WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


 

На правах рукописи

ШИРИНСКИЙ

Иван Валерьевич

МЕХАНИЗМЫ ДЕЙСТВИЯ СТАТИНОВ, ИХ ЭФФЕКТИВНОСТЬ И БЕЗОПАСНОСТЬ У БОЛЬНЫХ АУТОИММУННЫМИ ЗАБОЛЕВАНИЯМИ

Специальность 14.00.36. – «Аллергология и иммунология»

автореферат

диссертации  на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Новосибирск - 2009

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Научно-исследовательском институте клинической иммунологии СО РАМН

Научный консультант: академик РАМН, д-р мед. наук         

Владимир Александрович Козлов

                       

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

Арег Артемович Тотолян

доктор медицинских наук, профессор

Константин Валентинович Гайдуль

доктор медицинских наук

Анатолий Пантелеймонович Колесников

Ведущая организация Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Российский государственный медицинский университет  имени Н.И. Пирогова Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации»

 

Защита состоится 16 октября 2009 г. в  ___ часов на заседании диссертационного совета Д 001.001.01. при Учреждении Российской академии медицинских наук Научно-исследовательском институте клинической иммунологии СО РАМН (630099, г. Новосибирск, ул. Ядринцевская 14)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии медицинских наук Научно-исследовательском институте клинической иммунологии СО РАМН

Автореферат разослан _____ _____________ 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор биологических наук                                                О.Т. Кудаева


Общая характеристика работы



Актуальность темы

Актуальность темы исследования обусловлена распространенностью таких аутоиммунных заболеваний, как ревматоидный артрит (РА) и псориаз – 1-4% населения (Abdel-Nasser A.M. et al., 1997), несовершенством методов их лечения, которые у значительной части больных не приводят к улучшению качества жизни, снижению риска ранней нетрудоспособности и смертности. Так, показано, что пятилетняя выживаемость больных РА сопоставима с выживаемостью пациентов, страдающих ишемической болезнью сердца и лимфогранулематозом (Pincus T. et al., 1994).

В последние годы стало известно, что основной причиной высокой смертности больных аутоиммунными заболеваниями является раннее формирование и ускоренное прогрессирование атеросклеротического поражения сосудов, обусловливающего развитие инфаркта миокарда, инсульта, застойной сердечной недостаточности и внезапной смерти (Boehncke W.H. et al., 2008; Gabriel S.E., 2008; Salmon J.E. et al., 2008). РА и псориаз являются независимыми предикторами сердечно-сосудистых заболеваний (Gelfand J.M. et al., 2006; van Halm V.P. et al., 2008). Очевидно, что поиск методов профилактики и лечения кардиоваскулярных осложнений является не менее актуальной проблемой, чем разработка новых эффективных методов фармакотерапии самих болезней. Тем более, существующие в настоящее время методы системной терапии РА и псориаза не способны в достаточной мере снижать риск развития сердечно-сосудистых заболеваний или повышают его.

Известно, что при хроническом воспалении изменения в иммунной системе сопряжены с изменениями липидного обмена в крови, печени, жировой и других тканях. Обсуждаются два основных механизма интеграции метаболизма липидов и иммунного ответа, один из которых связан с синтезом холестерина (Shimizu T., 2009), другой – с активностью суперсемейства ядерных Х-рецепторов (Varga T. et al., 2008).  Предполагается, что эта взаимосвязь лежит в основе общности патогенеза аутоиммунных заболеваний и атеросклероза и является основанием для поиска препаратов, обладающих многоцелевым действием – противовоспалительным, антиатерогенным и иммуномодулирующим.

Этим требованиям в большей мере отвечают ингибиторы 3-гидрокси-3-метил коэнзим А (ГМГКоА) редуктазы (статины) благодаря открытию у них новых, холестериннезависимых иммуномодулирующих и противовоспалительных свойств. Так, установлено, что статины снижают экспрессию MHC класса II, процессинг и презентацию антигена, модулируют активность Th1 и Th2-лимфоцитов, влияют на синтез про- и противовоспалительных цитокинов и др. (Greenwood J. et al., 2006). Реализацию перечисленных эффектов связывают со способностью статинов предотвращать образование промежуточных продуктов биосинтеза холестерина – изопреноидов. Эти метаболиты участвуют в посттрансляционной прениляции ряда белков, в том числе – мономерных ГТФаз (Ras, Rho и др.), выполняющих роль «молекулярных переключателей» дифференцировки, пролиферации, апоптоза и пр. различных клеток. Изменение функции клеток осуществляется путем активации пренилированными ГТФазами некоторых внутриклеточных сигнальных путей, среди которых важная роль принадлежит семейству протеинкиназ (Perez-Sala D., 2007), в частности, митоген-активированным протеинкиназам (МАРК) (Lim L. et al., 1996). МАРК передают сигнал факторам транскрипции, активация которых приводит к изменению экспрессии генов белков, участвующих в реализации воспаления и иммуномодуляции (Karin M., 2004).

Открытие противоспалительных и иммуномодулирующих свойств статинов послужило обоснованием их применения у животных с экспериментальными аутоиммунными заболеваниями (коллаген-индуцированный артрит, ретинит и др.) (Gegg M.E. et al., 2005; Leung B.P. et al., 2003; Yamagata T. et al., 2007), при которых показана профилактическая и терапевтическая эффективность статинов. Это побудило исследователей к изучению возможностей применения статинов при аутоиммунных заболеваниях у человека. В настоящее время работы, посвященные оценке эффективности и безопасности применения статинов при РА единичны (Kanda H. et al., 2002), а при псориазе – отсутствуют.

Анализ данных литературы по изучению иммунофармакодинамики статинов при лечении экспериментальных аутоиммунных заболеваний позволяет предполагать, что ингибиторы ГМГ-КоА редуктазы могут влиять на следующие ключевые звенья патогенеза РА и псориаза (Greenwood J. et al., 2006):

  • Мононуклеарную инфильтрацию и пролиферацию в очаге воспаления (кожа, синовиальная оболочка)
  • Баланс активности Th1, Th2, Th17-лимфоцитов, продукцию про- и антивоспалительных цитокинов
  • Активацию внутриклеточных сигнальных молекул и др.

Несмотря на то, что РА и псориаз являются независимыми факторами риска развития сердечно-сосудистых заболеваний, данные о состоянии липидного обмена при этих заболеваниях противоречивы (Boers M. et al., 2003; Dessein P.H. et al., 2002; Mallbris L. et al., 2006; Seishima M. et al., 1994), а исследования, посвященные влиянию статинов на маркеры атеросклероза, единичны (McCarey D.W. et al., 2004).

Вышеизложенное позволяет предполагать, что назначение статинов при РА и псориазе может не только снизить активность воспаления, но и уменьшить риск развития атеросклероза путем реализации противовоспалительного, иммуномодулирующего и антиатерогенного действия. Это и определило цель и задачи исследования.

Цель исследования

Охарактеризовать липидный состав сыворотки крови и связь уровня различных субклассов сывороточных липопротеинов с активностью хронического воспаления у больных ревматоидным артритом и псориазом, обосновать патогенетическую терапию этих заболеваний ингибиторами 3-гидрокси-3 метилглютарил коэнзим А редуктазы, изучить их иммуномодулирующее, противовоспалительное и антиатерогенное действие.

Задачи исследования

  1. Изучить особенности липидного обмена при РА и псориазе, связь активности РА, псориаза, синтеза провоспалительных цитокинов и цитокинов профиля Th1, Th2, Th17-лимфоцитов in vivo и ex vivo с уровнем холестерина в про- и анти-атерогенных субфракциях липопротеинов. 
  2. Оценить эффективность и безопасность применения симвастатина у больных РА на фоне приема стандартных болезнь-модифицирующих препаратов.
  3. Охарактеризовать влияние симвастатина на содержание провоспалительных цитокинов и цитокинов профиля Th1, Th2, Th17-лимфоцитов в сыворотке крови больных РА.
  4. Оценить влияние статинов на антигенспецифическую и антигеннеспецифическую пролиферацию МНК ПК и продукцию иммунорегуляторных и провоспалительных цитокинов ex vivo и in vitro, оценить роль снижения синтеза изопреноидов в иммуномодулирующем действии статинов in vitro.
  5. Изучить влияние статинов и биологических препаратов для лечения  РА на активацию митоген-активированных протеинкиназ (MAPK) p38 и ERK1/2 в моноцитах больных РА in vitro.
  6. Оценить эффективность и безопасность использования специфического обратимого ингибитора p38 MAPK второго поколения VX-702 у больных РА.
  7. Выявить влияние терапии симвастатином на липидные и иммунологические маркеры атеросклероза при РА.
  8. Охарактеризовать признаки, отличающие подгруппы больных РА, ответивших и не ответивших на симвастатин, и разработать методы прогнозирования его эффективности.
  9. Изучить действие статинов и биологических препаратов для лечения РА на содержание ВЭБ-специфичных CD4+-лимфоцитов у здоровых людей и больных РА.
  10. Оценить влияние статинов на содержание субпопуляций Т- и В-лимфоцитов, моноцитов ПК, уровень сывороточных цитокинов профиля Th1, Th2, Th17-лимфоцитов , выраженность поражения кожи и качество жизни у больных псориазом.
  11. Охарактеризовать изменения параметров липидного обмена у больных псориазом до и после лечения симвастатином, оценить его фармакоэкономические показатели.

Научная новизна

Впервые показано, что в сыворотке периферической крови больных РА и псориазом выявляются проатерогенные изменения соотношения содержания холестерина различных субфракций липопротеинов, которые у больных РА прямо связаны с активностью воспаления и уровнем циркулирующих провоспалительных цитокинов.

Впервые установлено, что дополнительное к стандартному лечению DMARD назначение симвастатина больным активным РА снижает активность болезни. Впервые изучена иммунофармакодинамика статинов при РА, которая характеризуется снижением спонтанной, антиген-специфической пролиферации МНК ПК, антиген-специфической продукции IL-8, IFN-. Впервые выявлены механизмы антипролиферативного действия статинов у больных РА и механизмы ингибирования продукции цитокинов, обусловленные снижением содержания промежуточных продуктов синтеза холестерина.

Впервые установлено модулирующее действие статинов на продукцию цитокинов профиля Th2, Th17-лимфоцитов, провоспалительных цитокинов у больных РА in vivo и ex vivo, характеризующееся снижением уровня сывороточного IL-17, IL-6 у респондеров, повышением анти-CD3-стимулированного синтеза IL-10 и TNF-. Впервые выявлены субтипы РА, отличающиеся содержанием общего холестерина ЛП, холестерина ЛППП, IL-10 в сыворотке крови и ответом на терапию симвастатином. На основании этих данных впервые разработаны методы прогноза эффективности лечения статинами больных РА, обладающие высокой чувствительностью и специфичностью.

Впервые выявлено, что в моноцитах ПК больных РА мевастатин, так же, как инфликсимаб, TNF-RI и IL-1Ra уменьшает активацию сигнальных молекул – МАРК р38, ERK1/2, причем это действие мевастатина частично обусловлено снижением содержания изопреноидов.

Впервые показано, что лечение симвастатином больных РА оказывает антиатерогенное действие путем коррекции дислипидемии, уменьшения содержания иммунологических маркеров атеросклероза - СРБ и IL-6 в крови.

Впервые выявлено, что у больных РА снижено содержание ВЭБ-специфичных CD4+-лимфоцитов, а мевастатин, так же, как инфликсимаб, TNF-RI и IL-1Ra не влияют на антиген-специфическую активацию ВЭБ-специфичных CD4+-лимфоцитов.

Впервые установлена эффективность монотерапии псориаза симвастатином, заключающаяся в уменьшении выраженности и площади поражения кожи. Прием симвастатина больными псориазом сопровождается увеличением системной активности Th2-лимфоцитов, липидкорригирующим действием, связанным с повышением содержания холестерина ЛПВП3. Применение симвастатина безопасно, имеет фармакоэкономические преимущества перед ацитретином.

Научно-практическая значимость

У больных РА и псориазом установлены проатерогенные изменения липидного спектра, крови, которые у пациентов с РА были ассоциированы с выраженностью системного воспаления. Эти данные свидетельствуют о патогенетической взаимосвязи нарушений липидного обмена и иммунной системы при аутоиммунных заболеваниях. Вследствие этого, в клинической практике у больных аутоиммунными заболеваниями необходимо оценивать липидный состав крови с целью выявления пациентов с высоким риском развития атеросклероза и ранней коррекции дислипидемии.

При РА и псориазе показано умеренное противовоспалительное действие симвастатина, сопряженное с иммуномодулирующими эффектами, снижением липидных и иммунологических маркеров атеросклероза. Результаты исследования обосновывают принципиально новую стратегию лечения аутоиммунных заболеваниях, основанную на использовании статинов как эффективных и безопасных препаратов с плейотропным действием.

Установлены и описаны субтипы РА, ответившие и не ответившие на лечение симвастатином. Охарактеризована прогностическая значимость трех лабораторных показателей, оценивающих состояние иммунной системы, липидного профиля крови и позволяющих в клинической практике с высокой точностью предсказывать ответ на лечение симвастатином. 

Выявленные в работе механизмы иммуномодулирующего и противовоспалительного действия статинов определяют направление дальнейшего поиска мишеней для разработки новых лекарственных препаратов, уменьшающих воспаление и нормализующих липидный обмен при аутоиммунных заболеваниях. К числу таких потенциальных мишеней можно отнести ядерные гормональные рецепторы PPAR- и PPAR-, которые принимают участие в контроле за липидным обменом и иммунным ответом (Varga T. et al., 2008).

