WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

 

На правах рукописи

Паклина Оксана Владимировна

Морфогенез хронического панкреатита и

протоковой аденокарциномы поджелудочной железы

14.00.15 патологическая анатомия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

доктора медицинских наук

Москва-2009

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию Российской Федерации» и клинической больнице №119 Федерального медико-биологического агентства России 

Научные консультанты:

доктор медицинских наук, профессор  Елена Леонидовна Туманова

доктор медицинских наук, профессор  Виктор Викторович Цвиркун

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор  Андрей Петрович Милованов

доктор медицинских наук, профессор Галина Павловна Титова

доктор медицинских наук, профессор Юрий Петрович Грибунов

Ведущее учреждение: Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Московский государственный медико-стоматологический университет Росздрава»

Защита диссертации состоится  « »______2009г. в _____часов

на заседании диссертационного совета (Д 001.004.01)

Научно-исследовательского института морфологии человека РАМН по адресу: 117418 Москва, ул. Цюрюпы, д.3

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ морфологии человека РАМН

Автореферат разослан «_______»_______________2009г. 

Ученый секретарь

диссертационного совета,

доктор медицинских наук Лилия Петровна Михайлова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Хронический панкреатит (ХП) по масштабам распространенности и роста заболеваемости, потерям трудоспособности и инвалидизации является важной социально-экономической проблемой. В структуре заболеваний органов желудочно-кишечного тракта доля ХП составляет от 5 до 9 % (Маев И.В. и соавт., 2005).

В развитых странах ХП заметно «помолодел» - средний возраст с момента установления диагноза снизился с 50 до 39 лет, среди заболевших на 30% увеличилась доля женщин (Калинин А.В., 1999), первичная инвалидизация больных достигает 15% (Jaakkola M., Nortback J.,1993). В России заболеваемость ХП за последние 10 лет выросла в 4 раза (Римарчук Г.В. и соавт., 2003) и у взрослых составляет 27,4 – 50,0 случаев на 100 тыс. населения (Минушкин О.Н., 2001; Маев И.В., 2006). По данным Департамента здравоохранения Москвы, заболеваемость ХП с 1998 по 2005 гг. выросла в 1,5 раза. Показатели заболеваемости также постоянно растут за счет улучшения методов диагностики, позволяющих выявлять ХП на более ранних стадиях.

Летальность после первичного установления диагноза ХП достигает 20% в течение первых 10 лет и более 50% через 20 лет, причем 20% больных погибают от осложнений ХП (Ивашкин В.Т., 1996; Кокуева О.В., 1999).

В морфогенезе ХП важнейшая роль принадлежит фиброзу поджелудочной железы. Точные механизмы, инициирующие и поддерживающие развитие фиброза в поджелудочной железе, недостаточно изучены. Некоторые исследователи склонны рассматривать их в аналогии со ступенчатым процессом, наблюдаемым при фиброзе печени (Bedossa P., Paradis V., 2003; Туманова Е.Л., 2008). Основные процессы, приводящие к фиброзу поджелудочной железы, сходны вне зависимости от этиологии ХП, но типы фиброза отличаются друг от друга (Suda K., Takase M., 2000; Klоppel G., 2004). В настоящее время остаются неясными механизмы, которые могут привести к формированию определенных типов фиброза железы при ХП.

Внимание исследователей к проблеме ХП объясняется также тем, что он является предрасполагающим состоянием для развития рака ПЖ. Двадцатилетний анамнез ХП повышает риск развития рака ПЖ в 5 раз (Lohr J.M.М. 1998, Buchler M.W., Maltertheiner P., 1999). Статистический анализ данного заболевания, проведенный в США, выявил, что одновременно с ростом заболеваемости ХП отмечено увеличение смертности от рака ПЖ в 3 раза (Jemal A., Thomas A., 2002).

Фоновыми процессами для развития протоковой аденокарциномы (ПАК) ПЖ считаются гиперпластические повреждения в системе протоков, описанные как панкреатическая внутриэпителиальная неоплазия (PanIN) (Hruban R.H., Iacobuzio-Donahue C., 2001). К сожалению, многочисленные молекулярные исследования моделей возникновения и развития рака ПЖ на сегодняшний день не дали достоверной информации об обстоятельствах и времени, при которых PanIN может перейти в инвазивный рак, а также о том, являются ли только эти повреждения предраковыми изменениями (Kimura W. et al.,1998; Moskovitz A.H. et al., 2001; Iacobuzio-Donahue C. et al., 2003). Актуальной является проблема изучения фенотипа ПАК и ее гистологических вариантов. В отечественной литературе данному вопросу посвящено незначительное число работ, хотя существуют убедительные данные о различиях в фенотипе внутри группы ПАК, влияющих на прогноз заболевания.

Терапевтическое лечение тяжелых форм ХП, если и дает эффект, то в виде кратковременной ремиссии. Очевидно, что это обусловлено необратимостью морфологических изменений в ПЖ. В связи с этим хирургическое лечение ХП в последние десятилетия развивалось очень быстро. Однако продолжаются дискуссии по поводу различных вариантов операций при ХП. Многие хирурги не используют в клинической практике появившиеся в последние годы органосберегающие, но достаточно радикальные технологии резекций ПЖ (Буриев И.М. и соавт., 2000; Данилов М.В., Федоров В.Д., 1995, 2003; Гальперин Э.И., 2004). В отличие от зарубежного опыта хирургам-панкреатологам приходится иметь дело с далеко зашедшими процессами, когда выполнение такого рода вмешательств технически сложно или невозможно, отсюда неудовлетворительные результаты лечения. Поэтому работы, в которых приводятся объективные данные, позволяющие обосновать верную тактику лечения больных ХП и ПАК ПЖ, являются чрезвычайно актуальными как с научной, так и практической точки зрения.

Цель исследования изучить морфогенез хронического панкреатита и его влияние на развитие протоковой аденокарциномы поджелудочной железы для обоснования выбора тактики лечения.

Задачи.

  1. Разработать методику и описать объем морфологического исследования операционного материала больных хроническим панкреатитом и протоковой аденокарциномой поджелудочной железы.
  2. Провести сравнительный анализ морфологических и молекулярно-биологических изменений поджелудочной железы в норме при хроническом панкреатите и протоковой аденокарциноме поджелудочной железы.
  3. Исследовать виды и степень выраженности стромально-эпителиальных межклеточных взаимодействий в развитии фиброза паренхимы поджелудочной железы, и определить их значение.
  4. Охарактеризовать типы коллагена стромы  поджелудочной железы и описать их распределение в норме и при хроническом панкреатите.
  5. Выявить характерные гистологические изменения при хроническом панкреатите, указывающие на вероятность неопластической трансформации.
  6. Сравнить диагностическую значимость карбогидратного (СА19-9) и раковоэмбрионального (РЭА) онкомаркеров, определяемых в крови больных и ткани протоковой аденокарциномы поджелудочной железы.
  7. Изучить иммуногистохимические особенности гистологических вариантов протоковой аденокарциномы поджелудочной железы.
  8. Определить значение генов муцинов (MUC) для выявления трансформации хронического панкреатита в протоковую аденокарциному поджелудочной железы.

Научная новизна

Данные, представленные в настоящей работе, представлены впервые, и они подтверждают целесообразность выделения фиброза поджелудочной железы при хроническом панкреатите как самостоятельного заболевания, имеющего стадийное развитие, в  патогенезе которого ключевую роль играют фибропластические процессы.

Прогрессирование фиброза при хроническом панкреатите обусловлено снижением экспрессии матриксных протеаз и сопровождается основными изменениями типов коллагена внеклеточного матрикса и их соотношения.

Установлена взаимосвязь повреждений паренхимы поджелудочной железы при хроническом панкреатите с развитием протоковой аденокарциномы вследствие изменений пролиферации, апоптоза и экспрессии генов MUC в гиперплазированном и метаплазированном протоковом эпителии.

Выявлено отсутствие корреляции между значениями плазматических уровней СА19-9 и РЭА с уровнем экспрессии данных онкомаркеров в клетках протоковой аденокарциномы поджелудочной железы.

Выделены гистологические варианты протоковой аденокарциномы поджелудочной железы на основании изучения группы генов MUC и показана прямая зависимость между повышением экспрессии клетками протоковой аденокарциномы поджелудочной железы желатиназы-9, MUC4 и стадией опухоли.

Впервые предложен последовательный протокол патолого-анатомического исследования операционного материала при хирургических вмешательствах, в том числе лапароскопических, по поводу хронического панкреатита и протоковой аденокарциномы  поджелудочной железы.

Научно-практическая значимость

В результате клинико-морфологического и иммуногистохимического исследования установлено, что ключевую роль в развитии хронического панкреатита играют фибропластические процессы. Поэтому как терапевтическое, так и  хирургическое лечение тяжелых форм хронического панкреатита должно быть направлено против фиброза железы как ведущего морфологического проявления хронического панкреатита.

Активная тактика лечения хронического панкреатита  является реальной профилактикой развития протоковой аденокарциномы поджелудочной железы, развивающейся на его фоне.

Одновременное определение СА19-9 и РЭА в сыворотке крови при опухолях поджелудочной железы обладает высокой диагностической ценностью, особенно при протоковых формах рака поджелудочной железы, но это не специфично для недифференцированных форм опухолей, что является основанием для поиска новых онкомаркеров рака поджелудочной железы. 

  Выделение гистологических подтипов ПАК ПЖ и определение экспрессии трансмембранных муцинов в клетках опухоли  делает возможным использование данных онкомаркеров в диагностике, а также в качестве фактора прогноза заболевания.

Разработанные протоколы получения и детального морфологического исследования операционного материала могут быть использованы в практической деятельности патологоанатомов и хирургов.

Основные положения, выносимые на защиту

Фиброз при хроническом панкреатите является ведущим морфологическим проявлением заболевания, имеет стадийный и перманентный характер вследствие активации фибробластов, трансформации контрактильных миофибробластов в секреторные миофибробласты, нарушений стромально-эпителиальных клеточных взаимодействий.

