WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

 

На правах рукописи

КНЯЗЕВ

ОЛЕГ ВЛАДИМИРОВИЧ

ЛЕЧЕНИЕ ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ КИШЕЧНИКА

АЛЛОГЕННЫМИ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫМИ

СТРОМАЛЬНЫМИ КЛЕТКАМИ

14.01.28 – гастроэнтерология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора медицинских наук

Москва 2010 г.

Работа выполнена в Центральном научно-исследовательском институте

гастроэнтерологии Департамента здравоохранения г.Москвы

(директор – доктор медицинских наук, профессор Л.Б.Лазебник)

Научные консультанты:

Доктор медицинских наук, профессор               Леонид Борисович Лазебник

Доктор биологических наук, профессор                Анатолий Георгиевич

  Коноплянников

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор,

член-корреспондент РАМН         Игорь Сергеевич Гущин

Доктор медицинских наук, профессор                       Игорь Львович Халиф

Доктор медицинских наук                       Валентина Ивановна Касьяненко

Ведущая организация: ГОУ ВПО Российский государственный медицинский университет.

Защита состоится «_____» _________________ 2010г. в ____ч. на заседании Диссертационного Совета Д 850.002.01 Центрального научно-исследовательского института гастроэнтерологии по адресу:

111123, г. Москва, ул. Шоссе Энтузиастов, 86.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Центрального научно-исследовательского института гастроэнтерологии.

Автореферат разослан «____» августа 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук, профессор       И.А. Комиссаренко

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

ВВЕДЕНИЕ

Воспалительные заболевания кишечника (ВЗК), к которым относятся язвенный колит (ЯК) и болезнь Крона (БК), представляют одну из наиболее серьезных и нерешенных проблем в современной гастроэнтерологии. По уровню заболеваемости В3К значительно уступают другим заболеваниям органов пищеварения, но по тяжести течения, частоте осложнений и летальности они во всем мире занимают одно из ведущих положений в структуре болезней желудочно-кишечного тракта.

В изучении патогенеза ВЗК достигнут значительный прогресс, однако, несмотря на достижения фундаментальной медицины и широкий спектр применяемых лечебных средств, отмечается рост заболеваемости воспалительными заболеваниями кишечника среди наиболее трудоспособного возраста населения [Калинин А.В., 2007, Халиф И.Л., Лоранская И.Д., 2004]. В 35% случаев развивается стероидорезистентное или стероидозависимое течение ВЗК, а также резистентность не только к гормонам, но и к иммуносупрессивным препаратам, что приводит к развитию тяжелых осложнений, оперативным вмешательствам и выходу на инвалидность лиц молодого возраста. В многочисленных исследованиях было показано, что риск рецидива в течение первого года после установления диагноза ВЗК составляет 50% при ЯК и 47% при БК. Среди пациентов, леченных глюкокортикостероидами, лишь у 44% наблюдается стойкая ремиссия в течение первого года, в то время как у 36% формируется стероидозависимость и у 20% стероидорезистентность [Munkholm P., Langholz E., Davidsen M., Binder V., 1994; Moum B., Ecbom A., Vatn M.H. et al., 1997]. У больных ЯК, впервые леченных стероидными гормонами, только у 49% наблюдался пролонгированный ответ, у 22% развилась стероидозависимость, а у 29% возникает необходимость в колэктомии из–за резистентности к лечению [Faubion W.A., Loftus E.V., Harmsen W.S., Zinsmeister A.R. et all., 2001].

Данные проблемы потребовали разработки новых терапевтических направлений в лечении больных ВЗК. Прогресс в изучении молекулярных мишеней воспаления при ВЗК способствовал серьезному успеху появлению и развитию биологической антицитокиновой или клеточной терапии.

Быстрое развитие высоких медицинских и фармацевтических технологий способствует созданию все большего количества новых лекарственных препаратов для лечения ВЗК, что, безусловно, повысит эффективность лечения этих заболеваний, даже несмотря на отсутствие этиотропного лечения ВЗК. Основная задача биологических методов лечения – подавление эффекторных сигналов на разных уровнях и разрыв порочного круга воспаления. Главное преимущество этих методов – селективность действия, т.е. блокирование одного из ключевых патологических звеньев. Биологических методов на сегодняшний день достаточно много, но лишь единичные из них уже с успехом используются, практическое применение большинства относится к ближайшим или отдаленным перспективам. Впервые появилась возможность считать реальной целью лечения БК и ЯК достижение ремиссии заболевания. Первыми препаратами биологической терапии были ингибиторы фактора некроза опухоли (-ФНО). Однако частота развития ремиссий при их применении составляла не более 60%, а около трети больных были вынуждены прекращать лечение из–за развития вторичной неэффективности или побочных эффектов [Furst D.E., Breedveld F.C., Kalden J.R. et al., 2007; Pincus T., Yazici Y., van Vollenhoven R., 2006; Wintrop K.L., 2006].

В патогенезе любого заболевания, в том числе ВЗК, принимает участие большое количество биологически активных веществ, гормонов и других регуляторов воспаления. Данное обстоятельство нельзя не учитывать при лечении болезни Крона и язвенного колита. Учитывая данные обстоятельства, внимание клиницистов привлекла клеточная терапия, как один из методов биологической терапии. Развитие клеточных технологий, возросший в мире интерес к регенераторным свойствам стволовых клеток костного мозга, возможность их легитимного использования, позволило их применить у больных с хронической патологией. Клеточные биотехнологии стали использовать для лечения острой и хронической сердечной недостаточности [Шумаков В.И и др., 2003, 2004; Assmus B. et al., 2002], аутоиммунных заболеваний [Витязев Г.А., 1993; Шумаков В.И и др., 1995, 1998; Онищенко Н.А и др., 2006], острой и хронической печеночной недостаточности разного генеза [Parekkadan B. et al., 2007], длительно незаживающих язв желудка [Аскаров М.Б., 2009], ран и ожогов [Колосов Н.Г и др., 2000; Расулов М.Ф., 2007; Badiavas E. et al., 2003] и др.

МСК способны дифференцироваться в клетки самых разных типов тканей взрослого организма, доказано их системное иммуномодулирующее действие. Эти особенности обеспечивают перспективность их успешного клинического использования с целью усиления репаративного, противовоспалительного и иммуномодулирующего процессов [Frieedenstein A.J., 1968]. МСК костного мозга человека являются гипоиммуногенными, они также обладают иммуномодулирующим и противоспалительным эффектом [Fallarino F. et al., 2002, Aggarwal S., Pittinger M.F., 2005; Makino S., Fukuda K., Mioshi S. et al. 1999], мигрируя в область воспаления по хемотаксическому градиенту, выделяют вещества, ингибирующие продукцию провоспалительных цитокинов. МСК способны дифференцироваться в клетки костной, хрящевой, жировой и нервной тканей, мышц (включая кардиомиоциты), сосудистого эндотелия, печени и т.д., синтезировать цитокины и молекулы адгезии, фактор роста эндотелия сосудов, стимулирующий ангиогенез и непосредственно участвовать в процессах восстановительной регенерации поврежденных тканей [Потапов И.В и др., 2005; Amado L. et al., 2005; Parekkadan B. et al., 2007; Caplan A. et al., 2008].

Трансплантация МСК рассматривается как перспективный метод терапии БК и ЯК. Первые результаты зарубежных пилотных исследований показывают, что трансплантация аллогенных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга улучшает клиническое течение ВЗК.

Однако, приступая к нашим исследованиям, мы не обнаружили работ, в которых сформулированы показания для системной трансплантации МСК в зависимости от тяжести заболевания и активности воспалительного процесса при ЯК и БК. Мы не обнаружили сведений о влиянии мезенхимальных стромальных клеток костного мозга на состояние иммунного и цитокинового статуса организма и на связь цитокинового дисбаланса с состоянием регенераторных процессов в слизистой оболочке кишки, отсутствовали сведения о режиме, частоте и кратности введения МСК при язвенном колите и болезни Крона, нет информации об эффективности клеточной терапии у больных ЯК и БК в зависимости от особенностей клинического течения ВЗК и показателей иммунного статуса больных. Отсутствие в литературе вышеуказанных сведений и их важность для разработки новых методов терапии хронических воспалительных заболеваниях кишечника позволили нам сформулировать цель и задачи настоящего исследования.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ

Определить эффективность и безопасность трансплантации мезенхимальных стромальных клеток костного мозга в комплексной терапии у больных язвенным колитом и болезнью Крона.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

  1. Разработать показания к трансплантации мезенхимальных стромальных клеток у больных язвенным колитом и болезнью Крона.
  2. Выявить особенности влияния мезенхимальных стромальных клеток на клиническое течение язвенного колита и болезни Крона.
  3. Оценить местный и системный противовоспалительный эффект мезенхимальных стромальных клеток при язвенном колите и болезни Крона.
  4. Установить характер изменения гуморального иммунного ответа на введение культуры мезенхимальных стромальных клеток при язвенном колите и болезни Крона.
  5. Определить изменения цитокинового статуса на введение мезенхимальных стромальных клеток при язвенном колите и болезни Крона.
  6. Выявить изменения уровня цитокинов в экстракте слизистой оболочке кишки на введение мезенхимальных стромальных клеток при язвенном колите и болезни Крона.
  7. Оценить риски развития рецидива заболеваний при проведении стандартной терапии и комплексной терапии язвенного колита и болезни Крона с применением культуры клеток. 
  8. Сравнить фармакоэкономическую эффективность стандартной терапии препаратами 5-аминосалициловой кислоты, глюкокортикостероидами, цитостатиками, моноклональными антителами и трансплантацию мезенхимальных стромальных клеток.
  9. Оценить безопасность системной трансплантации мезенхимальных стромальных клеток в терапии воспалительных заболеваний кишечника.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

В настоящей работе, выполнявшейся в рамках программы «Клеточные технологии – медицине», утвержденной президиумом РАМН (регистрационный номер – 01.2.00 305442), впервые применен новый метод терапии - трансплантация МСК для лечения больных воспалительными заболеваниями кишечника.

Впервые сформулированы патогенетически обоснованные показания для системной трансплантации аллогенных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга с целью повышения эффективности лечения воспалительных заболеваний кишечника.

Продемонстрирована наибольшая эффективность комплексной терапии язвенного колита и болезни Крона с трансплантацией мезенхимальных стромальных клеток над стандартной медикаментозной терапией препаратами 5-аминосалициловой кислоты (5-АСК) и глюкокортикостероидами (ГКС).

Впервые проведена оценка иммуномодулирующего и противовоспалительного эффекта - показано, что аллогенные мезенхимальные стромальные клетки стимулируют функциональную активность угнетенной иммунной системы, снижают интенсивность аутоиммунных реакций и активность иммунопатологических процессов.

Продемонстрирован терапевтический и репаративный потенциал мезенхимальных стромальных клеток в комплексной терапии язвенного колита и болезни Крона.

Определена взаимосвязь между эффективностью терапиии мезенхимальными стромальными клетками и исходным уровнем иммунного статуса, а так же цитокинового профиля больных воспалительными заболеваниями кишечника.

Продемонстрировано улучшение заживления слизистой оболочки кишки после трансплантации мезенхимальных стромальных клеток по сравнению со стандартной терапией препаратами 5-аминосалициловой кислоты и глюкокортикостероидами.

Показана сопоставимость эффективности противовоспалительной терапии язвенного колита и болезни Крона с использованием инфликсимаба и с трансплантацией мезенхимальных стромальных клеток.

Продемонстрирована безопасность системной трансплантации аллогенных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга у больных ВЗК.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

Трансплантация аллогенных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга значительно увеличивает продолжительность ремиссии при хроническом рецидивирующем и непрерывном течении язвенного колита и болезни Крона.

Применение культуры аллогенных мезенхимальных стромальных клеток в большинстве случаев позволяет отказаться от приема иммуносупрессоров у больных ВЗК, а так же значительно уменьшить дозу принимаемых глюкокортикостероидов, а в ряде случаев полностью отказаться от них.

Введение аллогенных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга в комплексной терапии язвенного колита и болезни Крона позволяет снизить риск развития рецидива заболеваний.

Трансплантированные аллогенные мезенхимальные стромальные клетки костного мозга уменьшают частоту госпитализаций больных язвенным колитом и болезнью Крона.

Использование клеточной культуры мезенхимальных стромальных клеток, выращенной из костного мозга человека, в лечении больных ВЗК не приводит к развитию опухолевого процесса за двухлетний период наблюдения.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

  1. Системная трансплантация мезенхимальных стромальных клеток костного мозга является новым методом биологической терапии болезни Крона и язвенного колита.
  2. Системная трансплантация мезенхимальных стромальных клеток костного мозга проводится с учетом степени тяжести и активности заболевания, возраста больных, длительности течения болезни. Эффективность лечения оценивается по клиническим, эндоскопическим, иммунологическим и гистологическим критериям.
  3. Системная трансплантация культуры аллогенных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга оказывает иммуномодулирующий и противовоспалительный эффект, снижает активность иммунопатологических процессов.
  4. Трансплантация аллогенных мезенхимальных стромальных клеток позволяет отказаться от иммуносупрессоров, значительно уменьшить дозу принимаемых ГКС, а иногда полностью отказаться от них.
  5. Трансплантированные аллогенные мезенхимальные стромальные клетки костного мозга снижают риск развития рецидива язвенного колита и болезни Крона.
  6. Системная трансплантация аллогенных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга по своей эффективности сопоставима с терапией инфликсимабом (Ремикейдом®), но более экономически выгодна в условиях России.

ПУБЛИКАЦИИ

По материалам диссертации опубликовано 33 научные работы, из них 10 статей – в ведущих рецензируемых изданиях, 12 работ в материалах зарубежных конференций. Приоритетность полученных результатов подтверждена тремя патентами (№2364405 от 20.08.2009, №2367450 от 20.09.2009 и №2391914 от 20.06.2010). Получено положительное решение о выдаче двух патентов на изобретение №2008131627/14 (039471) от 07.12.09.

ВНЕДРЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ В ПРАКТИКУ

Результаты исследования внедрены в научно-практическую работу отделения патологии кишечника Центрального научно-исследовательского института гастроэнтерологии Департамента здравоохранения г.Москвы.

Основные положения и выводы исследования используются в лекциях, при проведении семинаров и научно-практических конференций для врачей г. Москвы и России.

По результатам исследования получен патент №2364405 «Способ лечения воспалительных заболеваний кишечника» (20 августа 2009 года), патент №2367450 «Способ лечения язвенного проктосигмоидита» (20 сентября 2009 года) и патент №2391914 «Способ оценки эффективности лечения болезни Крона и язвенного колита» (20 июня 2010 года).

