WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

 

На правах рукописи

Минакова Мария Юрьевна

МОНОАМИНЕРГИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ РЕГУЛЯЦИИ

КРОВЕТВОРЕНИЯ ПРИ ЦИТОСТАТИЧЕСКИХ ВОЗДЕЙСТВИЯХ

14.00.16 – патологическая физиология

  14.00.25 – фармакология, клиническая фармакология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

доктора медицинских наук

Томск – 2009

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук НИИ фармакологии Сибирского отделения РАМН

Научные консультанты:

доктор медицинских наук, профессор,

академик РАМН, 

заслуженный деятель науки РФ  Дыгай Александр Михайлович

доктор медицинских наук                 Скурихин Евгений Германович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор,

академик РАМН, 

заслуженный деятель науки РФ          Новицкий Вячеслав Викторович

доктор медицинских наук                         Алиев Олег Ибрагимович

доктор медицинских наук,

профессор                                                 Кондакова Ирина Викторовна

Ведущая организация: НИИ физиологии СО РАМН (г. Новосибирск)

Защита состоится «____» __________ 2009 г. в _________часов на заседании диссертационного совета Д 001.031.01 при НИИ фармакологии СО РАМН (634028, г. Томск, пр. Ленина, 3)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ фармакологии СО РАМН

Автореферат разослан «____» _______________ 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор биологических наук                                Амосова  Е.Н.        

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Изучение закономерностей функционирования системы крови в норме и при патологии является актуальной задачей современной экспериментальной гематологии и патофизиологии, решение которой создает предпосылки для разработки адекватных патогенетически обоснованных методов фармакологической профилактики и коррекции гемодепрессивных состояний различной этиологии [Moore M.A.S., Warren D., 1987; Dexter T.M., Heyworth C.M., 1994; Carde P., 1994; Drize N. et al., 1996; Хлусов И.А. и др., 1997; Prow D., Vadhan-Raj S. , 1998; Дыгай А.М. и др., 1999; Жданов В.В. и др., 2000; Воробьев А.И., 2002; Гольдберг Е.Д. и др., 2007]. В последние годы получены принципиально новые данные, позволившие во многом расшифровать механизмы локальной регуляции кроветворения в условиях миелоингибирующих воздействий [Дыгай А.М. и др., 1992; Жданов В.В. др., 1998; Гольдберг Е.Д. и др., 2001, 2007; Удут Е.В. и др., 2008], что, в свою очередь, послужило основанием для создания ряда высокоэффективных гемостимуляторов на основе производных гликозаминогликанов и рекомбинантных форм цитокинов [Asano S. , 1991; Ruef C., Coleman D.L., 1991; Abels R.I., 1992; Ganser A., Hattori K. et al., 1996; Жданов В.В. и др., 1997; Steward W.P. et al., 1998; Дыгай А.М. и др., 1999; Gabrivole J., 2000; Зак К.П., Грыцюк С.Н., 2001; Птушкин В.В., 2002; Egrie J.C. et al., 2003; Гольдберг Е.Д. и др., 2007; Beutel G., Ganser A., 2007; Littlewood T.J., Collins G.P., 2007; Xu Y.J. et al., 2007]. Целесообразным подходом к созданию новых гемостимуляторов можно считать и поиск средств, обладающих способностью воздействовать на дистантные механизмы контроля процессов кроветворения. В частности, предложены и апробированы в клинике методы терапии цитостатических миелосупрессий с помощью лекарственных средств, модулирующих активность симпатического отдела вегетативной нервной системы (ВНС) [Гольдберг Е.Д. и др., 1997; Хлусов И.А. и др., 1997].

Между тем, накопленные к настоящему времени данные об участии нейромедиаторных систем в обеспечении гемопоэза указывают на то, что спектр нейрофармакологических средств, способных стимулировать процессы восстановления кроветворной ткани в условиях супрессирующих воздействий (в том числе при введении цитостатиков) гораздо шире [Chatelain C. et al., 1989; Yang M. et al., 1996; Maestroni G.J. et al., 1997; Tsao C.W. et al., 1997; Broome C.S., Miyan J.A., 2000; Devoino L. et al., 2001]. В пользу этого свидетельствует тот факт, что в паренхиме костного мозга помимо симпатических обнаружено наличие чувствительных, пуринергических и холинергических нервных окончаний [Yamazaki K., Alien T.D., 1990; Weihe E. et al., 1991; Tabarowski Z. et al, 1996; Artico M. et al., 2002; Lakshmi C. et al., 2005; Aquila H.L., 2006]. Прослежена секреция ими как адреналина и норадреналина, так и дофамина, тахикининов и ряда других высокоактивных биологических веществ [Maestroni G.L., 2000; Захаров Ю.М., 2004]. Установлено, что кроветворные клетки-предшественники различной степени зрелости, равно как и морфологически распознаваемые гемопоэтические и стромальные клетки, способны нести на плазматической мембране рецепторы к различным лигандам медиаторной природы (ацетилхолин, катехоламины, серотонин, субстанция Р, нейрокинины А и В, опиоиды и др.) [Morley A. et al., 1971; Bosing-Schneider R., Haug M., 1976; Brown J.E., Adamson J.W., 1977; Федоров Н.А., 1979; Van Furth R., 1980; Depelchin A., Letesson J.J., 1981; Hall N.R., 1981; Miles K. et al., 1984; Mladenovic J., Adamson J.W., 1984; Setchenska M.S. et al., 1986; Zahniser N.R. et al., 1989; Харкевич Д.Д., 1989; Broome C.S., Miyan J.A., 2000]. Показано наличие прямого (рецепторного) и опосредованного через клеточные элементы гемопоэзиндуцирующего микроокружения (ГИМ) регулирующего влияния нейромедиаторов на процессы пролиферации и дифференцировки коммитирированных прекурсоров гемопоэза [Mladenovic J., Adamson J.W., 1984; Setchenska M.S. et al., 1986; Maestroni G.L., Conti A., 1994; Захаров Ю.М., 2004; Yang M. et al., 2007]. Немаловажным обстоятельством выступает способность кроветворных клеток и клеточных элементов ГИМ не только синтезировать и секретировать нейротрансмиттеры, но и вовлекать их в ауторегуляцию [Marino F. et al., 1997, 1999]. Все эти и многие другие факты  предполагают существование моноаминергического локального контроля процессов повреждения и регенерации кроветворной ткани в ответ на миелоингибирующие воздействия. Причем активность адренергических, дофаминергических и серотонергических механизмов в отношении различных клеточных популяций, скорее всего, носит специфический характер.

Согласно современным представлениям, для жизнедеятельности кроветворных клеток важнейшую роль играют гемопоэтические ростовые факторы и ингибиторы [DePace D.M., Weber R.H., 1974; Sieff CA. et al., 1987; Fibbe W.E. et al., 1989; Metcalf D., 1989; Dorshkind K., 1990; Натан Д.Г., Зифф К.А., 1994; Carde P., 1994; Grassinger J. et al., 2006; Kertesz Z. et al., 2006]. Известна избирательная чувствительность стволовых мультипотентных клеток и более зрелых предшественников, включая морфологически распознаваемые, к определенным гемопоэтинам [Metcalf D., 1989; Heyworth C.M. et al., 1992; Karger A.G., 1993; Натан Д.Г., Зифф К.А., 1994; Carde P., 1994; Cross MA. et al., 1997; Возианов А.Ф. и др., 1998; Чертков И.Л., Дризе Н.И., 1998]. На уровне отдела коммитированных предшественников ярко выражен синергизм действия ростовых факторов и для оптимального ответа крайне важно наличие комбинации «ранних» и «поздних» цитокинов [Sieff C.A., 1987; Ikebuchi K. et al., 1987; Rennick D. et al., 1989; Tanaka R. et al., 1992; Necas E. et al., 1993; Cross M.A. et al., 1997; Воробьев А.И, 2002; Grassinger J. et al., 2006]. Установлено, что в экстремальных условиях (иммобилизация, введение цитостатиков, невротические воздействия и др.) эритроидные и гранулоцитарные прекурсоры приобретают чувствительность к катехоламинам и адренотропным препаратам, на которые они способны отвечать и вне структур кроветворного микроокружения [Maestroni G.L. et al., 1997; Гольдберг Е.Д. и др., 1997, 2004]. В то же время ни в одном из известных нам экспериментов исследователи не рассматривают совместное влияние гемопоэтических факторов роста и лигандов адренергических, дофаминергических и серотонинергических рецепторов на предшественники кроветворения при патологических состояниях.

Другим аспектом рассматриваемой проблемы является вопрос о роли моноаминов центральной нервной системы (ЦНС) в регуляции гемопоэза. Существуют сведения о возможности эффекторного воздействия различных нейромедиаторных систем мозга (адренергическая, дофаминергическая, серотонинергическая, М-холинергическая, ГАМК-ергическая) на клеточность отдельных ростков кроветворения при невротических воздействиях [Гольдберг Е.Д. и др., 2002, 2004]. Активация центральных звеньев дофаминергической системы вызывает иммуностимуляцию, сопровождающуюся накоплением в костном мозге СD4+ Т-клеток, увеличением числа антителообразующих и розеткообразующих клеток в селезенке животных, отменой стресс-индуцированного угнетения иммунной реакции, а также усилением пролиферативного ответа Т-лимфоцитов к митогенам [Девойно Л.В., Ильюченок Р.Ю., 1993; Идова Г.В., 1994;  Tsao C.W. et al., 1997; Идова Г.В. и др., 2001] . Однако представленные данные литературы не позволяют сформировать четкого представления о регуляторном влиянии моноаминов ЦНС на пул коммитированных клеток-предшественников гемопоэза, а также функции ГИМ в норме и при различных патологических состояниях (включая цитостатические гемодепрессии).

Принимая во внимание вышеизложенное, представляет несомненный интерес изучение роли центральных и периферических моноаминов в развитии миелосупрессии и последующей регенерации кроветворной ткани при цитостатических воздействиях, а также особенностей адренергического, дофаминергического и серотонинергического контроля процессов пролиферации и дифференцировки гемопоэтических прекурсоров и функциональной активности гемопоэзиндуцирующего микроокружения. Исследование в данном контексте представляет не только теоретический, но и практический интерес, так как полученные результаты станут основой для разработки новых оригинальных методов коррекции гематологических нарушений при миелосупрессиях, вызванных введением противоопухолевых препаратов.

Цель исследования: изучить механизмы регуляторного влияния адренергической, дофаминергической и серотонинергической систем на кроветворную ткань при цитостатических миелосупрессиях.

Задачи исследования:

1. Оценить участие адренергической, дофаминергической и серотонинергической систем в развитии нарушений в системе крови в условиях введения циклофосфана и 5-фторурацила.

2. Исследовать особенности моноаминергической регуляции деления и созревания кроветворных клеток-предшественников при назначении цитостатиков.

3. Вскрыть специфические для адренергической, дофаминергической и серотонинергической систем механизмы восстановления функциональной активности элементов гемопоэзиндуцирующего микроокружения при моделировании цитостатических миелосупрессий.

4. Оценить вклад моноаминергических систем в реализацию регуляторных эффектов гемопоэтинов (эритропоэтина, Г-КСФ) в условиях введения циклофосфана и 5-фторурацила.

5. Разработать патогенетически обоснованные методы коррекции нарушений в эритроидном и гранулоцитарном ростках кроветворения при цитостатических воздействиях, основанные на модуляции активности центральных и периферических моноаминергических структур.

Положения, выносимые на защиту:

1. При гипопластических состояниях, моделированных введением алкилирующего агента (циклофосфан) или фторпиримидинового антиметаболита (5-фторурацил) в 1/3 МПД, пролиферация и дифференцировка коммитированных кроветворных предшественников и функциональная активность клеточных элементов ГИМ, системы КСФ и эритропоэтина находятся под контролем адренергической, дофаминергической и серотонинергической систем. При этом серотонинергическая система в большей степени ответственна за изменения со стороны эритрона, а адренергическая и дофаминергическая – в гранулоцитарном ростке кроветворения.

2. Основными причинами различных темпов и характера регенерации костномозговой ткани при назначении алкилирующего агента и фторпиримидинового антиметаболита выступают специфическая активность центральных адренергических, дофаминергических и серотонинергических структур и особенности их взаимодействия с гемопоэтическими прекурсорами и клетками ГИМ, а также избирательная чувствительность эритропоэтина и Г-КСФ к регуляторному влиянию моноаминов.

3. В условиях введения циклофосфана ингибирующее действие адренергической системы на гранулоцитарный и эритроидный ростки кроветворения опосредовано угнетением функциональной активности адгезирующих клеток ГИМ (образование ГО, продукция ЭПА) и снижением скорости деления грануломоноцитарных предшественников (связанное с Г-КСФ и периферическими адренергическими механизмами). Ускорение процессов регенерации кроветворной ткани адренергической системой при назначении 5-фторурацила обусловлено формированием ГО, продукцией ЭПА неадгезирующими клетками ГИМ и увеличением уровня КСА в сыворотке крови. При этом стимуляция пролиферативной активности прекурсоров гемопоэза обусловлена КСФ, эритропоэтином, - и -адренергическими структурами.

4. Дофаминергическая система углубляет нарушения структурно-функциональной организации преимущественно эритроидного компартмента кроветворения, вызванные алкилирующим агентом, что приводит к задержке регенерации эритропоэза и более выраженной ретикулоцитопении в периферической крови. При этом имеет место стимуляция Г-КСФ- и дофамин-зависимых механизмов контроля пролиферации грануломоноцитарных предшественников, препятствующая развитию нейтрофильной лейкопении.

5. При назначении 5-фторурацила дофаминергическая система, с одной стороны, увеличивает темпы регенерации эритрона (в силу роста уровня сывороточной ЭПА и эритропоэтин-зависимой активации пролиферации КОЕ-Э), с другой стороны, задерживает восстановление гранулоцитарного ростка кроветворения (за счет снижения продукции КСА адгезирующими клетками ГИМ).

6. При цитостатических воздействиях серотонинергическая система усугубляет развитие депрессии эритропоэза: в условиях введения алкилирующего агента это связано с угнетением формирования эритроидных ГО и функциональной активности эритроидных предшественников (опосредованной системой эритропоэтина) и падением уровня ЭПА в биологически активных средах, при назначении фторпиримидинового антиметаболита – с уменьшением секреции ЭПА клетками адгезирующей фракции ГИМ. Вместе с тем, при использовании 5-фторурацила серотонин ЦНС увеличивает скорость регенерации гранулоцитарного ростка кроветворения путем усиления образования гранулоцитарных и смешанных ГО и стимуляции опосредованной системой КСФ деления и созревания грануломоноцитарных прекурсоров.

7. В условиях цитостатической миелосупрессии, вызванной введением циклофосфана, истощение депо катехоламинов резерпином значительно увеличивает гранулоцитопоэзстимулирующую активность Г-КСФ за счет организации в костном мозге de novo гранулоцитарных и смешанных ГО. Нарушение серотониновой медиации в ЦНС ципрогептадином оказывает потенцирующее действие на эритропоэзстимулирующие эффекты эритропоэтина во многом благодаря восстановлению нарушенной антиметаболитом структурно-функциональной организации эритроидного компартмента кроветворения.

Научная новизна. В работе в сравнительном аспекте впервые изучена роль адренергической, дофаминергической и серотонинергической систем в развитии миелосупрессии и регенерации кроветворной ткани на моделях цитостатических воздействий, вызванных алкилирующим агентом и антиметаболитом. Продемонстрировано, что регулирующие эффекты центральных моноаминергических систем осуществляются через адренергические, дофаминергические и серотонинергические структуры на коммитированных кроветворных предшественниках и клеточных элементах ГИМ, а также опосредовано – через системы эритропоэтина и КСФ.

Выявлено, что в условиях цитостатических воздействий чувствительность прекурсоров гемопоэза к прямому действию лигандов моноаминергической природы возрастает, однако в динамике развития гипопластического состояния прослеживается не только стимуляция деления и созревания КОЕ, но и ингибиция данных процессов. В культуре дофамин и серотонин оказывают супрессирующее влияние на опосредованную гемопоэтическими факторами роста пролиферативную активность кроветворных предшественников, в то же время адреномиметики повышают темпы роста КОЕ-ГМ (более при назначении циклофосфана) и угнетают выход КОЕ-Э в присутствии эритропоэтина.

