WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

На правах рукописи

ЗУБАИРОВА ЛЯЙЛИ ДИЛЯВЕРОВНА

МИКРОВЕЗИКУЛЫ КРОВИ В ПАТОГЕНЕЗЕ ОСТРОЙ ГЕМОСТАТИЧЕСКОЙ РЕАКЦИИ

14.00.16 – патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

КАЗАНЬ – 2008

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Казанский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научный консультант:

Доктор медицинских наук, профессор Бойчук Сергей Васильевич

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, доцент Киселев Сергей Васильевич Доктор медицинских наук, профессор Фассахов Рустем Салахович Доктор медицинских наук, профессор Поздеев Оскар Кимович

Ведущая организация:

ГОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию».

Защита диссертации состоится «___»____________ 2008 года в ______ часов на заседании диссертационного совета Д 208.034.01 при ГОУ ВПО Казанском государственном медицинском университете Росздрава по адресу: 420012, г. Казань, ул.Бутлерова, 49.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Казанского государственнного медицинского университета.

Автореферат разослан «___»______________2008 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор Л.Н. Залялютдинова

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы Функционирование системы гемостаза в физиологических условиях включено в эффективное кровоснабжение тканей, предупреждение кровопотерь, тромбозов, ишемий и инфарктов, защиту от диссеминации бактерий и токсинов. В то же время чрезвычайные по силе или продолжительности воздействия вовлекают реакции гемостаза в механизмы заболеваний, как в качестве центральных звеньев патогенеза, так и в качестве усугубляющих первичное повреждение [Балуда В.П., 1995; Петрищев Н.Н., 2000; Баркаган З.С., 2001;

Воробьев А.И., 2001; Макацария А.Д., 2002; Кузник Б.И., 2004]. Несмотря на значительный прогресс, достигнутый в понимании механизмов свертывания крови и тромбообразования, артериальная, венозная или системная тромбоэмболия остается основной причиной смерти и нетрудоспособности населения индустриально развитых стран [Nordstrom M. et al, 1992;

Sallah S. et al, 2002; Nowak-Gottl U. et al, 2003/2004].

Развитие теории свертывания крови, в основе которой лежит главенство тканевого фактора в инициации тромботического процесса, а также активное участие клеток крови и эндотелия в ключевой составляющей свертывания – генерации тромбина, расставляет новые акценты в патогенезе тромбозов. Гиперкоагуляционное или претромботическое состояние развивается как следствие преобладания активации прокоагулянтных факторов над антикоагулянтными, представления о которых продолжают уточняться. Несколько десятилетий назад клеточные и плазменные компоненты системы гемостаза были дополнены субклеточными элементами – мембранными фрагментами – микровезикулами, отделяемыми при активации и апоптозе клеток и обладающими прокоагулянтной активностью клеточного источника [Wolf P., 1967; Зубаиров Д.М. и др.,1974]. Они признаны не только полноправными компонентами системы гемостаза, но и рассматриваются в качестве важнейших участников инициальных событий активации свертывания крови и тромбообразования [Зубаиров Д.М., 2000; Scholz T. et al, 2002; Furie B. et al, 2005; Sinauridze E.I. et al, 2007]. Везикуляция клеток рассматривается, как способ увеличения прокоагулянтной поверхности, поскольку также, как и активированные клетки, микровезикулы снабжены аминофосфолипидами, необходимыми для сборки факторов свертывания крови в теназный (IХa с VIIIa) и протромбиназный (Ха с Vа) комплексы.

Функциональные комплексы адгезии на микровезикулах, происходящих из тромбоцитов, опосредуют их взаимодействие с фактором фон Виллебранда, коллагеном, фибрином и фибриногеном [Miyazaki Y. et al, 1996; Siljander P. et al, 1996; Holme P.A. et al, 1997]. Однако микровезикулы не только несут доступный фосфатидилсерин и адгезивные белки или комплексы, но также другие прокоагулянтные молекулы, и в первую очередь тканевой фактор, если они происходят из клеток, экспрессирующих эти вещества [Mller I. et al, 2003].

Роль микровезикул в патологических процессах остается предметом дискуссии. С одной стороны, выявляется повышение уровня микровезикул крови при целом ряде заболеваний, сопровождающихся гиперкоагулемией [Mallat Z. et al, 2000; Kim H.K. et al, 2003; Preston R.A. et al, 2003]. Вместе с тем, в контексте гемостатических реакций повышенный уровень микровезикул не обязательно ведет к тромбозу, поскольку они могут также стимулировать экспрессию антикоагулянтной активности активированного протеина C [Tans G. et al, 1991], а содержание фасфатидилсерина может меняться в зависимости от типа клетки, предмета и условия индукции микровезикуляции [Weerheim A.M. et al, 2002;

Freyssinet J-M., 2003]. Кроме того, высокий уровень микровезикул может быть проявлением адаптивных изменений при патологии. Так, при аутоиммунной тромбоцитопении, более высокий уровень микровезикул был обнаружен у пациентов без геморрагических осложнений, что предполагает их адаптивную гемостатическую роль. Это продемонстрировано также при гемофилии, где уровень микровезикул выше нормального и может повышаться при развитии острого кровотечения, как отражение мобилизации системы гемостаза без угрозы тромботических осложнений, так как имеется недостаточность образования тромбина [Horstman L.L. et al, 1992; Proulle V. et al, 2001]. То есть микровезикулы, участвующие в физиологическом гемостазе, в целом выполняют адаптивную функцию.

Предполагается, что механизмы вовлечения микровезикул в физиологические и патологические процессы многообразны. Допускается, что их количество - определяющий физический фактор, что подразумевает проявление патогенных свойств микровезикул только после достижения их числа внепороговых значений. Исходя из концепции гомеостаза, уровень этих субклеточных образований, вероятно, отражает баланс между пролиферацией, активацией и смертью клетки. Сдвиг в одном из этих направлений ведет к патологическим нарушениям с существенными изменениями в составе микровезикул, зависящими от природы стимула, а дополнительно образующиеся микровезикулы вызывают усиление ответа в клетках-мишенях или реципиентах.

С тех пор, как достигнут относительный консенсус в определении этих субклеточных образований, характеристики микровезикул пополняются в рамках расшифровки механизма отторжения фрагментов клеточных мембран и внекоагуляционного значения этого процесса – их роли, как одной из форм межклеточной сигнализации. Вместе с тем, с точки зрения интегрального вклада микровезикуляционного механизма в адаптивные и патогенные последствия мобилизации системы гемостаза in vivo, представляется важным определение динамики микровезикуляции на ранних этапах гемостатической реакции. Кроме того, система гемостаза, как всякая открытая система в организме, использует различные сценарии развития реакций при воздействии разных стимулов. Расшифровка особенностей микровезикуляции в этих обстоятельствах, расширит представления о механизмах острых гемокоагуляционных реакций и о возможности применения количественных и качественных характеристик микровезикул, как маркера при изучении коагуляционных нарушений.

Исходя из этого, предпринято настоящее исследование, в котором определены следующие цели и задачи.

Цель исследования Определение патогенетической роли микровезикуляции клеток крови при острых гемостатических реакциях.

Задачи исследования 1. Оценить динамику микровезикуляции в ответ на краткосрочный однократный стресс при острой кровопотере, соотнести ее с изменениями гемостаза 2. Определить роль вазоактивных гормонов – адреналина и вазопрессина как индукторов микровезикуляции при острой гемостатической реакции.

3. Определить динамику микровезикуляции при персистенции внутрисосудистого прокоагулянтного стрессора – на ранних сроках эндотоксинемии и в ходе развития синдрома ДВС.

4. Исследовать прокоагулянтный фенотип микровезикул и оценить динамику их количества в системном кровотоке и на участке активации гемостаза, индуцированного на фоне гиперкоагулемии физиологическими родами.

5. Провести сравнительное исследование количественных и качественных характеристик микровезикул при физиологическом и оперативном родоразрешении.

Научная новизна Впервые исследована динамика уровня микровезикуляции в крови на ранних стадиях мобилизации гемостатических реакций in vivo, как функции различных моделей активации клеток-эффекторов гемостаза. Показано, что острые стрессоры – массивная кровопотеря, эндотоксинемия, гиперадреналинемия, 1-дезамино-8-D-аргинин-вазопрессинемия, инициирующие гиперкоагуляцию, индуцируют отделение клеточных микровезикул и диссеминацию их в системный кровоток в короткие сроки (15 минут). Выявлено, что интенсивность микровезикуляции под влиянием однократных стрессоров – адреналинемии и кровопотери меняется кратковременно. Длительное усиление микровезикуляции при эндотоксинемии сопровождается развитием диссеминированного внутрисосудистого свертывания.

Впервые определен уровень и прокоагулянтный фенотип микровезикул в системном кровотоке и в маточной крови в динамике родоразрешения. Выявлено пространственное ограничение микровезикуляционной реакции при физиологическом родоразрешении, характеризующееся образованием в 11 раз большего количества микровезикул с двукратно повышенной экспрессией фосфатидилсеринов на плацентарной площадке. Впервые выявлено принципиальное различие процесса микровезикуляции при физиологическом и оперативном родоразрешении, состоящее в образовании микровезикул с повышенной экспрессией фосфатидилсеринов в системной циркуляции в динамике кесарева сечения.

Таким образом, показан один из механизмов дезадаптации гемостатического ответа и повышенного риска развития тромбогеморрагического синдрома при оперативном родоразрешении.

Практическая значимость состоит в разработке нового подхода к оценке патогенеза коагуляционных нарушений, как базы для совершенствования диагностики и методов терапии протромботических состояний, основанного на расширении знаний о механизмах, вовлеченных в формирование гиперкоагулемии. Полученные данные о динамике микровезикуляции в крови, отражающей степень мобилизации системы гемостаза, позволяют считать образование микровезикул универсальным механизмом стрессовой реакции клеток и использовать определение количества микровезикул для выявления инициальной стадии острой гиперкоагулемии. Прокоагулянтный фенотип микровезикул, оцениваемый методом проточной цитометрии по уровню связывания липофильного флюорохрома мероцианина 540, может использоваться как маркер для выявления инициирования гиперкоагуляции. Отсутствие видовой специфичности маркера позволяет применять данный метод исследования и в экспериментах на животных. Результаты проведенного исследования могут быть использованы патофизиологами и гемостазиологами в научной, практической и учебной работе.