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Основные положения диссертации представлены, обсуждены и опубликованы в материалах международных и отечественных конференций и съездов: на VIII, IX и X Съездах НОГР (2008, 2009, 2010 г.г.), на Сибирском Научном Гастроэнтерологическом Форуме «Новые рубежи гастроэнтерологии», г.Новосибирск, 11 декабря, 2008г., на заседании Ученого Совета МРНЦ РАМН 16 декабря 2008г., г.Обнинск, на 4 и 5 Конгрессе ECCO - The European Crohn's and Colitis Organization в Гамбурге (Германия) и Праге (Чехия) (2009, 2010), на Международном конгрессе терапевтов стран Восточного Средиземноморья, Белград (Сербия), март 2009 г., на Третьем Международном Медицинском Форуме «Индустрия здоровья», Москва, март 2009г., на Выездной сессии НОГР в г.Чебоксары в сентябре 2009 г, в Екатеринбурге, 20 октября 2009, в г.Ярославле, 29 апреля 2010г., на Европейской школе ЕССО, Москва, 18 сентября 2009г., на III Конгрессе гастроэнтерологов и гепатологов Боснии и Герцеговины 25 сентября 2009, г.Банья Лука, на XI-м Международном конгрессе гастроэнтерологов стран Восточного Средиземноморья в Белграде (Сербия), сентябрь 2009г., на научно-практической конференции с международным участием «Актуальные проблемы гастроэнтерологии» (Василенковские чтения) в ММА им. И.М.Сеченова, Москва, ноябрь 2009г., на Ежегодном Всемирном Съезде гастроэнтерологов – 2009, Лондон (Великобритания), ноябрь 2009г., на IV Национальном Конгрессе терапевтов, Москва, ноябрь 2009г., на Всероссийской научно-практической конференции "Актуальные проблемы оказания специализированной медицинской помощи в условиях стационара и применение стационарозаменяющих технологий", Главный военный клинический госпиталь имени академика Н.Н. Бурденко, Москва, декабрь, 2009г., на Научно-практической конференции Центрального федерального округа России с международным участием «Инновации и информационные технологии в диагностической, лечебно-профилактической и учебной работе клиник», г.Тверь, декабрь 2009, на XVII Российском Национальном Конгрессе «Человек и лекарство» 13 апреля 2010, г.Москва, на 2-м Международном Конгрессе по биотехнологии и биоэнергетике «ЕвразияБио», 14 апреля 2010, г.Москва, на Digestive Disease Week, 1-5 мая, 2010. Новый Орлеан, Луизина, США, на пленарном заседании Московского городского научного общества терапевтов, 27 мая 2010г., на международной конференции «Современные тенденции в лечении воспалительных заболеваний кишечника», 28 мая 2010 - Всемирный день здоровья – день ВЗК, г.Москва, на 41-м Гастроэнтерологическом Конгрессе стран Северной Европы, 8-11 июня 2010, - Копенгаген, Дания, на 6-м Центрально Европейском Конгрессе гастроэнтерологов, 25-26 июня 2010, Прага (Чехия).

Основные положения диссертации доложены и обсуждены на заседании Ученого Совета Центрального научно - исследовательского института гастроэнтерологии 9 апреля 2010 года.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ

Диссертация изложена на 292 страницах машинописного текста, состоит из введения, 10 глав, в которых представлен обзор литературы, сведения о больных и методы исследования, результаты проведенных исследований и обсуждение полученного материала, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Работа иллюстрирована 50 таблицами и 61 рисунком. Библиографический указатель включает 426 работ, из них на русском языке 36 источников и 390 работ на английском языке. 

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В основу работы положены результаты обследования 132 больных ВЗК, находившихся на лечении в отделении патологии кишечника ЦНИИ гастроэнтерологии с 2008 по 2010 г.г. С 2008 г в отделе патологии кишечника ЦНИИГ впервые в нашей стране проводится системная (внутривенная) трансплантация аллогенных мезенхимальных стромальных клеток (МСК) больным ВЗК.

59 больным ЯК и БК была осуществлена трансплантация аллогенных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга, что составило 7,5% от всех больных ВЗК (791), пролеченных в отделении патологии кишечника за данный период времени, 55 больных ВЗК получали стандартную терапию препаратами 5-аминосалициловой кислоты (5-АСК), глюкокортикостероидами (ГКС) и иммунодепрессантами, 18 больным проведена индукционная и поддерживающая терапия инфликсимабом (ИНФ) в течение 12 месяцев.

Клиническая характеристика больных

С февраля 2008 г по март 2010 г комплексное лечение с трансплантацией МСК получили 44 больных ЯК (1-я группа) и 15 – БК (4-я группа). При введении МСК учитывался пол больных ВЗК. Повторная трансплантация МСК осуществлена 20 больным с интервалом от 2 месяцев до 1 года с момента первой трансплантации.

Критериями включения являлись больные, которые имели диагноз язвенного колита или болезни Крона, подтвержденный с помощью колоноскопии, ирригоскопии, рентгенологического исследования тонкой кишки, гистологического исследования, а так же наличие согласия больного на проведение данного метода лечения и режима обследования.

Больные исключались из исследования, если у них имелось: 1) сероположительный результат при определении поверхностного антигена к вирусу гепатита В (HВV), 2) антител к вирусу гепатита C (HCV), 3) положительная ИФА реакция на ВИЧ, положительная RW, 4) наличие в анамнезе лимфопролиферативных заболеваний или злокачественных опухолей, 5) беременность.

В группы сравнения мы включили 40 больных ЯК (2-я группа) и 15 больных БК (5-я группа), которые получали терапию 5-АСК/ГКС и цитостатиками, 12 больных ЯК (3-я группа) и 6 больных БК (6-я группа), которые получали терапию инфликсимабом (ИНФ). Возраст больных находился в диапазоне от 19 до 60 лет (медиана – Ме – 30 лет), большинство - 71(53,8%) составляли мужчины (Таблица 1). Продолжительность болезни составляла от 1 года до 10 лет (Ме 3 года).

Таблица 1

Распределение больных по возрасту и полу (n = 132)

Возраст

Болезнь Крона (n = 36)

Язвенный колит (n = 96)

муж

жен

муж

жен

абс.

доля, %

абс.

доля, %

абс.

доля, %

абс.

доля, %

18-29 лет

5

13,9

9

25

29

30,2

20

20,8

30-39 лет

4

11,1

5

13,9

13

13,5

11

11,5

40-49 лет

7

19,4

3

8,3

7

7,3

7

7,3

50 лет и старше

1

2,8

2

5,6

5

5,2

4

4,2

всего

17

47,2

19

52,8

54

56,25

42

43,75

Современная клиническая классификация язвенного колита учитывает распространенность процесса, выраженность клинических и эндоскопических проявлений, характер течения заболевания.

Согласно данным эндоскопического обследования преобладающее количество больных язвенным колитом имело тотальное поражение толстой кишки - 66 (68,8%), левостороннее поражение у 25 (26,1%) больных и у 5 больных (5,1%) - проктосигмоидит.

Распределение больных по протяженности в группах больных в зависимости от метода терапии было следующим (таблица 2): тотальный колит установлен у 30 больных (68,1%)1-й группы, у 26 (65,0%) больных 2-й группы, у 12 больных (100%) в 3-й группе; левостороннее поражение до селезеночного изгиба в 1-й группе было у 11 (25,0%), во 2-й – так же у 12 (30,0%), больных с левосторонним поражением толстой кишки в 3-й группе не было; дистальный колит (проктосигмоидит) – у 3 (6,8%) и 2 (5%) больных 1-й и 2-й группы соответственно, больных с проктосигмоидитом так же не было.

Таблица 2

Характеристика больных ЯК в зависимости от протяженности поражения

кишечника и особенностей течения

Характеристика больных

Группы больных

1-я

2-я

3-я

Протяженность поражения кишечника

Абс.

Доля,%

Абс.

Доля,%

Абс.

Доля,%

Дистальный колит

(проктосигмоидит)

3

6,8

2

5

-

-

Левосторонний колит

11

25

12

30

-

-

Тотальный колит

30

68,1

26

65

12

100

Течение заболевания

Впервые выявленное 

5

11,4

5

12,5

-

-

Хроническое рецидивирующее

29

65,9

25

62,5

12

100

Хроническое непрерывное 

10

22,7

10

25

-

-

По характеру течения заболевания у 11 (11,5%) больных ЯК установлен впервые, у остальных наблюдалось хроническое рецидивирующее 63 (65,6%) или непрерывное 22 (22,9%) течение. По группам распределение больных в зависимости от течения заболевания было следующим (таблица 3): в 1-й группе впервые ЯК был установлен у 5 (11,4%) больных, во 2-й – у 5 (12,5%) больных, в 3-й группе больных с острой атакой язвенного колита не было. В 1-й группе хроническое течение с частым чередованием обострений и ремиссий (рецидивирующий тип) был установлен у 29 (65,9%) больных, во 2-й – у 25 (62,5%) больных, в 3-й группе 12 (100%) больных, заболевание протекало непрерывно (непрерывное течение язвенного колита) в 1-й группе у 10 (22,7%) больных, во 2-й группе было 10 (25,0%) больных, в 3-й группе больных с непрерывном течением ЯК не было.

Тяжесть течения язвенного колита определялась как протяженностью поражения, так и активностью воспалительного процесса и глубиной деструктивных изменений кишечной стенки. Степень тяжести язвенного колита оценивались нами по критериям тяжести язвенного колита, предложенные в 1955 году Truelove и Witts, дополненные проф. М.Х. Левитаном и проф. Е.А.Белоусовой, которые учитывали частоту стула в сутки, наличие крови в кале, лихорадку, тахикардию, снижение массы тела, а так же уровень гемоглобина, СОЭ, лейкоцитоз, СРБ, наличие гипопротеинемии (таблица 3).

Таблица 3

Распределение больных язвенным колитом в зависимости тяжести атаки

Тяжесть атаки

1-я

2-я

3-я

Абс.

Доля,%

Абс.

Доля,%

Абс.

Доля,%

Легкая

3

6,7

2

5

-

-

Среднетяжелая 

37

84

36

90

8

75

Тяжелая

4

9,3

2

5

4

25

Легкое обострение было зарегистрировано нами у 5 больных с проктосигмоидитом (5,2%). Оно было обычно связано с минимальной степенью активности воспалительного процесса и клинически проявлялось частотой дефекаций менее 5 раз в сутки, небольшой примесью крови. При дистальных поражениях толстой кишки у больных нередко отмечались запоры, а эквивалентом дефекаций являлись ложные позывы или тенезмы.

Тяжелое течение отмечено нами у 10 (10,5%) больных, среднетяжелая форма была диагностирована нами у 81 (84,4%) больных, занимая промежуточное положение между легкими и тяжелыми вариантами заболевания. По группам больные со среднетяжелой формой язвенного колита были распределены следующим образом: 1-группа – 37 (84,0%), 2-я – 36 (90,0%), 3-я группа – 8 (75,0%) больных (Таблица 3).

Таким образом, основу группы больных язвенным колитом составили больные с распространенным поражением толстой кишки (тотальное или левостороннее), течение заболевания имело хронический рецидивирующий характер, госпитализированные с атакой средней тяжести.

Так же в исследование было включено 36 (27,3%) больных болезнью Крона. 15 получали стандартное противовоспалительное лечение (ГКС/цитостатики). У 15 больных стандартная терапия с определенной коррекцией сочеталась с трансплантацией МСК. 6 больных получали индукционную терапию инфликсимабом 5 мг/кг по протоколу 0-2-6, и последующую поддерживающую терапию с интервалом 8 недель.

Таблица 4

Распределение больных болезнью Крона в зависимости

от распространенности поражения и тяжести атаки

Распространенность, характер течения

Группы больных

4-я

5-я

6-я

Абс.

Доля,%

Абс.

Доля,%

Абс.

Доля,%

Распространенность

Колит

7

46,6

7

46,6

3

50

Илеоколит

1

7,4

8

53,4

2

33,3

Илеит

7

46,6

-

-

1

16,7

Тяжесть атаки

Легкая

4

36,4

5

33,5

-

-

Среднетяжелая

11

63,4

10

66,5

4

66,4

Тяжелая

-

-

-

-

2

33,6

По распространенности процесса, как известно, при болезни Крона воспалительный процесс имеет дискретный характер, с возможной локализацией в толстой, в тонкой кишках, либо в тонкой и толстой одновременно. В группе МСК (4-я группа) больные разделились следующим образом: у 7 (46,6%) больных имелось на момент обследования изолированное поражение толстой кишки (колит), у 7 (46,6%) – изолированное поражение тонкой кишки (илеит), у 1 (7,4%) больной – сочетанное поражение как тонкой, так и толстой кишки (илеоколит). В группе ГКС (5-я группа) изолированное поражение толстой кишки (колит) было у 7 (46,6%) больных, у 8 (53,4%) – изолированное поражение тонкой кишки (илеит), сочетанного поражения кишечника в этой группе не было, в группе больных, получающих инфликсимаб (6-я группа) изолированное поражение толстой кишки (колит) было у 3 (50,0%) больных, у 2 (33,3%) – изолированное поражение тонкой кишки (илеит), как тонкой, так и толстой кишки (илеоколит) у одного больного – 16,7%. 

Тяжесть атаки болезни Крона вычислялась в баллах. Применялся индекс Беста (CDAI). В оригинальном варианте полученную сумму баллов интерпретируют следующим образом: легкая 150-220, умеренная 220-450, тяжелая более 450 баллов.

Тяжесть атаки на момент обследования оценивалась с учетом клинических данных (тяжесть диареи, боли в животе, общее самочувствие, похудание), а также лабораторных данных (степень анемизации).

Для оценки гормонорезистентности и гормонозависимости ВЗК использовались методические рекомендации, подготовленные на основе Европейского консенсуса по диагностике и лечению болезни Крона и язвенного колита, принятого Европейской организацией Крона и колита в 2004 году с дополнениями 2009 года. Согласно этим рекомендациям определение гормонорезистентности подразумевает сохранение активной формы заболевания, несмотря на применение преднизолона в дозе до 0.75 мг/кг/сут в течение 4 недель. Гормонозависимость предполагает, что при снижении дозы ГКС ниже эквивалента преднизолона 10 мг/сут (или дозу будесонида ниже 3 мг/сут) в течение трех месяцев после начала приема ГКС происходит рецидив активности заболевания, а так же если у больных ВЗК происходит рецидив в течение трех месяцев после отмены кортикостероидов. Данное определение предполагает, чтобы общая продолжительность приема кортикостероидов не превышала трех месяцев до достижения ремиссии болезни [Болезнь Крона (диагностика и лечение). Методические рекомендации. – Санкт-Петербург, «Наука и техника», 2007, стр.10-14].

Методы исследования

Клиническое состояние больных оценивали по специально разработанной карте, включающей жалобы, данные анамнеза и объективного обследования. Для оценки клинической активности язвенного колита мы использовали индекс, предложенный D.Rachmilevitz в 1989 году, учитывающий частоту дефекаций и интенсивность болевого синдрома в течение предшествующей недели, ежедневную кровопотерю и общее самочувствие, повышение температуры, наличие и характер внекишечных проявлений, уровень гемоглобина и СОЭ. Тяжесть атаки болезни Крона вычислялась в баллах, как указывалось ранее, нами применялся индекс Беста.

Всем больным проводили эндоскопическое исследование на видеосистеме фирмы Фуджинон EVE W-88A или ректороманоскопия (РРС) с посегментарной оценкой активности воспаления по шкале D.Rachmilevitz (1989). Поскольку в оригинальном индексе учет активности осуществлялся по состоянию прямой и/или сигмовидной кишки, в качестве количественной оценки нами был принят максимальный балл, соответствующий степени воспаления. Осуществлялась множественная лестничная биопсия из всех отделов толстой кишки или тонкой кишки. Получали по 6-10 фрагментов слизистой оболочки кишки. Исследования проводились в отделении эндоскопии.