Теоретическое значение

Получены новые фундаментальные знания о взаимосвязи изменений в иммунной системе с нарушениями липидного профиля крови, свойственной хроническому воспалению аутоиммунной природы. Характер установленных связей при различных нозологических формах аутоиммунных заболеваний (РА, псориазе) имеет свои особенности и обусловлен механизмами, связанными с образованием не только холестерина, но и промежуточных продуктов его синтеза, обладающих провоспалительными и иммуномодулирующими свойствами.

Основные положения, выносимые на защиту

  1. РА и псориаз характеризуются проатерогенными изменениями содержания холестерина различных субфракций липопротеинов сыворотки крови. Ряд показателей липидного профиля у пациентов с РА связан с активностью болезни, уровнем провоспалительных цитокинов в сыворотке крови, а у больных псориазом – с содержанием HLA-DR+-моноцитов, CD3+,CD4+ и CD16+-лимфоцитов.
  2. Применение симвастатина у больных активным РА умеренно эффективно и безопасно. Подгруппы больных, ответивших и не ответивших на лечение симвастатином, различаются по исходному содержанию общего холестерина,  холестерина проатерогенной субфракции ЛППП и IL-10 сыворотки крови.
  3. У больных РА и псориазом использование статинов приводит к многоцелевым эффектам – иммуномодулирующему, противовоспалительному и липидкорригирующему. Механизмы иммуномодулирующего и противовоспалительного действия частично обусловлены снижением уровня изопреноидов, а также уменьшением активности  митоген-активированных протеинкиназ моноцитов.
  4. Монотерапия симвастатином у больных с псориазом эффективна, безопасна и экономически выгодна, обладает липидкорригирующим действием, снижает активность Th2-лимфоцитов.

Апробация работы

Материалы работы были доложены и обсуждены на XV Национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, Россия, 2007 г), 3-ей Международной Конференции «Фундаментальные науки – медицине» (Новосибирск, Россия, 2007 г), Конгрессе Европейской Противоревматической Лиги (European League Against Rheumatism, EULAR) в 2007 г, (Барселона, Испания) и 2008 г, (Париж, Франция), Объединенном иммунологическом форуме 2008 (Санкт-Петербург, Россия, 2008 г), конференции «Дни иммунологии в Сибири», (Томск, Россия, 2008 г), V Конференции молодых ученых с международным участием "Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины" (Москва, Россия, 2008 г), Конгрессе EULAR в 2009 г (Копенгаген, Дания).

По результатам исследований получены положительные решения о выдаче патентов:

  1. «Способ лечения псориаза» по заявке 2007-103-667/14(003950), 15.04.2009. Приоритет от 30.01.2007.
  2. «Способ прогноза эффективности лечения ревматоидного артрита симвастатином». по заявке 2008-115-076/14(016778), 01.04.2009. Приоритет от 16.04.2008.

Публикации

Материалы работы изложены в 44 публикациях, в том числе в 16 статьях в журналах, рекомендованных ВАК РФ для опубликования результатов докторских диссертаций (14 статей в отечественных, 2 - в зарубежных журналах).

Объем и структура работы

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 13 глав результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, заключения, выводов и библиографического указателя. Материал изложен на 302 страницах машинописного текста, включающего 35 таблиц и 88 рисунков. Прилагаемая библиография содержит ссылки на 316 источников, из них 305 иностранных.

Работа выполнена в лаборатории клинической иммунофармакологии НИИКИ СО РАМН (руководитель – профессор Ширинский В.С.).

Автор благодарит руководителя лаборатории иммунопатологии НИИКИ СО РАМН профессора Кожевникова В.С., сотрудников лаборатории иммунопатологии НИИКИ СО РАМН, старшего лаборанта кафедры дерматовенерологии НГМУ Ягодину Е.В., ведущего научного сотрудника Института катализа СО РАН имени им. Г.К. Борескова,  д.б.н. Ф.В. Тузикова, руководителя отделения ревматологии МУЗ ДКП №1 к.м.н. Чижова Н.Н., профессора Dinarello C.A., University of Colorado School of Medicine, Денвер, Колорадо, США, профессора Finlay A., University of Wales College of Medicine, Кардифф, Великобритания, за помощь в проведении исследования.

Содержание работы

Материалы и методы

Добровольное информированное согласие

Перед включением в исследование все пациенты подписали форму добровольного информированного согласия. Протоколы исследования были одобрены локальным этическим комитетом НИИКИ СО РАМН.

Связь активности РА и псориаза, функции Th1, Th2, Th17 лимфоцитов, уровня  провоспалительных цитокинов ПК с содержанием холестерина в про- и анти-атерогенных субфракциях липопротеинов.

Из 46 пациентов, прошедших скрининг, в исследование были включены 15 больных активным РА (медиана возраста 51 год, 25-75% квартили 46-68 лет). Оценивался индекс активности болезни с 28-суставным счетом (disease activity score with 28 joint count, DAS28) (Prevoo M.L. et al., 1995). Средний показатель DAS28 у больных РА составил 6,9 баллов.

После предварительного осмотра и обследования 25 больных с псориазом 15 пациентов (медиана возраста 55 лет, 25-75% квартили 28-59 лет) были включены в этот раздел работы. Клиническое обследование включало оценку индекса распространенности и выраженности поражения кожи (Psoriasis Area and Severity Index, PASI) (van de Kerkhof P.C., 1997) и пятибалльную общую оценку поражения кожи врачом.

Контрольная группа состояла из 120 здоровых людей (медиана возраста 52 года, 25-75% квартили 47,25-57 лет). Эта группа представляла собой популяционную выборку лиц без факторов риска сердечно-сосудистых заболеваний из неорганизованного населения г. Новосибирска и была сопоставима по возрасту и полу с больными РА и псориазом.

Оценка показателей липидного обмена заключалась в определении содержания холестерина в липопротеинах высокой плотности (ЛПВП) 2а и 2в (далее – ЛПВП2), 3а, 3в и 3с (далее – ЛПВП3) липопротеинах низкой плотности (ЛПНП) 1, 2 и 3 (далее – ЛПНП1-3), липопротеинах промежуточной плотности (ЛППП) и липопротеинах очень низкой плотности (ЛОНП) 3, 4 и 5 (далее – ЛПОНП3-5) и 1 и 2 (далее – ЛПОНП1-2). Концентрация холестерина в частицах липопротеинов оценивалась с помощью метода малоуглового рентгеновского рассеивания (МУРР) (Tuzikov F.V. et al., 2002). Частицы ЛПВП, ЛПВП2 и ЛПВП3 относятся к антиатерогенным, а ЛПНП, ЛПНП1-3, ЛППП, ЛПОНП, ЛПОНП3-5, ЛПОНП1 и ЛПОНП2 - к проатерогенным субфракциям липопротеинов.

Оценка субпопуляционного состава МНК ПК включала определение содержания лимфоцитов, экспрессирующих маркеры CD3, CD4, CD8, CD19, CD16 и HLA-DR+-моноцитов с помощью проточной цитометрии с использованием стандартной методики фенотипирования поверхностных клеточных маркеров (Robinson J.P. et al., 1997). Для иммунофенотипирования использовались моноклональные антитела фирмы “Медбиоспектр”, Россия.

Содержание IL-6, IL-8, TNF-, IFN-, IL-10 и IL-17 в сыворотках оценивалось с помощью стандартных наборов  (IL-6, IL-8, TNF- и IFN- ELISA-Best, Вектор-Бест, Россия, IL-10 и IL-17A ELISA Ready-SET-Go!, eBioscience, США) в соответствии с инструкциями производителя. Нижние пороги определения концентраций IL-6, IL-8, TNF-, IFN-, IL-10 и IL-17 были 0.5 пг/мл, 2 пг/мл, 2 пг/мл, 2 пг/мл,2 пг/мл и 4 пг/мл, соответственно.

Перед началом исследования был проведен предварительный расчет минимально необходимого количества больных РА и псориазом в соответствии с рекомендациями  (Chow S.C. et al., 2003). Показано, что при проведении корреляционного анализа для выявления умеренных и сильных зависимостей (r > 0.65) при предполагаемой вероятности ошибки I рода 0,05 и мощности исследования 80% необходимо включить минимум 15 человек. Сравнение содержания холестерина ЛП (стандартное отклонение 15 мг/дл) между группами больных РА и псориазом (15 человек) и здоровыми людьми (120 человек) при предполагаемой вероятности ошибки I рода 0,05 позволяет с 80% мощностью выявить различия в 12 мг/дл и более.

Эффективность и безопасность использования симвастатина у больных РА на фоне приема болезнь-модифицирующих препаратов.

После скринингового осмотра и обследования 119 больных РА в открытое сравнительное исследование эффективности и безопасности симвастатина при активном РА было включено 49 пациентов. Дополнительно к проводимой терапии пациентам опытной группы (n=33)  назначался симвастатин в дозе 40 мг однократно в сутки в течение 12 недель. Больные группы контроля (n=16) принимали плацебо во время участия в рандомизированных исследованиях II фазы, проводимых в нашем учреждении. Пациенты могли получать любые болезнь-модифицирующие препараты (disease-modifying anti-rheumatic drugs, DMARD) в стабильной дозировке за 1 месяц до включения в исследование. Первичной конечной точкой было изменение DAS28. Проводилась оценка ответа на лечение в соответствии с критериями EULAR (van Gestel A.M. et al., 1996). Оценка безопасности включала клиническое обследование, определение активности трансаминаз в сыворотке крови. Визиты проводились 1 раз в 4 недели.

Перед началом исследования был проведен предварительный расчет количества пациентов в группе симвастатина, который бы позволил с мощностью 80% выявить различие изменения DAS28 в 0,8 баллов между опытной и контрольной группами при их соотношении 2:1. Предполагаемый размер эффекта  при приеме симвастатина был определен нами на основании результатов пилотного испытания. Было подсчитано, что для обеспечения необходимой мощности исследования в опытную группу следует включить минимум 30 больных (Chow S.C. et al., 2003).

Влияние приема симвастатина больными РА на антигенспецифическую и антигеннеспецифическую пролиферацию МНК ПК ex vivo.

В этот раздел работы было включено 18 пациентов с активным РА. Уровень спонтанной пролиферации и пролиферации в ответ на анти-CD3 антитела и CII в трехдневных и семидневных культурах МНК ПК соответственно, оценивали до лечения и после 12 недель терапии.

МНК ПК выделялись на градиенте плотности фиколл-верографин в соответствии с методом Boyum (Boyum A., 1968). Далее МНК ПК (1106/мл) культивировали в среде RPMI-1640 (Sigma, США), дополненной 0,3 мг/мл L-глютамина, 5мМ HEPES-буфера, 100 мкг/мл гентамицина и 10% фетальной сыворотки телят (Sigma, США) (полная среда). Для стимуляции использовались моноклональные анти-CD3-антитела ICO-90 (анти-CD3, “Медбиоспектр”, Россия) в концентрации 1 мкг/мл и человеческий CII (Chemicon, США) в концентрации 10 мкг/мл. Интенсивность пролиферации оценивали по инкорпорации 3H-тимидина (1 мкКи/лунку) (Amersham, США), вносимого за 18 часов до окончания культивирования.

Действие статинов на антигенспецифическую и антигеннеспецифическую пролиферацию МНК ПК больных РА in vitro

Культивирование МНК ПК больных активным РА осуществляли, как описано выше. Для изучения влияния мевастатина  (Sigma, США) на бласттрансформацию лимфоцитов in vitro в культуры добавляли 0; 0,1;1; и 10 мевастатина и культивировали в течение трех дней для анализа анти-CD3-индуцированной пролиферации и семи дней для учета CII-индуцированной пролиферации. С целью определения влияния изопреноидов на действие мевастатина в культуры вносились L-мевалонат (Sigma, США) (100M), геранил-геранил пирофосфат (GGPP) (MP Biomedicals, США) (10 M) и фарнезил пирофосфат (FPP) (Sigma, США) (10 M). Интенсивность пролиферации изучалась с использованием инкорпорации 3Н-тимидина.

Перед проведением исследования in vitro были проводены расчеты размера выборки  (Chow S.C. et al., 2003).

Оценка влияния симвастатина на содержание Th1, Th2, Th17 и провоспалительных цитокинов в сыворотке крови и синтез цитокинов ex vivo МНК ПК больных РА..

Содержание IL-6, IL-8, TNF-, IFN-, IL-10 и IL-17 в сыворотках ПК и супернатантах культур МНК ПК оценивалось с помощью коммерческих наборов ELISA как описано выше. Стимуляция клеток проводилась 1 мкг/мл антител к CD3. Супернатанты забирались через 72 часа стимуляции.

Влияние статинов на антигенспецифическую и антигеннеспецифическую продукцию цитокинов МНК ПК in vitro.

МНК ПК больных активным РА культивировали в полной среде в присутствии 0; 0,1;1; и 10 мевастатина (Sigma, США) в течение трех дней для анализа анти-CD3-индуцированного (1 мкг/мл) синтеза цитокинов и семи дней для учета CII-индуцированной (5 мкг/мл) продукции цитокинов. Для оценки влияния изопреноидов на действие мевастатина в культуры вносились L-мевалонат  в концентрации 100M, GGPP в концентрации 10 M и FPP в концентрации 10 M. Содержание TNF-, IFN-, IL-8, -6 в супернатантах культур МНК ПК определялось как описано ранее.

Сравнительный анализ действия статинов и биологических препаратов для лечения РА на фосфорилирование MAPK p38 и ERK1/2 in vitro в моноцитах больных РА.

Обследовано 12 больных с активным РА и четверо здоровых людей. МНК ПК культивировали (1106/мл) в течение 18 часов в присутствии 0; 0,1;1; и 10 мевастатина (Sigma, США), 5 мкг/мл химерных моноклональных антител к TNF- (инфликсимаб, Schering-Plough, США), 5 мкг/мл рекомбинантной пегилированной формы натурального растворимого рецептора TNF p55 тип I (TNF-RI, Amgen, США) и 10 мкг/мл рекомбинантной, негликозилированной формы антагониста рецептора IL-1 (IL-1Ra, анакинра, Amgen США). Ингибиторы цитокинов были любезно предоставлены профессором C. Dinarello, США. Для оценки влияния изопреноидов на действие мевастатина в культуры вносились L-мевалонат (Sigma, США) в концентрации 100 мкмоль.

