WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


 

На правах рукописи

КАРТАШЕВ ВЛАДИМИР ВАСИЛЬЕВИЧ

КРИПТОСПОРИДИОЗ У БОЛЬНЫХ ВИЧ-ИНФЕКЦИЕЙ:

КЛИНИКО-ЭКПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ И

ПАРАЗИТОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ

14.00.10 – инфекционные болезни

А в т о р е фе р а т

диссертации на соискание ученой степени

доктора медицинских наук

Ростов-на-Дону

2009

       Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении

высшего профессионального образования «Ростовский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научный консультант:

доктор медицинских наук,

профессор

АМБАЛОВ Юрий Михайлович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук,

профессор

СИМОВАНЯН Эмма Никитична

доктор медицинских наук,

профессор

ЛУЧШЕВ Владислав Иванович

доктор медицинских наук

старший научный сотрудник

ЯГОВКИН Эдуард Александрович

Ведущая организация – Государственное образовательное учреждение дополнительного профессионального образования «Российская медицинская академия последипломного образования Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

       Защита состоится  «____»_______ 2009 г. в _____ часов на заседании диссертационного совета Д 208.082.02 при ГОУ ВПО Ростовском государственном медицинском университете (344022 г. Ростов-на-Дону, пер. Нахичеванский, 29).

       С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО Ростовского государственного медицинского университета

Автореферат разослан  « ____ »  __________________ 2009 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета

кандидат медицинских наук  Т.Н. Кузина

ОБЩАЯ ХАРАКЕТРИСТИКА РАБОТЫ

       

Актуальность исследования

Более ста лет назад Эрнест Эдвард Тизер (1875 – 1965) впервые обнаружил и описал нового паразита из класса споровиков (E. Tyzzer, 1907).

С момента этого открытия прошло около 70 лет прежде чем криптоспоридиоз был выявлен у человека. В 1976 году почти одновременно были опубликованы описания двух случаев болезни, один из них в форме энтероколита у ребенка с сохранным иммунитетом (F. Nime et al., 1976), другой – в виде обильной водной диареи у взрослого больного с иммунодепрессией (J.Meisel et al., 1976).

В целом 7 случаев криптоспоридиоза были опубликованы и суммированы в литературе к 1980 году, из них у 5 больных заболевание возникло на фоне иммунодепрессии (R. Bird, M. Smith, 1980). В связи с этим авторы отметили в своей публикации: «В тех случаях, когда иммунная система функционирует нормально, и нет никаких других фоновых поражений кишечника, криптоспоридиоз не представляет никаких проблем для здоровья и ориентировочно может рассматриваться как оппортунистический возбудитель». Эти слова были написаны в то самое время, когда стали регистрироваться первые случаи СПИД.

Уже через три года появилась первая статья, в которой были представлены 10 случаев криптоспоридиоза с затяжной водной диареей у больных СПИД гомосексуалистов (P. Ma, R. Soave, 1983). А еще через год число описанных в литературе случаев криптоспоридиоза у больных СПИД достигло пятидесяти (P. Ma, 1984). К концу 1984 года из числа всех описанных в литературе случаев криптоспоридиоза больные со СПИД составляли 83%, а 55% из них погибли (T. Navin, D. Juranek, 1984).

Связь криптоспоридиоза со СПИД была настолько очевидной, что криптоспоридиоз стал одним из общепризнанных индикаторов СПИД задолго до открытия и описания самого вируса иммунодефицита человека. С начала эпидемии ВИЧ-инфекции и до сегодняшнего дня основная часть исследований, посвященных проблеме криптоспоридиоза, так или иначе были связаны с проблемой СПИД. Исследователей меньше интересовала проблема криптоспоридиоза у больных, находящихся на ранних стадиях ВИЧ-инфекции. Отчасти это было обусловлено тем, что предположение о криптоспоридиозе и целенаправленное обследование больных на криптоспоридиоз выполнялось только у больных ВИЧ-инфекцией при появлении диареи.

Больные ВИЧ-инфекцией на стадии СПИД подвержены особо тяжелым затяжным и хроническим формам криптоспоридиоза с обильной водной диареей, обезвоживанием и неблагоприятным прогнозом для жизни (S. Pitlik et al., 1983; C. Petersen, 1992; B. Ramratnam, T. Flanigan, 1997; D. Clark, 1999; S. Caccio, 2005). Однако, почти одновременно с описанием злокачественных форм криптоспоридиоза у больных СПИД появлялись единичные публикации о более благоприятных клинических вариантах болезни со спонтанным выздоровлением и сообщения о ее бессимптомных формах (F. Zar et al., 1985; F. Zar, 1990; E. Janoff et al., 1990;  D. Saltzberg et al., 1991;  C. Blanshard et al., 1992;  R. Goodgame et al., 1993; I. McGowan et al., 1993; M. Pettoello-Mantovani et al., 1995; S. Chhin et al., 2006). Благоприятно протекающие формы любых болезней редко привлекают внимание врача.

Варианты клинического течения криптоспоридиоза у больных ВИЧ-инфекцией напрямую зависят от степени выраженности иммунодепрессии (T. Flanigan et al., 1992; E. Pozzio et al., 1997). Единичные публикации последних лет свидетельствуют также и о том,  что клинические проявления криптоспоридиоза у больных ВИЧ-инфекцией могут быть обусловлены биологическими свойствами отдельных видов и генотипов возбудителя (M. Messner et al., 2001; C. Chappell et al., 2006; V. Cama et al., 2007).

Важность проблемы криптоспоридиоза для больных ВИЧ-инфекцией неоднократно подчеркивалась и отечественными учеными (В.И. Покровский, В.В. Покровский, 1988; Н.А. Чайка, Т.В. Бейер, 1990; В.И. Покровский, Б.А. Годованный, 1995; В.В. Шкарин, С.Н. Соринсон, 1999; В.В. Покровский и др., 2000, 2003; Е.С. Белозеров, Е.И. Змушко, 2003; Ю.В. Лобзин и др., 2003; В.М.Волжанин, 2008). Однако специальные исследования по проблеме криптоспоридиоза у больных ВИЧ-инфекцией в России не выполнялись.

       Образовавшийся разрыв между информацией о криптоспоридиозе у больных ВИЧ-инфекцией за рубежом и отсутствием данных о состоянии этой проблемы у больных ВИЧ-инфекцией в России, а также неоспоримое значение проблемы криптоспоридиоза для больных ВИЧ-инфекцией определяют актуальность данного исследования.

Цель работы. На основе изучения эпидемиологии криптоспоридиоза в Ростове-на-Дону, особенностей его клинического течения и лабораторной диагностики у больных ВИЧ-инфекцией, а также методов оценки биологических свойств паразита разработать программу диагностики и прогноза криптоспоридиоза у больных с разными стадиями ВИЧ-инфекции.

Задачи исследования:

1)  исследовать чувствительность разных лабораторных методов диагностики криптоспоридиоза и определить частоту криптоспоридиоза у больных с ВИЧ-инфекцией, дать клиническую характеристику криптоспоридиоза в зависимости от клинической стадии ВИЧ-инфекции, а также изучить влияние разных клинических форм криптоспоридиоза на динамику клинического течения и прогноз ВИЧ-инфекции;

2) выполнить молекулярно-генетические исследования паразита и определить доминирующий вид криптоспоридий у больных ВИЧ-инфекцией в Ростове-на-Дону;

3) исследовать биологические особенности паразита, в частности, жизнеспособность ооцист, выделенных от больных ВИЧ-инфекцией с разными клиническими проявлениями криптоспоридиоза, провести оценку вирулентности криптоспоридий при экспериментальной инфекции у лабораторных мышей SCID, а также потенциал роста на искусственной питательной среде, не содержащей клеток хозяина;

4) провести исследование ооцист паразита в питьевой воде городской системы водоснабжения Ростова-на-Дону, а также изучить содержание ооцист криптоспоридий в речной воде бассейна Нижнего Дона для оценки ее роли в эпидемиологии криптоспоридиоза у больных ВИЧ-инфекцией;

5)  оценить потенциальную роль отдельных сельскохозяйственных животных и птиц как резервуара криптоспоридий и зоонозного источника инфекции для больных ВИЧ-инфекцией;

6)  на основе полученных данных разработать программу оптимизации клинико-лабораторной диагностики и прогноза течения криптоспоридиоза у больных ВИЧ-инфекцией.

Научная новизна

Установлены преимущества иммунологических методов лабораторной диагностики криптоспоридиоза (прямая иммунофлюоресценция и иммуномагнитная сепарация) при обследовании больных ВИЧ-инфекцией над традиционными методами лабораторной диагностики (прямая микроскопия, окраска мазка испражнений по Циль-Нильсену). Эти преимущества характеризуются высокой специфичностью и чувствительностью методов первой группы, которые позволили выявить высокую частоту бессимптомных формы болезни форм криптоспоридиоза у больных ВИЧ-инфекцией в г. Ростове-на-Дону.

Впервые установлена зависимость клинических проявлений и исходов криптоспоридиоза от клинической стадии ВИЧ-инфекции, а также отрицательное влияние хронического криптоспоридиоза на темпы прогрессирования  ВИЧ-инфекции уже на ее начальных стадиях.

Впервые в России выполнено генотипирование криптоспоридий, выделенных от больных ВИЧ-инфекцией и определен доминирующий вид паразита у больных ВИЧ инфекцией в Ростовской области – С. parvum.

Впервые в истории изучения криптоспоридиоза изучены биологические свойства криптоспоридий, обнаруживаемых в испражнениях больных ВИЧ-инфекцией. В частности, исследована жизнеспособность выделяемых с испражнениями больных ВИЧ-инфекцией ооцист по показателю активности  эксцистирования и их вирулентность для мышей SCID, а также потенциал роста паразита на искусственной питательной среде, не содержащей клеток хозяина.

Впервые выполнена эпидемиологическая оценка качества питьевой воды в г. Ростове-на-Дону и речной воды бассейна Нижнего Дона по содержанию в ней ооцист криптоспоридий, а также определен потенциал зоонозного резервуара инфекции среди сельскохозяйственных животных, которым является крупный рогатый скот.

Практическая значимость

Разработана программа клинико-лабораторной диагностики и оценки прогноза криптоспоридиоза у больных ВИЧ-инфекцией в зависимости от ее стадии.

Расширены показания к лабораторному обследованию больных ВИЧ-инфекцией на криптоспоридиоз. Рекомендованы методы лабораторной диагностики криптоспоридиоза, обладающие высокой специфичностью и чувствительностью, что повышает вероятность его распознавания у больных ВИЧ-инфекцией.

Изучены биологические особенности криптоспоридий, обнаруженных в испражнениях больных ВИЧ-инфекцией, выполнена оценка их жизнеспособности, потенциал роста при культивировании в искусственной питательной среде, не содержащей клеток хозяина, разработана модель оценки вирулентности паразита на экспериментальной модели инфекции у мышей SCID.