Гистологическое исследование биоптатов проводили с помощью световой микроскопии с предварительным окрашиванием гематоксилином и эозином. Морфометрическое исследование выполнено 43 больным с помощью системы автоматического анализа видеоизображений «Cito-W», фирмы Dia-Morph. Стадии изменений морфологической картины СОТК оценивали по классификации, предложенной шкале, предложенной Гебс [Geboes K., Riddel R., Jensfelt B. et al., 2000]. Для подтверждения связи процессов регенерации с восстановлением иммунного баланса в организме, маркерами которого являются иммуноцитокины, нами производилось определение содержания в экстракте слизистой оболочки кишки больных ЯК и БК ИЛ-1, -ФНО, ИЛ-4, ИЛ-6 до трансплантации МСК и через 2 месяца после введения клеток. Исследование цитокинов проводилось иммуноферментным методом с использованием тест систем Diamed (Швейцария).

Содержание IgA, IgG, IgM определяли методом радиальной иммунодиффузии (Mancini G. et al., 1965), иммуноферментным методом с использованием тест-систем «IMMCO Diagnostics» (США) и коммерческих наборов (Orgentec Diagnostics GmbH). Антитела к цитоплазме нейтрофилов (IgG –ВРI) методом непрямой иммунофлюоресценции [Kallenberg С.G.M., Mulder A.H.L., Tervaert J.W.C., 1992], используя реактивы фирмы «IMMCO Diagnostics» (США). Цитокины ИЛ-1, ИЛ-4, ИЛ-10, -ФНО, ТФР-1 - исследовали иммуноферментным методом с использованием коммерческих наборов тест-систем ООО «Протеиновый контур» и «Цитокин» (Санкт-Петербург). Иммуноферментный анализ содержания онкомаркеров СА-242, СА-19-9 до и после трансплантации МСК проводили тест-системами концерна "Hoffmann La Roche.

Оценку клинического состояния больных, инструментальные и лабораторные методы исследования осуществляли перед включением в исследование, через 2, 6, 12 и 24 месяца.

Получение МСК. Методика получения и размножения аутологических и аллогенных МСК в необходимом для системной пересадки количестве (150-200 млн клеток) опубликована [Цыб А.Ф., Коноплянников А.Г., Колесникова А.И. и др., 2004] осуществлялась в отделении клеточной и экспериментальной лучевой терапии ГУ «Медицинский радиологический научный центр» РАМН, г. Обнинск, на основании лицензии № ФС-2006/206 от 11 августа 2006 года. Перед внутривенным введением МСК делали посев из полученных выращиванием в культуре популяций клеток для контроля возможного бактериального загрязнения (его не было выявлено ни в одном случае).

Нами выбран наиболее адекватный способ введения культуры клеток, а так же методы оценки эффективности клеточной терапии: индекс клинической и эндоскопической активности ЯК, индекс Гебса, продолжительность ремиссии у больных с хроническим рецидивирующим и хроническим непрерывным течением язвенного колита (не менее 12 месяцев), оценка относительного и абсолютного рисков развития рецидивов заболевания, частоту госпитализаций в течение года. По результатам клинических, эндоскопических и морфологических исследований слизистой оболочки толстой кишки нами был проведен сравнительный анализ эффективности различных схем лечения больных язвенным колитом, включающих комплексную терапию с применением трансплантации МСК (1-я группа), терапию препаратами 5-АСК/ГКС (2-я группа), инфликсимабом (3-я группа) через 2, 6, 12 и 24 месяца от начала терапии. Больные всех трех групп были сопоставимы по возрасту, полу, индексам клинической, эндоскопической активности, длительности течения язвенного колита, протяженности поражения и средней продолжительности приема иммуносупрессоров. Данные показатели представляются важными для оценки прогнозирования эффективности клеточной терапии.

Культуру МСК, выращенную из костного мозга здорового донора того же пола, вводили капельно в/в. Для осуществления системной пересадки 150-200 млн аллогенных МСК, размноженных в культуре, клетки суспендировали в 200 мл стерильного физиологического раствора, содержащего гепарин в концентрации 50 ед/мл, и путем постановки капельницы вводились пациенту в течение 40-60 минут.

Прежде чем приступить к ограниченным клиническим испытаниям метода системной трансплантации аллогенных мезенхимальных стромальных клеток (МСК) костного мозга человека у больных язвенным колитом и болезнью Крона был проведен эксперимент по изучению терапевтического потенциала трансплантированных МСК при остром и хроническом поражении кишечника, индуцированном натрий декстран-сульфатом (ДС) у крыс линии Вистар.

Экспериментальный раздел работы выполнен на 60 лабораторных животных: крысах-самцах Вистар массой 250-300г при свободном доступе к пище, на рационе питания, соответствующем нормативам ГОСТа. Экспериментальный раздел состояла из 3-х основных частей. В 1 части работы проводилась отработка методов моделирования острого и хронического колита. Во 2 части работы была отработана методика введения МСК крысам с моделями острого и хронического колита и характеристика фенотипических свойств культуры клеток, подготовленных и использованных для трансплантации. В 3 разделе работы производили изучение деструктивных изменений слизистой оболочки кишки и процессов репаративной регенерации этих язв с помощью МСК.

Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием компьютерной программы «STATISTICA 6.0». Для определения значимости различий между средними величинами применяли t-критерий Стъюдента. Различия считали значимыми при уровне вероятности р<0,05. При оценке данных, не отвечающих нормальному распределению, использовали непараметрические методы: корреляционный анализ с применением коэффициента ранговой корреляции Спирмена (Rs); для анализа качественных признаков, применяли непараметрический критерий. Для оценки продолжительности ремиссии нами использовался метод построения кривых выживаемости - метод Каплана и Майера. При количестве наблюдений менее 5 использовали поправку Йейтса; для сравнения двух выборок разного объема использовали ранговый критерий Манна-Уитни.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

В ходе эксперимента было выявлено, что наиболее выраженные изменения при острой затравке дестран-сульфатом (ДС) наблюдались в слизистой оболочке подвздошной кишки: отмечалось резкое уменьшение высоты кишечных ворсин, в ряде случаев кишечные ворсины вовсе отсутствовали, глубина крипт резко увеличивалась, наблюдалось увеличение количества межэпителиальных лимфоцитов и усиление лимфоплазмоцитарной инфильтрации собственной пластинки. Менее всего по сравнению с контрольной группой изменения были выражены в слепой кишке и восходящем отделе толстой кишки. Введение МСК в серии с острой затравкой существенно улучшало гистологическую картину слизистой подвздошной кишки: высота кишечных ворсин хотя и была в ряде случаев снижена, однако в целом соответствовала их состоянию в контрольной группе. В серии опыта с хронической затравкой декстран-сульфатом, по сравнению с острой, через 2 месяца после введения МСК гистологическая картина значительно улучшилась. Практически восстанавливалась нормальная структура слизистой оболочки подвздошной, слепой и восходящей кишки, значительно большая высота крипт по сравнению с контрольной группой. Введение МСК резко активизировало пролиферативные процессы и приводило к гиперплазии эпителия слепой кишки и усиливало образование мелких и крупных фолликулов как в слизистой оболочке, так и в подслизистом слое, увеличивалось количество бокаловидных клеток в эпителии, а также высота и число кишечных ворсин слизистой оболочки

Таким образом, было продемонстрировано, что в эксперименте МСК обладают высокой пролиферативной активностью и большим репаративным потенциалом. Введение МСК приводило к полному восстановлению и уменьшению воспаления слизистой оболочки слепой и восходящей кишки. Наиболее выраженные репаративные процессы отмечаются в серии опыта с хронической затравкой через 2 месяца после введения МСК.

Оценка эффективности различных методов лечения язвенного колита

В настоящее время трансплантация мезенхимальных стромальных клеток при лечении тяжелых, рефрактерных форм воспалительных заболеваний кишечника в настоящее время не является стандартной терапией и требует дальнейшего проведения клинических исследований, однако уже сейчас эффективность данного метода убеждает в необходимости расширения дальнейших исследований.

Трансплантация аллогенных МСК костного мозга была осуществлена 86 больным, что составило 10,8% от всех больных ВЗК, пролеченных в отделении патологии кишечника за 2 года. 59 больных включены в аналитическую группу, с минимальным сроком наблюдения 12 месяцев. Время наблюдения за больными составило от 12 до 24 месяцев.

Все больные ЯК получали по показаниям препараты 5-АСК (сульфасалазин, месалазин), кортикостероиды (метипред, преднизолон), иммунодепрессанты (азатиоприн). Больным первой группы за 2 – 3 дня до введения МСК отменяли иммунодепрессанты, снижали дозу кортикостероидов до 20 – 30 мг/сут, дозу аминосалицилатов оставляли на уровне 3,0 г/сут.

Исходный уровень показателя клинической активности до начала терапии составил в 1- й группе 8,3±0,26 баллов, во 2-й - 8,1±0,2, а в 3-й, соответственно, - 8,5±0,5 разницы по группам по исходному индексу клинической активности не было (p>0,05). Уровень показателя эндоскопической активности до начала терапии составил в 1- й группе 7,7±0,3 баллов, во 2-й - 7,2±0,4, а в 3-й - 8,2±0,4. Разницы между 1-й и 2-й групп по исходному индексу эндоскопической активности не было (p>0,05), эндоскопическая активность была несколько выше в 3-й группе, так как терапию инфликсимабом получали больные с более тяжелым течением язвенного колита. Уровень основных исходных показателей группы больных язвенным колитом в зависимости от метода выбранной терапии представлен в таблице 5.

Таблица 5

Сравнение групп по основным клиническим и демографическим показателям

Показатель

Группы больных

1-я группа

2-я группа

3-я группа

Возраст, годы

34,25±1,9

35,1±1,8

45,5±4,6

Длительность ЯК, годы

3,34±0,3

3,36±0,31

7,25±1,6

Средняя продолжительность приема азатиоприна, мес

6,86±0,6

6,97±0,6

9,25±0,78

Индекс эндоскопической активности, баллы

7,7±0,3

7,2±0,4

8,2±0,42

Индекс клинической активности, баллы

7,4±0,35

7,2±0,4

8,5±0,4

При оценке полученных результатов выяснилось, что через 2 мес. по ряду показателей индексов клинической и эндоскопической активности - отмечалось достоверное снижение по сравнению с исходным уровнем и между группами (МСК и 5-АСК/ГКС), что в последующем было подтверждено сравнительным анализом между группами через 6 и 12 месяцев. Полученные данные подтвердили наличие и местного и системного воздействия МСК на течение ЯК. Суммарный индекс клинической активности у больных 1-й группы достоверно снизился в среднем с 8,3±0,26 до 1,55±0,3 баллов, у больных 2-й группы – с 8,1±0,2 до 1,4±0,2 баллов, в группе больных 3-й группы, получающих инфликсимаб – с 8,5±0,5 до 1,3±0,2. Достоверной разницы в величине индекса между группами через 2 месяца после проведенной терапии не было.

В таблице 6 показана динамика индекса эндоскопической активности Мейо в группах больных ЯК через 2, 6, 12 и 24 мес лечения. Величина индекса у больных 1-й группы составляла 7,7±0,3, у больных 2-й группы – 7,2±0,4 балла, в 3-й группе - 8,2±0,42. Через 2 месяца индекс достоверно снизился в 1-й, 2-й и 3-й группах до 1,16±0,09 (р<0,05), 1,43±0,15 (р<0,05), 1,2±0,1 баллов (р<0,05) соответственно, объективно подтверждая уменьшение морфологических признаков воспаления слизистой оболочки толстой кишки. В дальнейшем индекс эндоскопической активности ЯК уже значительно отличался: у больных 1-й группы через 6 и 12 месяцев он продолжал снижаться до 0,7±0,15 и 0,76±0,15 баллов, приближаясь к уровню ремиссии, через 24 месяца он составил 0,68±0,1. У больных 2-й группы он за этот же период времени повысился до 2,4±0,25 и 2,6±0,4 баллов (р<0,05), несмотря на отсутствие клинических симптомов рецидива. Динамика индекса Мейо у больных 3-й группы за 24 месяца наблюдения сохранялся на одном уровне - 0,7±0,1; 0,8±0,1 и 0,8±0,1.

Таблица 6

Динамика индекса эндоскопической активности Мейо

Группа

Исходный уровень

2 мес.

6 мес.

12 мес.

24 мес.

МСК (1-я)

7,7±0,3

1,16±0,1*

0,7±0,15**

0,76±0,2**

0,68±0,1**

5-АСК/ГКС (2-я)

7,2±0,4

1,43±0,15*

2,4±0,25*

2,6±0,4*

2,0±0,15*

ИНФ (3-я)

8,2±0,42

1,2±0,1*

0,7±0,1*

0,8±0,1*

0,8±0,1*

Примечание. *  (р<0,05) в сравнении с исходными значениями внутри группы

** (р<0,05) в сравнении групп

Динамика индекса клинической активности за 24 месяца наблюдения представлены в таблице 7.

Таблица 7

Динамика индекса клинической активности Рахмилевича

Группа

Исходный уровень

2 мес.

6 мес.

12 мес.

24 мес.

МСК (1-я)

8,3±0,26

1,55±0,3*

1,8±0,3**

1,8±0,3**

1,6±0,2**

5-АСК/ГКС (2-я)

8,1±0,2

1,4±0,2*

2,7±0,4*

2,9±0,4*

2,7±0,3*

ИНФ (3-я)

8,5±0,5

1,3±0,2*

2,0±0,3*

2,0±0,3*

1,7±0,3*

Примечание. *  (р<0,05) в сравнении с исходными значениями внутри группы

** (р<0,05) в сравнении групп

Таким образом, трансплантация аллогенных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга способствует снижению индекса клинической активности воспалительного процесса при язвенном колите через 12 месяцев с 8,3±0,26 до 1,8±0,3 баллов (во 2 группе с 8,1±0,2 до 2,9±0,4 баллов) (р<0,05) и снижению индекса эндоскопической активности у больных ЯК с 7,7±0,3 до 0,76±0,2 (во 2 группе с 7,2±0,4 до 2,6±0,4) (р<0,05) и сопоставима по эффективности с терапией инфликсимабом.

Гистологическая оценка эффективности различных методов лечения

язвенного колита

Для оценки степени воспаления нами использовался индекс Гебса, в котором учитывается лимфо-плазмоцитарная инфильтрация, нейтрофильная и эозинофильная инфильтрация, межэпителиальные нейтрофилы, деструкция крипт, наличие эрозий, язв, грануляций.

У 35 из 44 больных ЯК, леченных МСК, на протяжении последующих 12 месяцев отмечалось постепенное восстановление морфологической картины слизистой оболочки толстой кишки, исчезновение очагов деструкции, спонтанной и контактной кровоточивости.

Для оценки эффективности терапии мы также использовали интегративный индекс Гебса. До трансплантации МСК в группе больных язвенным колитом индекс Гебса составил 4,4±0,3, и во 2-й группе - 4,4±0,2, в 3-й - 4,35±0,2, то есть по степени патогистологической активности язвенного колита больные были сопоставимы.

При гистологическом исследовании в фазе обострения язвенного колита воспалительные изменения локализующиеся в слизистой оболочке и подслизистом слое, они были инфильтрированы плазматическими клетками и лимфоцитами, обнаруживались крипт-абсцессы, микроэрозии и изъязвления (рис.1 а, б).