Выделение моноцитов производилось с помощью охлаждения культуральных  планшетов до 0С в течение 30 минут. Клетки окрашивались РЕ-конъюгированными моноклональными анти-фосфо-МАРК р38 (Т180/Y182)(BD Biosciences, США) или FITC-конъюгированными поликлональными анти-фосфо-ERK1/2 (T185+T202) антителами (Abcam, Великобритания) как описано ранее (Montag D.T., 2003). Окрашенные клетки анализировались с помощью цитометра FACS Calibur (BD Biosciences, США). Активация МАРК р38 и ERK1/2 измерялась как медиана интенсивности флюоресценции в моноцитарном гейте.

Изучение эффективности и безопасности специфического ингибирования p38 MAPK у больных РА с использованием ингибитора МАРК второго поколения VX-702.

В двойное слепое, плацебо контролируемое исследование эффективности и безопасности ингибитора МАРК р38 второго поколения VX-702 вошли больные с активным РА. Обследовано 29 больных, по результатам скрининга было включено 11 пациентов, 6 из которых были рандомизированы к приему VX-702 в дозе 10 мг/д, один больной принимал VX-702 в дозе 5 мг/день и 4 больных принимали плацебо в течение 12 недель. Оценка эффективности лечения включала DAS28, продолжительности утренней скованности, боли по ВАШ.

Влияние терапии симвастатином на маркеры атеросклероза у больных РА.

У больных, принимавших участие в исследовании эффективности и безопасности симвастатина при РА, до и после лечения оценивались показатели липидного спектра крови - содержание холестерина  ЛПВП2, ЛПВП3, ЛПНП1-3, ЛППП, ЛПОНП3-5 и ЛПОНП1-2. Иммунологические маркеры атеросклероза – уровень сывороточного СРБ и IL-6 - определялись с помощью коммерческих наборов ELISA.





Выявление предикторов клинического ответа на симвастатин при РА.

Анализировались данные 33 пациентов, включенных в исследование эффективности и безопасности терапии симвастатином. В зависимости от наличия EULAR-ответа опытная группа пациентов была подразделена на подгруппы респондеров и нереспондеров.

Изучалась способность ряда клинических и лабораторных параметров прогнозировать развитие EULAR-ответа после терапии симвастатином. Оценивались индекс активности болезни DAS28, продолжительность утренней скованности, уровень боли по ВАШ, степень влияния артрита на качество жизни, а также активность болезни, оцениваемую пациентом и врачом. Помимо этого, у больных определялось содержание цитокинов в сыворотке и супернатантах нестимулированных и анти-CD3-стимулированных культур МНК ПК с помощью  коммерческих наборов ELISA как описано выше.  Путем корреляционного анализа проводилось выявление ассоциации выраженности изменения DAS28 в динамике при лечении с базовыми клиническими и лабораторными параметрами.

У показателей, для которых была выявлена связь с изменением DAS28, изучались операционные характеристики прогнозирования клинического ответа на терапию симвастатином – чувствительность, специфичность и отношение правдоподобия.

Влияние статинов и биологических препаратов для лечения РА на активацию ВЭБ-специфичных Т-лимфоцитов у здоровых людей и больных РА.

У трех здоровых доноров и четырех больных РА выделяли и культивировали МНК ПК в полной среде, дополненной 10 ЕД/мл рекомбинантного IL-2 в течение 18 часов, в присутствии 10 мевастатина, 5 мкг/мл инфликсимаба, 5 мкг/мл TNF-RI и 10 мкг/мл IL-1Ra. Для антиген-специфической стимуляции в культуры вносился экстракт ВЭБ-инфицированных клеток (Advanced Biotechnologies, США). Определение активации ВЭБ специфичных Т-лимфоцитов описано ранее (Amyes E. et al., 2003). Концентрация ВЭБ-специфичных Т-хелперов оценивалась на проточном цитометре как содержание CD4+, IFN-+-лимфоцитов на 500 000 CD4+-лимфоцитов. 

Иммунофармакодинамика статинов и их влияние на выраженность воспаления кожи и качество жизни у больных псориазом.

После скрининга 52 больных псориазом в исследование эффективности и безопасности симвастатина было включено 27 пациентов. За один месяц до включения и в течение всего исследования не разрешалось использовать препараты для системной терапии псориаза (ретиноиды, метотрексат и циклоспорин А, биологические препараты) и фототерапию. Пациенты опытной группы получали симвастатин в дозе 40 мг в день в течение двух месяцев. Группа непараллельного контроля была сформирована из 12 пациентов, принимавших участие в открытом исследовании эффективности активированных аутологичных Т-лимфоцитов на фоне стандартного местного лечения псориаза.  Обследование проводилось перед началом лечения и далее один раз в четыре недели. На каждом визите осуществлялась оценка безопасности, включавшая клиническое обследование и определение активности трансаминаз в сыворотках ПК.

Перед началом исследования был проведен предварительный расчет количества пациентов в группе симвастатина, который бы позволил с мощностью 80% выявить 30% различие выраженности изменения PASI между опытной и контрольной группами при их соотношении 1:1. Предполагаемый размер эффекта при приеме симвастатина был определен нами на основании результатов проведенного ранее пилотного испытания. Было подсчитано, что для обеспечения необходимой мощности исследования в опытную группу следует включить минимум 12 больных (Chow S.C. et al., 2003).

Опытная и контрольная группы сравнивались по относительному улучшению PASI, DLQI и частоте 50%, 75% и 90% уменьшения PASI в динамике при лечении. Первичной конечной точкой исследования было улучшение PASI в процентах.

На каждом визите у больных забиралась венозная кровь для определения содержания циркулирующих цитокинов и субпопуляций Т- и В-лимфоцитов, моноцитов. Идентификацию последних осуществляли с использованием проточной цитометрии. Определение содержания циркулирующих IL-17, IL-10 и IFN- описано ранее.

Изменения липидного спектра крови у больных псориазом до и после лечения симвастатином.

Определялось содержание общего холестерина, холестерина  ЛПВП2, ЛПВП3, ЛПНП1-3, ЛППП, ЛПОНП3-5 и ЛПОНП1-2.

Статистическая обработка данных

Описательная статистика представлена медианой, 25 и 75 квартилями в случае ненормального распределения и средней, стандартной ошибкой средней при нормальном распределении. Нормальность распределения определялась с помощью критерия D'Agostino-Pearson (D'Agostino R.B. et al., 1986).

Для сравнения непрерывных параметров использовался непараметрический критерий Манна-Уитни. Для выявления различий между категориальными параметрами применялся критерий 2. Достоверность корреляции определялась с использованием коэффициента корреляции Пирсона при нормальном распределении хотя бы одного из параметров и при помощи коэффициэнта корреляции Спирмана при ненормальном распределении.

В экспериментах in vitro статистическая значимость различий оценивалась с помощью W критерия Уилкоксона при единичных сравнениях и с использованием непараметрического метода ANOVA с поправкой Бонферрони при множественных сравнениях. Зависимость эффекта от дозы мевастатина определялась с применением пост-теста для линейного тренда.

Для выявления способности клинических и лабораторных параметров предсказывать развитие клинического ответа на терапию статинами использовались кривые ROC (receiver-operator characteristic). Построение ROC заключается в расположении на осях X и частоты истинно положительных результатов (чувствительность) и ложно-положительных результатов (100-специфичность) для каждой точки разделения. Для чувствительности и специфичности подсчитывались 95% доверительные интервалы (ДИ). Каждая точка на кривой ROC соответствует определенной точке разделения (Deyo R.A. et al., 1991).

Перед началом экспериментов ex vivo и in vitro проводилось предварительное определение объема выборки с учетом 80% мощности, уровня значимости 0,05 и стандартного отклонения, выявленного в пилотных исследованиях (Chow S.C. et al., 2003). 

Результаты исследования и их обсуждение

Связь активности РА и псориаза,  уровня цитокинов профиля Th1, Th2, Th17 лимфоцитов сыворотки ПК с содержанием холестерина про- и анти-атерогенных субфракций липопротеинов

Взаимосвязь между выраженностью воспалительного процесса и содержанием цитокинов, липидов периферической крови при РА

В ряде исследований было показано, что у пациентов с РА повышен риск развития сердечно сосудистых заболеваний  и ассоциированной с ними смертности (Maradit-Kremers H. et al., 2005).

Обсуждается несколько механизмов, приводящих к возрастанию частоты ишемической болезни сердца у больных РА (Boers M. et al., 2004):

  • Повышенная, по сравнению с общей популяцией, встречаемость традиционных факторов риска (дислипидемия, сахарный диабет, гипертензия, повышенный индекс массы тела, курение)
  • Воспаление стенки артерий, ассоциированное с системным воспалением при РА

Изучалось содержание холестерина различных субфракций липопротеинов сыворотки крови у больных РА по сравнению со здоровыми людьми и связи активности РА, содержания циркулирующих провоспалительных цитокинов с уровнем холестерина субфракций липопротеинов.

Установлено статистически значимое повышение содержания холестерина проатерогенной субфракции ЛПНП1-3, снижение содержания холестерина антиатерогенных субфракций ЛПВП2 и ЛПВП, проатерогенной субфракции ЛППП. Изменений содержания общего холестерина и холестерина в других субфракциях липопротеинов не выявлено (рис.  1).

Рис. 1.

Сравнение содержания холестерина субфракций липопротеинов больных РА (n = 15) и здоровых людей (n = 120). * - р<0,05

Выявляемые методом МУРР ЛППНП1-3 соответствуют ЛПНП типа В, которые считаются наиболее атерогенными (Assmann G., 2001) благодаря лучшей способности проникать между эндотелиальными порами (Austin M.A. et al., 1994). Так, показано, что диабет 2 типа и метаболический синдром, при которых в значительной степени повышен риск развития атеросклероза, характеризуются увеличением содержания холестерина ЛПНП типа В (Frost R.J. et al., 2001). Можно предположить, что увеличение содержания холестерина ЛПНП1-3 у больных РА, выявленное в этом разделе исследования, является одним из факторов риска возникновения сердечно-сосудистых заболеваний у этой группы пациентов.

Таблица 1

Корреляция индекса активности болезни, содержания циркулирующих провоспалительных цитокинов и уровня холестерина различных субфракций сыворотки крови.

DAS28

TNF-

IFN-

IL-17

r

p

r

p

r

p

r

p

ЛПВП

-0,403

0,153

-0,202

0,487

0,253

0,382

0,03

0,917

ЛПВП2

-0,583

0,028*

-0,504

0,066

0,18

0,538

0,152

0,603

ЛПВП3

0,414

0,14

0,551

0,041*

0,073

0,803

-0,21

0,47

ЛПНП

-0,107

0,714

-0,075

0,799

0,649

0,012*

0,128

0,662

ЛПНП1-3

-0,244

0,4

-0,297

0,303

0,593

0,025*

0,09

0,759

ЛППП

0,259

0,371

0,414

0,14

0,375

0,186

0,129

0,661

ЛПОНП

0,227

0,433

0,228

0,432

-0,266

0,357

0,1

0,717

ЛПОНП1

0,142

0,628

0,228

0,432

-0,266

0,357

0,1

0,717

ЛПОНП2

0,233

0,421

0,358

0,208

-0,047

0,873

0,547

0,043*

Примечание. r – коэффициэнт корреляции Пирсона. * - p < 0,05.

Для выяснения возможных механизмов связи системного воспаления  и дислипидемии изучалась корреляционная зависимость активности болезни и уровня циркулирующих про- и противовоспалительных цитокинов с содержанием холестерина различных субклассов липопротеинов сыворотки крови. Показана достоверная отрицательная корреляция содержания холестерина ЛПВП2 и DAS28. Связи между активностью болезни и содержанием холестерина других субфракций липопротеинов не установлено (табл. 1).

Определялась достоверная положительная корреляция содержания циркулирующего IFN- и холестерина ЛПНП, ЛПНП1-3, IL-17 и холестерина ЛПОНП2, TNF- и холестерина ЛПВП3. Ассоциации уровня циркулирующего TNF- и холестерина других субфракций липопротеинов не показано (табл. 1). Следует отметить, что у больных РА, по сравнению со здоровыми донорами, выявлялось достоверно более высокое содержание IL-17, IL-6 и пониженное -  IL-10 и TNF-.

Положительная связь содержания IFN- сыворотки и уровня холестерина ЛПНП и ЛПНП1-3 может быть обусловлена IFN--индуцированным подавлением экспрессии скавенджер-рецептора на макрофагах, что приводит к уменьшению захвата макрофагами частиц ЛПНП (Rader D.J. et al., 2008).

Исследований, изучавших влияние IL-17 на обмен липидов и vice versa, не проводилось. Выявленная нами положительная корреляция содержания IL-17 и ЛПОНП2 может отражать как проатерогенное действие IL-17, так и способность холестерина ЛПНП индуцировать синтез IL-17.

Взаимосвязь выраженности поражения кожи, содержания различных субпопуляций иммунокомпетентных клеток,  цитокинов и липидов периферической крови при псориазе

В ряде исследований было показано, что псориаз, так же, как и РА является независимым фактором риска развития сердечно-сосудистых заболеваний (Boehncke W.H. et al., 2008; Gelfand J.M. et al., 2006). Механизмы, приводящие к  ускоренному развитию атеросклероза при псориазе, изучены недостаточно. Среди них могут быть генетически детерминированное нарушение обмена липидов, системное воспаление, вызванное активацией Т-хелперов типа I,  использование препаратов, повышающих уровень холестерина (циклоспорин А, ретиноиды).