Показано, что клинические проявления и исход криптоспоридиоза варьируют в зависимости от клинической стадии ВИЧ-инфекции, вероятность выздоровления существует только у больных на ранних стадиях ВИЧ-инфекции. Установлено отрицательное влияние криптоспоридиоза на темпы прогрессирования ВИЧ-инфекции даже на ранних клинических стадиях при отсутствии выраженного иммунодефицита. При выявлении криптоспоридиоза у больного ВИЧ-инфекцией следует его в число первоочередного кандидата для проведения высоко активной антиретровирусной терапии.

Установлен доминирующий вид паразита, являющийся возбудителем криптоспоридиоза у больных ВИЧ-инфекцией, естественный резервуар инфекции в природе, показано, что вода не является основным путем передачи инфекции.

       Основные положения диссертации, выносимые на защиту

1. При использовании высоко чувствительных методов лабораторной диагностики выявлена высокая частота криптоспоридиоза у больных ВИЧ-инфекцией в г. Ростове-на-Дону, который характеризуется на ее ранних стадиях значительным удельным весом легких и бессимптомных форм.

2. ВИЧ-инфекция и криптоспоридиоз оказывают взаимное отягчающее влияние друг не друга. Отрицательное влияние ВИЧ-инфекции проявляется на поздних стадиях болезни и характеризуется увеличением удельного веса клинически проявляющихся и хронических форм криптоспоридиоза. Отрицательное влияние криптоспоридиоза выражается в ускорении темпов прогрессирования ВИЧ-инфекции у больных с хронической формой болезни, сопровождающейся диареей.

3. Доминирующим видом возбудителя криптоспоридиоза у больных ВИЧ-инфекцией в г. Ростове-на-Дону является  C. parvum, что является свидетельством преимущественно зоонозного резервуара и источника инфекции.

4. Экспериментальная инфекция у мышей SCID является наиболее чувствительной моделью оценки вирулентности криптоспоридий, выделенных из испражнений больных ВИЧ-инфекцией (с учетом видовой принадлежности обнаруженного паразита, представленного C. parvum), показатель эксцистирования ооцист и рост криптоспоридий на искусственной питательной среде не обладают такой чувствительностью.

5. Питьевая вода не является ведущим фактором передачи криптоспоридиоза у больных ВИЧ-инфекцией в г. Ростове-на-Дону.

6. Основным естественным резервуаром инфекции в природе является крупный рогатый скот.

Внедрение в практику

Материалы диссертации внедрены:

1) в работу Областного центра по борьбе со СПИД и инфекционными заболеваниями в Ростовской области;

2) в работу Северокавказского Центра СПИД;

3) в учебный процесс на кафедре инфекционных болезней РостГМУ

Росздрава.

Подготовлены и опубликованы методические указания для инфекционистов и врачей амбулаторно-поликлинического звена «Стандарты диагностики и лечения инфекционных болезней» (Ростов-на-Дону, 2008 г.).  Предложена программа оптимизации диагностики и прогноза течения криптоспоридиоза у больных ВИЧ-инфекцией.

Апробация работы

Основные результаты исследования представлены на научных конференциях: «Developing Research for a Common Future. The 2nd German-Russian Cooperative Symposium, 4-8 June, 2002» (Rostov-on-Don, Russia, 2002); «IWA Symposium on Health-Related Water Microbiology, 14-19 September, 2003» (Cape Town, South Africa, 2003); «Improving Research for a Common Future. The 3rd German-Russian Cooperative Symposium, 29-31 May, 2004» (Cologne, Germany, 2004); « The 3rd Congresss of German-Greek Academy for Biomedicine, 29-31 May, 2004» (Kavala, Greece, 2004); « The Fourth International Giardia Conference and the First Combined Giardia/Crypto Meeting in Amsterdam, 20-24 September, 2004» (Amsterdam, Netherlands, 2004); «The 15th Japanese-German Symposium on Protozoan Diseases, 16-21 September, 2006»  (Obihiro, Hokkaido, Japan, 2006). The 4-th German-Russian Cooperative Symposium, 6-10 June, 2006» (Rostov-on-Don, Russia, 2006). I Съезд инфекционистов ЮФУ (Краснодар, 2008). The 5-th German-Russian Cooperative Symposium, 14-17 June, 2008» (Cologne, Germany, 2008). Международная конференция «Физиология и патология иммунной системы», IV Международная конференция по иммунотерапии (Москва, 2008).

Публикации

Основные результаты диссертации представлены в  16 работах, в том числе в 7 изданиях, включенных в перечень рекомендованных ВАК.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на  337  страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, двух глав собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, практических рекомендаций. Список литературы включает 668 источников, из которых 34 опубликованы на русском языке и  634 – на иностранных языках. Работа иллюстрирована 8 таблицами и 36 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

  1. Общая характеристика обследованных больных и методы исследования

В период с 2002 года по 2006 год было выявлено 182 больных ВИЧ-инфекцией с криптоспоридиозом. Диагноз криптоспоридиоза устанавливали путем обнаружения ооцист в испражнениях методом прямой иммунофлюоресценции. Среди 182 больных криптоспоридиозом распределение больных по полу выглядело следующим образом: мужчин было 130 человек (71,4%), женщин – 52 (28,6%). Возраст обследованных больных колебался от 15 лет до 54 лет. Средний возраст больных составил 32,9 ± 0,6 лет. Характеристика распределения больных по возрасту представлена в таблице 1.

Таблица 1

Распределение больных криптоспоридиозом по возрасту

Показатель

Возраст (в годах)

< 15

16-20

21-25

26-30

31-35

36-40

41-45

46-50

51-55

Число боль-ных

Абс.

6

6

15

33

59

32

24

5

2

%

3,3

3,3

8,2

18,1

32,4

17,6

13,2

2,7

1,1

Заражение ВИЧ-инфекцией у большинства пациентов предположительно произошло в результате внутривенного употребления наркотиков в период с 1998 года по 2002 год. Подобный путь передачи ВИЧ-инфекции можно было рассматривать в качестве ведущего у 167 (91,8%) больных. Половой путь передачи в результате гетеросексуальных контактов предположительно имел место у 9 (4,9%) больных. Среди ВИЧ-инфицированных с таким путем заражения преобладали женщины – 7 (77,8%). У остальных 6 (3,3%) человек (женщин – 5, мужчин – 1) путь заражения мог быть смешанным, т.е. наряду с частой сменой половых партнеров и незащищенным сексом имела место практика эпизодического употребления внутривенно вводимых наркотиков.

Самым частым сопутствующим ВИЧ-инфекции заболеванием у всех обследованных больных с криптоспоридиозом был хронический гепатит С, который был выявлен у 158 (86,8%) из 182 больных. Хронический гепатит В был выявлен у 22 (12,1%) обследованных больных ВИЧ инфекцией.

Кроме серологических маркеров гепатита С у больных ВИЧ-инфекцией с криптоспоридиозом обнаруживались антитела класса IgG к вирусу простого герпеса (156 больных – 85,7%), цитомегаловирусу (152 больных – 83,5%), токсоплазмам (69 больных – 37,9%).

. Распределение больных с криптоспоридиозом по стадиям ВИЧ-инфекции выглядело следующим образом (таблица 2). У 9 (4,9%) человек на момент выявления криптоспоридиоза была диагностирована 3 стадия ВИЧ инфекции. Самым массовым контингентом больных с криптоспоридиозом были больные 4А стадии ВИЧ инфекции, их под наблюдением было 126 (69,2%). Больных криптоспоридиозом с 4Б стадией ВИЧ-инфекции было выявлено 33 (18,1%). Диагноз ВИЧ-инфекции 4В стадии был установлен у 14 (7,7%) больных криптоспоридиозом. Все больные со стадией ВИЧ-инфекции 4В в течение короткого отрезка времени, чаще в пределах от 6 до 11 месяцев, в результате прогрессирования иммунодефицита и развития тяжелых вторичных заболеваний переходили в терминальную стадию ВИЧ-инфекции и погибали.

Программа обследования больных включала:

1) клиническое обследование (жалобы, данные анамнеза, физикальный осмотр, консультации врачей различный медицинских специальностей – хирурга, гинеколога, невропатолога, ЛОР, психиатра, );

2) общепринятые лабораторные исследования (клинические анализы крови и мочи, спинномозговой жидкости, рутинные биохимические тесты, оценка иммунного статуса, серологические маркеры вирусных гепатитов и оппортунистических инфекций);

3) инструментальные исследования (ЭКГ, ЭЭГ, рентгенограмма и ультразвуковое исследование различных органов по показаниям, радиоизотопные исследования печени и почек, компьютерная и магнитно-резонансная томография по показаниям);

4) бактериоскопия и бактериологическое исследование крови, мочи, спинномозговой жидкости, испражнений, мокроты (в том числе, на микобактерии туберкулеза), экссудатов.

С целью лабораторной диагностики криптоспоридиоза были использованы:

1)  прямая микроскопия взвеси испражнений с использованием эталонного препарата очищенных ооцист из испражнений теленка, инфицированного в естественных условиях;

2) микроскопия мазка взвеси испражнений, окрашенного по методу Киньюн (Kinyoun), котрый является модификацией окраски на кислотоустойчивые микроорганизмы по методу Циль-Нильсена, оличающийся тем, что препарат не нагревают на этапе окраски фуксином (P. Ma, R. Soave, 1983).

3) метод прямой иммунофлюоресценции выполнялся с помощью коммерческого набора Crypto Cel (Cellabs Pty Ltd, Австралия), все этапы исследования выполняли в соответствии с инструкцией производителя;

4) для обнаружения ооцист методом иммуномагнтной сепарации ооцист криптоспоридий был использован набор Dynabeads M-280 anti-Cryptosporidium kit (Dynal, Норвегия).

Выделение ДНК из испражнений больных ВИЧ-инфекцией осуществляли после пяти циклов замораживания в жидком азоте и оттаивания при температуре 65 С для разрушения стенок ооцист. После этого для экстракции ДНК криптоспоридий из испражнений был использован коммерческий набор QIAamp DNA Stool Mini Kit (Qiagen GmbH, Германия). Все этапы исследования выполняли в соответствии с инструкцией производителя, прилагаемой к данному набору.

Для исследования видовой принадлежности криптоспоридий была ис-пользована полимеразная цепная реакция с вложенными праймерами (nested-ПЦР(, описанной в публикации L. Xiao и соавт. (1999). Для выполнения первого этапа ПЦР и амплификации фрагмента ДНК SSU rRNA гена криптоспоридий размером 1325 пн были использованы прямой праймер 5'-TTCTAGAGCTAATACATGCG-3' и обратный праймер 5'-CCCTAATCCTTCGAAACAGGA-3'. Второй этап ПЦР имел своей целью амплификацию фрагмента ДНК SSU rRNA гена криптоспоридий размером от 826 bp до 864 bp. Для выполнения второго этапа ПЦР был использован  продукт амплификации ДНК, полученный в результате выполнения первого этапа ПЦР. На втором этапе ПЦР были использованы прямой праймер 5'-GGAAGGGTTGTATTTATTAGATAAAG-3' и обратный праймер 5'-AAGGAGTAAGGAACAACCTCCA-3'. Для выполнения ПЦР использовали термоциклер MyCycler Bio-Rad (Cat. No. 1709703, Bio-Rad Laboratories, Inc., CA 94547 USA).

