдения гигиенических нормативов на основе анализа и систематизации результатов клинико-гигиенических исследований и банка  данных по гигиеническому нормированию биотехнологических штаммов
  5. оценить критериальную значимость изменений состояния тучноклеточной популяции и неспецифической клеточной реакции респираторного тракта дыхательной системы при гигиеническом нормировании биологических и химических факторов производственной среды
  6. исследовать характер и выраженность вредного действия биотехнологических штаммов при поступлении в желудочно-кишечный тракт для определения необходимости их регламентирования в воде водных объектов хозяйственно-питьевого и культурно-бытового назначения
  7. разработать методы  санитарного контроля микробного загрязнения в условиях интенсификации и расширения ассортимента биотехнологического производства

  Научная новизна и теоретическая значимость исследования

Получены новые данные о характере биологического действия промышленных микроорганизмов для развития теории и практики гигиенического нормирования микробиологического фактора. Установлена линейная зависимость между показателями дегрануляции тучных клеток, балансом Т- и В-лимфоцитов и показателем эозинофилии, имеющая гигиеническую значимость для нормирования промышленных микроорганизмов. Показано, что изменение функционально-метаболической активности фагоцитов респираторного тракта является  интегральным показателем вредного ингаляционного воздействия микроорганизмов. Выявлены основные закономерности нарушений микроэкологии кишечника при воздействии биотехнологических штаммов в токсиколого-гигиенических исследованиях. Предложена модель тучноклеточной популяции для выявления характера вредного действия и установления минимально эффективных уровней воздействия микробиологического и химического производственных факторов.

Научно обоснована классификация промышленных микроорганизмов по степени опасности воздействия на организм с учетом рекомендации международных организаций (ЕФБ, FAO, OECD), адаптированная для целей  гигиенического нормирования.  На основе критериального комплекса показателей иммунотропного и сенсибилизирующего действия оптимизирована схема и тактика токсиколого-гигиенических исследований микробиологического производственного фактора, а также  составлен  перечень приоритетных промышленных микроорганизмов.

Разработана классификация степени опасности промышленных микроорганизмов для здоровья работающих в зависимости от кратности превышения ПДК, которая отражает связь между величиной действующей концентрации и выраженностью нарушений здоровья и направлена на эффективную защиту работающих от вредного воздействия микробиологического фактора.

Практическая значимость работы

По материалам диссертации разработаны и утверждены в законодательном порядке на Федеральном уровне

  1. 26 ПДК микроорганизмов-продуцентов в воздухе рабочей зоны (ГН 2.2.6.709-98, ГН 2.2.6.1006-00,  ГН 2.2.6.1066-01, ГН 2.2.6.1762-03,  ГН 2.2.6.2178-07).
  2. ПДК мерказолила в воздухе рабочей зоны (ГН 2.2.5.686-98).
  3. 22 ПДК микроорганизмов-продуцентов в атмосферном воздухе населенных мест (ГН 2.1.6.711-98, ГН 2.1.6.1003-00 , ГН 2.1.6.1041-01,  ГН 2.1.6.1763-03, ГН 2.1.6.2177-07).

Результаты исследований реализованы при разработке следующих документов Федерального значения:

1. Руководство Р2.2.2006 – 05 «Руководство по гигиенической оценке факторов рабочей среды и трудового процесса. Критерии и классификация условий труда»

2. Перечень «Предельно допустимые концентрации (ПДК) микроорганизмов-продуцентов, бакпрепаратов и их компонентов в воздухе рабочей зоны». ГН 2.2.6.709-98  (1999 г.)

3. Перечень «Предельно допустимые концентрации (ПДК) микроорганизмов-продуцентов, бакпрепаратов и их компонентов в воздухе рабочей зоны».

-  Дополнение 1. ГН 2.2.6.1006-00 к ГН 2.2.6.709-98 (2001г.) 

- Дополнение 2. ГН 2.2.6.1066-01 к ГН 2.2.6.709-98  (2002 г.) 

  - Дополнение 3. ГН 2.2.6.1762-03 к ГН 2.2.6.709-98  (2004г.)

4. Перечень «Предельно допустимые концентрации  (ПДК) микроорганизмов-продуцентов  бактериальных препаратов и их компонентов в воздухе рабочей зоны». ГН 2.2.6.2178-07 (2007 г.)

5. Перечень «Предельно допустимые концентрации (ПДК) микроорганизмов-продуцентов, бакпрепаратов и их компонентов в атмосферном воздухе населенных мест».  ГН 2.1.6.711-98 (1999 г) 

6. Перечень «Предельно допустимые концентрации (ПДК)  микроорганизмов-продуцентов, бакпрепаратов и их компонентов в атмосферном воздухе населенных мест».

- Дополнение 1. ГН 2.1.6.1003-00 к ГН 2.1.6.711-98 (2001г.)

- Дополнение 2. ГН 2.1.6.1041-01 к ГН 2.1.6.711-98 (2002 г.)

- Дополнение 3. ГН 2.1.6.1763-03 к ГН 2.1.6.711-98 (2004 г.)

7. Перечень «Предельно допустимые концентрации (ПДК) микроорганизмов-продуцентов, бакпрепаратов и их компонентов в атмосферном воздухе населенных мест».  ГН 2.1.6.2177-07 (2007 г)

8. 21 методическое указание «Метод микробиологического измерения концентрации клеток микроорганизма-продуцента в воздухе рабочей зоны».

9. 18 методических указаний «Метод микробиологического измерения концентрации клеток микроорганизма-продуцента в атмосферном воздухе населенных  мест».

Создан информационный банк данных по гигиеническому нормированию промышленных микроорганизмов на бумажном и электронном носителях. Материалы диссертации используются при чтении лекций на кафедре гигиены и основ экологии человека ГОУ ВПО РГМУ.

  Основные положения, выносимые на защиту

    1. Оценка профессионального микробиологического риска для здоровья работников в зависимости от степени превышения ПДК промышленных микроорганизмов в воздухе рабочей зоны является  научной основой комплекса профилактических мероприятий на биотехнологическом производстве  
    2. Морфо-функциональная оценка секреторной активности тучноклеточной популяции, а также неспецифической реакции фагоцитов респираторного тракта представляет собой адекватную модель для установления минимально эффективных уровней воздействия при гигиеническом нормировании промышленных микроорганизмов
    3. Гигиеническая классификация промышленных микроорганизмов по степени опасности и оптимизированная программа исследований по регламентированию биотехнологических штаммов основаны на регистрации гигиенически значимых показателей их вредного действия

Апробация работы Материалы диссертации доложены и обсуждены на международной конференции «Медико-экологические проблемы репродуктивного здоровья работающих (Москва, 1998), на IV Всесоюзной конференции «Эндокринная система организма и вредные факторы окружающей среды» (Ленинград, 1991), на международной конференции «Медицина труда в третьем тысячелетии» (Москва, 1998), на международном симпозиуме (Пермь, 1991), на Всероссийском съезде токсикологов (Москва, 2003), на 2-ом съезде токсикологов Украины (Киев, 2004), на научно-практической конференции НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды им. А.Н. Сысина "Теоретические основы и практические решения проблем санитарной охраны атмосферного воздуха" (Москва, 2003), на Объединенном иммунологическом форуме (Екатеринбург, 2004), на Всероссийском конгрессе «Профессия и здоровье» (Москва, 2005), на заседаниях секции «Гигиенические аспекты биотехнологии и микробного загрязнения окружающей среды» Проблемной комиссии «Научные основы гигиены окружающей среды».

Личный вклад автора состоит в разработке унифицированной классификации промышленных микроорганизмов по степени опасности, создании приоритетного перечня аллергеноопасных микроорганизмов-продуцентов, оптимизации программы исследований по гигиеническому нормированию биотехнологических штаммов, в усовершенствовании классификации условий труда работающих на основе оценки риска при несоблюдении гигиенических регламентов промышленных микроорганизмов.

Изучение характера биологического действия микроорганизмов-продуцентов проводилось  в рамках научно-исследовательских работ подкомиссии "Профессиональные риски и здоровье работающих при воздействии биологических факторов" Проблемной комиссии "Научные основы медицины труда" (2004-2006 гг.), комплексной программы НИР РГМУ «Фундаментальные и прикладные научные исследования в медицинском университете» (2003-2005 гг.).

Материалы, изложенные в диссертации, получены в результате исследований, в которых автор являлся исполнителем или ответственным исполнителем НИР:

       - Изучение местных (тканевых) и общих регуляторных реакций при воздействии промышленных веществ на репродуктивную функцию с целью разработки профилактических мероприятий (№ 01.83.0074992, 1986 г.

       -Исследование особенностей биологического действия промышленных штаммов-продуцентов с целью регламентации их допустимых содержаний в воздухе рабочей зоны (в рамках Проблемной комиссии "Научные основы медицины труда", 2004-2006 гг.)

       - Разработка ПДК плесневых грибов в воздухе рабочей зоны (по заказу министерства труда и социального развития, госконтракт № 05010-46/00, 2000 г.).

       -Токсиколого-гигиеническое исследование химических и биологических факторов современного биотехнологического производства с целью предотвращения их неблагоприятного влияния на здоровье человека и окружающую среду" (в рамках комплексной программы НИР РГМУ, 2003-2005 гг.).