У больных псориазом, по сравнению с группой контроля, выявлено статистически значимое уменьшение концентрации общего холестерина за счет холестерина антиатерогенных ЛПВП, ЛПВП2 и ЛПВП1 (рис.  2).

Рис. 2.

Сравнение содержания холестерина субфракций липопротеинов больных псориазом (n = 15) и здоровых людей (n = 120). * - р<0,01

При проведении анализа корреляционной зависимости PASI, уровня IL-17 и IL-10 сыворотки с содержанием холестерина различных субклассов липопротеинов сыворотки крови достоверных связей не определялось. Установлены отрицательная корреляция содержания холестерина ЛПВП3 с уровнем CD3+, CD4+-лимфоцитов и положительная - с концентрацией CD16+-лимфоцитов (табл. 2), положительная связь содержания HLA-DR+-моноцитов с уровнем общего холестерина, холестерина ЛПНП1-3 и  ЛПНП. Следует отметить, что показатели иммунного статуса у больных псориазом находились в пределах референтных значений.

Окисленные ЛПНП способны повышать экспрессию MHC II класса на моноцитах, способствовать их дифференцировке в макрофаги и образованию пенистых клеток (Frostegard J. et al., 1990). Выявленная в настоящем исследовании положительная корреляция содержания холестерина ЛПНП1-3 и ЛПНП с содержанием HLA-DR+-моноцитов может свидетельствовать об активации моноцитов периферической крови у больных псориазом, инициированной повышением содержания холестерина ЛПНП1-3 и ЛПНП.

Проатерогенные изменения липидного профиля сыворотки ПК при РА и псориазе, связь активности воспалительного процесса при РА с нарушениями липидного состава крови, обосновывают необходимость использования в терапии этих заболеваний не только препаратов, уменьшающих воспаление, но и гиполипидемических средств. Оптимальным подходом является одновременное воздействие как на активность болезни, сопряженную с нарушениями функции иммунной системы, так и на измененный липидный спектр. Можно предположить, что назначение статинов, обладающих иммуномодулирующими, противовоспалительными и липидкорригирующими свойствами (Greenwood J. et al., 2006), приведет к многоцелевым эффектам, заключающимся в уменьшении активности РА и псориаза, коррекции нарушенного обмена липидов.

Таблица 2

Корреляция содержания холестерина субфракций липопротеинов сыворотки крови и показателей содержания субпопуляций Т- и В-лимфоцитов, моноцитов ПК

CD3

CD4

CD8

CD19

CD16

HLA-DR+ моноциты

ЛПВП3

r

-0.583

-0.615

0.285

0.099

0.588

0.254

p

0.028*

0.019*

0.323

0.737

0.027*

0.38

ЛПВП2

r

0.067

0.335

-0.557

0.1391

-0.273

-0.45

p

0.819

0.241

0.038

0.635

0.345

0.1

ЛПВП

r

-0.147

0.137

-0.506

0.19

-0.078

-0.4

p

0.615

0.64

0.065

0.515

0.791

0.159

ЛПНП1-3

r

-0.28

-0.216

0.322

-0.1

0.282

0.786

p

0.332

0.457

0.262

0.717

0.329

0.0009*

ЛППП

r

0.194

0.354

-0.4

0.06

-0.384

-0.238

p

0.507

0.214

0.156

0.84

0.175

0.412

ЛПНП

r

-0.26

-0.12

0.228

-0.1

0.1867

0.85

p

0.369

0.683

0.432

0.722

0.523

0.0001*

ЛПОНП2

r

-0.049

-0.162

0.108

0.006

0.151

0.04

p

0.869

0.58

0.714

0.983

0.605

0.893

ЛПОНП1

r

0.06

-0.013

0.032

-0.059

0.085

-0.093

p

0.838

0.965

0.913

0.84

0.772

0.753

ЛПОНП

r

-0.044

-0.154

0.103

0.002

0.149

0.03

p

0.882

0.597

0.725

0.994

0.61

0.915

Общий холестерин

r

-0.403

-0.125

0.036

-0.02

0.234

0.8

p

0.153

0.669

0.903

0.94

0.42

0.0006*

r – коэффициэнт корреляции Пирсона, * - p<0.05

Для подтверждения этой гипотезы были проведены исследования клинической эффективности симвастатина при активном РА и псориазе.

Эффективность и безопасность использования симвастатина у больных РА на фоне приема болезнь-модифицирующих препаратов

В исследование было включено 49 пациентов с активным РА, из которых 33 больных принимали симвастатин, а 16 - плацебо.

В опытной группе больных было 2 мужчин и 31 женщина, медиана возраста составила 55 (25-75% квартили 48-66), медиана продолжительности болезни - 6 (2-10) лет.  Контрольная группа состояла из 14 женщин, 2 мужчин,  в возрасте 58 (48-66,5) лет, с продолжительностью болезни 9 (5,5-13) лет.  Обе группы были сопоставимы по демографическим данным, активности РА и принимаемым DMARD. У больных, получавших симвастатин, при анализе «до-после» определялось достоверное уменьшение как интегрального показателя активности болезни (DAS28), так и других ее параметров, а также функционального статуса. В то же время после приема плацебо достоверных изменений клинических показателей и СОЭ зарегистрировано не было.

При сравнении динамики изучаемых параметров между группами больных, получавших симвастатин и плацебо, было показано, что прием симвастатина, по сравнению с контролем, приводит к достоверно более выраженному снижению DAS28 (рис.3, А). Размер эффекта составил 0,76 (95% ДИ 0,01-1,5), что в соответствии с критериями Cohen следует считать умеренным эффектом (Cohen J., 1992).

В группе симвастатина  также выявлялось более выраженное снижение оценки активности болезни пациентом и врачом после лечения (рис. 3, Б и В соответственно). Изменений других параметров клинической эффективности не зарегистрировано.

У 33% больных опытной группы и у 22% пациентов группы контроля определялся умеренный ответ на лечение в соответствии с критериями EULAR.

Рис. 3.

Изменение DAS28 (А), оценки активности болезни пациентом (Б) и врачом (ВАШ) (В) в сравниваемых группах. * - р<0,05

За время участия в исследовании у нескольких пациентов были зарегистрированы клинически значимые несерьезные нежелательные события, предположительно связанных с приемом симвастатина. У двоих больных после четвертой недели приема препарата было выявлено повышение активности трансаминаз более трех верхних границ нормы, потребовавшее уменьшение дозы симвастатина в одном случае и отмены – в другом. Одна пациентка отказалась от приема симвастатина из-за развития выраженной тошноты. Клинические данные пациентов, прекративших прием препарата, были включены в анализ.

Изучение механизмов действия лекарственных веществ относится к первому разделу фармакологии - фармакодинамике. Механизм действия лекарственных веществ устанавливается путем определения того, что они вызывают в организме и каким образом это происходит (Лоуренс Д.Р. et al., 1991). Важным представляется идентификация мишеней для воздействия - ключевых звеньев патогенеза РА и псориаза. В частности, следует ответить на вопрос, способны ли ингибиторы ГМГ-КоА-редуктазы снижать антигеннеспецифическую и антигенспецифическую пролиферацию мононуклеаров у больных РА. Изучение действия статинов на антигенспецифическую и антигеннеспецифическую пролиферацию МНК ПК

Влияние приема симвастатина больными РА на антигенспецифическую и антигеннеспецифическую пролиферацию МНК ПК ex vivo

Известно, что у больных РА воспалительный инфильтрат в синовиальной оболочке состоит из малых лимфоцитов, макрофагов и плазматических клеток (Koopman W.J., 2001). Среди субпопуляций Т-лимфоцитов в синовиальной оболочке преобладают клетки с поверхностными маркерами, соответствующими фенотипу Т-лимфоцитов памяти (Koopman W.J., 2001). Снижение пролиферации этих клеток является одним из механизмов развития клинического эффекта при использовании DMARD (Hine R.J. et al., 1990). В экспериментальной модели РА - коллаген II (CII)-индуцированном артрите у мышей - продемонстрировано ингибирующее влияние симвастатина на CII-индуцированную активацию лимфоцитов (Leung B.P. et al., 2003).

Изучалось влияние приема симвастатина на анти-CD3, CII-индуцированную и спонтанную пролиферацию лимфоцитов периферической крови больных активным РА. Выбор этих экспериментальных моделей не случаен. Считается, что спонтанная пролиферация МНК ПК больных активным РА свидетельствует о преактивации этих клеток в условиях in vivo (Линг Н.Р., 1971),  анти-CD3-индуцированная пролиферация неспецифична, не требует процессинга и презентации антигена. В третьем случае CII относится к числу потенциальных аутоантигенов, и можно предполагать, что вызванный им пролиферативный ответ регистрируется лишь у части пациентов с РА, поскольку существуют другие кандидатные аутоантигены (Koopman W.J., 2001).

Прием симвастатина приводил к достоверному снижению спонтанного включения 3Н тимидина МНК ПК на 3 сутки культивирования. Абсолютные значения анти-CD3-индуцированной бласттрансформации МНК ПК и ИС не изменялись. В конце курса терапии симвастатином определялось достоверное снижение ИС МНК ПК, активированных CII. Изменений абсолютных показателей CII-индуцированной инкорпорации 3Н-тимидина выявлено не было (рис. 4).

Рис. 4.

Влияние приема симвастатина на спонтанную, анти-CD3 и CII-индуцированную пролиферацию МНК ПК ex vivo. Представлены средние значения и стандартная ошибка средней. * - P<0,05. ИС анти-CD3 (3 сут) ИС CII (7 сут) - индекс стимуляции анти-CD3 на 3 сутки и CII на 7 сутки культивирования соответственно.

Снижение спонтанной пролиферации МНК ПК при использовании симвастатина, выявленное в нашем исследовании, согласуется с работой, продемонстрировавшей уменьшение Т-лимфоцитарной пролиферации при использовании статинов у больных рассеянным склерозом (Neuhaus O. et al., 2002). Следует заметить, что одним из механизмов действия наиболее часто используемого для лечения РА препарата – метотрексата, также является уменьшение спонтанной пролиферации Т-лимфоцитов (Russell A.S., 1990).

Предполагается, что иммуномодулирующие свойства статинов могут быть обусловлены снижением уровня промежуточных продуктов синтеза холестерина - фарнезила пирофосфата (FPP) и геранила пирофосфата (GGPP), осуществляющих пренилирование ряда белков, в частности малых ГТФаз, которые участвуют в функционировании клеток иммунной системы (Greenwood J. et al., 2006). Другим возможным механизмом подавления пролиферации при использовании статинов может быть их прямое действие, заключающееся в уменьшении синтеза холестерина и липопротеинов низкой плотности, обладающих стимулирующим действием на клетки иммунной системы, опосредованным активацией МАРК ERK1/2 (Stollenwerk M.M. et al., 2005).

Для изучения механизмов влияния статинов на пролиферацию МНК ПК больных РА проводилось исследование, оценивающее влияние мевастатина в культурах in vitro на антигензависимую, антигеннезависимую и спонтанную пролиферацию  больных активным РА при добавлении в культуры промежуточных продуктов синтеза холестерина.

Действие статинов на антигенспецифическую и антигеннеспецифическую пролиферацию МНК ПК больных РА in vitro, роль изопреноидов

В культуры in vitro МНК ПК больных активным РА добавляли мевастатин в различных концентрациях. Для стимуляции культур использовали анти-CD3 и СII. С целью оценки влияния изопреноидов на действие мевастатина в культуры вносились мевалоновая кислота, геранил-геранил пирофосфат или фарнезил пирофосфат.

Мевастатин в концентрациях 0,1, 1 и 10 M не влиял анти-CD3-индуцированную пролиферацию МНК ПК. В то же время при добавлении в культуры 10 M мевастатина было зарегистрировано статистически значимое подавление пролиферации, вызванной CII. L-мевалонат предотвращал это действие препарата, не восстанавливая бласттрансформацию до значений, достигнутых в контроле (рис. 5).

Рис. 5.

Влияние мевастатина в различных концентрациях на анти-CD3 и CII-индуцированную пролиферацию МНК ПК in vitro при добавлении L-мевалоната (мвл), Fpp и GGpp. Представлены средние значения и стандартная ошибка средней. * - P<0,05 по сравнению с 0 M мевастатина.

Эти данные свидетельствуют о влиянии статинов на одно из ключевых звеньев патогенеза РА - пролиферацию мононуклеаров, что вносит существенный вклад в реализацию клинического эффекта. Сходство антипролиферативных эффектов статинов in vitro и ex vivo позволяет предположить, что прием симвастатина уменьшает пролиферацию, вызванную CII, также за счет снижения синтеза изопреноидов.

Показано, что в патогенезе РА значительную роль играют изменения баланса цитокинов (Brennan F.M. et al., 2008). Цитокины принимают важное участие в инициации и поддержании воспаления, образовании паннуса, разрушении хряща и развитии ассоциированной с РА сопутствующей патологии, в частности,  атеросклероза (Brennan F.M. et al., 2008). Следовательно, ключевым моментом для понимания механизмов действия DMARD и противовоспалительных препаратов для лечения РА является изучение их влияния на системную продукцию цитокинов и синтез цитокинов в клетках, принимающих участие в развитии аутоиммунного воспаления – лимфоцитах, макрофагах, синовиальных фибробластах.

Исходя из этого, оценивалось влияние приема статинов на продукцию про- и противовоспалительных цитокинов у больных РА in vivo и ex vivo, действие статинов на МНК ПК в культурах in vitro.