In vitro показано, что N-ацетилнейраминовая кислота увеличивает способность подвергнутых прямому воздействию алкилирующего агента адгезирующих клеток ГИМ связывать обработанные изадрином или серотонином предшественники эритропоэза.

Истощение депо катехоламинов (резерпин) препятствует развитию депрессии костномозгового гранулоцитопоэза и ускоряет восстановление гемопоэтической ткани после назначения циклофосфана, что преимущественно связано с формированием de novo ГО в костном мозге и продукцией ЭПА адгезирующими нуклеарами. При этом возрастают сопряженные с Г-КСФ (период ингибиции) и адреноструктурами (период регенерации) деление и созревание грануломоноцитарных предшественников, а также эритропоэтин (период ингибиции) - и катехоламин (1–7-е сутки) - зависимая дифференцировка эритроидных клеток. Ингибиция симпатолитиком кроветворения в условиях введения антиметаболита вызвана, в первую очередь, нарушениями функций ГИМ (образования ГО и секреции ЭПА неадгезирующими миелокариоцитами) и снижением уровня сывороточного КСА, во вторую очередь, угнетением функциональной активности кроветворных предшественников: опосредованной гемопоэтинами и катехоламинами (период ингибиции) и -адренергическими структурами, эритропоэтином (период регенерации).

Фармакологическая блокада постсинаптических дофаминовых Д2 рецепторов (галоперидол) усугубляет гипоплазию гранулоцитопоэза в условиях введения алкилирующего агента, что обусловлено разрушением ГО гранулоцитарного и эритро-гранулоцитарного типов и сокращением пула пролиферирующих КОЕ-ГМ. В противоположность этому, галоперидол, повышая функциональную активность адгезирующих клеток, уровень ЭПА в сыворотке крови и интенсивность дифференцировки КОЕ-Э, увеличивает скорость регенерации эритропоэза. При назначении антиметаболита в основе стимуляции галоперидолом гранулоцитопоэза лежит возрастание секреции КСА адгезирующими клетками ГИМ и высокая пролиферативная активность  предшественников грануломоноцитопоэза, опосредованная периферическими дофаминергическими механизмами и Г-КСФ, при этом ингибиция эритрона сопряжена с угнетением деления и созревания эритроидных клеток, опосредованных эритропоэтином и дофаминергическими структурами.

Нарушение серотониновой медиации в ЦНС ципрогептадином до введения циклофосфана увеличивает уровень ЭПА в сыворотке крови и кондиционных средах адгезирующих миелокариоцитов в период ингибиции и угнетает периферические серотониновые механизмы регуляции эритроидных предшественников в сроки восстановления кроветворной ткани, что соответствующим образом отражается на содержании морфологически распознаваемых эритроидных клеток в системе крови (увеличение их числа в период депрессии эритрона и снижение – в сроки регенерации). При назначении 5-фторурацила основным условием ускорения антисеротониновым препаратом регенерации гемопоэза (преимущественно эритроидного ростка кроветворения) выступают стимуляция формирования de novo эритроидных и гранулоцитарных ГО, а также серотониновых и цитокиновых механизмов контроля пролиферации грануломоноцитарных предшественников.

Впервые продемонстрировано, что в условиях введения циклофосфана уменьшение депо катехоламинов потенцирует гранулоцитопоэзстимулирующий эффект Г-КСФ, а фармакологическая блокада постсинаптических серотониновых С2 рецепторов усиливает эритропоэзстимулирующее действие эритропоэтина при применении 5-фторурацила, что связано с опережающим восстановлением структурно-функциональной организации костного мозга (формирование ГО).

В условиях оптимальной жизнедеятельности организма (интактные животные) in vitro установлена стимуляция дофамином роста колоний преимущественно грануломоноцитарного типа, серотонином – эритроидного типа.

Истощение in vivo депо катехоламинов приводит к уменьшению выхода КОЕ-ГМ под действием Г-КСФ, мезатона и изадрина, но стимулирует in vitro образование КОЕ-Э в культуре с эритропоэтином и адреномиметиками. Нарушение дофаминовой медиации в ЦНС избирательно уменьшает число гранулоцитарно-макрофагальных колоний (in vitro дофамин), фармакологическая блокада постсинаптических серотониновых С2 рецепторов мозга угнетает эритроидное колониеобразование (in vitro серотонин).

Практическое значение работы. Показана важная роль адренергической, дофаминергической и серотонинергической систем в развитии миелосупрессии и регенерации костномозговой ткани в условиях цитостатических воздействий, выявлены основы регуляторного влияния центральных моноаминергических структур на коммитированные кроветворные клетки-предшественники и гемопоэзиндуцирующее микроокружение. Полученные данные вносят существенный вклад в понимание специфических моноаминергических механизмов контроля эритропоэза и гранулоцитопоэза при моделировании миелосупрессии введением цитостатиков с различным механизмом действия. 

Результаты экспериментального исследования дают возможность определить патогенетически обоснованные методы фармакологической коррекции гипопластических состояний кроветворения с помощью лекарственных средств, модулирующих активность центральных и периферических моноаминергических структур.

Материалы по доклиническому исследованию препарата гранулоцитарного колонистимулирующего фактора нейтростима, разработанного НИИ фармакологии СО РАМН совместно с ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» (Новосибирск), были представлены в Фармакологический комитет МЗ и СР РФ, получено разрешение на его клиническое применение и производство (РУ № ЛСР – 010185/08).

Апробация работы. Материалы диссертационной работы докладывались и обсуждались на научных конференциях НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН: «Актуальные проблемы фармакологии и фармакотерапии» (Томск, 1996), конференции фармакологов Сибири и Дальнего Востока, посвященной 15-летию НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН (Томск, 1999), «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической фармакологии» (Томск, 2001, 2002), «Актуальные проблемы фармакологии» (Томск, 2004); на V, VI,  VIII, VIV Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 1998, 1999, 2001, 2002), на конференции молодых ученых СО РАМН “Фундаментальные и прикладные проблемы современной медицины” (Новосибирск, 2000); на Международной научной конференции “Поиск, разработка и внедрение новых лекарственных средств и организационных форм фармацевтической деятельности” (Томск, 2000); на XII международной конференции по космической биологии и авиакосмической медицине (Москва, 2002); на конференции “Актуальные вопросы экспериментальной и клинической морфологии” (Томск, 2002); на 4-ом съезде физиологов Сибири (Новосибирск, 2002); на XIX съезде Физиологического общества им. И.П. Павлова (Екатеринбург, 2004); на конференции «Фармакологическая регуляция стволовой клетки» (Томск, 2005); на 4-ой Международной конференции «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам» (Москва, 2006); на Республиканской научной конференции «Создание новых лекарственных препаратов» (Томск, 2007); на конференции «Проблемы онкофармакологии» (Томск, 2008).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 60 работ, из них 21 – в журналах, рекомендованных «Перечнем ...» ВАК Минобрнауки России.

Получены патент (RU) № 2317541 «Способ изучения гемопоэза с учетом особенностей высшей нервной деятельности» (опубл. 20.02.2008 г., Бюл. № 5) и решение о выдаче патента «Средство, препятствующее развитию депрессии эритроидного ростка кроветворения при цитостатических миелодепрессиях» (№ 2007137872/15(041423) от 12.09.2008 г.).

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 492 страницах машинописного текста, иллюстирована  39 рисунками, 147 таблицами и состоит из введения, 4 глав, выводов, списка цитируемой литературы, включающего 650 источников, из них 222 отечественных и 428 зарубежных.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты проведены на 4835 мышах-самцах линии СВА/CaLac в возрасте 2–2,5 месяцев, массой 18–20 г. Животные 1 категории (конвенциональные линейные мыши) получены из коллекционного фонда отдела экспериментальных биологических моделей НИИ фармакологии СО РАМН (сертификат имеется).

Цитостатическую миелосупрессию моделировали однократным внутрибрюшинным введением алкилирующего агента циклофосфана («Биохимик», Саранск) либо фторпиримидинового антиметаболита 5-фторурацила (химфармобъединение «Дарница», Украина) в 1/3 максимально переносимой дозы (МПД), составившей по результатам пробит-анализа 83,3 и 76 мг/кг соответственно. За 30 минут до цитостатического воздействия животным опытных групп однократно внутрибрюшинно вводили симпатолитик резерпин (“Polfa”, Польша) в дозе 2 мг/кг, нейролептик галоперидол (“Gedeon Richter A.O.”, Венгрия) – 3 мг/кг, антисеротониновый препарат ципрогептадин (“Serwa”, Германия) – 30 мг/кг. На следующий день после введения цитостатиков 1 раз в сутки в течение 5 дней мышам подкожно вводили препарат негликозилированного гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека нейтростим (разработан НИИ фармакологии СО РАМН совместно с ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор», Новосибирск) в дозе 100 мкг/кг и препарат эритропоэтина эпоэтин-бета (рекормон, “Hoffman-La Roche Ltd.”, Швейцария) – 10 ЕД на мышь массой 20 г. Конечная концентрация альфа-адреномиметика мезатона (Опытный завод ГНЦЛС, Харьков, Украина), бета-адреномиметика изадрина («Sigma», США); серотонина («Sigma», США) и дофамина («Sigma», США) в полной культуральной среде составляла 10-8 М; Г-КСФ и рекормона  – 10-8 М, 10-9 М.

Контрольным животным во всех сериях экспериментов в аналогичных условиях вводили эквивалентный объем (0,2 мл) физиологического раствора. Фоновые показатели получали при использовании интактных животных. Мышей забивали на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 и 12-е сутки после введения цитостатиков методом дислокации шейных позвонков.

Показатели периферической крови и костномозгового кроветворения определяли общепринятыми методами [Гольдберг Е.Д. и др., 1992]. Содержание коммитированных клеток-предшественников эритропоэза (КОЕ-Э, КлОЕ-Э) и грануломоноцитопоэза (КОЕ-ГМ, КлОЕ-ГМ) в костном мозге изучали in vitro методом клонирования миелокариоцитов в полувязкой культуральной среде. Интенсивность созревания эритроидных и гранулоцито-макрофагальных прекурсоров определяли по величине индекса созревания (отношение числа кластеров к количеству колоний, выросших в той же лунке). Исследование пролиферативной активности предшественников эритро- и грануломоноцитопоэза производили с помощью метода “клеточного самоубийства” с использованием гидроксимочевины. Структурно-функциональную организацию костного мозга исследовали путем ферментативного выделения гемопоэтических островков (ГО) и последующей оценки их количественного и качественного состава. Эритропоэтическую (ЭПА) и колониестимулирующую (КСА) активности тестировали микрометодом в 96-луночных планшетах. ЭПА и КСА выражали количеством выросших эритроидных и гранулоцито-макрофагальных колоний (на 105 миелокариоцитов) [Гольдберг Е.Д. и др., 1992]. Статистическую обработку полученных результатов проводили методами вариационной статистики с использованием программного обеспечения IBM. В случаях нормального распределения признаков для статистической оценки применяли параметрический t-критерий Стьюдента. При больших отклонениях распределений признака от нормального вида для независимых выборок использовали непараматрический критерий Уилкоксона-Манна-Уитни [Урбах В.Ю., 1975; Гублер Е.В., 1978]. Для оценки степени связи между признаками использовался двумерный корреляционный анализ. Влияние цитостатического воздействия либо препаратов (факторов) на изменения признака исследовали с помощью факторного анализа по критерию Фишера [Лакин Г.Ф., 1990; Мендрина Г.И. и др., 2004] и линейного пошагового дискриминантного анализа Фишера [Seredenin S.B. et al., 1986; Мендрина Г.И. и др., 2004]. В работе использовался также интегральный показатель, характеризующий изменение показателей системы крови в определенный интервал времени [Новицкий В.В. и др., 1990; Гольдберг Е.Д. и др., 1997].

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

На первом этапе исследования изучались регенераторные возможности кроветворной ткани экспериментальных животных при назначении цитостатиков в 1/3 МПД.

Однократное введение циклофосфана вызывало выраженное угнетение гемопоэза. Так, под влиянием алкилирующего агента отмечалось резкое уменьшение общего количества кариоцитов (ОКК) на 1–5-е сутки опыта с последующей нормализацией клеточности костного мозга (6, 7-е сутки). Динамика содержания незрелых и зрелых форм нейтрофильных гранулоцитов, лимфоидных и эритроидных элементов в целом соответствовала изменениям ОКК. Вместе с тем, интенсивность восстановления числа нейтрофилов в кроветворной ткани значительно опережала таковую лимфоцитов и эритрокариоцитов. Миелосупрессия, вызванная введением алкилирующего агента, сопровождалась соответствующими изменениями в динамике содержания клеточных элементов изучаемых ростков в периферической крови. В частности, уже на 1-е сутки имело место статистически достоверное снижение количества палочкоядерных и сегментоядерных нейтрофильных лейкоцитов. Рост уровня палочкоядерных нейтрофилов регистрировался на 4–7-е сутки наблюдения, сегментоядерных нейтрофилов – на 6, 7-е сутки, причем на 4,5-е сутки опыта содержание молодых форм нейтрофильных гранулоцитов статистически достоверно превосходило исходные значения. На 1–5-е сутки после введения циклофосфана обнаруживалось развитие выраженной ретикулоцитопении в периферической крови, однако к 6-м суткам выявлялась тенденция к возрастанию числа незрелых эритроидных клеток, а на 7-е сутки их содержание не отличалось от уровня интактного контроля.

Для животных, получавших 5-фторурацил, была характерна более выраженная ингибиция костномозгового кроветворения, чем в случае назначения ЦФ. Так, статистически достоверное снижение числа незрелых и зрелых форм нейтрофильных гранулоцитов, моноцитов и лимфоцитов регистрировалось на 1–7-е сутки опыта. При этом наименьшее содержание указанных форм миелокариоцитов было выявлено на 2, 3, 4-е сутки исследования. Вслед за периодом депрессии имело место накопление клеток системы мононуклеарных фагоцитов и нейтрофильных гранулоцитов (8–12-е сутки). Увеличение числа лимфоидных элементов в кроветворной ткани на 8, 9, 10-е сутки опыта сменялось новым снижением их количества на 11, 12-е сутки. В отличие от белой крови, угнетение эритропоэза наблюдалось на протяжении всего периода исследования. Отражением состояния костномозгового кроветворения при введении антиметаболита являлась картина периферической крови. Так, уменьшение содержания палочкоядерных (1–5, 7, 9–10-е сутки) и сегментоядерных (1, 3–8-е сутки) нейтрофилов, лимфоцитов (1–4, 8–10-е сутки) и моноцитов (1–4-е сутки) в периферической крови приводило к развитию выраженной лейкопении (1–5, 6–10-е сутки). Интенсивное увеличение клеточности белой крови отмечалось на 11, 12-е сутки эксперимента. Вслед за ретикулоцитопенией (1–7-е сутки) и восстановлением содержания незрелых эритроидных клеток (8–10-е сутки) имело место падение числа ретикулоцитов (11-е сутки), которое вновь возрастало к окончанию исследования (12-е сутки).

Таким образом, однократное введение цитостатиков в 1/3 МПД вызывает развитие гипоплазии костного мозга, лейкопению и ретикулоцитопению в периферической крови у мышей линии CBA/CaLac. Нарушения в гемопоэтической ткани при инъекции 5-фторурацила более глубокие и продолжительные, чем в случае использования циклофосфана. Обращает на себя внимание различная чувствительность ростков кроветворения к действию цитостатических агентов. В частности, темпы регенерации эритропоэза в значительной степени уступают интенсивности восстановления клеточности гранулоцитарного ростка кроветворения (табл. 1).

Таблица 1

Сроки ингибиции и регенерации костномозгового гемопоэза мышей линии CBA/CaLac при цитостатических воздействиях

Циклофосфан

5-фторурацил

Ингибиция

Регенерация

Ингибиция

Регенерация

Гранулоцитопоэз

1–3-и сутки

4–7-е сутки

1–7-е сутки

8–12-е сутки

Эритропоэз

1–5-е сутки

6, 7-е сутки

1–11-е сутки

12-е сутки

При гипопластических состояниях (облучение, гипоксия, введение цитостатиков) глубина поражения и интенсивность процессов регенерации кроветворной ткани во многом определяется функциональной активностью коммитированных прекурсоров гемопоэза [Гольдберг Е.Д. и др., 1991, 2001, 2002, 2006, 2007]. С использованием культуральных методов проведено изучение воздействия in vitro -адреномиметика мезатона, -адреномиметика изадрина, дофамина и серотонина на темпы деления и созревания эритроидных и грануломоноцитарных предшественников мышей линии CBA/CaLac в условиях оптимальной жизнедеятельности и введения цитостатических препаратов в сравнении с препаратами эритропоэтина и гранулоцитарного КСФ.

