WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

 

На правах рукописи

ГРАШИН

Роман Арикович

КОРРЕКЦИЯ ПРОЛИФЕРАЦИИ КЕРАТИНОЦИТОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ЛИПОСОМ И ЕЁ КЛИНИКО-ЛАБОРАТОРНАЯ ОЦЕНКА КАК НАПРАВЛЕНИЕ В НАРУЖНОЙ ТЕРАПИИ ПСОРИАЗА

14.01.10 - кожные и  венерические болезни

14.03.10 - клиническая лабораторная диагностика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора медицинских наук

Санкт-Петербург

2009

Работа выполнена в ФГОУ ВПО «Военно-медицинская академия

имени С.М. Кирова» МО РФ

Научные консультанты:

доктор медицинских наук профессор Барбинов Вячеслав Витальевич

доктор медицинских наук профессор Карпищенко Анатолий Иванович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук профессор Горланов Игорь Александрович

доктор медицинских наук профессор Ключарева Светлана Викторовна

доктор медицинских наук профессор Эмануэль Владимир Леонидович

Ведущая организация:

ГОУ ДПО «Санкт-Петербургская  медицинская академия последипломного образования Федерального агенства по здравоохранению и социальному развитию»

Защита диссертации состоится “___” декабря 2009 года в ___ часов на заседании диссертационного совета Д 215.002.01 в ФГОУ ВПО «Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова» МО РФ (194044, г. Санкт-Петербург, ул. Академика Лебедева, дом 6).

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке ФГОУ ВПО «Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова» МО РФ

Автореферат разослан “____”  2009 года


Ученый секретарь  совета

доктор медицинских наук профессор

Пономаренко Геннадий Николаевич

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Согласно современным представлениям, псориаз - это хронический воспалительный иммунозависимый генодерматоз, основное патогенетическое звено которого проявляется усилением пролиферативной активности кератиноцитов, приводящей к нарушению процессов кератинизации [Самцов А. В. И соавт., 2002; Барбинов В.В. и соавт.,2008]. При этом в очагах поражения кожи митотическая активность эпидермальных клеток возрастает настолько, что время выхода кератиноцитов на поверхность кожи сокращается по сравнению с нормой с 14 до 2 суток, приводя при этом к полному обновлению эпидермиса всего за 5-6 дней вместо 28 [Шарапова Г.Я. и соавт., 1989]. Подобная скорость пролиферации в норме наблюдается лишь в клетках фолликулярного эпителия и клетках слизистых оболочек. Тем не менее, многочисленные исследования клеточного метаболизма не выявили нарушений, соответствующих изменениям, наблюдаемым при опухолевой прогрессии [Мошкалов А.В.,1995; Шилов В.Н., 2001]. В связи с этим большинство исследователей относит псориаз к сугубо воспалительным дерматозам, а ускоренную клеточную пролиферацию трактуют как результат дисбаланса в системе клеточных регуляторных механизмов.

К таким механизмам, относятся, в том числе, процессы свободнорадикального окисления и антиоксидантной защиты по изучению которых накоплен достаточный опыт. Однако, имеется ряд сообщений в которых указано, что характер процессов свободнорадикального окисления (СРО) при псориазе  отличен от общепринятого и непосредственно в клетках кожи имеет инвертный характер [Шилов В.Н. и соавт., 1997, 2001; Хышиктуев Б.С. и соавт., 2000; Тарасенко Г.Н. и соавт., 2002]. Участие этих процессов в пролиферации и дифференцировке кератиноцитов, несомненно, представляет немалый интерес, а  их регуляция – новые возможности в наружной терапии. 

На сегодняшний день предложено несколько теорий возникновения и развития псориаза, которые в целом не противоречат, а скорее дополняют друг друга. Доминирующей является теория Т-клеточно-опосредованного воспаления в коже, которая объясняет патогенез данного заболевания активацией нескольких субпопуляций лимфоцитов, которые управляют клеточным иммунитетом и контролируют его [Шегай М.М. и соавт., 1998; Шилов В.Н., 2000, 2001; Кrueger J.G., 2002]. Существует также и  теория  «псориатина» – неопознанного цитокина псориаза, вероятно, продуцируемого самими кератиноцитами и таким образом поддерживающими сам воспалительный и пролиферативный процессы, а также есть ещё  ряд других теорий [Скрипкин Ю.К., 1995; Мяделец О.Д. и соавт., 1997].