Для изучения полиморфизма длины рестрикционных фрагментов ДНК (ПДРФ-анализ) продукт, полученный в результате выполнения второго этапа ПЦР, подвергали воздействию рестрикционных эндонуклеаз SspI и VspI (Promega, США). Препарат ДНК, подвергнутый воздействию эндонуклеаз SspI и VspI, подвергали электрофоретическому разделению в 2% агарозном геле. Визуализацию результатов осуществляли путем окраски ДНК при помощи бромистого этидия. Гель окрашивался в течение 60 мин. в растворе красителя с концентрацией последнего 1 мг/л. Результат визуализировали с помощью ультрафиолетового трансиллюминатора LAS-4000 (Life Science, FUJIFILM, Japan) в соответствии со специальной встроенной программой и инструкцией изготовителя.

Для обнаружения ооцист криптоспоридий в питьевой воде Ростовской городской системы водоснабжения был использован метод фильтрации воды через полипропиленовый волокнистый фильтр с размером пор 1 мкм (Super Micro-Wynd CUNO, США), рекомендованному  LeChevallier и соавт. (1991) в модификации Karanis и соавт. (1998). Образцы питьевой воды отбирали два раза в месяц с интервалом в две недели. Всего были исследованы 12 образцов воды по 600 л каждый.

Помимо исследования питьевой воды было выполнено исследование воды реки Дон. Место забора проб было выбрано с учетом ранее выполненного изучения проб питьевой воды. На протяжении первого этапа  исследования местом забора был  правый берег Дона на расстоянии 1 км вверх по течению от места городского водозабора. Воду для исследования в объеме по 10 литров забирали два раза в неделю в период с 24 апреля 2005 г. по 19 мая 2005 г. Всего для данного исследования было получено 9 образцов воды. В период 26-27 мая 2005 года были дополнительно исследованы 16 проб воды реки Дон и ее притоков на протяжении от Цимлянского водохранилища до г. Азов (протяженность участка акватории около 250 км). Объем каждой из проб также составлял 10 л. Ооцисты криптоспоридий выделяли из исследуемого образца речной воды методом флокуляции (P. Karanis, A.  Kimura, 2002; C. Kourenti et al., 2003).

Концентрацию и очистку ооцист из испражнений больных ВИЧ-инфекцией осуществляли путем центрифугирования в градиенте плотности сахарозы и в градиенте плотности хлорида цезия (M. Arrowood, 2002).

Оценку жизнеспособности ооцист, выделенных из испражнений больных ВИЧ инфекцией с криптоспоридиозом, проводили по показателю их эксцистирования ( M. Arrowood, 2002). Исследование вирулентности ооцист, выделенных из испражнений больных ВИЧ-инфекцией, выполняли путем экспериментального заражения лабораторных мышей SCID (K. Hikosaka et al., 2005).

Культивирование криптоспоридий, выделенных из испражнений больных ВИЧ-инфекцией в искусственной питательной среде, которая не содержит клеток хозяина, осуществляли по методике N. Hijjawi с соавт. (2004).

Для оценки частоты криптоспоридиоза среди сельскохозяйственных животных и птиц были исследованы испражнения 116 телят, 56 поросят, 64 цыплят и 48 утят. Были также исследованы испражнения 29 хищников Ростовского зоопарка и 15 дико живущих лис. Обнаружение ооцист в испражнениях выполняли методом прямой иммунофлюоресценции.

2. Результаты собственных исследований и их обсуждение

2.1 Сравнительная чувствительность лабораторных методов  диагностики криптоспоридиоза у больных ВИЧ-инфекцией

С помощью прямой микроскопии влажного мазка испражнений у 6 (12,5 + 4,8%) больных из 48 были обнаружены ооцисты криптоспоридий, морфологически сходные с контрольным препаратом.

При микроскопии мазков, окрашенных по методу Киньюн, ооцисты были выявлены у 11 (22,9 + 6,1%) больных, причем у всех шести больных, у которых их удалось обнаружить ранее при диагностике методом прямой микроскопии. Среди 11 больных с положительными результатами диарея имела место у 8, но остальные трое больных сообщали об эпизодах диареи в течение последнего года. Статистически достоверной разницы между частотой обнаружения ооцист при прямой микроскопии и при окраске по Циль-Нильсену не было выявлено.

С помощью метода прямой иммунофлюоресценции ооцисты криптоспоридий были найдены в испражнениях 26 больных ВИЧ инфекцией (54,2 + 7,2%), включая всех 11 больных криптоспоридиозом, выявленных ранее с помощью микроскопии мазков после окраски по Циль-Нильсену. Из них у 9 больных на момент обследования была диарея, а из оставшихся 17 больных эпизоды диареи в отдаленном анамнезе отмечали 6 человек. Таким образом, связать положительный результат прямой иммунофлюоресценции с диареей  при криптоспоридиоза можно было у 15 больных из 27 (56%). Метод прямой иммунофлюоресценции позволял обнаруживать ооцисты достоверно чаще,  как по сравнению с прямой микроскопией влажного мазка испражнений (p < 0,05), так и по сравнению с микроскопией мазка после окраски по Циль-Нильсену (p < 0,01). У тех больных, у которых ооцисты не были обнаружены при окраске по Циль-Нильсену, метод прямой иммунофлюоресценции позволял обнаружить даже единичные ооцисты в препарате.

Метод иммуномагнитной сепарации позволил обнаружить ооцисты у 37 (77,1 + 6,1%) больных ВИЧ из 48 обследованных. При этом следует отметить, что из 11 вновь выявленных больных, у которых ооцисты не были найдены при использовании метода прямой иммунофлюоресценции, в пробах испражнений 10 больных было обнаружено всего по одной ооцисте, а у оставшегося одного больного –  лишь три ооцисты во всем препарате. Метод иммуномагнитной сепарации давал более значимые статистически отличия в частоте выявления ооцист по сравнению с прямой микроскопией влажного мазка испражнений (p < 0,01), микроскопией мазка после окраски по Циль-Нильсену  (p < 0,001) и методом прямой иммунофлюоресценции (p < 0,001). Диарея на момент обследования имела место у 9 больных с положительным результатом исследования испражнений методом иммуномагнитной сепарации, т.е. у оставшихся 2 из 11 больных с диареей не было установлено ее связи с криптоспоридиозом. Из 16 больных с диареей в анамнезе ооцисты были обнаружены у 7 человек, т.е. у 9 человек также не было оснований признавать причинную роль криптоспоридиоза при ранее имевшей место диарее. С другой стороны, ооцисты были обнаружены у 21 больного ВИЧ, у которых на протяжении последнего года до обследования, а также на момент обследования диарея отсутствовала.

Специфические методы обнаружения ооцист – метод прямой иммунофлюоресценции и метод иммуномагнитной сепарации, позволяли выявлять криптоспоридиоз у существенно большего числа больных. Недостатком метода иммуномагнитной сепарации является многоэтапность исследования и затраты времени на его выполнение. Поэтому при дальнейшей лабораторной диагностике криптоспоридиоза у всех обследованных нами больных ВИЧ инфекцией был использован метод прямой иммунофлюоресценции.

Клиническое значение обнаружения единичных ооцист в испражнениях больных ВИЧ без диареи подлежит специальному обсуждению. Полученные нами результаты использования высокочувствительных методов лабораторной диагностики криптоспоридиоза являются свидетельством высокой частоты бессимптомных или транзиторных форм криптоспоридиоза в популяции больных ВИЧ инфекцией в Ростове-на-Дону.

2.2 Клиническая характеристика криптоспоридиоза у больных ВИЧ-инфекцией на момент установления диагноза

При обследовании 515 больных ВИЧ-инфекцией лабораторный диагноз криптоспоридиоза с помощью исследования испражнений методом прямой иммунофлюоресценции был установлен 182 из них, что в целом составило 35,3 ± 2,1%.

Среди 39 обследованных больных с 3 клинической стадией ВИЧ-инфекции диагноз криптоспоридиоза был установлен у 9 больных, что составило 23,1 ± 6,7%. Из 332 больных с 4А клинической стадией ВИЧ-инфекции криптоспоридиоз был распознан у 126 (38,0 ± 2,7%) человек. Разница между частотой криптоспоридиоза у больных 3 и 4А клинических групп ВИЧ-инфекции была статистически значимой (p < 0,05). Больных с 4Б клинической группой ВИЧ-инфекции было обследовано 103, а диагноз криптоспоридиоза был выявлен у 33 (32,0 ± 4,6%), т.е. несколько чаще, чем у больных 3 группы, и реже, чем у больных 4А группы. Однако, эти отличия были статистически недостоверными (в обоих случаях p > 0,05).  Криптоспоридиоз был обнаружен у 14 (34,1 ± 7,4%) из 41 больного с 4В клинической стадией ВИЧ-инфекции, но и в этом случае полученный  показатель не имел статистически значимых отличий от таковых в группах больных 3 стадией, 4А стадией и 4Б стадией ВИЧ-инфекции (во всех трех случаях p > 0,05). Таким образом, только у больных с 3 клинической стадией ВИЧ-инфекции частота криптоспоридиоза была достоверно ниже по сравнению с больными с 4А клинической стадией.

Среди 9 больных криптоспоридиозом с  3 клинической стадией ВИЧ-инфекции диарея при первичном обследовании на момент госпитализации была выявлена у 3 (33,3 ± 16,6%) человек. Длительность диареи у одного больного составила 5 дней, у другого больного – 6 дней, у третьего больного диарея продолжалась 8 дней. Содержание CD4+ лимфоцитов  в группе больных криптоспоридиозом, относящихся к 3 клинической группе ВИЧ-инфекции составило в среднем 0,348 ± 0,035 109/л (у больных с диареей –  0,304 ± 0,029 109/л, у больных без диареи – 0,370 ± 0,049 109/л, p > 0,05).

Из 126 больных криптоспоридиозом и ВИЧ-инфекцией 4А клинической стадии диарея при обследовании была выявлена у 59 (46,8 ± 4,5%) человек. Статистически значимых различий в частоте диареи у больных с 3 и 4А стадиями ВИЧ-инфекции, установлено не было. Максимальная частота стула 2-3 раза в день наблюдалась у 31 (52,4%) больного с диареей. У 21 (35,6%) больных с диареей было отмечено учащение стула до 4-5 раз в день. У оставшихся 7 (11,9%) больных диарея сопровождалась учащением стула до 6-8 раз в день. Диарея продолжалась менее двух недель у 32 (54,2%) больных, от двух до трех недель – у 23 (39,0%) больных и более трех недель – у оставшихся 4 (6,8%) больных. Ни у одного больного диарея не сохранялась более одного месяца. Содержание CD4+ лимфоцитов  у 126 больных криптоспоридиозом, относящихся к 4А клинической группе ВИЧ-инфекции, составило в среднем 0,293 ± 0,013 109/л (у больных с диареей – 0,261 ± 0,015 109/л, без диареи – 0,319 ± 0,019 109/л, p < 0,05).