Установлено, что периферические катехоламины и серотонин, наряду с эритропоэтином и гранулоцитарным КСФ, оказывают стимулирующее действие на формирование колоний эритроидного и гранулоцитарно-макрофагального типов в культуре неадгезирующих миелокариоцитов интактных животных. При этом в рассматриваемой модели кроветворения степень индукции роста КОЕ гемопоэтическими факторами роста в концентрации близкой к физиологической (10-8 М) существенно превосходит таковую в тест-системах с адреномиметиками, дофамином либо серотонином.

В условиях введения циклофосфана эритропоэтин и лиганды, действующие в области моноаминергических рецепторов, неоднозначно влияли на функциональную активность эритроидных предшественников in vitro. Так, добавление в культуру неадгезирующих миелокариоцитов ЭП (10-9 М) (контрольная группа) вызывало усиление образования КОЕ-Э на протяжении всего периода наблюдения. Рост эритроидных колоний в метилцеллюлозной среде с препаратами аминов регистрировался менее продолжительно (1, 3, 5-е сутки). В экспериментах с оксимочевиной было обнаружено, что при стимуляции -адренергических структур интенсивность входа КОЕ-Э в S-фазу клеточного цикла в значительной степени превышала таковую в тест-системе с ЭП. В то же время в группах с мезатоном, дофамином и серотонином значение показателя было ниже, чем в контроле с эритропоэтином. Между тем, скорость созревания эритроидных клеток под влиянием лигандов моноаминергической природы в разы превосходила темпы дифференцировки в случае внесения в метилцеллюлозную среду ЭП. При этом изадрин и мезатон оказывали более выраженное стимулирующее воздействие на указанный процесс по сравнению с серотонином  и дофамином.

В условиях назначения 5-фторурацила препарат эритропоэтина in vitro статистически достоверно увеличивал митотическую активность прекурсоров эритропоэза (5, 7-е сутки). Существенное эритропоэзстимулирующее действие оказывал и изадрин. Интересно отметить, что на 1-е сутки функциональная активность прекурсоров эритропоэза в группе с -адреномиметиком превосходила таковую в контроле с ЭП. Дофамин статистически достоверно увеличивал число митотически активных КОЕ-Э на 1-е сутки, но уже к 5-м суткам величина показателя составила 33 % от исходной. В этой группе индекс созревания эритроидных клеток угнетался на протяжении всего периода исследования. Продолжительная ингибиция деления и дифференцировки предшественников эритропоэза была обнаружена в тест-системах с мезатоном и серотонином (3, 5, 7-е сутки).

Несколько иные закономерности были выявлены при изучении прямого действия Г-КСФ и моноаминергических лигандов на пул грануломоноцитарных предшественников в условиях цитостатической миелосупрессии. Так, при введении алкилирующего агента физиологически активные вещества (за исключением дофамина) способствовали усилению формирования КОЕ-ГМ. В группах с цитокином и -адреномиметиком после ингибиции деления  на 1-е сутки отмечалось значительное расширение пула находящихся в S-фазе клеточного цикла грануломоноцитарных предшественников. Серотонин, изадрин и дофамин также увеличивали пролиферативную активность клеток гранулоцитарного ряда, причем величина показателя значительно превосходила таковую в контроле с Г-КСФ. Скорость созревания грануломоноцитарных прекурсоров при внесении в культуру изадрина, дофамина и серотонина также возрастала. В то же время в тест-системе с мезатоном величина соотношения КлОЕ-ГМ/КОЕ-ГМ оказалась ниже исходного уровня на протяжении всего периода наблюдения. В группе с Г-КСФ падение индекса дифференцировки на 1-е сутки опыта сменялось его увеличением на 3, 5, 7-е сутки.

В условиях назначения фторпиримидинового антиметаболита характер сдвигов изучаемых процессов в отделе прекурсоров грануломоноцитопоэза был отличен от обнаруженного при использовании циклофосфана. Так, формирование КОЕ-ГМ под влиянием Г-КСФ, изадрина и серотонина регистрировалось на 7-е сутки, а дофамина – на 5, 7-е сутки наблюдения. В этих условиях темпы деления предшественников грануломоноцитопоэза также возрастали, причем наиболее выражено при стимуляции дофаминовых структур. В контроле с цитокином индекс дифференцировки грануломоноцитарных клеток изменялся волнообразно: увеличение показателя на 3, 7-е сутки и снижение на 5-е сутки эксперимента. Стимуляция in vitro -адренергических (7-е сутки), дофаминергических (3, 5-е сутки) и серотонинергических (3-и сутки) структур вызывала существенное возрастание индекса созревания. Отдельно в ряду исследуемых физиологически активных веществ стоял мезатон, так как его внесение в тест-систему угнетало функциональную активность гранулоцитарно-макрофагальных прекурсоров на протяжении всего периода исследования.

Таким образом, в культуре неприлипающих клеток костного мозга мышей линии CBA/CaLac, перенесших цитостатическое воздействие, мезатон, изадрин, дофамин и серотонин наряду с гемопоэтическими факторами роста оказывают влияние на интенсивность образования КОЕ, а также темпы деления и скорость созревания прекурсоров гемопоэза. Из этого следует, что периферические моноамины являются неотъемлемой частью системы локальной регуляции коммитированных кроветворных предшественников.

Обращает на себя внимание то обстоятельство, что в динамике развития цитостатической болезни уровень ответа кроветворных клеток при внесении в тест-систему физиологически активных веществ моноаминергической природы или Г-КСФ и ЭП меняется не только количественно, но и качественно. В этой связи, далее нами был рассмотрен вопрос об избирательной чувствительности процессов деления и созревания прекурсоров гемопоэза к тому или иному стимулу в динамике развития цитостатической болезни. При этом в качестве дополнительных методов обработки результатов использовались интегральный показатель (ИП) и методы многомерной статистики (факторный, дискриминантный и кластерный анализы), что, в конечном итоге, позволило дополнить изучаемые процессы новыми характеристиками.

При цитостатических миелосупрессиях ИПSКОЕ-ГМ в группах с Г-КСФ, дофамином, изадрином и серотонином существенно превосходил интегральный показатель в соответствующих контрольных группах. Однако детальный анализ результатов культуральных исследований методами многомерной статистики позволил установить, что характер стимуляции пролиферации КОЕ-ГМ лигандами был различен. Так, использование метода К-средних позволило обнаружить, что препараты формировали 3 кластера. В первый вошли цитокин и дофамин, длительно поддерживающие высокий темп деления гранулоцитарно-макрофагальных предшественников (3–7-е сутки). Второй образовали изадрин и серотонин, способствующие кратковременному усилению роста митотической активности КОЕ-ГМ (3-и сутки). Отдельно в ряду исследуемых физиологически активных веществ стоял мезатон (кластер № 3), так как стимуляция -адренергических структур in vitro приводила к падению числа КОЕ-ГМ в S-фазе клеточного цикла. Результаты факторного анализа позволили говорить о межмодельных различиях в действии колониестимулирующего фактора и моноаминергических лигандов, так как в случае ЦФ наибольший вклад в структуру первой компоненты вносил дофамин (k=0,901) (дофамин > мезатон > Г-КСФ, при этом не следует забывать об ингибирующем действии -адреномиметика), а в условиях введения 5-ФУ – изадрин (k=0,955) (изадрин > Г-КСФ > серотонин > дофамин).

Ингибиция гранулоцитопоэза, вызванная ЦФ, сопровождалась избирательным увеличением дифференцировки в группах с Г-КСФ (ИПИД-ГМ3-и сутки=350 %) и изадрином (ИПИД-ГМ3-и сутки=150 %). В период миелосупрессии, вызванной введением 5-ФУ, отмечалась последовательная смена чувствительности созревания гранулоцитарно-макрофагальных прекурсоров к регуляторному влиянию физиологически активных веществ: при стимуляции серотонинергических структур показатель возрастал на 1-е сутки (ИПИД-ГМ=200 %), в тест-системе с дофамином – на 3–5-е сутки (ИПИД-ГМ=183 %), под влиянием цитокина – на 5-е сутки (ИПИД-ГМ=200 %). В сроки регенерации ростка при назначении алкилирующего агента практически все исследуемые препараты (исключение составил мезатон) увеличивали ИП. Как показал дискриминантный анализ, по выраженности эффекта лиганды расположились в следующем порядке: дофамин > изадрин > Г-КСФ > серотонин. В случае антиметаболита ИПИД-ГМ7-е сутки в группе с серотонином составил 200 %, а при стимуляции -адренергических структур – 266 %. Показательно то обстоятельство, что в обеих моделях миелосупрессии на фоне снижения ИПИД-ГМ1-7-е сутки при применении мезатона in vitro значения факторных нагрузок достаточно высоки (2 фактор). Вполне вероятно, что снижение скорости созревания прекурсоров грануломоноцитопоэза имеет ведущее значение в патогенезе нейтрофильной лейкопении (в силу усугубления катехоламинами токсического действия цитостатиков на кроветворные предшественники – -адренергический механизм).

Как уже подчеркивалось выше, при цитостатических воздействиях изадрин, эритропоэтин и дофамин способны поддерживать высокие темпы деления эритроидных прекурсоров (ИПизадрин > ИПЭП > ИПдофамин). Однако по типу действия только препарат эритропоэтина и -адреномиметик следует отнести к одной группе, так как внесение в тест-систему дофамина в конце исследования угнетало процесс. Различный характер стимуляции лигандами подтверждался методом К-средних: изадрин и ЭП входят в состав одного кластера. Метод главных компонент позволил установить, что в условиях введения алкилирующего агента пролиферация предшественников эритропоэза более изменчива при -адренергической стимуляции, о чем свидетельствует превосходство факторных нагрузок в опыте с изадрином (2 фактор; k=0,952) над выявленными в контроле с эритропоэтином (2 фактор; k=0,828). Подобная картина была обнаружена при назначении фторпиримидинового антиметаболита. Итак, прямое воздействие на -адренергические структуры приводит к большей стимуляции деления эритроидных клеток, чем внесение ЭП.

Существенные межмодельные различия проявились в случае прямого действия мезатона и серотонина. Указанные лиганды избирательно угнетали пролиферативную активность эритроидных прекурсоров при назначении 5-фторурацила и не влияли на ИПSКОЕ-Э при введении циклофосфана.

В условиях гипоплазии, вызванной ЦФ, эритропоэтин и лиганды моноаминергической природы значительно увеличивали индекс созревания эритроидных клеток. По данным линейного пошагового дискриминантного анализа по эффективности действия стимуляторы расположились следующим образом: изадрин > мезатон > серотонин > дофамин > эритропоэтин. Причем адреномиметики и серотонин формируют кластер № 1, ЭП и дофамин вошли в состав кластера № 2. При назначении 5-ФУ стимуляция in vitro специфических -адренергических, серотонинергических, дофаминергических и эритропоэтинчувствительных структур угнетала дифференцировку прекурсоров эритропоэза. Наиболее выраженная ингибиция наблюдалась при внесении в культуру дофамина и серотонина. При этом если значения факторных нагрузок для серотонина (1 фактор; k=0,984) и дофамина (1 фактор; k=0,929) были существенно высоки, то коэффициенты корреляции в группах с адреномиметиками и ЭП не прошли редукцию данных.

Итак, использование многомерного статистического анализа позволило установить, что реализация токсического действия цитостатиков на гемопоэтические прекурсоры во многом опосредована через периферические -адренергические механизмы (табл. 2). При этом необходимо отметить способность серотонина и дофамина избирательно угнетать процессы в отделе предшественников эритропоэза (более выражено при введении фторпиримидинового антиметаболита).

Таблица 2

Лиганды, снижающие пролиферативную активность и интенсивность дифференцировки кроветворных предшественников при цитостатических воздействиях

Циклофосфан

5-фторурацил

Ингибиция

Регенерация

Ингибиция

Регенерация

Грануломоноцитарные предшественники

Пролиферация

Г-КСФ

мезатон

мезатон

мезатон

Дифференцировка

Г-КСФ, мезатон

Эритроидные предшественники

Пролиферация

дофамин

мезатон

серотонин дофамин

мезатон

серотонин

Дифференцировка

мезатон

серотонин дофамин

эритропоэтин

мезатон

серотонин дофамин

мезатон

серотонин дофамин

По-видимому, сокращение пула митотически активных КОЕ в сроки развития миелосупрессии является следствием усиления катехоламинами (-адренергические и дофаминергические механизмы) и серотонином проапоптозного действия алкилирующего агента и антиметаболита. Это предположение подтверждается результатами ряда исследований, свидетельствующих об индукции и/или модуляции апоптоза гемопоэтических клеток серотонином [Betten A. et al., 2001; Yang M. et al., 2007] и катехоламинами [Cioca D.P., Watanabe N., Isobe M., 2000; Josefsson E. et al., 2000; Lang P.A. et al., 2005], в том числе дофамином [Sookhai S. et al., 1996; Barzilai A. et al., 2000; Colombo C. et al., 2003; Lakshmi C. et al., 2005]. Можно полагать, что Г-КСФ на 1-е сутки после введения циклофосфана обладает схожим механизмом действия.

В период регенерации “насыщение” гемопоэтической ткани зрелыми кроветворными клетками, вероятно, приводит к запуску аминергических механизмов, сдерживающих деление КОЕ. Следует заметить, что приведенная гипотеза не является абсолютной. Известно, что клетки костного мозга, имеющие фенотип Thy 1,2+, играют важную роль в контроле процессов репарации поврежденного цитостатиками (циклофосфан, 5-фторурацил, адриамицин) гемопоэза [Гольдберг Е.Д. и др., 1999, 2002]. Причем стимуляция T-клетками роста кроветворных прекурсоров, как прямая, так и опосредованная взаимодействием с адгезирующими элементами, зависит не столько от количества клеток микроокружения в костном мозге экспериментальных животных, сколько от их функционального состояния. По всей видимости, лиганды -адренергической, дофаминергической и серотонинергической природы способны модулировать активность лимфоцитов при гипопластических состояниях, которые наряду с кроветворными предшественниками представлены в супернатантах неадгезирующей фракции миелокариоцитов. Исходя из этого, правильнее говорить не только о прямом, но и о непрямом – через ингибирующие факторы лимфоидных клеток, супрессирующем действии мезатона, дофамина и серотонина на гемопоэтические клетки. Веским подтверждением такового заключения служит обнаруженная рядом исследователей чувствительность лимфоцитов к катехоламинам [Bosing-Schneider R., Haug M., 1976; Федоров Н.А., 1979; Depelchin A., Letesson J.J., 1981; Miles K. et al., 1984; Харкевич Д.Д., 1989] и снижение их секреторной активности адреноблокаторами [Гольдберг Е.Д.и др., 1997].

Отдельно следует остановиться на группе лигандов, способных увеличивать темпы деления эритроидных (изадрин, эритропоэтин) и гранулоцитарно-макрофагальных (дофамин, изадрин, серотонин, Г-КСФ) предшественников (табл. 3).

Таблица 3

Лиганды, стимулирующие пролиферативную активность и интенсивность дифференцировки кроветворных предшественников при цитостатических воздействиях

Циклофосфан

5-фторурацил

Ингибиция

Регенерация

Ингибиция

Регенерация

Грануломоноцитарные предшественники

дофамин > изадрин > серотонин > Г-КСФ

Эритроидные

предшественники

изадрин > эритропоэтин > дофамин

эритропоэтин

дофамин

Феномен повышения чувствительности кроветворных клеток к физиологически активным веществам in vitro имеет место не только в сроки увеличения содержания морфологически распознаваемых нуклеаров в костном мозге и периферической крови, но и в период миелосупрессии. По-видимому, причину этого противоречия следует искать в нарушении функций клеточных элементов ГИМ, препятствующих реализации пролиферативно-дифференцировочного потенциала прекурсоров гемопоэза в рамках целостного организма. Кроме того, возможная супрессия цитостатиками периферической нейрональной секреции указанных аминов также способна задерживать репарацию кроветворной ткани.