Оптимальный объём знаний об этиопатогенезе заболевания позволяет разрабатывать адекватную программу терапии. Хотя многие из применяемых сегодня методов лечения принято считать патогенетическими, следует признать, что некоторые их них являются эмпирическими, в лучшем случае симптоматическими и, более того, применение почти всех методов (исключая цитостатические и кортикостероидные препараты, ультрафиолетовое облучение) даёт положительный результат примерно в одни и те же сроки [Шилов В.Н. и соавт., 1995].

Для наружной терапии  псориаза  традиционно используют препараты следующих групп: разрешающие средства, включая гидроксиантроны (Дёготь, Антралин, Дитранон, Цигнолин);  глюкокортикоидные препараты различной силы, как отдельные стероиды, так и  в комбинации  с кератопластическими препаратами, антибиотиками, анестетиками  и другими средствами (Элоком С, Дипросалик, Полькортолон и пр.); синтетические ретиноиды  (Тезаротен);  синтетические аналоги витамина D3  (Дайвонекс, Дайвобет) [Соколовский Е.В., ред., 1999; Иванов О.Л. и соавт., 2005; Терлецкий О.В., 2006]. Применение средств для наружной терапии входит в  комплекс лечебных мероприятий, направленных в конечном итоге на нормализацию пролиферации  клеток кожи. Наружная терапия при этом нередко является ведущей, особенно в стационарном периоде псориаза. Необходимо отметить, что далеко не все препараты являются высокоэффективными и нередко требуют длительного подбора и ещё более длительного применения. Кроме того, препараты всех групп имеют свои недостатки. Так, разрешающие средства обладают выраженным раздражающим действием и  не могут быть использованы в остром периоде псориаза [Соколовский Е.В., ред., 1999; Самцов А. В. И соавт., 2002]. Топические кортикостероиды являются гормонами, применение которых вызывает ухудшение регенерации эпидермиса, а при  длительном применении - подавление иммунологической функции и атрофию кожи, ослабление лечебного эффекта. Такими же недостатками обладают и производные витамина D3.  Ретиноиды, несмотря на их высокую эффективность, достаточно токсичны [Иванов О.Л. и соавт., 1998;  Хойбеш М. и соавт., 1998;  Жилова М. Б., 2000].

Препараты для наружной терапии значительно отличаются по механизму своего действия, но ни один из них не обладает комплексным влиянием на клетку с учётом тех звеньев патогенеза, которые приводят к снижению пролиферации и усилению дифференцировки кератиноцитов, устранению иммунологических сдвигов и воспалительного процесса. Отдельные их них, например, созданный на основе витамина D3, избирательно действует на ядерные рецепторы гистон-нуклеинового комплекса и таким образом подавляет продукцию интерлейкина–1 [Кубанова А.А., 1993; Никулин Н. К. и соавт., 2000]. Цинка пиритионат (Скин-кап) обладает выраженным цитостатическим эффектом, блокируя механизмы репликации нуклеиновых кислот [Соколовский Е.В., ред., 1999]. Кортикостероиды угнетают синтез лейкотриенов, также воздействуя на ядерный аппарат клетки [Суворов А.П., 1988; Шарапова Г.Я. и соавт., 1989; Суворова К.Н., 1996].

Одним из направлений работы явилась необходимость обеспечения эффективной доставки  и проникновения лекарственных соединений ко всем клеточным слоям эпидермиса независимо от его толщины на различных участках тела. Доказано, что мембранные структуры клетки практически не воспринимают водорастворимые соединения, наносимые на поверхность рогового слоя,  даже если они входят в состав мазей и кремов [Марголис Л.Б. и соавт., 1986; Каплун А.  П. и соавт., 1998]. Иными словами, для решения задачи о доставке лекарственных веществ ко всем  слоям  кожи необходим проводник, способный  проникать как внутрь клетки, так и проводить водорастворимые соединения в глубокие участки межклеточного пространства. Есть мнение, что наиболее удобным и вместе с тем физиологичным энхансером являются липосомы, по созданию которых в мире накоплен достаточный опыт, к сожалению, пока, в основном, только лабораторный и косметологический [Бердичевский В.П. и соавт., 1979; Грегориадис Г., 1983; Чубатова С.А. и соавт., 1999; Lasic D., 1993] без  широкого практического применения в дерматологии.