Внедрение результатов исследования в практику. Теоретические положения, разработанные в диссертационном исследовании, внедрены в научно-педагогическую деятельность кафедр патологической физиологии и биохимии Казанского государственного медицинского университета Росздрава при изучении механизмов тромбообразования и свертывания крови. Вновь использованные лабораторные методы внедрены в лаборатории иммунологии Республиканского центра по профилактике и борьбе со СПИД и ИЗ МЗ РТ и клинико-диагностической лаборатории ГУ «Межрегиональный клинико-диагностический центр » МЗ РТ, о чем свидетельствуют соответствующие акты внедрения.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Усиление микровезикуляции клеток сосудистого сектора является типовой реакцией на острый стрессор, развивающейся в течение 15 минут, при этом мобилизуется популяция микровезикул, содержащая в составе липидных плотов экто-5' нуклеотидазу и обогащенная прокоагулянтными фосфатидилсеринами. Пик микровезикуляции, совпадающий с максимальным ускорением свертывания крови, позволяет считать микровезикулы патогенетическим фактором гиперкоагуляции при остром стрессе.

2. Динамика интегральной микровезикуляции в крови отражает варианты клеточных реакций на стимул – при однократном стрессе реакция развивается за минуты, в соответствии с рефлекторным принципом нервной регуляции свертывания крови.

Персистенция стрессора сопровождается продлением микровезикуляционной реакции в течение часов с распространением в кровоток частиц, обогащенных фосфатидилсеринами. В организме, претерпевшем прокоагулянтную перестройку, микровезикуляция в ответ на острую активацию гемостаза ограничена рамками локального адаптивного ответа.

3. Существенное усиление микровезикуляционной реакции под влиянием чрезвычайных по продолжительности и силе прокоагулянтных стрессоров, сопровождается развитием явной картины синдрома ДВС при эндотоксинемии и более интенсивной локальной микровезикуляцией с диссеминацией в системную циркуляцию микровезикул с повышенной экспрессией фосфатидилсеринов, кореллирующей с циркуляцией активированных тромбоцитов, при оперативном родоразрешении.

Апробация работы Основные положения диссертационной работы доложены на V Всероссийской конференции Всероссийской ассоциации по изучению тромбозов, геморрагий и патологии сосудистой стенки, «Тромбозы, геморрагии, ДВС-синдром. Проблемы лечения».– Москва.– 2000; Региональной конференции «Актуальные проблемы теоретической и прикладной биохимии».– Ижевск.– 2001; Первой Всероссийской научной конференции «Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии».– Москва.– 2003; Третьем Российском конгрессе по патофизиологии “Дизрегуляционная патология органов и систем” Москва, 2004; Второй Всероссийской научной конференции «Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии».– Москва.– 2005; Всероссийской конференции Всероссийской ассоциации по изучению тромбозов, геморрагии и патологии сосудов “Тромбозы, геморрагии, ДВС-синдром. Современные достижения”.– Ярославль.– 2005; Первом Всероссийском форуме «Инновационные технологии медицины XXI века».– Москва.– 2005; Всероссийской конференции с международным участием «Гемореология в макро- и микроциркуляции», Ярославль, 2005; Третьей Международной конференции молодых врачей «3-rd Young Medics International Conference», Армения, Ереван, 2005;

Беломорском симпозиуме “Актуальные вопросы гемостазиологии и трансфузиологии”.– Архангельск.– 2005; VIII World Congress International society for adaptive medicine, Moscow, 2006; Всероссийская конференция с международным участием “Тромбозы в клинической практике: факторы риска, диагностика, терапия”. – Санкт-Петербург, 2007.

Личный вклад автора.

Определен алгоритм исследования, предполагающий интегральную оценку количества микровезикул и их прокоагулянтного фенотипа в динамике гемостатического ответа, инициированного тремя прокоагулянтными стрессорами – острой кровопотерей, эндотоксинемией, родоразрешением. Проведен анализ научной литературы, собрана и структурирована информация по проблеме исследования, определены методики, проведено разделение на логически завершенные этапы. Для изучения поставленной проблемы с моим участием проведены экспериментальные исследования микровезикуляционной реакции при постгеморрагической и индуцированной эндотоксином гиперкоагулемии. Под моим руководством проведено исследование особенностей микровезикуляции при физиологическом и оперативном родоразрешении. Проведена статистическая обработка, группировка, анализ результатов, интерпретированы полученные данные.

Публикации По теме диссертации опубликовано 36 работ, из них 9 – в журналах, рекомендованных ВАК Минобразования Российской Федерации.

Объем и структура диссертации Диссертация изложена на 224 страницах машинописного текста. Состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 3 глав с изложением результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Работа иллюстрирована 24 таблицами, рисунками. Библиография содержит 314 источников, в том числе 47 отечественных и 2зарубежных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования Экспериментальные модели. Острая кровопотеря.

Кровопускание из мобилизованной под местной анестезией бедренной артерии в объеме 1,5 мл/100г массы тела, соответствующее острой массивной потере крови [Зубаиров Д. М., 1957; Imai Y., 1996] производилось 12 бодрствующим обездвиженным кроликам.

Забор проб крови в течение часа осуществлялся тефлоновыми канюлями которые использовали для кровопускания. Количество микровезикул и состояние гемостаза оценивали до кровопускания и через 5, 15, 30, 60 минут – после, в отдельной серии экспериментов на животных регистировалось артериальное давление на кимографе.

Адреналинемия и вазопрессинемия.

9 бодрствующим обездвиженным кроликам вводили внутривенно 1 мкг/кг синтетический аналог вазопрессина 1-дезамино-8-0-аргинино-вазопрессин (десмопрессин, DDAVP), являющийся агонистом \/а-рецепторов (adiuretin, FERRING) в 1,5 мл 0,85% раствора NaCl [Bernat A., 1997]. 10 кроликам внутривенно вводили 0,5 мг/кг хлористоводородного адреналина в 1,5 мл 0,85% раствора NaCl [Ingram G. I. C., 1961], 8 контрольным животным такого же веса вводили внутривенно 1,5 мл 0,85% раствора NaCl. Кровь для исследования получали из бедренной артерии тефлоновыми канюлями, количество микровезикул и скорость свертывания крови оценивали до введения агонистов и через 5, 15, 30, 60 минут – после введения.

Эндотоксинемия.

15 кроликам вводили внутривенно эндотоксин E.coli, полученный ультразвуковой дезинтеграцией с последующим ультрацентрифугированием и гельфильтрацией, двукратно:

первый раз 1 мг/кг и через 24 часа 3 мг/кг [Bronza J. P., 1990; Perlik V., 2005]. контрольным животным вводили равный объем 0,85% раствора NaCl. Кровь для исследования получали из бедренной артерии тефлоновыми канюлями через 5, 15, 30, минут и 24 часа после однократного введения эндотоксина, далее через 15, 30, 120 мин после повторной инъекции эндотоксина.

Клинические группы.

Клинический материал представлял собой результаты обследования 47 беременных женщин, родоразрешенных путем операции кесарево сечение и через естественные родовые пути в родильном отделении клиники им. проф. В.С. Груздева, а также 20 небеременных женщин репродуктивного возраста. Производилось динамическое исследование микровезикуляции в последовом и раннем послеродовом периодах физиологических родов, а также при кесаревом сечении. Исследовались пробы цитратной периферической крови в 1 и 3 периодах физиологических родов, до разреза на коже и после извлечения плода при операции кесарево сечение, а также исследовалась ретроплацентарная кровь.

На проведение исследования получено одобрение Республиканского Комитета по Этическим вопросам при проведении клинических испытаний-исследований лекарственных средств при Министерстве Здравоохранения Республики Татарстан. Всем женщинам была предоставлена информация о сути проводимого исследования с подписанием добровольного информированного согласия на участие.

Основными критериями включения в группы для исследования включения явились:

отсутствие клинических и лабораторных признаков коагулопатических расстройств, серьезной экстрагенитальной патологии, тяжелого гестоза, а также по исходам родоразрешения (без патологической кровопотери). Средняя кровопотеря составила 180,77 + 9,02 мл при физиологических родах и 459,29 + 19,43 мл при кесаревом сечении.

Забор периферической крови осуществлялся венепункцией иглой G21, ретроплацентарную кровь собирали при ее свободном истечении из полости матки сразу после рождения последа при физиологических родах и забирали непосредственно из полости матки после извлечения последа при кесаревом сечении.

Выделение микровезикул.

0,9 мл крови набирали в пробирки, содержащие 0,1 мл профильтрованного стерильного 3,8% раствора цитрата натрия (разведение 9:1), для стабилизации ретроплацентарной крови использовали разведение 8:2. Стабилизированную кровь центрифугировали 15 минут при 1500 g, отделяли бесклеточную плазму.

Для оценки общего гемостатического потенциала и размеров микровезикул применялась ультрафильтрация бестромбоцитарной плазмы. Использовалась сконструированная нами тефлоновая ячейка, где под давлением 2 атм обеспыленного воздуха (Мембранный компрессор ЗМА Киев) производили фильтрацию через ультрафильтр Synpor VUFS (Прага) с размером пор ~0,2 мкм.

Оценка активности экто-5'-нуклеотидазы.

Кровь для определения активности экто-5'-нуклеотидазы стабилизировали кристаллическим гепарином (Spofa, Прага). Активность фермента определяли по изменению скорости гидролиза аденозин-5'-монофосфата при избирательном ингибировании 5'нуклеотидазы ионами никеля, с последующим тестированием неорганического фосфата.

Метод включает в себя два параллельных определения ферментативной активности в плазме с аденозин- 5'-монофосфатом в качестве субстрата. В первом определении в отсутствии ионов никеля оценивается общая фосфатазная активность, во втором – присутствие ионов никеля специфически подавляет 5'-нуклеотидазу и, таким образом, определяется гидролиз только неспецифической щелочной фосфатазой. Разница активностей (в единицах освобожденного неорганического фосфата) дает активность 5'-нуклеотидазы и выражается в наномолях субстрата, гидролизованного в 1 секунду 1 литра раствора (нанокаталах·л-1, нкат·л-1).

Подсчет количества микровезикул в проточном цитометре.

