WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

 

На правах рукописи

КАЗАКОВ

Сергей Петрович

МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ МАРКЕРЫ

В ДИАГНОСТИКЕ, ПАТОГЕНЕЗЕ И ПРОГНОЗЕ ЗАБОЛЕВАНИЙ

ЩИТОВИДНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

14.03.10 клиническая лабораторная диагностика

А в т о р е ф е р а т

диссертации на соискание ученой степени

доктора медицинских наук

Москва 2010

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении

высшего профессионального образования «Московский государственный

медико-стоматологический университет Росздрава»

Научные консультанты:

член-корреспондент РАМН, профессор 

КУШЛИНСКИЙ

Николай Евгеньевич

доктор биологических наук 

ЗАБОТИНА

Татьяна Николаевна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

ТОТОЛЯН

Арег Артёмович

доктор медицинских наук, профессор 

РЕЗНИКОВ

Юрий Петрович

доктор медицинских наук, профессор

ПОДВЯЗНИКОВ

Сергей Олегович

Ведущая  организация:  Государственное  образовательное  учреждение

высшего профессионального образования «Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова».

Защита диссертации состоится «___» декабря 2010 г. в 10.00 на заседании диссертационного совета Д 208.071.04 при Государственном образовательном  учреждении дополнительного профессионального образования «Российская медицинская академия последипломного образования Росздрава» (123995,  г. Москва, ул. Баррикадная, д. 2/1).

С диссертацией можно ознакомиться в медицинской библиотеке  ГОУ ДПО «Российская медицинская академия последипломного образования Росздрава»  (125445, г. Москва, ул. Беломорская, д. 19).

Автореферат разослан «____» ______________ 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук, профессор Морозова В.Т.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Несмотря на относительно скромное место (1-3%) в структуре злокачественных опухолей, проблема рака щитовидной железы (РЩЖ) в последние десятилетия серьезно волнует ученых и врачей из различных областей медицины [Валдина Е.А., 2005; Дедов И.И. и др., 2000; Знаменский А.А. и др., 2006]. Это во многом связано с крайне быстрым ростом заболевания среди лиц молодого и среднего возраста [Жуков С.А. и др., 2003; Davies L., Welch H., 2006]. По данным большинства исследователей, рост заболеваемости наблюдается в индустриально развитых странах и связан в первую очередь с увеличением радиационного воздействия [Берштейн Л.М., 2007; Валдина Е.А., 2001; Дедов И.И. и др., 2000; Williams D., 1996]. Сравнительно небольшие размеры органа и пошаговая прогрессия от гиперплазии до опухолевого узла, дифференциации и развития анапластической карциномы делает изучение опухолевого канцерогенеза и оценки иммунопатогенеза в этом достаточно обособленном органе удобным и оптимальным [Rzeszutko M. et al., 2007].

Основную надзорную функцию за опухолевой прогрессией несет в организме иммунная система, крайне важной задачей которой является сохранение неизменным антигенного гомеостаза жидкостей и тканей организма [Грачева Л.А., 1996; Скуинь Л.М., Кашкин К.П., 2001; Mazzoccoli G. et al., 2003]. Имеющиеся данные о патогенезе противоопухолевого иммунитета малочисленны и подчас противоречивы [Кадагидзе З.Г. и др., 2000; Телетаева Г.М., 2007]. В защите от опухолевых клеток главным образом участвуют клеточные факторы иммунитета (естественные киллерные клетки, натуральные киллерные Т-клетки (ТNK), цитотоксические Т-лимфоциты, макрофаги и моноциты, эозинофилы), оказывающие презентирующее, цитостатическое и цитолитическое действие [Князькин И.В., Цыган В.Н., 2007; Скуинь Л.М., Кашкин К.П., 2001]. Роль и функциональные особенности поведения этих иммунокомпетентных клеток при опухолях и аутоиммунных заболеваниях щитовидной железы (АИЗЩЖ) изучены крайне мало, а сведения о патогенетических механизмах взаимодействия между собой очень противоречивы [Mardente S. еt al., 2005; Zeppa P. et al., 2009]. Регуляция в организме характера и напряженности антигенспецифических иммунных реакций осуществляется при непосредственном участии цитокинов, с использованием механизмов
ауто- и паракрийной регуляции [Кашкин К.П., 1998; Фрейдлин И.С., 2001]. Наряду с регуляцией иммунного ответа цитокины участвуют не только как позитивные регуляторы клеточной пролиферации, они также могут контролировать аномальный клеточный рост, индуцируя дифференцировку и подавляя процессы опухолевой трансформации клеток [Антонов В.Г., Козлов В.К., 2004; Кашкин К.П., 1998; Mitsiades N. et al., 2001, 2003]. Поэтому исследование динамики цитокинов представляется достаточно актуальной задачей.

Известно, что инвазия и злокачественный рост опухоли обусловлены не только высоким уровнем пролиферации клеток, но и недостаточной активностью апоптоза или сочетанием этих двух факторов [Антонов В.Г., Козлов В.К., 2004; Кушлинский Н.Е. и др., 2002]. Это является следствием нарушения экспрессии в клетках одного или нескольких нормальных генов пролиферации и дифференцировки, так называемых протоонкогенов [Кашкин К.П., 2006; Пальцев М.А., 2004; Цыган В.Н., 2004]. Наиболее известные из них – это ген, запускающий апоптотическую гибель генетически измененных клеток на определенной фазе клеточного цикла, – ген р53, и семейство генов, блокирующих активность апоптоза, – онкогены семейства bcl-2 – bcl-2, Bax, Bag 3, bcl-xl, Вad и др. [Дедов И.И., 2000; Князькин И.В., Цыган В.Н., 2007; Копнин Б.К., 2003; Chiappetta G. et al., 2007]. Мутации в гене р53 и его регуляторах являются достаточно широко распространенными и встречаются у онкологических больных с опухолями щитовидной железы в 3-67% случаев [Белохвостов А.С., 2003; Марченко И.А., 2009; Трошина Е.А., 1996]. Недостаточно исследованы мутации этого гена у больных со злокачественными, доброкачественными и аутоиммунными заболеваниями щитовидной железы. Неясна степень распространения этих мутаций в пораженных патологическим процессом тканях щитовидной железы и неизменной ткани в других долях железы [Марченко И.А., 2009]. Исследования взаимоотношений между различными параметрами апоптоза и пролиферации в щитовидной железе малочисленны и подчас носят неопределенный характер [Лукьянова Н.Ю. и др., 2000; Марченко И.А., 2009; Орлинская Н.Ю., 2009; Соколова О.В., 2009]. Оценка апоптотического индекса, различных параметров апоптоза и их взаимоотношений между собой (белка р53 и его мутаций, bcl-2, FAS-системы) и с показателями пролиферации (Кi-67) при переходе от доброкачественного процесса к злокачественному и роль в этом процессе аутоиммунных заболеваний (расстройств) являются важной проблемой, требующей своего решения [Зугаирова О.Н., 2010; Кушлинский Н.Е., Трапезников Н.Н., 2000; Соколова О.В., 2009; Bossowski A. et al., 2006, 2007; Rzeszutko M., 2007].

Большое значение имеет степень васкуляризации опухолей и кровоснабжения при онкологических процессах. Одним из основных механизмов инвазии злокачественных опухолей является нарушение окружающей базальной мембраны и внеклеточного матрикса ассоциированными с опухолями протеазами [Трапезникова М.Ф. и др., 2002; Lan L. et al., 2009]. Решающую роль в процессе инвазии и метастазирования среди четырех основных классов протеаз играют сериновые протеазы. Их роль в регуляции межклеточного протеолиза в различных физиологических и патологических процессах: деструкции ткани и миграции клеток, воспалительные реакции, инвазивный рост трофобласта и опухолевых клеток – изучена недостаточно. Большую роль в этом процессе отводят активаторам и ингибиторам плазминогена урокиназного и тканевого типа [Кушлинский Н.Е., Трапезников Н.Н., 2000; Dass K. et al., 2008]. Их связь между собой может оказаться полезной для понимания процессов повышенной реваскуляризации при онкологических и неонкологических процессах в тканях щитовидной железы.

Несмотря на однозначный характер зависимостей апоптоза и пролиферации, необходимо выяснение взаимосвязи между ними для  поиска дополнительных диагностических и прогностических критериев, обсуждения вопросов эффективности проводимой терапии. В целом, мутации в генах, в частности в гене р53, которые прямо или косвенно приводят к снижению апоптоза, в основном связаны с плохим прогнозом в отношении целого спектра опухолей [Дедов И.И. и др., 2000].

Таким образом, исследование механизмов функционирования иммунной системы, роли факторов апоптоза и пролиферации, онкогенов и антионкогенов их мутации, а также оценка роли сериновых протеаз в васкуляризации новообразований при опухолевых и аутоиммунных процессах в щитовидной железе являются крайне актуальными проблемами.

Цель работы: комплексное изучение основных иммунологических показателей, цитокинов и молекул межклеточной адгезии, молекулярно-биологических и генетических маркеров, регулирующих апоптоз и пролиферацию, а также некоторых компонентов системы фибринолиза в диагностике, патогенезе и прогнозе заболеваний щитовидной железы.
Задачи исследования:
1. Провести комплексную оценку состояния некоторых параметров иммунной системы у больных со злокачественными, доброкачественными и аутоиммунными заболеваниями щитовидной железы и исследовать характерные особенности вариантов иммунных нарушений, встречающихся в каждой патологии.

2. Провести исследование цитокинов, хемокина, молекул межклеточной адгезии у больных с аутоиммунными, доброкачественными и злокачественными заболеваниями щитовидной железы.

3. Изучить экспрессию FAS-L на хелперных и эффекторных иммунокомпетентных клетках крови у больных со злокачественными новообразованиями щитовидной железы.

4. Оценить молекулярно-биологические (основные, сочетанные) маркеры, регулирующие апоптоз и пролиферацию, в тканях щитовидной железы при аутоиммунных, доброкачественных и злокачественных заболеваниях щитовидной железы.

5. Исследовать возможные механизмы повреждений процессов апоптоза и пролиферативную активность у больных с основными формами ненаследственных (папиллярных и фолликулярных) раков щитовидной железы.

6. Определить фенотипические особенности доброкачественных новообразований щитовидной железы и охарактеризовать возможный прогноз развития аденом по данным маркеров апоптоза и пролиферации.

7. Оценить развитие процесса опухолевой трансформации, используя основные и сочетанные показатели клеток с белками, регулирующими апоптоз и пролиферацию, в морфологически не измененных тканях при раках и аденомах щитовидной железы.

8. Количественно определить, сопоставить и оценить взаимосвязь основных компонентов активаторов плазминогена урокиназного (uPA) и тканевого (tPA) типа, а также их ингибитора (PAI-1) в цитозолях тканей злокачественных и доброкачественных опухолей щитовидной железы с учетом основных клинических и морфологических характеристик заболевания.

9. Оценить значение и рассчитать частоту встречаемости мутаций гена р53 при доброкачественных и злокачественных новообразованиях и аутоиммунных заболеваниях щитовидной железы, проанализировать частоту мутаций в тканях щитовидной железы, не пораженных опухолевым процессом.

Научная новизна

Полученные комплексные данные об иммунной системе организма у больных с аутоиммунными, доброкачественными и злокачественными заболеваниями щитовидной железы позволили раскрыть основные патогенетические механизмы и особенности иммунного ответа, сопровождающие изучаемые патологические процессы.

В работе представлены сравнительные данные одновременного исследования цитокинов, хемокина и молекул межклеточной адгезии, разработаны наиболее оптимальные соотношения (индексы) цитокинов.

Установлено, что в патогенезе заболеваний щитовидной железы некоторые цитокины играли ключевую роль и не могли быть использованы для
диагностики в других исследуемых группах. Так, при раке щитовидной железы определяющее значение играла растворимая форма молекулы адгезии sE-seleсtin, в патогенезе аденомы щитовидной железы – растворимая форма молекул межклеточной адгезии 1-го типа sICAM-1, а в патогенезе аутоиммунных заболеваний – ИЛ-4.

Получены новые данные о количественном содержании на мембранах иммунокомпетентных клеток рецепторов инициации апоптоза TNF-семейства  (FAS-L) в хелперных и эффекторных субпопуляциях лимфоцитов периферической крови у практически здоровых пациентов и больных папиллярным раком щитовидной железы.

В работе комплексно определена взаимосвязь между основными маркерами апоптоза и пролиферации в патологически измененных тканях щитовидной железы у больных с аутоиммунными заболеваниями, доброкачественными и злокачественными новообразованиями.

Описаны и использованы в дифференциальной диагностике и патогенезе новые сочетанные (комбинированные) фенотипы клеток с маркерами апоптоза и пролиферации, исследованы плотности экспрессии  рецепторов/белков на поверхности и внутри изучаемых групп клеток.

Представлены новые данные по фенотипическим особенностям основных и сочетанных параметров клеток с использованием маркеров пролиферации и апоптоза у больных с разными вариантами (папиллярный и фолликулярный) рака щитовидной железы.

Впервые описаны разные варианты аденом щитовидной железы, отличающиеся по фенотипическим характеристикам основных и сочетанных параметров клеток с маркерами, участвующими в процессах апоптоза и пролиферации.