Наличие панкреатической внутриэпителиальной неоплазии и метаплазии протокового или ацинарного эпителия по типу «тубулярных комплексов» являются факторами, способствующими неопластической трансформацией в протоковую аденокарциному поджелудочной железы.

Для определения лечебной тактики и прогноза протоковой аденокарциномы поджелудочной железы следует выделять её гистологические подтипы с различной экспрессией генов MUC и биологическим потенциалом прогрессии.

По морфологическим данным тяжелые формы хронического панкреатита характеризуются необратимым фиброзом и высокой вероятностью развития на их фоне рака, что является основанием для выбора более радикальных видов хирургического лечения.

Внедрение

Полученные в работе данные по морфологической диагностике хронического панкреатита  и выделенных вариантов протоковой аденокарциномы поджелудочной железы используются в практической работе ФГУЗ КБ №119 Федерального медико-биологического агентства России, ГКБ им. С.П.Боткина г. Москвы и кафедры патологической анатомии Московского факультета РГМУ.

Результаты исследования изложены в методических рекомендациях по заболеваниям поджелудочной железы для патологоанатомов, онкологов, студентов медицинских высших учебных заведений и используется в курсе лекций для студентов Московского факультета ГОУ ВПО «Российского государственного медицинского университета Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию Российской Федерации».

Апробация работы

Основные материалы диссертации были представлены на заседании Московского научного общества патологоанатомов (Москва, 2003); Московского хирургического общества (Москва, 2004, 2008); учёном совете КБ№119 ФМБА (Москва, 2007); XIV и  XV Международных конгрессах хирургов-гепатологов стран СНГ (Санкт-Петербург, 2007;  Казань, 2008); Всероссийской конференции с международным участием "Заболевания поджелудочной железы" (Сочи, 2007); I Международной конференции по торако-абдоминальной хирургии, посвященной 100-летию со дня рождения Б.В. Петровского (Москва, 2008); XI и XII Съездах общества эндоскопических хирургов России (Москва, 2007, 2008); заседании кафедры патологической анатомии Московского факультета РГМУ (Москва, 2008);  конференции «Высокотехнологичные методы диагностики и лечения» (Москва, 2008), на  совместном заседании кафедры патологической анатомии  Московского факультета РГМУ и кафедры общей, лазерной и эндоскопической хирургии с курсом гепатопанкреатобилиарной хирургии  РМАПО; межлабораторной конференции НИИ морфологии человека РАМН (май,2009).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 30 печатных работ, из них 13 в журналах, рекомендуемых ВАК РФ.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 222 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, общей характеристики материала и методов исследования, восьми глав результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов и указателя литературы. Работа иллюстрирована 103 рисунками и микрофотографиями, содержит 9 таблиц. Указатель литературы включает 276 источников: 88 отечественных и 188 зарубежных.

Материал и методы исследования

Проведены клинико-морфологические сопоставления и изучен операционный материал от 178 больных хроническим панкреатитом и 122 больных протоковой аденокарциномой поджелудочной железы, находившихся на лечении в ГУ Институт хирургии им. А.В.Вишневского, МУЗ Клиническая больница №53 г. Москвы, ФГУЗ Клиническая больница №119 ФМБА РФ в период с 1993 по 2008 гг.

Среди больных ХП преобладали мужчины (3:1) в возрасте от 25 до 75 лет (средний возраст - 45 лет). Возраст женщин колебался в тех же пределах: от 28 до 73 лет, средний - 47 лет. Среди больных ПАК ПЖ также преобладали мужчины (67 из 122), но по сравнению с группой больных ХП соотношение мужчин к женщинам было существенно меньшим и составило 1,2:1. Возраст больных колебался от 35 до 80 лет. Средний возраст мужчин - 56 лет, средний возраст женщин - 57лет.

Верификация новообразований проводилась на основании данных гистологического и иммуногистохимического исследования (ИГХИ) в соответствии с классификациями экзокринных и нейроэндокринных опухолей ПЖ (ВОЗ, 1998, 2000).

Для ИГХИ были отобраны наиболее репрезентативные образцы из архивного и текущего операционного материала, полученного от 100 больных, перенесших различные резекции поджелудочной железы по поводу ХП (50 случаев) и ПАК (50 случаев). Для контроля и сравнительного анализа было исследовано 7 образцов ткани неизмененной поджелудочной железы (аутопсийный материал лиц в возрасте от 50 до 60 лет с сердечно-сосудистой патологией, не страдавших заболеваниями поджелудочной железы).

В 36 случаях заболевания ХП был алкогольной этиологии, в 14 случаях вторичным обструктивным вследствие опухолевой обтурации проксимальных панкреатических протоков.

При исследовании протоковых аденокарцином ПЖ опухоли различали по степени дифференцировки: высоко- (19), умеренно- (25), низкодифференцированные (4). Выделили также 2 случая недифференцированного рака ПЖ: один с наличием анапластического компонента, другой - остеокластоподобных гигантских клеток. В 19 случаях(38%) наблюдали лимфогенные и гематогенные метастазы ПАК ПЖ.

Сравнивали уровень СА19-9 и РЭА в сыворотке крови и выраженность экспрессии данных маркеров в опухолевых клетках, анализируя материал от 139 больных. Из них 44 пациента с диагнозом хронический панкреатит (31,7%), протоковая аденокарцинома – 52 (37,4 %), муцинозная цистаденома - 5 (3,6%), муцинозная цистаденокарцинома - 8 (5,8%), серозная цистаденома - 12 (8,6%), недифференцированный рак - 6 (4,3%), железисто-плоскоклеточный рак - 1 (0,7%), эндокринный рак - 11 (7,9%).

Без представления о возможных оперативных вмешательствах на ПЖ полноценное морфологическое исследование, целью которого является не только верификация диагноза, но и определение радикальности операции, едва ли возможно. Полученный для морфологического исследования операционный материал отличался в зависимости от характера (Данилов М.В., Федоров В.Д., 1995; Патютко Ю.И. и соавт., 2007) и объема хирургического вмешательства.

Для объективизации морфологических изменений при работе с операционным материалом, полученным при резекциях, выполненных по поводу ХП или ПАК ПЖ, соблюдались ряд условий:

-при макроскопическом изучении препарата оценивали размеры удаленной части органа, цвет и сохранность архитектоники (дольчатости) паренхимы, её плотность и равномерность;

-при гастро-панкреатодуоденальной резекции помимо исследования удаленной части железы, необходимо тщательное изучение всех составляющих органокомплекса (части желудка, двенадцатиперстной кишки (ДПК), дистального отдела общего желчного протока, желчного пузыря, начального отдела тощей кишки);

-для оценки радикальности операции, помимо срочного гистологического исследования интраоперационного материала, который в стандартных ситуациях представлял собой кусочки ткани из краев резекции ПЖ, главного панкреатического и общего желчного протоков, а также лимфоузлов, указанный материал запускали в плановую проводку для контрольного исследования;

-при изучении изменений протоковой системы оценивали проходимость основных протоков зондами и по ним вскрывали их просвет; измеряли диаметр протоков в наиболее узкой и широкой их части, описывали состояние слизистой;

-получение корректных гистотопографических срезов обеспечивали вырезкой ткани железы перпендикулярными к главному панкреатическому протоку (ГПП) параллельными пластинами толщиной 0,5 см.

В дальнейшем из пластин вырезали фрагменты ткани железы размером 1х1 см из наиболее плотных участков. При наличии конкрементов в ткани железы и просвете протоков их удаляли; для оценки распространения патологического процесса при подозрении или наличии опухоли ПЖ на исследование обязательно брали фрагменты ткани, прилежащие к ДПК и стенку кишки в области инвазии и большой дуоденальный сосочек; при наличии опухоли или подозрении на развитие ПАК на фоне ХП исследованию подвергали регионарные лимфоузлы, а также парапанкреатическую клетчатку со всех сторон удаленного фрагмента железы.

Что касается методики исследования операционного материала, получаемого при лапароскопических резекциях ПЖ, которые только начинают внедряться в клиническую практику, то нами впервые в России был исследован органокомплекс после гастропанкреатодуоденальной резекции, выполненной полностью лапароскопически (Хатьков И.Е., Цвиркун В.В. и соавт., 2007). В настоящее время мы располагаем данными морфологического изучения операционного материала, полученного при 18 лапароскопических операциях. При данных резекциях органокомплекс после удаления помещали в пластиковый контейнер и держали в брюшной полости до конца операции, извлекая препарат после реконструктивного этапа, что диктуется эндовидеохирургическими технологиями. В связи с этим изучение краев резекции общего печеночного протока и ПЖ производили в процессе её выполнения, сразу после пересечения указанных структур. После пересечения общего печеночного протока на визуально неизмененном участке, его проксимальную, остающуюся культю дополнительно циркулярно дорезали на протяжении 1-2 мм. При этом хирурги не должны использовать коагулирующие инструменты, чтобы не повредить подлежащие морфологическому исследованию ткани. Аналогичным образом после пересечения ПЖ, дорезали её остающуюся культю (дистальную или проксимальную в зависимости от вида резекции) по всей площади среза, что позволяло изучить края ГПП и ткани паренхимы железы. В случае видимого или предполагаемого распространения опухоли на ДПК или парапанкреатическую клетчатку, прежде всего в зоне мезентериальных сосудов, выполняли дополнительное исследование соответствующих тканей. Благодаря существенно лучшей визуализации при эндовидеохирургических вмешательствах видимые и определенные при срочном гистологическом исследовании границы распространения опухоли в наших наблюдениях совпадали. Окончательное заключение о радикальности операции получали в результате последующего планового морфологического исследования всего операционного материала.

В работе использовались общепринятые гистологические методики: окраска гематоксилином и эозином, пикрофуксином по ван Гизон.