Наблюдается уменьшение количества бокаловидных клеток, инфильтрация lamina propria лимфоцитами, плазматическими клетками, нейтрофилами и эозинофилами (рис. 2).

Рис 1. Гистологическая картина СОТК до начала терапии МСК (больной П., 32 г.):

а) Деструкция крипт;

б) - формирование крипт-абсцесса

(окраска гематоксилином и эозином; увеличение Х 250).

Рис. 2. Гистологическая картина СОТК до начала терапии МСК (больной П., 32 г.).

Диффузная лейкоцитарная инфильтрация собственной пластинки, деструкция эпителия базальных отделов крипт. Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение Х 250.

После трансплантации МСК через 2 месяца отмечалась положительная динамика – индекс Гебса составил 0,7±0,1. Микроскопически отмечалась гиперплазия бокаловидных клеток, расщепление крипт (рис.3), появление большого количества бокаловидных клеток среди клеток поверхностного эпителия (рис.4).

Рис. 3 Гистологическая картина СОТК через 2 месяца после трансплантации МСК

(больной П., 32 г.). Гиперплазия бокаловидных клеток, расщепление крипт.

Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение Х 500.

Рис. 4. Гистологическая картина СОТК через 2 месяца после трансплантации МСК

(больной П., 32 г.). Появление бокаловидных клеток среди клеток поверхностного эпителия. Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение Х 500.

У больных 2-й группы, которым проводилась стандартная терапия индекс Гебса составил 1,0±0,1. Микроскопически также отмечалась положительная гистологическая динамика, однако сохранялась более выраженная лимфоплазмоцитарная инфильтрация по сравнению с группой больных, которым вводили МСК.

Динамика самого индекса представлена на рисунке 5, из которого видно, что через 2 месяца трансплантация МСК достоверно приводит к снижению индекса Гебса до 0,7±0,1, по сравнению с группой больных, получающих терапию препаратами 5-АСК/ГКС - 1,0±0,1 (р<0,05) и сопоставима по эффективности с терапией инфликсимабом, при которой индекс Гебса составил 0,66±0,1. Через 12 месяцев индекс Гебса в 1-й группе остается на прежнем уровне - 1,0±0,1, в то время как во 2-й группе индекс Гебса увеличивается более чем в полтора раза до 1,2±0,02, в 3-й группе больных, получающих инфликсимаб, степень воспаления слизистой по шкале Гебса- 0,6±0,1.

Рис. 5. Динамика индекса Гебса по группам больных за 12 месяцев наблюдения.

* - р>0,05 в сравнении групп

Прогнозирование стабильности ремиссии язвенного колита

Любая терапия должна быть направлена на улучшение прогноза заболевания, улучшение качества жизни больных. Это особенно важно, так как в большинстве случаев ВЗК имеет неблагоприятное течение и приводит большинство пациентов к инвалидизации. Для оценки продолжительности ремиссии нами использовался метод построения кривых выживаемости (метод Каплана и Майера) [Kaplan E.I., Meier P., 1958], который может быть использован практически при любом количестве пациентов), отражающих вероятность пережить определенное время без отрицательного события, в нашем случае без рецидива заболевания. Точка начала отсчета выживаемости — дата включения в исследование, точка окончания отсчета выживаемости — дата последнего наблюдения, отрицательное событие — рецидив заболевания. При сравнении двух кривых выживаемости - стабильности ремиссии, у пациентов с проктосигмоидитом различий выявлено не было (р=0.708), продолжительность ремиссии в группе МСК составила 19,2±2,4 месяца, в группе 5-АСК/ГКС – 17,6±3,1 месяца.

В группах больных с левосторонним поражением (рис.6) толстой кишки есть значимое различие в продолжительности ремиссии в зависимости от вида терапии (р=0.012). Продолжительность ремиссии у больных, которым проведена трансплантация МСК составила 20,0±1,1, в группе, получающих стандартную терапию препаратами 5-АСК/ГКС - 11,6±1,5.

При сравнении кривых выживаемости (стабильности ремиссии) у больных с тотальным поражением толстой кишки (рис.7) так же выявлено различие в зависимости от метода лечения больных язвенным колитом (р=0.036). Продолжительность ремиссии у больных с тотальным поражением толстой кишки, получивших МСК, составила 11,5±1,7 месяцев, в группе 5-АСК/ГКС – 7,4±0,6 месяцев.

Рис. 6. Кривая Каплана-Мейера для периода времени (месяцы) до обострения заболевания; для терапии в комбинации с трансплантацией МСК и стандартной терапией препаратами 5-АСК и ГКС у больных ЯК с левосторонним поражением.

Рис. 7. Кривая Каплана-Мейера для периода времени (месяцы) до обострения заболевания у больных ЯК с тотальным поражением; для терапии в комбинации с трансплантацией МСК и стандартной терапией препаратами 5-АСК и ГКС.

При сравнении кривых выживаемости (стабильности ремиссии) у больных с тотальным поражением толстой кишки при проведении трансплантации МСК и терапии инфликсимабом различий не было выявлено (p=0.554).

Продолжительность ремиссии у больных, получивших МСК, составила 11,5±1,7 месяцев, в группе ИНФ – 11,6±0,6 месяцев. Ремиссия заболевания сохранялась у большинства больных, которым проведена терапия инфликсимабом и трансплантированы МСК более года. Средняя продолжительность ремиссии у больных язвенным колитом в зависимости от метода терапии за 24 месяца наблюдения представлена на рисунке 8.

Рис. 8. Средняя продолжительность ремиссии (мес.) у больных язвенным колитом в зависимости от метода терапии за 24 месяца наблюдения.

Таким образом, продолжительность ремиссии зависит от метода выбранной терапии язвенного колита: более длительная ремиссия зарегистрирована у больных, которым проведена системная трансплантации аллогенных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга и проводится поддерживающая терапия инфликсимабом.

Оценка рисков возникновения рецидива язвенного колита

в зависимости от проводимого лечения

В ретроспективном исследовании мы сравнивали три группы больных в зависимости от метода выбранной терапии. Вопрос о проведении такой терапии должен решаться индивидуально с учетом риска рецидива заболевания. После проведенной оценки рисков на основе данных исследования получены следующие результаты. Риск развития рецидива ЯК за период наблюдения (12 месяцев) у больных, получивших МСК (1-я группа сравнения) составил 0,2051, у больных, получавших только препараты 5-АСК, ГКС и цитостатики (2-я группа сравнения), этот показатель составил 0,5333, таким образом, относительный риск (RR) составил 0,3486. При расчете отношения шансов (OR) риск развития рецидива в 1-й группе составил 0,2582, во 2-й – 1,1428, а отношение шансов – 0,2258. Следовательно, абсолютный риск развития рецидива (ARR) ЯК после системной трансплантации МСК был ниже, чем при проведении терапии препаратами 5-АСК, ГКС и цитостатиками (RR и OR меньше 1).

На основании показателя «снижение абсолютно риска» был рассчитан показатель Number needed to treat (NNT). Оказалось, чтобы избежать одного случая раннего рецидива язвенного колита, необходимо провести трансплантацию аллогенных мезенхимальных стволовых клеток 3 больным язвенным колитом (таблица 8). 

Таблица 8.

Расчет абсолютного снижения риска (Absolute risk Reduction (ARR)) и числа пациентов, которых необходимо пролечить(Number needed to treat (NTT))

Абсолютное снижение риска

Absolute risk Reduction (ARR)=

0,5333-

0,2051

0,3282%

Число пациентов, которых надо пролечить

Number needed to treat (NTT)=

1/0,3282

=3 человека

При сравнении оценки рисков между группой МСК и ИНФ были получены результаты, свидетельствующие о сопоставимости данных методов терапии ЯК по своей эффективности. Оценка рисков развития раннего рецидива язвенного колита при проведении терапии ИНФ и системной трансплантации аллогенных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга.

После проведенной оценки рисков на основе данных исследования получены следующие результаты. Относительный риск развития рецидива язвенного колита за период наблюдения (12 месяцев) при проведении системной трансплантации аллогенных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга составил 1, отношение шансов – 1. Риск развития рецидива ЯК за период наблюдения (12 месяцев) у больных, получивших МСК (1-я группа) составил 0,22, у больных, получавших инфликсимаб (3-я группа), этот показатель составил 0,2, таким образом, относительный риск (RR) составил 1,1. При расчете отношения шансов (OR) риск развития рецидива в 1-й группе составил 0,29, во 3-й – 0,25, а отношение шансов – 1,2. Следовательно, абсолютный риск развития рецидива (ARR) ЯК после системной трансплантации МСК был сопоставим c терапией инфликсимабом (RR и OR равны 1) (таблица 9).

Таблица 9.

Расчет абсолютного снижения риска (Absolute risk Reduction (ARR)) и числа пациентов, которых необходимо пролечить(Number needed to treat (NTT))

Абсолютное снижение риска

Absolute risk Reduction (ARR)=

0,2-

0,22

0,02%

Число пациентов, которых надо пролечить

Number needed to treat (NTT)=

1/0,02

На основании полученных данных можно сделать вывод, что риск развития рецидива при проведении системной трансплантации аллогенных МСК костного мозга в комплексной терапии язвенного колита и в группе при проведении терапии инфликсимабом равнозначный (так как RR и OR равны 1).

Рис. 9. Процент госпитализированных больных с обострением ЯК

за 12 месяца наблюдения

Трансплантация МСК так же снижает частоту госпитализаций (рис.9): процент госпитализированных больных за 12 месяцев наблюдения составил и 20,5% в 1-й группе и 66,6% во 2-й группе (р<0,05), госпитализация по поводу обострения язвенного колита у больных, которым проводится терапия инфликсимабом составила 16,6%.

Рис. 10. Подтверждение биологического эффекта МСК.

Сравнивая индексы клинической и эндоскопической активности при рецидиве ЯК, выяснилось, что эти показатели ниже у больных, леченных МСК, нежели у больных, леченных только препаратами 5-АСК/ГКС. Индекс клинической активности в 1-й группе составил 5.86±0.6, во второй - 7.9±0.9 (р<0,05), эндоскопической - 4.0±0.53 и 6.6±0.65 (р<0,05) соответственно.

Таким образом, нашло подтверждение биологического эффекта МСК – даже при рецидиве ЯК индексы клинической и эндоскопической активности (D.Rachmilevitz) ниже у больных, леченных МСК, нежели у больных, леченных препаратами 5-АСК/ГКС (рис.10). 

Оценка эффективности различных методов лечения болезни Крона

в зависимости от метода лечения

Ответ на лечение БК должен определяться как снижение индекса Беста на 100 пунктов или более. Ответ на лечение должен определяться как снижение СDАI на 100 пунктов или более.

Ранний рецидив БК расценивается как обострение, возникшее менее чем через 3 месяца после медикаментозно достигнутой ремиссии. По характеру рецидивирования различают нечастое обострение (1 раз в год или реже), частое (2 и более раз в год) и непрерывное течение БК с постоянным персистированием симптомов без периодов ремиссии.

Руководствуясь данными рекомендациями ECCO, мы наблюдали 36 пациентов БК (илеитом, колитом или илеоколитом), с частым обострением и непрерывным течением заболевания, которым была проведена системная трансплантация аллогенных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга – 4-я группа (n=15), больных, которые получали стандартную терапию глюкокортикостероидами и азатиоприном (ГКС/АзА) – 5-я группа (n=15) и группа больных, которые были проведены на терапию инфликсимабом (n=6) – 6-я группа (таблица 10).

Таблица 10.

Характеристика больных БК с разными методами лечения

Показатель

4-я группа

5-я группа

6-я группа

Возраст, лет

37,0±2,9

36,9±2,8

38,8±5,8

Длительность БК, годы

6,3±1,5

6,8±1,5

8,7±2,3

Средняя продолжительность приема азатиоприна мес

6,5±0,9

7,1±0,8

18,2±1,6

Среднегодовая доза преднизолона, мг

3185,5±324

3136,9±239

3772,5±154,9

Индекс Беста,баллы

246,9±12,1

234,3±10,9

265,5±14,6

СРБ, мг/л

26,7±4,4

25,7±4,7

27,6±6,1

Гормонорезистентные

7(46,6%)

2 (13,3%)

3(50,0%)

Гормонозависимые

5(33,3%)

3(20,0%)

2 (33,3%)

Как было отмечено выше, индекс Беста (CDAI) до начала терапии в 4-й группе составлял от 196 до 361, в среднем 246,9±12,1, уровень CРБ составил - 26,7±4,4 мг/л, в 5-й группе - 234,3±10,9, уровень CРБ составил - 25,7±4,7 мг/л, в 6-й группе - 265,5±14,6, CРБ - 27,6±6,1 мг/л. У больных БК, получавших стандартную терапию + МСК (4 группа), исходный индекс активности по Бесту в среднем составил 246,9±12,1 баллов, у больных 5 группы – 234,3±10,9 баллов, у больных 6 группы - 265,5±14,6 (р>0,05), уровень СРБ составил - 26,7±4,4, 25,7±4,7 и 27,6±6,1 соответственно (р>0,05). У больных, которым назначена терапия инфликсимабом средняя продолжительность заболевания составила 8,7±2,3, против 6,3±1,5 лет у больных 4-й группы и 6,8±1,5 лет в 5-й группе. Средняя продолжительность приема азатиоприна у больных 6-й группы составила 18,2±1,6 месяцев, в 4-й - 6,5±0,9, в 5-й - 7,1±0,8. Учитывая более тяжелое и длительное течение болезни Крона у больных, которым назначен инфликсимаб, среднегодовая доза приема преднизолона была больше чем в группах, получающих терапию ГКС и которым была осуществлена трансплантация мезенхимальных стромальных клеток, и составила 3772,5±154,9 мг.

За период наблюдения в каждой группе больных имелись особенности течения болезни Крона. У 8 больных, которым была осуществлена трансплантация аллогенных мезенхимальных стволовых клеток костного мозга через 2 месяца наблюдения достигнута полная клиническая ремиссия - диарея не более 2 раз в сутки, стул оформленной консистенции, без патологических примесей; боли в животе не беспокоят, общее состояние удовлетворительное, отмечалась прибавка массы тела, исчезновение болевого синдрома, у 5 больных достигнута клинико-эндоскопическая ремиссия (33,3%), зарегистрировано полное заживление слизистой оболочки толстой кишки, в то время как на стандартной терапии процент заживления слизистой составляет около 17%. Через 6 месяцев количество больных, достигших клинико-эндоскопической ремиссии увеличилось до 9 человек (60%), через 12 месяцев ремиссия, достигнутая в первые два месяца наблюдения, сохранялась у всех 13 больных болезнью Крона, из них у 8 (61,5%) отмечено полное заживление слизистой кишки. За 12 месяцев наблюдения индекс Беста достоверно снизился и сохраняется до настоящего времени в среднем 75,8±13,8 (р=0,046). 11 больных болезнью Крона, которым осуществлена трансплпантация МСК, ранее получавшие глюкокортикостероиды (преднизолон, Буденофальк®), в настоящее время получают только препараты 5-АСК (Пентаса®, Салофальк®). У 8 больных из 13 (61,5%) зарегистрирована клинико-морфологическая ремиссия, у остальных 5 - полная клиническая ремиссия, с частичной эндоскопической ремиссией.

