WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

УЧРЕЖДЕНИЕ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК ЦЕНТР ТЕОРЕТИЧЕСКИХ ПРОБЛЕМ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКОЙ ФАРМАКОЛОГИИ РАН

На правах рукописи

УДК 615.454.2 ТЕЛЕГИН Леонид Юрьевич ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ФАРМАКОГЕНЕТИКА ЦИКЛОФОСФАМИДА (14.03.06 – Фармакология, клиническая фармакология) А в т о р е ф е р а т диссертации на соискание учёной степени доктора медицинских наук

Москва — 2010 Диссертационная работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Центре теоретических проблем физико-химической фармакологии РАН Научные консультанты: доктор медицинских наук Владимир Митрофанович Писарев, академик РАН, профессор Лев Арамович Пирузян

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Владимир Михайлович Бухман доктор биологических наук, профессор Николай Николаевич Золотов доктор биологических наук Виктор Александрович Суханов

Ведущая организация: Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Московский государственный медико-стоматологический университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию"

Защита диссертации состоится 25 марта 2011 г. в ____ часов на заседании диссертационного совета Д.002.252.01 при Учреждении Российской академии наук Центр теоретических проблем физико-химической фармакологии РАН по адресу: 119991, Москва, ГСП-1, ул. Косыгина, д. 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Центр теоретических проблем физико-химической фармакологии РАН.

Автореферат разослан ___ декабря 2010 года

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук И. С. Николаева - 1

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Тема настоящего исследования тесно переплетается с одной из ведущих задач Центра теоретических проблем физико-химической фармакологии РАН – определение метаболического статуса человеческого организма (Л. А. Пирузян, 2004) для реализации принципа индивидуализации лекарственной терапии и, в частности, иммунодепрессивной терапии. Широкое использование иммунодепрессантов ставит перед клиницистами задачу оценить индивидуальную, наследственно обусловленную чувствительность (резистентность) к лекарственному воздействию. Очевидно, что для решения этой задачи, прежде всего, необходимы целенаправленные экспериментальные исследования.

Вопрос о значении наследственных факторов в определении степени иммунодепрессии, возникающей под влиянием химиопрепаратов-иммунодепрессантов, ранее систематически исследовался экспериментальной группой лаборатории иммуногенетики Института медицинской генетики АМН СССР.

Всё началось с экспериментального факта, обнаруженного Львом Алексеевичем Певницким в процессе работы над докторской диссертацией (Л. А. Певницкий, 1974) – наличие межлинейных различий у мышей в степени лекарственно индуцируемой иммунологической толерантности. Это состояние специфической иммунологической ареактивности (неотвечаемости) возникает в результате сочетанного введения в организм экспериментального животного огромной дозы антигена (тем самым активируется весь иммунокомпетентный клон) и лекарственного препарата-иммунодепрессанта, приводящего к элиминации активированного антигеном клона клеток иммунной системы (так называемая, клональная форма толерантности, см. Л. Н. Фонталин и Л. А. Певницкий, 1978).

Данное состояние специфично – сохраняется полноценный иммунный ответ на другие антигены. Наилучшие результаты были получены у мышей при использовании в качестве антигена эритроцитов барана (ЭБ), в качестве иммунодепрессанта – циклофосфамида (ЦФ). Длительность состояния полученной таким образом иммунологической толерантности сохранялась до 1 года (почти половина мышиной жизни).

Нами первоначально был изучен вопрос о существовании подобных межлинейных различий у мышей в степени подавления ЦФ первичной иммунной реакции на оптимальную иммуногенную дозу ЭБ. В широком диапазоне доз иммунодепрессанта мы выявили линии мышей, контрастно реагирующих на иммунодепрессивное воздействие:

- 2 BALB/cJLacSto (резистентная линия) и DBA/2JSto (чувствительная линия) (Л. А. Певницкий, Л. Ю. Телегин, В. Н. Большев, 1977).

При анализе причин обнаруженных различий мы установили, что иммунологические механизмы здесь играют подчинённую роль: сопоставление нормальной реакции мышей разных генотипов на антиген и степени относительной иммунодепрессии показало, что между этими параметрами связи нет. Так, например, при использовании ЭБ в дозе 5108 клеток высота иммунного ответа в контроле была практически одинаковой у мышей исследуемых линий, тогда как показатели относительной иммунодепрессии существенно различались. Следует также отметить, что гены комплекса H-2, по-видимому, не определяют чувствительность (резистентность) к препарату, поскольку мыши контрастных генотипов BALB/c и DBA/2 имеют одинаковый H-2-гаплотип – H-2d (http://jaxmice.jax.org/strain/000651.html и http://jaxmice.jax.org/strain/000671.html). Причину межлинейных различий при иммунодепрессии и иммунологической толерантности следовало искать в особенностях поведения лекарственного препаратаиммунодепрессанта в организме мышей разных генотипов.

Мы исследовали (Л. Ю. Телегин, 1981) следующие маркёрные признаки фармакокинетики и фармакодинамики ЦФ в организме мышей разных линий: особенности метаболизма ЦФ в микросомах клеток печени; фармакокинетику содержания в сыворотке крови активных алкилирующих метаболитов ЦФ; иммунодепрессивное действие на тестклетки ЦФ, активированного in vitro ("активный" постмикросомальный супернатант) и in vivo ("активная сыворотка"); чувствительность иммунокомпетентных клеток селезёнки к иммунодепрессивному влиянию "активной сыворотки".

В результате проведённых исследований было установлено, что для мышей "резистентного" генотипа BALB/c по сравнению с мышами "чувствительной" линии DBA/была характерна более высокая скорость метаболизма ЦФ в печени, большее содержание активных алкилирующих метаболитов в крови, но меньшая чувствительность иммунокомпетентных клеток-мишеней селезёнки. В процессе проведения опытов был обнаружен ранее неизвестный факт отсутствия параллелизма между содержанием активных алкилирующих продуктов метаболизма ЦФ в образцах "активной сыворотки" и её иммунодепрессивным действием в отношении тест-клеток. Тогда была высказана гипотеза, объясняющая это явление, – усиление интактным ЦФ действия своих активных метаболитов – и она нуждалась в экспериментальной проверке.

Цель и задачи исследований. Настоящее диссертационное исследование является логическим продолжением ранее проведённых нами работ. Дальнейшее выяснение меха- 3 низмов действия и особенностей поведения в организме циклофосфамида, объясняющих генетические различия в реакции на этот лекарственный препарат, явилось целью настоящей работы. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Выяснить, сохранятся ли подобные соотношения между мышами линий BALB/c и DBA/2 при использовании в качестве иммунодепрессантов лекарственных препаратов иной структуры и механизма действия (сарколизин, тиофосфамид, цитозинарабинозид, циклоспорин A).

2. Исследовать сравнительную чувствительность иммунокомпетентных клетокмишеней (T- и B-клеток селезёнки) мышей линий BALB/c и DBA/2 к иммунодепрессивному действию ЦФ in vitro.

3. Изучить чувствительность лимфоцитов периферической крови человека к действию ЦФ и тиофосфамида, определить степень изменчивости этого признака, выделить разные типы реакции на химиопрепараты (высоко- и низкореагирующие индивидуумы) и исследовать возможные механизмы различий в чувствительности к иммунодепрессантам.

4. Изучить особенности острого токсического действия ЦФ у мышей BALB/c и DBA/2, обладающих контрастной чувствительностью к иммунодепрессивному действию ЦФ (активность некоторых ферментов метаболизма ЦФ, кинетика токсического метаболита ЦФ, акролеина, кинетические показатели содержания свободных сульфгидрильных групп).

5. Определить уровень репликативного и репаративного синтеза ДНК в спленоцитах интактных мышей BALB/c и DBA/2 как возможного фактора, определяющего разную чувствительность клеток-мишеней мышей данных генотипов к действию ЦФ.

6. В разных экспериментальных условиях подробно исследовать ранее не установленный механизм биологического действия ЦФ, проверив выдвинутую ранее нами гипотезу (Л. Ю. Телегин, 1981) об усилении нативным ЦФ действия собственных активных метаболитов.

Положения, выносимые на защиту:

1. Разработан фармакогенетический подход для выяснения причин разной чувствительности к действию циклофосфамида.

2. Мыши двух линий, для которых характерна неодинаковая чувствительность к иммунодепрессивному действию циклофосфамида in vivo (BALB/cJLacSto – - 4 низкая, DBA/2JSto – высокая), имеют такой же тип чувствительности in vivo и к другим иммунодепрессантам – сарколизину, тиофосфамиду, цитозинарабинозиду и циклоспорину A.

3. Клетки селезёнки мышей линии BALB/cJLacSto обладают более высокой резистентностью к действию циклофосфамида, сарколизина, тиофосфамида и цитозинарабинозида, чем клетки селезёнки мышей линии DBA/2JSto. Таким образом, наблюдается прямая корреляция между степенью чувствительности мышей этих линий к иммунодепрессантам in vivo и степенью подавления иммунной реакции их иммунокомпетентных клеток in vitro.

4. T- и B-клетки селезёнки мышей "резистентной" к циклофосфамиду линии BALB/cJLacSto более устойчивы к иммунодепрессивному действию циклофосфамида in vitro, чем T- и B-клетки селезёнки мышей "чувствительной" к этому иммунодепрессанту линии DBA/2JSto. У мышей обеих линий Tлимфоциты поражаются циклофосфамидом сильнее, чем B-клетки.

5. Существует выраженная фенотипическая изменчивость чувствительности лимфоцитов периферической крови человека к подавлению антипролиферативного потенциала с помощью циклофосфамида и тиофосфамида. Выделены контрастные и промежуточные типы реагирования на данные алкилирующие агенты. Как и в опытах на животных, тип чувствительности клеток сохраняется независимо от вида применённого алкилирующего агента.

6. Признак "тип чувствительности" к действию циклофосфамида и тиофосфамида характеризуется относительным постоянством и не зависит от величины показателя "индекс стимуляции". Отсутствует ассоциация данного признака с фенотипом HLA-A-B-C лимфоцитов.

7. Причина разной чувствительности лимфоцитов периферической крови человека может быть связана с неодинаковой способностью цитозолей лимфоцитов инактивировать исследуемые алкилирующие агенты, что, в свою очередь, может быть обусловлено внутриклеточным балансом тиоловых соединений.

8. Имеются контрастные межлинейные различия у мышей в чувствительности к токсическому действию циклофосфамида при однократном внутрибрюшинном введении циклофосфамида в дозе 350 мг/кг. В печени, крови и селезёнки "высокочувствительных" к токсическому действию циклофосфамида мышей DBA/2JSto обнаружены изменения следующих показателей, отличающиеся от таковых мышей BALB/cJLacSto: более низкая активность в печени изоформы - 5 цитохрома P450, ответственной за активацию циклофосфамида; более низкое содержание в печени интактных мышей SH-групп; бльшая площадь под кривой содержания в печени токсического метаболита циклофосфамида – акролеина; более высокое содержание алкогольдегидрогеназы в крови – маркёра центрилобулярного повреждения печени; в крови выявлено более низкое содержание акролеина, а также было более низким содержание SH-групп; в селезёнке – уровень SH-групп был ниже, а содержание акролеина – выше, чем у BALB/cJLacSto.

9. В спленоцитах интактных мышей DBA/2JSto по сравнению с мышами BALB/cJLacSto отмечается более низкий уровень репликативного и репаративного синтеза ДНК.

10. В трёх экспериментальных системах удалось доказать наличие нового механизма действия циклофосфамида: интактный препарат, неактивный per se, усиливает иммунодепрессивное, антипролиферативное и мутагенное действие своих собственных активных метаболитов.