Бесклеточная плазма разводилась раствором Cell Wash (Becton Dickinson, США) 1:и исследовалась методом проточной цитометрии на приборе FACS Calibur (Becton Dickinson). Абсолютное количество микровезикул в 1 мкл определяли по светорассеиванию за фиксированное время (60 секунд) с использованием программы Cell Quest, регистрируя количество событий за единицу времени [Abrams C. S., 1990]. Регистрация прямого малоуглового (FSC) и бокового (SSC) светорассеивания в логарифмическом режиме позволила дискриминировать микровезикулы в отдельной зоне.

Оценка ремоделирования мембраны.

Нарушение асимметрии клеточной мембраны оценивалась окрашиванием клеток и микровезикул флуорохромом мероцианином 540 (МС540). Регистрация клеток и микровезикул с повышенной интенсивностью флуоресценции выявляет изменения упаковки мембранных фосфолипидов при их перемешивании (scrambling) [Flesch F. M., 2001; R. Jessel R., 2002] и совпадает с экспрессией фосфатидилсерина при ее выявлении аннексином V [Мустафин И. Г., 2005].

Экспрессию фосфатидилсерина с помощью МС540 определяли следующим образом.

0,5 мл крови в полистироловых пробирках 12х75 мм (Falcon 2052) подвергали лизированию (лизирующий раствор Becton Dickinson) для удаления эритроцитов, трижды центрифугировали по 15 минут при 1500g для удаления продуктов лизиса. Осадок клеток ресуспензировали в 1 мл раствора Cеll Wash (Becton Dickinson). Маточный раствор МС5(концентрация 1мг/мл) в объеме 5 мкл вносили в 1 мл клеточной суспензии, содержащей 1·106 кл/мл (конечная концентрация МС540 5мкг/мл) или 1мл плазмы в разведение 1:раствором Cеll Wash. Пробы перемешивали и инкубировали в течении 5 минут в темноте при комнатной температуре. Регистрацию результатов осуществляли на втором детекторе FLцитометра.

Определение фенотипа МС540 положительных клеток Оценку фенотипа клеток, связывающих мероцианин, проводили по экспрессии тромбоцитарного гликопротеида IIb-IIIa после окрашивания моноклональными антителами FITC-CD61 (Becton Dickinson) в реакции прямой иммунофлуоресценции. Различные области эмиссии используемых флуорохромов позволили произвести одновременную оценку фенотипа МС540+ клеток крови. Для исключения неспецифической флуоресценции проводили реакцию с отрицательным изотипическим контролем (использовали иммуноглобулины мыши того же изотипа, меченные аналогичным флуорохромом FITC).

Скрининг гемостаза и цитограмма крови Коагуляционную активность в экспериментальных сериях определяли по времени свертывания крови в аппарате Базарона С.Ц. при 37 С и 100% влажности на поверхности парафина. Скрининговую оценку системы гемостаза в клинических группах производили по уровню фибриногена, активированному частичному тромбопластиновому времени, протромбиновому времени в коагулометре Thrombotimer 4 (Behnk Elektronik).

Цитограмму крови определяли в гематологическом анализаторе MICROS-60-18 ABX.

Компьютерную электрокоагулографию (КЭлКГ) осуществляли с применением аппарата – коагулограф Н-334, оценивали параметры: T1-образование тромбина, T2-образование фибрина, Amax-максимальная амплитуда, A1-амплитуда через 10 минут от начала ретракции (отражает фибринолитическую активность крови, которая высчитвается по формуле ФА=А1х100/Amax (%) Оценка активности тромбина. Активность тромбина определяли спектрофотометрически (Specol 20 C.Zeiss) по гидролизу хромогенного субстрата S-2238 в цельной крови и в плазме. Амидолитическую активность тромбина выражали в нМ расщепленного S-2238 за 1 ч инкубации. Для определения амидолитической активности тромбина в цельной крови и плазме 0,025 мл исследуемого материала центрифугировали в одноразовых полистироловых кюветах для спектрофотометрии, помещенных в бакет-ротор, при 3000 g 15 мин.

Не взмучивая осажденные клетки, на них наслаивали 1,4 мл 0,05 М Трис-HCI, 0,1 М NaCI, 20 mM EDTA рН 7,9 и 0,075 мл 4 мМ раствора S-2238 и одновременно включали секундомер. В течение 30 с измеряли поглощение при 405 нм и далее измерения повторяли через 10 мин на протяжении часа [Beguin S.,1988].

Определение растворимых фибрин-мономерных комплексов в плазме крови Использован набор РФМК-тест («Технология – Стандарт» Россия, Барнаул). Принцип метода определения растворимых фибрин-мономерных комплексов в плазме крови заключается в регистрации времени (сек) появления зерен (паракоагулята) фибрина после добавления к ней раствора орто-фенантролина гидрохлорида, с последующим переводом результатов (сек) в количество РФМК (мг%).

Оценка концентрации внеклеточного гемоглобина.

Концентрацию внеклеточного гемоглобина, служившего маркером гемолиза, оценивали по поглощению при 540 нм в кварцевых микрокюветах плазмы крови, повторно центрифугированной 20 минут при 2670 g [Gerner E. W., 1980] в спектрофотометре Spekol (C.Zeiss, Jena).

Статистический анализ полученных результатов проводили на персональном компьютере с применением пакетов прикладных программ «Exell» и «BIOSTAT».

Достоверность различий полученных результатов оценивали по критерию Стьюдента.

Коррелятивный анализ результатов проводили с применением параметрического метода Спирмена.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Прежде всего была произведена оценка объекта исследования путем определения размеров и коагуляционной активности микровезикул. Фильтрация бесклеточной фракции плазмы через фильтр с размерами пор ~0,2 мкм выявила: до фильтрации количество микровезикул при проточной цитометрии составляло 123810,2±11706,4/ мкл, после фильтрации 17020,0±972,1/ мкл (13,7%), активность экто-5'-нуклеотидазы – 68,7±7,3 нкат·л-и 7,8±0,9 нкат·л-1 (11,4%), соответственно (рис.1).

Таким образом, 86-88% микровезикул имели размеры более 0,2 мкм, а 12-14% - менее 0,2 мкм. Скорость свертывания рекальцифицированной плазмы крови составляла 0,014±0,00018 с-1, бестромбоцитной плазмы отцентрифугированной в течение 15 минут при А Б 1до фильтрации после фильтрации Рис. 1 Оценка размеров микровезикул методом фильтрации А. Проточная цитометрия плазмы до фильтрации – левая панель, после фильтрации – правая панель.

Б. Уровень экто 5-нуклеотидазной активности 3000 об/мин, - 0,0055±0,0003 с-1 (р<0,001; n=6), а после фильтрации через фильтр со средним диаметром пор 0,2 мкм свертывание замедлялось до 0,0023±0,0002 с-1 (р<0,001; n=6). То есть удаление фракции микровезикул с размерами более 0,2 мкм, составляющих по нашим данным 86-88% общей популяции, приводила к снижению гемокоагуляционного потенциала бестромбоцитной плазмы крови. Таким образом, в стабилизированной плазме крови присутствуют микровезикулы, обладающие коагуляционной активностью.

Микровезикуляция в крови в динамике острой кровопотери.

Кровотечение вызывает адаптационные реакции, направленные на сохранение адекватного кровообращения, среди которых – повышение скорости свертывания крови.

Первичный механизм ускорения тромбиногенеза остается неясным, так как при детальном анализе сдвигов, происходящих в системе свертывания крови после острой кровопотери, обращает на себя внимание нормальный уровень факторов V, IX, X, XI, XII, антитромбина III, уменьшение содержания фибриногена, протромбина, фактора VIII, антитромбина II.

нкат В наших экспериментах острое кровопускание из бедренной артерии у бодрствующих кроликов сопровождалось снижением уровня кровяного давления на 25,2±6,4 мм Hg (р<0,01; n=6), которое возвращалось к исходному уровню через 60 минут. Развитие гиперкоагулемии проявлялось устойчивым сокращением времени свертывания крови, начиная с 5 минуты после кровопускания с 987,45±48,65 до 543,67±50,99 сек. (р<0,01; n=12), не достигающим исходных значений в течение 60 минут наблюдения – 627,30±61,90 сек. (р<0,01; n=12). Максимальное ускорение свертывания наблюдалось на 15-й минуте – 418,4±72,3 сек. (р<0,001; n=12). Активность тромбина в цельной крови до кровопотери составляла 0,41± 0,21 нМ/час расщепленного хромогенного субстрата S-2238, через 15 минут после кровопускания – 0,81± 0,11 нМ/час (р < 0,05; n=12), то есть тромбин, образуясь в больших количествах, циркулировал в крови.

Исследование активности мембранного эктофермента 5'-нуклеотидазы в бесклеточной фракции стабилизированной плазмы выявило достоверный рост на 15 минуте после кровопускания с 41,23±4,27 до 91,34±19,67 нкат·л-1 (р<0,01; n=12). Поскольку фильтрация плазмы приводила к снижению активности экто-5'-нуклеотидазы на 88,6%, можно заключить, что фермент преимущественно связан с поверхностью микровезикул, а возрастание активности в плазме свидетельствовало об усилении процесса микровезикуляции в крови. Полученные нами результаты демонстрируют, что микровезикулы крови являются пусковым фактором острой постгеморрагической гиперкоагулемии, поскольку их образование и циркуляция в системном кровотоке индуцировано на ранних этапах – через 15 минут после кровопускания и совпадает с тромбинемией и ускорением свертывания.

11** *** * *** *** *** 1231- исходный уровень, 2 - 5 минут, 3 - 15 минут, 4 - 30 минут, 5 - 60 минут время свертывания крови (%) активность 5-нуклеотидазы (нкат) Рис. 2 Сравнительная динамика микровезикуляции и временисвертывания крови при кровопотере ***- р<0,001, **- р<0,01, *- р<0,05 по сравнению с уровнем до кровопотери При соотнесении динамики свертывания и микровезикуляции видно (рис. 2), что усиление микровезикуляции немного отстает от развития гиперкоагулемической реакции, которая сохраняется и после того, как уровень 5’-нуклеотидазы снижается. Это может объясняться тем, что образование теназного и протромбиназного комплексов начинается на поверхности активированных клеток еще до отделения микровезикул. Пик активности фермента соответствует максимальному ускорению свертывания. Коэффициент ранговой корреляции для времени свертывания крови и активности экто-5’-нуклеотидазы составил -0.700 (р<0,05;

n=12), то есть выявлена отрицательная корреляция средней степени.