Из числа 33 больных с 4Б клинической стадией диарея была выявлена у 24 (72,7 ± 7,9%) человек. Удельный вес больных криптоспоридиозом с диареей в этой группе был заметно выше, чем у больных с 3 клинической стадией ВИЧ-инфекции (33,3 ± 16,6%, p < 0,05), с одной стороны, и у больных с 4А клинической стадией ВИЧ-инфекции (46,8 ± 4,5%, p < 0,01), с другой. Частота стула 2-3 раза в день наблюдалась  у 15 (62,5%) больных, 4-5 раз в день – у 7 (29,2%) больных, 6-8 раз в день – у оставшихся 2 (8,3%) больных. Диарея менее двух недель отмечена у 6 (25,0%) больных, от двух до трех недель – у 9 (37,5%), и более месяца – у 9 (37,5%) больных. Так же как и у больных 4А клинической стадии, ни у одного больного с 4Б клинической стадией ВИЧ-инфекции диарея не сопровождалась обезвоживанием.

Концентрация CD4+ лимфоцитов у больных криптоспоридиозом с 4Б клинической стадией ВИЧ-инфекции составила в среднем 0,166 ± 0,012 109/л (у больных с диареей – 0,151 ± 0,011 109/л, без диареи – 0,206 ± 0,028 109/л, p < 0,05).

Больных криптоспоридиозом с 4В клинической стадией ВИЧ-инфекции под наблюдением было 14 человек, из них диарея наблюдалась у 11 (78,6 ± 11,4%), т.е. чаще, по сравнению с больными на 3 стадии ВИЧ-инфекции (33,3 ± 16,6%, p < 0,05), а также по сравнению с больными на 4А стадии ВИЧ-инфекции (46,8 ± 4,5%, p < 0,01). Статистически значимая разница между частотой диареи у больных криптоспоридиозом с 4Б (72,7 ± 7,9%) и 4В (78,6 ± 11,4%) стадиями ВИЧ-инфекции отсутствовала.

Из 11 больных криптоспоридиозом с 4В клинической стадией ВИЧ-инфекции диарея у всех имела затяжной характер и продолжалась более одного месяца. В частности, у 3 (27,3%) больных она наблюдалась на протяжении 4-5 недель, у 5 (45,5%) –  6-7 недель, у оставшихся 3 (27,3%) – более двух месяцев.

Частота стула у 8 больных не превышала 5 раз в день. У 3 (27,3%) больных стул был чаще, испражнения имели водянистую консистенцию, но только у одного больного наблюдалось выраженное обезвоживание, частота стула у него достигала 10-12 раз в день. Только у этого больного можно было связывать выраженную потерю массы тела с дегидратацией.

Концентрация CD4+ лимфоцитов у больных криптоспоридиозом с 4В стадией ВИЧ-инфекции составила в среднем 0,081 ± 0,012 109/л (у больных с диареей – 0,067 ± 0,017 109/л, без диареи – 0,135 ± 0,033 109/л, p > 0,05).

2.3 Результаты наблюдения за больными криптоспоридиозом

в отдаленном периоде

За всеми больными ВИЧ-инфекцией, у которых при первичном обследовании был выявлен криптоспоридиоз, осуществлялось наблюдение в динамике с повторным исследованием испражнений и оценкой клинических проявлений. В результате прогрессирования ВИЧ-инфекции и присоединения других вторичных заболеваний из 182 больных криптоспоридиозом умер 31 (17,0  ± 2,8%) человек. Сроки наблюдения за всеми больными ВИЧ-инфекцией со смертельным исходом не превышали 1 года.

Из числа умерших только у 6 (19,4%) больных по результатам клинического наблюдения и патологоанатомического исследования был установлен диагноз СПИД. У всех умерших от СПИД криптоспоридиоз протекал с диареей, но только у одного больного испражнения были обильными, водянистыми и сопровождались обезвоживанием. Наряду с криптоспоридиозом у него была правосторонняя пневмония, токсоплазмоз головного мозга, распространенный кандидоз, хронический гепатит, эрозивный эзофагит с пищеводным кровотечением, кахексия (потеря массы более 30%). Еще у 5 больных со СПИД наблюдалась рецидивирующая диарея с ремиссиями. Причиной смерти у этих 5 больных также был не криптоспоридиоз, а другие множественные и тяжелые вторичные заболевания (у 4 больных – диссеминированный туберкулез, у 1 больного – энцефалит).

У остальных 25 больных криптоспоридиозом смерть наступала на стадии 4Б (6 больных) и на стадии 4В (19 больных). Среди всех причин смерти у этих больных на первом месте по частоте был туберкулез легких с распадом и гематогенной диссеминацией (14 больных). Из оставшихся 11 больных основной причиной смерти у 6 больных был сепсис, у 3 - пневмония, у 1 – менингит и еще у 1 больного нефрит.

Из оставшихся 151 больных криптоспоридиозом из наблюдения по разным причинам (смена места жительства, повторная неявка для диспансерного обследования по вызову и пр.) выбыли 16 (10,6  ± 2,5%) человек, у которых не удалось проследить дальнейшее течение и исход криптоспоридиоза. В результате динамика и исход болезни в отдаленном периоде были прослежены у оставшихся 135 больных.

Из 7 больных криптоспоридиозом с 3 клинической стадией ВИЧ-инфекции, у которых удалось проследить дальнейшее течение болезни, выздоровели 6 (85,7 ± 13,2%) человек. Оставшийся больной продолжал выделять ооцисты криптоспоридий с испражнениями при наличии рецидивирующей 2-3 раза в год диареи. В течение двух лет наблюдения у этого больного наблюдалось прогрессирование ВИЧ-инфекции в 4А стадию.

Из 126 больных криптоспоридиозом с 4А клинической стадией ВИЧ-инфекции динамика болезни прослежена у 112. Из этого числа больных паразитологическое выздоровление наблюдалось у 29 (25,9 ± 4,1%) больных. Доля больных, выздоровевших от криптоспоридиоза на 4А клинической стадии ВИЧ-инфекции, была намного меньше, чем среди выздоровевших больных с 3 клинической стадией ВИЧ-инфекции (p < 0,001). Из 53 больных криптоспоридиозом с диареей на момент первичного обследования паразитологическое выздоровление при наблюдении в динамике наступило у  9 (17,0 ± 5,2%) человек, а из 59 больных без диареи на момент первичного обследования – у 20 (33,9 ± 6,2%). Разница статистически  значима (p < 0,05).

Возможным вариантом объяснений указанной разницы в заметно более высокой частоте паразитологического выздоровления при криптоспоридиозе у больных с 4А клинической стадией ВИЧ-инфекции могло быть то, что на момент выявлении криптоспоридиоза больные без диареи находились в стадии реконвалесценции. Другим возможным объяснением является то, что более сохранный иммунный статус у больных криптоспоридиозом с 4А клинической стадией ВИЧ-инфекции без диареи обеспечил возможность формирования противопаразитарного иммунитета и освобождение организма больного от паразита.

Ответ на первый вопрос можно по результатам оценки жизнеспособности и других биологических свойств ооцист, выделяемых с испражнениями. Известно, что при реконвалесценции наблюдается выделение с испражнениями преимущественно нежизнеспособных ооцист (Z. Bukhari, H. Smith, 1997). Результаты оценки жизнеспособности ооцист, выделенных от больных ВИЧ-инфекцией, приведены ниже.

Ответ на второй вопрос получить сложнее. Прямых доказательств о взаимосвязи отдельных показателей противопаразитарного иммунитета с паразитологическим выздоровлением от криптоспоридиоза у больных ВИЧ-инфекцией до последнего времени не получено. В качестве косвенных доказательств может быть использован такой параметр, как темпы прогрессирования ВИЧ-инфекции у больных криптоспоридиозом с диареей по сравнению с больными без диареи.

После исключения из дальнейшего рассмотрения тех больных, у которых наблюдалось паразитологическое выздоровление, под наблюдением в динамике продолжали оставаться 83 больных с 4А стадией ВИЧ-инфекции, в том числе 44 больных с диареей. У них криптоспоридиоз протекал в хронической форме.

Из этой группы 44 больных с диареей 31 (70,5 ± 6,9%) больных сообщали о рецидивирующей  диарее с малой частотой (от 2 до 3 раз в год) и продолжительностью на протяжении всего периода последующего наблюдения. В этой группе пациентов только у 18 (40,9 ± 7,4%) человек не было установлено признаков прогрессирования ВИЧ-инфекции, т.е. все эти больные по-прежнему оставались на 4А клинической стадии.

Из 39 больных без диареи на момент первичной диагностики криптоспоридиоза от 18 (46,2 ± 8,0%) больных при дальнейшем наблюдении также были получены сведения об эпизодах непродолжительной диареи с частотой 2-3 раза в год. Удельный вес больных с диареей в отдаленном периоде (при ее отсутствии на момент первичного обследования) в этой группе больных был заметно меньше, а разница с 44 больными представленной выше группы по пропорции больных с диареей оказалась статистически значимой (p < 0,05). Признаков прогрессирования ВИЧ-инфекции из 39 больных без диареи на момент первичной диагностики криптоспоридиоза не наблюдалось у 26 (66,7 ± 7,5%). Этот показатель также заметно превышал аналогичный параметр в представленной выше группе из 44 больных, а обнаруженная разница была статистически достоверной (p < 0,05).

Еще один из возможных вариантов анализа выглядит так. Из 83 больных криптоспоридиозом с 4А клинической стадией ВИЧ-инфекции рецидивирующая диарея в отдаленном периоде наблюдения (вне зависимости от ее наличия на момент первичного обследования) имела место у 49 (59,0 ± 5,4%) больных. У остальных 34 (41,0 ± 5,4%) больных криптоспоридиоз также протекал в хронической форме, но бессимптомно. По истечении периода наблюдения у 44 (53,0 ± 5,5%) больных из 83 не наблюдалось прогрессирования ВИЧ-инфекции и перехода больных из 4А в 4Б или 4В клинические стадии. В группе из 34 больных с бессимптомным криптоспоридиозом отсутствие прогрессирования ВИЧ-инфекции наблюдалось у 24 (70,6% ± 7,8%). В то же время, в группе из 49 больных с хроническим криптоспоридиозом такое же течение ВИЧ-инфекции без прогрессирования имело место только у 20 (40,8 ± 7,0%) человек. Разница этих двух показателей была статистически значимой (p < 0,01).

Из 33 больных криптоспоридиозом с 4Б клинической стадией ВИЧ-инфекции паразитологическое выздоровление наблюдалось всего у 3 (9,1 ± 5,0%) человек. Доля больных с 4Б клинической стадией ВИЧ-инфекции, которые выздоровели от криптоспоридиоза, была намного меньше, чем в группе больных с 3 клинической стадией ВИЧ-инфекции (85,7 ± 13,2%,  p < 0,001) и с 4А клинической стадией ВИЧ-инфекции (25,9 ± 4,1%, p < 0,01).