Таблица 11

Динамика индекса Беста (СDAI) у пациентов с болезнью Крона

на протяжении 12 месяцев

Группа

Исходный индекс Беста (CDAI)

2 месяца

6 месяцев

12 месяцев

4-я (МСК)

246,9±12,1

78,9 ±11,6*

65,8 ±25,8*

75,8 ±13,8*

5-я (ГКС/АзА)

234,3±10,9

61,8 ±8,97*

100,7 ±6,57*

121,5 ±24,7*

6-я (ИНФ)

265,5±14,6

83,6 ±9,6*

91,2 ±18,2*

76,8 ±25,8*

*р<0,05 по сравнению с исходным уровнем в группах

В группе больных, получавших стандартную терапию ГКС/АзА, через 2 месяца клиническая ремиссия достигнута у 13 больных, у 7 (46,7%) больных с заживлением слизистой оболочки кишки. Через 6 месяцев клинико-эндоскопическая ремиссия сохранялась у 2-х больных (13,3%), клиническая - у 7 (46,7%), рецидив болезни Крона произошел у 6 больных (40%). За год наблюдения больных в данной группе результаты терапии выглядели следующим образом: клинико-эндоскопическая ремиссия сохранялась у одного больного (6,7%), клиническая ремиссия - у 6 (40%), в связи с рецидивом заболевания на высокие дозы ГКС и иммуносупрессоры были переведены 5 (33,3%) больных, а 3 (20%) - на терапию инфликсимабом. Динамика индекса Беста (СDAI) по группам больных представлена в таблице 11.

Уровень индекса Беста (CDAI) через 24 месяца наблюдения у больных с положительной клинической динамикой в группах так же отмечалось различие по конечной точке. В 4-й группе (n=13) индекс Беста составил 62,0±8,87, в группе больных, которые получали ГКС (n=7) (5-я группа) - 90,4±9,0, в 6-й группе, получавших инфликсимаб - 64,7 ±19,7.

Как и у больных язвенным колитом мы использовали шкалу Гебса для оценки активности воспалительного процесса в СОТК. До трансплантации МСК в 4-й группе больных БК индекс Гебса составил 4,1±0,3, и в 5-й группе - 4,2±0,16, в 6-й - 4,6±0,16. Степень патогистологической активности БК у больных, которым начата терапия инфликсимабом был несколько выше. Через 2 месяца у пациентов 4-й группы составил 1,2±0,03, в 5-й группе - 1,3±0,1, в 6-й - 1,3±0,1, через 12 месяцев наблюдения индекс Гебса у больных, которым осуществлена трансплантация МСК и которые получали терапию инфликсимабом составили 1,1±0,02 и 0,7±0,17 соответственно, в то время как у больных, получавших терапию ГКС он составил 1,4±0,14.

В группе больных, которым проведена терапия инфликсимабом, через 6 недель положительная динамика отмечена у всех больных – индекс активности снизился к концу 8 недели на 58–106 пунктов у 4 больных, и на 50 пунктов у 1 больной. Через 14 и 24 недели от начала терапии Ремикейдом® у 4 больных индекс активности снизился менее 150, у них же в течение года отмечается ремиссия, поддерживаемая 5–АСК (Пентаса®). Инфликсимаб позволяет достичь клинической и эндоскопической ремиссии у больных, не ответивших на стандартные средства, включая иммуносупрессивные; индукция и сохранение ремиссии достигается в большинстве случаев без стероидов.

При сравнении двух кривых выживаемости (стабильность ремиссии) у пациентов с болезнью Крона, которые получали комплексную терапию с введением МСК (n=10) и больным, которым проведена терапия инфликсимабом (Ремикейдом®) (n=6) различий выявлено не было (р=0.279) (рис.11).

Продолжительность ремиссии в группе МСК составила 12,6±1,6 месяца, в группе ИНФ – 11,8±0,6 месяца.

Есть значимое различие в группах больных, которым проведена трансплантация МСК и которым проводится терапия препаратами ГКС/АзА (рис.12) (р=0.001).

Продолжительность ремиссии у больных, которым проведена трансплантация МСК, составила 12,6±1,6 месяцев, а в группе, получающих стандартную терапию препаратами ГКС/АзА - 7,9±0,5 месяцев. Продолжительность ремиссии зависит от выбранной терапии болезни Крона: более длительная ремиссия зарегистрирована у больных, которым проведена системная трансплантации аллогенных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга и у больных, которым проводилась терапия Ремикейдом®. Оба метода терапии сопоставимы по конечному результату.

Рис. 11. Кривая Каплана-Мейера для периода времени (месяцы) до обострения ЯК;

для терапии  в комбинации с трансплантацией МСК и терапия инфликсимабом.

Рис.12. Кривая Каплана-Мейера для периода времени (месяцы) до обострения БК;

для терапии в комбинации с трансплантацией МСК и терапией

глюкокортикостероидами/иммуносупрессорами.

Помимо основных показателей, характеризующих активность болезни Кона, индекса Беста и уровня СРБ, мы проанализировали среднекурсовую дозу преднизолона, принимаемую больными в зависимости от выбранной терапевтической тактики. Мы сравнили между собой группы больных, получающих терапию ГКС и комплексную терапию с применением МСК через 2, 6, 12 и 24 месяца.

Сравнивая терапевтическую эффективность инфликсимаба и системной трансплантации мезенхимальных стволовых клеток (МСК) у больных с непрерывным течением и рефрактерной формой болезни Крона, выяснилось, что оба метода позволяют достичь клинической и, в некоторых случаях, эндоскопической ремиссии, сохранение клинической ремиссии достигается в большинстве случаев без стероидов (р=0,95). Полученный сравнительный анализ представлен в таблице 12.

Таблица 12

Динамика индекса Беста, уровня СРБ и среднекурсовой дозы преднизолона в течение 24 месяцев в группах больных БК

Группы

Сроки

Среднекурсовая доза преднизолона, мг

Индекс Беста, баллы

СРБ, мг/л

МСК (4-я группа)

Исходные

показатели

2173,3±69,6

246,9±12,1

26,7±4,4

ГКС(5-я группа)

2144,0±96,2

234,3±10,9

25,7±4,7

ИНФ (6-я группа)

2376,7±82,0

265,5±14,6

27,6±6,1

МСК (4-я группа)

2 мес.

181,7±37,8*

98,6±13,2*

6,7±1,6**

ГКС(5-я группа)

112,7±23,6*

69,2±10,1*

13,2±1,7*

ИНФ (6-я группа)

150,7±27,4*

69,7 6,3*

4,5±0,5**

МСК (4-я группа)

6 мес.

88,6±46,1**

64,4±9,7**

3,6±0,6*

ГКС(5-я группа)

332,8±32,8*

88,6±13,1*

5,7±0,9*

ИНФ (6-я группа)

145,3±23,4**

64,3 4,5**

4,3±0,3*

МСК (4-я группа)

12 мес

131,7±36,8**

55,0±9,5**

4,8±0,7*

ГКС(5-я группа)

811,7±260,0*

118,5±22,8

5,3±0,6*

ИНФ (6-я группа)

150,7±28,2**

42,7±2,5**

4,47 ±0,2*

МСК (4-я группа)

24 мес

143,6±24,0**

53,6±9,6**

6,3±0,4**

ГКС(5-я группа)

1413,0±270,8

89,4±8,9*

17,1±5,2*

ИНФ (6-я группа)

180,5±31,4**

50,3±2,4**

5,0 ±0,4**

Примечание. *  (р<0,05) в сравнении с исходными значениями внутри группы

** (р<0,05) в сравнении групп

Таким образом, трансплантация аллогенных МСК костного мозга может рассматриваться как перспективный метод терапии рефрактерных форм болезни Крона, сопоставимый с терапией инфликсимабом, увеличивающий продолжительность ремиссии, способствующий заживлению слизистой оболочки кишки и позволяющий уменьшить, а в некоторых случаях отказаться от ГКС.

Иммунорегуляторный эффект МСК у больных

воспалительными заболеваниями кишечника

Стандартная терапия у большинства пациентов с ВЗК сопровождалась достоверным снижением увеличенного содержания сывороточных цитокинов по сравнению с уровнем, предшествующим лечению. При терапии 5-АСК содержание цитокинов у больных ЯК снижалось в среднем до 90-240 пг/мл. Внутривенное введение инфликсимаба (антитела к -ФНО) больным ЯК приводило к снижению (р<0,05) концентрации провоспалительных цитокинов – -ФНО, ИЛ-1 (до 55-70 пг/мл). Длительное применение иммунодепрессантов при прогрессирующем течении ЯК сопровождалось снижением уровня цитокинов, иммуноглобулинов. Нарушения функциональной активности иммунной системы при язвенном колите проявляются повышенной циркуляцией цитокинов, иммуноглобулинов, аутоантител к субклеточным структурам цитоплазмы нейтрофилов, выраженной в зависимости от вариантов течения, активности, стадии, продолжительности заболевания и проводимой терапии.

По мере увеличения частоты рецидивов, продолжительности заболевания, базисной терапии системными иммунодепрессантами уровень цитокинов снижался (в среднем от 110 до 224 пг/мл). Это обусловлено тяжелым прогрессирующим течением заболевания, длительным применением иммунодепрессантной терапии, угнетением функциональной активности иммунной системы, развитием вторичного иммунодефицита, что можно расценить как результат истощения, угнетения функциональной, в том числе и цитокинпродуцирующей активности иммунокомпетентных клеток.

Рис.13. Динамика уровня про- и противовоспалительных цитокинов после

трансплантации МСК.

* - p<0,05 в сравнении с исходными показателями

Системная однократная трансплантация МСК у больных с длительным анамнезом заболевания вызывала достоверное повышение изначально сниженного уровня цитокинов (рис. 13) (с 11,4 до 23,6 пг/мл), которое, тем не менее, оставалось ниже контрольных значений (42,8 пг/мл). Минимальный уровень их выявлен у больных, длительно лечившихся кортикостероидами и цитостатиками, и составил: ИЛ-1 – 9пг/мл, -ФНО -9,1 пг/мл , ИЛ-4 – 16,2 пг/мл. В развитии и течении хронических прогрессирующих воспалительных заболеваний кишечника важная роль принадлежит аутоиммунным реакциям, иммуноглобулинам и аутоантителам. Так, у больных ЯК, как правило, повышается сывороточная концентрация циркулирующих аутоантител к различным антигенным структурам цитоплазмы нейтрофилов. Она отражает интенсивность аутоиммунных воспалительных процессов и, следовательно, имеет важное диагностическое и прогностическое значение. У больных ЯК концентрация аутоантител к антигенам цитоплазмы нейтрофилов оставалась повышенной (42 -56 Е/мл, в контроле - 10 Е/мл) при использовании стандартной (5-АСК), иммунодепрессантной (глюкокортикостероиды, цитостатики) и цитокиновой (Ремикейд® - антитела к -ФНО) терапии. Результаты проведенного нами исследования показали, что у больных язвенным колитом введение МСК вызывало достоверное снижение увеличенного содержания аутоантител к антигенам цитоплазмы нейтрофилов (IgG-BPI) с 42±2,8 до 28±1,6 Е/мл через 2 месяца. Через 6 и 12 месяцев концентрация аутоантител составила соответственно 26 и 12 Ед/мл в группе больных, у которых были выявлены аутоантитела к антигенам цитоплазмы нейтрофилов. Эти данные подтверждают снижение интенсивности системных гуморальных аутоиммунных реакций у больных ЯК после трансплантации МСК, что подтверждало снижение активности воспалительного процесса в кишечнике.

Рис. 14. Динамика уровня иммуноглобулинов в сыворотке крови больных ЯК

*-p<0,05 в сравнении с исходным уровнем

Содержание иммуноглобулинов (рис.14) в сыворотке крови больных ЯК до введения МСК и спустя 2, 6 и 12 месяцев соответственно составило: IgG - 11,2 - 14,8 - 12,8 и 11,8 г/л; IgM- 0,9 - 2,2 - 1,6 -1,1 г/л; IgA - 1,82 - 3,8 - 2,6 и 1,5 г/л (норма - IgM- 1,3; IgG- 13,0; IgA -2,3 г/л) (p<0,05), что подтверждает иммуномодулирующий эффект МСК- стимулирует угнетенную иммунную систему больных ВЗК и оказывает в последующем противовоспалительный эффект. Измеряя в динамике уровень про- (ИНФ-, -ФНО, ИЛ-1) и противовоспалительных (ТФР-1, ИЛ-4, ИЛ-10) сывороточных цитокинов, иммуноглобулинов G, M, секреторного IgA отмечаются следующие закономерности.

В группе больных с анамнезом заболевания не более 3-х лет средний уровень IgG составил 12.5±0.71 г/л, IgM - 1.56±0.04 г/л, IgA - 2.2±0.08 г/л, -ФНО - 26.7±1.2 пг/мл, ИЛ-4 – 22,6±2,4 пг/мл, ИЛ-1- 9.2±0.2 пг/мл, во группе больных в более длительным анамнезом: IgG -8.8±0.9 г/л, IgM – 0,9±0.01г/л, IgA - 1.3±0.01 г/л, -ФНО - 13.9±1.9 пг/мл, ИЛ-4 – 10.8±0.5пг/мл, ИЛ-1 - 5.7±0.28 пг/мл (p<0,05) (таблица 13).

Таблица 13

Характеристики групп пациентов ЯК

в зависимости от эффективности трансплантации МСК

Показатель

Трансплантация МСК эффективна

(n = 30/68,2)

Трансплантация МСК не эффективна

(n = 14/31,8)

p

IgG, г/л

12,5±0,71г/л

8,8±0,9 г/л

р < 0,05

IgA, г/л

2,2±0,8 г/л

1,3±0,01 г/л

р < 0,05

IgM, г/л

1,5±0,04 г/л

0,9±0,01 г/л

р < 0,05

-ФНО, пг/мл

26,7±1,2 пг/мл

13,9±1,9 пг/мл

р < 0,05

ИЛ-1, пг/мл

9,2±0,2 пг/мл

5,7±0,28 пг/мл

р < 0,05

ИЛ-4, пг/мл

22,6±2,4 пг/мл

10,8±0,5 пг/мл

р < 0,05

После трансплантации восстанавливается изначально пониженный уровень показателей гуморального иммунитета и циткинового профиля и баланс про- и противовоспалительных цитокинов. Через 6 и 12 месяцев после введения МСК отмечается достоверный рост противовоспалительных цитокинов ТФР-1, ИЛ-4, ИЛ-10 и снижении провоспалительных цитокинов ИНФ-, -ФНО, ИЛ-1, что свидетельствует о регуляторных свойствах МСК и готовности их к индукции восстановительных (репаративных) процессов (рис.15).

Рис. 15. Динамика про- и противовоспалительных цитокинов в сыворотке крови

после трансплантации МСК

Следовательно, содержание сывороточных цитокинов при ЯК максимально повышено у пациентов с впервые выявленным заболеванием и снижается при терапии 5-АСК, Ремикейдом® и достигает минимальных значений при длительном применении иммунодепрессантной терапии по мере прогрессирования заболевания. Системная трансплантация МСК костного мозга стимулирует угнетенный синтез цитокинов, снижает интенсивность иммунопатологических процессов при ЯК, в динамике способствует выработке противовоспалительных цитокинов ТФР-1, ИЛ-4, ИЛ-10 и снижению уровня провоспалительных цитокинов ИНФ-, -ФНО, ИЛ-1, в последующем обеспечивая адекватный баланс про- и противовоспалительных цитокинов, что одновременно сочетается с позитивной динамикой клинической и эндоскопической картины заболевания.