Представлены данные о сравнительной характеристике «нормальной», морфологически не измененной и патологической ткани щитовидной железы, подверженной доброкачественному и злокачественному опухолевому процессу, у больных с аденомами и раками в этом органе.

Получены новые патогенетические данные по сравнительному исследованию маркеров реваскуляризации при доброкачественном и злокачественном процессе на основе анализа активаторов тканевого и урокиназного типа и его ингибитора у больных с аденомами и раками щитовидной железы.

Практическая значимость

Комплексный подход к оценке состояния некоторых компонентов иммунной системы у больных с аутоиммунными, доброкачественными и злокачественными новообразованиями позволил составить целостное представление о механизмах нарушения в иммунной системе и способствовал разработке оптимальных диагностических критериев у данных групп пациентов. 

Разработаны наиболее оптимальные соотношения (индексы) цитокинов,
которые можно использовать для дифференциальной диагностики аутоиммунных, доброкачественных и злокачественных заболеваний щитовидной железы.

Осуществлен расчет пороговых значений и диагностических показателей чувствительности, специфичности и точности методов диагностики с использованием цитокинов, хемокина и молекул межклеточной адгезии для улучшения дифференциальной диагностики практически здоровых пациентов, больных с аутоиммунными заболеваниями, аденомами и раками щитовидной железы. Установлено, что в дифференциальной диагностике целесообразнее использовать следующие показатели: между злокачественными и аутоиммунными заболеваниями – sE-seleсtin, между доброкачественными и аутоиммунными заболеваниями – ИЛ-6 и sICAM-1, между раком и аденомой щитовидной железы – индекс ИЛ-6/-ИНФ. Разработана логистическая регрессивная модель дифференциальной диагностики рака щитовидной железы у больных с новообразованиями щитовидной железы на основе оценки показателей ИЛ-6, sE-seleсtin и индекса ИЛ-6/-ИНФ. Полученные данные рекомендуются к использованию в дополнительном исследовании для выявления рака щитовидной железы на этапе обследования больного.

В работе доказано, что определение показателей (количество клеток, плотность экспрессии рецепторов/белков) основных и сочетанных маркеров апоптоза и пролиферативной способности тиреоцитов может служить дополнительным диагностическим и прогностическим тестом к другим основным инструментальным, лабораторным и морфологическим методам исследования для улучшения диагностики исследуемых заболеваний щитовидной железы. Для дифференциальной диагностики аутоиммунных, доброкачественных, злокачественных заболеваний щитовидной железы; папиллярного и фолликулярного рака щитовидной железы; аденом разных типов рекомендованы к использованию общие и сочетанные показатели маркеров апоптоза и пролиферации с расчетом пороговых значений величин и показателей диагностической эффективности.

Отсутствие значимых различий в молекулярно-биологических показателях «нормальных», морфологически не измененных тканей щитовидной железы у больных раком позволяет рекомендовать врачам-хирургам (онкологам) ставить вопрос о целесообразности полного удаления железы и отказываться от таких органосохраняющих хирургических методов лечения, как секторальные резекции, гемиэктомии.  Использование общих и сочетанных показателей апоптоза и пролиферации помогает на основании фенотипических особенностей разных вариантов рака щитовидной железы провести дополнительную диагностику и, возможно, в будущем использовать эти данные для мониторирования динамики воздействия новых лекарственных средств и таргетной медикаментозной терапии, в механизмах которых лежит инициализация апоптоза в опухолевых клетках. Установлено, что применение общих и сочетанных параметров апоптоза и пролиферации в
диагностике аденом щитовидной железы позволяет выявить тип аденом, который фенотипически отличается от основного типа доброкачественных новообразований, а также, возможно, имеет более неблагоприятный прогноз. 

Получены новые данные о том, что в дополнительной дифференциальной диагностике злокачественных и доброкачественных новообразований щитовидной железы могут быть рекомендованы к использованию значения показателей активаторов урокиназного и тканевого типа и их ингибитора.

Своевременное выявление молекулярно-генетических дефектов – мутаций гена р53 у больных с ненаследственными формами злокачественных и доброкачественных новообразований – позволяет на доклинической стадии диагностировать развитие новообразования, своевременно начать терапию и тем самым улучшить прогноз развития заболевания.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту

В практике работы онкологов при дифференциальной диагностике наиболее часто приходится отличать злокачественные новообразования от доброкачественных и аутоиммунных заболеваний щитовидной железы. С помощью клинико-инструментальных методов исследований не всегда можно получить исчерпывающие данные для дифференциальной диагностики, тогда как использование для целей диагностики ключевых параметров иммунной системы помогает получить дополнительную информацию о патологическом процессе.

В дифференциальной диагностике между практически здоровыми пациентами и пациентами с аутоиммунными, доброкачественными и злокачественными заболеваниями в качестве дополнительных критериев диагностики должны использоваться современные методы диагностики цитокинов, а также разработанные индексы (соотношения) цитокинов.

Использование логистической регрессивной модели, основанной на совместном расчете показателей ИЛ-6, sE-seleсtin в плазме крови и индекса
ИЛ-6/-ИНФ, позволяет с наиболее высокой эффективностью диагностировать рак у больных с новообразованиями щитовидной железы.

У изучаемых нами патологий отмечаются характерные фенотипические изменения в общих и сочетанных (комбинированных) показателях количества клеток и экспрессии на/в них молекулярно-биологических маркеров, участвующих в регуляции апоптоза и пролиферации, которые могут использоваться в дополнительной диагностике этих нозологий.

Исследования фенотипа клеток, основанного на мембранных рецепторах и внутриклеточных белках, участвующих в регуляции апоптоза и пролиферации, у больных папиллярным и фолликулярным РЩЖ позволили выявить особенности течения патологического процесса при бласт-трансформации в зависимости от варианта.

Наличие большого количества клеток с маркерами CD95L у больных с аденомами щитовидной железы позволяет выделить тип аденом, который отличается более напряженными изменениями в показателях количества клеток, содержащих рецепторы и белки, регулирующие апоптоз и пролиферацию, их экспрессии, и соответственно более худшим прогнозом в развитии и озлокачествлении.

Сравнительная характеристика морфологически не измененных тканей и тканей с опухолевым процессом у больных с аденомами и раками щитовидной железы выявила незначительные различия по основным и сочетанным показателям апоптоза и пролиферации, наиболее фенотипически схожие данные были получены в тканях больных раком щитовидной железы.

Личный вклад автора

Автором проведены все исследования по иммунофенотипированию крови и тканей, исследованию цитокинов, основные этапы по молекулярно-биологическим исследованиям мутаций гена р53. Автор самостоятельно осуществил всю необходимую статистическую обработку полученных данных, интерпретировал полученные результаты.

Реализация результатов исследования

Результаты исследования внедрены в лечебную практику и используются в эндокринологических, хирургических, радиохирургическом, лабораторных отделениях Главного военного клинического госпиталя им. Н.Н. Бурденко МО РФ,
2 Центрального военного клинического госпиталя им. П.А. Мандрыка МО РФ,  3 Центрального военного клинического госпиталя им. А.А. Вишневского МО РФ, 5 Центрального военного клинического госпиталя ВВС МО РФ, 32 Центрального военно-морского клинического госпиталя МО РФ, 12 Лечебно-диагностического центра МО РФ. Материалы работы используются в лекциях и практических занятиях на кафедре хирургии Государственного института усовершенствования врачей МО РФ. Изданы методические рекомендации для медицинских учреждений Министерства обороны Российской Федерации «Полимеразная цепная реакция в клинико-диагностической практике многопрофильных лечебных учреждений» (2000).

По результатам научно-практической деятельности оформлено 8 рационализаторских предложений, которые внедрены в практику лечебно-диагностической деятельности Главного военного клинического госпиталя им. Н.Н. Бурденко и других военно-медицинских учреждений Министерства обороны Российской Федерации.

Апробация диссертации

Диссертация выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских программ Главного военно-медицинского управления МО РФ. Апробация работы проведена на совместной научной конференции кафедры клинической биохимии и лабораторной диагностики ФПДО МГМСУ и лаборатории клинической биохимии НИИ клинической онкологии ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН 18 мая 2010 г. (протокол №7).

Основные положения работы доложены на итоговой научно-практической конференции ГВКГ им. Н.Н. Бурденко «Современные подходы к диагностике и лечению злокачественных новообразований» (Москва, 2000); Национальных днях лабораторной медицины России (Москва, 2000); юбилейной научно-практической конференции «Современная специализированная амбулаторно-поликлиническая помощь в Московском регионе» (Москва, 2001); итоговой научно-практической конференции ГВКГ им. Н.Н. Бурденко «Клиническая и экономическая эффективность современных медицинских технологий, методов диагностики и лечения» (Москва, 2001); Всероссийской научной конференции «Биохимия – медицине» (Санкт-Петербург, 2002); юбилейной научно-практической конференции «Актуальные вопросы клинической и военно-морской медицины» (Московская область, г. Железнодорожный, 2003); итоговой научно-практической конференции ГВКГ им. Н.Н. Бурденко «Комбинированная и сочетанная патология: проблемы диагностики и лечения» (Москва, 2003); Третьем съезде онкологов Содружества независимых государств (Минск, 2004); Восьмом Всероссийском научном форуме с международным участием им. академика В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2004); Национальных днях лабораторной  медицины России (Москва, 2004); The Tenth Joint Meeting of the International Cytokine Society (ICS) and the International Society for Interferon and Cytokine Research (ISICR) (Puerto Rico, San Juan, 2004); Третьем Всероссийском тиреоидологическом конгрессе «Диагностика и лечение узлового зоба» (Москва, 2004); XII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2005); итоговой научно-практической конференции ГВКГ им. Н.Н. Бурденко «Актуальные проблемы клинической онкологии» (Москва, 2005); VI Всероссийском съезде онкологов «Современные технологии в онкологии» (Ростов-на-Дону, 2005); 1-st Joint Meeting of European National Societies of Immunology Under the auspices of EFIS and 16-th European Congress of Immunology (France, Paris, 2006); 17th IFCC - FESCC European Congress of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine; 60th National Congress of the Netherlands Society for Clinical Chemistry and Laboratory Medicine (NVKC) (Netherland, Amsterdam, 2007); International Federation of Clinical Chemistry – WorldLab – Clinical Chemistry and Laboratory Medicine (Brasil, Fortaleza, 2008); Тринадцатом Всероссийском научном форуме с международным участием им. академика
В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2009).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 38 научных работ, из них 10 – в центральной печати, изданы одни методические рекомендации, получено 8 рационализаторских предложений.


Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 332 страницах машинописного текста и состоит из введения, 5 глав (обзор литературы, описание материала и методов
исследования, собственные результаты и их обсуждение), заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы из 345 источников
(125 отечественных и 220 иностранных авторов). Работа иллюстрирована
54 таблицами и 23 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Клинический раздел работы включает анализ 178 больных с аутоиммунными, доброкачественными и злокачественными заболеваниями ЩЖ, средний возраст больных составил 49,4±13 (от 19 до 75) лет. Среди пациентов было
138 (77,53%) женщин и 40 (22,47%) мужчин. Все больные по характеру патологии были разделены на три основные группы: больные с аутоиммунными заболеваниями ЩЖ, больные с доброкачественными заболеваниями ЩЖ, больные со злокачественными заболеваниями ЩЖ (табл. 1).

В группе больных аутоиммунными заболеваниями ЩЖ находились пациенты с аутоиммунным тиреоидитом Хашимото, болезнью Грейвса (16 больных); в группе с доброкачественными заболеваниями ЩЖ – пациенты с аденомами щитовидной железы (61 больной); в группе со злокачественными заболеваниями ЩЖ – пациенты с преимущественно РЩЖ (101 больной).

Таблица 1

Распределение больных по нозологическим группам

Группа

Клинико-патоморфологический диагноз

Количество больных

абс.

%

I

Аутоиммунные заболевания ЩЖ:

- Хашимото

- Грейвса

16

15

1

100

93,75

6,25

II

Доброкачественные заболевания ЩЖ:

- аденома

- цистаденома

61

60

1

100

98,36

1,64

III

Злокачественные заболевания ЩЖ:

- папиллярный рак

- фолликулярный рак

101

92

9

100

91,09

8,91

В с е г о …

178

100

Все больные перенесли оперативные вмешательства – тиреоидэктомия, субтотальная резекция, гемитиреоидэктоимия.

Группу больных с доброкачественными заболеваниями ЩЖ составили пациенты (61 больной), которым по клиническим и функциональным свойствам была показана частичная или полная тиреоидэктомия или тиреоидэктомия по поводу АЩЖ.

В группу больных с аутоиммунными поражениями ЩЖ входили больные с заболеваниями Хашимото (15 больных) и болезнью Грейвса (1 больной), которым в связи с выраженным объемом проводили оперативное удаление части ЩЖ с одновременным гистологическим подтверждением диагноза.

Наиболее значимую группу больных занимали пациенты со злокачественными новообразованиями (101 больной) в одной или нескольких долях ЩЖ. При этом по данным гистологических исследований злокачественные новообразования выявлялись в одной доле, а в другой доле, как правило, отмечались аутоиммунные расстройства, доброкачественные изменения (микро и макрофолликулярная аденома) или неизмененные гистологические здоровые ткани.