Из 24 больных с 4Б клинической стадией ВИЧ-инфекции и диареей паразитологического выздоровления не наблюдалось ни в одном случае. Все 3 выздоровевших больных с 4Б клинической стадией ВИЧ-инфекции были из числа тех 9 больных, у которых диарея на момент первичного установления диагноза криптоспоридиоза отсутствовала (это составило 33,3 ± 15,7%).

Интересно, что практически с такой же частотой (33,9 ± 6,2%) наблюдалось выздоровление и среди больных криптоспоридиозом с 4А клинической группой ВИЧ-инфекции без диареи.

Из остававшихся под дальнейшим наблюдением 30 больных криптоспоридиозом с 4Б клинической стадией ВИЧ-инфекции умерли 17 больных. Из числа 24 больных с диареей при первичном обследовании умерил 15 (62,5 ±9,9%) человек, а из оставшихся 6 больных без диареи – 2 (33,3 ± 19,2%). Однако, при данном числе наблюдений статистически значимой разницы этих показателей не установлено.

Среди оставшихся 13 больных с 4Б стадией, которые были доступны дальнейшему наблюдению, у 9 человек наблюдалась диарея при первичном обследовании. В дальнейшем рецидивирующая диарея с периодами ремиссий сохранялась у всех 9 больных. Из 4 пациентов, у которых диарея при первичном обследовании отсутствовала, у всех были выявлены кратковременные эпизоды повторной диареи в отдаленном периоде. Признаков прогрессирования ВИЧ-инфекции за время наблюдения не было у 4 (30,8 ± 12,8%) больных, у остальных 9 (69,2 ± 12,8%) больных ВИЧ инфекция прогрессировала в 4В стадию.

Ни у одного из 14 больных криптоспоридиозом с 4В клинической стадией ВИЧ-инфекции паразитологического выздоровления не было зафиксировано вплоть до момента их смерти, которая наступала в результате усугубления  иммунодефицита и прогрессирующего течения резистентных к терапии вторичных болезней. Диарея отсутствовала у 3 (21,4 ± 11,4%) больных, что свойственно бессимптомному течению криптоспоридиоза.

2.4 Молекулярно-генетическая характеристика криптоспоридий, обнаруженных у больных ВИЧ-инфекцией

       Молекулярно-генетическая характеристика криптоспоридий стала предметом изучения только в конце 90-х годов 20 века и позволила четко определять источники инфекции, как при массовых заболеваниях, так и при спорадических случаях болезни. Изучение генотипов паразита на клиническом материале выявило отличия клинических проявлений при заражении тем или иным видом криптоспоридий.

Молекулярно генетические исследования были выполнены у 14 больных криптоспоридиозом с 4А клинической стадией ВИЧ инфекции. Из числа отобранных 14 больных, у 7 человек криптоспоридиоз сопровождался диареей, у других 7 человек имела место бессимптомная форма болезни. При отборе больных мы руководствовались критерием концентрации ооцист в испражнениях. У всех обследованных больных она была максимальной среди других представителей соответствующей группы. Это было предпринято для повышения вероятности положительных результатов экстракции ДНК для последующего исследования с помощью полимеразной цепной реакции с вложенными праймерами (ПЦР) и основанного на ней анализа полиморфизма рестрикционных фрагментов (ПДРФ) ДНК.

Амплификация ДНК была успешной с каждым из всех 14 исследованных образцов испражнений. При электрофоретическом разделении вторичного продукта ПЦР, подвергнутого воздействию рестрикционной эндонуклеазы Ssp I, были получены три отчетливые полосы . Одна из полос соответствовала фрагменту величиной 448-450 пар нуклеотидв (пн), другая – фрагменту величиной 250-255 пн, третья – фрагменту величиной 108-110 пн (рис. 1).

Фрагменты

ДНК:

а) 448-450 пн

б) 250-255 пн

в) 108-110 пн

Рис. 1. Результат ПЦР-ПДРФ анализа после воздействия рестрикционной эндонуклеазы SspI (метки указаны жирными стрелками и соответствуют фрагменту ДНК величиной 500 пар нуклеотидов (пн))

В результате воздействия рестрикционной эндонуклеазы Vsp I и последующего элетрофоретического разделения были получены две полосы. Одна полоса соответствовала фрагменту величиной 625-630 пн, другая фрагменту 100-106 пн (рис. 2). По результатам ПДРФ-анализа все обнаруженные в испражнениях больных ВИЧ криптоспоридии были идентифицированы как  C. parvum (ранее употреблявшиеся синонимы – C. parvum генотип 2 или C. parvum бычий генотип). Ни в одном из изученных образцов испражнений не было обнаружено ни C. hominis, равно как и ни одного другого из числа описанных у больных ВИЧ зоонозных генотипов паразита.

Фрагменты

ДНК:

  а) 625-630 пн

  б) 100-106 пн

Рис. 2. Результат ПЦР-ПДРФ анализа после воздействия рестрикционных эндонуклеаз VspI (метки указаны жирными стрелками и соответствуют фрагменту ДНК величиной 500 пар нуклеотидов (пн))

2.5 Оценка жизнеспособности ооцист криптоспоридий, выделенных от больных ВИЧ инфекцией, по показателю их эксцистирования

Применительно к задачам данного исследования оценка жизнеспособности ооцист была выполнена у больных ВИЧ инфекцией с криптоспоридиозом, который сопровождался клиническими проявлениями (диареей), а также у больных с бессимптомным течением. Исследование выполняло несколько задач. С одной стороны оно представляло собой попытку ответить на вопрос, является ли бессимптомное течение криптоспоридиоза признаком начинающегося выздоровления, с другой – давало возможность оценить в сравнении эпидемиологическую опасность больного криптоспоридиозом с диарей и без диареи. Известно, что в периоде ремиссии или реконвалесценции при отсутствии клинических проявлений больной продолжает выделять ооцисты криптоспоридий с испражнениями, но среди ооцист начинают преобладать нежизнеспособные формы (Z. Bukhari, H. Smith, 1997; Caccio, E. Pozio, 2006).

Исследование было выполнено у 25 больных с криптоспоридиозом с 4А стадией ВИЧ инфекции. Из их числа у 13 человек криптоспоридиоз протекал бессимптомно, а у 12 больных сопровождался диареей. Оценка активности эксцистирования выявила следующее. У 13 больных ВИЧ инфекцией без диареи средний показатель эксцистирования составил 82,7%+11,4%, а у12 больных ВИЧ инфекцией с диареей – 85,3%+12,1%. Статистически значимая разница этих показателей отсутствовала (p > 0,05).

Таким образом, у больных ВИЧ инфекцией содержащиеся в испражнениях ооцисты характеризовались одинаково высокой степенью жизнеспособности независимо от наличия или отсутствия клинических проявлений в виде диареи. Использованный нами метод оценки жизнеспособности ооцист позволяет считать,  что больные ВИЧ инфекцией с криптоспоридиозом без диареи представляют такую же эпидемиологическую опасность, как и больные с диареей. Высокий процент эксцистирования ооцист криптоспоридий у больных с субклинической формой криптоспоридиоза не дает оснований полагать, что отсутствие диареи было признаком ремиссии или начавшегося выздоровления.

2.6 Оценка вирулентности ооцист криптоспоридий, выделенных от больных ВИЧ-инфекцией, при экспериментальном заражении

мышей SCID

       Мыши линии SCID, у которых нет ни Т- ни В-лимфоцитов, представляют собой одну из наиболее адекватных экспериментальных моделей для оценки биологических свойств криптоспоридий, прежде всего их инфекционности (K. Hikosaka et al., 2005). До последнего времени интерес к оценке жизнеспособности ооцист был сконцентрирован на характеристике свойств паразита, обнаруживаемого в воде или подвергшегося воздействию дезинфицирующих средств. Удалось обнаружить только одну работу, в которой авторы выполнили исследование заразительности ооцист, выделенных от больных ВИЧ инфекцией, путем инокуляции лабораторным животным (C. Raccurt et al., 2006). Инфекцию удалось воспроизвести у всех 24 животных, зараженных ооцистами из испражнений 24 больных ВИЧ инфекцией (12 больных криптоспоридиозом с диареей и 12 больных – без диареи). Клиника криптоспоридиоза отсутствовала у всех зараженных мышей. На протяжении всего эксперимента и в отдаленные сроки наблюдения все мыши остались живы.

Заражающая доза ооцист, использованная нами для каждого отдельного опыта, была постоянной и составляла 103 ооцист. Несмотря на это биологическая модель позволила обнаружить разницу в вирулентности криптоспоридий, полученных от разных больных ВИЧ инфекцией. Наши исследования показали, что из 24 исследованных образцов испражнений больных ВИЧ только в 3 (12,5%), если ориентироваться на сроки первого появления ооцист в кале мышей, или в 5 (20,8%) образцах, если ориентироваться на время достижения пика экскреции ооцист, содержались высоковирулентные криптоспоридии. Это число высоковирулентных криптоспоридий может быть увеличено до 8 (33,3%), если ориентироваться на самую высокую концентрацию ооцист паразита, которая была зафиксирована в испражнениях этих 8 мышей по итогам двух месяцев наблюдения. Таким образом, результаты экспериментальной инфекции у мышей SCID дают основание предполагать, что у подавляющей части больных ВИЧ криптоспоридиоз был вызван штаммами паразита с невысокой вирулентностью.

Связь изученных параметров экспериментальной инфекции у мышей с наличием или отсутствием диареи при криптоспоридиозе у больных ВИЧ инфекцией отсутствовала. Это свидетельствовало о том, что наличие или отсутствие диареи в большей мере определялось состоянием организма больного, чем вирулентностью и патогенностью каждого отдельного изолята паразита.

2.7 Результаты оценки биологических свойств криптоспоридий по росту в культуре (в питательной среде, не содержащей клеток хозяина)

       Исследование культур криптоспоридий в течение первых двух часов инкубации позволило наблюдать процесс освобождения спорозоитов из ооцист. При этом в культуре можно было видеть одновременно целые ооцисты, частично освободившиеся от спорозоитов ооцисты, свободные спорозоиты, пустые оболочки ооцист.

       В специальной серии исследований, посвященной изучению процесса трансформации спорозоитов в другие морфологические формы паразита в культуре, были получены следующие результаты.

       На протяжении первого часа инкубации в среде доминировали интактные (не освободившиеся от спорозоитов) ооцисты. В течение второго часа инкубации освобождение спорозоитов из ооцист становилось более активным. К концу второго часа в культуре преобладали свободные спорозоиты и оболочки ооцист, хотя можно было видеть единичные сохранившиеся ооцисты без признаков эксцистирования.

       Первые признаки трансформации спорозоитов в другие клеточные формы появлялись спустя два часа инкубации. Их активность нарастала в течение последующих двух часов. Спорозоиты меняли форму и размеры, укорачиваясь и становясь толще. Клеточное ядро постепенно смещалось к центру, после чего в клетке соответственно расположению ядра формировалось выпячивание цитоплазмы. Клетка приобретала форму запятой.