Являясь стрессором, острая кровопотеря включает адаптивный ответ, реакции которого обусловлены активацией гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы. Сигнализация с участием катехоламинов и вазопрессина приводит к быстрым ответам сердечно-сосудистой системы, частью адаптивной реакции является и активация системы гемостаза. Для уточнения механизма микровезикуляции при острой кровопотере мы применили внутривенное введение хлористоводородного адреналина и синтетического аналога вазопрессина – 1-дезамино8-D-аргинин-вазопрессина с последующей регистрацией динамики свертывания крови и активности экто-5’-нуклеотидазы. 1-дезамино-8-D-аргинин-вазопрессин является синтетическим более устойчивым и длительно действующим аналогом вазопрессина.

Взаимодействуя с V2 типом, но не с V1 типом рецепторов, он не вызывает заметного повышения кровяного давления.

1** 111* * 1231 - исходный уровень, 2 - 5 минут, 3 -15 минут, 4 -30 минут, 5 -60 минут время свертывания крови (%) активность 5-нуклеотидазы (нкат) Рис. 3 Сравнительная динамика микровезикуляции и времени свертывания крови под влиянием адреналина **- р<0,01, *- р<0,05 по сравнению с исходным уровнем Полученные результаты свидетельствуют, что инициаторами микровезикуляции являются как адреналин, так и 1-дезамино-8-D-аргинин-вазопрессин, однако характер микровезикуляции под влиянием этих агонистов различается (рис.3, 4). Было выявлено, что время свертывания крови под влиянием адреналина достоверно сокращалось уже через минут, оставаясь пониженным через 15 минут и возвращаясь к нормальным значениям начиная с 30-й минуты.

Динамика под влиянием 1-дезамино-8-D-аргинин-вазопрессина отличалась – достоверное сокращение времени свертывания происходило через 15 минут и в течение часа к исходному значению не возвращалось. Усиление микровезикуляции под влиянием адреналина и 1-дезамино-8-D-аргинин-вазопрессина совпадало с таковым после острой кровопотери. Достоверный рост уровня микровезикул, содержащих экто-5'-нуклеотидазу, в кровотоке отмечался через 15 минут после введения агонистов. Адреналинемия вызывала краткосрочный ответ: как гиперкоагулемическая реакция, так и микровезикуляция разрешались в течении часа. Снижение уровня микровезикул совпадало с ослаблением гиперкоагулемической реакции. 1-дезамино-8-D-аргинин-вазопрессин индуцировал постепенное и более длительное отделение микровезикул, гиперкоагулемическая реакция также была растянута во времени и скорость свертывания крови не достигала исходных значений до конца наблюдения. Достоверное возрастание уровня микровезикул и ускорение свертывания под действием 1-дезамино-8-D-аргинин-вазопрессина совпадали по времени (на 15-й минуте).

1** 1 * ** *** 1231 - исходный уровень, 2 - 5 минут, 3 - 15 минут, 4 - 30 минут, 5 - 60 минут время свертывания крови (%) активность 5-нуклеотидазы (нкат) Рис. 4 Сравнительная динамика микровезикуляции и времени свертывания крови под влиянием 1-дезамино-8-D-аргинин-вазопрессина ***- р<0,001, **- р<0,01, *- р<0,05 по сравнению с исходным уровнем Наши результаты демонстрируют, что микровезикулы, содержащие экто-5’нуклеотидазу, локализующуюся в составе липидных плотов, мобилизуются не позднее минут после воздействия острого стрессора. Быстрое (в течение часа) снижение уровня экто 5’-нуклеотидаза-содержащих микровезикул, кроме элиминации, может являться, по крайней мере, частично, результатом их включения в состав образующихся микротромбов. По нашим данным активность экто-5’-нуклеотидазы в гепаринизированной плазме крови составляет 55,5±15,7 нкат·л-1, а в сыворотке крови – 41,3±12,3 нкат·л-1 (р<0,05; n=6) то есть около 25% микровезикул вовлекается в сгусток.

С учетом данных литературы, наиболее вероятными клеточными источниками микровезикул при постгеморрагической реакции являются тромбоциты и эндотелиоциты.

Индуцированное стрессом повышение уровня катехоламинов сопровождается дозозависимой активацией тромбоцитов посредством комбинированного вовлечения 2- и 2- адренорецепторов [von Kanel R. et al, 2000]. Агонист V2 рецепторов - 1-дезамино-8-Dаргинин-вазопрессин вызывает в тромбоцитах повышение уровня цитоплазматического Са2+ и отделение микровезикул in vitro [Horstman L. L. et al, 1995]. Рассматривая в качестве источника микровезикул эндотелиоциты, следует сказать, что у здоровых людей около 17% микровезикул крови содержат эндотелиальные маркеры [Berckmans R. J. et al, 2001]. При стимуляции 2-адренорецепторов эндотелиоцитов происходит выделение в кровоток факторов коагуляции и фибринолиза, кроме того, отделение эндотелиальных микровезикул может иметь и отдельный механизм, связанный с освобождением адгезивного гликопротеина фактора фон Виллебранда, увеличение его синтеза и секреции наблюдается под влиянием адреналина и вазопрессина [Datta Y. H. et al, 1999; Mannucci M. et al, 2003]. Общим для процессов микровезикуляции и секреции является мобилизация внутриклеточных ионов кальция из депо.

В целом, механизм острой гиперкоагулемической реакции, возникающей в ответ на кровопотерю, с учетом полученных результатов, последовательно включает в себя:

рефлекторное усиление секреции вазопрессина и адреналина; воздействие этих гормонов на V2вазопрессиновые и адренергические рецепторы эндотелиоцитов и тромбоцитов, стимуляцию их аденилатциклазной системы; вход в клетку Са++ и активацию скремблазы, ведущие к перемешиванию фосфолипидов между бислоями наружной клеточной мембраны и вынос фосфатидилсерина на поверхность клеток, последнее событие сопровождается увеличением прокоагулянтной активности клеток сосудистого сектора и отделением микровезикул.

Обнаруженная динамика микровезикуляции при острой кровопотере и в ответ на адаптогенные гормоны позволяет заключить, что образование и отделение в кровоток микровезикул является компонентом острого ответа клеток сосудистого сектора на стрессор, развивающееся в течение нескольких минут. При этом однократный стимул вызывает краткосрочную гипермикровезикуляцию, в целом коррелирующую с гиперкоагулемией.

Динамика микровезикуляции при более продолжительном воздействии повреждающего фактора стала целью дальнейших исследований.

Микровезикуляция в динамике эндотоксинемии.

Свертывания крови при бактериальном сепсисе индуцируется активированными эндотоксином моноцитами и поврежденным эндотелием внутри сосудистой системы.

Активация TLR4 моноцитов/макрофагов липидом А запускает биосинтез медиаторов воспаления, активирует продукцию костимуляторных молекул адаптивного иммунного ответа. В мононуклеарных и эндотелиальных клетках липид А стимулирует продукцию тканевого фактора [Raetz C. R. H. et al, 2002; Opal S. M. et al, 2003]. Изучение динамики образования микровезикул в артериальной крови начиная с первых же минут эндотоксинемии и в дальнейшем после повторного введения ЛПС явилось целью наших экспериментов.

Введение кроликам ЛПС сопровождалось развитием лихорадочной реакции, температура тела повышалась с 38, 27+0.06 до 39,39+0.25 (р < 0,001; n=15) в течение часов. Скорость свертывания крови имела двухфазную динамику: после однократного введения ЛПС (1мг/кг) происходило кратковременное достоверное ускорение свертывания на 60 минуте с 577,6±27,2 до 386,3±33,5 сек. (р<0,01; n=15), которое к 24 часам сменялось замедлением до 1042,4±101,2 сек. (р<0,01; n=15) и продолжало замедляться после повторного введения ЛПС (3мг/кг), составляя к концу наблюдений 1653,3±98,6 сек. (р<0,01;

n=15). У 5% подопытных животных уже через 15 минут после повторного введения ЛПС кровь не свертывалась более 60 минут.

При выявлении РФМК отмечено их повышенное содержание через 60 минут после введения ЛПС с 3,5±0,01 до 28,0±0,06 мг% (р < 0,0001; n=6) и далее до конца наблюдения.

Поскольку РФМК представляют собой продукт действия активного тромбина, такой уровень свидетельствовал об интенсивном внутрисосудистом свертывании. Таким образом, экспериментальная эндотоксинемия сопровождалась кратковременной гиперкоагуляцией, которая сменялась развитием синдрома ДВС и гипокоагуляцией после повторного введения ЛПС.

При исследовании динамики экто-5’-нуклеотидаза-содержащих микровезикул, выявлено их достоверное увеличение к 30 минуте после введения ЛПС с 48,48±13,58 нкат·л-до 109,88±14,42 нкат·л-1 (р<0,01; n=15), через 60 минут, когда мы отметили кратковременное ускорение свертывания активность сохранялась достоверно высокой 91,12±19,08 нкат·л-(р<0,01; n=15). Дальнейшие изменения носили волнообразный характер: активность несколько снижалась к 24 часам, не возвращаясь к исходным значениям, и вновь значительно возрастала до 144,76±15,36 нкат·л-1 (р<0,01; n=15) после повторного введения эндотоксина.

Популяция микровезикул является гетерогенной как по липидному, так и белковому составу, что связано со структурными и функциональными особенностями клеток, из которых они происходят и природой активирующего сигнала. В наших экспериментах признаком гетерогенности явилось различие в динамике общего числа микровезикул по результатам проточной цитометрии и популяции, содержащей экто-5’-нуклеотидазу (рис. 5), а также экспрессии на поверхности микровезикул фосфатидилсерина (рис. 6).

Общее количество микровезикул при подсчете в проточном цитометре достоверно возрастало с 15-ой минуты с 105099,1±10070,9/мкл до 145558,4±10166,6/мкл (р<0,05; n=15), достигая промежуточного пика к моменту достоверного ускорения свертывания через минут 199381,2±16943,6/мкл (р<0,01; n=15), к 24 часам составляло 185813,3±11488,9/мкл (р<0,01; n=15), и продолжало нарастать до конца наблюдения, составляя к 26 часам 291105,4±16327,5/мкл (р<0,01; n=15).