Таким образом, слабо  изученные механизмы патогенеза болезни, недостатки наружной терапии  показали необходимость исследования молекулярных механизмов пролиферации кератиноцитов при псориазе, разработки лекарственных препаратов, способных комплексно и при этом мягко воздействовать на рецепторный аппарат клеток кожи, стабилизировать метаболические процессы,  создавая условия для их окончательной дифференцировки  и полноценного кератинообразования. 

Цель исследования: разработать новое направление наружной терапии псориаза, основанное на комплексной регуляции процессов пролиферации, для чего создать комбинированное  лекарственное средство в липосомальной форме, разработать лабораторные показатели его биологической активности и изучить его клиническую эффективность.

  Задачи исследования.

  1. Исследовать  биорегулирующее действие отдельных лекарственных препаратов, включённых в липосомы,  на культуры кератиноцитов больных псориазом для выбора  наиболее эффективных из них.
  2. Изучить биорегулирующее действие комбинаций  лекарственных препаратов, включённых в липосомы,  на культуры кератиноцитов больных псориазом для выбора оптимальной, в наибольшей степени подавляющей их пролиферацию и  разработать высокоэффективное комбинированное средство для наружной терапии.
  3. Изучить клиническую эффективность комбинированного липосомального препарата для наружной терапии псориаза.
  4. Провести сравнительный анализ динамики разрешения псориатических высыпаний у больных, получавших современные препараты для наружной терапии псориаза с новым антипролиферативным кремом.
  5. Исследовать  молекулярные механизмы регуляции пролиферативно-дифференцировочной активности кератиноцитов в культуре клеток на основе клинико-лабораторных методов комплексной оценки процессов свободнорадикального окисления и антиоксидантной защиты.

Научная новизна.

На основе разработанного метода определения чувствительности кератиноцитов подтверждена теория происхождения псориаза как воспалительного дерматоза.

Разработано новое научное направление в наружной терапии дерматозов, основанное на использовании высокоэффективных фармацевтических субстанций, ранее не применявшихся в дерматологии и нанотехнологий (липосом), обеспечивая, таким образом, помимо высокой клинической эффективности, нивелирование побочных эффектов, возникающих при  применении современных наружных лекарственных средств.

Установлено, что культуры кератиноцитов больных псориазом выращенные из клеток как  поражённых, так и  здоровых участков кожи, обладают одинаково высокой пролиферативной активностью и способны длительное время самоподдерживаться без добавления специальных ростовых факторов.

На изолированных культурах псориатических кератиноцитов, с использованием специально разработанного метода оценки чувствительности клеток,  установлен антипролиферативный эффект лекарственных препаратов включённых в липосомы и их комбинаций.

На изолированных культурах  кератиноцитов больных псориазом с использованием лабораторно-диагностических методов показано поведение систем свободнорадикального окисления  и антиоксидантной защиты и установлена  их роль  в регуляции  клеточной пролиферации, что  дополняет и расширяет представления о патогенезе псориаза и способах его лечения.

Практическая значимость.

Разработанное направление наружной терапии псориаза и созданный на этой основе комбинированный лекарственный препарат в форме крема позволяют проводить и в дальнейшем совершенствовать эффективную наружную терапию больных псориазом  как в остром (с использованием общей терапии), так и в стационарном (в качестве монотерапии) периодах.

Разработан и апробирован принципиально новый негормональный липосомальный  комбинированный лекарственный препарат для наружной терапии псориаза.

Разработанный лабораторный метод определения чувствительности кератиноцитов с использованием клеточных культур позволяет тестировать клетки кожи к известным препаратам  для выбора оптимальной терапии ещё до начала лечения и таким образом максимально индивидуализировать  проведение наружной терапии, а также создавать  новые эффективные препараты комбинированного действия.

Результаты, полученные при изучении систем свободнорадикального окисления и антиоксидантной защиты свидетельствуют о  необходимости включения в состав рецептур для наружной терапии псориаза препаратов прооксидантного действия.