При микроскопическом исследовании в случаях с ХП придерживались следующего протокола, описывающего: изменения ацинарной ткани и стромы (атрофия ацинарной ткани; дистрофия ацинарных клеток; наличие меж-, пери-, внутридолькового фиброза); характер воспалительной инфильтрации (лимфоидные фолликулы; перидуктальная, периневральная лимфоцитарная инфильтрация и вовлечение стенки ДПК); изменения эпителия протоков (PanIN- 1, 2 и 3; тубулярные комплексы); состояние эндокринных островков (незидиобластоз, тубуло-эндокринные комплексы), поражения нервных стволов (отек и набухание миелиновых оболочек; периневральный фиброз), состояние желчевыводящих путей (холангит, холецистит), вторичные изменения перенхимы железы (калькулез, кальцинаты, хронические или острые постнекротические кисты).

  Протокол микроскопического исследования при ПАК ПЖ должен содержать следующие данные: гистологический тип опухоли, степень злокачественности опухоли (дифференцировка); стадию опухолевого процесса по системе pTMN; информацию о радикальности оперативного вмешательства; наличие периневральной опухолевой инвазии, опухолевой инвазии лимфатических сосудов и вен; состояние удаленных лимфоузлов; наличие и характер панкреатита в окружающей опухоль паренхиме железы, а также кальциноз, конкременты, PanIN, тубулярные комплексы.

Изучаемые линии резекции: края общего желчного и главного панкреатического протоков, край резекции ткани железы, срезы задней и передней поверхностей удаленной части железы.

Варианты радикальности резекции:

  • R0 – линии резекции макроскопически непораженной ткани, микроскопически не содержат опухолевые клетки;
  • R1 – линии резекции макроскопически непораженной ткани, микроскопически содержит опухолевые клетки;
  • R2 – линии резекции макроскопически по ткани опухоли.

Для иммуногистохимического исследования были использованы маркеры: общий цитокератин, цитокератины 7,19,20, эпителиальный мембранный антиген, CD 56, хромогранин А, синаптофизин, серотонин, альфа-1- антитрипсин, раковоэмбриональный антиген, альфафетопротеин, CA 19-9, S-100, инсулин, гастрин, соматостатин, Ki-67, PCNA, p53, альфа- гладкомышечный актин, виментин (Dako, Дания), матриксные металлопротеиназы-1,2,9 и их ингибиторы 1,2 (Novocastra, Великобритания), MUC 1,2,5AC,6 (Labvision, США), MUC 4(Santa Cruz, США), коллаген 1,3 и 5 типов (Имтек, Россия).

Интенсивность пероксидазной метки для каждого плазматического или мембранного маркера оценивалась полуколичественным методом с учетом интенсивности окрашивания и количества антиген-позитивных клеток. Иммуногистохимическая реакция оценивалась как негативная («» - нет реакции), слабопозитивная («+» - <10% окрашенных клеток), умереннопозитивная («++» - >10% клеток средней интенсивности окраски) и сильнопозитивная («+++» - >50% клеток высокой интенсивности окраски). Для дальнейшего сравнительного иммуногистохимического исследования выделяли два основных уровня иммунореактивности: низкий уровень или редуцированная экспрессия белков (/+) и высокий уровень или гиперэкспрессия маркеров (++/+++). Определение индексов пролиферации Ki67 и PCNA, а также экспрессии протеина р53 и р16 в ядрах клеток проводилось по той же методике, но вычисляли ядерные онкомаркеры как среднее значение от числа меченых ядер на 100 учтенных (при анализе 500-1000 опухолевых клеток). Подсчет меченых ядер проводился в репрезентативных полях зрения с относительно равномерным распределением опухолевых клеток, сверху вниз и слева направо. Клетки на периферии срезов, где чаще всего наблюдается неспецифическое фоновое окрашивание, не учитывалось. Экспрессия белка р53 считалась низкой при окрашивании ядер 10% опухолевых клеток и высокой- при количестве антиген-позитивных клеток в первичной опухоли или метастазе >10%.

Площадь структур, окрашенных виментином, гладкомышечным актином-, различными коллагенами рассчитывали с помощью программы WCIF ImageJ в пикселях, а затем вычисляли процент площади окрашивания по отношению к площади светового поля. Позитивным контролем для иммуногистохимических исследований к группе муцинов являлись реакции на неизмененных тканях органов с заранее известной экспрессией маркера, при этом негативный контроль - без первичных антител.

Для определения концентрации СА-19-9, РЭА в сыворотке крови использовался коммерческий набор реагентов фирмы «International CJS». Иммуноморфологическое исследование проводилось на серийных парафиновых срезах по стандартной методике, предлагаемой фирмой DAKO с использованием аналогичных моноклональных антител.

Качественные признаки оценивались непараметрическими методами статистики при помощи программы Statistica для Microsoft Windows, версии 6.0, StatSoft Inc. (CША). Для количественных признаков подсчитывался корреляционный коэффициент Пирсона. Достоверность различий между средними величинами определяли по t-критерию Стьюдента, F- критерию Фишера. За уровень статистической значимости был принят p<0,05.

Для детального представления о структурных и функциональных особенностях клеток проведено электронно-микроскопическое исследование материала от 4 больных ХП. Ткань фиксировали 2,5% раствором глутарового альдегида на 0,15М фосфатном буфере, затем 1% раствором OsO4 на 0,15М фосфатном буфере. Обезвоживали материал в спиртах возрастающей концентрации (50, 70, 96 и 100%), затем в пропилен оксиде и заливали в аралдит. Полутонкие срезы толщиной 1,5–2 мкм окрашивали  толуидиновым синим, ультратонкие срезы (100–200) - раствором уранил-ацетата и цитратом свинца по Reynolds (1969), препараты просматривали в электронном микроскопе Philips CM10 в трансмиссионном режиме при ускоряющемся напряжении 80 Кв.

Результаты исследования и их обсуждение

Морфологическая характеристика поджелудочной железы в норме

При иммуногистохимическом исследовании неизмененной ПЖ клетки ацинарной ткани и протоков обладали  низкой пролиферативной активностью, при реакции с Ki-67 она составляла от 15 до 20 окрашенных ядер на 300 клеток. По сравнению с ацинарной тканью протоковый эпителий обладал еще более низкой пролиферативной активностью, которая составляла 2-3 клетки на 300. ИГХИ с антителами к p53 дало отрицательный результат. Фибробласты соединительнотканных междольковых перегородок характеризовались слабой экспрессией коллагена III типа. В состав базальных мембран ацинусов входит коллаген IV типа. Экспрессия MUC1 отмечалась не только в апикальной части клеток эпителия внутридольковых протоков (Adsay N.V. et al., 2002), но и в цитоплазме клеток эпителия крупных протоков и в ацинарных клетках. В отличие от литературных данных (McCawlley L.J., Matrisian L.M, 2001) экспрессия желатиназы (MMП-9) отмечалась не только в фибробластах, эндотелиальных клетках, макрофагах, но и в эпителии протоков, нервных стволах. Согласно нашим данным коллагеназа ММП-1 и желатиназа ММП-9, а также их ингибитор ТИМП-1в норме характеризуются слабой экспрессией. Экспрессия протеаз отмечается в ядрах и цитоплазме ацинарных клеток, фибробластах, эндотелии, макрофагах, клетках нервных стволов и цитоплазме единичных клеток эпителия мелких протоков. Экспрессия ингибиторов наблюдается только в ацинарных и эндокринных клетках. Именно такая картина экспрессии матриксных протеаз и их тканевых ингибиторов в норме, вероятно, отражает тот баланс между ними, при котором не происходит накопления коллагена во внеклеточном матриксе. Экспрессия гладкомышечного актина- отмечена только в гладкомышечных оболочках стенок сосудов и полностью отсутствовала в строме железы. При ИГХИ с антителами к белку S-100, на микроскопическом уровне видно, что в норме нервные стволы имеют тонкие миелиновые оболочки.

Морфологическая характеристика поджелудочной железы

при хроническом панкреатите

Длительно существующий ХП приводит к выраженным морфологическим изменениям ПЖ, проявляющимся фиброзом паренхимы, а также калькулёзом (33/22%) и наличием постнекротических псевдокист (47/26%). При гистологическом исследовании поражение ацинарной ткани проявляется вакуольной дистрофией клеток, частичной или полной атрофией. При атрофии ацинарной ткани железы разные по величине эндокринные островки располагались близко друг к другу, а также к нервным пучкам. В 19% случаев отмечена гиперплазия эндокринных островков или незидиобластоз.

Вследствие прогрессирующего фиброза при ХП менялась структура протоковой системы железы. В паренхиме из ацинарной ткани формировались тубуло-островковые и тубулярные комплексы, что отражает компенсаторную реакцию на хроническую гипоксию паренхимы в виде метаплазии ацинарной ткани в более примитивный протоковый эпителий. Тубуло-островковые комплексы (ТОК) представляли собой структуру из мелких протоков в тесной связи с эндокринными островками. Тубулярные комплексы (ТК) – это мелкие пролиферирующие протоки с дисплазией эпителия, проявляющейся в увеличении ядерно-цитоплазматического соотношения и в «визуализации» ядрышек. Также встречались цилиндрическая метаплазия протокового эпителия, папиллярная гиперплазия протокового эпителия с псевдостратификацией ядер или наличием ядерного атипизма. Данные изменения протоков классифицированы как панкреатическая внутриэпителиальная неоплазия (PanIN).

Воспалительная инфильтрация при ХП, как правило, носит скудно очаговый характер и представлена лимфоцитами, плазмоцитами, гистиоцитами. В строме формируются лимфоидные фолликулы. Выраженная лимфоплазмоцитарная инфильтрация, особенно вокруг крупных и средних протоков, присутствует при аутоиммунном панкреатите и является его отличительным гистологическим признаком. В исследованных нами случаях аутоиммунный панкреатит встретился только в одном наблюдении (0,56%), хотя имеющиеся публикации свидетельствуют о том что его частота колеблется в пределах от 5 - 7% (Okazaki K., Chiba T., 2002). Аутоиммунный панкреатит может имитировать ПАК ПЖ, а также опухоль Клатскина.