Научная новизна работы. Использование фармакогенетического подхода позволило впервые выявить генетически контролируемые факторы, их роль и значение в определении степени чувствительности (устойчивости) к действию циклофосфамида. Впервые было показано, что высокая степень чувствительности к действию циклофосфамида определяется сочетанием низкой активности систем активации и инактивации препарата в процессе метаболизма, что обеспечивает феномен усиления циклофосфамидом биологического действия собственных активных метаболитов; низкого содержания свободных сульфгидрильных групп в клетках-мишенях и низкой активностью в них систем репарации повреждений ДНК. Фенотип устойчивости к действию ЦФ in vivo определяется максимальным значением этих показателей. Впервые обнаружено явление усиления циклофосфамидом действия своих собственных активных метаболитов, и существование этого феномена была доказано при исследовании иммунодепрессивного, антипролиферативного и мутагенного действия циклофосфамида.

Практическая ценность работы. Проведённые исследования вносят вклад в понимание механизмов действия циклофосфамида, открывая новые возможности при разработке наиболее эффективных способов подавления пролиферативной реакции клеток при их экстракорпоральной обработке (получен патент РФ № 2393481, зарегистрировано в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 27 июня 2010 г.). Полученные сведения о конкретизации механизмов, с помощью которых реализуются генети- 6 ческие различия в действии иммунодепрессивных и противораковых препаратов, могут быть применены при разработке подходов к персонифицированной медицине, главный принцип которой – "лечить не болезнь, а больного" – был сформулирован знаменитым русским терапевтом Михаилом Яковлевичем Мудровым ещё в 1820 г. в книге "Слово о способе учить и учиться медицине практической": "Я намерен сообщить вам новую истину, которой многие не поверят и которую, может быть, не все из вас постигнут. Врачевание не состоит в лечении болезни... Врачевание состоит в лечении самого больного.… Каждый больной, по различию сложения своего, требует особого лечения, хотя болезнь одна и та же" (цит. по А. Л. Мясников, 1951).

Апробация работы. Результаты работы были доложены на Всесоюзной конференции "Цитохром Р-450 и модификация макромолекул", Ялта, 1989 г.; Всесоюзной конференции "Оценка фармакологической активности химических соединений: принципы и подходы", Москва, 1989 г.; Всесоюзном симпозиуме "Биохимия опухолевой клетки", Минск, 1991 г.; I Съезде иммунологов России, Новосибирск, 1992 г.; I Съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (ВОГИС), Саратов, 20-25 декабря 1994 г.;

Межлабораторной конференции ЦТП ФХФ РАН, 8 сентября 2010 г., Конференции лаборатории биофизической биохимии Гематологического научного центра РАМН, 11октября 2010 г.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 25 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из "Введения", главы "Обзор литературы", раздела "Экспериментальная часть", который содержит главы "Материалы и методы", "Результаты опытов", "Обсуждение экспериментальных данных", глав "Заключение", "Выводы" и списка цитируемой литературы.

Работа содержит 1страниц машинописного текста, 21 таблицу и 26 рисунков. Список литературы включает 247 источников, из них 42 – на русском языке.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Животные. В опытах использовали мышей-самцов инбредных линий BALB/cJLacSto (BALB/c), CBA/CaLacY (CBA) и DBA/2JSto (DBA/2), гибридов (BALB/cJLacSto DBA/2JSto)F1 (CD2F1, собственное выведение в виварии Института медицинской генетики АМН СССР) и самок линии C57BL/6J (обозначения линий приведены согласно Международной стандартной номенклатуре, Staats, 1985). Мыши получали стандартный пищевой рацион вивария и имели свободный доступ к питьевой воде. Для - 7 получение анти-T-сыворотки и анти-B-клеточного глобулина использовали кроликов породы "Советская шиншилла", которых получали из питомника АМН СССР "Светлые горы".

Антиген. В качестве антигена применяли эритроциты барана (ЭБ), взятые стеo рильно в консервант № 7Б и хранившиеся при 4 C. Перед иммунизацией эритроциты трижды отмывали стерильным 0,9 % раствором хлорида натрия или стерильным солевым раствором, забуференном фосфатами (PBS), pH 7,4. В опытах по исследованию иммунодепрессии первичного иммунного ответа ЭБ вводили мышам внутривенно в дозе 51клеток в объёме 0,2 мл. В опытах с адоптивным переносом доза ЭБ составляла 4108 клеток; их вводили либо вместе с клетками селезёнки внутривенно (суммарный объём 1 мл), либо отдельно внутрибрюшинно (0,4 мл).

Иммунодепрессанты. В качестве иммунодепрессантов в работе использовали циклофосфамид (ЦФ, отечественный препарат "Циклофосфан", производство ОАО "Биохимик", Саранск, Россия), мафосфамид (МАФ, циклогексиламиновая соль, D-17272, любезно предоставлен профессором Norbert Brock и доктором Jrg Pohl, фирма Asta Medica, Германия), сарколизин (СЛ, синтезирован в химико-технологической лаборатории Всесоюзного онкологического научного центра АМН СССР, любезно предоставлен к. б. н. Т. А. Сидоровой), тиофосфамид (ТиоТЭФ, синтезирован во Всесоюзном научноисследовательском химико-фармацевтическом институте им. С. Орджоникидзе, любезно предоставлен проф. Л. Н. Филитисом), цитозинарабинозид (ЦА, препарат "Cytosar", фирма Upjohn, Бельгия), циклоспорин A (ЦсА, препарат "Sandimmun", Novartis, Швейцария). Все препараты (кроме мафосфамида, который использовали только в экспериментах in vitro) вводили животным внутрибрюшинно, по весу, растворёнными в дистиллированной воде или стерильном физиологическом растворе.

Метод определения антителообразующих клеток (АОК) в селезёнке мышей.

Высоту первичного иммунного ответа оценивали на 4 или 5 сутки после иммунизации в зависимости от условий опыта. Число АОК в селезёнке животных определяли при помощи "прямого" метода локального гемолиза в геле (Jerne & Nordin, 1963). Методика постановки реакции детально описана в работах отечественных авторов (Л. А. Певницкий и соавт., 1965; В. М. Писарев, 1980; Л. Ю. Телегин, 1981).

Методика активации циклофосфамида in vivo. Так как в отличие от других алкилирующих агентов ЦФ in vitro не обладает биологической активностью в нативном состоянии, то в опытах по изучению его действия на клетки in vitro, помимо МАФ, использовали "активированную" форму ЦФ, т. е. активные метаболиты, содержащиеся в сыво- 8 ротке крови животных, которым вводили ЦФ (Л. Ю. Телегин, 1979). С этой целью мышам линии BALB/c инъецировали внутрибрюшинно 200 мг/кг ЦФ, через 30 мин их забивали и получали так называемую "активную сыворотку", которую использовали в день постановки опыта. В опытах по изучению чувствительности лимфоцитов человека к действию ЦФ полученную "активную сыворотку" подвергали стерилизующей фильтрации и хранили не более 3 дней до начала опыта согласно рекомендациям Weaver и соавт.

(1978). Содержание алкилирующих метаболитов в образцах "активной сыворотки" определяли с помощью NBP-теста, предложенного Epstein с соавт. (1955) и основанного на взаимодействии 4-(п-нитробензил)пиридина (NBP) с алкилирующими группами при температуре 80-100 C. Использовали модификацию (О. П. Кириченко и др., 1976) методики, описанной Friedman & Boger (1962). Результаты выражали в единицах оптической плотности на мл пробы.

Методы исследования действия иммунодепрессантов in vitro. Действие на общую популяцию клеток селезёнки мышей. Из селезёнок мышей готовили клеточную взвесь в среде 199 (Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов, Москва, Россия) с антибиотиками (по 100 ед. пенициллина и стрептомицина на 1 мл). Взвесь инкубировали с исследуемыми агентами – "активной сывороткой", СЛ, ТиоТЭФ или МАФ в течение часа при 37 C. В 1 мл инкубационной смеси содержалось 1,25108 клеток селезёнки и соответствующее количество иммунодепрессанта: 0,5 мл "активной сыворотки", 6 мкг СЛ, 12,5 мкг ТиоТЭФ или 1,5 мкг МАФ. Эти концентрации иммунодепрессантов (кроме МАФ) были подобраны эмпирически с целью получения одинаковой степени подавления иммунной реакции клеток мышей одной линии (BALB/c). Концентрация МАФ подавляла на 50 % иммунный ответ спленоцитов мышей линии CBA, поэтому и была использована для сравнительного анализа. После инкубации клетки отмывали однократно охлаждённой до 4 C средой 199 и вводили внутривенной сингенным мышам-реципиентам в количестве 5107 вместе с ЭБ. Реципиенты за 3-4 часа до введения клеток получали внутрибрюшинно 200 мг/кг ЦФ для подавления их собственной иммунореактивности. Такая обработка мышей-реципиентов эквивалентна сублетальному облучению и обеспечивает их иммунологическую ареактивность до 6 дней, что позволяет в течение этого срока оценивать иммунный ответ донорских клеток, обработанных различными агентами (Г. К. Баймуканова, Н. Н. Смирнова, 1977). Через 5 дней после переноса определяли число АОК в селезёнке реципиентов.

Действие на T- и B-клетки. В опытах по изучению влияния "активированного" ЦФ на субпопуляции клеток селезёнки (T- и B-лимфоциты) была использована методика, - 9 в своих основных чертах аналогичная применённой ранее при изучении иммунологической компетенции Т- и В-клеток при толерантности, индуцированной при помощи ЦФ (Л. Н. Фонталин и др., 1976).

Влияние на пролиферацию T-клеток селезёнки. Для оценки пролиферации мышиных Т-клеток селезёнки использовали планшеты с адсорбированными антителами против CD3-рецептора Т-клеток (Biocoat anti-mouse CD3 T-cell activation plate, Becton Dickinson, Labware, Bedford, MA, США). Поскольку полноценная активация T-клеток посредством антител к CD3 нуждается в дополнительных стимулах, опосредуемых молекулами межклеточного взаимодействия, в качестве отвечающих клеток использовали неочищенные спленоциты, содержащие вспомогательные клетки, которые экспрессируют LFA-3 и другие костимулирующие молекулы. После лизиса эритроцитов раствором NH4CL спленоциты отмывали дважды в изотоническом солевом растворе, забуференном фосфатами, и инкубировали при концентрации 107 клеток в 1 мл с ЦФ (1000 мкг/мл), о МАФ (разные концентрации) или в их комбинации в течение 1 часа при 37 C. Контрольные клетки инкубировали без препаратов. Инкубацию прекращали добавлением холодной среды, содержащей 10 % эмбриональной телячьей сыворотки, трижды отмывали и переносили в планшеты с антителами к CD3. Клетки инкубировали 72 часа в объёме 2мкл. За 8 часов до окончания культивирования в лунки добавляли 1 мкKu H-тимидина.

Клетки переносили на фильтры с помощью автоматического харвестера (сборщика) клеток и определяли уровень радиоактивной метки с помощью радиоспектрометрии лизата клеток, взятого из каждой лунки. По уровню включения радиоактивной метки судили о степени пролиферации клеток. Результаты выражали в имп./мин.

Оценка иммунодепрессивного действия препаратов на лимфоциты человека.

Лимфоциты из периферической крови (ЛПК) здоровых доноров обоего пола (51 человек) выделяли по методу Byum (1968). Затем лимфоциты от каждого донора в количестве 2106 инкубировали с разными концентрациями "активной сыворотки" или ТиоТЭФ о (объём инкубационной смеси составлял 1 мл) в течение 1 часа при 37 C. Затем клетки о трижды отмывали центрифугированием в охлаждённой до 4 C средой 199 и оценивали их способность реагировать на митоген фитогемагглютинин (ФГА, производство Difco, США) в реакции бласттрансформации (РБТ). Методика постановки РБТ детально описана в работе Л. Н. Веремко (1983).