Личное участие автора в получении результатов.

Автор принимал непосредственное участие в получении липосомальных препаратов и их комбинаций, в разработке и внедрении метода тестирования липосомальных препаратов и их влияния на активность пролиферации в культурах клеток, в разработке и создании липосомального комбинированного препарата,  а также непосредственно проводил сбор и обработку материала в ходе клинической части исследования. Автор лично выпол­нил все методики по исследованию систем свободнорадикального окисления и антиоксидантной защиты.

Автор составил план настоящего исследования, сформировал базу данных,  провёл аналитический обзор отечественной и зарубежной литературы,  статистическую обработку и обобщение полученных ре­зультатов,  сформулировал выводы и практические рекомендации.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту.

1. Культуры кератиноцитов кожи больных псориазом как с поражённых, так и с непоражённых участков  обладают высокой пролиферативной  активностью и способны длительное время самоподдерживаться без добавления специальных ростовых факторов, что свидетельствует о том, что кератиноциты больного псориазом способны секретировать собственные факторы роста.

2. Лекарственные препараты  механизм действия, которых, связан с подавлением клеточной пролиферации:  пентоксифиллин, пирроксан, селенит натрия, глутатион окисленный и сальбутамол, переведённые в липосомальную форму, обладают антипролиферативным действием на кератиноциты больных псориазом (подавление включения 3Н-тимидина в 4,2; 4,2; 3,2; 2,5 и 2.2  раза соответственно).

3. Комбинации из наиболее эффективных липосомальных лекарственных препаратов (пентоксифиллина, селенита натрия и пирроксана, а также  пентоксифиллина, селенита натрия и этмозина)  целесообразно  использовать в качестве лекарственных средств  для наружной терапии псориаза, так как они обладают синергидным действием (подавление включения 3Н-тимидина в 36,2 и в 23 раза соответственно).

4. Комбинированный препарат, в состав которого входят липосомальные: пентоксифиллин, пирроксан и селенит натрия  является высокоэффективным средством для наружной терапии псориаза и может быть использован как в остром, так и в стационарном периоде заболевания, так как не обладает раздражающим эффектом и  по клинической эффективности не уступает современным наружным средствам (чувствительность 93,9% стационарных и 90% амбулаторных больных;  скорость  разрешения псориатических элементов кожной сыпи:  4-5 нед у больных с ограниченной и 7-8 нед при распространённой формах болезни).

5. При псориазе  увеличение интенсивности свободнорадикального окисления ведёт к остановке клеточной пролиферации, а высокий уровень антиокислительной защиты её поддерживает.

Реализация  и внедрение полученных результатов работы

На основе полученных в ходе исследования результатов разработан и внедрён в практику липосомальный  биорегулирующий препарат для наружной терапии псориаза. Патент на изобретение №2196583 «Средство для наружной терапии псориаза и способ его изготовления»  от 20.01.2003 г.

Разработан лабораторный метод определения чувствительности кератиноцитов  больных псориазом к  лекарственным липосомальными препаратам, в том числе и к ранее не применявшимся в дерматологии в качестве наружных средств. Патент на изобретение № 2361219: «Способ определения чувствительности кератиноцитов больного псориазом к лекарственным препаратам» от 16.04.2008 г.

Результаты, полученные в ходе  исследования, были использованы при разработке и внедрении в клиническую практику дерматологических учреждений Санкт-Петербурга препаратов для наружной терапии и профилактики различных дерматозов, а также  серии липосомальной косметической продукции.

Рекомендации, разработанные на основании полученных в ходе диссертационного исследования данных, используются в научной работе и учебном процессе на кафедре кожных и венерических болезней и кафедре клинической биохимии и лабораторной диагностики Военно-медицинской академии, на кафедрах и клиниках дерматовенерологии СПбГМУ им И.П. Павлова, СПбГМА им.  И.И. Мечникова, в лечебно-диагностическом процессе в кожно-венерологических диспансерах Санкт-Петербурга и  медицинском центре «Альтермед». 

Апробация  и публикация материалов исследования.