3** 300 ** ** 2** ** ** ** ** ** 2** * * * 111 2 3 4 5 6 7 8 1- исходный уровень. 2-5 минут. 3-15минут, 4-30 минут, 5-60 минут, 6-часа, 7-24 часа 15 минут, 8-24 часа 30 минут. 9-26 часов общее кол-во микровезикул 5-нуклеотидаза содержащие микровезикулы время светрывания крови Рис. 5 Сравнительная динамика микровезикуляции и свертывания крови при эндотоксинемии **- р<0,01, *- р<0,05 по сравнению с исходным уровнем Возрастание общего количества микровезикул до 189%, а экто-5’-нуклеотидаза содержащих – до 188% от исходного уровня соответствовало максимальному ускорению свертывания, в то время как повышение общего количества до 276%, а экто-5’нуклеотидаза содержащих – до 298% через сутки после начала эксперимента – резкой % гипокоагулемии на фоне развивающего диссеминированного внутрисосудистого свертывания крови.

Рис. 6 Экспрессия фосфатидилсерина по связыванию мероцианина (МС540) микровезикулами в динамике эндотоксинемии.

1-исходный уровень, 2- 15 минут, 3- 30 минут, 4- 60 минут после однократного введения ЛПС.

Окрашиванием микровезикул липофильным флуорохромом мероцианином 5(МС540) мы оценивали нарушение асимметрии клеточной мембраны. Регистрация интенсивности флуоресценции выявляет изменения упаковки мембранных фосфолипидов при их перемешивании (scrambling) и отражает экспрессию фосфатидилсерина. При исследовании связывания микровезикулами мероцианина, выявлено, что эти частицы являются фосфатидилсерин положительными, что соответствует механизму их образования в ходе мембранного ремоделирования клеточного источника. Кроме того, был обнаружен феномен образования популяции частиц с повышенным содержанием этого прокоагулянтного фосфолипида на 15-30 минутах эндотоксинемии, сохранявшейся и через 24 часа, что видно на цитофлуореграмме (рис. 6), в области, выделенной маркером М2, соответствующей более интенсивному свечению флуорохрома. Через 30 минут эндотоксинемии экспонирование фосфатидилсерина возрастает с 5,96±0,71% до 14,21±0,53% (р<0,05, n=6), а через 24 часа составляло 9,69±0,82%.

В обнаруженном отделении микровезикул в кровоток на ранних сроках эндотоксемии могут участвовать медиаторы системного воспалительного ответа.

Поскольку эндотоксинемия приводит к активации комплемента, а цитотоксический комплекс С5b-9 известен как один из наиболее мощных инициаторов микровезикуляции in vitro [Sims P. J. et al, 1988], мы определили уровень свободного гемоглобина в плазме, как маркер лизиса эритроцитов. Уровень плазменного гемоглобина достоверно возрастал через 30 минут после однократного введения ЛПС с 0,1774 ± 0,0139 до 0,2547 ± 0,02(Е540) (р<0,05; n=15), многократно возрастал к 24 часам от начала эксперимента 1,6685±0,5097 (Е540) (р<0,01; n=15) и вновь повышался после введения второй дозы эндотоксина до конца эксперимента 2,7956±0,2718 (Е540) (р<0,001; n=15). Резкий рост уровня плазменного гемоглобина, наблюдавшийся нами на протяжении всего эксперимента свидетельствует о перманентном гемолизе. Индукционный период комплемент-зависимого гемолиза составляет около 5 минут [Галембская Л. В., 1998].

18*** 1614*** *** 121000 ** 864* * 21 2 3 4 5 6 7 8 +ЛПС плазменный Нв +NaCl плазменный Нв кол-во микровезикул Рис. 7 Сравнительная динамика микровезикуляции и уровня плазменного гемоглобина при эндотоксинемии ***- р<0,001; **- р<0,01; *- р<0,05 по сравнению с исходным уровнем % Таким образом, нельзя исключить участия комплемента в инициации образования микровезикул, поскольку динамика плазменного гемоглобина и уровень микровезикуляции после однократного введения ЛПС совпадают (рис. 7). Коэффициент ранговой корреляции для активности экто-5'-нуклеотидазы и уровня плазменного гемоглобина составил 0.900 для параметров от начала до 60 минут наблюдения (р<0,05), то есть в этот период выявлена корреляция высокой степени. В то же время через 24 часа и после повторного введения ЛПС уровень плазменного гемоглобина резко возрастает (до 940% - 1572%), значительно превосходя степень возрастания количества микровезикул.

Таким образом, патогенетическими факторами инициальной гиперкоагулемии при эндотоксинемии по нашим данным являются микровезикулы крови. Уже через 15 минут эндотоксин индуцирует везикуляцию клеток сосудистого сектора, которая продолжается и усиливается на протяжении генерализованного феномена Швартцмана. Обращает на себя внимание то, что инициация микровезикуляции совпадает по времени с аналогичным процессом, индуцированным острой кровопотерей, адреналинемией и вазопрессинемией.

Выявленный нами рост числа микровезикул с появлением популяции с высокой степенью экспрессии фосфатидилсерина свидетельствует об инициации Са2+-зависимого ремоделирования клеточных мембран и выносом фосфатидилсерина на наружный слой.

Вместе с тем, достоверное ускорение свертывания крови при эндотоксинемии отмечено через 60 минут на фоне промежуточного пика микровезикуляции, то есть для достижения необходимого уровня тромбинообразования внутри сосудистой системы необходимы как фосфолипидные площадки, так и требующее времени экспонирование активированными клетками-эффекторами индукторов гемостаза, в первую очередь тканевого фактора.

Реакция Швартцмана с двукратным введением ЛПС – классическая модель тяжелого сепсиса, осложняющегося ДВС с характерной агрегацией тромбоцитов, сладжированием эритроцитов, аккумуляцией нейтрофилов, повреждением эндотелия с апоптозом и некрозом различной распространенности, окклюзией сосудов[Sjoukje H.et al, 2006]. О развитии диссеминированного внутрисосудистого свертывания в наших экспериментах свидетельствует резкое замедление свертывания крови и повышение уровня РФМК – продуктов действия тромбина. Кроме того, через 24 часа эндотоксинемии и после повторного введения ЛПС в наших экспериментах значительно возрастал уровень плазменного гемоглобина (до 940% - 1572% от исходного уровня), что является дополнительным маркером тромбогеморрагического синдрома, так как выявление большого числа фрагментов эритроцитов и свободного гемоглобина характерно для синдрома ДВС любого происхождения [Баркаган З. С. и др., 1988; Dolea A. et al, 1988].

Индуцированное двукратным введением ЛПС диссеминированное внутрисосудистое свертывание сопровождается циркуляцией в кровотоке повышенного количества микровезикул, превышающего исходный уровень в 2,7 раза. При этом популяция микровезикул, являющихся носителем экто-5'-нуклеотидазы в составе липидных плотов, дополнительно мобилизуется после второй инъекции ЛПС. То есть перманентно образующиеся под влиянием ЛПС микровезикулы с прокоагулянтным фенотипом, которые легче, чем клетки, могут быть подхвачены током крови и распространятся за пределы места инициации свертывания, становятся компонентом патогенеза развивающегося синдрома ДВС.

С учетом полученных результатов, события при эндотоксинемии включают:

индуцированную ЛПС и/или комплементом активацию клеток и отделение микровезикул с повышенной экспрессией фосфатидилсерина, предоставляющих фосфолипидные площадки для коагуляции, инициацию внешнего пути свертывания, гиперкоагуляцию.

Персистенция прокоагулянтного стрессора сопровождается гипермикровезикуляцией, которая, выходя за рамки адаптивного ответа, становится частью патогенеза ДВС, создавая условия для непрерывной системной активации свертывания крови и гипокоагуляции.

Однако прокоагулянтный стимул может действовать не одномоментно, а длительно, приводя к формированию нового стационарного состояния в системе гемостаза, исследование характера микровезикуляции в таких обстоятельствах явились следующей задачей работы.

Системный и местный уровни микровезикуляции при физиологических родах и кесаревом сечении.

Уникальными физиологическими вызовами системе гемостаза являются беременность и родоразрешение. Гемостаз необходим в ходе имплантации, развития плаценты и при ее отделении от стенки матки в родах. Результатом приспособительной эндокриногенной системной и локальной перестройки системы является умеренная кровопотеря, сопровождающая процесс естественных родов у человека, которую принято считать и называть «физиологической», «допустимой» или «адаптивной» [Сидельникова В. М. И др., 2004; Маршалов Д. В., 2005]. При острых стрессах, в том числе массивной кровопотере, по данным наших экспериментов, в периферической крови наблюдается гипермикровезикуляция, соответствующая развитию гиперкоагулемии. В то же время мобилизация гемостатического механизма в родах происходит на фоне уже сформировавшейся перестройки системы свертывания крови. Для выявления реализации микровезикуляционного механизма при физиологическом гиперкоагуляционном состоянии у беременных, а также в периферической и маточной крови в динамике родоразрешения нами проведено исследование количества и прокоагулянтных свойств микровезикул.

Для интегрального суждения о состоянии системы крови использовался дифференциальный подсчет клеток крови и скрининг гемостаза по уровню фибриногена, АЧТВ и протромбиновому времени (ПВ). Нами не обнаружено патологических отклонений в гемограмме и системе гемостаза ни в одной из обследованных групп женщин, что и определяло включение пациенток в группы по исследованию микровезикуляции. При анализе временных показателей Т1 и Т2 методом компьютерной электрокоагулографии (КэлКГ) выявлена тенденцию к снижению параметра Т1, свидетельствующая об ускорении тромбинообразования при физиологическом родоразрешении по сравнению с этим показателем в контрольной группе небеременных женщин, не достигавшим, впрочем, достоверных значений. Отмечалась также тенденция к повышению фибринолитической активности (Amax, ФА (%)) перед родоразрешением.

В то время как стандартные скрининговые методы оценки гемостаза не выявили достоверных изменений в системе, исследование микровезикуляции показало наличие реакций прокоагулянтного характера. Оценка общего количества микровезикул в пробах периферической и ретроплацентарной крови производилась в проточном цитометре. На рисунке 9 представлена типичная цитофлуореграмма пробы плазмы, полученной после центрифугирования цитратной крови роженицы.