Определение фенотипа HLA (HLA-A, HLA-B и HLA-C) ЛПК исследуемых доноров. Типирование HLA-антигенов на поверхности ЛПК исследуемых лиц проводили - 10 при помощи лимфоцитотоксического теста (Terasaki et al., 1978). Характеристика панели антисывороток и ход типирования детально описаны в работе Л. Н. Веремко (1983).

Получение цитозолей из ЛПК человека. ЛПК (концентрация клеток в суспензии – 2106 в 1 мл) разрушали с помощью ультразвукового дезинтегратора "MSE" (Великобритания) в ледяной бане (режим работы дезинтегратора – "med-3") в течение 1 мин. Полученный гомогенат затем центрифугировали при 105000 g (центрифуга LP-50, Beckman, о Австрия) в течение 1 час при 4 C. После удаления поверхностной жировой плёнки суо пернатант подвергали стерилизующей фильтрации и хранили при 0 C не более 48 часов.

Получение S9-фракции клеток печени и селезёнки и микросом клеток печени мышей. Выделение S9-фракции (постмитоходриальный супернатант) из печени и селезёнки и получение микросомальной фракции из гепатоцитов получали согласно методике, описанной И. И. Карузиной и А. И. Арчаковым (1977).

Определение относительного содержания группы изоформ цитохромов P450В в печени мышей. Теоретические предпосылки и обоснование метода были представлены в работах (М. В. Изотов и др., 1986; Honkakoski et al., 1992). Цитохромы P-450В определяли по способности комплекса ксантиноксидаза-менадион восстанавливать цитохром P-450 в анаэробных условиях (Izotov et al., 1988).

Определение активности алкогольдегидрогеназы (ADH). Определяли активность алкогольдегидрогеназы класса 1 (мышиный аналог – Adh1). Использовали этанол в качестве субстрата, окисление которого под действием фермента сопровождается восстановлением НАД, что регистрируется спектрофотометрически по увеличению оптической плотности при 340 нм. Использовали методику, описанную П. Л. Вульфсоном и соавт. (1989).

Определение активности альдегиддегидрогеназы (ALDH). Активность цитозольной ALDH у мышей (ALDH1A1) определяли по методике, описанной в работе (Hipkens, Struck & Gurtoo, 1981).

Определение содержания свободных сульфгидрильных групп. Использовали колориметрический метод определения с помощью 5,5'-дитиобис(2-нитробензойной) кислоты (реактив Эллмана) согласно методике, описанной И. В. Верёвкиной и соавт.

(1977).

Определение акролеина. Определение содержания акролеина в плазме крови и S9-фракциях печени и селезёнки мышей определяли по методу Аларкона (Alarcon, 1968).

Методика определения уровня репликативного и репаративного синтеза ДНК в спленоцитах мышей. В 1968 г. Evans & Norman обнаружили, что ультрафиолетовое - 11 облучение (УФО) ЛПК человека стимулирует включение H-тимидина в ДНК в присутствии оксимочевины, но в отсутствие этого мутагена процесс включения радиоактивной метки ингибируется. Это свидетельствует о том, что УФО подавляет репликативный синтез ДНК и стимулирует относительно нечувствительный к влиянию оксимочевины репаративный синтез ДНК. На основании этого факта Nordenskjld et al. (1978) разработали методику оценки уровня репликации и репарации ДНК, которую и использовали в настоящей работе.

Метод оценки мутагенного действия циклофосфамида, мафосфамида и их комбинации. Поскольку биологическое действие ЦФ в организме и, в частности, его иммунодепрессивный эффект обусловлены алкилированием ДНК, мы изучали мутагенное действие (индукцию хромосомных аберраций) комбинации ЦФ и МАФ на лимфоциты периферической крови человека. Условия культивирования клеток, полученных от здорового донора, приготовление и окраска препаратов (рутинное окрашивание) и их микроскопический анализ были общепринятыми (Hungerford, 1965).

Статистическая обработка результатов опытов. При статистической обработке экспериментальных данных использовали методы и критерии параметрической и непараметрической статистики (критерий t Фишера-Стьюдента, критерий 2, коэффициент корреляции рангов Спирмена; В. Л. Вознесенский, 1969; Е. В. Гублер и А. А. Генкин, 1973; Л. Закс, 1976; В. С. Пугачёв, 1979). Достоверными считали различия при P 0,05.

В опытах на животных при изучении действия иммунодепрессантов основным показателем иммунного ответа было число АОК в селезёнке после иммунизации или переноса клеток вместе с антигеном. Поскольку накопление АОК в селезёнке мышей, иммунизированных ЭБ, подчиняется логарифмически нормальному распределению (Л. А.

Певницкий, 1973б; Wigzell, 1966), вычисляли среднюю геометрическую числа АОК.

При проведении анализа совокупности данных экспериментов по исследованию чувствительности ЛПК разных доноров к действию активированного ЦФ и ТиоТЭФ с целью её разбиения на однородные группы мы использовали критерий однородности U(2) Кильдишева и Аболенцева (1978), величину которого сравнивали с критическим значением 21, 0,99 = 6,63 при уровне значимости = 0,01 и одной степени свободы.

Для построения графиков использовали программу SigmaPlot версии 8.0 (США).

РЕЗУЛЬТАТЫ ОПЫТОВ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Чувствительность мышей разных линий к иммунодепрессивному действию циклофосфамида, сарколизина и тиофосфамида in vivo. Определяли степень подавления ЦФ, СЛ и ТиоТЭФ гуморального первичного иммунного ответа на ЭБ. В предвари- 12 тельных опытах, проведённых на мышах линии BALB/c (данные не представлены), были подобраны такие дозы СЛ и ТиоТЭФ, которые давали иммунодепрессивный эффект, сопоставимый с эффектом доз ЦФ, при которых различия между BALB/c и DBA/2 были наиболее выражены (Л. А. Певницкий, Л. Ю. Телегин, В. Н. Большев, 1977) – 50, 25 и 12,5 мг/кг. Для СЛ эти дозы были равны 8, 4 и 2 мг/кг, для ТиоТЭФ – 16,8 и 4 мг/кг. Препараты в указанных дозах вводили животным внутрибрюшинно спустя 1 сутки после иммунизации 5•108 ЭБ. Пути введения антигена и иммунодепрессантов различались, согласно рекомендациям Berenbaum (1979). На 4 день после иммунизации в селезёнке определяли число АОК. Результаты экспериментов представлены в табл. 1-3.

Таблица 1. Чувствительность мышей BALB/c и DBA/2 к иммунодепрессивному действию циклофосфамида Линия Доза Но- Число Средние и (в скобках) P мышей ЦФ, мер мышей 95%-ые доверительные мг/кг груп- интервалы числа АОК, пы %% от контроля BALB/c 50 1 13 0,05 (0,03 0,07) P1-4 = 0,25 2 13 8,3 (6,0 11,4) P2-5 < 0,0012,5 3 13 57,7 (51,5 64,7) P3-6 < 0,00DBA/2 50 4 12 0,04 (0,02 0,05) 25 5 14 0,20 (0,14 0,30) 12,5 6 14 13,2 (8,5 20,4) Таблица 2. Чувствительность мышей BALB/c и DBA/2 к иммунодепрессивному действию сарколизина Линия Доза Номер Число Средние и (в скобках) P мышей СЛ, группы мышей 95%-ые доверительные мг/кг интервалы числа АОК, %% от контроля BALB/c 8 1 23 1,9 (1,3 2,8) P1-4 < 0,004 2 24 25,3 (21,0 30,4) P2-5 < 0,002 3 24 59,9 (51,5 64,7) P3-6 < 0,00DBA/2 8 4 12 0,05 (0,03 0,08) 4 5 13 1,5 (0,9 2,4) 2 6 13 18,2 (14,1 23,4) - 13 Таблица 3. Чувствительность мышей BALB/c и DBA/2 к иммунодепрессивному действию тиофосфамида Линия Доза Тио- Но- Число Средние и (в скобках) P мышей ТЭФ, мг/кг мер мы- 95%-ые доверительные груп- шей интервалы числа АОК, пы %% от контроля BALB/c 16 1 22 0,08 (0,05 0,12) P1-4 > 0,8 2 24 11,7 (8,4 16,4) P2-5 < 0,004 3 23 51,5 (45,3 58,6) P3-6 = 0,00DBA/2 16 4 11 0,07 (0,04 0,13) 8 5 12 2,1 (1,0 4,5) 4 6 13 34,1 (23,7 49,1) При анализе представленных в таблицах данных можно сделать вывод, что независимо от вида применяемого иммунодепрессанта мыши линии BALB/c оказываются наиболее резистентными к подавлению иммунной реакции, а мыши линии DBA/2 – наиболее чувствительными.

Чувствительность мышей BALB/c и DBA/2 к иммунодепрессивному действию цитозинарабинозида и циклоспорина A in vivo. На этом этапе работы мы попытались выяснить, сохранятся ли различия в чувствительности у мышей контрастных по реакции на алкилирующие агенты генотипов при использовании иммунодепрессантов иной структуры и иного механизма действия. Мы исследовали цитозинарабинозид (ЦА) – аналог пиримидиновых оснований нуклеиновых кислот, ингибитор ДНК-полимеразы и циклоспорин A (ЦсА, полипептидный продукт метаболизма грибов), селективное действие которого направлено на T-лимфоциты, продуцирующие лимфокины. Результаты опытов представлены на рис. 1.

- 14 Рисунок 1. Влияние ЦА (а) и ЦсА (б) на первичный иммунный ответ мышей линии BALB/c и DBA/По оси абсцисс – доза препарата (в мг/кг), по оси ординат – величина иммунного ответа (в %% от контроля, принятого за 100, логарифмическая шкала). 1 – контроль (мыши, получившие только ЭБ); 2 – мыши линии BALB/c (ЭБ + иммунодепрессант); 3 – мыши линии DBA/2 (ЭБ + иммунодепрессант). Представлены средние геометрические величины с доверительными интервалами при p = 0,05 (по данным 3 опытов, 11-животных на каждую точку кривых).

Как видно на рисунке (а), ЦА в диапазоне использованных доз ингибировал иммунную реакцию мышей DBA/2 существенно сильнее, чем мышей BALB/c (3,5-8-кратная разница в степени подавления). ЦсА (б) в дозе 15 мг/кг не влиял на величину иммунного ответа животных. В дозе 40 мг/кг препарат не только не снижал, но даже несколько усиливал (P = 0,04) иммунную реакцию мышей BALB/c по сравнению с контролем; у мышей линии DBA/2 иммунная реакция была снижена почти вдвое (при сравнении с контролем P = 1,8 • 10-4, при сравнении с мышами линии BALB/c P < 1 • 10-4). В дозе 100 мг/кг ЦсА достоверно снижал иммунный ответ мышей обеих линий, причём подавление реакции у мышей линии DBA/2 было сильнее, чем у мышей BALB/c (3,3-кратное различие, P = 0,002).

Чувствительность иммунокомпетентных клеток селезёнки к алкилирующим агентам у мышей BALB/c и DBA/2. В предварительных опытах по изучению действия иммунодепрессантов на клетки селезёнки in vitro были подобраны такие концентрации веществ, которые вызывали бы умеренное подавление ответа у мышей линии BALB/c (до 10-40 % контрольного уровня). Эта степень иммунодепрессии позволила бы определить - 15 как более, так и менее выраженное подавление иммунной реакции клеток мышей исследуемых генотипов. Другими словами, позволило бы более корректно провести сравнительный анализ. Для ЦФ такая концентрация составила 0,5 мл "активной" сыворотки в мл инкубационной смеси (см. раздел "Материалы и методы"), для СЛ – 2 мкг/мл, ТиоТЭФ – 12,5 мкг/мл. Результаты проведенных опытов представлены в табл. 4.