Таким образом, трансплантация МСК больным ЯК и БК сопровождается разнонаправленными изменениями иммунного статуса больных: повышением сниженной концентрации цитокинов, иммуноглобулинов, уменьшением содержания аутологичных антител, наряду с позитивной клинической динамикой заболевания.

Прогнозирование клинической эффективности трансплантации

мезенхимальных стромальных клеток

Задачей нашего исследования явилось выявить критерии и показатели по которым возможно прогнозировать ответ на трансплантацию МСК.

В нашем исследовании системная трансплантации МСК оказалась эффективна у 32 больных (72,7%): безрецидивное течение ЯК за 12 месяцев наблюдения. Малоэффективной терапия оказалась у 12 (27,3%): у 6 больных рецидив в течение 2 месяцев, у 4 – через 6 месяцев, 2 – через 12 месяцев (таблица 14).

Таблица14

Исходы терапии МСК больных ЯК за период наблюдения

Критерии

эффективности

терапии

Непрерывное

n= 10

Рецидивирующее

n = 29

Впервые

выявленный

n = 5

Всего n=44

Абс.

Доля,%

Абс.

Доля,%

Абс.

Доля,%

Абс.

Доля,%

Исчезновение клинических симптомов

2

4,6

4

9,0

2

4,6

8

18,0

Исчезновение клинических симптомов + положительная клиническая динамика

1

2,3

2

4,6

0

0

3

6,8

+ эндоскопическая динамика, + клиническая динамика

2

4,6

1

2,3

1

2,3

4

9,0

+ эндоскопическая ремиссия, клинические симптомы исчезли

5

11,4

22

50,0

2

4,6

29

65,9

Таким образом, терапия оказалась эффективна в 77,3%: у 34 больного безрецидивное течение за 12 месяцев наблюдения, а неэффективной у 22,7% больных ВЗК (N=10): у 6 больных рецидив в течение 2 месяцев, у 4 – через 6 месяцев.

Мы проанализировали 2 группы больных в зависимости от эффекта от проведенной трансплантации мезенхимальных стромальных клеток костного мозга и больных, у которых эффекта от введения МСК не было или он был непродолжительным (таблица 15). При анализе учитывали пол, возраст больных, длительность и тяжесть заболевания, протяженность поражения кишки, среднюю продолжительность приема азатиоприна до трансплантации МСК, индекс клинической и эндоскопической активности, исходным уровнем иммуноглобулинов G, иммуноглобулинов А, иммуноглобулинов М, исходными значениями уровня цитокинов -ФНО и ИЛ-4 до трансплантации МСК.

Таблица 15

Характеристика групп больных в зависимости от эффективности трансплантации МСК

Показатель

Трансплантация МСК эффективна

(n = 30/68,2)

Трансплантация МСК не эффективна

(n = 14/31,8)

p

Возраст, годы

30,8±1,74

41,6±4,14

р < 0,05

Длительность ЯК, годы

2,3±0,2

5,85±0.56

р < 0,05

Средняя продолжительность приема азатиоприна до трансплантации МСК, мес.

5,3±0,2

10,1±1,5

р < 0,05

Индекс эндоскопической активности

7,25±0,2

7,2±0,2

р > 0,05

Индекс клинической активности

7,4±0,35

7,7±0,38

р >0,05

Частота курсов ГКС в год

0,86±0,09

2,00±0,19

р < 0,05

IgG

12,5±0,71г/л

8,8±0,9 г/л

р < 0,05

IgA

2,2±0,8 г/л

1,3±0,01 г/л

р < 0,05

IgM

1,5±0,04 г/л

0,9±0,01 г/л

р < 0,05

-ФНО

26,7±1,2 пг/мл

13,9±1,9 пг/мл

р < 0,05

ИЛ-1

9,2±0,2 пг/мл

5,7±0,28 пг/мл

р < 0,05

ИЛ-4

22,6±2,4 пг/мл

10,8±0,5 пг/мл

р < 0,05

Мужчины

56,6%

57,2%

-

Женщины

43,7%

42,8%

-

Протяженность поражения кишечника

Дистальный колит

(проктосигмоидит)

3(10%)

0

-

Левосторонний колит

8(26.6%)

3(21.5%)

-

Тотальный колит

19(63.3%)

11(78.5%)

-

Течение заболевания

впервые выявленное

5(16.6%)

1(7.2%)

-

хроническое рецидивирующее

17(56.6%)

9(64.3%)

-

хроническое непрерывное

8(26.8%)

4(28.5%)

-

Как указывалось ранее в патогенезе ВЗК, особенностях течения заболевания, данные клинико-лабораторные характеристики играют важную роль, и, следовательно, они могут быть предикторами эффективности трансплантации МСК.

В среднем содержание иммуноглобулинов в сыворотке крови до и после введения МСК соответственно составило: IgM - 1,6 г/л и 2,18 г/л; IgG - 11,2 и 14,8г/л; IgA - 1,42 и 2,84 г/л. Наиболее существенно возрастала концентрация IgA (р<,05), опосредующего местный гуморальный иммунный ответ. Содержание иммуноглобулинов в сыворотке крови в группе больных, где трансплантация оказала положительный эффект (n=32), до введения МСК составило: IgM - 1,5±0,04 г/л, IgG - 12,5±0,71 г/л, IgA - 2,2±0,8 г/л. В группе больных (n=12), где эффект был непродолжительный, исходный уровень иммуноглобулинов составил: IgG - 8,8±0,9 г/л, IgM - 1,3±0,01 г/л, IgA - 0,9±0,01 г/л (р<0,05). Уровень про-и противовоспалительных цитокинов в группе больных, где трансплантация эффективна, оказался достоверно выше по сравнению с группой, где эффекта от данной терапии не было. Показатели уровня -ФНО были в группе с эффективной трансплантацией составил 26,7±1,2 пг/мл, ИЛ-1-9,2±0,2 пг/мл, ИЛ-4 - 22,6±2,4 пг/мл, в группе без эффекта - 13,9±1,9 пг/мл, 5,7±0,28 пг/мл и 10,8±0,5 пг/мл соответственно. В своей работе мы продемонстрировали эффективность трансплантации МСК среди всех включенных в исследование больных ЯК, которая составила 68,2%. Динамика показателей гуморального иммунитета и цитокинового статуса через 2 месяца после трансплантации так же существенно отличалась в этих двух группах. В группе больных (n=12), где эффект был непродолжительный, уровень иммуноглобулинов составил: IgG - 7,3±0,2 г/л, IgM - 1,4±0,01 г/л, IgA - 1,0±0,01 г/л (р<0,05), в группе с положительным эффектом (n=30) IgG-18,5±0,9 г/л, IgM - 2,5±0,1 г/л, IgA - 2,1±0,8 г/л. Уровень про-и противовоспалительных цитокинов в группе больных, где трансплантация эффективна, так же оказался достоверно выше через 2 месяца по сравнению с группой, где эффекта от данной терапии не было показатели составили - -ФНО были в группе с эффективной трансплантацией составил 12,9±1,3 пг/мл, ИЛ-1 - 8,7±0,4 пг/мл, ИЛ-4 40,1±2,5 пг/мл; -ФНО - 22,3±1,1 пг/мл, ИЛ-1 - 14,2±0,2 пг/мл, ИЛ-4 - 14,6±2,4 пг/мл в группе без эффекта - соответственно. Данные изменения подтверждают концепцию о том, что трансплантация МСК наиболее эффективна на ранних стадиях заболевания.

Для того, чтобы установить связь между эффективностью МСК и возможными факторами, влияющие на положительный результат трансплантации, нами проведен корреляционный анализ между клинической и эндоскопической активностью через 2 месяца после трансплантации у больных язвенным колитом и основными клиническими и лабораторными характеристиками (таблицы 16 и 17).

Таблица 16

Корреляция между показателями клинической активности через 2 месяца после трансплантации МСК и исходными значениями клинико-лабораторных показателей у больных ЯК

Показатель

r

р

Индекс Мейо

0.87

<0,001

IgG

0.87

<0,001

IgM

0.72

<0,001

IgA

0.70

<0,001

ФНО

0.16

>0,05

ИЛ-4

0.3

>0,05

Анамнез ЯК, лет

0.69

<0,01

Возраст, лет

0.44

<0,05

Протяженность поражения кишки

0.69

<0,01

Таблица 17

Корреляция между показателями эндоскопической активности через 2 месяца после трансплантации МСК и исходными значениями клинико-лабораторных показателей у больных ЯК

Показатель

r

р

Клинический индекс Рахмилевич

0.87

<0,001

IgG

0.68

<0,001

IgM

0.63

<0,001

IgA

0.75

<0,001

ФНО

0.14

>0,05

ИЛ-4

0.4

>0,05

Анамнез ЯК, лет

0.65

<0,01

Возраст, лет

0.43

<0,05

Протяженность поражения кишки

0.35

>0,05

Была выявлена обратная зависимость между клинической эффективностью (индекс Rachmilewitz) иммуноглобулинов G (r=-0.87, p<0,001), иммуноглобулинов А (r=-0.70, p<0,001), иммуноглобулинов М (r=0.72, p<0,001).

Помимо лабораторных показателей, которые по нашему мнению могли играть существенную роль в прогнозировании эффективности трансплантации МСК, мы приняли во внимание длительность анамнеза язвенного колита (r=0.69, p<0,01) и возраст больных (r=0.44, p<0,05), так как общеизвестным является факт, что по мере прогрессирования аутоиммунного процесса происходит срыв механизмов адаптации и истощения резервов иммунитета. Нами так же выявлена корреляция между эндоскопической эффективностью (индекс Мейо) после трансплантации МСК и исходными значениями уровня Ig G (r=-0.68, p<0,001), Ig А (r=-0.75, p<0,001, Ig М (r=-0.63, p<0,001), длительностью анамнеза (r=0.65, p<0,01) и возрастом больных (r=0.43, p<0,05). Отсутствует корреляция между клинической эффективностью (индекс Rachmilewitz) протяженностью поражения кишки (r=0.35, p<0,05), исходными значениями уровня -ФНО (r=-0.16, p>0,05), исходными значениями уровня ИЛ-4 (r=-0.3, p>0,05), а так же эндоскопической эффективностью (индексМейо) и протяженностью поражения кишки (r=0.35, p<0,05), исходными значениями уровня -ФНО (r=-0.14, p>0,05), исходными значениями уровня ИЛ-4 (r=-0.4, p>0,05).

Анализ полученных результатов демонстрирует эффективность системной трансплантации МСК у больных на более ранних сроках заболевания, которые получали иммунодепрессанты непродолжительный период и с достаточным уровнем иммунного и воспалительного ответа на повреждение. Низкий уровень показателей иммунного статуса, обусловленный, вероятнее всего, прогрессированием аутоиммунного компонента заболевания и иммуносупрессивным эффектом преднизолона и иммуносупрессоров, является предиктором отсутствия положительного ответа на трансплантацию МСК у больных воспалительными заболеваниями кишечника. Представляется важным то, что повторная трансплантация МСК обеспечивает восстановление чувствительности к предварительно неэффективной терапии [Oyama Y., Traynor A.E., Barr W., Burt R.K., 2003]. Эффективность проводимой терапии МСК также напрямую связана с кратностью введения клеток. Например, в экспериментах на животных с моделью сахарного диабета I типа было показано, что более существенное и длительное снижение уровня глюкозы наблюдается у животных с многократным введением МСК по сравнению с животными, которым трансплантация производилась однократно [Banerjee M., Kumar A., Bhonde R.R., 2005]. Необходимо продолжить исследование с целью определения кратности и частоты введения клеток для достижения наиболее оптимального эффекта в лечении больных язвенным колитом.

Преодоление гормонорезистентности и гормонозависимости

у больных воспалительными заболеваниями кишечника

Больные с болезнью Крона и язвенным колитом, находящиеся в отделении патологии кишечника, получали комплексное лечение, включавшее глюкокортикостероиды (преднизолон 1-2 мг/кг/сут). Отсутствие улучшения в состоянии больных в течение 4 недель расценивали как гормонрезистентность, если при снижении дозы преднизолона до 10 мг/день или будесонида до 3 мг/день в течение 3 мес от начала заболевания развивалось обострение заболевания или обострение заболевания развивается в течение 3 мес после прекращения приема кортикостероидов – стероидозависимость. Среди больных язвенным колитом в нашем исследовании гормонозависимость была установлена у 23 больных (23,9%) и у 14 (14,6%) гормонорезистентность, у больных болезнью Крона гормонозависимость была у 8 больных (22,2%) и у 10 (27,8%) гормонорезистентность. Распределение гормонорезистентной и гормонозависимой формами больных по группам, в зависимости от метода терапии представлены в таблицах 18 и 19 В нашем исследовании среди 96 больных ЯК гормонорезистентность была у 14, что составило 14,6% и гормонозависимая форма ЯК у 23 больных – 24,0% (таблица 18).

Таблица 18

Количественный анализ больных ЯК (n=96) по характеру течения заболевания

Форма ЯК

Характер течения ЯК

Острый

Рецидиви-рующий

Непрерыв-ный

Абс.

Доля,%

Абс.

Доля,

%

Абс.

Доля,%

Гормонорезистентная (n=14)

2

14,3

8

57,1

4

28,6

Гормонозависимая  (n=23)

-

-

5

21,7

18

78,3

Среди 36 больных БК гормонорезистентность была у 10, что составило 27,7% и гормонозависимая форма БК у 8 больных – 22,2% (таблица 19).

Таблица 19

Количественный анализ больных БК (n=36) по характеру течения заболевания

Форма БК

Характер течения БК

Легкий

Среднетяжелый

Тяжелый

Абс.

Доля,%

Абс.

Доля,%

Абс.

Доля,%

Гормонорезистентная (n=10)

2

20,0

6

60,0

2

20,0

Гормонозависимая (n=8)

-

-

6

75,0

2

25,0

Распределение гормонорезистентной и гормонозависимой формами больных по группам, в зависимости от метода лечения представлены в таблицах 20 и 21.

Таблица 20.

Количественный анализ больных ЯК (n=37) по группам терапии

Форма ЯК

Группы больных

1-я

2-я

3-я

Абс.

Доля, %

Абс.

Доля,%

Абс.

Доля,%

Гормонорезистентная (n=14)

8

51,2

1

7,1

5

35,7

Гормонозависимая (n=23)

15

65,3

1

4,3

7

30,4

Таблица 21

Количественный анализ больных БК (n=18) по группам терапии

Форма БК

Группы больных

1-я

2-я

3-я

Абс.

Доля,%

Абс.

Доля,%

Абс.