Автор принимала непосредственное участие в планировании, подготовке и проведении экспериментальных исследований по оценке характера действия и опасности химических и биологических факторов, в осуществлении морфометрических гистологических и цитологических исследований, в разработке методов контроля микробиологического загрязнения новыми биотехнологическими штаммами производственных помещений и атмосферного воздуха.

Автором обобщены и проанализированы результаты исследований, определены цель и задачи исследования, обоснована их актуальность, научная и практическая значимость, осуществлена организация и координация исследований, сформулированы выводы, разработаны методические документы.

По теме диссертации опубликовано 39 работ, 28 из которых опубликованы в центральных рецензируемых журналах.

Структура и объем диссертации Диссертация состоит из введения, 13 глав, обсуждения полученных результатов, выводов, списка использованной литературы, включающей 345 источников отечественных и иностранных авторов. Работа изложена на 372 страницах машинописного текста, иллюстрирована 90 таблицами, 54 рисунками, 3 приложениями.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объекты, методы и объем исследований

Исследования по оценке характера вредного действия  биотехнологических штаммов проводились в аспекте работ по гигиеническому нормированию микроорганизмов, используемых в биотехнологии [О.Г. Алексеева, Г.А. Багдасарьян, П.Л.Зельцер и др.,1991].

Проведение отдельных фрагментов исследований осуществлялось совместно со старшим научным сотрудником лаборатории экологии и токсикологии Э.Г. Скрябиной и доцентом кафедры гигиены и основ экологии человека РГМУ В.В. Колесниковой, а также доцентом кафедры микробиологии ММА Е.В. Будановой.

В процессе работы было отобрано 29 новых биотехнологических штаммов различных таксонов, продуцирующих протеолитические и целлюлолитические ферменты, ферменты, используемые в химическом синтезе, антибиотики, кормовые препараты для животных и др., а также микроорганизмы, применяемые для очистки природных систем от нефти и нефтепродуктов, воздуха от продуктов табачной промышленности (табл.1). Изученные штаммы микроорганизмов получены путем селекции или селекции  в сочетании с приемами мутагенеза.

  Основные направления, характер и объем исследований представлены в таблице 2. Экспериментальная часть работы включала проведение токсикологических, микробиологических, иммунологических, цито- и гистологических исследований, а также математико-статистического анализа с помощью программ Statistica 6.0, Microsoft Excel.

Таблица 1

Таксономическое положение  изученных промышленных микроорганизмов

Бактерии

Актиномицеты

Микромицеты

1.Грамотрицательные

а. палочки, кокки

Alcaligenes denitrificans

Pseudomonas caryophylii

б. факультативно-анаэробные палочки

Escherichia coli

2.Грамположительные

палочки, не образующие споры

Lactobacillus casei

Lactobacillus plantarum

Micrococcus varians

3.Грамположительные

палочки, образующие споры

Bacillus subtilis

Bacillus licheniformis

Bacillus thuringiensis

1.Собственно актиномицеты

Streptomyces aureofaciens

Streptomyces avermitilis

Streptomyces fradiae

2.Нокардиоформные актиномицеты

Rhodococcus corallinus

Rhodococcus erythropolis

1.Пор. Saccharomycetales

Candida tropicalis

Kluyveromyces maxianus

2. Пор. Eurotiales

Aspergillus terreus

Aspergillus awamori

Penicillium funiculosum

Penicillium canescens

3. Пор. Hypocreales

Trichoderma longibrachiatum

Trichoderma reesei

Trichoderma viride

Tolypocladium cylindrosporum

В экспериментах были использованы нелинейные белые беспородные мыши массой 25-30г и белые крысы популяции Wistar массой 260-290г. Животных содержали на стандартном пищевом рационе в течение всего эксперимента. Статистическая группа состояла из 15-20 особей. Манипулирование в течение эксперимента производили в соответствии с требованиями этических норм работы с животными.

Исследования по оценке патогенности проводились в соответствии с требованиями методических рекомендаций «Критерии оценки патогенных свойств штаммов-продуцентов, предлагаемых для использования в промышленности микробиологического синтеза» [Ю.П. Пивоваров, В.В. Королик,1992]. Из показателей патогенности определяли средневирулентную и «пороговую» дозы, токсигенность и возможность диссеминации микроорганизма во внутренние органы и кровь.

 

  Таблица 2

Направления и объем исследований

Направление исследований

Характер исследований

Материалы и объем исследований

Аналитическое

Анализ существующих методических подходов к оценке неблагоприятного действия промышленных микроорганизмов

Информация о характере вредного действия более 100 промышленных микроорганизмов, нормативные материалы

Гигиеническое

-обоснование ПДК в воздухе рабочей  зоны

-обоснование ПДК в атмосферном воздухе населенных мест

-разработка методов контроля  штаммов-продуцентов в воздухе производственных помещений и атмосферном воздухе

27

22

39

Токсикологическое

установление минимально эффективных уровней воздействия при ингаляционном и энтеральном введении

51 концентрация при ингаляционном  и 15 доз при энтеральном введении,

1265 лабораторных животных (крысы, мыши),

10445 определений интегральных показателей

Цито- и гистологическое

-подсчет лейкоцитарной формулы,

-подсчет Т- и В-лимфоцитов в сыворотке крови,

-тест дегрануляции тучных клеток in vitro, 

-оценка функциональной активности тучноклеточной популяции,

-подсчет клеточных элементов лаважной жидкости дыхательных путей

990 препаратов

1980 препаратов

990 препаратов

264 препарата

288 препаратов

Микробиологическое

-выявление возможной патогенности новых штаммов

-определение концентраций отдельных представителей аутохтонной микрофлоры кишечника

-определение  диссеминации биотехнологических штаммов в кровь и внутренние органы

-определение антибиотикочувствительности

600 белых мышей, 2112 посевов на питательные среды

17820 посевов

792 посева

210 определений

Статистическое

Прикладные пакеты программ Stastistica 6.0, Microsoft Excel

Весь массив экспериментальных данных

       Чувствительность бактерий к антибиотикам исследовали методом диффузии в агар, используя  диски с антибиотиками, относящимися к различным классам химических соединений (30 основных наименований). 

Оценка характера вредного действия промышленных микроорганизмов проводилась при ингаляционном и энтеральном воздействии в течение 1 месяца. Ингаляционное воздействие моделировали путем интраназального введения суспензии штаммов и вычислением расчетно-поглощенной концентрации [О.Г. Алексеева, Г.А. Багдасарьян, П.Л.Зельцер и др.,1991].

Для регистрации проявлений интоксикации использовали интегральные показатели функционального состояния организма: показатели нервной системы, легких, печени и почек, морфологический состав периферической крови, прирост массы тела на протяжении всего эксперимента, а также коэффициенты массы внутренних органов (сердце, печень, почки, легкие) в конце эксперимента.

Функциональное состояние нервной системы оценивали по суммационно-пороговому показателю (СПП) и по поведенческим тестам - методы «открытого поля» и «темной камеры с отверстиями» (ТКСО). При исследовании морфологического состава крови определяли содержание гемоглобина, эритроцитов и лейкоцитов  [В.Е.Предтеченский, 1964]. Функцию печени оценивали по изменению активности аминотрансфераз (АлАТ, АсАТ). [А.А.Покровский, 1969]. Исследование функции почек проводили путем измерения суточного диуреза после водной нагрузки и содержанию белка в суточной моче животных  [Н.И. Шумская и др., 1970].

Оценку состояния неспецифической клеточной защиты респираторного тракта проводили по методу Л.К. Романовой (1994, 2001). У экспериментальных животных под тиопенталовым наркозом получали назальный и бронхо-легочный лаваж путем промывания физиологическим раствором в объеме 10 мл нижних и верхних отделов дыхательного тракта.

На цитологических препаратах, окрашенных по Романовскому-Гимзе, проводили количественную оценку клеточных элементов (нейтрофилы, лимфоциты, макрофаги) и метаболической активности фагоцитов (НСТ-тест) респираторного тракта экспериментальных животных [Ю.И. Бажора и др., 1981, Т.К. Бумагина, 1981].

Оценка иммунотропной активности микроорганизмов включала определение коэффициентов массы иммунокомпетентных органов (тимус, селезенка), содержания общего числа лимфоцитов, популяций  Т- и В-лимфоцитов и подсчет лейкоцитарной формулы периферической крови. Иммуномодулирующее действие оценивали в реакции гемагглютинации к эритроцитам барана, которыми были иммунизированы животные по окончании эксперимента. Для определения титра специфических антител в сыворотке крови подопытных животных проводили реакцию специфической агглютинации.

При оценке сенсибилизирующего действия использовали тесты для выявления гиперчувствительности замедленного типа (внутрикожный тест по А.П. Черноусову) и гиперчувствительности немедленного типа (реакция прямой дегрануляции перитонеальных тучных клеток in vitro) [В.Н. Федосеева, Л.В.Ковальчук, 1993]. 

С целью повышения надежности обоснования порогов вредного действия и количественной оценки напряженности регуляторных механизмов на клеточном уровне разработали  модель тучноклеточной популяции, которая позволила оценить секреторную активность тучных клеток при воздействии промышленных микроорганизмов и химических соединений (пиракрил, мерказолил) на минимально эффективных уровнях. 

  Для определения характера и значимости изменений микроэкологического равновесия кишечника животных при гигиеническом нормировании биотехнологических штаммов изучали качественное и количественное представительство  аутохтонной микрофлоры кишечника (концентрация и частота высеваемости лактозоположительных и лактозонегативных E.coli, стафилококков, энтерококков и энтеробактерий, клостридий, дрожжеподобных грибов рода Candida, лактобацилл и бифидобактерий) [И.Я. Квятковская, 1984 1989, Е.В. Буданова, 1994].