После операции проводился гистологический анализ удаленного препарата в соответствии с Гистологической классификацией опухолей  щитовидной железы ВОЗ (1989) (табл. 2).

Таблица 2

Распределение больных раком щитовидной железы

по стадиям заболевания

Стадии
FIGO

TNM

(международная классификация)

Количество больных

абс.

%

I

T1N0M0,T2N0M0 до 41 года

1

1,01

II

T2N0M0; T3N0M0

51

50,5

III

T4N0M0; Т любое N1M0

42

41,56

IV

T любое, N любое, M1,

низкодифференцированный рак

7

6,93

Всего …

101

100

Всем больным на этапе обследования проводилось иммунофенотипирование крови методом проточной цитометрии на аппарате COULTER EPICS XL-MCL фирмы «Beckman Coulter» (США) с рабочей станцией COULTER FLOW CENTRE в двух- и (или) трехцветных протоколах для определения основных субпопуляционных характеристик лимфоцитов, характеризующих клеточное звено специфического иммунитета  с определением относительного и абсолютного количества основных иммунокомпетентных групп хелперных и эффекторных клеток:
СD3+ – зрелые Т-клетки, CD3+/4+, СD3+/8+ – субпопуляции Т-клеток, СD19+ –
В-лимфоциты, СD16+56+ – NK-клетки, CD3+/16+56+ – TNK-клетки, CD3-/16+56+ – NK истинные.

Подсчитывалось общее число поверхностных маркеров в условных единицах по средней интенсивности свечения флуоресценции (MFI), пропорциональной номеру канала, измеренного в логарифмическом режиме (средняя плотность экспрессии рецепторов в исследуемой группе клеток).

Для оценки состояния иммунитета рассчитывали также иммунорегуляторный индекс CD4/CD8.

Для оценки FAS-L на лимфоцитах использовали одинарные моноклональные антитела (МКА) – СD3-FITC, СD19-FITC, CD4-FITC, CD8-FITC, CD16-FITC – в комбинации с МКА CD95L-PE. 

Оценку параметров клеточного звена иммунитета, FAS-L на основных субпопуляциях лимфоцитов проводили методом проточной цитометрии с подсчетом 3000 событий в лимфоцитарном гейте с определением относительного и абсолютного количества и плотности экспрессии рецепторов на клетке.

В основных исследуемых группах больных и в контрольной группе  проводили определение цитокинов, хемокина и некоторых молекул межклеточной адгезии: INF-, IL-4, IL-6, IL-10, TNF-, MCP-1, sICAM-1 и sE-selectin. Для определения цитокинов использовали метод проточной цитометрии и симплексные наборы фирмы «Bender Medsystems Gmbh» (Австрия) с использованием технологии Multiplex. В работе с использованием логического метода сравнения изучены и используются для дополнительной дифференциальной диагностики обследуемых патологий  следующие соотношения (индексы) цитокинов: -INF/IL-4, -INF/IL-10, -INF/TNF-, IL-6/-INF, -INF/MCP-1, -INF/sICAM-1, -INF/sE-seleсtin. Расчеты соотношений (индексов) определяли по формуле

Индекс = (Цитокин1/Цитокин2)100.

Также исследовали другие показатели, характеризующие гуморальное звено специфического и неспецифического иммунитета, – иммуноглобулины классов А, М, G, Е, компоненты комплемента С3, С4, ЦИК, некоторые показатели аутоиммунитета – антитела к тиреоглобулину, тиреопероксидазе и микросомальной фракции, показатели, отражающие функциональное  состояние ЩЖ – ТТГ, Т3, Т4, Т3С, Т4С, паратгормона, показатель активации системы иммунитета – неоптерин.

У всех больных из операционного материала (тканей) готовили суспензию клеток, окрашивая тиреоциты моноклональными антителами к мембранным рецепторам и внутриклеточным белкам. В работе использовались МКА для оценки параметров апоптоза и пролиферации фирмы «CALTAG» (Австрия) – Bcl-2-Fits, CD95-PE-Cy5, CD95L-PE-Cy5 и фирм «DAKO» и «BD» – p53-Fits, Ki-67-РЕ.

При подсчете клеток оценивали показатели в локальной области, используя гейтирование (рис. 1), при котором определялось окно, куда попадали клетки размером до 25 мкн.

Определяли количество клеток и их плотность с маркерами, распределенными на поверхности клеток, CD95, CD95L и внутриклеточных маркеров пролиферации Кi-67 и апоптоза bcl-2, p53, в которых выделяли группы общих p53-клеток, клеток р53dim, р53bright, общих bcl-2-клеток, клеток bcl-2dim, bcl-2bright.

Фенотипирование проводили на проточном цитофлуориметре с подсчетом 100 000 событий в образце и расчетом относительного количества клеток, а также показателем плотности экспрессии рецепторов (белков) на клетках или группе клеток.

Рис. 1. Гистограммы распределения суспензии клеток по

размеру и структуре с ограниченной зоной гейтирования (А)

Цифровые данные (гистограммы) в виде файлов (.LMD) анализировались в специальной аналитической программе CXP ver.2.2 с получением результатов проведенных исследований.

Также исследовали малочисленные группы клеток, образованные возможными комбинациями: р53/Ki-67, p53/CD95, bcl-2/Ki-67, bcl-2/CD95, CD95/Ki-67, p53/CD95L, CD95/CD95L, bcl-2/CD95L.

Показатели активаторов плазминогена урокиназного и тканевого типа и их ингибитора исследовали в цитозолях, приготовленных из тканей ЩЖ у больных с новообразованиями, иммунохимическим методом с использованием неконкурентного непрямого твердофазного гетерогенного иммуноферментного анализа (ELISE) в модификации двойного сендвич-метода и с применением наборов реактивов, разработанных в лаборатории профессора Т. Benraad'a (Ниймеген, Нидерланды) [Grebenschikov et al., 1997].

В материале, взятом из парафиновых блоков, у больных с аутоиммунными заболеваниями, доброкачественными и злокачественными новообразованиями проводили исследование мутаций гена р53 в 273 кодоне 6-го экзона методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) по методике М. Zou и соавт. (1993).

Статистическая обработка результатов выполнялась на персональном компьютере с помощью статистического пакета SPSS 13,0 и MS Office Excel XP с расчетом средних арифметических значений. Для оценки значимости различий между группами использовали непараметрический критерий Манна–Уитни. Корреляционный анализ проводили по методу Спирмена. Различия и рассчитанные коэффициенты корреляции (r) считались достоверными при уровне значимости p<0,05. Для расчета логистической регрессивной модели использовали  регрессионный анализ [Реброва О.Ю., 2003]. Для оценки информативности диагностического теста использовали ROC-анализ.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Для комплексного исследования механизмов нарушения иммунной  системы у больных с аутоиммунными, доброкачественными и злокачественными заболеваниями щитовидной железы нами было изучено клеточное и гуморальное звено специфического и неспецифического иммунитета. Результаты исследования показывают, что у больных с АИЗЩЖ отмечаются выраженные изменения в клеточном звене специфического иммунитета, характеризующиеся наличием повышенного относительного и абсолютного количества Т-лимфоцитов (CD3+), Т-хелперов (СD3+CD4+), TNK-лимфоцитов (СD3+CD16+56+), относительного снижения Т-цитотоксических лимфоцитов (СD3+CD8+). Аутоиммунные заболевания ЩЖ характеризовались также развитием и функционированием аутоаллергического состояния в иммунной системе, которое характерно для всех аутоиммунных и аллергических заболеваний, проявившихся в повышении индекса иммунорегуляции.

Показатели клеточного звена иммунной системы больных со злокачественными и доброкачественными новообразованиями ЩЖ имели сходные нарушения, проявляющиеся в относительном снижении процентного и абсолютного количества общих лимфоцитов, Т-лимфоцитов (CD3+), Т-хелперов (СD3+CD4+), Т-цитотоксических лимфоцитов (СD3+CD8+). Схожесть процессов онкогенеза у больных со злокачественными и доброкачественными новообразованиями ЩЖ характеризовалась и сходными нарушениями в иммунной системе. У больных с новообразованиями ЩЖ выявлено развитие иммунодефицитного состояния иммунной системы с характерным снижением иммунорегуляторного индекса. Больные со злокачественными новообразованиями имели более выраженные изменения в показателях основных субпопуляций лимфоцитов, характеризующих клеточное звено специфического иммунитета.

Сравнительная характеристика доброкачественных и злокачественных новообразований ЩЖ показала наличие у больных с аденомами повышенного относительного и абсолютного количества общих NK-клеток (CD16+56+), а также их субпопуляций – ТNK- клеток (СD3+/CD16+56+) и натуральных киллерных клеток (СD3-/CD16+56+), что является патогномоничным признаком для пациентов с АЩЖ, в отличие от больных РЩЖ.

Анализ показателей гуморального звена неспецифического иммунитета показал, что потребление С3-компонента комплемента было наиболее выражено у больных с доброкачественными и злокачественными новообразованиями ЩЖ, менее – у больных с АИЗЩЖ. С4-компонент комплемента, по нашим данным, не играл значительной роли в патогенезе нарушений иммунной системы.

Исследование гуморального звена специфической иммунной системы у больных с аутоиммунными заболеваниями, доброкачественными и злокачественными новообразованиями ЩЖ показывает повышение количества иммуноглобулина Е в сыворотке всех исследуемых групп больных. Наиболее выраженное повышение отмечалось в крови больных с АИЗЩЖ – 240,92 МЕ/мл. Менее выраженное повышение – 217,16 МЕ/мл - отмечено у больных со злокачественными новообразованиями ЩЖ. Повышенный уровень иммуноглобулина Е был отмечен и в группе больных с АЩЖ – 177,06 МЕ/мл. 

Функциональные расстройства ЩЖ были более выражены у больных  РЩЖ, чем у больных с доброкачественными новообразованиями. Функциональные расстройства характеризовались нормальной или сниженной до нижних границ концентрацией Т4, превышением концентрации Т3 на 50-100% по сравнению с нормальным уровнем этого гормона.

В патогенезе развития аутоиммунных, доброкачественных и злокачественных заболеваний ЩЖ большое значение придается интерлейкинам, хемокинам, молекулам адгезии и иным цитокинам, которые наряду с регуляцией антигенспецифических иммунных реакций иммунной системы, осуществляемых по механизмам аутокрийной и паракрийной регуляции, способны, невзирая на локальное их действие, оказывать позитивный или негативный ответ на регуляторы клеточной пролиферации, механизмы апоптоза и способствовать клеточному росту, дифференцировке, подавлять аномальный опухолевый рост, играть значительную роль в процессах трансформации иммунокомпетентных клеток и их субпопуляций.

В диагностике исследуемых патологий большую роль могут играть соотношения (индексы) цитокинов, использование которых позволяет получить дополнительные диагностические критерии иной раз с более высокими показателями диагностической эффективности.

Сравнительная характеристика цитокинов у больных с аутоиммунными, доброкачественными и злокачественными заболеваниями ЩЖ представлена в  табл. 3, а соотношения (индексы) – в табл. 4.

Представлены данные по пороговым значениям, показателям диагностической эффективности (чувствительность, специфичность, точность, достоверность), которые могут использоваться в дифференциальной диагностике между группами практически здоровых пациентов, больных с аутоиммунными заболеваниями, доброкачественными и злокачественными новообразованиями ЩЖ по показателям цитокинов и их соотношений (индексов).

Таблица 3

Значения цитокинов, молекул межклеточной адгезии и неоптерина

в плазме крови у больных с аутоиммунными заболеваниями,

доброкачественными и злокачественными опухолями

щитовидной железы

Исследуемые показатели,

пг/мл

Группы больных и контроля

I

(контроль),

n=10

II

(АИЗЩЖ),

n=12

III

(АЩЖ),

n=15

IV

(РЩЖ),

n=24

-ИНФ

8,47±0,26

7,55±3,01

9,55±4,09

6,89±5,56

ИЛ-4

40,66±12,73

111,71±44,29

83,47±70,73

147,57±126,02

ИЛ-6

7,61±0,63

  34,28±14,85

  16,53±7,16 ~

  31,3±17,41 *

ИЛ-10

9,99±0,97

11,88±2,77

  21,78±10,55 ~

  24,1±13,67^

ФНО-

8,35±0,57

  9,82±1,34

10,25±1,5

11,74±7,09

MCP-1

  109,22±5,62

155,77±27,2

171,63±43,3

  202,08±59,65 ^

sE-seleсtin

39,54±1,47

  44,93±20,63

45,83±13,11

68,56±27,42 *^

sICAM-1

233,93±21,11

255,68±30,56

412,90±159,03 ~

  296,86±76,01

Неоптерин

2,02±0,26

3,75±0,29

  4,5±1,01

  5,71±3,63

Примечание. – статистическая достоверность между группами I и II, III, IV (р<0,05); ~ – статистическая достоверность между группами II и III (р<0,05); * – статистическая достоверность между группами III и IV (р<0,05); ^ – статистическая достоверность между группами II и IV (р<0,05).

Нами изучались данные по дифференциальной диагностике аутоиммунных заболеваний и практически здоровых людей. Для этих целей можно с высокой достоверностью использовать следующие цитокины и их соотношения: ИЛ-4, ИЛ-6, ФНО-, MCP-1, индексы -ИНФ/ИЛ-4 и ИЛ-6/-ИНФ. Наиболее значимыми цитокинами в патогенезе аутоиммунных заболеваний являются ИЛ-6 и MCP-1.