Оценка влияния симвастатина на содержание цитокинов профиля Th1, Th2, Th17-лимфоцитов, провоспалительных цитокинов в сыворотке крови больных РА

Статистически значимых изменений содержания циркулирующих IL-10, IFN-, TNF- , IL-6 и IL-8 в динамике после терапии симвастатином зарегистрировано не было. В то же время выявлялось достоверное снижение концентрации IL-17 в сыворотке (рис. Рис. 6).

Рис. 6.

Содержание сывороточных IFN-, IL-10, IL-17, IL-6, IL-8 и TNF- в динамике при лечении симвастатином.

Далее изучались различия в изменениях цитокинового профиля у больных РА, ответивших и не ответивших на терапию симвастатином. Достоверное уменьшение концентрации IL-17 выявлялось только у пациентов, не ответивших на терапию симвастатином, в то время как у респондеров содержание IL-17 в конце лечения не изменилось. В группе ответчиков регистрировалось достоверное уменьшение концентрации циркулирующего IL-6 (рис. 7). Различий в динамике содержания других изучаемых цитокинов в сыворотке между респондерами и нереспондерами выявлено не было.

Необходимо отметить, что уровень IL-17 и IL-6 в группе больных РА до начала терапии были достоверно выше, чем у здоровых доноров. После лечения содержание IL-17 в сыворотке снизилось почти в два раза, не достигая при этом референтных значений. После курса лечения уровень IL-6 не отличался от его содержания у здоровых людей.

Показано, что IL-17 играет важную роль в патогенезе РА, являясь индуктором синтеза IL-1 и TNF- макрофагами (Jovanovic D.V. et al., 1998) и активируя остеокластогенез (Kotake S. et al., 1999). Несмотря на то, что снижение содержания сывороточного IL-17, выявленное в настоящем исследовании, не было ассоциировано с клиническим ответом, можно предположить, что статины оказывают влияние на прогрессию повреждения суставов, опосредованную IL-17.

Известно, что у пациентов с метаболическим синдромом (Devaraj S. et al., 2006) и гиперхолестеринемией (Musial J. et al., 2001) терапия симвастатином приводит к снижению содержания сывороточных IL-6 и TNF-. Уменьшение концентрации циркулирующего IL-6 после лечения аторвастатином было продемонстрировано у больных РА (McCarey D.W. et al., 2004). В настоящей работе снижение содержания IL-6 в сыворотке выявлялось только у респондеров.

Рис. 7.

Изменение содержания циркулирующих IL-17 (А) и IL-6 (Б) до и после лечения симвастатином у пациентов, ответивших и не ответивших на терапию.

Содержание системных цитокинов при РА и других воспалительных заболеваниях является интегральным показателем продукции цитокинов различными клетками организма – лейкоцитами периферической крови, активированными синовиальными фибробластами, адипокинами и др. (Cavaillon J.M. et al., 1992; McInnes I.B. et al., 2007).  Поскольку статины могут воздействовать на разные мишени, для более глубокого понимания механизмов действия статинов представляется необходимым изучение их влияния на продукцию цитокинов на клеточном уровне.

Изучение действия статинов на продукцию цитокинов профиля Th1, Th2, Th17-лимфоцитов, провоспалительных цитокинов ex vivo и in vitro

Изменение синтеза цитокинов ex vivo МНК ПК больных РА, принимающих симвастатин

Прием симвастатина не оказывал влияния на спонтанную продукцию про- и противовоспалительных цитокинов в культурах МНК ПК больных РА. В то же время терапия симвастатином приводила к увеличению продукции IL-10 в 1,5 раза и к почти двадцатикратному увеличению синтеза TNF- (рис. 8). 

Выявленные эффекты могут быть обусловлены уменьшением рекрутирования лимфоцитов в очаг воспаления за счет подавления симвастатином экспрессии молекул клеточной адгезии (Zapolska-Downar D. et al., 2004) и аккумуляции IL-10 и TNF- –продуцирующих Т-лимфоцитов в периферической крови. Показано, что назначение ингибитора TNF- инфликсимаба больным РА также приводит к повышению синтеза провоспалительных цитокинов периферическими Т-лимфоцитами за счет уменьшения их миграции в синовиальную оболочку (Nissinen R. et al., 2004).

Описано прямое стимулирующее действие симвастатина на Th2-лимфоциты, опосредованное активацей STAT6 (Bessler H. et al., 2005). Этот эффект может объяснять выявленную в настоящем исследовании повышенную продукцию IL-10.

Как статины влияют на антигенспецифическую и антигеннеспецифическую продукцию цитокинов? Являются ли найденные изменения результатом прямого действия статинов на МНК ПК?

Для ответа на эти вопросы было проведено исследование действия статинов на синтез про- и противоспалительных цитокинов МНК ПК in vitro.

Рис. 8.

Анти-CD3 индуцированная продукция IFN-, IL-10, IL-17, IL-6 и TNF- МНК ПК в динамике при лечении симвастатином.

Влияние статинов на антигенспецифическую и антигеннеспецифическую продукцию цитокинов МНК ПК in vitro, роль изопреноидов

Оценивалось влияние мевастатина на CII и CD3-индуцированную продукцию цитокинов МНК ПК больных активным РА.

Действия мевастатина на анти-CD3-индуцированный синтез IFN- выявлено не было. Показано торможение CII-стимулированной продукции IFN-  и IL-8 при добавлении в культуры мевастатина в максимальной концентрации (10 M). Продукты метаболизма мевалоната FPP и GGPP предотвращали это действие препарата на IFN-, не восстанавливая синтез цитокина до значений, достигнутых в контроле (рис.  9).

Различия в действии мевастатина на антиген-специфическую и антигеннеспецифическую продукцию IFN-, видимо, объясняются тем, что стимуляция продукции цитокинов CII опосредована участием фагоцитирующих клеток, процессингом антигена, а стимуляция анти-CD3 не требует процессинга. Можно предположить, что действие статинов на CII-индуцированный синтез цитокинов опосредовано влиянием на антиген-презентирующие клетки. Данные этого раздела согласуются с результатами работы Leung B. P. et al, где было показано, что симвастатин уменьшает преимущественно антигенспецифический иммунный ответ in vitro и in vivo у мышей с CII-индуцированным артритом (Leung B.P. et al., 2003).

Рис. 9.

Влияние мевастатина в различных концентрациях на CII-индуцированный синтез IFN- и IL-8 в культурах МНК ПК и при добавлении мевалоната (мвл), Fpp и GGpp. *-p<0,05 по сравнению с 0 M мевастатина.

Отсутствие влияние статинов in vitro на анти-CD3-стимулированный синтез IL-10 и TNF- свидетельствует о том, что выявленное в работе повышение синтеза этих цитокинов ex vivo у больных РА после терапии симвастатином является следствием непрямого действия препарата, обусловленного уменьшением экспрессии молекул клеточной адгезии и аккумуляцией IL-10 и TNF- синтезирующих клеток в ПК.

К числу наиболее значимых внутриклеточных сигнальных молекул, осуществляющих контроль за продукцией провоспалительных цитокинов, относятся МАРК (Karin M., 2004).

Для выяснения внутриклеточных механизмов противовоспалительного действия статинов при РА представлялась важной оценка  влияния статинов на активацию МАРК в клетках, принимающих участие в поддержании хронического воспаления.

Сравнительный анализ действия статинов и биологических препаратов для лечения РА на процесс фосфорилирования MAPK p38 и ERK1/2 in vitro в моноцитах больных РА

В исследование было включено четыре здоровых человека и 12 больных активным РА (средний возраст - 51±4,1 лет, средний индекс активности болезни DAS28 – 6.4±0.3, средняя продолжительность болезни – 8,6±1,6 лет), получающих стандартные DMARD.

Было обнаружено, что IL-1Ra приводит к достоверному уменьшению спонтанной активности МАРК р38 на 72,9% в моноцитах ПК больных РА. Схожие изменения были зарегистрированы при добавлении в культуры TNF-RI – активация МАРК снижалась на  77,7%. Влияния инфликсимаба на фосфорилирование МАРК р38 не зарегистрировано (рис. 10).

Таким образом, «точечное» воздействие на провоспалительные цитокины с помощью растворимых рецепторов приводит к значительному уменьшению активности МАРК р38 в моноцитах больных РА. Могут ли статины, обладающие плейотропными свойствами, влияющие на синтез ряда провоспалительных цитокинов, подавлять активность МАРК?

Показано, что мевастатин в концентрациях 1 и 10 мкмоль статистически значимо снижает спонтанную активацию МАРК р38 в моноцитах ПК больных РА на 18,5% и 19% соответственно. Достоверное уменьшение фосфорилирования  МАРК ERK1/2 регистрировалось при добавлении в культуры 0,1, 1 и 10 мкмоль мевастатина (на 24,3%, 26,4% и 30,57% соответственно). Мевастатин-индуцированное подавление спонтанной активации МАРК р38 и ERK1/2 не было дозозависимым (р = 0,8 и р = 0,7) (рис. 11).

Рис. 10.

Влияние биологических препаратов на спонтанную активацию МАРК р38 у больных РА (А). Контроль – окрашенные специфическими антителами клетки без добавления биологического препарата. На репрезентативных гистограммах (Б, В, Г) толстой линией обозначена активация МАРК р38 в контроле, тонкой линией - при добавлении в культуры инфликсимаба (Б), TNF-RI (В) и IL-1Ra (Г). * - p < 0,05. MIF – медиана интенсивности флюоресценции.

Для изучения механизмов действия статинов на активацию МАРК в культуры МНК ПК добавлялась мевалоновая кислота. L-мевалонат полностью отменял мевастатин-индуцированное подавление спонтанного фосфорилирования МАРК р38 (на 109,1%) и частично предотвращал уменьшение активации MAPK ERK1/2, вызванное мевастатином (на 26,7%)(рис. 11).

Рис. 11.

Влияние мевастатина на спонтанную активацию МАРК р38 (А) и RK1/2 (В). МВСТ 0.1, 1 и 10 – мевастатин в концентрациях 0,1, 1 и 10 мкмоль соответственно, МВЛ – мевалонат (100 мкмоль). Контроль – окрашенные специфическими антителами клетки без добавления мевастатина. На репрезентативных гистограмме активации МАРК р38 (Б) и ERK1/2 (Г) тонкой линией обозначен контроль, толстой линией – активация МАРК при добавлении мевастатина 10 мкмоль, заполненной линией – неокрашенный контроль.  * - p < 0,05. MIF – медиана интенсивности флюоресценции.

Статин-индуцированное подавление МАРК р38, выявленное в этом разделе исследования, может быть основным механизмом снижения уровней сывороточного IL-6 у больных РА, получающих лечение аторвастатином (McCarey D.W. et al., 2004), и уменьшения продукции IL-6 и IL-8 синовиоцитами больных РА, культивированными в присутствии симвастатина (Lazzerini P.E. et al., 2007). Полученные данные позволяют предположить следующую последовательность молекулярных событий, приводящих к развитию противовоспалительного эффекта статинов при РА: уменьшение содержания промежуточных продуктов синтеза холестерина снижение прениляции малых ГТФаз уменьшение активации МАРК ингибирование экспрессии факторов транскрипции снижение синтеза провоспалительных цитокинов, уменьшение пролиферации иммунокомпетентных клеток.

Клиническая значимость селективной ингибиции МАРК различными соединениями у больных РА продемонстрирована нами в пилотном исследовании эффективности низкомолекулярного специфического ингибитора МАРК р38 второго поколения VX-702.

Изучение эффективности и безопасности использования ингибитора p38 МАРК второго поколения VX-702 у больных РА

Этот раздел работы выполнен лично автором в рамках международного проекта «12-ти недельное, двойное слепое, рандомизированное, проводимое в параллельных группах, плацебо-контролируемое исследование препарата VX-702  в двух дозировках у больных с РА средней и высокой степени активности». Спонсор исследования – компания Вертекс Фармасьютикал Инкорпорейтид, США. VX-702 представляет собой низкомолекулярный специфическим ингибитор р38 МАРК.

Одиннадцать больных с активным РА, включенных в исследование, были рандомизированы к приему VX-702 10 мг/сут (n=6), VX-702 5 мг/сут (n=1) и плацебо (n=4) в течение 12 недель. При анализе эффективности пациенты, получавшие VX-702 в дозировках 5 мг/сут и 10 мг/сут, были объединены в одну группу.

До начала терапии больные не отличались по клиническим и лабораторным показателям, принимаемому лечению. Установлено, что после приема VX-702 в течение 12 недель достоверно уменьшились индекс DAS28, общая оценка здоровья пациентом, число припухших и болезненных суставов и уровень боли (табл. 3). У больных, принимавших плацебо, уменьшения параметров клинической эффективности активности болезни не выявлялось.

Таблица 3

Изменения показателей клинической эффективности через 12 недель терапии VX-702 и плацебо

 

Показатель эффективности

VX-702 (5 и 10 мг/сут)(n=7)

Плацебо (n=4)

Медиана (25-75% квартили)

Р

Медиана (25-75% квартили)

Р

DAS28

-1.84 (-2.262 - -0.74)

0.0156

0.31 (-1.26 - 1.17)

1

Общая оценка здоровья, мм ВАШ

-20 (-22.250 - -6.2)

0.022

-6 (-13 - 2.5)

0.625

ЧПС

-8 (-14 - -6.5)

0.022

-0.5 (-6.5 - 6)

1

ЧБС

-13 (-17.25 - -5.7)

0.0156

-0.5 (-10 - 8.5)

0.875

СРБ, мг/дл

0.2 (-1.425 - 1.2)

0.8438

6.1 (0.9 - 7.8)

0.25

СОЭ, мм/ч

8 (-4.5 - 17.5)

0.3972

29 (6.5 - 31)

0.25

HAQ

-0.125 (-0.531 - -0.125)

0.1248

-0.31 (-0.56 - -0.19)

0.125

Утренняя скованность

-170 (-180 - -3.75)

0.271

60 (0 - 102)

0.8857

Уровень боли, мм ВАШ

-20 (-21 - -11.5)

0.0343

-2.5 (-13.5 - 4.5)

0.75

Активность болезни, мм ВАШ (врач)

-20 (-20 - -2.5)

0.3408

0 (-10 - 100)

0,582

Активность болезни, мм ВАШ (пациент)

0 (-27.5 - 7.5)

0.3883

0 (-10 - 10)

0.681

Сопоставляя полученные в предыдущем разделе работы данные о влиянии мевастатина и ряда биологических агентов на активность МАРК с результатами испытания клинической эффективности ингибитора р38 МАРК, можно предположить, что влияние мевастатина на активность МАРК моноцитов ПК больных РА является не только феноменом in vitro. Это действие является одной из составляющих механизма реализации клинического эффекта симвастатина, что подтверждается эффективностью селективных ингибиторов р38 МАРК при лечении РА.