Доля,%

Гормонорезистентная (n=10)

7

38,9

1

5,5

2

11,0

Гормонозависимая (n=8)

5

27,8

-

-

3

16,5

Среди 37 больных ЯК с гормонорезистентностью и гормонозависимостью 23 пациента было в группе получающих МСК, что составило 52,3% от 1-й группы, 2 больных из 2-й группы – 5%, в 3-й группе – 12 больных – 100%. Среди 18 больных БК с гормонорезистентностью и гормонозависимостью 12 пациентов было в группе получающих МСК, что составило 80,0% от 4-й группы, 1 больной из 5-й группы – 6,6%, в 6-й группе – 5 больных – 83,3%.

Таким образом, наибольший процент больных ВЗК с гормонорезистентностью и гормонозависимостью был в группах больных, получающих ИНФ и трансплантация МСК.  У 26 (59%) в течение 2 мес наблюдения удалось постепенно полностью отменить глюкокортикостероиды. Поддерживающую терапию осуществляли препаратами 5-АСК (сульфасалазин или месалазин) и пробиотиками. У 10 больных (22,7%) дозу преднизолона постепенно снизили до 5 мг/сут, но у 2 в связи с развившимся рецидивом она была вновь увеличена. У 6 больных этой группы улучшения не наступило: сохранялся частый жидкий стул с примесью крови, лихорадка. Двум из них был назначен инфликсимаб, а остальным вновь увеличили дозу преднизолона до 1 мг/кг м.т. Больные 2-й группы на протяжении всего периода наблюдения продолжали получать преднизолон в дозе от 10 до 15мг/ сут и азатиоприн от 100 до 150 мг/ сут. В 3-й группе больных дозу ГКС так же удалось снизить, а затем полностью отменить у 12 больных (80%). Через полгода наблюдения 34 больных, которым осуществлена трансплантация МСК не получали преднизолон, у 2 больных развился рецидив заболевания с повторным назначением ГКС. Через 12 месяцев ремиссия сохранялась у 32 больных в 1-й группе, как указывалось ранее, эффективность составила 72,7%. При этом гормонозависимость была преодолена у 12 больных, что составило 80% из данной группы больных язвенным колитом (n=15). В 3-й группе 7 больных (46,6%) были гормонозависимы. Проводимая терапия инфликсимабом позволила полностью отказаться 6 больным (85%) от ГКС.

У больных болезнью Крона в группе МСК гормонозависимость была у 5 больных, гормонорезистентность – у 7 больных, в группе больных, которые переведены на терапию инфликсимабом – 2 и 3 соответственно. После трансплантации МСК гормонозависимость и гормонорезистентность преодолена у 10 больных (83%), что сопоставимо с терапией инфликсимабом – 80%.

Полученные данные свидетельствуют о том, что внедрение современных методов терапии ВЗК способствуют не только купированию атаки заболевания и увеличению продолжительности ремиссии, тем самым повышая эффективность лечения этих заболеваний, но и позволяет помочь преодолеть рефрактерность к стероидам. Механизм может быть обусловлен особенностями иммуномодулирующего эффекта МСК, особенности которого неоднократно подчеркивались и анализировались в данной работе.

Контроль онкологической безопасности анализ нежелательных побочных

эффектов трансплантации МСК

Учитывая то, что клеточная терапия является медицинской технологией третьего класса, данной группе больных в период ремиссии необходимо проводить контрольные эндоскопические (КС 2 раза в год, РРС 4-6 раз в год) и рентгенологические исследования кишки. Только во время колоноскопии можно оценить степень прогрессирования болезни, активность воспаления и наличие дисплазии слизистой кишки. Нами проводилась множественная лестничная биопсия с последующим гистологическим исследованием. Однако даже при множественной биопсии мы не можем с полной уверенностью исключить наличие онкологического процесса. Помимо инвазивных методов ранней диагностики рака, мы ежемесячно определяли уровень онкомаркеров СА 242 и СА 19-9. Определение уровня онкомаркеров позволяет выявить группы повышенного риска развития рака. Специфичность СА 242 позволяет проводить диагностику уже на ранних стадиях заболевания. По различным данным с помощью этого теста удается прогнозировать развитие рецидивов колоректального рака за 5-6 месяцев. За 24 месяца наблюдения за больными, которым проведена трансплантация МСК ни в одном случае не было зарегистрировано повышения уровня онкомаркеров и злокачественной трансформации ВЗК. Таким образом, полученные нами данные согласуются с материалами исследований, подтверждающих, что трансплантация МСК костного мозга человека не приводит к развитию опухолевого процесса. Следовательно, проведение системных (внутривенных) трансплантаций МСК, полученных из костного мозга взрослого человека, является безопасным медицинским мероприятием.

У 12 больных (20%) после введения МСК наблюдалась слабая трансфузионная реакция. Она характеризовалась появлением субфебрильной температуры, артралгии и миалгии, продолжавшейся несколько часов. У двух больных развилась аллергическая реакция по типу крапивницы и отека Квинке, которую купировали введением антигистаминных препаратов и глюкортикостероидов.

Сравнительный фармакоэкономический анализ различных методов

лечения ВЗК

Лечение больных БК дорого обходится национальным системам здравоохранения. Например, в Великобритании, прямые затраты составляют более 2000 в год на одного больного, в Бельгии - 2500 € за 6 месяцев.

Таблица 22

Стоимость лечения (на 1 больного) ЯК в зависимости от выбранного метода терапии

Терапия

Стоимость (руб)

Безрецидивные дни.

Стоимость/эффективность (руб/день)

5-АСК/ГКС

26645±4849,4

141

189,5

МСК

35395±6532,1

238,5

148,7

ИНФ

730564,6±9894,4

220,5

3313,2

Как следует из представленных в табл.15 данных, несмотря на высокую стоимость лечения больных в группе МСК+стандартная терапия, коэффициент «затраты-эффективность» в данной группе больных оказался низким в сравнении со стандартной терапией. Одинаковые результаты были получены независимо от выбора критерия эффективности лечения ЯК. Результаты расчета коэффициента «затраты-эффективность» по длительности ремиссии ЯК показывают, что используя МСК + стандартную терапию, можно добиться увеличения длительности ремиссии болезни, и одновременно - экономии расходов до 214,5 руб./больн./1 день. Экономическая и клиническая эффективность применения МСК на фоне стандартной терапии в сравнении с результатами только стандартной терапии также подтверждается расчетами коэффициентов «затраты-эффективность», а также индексов Рахмилевича и Мейо. Таким образом, с клинической и экономической точек зрения более оправдано применение схемы лечения, при которой клиническая эффективность наибольшая, а коэффициент «затраты-эффективность» наименьший. Такой вариант лечения оказался у больных, пролеченных МСК на фоне стандартной терапии.

В течение 12 мес. исследования затраты на МСК в значительной степени компенсируются предотвращенными осложнениями и госпитализациями, связанными с ними расходами. На протяжении этого периода затраты на МСК составляют небольшую часть общей стоимости ведения больных ЯК. Благодаря более высокой избирательности, эффективности и безопасности, по сравнению со стандартной терапией ЯК, использование МСК приводит к снижению сроков и стоимости стационарного и амбулаторного обслуживания (уменьшается число рецидивов и осложнений), что в конечном итоге  приводит к значительной экономии общей стоимости лечения, бюджетных затрат, в том числе и за счет снижения частоты и длительности периодов нетрудоспособности больных и улучшения их качества жизни. Можно утверждать, что для РФ актуально использование новой технологии МСК - терапии поскольку, она обладает жизнесохраняющими свойствами и экономически оправдана, несмотря на её изначально более высокую стоимость. Данный метод терапии по своей эффективности сопоставим с терапией инфликсимабом. Оба метода лечения увеличивают продолжительность ремиссии у больных ВЗК, снижают риск развития рецидива, уменьшают частоту госпитализаций. Однако стоимость лечения инфликсимабом составляет 730564,6±9894,4 руб (комплексная терапия с применением МСК - 35395±6532,1 руб), показатель стоимость/эффективность - 3313,2 руб/день, против 148,7 руб/день при проведении трансплантации МСК.

ВЫВОДЫ

1.Трансплантация аллогенных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга показана больным с умеренной и высокой активностью язвенного колита (индекс Рахмилевича 20 баллов) и болезни Крона легкой (индекс Беста 220 баллов) и средней степени тяжести (индекс Беста - 220-450 баллов) на ранних стадиях заболевания (длительность заболевания не более 5 лет), при непрерывном приеме иммуносупрессоров не более шести месяцев.

2.Трансплантация аллогенных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга способствует снижению индекса клинической активности Рахмилевича при язвенном колите через 12 месяцев с 8,3±0,26 до 1,8±0,3 баллов (в группе сравнения, получающих препараты 5-АСК/ГКС с 8,1±0,2 до 2,9±0,4 баллов, при р<0,05).

3.Трансплантация аллогенных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга способствует снижению индекса эндоскопической активности Мейо у больных ЯК с 7,7±0,3 до 0,76±0,2 (в группе сравнения, получающих препараты 5-АСК/ГКС с 7,2±0,4 до 2,6±0,4, при р<0,05).

4.Трансплантация аллогенных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга способствует снижению индекса Беста у больных болезнью Крона с 246,9±12,1 до 75,8 ±13,8 (в группе сравнения с 234,3±10,9 до 121,5±24,7, при р<0,05). У больных болезнью Крона после трансплантации МСК в 61,5% случаев наступило заживление слизистой, в группе сравнения, получающих ГКС - 40,0 %.

5.Трансплантация аллогенных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга приводит к снижению патогистологического индекса (индекс Гебса) с 4,4±0,3 до 0,7±0,1 по сравнению с группой больных, получающих терапию препаратами 5-АСК/ГКС – с 4,4±0,2 до 1,2±0,02 и сопоставима по эффективности с терапией инфликсимабом - индекс Гебса снизился до 0,6±0,18 с 4,4±0,2 (р<0,05).

6.Трансплантация аллогенных МСК оказывает иммуномодулирующий эффект, повышая уровень сниженных иммуноглобулинов, обусловленный длительной иммуносупрессивной терапией: IgG с 11,2 до 14,8 г/л (р<0,05); IgM с 0,9 до 2,2 г/л (р<0,05); IgA с 1,82 до 3,8 г/л (р<0,05), снижая уровень повышенных иммуноглобулинов: IgG с 12,8 до 11,8 г/л (р>0,05); IgM с 1,6 до 1,1 г/л (р<0,05); IgA с 2,6 до 1,5 г/л (норма - IgM- 1,3; IgG- 13,0; IgA -2,3 г/л); а так же уменьшает интенсивность аутоиммунных реакций, снижая в течение 12 месяцев содержание аутоантител к антигенам цитоплазмы нейтрофилов (IgG-BPI) с 42±2,8 до 12±1,6 Ед/мл (р<0,05).

7.Трансплантация аллогенных МСК уменьшает активность воспалительного процесса у больных ВЗК: снижает уровень провоспалительных цитокинов - -ФНО, ИНФ- и ИЛ-1; показателей острой фазы воспалительного процесса (СРБ, СОЭ, уровень лейкоцитов), в динамике повышает уровень противовоспалительных цитокинов ИЛ-4 и ИЛ-10 (с 11,4 до 23,6 пг/мл).

8. У 80,5% больных ЯК и БК трансплантация аллогенных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга способствует преодолению гормонорезистентности и гормонозависимости; позволяет отказаться от приема иммуносупрессоров; в 2 раза уменьшить дозу принимаемых ГКС, а в 65% случаев полностью отказаться от них и вернуться к терапии препаратами 5-АСК.

9.Трансплантация аллогенных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга снижает риск развития рецидива у больных с хроническим рецидивирующим и непрерывным течением язвенного колита и болезнью Крона на 60,5%, увеличивает продолжительность ремиссии в среднем до 11,5±1,7 месяцев, (в группе сравнения, получающих препараты 5-АСК/ГКС – 4,6±0,6 месяцев, при р<0,05) и уменьшает частоту госпитализаций больных ВЗК до 20,5% (в группе 5-АСК/ГКС 66,6%, при р<0,05).

10.Трансплантация аллогенных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга способствует повышению эффективности комплексной противовоспалительной терапии ВЗК. Данный метод лечения по своей терапевтической эффективности сопоставим с терапией инфликсимабом при котором показатель стоимость/эффективность - 3313,2 руб/день; против 148,7 руб/день при проведении трансплантации МСК.

11. У 100% больных ВЗК использование клеточной культуры МСК, выращенной из костного мозга человека не приводит к развитию опухолевого процесса кишечника, что подтверждается регулярными эндоскопическими исследованиями с проведением множественных биопсий СОК и нормальным уровнем онкомаркеров СА 242 и СА19-9 не превышающим 7 Ед/мл за 2 года наблюдения.

12. У 23,7 % больных, которые имели в анамнезе поливалентную аллергию, нежелательными побочными эффектами непосредственно в период введения являются аллергические реакции по типу крапивницы и/или отека Квинке – у 3,4%; гипертермия - у 20,3% больных.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1.Клеточная терапия ВЗК должна проводиться методом внутривенного введения, что создает условия для системного действия мезенхимальных стромальных клеток.

2.Эффективность клеточной терапии при ВЗК необходимо оценивать по динамике клинической, эндоскопической активности течения язвенного колита и болезни Крона, лабораторным показателям, отражающим степень воспалительного процесса и морфологическим исследованиям биоптатов СОК.

3. Перед трансплантацией МСК необходимо определять уровень про- и противовоспалительных цитокинов, показателей острой фазы воспалительного процесса (СРБ, СОЭ, уровень лейкоцитов), иммуноглобулинов, отражающих степень нарушения иммунопатологических сдвигов в организме, для решения вопроса о частоте введения МСК: при снижении уровня сывороточных иммуноглобулинов G,M,A более чем на 50% от нижней границы нормы трансплантация мезенхимальных стромальных клеток не показана.

4.С целью восстановления биорегуляторной и функциональной активности иммунного статуса организма больным с исходно нормальными показателями сывороточных иммуноглобулинов G, M, A, в период обострения ВЗК системную трансплантацию МСК необходимо проводить дважды.

5.Трансплантацию МСК не целесообразно проводить больным с наличием в анамнезе поливалентной аллергии (поллиноз, бронхиальная астма атопического генеза, атопический дерматит и др.), в связи с высоким риском развития аллергической реакции немедленного типа (отек Квинке, крапивница).

6.Больным ВЗК, которым осуществлена трансплантация МСК, в период ремиссии необходимо проводить контрольные эндоскопические исследования (КС 1 раза в год, РРС 2 раз в год); больным БК тонкой кишки - рентгенологическое исследование тонкой кишки 1 раз в год, а так же определять уровни онкомаркеров не реже, чем 2 раза в год, с целью своевременной диагностики колоректального рака.