Для дифференциальной диагностики доброкачественных новообразований и практически здоровых пациентов были выявлены такие показатели цитокинов, которые имеют высокую диагностическую эффективность: ИЛ-6, ИЛ-10, ФНО-, хемокин MCP-1, молекула адгезии sICAM-1 и индекс -ИНФ/ИЛ-10. Можно с уверенностью отметить, что цитокины, имеющие наиболее достоверные отличия, а также самую высокую диагностическую эффективность, играют значительную роль в патогенезе АЩЖ. Среди изучаемых цитокинов и их соотношений такими данными обладал ИЛ-6. 

Таблица 4

Показатели некоторых расчетных индексов цитокинов, хемокина,

молекул межклеточной адгезии в плазме крови в контроле, у больных

с аутоиммунными заболеваниями, злокачественными и доброкачественными опухолями щитовидной железы

Исследуемые

показатели

Группы больных и контроля

I

(контроль),

n=10

II

(АИЗЩЖ),

n=12

III

(АЩЖ),

n=15

IV

(РЩЖ),

n=24

Индекс
-ИНФ/ИЛ-4

22,85±8,5

8,36±7,28

214,38±172,69~

7,72±5,45

Индекс
-ИНФ/ИЛ-10

85,35±8,64

64,83±27,44

  43,70±20,62 ~

24,53±16,83 ^

Индекс
-ИНФ/ФНО-

  101,74±6,94

79,20±34,5

100,37±46,13

52,54±38,81

Индекс
ИЛ-6/-ИНФ

90,15±9,95

485,9±171,5

282,4±169,2~

2664,9±1198,5*

Индекс
-ИНФ/MCP-1

7,78±0,65

5,00±2,35

  5,42±2,53

4,19±3,52

Индекс
-ИНФ/sE-seleсtin

21,45±1,38

18,62±9,97

22,17±9,47

12,48±9,01

Индекс
-ИНФ/ sICAM-1

3,64±0,33

2,97±1,11

2,78±1,74

2,3±1,12

Примечание.  – статистическая достоверность между группами I и II, III, IV (р<0,05); ~ – статистическая достоверность между группами II и III (р<0,05); ^ – статистическая достоверность между группами II и IV (р<0,05); – статистическая достоверность между группами III и IV (р<0,05).

Для дифференциальной диагностики злокачественных новообразований ЩЖ и практически здоровых пациентов были получены пороговые значения для следующих показателей цитокинов: ИЛ-6, ИЛ-10, MCP-1, sE-seleсtin и соотношений – индекс -ИНФ/ИЛ-4, индекс -ИНФ/ИЛ-10, индекс -ИНФ/MCP-1, индекс -ИНФ/sE-seleсtin и индекс ИЛ-6/-ИНФ. Среди используемых в диагностике цитокинов важную роль в патогенезе развития РЩЖ имеют интерлейкины ИЛ-6, ИЛ-10 и хемокин MCP-1.

Нами определены и рассчитаны критические значения для показателей цитокинов и их соотношений, которые могли бы использоваться в дифференциальной диагностике злокачественных и аутоиммунных заболеваний ЩЖ. Это такие цитокины, как ИЛ-10, MCP-1, sE-seleсtin и индекс -ИНФ/ИЛ-10. Эти показатели имели удовлетворительные и хорошие значения диагностической эффективности и поэтому в той или иной мере принимали участие в патогенезе развития РЩЖ железы.

В дифференциальной диагностике доброкачественных новообразований и аутоиммунного заболевания ЩЖ было доказано, что можно использовать показатели цитокинов ИЛ-6, ИЛ-10 и молекулы межклеточной адгезии sICAM-1, а также с высокой эффективностью применять расчетные индексы -ИНФ/ИЛ-4,
-ИНФ/ИЛ-10, ИЛ-6/-ИНФ. Представленные показатели также имели хорошую и удовлетворительную диагностическую информативность, однако не было возможности выделить наиболее значимые цитокины, которые могли бы участвовать в патогенезе развития АЩЖ.

Наиболее сложной в диагностическом плане является дифференциальная диагностика злокачественных и доброкачественных новообразований, основанная на пороговых значениях цитокинов. Было выявлено, что в диагностике рака и аденомы ЩЖ можно применять ИЛ-6, sE-seleсtin, а также использовать индекс  ИЛ-6/-ИНФ. В связи с относительно удовлетворительной и хорошей диагностической эффективностью используемых нами показателей не было возможности предложить наиболее эффективный цитокин, который мог бы вносить значительный вклад в патогенез РЩЖ и отличать ее от АЩЖ с 99,9% эффективностью.

В этой связи нами разработана на основе регрессивного анализа логистическая модель, которая включала используемые показатели некоторых наиболее значимых цитокинов и индекса ИЛ-6/-ИНФ для улучшения диагностики рака щитовидной железы от аденомы. Полученная модель обладает более высокой достоверностью различия и более высокими показателями точности и специфичности и позволяет использовать ее для диагностики этих схожих по механизму канцерогенеза патологий.

В результате проведенного логического регрессивного анализа была получена следующая формула модели:

Y= 0,017X1+0,005X2+0,0000774Х3+1,654,

где Y – рассчитанный коэффициент, равный 2,2485; Х1 – значение ИЛ-6; Х2 – значение sE-seleсtin; Х3 – значение индекса ИЛ-6/-ИНФ; 1,654 – константа А (определяет смещение по оси ординат).

При Y более 2,2485 была высока вероятность развития РЩЖ.

При Y менее 2,2485 вероятность развития рака отсутствовала и соответственно была высока вероятность развития АЩЖ.

Сравнительная характеристика sE-seleсtin, ИЛ-6, индекса ИЛ-6/-ИНФ и разработанной нами модели с показателями достоверности, площади под ROC-кривой, чувствительности, специфичности и точности методов представлена в табл. 5.

Таким образом, полученная в результате логистического регрессивного анализа модель диагностики РЩЖ у больных с доброкачественными и злокачественными новообразованиями, основанная на анализе показателей, имевших достоверные различия между группами, сравниваемыми по ИЛ-6 и sE-seleсtin, является более диагностически эффективной и обладает более высокой достоверностью (р=0,005) и более высокими значениями площади под ROC-кривой (0,914).

Таблица 5

Диагностическая эффективность использования sE-seleсtin, ИЛ-6, индекса ИЛ-6/-ИНФ и разработанной логистической регрессивной модели при дифференциальной диагностике злокачественных и доброкачественных новообразований щитовидной железы

Показатель

Значение

Достовер-ность,

р

Площадь

под

кривой

AUC

Чувстви-тель-

ность,

%

Специ-
фич-
ность,

%

Точность

метода,

%

ИЛ-6

Более 18,16

0,015

0,857

71,4

80

75,7

sE-selektin

Более 56,39

0,04

0,800

71,4

90

80,7

Индекс
ИЛ-6/-ИНФ

Более 421,32

0,015

0,857

85,7

90

87,95

Логистиче-ская модель

Более 2,2584

0,005

0,914

85,7

80

82,85

В процессе исследования цитокинов и их индексов можно использовать следующий простой алгоритм диагностики по одному показателю между аутоиммунными, злокачественными и доброкачественными заболеваниями ЩЖ.

Для дифференциальной диагностики между злокачественными и аутоиммунными заболеваниями мог использоваться показатель MCP-1, который не был диагностическим критерием в других группах.

Показатель величины sICAM-1 был характерен для диагностики между доброкачественными и аутоиммунными заболеваниями ЩЖ.

Для дифференциальной диагностики между раком и аденомой ЩЖ можно использовать величину соотношения ИЛ-6/-ИНФ или логистическую регрессионную модель.

Таким образом,  в патогенезе заболеваний ЩЖ некоторые цитокины играли ключевую роль и не могли быть использованы для диагностики в других исследуемых группах. Так, например, при РЩЖ определяющее значение имела растворимая форма молекулы адгезии sE-seleсtin, при АЩЖ – растворимая форма молекулы межклеточной адгезии 1-го типа sICAM-1, а при аутоиммунных тиреоидитах определяющее значение имел цитокин ИЛ-4.

В работе представлены исследования FAS-L-рецепторов на поверхности иммунокомпетентных клеток основных, хелперных и эффекторных субпопуляциях лимфоцитов у больных со злокачественными заболеваниями ЩЖ и в контрольной группе.

У больных со злокачественными заболеваниями ЩЖ показано значительное повышение FAS-L на основных субпопуляциях лимфоцитов: общих Т-лимфоцитов с FAS-L, В-лимфоцитов с FAS-L, Т-хелперов с FAS-L, Т-цитотоксических с FAS-L, натуральных киллерных клеток (лимфоцитов, несущих маркер CD16+) с FAS-L. При одновременном значительном увеличении на основных, хелперных и эффекторных клетках маркеров CD178+ отмечалось незначительное снижение плотности распределения этого маркера.

Значительное повышение CD178+-рецепторов на основных субпопуляциях иммунокомпетентных клеток у больных со злокачественными новообразованиями ЩЖ, особенно на эффекторных клетках (CD8+- и CD16+ -лимфоцитах), позволяет предположить создание иммунной системой больного человека условий для контакта с опухолевыми клетками посредством механизма FAS-L/FAS запуска процессов апоптоза в опухолевых клетках. Наличие повышенного количества FAS-L на других клетках позволяет предположить, что посредством механизма отбрасывания FAS-L в растворимую форму увеличивается количество FAS-L в крови и позволяет сывороточному FAS-L достигать удаленных участков тканей и провоцитовать апоптоз в клетках, содержащих большое количество FAS-рецептора, например, на тиреоцитах у больных с АИЗЩЖ.

Были разработаны и представлены в работе критические значения и оценена диагностическая эффективность показателей, имеющих достоверные различия в контрольной группе и группе больных РЩЖ для проведения дифференциальной диагностики РЩЖ по показателям количества иммунокомпетентных клеток и плотности распределения рецепторов на поверхности в каждой группе, несущих маркеры FAS-L.

Интересные результаты получены при исследовании показателей апоптоза и пролиферации в тканях ЩЖ у больных с аутоиммунными заболеваниями, доброкачественными и злокачественными новообразованиями ЩЖ.

Исследовалась суспензия клеток, приготовленных из морфологически измененной ткани ЩЖ, по данным основных маркеров, регулирующих апоптоз и пролиферацию (количество клеток, несущих маркеры CD95, CD95L, p53, bcl-2, Ki-67, и плотность их экспрессии в группах клеток, позитивных по одному из маркеров).

В работе также представлено исследование количества клеток с сочетанными (комбинированными) маркерами апоптоза и пролиферации и плотности распределения рецепторов в этих группах клеток в тканях исследуемых групп больных.

Выявлено значительное увеличение количества клеток с маркерами FAS на мембранах тиреоцитов у больных с аутоиммунными тиреоидитами. У больных этой же группы отмечено повышенное содержание клеток с маркерами СD178+ по сравнению с больными из группы доброкачественных и злокачественных новообразований. 

Анализ количества клеток с онкосупрессором р53 (общим) выявил наличие повышенного количества клеток в группе больных аутоиммунными тиреоидитами (66,9±3,9%). Значение плотности рецепторов р53 (общего) было наибольшим в группах больных АЩЖ (4,79±1,09) и аутоиммунными заболеваниями, где этот показатель составил 4,07±0,28. Количество клеток с белком р53dim было значительно повышено у больных РЩЖ – 51,07±6,81%, статистически достоверно (р=0,026) отличаясь от этого показателя у больных АЩЖ, где количество клеток с белком р53dim составило 38,73±5,42%. Обнаружено значительное снижение количества клеток с фенотипом р53bright в группе больных РЩЖ (9,07±3,85%) по сравнению с больными АЩЖ – 21,82±7,84% (р=0,003) и АИЗЩЖ – 19,21±1,75% (р=0,0001). Плотность экспрессии белка р53 в группе р53bright - клеток была значительно снижена у больных РЩЖ и составила 7,27±0,85 по сравнению с этим показателем в группах больных АЩЖ (10,93±2,21) (р=0,0001)  и аутоиммунными тиреоидитами (9,28±1,07) (р=0,033).

Исследование внутриклеточного маркера пролиферации Ki-67 у пациентов с заболеваниями ЩЖ показало, что количество клеток, несущих данный маркер, было наибольшим при АИЗЩЖ (4,23±1,86%) и минимальным при АЩЖ (1,49±0,58%) и РЩЖ (1,45±0,77%).

Динамика содержания общего количества клеток с антиапоптотическим  белком bcl-2 у больных с патологией ЩЖ выявила, что общее количество клеток с белком bcl-2 было наибольшим у пациентов с аутоиммунными тиреоидитами (82,52±2,01%) и сопровождалось повышенной величиной плотности распределения этого внутриклеточного белка (8,12±0,65). Общее количество клеток у больных АЩЖ составило 70,11±10,36%, а величина его плотности – 4,51±1,65. У больных РЩЖ количество клеток с bcl-2 составило 70,54±8,37%, показатель плотности распределения белка в исследуемых клетках был значительно снижен и составил 2,36±0,49.