Рис. 9. Цитофлуореграмма плазмы роженицы R1 – микровезикулы FSC-Н – прямое малоугловое светорассеивание SSC-Н – боковое светорассеивание Область R1, соответствующая зоне микровезикул, содержит 98,9% зарегистрированных событий. В этой области осуществлялся подсчет количества микровезикул. Следует отметить, что на сегодняшний день еще не существует универсальных норм количества микровезикул в крови человека. Поэтому в наших исследованиях мы, во-первых, использовали для сравнения пробы крови одной и той же пациентки в динамике родоразрешения, а во-вторых, проводили статистический анализ в относительных величинах (%), так как столкнулись со значительными индивидуальными колебаниями числа микровезикул в периферической крови.

Оценка особенностей микровезикуляционного механизма при острой гемостатической реакции в динамике родоразрешения выявила его пространственное ограничение. В периферической крови у беременных, повышено общее количество микровезикул с 61353,0±1901,4/мкл (n=10) у небеременных до 84667,1±13164,5/мкл (р <0,05, n=13), что согласуется с данными других авторов, использовавших различные методы оценки микровезикуляции [Субханкулова А.Ф., 1987; Bretelle F. et al, 2003; Combes V. et al, 2003]. При физиологическом родоразрешении нами не выявлено изменений уровня микровезикул в периферической крови, то есть дополнительной диссеминации микровезикул в системный кровоток. Уровень в первом периоде родов - 79145,4±12676,9/мкл, в третьем - 68101,8±22520,2/мкл р >0,05 (n=13).

На плацентарной площадке происходит выраженная активация клеток, проявляющаяся высоким уровнем микровезикуляции, о чем свидетельствует в 11 раз большее количество этих частиц в ретроплацентарной крови - 749120,1±48504,8/мкл по сравнению с 68101,8±22520,2/мкл (р <0,001, n=13) в периферической крови после родоразрешения.

Histogram Stat File: Mochaeva platelets 2.00Sample ID: 21.03.

Patient ID: Mochaeva platele Tube:

Panel: Acquisition Date: Gate: No Gate Gated Events: 2Total Events: 235MMark Left, Rig Event % Gat % Tot Al 1, 99 2350 100.0 100.M1 9, 99 1146 48.7 48.Рис. 10. Гистограмма, иллюстрирующая экспрессию молекул СD61 (зона М1) на поверхности фосфатидилсерин-позитивных клеток, (по результатам двойного окрашивания МС540 и анти-СD61-мАТ и анализа в режиме dot-plot).

Поскольку биологический потенциал микровезикул обусловлен не только их количеством, но и фенотипом, мы исследовали экспрессию на них фосфатидилсерина, используя в качестве маркера связывание флюорохрома МС540. Параллельно оценивали тот же параметр на клетках. Для определения фенотипа клеток, экспонирующих фосфатидилсерин использованы мкАТ CD61. Обработанные мкАТ CD61 (меченные FITC) пробы клеточной взвеси, полученные после лизирования эритроцитов, анализировали методом проточной цитометрии с регистрацией результатов на первом (FL1) канале флуоресценции. Клетки, экспрессировавшие фосфатидилсерин, связывали мкАТ CD61, то есть являлись тромбоцитами (рис. 10).

У беременных отмечена тенденция к повышению экспрессии фосфатидилсерина на тромбоцитах, которая достигала достоверных значений в первом периоде родов - 9,7±3,6% (n=10); 19,8±8,4% (р>0,05; n=13); 21,9±3,4% (р<0,05; n=13). В ходе физиологического родоразрешения в периферической крови она достоверно не менялась 15,9 ± 2,1% (р>0,05; n=13), но возрастала на плацентарной площадке, где экспонирование фосфатидилсерина на тромбоцитах, свидетельствующее о реаранжировке их мембран, было наибольшим и составило 25,5±0,5% (р<0,01; n=13) (рис.11).

MMHistogram Statistics Histogram Statistics File: Sabirzyanova PL.002 Log Da File: Sabirzyanova PL.003 Log Data Sample ID: 29.04.05 Patien Sample ID: 29.04.05 Patient ID Tube: Panel:

Tube: Panel:

Acquisition Date: 3-Jun-5 Gate: G Acquisition Date: 3-Jun-5 Gate: GGated Events: 51724 Total E Gated Events: 54835 Total Eve X Parameter: FL2-H MC540 (Log) X Parameter: FL2-H MC540 (Log) Marker Left, Right Events % Gated % Tota Marker Left, Right Events % Gated % Total All 1, 9910 51724 100.00 91.All 1, 9910 54835 100.00 97.M1 38, 9910 12764 23.28 22.78 4 M1 38, 9910 8443 16.32 14. Рис.11. Уровень экспрессии фосфатидилсерина на тромбоцитах, оцениваемый по интенсивности свечения флуорохрома МС 540.

002-периферическая кровь; 003-ретроплацентарная кровь.

Экспонирование фосфатидилсерина на микровезикулах достоверно возрастало у беременных 23,3±2,2% (р<0,05; n=13) и в первом периоде родов 25,8±0,6% (р<0,05; n=13) по сравнению с уровнем у небеременных 6,4±0,9% (n=10). В динамике родов показатель в периферической крови не менялся, также как и на тромбоцитах 26,1±0,9% (р>0,05, n=13). В то же время на плацентарной площадке, где, как выявлено нами, общее количество микровезикул больше, чем на периферии, значительно выше и содержание на микровезикулах фосфатидилсерина 54,6±2,7% (р<0,01, n=13) (рис. 12). Коэффициент ранговой корреляции для экспресии ФС на микровезикулах и тромбоцитах в динамике физиологического родоразрешения составил 0.700, что соответствует корреляции средней степени.

Histogram Statistic File: Gilmoutdinova MP.001 Log Data Units: Linear Valu Sample ID: 29.04.05 Patient ID: Gilmoutdinova M Tube: Panel:

Acquisition Date: 3-Jun-5 Gate: GGated Events: 53564 Total Events: 546X Parameter: FL2-H MC540 (Log) MА Marker Left, Righ Events % Gated % Tota Mean All 1, 991 53564 100.00 98.05 5.M1 7, 991 12524 23.38 22.93 17.Histogram Statistics File: Gilmoutdinova MP.002 Log Data Units: Linear Values Sample ID: 29.04.05 Patient ID: Gilmoutdinova MP Tube: Panel:

Acquisition Date: 3-Jun-5 Gate: GGated Events: 53214 Total Events: 540X Parameter: FL2-H MC540 (Log) MБ Marker Left, Right Events % Gated % Total Mean All 1, 9910 53214 100.00 98.41 7.M1 7, 9910 14363 26.99 26.56 22.Histogram Statisti File: Gilmoutdinova MP.003 Log Data Units: Linear Val Sample ID: 29.04.05 Patient ID: Gilmoutdinova Tube: Panel:

Acquisition Date: 3-Jun-5 Gate: No Gate Gated Events: 58800 Total Events: 588X Parameter: FL2-H MC540 (Log) В MMarke Left, Righ Events % Gated% Tota Mean All 1, 991 58800 100.00 100.00 207.M1 17, 991 38207 64.98 64.98 318.Рис.12. Экспрессия фосфатидилсерина на микровезикулах, оцениваемая по интенсивности свечения флюорохрома МС 540. А - первый период родов, Б - третий период родов, В - ретроплацентарная кровь Таким образом, новое стационарное состояние системы гемостаза, формирующееся при беременности, в ходе физиологического родоразрешения реализуется пространственно ограниченной реакцией тромбоцитов и локальным образованием прокоагулянтных микровезикул в крови, изливающейся из маточных сосудов.

Оперативное родоразрешение, являясь не физиологическим, расширяет активационные механизмы гемостаза. Кесарево сечение, несмотря на длительный опыт его применения и постоянное совершенствование, несет в себе значительную угрозу здоровью матери, в первую очередь в связи с высоким риском развития тромбогеморрагических осложнений. Кровотечения при кесаревом сечении встречаются в 3-5 раз чаще, чем при естественном родоразрешении, причем в 68,4% случаев они имеют коагулопатический механизм [Кулаков В. И. И др., 2004]. Мы провели изучение количественных и качественных характеристик микровезикул в динамике оперативного родоразрешения, включив в группу обследованных только женщин с неосложненным течением беременности и показаниями к операции со стороны плода. Средняя кровопотеря в ходе оперативного родоразрешения составила 459,29 ± 19,43 мл. Скрининговые характеристики гемостаза и цитограмма крови не имели патологических отклонений, что и определило включение пациенток в группу по исследованию микровезикуляции. При анализе временных показателей Т1 и Т2 КэлКГ выявлена тенденцию к снижению параметра Т1 до операции, свидетельствующая об ускорении тромбинообразования, и повышению Т1 в динамике оперативного вмешательства, которая, впрочем, не достигала достоверных значений.

Отмечалось увеличение параметров Amax, ФА(%), свидетельствующее об активации фибринолиза перед родоразрешением и в ходе операции, однако также только в виде тенденции.

Количество микровезикул в периферической крови перед началом операции составило 123319,5±35411,2/мкл по сравнению с уровнем у небеременных 61353,0±1901,4/мкл (р <0,05, n=10), в динамике вмешательства количество микровезикул снижалось до 77304,8±2525,0/мкл (р <0,05, n=14), что могло быть результатом их потребления. Ретроплацентарная кровь содержала микровезикул в 11,2 раза больше, чем периферическая 865813,5±36394,3/мкл (р <0,001, n=14), что соответствовало уровню, выявленному при физиологическом родоразрешении и свидетельствовало о выраженной локальной микровезикуляции. Достоверного различия в общем количестве микровезикул в ретроплацентарной крови при физиологическом и оперативном родоразрешении мы не наблюдали.

В ходе оперативного родоразрешения достоверно возрастала экспрессия фосфатидилсерина на тромбоцитах в периферической крови с 17,6 ± 1,3% до 29,5 ± 3,9% (р<0,05, n=14), свидетельствуя о нарушении мембранной асимметрии с переносом анионных фосфолипидов из цитоплазматического листка клеток на наружный. Достоверно высоким было также экспонирование фосфатидилсерина на тромбоцитах в ретроплацентарной крови 23,8 ± 4,8% (р<0,05, n=14). В целом, степень активации тромбоцитов, оцениваемая по нарушению асимметрии мембранных фосфолипидов, в динамике оперативного вмешательства выше, чем при физиологических родах.