В заключение этого раздела работы мы попытались объяснить разный  тип реагирования (угнетение, стимуляция) прекурсоров на внесение в культуру препаратов аминов и ростовых факторов. Учитывая гетерогенность популяции коммитированных кроветворных предшественников [Натан Д.Г., Зифф К.А., 1994; Воробьев А.И., 2002], следует говорить о клетках чувствительных и резистентных к цитостатикам. Существование последних дает возможность реализации программы восстановления кроветворной ткани при чрезвычайных воздействиях. Выявленное в ходе исследования преимущество стимулирующих эффектов физиологически активных веществ in vitro в случае назначения алкилирующего агента над таковыми в условиях введения антиметаболита, указывает на то, что токсичность противоопухолевых препаратов во многом регламентирует величину популяций чувствительных и резистентных прекурсоров эритроидного и грануломоноцитарного типа, и, как следствие, скорость регенерации эритроидного и гранулоцитарного ростков кроветворения.

Следующий раздел работы был посвящен особенностям локальной регуляции кроветворения при цитостатических воздействиях.

Введение алкилирующего агента снижало общее количество ГО в костном мозге на 1–5, 7-е сутки исследования, что было связано с нарушением процессов формирования клеточных комплексов с центрально расположенным макрофагом (1–7-е сутки) и стромальной клеткой (1–5-е сутки). Анализ цитограмм позволил выявить снижение числа ассоциаций эритроидного типа на протяжении всего периода исследования. Дефицит смешанных ГО в кроветворной ткани сохранялся менее продолжительно: к 7-м суткам их содержание практически нормализовалось. Наиболее быстро восстанавливалось содержание гранулоцитарных клеточных комплексов.

Циклофосфан нарушал продукцию колониестимулирующей активности клетками кроветворного микроокружения на протяжении всего периода исследования. В то же время уровень сывороточной КСА возрастал на 1, 3, 7-е сутки наблюдения, однако только на 1-е сутки величина показателя в опыте статистически достоверно превосходила таковую в интактном контроле. Секреция эритропоэтической активности миелокариоцитами увеличивалась к 7-м суткам, тогда как изменения уровня ЭПА в сыворотке крови были незначительными.

Под влиянием фторпиримидинового антиметаболита отмечалось более выраженное, чем при ЦФ, угнетение процессов формирования ГО в костном мозге. Так, статистически достоверное уменьшение содержания клеточных комплексов с центрально расположенным макрофагом и стромальным элементом регистрировалось дважды: на 1–5-е и 8–10-е сутки опыта. На 6, 7-е и 12-е сутки исследования отмечалось увеличение абсолютного числа клеточных ассоциаций. Причем если в указанные сроки количество макрофагположительных комплексов нормализовалось, то интенсивность формирования фибробластоидных ГО существенно превосходила исходный уровень. Динамика содержания эритроидных, гранулоцитарных и эритро-гранулоцитарных гемопоэтических островков в целом повторяла таковую в случае с макрофаг- и фибробластсодержащими ассоциациями. Обращало на себя внимание то обстоятельство, что интенсивность восстановления структурно-функциональной организации гранулоцитарного компартмента кроветворения значительно опережала скорость образования эритроидных ГО.

После назначения 5-фторурацила отмечалось резкое увеличение секреции эритропоэтической активности адгезирующими (1, 3-и сутки) и неадгезирующими (1-е сутки) клетками кроветворного микроокружения. Продукция КСА миелокариоцитами в указанные сроки, напротив, нарушалась. Антиметаболит не влиял на уровень сывороточного ЭПА на протяжении всего периода исследования, но способствовал стимуляции гранулоцитарно-макрофагального колониеобразования гуморальными ростовыми факторами, полученными на 1-е сутки эксперимента.

Совокупность выявленных феноменов позволяет сделать вывод о том, что повреждение структурно-функциональной организации кроветворной ткани, нарушение продукции гемопоэтических факторов роста клеточными элементами ГИМ играют существенную роль в развитии депрессии костномозгового кроветворения, лейкопении и ретикулоцитопении в периферической крови мышей линии CBA/CaLac в условиях введения цитостатиков в 1/3 МПД. Более глубокая и продолжительная ингибиция гемопоэза у животных, получавших 5-фторурацил, обусловлена значительным токсическим действием антиметаболита на формирование ГО и секрецию КСА. Постцитостатическая регенерация эритрона и белой крови связана с восстановлением функций стромальных и макрофагальных элементов ГИМ (образование ГО).

Дальнейшие эксперименты позволили расширить представления о взаимодействии аминов и клеток микроокружения в регуляции прекурсоров гемопоэза. ЦФ in vitro (20 мкг/мл) существенно снижал способность прилипающих клеток кроветворного микроокружения связывать интактные и обработанные эритропоэтином (10-9 М) эритроидные предшественники. Однако стимуляция -адренергических и серотонинергических структур соответственно изадрином и серотонином (10-8 М) на подвергнутых цитостатическому воздействию макрофагах препятствовала ингибиции эритроидного колониеобразования.

Известно, что при цитостатических воздействиях важная роль в регуляции гемопоэза принадлежит компонентам основного вещества соединительной ткани костного мозга (протеогликаны, гликозаминогликаны) [Дыгай А.М. и др., 1992; Гольдберг Е.Д. и др., 2007]. В связи с этим, нам представилось целесообразным изучить возможность восстановления подавленной цитостатиком  функциональной активности адгезирующих клеток ГИМ N-ацетилнейраминовой кислотой, которая входит в состав гликозаминогликанов (ГАГ), в комбинации  с лигандами моноаминергической природы.

Установлено, что в метилцеллюлозной среде N-ацетилнейраминовая кислота (50 мкг/мл) увеличивала способность подвергнутых прямому воздействию ЦФ (20 мкг/мл) прилипающих клеток ГИМ связывать обработанные изадрином или серотонином (10-8 М) эритроидные предшественники, что косвенно подтверждает участие сиаловой кислоты в периферических -адренергических и серотонинергических механизмах индукции пролиферации предшественников эритропоэза.

На основании данных литературы и результатов собственных экспериментальных исследований нами предложена схема участия периферических моноаминов и специфических рецепторов в регуляции кровообразования при цитостатических воздействиях (рис. 1). Периферические моноамины (нейрональной природы) оказывают стимулирующее влияние на резистентные к цитостатикам предшественники кроветворения как путем прямого воздействия на соответствующие плазматические рецепторы, так и опосредованно через клеточные элементы ГИМ. При этом ГАГ потенцируют действие цитокинов. В то же время следует учитывать, что стимулы моноаминергической природы (в основном -адренергические, серотонинергические) способны инициировать апоптическую гибель прекурсоров гемопоэза, чувствительных к цитостатикам.

Далее нами изучалась роль центральных адренергических, дофаминергических и серотонинергических структур в регуляции кроветворения. На первом этапе исследовалось регуляторное влияние моноаминов ЦНС на систему крови в условиях оптимальной жизнедеятельности мышей линии CBA/CaLac. Введение резерпина, галоперидола либо ципрогептадина вносило некоторые изменения в состояние костномозговой ткани и периферической крови экспериментальных животных. Однако обнаруженные сдвиги в подавляющем большинстве случаев статистически достоверно не отличались от соответствующих значений в интактном контроле.

Приведенные факты в целом подтверждают существующую точку зрения о том, что ЦНС не играет решающей роли в образовании клеток эритрона и белой крови в условиях сбалансированного гемопоэза. В норме преимуществен локальный контроль кроветворения [Гольдберг Е.Д. и др., 1992, 1996, 1999, 2002]. Однако результаты собственных культуральных исследований позволяют внести некоторые коррективы в известное положение. Установлено, что введение резерпина снижало интенсивность роста КОЕ-ГМ и усиливало формирование КОЕ-Э в культуре неадгезирующих миелокариоцитов. При этом в случае внесения в тест-систему адреномиметиков выраженность изменений величин показателей была более значительной, чем в опыте с эритропоэтином in vitro. Обращало на себя внимание избирательное угне-

тение антисеротониновым препаратом периферических серотониновых механизмов контроля активности эритроидных предшественников, а нейролептиком – опосредованный дофаминергическими структурами рост КОЕ-ГМ. Как видно, в рассматриваемой модели кроветворения прослеживается тропность эритроидных клеток к регуляторному влиянию центрального серотонина, а гранулоцитарно-макрофагальных прекурсоров – к дофаминовым структурам мозга.

Изучение зависимости восстановления подавленного цитостатиками костномозгового кроветворения от метаболизма катехоламинов ЦНС позволило выявить, что в условиях введения циклофосфана резерпин препятствовал снижению числа нейтрофильных (3, 5-е сутки) гранулоцитов в костном мозге. При этом препарат не влиял на динамику содержания клеток СМФ на протяжении всего периода исследования и усугублял депрессию эритропоэза на 4-е сутки эксперимента. Следует отметить накопление лимфоцитов на 2, 3-и сутки опыта и падение величины показателя на 6-е сутки. Системное введение симпатолитика препятствовало развитию нейтрофильной лейкопении (2, 4-е сутки) и ретикулоцитопении (2–4-е сутки) в периферической крови. В противоположность этому, лимфопения на 4-е сутки исследования усугублялась.

При последовательном назначении резерпина и 5-фторурацила регистрировалось кратковременное (4-е сутки) увеличение числа нейтрофильных гранулоцитов и лимфоцитов в гемопоэтической ткани. Однако в сроки активного восстановления гемопоэза симпатолитик уменьшал количество практически всех исследуемых морфологически распознаваемых миелокариоцитов: незрелых (8, 11-е сутки) и зрелых (11-е сутки) нейтрофилов, лимфоцитов (6, 9, 10-е сутки) и эритрокариоцитов (6, 9–11-е сутки). В периферической крови препарат уменьшал содержание сегментоядерных нейтрофилов (4, 11-е сутки), что приводило к усугублению нейтрофилопении на 4-е сутки эксперимента и отмене нейтрофилеза на 11-е сутки. Действие симпатолитика на периферическое звено лимфоидного ростка и эритрона было неоднозначно. Так, лимфопения на 1-е сутки и ретикулоцитопения на 1, 2, 6-е сутки в опыте были менее выражены, чем в цитостатическом контроле. С другой стороны, препарат усугублял лимфопению на 5, 8–11-е сутки и ретикулоцитопению на 8, 12-е сутки.

Итак, резерпин способствует восстановлению кроветворной ткани (преимущественно гранулоцитопоэза) при назначении циклофосфана и задерживает регенерацию гемопоэза в условиях введения 5-фторурацила (более эритроидного ростка кроветворения).

Учитывая используемую в работе дозу и механизм действия резерпина (преимущественное истощение депо норадреналина, дофамина и незначительно – серотонина в ЦНС), можно предположить, что катехоламины мозга усиливают токсическое действие алкилирующего агента на гемопоэтические клетки (табл. 4). В противоположность этому, при назначении антиметаболита норадреналин и дофамин способствуют стимуляции процессов репарации эритроидного и гранулоцитарного ростков кроветворения.

Таблица 4

Регуляторное влияние катехоламинов на систему крови мышей линии CBA/CaLac при цитостатических воздействиях (по результатам анализа ИП)

Циклофосфан

5-фторурацил

Ингибиция

Регенерация

Ингибиция

Регенерация

Эритропоэз

0

+

+

Гранулоцитопоэз

+ –

+

Примечание. Здесь и в таблицах 6, 8 увеличение количества клеток эритроидного и гранулоцитарного ростка кроветворения +, снижение –, изменений нет 0.

Как было продемонстрировано ранее, лиганды моноаминергической природы выступают в качестве элементов системы локальной регуляции гемопоэтических прекурсоров при цитостатических воздействиях. В этой связи, мы рассмотрели возможность действия резерпина на кроветворные клетки через периферические адренергические и дофаминергические структуры, систему КСФ и эритропоэтин.

В условиях назначения циклофосфана симпатолитик значительно снижал темпы деления прекурсоров эритропоэза. По чувствительности к супрессирующему действию резерпина периферические рецепторные механизмы, контролирующие активность процесса, расположились следующим образом: эритропоэтинчувствительные3,7-е сутки > адренергические3,7-е сутки > дофаминовые3,5-е сутки. При введении 5-фторурацила ЭП1,5,7-е сутки, дофамин1,3-и сутки и, в меньшей степени, -адренергические1-е сутки механизмы участвовали в реализации ингибирующего влияния симпатолитика на деление КОЕ-Э. На обеих моделях цитостатического воздействия резерпин угнетал (ЦФ > 5-ФУ) созревание эритроидных клеток в тест-системе с ЭП и изадрином (регенерация), а при назначении 5-фторурацила – дополнительно и в культуре с мезатоном (ингибиция).

Как это не парадоксально, но при цитостатических воздействиях фармакологическое истощение депо катехоламинов в ЦНС увеличивало интенсивность дифференцировки эритроидных клеток в группах с эритропоэтином, мезатоном и дофамином (преимущественно в период ингибиции), причем стимуляция процесса в случае с алкилирующим агентом превосходила таковую в условиях введения антиметаболита. В опыте с 5-ФУ регистрировался прирост ИПSКОЕ-Э: в культуре с мезатоном5,7-е сутки и изадрином3-и сутки .

Симпатолитик неоднозначно влиял на периферические механизмы регуляции предшественников грануломоноцитопоэза при цитостатических воздействиях. Так, при назначении циклофосфана препарат оказывал преимущественно стимулирующее действие на пролиферацию (дофамин1-7-е сутки, мезатон1-3-и сутки, Г-КСФ1-3-и сутки) и дифференцировку (мезатон1-7-е сутки, дофамин5,7-е сутки, Г-КСФ1-е сутки) КОЕ-ГМ. В угнетении функциональной активности гранулоцитарно-макрофагальных прекурсоров оказались задействованы -адренергические структуры и цитокин.

При применении 5-фторурацила резерпин снижал деление и созревание КОЕ-ГМ. В супрессирующем действии симпатолитика на прекурсоры участвовали дофаминергические структуры и Г-КСФ (весь период наблюдения) и адренергические механизмы (регенерация). Между тем, деструкция кроветворной ткани сопровождалась ростом темпов деления и созревания примитивных предшественников, сопряженных с адренергическими структурами.

Исходя из представленных выше данных, можно сделать заключение о том, что при цитостатических воздействиях катехоламины оказывают как ингибирующее, так и стимулирующее влияние (табл. 5). В частности, при развитии миелосупрессии, вызванной назначением фторпиримидинового антиметаболита, в сокращении пула митотически активных КОЕ-Э и КОЕ-ГМ задействованы исключительно адренергические структуры. В условиях введения алкилирующего агента развитие гипоплазии кроветворной ткани во многом связано с ингибицией -адренергических, дофаминергических и Г-КСФ-опосредованных механизмов регуляции прекурсоров грануломоноцитарного типа.

Таблица 5

Периферические механизмы ингибирующего и стимулирующего влияния катехоламинов на пролиферацию кроветворных предшественников при цитостатических воздействиях (по данным ИП)

Рецепторные механизмы

Циклофосфан

5-фторурацил

Ингибиция

Регенерация

Ингибиция

Регенерация

Грануломоноцитарные предшественники

система Г-КСФ

– –

+ +

+ +

+

-адренергические

0

– –

+

-адренергические

+ +

+ +

дофаминергические

+ +

+ +

Эритроидные предшественники

эритропоэтин

+ +

+ + +

+ + +

+ + +

-адренергические

0

0

+

-адренергические

+

+ +

0

дофаминергические

+ +

0

+ + +

0

Примечание. Здесь и табл. 7, 9 увеличение темпов пролиферации гемопоэтических прекурсоров +, снижение –, изменений нет 0.

Очевидно, что природа цитостатика во многом определяет характер взаимоотношения дистантных (катехоламины) и локальных (адренергические и дофаминергические структуры, ростовые факторы) механизмов, что, в свою очередь, регламентирует характер сдвигов в отделе прогениторных клеток крови. 