Способность статинов замедлять развитие атеросклероза была показана в исследованиях на больных с рядом заболеваний и состояний, повышающих риск сердечно-сосудистых заболеваний – гиперхолестеринемией (Saito Y. et al., 2008), метаболическим синдромом, сахарным диабетом II типа (Verges B. et al., 2008), ишемической болезнью сердца с нормальным содержанием холестерина (Hosokawa S. et al., 2006) и др. Неизвестно, оказывают ли статины антиатерогенное действие у больных аутоиммунными заболеваниями, в частности РА, и существует ли взаимосвязь между возможным липидкорригирующим эффектом и уменьшением активности болезни при использовании статинов. Этому вопросу был посвящен следующий раздел работы.

Влияние терапии симвастатином на маркеры атеросклероза у больных РА

Изучалось содержание холестерина в субфракциях липопротеинов сыворотки крови и связи динамики системного воспаления с изменениями липидного профиля у больных РА до и после лечения симвастатином.

После курса терапии симвастатином зарегистрировано статистически значимое повышение содержания общего холестерина ЛПВП и холестерина ЛПВП2. В то же время терапия симвастатином приводила к достоверному уменьшению содержания общего холестерина ЛПНП и холестерина ЛПНП1-3 в сыворотке крови (рис. 12).

Рис. 12.

Изменение содержания холестерина субфракций липопротеинов у больных РА в динамике при лечении симвастатином. * - р < 0,05.

Поскольку положительные изменения при приеме симвастатина касались содержания холестерина ряда субфракций сывороточных липопротеинов, можно считать, что использование статинов в терапии активного РА влияет на липидный профиль и способно снижать риск развития атеросклероза в большей степени, чем стандартные DMARD, антиатерогенные эффекты которых заключаются лишь в повышении холестерина ЛПВП (Georgiadis A.N. et al., 2006).

К иммунологическим маркерам атеросклероза относятся белки острой фазы воспаления, провоспалительные цитокины и др. Показано, что увеличение содержания таких молекул, как СРБ и IL-6 в сыворотке крови отражает риск развития атеротромбоза у лиц среднего и пожилого возраста, является фактором риска преждевременной смерти, обусловленной инфарктом миокарда или инсультом (Насонов Е.Л., 2002). В 15-летнем проспективном наблюдении за когортой больных РА EURODISS установлено, что основным независимым предиктором развития сердечно-сосудистых заболеваний и повышения ригидности сосудистой стенки является содержание СРБ (Provan S.A. et al., 2009).

Изучалось влияние приема симвастатина на содержание СРБ и IL-6 у больных РА. Было показано статистически значимое уменьшение содержания СРБ (рис. 13, А) и снижение циркулирующего IL-6 в группе респондеров (рис. 7, Б).

Для выявления взаимосвязи между противовоспалительным и антиатерогенным действием статинов при РА изучалась корреляционная зависимость динамики содержания СРБ и изменения уровня холестерина субфракций липопротеинов сыворотки крови после лечения симвастатином. Была обнаружена отрицательная корреляция изменения концентрации СРБ с ЛПВП и ЛПВП2 (рис. 13, Б и В соответственно). Это может свидетельствовать о том, что эффективность симвастатина при РА обусловлена не только снижением содержания промежуточных продуктов синтеза холестерина, но и холестеринснижающим эффектом статинов, приводящим к повышению концентрации ЛПВП, обладающих противовоспалительным действием (Rye K.A. et al., 2008).

Рис. 13.

Динамика содержания СРБ сыворотке (А), корреляция изменений содержания холестерина ЛПВП (Б) и ЛПВП2 (В) с изменениями уровня СРБ сыворотки крови до и после лечения симвастатином.

Одной из актуальных проблем современной медицины является выявление прогностических факторов, связанных с конкретными исходами заболевания при его клиническом течении. Это касается, в первую очередь, хронических заболеваний, при которых эффективность лечения достигается после достаточно продолжительной терапии и лишь у части пациентов. Поскольку клинически значимое улучшение при применении статинов развивается у небольшой части больных РА, актуальным является поиск прогностических факторов, определяющих ответ на терапию. Выявление таких факторов позволит индивидуализировать терапию и улучшить фармакоэкономические параметры. В следующем разделе работы будут представлены результаты поиска возможных предикторов развития клинического ответа на лечение симвастатином у больных РА.

Выявление предикторов клинического ответа на симвастатин при РА

Задачей данного этапа исследования являлось выявление предикторов ответа на лечение симвастатином больных РА. На основании критериев EULAR группа больных РА, получавших симвастатин, была подразделена на подгруппы ответивших (33%) и не ответивших (67%) на терапию симвастатином пациентов, между которыми был проведен сравнительный анализ демографических, клинических, иммунологических и др. показателей.

Респондеры и нереспондеры не отличались по демографическим и клиническим показателям. В качестве кандидатов на роль прогностических критериев было отобрано достаточно большое количество лабораторных параметров – содержание циркулирующих Th1, Th2, Th17 и провоспалительных цитокинов, уровень холестерина в различных субфракциях липопротеинов сыворотки крови.

При сравнении базовых концентраций сывороточных цитокинов и цитокинов, продуцируемых в культурах МНК ПК у пациентов, ответивших и не ответивших на лечение симвастатином, достоверное различие выявлялось только по содержанию циркулирующего IL-10,  которое было выше в группе ответчиков.  Корреляционный анализ изменения активности болезни в динамике при лечении симвастатином и содержания Th1, Th2, Th17 и провоспалительных цитокинов в сыворотках и супернатантах МНК ПК до начала терапии показал положительную связь базального уровня сывороточного IL-10 и улучшения DAS28. Помимо этого, в группе ответчиков до начала лечения определялось достоверно более низкое содержание общего холестерина ЛП и холестерина проатерогенной субфракции ЛППП.  Также была обнаружена достоверная положительная корреляция базового уровня холестерина ЛППП и улучшения DAS28.

Эти результаты послужили основанием для анализа операционных характеристик теста прогнозирования клинического ответа на симвастатин, основанного на определении сывороточных IL-10, общего холестерина и холестерина ЛППП. Для этого была построена характеристические кривые (receiver-operator curve, ROC) для IL-10, общего холестерина и холестерина ЛППП (рис.  14, А, Б и В соответственно). Площадь под кривой для IL-10 составила 0,76 (95%, ДИ 0,58-0,95, р = 0,031),  для общего холестерина ЛП - 0,84 (95% ДИ 0.63-1.062, р = 0,039) и для холестерина ЛППП - 0,91 (95% ДИ 0,75-1,069, р = 0,014).

В соответствии с классификацией Swets (Swets J.A., 1988) площадь под ROC кривой от 0,5 до 0,7 свидетельствует о невысокой точности теста, тест с площадью под кривой ROC от 0,7 до 0,9 может быть использован в практике и площадь под ROC кривой выше 0,9 характеризует тест, обладающий высокой точностью. Следовательно, определение содержания холестерина ЛППП является тестом, с высокой точностью предсказывающим развитие EULAR-ответа на терапию симвастатином. В то же время выявление общего холестерина ЛП и циркулирующего IL-10 обладает умеренной информативностью для прогноза успешного ответа на лечение.

Следующим этапом оценки операционных характеристик изучаемых параметров было определение чувствительности, специфичности и отношения правдоподобия. На основании кривой ROC для IL-10 были подсчитаны чувствительность и специфичность для различных точек разделения. Точкой разделения, соответствующей максимальным показателям чувствительности (89%) и специфичности (62%), была 6,5 пг/мл (отношение правдоподобия 2,33). Точкой разделения содержания общего холестерина ЛП, соответствующей наилучшим показателям чувствительности (80%) и специфичности (88,89%), была 169,4 мг/дл (отношение правдоподобия 7,2). Оптимальной точкой разделения концентрации холестерина ЛППП можно считать 10,1 мг/дл (чувствительность 100%, специфичность 66,67%, отношение правдоподобия 3).

Следует подчеркнуть, что в выбранном компромиссе между чувствительностью и специфичностью теста, при использовании низкотоксичных и недорогих препаратов,  предпочтение следует отдать высокочувствительным тестам, возможно даже в ущерб специфичности. В таком случае клиницист получает возможность выявлять максимально большее количество пациентов, у которых терапия будет эффективна.

Рис. 14.

Кривые ROC, иллюстрирующие отношение между чувствительностью и специфичностью для различных точек разделения содержания сывороточных IL-10 (А), холестерина ЛППП (Б) и общего холестерина ЛП (В) в отношении прогнозирования EULAR-ответа.

Итак, операционные характеристики тестов определения содержания в сыворотке ПК общего холестерина ЛП, IL-10, холестерина ЛППП, позволяют отнести их к прогностически значимым критериям, поскольку их чувствительность составляет 80%, 88,9% и 100%, соответственно. Следовательно, у врача, принимающего решение о целесообразности назначения симвастатина больным РА, существует три возможности предсказать клинический эффект. Решение может быть принято с учетом различий в чувствительности и специфичности и/или стоимости метода.

Важно также отметить, что среди более чем 40 клинических и лабораторных признаков, характеризующих респондеров и нереспондеров, только 3 показателя (содержание общего холестерина ЛП, холестерина ЛППП и IL-10) позволяют различать эти две подгруппы больных. Примечательно, что первые два показателя оценивают липидный состав крови, а третий – функциональную активность ряда клеток иммунной системы. Это является еще одним свидетельством тесной взаимосвязи нарушений липидного обмена, выраженности воспаления, изменений в иммунной системе при РА и позволяет предполагать, что клинически однородные группы больных РА разнородны патогенетически. Эти группы можно определить, как субтипы болезни (табл. 4).

Как видно из таблицы, клинико-иммунологические субтипы РА различались ответом на терапию симвастатином, уровнем базового содержания холестерина некоторых липопротеинов и IL-10, динамикой уровня циркулирующих цитокинов.

Таблица  4

Характеристики субтипов больных РА, ответивших и не ответивших на лечение симвастатином

Отличительные признаки

Нереспондеры (n=22)

Респондеры (n=11)

Р

Медиана

25-75% квартили

Медиана

25-75% квартили

Отличительные признаки до лечения

IL-10, пг/мл

55,99

4,53-8

8,33

7,09-10,72

0,025

Холестерин ЛППП, мг/дл

18,2

7,6-25,1

0,9

0,35-6,7

0,012

Общий холестерин, мг/дл

191,3

170,8-219,2

150

143,6-175,9

0,0453

Изменение содержания показателей в динамике после лечения

IL-6

-0,3

(-23,6-2,77)

-4,36*

(-28,1- -0,35)

-

IL-17

-30,5*

(-151,3-0)

-51,6

(-133,9-2,255)

-

* - р <0,05 до и после лечения симвастатином

Важнейшим требованием к любому противовоспалительному или болезнь-модифицирующему препарату, используемому для лечения РА, является безопасность.

Известно, что РА ассоциирован с 2-5 кратным повышением риска развития неходжскинских лимфом (Baecklund E. et al., 2004). В некоторых исследованиях было показано, что терапия ингибиторами TNF- и метотрексатом может приводить к  еще большему повышению вероятности развития лимфом (Wolfe А. et al., 2003). Одним из возможных механизмов увеличения риска развития лимфомы при использовании ингибиторов TNF- и метотрексата является подавление специфического иммунного ответа к вирусу Эпштейн-Барра (ВЭБ) и реактивация латентной ВЭБ-инфекции (Feng W.H. et al., 2004).

Учитывая способность статинов уменьшать антигенспецифическую стимуляцию лимфоцитов, можно предположить, что статины снижают ВЭБ-специфичный иммунный ответ. Теоретически такое свойство статинов может делать небезопасным их длительное применение у больных РА.

Исходя из этого, было проведено сравнительное исследование влияния мевастатина и биологических препаратов на активацию ВЭБ-специфичных Т-хелперов in vitro.

Влияние статинов и биологических препаратов для лечения РА на активацию ВЭБ-специфичных Т-лимфоцитов у здоровых людей и больных РА

Сравнивалось влияние мевастатина и некоторых биологических препаратов для лечения РА на активацию ВЭБ-специфичных CD4+-лимфоцитов у здоровых людей и пациентов с РА.

Показано, что у сопоставимых по возрасту и полу здоровых людей по сравнению с больными РА регистрировалось достоверно большее содержание ВЭБ-специфичных CD4+-лимфоцитов (рис. 15).

Проводилась оценка влияния биологических препаратов в сравнении с плацебо на содержание ВЭБ-специфичных Т-хелперов здоровых людей. Было обнаружено, что IL-1Ra, TNF-RI, инфликсимаб и мевастатин не влияют на ВЭБ-индуцированный синтез IFN- в CD4+-лифмоцитах ПК (рис. 16).

Рис. 15.

Сравнение содержания ВЭБ-специфичных CD4+- лимфоцитов у больных РА и здоровых людей. Представлены репрезентативные графики изотипического контроля, больных РА и здоровых людей.