       Вслед за этой стадией развития в течение последующих двух часов инкубации, с четвертого по шестой час от начала культивирования, часть клеток приобретала форму веретена, а другая часть приобретала круглую или овальную форму. Спустя шесть-восемь часов инкубации овальные и веретенообразные клетки формировали небольшие группы. На этой стадии обнаруживались клеточные формы, которые по своему строению уже существенно отличались от спорозоитов. По своим морфологическим характеристикам клетки больше соответствовали трофозоитам, но выглядели полиморфно.

       Динамика трансформации клеточных форм паразита в культуре не была подвержена вариациям и не отличалась между изолятами, полученными от разных больных. Мы также сравнивали разные методы стимуляции освобождения спорозоитов из ооцист. Они включали внесение в среду культивирования только свободных спорозоитов, частично эксцистированных ооцист, а также интактных ооцист без эксцистирования. Никаких особенностей поведения культуры в зависимости от способа эксцистирования отмечено не было. Изученные нами добавки в среду культивирования также не оказывали влияния на описанную динамику трансформации спорозоитов в культуре.

       На второй день роста культуры в ней можно было обнаружить только единичные целые или частично освободившиеся от спорозоитов ооцисты. В культуре преобладали активно двигавшиеся овальные и веретенообразные клетки с одним ядром. Клетки имели размеры от 1,5 до 2.0 мкм. Некоторые клетки располагались попарно с достаточно плотным контактом между ними, что могло быть признаком недавнего клеточного деления.

       Известно, что для мерозоитов характерна веретенообразная форма с заостренными концами и смещенным к периферии цитоплазмы ядром. Такие клетки можно было обнаружить в культуре. Но некоторые клетки удлиненной формы имели закругленные концы, что отличало их от мерозоитов. Другой тип клеток более соответствовал морфологическим характеристикам трофозоитов. Ядро в таких клетках также располагалось несколько асимметрично и было окружено более широкой цитоплазмой. Клетки овальной формы находились в среде отдельно либо в составе кластеров, включавших от трех до нескольких десятков клеток.

       В культуре редко удавалось наблюдать меронты первого и второго типов, хотя мерозоиты первого типа встречались достаточно часто в период от третьего до шестого дня инкубации культуры. Мерозоиты первого типа представляли собой клетки овальной или округлой формы с максимальными размерами 0,6 – 1,1 мкм в диаметре. Спустя шесть-девять дней инкубации можно было обнаружить в культуре единичные меронты второго типа. Их размеры варьировали от 9 мкм до 15 мкм в диаметре.

       Начиная со второй недели культивирования и вплоть до одного месяца наблюдения все описанные выше формы развития паразита обнаруживались с различной частотой во всех изученных культурах.

       Предположительно половые формы развития паразита (микрогамонты) появлялись в культуре начиная со второго дня культивирования, но чаще к концу первой недели роста и развития культуры. Ни в одной из культур не удалось наблюдать формирование новых ооцист паразита.

Выполненные в рамках данного исследования эксперименты по культивированию криптоспоридий в искусственной питательно среде, не содержащей клеток хозяина, показали следующее. Несмотря на все усилия и поиски путей стимуляции культуры, нам не удалось добиться полного завершения жизненного цикла. С другой стороны, нам удалось показать, что обнаруженные у больных ВИЧ инфекцией паразиты обладают некоторым потенциалом роста в условиях in vitro.

После сенсационной публикации, в которой авторы из Австралии утверждали, что им удалось в бесклеточной питательной среде добиться завершения жизненного цикла и получить ооцисты, обладавшие инфективностью  для мышей (N. Hijjawi et al., 2004). Иными словами, были получены результаты, которые давали основания утверждать, что паразит больше не нуждается в хозяине, т.е не является облигатным внутриклеточным паразитом как полагали на протяжении всей истории его изучения.

Появившаяся через два года после нее публикация авторов из США  опровергла заявленную сенсационную возможность культивирования в бесклеточной среде (D. Girouard et al., 2006). Авторам из США не удалось увидеть ни одной из стадий развития паразита в питательной среде, приготовленной по рецептуре австралийских исследователей, с использованием заявленной ими методики культивирования.

Результаты наших исследований культуры криптоспоридий в бесклеточной питательной среде занимают промежуточное положение, культура характеризовалась ростом до некоторого предела, но нам не удалось добиться завершения жизненного цикла.

Исследование показало, что паразит способен проходить некоторые начальные стадии развития в искусственной питательной среде, не содержащей клеток хозяина. Были детально изучены стадии трансформации в течение первых часов и суток культивирования. Трансформация начиналась спустя два часа инкубации и в основном завершалась спустя восемь часов культивирования. Она шла двумя путями и приводила к появлению двух типов клеток, морфологически сходных с трофозоитами и с мерозоитами. Обнаружение в культуре трофозоитов сразу вслед за спорозоитами логично и соответствует тому, что обычно имеет место при инвазии паразита в клетку хозяина. Труднее объяснить появление веретенообразных клеток, морфологически напоминающих мерозоиты, но не вслед за трофозоитами, а параллельно с ними. Никаких вариантов объяснения не приведено и в публикации из Австралии, т.к. появление подобного типа клеток они отмечали спустя несколько дней культивирования (N. Hijjawi et al., 2004). Коллектив авторов из США был лишен этой проблемы трактовки, т.к. вообще не наблюдал никакой трансформации в культуре паразита (D. Girouard et al., 2006).

Формирование подобных клеток наблюдали авторы из Испании при культивировании криптоспоридий в культуре клеток (M. Rosales et al., 2005), но только начиная с третьего дня инкубации.

Нам не удалось наблюдать ни в одной культуре агрегацию трофозоитов и формирование меронтов первого типа или сходных с ними структур, равно как и половые стадии развития паразита, вновь сформировавшиеся ооцисты или спорозоиты в поздние сроки наблюдения за культурами. Данная модель in vitro не обладала чувствительностью, достаточной для выявления отличий между различными изолятами паразита, как это наблюдалось при экспериментальном инфицировании мышей SCID. Следует признать, что биологическая модель более адекватно отражала индивидуальных отличия изолятов паразита, выделенных от разных больных ВИЧ инфекцией.

2.8 Результаты исследования ооцист криптоспоридий 

в питьевой воде

       Исследование питьевой воды было выполнено для оценки ее роли в качестве потенциального фактора передачи криптоспоридиоза у больных ВИЧ инфекцией.

Нам удалось обнаружить ооцисты паразита только в одном образце питьевой воды объемом 600 литров, который был  получен во второй половине октября, были обнаружены две ооцисты. Обе ооцисты были нежизнеспособными. Они представляли собой пустые оболочки без спорозоитов. Эпидемиологическое значение этой находки в плане потенциальной опасности пути заражения при употреблении питьевой воды минимально. Во-первых, все обнаруженные в питьевой воде ооцисты были нежизнеспособными, во-вторых, их удельная концентрация составила всего одну ооцисту в 300 литрах питьевой воды. Однако, эта находка может представлять определенный интерес в контексте других результатов предпринятого нами исследования.

Результаты исследования питьевой воды позволили заключить, что она не может быть ведущим фактором передачи криптоспоридиоза у больных ВИЧ инфекцией в Ростове-на-Дону. Однако, обнаружение даже следовых количеств ооцист и только в одном из 12 исследованных образцов питьевой воды свидетельствует о том, что потенциальная возможность контаминации воды ооцистами криптоспоридий существует. Обнаружение ооцист криптоспоридий в питьевой воде стало поводом для исследования воды реки Дон.

2.9 Результаты исследования ооцист криптоспоридий в воде

бассейна реки Дон и его притоков

       Обнаружение двух ооцист криптоспоридий в единственном образце питьевой воды поставило вопрос об оценке степени контаминации этим паразитом речной воды.  Река Дон является единственным источником водоснабжения населения Ростова-на-Дону питьевой водой. Хозяйственная деятельность на территориях, прилегающих к руслу Дона или его притоков, может быть потенциальным  фактором риска загрязнения речной воды. Населенные пункты и животноводческие фермы, расположенные по берегам Дона и его притоков,  имеют разный уровень благоустройства и очистки стоков. Земледельческие хозяйства постоянно вносят в почву органические удобрения (навоз). Все это создает угрозу заражения воды реки Дон ооцистами криптоспоридий.

В первой серии исследований были изучены 9 образцов воды реки Дон, которые были получены из одного и того же места, расположенного на 1 км выше по течению от места Ростовского городского водозабора. Интерес к исследованию воды на этом участке реки был обусловлен тем, что именно в этом месте производится ее получение для последующей очистки, обеззараживания и подачи в городскую систему водоснабжения. Выше по течению от этого участка в основное русло реки Дон со стороны ее правого берега впадает небольшая река Аксай. Забор проб воды производился с 24 апреля по 19 мая 2005 г. с кратностью два раза в неделю. Всего было отобрано и исследовано 9 образцов воды.

Результаты определения ооцист паразита в воде реки Дон на 1 км выше по течению от места городского водозабора позволили выявить их в каждом из 9 исследованных образцов. В дождливые дни было получено 4 образца воды для исследования (образцы № 1, № 2, № 3, № 5). Средняя концентрация ооцист криптоспоридий в речной воде составила 16,3 ± 2,7 в 10 литрах исследованного образца с колебаниями концентрации от 12 до 23 ооцист в 10 литрах воды. Пять образцов воды были получены в те дни, когда осадков не наблюдалось (образцы № 4, № 6, № 7, № 8, № 9) средняя концентрация ооцист в воде в эти дни была ниже и составила 10,2 ± 2,9 в 10 литрах с колебаниями от 5 до 21 ооцист в одном образце. При формальном анализе средние показатели концентрации ооцист в воде реки Дон в дождливые дни существенно не отличались от показателей их концентрации в дни без осадков, во всяком случае статистическая разница этих двух показателей отсутствовала.

Однако, следует обратить внимание на образец № 4, который формально был получен не в дождливый день, но в тот период, когда стояла дождливая погода и осадки в те дни были регулярными. Уровень воды в реке при заборе образца № 4 был таким же высоким, как и у других образцов, полученных во время дождей, что также косвенно указывает на взаимосвязь образца № 4 дождливой погодой. Если этот образец № 4 включить в группу образцов, полученных во время дождей (образцы № 1, № 2, № 3, № 5 и плюс добавленный к ним образец № 4), и исключить его из числа образцов, полученных в сухую погоду (образцы № 6, № 7, № 8, № 9 минус образец № 4), то результаты выглядят по-иному. При таком варианте группировки средняя концентрация ооцист в речной воде в дождливую погоду составила 17,2 ± 2,7, а при отсутствии дождей – 7,5 ± 1,3 в 10 литрах исследованного образца. При таком варианте группировки образцов и статистического анализа разница между средней концентрацией ооцист в период дождей и в период отсутствия осадков становится статистически значимой (p < 0,05). Таким образом, гипотеза о влиянии атмосферных осадков на концентрацию ооцист в воде реки Дон имеет право на существование.