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ  

1. Оценка клеточных факторов неспецифической защиты респираторного тракта при ингаляционном введении штаммов.

Исследованиями ряда авторов показано, что интегральные показатели состояния организма, традиционно используемые при оценке действия вредных веществ, не являются информативными при изучении характера действия промышленных микроорганизмов [И.М. Трахтенберг и др., 1987, И.Я. Квятковская, 1989,  Н.П. Сергеюк, 2004]. Результаты наших исследований также свидетельствуют о том, что воздействие биотехнологических штаммов в концентрациях 104, 105, 106,  10 7 и 108 кл/м3 не влияет на функциональное состояние нервной системы, почек и печени.

При ингаляционном пути поступления вредных факторов окружающей среды, в том числе микроорганизмов, защитную функцию  организма на клеточном уровне выполняет система фагоцитов дыхательной системы (Г.Б. Федосеев и др. 1980, 1995, А.В. Санин, В.М. Манько, 1993). При ингаляции промышленных  микроорганизмов в минимально эффективных концентрациях показано усиление миграции и повышение активности лизосомальных гидролаз альвеолярных макрофагов (Н.П. Сергеюк, 2004). В связи с этим представлялось целесообразным исследовать возможность использования других показателей клеточной реактивности (нейтрофилы, лимфоциты) респираторного тракта при гигиеническом нормировании микробиологического фактора.

Установлено, что при воздействии изученных промышленных микроорганизмов (Bacillus, Rhodococcus, Aspergillus, Penicillium) развивалась клеточная реакция дыхательных путей, характерная для воспалительного процесса. Она формировалась за счет повышенной миграции нейтрофилов в назальном отделе, макрофагов, нейтрофилов и лимфоцитов – в бронхо-легочном отделе дыхательного тракта. При усилении действующего фактора наблюдалась, как правило, более выраженная ответная клеточная реакция  (табл.3).

  Таблица 3

Клеточная реакция лаважной жидкости из бронхо-легочного отдела респираторного тракта при ингаляционном воздействии

промышленных микроорганизмов

Штамм

Концентрация,  кл/м3

Нейтрофилы

х106 кл/мл

Лимфоциты

х106 кл/мл

Макрофаги

х106 кл/мл

Общая

концентрация

х106 кл/мл

Контроль

R.corallinus

3х106

R.erythropolis

5х107

5х108(Limcitotox)

0.31±0.06

0.31±0.05

0.96±0.27

1.23±0.19**

0.37±0.06

0.19±0.04

0.42±0.14

0.61±0.08**

0.14±0.02

0.18±0.03

0.35±0.08

0.58±0.16*

0.82±0.13

0.66±0.08

1.72±0.46

2.42±0.40**

Контроль

B.subtilis72

5х105(Limsens)

5х106

0.48±0.07

1.13±0.21**

0.92±0.03*

0.29±0.05

0.74±0.21**

0.57±0.09**

0.19±0.04

0.50±0.12**

0.57±0.09***

0.96±0.15

2.38±0.47**

2.06±0.43**

Контроль

A.awamori

2х104(Limsens)

2х105

P.funiculosum

2х105

0.48±0.07

0.61±0.09

0.99±0.24*

0.94±0.28

0.29±0.05

0.34±0.03

0.44±0.10

0.66±0.02*

0.19±0.04

0.35±0.02**

0.54±0.10**

0.30±0.05*

0.96±0.15

1.29±0.06

1.97±0.39**

1.90±0.04**

  Обозначения: * Р<0.05,  ** Р<0.01,  *** Р<0.001

Количественная оценка НСТ-теста показала, что ингаляция биотехнологических штаммов приводила к дозозависимому повышению микробоцидной активности, т.е.  характерному для микроорганизмов «метаболическому взрыву» в фагоцитах (макрофаги, нейтрофилы). При этом повышение их метаболической активности происходило путем увеличения свободных форм кислорода (свободные радикалы, супероксидного аниона и кислорода О2).

Иная реактивность клеточных элементов выявлена на воздействие грамотрицательных бактерий (Pseudomonas, Alcaligenes). При воздействии этих бактерий в концентрации 104 и 105 кл/м3 наблюдалось уменьшение общего числа клеточных элементов в лаважной жидкости респираторного тракта за счет снижения преимущественно нейтрофилов и макрофагов. Полученные данные объясняются высокими адгезивными свойствами  клеточной оболочки, а также способностью грамотрицательных бактерий нарушать кислородную метаболическую активность фагоцитов [А.Л. Лобашевский 1986, Sorensen, 1987, Bishop, 1987].

Проведенные исследования показали, что  функционально- метаболическая активность фагоцитирующих клеток респираторного тракта значимо менялась в зависимости от концентрации промышленных микроорганизмов, минимальные изменения фагоцитов были отмечены на пороговых уровнях воздействия по сенсибилизирующему эффекту.

Оценивая значимость изученных показателей (миграционная активность клеток, НСТ-тест), нужно признать целесообразность использования их в качестве интегральных при  установлении порогов вредного действия штаммов при ингаляционном воздействии.        

2. Оценка иммунотропных свойств промышленных  микроорганизмов

Показано, что воздействие нокардиоформных актиномицетов в концентрации 106 и 107 кл/м3 не оказывало иммунотропного действия (табл.4).  Воздействие штаммов рода Rhodococcus в концентрации 108 кл/м3 приводило лишь к увеличению полиморфноядерных лейкоцитов, что может свидетельствовать о развитии неспецифических воспалительных процессов в ответ на фактор высокой интенсивности.

Воздействие грамположительных бактерий в концентрациях 104 и 105 кл/м3 на организм различно. Одни бактерии (Lactobacillus, Micrococcus, B.subtilis 72, B.subtilis 103) не обладали иммунотропными свойствами. Общее содержание лимфоцитов, концентрация Т- и В-лимфоцитов, а также показатели соотношения Т/В и эозинофилии находились на уровне контрольных значений (для Т/В – 2.0-2.5; для Эо/Эк – 1.0-1.5). Эти штаммы  не проявляли  аллергенной активности. Ингаляция других грамположительных бактерий (B.subtilis 65, B.licheniformis 60,103) и актиномицетов (S.fradiae, S.aureofaciens) в концентрации 105 кл/м3 приводила к слабо выраженным изменениям иммунной системы.

Таблица 4

Характеристика иммунотропной и сенсибилизирующей активности промышленных микроорганизмов при ингаляционном воздействии

Концентрация,

кл/м3

Т-

лимфоциты

%

В-лимфоциты %

ГНТ

%

ГЗТ

мм

Контроль

R.erythropolis  5х107

44.2±1.5

39.6±2.3

17.8±1.5

20.2±1.4

4.7±1.2

5.7±1.0

0.142±0.007

0.151±0.010

B.subtilis 103

Контроль

6х104

6х105

 

46.5±0.9

44.2±1.4

42.8±1.7

16.8±1.0

17.2±1.2

17.6±1.5

 

  3.6±0.6

  4.6±1.7

  9.1±2.8

0.13±0.013

0.20±0.007

0.29±0.022

B.licheniformis 60

Контроль

5х104

5х105

44.0±1.1

45.5±1.5

39.1±1.0*

21.8±0.9

20.4±1.0

25.4±1.7

4.6±0.4

4.4±0.5

9.0±0.9**

0.12±0.03

0.22±0.03

0.38±0.02**

P. сaryophylii

Контроль

7х103

7х104

43.9±2.0

40.5±2.1

33.2±1.9**

18.4±2.3

18.9±2.1

22.5±1.7*

4.0±0.9

6.1±1.6

12.6±2.4**

0.139±0.021

0.233±0.064

0.403±0.034*

P. canescens

Контроль

2х103

2х104

41.6±0.8

39.8±0.4

36.3±1.2*

  21.1±0.8

  22.2±1.8

  27.0±1.4*

  3.5±0.6

  4.2±0.5 12.5±2.7**

0.19±0.03

0.24±0.04

0.36±0.04*

A. awamori

Контроль

1.2х104 

1.2х105

43.5±2.3

32.2±1.7** 29.6±3.5**

  21.0±1.1

  24.6±0.9

  30.4±1.4**

  4.4±0.4  11.0±1.1** 24.4±2.7**

0.188±0.018

0.138±0.028

0.306±0.044*

C.tropicalis      Контроль

3х103

3х104

42.2±2.6

38.7±1.7

35.5±1.7

19.5±1.6

25.5±1.7*

31.3±2.1**

  4.7±0.4

11.2±1.8**

20.0±3.3**

 

0.201±0.045

0.436±0.061*

0.490±0.051*

  Обозначения: * Р<0.05,  ** Р<0.01

Иммунотропное действие грамотрицательных бактерий (Pseudomonas, Alcaligenes) и микромицетов (Penicillium, Aspergillus, Candida)  выявлялось на достаточно низких уровнях воздействия – 103-104 кл/м3. Влияние на организм характеризовалось изменением баланса иммунокомпетентных клеток и увеличением эозинофилов крови. Отмечено  снижение Т-лимфоцитов и увеличение В-лимфоцитов, а также показано существенное изменение баланса Т- и В-лимфоцитов периферической крови. Показатель соотношения Т/В при ингаляции P.caryophylii  снижен до 1.5 (в контроле 2.4), а показатель эозинофилии, напротив, увеличен до 1.9 (в контроле 1.0). Величина показателя Т/В при воздействии A.awamori в концентрации 105 кл/м3 снижена до 0.97 (в контроле 2.1).