Рис. 16.

Влияние IL-1Ra, инфликсимаба, TNF-RI и мевастатина на активацию ВЭБ-специфичных CD4+-лимфоцитов у здоровых людей. Представлены репрезентативные графики содержания ВЭБ-специфичных CD4+- лимфоцитов при добавлении плацебо,  IL-1Ra, TNF-RI и мевастатина.

Снижение содержания ВЭБ-специфичных CD4+-лимфоцитов у больных РА по сравнению со здоровыми людьми может быть одним из механизмов, приводящих к повышенному риску активации латентной ВЭБ инфекции и развития неходжскинских лимфом. Мевастатин, IL-1Ra, TNF-RI и инфликсимаб не оказывают влияния на ВЭБ-индуцированную активацию Т-хелперов. Можно предположить, что биологические препараты для лечения РА и статины не увеличивают риск развития лимфом.

Являются ли клинико-иммунологические эффекты статинов специфичными для РА или они могут проявляться при других аутоиммунных заболеваниях?

Сходным с РА по патогенезу органонеспецифическим аутоиммунным заболеванием является псориаз. Известно, что псориаз, также как и РА, ассоциирован с повышенным риском сердечно-сосудистых заболеваний (Gelfand J.M. et al., 2006) и нарушениями липидного обмена (Mallbris L. et al., 2006).

Несмотря на доказанное противовоспалительное и антиатерогенное действие статинов, данных об использовании этого класса препаратов при псориазе нет. В связи с этим нами были проведены исследования по изучению эффективности, безопасности и фармакодинамики симвастатина у больных псориазом.

Иммунофармакодинамика статинов и их клиническая эффективность у больных псориазом

В исследование было включено 27 пациентов с умеренным и тяжелым вульгарным псориазом, 15 из которых получали симвастатин в дозе 40 мг ежедневно в течение 8 недель. Группа контроля была сформирована из 12 пациентов, принимавших участие в открытом исследовании эффективности активированных аутологичных Т-лимфоцитов, проводимом в клинике нашего Института в 2005 году.

Группы сравнения не отличались по возрасту, индексу качества жизни дерматологических больных DLQI и оценке поражения кожи врачом. В то же время у больных группы симвастатина регистрировался достоверно более высокий показатель PASI. На восьмой неделе терапии в опытной группе выявлено статистически значимое улучшение PASI по сравнению с группой контроля (рис.  17, А). У 40% больных, принимавших симвастатин, на восьмой неделе лечения врачом было зарегистрировано полное/почти полное очищение кожи, в то время как в контрольной группе частота этого события была в 2,5 раза меньше (р = 0.09) (рис.  17, Б). В группе симвастатина также выявлялась тенденция к увеличению числа больных с ответом PASI 50 (p = 0.2).

Рис. 17

Влияние симвастатина на относительное изменение PASI (А) и частоту полного/почти полного очищения кожи (Б) в динамике при лечении. Примечания: * - р < 0,05.

Достоверных изменений содержания CD3+, CD4+, CD8+, CD19+, CD16+ лимфоцитов, HLA-DR+ моноцитов  ПК на 4 и 8 неделях лечения не выявлялось.

Следует отметить, что концентрация IFN- в сыворотках ПК больных псориазом до и после лечения симвастатином была ниже пороговых значений метода определения. Содержание IL-10 до лечения не отличалось от значений здоровых доноров, а уровень IL-17 был достоверно выше у больных псориазом. При изучении влияния приема симвастатина на содержание IL-17, IL-10 и IFN- было показано, что назначение симвастатина ассоциировано с достоверным повышением уровня циркулирующего IL-10 (рис. 18).

Препарат хорошо переносился больными. Один пациент преждевременно выбыл из исследования из-за выраженной головной боли, которая была расценена как следствие приема симвастатина.

Рис. 18.

Изменение содержания сывороточных IL-17 и IL-10 в динамике при лечении симвастатином.

Больные псориазом не случайно были включены в исследование. Gelfand et al было показано, что у больных псориазом молодого возраста в несколько раз повышен риск инфаркта миокарда (Gelfand J.M. et al., 2006). В предыдущих разделах работы были продемонстрированы проатерогенные нарушения липидного спектра при псориазе. 

Поскольку данные о липидкорригирующем действии статинов при псориазе отсутствуют, изучалось содержание холестерина в субфракциях липопротеинов сыворотки крови у больных псориазом до и после лечения симвастатином.

Изменения липидного спектра крови у больных псориазом до и после лечения симвастатином

Лечение симвастатином не приводило к изменениям содержания общего холестерина. В то же время прием симвастатина был ассоциирован с повышением ЛПВП3  более, чем в два раза. Изменений содержания холестерина других субфракций липопротеинов в динамике после лечения симвастатином не выявлено (рис.  19).

Влияние статинов на ЛПВП3  свидетельствует об их антиатерогенном действии при псориазе, поскольку в ряде исследований было показано, что снижение уровня холестерина ЛПВП является независимым фактором риска сердечно-сосудистых заболеваний. Так, изолированное уменьшение содержания холестерина ЛПВП  менее 25 мг/дл повышает риск развития сердечно-сосудистых катастроф в 4 раза (Kannel W.B., 1983).

В настоящем исследовании показано, что при использовании симвастатина у больных псориазом регистрируются уменьшение поражения кожи и коррекция параметров липидного состава крови. Однако при проведении фармакотерапии врачу приходится решать проблему выбора препарата, основываясь не только на данных об его клинической эффективности и безопасности, но и на ряде фармакоэкономических показателей – «стоимость-эффективность», «приращение эффективности затрат» и др.

Представлялось целесообразным провести сравнительный фармакоэкономический анализ прямых финансовых затрат, которые несет пациент, страдающий умеренной формой бляшечного псориаза при терапии статинами и классическими препаратами для лечения псориаза.

Рис. 19.

Изменение содержания холестерина субфракций липопротеинов у больных псориазом в динамике при лечении симвастатином. * - р < 0,05.

Изучение фармакоэкономических показателей применения симвастатина при псориазе

В условиях дефицита ресурсов здравоохранения России существует необходимость проведения фармакоэкономического анализа альтернативных методов лечения хронических заболеваний.

Изучались параметры «стоимость-эффективность» при использовании симвастатина и ацитретина у больных псориазом (табл 5).

Ацитретин - препарат для системного лечения умеренного псориаза, зарегистрированный и рекомендованный Федеральным руководством по использованию лекарственных средств (Чучалин А.Г. et al., 2007).

Видно, что соотношение «затраты/эффективность» на один эффективный случай и на одну единицу индекса площади и поражения кожи значительно ниже при использовании симвастатина вследствие его более высокой эффективности и меньшей стоимости.

Таблица 5

Анализ «затраты-эффективность» лечения псориаза симвастатином и ацитретином.

Препарат

Прямые затраты

«Затраты-эффективность», руб на 1 случай PASI 50

«Затраты-эффективность», руб на 1 единицу PASI

Стоимость,

сут, руб.

Стоимость, курс, руб.

Симвастатин

19,4

1164

2164

67,5

Ацитретин

298,5

13360

18301

534,4

Данные об эффективности и безопасности симвастатина у больных псориазом, результаты фармакоэкономического анализа позволяют определить назначение препарата в качестве системного средства как «доминирующую альтернативу» лечения.

Таким образом, в настоящем исследовании выявлена взаимосвязь между хроническим воспалением и нарушениями липидного спектра крови у больных РА и псориазом. Применение статинов при этих заболеваниях уменьшало выраженность воспаления, оказывало иммуномодулирующее и антиатерогенное действие. Результаты работы свидетельствуют о перспективности дальнейшего изучения молекулярных и клеточных механизмов интеграции иммунного ответа и метаболизма липидов у больных аутоиммунными заболеваниями. Более глубокое понимание этих механизмов позволит ответить на ряд ключевых вопросов. Каковы патогенетические отличия вторичных васкулопатий при аутоиммунных заболеваниях от атеросклеротического поражения сосудов? Является ли атеросклероз одним из системных проявлений аутоиммунных заболеваний или это самостоятельное заболевание со сходным имунопатогенезом? Инициация аутоиммунных заболеваний обусловлена первичными изменениями в обмене липидов и/или в иммунной системе?

Ответы на эти и многие другие вопросы послужат основой для разработки новых стратегий лечения аутоиммунных заболеваний:

  • Использование препаратов, обладающих сходным со статинами многоцелевым действием – противовоспалительным, иммуномодулирующим, антиатерогенным
  • Применением комбинации иммуномодулирующих средств с липидкорригирующими препаратами (снижающих синтез холестерина и/или уменьшающих его абсорбцию)

Можно надеяться, что решение поставленных задач позволит существенно улучшить качество жизни, снизить риск серьезных сердечно-сосудистых осложнений у больных с пока еще неизлечимыми органонеспецифическими аутоиммунными заболеваниями.

Выводы

  1. У больных РА и псориазом выявлена дислипидемия, характеризующаяся проатерогенными нарушениями соотношения субфракций холестерина липопротеинов, прямо коррелирующими со степенью активности болезни, уровнем провоспалительных цитокинов в сыворотке крови, что указывает на сопряженность нарушений липидного обмена с аутоиммунным воспалением и патогенетически обосновывает применение при этих заболеваниях статинов, обладающих противовоспалительным, иммуномодулирующим и антиатерогенным действием.
  2. Прием симвастатина больными РА на фоне стандартных DMARD к концу 12-ой недели лечения уменьшает выраженность воспаления в суставах, число припухших суставов и острофазовые показатели, что свидетельствует о клинической эффективности препарата.
  3. Клинический эффект симвастатина у больных РА ассоциирован со снижением спонтанной, коллаген-II (CII), но не анти-CD3-индуцированной пролиферации МНК ПК. Антиген-специфическое антипролиферативное действие статинов наблюдается также in vitro и отменяется при внесении в культуры промежуточных продуктов холестерина. Это указывает на то, что ex vivo и in vitro статины уменьшают только антиген-специфическую пролиферацию путем снижения содержания изопреноидов.
  4. Содержание циркулирующих TNF-, IFN-, IL-6, IL-10, IL-8 у больных РА к концу лечения симвастатином не изменяется, а уровень IL-17 - снижается. Терапия симвастатином не влияет на спонтанную продукцию TNF-, IFN-, IL-6, IL-10, IL-17, увеличивает анти-CD3-стимулированный синтез IL-10 и TNF-. У респондеров после лечения уровень IL-6 снижается, а других изучаемых цитокинов - не меняется. Эти данные свидетельствуют о том, что симвастатин оказывает модулирующее действие на продукцию цитокинов профиля Th2, Th17-лимфоцитов, провоспалительных цитокинов in vivo и ex vivo, различающееся у ответчиков и неответчиков.
  5. Мевастатин in vitro не влияет на анти-CD3-индуцированную продукцию МНК ПК больных РА TNF-, IFN-, IL-10, IL-6, IL-8, IL-17, а в культурах, стимулированных CII, снижает продукцию IFN- и IL-8. Изопреноиды отменяют влияние мевастатина на синтез IFN-, и это дает основания считать, что статины подавляют антиген-специфическую продукцию цитокинов, а механизм ингибиции связан с уменьшением содержания изопреноидов.
  6. Спонтанная активация МАРК р38 и ERK1/2 в моноцитах больных РА подавляется мевастатином вследствие снижения содержания изопреноидов. Инфликсимаб, рекомбинантный пегилированный растворимый рецептор TNF p55 типа I (r-met-Hu-sTNF-RI) и IL-1Ra уменьшают фосфорилирование МАРК р38, что указывает на сходные эффекты влияния как статинов, так и биологических препаратов на МАРК. Эффект снижения статинами активности МАРК является одним из механизмов их противовоспалительного действия, поскольку терапия селективным ингибитором МАРК р38 VX-702 вызывает подавление активности РА.
  7. Клинический эффект от лечения симвастатином больных РА сопровождается повышением содержания холестерина антиатерогенных субфракций липопротеинов, уменьшением содержания холестерина проатерогенных субфракций липопротеинов, иммунологических маркеров атеросклероза СРБ  и IL-6, и это указывает на то, что препарат не только снижает активность болезни, но и обладает антиатерогенным действием.
  8. Больные РА, ответившие и не ответившие на терапию симвастатином, до начала терапии отличаются по содержанию циркулирующего IL-10, общего холестерина ЛП, холестерина ЛППП, и это позволяет считать, что респондеры и нереспондеры являются определенными субтипами РА. Выявление указанных различий позволяет с высокой чувствительностью прогнозировать исход терапии.
  9. У больных активным РА, в сравнении со здоровыми людьми, определяется снижение содержания ВЭБ-специфичных CD4+-лимфоцитов, которое не увеличивается под действием мевастатина, инфликсимаба, TNF-RI и IL-1Ra. Это указывает на то, что статины не способствуют уменьшению содержания ВЭБ-специфичных CD4+-лимфоцитов, играющих ключевую роль в контроле за латентной инфекцией ВЭБ у больных РА.
  10. Монотерапия симвастатином у больных псориазом приводит к снижению выраженности и распространенности воспаления кожи, повышению содержания холестерина антиатерогенной субфракции ЛПВП3, что свидетельствует о клинической эффективности препарата и его липидкорригирущем действии. Симвастатин, в сравнении с ацитретином, отличается лучшими фармакоэкономическими показателями, и это позволяет считать, что прием симвастатина экономически более выгоден, чем использование ацитретина.
  11. Снижение воспаления кожи к концу лечения у пациентов с псориазом, получавших симвастатин, не сопровождается изменениями содержания субпопуляций Т и В-лимфоцитов, моноцитов периферической крови, уровней сывороточных IL-17 и IFN-. Увеличение содержания циркулирующего IL-10 в конце лечения свидетельствует о повышении системной активности Th2-лимфоцитов.