Таблица 4. Чувствительность спленоцитов мышей BALB/c и DBA/2 к циклофосфамиду, сарколизину и тиофосфамиду Линия мышей P Препарат BALB/c DBA/P < 0,00ЦФ 13,1 1,(9,1 19,0) (0,8 2,4) n = 12 n = СЛ 37,6 8,2 P < 0,00(26,9 52,6) (4,3 15,4) n = 27 n = ТиоТЭФ 17,8 6,5 P = 0,0(9,1 34,7) (4,4 9,5) n = 33 n = Примечание. Здесь и в табл. 5 и 6 представлены средние геометрические числа антителообразующих клеток в селезёнке мышей, выраженные в процентах к контролю, и 95 % доверительные интервалы (в скобках); n – число животных в группе.

Чувствительность спленоцитов BALB/c и DBA/2 к иммунодепрессивному действию цитозинарабинозида. В следующей серии опытов определяли, коррелируют ли найденные различия между мышами оппозитных линий с чувствительностью их иммунокомпетентных клеток к ЦА. В противоположность ЦФ ЦА оказывает иммунодепрессивное действие лишь при введении в первые дни после иммунизации, то есть преимущественно влияет на стимулированные антигеном активно пролиферирующие клетки (Makinodan at al., 1970). Поэтому инкубация клеток с ЦА in vitro с последующим их введением вместе с антигеном мышам-реципиентам (как это было в опытах, изложенных в разделе 3.3.) не создаёт оптимальных условий для проявления иммунодепрессивного эффекта ЦА. В связи с этим определение влияния ЦА на иммунокомпетентные клетки проводили в системе адоптивного полусингенного переноса. С этой целью клетки селезёнки мышей в количестве 50 млн. вместе с ЭБ (5•108 клеток) вводили мышам-реципиентам, - 16 предварительно за 3-4 часа до клеточного переноса, получавшим 200 мг/кг ЦФ для подавления их собственной иммунореактивности (см. главу "Материалы и методы"). Через двое суток после переноса реципиентам внутрибрюшинно вводили 25 мг/кг ЦА и через три дня (то есть через 5 суток после иммунизации) определяли число АОК селезёнки реципиентов. Чтобы исключить возможное влияние на эффект препарата особенностей фармакокинетики и фармакодинамики ЦА в организме мышей-реципиентов в системе сингенного переноса (DBA/2 DBA/2, BALB/c BALB/c), в этих опытах в качестве реципиентов мы использовали мышей-гибридов этих линий (BALB/c DBA/2)F1 (CD2F1).

По этой же схеме для сравнения были приведены опыты с применением в качестве иммунодепрессанта ЦФ (25 мг/кг). Результаты опытов представлены в табл. 5.

Таблица 5. Влияние цитозинарабинозида и циклофосфамида на иммунный ответ клеток селезёнки мышей BALB/c и DBA/2 в адоптивном переносе ЦА ЦФ Группа BALB/c DBA/2 P BALB/c DBA/2 P Контроль- 100 100 100 1ная (76,9 (78,3 (67,0 (72,4 130,0) 127,7) – 149,3) 138,0) – n = 12 n = 12 n = 12 n=Опытная 26,4 7,8 0,0001 2,8 0,7 0,00(19,1 36,6) (4,6 13,2) (1,6 4,9) (0,3 1,5) n = 15 n = n=13 n=Как показывают данные табл. 5, иммунный ответ трансплантированных клеток (как DBA/2, так и BALB/c) ЦФ подавлял примерно в 10 раз сильнее, чем ЦА, однако оба этих препарата значительно более эффективно ингибировали реакцию клеток мышей DBA/2 по сравнению с таковой мышей BALB/c.

Таким образом, независимо от вида применяемого иммунодепрессанта мыши линии BALB/c оказываются наиболее резистентными к подавлению иммунного ответа, мыши линии DBA/2 наиболее чувствительными. Эта закономерность была справедлива как в опытах in vivo, так и при исследовании чувствительности иммунокомпетентных клеток-мишеней. Что же могло быть общего у этих препаратов при взаимодействии с разными органами и системами организма мышей указанных генотипов? Обращаясь к - 17 данным литературы, мы обнаружили, что у исследуемых в настоящей работе иммунодепрессантов общим свойством является возможность их инактивации с помощью SHгрупп (Adams et al., 1985; Dirven et al., 1996; Backway et al., 1997; Palomero et al., 2001;

Hagar, 2004). Именно этим обстоятельством может объясняться разная степень чувствительности мышей BALB/c и DBA/2 к иммунодепрессивному действию агентов разной структуры и механизмов действия. Другими словами, независимо от исходной структуры и фармакокинетики применённых в нашей работе препаратов тип чувствительности in vivo животных разных генотипов к иммунодепрессивному действию всех препаратов сохраняется. Из этого следует, что главный генетически контролируемый признак, с которым могут быть связаны различия в иммунодепрессивном эффекте исследуемых агентов, следует искать на уровне взаимодействия иммунодепрессанта с мишенями (клетками и/или молекулами). Также результаты первых пяти опытов позволяют сделать заключение о том, что именно чувствительность иммунокомпетентных клеток есть тот генетически контролируемый признак, который если и не является единственным в определении степени чувствительности или резистентности иммунной реакции мышей разных линий к ЦФ, то, во всяком случае, играет существенную роль. Для более детального изучения механизмов генетических различий в чувствительности к ЦФ на клеточном уровне нами было исследовано влияние ЦФ на T- и B-клетки мышей BALB/c и DBA/2.

Влияние циклофосфамида на T- и B-клетки селезёнки мышей BALB/c и DBA/2. В этих экспериментах была использована методика (Л. Н. Фонталин и др., 1976), принцип которой состоит в том, что к клеткам, обработанным ЦФ in vitro, добавляли интактные T-и B-клетки. По степени восстановления иммунной реакции судили о преимущественном поражении ЦФ T- и B-лимфоцитов. Контролем служили мыши, получившие нормальные, ничем не обработанные клетки селезёнки (Н-клетки), или клетки селезёнки, обработанные одним из сывороточных препаратов: а) "активной сывороткой" – ЦФклетки; б) анти-T-клеточной сывороткой – В-клетки; в) анти-B-клеточным глобулином – Т-клетки, соответственно. На 5 день после переноса клеток и иммунизации в селезёнке реципиентов определяли число АОК. О степени восстановления иммунной реакции судили, сравнивая содержание АОК в селезёнке реципиентов опытных и перечисленных контрольных групп. Результаты представлены в табл. 6.

- 18 Таблица 6. Влияние добавления T-клеток и B-клеток на реакцию спленоцитов, обработанных активированным in vivo циклофосфамидом Группа BALB/c DBA/Н-клетки 100 1(контроль) (82,2 121,6) (71,6 139,6) n = 22 n = ЦФ-клетки 35,3 10,(31,2 39,9) (8,1 14,6) n = 22 n = ЦФ-клетки 80,7 18,+ (59,2 109,8) (13,2 24,6) T-клетки n = 24 n = ЦФ-клетки 56,5 18,+ (42,2 75,5) (11,6 28,3) B-клетки n = 23 n = Оказалось, что подавление антителообразующей функции клеток селезёнки ЦФ значительно менее выражено у мышей линии BALB/c, чем у мышей линии DBA/2 (соответственно до 35,3 и 10,8% от контрольного уровня, P < 0,0001), что согласуется с ранее полученными данными. У мышей линии BALB/c иммунный ответ клеток, обработанных ЦФ (ЦФ-клеток), достоверно повышает добавление как Т-, так и В-клеток, причём более выраженный эффект дают Т-клетки: число АОК достоверно не отличается от их уровня в контроле (P = 0,4). У мышей линии DBA/2 частичное восстановление иммунной реакции ЦФ-клеток обеспечивают Т-клетки, в то время как добавление В-клеток даёт граничный эффект (при сравнении с ЦФ-клетками – P = 0,054 по критерию t, достоверное различие выявляет лишь критерий U, P = 0,017). Полученные данные позволяют сделать вывод, что у мышей обеих линий ЦФ поражает как Т-, так и В-клетки с преимущественной ингибицией Т-клеток. У мышей линии BALB/c, обладающих большей резистентностью к действию ЦФ, интактные Т- и В-клетки способны полностью или значительно восстанавливать иммунную реакцию клеток, подвергнутых обработке иммунодепрессантом, тогда как у мышей линии DBA/2, высокочувствительных к действию ЦФ, Т- и В-клетки восстанавливают иммунный ответ в меньшей степени. Полученные результаты, на наш взгляд, представляют интерес в нескольких аспектах.

- 19 Во-первых, они показывают, что как T-, так и B-клетки мышей линии DBA/2 более чувствительны к активным метаболитам ЦФ, чем клетки мышей линии BALB/c, что отражает различия в чувствительности клеток селезёнки в целом.

Во-вторых, у мышей обеих линий T-клетки оказались более чувствительными к действию ЦФ, чем B-клетки. Эти результаты соответствуют данным Shand (1978), полученным в сходных по своей постановке опытах по изучению действия ЦФ, активированного in vitro, на функцию T- и B-клеток селезёнки мышей. Shand оценивает полученные им результаты с осторожностью, указывая, что условия взаимодействия метаболитов ЦФ с клетками in vitro могут отличаться от таковых in vivo. Тем не менее, наши и литературные данные свидетельствуют о большей чувствительности T-клеток к ЦФ и in vivo. Так, было показано, что при комбинированном введении мышам ЭБ и ЦФ (напр., при индукции толерантности) регистрируется, как правило, более глубокое угнетение функции Tлимфоцитов (Л. А. Певницкий, 1973а; Л. Н. Фонталин и соавт., 1976; Miller & Mitchell, 1970). Важнейшей для интерпретации различий в чувствительности T- и B-клеток в наших экспериментальных условиях является работа Noelle и Lawrence (1981), где, в частности, было показано, что исходное содержание GSH в T- и B-спленоцитах мышей CBA не различалось, однако, по мере инкубации в фосфатно-солевом буфере при 37 C только в B-клетках уровень GSH возрастал и становился достоверно выше такового T-клеток, не изменяясь на протяжении всего периода инкубации (120 мин). В наших опытах клетки селезёнки мышей BALB/c и DBA/2 обрабатывали "активной сывороткой" в течение 1 часа, поэтому мы не исключаем того, что более высокая чувствительность T-клеток по сравнению с B-клетками к действию ЦФ in vitro обусловлена как раз низким содержанием в них GSH.

Таким образом, результаты данного раздела нашей работы показывают, что различия в чувствительности к ЦФ у мышей линий BALB/c и DBA/2 не связаны с преимущественным поражением какой-либо субпопуляции лимфоидных клеток у мышей одной линии или резистентностью этой субпопуляции у мышей другой линии. При наличии разницы в чувствительности между T- и B-клетками и те и другие у мышей линии BALB/c более резистентны к ЦФ, чем у мышей линии DBA/2.

Обнаруженный нами факт существования генетических различий в чувствительности иммунокомпетентных клеток-мишеней к алкилирующим иммунодепрессантам (ЦФ и ТиоТЭФ) явился отправным пунктом для проведения следующей части работы:

изучение чувствительности лимфоцитов человека к действию ЦФ и ТиоТЭФ. Целью исследования было определение степени фенотипической изменчивости этого признака, - 20 попытка выделить разные типы реакции на эти химиопрепараты и, по возможности, определить механизмы предполагаемой разной чувствительности лимфоцитов.