Выявлено, что количество клеток с bcl-2dim у пациентов с аутоиммунными заболеваниями было минимальным и составило 28,25±4,48% при относительно небольшой величине плотности распространения этого белка – 1,71±0,11. У больных АЩЖ показатели количества bcl-2dim-клеток были более высокими в сравнении с группой пациентов с АИЗЩЖ и составили 48,47±12,83% и при более низких значениях плотности распространения bcl-2dim – 1,53±0,1. Наиболее высокие показатели количества bcl-2dim-клеток обнаружены у больных РЩЖ – 56,44±9,95% при схожей с группой АЩЖ величине плотности распределения bcl-2-белка – 1,59±0,15.

Наиболее интересные результаты получены при сравнительном анализе показателей количества bcl-2bright-клеток и величин плотности экспрессии bcl-2-белка в исследуемых группах. Наибольшее количество клеток с фенотипом bcl-2bright  и показатель плотности распределения белка bcl-2 в bcl-2bright-клетках были обнаружены у больных аутоиммунными тиреоидитами и составили 51,48±3,82% и 12,32±0,08 соответственно. В группе больных с доброкачественными опухолями ЩЖ количество bcl-2bright-клеток было в 2,5 раза ниже, чем в группе больных АИЗЩЖ, и составил 18,12±7,29%; при этом показатель плотности экспрессии белка bcl-2 в этой группе клеток незначительно превышал этот же показатель в группе АИЗЩЖ и составил 13,66±2,79. В группе больных РЩЖ обнаружено значительное снижение показателя количества клеток с фенотипом bcl-2bright  (8,85±2,76%), а также показателя плотности распределения белка bcl-2 в bcl-2bright-клетках, значение которого не превышало 8,32±1,03. Получены статистически значимые различия по показателю количества bcl-2bright-клеток как между группами больных РЩЖ и АЩЖ (р=0,042), так и между группами РЩЖ и аутоиммунными заболеваниями ЩЖ (р=0,0001), а также по величине плотности экспрессии bcl-2 в этой группе клеток между группами РЩЖ и АЩЖ (р=0,001) и в группах РЩЖ и аутоиммунными тиреоидитами (р=0,0001).

Представлены данные по исследованию комбинированных показателей апоптоза и пролиферации у больных с заболеваниями ЩЖ. Так, обнаружено, что у больных аутоиммунными тиреоидитами повышено количество всех групп сочетанных клеток (р53/Ki-67, p53/CD95, bcl-2/Ki-67, bcl-2/CD95, CD95/Ki-67, р53/CD95L, CD95/CD95L, bcl-2/CD95L) в 3-25 раз по сравнению с группой пациентов с новообразованиями ЩЖ. Наибольшие различия выявлены в группе клеток bcl-2/ CD95, которые имели более чем 25-кратное их превышение у больных АИЗЩЖ по сравнению с пациентами с новообразованиями.

Количество сочетанных клеток у больных с новообразованиями было значительно снижено, а достоверные различия между группами больных АЩЖ и РЩЖ выявлены только лишь при анализе количества р53/CD95L-позитивных клеток. Незначительное достоверное превышение количества р53/CD95L-клеток в группе аденом ЩЖ по сравнению с РЩЖ позволяет использовать этот показатель в дополнительной диагностике раков и аденом ЩЖ. Достоверно сниженным в этой группе клеток оказался показатель плотности распределения белка р53 у больных РЩЖ в отличие от пациентов с аденомой ЩЖ. Еще одной характерной особенностью пациентов с новообразованиями ЩЖ явилось 4-7-кратное увеличение плотности CD95L-рецепторов на CD95/CD95L-позитивных клетках, при этом плотность CD95L-рецепторов на CD95/CD95L-клетках ткани аденомы ЩЖ была наиболее высокой, а плотность этих рецепторов в тканях рака ЩЖ была минимальной для новообразований ЩЖ.

Нами были рассчитаны диагностическая эффективность, пороговые значения у показателей количества клеток и плотности распределения общих рецепторов/белков  по общим и сочетанным показателям апоптоза и пролиферации,  которые имели достоверные различия между группами сравнения: группами больных с аутоиммунными, доброкачественными и злокачественными новообразованиями.

В дифференциальной диагностике рака и АИЗЩЖ наибольшую диагностическую информативность имели следующие показатели: количество CD95-позитивных клеток, количество CD95L-позитивных клеток, количество bcl-2dim-позитивных клеток, количество bcl-2bright-позитивных клеток и плотность распределения белка bcl-2bright в bcl-2 bright-позитивных клетках ЩЖ. Остальные показатели имеют хорошую диагностическую эффективность и могут быть рекомендованы как дополнительные маркеры дифференциальной диагностики РЩЖ и аутоиммунных тиреоидитов.

В дифференциальной диагностике аденом и аутоиммунных заболеваний ЩЖ высокие показатели достоверности, диагностической чувствительности и специфичности используемых методов выявили значения следующих показателей: количество CD95-позитивных клеток, количество CD95L-позитивных клеток и плотность распределения белка bcl-2 в bcl-2-позитивных клетках ЩЖ. Другие показатели, используемые в диагностике АЩЖ и аутоиммунного тиреоидита, показали очень хорошую, хорошую и удовлетворительную диагностическую эффективность.

Наибольшие сложности возникали в дифференциальной диагностике  рака и аденом ЩЖ. Нами были выявлены показатели, которые имели высокую достоверность получаемых результатов, но не обладали столь же хорошей и отличной диагностической эффективностью. Это создает определенные трудности в дифференциальной диагностике данных нозологий и не позволяет с высокой степенью надежности использовать показатели апоптоза и пролиферации для этих целей, что способствует поиску новых диагностических маркеров.

Для данного вида диагностики мы рекомендуем использовать комбинированные показатели апоптоза и пролиферации по количеству клеток, применение которых с высокой достоверностью и отличными показателями чувствительности, специфичности и точности позволяет дифференцировать РЩЖ от аутоиммунного тиреоидита: bcl-2/Ki-67, bcl-2/CD95, p53/CD95L, CD95/CD95L, bcl-2/CD95L.

Содержание клеток с маркерами bcl-2/CD95 (рис. 2) было очень высоким в группе пациентов с АИЗЩЖ и достигало значений 47,2±1,82%; количество
bcl-2/CD95-клеток у больных РЩЖ и АЩЖ было на низком уровне и составило 1,19±0,59 и 1,87±0,57% соответственно. Различия между группами больных со злокачественными новообразованиями и аутоиммунными заболеваниями ЩЖ были найдены по показателям количества bcl-2/CD95-клеток (р=0,0001). Между группами больных с аденомами и аутоиммунными заболеваниями ЩЖ выявлены значимые различия по количеству bcl-2/CD95-клеток (р=0,0001) и показателю плотности экспрессии белка bcl-2 (р=0,019). Отмечены лишь незначительные достоверно значимые различия в 98,9% по величине плотности экспрессии bcl-2-белка на CD95/bcl-2-клетках у больных раком и аденомой ЩЖ.

Кроме пяти групп клеток в дифференциальной диагностике РЩЖ и аутоиммунного тиреоидита имеется достаточно большое количество показателей плотности экспрессии рецепторов в этих группах клеток, которые могут быть полезны как дополнительные дифференциально-диагностические маркеры с очень хорошими, хорошими и удовлетворительными показателями диагностической эффективности.

 

А Б

В

Рис. 2. Гистограммы показателей групп bcl-2/CD95-клеток с сочетаниями маркеров

апоптоза в тканях щитовидной железы у больных с аутоиммунными (А),

доброкачественными (Б) и злокачественными (В) заболеваниями

В дифференциальной диагностике аденом и аутоиммунных заболеваний ЩЖ наиболее значимыми показателями могут служить следующие сочетания клеток с фенотипами: р53/CD95, bcl-2/Ki-67, bcl-2/CD95, CD95/CD95L, bcl-2/CD95L, отличающиеся наивысшей диагностической эффективностью. Выявлены и другие показатели, отвечающие высоким параметрам диагностической эффективности, которые можно использовать в дифференциальной диагностике аденом и аутоиммунных тиреоидитов, например по параметрам плотности распределения рецепторов/белков в группах клеток с сочетанными маркерами апоптоза и пролиферации.

Наибольшую сложность представляли дифференциальная диагностика рака и аденомы ЩЖ, а также выявление диагностических критериев, которые обладали высокой диагностической информативностью и позволяли дифференцировать рак и аденому ЩЖ.

Анализ полученных данных показал, что в диагностике этих двух схожих нозологий наибольшую диагностическую эффективность имели показатели количества p53/CD95L-клеток, а также плотности распределения белка р53 в группе p53/CD95L-клеток, но они не обладали отличной диагностической информативностью. Определены и другие показатели, в основном плотности распределения в комбинированных группах клеток рецепторов/белков, которые могли бы использоваться в дифференциальной диагностике рака и аденомы ЩЖ. Однако все эти показатели имели главным образом неудовлетворительную и удовлетворительную диагностическую эффективность, которая не может быть рекомендована в практику специалистам клинической лабораторной диагностики.

Проведенные исследования общих маркеров апоптоза и пролиферации у больных с папиллярным и фолликулярным РЩЖ показывают наличие значительных различий между этими вариантами РЩЖ.

Количество CD178+-клеток было повышено у пациентов с фолликулярным РЩЖ и составило 36,52±4,28%, при этом его плотность распространения была минимальной – 5,59±0,52. При папиллярном РЩЖ количество CD178+-клеток было минимальным (5,97±2,46%), почти в 6 раз отличалось от количества CD178+-клеток, выявленных при фолликулярном раке; при этом плотность экспрессии CD95L-рецепторов значительно повышалась на мембране исследуемых клеток ткани папиллярного РЩЖ и составила 24,79±9,53.

Выявлены и другие показатели белков, регулирующих в основном  апоптоз, которые могут быть рекомендованы в дифференциальной диагностике папиллярного и фолликулярного варианта РЩЖ, однако они обладали меньшей, но вполне удовлетворительной диагностической информативностью.

Таким образом, фолликулярный вариант РЩЖ в основном характеризовался достоверно повышенным количеством клеток с рецептором CD178+ (CD95L, FAS-L).

Были исследованы количество клеток и показатели плотности распределения рецепторов/белков с использованием комбинированных показателей апоптоза и пролиферации у пациентов с фолликулярными и папиллярными вариантами РЩЖ.

Выявлено несколько групп клеток с комбинированными маркерами, которые были повышены, а в некоторых случаях значительно повышены у больных фолликулярными РЩЖ. Это группы клеток с фенотипами: р53/Ki-67, bcl-2/Ki-67, p53/CD95L, среди которых выделялась группа клеток с сочетанными маркерами bcl-2/CD95L, повышение которых было максимальным и отличалось более чем в 10 раз от этого показателя в группе больных папилллярным РЩЖ.

Большое значение следовало бы уделить некоторым стабильным показателям сочетанных маркеров апоптоза и пролиферации, в частности показателям плотности распределения белков/рецепторов в исследуемой суспензии клеток и на их поверхности; их различие более чем на 20-30% позволяло предполагать значительный вклад этих параметров в диагностику разных вариантов РЩЖ. Нами выявлены достаточно убедительные превышения в показателях плотности экспрессии: белков р53 в клетках с фенотипом р53/Ki-67, белков bcl-2 и рецепторов CD95 в клетках с фенотипом bcl-2/CD95, рецепторов CD95 и белка Ki-67 в клетках с фенотипом CD95/Ki-67, белков р53 и рецептора CD95L в клетках с фенотипом р53/CD95L, рецепторов CD95 в клетках с фенотипом CD95L/CD95 и белков bcl-2 и рецепторов CD95L в клетках с bcl-2/CD95L-фенотипом у больных папиллярным РЩЖ. Аналогичные изменения, выразившиеся в повышении плотности экспрессии белка bcl-2 в клетках с bcl-2/Ki-67-фенотипом, были нами зафиксированы у больных фолликулярным РЩЖ.

В работе представлены расчеты пороговых значений и оценена диагностическая эффективность общих и комбинированных показателей апоптоза и пролиферации, которые могут использоваться в дифференциальной диагностике папиллярного и фолликулярного РЩЖ.

В исследовании были проанализированы результаты общих параметров апоптоза и пролиферации в морфологически не измененных тканях ЩЖ («нормальных»), забранных из доли органа, где опухолевого процесса не было, в сравнении с тканями, взятыми из участков, пораженных папиллярным РЩЖ. 

Минимальные различия «нормальных» и опухолевых тканей в ЩЖ, пораженной опухолевым процессом, а также практическое отсутствие достоверных различий по большему количеству исследуемых показателей, в основном характеризующих наиболее важные параметры апоптоза, могут считаться достаточными аргументами в пользу поддержки гипотезы о генетически детерминированном процессе в органе, в котором выявлен папиллярный РЩЖ. Различия, выявленные лишь в количестве клеток с рецептором CD95 и маркерами пролиферативной активности (Ki-67), не дают веских оснований дифференцировать эти ткани, взятые из одного органа.

Вне зависимости от того, в каком анатомическом участке ЩЖ морфологически выявлен рак, уже в морфологически не измененных участках нормальной ткани на внутриклеточном уровне отмечаются близкие к опухолевому процессу нарушения в механизмах апоптоза, снижении пролиферативной активности клеток.