Практические рекомендации

  1. При обследовании больных РА, псориазом рекомендуется в первом случае оценивать содержание СРБ, IL-6, холестерина различных субфракций ЛП в сыворотке ПК, во втором – липидный спектр крови. Это обследование необходимо для выявления факторов риска развития атеросклероза, его осложнений и целесообразности назначения антиатерогенной терапии.
  2. Больным РА с умеренной и высокой активностью болезни, плохо контролируемой базисными средствами, рекомендуется прием симвастатина в сочетании с DMARD как одна из альтернатив комбинированного лечения, а также в случае выявления у больных высокого риска развития атеросклероза. Симвастатин рекомендуется принимать не менее трех месяцев в дозе 40 мг ежедневно.
  3. Для принятия решения о назначении симвастатина больным РА следует до начала лечения определить в сыворотке ПК содержание холестерина ЛППП и/или уровень общего холестерина ЛП, IL-10, которые являются прогностическими критериями ответа на лечения.
  4. Больным с умеренно выраженным бляшечным псориазом рекомендуется терапия симвастатином в дозе 40 мг в сутки в течение минимум двух месяцев. Как липидкорригирующее средство, симвастатин может быть назначен больным неактивным псориазом в случае выявления у них проатерогенных изменений липидного спектра. На основании полученных в работе данных в международном консенсусном документе по проблеме сердечно-сосудистых заболеваний при псориазе «AJC Editor’s Consensus: Psoriasis and Coronary Artery Disease» было рекомендовано использование статинов при псориазе (уровень доказательности 2D) (Friedewald V.E. et al., 2008).

Список работ, опубликованных по теме диссертации

  1. Ширинский B.C., Малышева О.А., Ширинский И.В. Цитокиновая и антицитокиновая терапия ревматоидного артрита и рассеянного склероза // Медицинская иммунология. – 2001.- № 3.- С.401-404.
  2. Ширинский И.В., Ширинский В.С. Антицитокиновая терапия ревматоидного артрита // Сборник «Система цитокинов. Теоретические и клинические аспекты». Новосибирск, Наука, 2004. С.297-308.
  3. Ширинский И.В. Использование статинов при ревматоидном артрите - клиническая эффективность и механизмы действия. // Фундаментальная наука и клиническая медицина. Десятая Всероссийская медико-биологическая конференция молодых исследователей «Человек и его здоровье» (тезисы докладов), С. Петербург.- 2007.-C.524.
  4. Ширинский И.В., Желтова О.И., Ширинский В.С. Эффективность применения статинов у больных ревматоидным артритом. // XIV российский национальный конгресс «Человек и лекарство» (тезисы докладов), Москва 2007. - С.464.
  5. Ширинский И.В. Клиническая эффективность и механизмы действия статинов при ревматоидном артрите. // Тезисы международной научной конференции студентов и молодых врачей, Харьков 2007.- С.160.
  6. Shirinsky I.V., Zheltova O.I., Shirinsky V.S. Efficacy and safety of simvastatin in the treatment of rheumatoid arthritis // 2007 Annual European Congress of Rheumatology, Barcelona, Spain. Ann. Rheum. Dis.-2007.-Vol.66 (suppl. II)-P.448.
  7. Ширинский И.В., Желтова О.И., Ширинский В.С., Козлов В.А. Применение симвастатина у больных ревматоидным артритом // V Всемирный конгресс по иммунопатологии и аллергии. V Европейский конгресс по астме, Москва. Аллергология и иммунология.- 2007. - Т.8. -№1.-С.76.
  8. Ширинский В.С., Ягодина Е.В., Ширинский И.В., Лыкова С.Г. Эффективность применения симвастатина у больных псориазом - пилотное исследование // Сибирский журнал дерматологии и венерологии.-2007. -№8.-С.80
  9. Ширинский И.В., Ширинский В.С., Жетова О.И., Козлов В.А. Фармакодинамические свойства статинов при ревматоидном артрите // 3rd International Conference “Basic Science for Medicine”, Новосибирск. Тезисы докладов. 2007. - С. 89.
  10. Ширинский В.С., Ширинский И.В., Козлов В.А. Статины уменьшают выраженность воспаления кожи и улучшают качество жизни больных псориазом // Медицинская иммунология. - 2007. - №2-3. - С.356.
  11. Козлов В.А., Ширинский И.В., Желтова О.И., Ширинский В.С. Симвастатин уменьшает активность болезни и улучшает качество жизни у больных ревматоидным артритом // Медицинская иммунология. - 2007. - №2-3. - С.349.
  12. Ширинский И.В., Ширинский В.С. Ингибирование 3-гидрокси-3-метилглутарил коэнзим А редуктазы снижает активацию Т-лимфоцитов у больных ревматоидным артритом за счет снижения концентрации изопреноидов // Медицинская иммунология. - 2007. - №2-3. - С.357.
  13. Ширинский И.В., Желтова О.И., Соловьева Н.Ю., Ширинский В.С. Влияние статинов на пролиферацию лимфоцитов при ревматоидном  артрите // Аллергология и иммунология. -2007.-№4.-С.380-383.
  14. Shirinsky I.V.,Shirinsky V.S. Efficacy of simvastatin in plaque psoriasis: A pilot study // Journal of the American Academy of Dermatology.-2007.-Vol.57-P.529-531.
  15. Ширинский И.В., Козлов В.А., Ширинский В.С. Коррекция липидного обмена и псориатического поражения кожи при использовании симвастатина // Российский журнал кожных и венерических болезней. – 2007.-№6.-С.29-31. 
  16. Ширинский В.С., Ширинский И.В., Демина Д.В., Ду Инбо, Пархоменко А.Г., Козлов В.А. Характеристика иммунного статуса при различных синдромах традиционной китайской медицины у больных ревматоидным артритом и бронхиальной астмой // Бюллетень СО РАМН. - 2007. - №2.- С.38-42.
  17. Ширинский И.В., Желтова О.И., Соловьева Н.Ю., Ширинский В.С., Козлов В.А. Клиническая эффективность статинов при ревматоидном артрите - пилотное исследование // Медицинская иммунология.-2007.-№4-5.-С.505-508.
  18. Ширинский И.В. Изменения клинических и иммунологических параметров у больных ревматоидным артритом при использовании симвастатина // XII Международный конгресс студентов и молодых врачей, Тернополь, Украина, 2008. Тезисы докладов.-С.160.
  19. Ширинский И.В. Внутриклеточные механизмы действия статинов при ревматоидном артрите // V Конференция молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины», Москва. Тезисы докладов. 2008 - С.486-487.
  20. Ширинский И.В. Мевастатин ингибирует митоген-активированные протеинкиназы моноцитов больных ревматоидным артритом - новый механизм действия // Вторая городская научно-практическая конференция врачей «Актуальные проблемы медицины. Клиника, диагностика и лечение воспалительных заболеваний в терапевтической практике». Новосибирск, 2008 г. Тезисы докладов. - С.36-37.
  21. Ширинский И.В., Козлов В.А., Ширинский В.С. Использование статинов в комбинированной терапии ревматоидного артрита // Вторая городская научно-практическая конференция врачей «Актуальные проблемы медицины. Клиника, диагностика и лечение воспалительных заболеваний в терапевтической практике». Новосибирск, 2008 г. Тезисы докладов. - С.37-38.
  22. Ширинский И.В., Желтова О.И., Соловьева Н.Ю., Ширинский В.С., Козлов В.А. Эффективность и иммуномодулирующие эффекты симвастатина при ревматоидном артрите // V Конференция молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины», Москва.-2008.- Тезисы докладов. - С.487-488.
  23. Ширинский И.В., Ширинский В.С. Эффективность и безопасность симвастатина при бляшечном псориазе // V Конференция молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины», Москва. Тезисы докладов.-2008.- С.488-489.
  24. Shirinsky I.V.,Shirinsky V.S. Mevastatin inhibits p38 and ERK1/2 MAPK activation in rheumatoid arthritis monocytes: an in vitro study // 2008 Annual European Congress of Rheumatology, Paris, France. Ann. Rheum. Dis.-2008.-Vol.67 (suppl. II)-P.294.
  25. Shirinsky I.V., Solovyeva N.Y., Zheltova O.I., Kozlov V.A., Shirinsky V.S. Efficacy and immunomodulatory effects of simvastatin in rheumatoid arthritis // 2008 Annual European Congress of Rheumatology, Paris, France. Ann. Rheum. Dis.-2008.-Vol.67 (suppl. II)-P.205.
  26. Ширинский И.В., Желтова О.И., Соловьева Н.Ю., Ширинский В.С. Механизмы действия, эффективность и безопасность использования статинов при ревматоидном артрите // Объединенный иммунологический форум, С. Петербург, 2008. Российский иммунологический журнал. -  2008. - №2-3. - С.241.
  27. Ширинский И.В. Митоген-активированные протеинкиназы моноцитов как мишень для статинов при ревматоидном артрите // Объединенный иммунологический форум, С. Петербург, 2008. Российский иммунологический журнал. -  2008. - №2-3. - С.240.
  28. Ширинский В.С., Ширинский И.В., Козлов В.А. Новые возможности лечения аутоиммунных заболеваний - использование статинов // Объединенный иммунологический форум, С. Петербург, 2008. Российский иммунологический журнал. -  2008. - №2-3. - С.240-241.
  29. Ширинский И.В., Желтова О.И., Ширинский В.С. Применение симвастатина у больных ревматоидным артритом // XV Российский национальный конгресс «Человек и лекарство», 2008. Сборник тезисов. -С. 519.
  30. Изучение фармакодинамики симвастатина и его влияния на выраженность воспаления кожи и качество жизни у больных псориазом // XV Российский национальный конгресс «Человек и лекарство», 2008. Сборник тезисов. - С. 373.
  31. Ширинский И.В., Желтова О.И., Ширинский В.С., Козлов В.А. Связь активности болезни и липидного спектра крови у больных ревматоидным артритом // Клиническая медицина. – 2008.-№12.-С.40-43.
  32. Ширинский И.В., Ширинский В.С., Кожевников В.С. Содержание субфракций липопротеинов сыворотки крови и их связь с фенотипом иммунокомпетентных клеток у больных псориазом // Вестник дерматологии.-2008.-№3.-С.44-47.
  33. Ширинский И.В., Желтова О.И., Ширинский В.С., Козлов В.А. Применение статинов при аутоиммунных заболеваниях - возможность улучшения фармакоэкономических параметров // Российский аллергологический журнал.-2008.-№1.-С.35-36.
  34. Ширинский И.В., Желтова О.И., Ширинский В.С., Козлов В.А. Влияние симвастатина на активность болезни и содержание холестерина субфракций липопротеинов сыворотки крови у больных ревматоидным артритом // Терапевтический архив.-2008.-№3.-С.63-65.
  35. Ширинский И.В., Желтова О.И., Ширинский В.С., Козлов В.А. Эффективность и безопасность симвастатина у больных ревматоидным артритом - открытое контролируемое исследование // Медицинская иммунология. – 2008. – Т. 10.- № 4-5. – С. 477-482.
  36. Ширинский И.В., Ширинский В.С. Влияние статинов на антигенспецифическую активацию лимфоцитов больных ревматоидным артритом – исследование in vitro // Медицинская иммунология. – 2008.-№1.-С.77-80.
  37. Ширинский И.В., Ширинский В.С., Динарелло С.А. Влияние агонистов TNF- и IL-1 на активацию ВЭБ-специфичных CD4+-лимфоцитов у больных РА in vitro // X Международный конгресс «Современные проблемы аллергологии иммунологии и иммунофармакологии», сборник трудов конгресса, Казань, 2009. - С. 408-409.
  38. Ширинский И.В., Козлов В.А., Ширинский В.С. Механизмы противовоспалительного, иммуномодулирующего действия статинов, их эффективность и безопасность при ревматоидном артрите // V съезд ревматологов России. Москва, 2009. Сборник материалов съезда. - С.503.
  39. Shirinsky I.V.,Shirinsky V.S. Effects of PPAR agonists on IL-17 production by rheumatoid arthritis peripheral blood mononuclear cells // 2008 Annual European Congress of Rheumatology, Copenhagen, Denmark. Ann. Rheum. Dis.-2009.-Vol.68 (suppl. III)-P.742.
  40. Shirinsky I.V., Shirinsky V.S., Dinarello C.A. TNF and IL-1 inhibition has no effect on rheumatoid arthritis Epstein-Barr virus-specific CD4+ T-cell activation: an in vitro study // 2008 Annual European Congress of Rheumatology, Copenhagen, Denmark. Ann. Rheum. Dis.-2009.-Vol.68 (suppl. III)-P.241.
  41. Ширинский И.В., Козлов В.А., Ширинский В.С. Влияние статинов и биологических препаратов на активацию митоген-активированных протеинкиназ у больных ревматоидным артритом // Медицинская иммунология. - 2009. - №1. - стр. 71-78.
  42. Shirinsky I.V., Zheltova O.I., Solovyeva N.Y., Kozlov V.A., Shirinsky V.S. Changes in disease activity, cytokine production, and proliferation of peripheral blood mononuclear cells in patients with rheumatoid arthritis after simvastatin treatment // Scandinavian Journal of Rheumatology. – 2009.- №1.-P.23-27.
  43. Ширинский И.В., Козлов В.А., Ширинский В.С. Использование статинов – новый подход к терапии аутоиммунных заболеваний // Вестник РАМН. - 2009. - №2. - С. 26-32.
  44. Ширинский И.В., Ширинский В.С. Прогнозирование клинической эффективности лечения симвастатином у больных ревматоидным артритом // Медицинская иммунология. - 2009. - №2-3. - стр. 221-226.





© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.