Чувствительность лимфоцитов периферической крови (ЛПК) человека к действию активированного in vivo циклофосфамида и тиофосфамида. Исследования проводили на ЛПК 51 здорового донора обоего пола в возрасте от 18 до 55 лет. Лимфоциты инкубировали с разными концентрациями "активной" сыворотки или ТиоТЭФ. Далее клетки отмывали и в культуре оценивали степень угнетения их реакции бласттрансформации (РБТ), индуцированной фитогемагглютинином (ФГА). В предварительных экспериментах с помощью теста окраски лимфоцитов трипановым синим было показано, что оба алкилирующих агента в исследуемых концентрациях не обладали прямым лимфоцитотоксическим действием. Результаты выражали в процентах подавления пролиферации по сравнению с контролем. При статистической обработке полученных экспериментальных данных был проведён анализ исходной генеральной совокупности – многомерная группировка данных с целью её разбиения на однородные группы. Многомерная группировка – это группировка, выполненная по нескольким группировочным признакам одновременно. В нашем случае такими признаками являются тип реакции на препарат и зависимость этой реакции от концентрации ЦФ или ТиоТЭФ. Разбиение данных на однородные группы проводили по методу Кильдишева и Аболенцева (1978) с помощью критерия однородности показателей U(2). Группировку данных проводили по той концентрации препарата, где наблюдалась наибольшая вариабельность результатов. Самым важным итогом проведённых экспериментов, представленных в этом разделе, является тот факт, что, как и в опытах на животных, доноров ЛПК можно разделить по однородности показателей на разные типы чувствительности (резистентности) к действию ЦФ и ТиоТЭФ. Причём тип реакции на ЦФ совпадает с таковым на действие ТиоТЭФ. Популяционная частота фенотипа "сверхнизкий тип чувствительности" как для ЦФ, так и для ТиоТЭФ составила 9,8 %. Частота фенотипа "сверхвысокий тип чувствительности" для ЦФ была равна 11,8 %, для ТиоТЭФ – 7,8 %. Следует также подчеркнуть, что принадлежность к типам чувствительности является стойким признаком. При постановке повторного контрольного эксперимента, где одновременно исследовали чувствительность лимфоцитов донора А.В. ("сверхнизкий" тип чувствительности к действию ЦФ и "средний" к действию ТиоТЭФ) и донора Л.С. ("высокий" тип при действии ЦФ и "сверхвысокий" – при действии ТиоТЭФ) принадлежность к указанным типам чувствительности сохранилась. Обнаруженная изменчивость признака чувствительности лимфоцитов человека к действию алкилирующих агентов не была связана с величиной показателя "индекс - 21 стимуляции" (отношение уровня пролиферации лимфоцитов после митогенного стимула к уровню спонтанной пролиферации в контрольных культурах), что объясняется схемой проведения опытов: митогенный стимул (ФГА) давали уже после обработки клеток препаратами и последующего их удаления из среды инкубации. В литературе имеются единичные сообщения о связи чувствительности к лечению ЦФ с HLA-фенотипом. Так, Trompeter et al. (1980) установили наличие ассоциации между реакцией на ЦФ и носительством антигена HLA-B12 у детей, больных формой нефротического синдрома, чувствительной к лечению кортикостероидами. Позднее, в работе Marincola et al. (1992) была отмечена повышенная частота встречаемости антигена HLA-A11 у больных меланомой, "отвечающих" на комбинированную терапию интерлейкином 2 и ЦФ. В наших исследованиях корреляция с HLA-фенотипом показателя "тип чувствительности " к ЦФ и ТиоТЭФ отсутствовала.

Возможные причины различий в индивидуальной чувствительности лимфоцитов человека к действию алкилирующих агентов. Была проведена серия опытов по изучению инактивирующей способности цитозолей, полученных из лимфоцитов лиц с контрастной чувствительностью, в отношении активных метаболитов ЦФ. Методические особенности выделения цитозолей из лимфоцитов гарантировали отсутствие в них ядер, митохондрий и обрывков эндоплазматического ретикулума печени, что исключало возможность "доактивации" неметаболизированного ЦФ, присутствующего в образцах "активной" сыворотки. Цитозоль получали из клеток донора М.Ф. ("сверхнизкий" тип чувствительности к действию ЦФ) и донора Л.С. ("сверхвысокий" тип чувствительности).

Далее цитозоль объёмом 1 мл (получен из 2106 лимфоцитов) инкубировали с "активной" сывороткой (0,2 ед. оптической плотности/мл) или 25 мкг/мл ТиоТЭФ и 1,36 мкМ НАД+ в течение 1 часа при 37 C и затем в инкубационную смесь (её общий объём составлял мл) добавляли лимфоциты (в 0,1 мл среды 199) в количестве 2106, полученные от донора со "средним" типом чувствительности, и инкубировали ещё 1 час в тех же условиях.

Затем клетки отмывали и оценивали РБТ тест-клеток по сравнению с контролем (инкубация "активной" сыворотки или ТиоТЭФ со средой). Было проведено 2 серии экспериментов, в результате которых было обнаружено, что цитозоль донора М.Ф. ("сверхнизкий" тип чувствительности к ЦФ и ТиоТЭФ) в значительно большей степени подавлял действие "активной" сыворотки, чем цитозоль донора Л.С. ("сверхвысокий" тип чувствительности к обоим препаратам): уровень пролиферации по сравнению с группой "активная сыворотка" (100 %) после обработки цитозолем донора М.Ф. составил 244 ± 11 % (n = 10), после обработки цитозолем донора Л.С. – 79 ± 2,5 % (n = 10); для ТиоТЭФ эти по- 22 казатели были равны, соответственно, 166 ± 3 % (n = 10) и 115 ± 5 % (n = 10). Различия в инактивации действия ЦФ и ТиоТЭФ были высокодостоверны. В результате этих экспериментов была обнаружена инактивирующая способность цитозолей в отношении как активированного in vivo ЦФ, так и ТиоТЭФ, хотя в отношении последнего эффект инактивации был менее выражен. Наиболее вероятным объяснением фенотипического полиморфизма признака чувствительности ЛПК к действию ЦФ и ТиоТЭФ являются возможные различия в содержании тиоловых соединений в клетках-мишенях. Так, Hohorst и соавт. (1976) показали возможность реакции 4-OH-ЦФ с GSH, что приводило к образованию 4-(S-R)-меркапто-ЦФ в физиологических условиях pH и температуры. Взаимодействие со свободными сульфгидрильными группами белков также приводило к фиксации на макромолекулах активных метаболитов ЦФ. Сходные данные были получены Lee (Lee, 1991; Lee et al., 1991): стабилизация 4-OH-ЦФ в водном растворе, содержащим высокие концентрации GSH; рост цитотоксичности 4-OOH-ЦФ (синтетический предшественник 4-OH-ЦФ) при удалении GSH из клеток рака молочной железы человека SKOV-3; при тестировании 4-OOH-ЦФ на 19 человеческих и 3 мышиных линиях опухолевых клеток резкое угнетение опухолевого роста сопровождалось истощением внутриклеточного GSH и vice versa. Возможность инактивации акролеина с помощью GSH описана в обзоре литературы Kehrer & Biswal (2000). В своей монографии О. С. Франкфурт (1976) приводит данные Д. П. Лея и др. (1973) о том, что "в карциноме Герена, резистентной к ЦФ, количество небелковых SH-групп не изменялось, но после введения препарата содержание SH-групп уменьшалось только в чувствительных клетках". Таким образом, результаты опытов, представленных в этом разделе диссертации, позволяют сделать вывод, что в основе фенотипической изменчивости признака чувствительности лимфоцитов человека к действию ЦФ и ТиоТЭФ может лежать способность цитозолей лимфоцитов инактивировать действие данных алкилирующих агентов, что, в свою очередь, может быть обусловлено разным содержанием в цитоплазме свободных и связанных сульфгидрильных групп.

Подводя общий итог результатов исследования особенностей действия иммунодепрессантов и противоопухолевых агентов самой разнообразной природы и механизмов действия как in vivo, так и на лимфоидные клетки животных и человека, следует сказать, что чувствительность клеток-мишеней к действию лекарственных препаратов является ведущим фактором, определяющим конечный результат влияния химиопрепарата. Это вывод, прежде всего, базируется на результатах опытов, проведённых на экспериментальных животных. Полученные данные позволяют полагать, что существует определён- 23 ный параллелизм между результатами, полученными в опытах на мышах, и результатами исследований на лимфоцитах человека. Подобно тому, как существуют линии мышей, высокочувствительных к иммунодепрессивному воздействию, и линии мышей, обладающих низкой или промежуточной степенью чувствительности, обследованных лиц также можно распределить по чувствительности лимфоцитов на те же типы.

Ближе всего к пониманию механизмов межлинейных различий у мышей в чувствительности (резистентности) к действию ЦФ мы подошли при изучении его токсического действия у мышей BALB/c и DBA/2.

Особенности токсического действия циклофосфамида у мышей линий BALB/c и DBA/2. Были использованы 3 дозы препарата – 500, 450 и 350 мг/кг. Время инъекции ЦФ обозначали, как "День 0". Препарат вводили 10 мышам-самцам указанных линий. Были выявлены различия у мышей в чувствительности к токсическому действию ЦФ, которые носили качественный характер, наиболее выраженные различия наблюдали при дозе ЦФ, равной 350 мг/кг: мыши генотипа DBA/2 погибли через 5 дней, практически все мыши BALB/c были живы в течение 2 месяцев (далее наблюдения не вели). Для выяснения механизмов межлинейных различий в токсическом действии ЦФ у мышей BALB/c и DBA/2 в разные сроки (по 5 животных на каждую временную точку) после внутрибрюшинного введения препарата в дозе 350 мг/кг в микросомах клеток печени определяли относительное содержание группы изоформ цитохрома P-450 с обращёнными в водную среду активными центрами (цитохромы P-450В), которые участвуют в активации (гидроксилировании) ЦФ. В S9-фракциях печени и селезёнки, а также в плазме крови исследовали кинетику содержания неалкилирующего токсического метаболита ЦФ, акролеина, активность альдегиддегидрогеназы (АЛДГ), алкогольдегидрогеназы (АДГ) и содержание свободных SH-групп. Наконец, в спленоцитах интактных мышей BALB/c и DBA/2 мы определяли уровни репликативного и репаративного синтеза ДНК – показатели, от величины которых могла бы зависеть степень иммунодепрессивного и токсического действия ЦФ.

На рис. 2 представлены результаты экспериментов по определению цитохромов P450В в микросомах клеток печени BALB/c и DBA/2.

- 24 1BALB/c DBA/0 МИН 60 МИН 180 мин 20 МИН Рисунок 2. Относительное содержание группы изоформ цитохромов P-450В у мышей BALB/c и DBA/2 после введения 350 мг/кг ЦФ.

По оси абсцисс время после введения препарата, мин; по оси ординат – содержание P450В, %% (средние значения и 95% доверительные интервалы).

Как видно на рис. 2, содержание P-450В у интактных мышей BALB/c было достоверно выше такового мышей DBA/2. Введение ЦФ нивелировало эти различия. На рис. и 4 представлены результаты опытов, свидетельствующие об отсутствии межлинейных различий в активности АЛДГ (рис. 3) и АДГ (рис. 4) в печени как интактных, так и подопытных животных.

- 25 BALB/c DBA/0 мин 20 мин 60 мин 180 мин Рисунок 3. Активность альдегиддегидрогеназы в печени мышей BALB/c и DBA/2 после введения 350 мг/кг ЦФ.

По оси абсцисс время после введения препарата, мин; по оси ординат – активность альдегиддегидрогеназы, нмоль/мин/мг белка (средние и 95% доверительные интервалы).

- 26 BALB/c DBA/0 МИН 60 МИН 180 мин 20 МИН Рисунок 4. Активность алкогольдегидрогеназы в печени мышей BALB/c и DBA/2 после введения 350 мг/кг ЦФ.

По оси абсцисс время после введения препарата, мин; по оси ординат – активность алкогольдегидрогеназы, нмоль/мин/мг белка (средние и 95% доверительные интервалы).

- 27 2BALB/c DBA/110 МИН 60 МИН 180 мин 20 МИН Рисунок 5. Содержание SH-групп в печени мышей BALB/c и DBA/2 после введения 350 мг/кг ЦФ.

По оси абсцисс время после введения препарата, мин; по оси ординат – содержание GSH, нмоль/мг белка (средние и 95% доверительные интервалы).