Периневральная инфильтрация отмечалась в 36% случаев, а выраженный болевой симптом сопровождал тяжелые формы ХП всегда и в большинстве случаев являлся одним из главных показаний к хирургическому лечению. Возможно, выраженность болевого симптома, обуславливает, не столько воспалительный компонент заболевания, сколько поражение миелиновых оболочек нервных стволов. Отек и набухание миелиновых оболочек вызывает сдавливание нервных стволов в ПЖ. В свою очередь нарушение целостности миелиновых оболочек, способствует прорастанию в них фиброзной ткани, что также проявляется в некупируемом терапевтическими средствами болевом синдроме. Так как, в большинстве случаев ХП наблюдается  с преимущественное поражение головки ПЖ, то вовлечение стенки ДПК в воспалительный процесс, отмечалось в 82% случаев.

При ультраструктурном исследовании выявлялись тяжелые повреждения микроциркуляторного русла в виде разрушения стенок межацинарных сосудов и базальных мембран, периваскулярный отек и периваскулярный луковичный фиброз, что усугубляет хроническую гипоксию и приводит к полной атрофии ацинарной ткани и необратимым нарушениям экзокринной функции.

Фиброз паренхимы железы при ХП является доминирующим морфологическим проявлением заболевания. При тяжелых формах ХП наблюдали все виды фиброза: перидуктальный, междольковый и внутридольковый. Для систематизации выраженности фиброза на основании показателей площади экспрессии виментина мы разделили образцы ткани по степени выраженности склеротических изменений на 3 группы: I степень - в пределах 10,00 -19,99% площади светового поля; II степень - 20,00-29,99%; III степень - 30,0% и выше.

В этих группах был проведен сравнительный анализ экспрессии различных типов коллагена. Также в участках фиброза ПЖ получили положительную ИГХ реакцию с антителами к гладкомышечныму актину–, что свидетельствует о наличии миофибробластов. Безусловно, появление активных миофибробластов, экспрессирующих гладкомышечный актин-, влияло на состав внеклеточного матрикса при ХП. Согласно нашим данным тонковолокнистая соединительнотканная строма неизмененной железы в небольшом количестве содержит эмбриональный коллаген III типа. При ХП менялись типы коллагена в строме железы, а также соотношение между ними.

При фиброзе первой степени усиливалась экспрессия коллагена III типа и появлялся в небольшом количестве коллаген V типа. При этом коллаген V типа практически повторял рисунок экспрессии коллагена III типа, но площадь его экспрессии при I и II степенях фиброза была меньше экспрессии коллагена III типа, а при III степени фиброза уже её превышала. По мере прогрессирования фиброзного процесса в отличие от нормы, в середине междольковых перегородок появлялась экспрессия коллагена I типа, в виде узких полос различной интенсивности. Причем появившись при I степени, его экспрессия по мере нарастания фиброза в отличие от коллагенов III и V менялась незначительно (рис.1).

Рис.1. Соотношение типов коллагена в зависимости от степени фиброза (I,II,III) при хроническом панкреатите (р<0,01).

Выявленная нами выраженная экспрессия коллагена III и V типов клетками стромы ПЖ при хроническом панкреатите, приводит к появлению коллагена I типа, который не расщепляется и накапливается в экстрацеллюлярном матриксе. Коллаген I типа характерен для цирротических изменений, старых рубцов и плохо расщепляется протеазами. Причем при ХП замещение коллагена III типа на I тип происходит постепенно от середины междольковой соединительнотканной перегородки к ее периферии, что также может объясняться более ранним развитием повреждения микроциркуляторного русла разрастающейся фиброзной тканью именно в середине междольковой перегородки.

В ткани неизмененной ПЖ помимо коллагена III типа присутствовал в незначительном количестве коллаген V типа. Иммуногистохимическая реакция с антителами к коллагену I типа была отрицательной. Позитивная реакция с антителами к коллагену V типа в выбранных микроскопически неизмененных образцах ткани железы свидетельствует о начальных фиброзных изменениях, невидимых под микроскопом и связанных, наиболее вероятно, с возрастом больных.

Одновременно с синтезом и накоплением коллагена во внеклеточном матриксе происходит его гидролизация или расщепление, в котором участвуют коллагеназы (MMП-1) и желатиназы (MMП-9), секретируемые фибробластами, эндотелиальными клетками, макрофагами и эпителиальными клетками (Woessner J.F., 1991; Nagase H., 1996). Коллагеназы расщепляют коллаген I и III типов, желатиназы значительно лучше гидролизуют коллаген V типа (Birkedal-Hansen H. et al., 2008). Активность этих протеаз регулируется как неспецифическими, так и специфическими ингибиторами, к которым относятся тканевые ингибиторы металлопротеиназ, а именно TИМП-1. В норме выработка протеаз и их ингибиторов уравновешена( Birkedal-Hansen H. et al., 2003).

Согласно нашим данным в ткани поджелудочной железы при ХП экспрессия MMП-1 была положительной в 37% случаев (13/35), а в остальных - она полностью отсутствовала. Экспрессия MMП-9 при сравнении с MMП-1 была выше и отмечалась в 51% (18/35) случаев. Экспрессия тканевых ингибиторов протеаз сохранилась в большинстве случаев: ТИМП-1 – 82% (29/35). Характер ИГХ - реакции с антителами к коллагеназе также отличался от аналогичной к желатиназе. Отмечалась слабая экспрессия MMП-1 в эпителии мелких протоков и единичных ацинарных клетках. В эндотелии и строме реакция была отрицательной. MMП-9 экспрессировалась не только эпителиальными клетками, но макрофагами и единичными клетками стромы. В зависимости от степени фиброзных изменений прослеживались определенные изменения в экспрессии протеаз (рис.2).

Рис.2. Соотношение экспрессии металлопротеиназ и их тканевых ингибиторов и степени выраженности фиброзных изменений паренхимы поджелудочной железы при хроническом панкреатите (p<0,02).

По мере нарастания фиброза в ПЖ снижался уровень экспрессии MMП-1 (p=0,018 ) и MMП-9 (p=0,00). При этом отмечалась равномерное снижение обоих типов протеаз (p=0,019). Содержание тканевых ингибиторов не менялось. При этом выявились статистически значимые обратные зависимости между экспрессией MMП-9 и накоплением коллагена III типа (t=-2,94), а также MMП-9 и коллагеном V типа (t=-4,158). Отсюда можно сделать вывод, что количественное снижение коллагенезы в ткани железы при ХП, особенно желатиназы, способствует накоплению коллагена III и V типов. Дальнейшее появление и отложение во внеклеточном матриксе коллагена I типа, вероятно, является неконтролируемым процессом из-за возникшего дисбаланса между протеазами и их ингибиторами.

В последних исследованиях основными матрикс-продуцирующими клетками, ответственными за формирования фиброза, были названы панкреатические ретиноид-содержащие звездчатые клетки (PSC) (Apte M.V., Haber P.S., 1999). Введение в культуру этих клеток витамина А показало их дифференцировку в миобластоподобные клетки, экспрессирующие мышечный актин и коллагены I и III типов, ламинин и фибронектин (Elsser H.P., Adler G., Kern H.F., 1989).

Обнаруженные при электронной микроскопии функционально активные фибробласты подтверждают, что фиброз железы при ХП является не статическим состоянием, а активно прогрессирующим процессом. В динамике фиброза большую роль играет появление секреторных миофибробластов, проявляющееся в повышении экспрессии гладкомышечного актина-. Миофибробласты, наряду с фибробластами, синтезируют коллаген, откладывающийся во внеклеточном матриксе. Различные типы коллагена участвуют в процессе фиброгенеза неодинаково. Накопление коллагена в строме последовательно: сначала повышается экспрессия коллагена III типа, затем V.  Представляется что, после накопления коллагена в интерстиции происходит его дальнейшая модификация, что проявляется в смене типов коллагена с III и V на I тип. Формирование рубцовой ткани при хроническом панкреатите начинается от середины междольковых перегородок - именно там начинает появляться коллаген I типа и постепенно переходит на внутридольковые пространства. По мере прогрессирования фибропластических изменений экспрессия гладкомышечного актина- не снижается, а наоборот повышается, что может указывать на увеличение числа миофибробластов и повышение их активности. Это играет большую роль в кумуляции коллагена во внеклеточном матриксе и приобретении фиброзной соединительной тканью свойств, способствующих пара- и аутокринной стимуляции ее дальнейшего роста при хроническом панкреатите.

Все приведенные выше патологические изменения ПЖ имели или очевидно необратимый характер, или вызывали обоснованные сомнения в возможности эффективной терапевтической коррекции. Более того, наличие внутриэпителиальной протоковой неоплазии, тубулярных и тубуло-островковых комплексов свидетельствовало о высокой вероятности развития на фоне имеющихся изменений рака ПЖ. Данные изменения, выражающиеся в соответствующей клинической картине, и послужили основанием для хирургического лечения наших пациентов.

Морфологическая характеристика протоковой аденокарциномы поджелудочной железы

Исследуя вопрос возможности возникновения протоковой аденокарциномы на фоне хронического панкреатита, мы изучили материал от 122 больных, оперированных по поводу указанного рака. Протоковая аденокарцинома ПЖ является быстропрогрессирующим заболеванием, при котором 5-летняя выживаемость колеблется в пределах 1-5%, а средняя продолжительность жизни после установления диагноза не превышает 6 месяцев (Ries L., Eisner M., 2003). Среди больных с гематогенными метастазами медиана выживаемости с момента установления диагноза не превышает 4 месяцев. Это обусловлено тем, что в 90% случаев ПАК диагностируется на поздних стадиях и характеризуется низкой эффективностью стандартной терапии (Kleef J., Freess H., 2000). В нашем материале также преобладали опухоли IIB, III и IV стадии, то есть ПАК ПЖ с наличием лимфогенных и гематогенных метастазов. Опухоли в IV стадии составили 34% (17/50), а стадия IA, при которой отмечается самый благоприятный прогноз, так как опухолевый узел не превышает 2 см в наибольшем размере и при этом отсутствуют метастазы, составила всего 8% (4/50).