Если провести группировку результатов определения ооцист в зависимости от уровня воды в реке Дон, то получится, что при высоком уровне воды средняя концентрация ооцист составила  17,2 ± 2,7, а при низком уровне воды – 7,5 ± 1,3 (p < 0,05), что полностью соответствует приведенному выше варианту статистического анализа применительно к осадкам.

Для обнаружения ооцист криптоспоридий в воде реки Дон было выполнено еще одно исследование, которое предполагало забор воды реки Дон и ее главных притоков на участке от Цимлянского водохранилища до г. Азов. Задачей данного фрагмента исследования была эпидемиологическая оценка уровня контаминации ооцистами криптоспоридий отдельных участков реки Дон и воды ее основных притоков.

Образцы воды реки Дон и ее притоков отбирали 26-27 мая 2005 года. В первый день были исследованы участки акватории в непосредственной близости от Ростова-на-Дону и в пределах городской черты. В этот же день был получен один образец воды в районе городского водозабора г. Азов, т.е. вниз по течению от Ростова-на-Дону.

На следующий день были произведены заборы проб воды из рек Маныч, Сал и цимлянского судоходного канала, которые расположены на левом берегу Дона от Ростова до Волгодонска. Затем были выполнены заборы образцов воды из Цимлянского водохранилища, участков реки Дон и Северский Донец, которые расположены вдоль правого берега Дона.

Ооцисты криптоспоридий были обнаружены в 6 из 16 исследованных образцов речной воды. Образец № 1, полученный на левом берегу основного русла Дона и расположенный на уровне городского водозабора на противоположном берегу содержал всего 9 ооцист криптоспоридий в 10 литрах. Этот образец был получен с территории частного пляжа. Ниже по течению на левом берегу реки Дон расположены базы отдыха, а еще ниже по течению на уровне центральной части города находится городской пляж.

Самая высокая концентрация ооцист (565 в 10 л образца) была выявлена в реке Темерник на участке ее течения в центре города за 300 м до впадения в реку Дон (образец № 6). На втором месте по содержанию ооцист (335 в 10 л) была вода реки Дон, на участке вниз по течению после впадения в нее реки Темерник (образец № 5). Возможным объяснением таких результатов является то, что вода реки Темерник после впадение в русло Дона смешивается с донской водой и на короткой дистанции подвергается небольшому разбавлению. В воде той же реки Темерник в районе ботанического сада (образец № 8) содержание ооцист было еще ниже (95 в 10 л). Следует отметить, что именно на участке реки Темерник от ботанического сада и до ее впадения в реку Дон в нее попадает большой объем городских стоков. Возможно, этим и объясняется более интенсивное загрязнение воды реки Темерник на участке ее течения в районе городской застройки высокой плотности.

Приблизительно в одинаковой и сравнительно невысокой концентрации содержала ооцисты криптоспоридий вода реки Мертвый Донец (30 и 25 ооцист в 10 л, в образцах №3 и № 4, соответственно). По правому берегу реки Мертвый Донец расположен обширный участок малоэтажной застройки с преобладанием частных домовладений. В этом районе города нет системы канализации, и преобладают туалеты с выгребными ямами. Часть населения, проживающего в районе реки Мертвый Донец, занимается разведением животных, включая крупный рогатый скот. Сточные воды с мест содержания животных имеют возможность непосредственного попадания в воду реки, особенно во время дождей и таяния снега. Выпас животных производится на правом и левом берегах реки Мертвый Донец. Кроме этого, река Мертвый Донец является одним их рукавов дельты реки Дон и питается водой из основного русла Дона. Таким образом, источником контаминации воды реки Мертвый Донец ооцистами криптоспоридий могут быть как основное русло реки Дон, так и стоки с территории частных домовладений.

Обращает на себя внимание тот факт, что вода Дона и его главных притоков (рек Маныч, Сал, Северский Донец) на всем протяжении вниз по течению от Цимлянского водохранилища (включая и воду самого Цимлянского водохранилища) до станицы Старочеркасской не содержала ооцист криптоспоридий. Определяемые количества ооцист в воде реки Дон появлялись в районе городского водозабора. Единственным вариантом объяснения этой находки является попадание ооцист в русло Дона ниже станицы Старочеркасской. В этом месте в реку Дон впадает небольшая река Аксай. На правом ее берегу на протяжении нескольких километров расположены населенные пункты с преобладанием частных малоэтажных домов с приусадебными хозяйствами. Система централизованной канализации отсутствует, поэтому население пользуется выгребными туалетами. На приусадебных участках, которые расположены на склоне, население занимается интенсивным разведением овощей, а также содержит скот. Правый и левый берег реки Аксай используется в качестве пастбищ для скота. Т.е. условия хозяйственной деятельности и благоустройства по берегам реки Аксай совпадали с таковыми в районе реки Мертвый Донец. Наиболее вероятно, что контаминация воды реки Дон в районе городского водозабора имела своим источником реку Аксай.

Результаты исследования ооцист в основном русле реки Дон на уровне города Азов в районе городского водозабора также дали неожиданный результат. В образцах воды реки Дон, полученных на уровне г. Азов ооцисты криптоспоридий обнаружены не были. Как уже было указано выше, вода основного русла реки Дон после впадения в нее реки Темерник содержала достаточное количество ооцист криптоспоридий (образец № 5 – 335 ооцист в 10 литрах воды). Вода является настолько благоприятной средой для ооцист, что они сохраняют свою жизнеспособность в воде на протяжении нескольких месяцев, а исследование образцов № 2 и № 5 было выполнено в один и тот же день. Исследование воды было произведено в конце мая, т.е. температура воды также способствовала сохранению жизнеспособности ооцист.

Следует также учесть, что все образцы с № 9 по № 16 были получены на фоне стабильной сухой и солнечной погоды в течение предшествующей недели. Отсутствие осадков могло обусловить низкую вероятность попадания ооцист криптоспоридий в воду реки Дон в дни, которые предшествовали забору образцов.

Если приведенное допущение верно, то все же следует признать, что концентрация ооцист криптоспоридий в воде реки Дон не является высокой. В частности, в районе Ростовского водозабора в 9 пробах воды определяемая концентрация ооцист была невысокой по сравнению с другими участками, где ооцисты были обнаружены. Наиболее контаминирована  ооцистами вода реки Темерник, участок реки Дон после впадения в нее реки Темерник и вода реки Мертвый Донец.

Результаты исследования питьевой воды позволили обнаружить всего две ооцисты в одной из двенадцати исследованных проб при объеме каждой из проб в 600 литров. Полученный результат контрастировал с наличием достаточного количества ооцист в воде реки Дон в районе водозабора. Средняя концентрация в 9 исследованных образцах составила 12,9 ± 2,2 ооцист в 10 литрах, т.е. около 780 ооцист в пересчете на 600 литров (объем исследованных образцов питьевой воды). Исходя из этого следует заключить, что применяемая в Ростове-на-Дону технология очистки питьевой воды позволяет добиваться эффективного удаления ооцист криптоспоридий и сводить к предельному и безопасному минимуму их содержание в конечном продукте.

Наши исследования показали, что потенциал водного пути передачи криптоспоридиоза у больных ВИЧ-инфекцией, проживающих в Ростове-на-Дону, следует признать ничтожно малым. Результаты исследования воды не позволили установить ее существенной роли в эпидемиологии криптоспоридиоза.

2.10 Результаты исследования ооцист криптоспоридий

в испражнениях  сельскохозяйственных животных,

хищников зоопарка и дико живущих лис

       Для оценки потенциальной роли сельскохозяйственных животных как источника инфекции были выполнены исследования сельскохозяйственных животных и птиц, которые содержались на фермах в окрестностях Ростова-на-Дону и снабжали своей продукцией население города.

Исследование испражнений поросят не позволило обнаружить ооцисты криптоспоридий ни в одном из изученных образцов. Все исследованные испражнения птиц, цыплят и утят, также не содержали ооцист паразита.

В испражнениях 8 (16,3%) телят из 49 обследованных в 2005 году были обнаружены ооцисты криптоспоридий. В связи с этим было выполнено еще одно обследование телят с другой фермы в 2006 году. Это обследование позволило обнаружить ооцисты криптоспоридий в испражнениях 13 (19,4%) из 67 изученных проб испражнений от разных животных.

При этом у 16 из 21 животных концентрация ооцист в испражнениях была невысока и колебалась в пределах 103 – 104 ооцист в пересчете на грамм испражнений. У трех телят концентрация ооцист испражнений была 105 – 106 в пересчете на один грамм. У двух животных концентрация ооцист в испражнениях составила 107 в пересчете на грамм. Учитывая, что заражающая доза для человека составляет от 30 до 100 ооцист, обнаруженные у животных концентрации способны приводить к интенсивному заражению разнообразных объектов окружающей среды, включая водные ресурсы и сельскохозяйственные земледельческие угодья.

Определение принадлежности обнаруженных у телят ооцист криптоспоридий к конкретному виду паразита было выполнено с использованием морфометрических критериев.

Согласно данным литературы, крупный рогатый скот может быть резервуаром трех видов криптоспоридий, C. parvum, C. andersoni и C. muris, при этом размеры ооцист C. parvum составляют 4,55,5 мкм, C. andersoni – 5,67,4 мкм, C. muris 5,57,4 мкм (S. Caccio, 2005). Из представленных данных литературы видно, что трудности в определении видовой принадлежности ооцист возникают только при разграничении C. andersoni и C. muris, т.к. размеры ооцист у них практически одинаковы и намного больше, чем у C. parvum. Размеры обнаруженных в испражнениях телят ооцист соответствовали C. parvum. Эпидемиологическое значение обнаружения ооцист C. parvum у обследованных нами телят заключается в том, что C. parvum патогенна для человека и относится к числу самых частых возбудителей криптоспоридиоза в популяции людей, а C. andersoni заболевание у человека не вызывает.

Кроме сельскохозяйственных животных в 2005 году были обследованы испражнения 29 хищников Ростовского зоопарка. Зимой того же года были выполнены дополнительные исследования испражнений 15 дико живущих лис. Испражнения лис были обнаружены и собраны в окрестностях Ростова-на-Дону. Результаты исследования ооцист криптоспоридий во всех образцах испражнений хищников Ростовского зоопарка и дико живущих лис были отрицательными. Это позволило сделать заключение, что обследованные животные не являются резервуаром инфекции.