Содержание свободных сульфгидрильных групп в печени (рис. 5) интактных мышей BALB/c было достоверно выше, чем у мышей DBA/2. После введения ЦФ отмечали снижение этого показателя у мышей обоих генотипов почти на 50 %, и такая картина оставалась постоянной при всех сроках наблюдения. Межлинейные различия нивелировались.

- 28 0,0,BALB/c DBA/0,0,0,0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 2Время, мин Рисунок 6. Динамика содержания акролеина в S9-фракции печени мышей BALB/c и DBA/2 после введения 350 мг/кг ЦФ.

По оси абсцисс время после введения препарата, мин; по оси ординат – содержание акролеина, мкмоль/мг белка.

Кинетика содержания акролеина в печени (рис. 6) имела следующие особенности:

у BALB/c амплитуда кинетической кривой была выше, но площадь под кривой, характеризующее общее содержание акролеина, была ниже, чем у DBA/2 (соответственно 23,4 и 30,0 мкмоль/мг белка мин).

В плазме крови активность АЛДГ не определялась. После введения ЦФ в плазме крови подопытных мышей мы зарегистрировали появление АДГ, что свидетельствовало о раннем поражении печени (рис. 7).

СОДЕРЖАНИЕ АКРОЛЕИНА, мкмоль/мг белка - 29 DBA/0,BALB/c 0,0,0,0,0,0 МИН 60 МИН 180 мин 20 МИН Рисунок 7. Активность алкогольдегидрогеназы в плазме крови мышей BALB/c и DBA/2 после введения 350 мг/кг ЦФ.

По оси абсцисс время после введения препарата, мин; по оси ординат – активность алкогольдегидрогеназы, нмоль/мин/мл плазмы.

На следующем рис. 8 представлены результаты исследования кинетики содержания акролеина в плазме крови.

- 30 BALB/c DBA/0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 2Время, мин Рисунок 8. Динамика содержания акролеина в плазме крови мышей BALB/c и DBA/2 после введения 350 мг/кг ЦФ.

По оси абсцисс время после введения препарата, мин; по оси ординат – содержание акролеина, нмоль/мл плазмы.

Максимум кинетической кривой и показатель общего содержания акролеина (AUC) у мышей BALB/c были выше: Cmax для BALB/c была равна 39 нмоль/мл плазмы, AUC для BALB/c составила 3,510 мкмоль/мл мин; DBA/2 – соответственно 25,5 и 1,325.

Такие же фармакокинетические закономерности были нами выявлены ранее для алкилирующих метаболитов ЦФ (Л. Ю. Телегин, 1981; Pevnitsky et al., 1985).

Также в плазме крови мы определяли содержание SH-групп, одного из факторов инактивации токсических метаболитов ЦФ. Результаты этих опытов представлены на рис. 9.

СОДЕРЖАНИЕ АКРОЛЕИНА, нмоль/мл плазмы - 31 2BALB/c DBA/110 МИН 60 МИН 180 мин 20 МИН Рисунок 9. Содержание сульфгидрильных групп в плазме крови мышей BALB/c и DBA/2 после введения 350 мг/кг ЦФ.

По оси абсцисс время после введения препарата, мин; по оси ординат – содержание GSH, нмоль/мл (средние и 95% доверительные интервалы).

Как видно на рис. 9, в плазме крови картина была сходна с таковой, наблюдаемой для этого показателя в печени: базовый уровень SH-групп у мышей BALB/c был достоверно выше; через 20 мин после введения препарата содержание SH-групп снизилось, при этом достоверные межлинейные различия сохранились; в дальнейшем уровень сульфгидрильных групп не изменялся, межлинейные различия исчезли.

Наконец на последнем этапе аналитических исследований механизмов токсического действия ЦФ мы изучали S9-фракцию спленоцитов мышей BALB/c и DBA/2. В селезёнке мышей АЛДГ и АДГ не определялись. Содержание SH-групп (рис. 10): базовый уровень у мышей BALB/c достоверно выше такового мышей DBA/2, после введения ЦФ уровень сульфгидрильных групп снизился, при этом характерные для базового уровня межлинейные различия сохранились.

- 32 2BALB/c DBA/110 МИН 60 МИН 180 мин 20 МИН Рисунок 10. Содержание сульфгидрильных групп в S9-фракции селезёнки мышей BALB/c и DBA/2 после введения 350 мг/кг ЦФ.

По оси абсцисс время после введения препарата, мин; по оси ординат – содержание SHгрупп, нмоль/мг белка (средние и 95% доверительные интервалы).

На рис.11 представлены параметры фармакокинетики акролеина в селезёнке мышей BALB/c и DBA/2 после введения ЦФ.

- 33 1,1,BALB/c DBA/0,0,0,0,0,0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 2Время, мин Рисунок 11. Динамика содержания акролеина в S9-фракции селезёнки мышей BALB/c и DBA/2 после введения 350 мг/кг ЦФ.

По оси абсцисс время после введения препарата, мин; по оси ординат – содержание акролеина, мкмоль/мл белка.

В отличие от ранее представленных кривых фармакокинетики акролеина здесь основные параметры были иными. BALB/c: Cmax = 0,35 мкмоль/мг белка, AUC = 13,мкмоль/мг белка мин; DBA/2: Cmax = 1,1 мкмоль/мг белка, AUC = 68,5 мкмоль/мг белка мин.

Проведём анализ результатов, полученных в этой серии опытов (рис. 2-11).

Печень. Содержание цитохрома P450В (фактически, изоформы Cyp2b10) у интактных мышей BALB/c превышало таковое у мышей DBA/2. Этот факт согласуется с ранее полученными нами данными о том, что скорость метаболизма ЦФ в микросомах клеток печени BALB/c достоверно выше скорости метаболизма в микросомах DBA/2 (Л.

Ю. Телегин и соавт., 1981; Telegin et al., 1983; Pevnitsky et al., 1985). Однако введение ЦФ нивелировало эти различия. Взаимодействие с Cyp2b10 – это только первый этап активаСОДЕРЖАНИЕ АКРОЛЕИНА, мкмоль/мг белка - 34 ции ЦФ. Этот этап необходим, но он до конца не объясняет генотипических различий в действии ЦФ у мышей. Слишком большое внимание, уделяемое роли CYP450-зависимой монооксигеназной системы, приводит подчас к неожиданным результатам. Так, в работе Aitchison et al. (1999) группу психиатрических больных, рефрактерных к лечению типичными психотропными препаратами (235 чел.) и чувствительных к лечению (73 чел.), генотипировали на предмет наличия генной дупликация аллеля (CYP2D6*4) CYP2D6 – изоформы P450, ответственной за метаболизм психолептиков. Предполагалось, что нечувствительные к лечению больные имеют статус "сверхбыстрых метаболизаторов".

Оказалось, что только 2 человек из этой группы (0,85 %) можно отнести к этому статусу – они имели дупликацию аллеля дикого типа. В группе поддающихся лечению таких лиц было 3 (4,1 %). Различия по частоте встречаемости дупликации аллеля CYP2D6*4 между этими группами были достоверны. Оба показателя не выходили за рамки популяционной нормы среди европеоидов. Один из ведущих специалистов в области фармакогенетики, открывший Ah-рецептор, Даниэль Вальтер Неберт совершенно справедливо указывает (Nebert et al., 2003) на уклон в сторону исследования генов биотрансформации ксенобиотиков и на меньшее внимание "генам чувствительности", обусловливающим взаимодействие лекарственного препарата или его метаболита с молекулой рецептора в клеткемишени или с молекулой-переносчиком – событиями, до конца не изученными на молекулярном уровне, и которые зачастую и определяют конечный терапевтический или побочный эффект. Исходный базовый уровень АЛДГ (в нашем случае – ALDHA1) у мышей исследуемых генотипов не различался. Введение ЦФ привело к резкому падению уровня фермента у мышей обеих линий, затем наблюдалась тенденция к восстановлению активности АЛДГ, в особенности у мышей BALB/c – уровень АЛДГ через 3 часа после введения ЦФ достоверно превысил таковой мышей DBA/2, у которых активность этого фермента оставалась практически неизменной после инъекции ЦФ, то есть на низком уровне. Исследование содержания АДГ дало аналогичную картину. Эти данные указывают на возможные более выраженные проявления токсичности ЦФ в печени DBA/2, так как оба этих фермента участвуют в инактивации активных метаболитов ЦФ – 4-OH-ЦФ и альдофосфамида. О роли ALDHA1 в гепатотоксичности ЦФ сообщают Pinto и соавт. (2009). У больных, гетерозиготных по мутантному аллелю 1A1*2, повышена частота гепатотоксических проявлений под действием ЦФ, по сравнению больными, имеющими аллель дикого типа. Авторы также отмечают, что ALDHA1 экспрессируется преимущественно в печени. Несмотря на то, что исходный уровень свободных SH-групп в печени мышей BALB/c был достоверно выше, чем у DBA/2, введение ЦФ нивелировало эти различия, - 35 при этом содержание SH-групп упало почти на 50 % и оставалось неизменным при всех сроках наблюдения. Вполне возможно, что различия в токсических проявлениях ЦФ именно в печени мышей BALB/c и DBA/2 определяются не только данным показателем, но и активностью ALDHA1. Одной из причин более высокой гепатотоксичности ЦФ у DBA/2 по сравнению с BALB/c может быть более высокое содержание в печени токсического метаболита ЦФ – акролеина (рис. 6).

Кровь. Активность АЛДГ не определялась. После введения ЦФ в плазме крови подопытных мышей мы зарегистрировали появление АДГ, что является маркёрным признаком центрилобулярного (зона 3) повреждения печени (Kato et al., 1985). Судя по этому показателю, гепатотоксичность ЦФ у DBA/2 в период времени от 20 до 180 мин после введения ЦФ резко возросла и достоверно превысила значения, наблюдаемые у BALB/c.

Параметры фармакокинетики содержания акролеина в крови мышей BALB/c и DBA/совпали с ранее исследуемыми показателями содержания NBP-метаболитов (Л. Ю. Телегин, 1981; Pevnitsky et al., 1985) при использовании дозы ЦФ, равной 200 мг/кг: максимум кинетической кривой и показатель общего содержания акролеина (AUC) у мышей BALB/c были выше. Это обусловлено одинаковой стехиометрией образования акролеина и phosphoramide mustard при -расщеплении альдофосфамида. Здесь следует отметить, что кинетические профили NBP-активности и phosphoramide mustard полностью совпадают по всем параметрам (Chan et al., 1994). Также в плазме крови мы определяли общее содержание SH-групп, одного из факторов инактивации токсических метаболитов ЦФ (см., например, Schlenke et al., 1999). Состояние данной защитной системы после токсического воздействия ЦФ в крови BALB/c оказалось на более высоком уровне, чем у мышей DBA/2. Это было справедливо как в отношении исходных показателей у интактных животных, так и по прошествии первых 20 минут после введения иммунотоксиканта.

Селезёнка. АЛДГ и АДГ не определялись. Что касается такого показателя, как содержание SH-групп, то по этому параметру мыши BALB/c достоверно превосходили аналогичные значения у мышей DBA/2. Это было характерно как для базового уровня у интактных животных, так и на протяжении всего опыта после инъекции ЦФ. Причём, уровень SH-групп у BALB/c после ЦФ снизился по сравнению с показателем интактных животных, но в отличие от DBA/2 оставался практически неизменным, тогда как у DBA/2 уровень SH-групп после ЦФ неуклонно снижался. Эти различия, по-видимому, и обусловили фармакокинетический профиль акролеина в селезёнке мышей BALB/c и DBA/2 – в отличие от картины, наблюдаемой в крови, здесь показатели максимальной - 36 концентрации акролеина и площади под кривой содержания у DBA/2 значительно превосходили таковые BALB/c.