Несмотря на преобладание высоко- и умеренно- дифференцированных форм, ПАК ПЖ относится к агрессивным протоковым ракам, обладающим пока необъяснимой тропностью к нервной ткани с наличием периневральной инвазии по нашим данным в 66% (33/50) случаев. В 16% (7/50) случаев имелась инвазия в стенку ДПК. Выявленные нами корреляционные связи между стадией заболевания, наличием метастазов и вовлечением в опухолевый процесс стенки ДПК (r=0,7 и r=0,34 при р<0,001) еще раз подтверждают необходимость стадирования при раке ПЖ. Однако, связи между стадией и наличием периневральной инвазии обнаружить не удалось. Периневральная инвазия больше зависела от степени дифференцировки опухоли (r=0,32; р=0,024) и ее распространения в прилежащие ткани, например, в стенку ДПК (r=0,31; р=0,028).

Очевидно, что ПАК ПЖ может развиться только из эпителия с протоковым фенотипом, а именно, из эпителия с положительной экспрессией панцитокератина, цитокератинов 7 и 19, карбонгидратного, раково-эмбрионального и эпителиального мембранного антигенов, что используется для дифференциальной диагностики ПАК с другими опухолями железы, требующими иных подходов в лечении (Патютко Ю. И., Котельников А. Г., 2007).

В 88% (44/50) случаев в окружающей опухоль паренхиме поджелудочной железы обнаружены отчетливые гистологические признаки хронического панкреатита с различными поражениями эпителия протоков по типу внутриэпителиальной неоплазии или тубулярных комплексов.

Выявленные уровни экспрессии Ki-67 в ПАК ПЖ составляли от 14 до 89% (средний - 58,52%), PCNA - от 35 до 97% (средний - 78,8%). Экспрессия p53 наблюдалась во всех случаях ПАК и составляла от 12 до 78% (средний - 48,68%). При этом обнаруженные прямые корреляционные связи между уровнями экспрессии p53 и Ki-67 (r=0,67; p<0,005), p53 и PCNA (r=0,32; p=0,024) закономерны, так как мутация и блокирование гена р53 приводят к ингибированию апоптоза клеток и усилению их пролиферативной активности.

В строме протоковой аденокарциномы, как и при хроническом панкреатите, сохранялась экспрессия гладкомышечного актина-. Наличие секреторных миофибробластов в строме ПАК опосредовано объясняет часто наблюдаемую выраженную десмопластическую реакцию в опухоли.

В результате проведенного исследования выяснилось, что высокая экспрессия коллагеназы ММП-1 наблюдалась только в 14% (7/50) случаев ПАК, в остальных она была низкой. Высокая экспрессия желатиназы ММП-9 выявлена в 58% (29/50) и желатиназы ММП-2 выявлена в 24% (12/50). ИГХ- реакция с антителами к протеазам была позитивной преимущественно в цитоплазме опухолевых клеток, иногда в клетках стромы вокруг опухолевых комплексов, макрофагах.

Положительная реакция с антителами к тканевым ингибиторам металлопротеиназ в протоковой аденокарциноме составила в среднем 8% к TИМП-1 и 12% к TИМП-2. В отличие от ХП экспрессия протеаз в ПАК нарастала, а экспрессия их тканевых ингибиторов снижалась.

Повышенная экспрессия ММП-9 обнаружена в 52% (15/29) при наличии у больных ПАК отдаленных метастазов и коррелировала со стадией заболевания (таблица 1). Известно, что в случае инвазивного роста опухоли меняется равновесие между металлопротеиназами и их ингибиторами - стремясь разрушить тканевой барьер, опухоль синтезирует преимущественно протеазы (DeClerck Y.A., Perez N. et al., 1992). Помимо коллагеназы ММП-1 и желатиназы ММП-9 значимость приобретает вторая желатиназа ММП-2, даже в большей степени ее ингибитор ТИМП-2. При избыточной экспрессии гена ТИМП-2, способность опухоли к инвазивному росту падает, в то время как при утрате этого гена она резко возрастает (Giannopoulos G. et al., 2008). В протоковой аденокарциноме экспрессия ТИМП-2 снижалась, экспрессия ММП-2 и ММП-9 нарастала. Однако полученные данные свидетельствуют о том, что только экспрессия ММП-9 является важным показателем для оценки прогрессирования ПАК ПЖ.

Таблица 1.

Связь экспрессии MMП-2 и MMП-9 в протоковой аденокарциноме поджелудочной железы и  клинико-морфологических проявлений заболевания

Признак

Экспрессия в раковых клетках

ММП-2

MMП-9

низкая

n = 38

высокая

n =12

р

низкая

n = 21

высокая

n =29

р

Возраст (лет)

>60

24

9

0,46

11

22

0,086

60

14

3

10

7

Пол

м

23

6

0,529

12

17

0,918

ж

15

6

9

12

Стадия

IA, IB,IIA

20

4

0,127

14

10

0,016*

IIB,III,IV

18

8

7

19

Дифферен-цировка опухоли

выс/ум

32

12

0,148

19

25

0,654

низкая

6

0

2

4

Метастазы в печени

+

12

7

0,099

4

15

0,018*

26

5

17

14

Инвазия в ДПК

+

5

3

0,339

3

5

0,78

-

33

9

18

24

Периневр. инвазия

+

23

10

0,151

16

17

0,203

15

2

5

12

Примечание: * - статистически значимые показатели (р < 0.05)

Морфологическая характеристика предраковых изменений эпителия протоков поджелудочной железы

Представляется возможным выделение двух типов морфологических структур при ХП, которые могут послужить основой развития протоковой аденокарциномы. Это гиперпластические изменения эпителия протоков по типу внутрипротоковой неоплазии (PanIN) (Hruban R.H. et al., 2001) и метапластические изменения ацинарной ткани по типу тубулярных комплексов.

При ХП наблюдались изменения протоков, соответствующие PanIN-1 в 24% случаев и PanIN-2 – в 13%. В остальных наблюдениях поражения эпителия протоков по типу внутриэпителиальной неоплазии отсутствовали. Помимо панкреатической внутриэпителиальной неоплазии (PanIN) мы отнесли к предраковым поражениям протоков тубулярные комплексы, которые встретились при ХП в 73 случаях (49%).

При протоковой аденокарциноме в 48% случаев в окружающей ткани поджелудочной железы, в которой в большинстве случаев мы видели гистологическую картину обструктивного панкреатита, выявлены тубулярные комплексы. В 14% наблюдений обнаружены фокусы PanIN-1, в 18% - фокусы PanIN-2 и 30% - PanIN-3. При этом прослежена прямая зависимость между наличием тубулярных комплексов и PanIN 1-2 (r =0,4231). Таким образом, ТК встречаются в паренхиме железы как при автономном, так и при обструктивном панкреатите и сопровождают ПАК существенно чаще, чем панкреатическая внутриэпителиальная неоплазия.

Прямая зависимость выявлена также в отношении частоты наблюдения ТК при ХП и непораженной паренхиме ПЖ при протоковой аденокарциноме, в которой выявлен обструктивный панкреатит (r =0,4124). В случаях ХП число ТК статистически достоверным было меньше.

При иммуногистохимическом исследовании с антителами к Ki-67 было выявлено повышение пролиферативной активности клеток в эпителии внутрипротоковой неоплазии (в среднем 33,09%, стандарное отклонение ±33,28). Данный размах в стандартном отклонении объяснялся вариабельностью экспрессии в зависимости от степени PanIN, так как минимальный показатель экспрессии Ki -67 был в PanIN-1 и составил 3%, а максимальный в PanIN-3 и составил 89%. В целом экспрессия Ki -67 в PanIN-1 была немного выше экспрессии в неизмененной железе, составляя в среднем 6%. Уровни экспрессии Ki-67 в PanIN-2 и PanIN-3 были выше, чем в PanIN-1 и в среднем составили 14,4% и 77,1% соответственно.

Уровень экспрессии Ki-67 в тубулярных комплексах был выше, чем в PanIN2, но ниже, чем в PanIN-3 и составил в среднем 26%. Выявлены сильные корреляционные связи между уровнями экспрессии Ki-67 и PCNA, как в группе внутрипротоковой неоплазии (r=0,98), так и в группе ТК (r=0,63). Уровни экспрессии PCNA во всех группах были пропорционально выше, чем Ki-67. Экспрессия онкобелка р53 наблюдалась только в двух случаях PanIN-1, при этом процент позитивных ядер составил 3 и 5, что в среднем составило только 0,3% (рис.3).

Уровни экспрессии р53 в PanIN-2 и тубулярных комплексах был приблизительно одинаков и составлял 14,4% и 15,8% соответственно. Средний уровень экспрессии в PanIN3 практически приближался к средним цифрам экспрессии р53 в ПАК ПЖ и составил 62,3%.

Таким образом, по своим молекулярно-биологическим свойствам тубулярные комплексы соответствовали внутриэпителиальной панкреатической неоплазии 2 степени.

Рис. 3. Экспрессия p53, Кi67, PCNA в PanIN и тубулярных комплексах (р<0,01)

Согласно публикациям (Lowenfels A.B. et al., 1999, Jemal A., Thomas A., 2002) и нашим наблюдениям существующая патогенетическая связь между хроническим панкреатитом и развитием ПАК ПЖ не вызывает сомнения. В выделенных гиперпластических изменениях протокового эпителия в виде внутриэпителиальной панкреатической неоплазии (PanIN) отмечалась повышенная пролиферативная активность клеток, особенно в случаях с PanIN-2 и PanIN-3, при которых также отмечалась повышенная экспрессия онкобелка р53. Согласно полученной ИГХ-характеристике, PanIN-3 по своим биологическим свойствам соответствовала ПАК ПЖ. Неопластические изменения эпителия при PanIN-3 соответствуют раку in situ, но изучив большой объем материала нам не встретились PanIN-3 в ткани ПЖ при автономном ХП, а только в ткани, окружающей ПАК. Поэтому остается открытым вопрос, являлись ли изменения протоков в виде PanIN-3 причиной развития ПАК или это внутрипротоковое распространение опухоли.