СПИСОК РАБОТ,

ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

  1. Князев О.В., Коноплянников А.Г., Лазебник Л.Б., Румянцев В.Г. Перспектива использования мезенхимальных стволовых клеток у больных с патологией органов пищеварения // Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология.- 2008.-№6.- С. 64-78.
  2. Лазебник Л.Б., Князев О.В., Парфенов А.И., Ручкина И.Н., Ефремов Л.И. Успешное применение аллогенных мезенхимальных стволовых клеток у больного с язвенным колитом // Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология.- 2009.-№4.-С. 112-115.
  3. Князев О.В., Лазебник Л.Б., Ручкина И.Н., Царегородцева Т.М., Парфенов А.И. Инфликсимаб в терапии воспалительных заболеваний кишечника // Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология.- 2009.-№5.- С. 64-68.
  4. Лазебник Л.Б., Коноплянников А.Г., Князев О.В., Парфенов А.И., Царегородцева Т.М., Ручкина И.Н., Хомерики С.Г., Рогозина В.А., Коноплянникова О.А. Применение аллогенных мезенхимальных стволовых клеток в комплексной терапии больных язвенным колитом // Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология.- 2009.-№5.-С. 4-12.
  5. Лазебник Л.Б., Коноплянников А.Г., Князев О.В., Парфенов А.И., Царегородцева Т.М., Ручкина И.Н., Хомерики С.Г., Рогозина В.А., Коноплянникова О.А. Использование аллогенных мезенхимальных стромальных клеток костномозгового происхождения в лечении воспалительных заболеваний кишечника // Терапевтический архив.- 2010. №2, Т.82. - С. 38-43.
  6. Лазебник Л.Б., Князев О.В., Парфенов А.И., Ручкина И.Н., Рогозина В.А., Коноплянников А.Г. Трансплантация аллогенных мезенхимальных стволовых клеток костного мозга увеличивает продолжительность ремиссии и снижает риск развития рецидива язвенного колита // Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология.- 2010.-№3.-С. 5-10.
  7. Лазебник Л.Б., Гусейн-Заде М.Г., Князев О.В., Ефремов Л.И, Ручкина И.Н. Фармакоэкономический анализ лечения больных язвенным колитом мезенхимальными стромальными (стволовыми) клетками // Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология.- 2010.-№3.-С. 51-59.
  8. Михйлова З.Ф., Лычкова А.Э., Князев О.В. Нервная регуляция бронхолегочной системы в норме и при воспалительных заболеваниях кишечника // Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология.- 2010.-№6.-С. 61-66.
  9. Лазебник Л.Б., Царегородцева Т.М., Серова Т.И., Князев О.В. Цитокиновый статус при хронических воспалительных заболеваниях кишечника и мезенхимальные стволовые клетки // Аллергология и иммунология.- 2009.- Т.10, № 2.-С.260
  10. Лазебник Л.Б., Коноплянников А.Г., Парфенов А.И., Ручкина И.Н., Князев О.В., Царегородцева Т.М., Хомерики С.Г., Щербаков П.Л., Рогозина В.А., Гудкова Р.Б., Михайлова З.Ф., Коноплянникова О.А. Применение аллогенных мезенхимальных стромальных клеток в лечении больных язвенным колитом: два года наблюдения // Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология.- 2010.-№7 (Сдана в печать)
  11. Лазебник Л.Б., Царегородцева Т.М., Серова Т.И., Ручкина И.Н., Князев О.В. Влияние мезенхимальных стволовых клеток на иммунный статус при неспецифическом язвенном колите // Материалы III национального конгресса терапевтов «Новый курс: консолидация усилий по охране здоровья нации». - Москва. - 2008.-С.139-140.
  12. Лазебник Л.Б., Князев О.В., Парфенов А.И., Ручкина И.Н., Рогозина В.А. Оценка клинической и эндоскопической эффективности трансплантации аллогенных мезенхимальных стволовых клеток у больных воспалительными заболеваниями кишечника // Материалы IX съезда Научного общества гастроэнтерологов России. – Москва. - 2009. С.205-206.
  13. Парфенов А.И, Лычкова А.Э., Ручкина И.Н., Лазебник Л.Б., Князев О.В. Электромоторная активность желудка и толстой кишки при лечении язвенного колита и болезни Крона стволовыми клетками // Материалы IX съезда Научного общества гастроэнтерологов России. – Москва. - 2009. С.24-25.
  14. Лазебник Л.Б., Царегородцева Т.М., Серова Т.И., Голованова Е.В., Винокурова Л.В., Князев О.В. Содержание, диагностическое и прогностическое значение аутоантител к нейтрофилам при заболеваниях органов пищеварения // Материалы IX съезда Научного общества гастроэнтерологов России. – Москва. - 2009. С.237.
  15. Конопляников А.Г., Князев О.В., Лазебник Л.Б., Цыб А.Ф. Экспериментальное обоснование и клинический опыт клеточной терапии методом системной трансплантации аллогенных мезенхимальных стволовых клеток при язвенном колите и болезни Крона // Материалы Всероссийской научной школы-конференции для молодежи «Аутологичные стволовые клетки: экспериментальные и клинические исследования».- Москва.- 2009.- С.33.
  16. Лазебник Л.Б., Князев О.В., Парфенов А.И., Ручкина И.Н., Коноплянников А.Г. Трансплантация аллогенных мезенхимальных стволовых клеток - новое направление биологической терапии болезни Крона//Всероссийская научно-практической конференции "Актуальные проблемы оказания специализированной медицинской помощи в условиях стационара и применение стационарозаменяющих технологий." Главный военный клинический госпиталь имени академика Н.Н. Бурденко, Москва. - 2009.- С. 133-134.
  17. Лазебник Л.Б., Князев О.В., Парфенов А.И., Ручкина И.Н., Коноплянников А.Г. Влияние аллогенных мезенхимальных стволовых клеток костного мозга на продолжительность ремиссии у больных с хроническим рецидивирующим и непрерывно рецидивирующим течением язвенного колита // Всероссийская конференция с международным участием «Инновации и информационные технологии в диагностической, лечебно-профилактической и учебной работе клиник». – Тверь. – 2009.- С. 34.
  18. Лазебник Л.Б., Сагынбаева В.Э., Парфенов А.И., Князев О.В., Ручкина И.Н. Влияние исходного уровня показателей гуморального иммунитета на клиническую и эндоскопическую эффективность трансплантации аллогенных мезенхимальных стволовых клеток костного мозга при язвенном колите. Материалы 12-ого Международного Славяно-Балтийского научного форума «Санкт-Петербург-Гастро-2010». Гастроэнтерология Санкт-Петербурга. №2-3. 2010. М 51-52.
  19. Лазебник Л.Б., Князев О.В., Парфенов А.И., Ручкина И.Н., Коноплянников А.Г Влияние аллогенных мезенхимальных стволовых клеток костного мозга на продолжительность ремиссии у больных с хроническим рецидивирующим и непрерывным течением язвенного колита // Материалы X съезда Научного общества гастроэнтерологов России. – Москва.- 2010.- С.106.
  20. Лазебник Л.Б., Князев О.В., Парфенов А.И., Ручкина И.Н., Рогозина В.А. Трансплантация аллогенных мезенхимальных стволовых клеток костного мозга снижает риск развития рецидива язвенного колита // Материалы X съезда Научного общества гастроэнтерологов России. – Москва.- 2010.- С.107.
  21. Лазебник Л.Б., Князев О.В., Парфенов А.И., Ручкина И.Н., Щербаков П.Л. Влияние трансплантации аллогенных мезенхимальных стволовых клеток на клиническое течение и заживление слизистой оболочки кишки при болезни Крона // Материалы X съезда Научного общества гастроэнтерологов России. – Москва.- 2010.- С.108.
  22. L.B. Lazebnik, O.V. Knyazev, A.G. Konoplyannikov, A.I. Parfenov, I.N. Ruchkina. Mesenchymal stem cells improves clinical symptoms and are effective for mucosal healing in ulcerative colitis and Crohn's disease // Abstracts of the GASTRO. – London.- 2009. Р. А 10.
  23. L.B. Lazebnik, T. Tsaregorodseva, O. Knyazev, T. Serova. The influence of Mesenchymal stem cells over immune status in ulcerative colitis // Abstracts of the GASTRO. – London.- 2009. Р. А 303.
  24. L. Lazebnik, O.Knyazev, A. Parfenov, I. Ruchkina, V. Rogozina, E. Baryshnikov Mesenchymal stem cells are effective for mucosal healing in ulcerative colitis and Crohn's disease // Abstracts of the 4th Congress of ECCO - the European Crohn's and Colitis Organization. – Hamburg. – 2009. Р.544-545.
  25. L. Lazebnik, О. Knyazev, A. Parfenov, I. Ruchkina, Mesenchimal Stem Cells Transplantation Decreases Relapse Development Risk In Patients With Ulcerative Colitis.// Abstracts of the 5th Congress of ECCO - the European Crohn's and Colitis Organization.- Praga.- 2010. Р.S67.
  26. L. Lazebnik, О. Knyazev, A. Parfenov, I. Ruchkina, А. Konoplaynnikov The Influence Of Allogenic Mesenchimal Stem Cells Of Bone Marrow On The Remission Duration Of Chronic Relapsing And Continuously Relapsing Form Of Ulcerative Colitis. // Abstracts of the 5th Congress of ECCO - the European Crohn's and Colitis Organization.- Praga.- 2010. Р.S95.
  27. L.Lazebnik, О.Knyazev, A.Parfenov, I.Ruchkina, A. Konoplaynnikov Transplantation Of Allogenic Mesenchimal Stem Cells Is A New Way Of Biological Therapy Of Crohn's Disease. // Abstracts of the 5th Congress of ECCO - the European Crohn's and Colitis Organization.- Praga.- 2010. Р.S 99.
  28. L.Lazebnik, О.Knyazev, A.Parfenov, I.Ruchkina, A.Konoplaynnikov, P.Scherbakov, V.Rogozina Transplantation of allogenic mesenchimal stem cells is a new method of biological therapy of Crohn's Disease//Abstracts of the Digestive Disease Week®. - New Orleans, Louisiana.- 2010. Р.465.
  29. О.Knyazev, I.Ruchkina, A.Parfenov, A.Konoplaynnikov The effectiveness of transplantation of allogeneic mesenchymal stromal cells of bone marrow in patients with chronic relapsing and continuous forms of ulcerative colitis. 2 years of observations// Abstracts of the 41st Nordic Gastroenterology Congress, 8-11 June 2010, - Copenhagen, Denmark.- 2010. Р.79.
  30. L.Lazebnik, O.Knyazev, I.Ruchkina, V.Sagynbaeva, T.Tcaregorodtceva, I.Trubitcyna. Effect of allogeneic mesenchymal stromal cells of bone marrow in the immune status of patients with inflammatory bowel disease//Abstracts of the 41st Nordic Gastroenterology Congress, 8-11 June 2010, - Copenhagen, Denmark.- 2010. Р.82-83.
  31. L.Lazebnik, О.Knyazev, A.Parfenov, I.Ruchkina, A.Konoplaynnikov, P.Scherbakov, Transplantation Of Allogenic Mesenchimal Stromal Cells Is A New Methods Of Biological Therapy Of Crohn's Disease//Abstracts of the 41st Nordic Gastroenterology Congress, 8-11 June 2010, - Copenhagen, Denmark.- 2010. Р.61.
  32. L.Lazebnik, O.Knyazev, V.Sagynbaeva, A.Konoplaynnikov. The influence of mesenchymal stromal cells over immune status in ulcerative colitis// Abstracts of the 6th Central European Gastroenterology Meeting, 25-26 June 2010, - Praga - 2010. Р.35.
  33. L.Lazebnik, О.Knyazev, A.Konoplaynnikov, P.Scherbakov, Churikova A. Allogenic mesenchymal stromal cells are effective for mucosal healing in Crohns disease// Abstracts of the 6th Central European Gastroenterology Meeting, 25-26 June 2010, - Praga - 2010. Р.35.

ПАТЕНТЫ

  1. Лазебник Л.Б., Коноплянников А.Г., Князев О.В., Парфенов А.И., Коноплянникова О.А., Ручкина И.Н. Способ лечения воспалительных заболеваний кишечника. Патент №2364405 РФ ФГУ ФИПС, опубликован 20.08.2009. в бюллетене «Изобретения. Полезные модели» №25. Решение о выдаче патента на изобретение №20008113522/14 от 10.04.2008.
  2. Лазебник Л.Б., Коноплянников А.Г., Парфенов А.И., Коноплянникова О.А., Ручкина И.Н., Князев О.В., Лычкова А.Э. Способ лечения язвенного проктосигмоидита. Патент №2367450 РФ ФГУ ФИПС, опубликован 20.09.2009 в бюллетене «Изобретения. Полезные модели» №26. Решение о выдаче патента на изобретение 2008119823/14 от 19.05.2009.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

-ФНО – -фактор некроза опухоли

BPI – аутоантитела к нейтрофилам

CDAI – индекс Беста клинической активности болезни Крона

БК болезнь Крона

БТ - биологическая терапия

ВЗК – воспалительные заболевания кишечника

ГКС глюкокортикостероиды

ИГ – иммуноглобулин

ИЛ – интерлейкин

ИНФ - инфликсимаб

ИНФ- – интерферон-

КМ- костный мозг

ККМ клетки костного мозга

МСК – мезенхимальные стромальные клетки

СОЭ скорость оседания эритроцитов

СРБ С - реактивный белок

СОК – слизистая оболочка кишки

СОТК – слизистая оболочка толстой кишки

ЯК – язвенный колит

Автор выражает благодарность заведующему отделом внутрипросветной эндоскопии профессору Щербакову П.Л. и врачу отделения, к.м.н. Рогозиной В.А. за проведение эндоскопических исследований, а так же сотрудникам отделения патологии кишечника Голубевой Е.К, Косачевой Т.А., Барышникову Е.Н., Кузьминой Т.Н., оказавшим помощь в проведении ректороманоскопии. Особая благодарность сотрудникам лаборатории иммунологии ЦНИИГ, в первую очередь заведующей лабораторией профессору Царегородцевой Т.М., д.м.н. Гудковой Р.Б., к.м.н. Серовой Т.И., к.м.н. Сагынбаевой В.Э., проводившим иммунологические исследования, а так же заведующей лаборатории патофизиологии, д.м.н. И.Е.Трубицыной. Автор искренне благодарит зав. отделением клинической лаборатории к.м.н. Носкову К.К. и всех сотрудников данной лаборатории за помощь в проведении исследований.

Глубокая признательность сотрудникам лаборатории патоморфологии ЦНИИГ: к.м.н. Чикуновой Б.З., к.м.н. Воробьевой Н.Н. и д.м.н. Хомерики С.Г. за оказанную помощь в проведении гистологического и морфометрического исследования СОК. Автор выражает глубочайшую признательность заведующему отделом научных лабораторных и клинико-диагностических исследований ЦНИИ гастроэнтерологии, доктору медицинских наук, профессору Дроздову В. Н. за помощь в обработке полученных результатов исследования и конструктивную критику. Выражаю признательность зав. лаб. фармэкономики д.м.н. Гусейн-Заде М.Г. и старшему научному сотруднику Л.И. Ефремову за помощь в поведении фармакоэкономического анализа. Считаю необходимым поблагодарить профессора Парфенова А.И. и д.м.н. Ручкину И.Н. за всестороннюю и всеобъемлющую помощь в период работы над диссертацией, а так же всех сотрудников отделения патологии кишечника.

Выполнение данной работы было бы невозможным без участия сотрудников лаборатории отделения клеточной и экспериментальной лучевой терапии Медицинского радиологического научного центра РАМН, г.Обнинска под руководством профессора Коноплянникова А.Г. Всем им выражаю благодарность за помощь в работе.

Особая благодарность за оказанную всестороннюю помощь при выполнении работы Щербакову Денису Валерьевичу.

Сердечная благодарность и глубочайшая признательность моим научным консультантам Леониду Борисовичу Лазебнику и Анатолию Георгиевичу Коноплянникову за доверие и терпение






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.