Определение уровня репликативного и репаративного синтеза ДНК в спленоцитах интактных мышей BALB/c и DBA/2. Суспензии спленоцитов интактных мышей BALB/c и DBA/2 были разделены на 3 группы. Группа 1: инкубация клеток с тимидином-3H. Группа 2: облучение клеток УФ-светом и внесение тимидина-3H. Группа 3:

облучение клеток УФ-светом, затем обработка оксимочевиной и последующее внесение тимидина-3H. Результаты выражали в количестве DPM. Индекс репарации – отношение показателей группы 3 к таковым группы 2. Результаты экспериментов представлены в табл. 7.

Таблица 7. Показатели репликативного и репаративного синтеза ДНК в клетках селезёнки интактных мышей BALB/c и DBA/Линия мышей P Группа BALB/c DBA/P = 0,0001 63358 382(49507 77209) (2979 44767) n = 9 n = 2 5670 79(4485 6855) (5958 9860) n = 9 n = 3 6957 44(4413 9501) (2935 6045) n = 9 n = Индекс ре- 1,298 0,644 P = 0,03парации (0,763 1,832) (0,292 0,996) n = 9 n = Примечание. Представлены средние арифметические числа DPM в клетках селезёнки мышей и 95 % доверительные интервалы (в скобках); n – число измерений.

Из табл. 7 видно, что показатели репликативного и репаративного синтеза ДНК у мышей BALB/c были достоверно выше. Эти показатели можно рассматривать как один из факторов устойчивости/чувствительности к иммунодепрессивному и токсическому действию ЦФ.

- 37 Подводя итог экспериментам, результаты которых были представлены в последних двух разделах, можно сделать вполне правомочный вывод, что до некоторой степени определяющими факторами чувствительности/резистентности к иммунодепрессивному и токсическому действию циклофосфамида в наших экспериментальных условиях являются системы, определяющие баланс свободных сульфгидрильных групп, и системы репарации ДНК. Так в клетках селезёнки мышей DBA/2, наиболее чувствительных к токсическому действию ЦФ, мы обнаружили более низкое, по сравнению с BALB/c, содержание SH-групп, что, возможно, обусловило более высокое содержание токсического метаболита ЦФ – акролеина. Также для спленоцитов мышей DBA/2 был характерен более низкий уровень репаративного синтеза ДНК. Более высокие показатели гепатотоксичности ЦФ у DBA/2 могли быть обусловлены низкой активностью печёночной ALDHA1.

Новый механизм иммунодепрессивного и мутагенного действия циклофосфамида. На заключительном этапе работы были проведены эксперименты, которые позволили открыть новый механизм биологического действия ЦФ. Ранее при изучении фармакогенетических аспектов биологического действия ЦФ у мышей (Л. Ю. Телегин, 1979, 1981; Pevnitsky et al., 1985) мы обнаружили парадоксальный факт отсутствия параллелизма между алкилирующей и иммунодепрессивной активностью in vitro образцов сыворотки крови животных, получивших ЦФ. Мы предположили, что неметаболизированный (интактный) ЦФ усиливает иммунодепрессивное действие своих активных метаболитов. В настоящей работе эта гипотеза была подвергнута экспериментальной проверке. В качестве источника активных метаболитов мы использовали мафосфамид (МАФ), который при растворении даёт весь спектр активных метаболитов ЦФ (Niemeyer et al., 1989). В первой серии опытов исследовали иммунодепрессивное действие ЦФ, МАФ и комбинации МАФ + ЦФ in vitro в системе адоптивного сингенного переноса. В предварительных экспериментах было установлено, что концентрация МАФ, равная 1,5 мкг/мл, обеспечивает 50 % уровень подавления тест-клеток (данные не представлены). Клетки селезёнки мышей линии CBA обрабатывали при 37 C в течение 1 часа препаратами: 1,мкг/мл МАФ + 1000 мкг/мл ЦФ (группа 1), 1,5 мкг/мл МАФ (группа 2), 1000 мкг/мл ЦФ (группа 3). Контролем служили клетки, инкубируемые в среде 199 (группа 4). Концентрация клеток в инкубационной смеси (объём 1,5 мл) составляла 2,5108. Затем спленоциты трижды отмывали центрифугированием и вводили внутривенно по 50 млн. вместе с 4108 ЭБ сингенным мышам-реципиентам, иммунореактивность которых была подавлена предварительным введением ЦФ в дозе 200 мг/кг за 3–4 ч до клеточного переноса. Концентрация ЦФ, равная 1000 мкг/мл, приблизительно соответствует (с учётом общего объ- 38 ёма жидкости тела мыши) дозе 70 мг/кг in vivo (http://www.labanimal.ru/?catid=10), при которой мы ранее наблюдали выраженные межлинейные различия у мышей в чувствительности к иммунодепрессивному действию ЦФ (Л. А. Певницкий и др., 1977). Через дней после клеточного переноса в селезёнке реципиентов определяли содержание IgMантителообразующих клеток (АОК) по методу Ерне. Результаты опытов представлены в табл. 8.

Таблица 8. Влияние циклофосфамида, мафосфамида и их комбинации на иммунный ответ нормальных клеток селезёнки мышей CBA/CaLacY Группа Препараты Число АОК P в селезёнке 1 МАФ + ЦФ 21 (13 32) P1,2 < 0,n = 2 МАФ 46 (33 64) P2,3 < 0,n = 3 ЦФ P3,4 = 0,698 (81 118) n = 4 Контроль — 100 (85 117) n = Примечание. Представлены средние геометрические числа антителообразующих клеток в селезёнке мышей, выраженные в процентах к контролю, и 95 % доверительные интервалы (в скобках); n – число животных в группе.

Как видно из табл. 8, обработка ЦФ практически не влияла на иммунный ответ спленоцитов, МАФ на 54 % ингибировал иммунный ответ тест-клеток (P < 0,01). Добавление ЦФ достоверно, более чем в 2 раза усиливало иммунодепрессивное действие МАФ. Поскольку основной мишенью иммунодепрессивного действия ЦФ являются Тлимфоциты, в следующей серии опытов мы попытались выяснить, усилится ли подавление пролиферации Т-клеток селезёнки мышей линии C57BL/6J при комбинированном воздействии ЦФ и его активных метаболитов. Результаты опытов представлены в табл. 9.

- 39 Таблица 9. Чувствительность Т-клеток селезёнки мышей C57BL/6J к циклофосфамиду и мафосфамиду Номер, название груп- CD3-ответ, P пы % к контролю Группа 1 1“контроль” P1,2 = 0,6(91 110) n = Группа 2 1“ЦФ” (92 114) n = Группа 3 “МАФ (0,75 мкг/мл)” (78 95) P1,3 < 0,n = Группа 4 “ МАФ (1,5 мкг/мл) ” (56 71) P1,4 < 0,00n = Группа 5 “ МАФ (3,0 мкг/мл)" (38 53) P1,5 < 0,00n = Группа 6 “МАФ (0,75 мкг/мл) + (52 72) P3,6 < 0,0ЦФ" n = Группа 7 “МАФ (1,5 мкг/мл) + (39 49) P4,7 < 0,00ЦФ" n = Группа 8 “МАФ (3,0 мкг/мл) + (23 43) P5,8 < 0,ЦФ" n = Примечание. Представлены средние значения числа имп./мин, выраженные в процентах к контролю, и (в скобках) 95 % доверительные интервалы; n – число животных в группе.

Результаты этой серии экспериментов свидетельствуют о том, что при совместном действии ЦФ и МАФ наблюдается наиболее сильное подавление пролиферации Tклеток. Как и при исследовании иммунодепрессивного действия препаратов в системе - 40 адоптивного переноса, ЦФ сам по себе не оказывал антипролиферативного действия на T-клетки.

Поскольку биологическое действие ЦФ в организме и, в частности, его иммунодепрессивный эффект обусловлены алкилированием ДНК, мы изучали мутагенное действие (индукцию хромосомных аберраций) комбинации ЦФ и МАФ на лимфоциты периферической крови человека. Культуру клеток, содержащихся в среде RPMI-1640 (Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов, Москва, Россия) c добавлением эмбриональной телячьей сыворотки (Biotest, Германия), в течение 1 часа при 37 C обрабатывали ЦФ и разными концентрациями МАФ, которые вводили на стадии G0 клеточного цикла (до введения фитогемагглютинина, ФГА, ПанЭко, Москва, Россия). Далее клетки дважды отмывали и заменяли среду культивирования на новую, содержащую ФГА. Затем культуру фиксировали на 52 часу. За 2 часа до фиксации добавляли колхицин (Calbiochem, Великобритания) в конечной концентрации 0,5 мкг/мл. Результаты опытов представлены в табл. 10.

Таблица 10. Мутагенное действие циклофосфамида и мафосфамида на лимфоциты человека Группа Количество Из них % абер- Количество Количество проанали- аберрант- рантных аберраций аберраций зированных ных метафаз на 100 клеметафаз ток Контроль 100 7 7,00 7 7,ЦФ, 100 8 8,00 8 8,1 мг/мл МАФ, 100 16 16,00 21 21,3 мкг/мл МАФ, 100 34 34,00 41 41,3 мкг/мл + ЦФ 1 мг/мл МАФ, 100 17 17,00 24 24,5 мкг/мл МАФ, 90 24 26,67 26 28,5 мкг/мл + ЦФ 1 мг/мл - 41 Как видно из таблицы, добавление ЦФ достоверно (по критерию 2) усиливает мутагенное действие МАФ, особенно это выражено при использовании концентрации МАФ, равной 3 мкг/мл (более чем в 2 раза). ЦФ per se практически не оказывал мутагенного влияния.

Таким образом, результаты экспериментов, представленные в табл. 8-10, демонстрируют новый механизм иммунодепрессивного и мутагенного действия ЦФ – усиление нативным препаратом действия своих собственных активных метаболитов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ Циклофосфамид (ЦФ) является классическим цитостатическим препаратом, обладающим мощным противоопухолевым действием и выраженной иммуномодулирующей активностью. Клиническая эффективность препарата была многократно подтверждена при терапии опухолей (Loeffler et al., 2005; Emadi et al., 2009), трансплантации костного мозга и лечении ревматоидного артрита и других аутоиммунных заболеваний (http://www.xpharm.com/citation?Article_ID=8220). Потенциальные области применения ЦФ для лечения заболеваний за последние годы существенно расширились благодаря экспериментальному обоснованию его применения при суицидной генотерапии опухолей (Hedley et al., 2007) и для подавления активности регуляторных Т-клеток, ингибирующих развитие иммунных реакций при иммунотерапии рака (Thistlethwaite et al., 2008).

В настоящей работе мы исследовали фармакогенетический профиль ЦФ с помощью сравнения фармакокинетических и фармакодинамических показателей у мышей контрастно реагирующих на ЦФ генотипов – BALB/c (резистентный) и DBA/2 (чувствительный). В результате проведённых исследований было установлено, что высокая чувствительность мышей DBA/2 обеспечивается низкой активностью изоформы цитохрома P450 – фермента, активирующего ЦФ. Это способствует оптимальному для реализации биологического действия ЦФ сочетанию неметаболизированного препарата и его активных метаболитов. Также для DBA/2 характерна более высокая по сравнению с BALB/c чувствительность клеток-мишеней к действию смеси ЦФ + активные метаболиты. Данный параметр фармакодинамики ЦФ у DBA/2 обусловлен низким содержанием тиоловых соединений, одного из компонентов защитных систем клетки. И, наконец, ещё одним фактором высокой чувствительности клеток-мишеней DBA/2 является низкая активность систем репарации повреждений ДНК.

Нам представляется также важным обнаруженный в настоящей работе факт наличия разной чувствительности к действию ЦФ и ТиоТЭФ лимфоцитов периферической - 42 крови человека. Здесь также мы выявили "сверхнизкий" и "сверхвысокий" типы чувствительности клеток. Принадлежность к тому или иному типу чувствительности в данном случае, по-видимому, также обусловлена балансом SH-групп.