При продолжении поиска закономерностей были проанализированы параметры комбинированных маркеров апоптоза и пролиферации в «нормальных» тканях и опухоли при папиллярном РЩЖ. Выявлено пять групп клеток, которые достоверно различались между собой по количественному составу: p53/Ki-67, p53/CD95, bcl-2/CD95, CD95/Ki-67, bcl-2/CD95L. В «нормальных» тканях ЩЖ количество клеток с выявленными фенотипами клеток было увеличено в 2-5 раз по сравнению с тканями, забранными из опухоли ЩЖ. Снижение количества клеток с комбинированными маркерами в опухолевых тканях могло быть косвенным свидетельством снижения полиморфизма клеток и характерным признаком бластомогенеза. Полученные различия по пяти фенотипически малочисленным группам клеток позволяют нам использовать их в дополнительной диагностике зоны поражения опухолевого процесса, что было практически невозможным при анализе основных маркеров, регулирующих апоптоз и описанных выше.

С учетом наилучших показателей диагностической эффективности (по параметрам сходимости результатов, чувствительности, специфичности и точности) в  дополнительной дифференциальной диагностике между «нормальной» и патологической тканями ЩЖ может применяться такой показатель, как количество клеток с фенотипом p53/CD95. Остальные четыре группы клеток показали хорошую диагностическую информативность и могут также быть рекомендованы для дифференциальной диагностики в следующем порядке по мере убывания эффективности диагностических показателей количества клеток с фенотипами: p53/CD95, p53/Ki-67, bcl-2/CD95L, bcl-2/CD95.

Были проанализированы показатели общих маркеров апоптоза и пролиферации в тканях у больных с АЩЖ. В процессе исследования выявлено, что у больных с доброкачественными новообразованиями имелись два типа АЩЖ, различающихся по фенотипу. Основным отличием от основной (аденомы I типа) группы АЩЖ в выявленной группе аденом II типа явилось наличие повышенного количества клеток с мембранным рецептором FAS-L. По нашим данным, частота встречаемости аденом II типа составила 24%. Повышенная экспрессия FAS-L в АЩЖ может служить фактором плохого прогноза опухоли, возможным ее быстрым ростом и перерождением из доброкачественного процесса в злокачественный. Поэтому выделение аденом с повышенной экспрессией в отдельную группу и изучение фенотипа этих новообразований представляет определенную научную и прогностическую ценность.

Анализ количества CD95L-клеток, содержащихся в суспензии, приготовленной из аденом ЩЖ, показал, что число CD178+-клеток было очень высоким
(рис. 3) у больных с аденомой II типа и составило 54,54±12,84%, статистически достоверно отличаясь (р=0,002) от этого показателя у больных с аденомой I типа, где этот показатель был равен 5,96±2,15%. Показатель плотности распределения рецептора CD95L имел тенденцию к 3-кратному снижению в аденомах II типа (3,82±0,46), а в группе пациентов с основным типом АЩЖ это значение было равно 9,86±5,69.

В диагностике аденом разных типов могли помочь и показатели количества клеток с белком р53 и плотности распределения белка р53 в исследуемой группе р53-позитивных клеток. Значимыми оказались показатели количества р53-клеток, которые были наиболее высокими (93,74±4,98%) в аденомах II типа, достоверно отличаясь (р=0,002) от этого показателя в аденомах I типа (64,72±15,2%). Значение плотности экспрессии белка р53 в этой группе клеток было наибольшим (13,56±3,08) в аденомах II типа, статистически отличаясь (р=0,002) от этого показателя (4,79±2,09) в аденомах I типа.

Заслуживают внимания данные, полученные при анализе общего количества р53dim-клеток: наибольшее количество клеток отмечено в аденомах I типа –38,73±16,22%, в аденомах II типа – 8,5±2,67% (р=0,002) (см. рис. 4). Плотность распределения белка р53 в р53dim-позитивных клетках изучаемых групп больных была достоверно большей в аденомах II типа (1,77±0,07), статистически достоверно отличаясь (р=0,005) от значения этого же показателя (1,55±0,08) в аденомах I типа.

Подобные достоверные различия (р=0,002) выявлены и при сравнении количества р53bright-клеток (см. рис. 3). Количество р53bright-клеток было значительно повышено у больных с аденомой II типа – 83,25±9,8%, в то время как у больных аденомой I типа количество р53bright-клеток было намного ниже – 21,82±19,84%. Обнаружены также статистически значимые различия (р=0,011) в величинах

 

 

 

  А Б

Рис. 3. Гистограммы общего количества клеток с маркерами, регулирующими апоптоз CD95L, р53, р53dim, р53bright, bcl-2, bcl-23dim, bcl-2bright у больных с разными типами

аденомы щитовидной железы: А – аденома I типа; Б – аденома II типа

плотностей распределения белка р53 в р53bright-клетках у больных аденомой I типа (10,93±2,21) в сравнении с аденомами II типа (14,84±1,34).

Выявлено статистически значимое (р=0,002) более чем 40-кратное повышение количества клеток, экспрессирующих маркер Ki-67, в группе пациентов с аденомой II типа – до 60,12±18,1% по сравнению с аденомой I типа, где этот показатель составил 1,45±0,77%. В то же время не было получено достоверных различий (р=0,131) между группами больных с аденомами двух типов по показателю плотности распределения белка Ki-67 в исследуемых клетках. Высокий показатель плотности распределения белка Ki-67 обнаружен в аденомах II типа (4,83±0,73) против 3,26±3,68 в аденомах I типа.

Обнаружено различие в показателях количества bcl-2-клеток в аденомах разных типов. Так, число bcl-2-клеток в аденомах II типа было значительно достоверно выше (р=0,002) (95,47±4,2%) по сравнению с аденомами I типа (71,47±10,36%). Обнаружены статистически значимые различия (р=0,002) по величинам плотности распределения белка bcl-2 в bcl-2-позитивных клетках между аденомами II типа (16,22±2,23) и I типа (4,51±1,65).

Показатели количества bcl-2dim-клеток (см. рис. 3) также достоверно (р=0,002) повышены (48,47±12,83%) в аденомах I типа и значительно снижены в аденомах II типа (5,24±3,32%). Величина плотности распределения bcl-2-белка в исследуемой группе bcl-2dim-клеток была повышена в аденомах II типа и составила 1,73±0,06, достоверно отличаясь (р=0,006) от этого показателя при аденомах II типа, где он был достоверно ниже и составил 1,51±0,1.

Иная динамика отмечена при сравнительном анализе показателей  количества bcl-2bright-клеток в группах сравнения (см.рис. 3). Количество bcl-2bright-клеток было значительно достоверно (р=0,002) выше в аденомах II типа (89,85±8,44%), чем в аденомах I типа (18,12±15,29%). Не выявлены достоверные различия (р=0,059) между показателями плотности экспрессии белка bcl-2 в группе bcl-2bright-позитивных клеток в аденомах II типа (16,67±0,93) и I типа (13,66±2,79).

Таким образом, исследование общих маркеров, регулирующих апоптоз и пролиферацию в группе клеток у больных с АЩЖ, позволило выделить фенотипически отличный вариант АЩЖ (аденома II типа) и изучить распределение числа клеток и плотности рецепторов/белков в двух типах аденом.

Выявленная группа аденом II типа обладала отличительными фенотипическими особенностями, выраженными в повышенном, а иногда и в значительно повышенном количестве клеток с маркерами CD95L, p53, p53dim, p53bright, Ki-67, bcl-2, bcl-2dim, bcl-2bright, что предполагало наличие агрессивной пролиферативной активности, повышенного участия клеток в механизмах апоптоза и, по всей видимости, неблагоприятного прогноза развития опухолей с возможностью перерождения доброкачественного процесса в злокачественный, например в фолликулярный РЩЖ, обладающий сходными фенотипическими особенностями.

Выявленное значительное повышение количества FAS-L в аденомах II типа может быть также плохим прогностическим признаком при проведении химиотерапии, так как считается, что в некоторых типах опухолевых клеток цитостатики индуцируют апоптоз, усиливая экспрессию лигандов и рецепторов семейства TNF. Следовательно, резистентность к сигналам рецепторов смерти наделяет опухолевые клетки химиорезистентным фенотипом.

Изучены диагностическая информативность и пороговые значения показателей маркеров, регулирующих апоптоз и пролиферацию, в дифференциальной диагностике аденом I и II типа. Выявлены критические значения по всем исследуемым параметрам белков/рецепторов: CD95L, p53, p53dim, p53bright, Ki-67, bcl-2, bcl-2dim, bcl-2bright, регулирующих апоптоз и пролиферацию, с очень хорошими и отличными параметрами диагностической эффективности значений количества клеток ЩЖ и большинства показателей плотности распределения рецепторов и белков в/на клетках ЩЖ.

Проведены исследования количества клеток и плотности распределения рецепторов/белков сочетанных маркеров апоптоза и пролиферации в аденомах ЩЖ разных типов.

Проведены исследования количества клеток и плотности распределения рецепторов/белков в сочетании нескольких маркеров, регулирующих апоптоз и пролиферацию, в АЩЖ разных типов, что позволило выявить четыре группы клеток с фенотипами p53/Ki-67, bcl-2/Ki-67, CD95/Ki-67, bcl-2/CD95L, которые достоверно отличали АЩЖ II типа от АЩЖ I типа. Однако лишь в двух группах клеток превышение было настолько значительным, что позволяло использовать эти показатели в диагностике с наибольшей достоверностью. Превышение в 58 раз количества клеток с фенотипом p53/Ki-67 и в 23 раза клеток с фенотипом bcl-2/CD95L в аденомах ЩЖ II типа бесспорно делает использование этих показателей диагностически и практически эффективными в сравнении с аналогичными показателями в АЩЖ I типа (рис. 4).

 

 

А  Б

Рис. 4. Гистограммы количества p53/Ki-67- и bcl-2/CD95L-клеток в различных

типах аденом щитовидной железы: А – аденома I типа; Б – аденома II типа

Еще одной отличительной особенностью аденом II типа следует считать характе-ристики повышенной плотности экспрессии практически всех белков/рецепторов на диагностически  важных фенотипически определенных группах клеток в сравнении  с этими же показателями плотности в тканях АЩЖ I типа. Лишь в одном случае не соблюда-

лось характерологическое соответствие повышенной плотности экспрессии рецепторов (белков) повышенному количеству комбинированных (сочетанных) групп клеток  в  аденоме II типа, выразившееся в 3-кратном достоверном снижении показателя плотности экспрессии рецептора CD95L на клетках с фенотипом CD95/CD95L в сравнении с АЩЖ I типа.

Были проанализированы расчеты критических показателей и значений диагностической эффективности для проведения дифференциальной диагностики аденом I и II типа по показателям групп клеток и плотности распределения белков/рецепторов с использованием общих и сочетанных маркеров апоптоза и пролиферации. Выявлено, что отличную диагностическую эффективность по показателям чувствительности, специфичности и точности оценки метода в 99,9% показали группы клеток с фенотипами p53/Ki-67, bcl-2/Ki-67 и bcl-2/CD95L и некоторыми показателями плотности распределения белков/рецепторов в других группах клеток.

Сравнительная характеристика общих показателей, регулирующих апоптоз  и пролиферацию в «нормальных» тканях и АЩЖ, выявила незначительные достоверные отличия в основном на мембранных рецепторах (CD95, CD95L), принимающих участие в апоптозе, а также в перераспределении количества клеток с белком р53, выразившемся в снижении количества клеток р53dim и повышении p53bright-позитивных клеток.

Так, количество клеток с рецепторами CD95 у больных с аденомами ЩЖ в  3,3 раза превышало аналогичное число CD95-позитивных клеток в морфологически не измененных тканях ЩЖ, забранных из другой доли пораженного аденомой органа. Количество клеток с фенотипом CD95L в аденоматозной ткани ЩЖ превышало этот показатель в гистологически не измененных тканях на 75%. Отмечено, что при сравнимом уровне общего количества клеток с фенотипом р53+ в исследуемых тканях ЩЖ количество клеток р53dim достоверно снижалось в тканях с АЩЖ на 87%, а количество  клеток с фенотипом p53bright  в 2,8 раза достоверно резко возрастало. Такое перераспределение было характерным  для АЩЖ  и  свидетельствовало о готовности  и повышенной активности мембранных рецепторов и внутриклеточных апоптозных белков к запуску в трансформированных клетках естественного механизма программируемой клеточной гибели. Следует заметить, что в тканях АЩЖ отмечалось повышенное образование  прежде всего  апоптозных  рецепторов и белков  и  практически  отсутствовал достоверный рост антиапоптозных белков.

Сравнительный анализ групп  клеток  и плотности распределения рецепторов/белков  в/на клетках с сочетаниями маркеров апоптоза и пролиферации у пациентов, оперированных по поводу АЩЖ, в «нормальных» и патологических тканях выявил наличие четырех групп клеток с фенотипами р53/Ki-67, bcl-2/CD95, CD95/CD95L, bcl-2/CD95L. 