Принципиально сходная динамика экспонирования фосфатидилсерина при кесаревом сечении обнаружена на микровезикулах. Значительно (до 157%) возрастала экспрессия фосфатидилсерина на микровезикулах в периферической крови 32,6 ± 2,9% по сравнению с дооперационным уровнем 20,8 ± 2,2% (р<0,05, n=14). Имея в виду выявленное нами снижение общего количества этих частиц при кесаревом сечении, следует отметить, что остающиеся в циркуляции микровезикулы экспонируют больше фосфатидилсерина. Это может быть объяснено образованием их из активированных тромбоцитов, что согласуется с отмеченной выраженной экстернализацией фосфатидилсерина на этих клетках в периферической крови в динамике кесарева сечения. То есть при кесаревом сечении относительно более выражена активация и микровезикуляция тромбоцитов в периферической крови. Наибольший уровень фосфатидилсерина обнаружен на микровезикулах в ретроплацентарной крови 43,0 ± 1,3% (р<0,01, n=14) (рис. 13).

Таким образом, при физиологических родах, образующиеся в значительном количестве микровезикулы с повышенным содержанием фосфатидилсерина, ограничены плацентарной площадкой, где они выполняют адаптивную гемостатическую функцию наряду с другими прокоагулянтными компонентами, в первую очередь повышенной экспрессией тканевого фактора. Расширение зоны активации гемостаза при кесаревом сечении принципиально изменяет характер микровезикуляции. В ретроплацентарной крови обнаруживается высокий уровень микровезикул, экспрессирующих повышенное количество фосфатидилсерина, что также, как при физиологических родах отражает местный адаптивный ответ системы. В то же время выраженная активация тромбоцитов и микровезикуляция сопровождается распространением микровезикул в периферическую кровь. Учитывая прокоагулянтный потенциал микровезикул, этот механизм может являться фактором риска тромбогеморрагических осложнений кесарева сечения при наличие таких отягчающих факторов, как неадекватный хирургический гемостаз, декомпенсированная экстрагенитальная патология, осложнения беременности.

Histogram S File: Trofimova MP.001 Log Data Units: L Sample ID: 3.08.05 Patient ID: Trofim Tube: Panel:

А Acquisition Date: 3-Aug-Gate: No Gate MGated Events: 53445 Total Events: 5X Parameter: FL2-H MC MarkLeft, R Even % Ga % To Mea Geo M CV Medi Peak A 1, 9 5344 100. 100. 9.6 3.4 502. 2.1 M 12, 9 129 24.2 24.2 31.4 24.6 301. 23.2 Histogram S File: Trofimova MP.002 Log Data Units: Li Sample ID: 3.08.05 Patient ID: Trofimo Tube: Panel:

Acquisition Date: 3-Aug-5Gate: No Gate Б MGated Events: 54630 Total Events: 54X Parameter: FL2-H MCMarkLeft, R Even % Ga % To Mea Geo M CV Medi Peak Al 1, 9 5463 100. 100. 20.9 4.3 287. 2.5 M 12, 9 1525 27.9 27.9 68.2 38.9 145. 28.6 Histogram St File: Trofimova MP.004 Log Data Units: Lin Sample ID: 3.08.05 Patient ID: Trofimo Tube: Panel:

Acquisition Date: 3-Aug-5 Gate: No Gate MGated Events: 54360 Total Events: 54В X Parameter: FL2-H MCMarkLeft, R Even % Ga % To Mea Geo M CV Medi Peak Al 1, 9 5436 100.0100.0 14.9 5.6 235. 5.2 M 12, 9 2000 36.8 36.8 35.2 28.6 147. 27.6 Рис.13. Экспрессия фосфатидилсерина на микровезикулах, оцениваемая по интенсивности свечения флюорухрома МС 540. А - до операции, Б - после операции, В - ретроплацентарная кровь Таким образом, для исследования значения микровезикуляции, как функции различных моделей активации клеток-эффекторов гемостаза, проведено исследование трех сценариев активации гемостаза: однократное воздействие чрезвычайного стрессора – острая кровопотеря, персистенция чрезвычайного стрессора – эндотоксинемия в дозах, моделирующих септическое состояние, острый стресс на фоне прокоагулянтной модуляции системы гемостаза – родоразрешение.

Являясь процессом, характерным для жизнедеятельности клеток, интегральная микровезикуляция соответствует трем вариантам ответов на стимул. В первом случае реакция клеток развивается за минуты, отражая рефлекторный принцип нервной регуляции свертываемости крови. Во втором – нарастает в течение часов и достигает декомпенсированной степени под влиянием перепрограммирующего клетки-мишени и индуцирующего непрерывный процесс внутрисосудистого свертывания ЛПС. В третьем – микровезикуляционная реакция ограничена рамками локального адаптивного ответа на стрессор в организме, обеспечившем приспособление системы гемостаза к изменившимся условиям. Таким образом, как быстрые, кратковременные ответы системы гемостаза, характерные для острой кровопотери, гиперадреналинемии, так и длительные, как, например, во время беременности, имеют в своей основе микровезикуляционные клеточные реакции. При этом адаптивный вариант микровезикуляции ограничен во времени или в пространстве, в наших экспериментах такими являлись постгеморрагическая, постадреналиновая реакции и физиологическое родоразрешение. Затяжные и интенсивные воздействия вызывают более существенное усиление микровезикуляции, которое сопровождается выявленным при феномене Шварцмана развитием явной картины диссеминированного внутрисосудистого свертывания, а распространение прокоагулянтных микровезикул в системный кровоток при оперативном вмешательстве – потенциальным механизмом скрытого внутрисосудистого свертывания. То есть распространение в кровоток микровезикул, являющихся носителем биологически активных эффекторов гемостаза является прямым патогенетическим маркером гиперкоагуляции ВЫВОДЫ 1. Патогенетическими факторами острой адаптивной постгеморрагической гиперкоагулемии являются микровезикулы крови. Пик циркуляции в кровотоке микровезикул, содержащих экто-5’-нуклеотидазу – компонент липидных плотов – соответствует максимальному ускорению свертывания крови. Начинающаяся нормализация коагуляционных свойств крови сопровождается снижением количества микровезикул.

2. Адреналин и агонист V2 рецепторов - 1-дезамино-8-D-аргинин-вазопрессин являются индукторами микровезикуляции. Постадреналиновая гипермикровезикуляция – кратковременна, совпадает с периодом ускорения гемокоагуляции, снижение уровня микровезикул соответствует замедлению свертывания крови. Достоверное возрастание уровня микровезикул и ускорение свертывания крови при 1-дезамино-8-D-аргинин-вазопрессинемии совпадают.

3. Микровезикулы являются триггером развития гиперкоагуляции при эндотоксинемии.

Резкое (двукратное) возрастание числа микровезикул и появление популяции с высоким уровнем экспрессии фосфатидилсерина, свидетельствующие о переносе прокоагулянтного фосфатидилсерина на наружный листок бислоя, соответствует максимальному ускорению свертывания крови.

4. Индуцированные липополисахаридом (эндотоксином) диссеминированное внутрисосудистое свертывание крови и гипокоагуляция характеризуется циркуляцией в cистемном кровотоке повышенного количества микровезикул, превышающего исходный уровень в 2,7 раза.

5. Активация свертывающей системы крови при физиологических родах на фоне прокоагулянтной перестройки у беременных характеризуется локальной пространственно ограниченной микровезикуляцией клеток. Количество микровезикул с двукратно повышенной экспрессией фосфатидилсерина на плацентарной площадке на участке активации гемостаза многократно превышает таковое в системном кровотоке, где при физиологическом родоразрешении ни уровень, ни экспрессия фосфатидилсерина микровезикулами не меняются.

6. Оперативное родоразрешение нарушает локализованность микровезикуляционной реакции, сопровождаясь диссеминацией в системный кровоток тромбоцитов и микровезикул с повышенной экспрессией прокоагулянтного фосфатидилсерина на их поверхности.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 1. Исследование плазмы, полученной после центрифугирования стабилизированной крови, методом проточной цитометрии позволяет производить подсчет количества микровезикул в единице объема крови. При регистрации спонтанного прямого малоуглового (FSC) и бокового (SSC) светорассеивания в логарифмическом режиме микровезикулы дискриминируются в отдельной зоне и возможен их подсчет за фиксированное время.

Кратное повышение уровня микровезикул соответствует гиперкоагуляции и может служить ее маркером.

2. Прокоагулянтный фенотип микровезикул, оцениваемый методом проточной цитометрии по уровню связывания липофильного флюорохрома мероцианина 540, может использоваться как маркер при исследовании механизмов гиперкоагуляции. Отсутствие видовой специфичности маркера позволяет применять данный метод исследования и в экспериментах на животных.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Зубаирова Л. Д. Активность 5'-нуклеотидазы альвеолярных макрофагов при анафилактическом шоке / Л. Д. Зубаирова, А. И. Рахматуллина // Казанский мед. журнал.– 1984. –№1. –№1. – С.62.

2. Зубаиров Д. М. Патофизиологическое и клинико-диагностическое значение микровезикуляции в крови / Д. М. Зубаиров, И. А. Андрушко, Л. Д. Зубаирова // Гематология и трансфузиология. – 1999. – Т. 44, № 5. – С. 24-30.

3. Zoubairov D. Microvesicles and Lysosomes are the Effectors of Physiological Hypercoagulability in Mammals / D.Zoubairov, I. Andrushko, L. Zoubairova // XVII Congress of International Society on Thrombosis and Haemostasis, Washington. – 1999. – Р. 954.

4. Микровезикулы в крови больных острыми лейкозами / Д. М. Зубаиров, И. А.

Андрушко, Л. Д. Зубаирова, Г. Ю. Свинтенок // Биохимия на рубеже ХХ1 века:

межрегиональный сборник научных трудов. – Рязань, 2000. – С. 211-214.

5. Выявление гемокоагуляционной активности лейкозных клеток при остром миелобластном лейкозе и хроническом миелолейкозе / Д. М. Зубаиров, И. А. Андрушко, Л.