При воздействии грибов на более высоком уровне в лейкограмме подопытных животных отмечались изменения многих показателей: снижение общего числа лимфоцитов, увеличение моноцитов и нейтрофилов в периферической крови, характеризующих выраженное цитотоксическое действие. При воздействии дрожжеподобного гриба Candida в концентрации 3х104 кл/м3 отмечено снижение коэффициентов массы иммунокомпетентных органов (тимус и селезенка).

Воздействие грамнегативных бактерий и микроскопических грибов вызывало у животных формирование гиперчувствительности немедленного и замедленного типа  на уровне 103-104 кл/м3.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что длительная ингаляция большинства изученных штаммов приводит к изменению баланса иммунокомпетентных клеток, эозинофилии в крови и сенсибилизации экспериментальных животных. При этом происходит формирование гиперчувствительности немедленного типа, опосредованной антителами-реагинами, а также гиперчувствительности замедленного типа, опосредованной Т-лимфоцитами. Увеличение количества эозинофилов в периферической крови служит признаком аллергеноопасности штаммов, хотя не исключено непосредственное участие эозинофилов в сенсибилизации организма, опосредованное через Fc – рецепторы этих клеток к Ig E (А.Н. Маянский, Д.Н. Маянский, 1989, 2003, А.А. Тотолян, И.С. Фрейдлин, 1999).

При этом иммунотропная, в том числе и сенсибилизирующая активность биотехнологических штаммов проявляется в зависимости от их таксономической принадлежности, а величина регистрируемого эффекта –  от уровня действия микробиологического фактора.

а

б

Рис.1  Связь между показателем дегрануляции тучных клеток и соотношением Т/В-лимфоцитов (а), показателем дегрануляции тучных клеток и показателем эозинофилии (б) при ингаляционном воздействии биотехнологических штаммов на минимально эффективных уровнях в зависимости от их таксономической характеристики.

Регрессионный анализ наиболее информативных и гигиенически значимых показателей иммунотропной активности 26 биотехнологических штаммов, принадлежащих к различным таксономическим группам,  позволил выявить связь между показателем дегрануляции тучных клеток и соотношением Т/В-лимфоцитов, а также между показателями дегрануляции тучных клеток и эозинофилии (рис.1а,б).

Установленная зависимость, отражающая патогенетические механизмы развития сенсибилизации (ГНТ), имеет прогностическую значимость в плане регламентирования и оценки риска воздействия новых штаммов промышленных микроорганизмов.

3. Совершенствование программы исследований по гигиеническому нормированию биотехнологических штаммов

На основе анализа результатов исследований и данных информационного банка усовершенствована программа исследований по гигиеническому нормированию промышленных микроорганизмов.

Кластерный анализ, широко используемый в микробиологии (В.А.Рожков,1989, Jongman e.a.,1996),  позволил сгруппировать и объединить изученные штаммы различных таксонов в зависимости от  выделенных гигиенически значимых показателей: показателя дегрануляции тучных клеток, баланса Т- и В-лимфоцитов и показателя эозинофилии. Пространственное положение штаммов определялось евклидовым расстоянием, рассчитанным  на основе экспериментальных данных.

Наиболее четкие группировки были получены по показателю дегрануляции тучных клеток. На рис.2 выявляются 3 группы микроорганизмов. Наиболее удаленная группа (3) представлена микроорганизмами, у которых не выражены сенсибилизирующие свойства. Центральная группа (1) представлена микроорганизмами с выраженными сенсибилизирующими свойствами. К ней примыкает группа (2) биотехнологических штаммов, у которой аллергенные свойства выражены в слабой степени.

Результаты кластерного анализа данных позволил разработать шкалу аллергенной активности промышленных микроорганизмов, которая может быть использована для тестирования новых штаммов в скрининговых исследованиях "аллерген –  не аллерген". В таблице 5 приведены оценочные критерии сенсибилизирующей активности штаммов.

Рис.2 Дендрограмма для промышленных микроорганизмов, построенная по показателю дегрануляции перитонеальных тучных клеток при ингаляции на уровне Limch (по оси x – сходство, отн.ед., по оси y – сокращенное название штамма)

Таблица 5

Шкала аллергенной активности

промышленных микроорганизмов, выявляемой в реакции

дегрануляции тучных клеток in vitro (ГНТ)

Критерии

1 группа

2 группа

3 группа

достоверность различий (α) количества деграну-лированных ТК (%) в опытной и контрольной группах

α0.01

0.01<α0.05

α> 0.05

величина показателя дегрануляции (ДТК)

2.0<ДТК

1.5ДТК2.0

ДТК<1.5

частота развития сенсибилизации (Р), %

50<Р100

20<  Р50

0Р20

Анализ созданного информационного банка данных по обоснованию ПДК 131 биотехнологического штамма  и микробиологического препарата показал, что лимитирующим критерием вредного действия подавляющей части микроорганизмов (около 80 %) являлись сенсибилизирующие свойства. С учетом таксономической характеристики биотехнологических штаммов среди бактерий аллергенными свойствами обладали 75%, среди актиномицетов – 67%, среди грибов – 80 %  (рис.3).

Рис.3 Структура массива промышленных микроорганизмов в зависимости от таксономического положения и лимитирующего показателя вредного действия. А – микроорганизмы, нормированные по аллергенному эффекту

Совокупность полученных данных позволила усовершенствовать научную программу исследований по гигиеническому нормированию микроорганизмов, используемых в биотехнологической промышленности, и обосновать приоритетный список микроорганизмов, наиболее опасных для развития аллергических заболеваний. 

Для микроорганизмов родов Lactobacillus, Micrococcus, Rhodococcus и др., не проявляющих сенсибилизирующих и иммунотропных свойств, после исследования патогенных свойств возможно установление групповых (родовых) нормативов.

  Промышленные микроорганизмы (Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Streptomyces, Trichoderma), обладающие  слабыми аллергенными свойствами,  могут быть исследованы по укороченной программе (патогенные, иммунотропные, в том числе сенсибилизирующие  свойства).

Для биотехнологических штаммов, принадлежащих к родам  Pseudomonas, Alcaligenes, Penicillium, Aspergillus, Candida и обладающих выраженными сенсибилизирующими свойствами, необходимо проведение исследований  по полной программе, включая изучение всех наблюдаемых эффектов (патогенность, функционально-метаболическая активность фагоцитов респираторного тракта, иммунотропный, сенсибилизирующий и дисбиотический эффекты). Микроорганизмы этих родов составляют приоритетный перечень биотехнологических штаммов в плане контроля и оценки риска их воздействия на здоровье работников.

В ходе проведения исследований были усовершенствованы подходы к определению уровней микробного загрязнения в воздухе производственных помещений и атмосферном воздухе, что позволяет осуществлять эффективный контроль за соблюдением гигиенических регламентов в  условиях расширения биотехнологического производства.

Установлено, что бактериальные формы, используемые в промышленных целях, различаются своим отношением к широкому спектру антибиотиков (30 наименований), принадлежащих к различным группам в зависимости от химической структуры: -лактамы (пенициллины, аминопенициллины, карбоксипенициллины и цефалоспорины), аминогликозиды, тетрациклины, макролиды, линкозамины, гликопептиды, рифамицины, сульфаниламиды, полимиксины, нитрофураны.

Так, грамположительные бактерии являются чувствительными к антибиотикам. Их устойчивость составляет 0-33%. Исключением, пожалуй, является B. thuringiensis, резистентность которого составляет 48% от испытанных антибиотиков. Устойчивость Rhodococcus к антибиотикам также невысока и составляет 24-30%. Наиболее резистентными штаммами являются грамотрицательные бактерии, их устойчивость к антибиотикам составляет 54-91% (рис. 4).

Рис.4 Диаграмма антибиотикорезистентности биотехнологических штаммов: 1 – B.subtilis 103, 2 – В. subtilis 65, 3 – В. subtilis 72, 4 – B.licheniformis 1001, 5 – B. thuringiensis var.israelensis, 6 – R. erythropolis КД, 7 – R. corallinus, 8 –  A.denitrificans С-32, 9 – P.caryophylii КМ 92-102/1

Полученные экспериментальные данные были использованы для усовершенствования методов индикации и идентификации  новых биотехнологических штаммов, что позволяет ускорить разработку и повысить эффективность методов контроля микробного загрязнения производственных помещений и атмосферного воздуха.

4. Разработка и апробация модели тучноклеточной популяции в токсиколого-гигиенических исследованиях

Принимая во внимание полифункциональный характер действия тучных клеток, оценка их секреторной активности является перспективным направлением при гигиеническом нормировании факторов окружающей среды [Л.И. Бережнова, Л.П. Петрова, 1982, Л.А. Дуева, А.В. Карамышева, 2001]. С одной стороны, тучные клетки являются клетками-мишенями для специфических IgE при реализации аллергического процесса и широко используются в этом плане. С другой стороны, дегрануляция тучных клеток может осуществляться неиммунологическим путем при действии химических веществ – либераторов гистамина [Д.П. Линднер, Э.М. Коган, 1976,  Э.В. Гюллинг, Л.А. Дюговская, 1979, В.А. Проценко и др., 1987, С.В. Хлгатян, 2000].