Выделенные нами тубулярные комплексы встречались в паренхиме железы существенно чаще, чем панкреатическая внутриэпителиальная неоплазия, и по своим пролиферативным свойствам соответствовали PanIN-2. Поэтому можно предположить, что фоновыми изменениями, способными привести к развитию рака ПЖ, вероятно, являются панкреатическая внутриэпителиальная неоплазия и метаплазия протокового или ацинарного эпителия по типу «тубулярных комплексов», которые развиваются вследствие нарушений молекулярных характеристик клеток.

Исследования диагностической значимости карбогидратного и раковоэмбрионального антигенов при протоковой аденокарциноме поджелудочной железы и хроническом панкреатите

В настоящее время в дифференциальной диагностике рака поджелудочной железы, прежде всего ПАК, наиболее информативным серологическим тестом является изучение уровня карбонгидратного антигена - СА19-9, как правило, в корреляции с уровнем общего раковоэмбрионального антигена РЭА  (Федоров В.Д. и соавт., 1999). Нами изучена информативность радиоиммунологическогого определения в периферической крови уровня СА19-9 у 139 и РЭА у 125 больных при опухолях и неопухолевых заболеваниях ПЖ (рис. 4).

При анализе полученных данных выявлено, что в группе ХП показатели в 39/44 (88,6%) случаях были в пределах 0-45 ед/мл, в 3-х (6,8%) – 100-200 ед/мл, в 2-х (4,6%) > 1000 ед/мл. В группе ПАК показатели у 13/51 (25,5%) обследованных были меньше 50 ед./мл, то есть в пределах нормы. У 10 больных (19,6%) – 50-200 ед./мл, у 26 (54,9 %) > 200 ед./мл, что подтверждает далеко не абсолютную специфичность данного теста.

Рис.4. Показатели сывороточного СА19-9 при опухолях ПЖ и хроническом панкреатите (p<0,05).

В единственном случае железисто-плоскоклеточного рака ПЖ уровень сывороточного СА19-9 достиг 10638 ед/мл. Мы не выявили каких-либо статистических корреляций показателей в перечисленных гистологических группах.

Низкие уровни показателей сывороточного СА19-9 в случаях эндокринноклеточного рака ПЖ совпали с данными иммуноморфологического исследования, при котором экспрессия СА19-9 опухолевыми клетками полностью отсутствовала. Это объясняется тем, что данный опухолево-ассоциированный антиген вырабатывается только экзокринным аппаратом ПЖ. Низкие цифры сывороточного СА19-9 при недифференцированном раке можно объяснить потерей дифференцировки клеток опухоли. Интерес представляет группа слизистых аденокарцином, где мы ожидали более высокие показатели СА19-9, так как при ИГХИ наблюдалась выраженная положительная реакция с СА19-9 в цитоплазме опухолевых клеток (++/+++) во всех 6 случаях. С нашей точки зрения, можно предположить, что накопление СА19-9 в данном случае идет локально, только в «слизистых озерах» этих опухолей, и антиген не выделяется в кровь в определяемом количестве. В группе ПАК при ИГХИ реакция с антителами к СA19-9 была высокой (++/+++) в 39/51 (76,5%) случаев и низкой (-/+) в 12/51(23,5%) случаях, но степень выраженности ИГХ-реакции не зависела от уровня онкомаркера в крови (p=0,135) и стадии заболевания.

Локализация опухоли в ПЖ (головка, тело, хвост) не оказывала влияния на уровень концентрации антигена в крови. В то же время нами отмечена определенная зависимость уровня концентрации СА19-9 от распространенности опухоли, поэтому для рака ПЖ немаловажное практическое значение имеет уточнение размеров опухоли, при которых сохраняется информативность этого теста. По нашим данным тест на СА19-9 при IIA, III и IV стадиях, т.е при опухолях любой величины с наличием метастазов в регионарных лимфатических узлах, уровень СА19-9 резко возрастал, отмечена прямая зависимость между уровнем СА19-9 в крови и наличием метастазов (r=0,33). При ХП иммуногистохимическая реакция с антителами к СА19-9 была в целом отрицательная и только в 8/44 случаях слабоположительная в протоковом эпителии, что составило18%.

Показатели уровня раковоэмбрионального антигена в группе из 42 больных ХП были в норме - от 2,5 до 5,0 нг/мл, и только у одного больного он составил 9,5 нг/мл. При ИГХИ с антителами к РЭА реакция была слабоположительная только в 2/42 (4,7%) случаях. В группе злокачественных опухолей РЭА был повышен только у 6 больных из 60, что составило всего 10%. Из них показатели в крови были выше нормы только у 3 больных с ПАК ПЖ (11,2 нг/мл; 13,1нг/мл и 17,7 нг/мл); также у больных с недифференцированным раком ПЖ - 37,6 нг/мл, муцинозной аденокарциномой - 20,3 нг/мл и железисто-плоскоклеточным раком ПЖ - 19,4 нг/мл. При ИГХИ реакция c антителами к РЭА в группе ПАК была высокой (++/+++) в 7/47 (14,9%) случаев и низкой (-/+) в 40/47 (85,1%) случаях. Степень выраженности ИГХ реакции зависела от уровня онкомаркера в крови (r=0,304; p=0,038) и не зависела от наличия метастазов и стадии заболевания.

Анализируя наши данные, можно констатировать, что определение РЭА в сыворотке крови  не обладает диагностической ценностью для  рака ПЖ. Тем не менее выявлена зависимость между повышением уровня СА19-9 и РЭА в крови (r=0,38). Поэтому при одномоментном повышении обоих маркеров чувствительность теста возрастает. По сравнению с РЭА, карбонгидратный антиген обладает высокой чувствительностью при ПАК ПЖ, но все же не является абсолютно специфичным онкомаркером на ранней стадии и при низко- или недифференцированных формах рака, когда способность к продукции опухолевыми клетками онкобелка резко снижается. Также не выявлено корреляций между уровнем экспрессии в клетках при ИГХИ и уровнем сывороточного СА19-9. Поэтому, в последнее время, возрос интерес к исследованию группы муцинов (гены группы MUC), их роли в прогрессии рака ПЖ и возможному использованию их в ранней диагностике рака ПЖ в качестве альтернативных СА19-9 онкомаркеров.

Исследование генов группы MUC при хроническом панкреатите и протоковой аденокарциноме поджелудочной железы

В ряде исследований было показано, что по сравнению с нормальными эпителиальными клетками в опухолевых клетках либо увеличивается синтез или секреция муцинов, либо теряется их полярность. При потере полярности начинается секреция муцинов всей поверхностью клетки с изменением их гликозилирования (Itzkowitz S.H., Ogata,S., 1990). В результате проведенных исследований мы выявили, что в неизмененной ткани ПЖ экспрессия MUC1 помимо апикальной части клеток эпителия внутридольковых протоков присутствовала в цитоплазме клеток эпителия крупных протоков и в ацинарных клетках, что не совпадает с данными литературы. Экспрессия MUC2 и MUC4 в неизмененной железе полностью отсутствовала. Экспрессия MUC5AC встречалась в цитоплазме вставочных бокаловидных клеток эпителия крупных и средних протоков, MUC6 - только в апикальной части цитоплазмы ацинарных клеток.

Рисунок иммуногистохимических реакций с антителами к MUC1 при ХП практически повторял экспрессию в норме, но реакция была интенсивней и распространялась по всей цитоплазме эпителиальных клеток. Дополнительно выявилась высокая иммунореактивность в очагах PanIN и эпителии тубулярных комплексов. Статистически значимым оказалось, что экспрессия MUC1 выше при алкогольном ХП (р=0,018). Экспрессия MUC2 и MUC4 в таких случаях была отрицательной. Реакция с антителами к MUC5AC носила более интенсивный характер в эпителии крупных и средних протоков ПЖ и присутствовала в цитоплазме клеток цилиндрического эпителия PanIN-1 и PanIN-2.

Экспрессия MUC6 носила очаговый характер и в отличие от нормы наблюдалась в апикальной части единичных клеток эпителия внутридольковых протоков и тубулярных комплексов. Выраженная экспрессия белка MUC1, а также положительная ИГХ-реакция с антителами к MUC5АС и MUC6 в тубулярных комплексах и очагах PanIN может являться подтверждением возникших нарушений в синтезе трансмембранных муцинов.

На основании серии иммуногистохимических исследований группы муцинов в ПАК ПЖ J. Luttges с соавт. (2001) утверждают, что эту опухоль необходимо подразделять на самостоятельные гистологические варианты, характеризующиеся различным фенотипом муцинов. Выделена самостоятельная подгруппа с положительным профилем MUC2 и MUC5AC, характеризуемая как протоковый рак ПЖ с кишечным фенотипом, имеющий лучший прогноз (Komatsu M., Tatum L., 2000). Позже появились работы по разделению ПАК на три группы: кишечного (MUC1 -, MUC2 +), протокового (MUC1 +, MUC2 -) и желудочного (MUC1 -, MUC2 -, MUC5AC +) типов (Swartz M.J., Batra S.K., 2002).

При оценке наших результатов мы также пришли к выводу, что определенные формы ПАК имеют выраженные различия в экспрессии муцинов. Согласно этим различиям изученные протоковые аденокарциномы ПЖ мы разделили на следующие подгруппы:

ПАК1А, где MUC1 +, MUC2 -,  MUC5AC +;

ПАК1Б, где MUC1 +, MUC2 -, MUC5AC -;

ПАК2, где MUC1 -, MUC2 +, MUC5AC -;

ПАК3, где MUC1 -, MUC2 -, MUC5AC +.