Д. Зубаирова, Г. Ю. Свинтенок, А. Р. Ахмадеев, В. Н. Григорьев, З. М. Нехорошкова // Казанский мед. журнал. – 2000.– Т. 81, № 3. – С. 185-188.

6. Микровезикулы в крови больных острыми лейкозами / Д. М. Зубаиров, И. А.

Андрушко, Л. Д. Зубаирова, Г. Ю. Свинтенок, А. Р. Ахмадеев, В. Н. Григорьев, З. М.

Нехорошкова // Казанский мед.журнал. – 2000. – Т. 81, № 4. – С. 269-271.

7. Роль микровезикуляции в непрерывном свертывании крови при вирусных, бактериальных и микоплазменных инфекциях / Д. М. Зубаиров, И. А. Андрушко, В. Х.

Фазылов, Л. Д. Зубаирова, Л. И. Мальцева // V Всероссийская конференция Всероссийской ассоциации по изучению тромбозов, геморрагий и патологии сосудистой стенки, «Тромбозы, геморрагии, ДВС-синдром. Проблемы лечения». – М., 2000. – С. 76-78.

8. Microvesicles-modulators of haemostasis in acute and chronic infections / L. Zoubairova, D. Zoubairov, I. Andrushko, V. Fazilov, L. Malceva // Supplement to the journal Thrombosis and Haemostasis. Juli 2001. (ISSN 0340-6245) XV111 Congress of The International Society on Thrombosis and Haemostasis. – Paris, 2001. – Р. 761.

9. Зубаиров Д. М. Роль микровезикул в регуляции свертывания крови / Д. М. Зубаиров, И. А. Андрушко, Л. Д. Зубаирова // Актуальные проблемы теоретической и прикладной биохимии: материалы региональной конференции. – Ижевск, 2001. – С. 36-41.

10. Пертурбация эндотелия – причина острой гиперкоагулемии / Д. М. Зубаиров, И. А.

Андрушко, Л. Д. Зубаирова, Г. Ю. Свинтенок // Казанский мед. журнал. – 2002. –Т. 83, № 5.

– С. 327-334.

11. Механизмы острой гиперкоагулемии после острой кровопотери / Д. М. Зубаиров, И.

А. Андрушко, Л. Д. Зубаирова, Г. Ю. Свинтенок // Первая Всероссийская научная конференция «Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии». – М., 2003. – С. 28.

12. Механизмы острой постгеморрагической гиперкоагулемии / Д. М. Зубаиров, И. А.

Андрушко, Л. Д. Зубаирова, Г. Ю. Свинтенок // Тромбоз, гемостаз и реология. –2003. – № 1.

– С. 27-31.

13. Нарушение липидной асимметрии при термогемолизе эритроцитов человека / Д. М.

Зубаиров, И. А. Андрушко, Г. Ю. Свинтенок, Д. М. Садыкова, А. К. Зыятдинова, Л. Д.

Зубаирова // Гематология и трансфузиология. – 2003. – Т. 48, № 3. – С. 33-35.

14. Диагностическое значение микровезикуляции в крови человека и животных/ Д. М.

Зубаиров, Г. Ю. Свинтенок, И. А. Андрушко, Л. Д. Зубаирова // Академия наук Республики Татарстан. Сборник аннотированных отчетов по НИР. Этап 2003 г. – Казань, Изд-во «Фэн». – 2003. –С.67-69.

15. Клеточные микровезикулы в динамике экспериментальной эндотоксиемии / Л. Д.

Зубаирова, И. А. Андрушко, Г. Ю. Свинтенок, И. Г. Мустафин, Д. М. Зубаиров // Третий Российский конгресс по патофизиологии “Дизрегуляционная патология органов и систем”. – М., 2004. – С. 69.

16. Зубаирова Л. Д. Роль клеточных микровезикул в свертывании крови / Л. Д.

Зубаирова, Д. М. Зубаиров // Забайкальский медицинский вестник. – 2004. – № 4. –С. 39-43.

17. Повышение свертываемости крови после острого артериального кровотечения / Д. М.

Зубаиров, И. А. Андрушко, Л. Д. Зубаирова, Г. Ю. Свинтенок // Сборник работ Гематологического Научного Центра РАМН “Патофизиология крови. Экстремальные состояния”. – М., 2004. – С. 44-49.

18. Клинико-диагностическое значение микровезикуляции в крови больных/ Л. Д.

Зубаирова, Г. Ю. Свинтенок, И. А. Андрушко, Д. М. Зубаиров // Академия наук Республики Татарстан. Сборник аннотированных отчетов по НИР. Этап 2004 г. – Казань, Изд-во «Фэн». – 2004. –С.69-70.

19. Функции и диагностическое значение микровезикул в крови / Л. Д. Зубаирова, Д. М.

Зубаиров, И. А. Андрушко, Г. Ю. Свинтенок, И. Г. Мустафин // Вторая Всероссийская научная конференция «Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии». – М., 2005. – С. 109-110.

20. Зубаиров Д. М. Роль микровезикул в гемостазе - новое направление в изучении патофизиологии гемостаза / Д. М. Зубаиров, Л. Д. Зубаирова // Вестник гематологии. – 2005.

– Т. 1, № 2. – С. 15-20.

21. Микровезикулы в крови / Д. М. Зубаиров, И. А. Андрушко, Л. Д. Зубаирова, Г. Ю.

Свинтенок, И. Г. Мустафин // Наукоемкие технологии. – 2005. – Т. 6, № 8-9. – С. 54-58.

22. Яковлев Н. В. Клеточные микрочастицы в динамике операции кесарево сечение / Н.

В. Яковлев, Л. Д. Зубаирова, Ф. А. Абдулхаев // Вторая Всероссийская научная конференция «Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии». – М., 2005. – С. 111.

23. Проточная цитометрия в оценке механизмов маточного гемостаза в последовом и раннем послеродовом периодах / А. А. Хасанов, Л. Д. Зубаирова, Н. В. Яковлев, Ф. А.

Абдулхаев // Первый Всероссийский форум «Инновационные технологии медицины XXI века».– М., 2005. – С. 281-283.

24. Роль клеточных микровезикул в механизмах маточного послеродового гемостаза / Н.

В. Яковлев, Л. Д. Зубаирова, А. А. Хасанов, Ф. А. Абдулхаев // Международная конференция “Гемореология в микро- и макроциркуляции”. – Ярославль, 2005. – С. 96.

25. Клеточные микровезикулы в динамике экспериментальной эндотоксинемии / Л. Д.

Зубаирова, Д. М. Зубаиров, И. А. Андрушко, Г. Ю. Свинтенок, И. Г. Мустафин // Всероссийская конференция Всероссийской ассоциации по изучению тромбозов, геморрагии и патологии сосудов “Тромбозы, геморрагии, ДВС-синдром. Современные достижения”. – Ярославль, 2005. – С. 39.

26. Зубаирова Л. Д. Участие микровезикул в развитии синдрома ДВС / Л. Д. Зубаирова, Д. М. Зубаиров // Беломорский симпозиум “Актуальные вопросы гемостазиологии и трансфузиологии”. – Архангельск, 2005. – С. 51-54.

27. Функции и диагностическое значение микровезикул в крови.–Беломорский симпозиум “Актуальные вопросы гемостазиологии и трансфузиологии” / Л. Д. Зубаирова, Д. М. Зубаиров, И. А. Андрушко, Г. Ю. Свинтенок, И. Г. Мустафин. – Архангельск, 2005. – С. 75.

28. The role of cell derived microparticles in uterine postpartum haemostasis during vaginal and cesarean delivery / N. V. Yakovlev, L. D. Zubairova, A. A. Khasanov, F. A. Abdulhaev The //3-rd Young Medics International Conference.– Yerevan, 2005. – P. 34.

29. Патофизиологическое и клинико-диагностическое значение микровезикуляции в крови человека и животных / Д. М. Зубаиров, И. А. Андрушко, Л. Д. Зубаирова, Г. Ю.

Свинтенок // Академия наук Республики Татарстан. Сборник аннотированных отчетов по НИР. Этап 2005 г. – Казань, Изд-во «Фэн». –2005. –С.60-62.

30. Микровезикуляция при физиологических родах и кесаревом сечении / Н. В. Яковлев, Л. Д. Зубаирова, А. А. Хасанов, Ф. А. Абдулхаев // Казанский мед. журнал. – 2006. –Т. 87, № 3. – С. 203-207.

31. Zubairova L. D. Cell-derived microparticles in the course of delivery / L. D. Zubairova, N.

V. Yakovlev, D. M. Zubairov // VIII World Congress International society for adaptive medicine. – Moscow, 2006. – Р. 55-56.

32. Клеточные микровезикулы в динамике экспериментальной эндотоксинемии / Л. Д.

Зубаирова, Д. М. Зубаиров, И. А. Андрушко, Г. Ю. Свинтенок, И. Г. Мустафин // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2006. – № 11. – С. 517-520.

33. О механизме гемостатического действия десмопрессина / Д. М. Зубаиров, И. А.

Андрушко, Л. Д. Зубаирова, Г. Ю. Свинтенок // Тромбозы, кровоточивость и болезни сосудов. – 2007. – № 6. – С. 10-14.

34. Липидные рафты в микровезикулах при генерализованном феномене Шварцмана / Л.

Д. Зубаирова, Д. М. Зубаиров, И. А. Андрушко, Г. Ю. Свинтенок, И. Г. Мустафин. // Всероссийская конференция с международным участием “Тромбозы в клинической практике: факторы риска, диагностика, терапия”. – Санкт-Петербург, 2007. – С. 72.

35. Зубаирова Л. Д. Роль лейкоцитов и лейкоцитарных микровезикул в атерогенезе и тромбообразовании / Л. Д. Зубаирова, Д. М. Зубаиров // Всероссийская конференция с международным участием “Тромбозы в клинической практике: факторы риска, диагностика, терапия”. – Санкт-Петербург, Клинико-лабораторный консилиум. – 2007. –№16. – С. 10-19.

36. Изучение механизма гемостатического действия десмопрессина / Д. М. Зубаиров, И.

А. Андрушко, Л. Д. Зубаирова, Г. Ю. Свинтенок // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2007. – № 8. – С. 167-169.




© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.