Нами разработана и апробирована модель тучноклеточной популяции при гигиеническом нормировании биологических и химических факторов. Морфо-функциональная оценка секреторной активности тучноклеточной популяции включает построение цитограммы по фазам секреторного цикла, определение индексов дегрануляции и  насыщения тучных клеток, а также составление цитограммы пула дегранулированных клеток.

а

б

Рис.5 Фазы секреторного цикла тучноклеточной популяции при ингаляции промышленных микроорганизмов. По оси x: а – A.denitrificans  (к – контроль, а – 4х104 , А – 4х105 кл/м3), б – плесневые грибы  (к – контроль, р – P.funiculosum 104 кл/м3, а – A.awamori 2х104 кл/м3, A – A.awamori 2х105 кл/м3). 1,2, 3, 4 – фазы секреции тучных клеток. По оси y - % тучных клеток

Показано, что ингаляция микроорганизмов, обладающих сенсибилизирующими свойствами, вызывала значимые изменения секреторной активности тучноклеточной популяции в сторону увеличения числа дегранулированных форм (рис.5 а,б). Одновременно с этим изменялась и структура пула дегранулированных клеток, среди которых преобладали опустошенные, лишенные гранул клетки (рис.6 А,Б). При этом наблюдаемые изменения секреторной активности тучноклеточной популяции подчинялись зависимости концентрация – эффект, что позволило точно дифференцировать уровни  воздействия вредного фактора, в том числе и минимальные, отражающие адаптивные реакции организма на клеточном уровне.

А

Б

Рис.6 Цитограмма пула дегранулированных тучных клеток при ингаляции промышленных микроорганизмов. По оси x: А – (к – контроль, а – A.denitrificans  4 х104 , А – A.denitrificans  4х105 кл/м3), Б – (к – контроль, в – B.licheniformis 5х104, В – B.licheniformis 5х105, р – P.funiculosum 104, а – A.awamori 2х104 кл/м3;1 – слабо, 2 – умеренно и 3 – сильно дегранулированные формы тучных клеток. По оси y - %

Разработанная модель тучноклеточной популяции была апробирована при гигиеническом нормировании химических веществ, обладающих различным механизмом действия: мерказолил (сенсибилизация), пиракрил (гонадотропное действие).

Так, при введении пиракрила в дозе 5.0 мг/кг состояние тучноклеточной популяции характеризовалось усилением инфильтрации клеток в органы (матки и яичников) репродуктивной системы  и снижением депонирующих форм тучных клеток. При этом наибольшие структурно- функциональные изменения популяции наблюдались в восстановительном периоде, которые выражались в резком снижении депонирующих форм и увеличением дегранулирующих клеток, что обусловлено высокой кумулятивной активностью препарата (рис.7).

  подострый период восстановительный период

Рис.8  Фазы секреторного цикла тучноклеточной популяции матки при введении пиракрила в дозе 5.0 мг/кг в течение 1 месяца (подострый период) и через 1 месяц после окончания введения (восстановительный период). 1, 3 – контроль, 2, 4 – опыт.

Вместе с тем изменения секреторной активности тучноклеточной популяции органов репродуктивной системы при воздействии пиракрила  коррелировали с изменениями гормонального статуса (снижение эстрогенов), удлинением эстрального цикла и нарушением морфологической структуры репродуктивных органов (отек, расширение сосудов, лимфо- и гемостаз).

Авторы полагают, что нарушение  женской репродуктивной функции при действии пиракрила осуществляется за счет местных гистамин-эстрогеновых отношений и последующего влияния на гипоталямо-гипофизарные механизмы регуляции репродукции [Е.Ф.Оскерко, 1987, М.А. Фесенко, 1987, И.Д. Ионов,1988, А.Г. Гунин, 1990]. 

Таким образом, морфофункциональная оценка тучноклеточной популяции представляет собой адекватную модель как для установления минимально эффективных уровней воздействия биологических и химических факторов окружающей среды, так для определения характера их вредного действия на организм, а наиболее информативными показателями ее являются индекс дегрануляции и насыщения, а также структура пула дегранулированных тучных клеток.

5. Оценка микроэкологии кишечника животных при гигиеническом нормировании микроорганизмов, используемых в биотехнологии

При проведении токсиколого-гигиенических исследований оценка  микроэкологического баланса кишечника включала количественную и качественную характеристику реакции аутохтонной микрофлоры в ответ на воздействие штаммов в минимально эффективных концентрациях/дозах.

Показано, что ингаляция грамположительных бактерий и нокардиоформных актиномицетов в концентрациях 105, 106, 107 и 108 кл/м3 вызывали слабую ответную реакцию со стороны условно-патогенной микрофлоры, которая выражалась в изменении частоты высеваемости отдельных ее представителей (E.coli,энтерококки, Proteus).

Воздействие грамотрицательных бактерий приводило к более существенным сдвигам микробного баланса в кишечнике. Менялась не только частота высеваемости представителей микрофлоры (лактозоположительные E.coli, стафилококки, клостридии, энтерококки), но и  концентрация отдельных представителей условно-патогенной микрофлоры (стафилококки, энтеробактерии) (рис.8 б).

Наибольшие изменения были отмечены при воздействии плесневых грибов на уровне 104 и 105 кл/м3. Они затрагивали не только наиболее реактивную часть микробиоценоза, но и касались ее облигатной части – бифидобактерий и лактобацилл (рис.8 а). Воздействие плесневых грибов вызывало также изменение широкого спектра условно-патогенной микрофлоры, о чем свидетельствовала оценка частоты их высеваемости (рис.9).

       

а

б

Рис.8 Количественная характеристика нарушений микроэкологического баланса кишечника при ингаляции A.awamori, A.terreus, P.funiculosum (а)  и энтеральном введении P.caryophylii, A.denitrificans (б)

Рис. 9  Частота высеваемости (%) микрофлоры кишечника при ингаляции плесневых грибов. За 0 принято значение показателя у контрольных животных. Обозначение: E.coli (1) – лактозоположительные, E.coli (2) – слабоферментирующие кишечные палочки

Обобщая полученные результаты, следует отметить, что реакция микрофлоры кишечника зависит от таксономической принадлежности штамма, пути поступления и концентрации/дозы микроорганизмов.

Проведенные исследования и анализ банка данных по гигиеническому нормированию промышленных микроорганизмов позволили сформулировать основные этапы формирования дисбаланса микроэкологии кишечника – изменение частоты высеваемости представителей микрофлоры – изменение концентрации E.coli и представителей условно-патогенной микрофлоры – снижение содержания бифидобактерий и лактобацилл.

Сопоставление критериально значимых, лимитирующих  эффектов (иммунотропного, сенсибилизирующего, дисбиотического) микроорганизмов  позволило придти к выводу, что признаки дисбиотических отклонений выявляются, как правило, на изоэффективных уровнях или при воздействии больших концентраций/доз по сравнению с регистрацией  сенсибилизирующего и иммунотропного эффектов. Это свидетельствует о том, что нарушения микроэкологического баланса кишечника опосредованы  изменениями иммунной системы организма [Н.М. Грачева, 1999, И.Я. Квятковская, 1988, 1989, Н.П. Сергеюк, 2004], что подтверждает целесообразность оценки микроэкологии кишечника при гигиеническом нормировании только приоритетных промышленных микроорганизмов.

6. О гигиеническом нормировании биотехнологических штаммов в воде водных объектов хозяйственно-питьевого и культурно-бытового назначения

В настоящее время в России содержание  промышленных микроорганизмов в воде водоемов не лимитируется, хотя уже давно существует практика гигиенического нормирования химических веществ (Г.Н. Красовский, З.И.Жолдакова и др.1999).

Опубликованы многочисленные данные о влиянии промышленных микроорганизмов на санитарное состояние водоемов. Так, установлено вредное влияние B.thuringiensis в концентрации 108 кл/л, P.aurantiaca и P.carnea в концентрациях 106 и 107 кл/л  на микробиоценоз и процессы самоочищения водоемов [Ю.П.Пивоваров, В.В. Королик, 1999, Т.Г.Омельянец, 1981]. Показано значимое влияние микробных препаратов, представляющих консорциум из Bacillus, Pseudomonas, на санитарно-микробиологические показатели воды в концентрации 107 кл/л и на органолептические свойства воды в концентрации 109 кл/л [З.И. Жолдакова, 2000].

Нами проведено изучение влияния промышленных микроорганизмов (R.corallinus, B.licheniformis 60, P.caryophylii, A.denitrificans, A.awamori, P.canescens) на организм при длительном энтеральном поступлении.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что при длительном введении в желудок промышленные микроорганизмы в концентрациях 105, 106 и 107 кл/л оказывали иммунотропное, сенсибилизирующее и дисбиотическое действие. Влияние штаммов выражалось в дисбалансе иммунокомпетентных клеток, формировании гиперчувствительности немедленного и замедленного типа, а также изменении качественной и количественной характеристики аутохтонной микрофлоры кишечника (табл.6, рис.8б). Для большинства изученных штаммов установлены минимально действующие (105 кл/л) и недействующие (104 кл/л) уровни  при введении в желудок.

  При энтеральном введении штаммов в минимально эффективных дозах выявлена линейная связь между показателем дегрануляции тучных клеток и балансом иммунокомпетентных клеток, а также между показателями дегрануляции тучных клеток и эозинофилии в зависимости от таксономической характеристики микроорганизмов. Установленные зависимости аналогичны таковым при ингаляционном воздействии биотехнологических штаммов.