ВЫВОДЫ

  1. Иммунологические методы лабораторной диагностики криптоспоридиоза обладают преимуществом по сравнению с микроскопическими методами и характеризуются высокой чувствительностью и специфичностью, что позволяет выявлять даже бессимптомные формы болезни.
  2. На ранних стадиях ВИЧ-инфекции криптоспоридиоз выявляется у небольшой части больных, течение болезни благоприятное и в большинстве случаев характеризуется спонтанным выздоровлением. По мере прогрессирования ВИЧ-инфекции и формирования иммунодефицита частота спонтанного выздоровления от криптоспоридиоза снижается, увеличивается частота хронических и клинически выраженных форм болезни.
  3. Криптоспоридиоз, сопровождающийся клиническими проявлениями (диареей), приводит к ускоренному прогрессированию иммунодефицита и сокращению продолжительности жизни больных ВИЧ-инфекцией. С учетом негативного влияния криптоспоридиоза на прогноз ВИЧ-инфекции, установление этого диагноза целесообразно рассматривать как самостоятельное и независимое от других критериев показание к немедленному назначению антиретровирусной терапии.
  4. Экспериментальная инфекция у мышей SCID является наиболее чувствительной моделью изучения вирулентности криптоспоридий. Показатель эксцистирования (освобождения спорозоитов) и культивирование паразита на искусственной питательной среде, не содержащей клеток хозяина, не позволяют дифференцировать вирулентность отдельных изолятов паразита.
  5. Наличие следовых концентраций ооцист в питьевой воде Ростовской городской системы водоснабжения и малой концентрации ооцист в воде реки Дон не представляет эпидемиологической опасности для больных ВИЧ-инфекцией. Повторяющаяся антигенная стимуляция малыми дозами паразита может способствовать формированию иммунитета и резистентности к последующему заражению криптоспоридиями. Это может быть одним из объяснений высокого удельного веса бессимптомных форм криптоспоридиоза у больных ВИЧ-инфекцией с компенсированными нарушениями иммунитета.
  6. Единственным установленным резервуаром криптоспоридий среди сельскохозяйственных животных является крупный рогатый скот, что косвенно подтверждают и результаты идентификации зоонозного вида криптоспоридий (C. parvum) в испражнениях всех обследованных больных ВИЧ-инфекцией.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

  1. При выявлении у больного ВИЧ-инфекцией диареи или эпизодов диареи в анамнезе даже в случае ее отсутствия на момент обращения к врачу по любому другому поводу, пациенту рекомендуется выполнить обследование на криптоспоридиоз. Особое внимание следует проявлять к больным на стадиях ВИЧ-инфекции 4А, 4Б и 4В, а также на стадии СПИД.
  2. При лабораторной диагностике криптоспоридиоза следует отдать предпочтение методу прямой иммунофлюоресценции, который прост в выполнении, обладает высокой чувствительностью и специфичностью по сравнению с прямой микроскопией испражнений или методом окраски мазка испражнений на кислотоустойчивые микроорганизмы.
  3. Обнаружение криптоспоридиоза при эпизодах диареи у больных ВИЧ-инфекцией с 4А, 4Б и 4В клиническими стадиями болезни следует рассматривать в качестве фактора неблагоприятного прогноза, что выражается в ускорении темпов прогрессирования иммунодепрессии. Выявление криптоспоридиоза у больных с ВИЧ-инфекцией на этих стадиях болезни следует рассматривать в качестве самостоятельного показания к немедленному назначению антиретровирусной терапии.
  4. Крайне низкая вероятность водного пути передачи криптоспоридиоза у больных ВИЧ-инфекцией должна направлять усилия врачей на профилактику других вероятных путей заражения, в частности, полового.
  5. Больным ВИЧ-инфекцией следует избегать прямого контакта с крупным рогатым скотом или испражнениями этих животных из-за высокого риска заражения криптоспоридиозом.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

  1. Карташев В.В., Пономаренко Я.В., Ящинский Л.В., Быков С.А., Амбалов Ю.М., Пшеничная Н.Ю., Лаптева Л.А. Поражение органов пищеварения у больных ВИЧ-инфекцией // Актуальные вопросы патологии желудка и двенадцатиперстной кишки. Ростов-на-Дону. – 2000. - С. 49-51.
  2. Карташев В.В., Пономаренко Я.В., Быков С.А. Современное состояние проблемы ВИЧ-инфекции в Ростове-на-Дону // Третья научная сессия Ростовского государственного медицинского университета -Ростов-на-Дону. – 2000. - С. 143-144.
  3. Kartashev V., AmbalovY., Karanis P., Kushnir L., Sauhat S., Ponomarenko Y., Cryptosporidium infection in HIV patients // Developing Research for a Common Future. 2nd German-Russian Cooperative Symposium, 4-8 June 2002. -Rostov-na-Donu , Russia. – 2002 - Р. 30-31.
  4. Kartashev V., Mitov R., Kourenti C., Gusarev S., Ponomarenko Y., Kushnir L., Ambalov Y., Karanis P. Cryptosporidium parvum among HIV patients in Rostov region (Southern Russia) and detection of oocysts in tap water //  IWA Symposium on Health-Related Water Microbiology, Cape Town, South Africa, 14-19 September 2003. – Р. 123.
  5. Kartashev V.V., Karanis P., Kushnir L., Sauhat S., Ponomarenko Y., Malysheva M., Bykov S., Ambalov Y., Ternovoi M. Current situation of cryptosporidiosis among HIV patients in Rostov area // Improving Research for a Common Future. 3rd German-Russian Cooperative Symposium, Cologne 13.-14. May 2004. Cologne, Germany. – 2004. - Р. 14.
  6. Kartashev V., Karanis P., Dumbadze O., Tverdohlebova T., Nogornii S., Ambalov Y., Gaeva Z., Dontsov D. Helminthosis and other parasitic diseases in Russia and in the Southern Administrative Region of Russia // Improving Research for a Common Future. 3rd German-Russian Cooperative Symposium, 13.-14. May 2004, Cologne, Germany. – 2004. - Р. 17.
  7. Kartashev V.V., Karanis P., Ponomarenko Y., Malysheva M., Bykov S., Gusarev S., Kudriavtsev L., Romanov N., Homman N. Study of histopathology of cryptosporidiosis as an opportunistic infection of the digestive tract in acquired immunodeficiency syndrome patients from Rostov area // Improving Research for a Common Future. 3rd German-Russian Cooperative Symposium, 13.-14. May 2004, Cologne, Germany. – 2004. - Р. 80.
  8. Kartashev V., Karanis P., Sotiriadou I., Kourenti C. Investigations on Giardia and Cryptosporidium in drinking water in Rostov region (Southern Russia). Improving Research for a Common Future. 3rd German-Russian Co-operative Symposium, 13.-14. May 2004, Cologne, Germany. – 2004. - Р. 82.
  9. Kartashev V., Karanis P., Ponomarenko Y., Malysheva M., Bykov S., Gusarev S., Kudriavtsev L., Romanov N., Homman N. Histopathology of cryptosporidiosis as an opportunistic infection of the digestive tract in AIDS patients 3 Congresss of German-Greek Academy for Biomedicine, 29-31 May 2004, Kavala, Greece.  – 2004. - Р. 30.
  10. Karanis P., Kartashev V., Sotiriadou I., Kourenti C. Detection of Giardia and Cryptosporidium in drinking water in Rostov region (Southern Russia). 3 Congresss of German-Greek Academy for Biomedicine, 29-31 May 2004, Kavala, Greece.  – 2004. - Р. 31.
  11. Kartashev V.V. Cryptosporidiosis – clinical presentation and therapy // International Giardia Conference and first combined Giardia/Crypto meeting in Amsterdam, 20-24 Sept., Amsterdam, Netherlands. – 2004. - Р. 55.
  12. Kartashev V., Karanis P., Sotiriadou I., Kourenti C., Kostova D. Giardia and Cryptosporidium in drinking water supplies of Rostov region (Southern Russia) and Sofia (Bulgaria) // 4 International Giardia Conference and first combined Giardia/Crypto meeting in Amsterdam, 20-24 September, 2004, Amsterdam, Netherlands. – 2004. - Р. 103.
  13. Karanis P, Sotiriadou I, Kartashev V, Kourenti C, Tsvetkova N, Stojanova K. Occurrence of Giardia and Cryptosporidium in water supplies of Russia and Bulgaria // Environ Res. 2006 – Vol. 102, N 3. – P. 260-71.
  14. Karanis P, Kartashev V. New insights on the development, molecular biology and phylogeny of Cryptosporidium // The 15th Japanese-German Symposium on Protozoan Diseases – Obihiro, Japan, 2006 – P. 52-53.
  15. Kartashev V, Ambalov Y, Ponomarenko Y, Karanis P. Cryptosporidiosis in humans – clinical presentation and prognosis in HIV patients from Russia // The 15th Japanese-German Symposium on Protozoan Diseases – Obihiro, Japan, 2006 – P. 54-55.
  16. Kiouptsi K, Thekisoe O, Inoue N, Kartashev V, Karanis P. Evaluation and application of loop-mediated isothermal amplification (LAMP) of DNA for the detection of Cryptosporidium // The 15th Japanese-German Symposium on Protozoan Diseases – Obihiro, Japan, 2006 – P. 80-81.
  17. Sotiriadou I, Kartashev V, Karanis P. Application of molecular tools on environmental water for the common detection of Cryptosporidium, Giardia and Toxoplasma // The 15th Japanese-German Symposium on Protozoan Diseases – Obihiro, Japan, 2006 – P. 84-85.
  18. Карташев В.В., Амбалов Ю.М., Бекетова Е.В., Пономаренко Я.В., Малышева М.И., Быков С.А., Гусарев С.В. Криптоспоридиоз у больных с ранними стадиями ВИЧ-инфекции в Ростове-на-Дону // Инфекционные болезни – 2008, № 2. – С. 50 – 52. 
  19. Карташев В.В., Амбалов Ю.М., Бекетова Е.В., Пономаренко Я.В., Малышева М.И., Быков С.А., Гусарев С.В. Криптоспоридиоз у больных ВИЧ-инфекцией в Ростове-на-Дону // Эпидемиология и инфекционные болезни – 2008, № 3. – С. 21 – 24.
  20. Карташев В.В., Амбалов Ю.М., Саухат С.Р., Шемшура А.Б., Бекетова Е.В., Быков С.А., Пономаренко Я.В., Малышева М.И., Ладычук М.Ю. Роль водных ресурсов в эпидемиологии криптоспоридиоза у больных ВИЧ-инфекцией // Аллергология и иммунология – 2008. – Т. 9, № 3. – С. 302.
  21. Карташев В.В., Хачикян В.З., Амбалов Ю.М., Саухат С.Р., Шемшура А.Б., Бекетова Е.В., Быков С.А., Пономаренко Я.В., Малышева М.И., Ладычук М.Ю. Видовая характеристика криптоспоридий у больных ВИЧ-инфекцией и определение резервуара инфекции среди сельскохозяйственных животных // Аллергология и иммунология – 200-8. – Т. 9, № 3. – С. 302.
  22. Карташев В.В., Амбалов Ю.М., Саухат С.Р., Шемшура А.Б., Бекетова Е.В., Быков С.А., Пономаренко Я.В., Малышева М.И., Ладычук М.Ю. Изучение свойств криптоспоридий, обнаруженных в испражнениях больных ВИЧ-инфекцией с диареей и без диареи // Аллергология и иммунология – 2008. – Т. 9, № 3. – С. 303.
  23. Карташев В.В., Амбалов Ю.М., Саухат С.Р., Шемшура А.Б., Бекетова Е.В., Быков С.А., Пономаренко Я.В., Малышева М.И., Ладычук М.Ю. Проявления криптоспоридиоза на разных стадиях ВИЧ-инфекции // Аллергология и иммунология – 2008. – Т. 9, № 3. – С. 303.





© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.