Вместе с тем, ряд феноменов, обнаруженных в культуре, достаточно трудно интерпретировать: стимуляцию центральными катехоламинергическими структурами деления гемопоэтических прекурсоров в условиях развития миелосупрессии и задержку входа КОЕ в S-фазу фазу в период регенерации костного мозга. Безусловно, создаваемые in vitro модели кроветворения не в состоянии воссоздать достоверной картины кроветворения в организме. Объяснение выявленным противоречиям, вероятно, находится, в том, что в рассматриваемые сроки клеточные элементы ГИМ (но не нейромедиаторные системы) являются ведущими структурами, определяющими  активность прогениторных клеток.

Дальнейшие эксперименты были направлены на изучение действия резерпина на ГИМ. Показано, что в условиях назначения алкилирующего агента препарат способствовал восстановлению структурно-функциональной организации кроветворной ткани, о чем свидетельствовало увеличение количества макрофагпозитивных (1–5-е сутки), фибробластных (1–4-е сутки), гранулоцитарных (1–4-е сутки), эритроидных (1, 2, 4, 5-е сутки) и смешанных (1–5-е сутки) гемопоэтических островков в костном мозге. Симпатолитик отменял высокий уровень сывороточной КСА (1-е сутки). При этом регистрировалась стимуляция секреции ЭПА адгезирующими клетками костного мозга (5, 7-е сутки).

Истощение депо катехоламинов препятствовало восстановлению структурно-функциональной организации костного мозга при назначении 5-фторурацила, о чем свидетельствовало уменьшение числа ГО с центрально расположенным макрофагом (6–8, 12-е сутки) и стромальным элементом (6, 7, 12-е сутки), а также клеточных ассоциаций гранулоцитарного (6, 7, 12-е сутки), эритроидного (6, 8, 9, 12-е сутки) и эритро-гранулоцитарного (6, 7, 9, 10, 12-е сутки) типа. Резерпин снижал высокий уровень ЭПА в кондиционных средах неадгезирующих клеток ГИМ и КСА в сыворотке крови (1-е сутки). В то же время продукция ЭПА адгезирующими миелокариоцитами и способность сывороточных ростовых факторов стимулировать эритроидное колониеобразование возрастали.

Таким образом, при введении циклофосфана увеличение клеточности гранулоцитарного и эритроидного ростков под влиянием резерпина связано с формированием de novo гемопоэтических островков в костном мозге и продукцией факторов роста КОЕ-Э адгезирующими миелокариоцитами. По-видимому, на этой модели миелосупрессии катехоламины сдерживают активность стромальных элементов кроветворного микроокружения (макрофаги, фибробласты). При применении 5-фторурацила еще большее нарушение симпатолитиком процессов формирования ГО и падение уровня сывороточного КСА и ЭПА в кондиционных средах неадгезирующих клеток на фоне увеличения секреции ЭПА прилипающими миелокариоцитами и уровня ЭПА в крови свидетельствует об избирательной чувствительности элементов ГИМ к регуляторному влиянию центральных аминов. Очевидно, в этих условиях катехоламины оказывают стимулирующее действие на процессы образования ГО и продукцию гемопоэтических факторов роста неприлипающими клетками ГИМ, но угнетают секрецию стимулирующих эритропоэз цитокинов прилипающими миелокариоцитами.

При изучении влияния блокады постсинаптических дофаминовых Д2 рецепторов галоперидолом на подавленный цитостатиками гемопоэз было обнаружено, что в условиях введения циклофосфана препарат препятствовал снижению числа эритрокариоцитов (3, 4, 5-е сутки) и клеток моноцит-макрофагального ряда (3, 5, 6-е сутки) в костном мозге. Действие нейролептика на гранулоцитарный росток было не столь однозначно. Если в ранние сроки наблюдения количество зрелых форм нейтрофильных гранулоцитов (1, 2, 3-и сутки) снижалось, то на 5, 6-е сутки эксперимента, напротив, регистрировалось увеличение их числа. В периферической крови галоперидол препятствовал развитию нейтрофилеза и ускорял выход ретикулоцитов из кроветворной ткани (6, 7-е сутки). Усугубление лимфопении на 1, 2-е сутки исследования сменялось на существенный прирост лимфоцитов на 7-е сутки.

В случае назначения 5-фторурацила системное введение нейролептика ускоряло восстановление гранулоцитопоэза и лимфопоэза, о чем свидетельствовало накопление в костном мозге нейтрофильных гранулоцитов и лимфоцитов на 5-е сутки исследования, а не на 6-е сутки, как в контрольной группе (без галоперидола). К концу исследования (6, 7-е сутки) интенсивность регенерации указанных ростков кроветворения в опыте падала и значительно уступала таковой в цитостатическом контроле. Действие галоперидола на эритроидный росток было ингибирующим, что подтверждалось отменой роста числа эритрокариоцитов на 6-е сутки исследования. В периферической крови блокада постсинаптических Д2 рецепторов в ЦНС препятствовала развитию нейтрофильной лейкопении на 2, 7-е сутки и увеличивала содержание ретикулоцитов на 5–7-е сутки после введения антиметаболита. В противоположность этому, представительство лимфоцитов в опыте снижалось (6, 7-е сутки).

Итак, галоперидол в условиях введения циклофосфана уменьшает клеточность гранулоцитарного ростка кроветворения и увеличивает скорость регенерации эритрона, при назначении 5-фторурацила способствует восстановлению гранулоцитопоэза и усугубляет депрессию эритрона (табл. 6). Исходя из этого, вполне допустимо, что дофаминергические структуры тканей мозга препятствуют развитию ингибиции костномозгового гранулоцитопоэза и еще более снижают активность эритропоэза в условиях введения алкилирующего агента. В случае 5-фторурацила просматривается обратная закономерность.

Таблица 6

Регуляторное влияние дофаминергических структур ЦНС на систему крови мышей линии CBA/CaLac при цитостатических воздействиях (по результатам анализа ИП)

Циклофосфан

5-фторурацил

Ингибиция

Регенерация

Ингибиция

Регенерация

Эритропоэз

0

+

Гранулоцитопоэз

+

0

0

Фармакологическая блокада постсинаптических дофаминергических Д2 рецепторов вызывала существенные изменения активности процессов в отделе кроветворных предшественников мышей линии CBA/CaLac, перенесших цитостатическое воздействие. Так, при введении ЦФ галоперидол снижал функциональную активность эритроидных предшественников в сроки развития миелосупрессии. В период регенерации кроветворной ткани пул митотически активных КОЕ-Э продолжал сокращаться, при этом скорость созревания эритроидных клеток, напротив, возрастала. В условиях введения 5-фторурацила нейролептик угнетал пролиферативную активность и интенсивность дифференцировки прекурсоров, связанных с системой эритропоэтина, и оказывал модулирующее (нормализующее) влияние на процессы, ассоциированные с периферическими дофаминергическими структурами.

Нейролептик уменьшал темпы деления гранулоцитарно-макрофагальных предшественников в сроки ингибиции гранулоцитопоэза и увеличивал их в период регенерации. При этом скорость созревания КОЕ-ГМ, сопряженная с системой КСФ, падала, а ассоциированная с дофамином – возрастала. При назначении 5-фторурацила нейролептик в целом задерживал цитокинзависимый рост темпов пролиферации и дифференцировки гранулоцитарно-макрофагальных прекурсоров, в опыте с дофамином стимуляция указанных процессов сменялась на умеренное снижение их активности.

Полученные данные позволяют утверждать, что при цитостатических воздействиях дофамин тканей мозга оказывает ингибирующее влияние на грануломоноцитарные клетки-предшественники (табл. 7). Причем если при назначении 5-фторурацила вход КОЕ-ГМ в S-фазу митотического цикла (миелосупрессия) затрудняет исключительно дофаминергическая стимуляция, то в случае введения циклофосфана в падении пролиферативной активности грануломоноцитарных прекурсоров (регенерация) задействованы структуры к дофамину и Г-КСФ.

Таблица 7

Периферические механизмы ингибирующего и стимулирующего влияния дофаминергической системы на пролиферацию кроветворных предшественников при цитостатических воздействиях (по данным ИП)

Рецепторные механизмы

Циклофосфан

5-фторурацил

Ингибиция

Регенерация

Ингибиция

Регенерация

Грануломоноцитарные предшественники

система Г-КСФ

+

+

+

дофаминергические

+

+

Эритроидные предшественники

эритропоэтин

+

+

+

+

дофаминергические

+

+

– +

0

Между тем, результатом взаимодействия дофаминергической системы с ЭП и системой КСФ может выступать увеличение темпов деления гемопоэтических прекурсоров (периферические дофаминергические структуры также не стали исключением). Подобное было обнаружено и при взаимодействии центральных катехоламинергических структур с гемопоэтическими факторами роста (эксперимент с резерпином): в случае назначения антиметаболита со стороны предшественников всех классов, при моделировании миелосупрессии алкилирующим агентом – КОЕ-Э. Во многом совпадают и сроки стимуляции деления катехоламинами в целом (эксперимент с резерпином) и дофамином в частности (эксперимент с галоперидолом). Сопоставление ИПSКОЕРезерпин и ИПSКОЕГалоперидол выявило, что глубина сдвигов показателя в случае введения симпатолитика и нейролептика различна. В этой связи возникает вопрос о вкладе норадреналина и дофамина тканей мозга в регуляцию гемопоэтинзависимого входа КОЕ в S-фазу митотического цикла. Анализ коэффициентов корреляции, прошедших редукцию данных (факторный анализ), позволил сделать следующие выводы. В условиях введения ЦФ выраженность эритропоэзстимулирующего эффекта дофамина превосходит активность адренергической системы в период развития миелосупрессии, но в сроки регенерации наблюдается обратное. При назначении 5-ФУ чувствительность системы КСФ к стимулирующему действию аминов расположилась следующим образом: дофамин > норадреналин. Со стороны пула эритроидных прекурсоров обнаруживается противоположная картина.

Введение нейролептика неоднозначно влияло на систему локальной регуляции кроветворения при цитостатических воздействиях. Препарат практически восстанавливал структурно-функциональную организацию гемопоэтической ткани на 1, 2, 4, 6-е сутки после введения ЦФ, о чем свидетельствовал существенный прирост числа гемопоэтических островков всех типов в указанные сроки. Некоторое снижение содержания макрофагпозитивных, гранулоцитарных (3, 5-е сутки), эритроидных (1-е сутки) и смешанных (3-и сутки) клеточных ассоциаций не умаляло стимулирующий эффект препарата. Галоперидол увеличивал продукцию ЭПА прилипающими миелокариоцитами (7-е сутки) и выход КОЕ-Э в культуре интактных клеток костного мозга под влиянием сыворотки крови, полученной на 1, 3, 5-е сутки после введения цитостатика. Вместе с тем, уровни КСА в биологических средах опытных животных не отличались от таковых в цитостатическом контроле.

Блокада постсинаптических Д2 рецепторов вносила определенные изменения со стороны динамики содержания макрофагпозитивных, содержащих стромальную клетку, эритроидных, гранулоцитарных и эритро-гранулоцитарных клеточных ассоциаций в костном мозге при назначении 5-фторурацила: отмечались периоды как увеличения, так и уменьшения величин показателей. Однако в целом нарушения процессов формирования ГО сохранялись (преимущественно комплексов эритроидного и смешанного типа) и регистрировались в те же сроки, что и в цитостатическом контроле (1–6-е сутки). Причем к концу исследования – 7-е сутки, ситуация усугублялась по причине отмены галоперидолом восстановления до уровня интактного контроля числа гемопоэтических островков. В этих условиях высокий уровень ЭПА в супернатантах неадгезирующих миелокариоцитов и КСА в сыворотке крови снижался (1-е сутки). В противоположность этому, продукция факторов роста КОЕ-ГМ адгезирующими миелокариоцитами возрастала (7-е сутки).

Итак, галоперидол способствует восстановлению активности процессов формирования ГО, секреции ЭПА адгезирующими клетками ГИМ и уровня сывороточной эритропоэтической активности при введении циклофосфана. В противоположность этому, при использовании 5-фторурацила нейролептик углубляет нарушение функциональной активности клеточных элементов ГИМ и снижает концентрацию сывороточного КСА. Судя по всему, центральные дофаминергические структуры мозга усугубляют повреждающее действие алкилирующего агента на адгезирующие нуклеары ГИМ, но препятствуют развитию деструктивных изменений в кроветворной ткани мышей, получавших фторпиримидиновый антиметаболит.

Далее нами изучалась роль серотонинергических структур мозга в регуляции кроветворения при цитостатических воздействиях. Нарушение серотониновой медиации в ЦНС ципрогептадином не оказывало существенного влияния на динамику содержания гранулоцитов, клеток моноцит-макрофагального ряда и лимфоцитов в костном мозге животных в условиях введения ЦФ на протяжении всего периода исследования. Количество эритрокариоцитов возрастало на 5-е сутки опыта, но на 7-е сутки отмечалось усугубление депрессии эритропоэза. В периферической крови антисеротониновый препарат отменял нейтрофильную лейкопению на 6-е сутки эксперимента, но вызывал еще больший, чем в цитостатическом контроле, дефицит лимфоцитов (2, 4, 6-е сутки). В свою очередь, число ретикулоцитов увеличивалось на 3, 5-е сутки, но к концу наблюдения вновь снижалось (6, 7-е сутки).

При назначении 5-ФУ ципрогептадин ускорял процессы регенерации эритроидного ростка кроветворения, о чем свидетельствовало накопление эритрокариоцитов в костном мозге (4, 6, 7, 12-е сутки) и ретикулоцитов в периферической крови (2, 4, 5, 6, 7, 12-е сутки). В то же время антисеротониновый препарат усугублял депрессию костномозгового гранулоцитопоэза на 3, 5, 7-е сутки опыта, а лимфопоэза – на 5-е сутки. В периферической крови имело место усугубление нейтрофильной лейкопении (2, 4, 5, 7-е сутки) и лимфопении (3–7, 12-е сутки). Следует отметить, что на 4, 6-е сутки эксперимента содержание нейтрофильных гранулоцитов и лимфоцитов в кроветворной ткани превосходило таковое в цитостатическом контроле.

Приведенные факты свидетельствуют о том, что при назначении циклофосфана ципрогептадин не оказывает существенного влияния на гранулоцитопоэз, при этом клеточность эритроидного ростка кроветворения в период миелосупрессии возрастает и падает в сроки регенерации. В условиях введения антиметаболита антисеротониновый препарат стимулирует эритропоэз, но снижает содержание нейтрофильных гранулоцитов в системе крови.

Учитывая механизм действия ципрогептадина, можно предположить, что серотонинергические структуры мозга способствуют развитию ингибиции костномозгового эритропоэза и ретикулоцитопении в периферической крови (более при назначении антиметаболита), но, вместе с тем, участвуют в процессах регенерации гранулоцитопоэза (преимущественно при введении 5-фторурацила) (табл. 8).

Таблица 8

Регуляторное влияние серотонинергических структур ЦНС на систему крови мышей линии CBA/CaLac при цитостатических воздействиях (по результатам анализа ИП)

Циклофосфан

5-фторурацил

Ингибиция

Регенерация

Ингибиция

Регенерация

Эритропоэз

0

– +

Гранулоцитопоэз

0

0

+

– +

Ципрогептадин подавлял сопряженные с эритропоэтином деление и созревание предшественников эритропоэза при назначении циклофосфана и 5-фторурацила. После введения алкилирующего агента ингибиции подвергались и ассоциированные с серотонинергическими структурами пролиферация и дифференцировка эритроидных клеток.

Антисеротониновый препарат в целом угнетал ассоциированные с Г-КСФ деление и созревание гранулоцитарно-макрофагальных клеток-предшественников (5-фторурацил > циклофосфан). Изменения активности процессов, сопряженных с периферическим серотонином, отличались от выявленных в тест-системе с цитокином. Если при введении антиметаболита падение индекса созревания КОЕ-ГМ сопровождалось ростом их пролиферативной активности, то в случае назначения алкилирующего агента ингибиция деления (миелосупрессия) сменялась на увеличение функциональной активности прекурсоров грануломоноцитопоэза (регенерация).

Из полученных результатов можно сделать вывод о том, что регуляторное влияние центральных серотонинергических структур на кроветворные клетки-предшественники осуществляется через эритропоэтин, систему КСФ и периферические серотонинергические структуры (табл. 9). Обращает на себя внимание, что в условиях назначения фторпиримидинового антиметаболита с ростовыми факторами связано преимущественно увеличение темпов деления кроветворных клеток. Причем анализ ИПSКОЕРезерпин, ИПSКОЕГалоперидол и ИПSКОЕЦипрогептадин позволил установить, что гемостимулирующий эффект серотонина превосходит таковой у катехоламинов. В противоположность этому, серотонинергические механизмы участвуют в ингибиции пролиферации КОЕ-ГМ.