  Необходимо отметить, что характер действия промышленных микроорганизмов при энтеральном введении определяется таксономической характеристикой штамма, а выраженность неблагоприятных эффектов (иммунотропного, сенсибилизирующего и дисбиотического) зависит от дозы. Особое внимание нужно обратить на оценку микроэкологического баланса кишечника, т.к. при поступлении в желудочно-кишечный тракт биотехнологические штаммы могут оказывать непосредственное влияние на микрофлору кишечника. 

Таблица 6

Характеристика иммунотропного и сенсибилизирующего действия биотехнологических штаммов при энтеральном введении

концентрация,

кл/л

Т-

лимфоциты

%

В-

лимфоциты

%

ГНТ

%

ГЗТ

мм

B. licheniformis 60

Контроль

2х105 

2х107

43.2±1.4

35.0±1.1*

33.9±1.6**

  21.6±0.7

  19.0±1.0

  30.5±1.7**

  4.2±0.5

8.2±0.9*  13.4±1.5**

  0.11±0.024

0.26±0.028*

  0.21±0.035

R.corallinus

Контроль

2х107

46.3±2.4

45.5±1.5

19.8±2.9

20.4±1.0

4.7±1.0

5.8±1.1

0.12±0.02

0.21±0.04

P.caryophylii

Контроль

  4х105

  4х107

  46.3±2.4

38.4±2.1*

  32.4±3.1**

19.8±2.9

24.2±4.8

28.0±4.4

5.3±1.4

15.2±6.6*  15.8±3.3**

0.13±0.02

0.25±0.03*

0.25±0.03*

A.denitrificans

Контроль

104

105 

  106

  42.7±1.3

  40.6±1.3

37.1±1.7*

  33.1±2.3**

19.2±0.9

  19.6±0.9

  20.4±0.8

25.6±1.2**

6.9±0.9

8.0±1.0

11.6±1.3**

  19.3±2.0***

0.12±0.03

0.24±0.03

0.31±0.04*

нет данных

A.awamori

Контроль

4х105 

4х107

43.2±1.4

37.0±1.1*

  33.2±1.7**

  21.6±0.7

25.0±1.0*

30.0±1.8**

4.5±0.6

15.1±2.3*** 34.6±6.6***

  0.11±0.024

  0.14±0.018

0.23±0.036*

P.canescens

Контроль

6x104

  6x105

41.6±0.8

39.2±1.2

29.6±1.2**

21.3±1.8

  22.8±1.5

24.9±1.6

3.5±0.6

5.5±0.7

7.6±0.9*

0.15±0.03

0.14±0.06

0.24±0.07

  Обозначения: * Р<0.05,  ** Р<0.01,  *** Р<0.001

Совокупность собственных и литературных данных позволили предложить программу исследований по гигиеническому нормированию промышленных микроорганизмов и микробиологических препаратов на их основе в воде водоемов, включающей оценку органолептических свойств воды, изучение общесанитарного режима водоема и проведение токсикологического эксперимента.

7. Научное обоснование гигиенической классификации промышленных микроорганизмов и гармонизация ее с международными рекомендациями

Основные положения и выводы о характере вредного действия промышленных микроорганизмов позволили разработать и научно обосновать их гигиеническую классификацию по степени опасности их воздействия на организм (табл. 7).

  Таблица 7

Гигиеническая классификация промышленных микроорганизмов

по степени опасности

показатели

1 класс

2 класс

3 класс

4 класс

Показатели патогенности

- пороговая доза, кл/жив.

107

> 107

-минимальная доза высевания, кл/жив.

107

> 107

-диссеминация в кровь и органы, дни

Диссеминация

1-30 дней

Персистирование

1-15 дней

ПДКр.з., кл/м3

Не рекомендуются

к использованию в биотехнологической промышленности

5х103

>5х103

ПДКа.в., кл/м3

5х102

>5х102

Limch sens, кл/м3

5х104

>5х104

Limch imm, кл/м3

5х104

>5х104

Limch dis, кл/м3

5х105

>5х105

Обозначения:

1 класс –  особо опасные инфекции

2 класс –  опасные микроорганизмы, возбудители других инфекционных заболеваний

3 класс –  умеренно опасные микроорганизмы

4 класс –  мало опасные микроорганизмы

Согласно предложенной классификации промышленные микроорганизмы, которые могут иметь контакт с человеком, разделены на 4 класса. Количественные признаки патогенности (пороговая и минимальная доза высеваемости, сроки пребывания в теплокровном организме) при однократном введении высоких доз микроорганизмов положены в основу деления микроорганизмов на 2 группы. На основании  учета этих признаков 1 класс (особо опасные инфекции) и 2 класс (опасные микроорганизмы) являются патогенными и не могут быть рекомендованы к использованию в биотехнологической промышленности.

  Таблица 8

Показатели патогенности биотехнологических штаммов микроорганизмов при однократном внутрибрюшинном введении

Промышленные микроорганизмы

DV50,

кл/жив

«порого-

вая»

доза,

кл/жив

диссеминация

Сроки высева сут.

Min доза, кл/жив

Орган-мишень

Микромицеты

Aspergillus, Penicillium, Tolypocladium, Candida

>109-12

109-10

2

109-11

Кровь, почки, селезенка

Грамположительные бактерии Bacillus, нокардиоформные актиномицеты Rhodococcus

>1010-12

109-11

2

109-11

Кровь, почки, селезенка, печень

Грамотрицательные бактерии Alcaligenes, Pseudomonas, E.coli

1010-12

108-9

2,5

108-10

Кровь,

почки, селезенка

Проведенные исследования показали, что изученные штаммы не проявляли вирулентных, токсичных и токсигенных свойств в отношении теплокровных животных (табл.8). Поэтому они  относятся к 3 (умеренно опасные) и 4 (мало опасные) классу опасности и могут быть рекомендованы для использования в промышленных целях. Только штамм E.coli DLT 1270  обладал патогенными свойствами (2 класс опасности) и не был рекомендован для использования в биотехнологии.

Длительный производственный контакт с непатогенными  микроорганизмами приводит к аллергизации работающего контингента, поэтому использование промышленных микроорганизмов требует обоснования  безопасных уровней воздействия и оценки риска их  воздействия на организм  в условиях биотехнологического производства.

В связи с этим  в основу деления биотехнологических штаммов на 3-ий и 4-ый классы положены  величина ПДК в воздухе рабочей зоны и атмосферном воздухе, порог хронического действия по сенсибилизирующему эффекту (Limch sens), порог хронического действия по иммунотропному эффекту (Limchimm) и порог хронического действия  по дисбиотическому эффекту (Limch dis).

По таксономической структуре к 3-му классу опасности (умеренно опасные микроорганизмы) относятся грамотрицательные бактерии (Pseudomonas, Alcaligenes, Arthrobacter, Azotobacter и др.), актиномицеты (Actinomyces, Streptomyces), микромицеты (Aspergillus, Penicillium, Trichoderma, Tolypocladium) и дрожжеподобные грибы рода Candida.

На их долю приходится 70% всех используемых в промышленности микроорганизмов, что свидетельствует об актуальности и необходимости  проведения исследований по оценке опасности  микроорганизмов, регламентированию и оценке их риска для здоровья работающих.

Среди штаммов, относящихся к 3 классу опасности, можно выделить  микроорганизмы родов Candida, Aspergillus и Pseudomonas (11%), которые обладают выраженным неблагоприятным действием на организм и имеют ПДКр.з. на уровне 102 кл/м3. Принимая во внимание клинико-гигиенические данные о неблагоприятном действии этих штаммов, биотехнологические производства отказываются от  использования микроорганизмов с высоким аллергенным потенциалом и перепрофилируются в сторону менее аллергеноопасных штаммов.

Меньшая часть штаммов (30%) относится к 4 классу опасности (малоопасные). Основу этой группы составляют B.subtilis, B.licheniformis, а также представители родов Rhodococcus, Lactobacillus, Micrococcus. При этом неблагоприятное действие микроорганизмов этих родов на экспериментальных животных проявляется на значительно более высоких, чем 105 кл/м3  уровнях воздействия.

При научном обосновании гигиенической классификации микроорганизмов, используемых в  промышленности, были использованы рекомендации международных организаций (ЕФБ, FAO, OECD) для унификации и координации деятельности, направленной на обеспечение безопасности условий труда и рационального трудового процесса на биотехнологических предприятиях.

8. Разработка подходов к оценке профессионального риска воздействия промышленных микроорганизмов на здоровье работающих

 Новым направлением в методологии оценки риска является интенсивно развиваемая в последние годы рядом международных организаций, в частности FAO, концепция микробиологического риска.

Микробиологический риск рассматривают как профессиональный, если существует вероятность развития нарушения здоровья под действием микроорганизмов в процессе трудовой деятельности.

Анализ клинико-гигиенических исследований за последние 30 лет и банка данных по гигиеническому нормированию промышленных микроорганизмов выявил зависимость наблюдаемых изменений от уровня действующего фактора, а на производстве также от стажа работы.

Клинико-гигиеническое обследование основных микробиологических производств: белково-витаминного концентрата и гидролизных дрожжей (продуцент Candida), ферментных препаратов (продуценты Aspergillus, Bacillus), препарата дендробациллин (продуцент B.thuringiensis) позволило выделить зоны выраженности нарушений здоровья работающих в зависимости от концентрации микробного аэрозоля в воздухе различных цехов микробиологического производства (табл.9).