Показатель количества р53/Ki-67-клеток был увеличен на 77% при одновременно повышенной в 2,3 раза экспрессии белка р53 в р53/Ki-67-позитивных клетках в тканях АЩЖ. Наиболее  значительным  ростом (в 3,5 раза)  был отмечен уровень количества клеток с фенотипом bcl-2/CD95 в аденоматозной ткани ЩЖ. Почти в 2 раза выявлено увеличение количества клеток с фенотипами CD95/CD95L, bcl-2/CD95L в тканях АЩЖ по сравнению с «нормальной» морфологически не измененной тканью.

Была изучена диагностическая эффективность при дифференциальной  диагностике «нормальной» и патологической ткани ЩЖ у больных с аденомами.

Наиболее  значимыми среди изученных показателей по критериям диагностической  информативности являются показатели общего количества клеток с фенотипами CD95+, р53dim+; среди сочетанных маркеров - группа клеток с фенотипом bcl-2/CD95L (чувствительность – 83,3%, специфичность – 99,9%, точность метода – 91,6%).

Нами изучались также процессы инвазии и метастазирования злокачественных  и доброкачественных  новообразований  по некоторым  компонентам системы фибринолиза.

Изучены урокиназные и тканевые протеазы и их ингибитор у больных раками ЩЖ в зависимости от стадии заболевания и вовлеченности в процесс лимфатических узлов. Величина активатора плазминогена урокиназного типа увеличивалась по мере развития злокачественного процесса, начиная со II стадии заболевания и по мере вовлеченности в процесс лимфатических узлов. Отмечалось также линейное повышение активатора плазминогена тканевого типа у больных РЩЖ во II и IV стадии заболевания, при этом динамики по вовлеченности в процесс лимфатических узлов показателей тканевой протеазы выявлено не было. В результате исследования значений ингибитора плазминогена 1-го типа выявлено, что наиболее высокое значение этого показателя было обнаружено в III стадии заболевания РЩЖ и при вовлечении в процесс лимфатических узлов. Все это могло свидетельствовать о влиянии повышенной концентрации PAI-1 на подавление активности онкосупрессора р53 и торможение процессов апоптоза.

В патогенезе развития и прогнозе злокачественных и доброкачественных новообразований ЩЖ в подтверждение генетически детерминированной гипотезы развития опухолевого процесса в организме, наверное, главную роль играют поломки в генетическом аппарате клеток.

Нами исследованы мутации гена р53 в целях изучения степени его влияния на нарушения процессов пролиферации и апоптоза в тиреоцитах. Выявлено, что мутации гена встречаются у больных с аутоиммунными заболеваниями ЩЖ в 7,15% случаев, с доброкачественными новообразованиями – в 9,09% случаев и со злокачественными новообразованиями – в 19,2% случаев. Общий процент выявления мутации гена р53 у исследуемых больных с заболеваниями ЩЖ составил 10,9.

Изучена частота встречаемости мутации гена р53 в тканях, взятых из  разных участков ЩЖ при доброкачественных и злокачественных новообразованиях. Так, у больных с папиллярными раками ЩЖ выявлено в 12,5% случаев наличие мутации гена р53 в нормальной морфологически не измененной ткани ЩЖ. А у больных с доброкачественными новообразованиями выявлен один образец «нормальной» ткани, где была обнаружена мутация гена р53, которая встретилась в том же образце, где была выявлена мутация гена р53 в АЩЖ.

В заключение хочется отметить, что выполнено обширное комплексное исследование иммунной системы, цитокинов и молекул адгезии, FAS-L на иммунокомпетентных клетках в крови, а также определены общие и сочетанные показатели апоптоза и пролиферации в тканях ЩЖ, компонентов системы фибринолиза, проведены исследования генетического дефекта гена р53 в аутоиммунных, доброкачественных и злокачественных заболеваниях ЩЖ. 

Проведенные исследования позволили расширить наши познания о процессах в иммунной системе, в механизмах пролиферации и апоптоза тиреоцитов для более полного понимания патогенеза и прогноза развития прежде всего опухолевого и аутоиммунного процесса, а также использования в диагностической практике новых молекулярно-биологических маркеров.

ВЫВОДЫ

  1. Комплексный анализ некоторых параметров иммунной системы у больных с аутоиммунными, доброкачественными и злокачественными заболеваниями щитовидной железы позволяет установить, что у разных групп пациентов имели место свои нарушения показателей иммунитета, выражавшиеся у больных с аутоиммунными расстройствами развитием аутоиммунного состояния с наличием повышенных концентраций антител к тиреопероксидазе (микросомальной фракции) и тиреоглобулину, а у больных с доброкачественными и злокачественными новообразованиями – иммунодефицитного состояния.
  2. Результаты исследования цитокинов, хемокина и молекул межклеточной адгезии, соотношений цитокинов у больных с аутоиммунными заболеваниями, доброкачественными и злокачественными новообразованиями позволяют использовать их  в дополнительной дифференциальной диагностике этих нозологических  форм.
  3. Исследование экспрессии FAS-L-рецепторов на иммунокомпетентных клетках основных хелперных и эффекторных субпопуляциях лимфоцитов у больных со злокачественными новообразованиями щитовидной железы выявили наличие повышенного количества лимфоцитов с FAS-L, а также установили присутствие повышенного (в 100-70 раз) количества клеток с FAS-L на основных (хелперных, эффекторных) субпопуляциях лимфоцитов, что является косвенным признаком противоопухолевой активности иммунной системы.
  4. При анализе основных и сочетанных показателей апоптоза и пролиферации в тканях щитовидной железы у больных с аутоиммунными, доброкачественными и злокачественными новообразованиями выявлены фенотипические показатели пролиферативной активности, характерных особенностей, содержания рецепторного и белкового аппарата, принимающего участие в регуляции апоптоза в клетках исследуемых тканей, количественный состав клеток и плотности экспрессии этих маркеров. 
  5. Проведенные исследования фенотипа клеток в тканях щитовидной железы у больных с ненаследственными формами рака (папиллярный, фолликулярный) щитовидной железы выявили характерные различия в фенотипах общих и сочетанных показателей и на их основе позволили классифицировать исследуемые варианты рака щитовидной железы. Так, в дополнительной дифференциальной диагностике фолликулярного и папиллярного вариантов рака определяющее значение имеет показатель количества клеток с CD95L, который при значениях более 20,64% с достоверностью (р=0,002) и диагностической эффективностью в 99,9% свидетельствовал о наличии фолликулярного рака щитовидной железы.
  6. Выявлена группа аденом (аденомы II типа), значительно отличающихся по своим фенотипическим характеристикам, которая характеризовалась повышенным содержанием в суспензии клеток ткани ЩЖ маркеров пролиферации Ki-67 и рецепторов с CD95L, имела более выраженные изменения по количественному составу клеток с р53 и bcl-2-белками в р53, р53bright, bcl-2, bcl-2bright-позитивных клетках и повышенной плотности распределения этих белков в р53bright, bcl-2bright-клетках, а также большого количества клеток с сочетанными маркерами p53/Ki-67, bcl-2/Ki-67, CD95/Ki-67, bcl-2/CD95L. Все это может свидетельствовать о неблагоприятном прогнозе развития заболевания. В диагностическом плане для выявления аденом II типа нужно использовать показатели количества клеток p53/Ki-67, при значениях которых более 30,89% с достоверностью (р=0,002) и диагностической эффективностью в 99,9% выявляются аденомы II типа.
  7. Сравнительные исследования общих и сочетанных показателей  апоптоза  и пролиферации в морфологически не измененных и опухолевых тканях у больных с аденомами и раками щитовидной железы, взятых из одной железы, выявили наличие минимальных различий у больных со злокачественными новообразованиями и более выраженных изменений у больных с доброкачественными новообразованиями. Все это свидетельствовало о развитии на молекулярном (клеточном и внутриклеточном) уровне уже начавшихся процессов опухолевой трансформации в визуально и микроскопически не измененных тканях пораженной новообразованием щитовидной железы.
  8. Уровень активатора плазминогена урокиназного типа (uPA) прогрессивно возрастает с увеличением стадии заболевания, размера опухоли и наличия регионарных метастазов. Не обнаружено четкой взаимосвязи содержания uPA, tPA и PAI-1 в злокачественных опухолях щитовидной железы со степенью дифференцировки и типом роста опухолевого процесса.
  9. Выявлена частота мутации р53 у больных папиллярным раком ЩЖ -20,83%, аденомой – 9,1%, аутоиммунными тиреоидитами – 7,1%. Такая частота позволяет предложить выполнять раннее скрининговое исследование на предмет выявления данной мутации для возможности начать противораковые мероприятия на ранних этапах развития патологического процесса в щитовидной железе.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для улучшения дифференциальной диагностики аутоиммунных, доброкачественных и злокачественных заболеваний щитовидной железы должны учитываться особенности нарушения иммунной системы, показателей цитокинов и иных параметров, характеризующих состояние иммунитета.

2. В результате исследования цитокинов, хемокина, молекул адгезии  разработаны соотношения (индексы) цитокинов; для них совместно с показателями  цитокинов рассчитаны пороговые значения и приведены показатели диагностической эффективности, которые могут использоваться в дифференциальной диагностике практически здоровых пациентов и больных с аутоиммунными, доброкачественными и злокачественными заболеваниями. Полученные пороговые значения индексов  цитокинов рекомендуются для использования в дополнительной диагностике исследуемых нозологий.

3. С высокой диагностической эффективностью рекомендуется  использовать в дифференциальной диагностике злокачественных и аутоиммунных заболеваний показатели ИЛ-10 (значения более 13,94 пг/мл), sE-selectin (значения более 45,12 пг/мл), MCP-1 (значения более 170,58 пг/мл), индекс -ИНФ/ИЛ-10 (значения менее 32,74), доброкачественных и аутоиммунных заболеваний –показатели ИЛ-6 (значения менее 18,57 пг/мл), sICAM-1 (значения более 304,48 пг/мл), ИЛ-10 (значения более 15,94 пг/мл), индексы ИЛ-6/-ИНФ (значения менее 256,07), -ИНФ/ИЛ-4 (значения более 10,09), -ИНФ/ИЛ-10 (значения менее 48,18), злокачественных и доброкачественных новообразований – показатели ИЛ-6 (значения более 18,16 пг/мл),
sE-selectin (значения более 56,39 пг/мл), индекс ИЛ-6/-ИНФ (значения более  421,32).

4. Для улучшения диагностической эффективности разработана  логистическая регрессивная модель диагностики рака щитовидной железы у больных с новообразованиями (доброкачественными и злокачественными) ЩЖ, основанная на совместном использовании показателей ИЛ-6, sE-seleсtin и индекса  ИЛ-6/-ИНФ, обладающая более высокой достоверностью и точностью в отношении дифференцированных ненаследственных форм раков щитовидной железы.

5. Рассчитаны пороговые значения для общих и сочетанных показателей апоптоза и пролиферации, которые могут быть использованы в дифференциальной диагностике этих патологий. Предложено их использовать в диагностической практике «нормальной» ткани ЩЖ, ткани больных аутоиммуными, доброкачественными и злокачественными заболеваниями щитовидной железы и в дифференциальной диагностике ткани исследуемых патологий ЩЖ, а также при мониторинге терапии и в перспективе для иных видов «таргетной» лекарственной терапии, в механизме действия которых мишенями являются пролиферативные и апоптозные белки.

6. Исследованные фенотипические особенности рецепторного и белкового аппарата, участвующего в регуляции апоптоза, в суспензии клеток при папиллярных и фолликулярных раках щитовидной железы, позволяют использовать полученные пороговые значения в дополнительной дифференциальной диагностике на доклиническом этапе обследования пациента.

7. Оценка белков и рецепторов, участвующих в регуляции апоптоза и пролиферации, методом проточной цитометрии в группе больных АЩЖ позволяет диагностировать аденомы, фенотипически отличные от основного типа аденом, – АЩЖ II типа. Выявленные особенности аденомы II типа характеризуют неблагоприятный прогноз развития патологического процесса и требуют последующего изучения вопроса о разработке новых подходов к терапии пациентов с данной фенотипической формой аденомы ЩЖ.

8. Наличие, по данным общих и сочетанных показателей  апоптоза и пролиферации, у больных раком щитовидной железы в морфологически и патологически визуально не измененной ткани щитовидной железы практически похожих фенотипических изменений с тканями, где этот процесс визуализируется морфологами, позволяет рекомендовать онкологам выполнять операции по полному удалению органа и отказаться от использования таких органосохраняющих (паллиативных) оперативных вмешательств, как гемитомия, секторальная резекция щитовидной железы.

9. В целях дополнительной дифференциальной диагностики доброкачественных и злокачественных новообразований рекомендуется использовать в практике пороговых значений показатели активаторов плазминогена урокиназного и тканевого типа и их ингибиторы.

10. Своевременное проведение скрининговых исследований на выявление мутаций в гене р53 в ненаследственных раках щитовидной железы позволяет на более ранних стадиях выявлять начало опухолевого процесса и своевременно начинать проведение терапии, что в конечном итоге будет положительно отражаться на более благоприятном прогнозе заболевания.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Казаков С.П. ДНК-диагностика в клинической лабораторной практике. Харьков: Аналитика, 1999. 25 с.

2. Владимиров В.Г., Карпищенко А.И., Скворцов С.В., Казаков С.П., Шарова Л.А., Трофимов Д.Ю., Мальков И.Г. Молекулярно-биологические методы исследований в клинической лабораторной практике // В кн.: Медицинские лабораторные технологии – программы и алгоритмы / Под ред. А.И. Карпищенко. СПб, 1999. Т. 2. С. 579-602.