В результате подгруппа ПАК1А составила 70% (35/50) общего числа изученных опухолей, ПАК1Б - 12% (6/50), ПАК2 - 8% (4/50), ПАК3 - 10% (5/50). Оказалось, что данные подгруппы имели различия в гистологическом строении. Подгруппа 1А представлена классическим светлоклеточным типом протоковых высоко- и умеренно дифференцированных аденокарцином ПЖ. Подгруппа 1Б состояла из недифференцированных раков с анапластическим компонентом. В подгруппе ПАК2 эпителий был представлен темными штифтовыми клетками, сходными с клетками аденокарцином толстой кишки, также с преобладающим крупно-железистым типом строения. В ПАК3 эпителий имел промежуточный вид между эпителием ПАК1А и ПАК2 и представлял собой опухолевые клетки со скоплением внутриклеточного муцина в апикальной части с преимущественно базально расположенными ядрами.

В группе ПАК ПЖ с протоковым фенотипом у нас выделилась многочисленная подгруппа ПАК1А с положительной иммунореактивностью MUC1 в сочетании с положительной реакцией на MUC5AC. В группе ПАК1Б (MUC1 +; MUC5AC -) уровень экспрессии MUC1 был снижен до 25%, что вероятно связано с падением дифференцировки опухолевых клеток и их неспособностью вырабатывать внутриклеточный муцин. В этой группе также отмечено низкое содержание или полное отсутствие других типов муцинов. Характерно, что высокое содержание MUC5AC отмечалось в высокодифференцированных формах ПАК. Это относится и к MUC6. Уровни данных муцинов, близких по своим свойствам, снижались по мере уменьшения дифференцировки опухоли, находясь в прямой зависимости (r=0,76).

Как было сказано выше, MUC4 является аналогом MUC1, что объясняет его отсутствие в протоковых аденокарциномах с кишечным и желудочным фенотипами (группы ПАК2, ПАК3). Он не вырабатывается клетками эпителия неизмененной ПЖ, а только опухолевыми клетками аденокарцином протокового типа. В группе ПАК1А в 91,43% отмечена положительная экспрессия MUC4 различной интенсивности. В 48,57% реакция оценена в 4 балла. В недифференцированных раках ПЖ высокая экспрессия MUC4 отмечена только в 3 случаях из 6 и составила не более 3 баллов. Отсутствие MUC4 в анапластическом раке, несмотря на его высокую степень злокачественности, можно также отнести к резкому падению дифференцировки опухолевых клеток и их неспособности вырабатывать трансмембранные высокомолекулярные гликопротеины.

Выявлены прямые корреляционные связи между экспрессией MUC4, типами ПАК, дифференцировкой опухоли и наличием метастазов. В группах ПАК1А и ПАК1Б прослежена прямая зависимость между уровнем MUC1 и наличием метастазов (r=0,46), уровнем MUC4 и наличием метастазов (r=0,64). Так же по мере увеличения выработки MUC1 нарастала экспрессия MUC4 (r=0,66). Очевидно, что по мере повышения экспрессии MUC1 и MUC4 возрастает вероятность метастазирования опухоли.

Сверхэкспрессия белка MUC1, положительная реакция на MUC5АС и MUC6 в тубулярных комплексах и очагах PanIN являются подтверждением возникших нарушений в синтезе трансмембранных муцинов, регулирующих рост, адгезию и миграцию клеток. Данные изменения при ХП можно рассматривать как дополнительное свидетельство в пользу его возможной  предраковой природы и обоснование необходимости более радикального хирургического лечения ХП, особенно в далеко зашедших стадиях.

Иммуногистохимические исследования с антителами к генам группы MUC позволили выделить гистологические типы ПАК ПЖ, различающиеся злокачественностью своего потенциала. В отличие от данных Luttges J. с соавт. (2001), у нас самая многочисленная группа c фенотипом MUC1+ и MUC5AC+, которая составила 70% всех исследованных опухолей. Согласно полученным результатам в патологоанатомической практике необходимо выделять ПАК ПЖ с кишечным фенотипом, то есть положительной экспрессией MUC2, так как этот гистологический тип имеет лучший прогноз при правильно выбранном на основании полученных сведений варианте лечения. Кроме того, имеется группа с экспрессией только MUC5АС – желудочного типа, которая требует дальнейшего изучения.

Обнаружено, что муциноподобный гликопротеин эпигликанин участвует в защите опухолевых клеток от действия иммунной системы (Gum J.R., Hicks J.W., 1990). Вероятно, высокая концентрация сиаломуцинов защищает опухолевые клетки, покинувшие эпителиальный слой от лизиса клетками киллерами. Помимо этого, MUC1 также ингибирует цитотоксическую активность эозинофилов. Это объясняет неспособность цитотоксических клеток уничтожать эпителиальные опухолевые клетки с увеличенной экспрессией MUC1. Другой способ блокировать иммунную систему основан на способности фрагментов муцинов, протеолитически освобожденных с клеточной поверхности, формировать иммунноблокирующие комплексы (Ohta T., Sasaki M. et al., 1996). Имеются данные, что одно-, трех- и пятилетняя выживаемость пациентов в группе с высоким содержанием MUC4 (> 20% опухолевых клеток) в тканях опухоли составила 31,5%, 5,6% и 0% соответственно. У пациентов с пониженной экспрессией MUC4 (<20% опухолевых клеток) аналогичные показатели были статистически значимо выше 64,2%, 22,0% и 13,9% (Lowenfels A.B. et al., 1993). Мы также придерживаемся позиции, что трансмембранные муцины MUC1 и MUC4 являются достаточно достоверными маркерами более агрессивного фенотипа протоковых аденокарцином ПЖ (рис.5). Экспрессия MUC1 сохраняется в недифференцированных раках протокового фенотипа, когда экспрессия других типов MUC снижается.

Рис.5. Экспрессия муцинов в зависимости от наличия метастазов ПАК ПЖ.

Существующая прямая связь между уровнем экспрессии MUC4 и адгезивными свойствами опухолевых клеток ПАК ПЖ делает возможным использование данного онкомаркера в качестве фактора прогноза. Так как мы выявили положительную ИГХ-реакцию с антителами к MUC4 только в клетках опухоли, есть все основания считать дополнительное определение экспрессии данного онкомаркера информативным в сложных диагностических случаях с точки зрения дифференциальной диагностики между аденокарциномами протокового типа и хроническим панкреатитом.

Выводы

  1. На основании комплексного морфологического, иммуно-морфологического, ультраструктурного исследования операционного материала поджелудочной железы больных хроническим панкреатитом  и  протоковой аденокарциномой, установлено, что фиброз железы является ведущим морфологическим проявлением при хроническом панкреатите, имеет стадийный характер, что проявляется  различным соотношением I, III и V типов коллагена. Хронический панкреатит является фоновым заболеванием для протоковой аденокарциномы поджелудочной железы, что подтверждается изменением молекулярных свойств протокового эпителия.
  2. При тяжелых формах хронического панкреатита наблюдается последовательное развитие перидуктального, перилобулярного и внутрилобулярного видов фиброза, сопровождающееся нарастанием экспрессии гладкомышечного актина, свидетельствующего о перманентном характере процесса, приводящего в конечном итоге, к циррозу паренхимы железы.
  3. Выявленные нарушения баланса между экспрессией матриксных металлопротеиназ ММП-1, ММП-9 и их тканевых ингибиторов в сторону снижения экспрессии протеаз способствуют накоплению коллагена во внеклеточном матриксе и стимулируют процесс фиброгенеза.
  4. Нарушения синтеза коллагенов клетками стромы поджелудочной железы, проявляющиеся увеличением экспрессии коллагена III на ранних стадиях хронического панкреатита, приводят в дальнейшем к продукции секреторными миофибробластами коллагенов I и V типов и формированию необратимых склеротических изменений железы.
  5. Фоновыми изменениями при тяжелых формах хронического панкреатита, способными привести к развитию рака поджелудочной железы, являются панкреатическая внутриэпителиальная неоплазия (PanIN) и метаплазия протокового или ацинарного эпителия по типу «тубулярных комплексов», которые сопровождаются молекулярными изменениями клеток.
  6. Соблюдение разработанных протоколов морфологического исследования обеспечивает получение максимально возможного представления о характере и степени изменений при хроническом панкреатите и служит основанием для радикального хирургического лечения при его тяжелых формах, что обусловлено необратимостью указанных изменений и высокой вероятностью развития на этом фоне рака.
  7. Уровни СА19-9 в сыворотке крови имеют диагностическую ценность при протоковой аденокарциноме поджелудочной железы в сравнении с уровнем РЭА, но не являются абсолютно специфичным онкомаркером на ранней стадии, особенно при низко- и недифференцированных формах, когда способность к продукции онкобелка резко снижается. Корреляций между уровнем экспрессии СА19-9 в клетках опухоли и его сывороточным уровнем не выявлено.
  8. Прямая связь между уровнем экспрессии трансмембранных муцинов и адгезивными свойствами клеток протоковой аденокарциномы поджелудочной железы делает возможным использование данных онкомаркеров в качестве фактора прогноза. Есть основания считать дополнительное определение экспрессии MUC4 информативным в сложных случаях для дифференциальной диагностики между аденокарциномами протокового типа и хроническим панкреатитом.
  9. Для более достоверной оценки радикальности операции, прогноза, выбора стратегии и тактики дальнейшего лечения больных протоковой аденокарциномой поджелудочной железы необходимо детальное морфологическое исследование, включащее определение экспрессии муцинов и гистологического варианта с кишечной дифференцировкой.