Таблица 9

Периферические механизмы ингибирующего и стимулирующего влияния серотониновой системы на пролиферацию кроветворных предшественников при цитостатических воздействиях (по данным ИП)

Рецепторные механизмы

Циклофосфан

5-фторурацил

Ингибиция

Регенерация

Ингибиция

Регенерация

Грануломоноцитарные предшественники

система Г-КСФ

+

+

+

серотонинергические

+

0

Эритроидные предшественники

эритропоэтин

+

0

+

+

серотонинергические

+

+

0

0

Между тем, в условиях введения алкилирующего агента расширению пула митотически активных КОЕ в период миелосупрессии способствуют не только эритропоэтин и Г-КСФ, но и серотонин. По выраженности эритропоэтинзависимой стимуляции роста колоний центральные серотонинергические структуры уступают дофаминергическим, но превосходят адренергические. В последующем регенерация кроветворной ткани, высокие темпы деления эритроидных клеток поддерживаются исключительно серотонинергическими механизмами, в то время как вход КОЕ-ГМ в S-фазу клеточного цикла ингибируется (этому содействует Г-КСФ и серотонин).

Фармакологическая блокада центральных постсинаптических С2 рецепторов существенно изменяла активность клеточных элементов системы локальной регуляции кроветворения при цитостатической болезни. Так, при назначении алкилирующего агента ципрогептадин способствовал восстановлению активности процессов формирования гемопоэтических островков, о чем свидетельствовало увеличение числа макрофагпозитивных (4, 7-е сутки) и содержащих стромальную клетку (4, 5, 7-е сутки) клеточных комплексов в костном мозге. При этом возрастали темпы формирования гранулоцитарных и, в меньшей степени, эритроидных и смешанных  ГО (4, 5, 7-е сутки). Одновременно повышался уровень ЭПА (1-е сутки) и КСА (7-е сутки) в сыворотке крови, а также продукция факторов роста КОЕ-Э адгезирующими нуклеарами ГИМ (1–7-е сутки).

В условиях введения 5-фторурацила ципрогептадин препятствовал разрушению структурно-функциональной организации гемопоэтической ткани на 2–4, 6, 7, 12-е сутки исследования. Наиболее существенно увеличивалось содержание макрофагположительных и эритроидных ГО. На 5-е сутки опыта возрастала продукция эритропоэтической активности адгезирующими нуклеарами. Вместе с тем, высокий уровень ЭПА в супернатантах адгезирующих (1, 3-и сутки) и неадгезирующих (1-е сутки) миелокариоцитов и сывороточных ростовых факторов (1-е сутки), наблюдаемый в цитостатическом контроле, отменялся.

Таким образом, нарушение серотониновой медиации в ЦНС ципрогептадином стимулирует восстановление структурно-функциональной организации при цитостатических воздействиях (в случае с 5-фторурацилом преимущественно эритроидных ГО). При этом антисеротониновый препарат снижает активность секреции факторов роста КОЕ-Э клетками ГИМ при назначении антиметаболита, но увеличивает концентрацию ЭПА в супернатантах адгезирующих миелокариоцитов и сыворотке крови в условиях введения алкилирующего агента.

Исходя из результатов собственных экспериментов и данных литературы, следует признать, что развитие цитостатической миелосупрессии связано не только с угнетением и дискоординацией процессов деления и созревания кроветворных клеток-предшественников. Не последнюю роль в этом играют длительно сохраняющиеся деструктивные изменения структурно-функциональной организации кроветворной ткани (нарушения межклеточных взаимодействий и продукции клетками ГИМ гемопоэтических ростовых факторов). В клинической практике препараты рекомбинантного человеческого эритропоэтина и гранулоцитарного колониестимулирующего фактора используют для профилактики и лечения различных видов анемий и нейтропений, восстановления гемопоэза у онкологических больных, подвергающихся цитостатической химиотерапии [Asano S., 1991; Abels R.I., 1992; Schmitz N. et al., 1995; Bennet C.L. et al., 1996; Волкова М.А., 1998; Гершанович М.Л. и др., 1999; Воробьев П.А., 2001; Птушкин В.В., 2002; Переводчикова Н.И., 2005; Littlewood T.J., Collins G.P., 2007]. Между тем, применение ЭП и Г-КСФ во многом ограничено вследствие наличия у них достаточно большого спектра побочных эффектов [Jain K.K., 1994; Vial T., Descotes J., 1995; de Wit R. et al., 1996; Alvarado Ibarra M.L. et al., 1999; Машковский М.Д., 2006; Beutel G., Ganser A., 2007; Tiggue C.C. et al., 2007; Бигильдеев А.Е. и др., 2008]. Обнаруженное нами увеличение темпов восстановления структурно-функциональной организации эритроидного компартмента при введении антисеротонинового препарата и формирование de novo содержащих гранулоциты ГО при назначении симпатолитика дает основание полагать, что восстановление нейрофармакологическими средствами функций адгезирующих клеточных элементов ГИМ будет существенно усиливать гемопоэзстимулирующий эффект Г-КСФ и эритропоэтина.

В связи с вышеизложенным, в следующем разделе представлены результаты изучения возможности стимулирующего действия Г-КСФ на подавленный цитостатиками гранулоцитарный росток кроветворения в условиях истощения депо катехоламинов и эффективность стимуляции эритрона эритропоэтином при снижении активности серотонинергической системы.

Прежде всего, была проведена оценка влияния курсового введения Г-КСФ на гранулоцитопоэз при цитостатических воздействиях. Цитокин ускорял процессы регенерации ростка при назначении циклофосфана, о чем свидетельствовало накопление незрелых (на 2, 3-и сутки) и зрелых (5-е сутки) форм нейтрофильных гранулоцитов в костном мозге. Существенный прирост сегментоядерных нейтрофилов наблюдался и в периферической крови на 2, 4, 5-е сутки эксперимента (вплоть до развития умеренного нейтрофильного лейкоцитоза на 4, 5-е сутки). Одновременно Г-КСФ увеличивал количество ГО, содержащих стромальную клетку, и гранулоцитарных  клеточных комплексов (2, 3, 5-е сутки) (причем число последних уже на 3, 5-е сутки исследования восстанавливалось до уровня интактного контроля). В противоположность этому, содержание клеточных комплексов смешанного типа снижалось (4–7-е сутки).

В условиях введения 5-фторурацила Г-КСФ существенно усугублял депрессию гранулоцитопоэза (1–3, 6-е сутки), но начиная с 8-х суток наблюдалось резкое увеличение числа незрелых (10, 12-е сутки) и зрелых (8–12-е сутки) нейтрофилов в костном мозге. При этом снижалась активность восстановления числа макрофагнегативных (7, 9-е сутки), гранулоцитарных (7-е сутки) и эритро-гранулоцитарных (6, 7, 9-е сутки) ГО. В периферической крови цитокин не только отменял нейтрофильную лейкопению (1, 8, 10-е сутки), но и задерживал выход зрелых гранулоцитов из кроветворной ткани (3, 4-е сутки).

Представленные выше данные свидетельствуют о том, что при цитостатических воздействиях гранулоцитопоэзстимулирующее действие Г-КСФ обусловлено преимущественно непосредственной активацией пролиферации и созревания предшественников гранулоцитопоэза. Между тем, при назначении циклофосфана цитокин способствует увеличения скорости восстановления гранулоцитарных клеточных ассоциаций.

В условиях назначения алкилирующего агента интенсивность восстановления клеточности гранулоцитарного ростка кроветворения при последовательном истощении депо катехоламинов и введении Г-КСФ значительно превосходила выявленную в группах с Г-КСФ и симпатолитиком. Так, уже на 3-и и 4-е сутки наблюдения содержание соответственно незрелых и зрелых нейтрофилов в костном мозге практически не отличалось от исходных величин, а на 6, 7-е сутки регистрировалась гиперплазия гранулоцитопоэза. Более активный выход сегментоядерных нейтрофилов в периферическую кровь при этом вызывал развитие выраженного лейкоцитоза на 4, 5, 7-е сутки. Последовательное введение симпатолитика и цитокина ускоряло восстановление структурно-функциональной организации гемопоэтической ткани, о чем свидетельствовало значительное увеличение числа макрофагнегативных (1–3, 7-е сутки) и гранулоцитарных (1–3, 5–7-е сутки) клеточных комплексов. При этом клетки гранулоцитарных гемопоэтических островков были представлены преимущественно морфологически распознаваемыми гранулоцитами (сегментоядерными нейтрофилами). В контрольных группах (резерпин, Г-КСФ) количество нуклеаров в клеточных ассоциациях существенно уступало таковому в опыте. Следует отметить, что при последовательном введении резерпина и цитокина формирование дополнительных очагов гранулоцитарного кроветворения предшествовало развитию костномозговой гиперплазии и нейтрофильного лейкоцитоза в периферической крови.

В свою очередь, при назначении антиметаболита последовательное истощение депо катехоламинов и введение Г-КСФ увеличивало содержание нейтрофилов в костном мозге только к 7-м суткам эксперимента, чему предшествовало усугубление миелосупрессии на 1–3-и сутки. Сдвиги в содержании ГО были выявлены на 8, 9-е сутки опыта: в указанные сроки имело место усиление образования клеточных комплексов. В этих условиях характер изменения содержания нейтрофилов в периферической крови полностью совпадал с таковым в группе с цитокином.

Таким образом, резерпин значительно снижает токсическое действие катехоламинов на структурно-функциональную организацию костного мозга (гемопоэтические островки) в условиях введения циклофосфана, что усиливает стимулирующее влияние Г-КСФ на процессы регенерации гранулоцитарного ростка кроветворения. Вместе с тем, при назначении 5-фторурацила элемент синхронизации формирования ГО и стимуляции кроветворных клеток-предшественников (и как следствие – увеличение скорости репарации костного мозга) под влиянием симпатолитика и цитокина отсутствует, напротив, просматривается усугубление ситуации в период ингибиции ростка, гиперплазия гранулоцитопоэза, наблюдаемая в группе с цитокином в сроки регенерации, отменяется.

Полученные результаты свидетельствуют о целесообразности избирательного использования для терапии цитостатических лейкопений наряду с препаратами Г-КСФ фармакологических агентов, снижающих ингибирующее действие катехоламинов.

Прежде чем изучить возможность потенцировать ципрогептадином стимулирующее влияние эритропоэтина был проведен сравнительный анализ эффектов гормона на эритрон в условиях введения цитостатиков с различным механизмом действия.

При назначении фторпиримидинового антиметаболита курсовое введение ЭП вызывало статистически достоверное увеличение числа эритроидных клеток в костном мозге (4, 6, 7, 12-е сутки). В периферической крови существенный прирост ретикулоцитов обнаруживался уже на 2-е сутки и продолжался на протяжении всего периода наблюдений. Примечательно, что на 6, 7, 12-е сутки опыта клеточность эритроидного ростка кроветворения нормализовалась.

Стимулирующий эффект гормона в условиях введения алкилирующего агента регистрировался только в период регенерации эритрона. Безусловно, возрастание числа эритроидных элементов в системе крови связано с активацией функциональной активности предшественников эритропоэза. Тем более, что in vitro высокая реактивность прекурсоров к действию эритропоэтина при цитостатических воздействиях сохраняется (смотри данные культуральных исследований). Веским подтверждением такого заключения служит тот факт, что при курсовом введении препарата эритропоэтина нарушения структурно-функциональной организации гемопоэтической ткани сохранялись на протяжении всего периода наблюдения.

При последовательной блокаде постсинаптических серотониновых С2 рецепторов и введении эритропоэтина в условиях применения 5-ФУ интенсивность восстановления клеточности эритроидного ростка значительно превосходила таковую в группах с эритропоэтином и ципрогептадином (3–12-е сутки). Так, уже на 4-е сутки наблюдения содержание эритроидных клеток в костном мозге практически не отличалось от исходных величин, а на 5-е сутки регистрировалась гиперплазия эритропоэза. При этом увеличение выхода ретикулоцитов в периферическую кровь приводило к развитию выраженного ретикулоцитоза на 6, 7-е сутки исследования.

При изучении локальных механизмов совместного применения ципрогептадина и эритропоэтина было обнаружено активное восстановление структурно-функциональной целостности костного мозга у мышей, получавших антиметаболит. Препараты способствовали накоплению числа макрофагпозитивных (2, 4–7-е сутки), эритроидных (2–7-е сутки) и, в меньшей степени, эритро-гранулоцитарных (2, 4, 6, 7, 12-е сутки) клеточных комплексов. Формирование дополнительных очагов эритроидного кроветворения предшествовало развитию гиперплазии костномозгового эритропоэза и ретикулоцитоза в крови. В дополнение следует отметить, что в опытной группе клетки эритроидных ГО были представлены средними и поздними полихроматофильными нормобластами, оксифильными нормобластами, а также ретикулоцитами. Интересно, что в контрольных группах количество нуклеаров в клеточных комплексах значительно уступало таковому в опыте, причем в группе с ципрогептадином отсутствовали ретикулоциты.

В условиях введения алкилирующего агента применение ципрогептадина и гормона не вызывало столь выраженного увеличения значений показателей, характеризующих костномозговой эритропоэз, как в случае антиметаболита. Исключение составили ретикулоциты периферической крови, восстановление содержания которых в опыте отмечалось гораздо раньше (4–6 сутки), чем в контрольных группах с ЭП (6-е сутки) и антисеротониновым препаратом (7-е сутки).

Таким образом, нарушение серотониновой медиации в ЦНС до моделирования цитостатической миелосупрессии 5-фторурацилом и последующее введение эритропоэтина отменяют депрессию костномозгового эритропоэза и способствуют интенсивному восстановлению содержания ретикулоцитов в периферической крови, вплоть до развития ретикулоцитоза. При этом скорость регенерации подавленного антиметаболитом эритропоэза в опыте (комбинация ципрогептадина с эритропоэтином) превосходит темпы его восстановления в контрольных группах с гормоном и ципрогептадином. При назначении циклофосфана препараты стимулируют только дифференцировку и выход зрелых эритроидных клеток в периферическую кровь.

Судя по полученным данным, в условиях введения фторпиримидинового антиметаболита серотонин ЦНС оказывает “деструктивное” действие на гемопоэтические островки. В предыдущих исследованиях нами было продемонстрировано супрессирующее влияние серотонина in vitro на митотическую активность эритроидных предшественников животных при назначении 5-ФУ. С этих позиций мы пришли к заключению, что, вероятно, существует «серотониновый» механизм развития анемии при некоторых цитостатических воздействиях (в частности, при использовании антиметаболитов). Его реализация осуществляется на уровне коммитированных кроветворных предшественников и клеток ГИМ (формирование ГО). В этой связи представляется целесообразным использование в терапии цитостатических анемий препаратов, снижающих активность серотонинергической системы.

Результаты последней серии экспериментов дают основание считать, что в реализации эффектов ЭП и Г-КСФ при гипоплазии, вызванной введением цитостатиков, во многом задействованы центральные моноаминергические структуры. Между тем, не исключается возможность модуляции эффектов ростовых факторов на уровне локальной моноаминергической системы. Так, проведенные культуральные исследования позволили выявить, что ряд лигандов моноаминергической природы (мезатон, изадрин, дофамин, серотонин) сдерживали опосредованную эритропоэтином пролиферативную активность КОЕ-Э в культуре неадгезирующих клеток костного мозга мышей при назначении циклофосфана. Внесение моноаминов в 7-суточную культуру вызывало несколько иные сдвиги в активности Г-КСФ: серотонин и дофамин отменяли высокие темпы деления и скорость дифференцировки КОЕ-ГМ, под влиянием адреномиметиков (более изадрина) активность указанных процессов, напротив, возрастала.

При моделировании миелосупрессии введением 5-фторурацила моноаминергические лиганды in vitro отменяли ассоциированное с ростовыми факторами расширение пула митотически активных кроветворных прекурсоров. Исключение составил изадрин, который потенцировал стимулирующий эффект Г-КСФ. Адреномиметики и серотонин препятствовали увеличению величины соотношения КлОЕ/КОЕ, наблюдаемому в контроле с гормоном и цитокином. Аналогичное действие оказывал и дофамин в отношении дифференцировки клеток гранулоцитарного ряда, при этом индекс созревания прекурсоров эритропоэза, напротив, возрастал.