3. Казаков С.П., Скворцов С.В., Изгородин А.С., Лешкина Г.В., Кушлинский Н.Е. Биохимические и иммунологические показатели в оценке аутоиммун-ных и гормональных нарушений у больных злокачественными и доброкачествен-ными новообразованиями щитовидной железы // Клин. лаб. диагн. 2000. № 9. С. 4.

4. Скворцов С.В., Казаков С.П. Полимеразная цепная реакция в клинико-диагностической практике многопрофильных лечебных учреждений: Методические рекомендации.  М.: ГВКГ им. Н.Н. Бурденко, 2000. 50 с.

5. Кушлинский Н.Е., Казанцева И.А., Герштейн Е.С., Харитиди Т.Ю.,  Лякина Л.Т., Богатырев О.П., Казаков С.П., Смирнов В.В., Карпищенков В.И.,  Калинин А.П. Сравнительный анализ уровня активаторов плазминогена урокиназного и тканевого типа и их ингибитора при заболеваниях щитовидной железы // Матер. науч.-практ. конф.: Современные подходы к диагностике и лечению злокачественных новообразований. М.: ГВКГ им. Н.Н. Бурденко, 2000. С. 61-62.

6. Кушлинский Н.Е., Герштейн Е.С., Казанцева И.А., Харитиди Т.Ю.,  Казаков С.П., Лякина Л.Т., Богатырев О.П., Калинин А.П. Активаторы плазминогена урокиназного и тканевого типа и их ингибитор (PAI-1) в цитозольной фракции при заболеваниях щитовидной железы // Вестн. АМН. 2001. № 5. С. 32-34.

7. Казаков С.П., Харидити Т.Ю., Кибалко Е.И., Казанцева И.А., Кушлинский Н.Е. Динамика изменения количества сериновых протеаз и их ингибитора при злокачественных новообразованиях щитовидной железы // Матер. юбил. науч.-практ. конф.: Современная специализированная амбулаторно-поликлиническая помощь в Московском регионе. М.: 9 Поликлиника Московского гарнизона МВО МО РФ, 2001. С. 60-62.

8. Казаков С.П., Харидити Т.Ю., Казанцева И.А., Кушлинский Н.Е. Сериновые протеазы при доброкачественных и неонкологических заболеваниях щитовидной железы // Матер. науч.-практ. конф.: Клиническая и экономическая эффективность современных медицинских технологий, методов диагностики и лечения. М.: ГВКГ им. Н.Н. Бурденко, 2001. С.107.

9. Харитиди Т.Ю., Казанцева И.А., Герштейн Е.С., Казаков С.П., Смирнов В.В., Карпищенко А.И., Калинин А.П., Кушлинский Н.Е. Активаторы плазминогена урокиназ-ного (uPA) и тканевого (tPA) типа и их ингибитор (PAI-1) при заболеваниях щитовид-ной железы // Матер. всерос. науч. конф.: Биохимия – медицине. СПб., 2002. С. 93-94.

10. Владимиров В.Г., Карпищенко А.И., Скворцов С.В., Казаков С.П., Шарова Л.А., Трофимов Д.Ю., Мальков И.Г. Молекулярно-биологические методы исследова-ний в клинической лабораторной практике // В кн.: Медицинские лабораторные техноло-гии – программы и алгоритмы / Под ред. А.И. Карпищенко. СПб, 2002. Т. 2. С. 533-555.

11. Казаков С.П., Харидити Т.Ю. Динамика уровней ингибитора и активаторов плазминогена  урокиназного и тканевого  типа  при  новообразованиях  щитовидной  железы // Матер. юбил. науч.-практ. конф.: Актуальные  вопросы клинической и военно-морской медицины. Московская область, г. Железнодорожный, п/о Купавна: 32 ЦВМКГ, 2003. С. 92-94.

12. Казаков С.П., Харидити Т.Ю., Кушлинский Н.Е. Изменение уровней ингибитора и активаторов плазминогена урокиназного и тканевого типа при злокачественных и доброкачественных опухолях щитовидной железы // Матер. науч.-практ. конф.: Комбинированная и сочетанная патология: проблемы диагностики и лечения. М.: ГВКГ им. Н.Н. Бурденко, 2003. С. 183-184.

13. Казаков С.П., Кушлинский Н.Е. Оценка некоторых иммунологических и био-химических показателей у больных с онкологическими и аутоиммунными заболевани-ями щитовидной железы // Матер. науч.-практ. конф.: Комбинированная и сочетанная патология: проблемы диагностики и лечения. М.: ГВКГ им. Н.Н. Бурденко, 2003. С. 181-183.

14. Казаков С.П., Кушлинский Н.Е. Частота мутаций гена р53 в тканях солидных опухолей при злокачественных и доброкачественных новообразованиях щитовидной железы // Матер. науч.-практ. конф.: Комбинированная и сочетанная патология: проблемы диагностики и лечения. М.: ГВКГ им. Н.Н. Бурденко, 2003. С. 180-181.

15. Казаков С.П., Скворцов С.В., Сухоруков А.Л., Кушлинский Н.Е. Динамика цитокинов у больных с онкологическими и аутоиммунными заболеваниями щитовидной железы // Матер. 3-го съезда онкологов СНГ. Минск, 2004. Ч. 2. С. 28.

16. Казаков С.П., Федосюк А.М., Анфилов С.В., Коржиков А.В.,  Лапшин И.М., Кушлинский Н.Е. Изучение экспрессии маркеров CD95, p53, bcl-2 и Ki-67 у больных аутоиммунной патологией и новообразованиями щитовидной железы // Мед. иммунол. 2004. № 3-5. С. 296-297.

17. Казаков С.П., Кушлинский Н.Е. Исследование сочетанных параметров апоптоза и пролиферации в тканях щитовидной железы у больных с доброкачественными и злокачественными новообразованиями // Мед. иммунол. 2004. № 3-5. С. 362-363.

18. Казаков С.П., Кушлинский Н.Е. Исследования комбинационных параметров пролиферации и апоптоза в тканях больных с новообразованиями щитовидной железы  // Клин. лаб. диагн. 2004. № 9. С. 8.

19. Казаков С.П., Скворцов С.В., Сухоруков А.Л., Кушлинский Н.Е. Oценка иммуно-логической реактивности больных с онкологическими и аутоиммунными заболевания-ми щитовидной железы // Матер. 3-го съезда онкологов СНГ. Минск, 2004. Ч. 2. С. 27,28.

20. Казаков С.П., Кушлинский Н.Е. Оценка маркеров FAS-системы, пролиферации и апоптоза у больных аутоиммунными и онкологическими заболеваниями щитовидной железы // Клин. лаб. диагн. 2004. № 9. С. 8-9.

21. Шебанкова В.Н., Казаков С.П., Сухоруков А.Л., Скворцов С.В., Кушлинский Н.Е. Сравнительная характеритика интерлейкинов IL-1-, IL-6, IL-10 и TNF- у больных с новообразованиями и аутоиммунными заболеваниями щитовидной железы // Мед. иммунол. 2004. № 3-5. С. 371.

22. Казаков С.П., Сандыбаев М.Н., Казанцева И.А., Джабаров А.К., Кушлинский Н.Е. Сравнительный анализ содержания интерлейкинов (ИЛ-1-, ИЛ-6,
ИЛ-10) в плазме крови больных аутоиммунным тиреоидитом, аденомой и раком щитовидной железы  // Матер. 3-го Всерос. тиреоидол. конгр.: Диагностика и лечение узлового зоба. М., 2004. С. 152-153.

23. Kazakov S.Р., Кushlinsky N. Ye.  Сytokin`s level IL-1, IL-6, IL-10 and TNF-α from patients with autoimmune and oncology thyroid diseases  // «Cytokines in Cancer and Immunity» - Tenth Joint Meeting of the International Cytokine Society (ICS) and the International Society for Interferon and Cytokine Research (ISICR). San Juan, Puerto Rico. October 21-25, 2004. P. 322.

24. Казаков С.П., Скворцов С.В., Шебанкова В.Н., Сухоруков А.Л., Кушлинский Н.Е. Динамика интерлейкинов IL-1, IL-6, IL-10 и TNF-α у больных с онкологической и аутоиммунной патологией щитовидной железы // Матер. науч.-практ. конф.: Актуальные проблемы клинической онкологии. М.: ГВКГ им. Н.Н. Бурденко, 2005. С. 33-34.

25. Казаков С.П., Серяков А.П., Харидити Т.Ю., Кушлинский Н.Е. Изменение уровней ингибитора и активаторов плазминогена урокиназного и тканевого типа при злокачественных и доброкачественных опухолях щитовидной железы // Матер. VI Всерос. съезда онкол.: Современные технологии в онкологии. Ростов-на-Дону, 2005. Т. 2. С. 39-40.

26. Казаков С.П., Кушлинский Н.Е., Сандыбаев М.Н., Казанцева И.А. Иммунологическая реактивность больных раком и аутоиммунными заболеваниями  щитовидной железы // Матер. XII Российского нац. конгр.: Человек и лекарство. М., 2005. С. 130-131.

27. Казаков С.П., Серяков А.П., Сухоруков А.Л., Кушлинский Н.Е. Мутации гена р53 в тканях щитовидной железы при злокачественных и доброкачественных новообразованиях // Матер. VI Всерос. съезда онкол.: Современные технологии в онкологии. Ростов-на-Дону, 2005. Т. 2. С. 38-39.

28. Казаков С.П., Анфилов С.В., Лапшин И.М., Федосюк А.М., Кушлинский Н.Е. Сочетанные параметры апаптоза и пролиферации в тканях щитовидной железы у больных с онкопатологией // Матер. науч.-практ. конф.: Актуальные проблемы клинической онкологии. М.: ГВКГ им. Н.Н. Бурденко, 2005. С. 31-33.

29. Казаков С.П., Серяков А.П., Сухоруков А.Л., Кушлинский Н.Е. Уровень цитокинов у больных с онкологическими и аутоиммунными заболеваниями щитовидной железы // Матер. VI Всерос. съезда онкол.: Современные технологии в онкологии. Ростов-на-Дону, 2005. Т. 2. С. 40-41.

30. Казаков С.П., Федосюк А.М., Анфилов С.В., Лапшин И.М., Кушлинский Н.Е. Экспрессия маркеров CD95, p53, bcl-2 и Ki-67 у больных с аутоиммунной и онкологической патологией щитовидной железы // Матер. науч.-практ. конф.: Актуальные проблемы клинической онкологии. М.: ГВКГ им. Н.Н. Бурденко, 2005. С. 34-35.

31. Казаков С.П., Кушлинский Н.Е., Сандыбаев М.Н., Казанцева И.А. Экспрессия некоторых маркеров апоптоза и пролиферации при раке и аденоме щитовид-ной железы // Матер. XII Российского нац. конгр.: Человек и лекарство. М., 2005. С. 130.

32. Kazakov S.Р., Кushlinsky N.Ye. Main parametrs expression of apoptosis and prolifiration in oncology thyroid diseases // First Joint Meeting of European National Societies of Immunology Under the auspices of EFIS and 16th European Congress of Immunology - ECI - September 6-9, 2006. Paris, France. P. 547.

33. Kazakov S.Р., Кushlinsky N.Ye. The investigation of CD 95, p53, bcl-2 and Ki-67 markers in autoimmune thyroid pathology patients // First Joint Meeting of European National Societies of Immunology Under the auspices of EFIS and 16th European Congress of Immunology - ECI - September 6-9, 2006. Paris, France. P. 547.

34. Kazakov S.Р., Кushlinsky N.Ye. Some well-known parametrs expression of apoptosis in thyroid cancer // 17th IFCC - FESCC European Congress of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine, 60th National Congress of the Netherlands Society for Clinical Chemistry and Laboratory Medicine (NVKC), 3-7 June 2007, Amsterdam / Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. 2007. Vol. 45 (special Suppl.). Р. S326.

35. Kazakov S.Р., Кushlinsky N.Ye. Аpoptosis and proliferation markers in thyroid tissue of oncology patients // IFCC – WorldLab Fortaleza 2008, 28 Sep-2 Oct 2008, Brasil / Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. 2008. Vol. 46 (special Suppl.). Р. S404-405.

36. Казаков С.П. Исследование динамики цитокинов, молекул  адгезии и их соотношения в диагностике аутоиммунных заболеваний, злокачественных и доброкачественных новообразований щитовидной железы // Мед. иммунол. 2009. № 4-5. С. 367-368.

37. Казаков С.П., Заботина Т.Н., Кушлинский Н.Е. Роль тканевых маркеров апоптоза и пролиферации в дополнительной дифференциальной диагностике папиллярного и фолликулярного рака щитовидной железы // Военно-медицинский журнал. 2010. № 7. С. 48-50. 

38. Казаков С.П., Заботина Т.Н., Короткова О.В., Джабаров А.К, Казанцева И.А., Кушлинский Н.Е. Сравнительный анализ клеток с комбинированными маркерами апоптоза и пролиферации в образцах тканей щитовидной железы при  раках, аденомах и аутоиммунных заболеваниях  // Бюл. экспер. биол. и мед. 2010. Том. 150, № 10. С. 427-432. 




© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.