Фармакогенетический анализ иммунодепрессивного действия ЦФ у мышей позволил нам выдвинуть гипотезу о существовании нового, до сих пор не описанного в мировой литературе, механизма действия ЦФ: усиление неметаболизированным препаратом действия собственных активных метаболитов. С помощью трёх разных экспериментальных систем мы получили убедительные доказательства существования данного явления.

Таким образом, фармакогенетический подход к исследованию лекарственных препаратов позволяет не только понять механизмы разной чувствительности к их терапевтическому и токсическому действию и на основе этих знаний оптимизировать схему лечения конкретного больного, но и выявить новые, до сих пор неизвестные механизмы их фармакологического действия.

ВЫВОДЫ 1. Разработан фармакогенетический подход для выяснения причин разной чувствительности к действию циклофосфамида, позволивший оценить вклад иммунологических и биохимических факторов в определение степени иммунодепрессии и токсичности циклофосфамида.

2. Установлено, что фенотип чувствительности к действию циклофосфамида у мышей определяется совокупным влиянием трёх ключевых признаков: активность изоформы CYP2B6 – фермента, активирующего циклофосфамид; содержание сульфгидрильных групп в гепатоцитах, крови и клетках мишенях; активность систем репарации повреждений ДНК. Для мышей "чувствительного" генотипа DBA/2JSto было характерно минимальное значение этих трёх показателей, для мышей "устойчивого" генотипа BALB/cJLacSto – максимальное значение.

3. Разработана система оценки чувствительности лимфоидных клеток человека к действию иммунодепрессантов. Обнаружена выраженная фенотипическая изменчивость чувствительности лимфоцитов периферической крови человека к подавлению пролиферативного потенциала с помощью циклофосфамида и тиофосфамида. Выделены контрастные и промежуточные типы реагирования на данные алкилирующие агенты.

4. Как и в опытах на животных, тип чувствительности лимфоцитов человека сохранялся независимо от вида применённого алкилирующего агента. Признак "тип - 43 чувствительности" к действию циклофосфамида и тиофосфамида характеризовался относительным постоянством и не зависел от уровня пролиферативной реакции мононуклеаров крови на митоген, определяемой по величине показателя "индекс стимуляции".

5. Признак чувствительности к иммунодепрессивному действию использованных в настоящей работе лекарственных препаратов не зависит от генов главного комплекса гистосовместимости (H-2 у мышей и HLA-A, HLA-B и HLA-C у человека).

6. Установлено, что причина разной чувствительности лимфоцитов периферической крови человека связана с неодинаковой способностью цитозолей лимфоцитов инактивировать исследуемые алкилирующие агенты, что, в свою очередь, может быть обусловлено внутриклеточным балансом тиоловых соединений.

7. В трёх экспериментальных системах доказано наличие нового механизма действия циклофосфамида: интактный препарат, неактивный per se, усиливает иммунодепрессивное, антипролиферативное и мутагенное действие своих собственных активных метаболитов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. А. Н. Чеботарёв, Л. Ю. Телегин, Е. М. Державец. Цитогенетический эффект циклофосфамида в культуре лимфоцитов человека после активации его в организме мышей // Генетика. 1976. Т. 12. № 11, С. 151-12. Ким Нам Ир, Л. Ю. Телегин, Л. А. Певницкий. Генетические различия у мышей в чувствительности к иммунодепрессивному действию алкилирующих агентов // Бюл.

эксперим. биологии и медицины, 1983, Т. 95, № 4, С. 79-3. Л. Н. Веремко, Л. Ю. Телегин, Л. А. Певницкий. Вариабельность чувствительности лимфоцитов человека к антипролиферативному действию алкилирующих агентов // Бюл. эксперим. биологии и медицины, 1983, Т. 95, № 5, С. 73-4. Л. Ю. Телегин, Л. Н. Веремко, Ким Нам Ир, Б. Н. Афанасьев. Иммунофармакогенетический анализ действия алкилирующих соединений на лимфоидные клетки человека и животных // "Онкологический научный центр", М., "Медицинская генетика: итоги и перспективы. Труды", М., 1983, С. 180-15. Л. Ю. Телегин, Ким Нам Ир. Чувствительность мышей разных генотипов к иммунодепрессантам // Тезисы докладов I Всесоюзного съезда медицинских генетиков, Киев, 1984, С. 327-3- 44 6. Ким Нам Ир, Л. Ю. Телегин, Л. А. Певницкий, А. М. Малашенко. Чувствительность мышей BALB/c и WR к иммунодепрессивному действию циклофосфамида и тиофосфамида // Бюл. эксперим. биологии и медицины, 1984, т. 97, № 5, С. 598-67. Л. А. Певницкий, Л Ю. Телегин, Ким Нам Ир. Чувствительность иммунокомпетентных клеток селезёнки мышей разных генотипов к действию алкилирующих агентов // Бюл. эксперим. биологии и медицины, 1985, т. 100, № 8, С. 213-28. L. A. Pevnitsky, L. Yu. Telegin, G. F. Zhirnov, А. V. Mazurov, V. V. Viktorov. Sensitivity of immunodepressant action of cyclophosphamide: analysis of interstrain differences in mice // Int. J. Immunopharmacol., 1985, v. 7, No. 6, pp. 875-89. Л. Ю. Телегин, А. В. Ермаков, Н. И. Поспехова. Влияние предварительного введения фенобарбитала на межлинейные различия у мышей в чувствительности к иммунодепрессивному действию циклофосфамида // Тезисы докл. Всесоюзной конф. "Цитохром Р-450 и модификация макромолекул", Ялта, 1989, С. 110. С. М. Спиридонова, М. В. Изотов, В. М. Щербаков, Е. Н. Корнева, Л. Ю. Телегин, С.

А. Бенедиктова, В. М. Девиченский. Взаимосвязь между относительным содержание цитохромов Р-450В и метаболизмом ксенобиотиков in vitro // Тезисы докл. Всесоюзной конф. "Цитохром Р-450 и модификация макромолекул", Ялта, 1989, С. 111. Ю. В. Котловский, Л. Ю. Телегин, Г. Ф. Жирнов, В. Б. Лисицына. Метод оценки иммуномодулирующего действия метаболитов микросомального окисления ксенобиотиков // Тезисы докл. Всесоюзной конф. "Оценка фармакологической активности химических соединений: принципы и подходы", М., 1989, часть II, С. 112. Ф. В. Доненко, Б. Ш. Чихвашвили, Н. Б. Боровкова, В. М. Девиченский, А. О. Кабиева, Е. Н. Корнева, В. М. Щербаков, Л. Ю. Телегин, В. П. Летягин, Л. В. Мороз. Влияние финоптина на метаболизм и фармакологическое действие циклофосфана in vivo и in vitro // Бюл. эксперим. биологии и медицины, 1991, т. 111, № 3, С. 300-313. В. М. Щербаков, М. В. Изотов, Е. Н. Корнева, Л. Ю. Телегин, Л. Д. Молчанова, С. М.

Спиридонова, В. М. Девиченский. Ферментный статус мышей, контрастных по чувствительности к циклофосфамиду линий BALB/c и DBA/2 // Тезисы докл. Всесоюзного симп. "Биохимия опухолевой клетки", Минск, 1991, С. 120-114. В. М. Щербаков, Ф. В. Доненко, Л. Ю. Телегин, В. М. Девиченский. Влияние веропамила на цитохром Р-450-зависимый метаболизм циклофосфамида // Тезисы докл.

Всесоюзного симп. "Биохимия опухолевой клетки", Минск, 1991, С. 154-1- 45 15. Л. А. Певницкий, В. М. Писарев, Л. Ю. Телегин, А. В. Тутельян. Генетические аспекты действия различных иммунодепрессантов // Вестник Российской АМН, 1992, № 4, С. 52-16. Л. А. Певницкий, В. М. Писарев, Л. Ю. Телегин, А. В. Тутельян. Генетические аспекты модуляции иммунного ответа // Тезисы докладов I Съезда иммунологов России, Новосибирск, 1992, С. 317. М. П. Тараканова, Е. Ю. Москалёва, Л. В. Безобразова, О. И. Семёнова, Е. Н. Корнева, Л. Ю. Телегин. Структура ДНК лейкоцитов больных лейкозом в процессе химиотерапии // Вестник Российской АМН, 1993, № 4, С. 17-18. Л. Ю. Телегин, В. М. Щербаков, Е. Н. Корнева, В. М. Девиченский, Н. В. Корчагин, Л. А. Певницкий. Возможные причины контрастной чувствительности мышей BALB/c и DBA/2 к острому токсическому действию циклофосфамида // Генетика, доп. выпуск, Материалы I Съезда Вавиловского общества генетиков и селекционеров (ВОГИС), (Саратов, 20-25 декабря 1994), М., 1994, С. 119. Р. М. Хаитов, Р. И. Атауллаханов, А. С. Иванова, Т. Б. Мастернак, А. С. Ларин, О. Н.

Стеценко, Б. И. Любимов, Л. П. Коваленко, Л. Ю. Телегин, Т. А. Гуськова, Е. В. Арзамасцев, А. В. Никитин, Г. П. Кудрина, О. Л. Верстакова. Методические рекомендации по оценке иммунотоксического действия фармакологических средств. Методические рекомендации Фармкомитета // Ведомости Научного центра экспертизы лекарств и контроля лекарственных средств Минздрава России, сентябрь 1999 г., № 1, С. 62-20. Л. Ю. Телегин, Л. А. Певницкий, Э. В. Громова, Г. Ф. Жирнов, В. Б. Лисицына, Е. В.

Арзамасцев, А. Н. Николаев, О. Л. Верстакова. Метод определения прямой иммунотоксичности фармакологических средств и их возможных метаболитов // Тезисы докладов VIII Российского национального конгресса “Человек и лекарство“, Москва, 2-апреля 2001 г., М., С. 721. В. А. Тутельян, М. М. Гаппаров, Л. Ю. Телегин, В. М. Девиченский, Л. А. Певницкий. Флавоноиды и резвератрол как регуляторы активности Ah-рецептора: защита от токсичности диоксина // Бюл. эксперим. биологии и медицины, 2003, т. 136, № 12, С.

604-622. Р. М. Хаитов, А. С. Иванова, Т. Б. Мастернак, О. Н. Стеценко, Р. И. Атауллаханов, Б.

И. Любимов, Л. П.Коваленко, Л. Ю.Телегин, Т. А. Гуськова, А. В. Никитин, Г. П.

Кудрина, Е. В. Арзамасцев. Методические указания по оценке иммунотоксического действия фармакологических средств // Руководство по экспериментальному (докли- 46 ническому) изучению новых фармакологических веществ / Под общей редакцией член-корр. РАМН, проф. Р. У. Хабриева. - 2-изд., перераб. и доп. - М.: ОАО "Издательство "Медицина", 2005. - С.70-23. Л. Ю.Телегин. Иммунотоксикология: определения, цели и задачи, значение для медицины и здравоохранения (аналитический обзор) // М.: НТИМИ, 2006, 45 с.

24. Способ подавления иммунных реакций [Текст]: пат. 2393481 Рос. Федерация: МПК G01N33/554 (2006.01) / Л. Ю. Телегин, В. М. Писарев, Л. А. Певницкий, В. Г. Пухальская, В. М. Девиченский, Ю. Л. Телегин, О. Р. Ерофеева, И. Б. Жукова (заявители и патентообладатели) — № 2008141628/15, 22.10.2008; опубл. 27.06.2010, "Изобретения. Полезные модели. Официальный бюллетень Федеральной службы по интеллектуальной собственности, патентам и товарным знакам", № 18, 2010. – 5 с.

25. Л. Ю. Телегин, В. М. Писарев, Л. А. Певницкий. Циклофосфамид усиливает иммунодепрессивное действие своих активных метаболитов // Доклады Академии Наук, 2008, т. 423, № 3, С. 427-4




© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.