Таким образом, эффекторные аминергические молекулы выступают в качестве модуляторов активности эритропоэтина и Г-КСФ. При этом характер действия моноаминов зависит от типа кроветворных прогениторных клеток и механизма токсического действия цитостатика. Вполне вероятно, что реализация программы линейного коммитирования кроветворных предшественников при цитостатических воздействиях невозможна без взаимодействия системы локальной аминергической регуляции гемопоэтических клеток и ростовых факторов.

Потенцирующее действие адреномиметиков в отношении Г-КСФ, а серотонина – в отношении ЭП продемонстрировано и в культуре неадгезирующих миелокариоцитов интактных животных. По-видимому, в случае алкилирующего агента модулирующая активность моноаминов менее подвержена токсическому действию цитостатика. Усугубление ситуации при назначении антиметаболита (наряду с развитием дефицита активных в отношении гемопоэтических клеток молекул), очевидно, связано с нарушением взаимодействия эритропоэтина и системы КСФ с периферическими моноаминергическими механизмами.

В совокупности собственные результаты экспериментов и данные литературы легли в основу предложенных нами схем регуляторного влияния моноаминов на систему крови при гипопластических состояниях, вызванных введением циклофосфана либо 5-фторурацила (рис. 2).

Развитие миелосупрессии и последующее восстановление кроветворной ткани при цитостатических воздействиях находятся под контролем адренергической, серотонинергической и дофаминергической систем. Регуляторное влияние центральных моноаминергических структур на гемопоэз реализуется прямо через соответствующие рецепторы на коммитированных кроветворных клетках-предшественниках и опосредованно – через изменение функциональной активности клеточных элементов ГИМ (формирование ГО, продукция цитокинов). При цитостатических воздействиях велико значение центральных серотонинергических структур и катехоламинов в реализации гемостимулирующих эффектов ряда гемопоэтических факторов роста: эритропоэтина и гранулоцитарного колониестимулирующего фактора соответственно. Причем нами не исключается участие системы локальной моноаминергической регуляции в восстановлении нарушенного антинеобластомными средствами оптимального соотношения физиологически активных веществ в межклеточном пространстве кроветворной ткани.

В условиях моделирования гипопластического состояния цитостатиками моноаминергические механизмы регенерации эритрона и белой крови существенно различаются. Так, если активность эритропоэза во многом связана с серотонином (формирование клеточных комплексов эритроидного типа и продукция ЭПА адгезирующими клетками ГИМ, увеличение активности дифференцировки эритроидных предшественников), то с катехоламинами сопряжено восстановление клеточности гранулоцитарного ростка (образова-

ние гранулоцитарных ГО и продукция КСА клетками ГИМ, пролиферация и созревание грануломоноцитарных прекурсоров).

Наряду с общими принципами был обнаружен ряд существенных межмодельных различий в моноаминергической регуляции костномозгового гемопоэза. Так, центральные адренергические структуры усиливают токсическое действие алкилирующего агента как на гранулоцитарный (1–7-е сутки), так и на эритроидный ростки кроветворения (ингибиция) (рис. 3). Это связано с сокращением пула митотически активных КОЕ-ГМ (в период ингибиции опосредованное Г-КСФ и -адренергическими структурами, в сроки регенерации – -адренергическими механизмами), нарушением структурно-функциональной организации кроветворной ткани (1–7-е сутки) и продукции ЭПА адгезирующими клетками ГИМ (регенерация). Между тем, в длительном ингибирующем действии дофаминергической системы на эритрон задействованы исключительно клеточные элементы ГИМ (угнетается образование ГО на 1–6-е сутки и секреция ЭПА на 7-е сутки). При этом дофамин тканей мозга снижает и высокий уровень сывороточной ЭПА (1-е сутки). В противоположность этому, в период миелосупрессии амин оказывает стимулирующее влияние на периферические Г-КСФ- и дофамин-зависимые механизмы контроля пролиферации грануломоноцитарных предшественников, что во многом препятствует развитию нейтрофильной лейкопении при назначении циклофосфана. В рассматриваемой моделе гемодепрессии регуляторное влияние серотонина ЦНС проявляется только в задержке репарации эритроидного компартмента кроветворения, что, в первую очередь, связано с подавлением восстановления эритроидных клеточных комплексов, во вторую – со снижением функциональной активности эритроидных прекурсоров (механизмы сопряженные с эритропоэтином) и уровня ЭПА в сыворотке крови.

В условиях введения фторпиримидинового антиметаболита адренергическая система препятствует развитию миелосупрессии и увеличивает скорость восстановления гемопоэза (рис. 4). В основе накопления нуклеаров в костном мозге и периферической крови лежат активация формирования ГО (регенерация), продукция ЭПА неадгезирующими клетками ГИМ и рост уровня сывороточного КСА (ингибиция). Центральные адренергические структуры стимулируют систему КСФ и ЭП (на протяжении всех сроков исследования). Значительный вклад в активацию гемопоэза вносят и периферические адренергические механизмы. Причем в период ингибиции высокие темпы деления и созревания в отделе эритроидных прекурсоров поддерживают исключительно -адренергические структуры, в сроки регенерации рост функциональной активности в отделе грануломоноцитарных предшественников сопряжен с - и -рецепторами.

Дофаминергическая система неоднозначно влияет на регенерацию отдельных ростков кроветворения при назначении 5-фторурацила. Так, в силу роста концентрации сывороточной ЭПА и эритропоэтин зависимой активации пролиферации КОЕ-Э скорость восстановления эритрона увеличивается. С нарушением продукции  КСА  адгезирующими  клетками связано замедле-

ние восстановления содержания нейтрофильных гранулоцитов в системе крови.

Регуляторное влияние серотонинергической системы на гемопоэз было отличным от такового со стороны дофаминергических структур ЦНС. Так, снижая продукцию ЭПА клетками кроветворного микроокружения и уровень эритропоэтина в сыворотке крови, серотонин тканей мозга усугубляет депрессию эритропоэза, вызванную введением антиметаболита. При этом амин препятствует разрушению гранулоцитарных и смешанных ГО (ингибиция) и увеличивает опосредованную системой КСФ пролиферативную активность и интенсивность дифференцировки гранулоцитарно-макрофагальных предшественников (весь период исследования), что, в конечном итоге, приводит к увеличению скорости регенерации гранулоцитарного ростка кроветворения.

Как было показано выше, под влиянием резерпина, галоперидола и ципрогептадина изменения величин переменных, характеризующих ГИМ и коммитированные кроветворные предшественники, в ряде случаев были противоположны реакциям костного мозга и периферической крови (содержание морфологически распознаваемых нуклеаров). Безусловно, этот факт вносит определенные сложности в объяснение механизмов регуляторного действия моноаминов на систему крови при цитостатических воздействиях. Однако выявленный феномен является весомым аргументом в пользу того, что токсическое действие алкилирующего и фторпиримидинового агентов проявляется не только в нарушении структурно-функциональной организации кроветворной ткани и функциональной активности гемопоэтических прекурсоров, но и в дисфункции моноаминергических систем, контролирующих кровообразование.

ВЫВОДЫ

1. Адренергическая, дофаминергическая и серотонинергическая системы участвуют в регуляции гемопоэза в условиях цитостатических миелосупрессий, вызванных алкилирующим агентом (циклофосфан) и антиметаболитом (5-фторурацил). Регуляторное влияние моноаминов ЦНС осуществляется через адренергические, дофаминергические и серотонинергические структуры на гемопоэтических прекурсорах и клетках гемопоэзиндуцирующего микроокружения (ГИМ), а также системы колониестимулирующих факторов и эритропоэтина.

2. В условиях введения алкилирующего агента регуляция гранулоцитарного ростка кроветворения сопряжена преимущественно с адренергической и дофаминергической системами, тогда как развитие изменений в эритроне при назначении антиметаболита в большей степени связано с серотонинергической системой.

3. Мезатон, изадрин, дофамин и серотонин оказывают стимулирующее действие на формирование колоний эритроидного и грануломоноцитарного типов в тест-системе неадгезирующих миелокариоцитов интактных животных. Степень индукции роста КОЕ лигандами моноаминергической природы существенно уступает таковой под влиянием эритропоэтина и Г-КСФ.

4. В условиях введения цитостатиков лиганды моноаминергической природы in vitro увеличивают темпы деления эритроидных (изадрин) и гранулоцитарно-макрофагальных (дофамин, изадрин, серотонин) предшественников, при этом гемостимулирующая активность -адреномиметика и дофамина превосходит выявленную в контроле с рекомбинантными гемопоэтическими ростовыми факторами. Вместе с тем, мезатон снижает пролиферативную активность и интенсивность дифференцировки КОЕ-Э и КОЕ-ГМ, а серотонин и дофамин избирательно угнетают процессы в отделе предшественников эритропоэза (более выражено при введении фторпиримидинового антиметаболита).

5. В культуре неадгезирующих миелокариоцитов интактных животных адреномиметики усиливают Г-КСФ-зависимую стимуляцию роста КОЕ-ГМ, а серотонин ускоряет сопряженное с эритропоэтином формирование КОЕ-Э. Если при моделировании миелосупрессии введением циклофосфана потенцирующее действие адреномиметиков и серотонина сохраняется, то при назначении 5-фторурацила моноаминергические лиганды, напротив, отменяют ассоциированные с гемопоэтическими факторами роста высокие темпы деления и созревания гемопоэтических прекурсоров.

6. N-ацетилнейраминовая кислота in vitro препятствует угнетению фидерной активности стромальных клеток костного мозга, подвергнутых воздействию циклофосфана, в отношении предварительно обработанных серотонином или изадрином предшественников эритропоэза.

7. Истощение депо катехоламинов (резерпин), блокада постсинаптических дофаминовых Д2 (галоперидол) и серотониновых С2 (ципрогептадин) рецепторов не влияют на содержание морфологически распознаваемых нуклеаров в костном мозге и периферической крови интактных мышей. В то же время симпатолитик уменьшает содержание КОЕ-ГМ в культуре неадгезирующих миелокариоцитов с Г-КСФ, мезатоном и изадрином, но увеличивает число КОЕ-Э в тест-системе с эритропоэтином и адреномиметиками. Антисеротониновый препарат избирательно снижает активность выхода КОЕ-Э (in vitro серотонин), а нейролептик – образование гранулоцитарно-макрофагальных колоний (in vitro дофамин).

8. При назначении циклофосфана стимуляция восстановления гемопоэза резерпином (преимущественно гранулоцитарного ростка кроветворения) связана с формированием de novo гемопоэтических островков в костном мозге, продукцией ЭПА адгезирующими миелокариоцитами. При этом сопряженное с Г-КСФ (период ингибиции) и адреномиметиками (период регенерации) увеличение функциональной активности гранулоцитарно-макрофагальных предшественников, а также рост скорости созревания эритроидных прекурсоров, связанный с эритропоэтином (период ингибиции) и -адренергическими структурами (1–7-е сутки), играют меньшую роль в развитии регенераторных процессов.

9. Основными причинами усугубления резерпином миелосупрессии и задержки восстановления гемопоэза (более – эритроидного ростка кроветворения) в условиях введения 5-фторурацила выступают нарушения структурно-функциональной организации костного мозга (угнетение формирования ГО и секреции ЭПА неадгезирующими миелокариоцитами) и снижение уровня сывороточного КСА. В реализации ингибирующего влияния симпатолитика на функциональную активность эритроидных прекурсоров участвуют эритропоэтин (весь период исследования) и адренергические структуры (период ингибиции), падение темпов деления КОЕ-ГМ и скорости их созревания происходит при участии Г-КСФ (период ингибиции) и преимущественно периферических -адренергических механизмов (период регенерации).

10. Фармакологическая блокада постсинаптических дофаминовых рецепторов (галоперидол) при назначении циклофосфана увеличивает скорость регенерации эритропоэза за счет возрастания функциональной активности адгезирующих клеток ГИМ (образование макрофагпозитивных и эритроидных ГО, продукция ЭПА), повышения уровня сывороточной ЭПА и интенсивности дифференцировки эритроидных предшественников. В этих условиях нейролептик усугубляет ингибицию гранулоцитопоэза, что во многом обусловлено разрушением гранулоцитарных и смешанных клеточных комплексов и падением пролиферативной активности грануломоноцитарных прекурсоров.

11. При фармакологической блокаде постсинаптических Д2 рецепторов продукция КСА адгезирующими миелокариоцитами и высокие темпы деления грануломоноцитарных предшественников, ассоциированные с дофаминергическими структурами и Г-КСФ, выступают основными механизмами, определяющими ускоренное восстановление гранулоцитопоэза в условиях введения 5-фторурацила. Ингибирующий эффект нейролептика на процессы регенерации эритроидного ростка кроветворения связан с угнетением пролиферативной активности и интенсивности дифференцировки прекурсоров эритропоэза, сопряженных с эритропоэтином и дофаминергическими структурами.

12. При моделировании миелосупрессии введением алкилирующего агента фармакологическая блокада серотониновых постсинаптических С2 рецепторов (ципрогептадин) препятствует развитию депрессии эритроидного ростка кроветворения, что связано с увеличением концентрации эритропоэзстимулирующих факторов в сыворотке крови и кондиционных средах адгезирующих клеток ГИМ. Последующее снижение скорости регенерации эритрона обусловлено супрессирующим действием антисеротонинового препарата на периферические серотониновые механизмы контроля эритроидных предшественников.

13. В условиях введения антиметаболита блокада серотониновых постсинаптических С2 рецепторов стимулирует формирование макрофагпозитивных, эритроидных и гранулоцитарных гемопоэтических островков, что приводит к ускорению восстановления гемопоэза (более – эритроидного ростка кроветворения). При этом расширяется пул грануломоноцитарных предшественников, находящихся в S-фазе митотического цикла.

14. Истощение депо катехоламинов резерпином усиливает гранулоцитопоэзстимулирующее действие Г-КСФ при моделировании миелосупрессии циклофосфаном за счет образования дополнительных очагов гранулоцитарного кроветворения в кроветворной ткани. В условиях назначения фторпиримидинового антиметаболита последовательное введение симпатолитика и цитокина препятствует восстановлению структурно-функциональной организации костного мозга, следствием чего является снижение активности гранулоцитопоэза.