Таблица 9

Характеристика категорий риска профессионально обусловленных нарушений здоровья работников биотехнологических предприятий 

категория риска

класс условий труда

характер и степень выраженности клинических проявлений

малый

2 (допустимый)

к ПДК

клинические проявления не выявлены

низкий

3.1 (вредный)

1ПДК < к 10 ПДК

ранние признаки бронхо-легочной патологии – сухой кашель, ощущение першения в носу и горле, сухость слизистой носа, а также зуд кожи и отечность, миконосительство у лиц, имеющих контакт с микромицетами.

повышенная заболеваемость с временной утратой трудоспособности, в том числе органов дыхания.

средний

3.2 (вредный)

10 ПДК < к 100 ПДК

увеличение неспецифических заболеваний органов дыхания (трахеит, хронический бронхит, пневмония) в 2.5 раза, при обследовании увеличение положительных серологических реакций и аллергологических тестов, снижение Т-лимфоцитов и увеличение В-лимфоцитов,  миконосительство у работающих, контактирующих с микромицетами.

выше среднего

3.3 (вредный)

к > 100 ПДК

аллергический ринит, астматический бронхит, бронхиальная астма, дерматиты, рецедивирующая крапивница, микозы стоп,  ладоней и ногтей.

 

Так, при воздействии микроорганизмов-продуцентов в концентрациях 1ПДК< k 10ПДК у работников микробиологических производств выявляются ранние признаки бронхо-легочной патологии – сухой кашель, ощущение першения в носу и горле, сухость слизистой носа, зуд и отечность кожи, а также миконосительство у лиц, имеющих контакт с микромицетами. Наблюдаемые изменения носят нестойкий характер и соответствуют минимальному риску.

При воздействии промышленных штаммов в концентрациях на уровне 10ПДК < k 100ПДК  отмечается увеличение неспецифических заболеваний органов дыхания (трахеит, хронический бронхит, пневмония) в 2.5 раза по сравнению с контрольной группой работников, не контактирующих с микроорганизмами. При клиническом обследовании показано увеличение положительных серологических реакций и аллергологических тестов (базофильный тест, РТМЛ). Кроме этого выявлено снижение Т-лимфоцитов и увеличение В-лимфоцитов крови, а также миконосительство у работающих, контактирующих с микромицетами. Наблюдаемые стойкие и выраженные функциональные изменения, могущие приводить к профессионально обусловленной заболеваемости, характеризуют средний уровень профессионального риска.

При воздействии высоких концентраций микробного аэрозоля (k > 100 ПДК) у 36-50% работников наблюдаются специфические заболевания органов дыхания (аллергический ринит, астматический бронхит, бронхиальная астма) и  кожи (дерматиты, рецедивирующая крапивница, микозы стоп и ладоней).  Профессионально обусловленные заболевания легкой и средней степеней тяжести соответствуют уровню выше среднего профессионального риска.

Анализ выраженности медико-биологических изменений в организме работающих и у животных в эксперименте в зависимости от превышения ПДК промышленных микроорганизмов в условиях несоблюдения гигиенических регламентов  позволил выделить зоны риска, соответствующие разным классам условий труда гигиенической классификации, установить четкие  границы подклассов 3 класса условий труда работающих при воздействии микробиологического фактора (табл. 10), что нашло отражение в руководстве Р 2.2.2006-05.

Таблица 10

Классы условий труда в зависимости от содержания в воздухе рабочей зоны микробиологического фактора (превышение ПДК, раз)

микробиологический фактор

Класс условий труда

допусти-мый

вредный

опасный

2

3.1

3.2

3.3

4

ПДК

1.1-10.0

10.1-100

> 100

Патогенные микроорганизмы

Особо опасные инфекции

+

Возбудители других инфекционных заболеваний

+

+

Предложенная классификация условий труда в зависимости  от содержания микроорганизмов в воздухе рабочей зоны позволяет объективно судить о риске их воздействия для здоровья работающих в условиях превышения гигиенических стандартов.  

  Таким образом, в проведенном исследовании на основе оценки характера неблагопрятного действия 29 промышленных микроорганизмов усовершенствована система гигиенического нормирования и оценки риска производственного микробиологического фактора, создан перечень приоритетных промышленных микроорганизмов  и разработан комплекс профилактических мероприятий, направленных на создание безопасных условий труда и рационального трудового процесса работников биотехнологической промышленности.

ВЫВОДЫ

  1. На основании исследования токсичности и опасности 29  биотехнологических штаммов установлено, что основными проявлениями вредного действия промышленных микроорганизмов при ингаляционном и энтеральном поступлении являются иммунотропный, в том числе сенсибилизирующий, и дисбиотический эффекты, выраженность которых зависит от таксономического положения микроорганизмов (бактерии, актиномицеты, микроскопические грибы).
  2. Схема и порядок проведения экспериментальных исследований по установлению гигиенических нормативов промышленных микроорганизмов в воздухе рабочей зоны и атмосферном воздухе определяется их таксономическим положением. Для представителей родов микроорганизмов Lactobacillus, Micrococcus, Rhodococcus и др., не проявляющих вредных свойств,  рекомендуется групповое (родовое) нормирование. Для представителей родов Bacillus, Streptomyces, Trichoderma, обладающих слабо выраженными сенсибилизирующими свойствами, возможно сокращение программы исследований за счет оценки только иммунотропной и сенсибилизирующей активности. Наиболее аллергеноопасными являются грамотрицательные бактерии и микромицеты родов Pseudomonas, Alcaligenes, Aspergillus, Penicillium, Candida,  исследования которых необходимо проводить по полной программе, включающей оценку всех неблагоприятных эффектов. Биотехнологические штаммы этих родов составляют перечень приоритетных промышленных микроорганизмов в плане контроля и оценки риска их воздействия на здоровье работников биотехнологических производств.
  3. Разработана гигиеническая классификация промышленных микроорганизмов, унифицированная с рекомендациями международных организаций (ЕФБ, OECD) и включающая комплекс гигиенически  значимых показателей, характеризующих патогенные свойства микроорганизмов,  пороговые концентрации при  хроническом ингаляционном воздействии по иммунотропному, сенсибилизирующему и дисбиотическому эффектам, а также ПДКр.з. и ПДКа.в..
  4. На основе обобщения результатов собственных исследований и данных литературы обоснованы границы классов условий труда работающих при воздействии микробиологического фактора в зависимости от степени превышения ПДК (руководство Р 2.2.2006-05).
  5. Морфо-функциональная оценка  тучноклеточной популяции является адекватной моделью для установления минимально эффективных уровней воздействия биологического и химического факторов и выявления характера их вредного действия при различных путях поступления в организм. Информативными показателями тучноклеточной популяции являются индекс дегрануляции и насыщения, характеристика пула дегранулированных тучных клеток. Для оценки сенсибилизирующей активности биотехнологических штаммов разработана шкала, включающая показатели степени дегрануляции тучных клеток и частоту развития сенсибилизации. Функционально-метаболическая активность фагоцитов респираторного тракта служит критерием интегрального действия биотехнологических штаммов при ингаляционном воздействии.
  6. При поступлении в организм через желудочно-кишечный тракт промышленные микроорганизмы оказывают зависимое от дозы неблагоприятное действие. При этом изменения иммунной системы и микрофлоры кишечника являются лимитирующими и выявляются на низких уровнях (106 и 105 кл/л). Полученные результаты наряду с имеющимися данными о влиянии промышленных микроорганизмов на санитарное состояние водоемов свидетельствуют о необходимости их гигиенического нормирования в воде водных объектов хозяйственно-питьевого и культурно-бытового назначения.
  7. На основе изучения резистентности штаммов промышленных микроорганизмов к широкому спектру антибиотиков усовершенствована разработка методов контроля микробной загрязненности объектов производственной и окружающей среды, которые внедрены в практику санитарно-эпидемиологической службы

 

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Яглов В.В., Шеина Н.И.,  Фесенко  М.А. Тканевые базофилы как информативная  модель изучения эффектов химических соединений при гигиеническом нормировании. Методология  фундаментальных исследований в гигиене окружающей среды. Сб. института им. А.И. Сысина – М., 1989. – С.118-123         

2.  Яглов В.В., Шеина Н.И.Фесенко М.А. Морфофункциональные показатели влияния пиракрила на органы женской половой системы крыс. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 1990. – № 5. – С. 508-510

3. Яглов В.В., Фесенко  М.А. Шеина Н.И. Значение морфофункциональной оценки реакции тканевых базофилов для прогнозирования вредного действия химических веществ. // Гигиена труда и  профзаболевания. – 1991. – №5. –  С.23-25

4. Фесенко М.А., Шеина Н.И. Использование современных морфометрических методов для прогнозирования нарушений репродуктивной системы.  Сб. «Проблемы  токсикологии и прикладной экологии».  Тезисы докл.  межд. симпозиума Москва-Пермь, 16-26июля. – 1991. – Л., ВНИИГ. –  1991. – С. 257-258

5. Яглов В.В.,  Фесенко  М.А., Шеина Н.И. Морфофункциональная характеристика  популяции тучных клеток щитовидной  железы и органов репродуктивной системы крыс при воздействии мерказолила. Тезисы докл. 4Всес. конференции "Эндокринная система организма и вредные факторы окружающей среды",  Л.,15-19 сент. – 1991. – С. 238

6. Yaglov V.V., Sheina N.I., Fesenko M.A. Morphological and functional effects of  pyracryl  on female reproductive organs. //  Bull. exp. biology and medicine. –  1991. – V.109. –  Р. 676-678

7. Фесенко М.А., Шеина Н.И. Изучение действия мерказолила в экспериментальных условиях.  Тезисы Международной  конференции «Медицина труда в 3-ем тысячелетии». –  1998. – С. 81

8. Иванов Н.Г., Далин М.В., Немыря В.И., Н.И. Шеина Предельно допустимые концентрации микроорганизмов-продуцентов, бакпрепаратов и их компонентов в воздухе рабочей зоны. // Токсикологический вестник. –  1998. – №5. – С.34-39

9.  Иванов Н.Г., Шеина Н.И., Скрябина Э.Г. и др. Разработка ПДК плесневых грибов в воздухе рабочей зоны. – ВНТИЦ, рег. N 01200012628. –  Отчет НИР,  2000. – 69 с.