Практические рекомендации

  1. Терапевтические подходы к лечению хронического панкреатита на его ранних стадиях следует искать в механизмах прерывания на молекулярно-клеточном уровне активации фибробластов и их трансформации в миофибробласты, а также в поступательном характере накопления во внеклеточном матриксе коллагенов, экспрессия I и V типов которых свидетельствует о формировании необратимых склеротических изменений железы.
  2. Последовательное развитие фиброза при хроническом панкреатите, имеющее перманентный характер, делает малоперспективными известные методы консервативного лечения, особенно при 2 и 3 степени фиброза. В такой ситуации необходимо более раннее рассмотрение показаний к хирургическому лечению.
  3. При планировании хирургических вмешательств по поводу хронического панкреатита и протоковой аденокарциномы поджелудочной железы патологоанатому целесообразно совместно с хирургом на основании полученных дооперационных данных составлять план морфологического изучения операционного материала, как во время, так и после операции. Такой подход в большей степени обеспечивает достоверность морфологического исследования как с точки зрения верификации диагноза, так и радикальности выполненной операции.
  4. При лапароскопических операциях по поводу хронического панкреатита и, особенно, опухолях поджелудочной железы и других органов билиопанкреатодуоденальной зоны методика изучения операционного материала отличается от традиционной. Отсутствие возможности интраоперационного исследования всего материала обусловливает специальные требования к хирургам по получению образцов ткани, позволяющих морфологу достоверно констатировать степень радикальности вмешательства.
  5. Наличие при длительно существующем хроническом панкреатите внутриэпителиальной панкреатической неоплазии (PanIN) и метаплазии протокового или ацинарного эпителия по типу «тубулярных комплексов», которые развиваются вследствие изменений молекулярных характеристик клеток, способно привести к развитию рака поджелудочной железы. Это обстоятельство является одним из главных в определении степени радикальности хирургического лечения при тяжелых формах хронического панкреатита.
  6. Последовательное подробное морфологическое изучение операционного материала при протоковой аденокарциноме поджелудочной железы необходимо для детальной верификации диагноза современными методами, позволяющими более точно определить прогноз и тактику дальнейшего специального лечения. В частности, исследование экспрессии муцинов дает возможность выделить из общей группы аденокарциномы с кишечной дифференцировкой, имеющей прогноз, отличный от других видов протоковой аденокарциномы.
  7. Показатели уровня СА19-9 в плазме обладают высокой чувствительностью при протоковой аденокарциноме поджелудочной железы, но не являются абсолютно специфичным онкомаркером, особенно при низко- и недифференцированных формах.
  8. Прямая связь между уровнем экспрессии трансмембранных муцинов и гематогенными метастазами протоковой аденокарциномы поджелудочной железы делает возможным использование данных онкомаркеров в качестве фактора прогноза. Есть основания считать дополнительное определение экспрессии MUC4 информативным в сложных случаях для дифференциальной диагностики между аденокарциномами протокового типа и хроническим панкреатитом.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

  1. Щеголев А.И., Паклина О.В., Тинькова И.О. Стандартизация патоморфологического исследования операционного материала при опухолях и опухолеподобных процессах поджелудочной железы //Актуальные вопросы организации патологоанатомической службы, патологоанатомической диагностики и экспертизы. – Магнитогорск.- 2004.- C.142-143.
  2. Паклина О.В., Щеголев А.И., Скуба Н.Д., Тинькова И.О., Богаутдинова Г.Р. Оптимальные иммуноморфологические панели антител для дифференциальной диагностики опухолей поджелудочной железы //Актуальные вопросы организации патологоанатомической службы, патологоанатомической диагностики и экспертизы. – Магнитогорск.- 2004.- C.225-226.
  3. Паклина О.В., Щеголев А.И., Гришанков С.А. Кистозные опухоли поджелудочной железы// Мат. Всероссийской конференции «Новые горизонты гастроэнтерологии»,- Новосибирск- 2004.- №1- C.142-143.
  4. Тинькова И.О., Щеголев А.И., Паклина О.В., Кармазановский Г.Г. Билиарная цистаденома. //Архив патологии.- 2004.- №3-C.45-6.
  5. Галил-Оглы Г.А., Паклина О.В., Сергеев Ю.В., Козловский О.М. Рак из клеток Меркеля //Архив патологии.- 2004.- №3- C.50-3.
  6. Щеголев А.И., Тинькова И.О., Мишнев О.Д., Втюрин Б.В., Паклина О.В. Нодулярная гиперплазия печени. //Архив патологии.-2004.- №3-C.42-4.
  7. Паклина О.В., Щеголев А.И., Галил-Оглы Г.А., Скуба Н.Д. Классификация опухолей экзокринной части поджелудочной железы. //Архив патологии.- 2005, том  67, №3, стр.45-51.
  8. Паклина О.В., Щеголев А.И., Тинькова И.О., Кравченко Э.В., Богаутдинова Г.Р. Иммунологические панели антител для дифференциальной диагностики опухолей и опухолеподобных процессов поджелудочной железы» //«Актуальные вопросы абдоминальной хирургии»- Ташкент.- 2004.- С.100.
  9. Щеголев А.И., Паклина О.В., Галил-Оглы Г.А., Демидова В.С, Богаутдинова  Г.Р., Никитин П.Н. Диагностическая ценность СА19-9 при заболеваниях поджелудочной железы //Мат. конференции «Клиническая морфология новообразований эндокринных желез» -2005-С.196-197.
  10. Паклина О.В., Щеголев А.И., Богаутдинова Г.Р. Роль трансформирующего фактора роста 1 в формировании склероза поджелудочной железы при хроническом панкреатите //Новые технологии в диагностике, интервенционной радиологии и хирургии печени и поджелудочной железы. Санкт-Петербург.- 2005.- C.107-8.
  11. Щеголев А.И., Скуба Н.Д., Паклина О.В., Тинькова И.О., Вишневский В.А. Гепатобластома у врозлых //Архив патологии- 2005- №3.-C.45-2.
  12. Паклина О.В., Галил-Оглы Г.А., Цвиркун В.В. Морфологические изменения и механизм фиброза при хроническом панкреатите //Научные достижения в практическую работу.- Сб.работ КБ№119 ФМБА РФ-2005.- №12-С.129-134.
  13. Галил-Оглы Г.А., Паклина О.В., Цвиркун В.В. Внутрипротоковая интраэпителиальная неоплазия и протоковый рак поджелудочной железы. //Архив патологии.- 2005. -№6 -C.31-34.
  14. Щеголев А.И., Паклина О.В., Галил-Оглы Г.А. Опухоли поджелудочной железы // Приложение к журналу «Архив патологии» - 2006.- 48 с.
  15. Щеголев А.И., Паклина О.В. Стандартизация морфологического исследования опухолей поджелудочной железы. //Актуальные проблемы управления качеством работ по специальности гистология.- Челябинск.-2006.
  16. Paklina O., Bogautdinova G., Tsvircun V. Quantitative analysis of collagen subtypes I, II, III and V in chronic pancreatitis. //HPB V.8-Suppl.2-2006-P.205
  17. Паклина О.В., Сетдикова Г.Р., Дралов В.Н, Никитин П.Н. Исследование генов MUC при хроническом панкреатите и протоковой аденокарциноме поджелудочной железы //Мат. X Российского Онкологического конгресса-2006.-C.211.
  18. Щеголев А.И., Паклина О.В. Стандартизация морфологического исследования опухолей поджелудочной железы. //Актуальные проблемы управления качеством работ по специальности гистология- Челябинск- 2006.
  19. Щеголев А.И., Дубова Е.А., Паклина О.В., Тинькова И.О. Первичный плоскоклеточный рак печени. //Архив патологии.- 2006.- №3.-C. 28-30.
  20. Buriev I., Tsvircun V., Guzeeva V., Paklina O., Setdikova G. Surgical treatment of chronic pancreatitis. //HPB V.9-Suppl.2-2007.
  21. Буриев И.М., Гузеева Е.Б., Мелихова М.В., Паклина О.В., Сетдикова Г.Р., Цвиркун В.В. Хирургическое лечение проксимального хронического панкреатита. //Вестник хирургической гастроэнтерологии.- 2007.- №3-C.91.
  22. Паклина О.В., Сетдикова Г.Р., Цвиркун В.В. Изучение активности матриксных металлопротеиназ при хроническом панкреатите //Вестник хирургической гастроэнтерологии- 2007- №3-C.97.
  23. Паклина О.В., Сетдикова Г.Р., Никитин П.Н. Морфологические признаки ранних неопластических процессов поджелудочной железы. //Мат. XI Российского Онкологического конгресса. С 204.
  24. Паклина О.В., Цвиркун В.В., Сетдикова Г.Р. Некоторые аспекты морфологии хронического панкреатита. //Анналы хирургической гепатологии.- 2007.- том12.- C.101.
  25. Хатьков И.Е., Цвиркун В.В., Агапов В.К., Израилов Р.Е., Багдатьева М.Г., Паклина О.В., Кулезнева Ю.В., Садовников С.В. Первый опыт лапароскопических панкреатодуоденальных резекций. //Анналы хирургической гепатологии.- 2007.- том12 -С.119.
  26. Хатьков И.Е., Цвиркун В.В., Агапов В.К., Израилов Р.Е., Багдатьева М.Г., Паклина О.В., Кулезнева Ю.В. Лапароскопическая панкреатодуоденальная резекция. //Анналы хирургической гепатологии.- 2007.- №4- C.26-31.
  27. Паклина О.В., Сетдикова Г.Р. Иммуногистохимическое исследование муцинов при хроническом панкреатите и протоковой аденокарциноме поджелудочной железы. //Архив патологии.- 2008.- №4- C.13-7.
  28. Хатьков И.Е., Цвиркун В.В., Агапов В.К., Израилов Р.Е., Дзугкоева Ф.А., Багдатьева М.Г., Паклина О.В., Кулезнева Ю.В. Лапароскопические панкреатодуоденальные резекции. //Анналы хирургической гепатологии.- 2008.-№3- C.78.
  29. Буриев И.М, Гузеева Е.Б., Мелихова М.В., Паклина О.В., Цвиркун В.В. Выбор хирургического лечения «проксимального» хронического панкреатита. //Анналы хирургической гепатологии.- 2008.-№3-C.154.
  30. Мелихова М.В., Кармазановский Г.Г., Гузеева Е.Б., Паклина О.В., Цвиркун В.В. Возможности спиральной компьютерной томографии с болюсным контрастным усилением в дифференциальной диагностике неорганных забрюшинных образований. //Медицинская визуализация 2007 -№3- с. 43-57.

Соискатель О.В. Паклина




© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.