15. При введении 5-фторурацила нарушение серотониновой медиации в ЦНС ципрогептадином потенцирует эритропоэзстимулирующее действие эритропоэтина во многом благодаря активному формированию de novo макрофагпозитивных и эритроидных ГО в костномозговой ткани. В свою очередь, последовательное назначение антисеротонинового препарата и эритропоэтина не влияет на эритроидный росток кроветворения в случае моделирования депрессии эритрона алкилирующим агентом.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

  1. Характеристика состояния костномозгового пула Т-лимфоцитов мышей после введения 5-фторурацила // Труды молодых ученых института фармакологии ТНЦ РАМН. – Томск, 1995. – С. 16–18.
  2. Итоги работ по созданию гемостимуляторов природного происхождения  // Актуальные проблемы фармакологии и поиска новых лекарственных препаратов. – Томск, 1995. – Т.8. – С. 3–11 (соавт. Гольдберг Е.Д., Дыгай А.М., Агафонов В.И. и др.).
  3. Содержание кроветворных предшественников в прилипающем слое костного мозга мышей  после введения цитостатиков // Клинические и экспериментальные исследования молодых ученых Сибирcкого отделения РАМН. – Новосибирск, 1996. – С.81.
  4. Механизмы изменений структурно-функциональной организации костного мозга при цитостатических миелосупрессиях // Проблемы экспериментальной и клинической медицины. – Томск, 1996. – Вып. 1. – С. 3–5.
  5. Значение связывающей способности клеток кроветворного микроокружения для восстановления отдельных ростков гемопоэза, подавленного цитостатиками // Бюл. эксперим. биол. и мед. – 1996. – Т. 122. – № 11. – С. 490–494 (соавт. Жданов В.В., Дыгай А.М., Кириенкова Е.В., Гольдберг Е.Д.).
  6. Влияние цитостатиков на состояние стромальных элементов кроветворного микроокружения // Актуальные проблемы фармакологии и поиска новых лекарственных препаратов. – Томск, 1997. – Т.9. – С. 81–82.
  7. Участие процессов связывания кроветворных клеток со стромальными элементами костного мозга в восстановлении гемопоэза при цитостатических миелосупрессиях // Гематол. и трансфузиол. – 1998. – Т. 43. – № 4. – С. 14–16 (соавт. Жданов В.В., Дыгай А.М., Гольдберг Е.Д.).
  8. Создание лекарственных препаратов для терапии лучевых миелодепрессий // Вестник научной программы «Семипалатинский полигон – Алтай». – 1997. – Т.1. – № 13. – С. 96–100 (соавт. Гольдберг Е.Д., Дыгай А.М., Агафонов В.И. и др.).
  9. Использование препаратов из лекарственных растений в терапии анемий и лейкопений различного генеза // Тезисы докладов V Российского национального конгресса «Человек и лекарство». – Москва, 1998. – С. 359 (соавт. Гольдберг Е.Д., Дыгай А.М., Жданов В.В. и др.).
  10. Роль процессов пролиферации и дифференцировки кроветворных клеток-предшественников в восстановлении гемопоэза при цитостатических миелосупрессиях // Бюл. эксперим. биол. и мед. – 1997. – № 12. – С. 616–619 (соавт. Дыгай А.М., Жданов В.В., Рыжаков В.М., Гольдберг Е.Д.).
  11. Участие процессов связывания кроветворных клеток со стромальными элементами костного мозга в восстановлении гемопоэза при цитостатических миелосупрессиях // Гематол. и трансфузиол. – 1998. – Т. 43. – № 4. – С. 14–16 (соавт. Жданов В.В., Дыгай А.М., Гольдберг Е.Д.).
  12. Гемостимулирующие свойства рекомбинантного колониестимулирующего фактора и глицирама в условиях цитостатической миелосупрессии // Эксперим. и клинич. фармакология. – 1999. – № 1. – С. 34–37 (соавт. Дыгай А.М., Жданов В.В., Масычева В.И. и др.).
  13. О роли центральных адренергических структур в регуляции кроветворения в условиях экспериментальных невротических воздействий // Бюл. эксперим. биол. и мед. – 1999. – Приложение 1. – С. 7–11 (соавт. Скурихин Е.Г., Суслов Н.И., Провалова Н.В.).
  14. Новые данные о механизмах развития цитостатической болезни  // Актуальные проблемы фармакологии и поиска новых лекарственных препаратов. – Томск, 1999. – Том 10. – С. 35–42 (соавт. Жданов В.В., Симанина Е.В., Пушкарева Н.С. и др.).
  15. Роль мононуклеарных фагоцитов костного мозга в регуляции кроветворения при цитостатических миелосупрессиях // Актуальные проблемы фармакологии и поиска новых лекарственных препаратов. – Томск, 1999. – С. 159–160.
  16. Новые стимуляторы гранулоцитопоэза // Тезисы докладов VI Российского национального конгресса «Человек и лекарство». – Москва, 1999. – С. 399 (соавт. Гольдберг Е.Д., Дыгай А.М., Жданов В.В., Гольдберг В.Е.).
  17. Новые подходы в создании гемостимуляторов для клинической практики // Тезисы докладов VII Российского национального конгресса «Человек и лекарство». – Москва, 2000. – С. 494 (соавт. Дыгай А.М., Гольдберг Е.Д., Жданов В.В. и др.).
  18. Адренергические механизмы влияния адаптогенов на периферическую кровь в условиях иммобилизационного стресса // Фундаментальные и прикладные проблемы современной медицины (материалы молодежной научной конференции СО РАМН). – Новосибирск, 2000. – С. 110–112 (соавт. Скурихин Е.Г., Провалова Н.В.).
  19. Гемостимулирующие свойства таблетированной формы рекомбинантного эритропоэтина человека в эксперименте  // Фармакология системы крови. – 2000. – Том 63. – № 5 – С. 37–40 (соавт. Дыгай А.М., Колокольцова Т.Д., Костина Н.Е. и др.).
  20. Роль адгезирующих элементов кроветворного микроокружения в регенерации эритропоэза при цитостатических гемодепрессиях // Проблемы экспериментальной и клинической фармакологии. – Томск, 2000. – С. 25–26.
  21. Коррекция адаптогенами изменений в системе крови при экспериментальных невротических воздействиях // Проблемы экспериментальной и клинической фармакологии. – Томск, 2000. – С. 34–36 (соавт. Провалова Н.В., Скурихин Е.Г., Зюзьков Г.Н., Пахомова А.В.).
  22. Роль дофамин- и серотонинергических систем в регуляции кроветворения в условиях экспериментальных невротических воздействий // Проблемы экспериментальной и клинической фармакологии. – Томск, 2000. – С. 39–41 (соавт. Скурихин Е.Г., Провалова Н.В., Зюзьков Г.Н., Пахомова А.В.).
  23. Адренергические механизмы влияния препаратов природного происхождения на систему крови в условиях иммобилизационного стресса // Поиск, разработка и внедрение новых лекарственных средств и организационных форм фармацевтической деятельности (материалы международной научной конференции). – Томск, 2000. – С. 186–187 (соавт. Скурихин Е.Г., Суслов Н.И., Провалова Н.В. и др.).
  24. Адренергические механизмы влияния адаптогенов на периферическую кровь в условиях иммобилизационного стресса // Бюл. СО РАМН. – № 2. – 2000. – С. 86–92 (соавт. Скурихин Е.Г., Провалова Н.В.).
  25. Новые лекарственные формы рекомбинантных цитокинов для лечения анемий и лейкопений различного генеза // Тезисы докладов VIII Российского национального конгресса «Человек и лекарство». – Москва, 2001. – С. 295 (соавт. Гольдберг Е.Д., Дыгай А.М., Жданов В.В. и др.).
  26. Механизмы регуляции кроветворения в условиях экспериментальных невротических воздействий // Актуальные проблемы экспериментальной и клинической фармакологии. – Томск, 2001. – С. 138–141 (соавт. Скурихин Е.Г., Провалова Н.В., Першина О.В.).
  27. Гемостимулирующие свойства нового препарата на основе Д-глюкуроновой кислоты // Тезисы докладов IX Российского национального конгресса «Человек и лекарство». – Москва, 2002. – С. 612 (соавт. Дыгай А.М., Симанина Е.В., Гольдберг В.Е.).
  28. Механизмы действия адаптогенов на гранулоцитопоэз в условиях экспериментальных невротических воздействий  // 4 съезд физиологов Сибири (тезисы). – Новосибирск, 2002. – С.58–59 (соавт. Гольдберг Е.Д., Дыгай А.М., Суслов Н.И. и др.).
  29. Реакции системы крови в ответ на депривацию парадоксальной фазы сна при введении адаптогенов // Актуальные вопросы экспериментальной и клинической морфологии. – Томск, 2002. – С. 112–114 (соавт. Гольдберг Е.Д., Дыгай А.М., Суслов Н.И. и др.).
  30. Влияние препаратов природного происхождения на развитие постгипоксической энцефалопатии // Актуальные проблемы экспериментальной и клинической фармакологии. – Томск, 2002. – С. 131–135 (соавт. Першина О.В., Провалова Н.В., Скурихин Е.Г.).
  31. Механизмы действия адаптогенов на эритропоэз в условиях депривации парадоксальной фазы сна // Актуальные проблемы экспериментальной и клинической фармакологии. – Томск, 2002. – С. 146–151 (соавт. Провалова Н.В., Скурихин Е.Г., Першина О.В.).
  32. Механизмы локальной регуляции кроветворения в условиях гиподинамии // Материалы XII конференции по космической биологии и авиакосмической медицине. – Москва, 2002. – С. 113–114  (соавт. Гольдберг Е.Д., Дыгай А.М., Жданов В.В., Шерстобоев Е.Ю.).
  33. Механизмы действия адаптогенов на эритропоэз в условиях депривации парадоксальной фазы сна // Бюл. эксперим. биол. и мед. – 2002. – № 5. – С. 496–500 (соавт. Провалова Н.В., Скурихин Е.Г., Першина О.В. и др.).
  34. Влияние препаратов природного происхождения на систему крови и когнитивные функции при гипоксическом воздействии // Бюл. эксперим. биол. и мед. – 2002. – Приложение 1. – С. 27–30 (соавт. Першина О.В., Суслов Н.И., Провалова Н.В. и др.).
  35. Влияние препаратов природного происхождения на эритропоэз в условиях конфликтной ситуации и возможные механизмы их действия // Бюл. эксперим. биол. и мед. – 2003. – № 8. – С. 190–194 (соавт. Провалова Н.В., Скурихин Е.Г., Першина О.В.).
  36. Механизмы регуляции кроветворения при невротических воздействиях // Бюл. эксперим. биол. и мед. – 2003. – Приложение № 2. – С. 76–84 (соавт. Гольдберг Е.Д., Дыгай А.М., Суслов Н.И.).
  37. Локальные механизмы регуляторного действия кропанола на гемопоэз при депривации парадоксального сна // Бюл. эксперим. биол. и мед. – 2004. – Т. 137. – № 2. – С. 182–186 (соавт. Провалова Н.В., Скурихин Е.Г., Першина О.В. и др.). 
  38. Deer velvet products as new sources of nutrigenomic adaptogens: The Russian perspective – 1  //Advance in Antler Science and Product Technology. – 2004. – P. 189–192 (Letchamo W., Shebalin A.S., Dygai A.M. et al.).
  39. Механизмы регуляции кроветворения при экспериментальных неврозах // Актуальные проблемы фармакологии (материалы международной конференции).  – Томск, 2004. – С. 77–78 (соавт. Скурихин Е.Г.).
  40. Механизмы эриропоэзстимулирующего действия экстракта шлемника байкальского // Эксперим. и клин. фармакология. – 2005. – Т. 68. – № 4. – С. 43–45 (соавт. Удут Е.В., Жданов В.В., Гурьянцева Л.А., Дыгай А.М.).
  41. К вопросу о механизмах регуляции эритропоэза при экспериментальных неврозах // Бюл. эксперим. биол. и мед. – 2005. – № 5. – С. 495–501 (соавт. Скурихин Е.Г., Дыгай А.М., Провалова Н.В., Суслов Н.И.).
  42. Особенности реакций гранулоцитарного ростка кроветворения у мышей с различной способностью к обучению при неврозах // / Бюл. эксперим. биол. и мед. – 2005. – Том 140. – № 8. – С. 136–141 (соавт. Скурихин Е.Г., Першина О.В., Ставрова Л.А. и др.).
  43. Механизмы регуляции гранулоцитарного ростка кроветворения в условиях конфликтной ситуации и при депривации парадоксального сна // Бюл. эксперим. биол. и мед. – 2005. – Приложение № 1. – С. 14–20 (соавт. Скурихин Е.Г., Першина О.В., Провалова Н.В. и др.).
  44. Влияние кропанола на локальные механизмы регуляции гемопоэза в конфликтной ситуации // Бюл. эксперим. биол. и мед. – 2005. – Приложение № 1. – С. 21–25 (соавт. Провалова Н.В., Скурихин Е.Г., Суслов Н.И., Дыгай А.М.).
  45. Моноаминергическая регуляция пула стволовых клеток эритропоэза активных и пассивных мышей при экспериментальных неврозах // Клеточные технологии в биологии и медицине. – 2005. – № 4. – С. 248–254 (соавт. Скурихин Е.Г., Першина О.В.).
  46. Кроветворные прекурсоры: механизмы регуляции в условиях хронического стресса // Клеточные технологии в биологии и медицине. – 2005. – № 4. – С. 214–218 (соавт. Шерстобоев Е.Ю.).
  47. Фармакологическая регуляция пула прекурсоров эритропоэза при экспериментальных неврозах // Клеточные технологии в биологии и медицине. – 2005. – № 4. – С. 219–228 (соавт. Скурихин Е.Г., Провалова Н.В., Першина О.В.). 
  48. Особенности действия симпатолитика резерпина на эритропоэз активных и пассивных мышей при экспериментальных невротических воздействиях // Материалы 4-ой Международной конференции: Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам. – Москва, 2006. – С. 23 (соавт. Гольдберг Е.Д., Дыгай А.М., Скурихин Е.Г. и др.).
  49. Моноаминергический контроль пролиферации и дифференцировки прекурсоров грануломоноцитопоэза при невротических воздействиях // Бюл. эксперим. биол. и мед. – 2006. – Том 141. – № 6. – С. 616–621 (соавт. Скурихин Е.Г., Першина О.В., Дыгай А.М., Гольдберг Е.Д.).
  50. Роль серотонина в регуляции эритропоэза при цитостатических миелосупрессиях // Вестник Уральской медицинской академической науки. – Екатеринбург, 2006. – № 3–2 (15). – С. 41.
  51. Дофаминергическая регуляция эритропоэза при моделировании миелосупрессий циклофосфаном и 5-фторурацилом // Бюл. эксперим. биол. и мед. – 2007. – Приложение 1. – С. 79–86 (соавт. Скурихин Е.Г., Першина О.В.).
  52. Новый подход к фармакологической коррекции нарушений в эритроне при цитостатических воздействиях // Создание новых лекарственных препаратов (материалы конференции). – Томск, 2007. – С. 112–114 (соавт. Першина О.В., Скурихин Е.Г.).
  53. Роль серотонинергической системы в регуляции эритропоэза при цитостатических миелосупрессиях // Бюл. эксперим. биол. и мед. – 2007. – Приложение 1. – С. 86–91 (соавт. Скурихин Е.Г., Першина О.В.).
  54. Роль дофаминергической системы в регуляции гранулоцитопоэза при цитостатических миелосупрессиях // Актуальные проблемы экспериментальной и клинической фармакологии (материалы конференции) – Томск, 2007. – С. 55–57.
  55. Роль серотонина в регуляции гранулоцитопоэза при цитостатических миелосупрессиях // Бюл. эксперим. биол. и мед. – 2007. – Т. 143 – № 5. – С. 501–507 (соавт. Скурихин Е.Г., Першина О.В., Дыгай А.М., Гольдберг Е.Д.).
  56. Особенности дофаминергической регуляции гранулоцитопоэза при цитостатических миелосупрессиях // Бюл. эксперим. биол. и мед. – 2007. – Том 144. – № 9 – С.  253–259 (соавт. Скурихин Е.Г., Першина О.В., Дыгай А.М., Гольдберг Е.Д.).
  57. Роль центральных адренергических структур в регуляции гранулоцитопоэза при цитостатических воздействиях // Бюл. эксперим. биол и мед. – 2008. – Том 145. – № 4. – С. 383–388 (соавт. Дыгай А.М., Скурихин Е.Г., Першина О.В., Гольдберг Е.Д.).
  58. Моноаминергические механизмы регуляции гемопоэза при миелоингибирующих воздействиях // Проблемы онкофармакологии (материалы конференции). – Томск, 2008 – С. 6–8 (соавт. Скурихин Е.Г., Першина О.В.).
  59. Теория регуляции кроветворения и создание на ее основе новых препаратов для терапии патологии системы крови // Бюл. эксперим. биол. и мед. – 2008. – Приложение 2. – С. 6–13 (соавт. Гольдберг Е.Д., Дыгай А.М., Жданов В.В. и др.).
  60. Об адренергической регуляции эритропоэза при цитостатических миелосупрессиях // Бюл. эксперим. биол. и мед. – 2008. – № 10. – с. 385–390 (соавт. Скурихин Е.Г., Першина О.В., Ермакова Н.Н. и др.).

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ВНС – вегетативная нервная система

ГАГ – гликозаминогликаны

ГИМ – гемопоэзиндуцирующее микроокружение

Г-КСФ – гранулоцитарный  колониестимулирующий фактор

ГО – гемопоэтический островок

КОЕ (КлОЕ)-ГМ – колониеобразующая (кластерообразующая) единица гранулоцитарно-макрофагальная

КОЕ (КлОЕ)-Э – колониеобразующая (кластерообразующая) единица эритроидная

КСА – колониестимулирующая  активность

КСФ – колониестимулирующий фактор

МПД – максимально переносимая доза

ОКК – общее количество миелокариоцитов

ОКЛ – общее количество лейкоцитов

СМФ – система мононуклеарных фагоцитов

ЦНС – центральная нервная система

ЦФ – циклофосфан

ЭП – эритропоэтин

ЭПА – эритропоэтическая активность

5-ФУ – 5-фторурацил






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.