10. Шеина Н.И., Скрябина Э.Г., Колесникова В.В. и др. Бюллетень Российского регистра потенциально опасных химических и биологических в-в. Streptomyces fradiae БС-1, штамм-продуцент тилозина. //Токсикологический вестник. –  2002. –  N1. –  С.41-43 

11. Шеина Н.И., Скрябина Э.Г., Буданова Е.В.  и др.Новые сведения о токсичности и опасности  химических и биологических веществ. Aspergillus awamori  ВНИИгенетика 120/177, штамм-продуцент глюкоамилазы. // Токсикологический вестник. –  2003. – № 3. – С. 46-47 

12. Шеина Н.И., Скрябина Э.Г., Буданова Е.В.  и др. Новые сведения о токсичности и опасности  химических и биологических веществ. Aspergillus terreus 44-62, штамм-продуцент  ловастатина. // Токсикологический вестник. –  2003. – № 3. – С. 48-49

13. Шеина Н.И., Скрябина Э.Г., Иванов Н.Г. и др. Новые сведения о токсичности и опасноти  химических и биологических веществ. Penicillium funiculosum F-149, штамм-продуцент  декстраназы, маркер загрязнения воздушной среды плесневыми грибами. // Токсикологический вестник. –  2003. – № 4. –  С. 44-45

14. Шеина Н. И., Скрябина Э.Г., Буданова Е.В.  и др. Новые сведения о токсичности и опасности  химических и биологических веществ.  Trichoderma viride 44-11-62/3, штамм-продуцент  комплекса целлюлолитических ферментов. //  Токсикологический вестник. –  2003. – № 4. – С. 45-47 

15. Шеина Н. И., Скрябина Э.Г., Буданова Е.В.  и др.  Новые сведения о токсичности и опасности  химических и биологических веществ. Candida tropicalis Y-456, штамм-продуцент  ксилита.  //  Токсикологический вестник. – 2003. – № 4. – С. 47-49 

16. Шеина Н. И., Скрябина Э.Г., Буданова Е.В.  и др. О гигиеническом нормировании плесневых грибов в атмосферном воздухе и в воздухе производственных помещений. Сб. «Теорет. основы и практические решения  проблем санитарной охраны атмосферного воздуха», М. – 2003. – С.  83-85

17. Шеина Н.И., Скрябина Э.Г., Колесникова В.В. и др. Биомаркеры токсического эффекта при  оценке риска воздействия промышленных штаммов-продуцентов на организм. //  2-ой съезд токсикологов России.  Тезисы докл., М. – 2003. – С. 290-291

18. Шеина Н.И., Скрябина Э.Г., Буданова Е.В. Новые сведения о токсичности и опасности  химических и биологических веществ. B.licheniformis ВНИИгенетика 1001, продуцент бацитрацина. // Токсикологический вестник. –  2003. – № 5. – С. 48-50

19. Шеина Н.И.,  Скрябина Э.Г., Буданова Е.В. и др. Новые сведения о токсичности и опасноти  химических и биологических веществ.  B.subtilis 103, штамм-продуцент нейтральной протеазы. // Токсикологический вестник. – 2004. – № 1. – С. 38-39 

20. Шеина Н.И.,  Скрябина Э.Г., Буданова Е.В. и др. Новые сведения о токсичности и опасности  химических и биологических веществ.  B.subtilis 65, штамм-продуцент нейтральной  протеиназы и амилазы. // Токсикологический вестник. – 2004. – № 1. – С. 39-41 

21. Шеина Н.И., Скрябина Э.Г., Буданова Е.В.  и др. Новые сведения о токсичности и опасности  химических и биологических веществ.  B.subtilis 72, штамм-продуцент щелочной протеазы. // Токсикологический вестник. – 2004. – № 1. – С. 41-42

22. Скрябина Э.Г., Шеина Н.И. Экспериментальная оценка иммунотропной активности промышленных микроорганизмов. // Russian J. of Immunology. – 2004. – V.9. – suppl. Объединенный иммунологический форум. –  P.123

23. Шеина Н.И., Буданова Е.В. Токсиколого-гигиенические аспекты изучения микрофлоры кишечника при воздействии микроорганизмов-продуцентов. Abstract of the 2 Congress of Ukrainian Toxicologysts. 12-14 october. Тезисы докл. 2-ого съезда  токсикологов Украины. 2004. – P.104 -105

24. Шеина Н.И., Иванов Н.Г., Скрябина Э.Г. Новые сведения о токсичности и опасности химических и биологических веществ. Rhodococcus erithropolis КД. // Токсикологический вестник. – 2004. – №5. – С.44-46 

25. Шеина Н.И., Буданова Е.В., Скрябина Э.Г., и др. Новые сведения о токсичности и опасности химических и биологических веществ. Rhodococcus corallinus.// Токсикологический вестник. –  2005. –  №2. – С.36-37

26. Шеина Н.И., Буданова Е.В., Скрябина Э.Г. Новые сведения о токсичности и опасности химических и биологических веществ. Pseudomonas caryophylii  KM 92-102/1.  // Токсикологический вестник. –  2005. – №2. – С.37-39 

27. Шеина Н.И., Скрябина Э.Г., Иванов Н.Г. Сравнительная характеристика иммунотропной активности промышленных  микроорганизмов при гигиеническом нормировании. // Токсикологический вестник. – 2005. – .№3. – С. 12-15

28. Шеина Н.И., Е.В. Буданова  Оценка микроэкологического дисбаланса кишечника животных при воздействии  промышленных микроорганизмов в токсиколого-гигиенических исследованиях. //  Токсикологический вестник. –  2005. –  №5. – С.23-27

29. Шеина Н.И Гигиенические аспекты изучения характера биологического действия промышленных  микроорганизмов.  Материалы IY Всероссийского конгресса «Профессия и здоровье». М., 25-27 октября 2005. – С.164-165

30. Шеина Н.И., Скрябина Э.Г., Колесникова В.В. и др. Новые сведения о токсичности и опасности химических и биологических веществ. Bacillus licheniformis 60, штамм-продуцент комплекса термостабильных амилолитических и протеолитических ферментов. //  Токсикологический  вестник. – 2006. – №6. – С.30-31 

31. Шеина Н.И., Буданова Е.В., Скрябина Э.Г. и др. Новые сведения о токсичности и опасности химических и биологических веществ. Penicillium funiculosum ВКМ F 3668 D, штамм-продуцент комплекса карбогидраз. // Токсикологический  вестник. – 2006. – №6. – С.31-33

32. Шеина Н.И., Буданова Е.В., Скрябина Э.Г. и др. Новые сведения о токсичности и опасности химических и биологических веществ. Aspergillus awamori Nakazawa  ВУД Т-2 1000-У, штамм-продуцент глюкоамилазы. // Токсикологический вестник. – 2006. – №6. – С. 33-34

33. Шеина Н.И. Количественная цитологическая характеристика функциональной  активности тучноклеточной популяции при длительном воздействии  промышленных микроорганизмов. // Токсикологический вестник. – 2006. – №6. – С. 15-19

34. Руководство по гигиенической оценке факторов рабочей среды и трудового  процесса. Критерии и классификация  условий труда.  Р 2.2.2006-05. М., Федеральный центр  гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора. – 2005. –  142 с. 

35. Шеина Н.И. Скрябина Э.Г. Буданова Е.В. и др. Новые сведения о токсичности и опасности химических и биологических веществ. Микроорганизм  B.licheniformis 103. // Токсикологический вестник. – 2007. –№2. – С.45-46

36. Шеина Н.И. Токсиколого-гигиеническая оценка  биотехнологических штаммов микроорганизмов. // Вестник Российского  государственного медицинского университета. –  2007. – №3 (56). – С.66-71 

37. Шеина Н.И. Скрябина Э.Г. Буданова Е.В. и др. Новые сведения о токсичности и опасности химических и биологических веществ. Микроорганизм  Penicillium canescens PlPh33, штамм-продуцент пектинлиазы и фитазы. // Токсикологический  вестник. –  2007. – №3. –  С.37-39

38. Шеина Н.И., Фесенко М.А. Методические подходы к использованию тучноклеточной популяции при гигиеническом нормировании вредных факторов окружающей среды. //  Токсикологический  вестник. – 2007. – №5. – С. 2-6 

39. Шеина Н.И. Критерии дисбаланса микроэкологии  кишечника в системе гигиенического нормирования и оценки риска воздействия  промышленных микроорганизмов. // Медицина труда и  промышленная экология. – 2007. – № 11. – С.21-26






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.