Основные положения диссертационного исследования были доложены  и обсуждены на: 1-ом Европейском конгрессе по псориазу (Париж, 2004); I Всероссийском конгрессе дерматовенерологов (Санкт-Петербург, 2005); II Всероссийском конгрессе дерматовенерологов (Санкт-Петербург, 2007); Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные проблемы лабораторной диагностики" (Санкт-Петербург, 2008); VI Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы лечения в многопрофильных учреждениях" (Санкт-Петербург, 2003); Юбилейной научной  конференции посвящённой 80-летию кафедры микробиологии ВМедА и 300-летию основания Санкт-Петербурга «Современная микробиология клинической  медицине» (Санкт-Петербург, 2003); Юбилейной  научно-практической конференции «Актуальные вопросы дерматологии, косметологии и ИППП»: посвящённой 10-ти летию кафедры кожных и венерических болезней с курсом дерматокосметологии ФУВ (Москва, 2003); второй научно-практической конференции «Санкт-Петербургские дерматологические чтения» (Санкт-Петербург, 2008).

По теме диссертационного исследования опубликовано 30 научных работ,  из них 10 в рецензируемых журналах, получены патенты на 2 изобретения.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, 5 глав, включающих обзор литературы, общую характеристику материалов и методов исследования, 3 главы полученных результатов с их обсуждением, заключения и выводов. Работа изложена на 231 странице машинописного текста, содержит 12 рисунков, 9 таблиц. Список литературы состоит из 368 источников, из них 252 отечественных и 114 иностранных авторов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Для достижения цели исследования и решения поставленных задач работа проводилась по двум основным направлениям – экспериментальному и клиническому.

Экспериментальная  (клинико-лабораторная) часть исследования заключалась в последовательном проведении следующих этапов работы:

- приготовления липосом и лекарственных липосомальных комбинаций;

- культивирования кератиноцитов, полученных от больных псориазом;

- изучения антипролиферативной активности отдельных липосомальных фармацевтических препаратов и их комбинаций на полученных культурах кератиноцитов;

- изучения состояния систем СРО и АОЗ на полученных культурах кератиноцитов.

Клиническая  часть исследования предусматривала:

-изучение клинической эффективности созданного препарата для наружной терапии - крема Липсор в амбулаторных и стационарных условиях;

-сравнение  крема Липсор с наиболее эффективными современными препаратами для наружной терапии псориаза.

1. Методы приготовления липосом и лекарственных липосомальных комбинаций. Изготовление липосом и включение в них лекарственных субстанций производилось по методу Г. Грегориадиса, А. Аллисона (1983),  в нашей модификации [Грегориадис Г. и соавт., 1983; Грашин Р.А., 2008].

  Таким образом, были приготовлены липосомальные эмульсии: пентоксифиллина, этмозина гидрохлорида, сальбутамола, натрия селенита, глутатиона окисленного, кальция хлорида и фторурацила, а также различные липосомальные комбинации из данных препаратов. Размер частиц составлял от 50 до 200 нм.

2. Культуральные методы исследования.  Выделение первичной культуры кератиноцитов человека осуществлялось по методу Rheinwald J.G., Green H. (1975), в нашей модификации [Грашин Р.А., 2008;]. В этих условиях кератиноциты образовывали колонии, вытесняя фибробласты. Такая система может быть использована для изучения не только дифференцировки клеток кожи и различных ее патологических изменений, но и для тестирования лекарственных препаратов, влияющих на эпидермис.

Метод радиометрической оценки пролиферативной активности клеток. Влияние составных частей антипсориатического крема Липсор оценивали по включению в клетки меченых предшественников синтеза ДНК. Все эксперименты по определению пролиферативной активности кератиноцитов проводили в 4 параллельных пробах. Радиоактивность измеряли на синтиляционном анализаторе «Tracor Analytic Delta 300» (6891 Liquad Scintillation System) (Великобритания). Фотографии изготавливали с помощью компьютерной системы анализа изображения, состоящей из стандартного светового микроскопа, монохромной камеры «Chiper» (США), платы захвата изображения «Utech» (США) и программного морфометрического пакета «Image-Pro-Plus» (США).

3. Методы исследования свободнорадикального окисления и антиоксидантной защиты тканей на модели культур кератиноцитов при использовании отдельных липосомальных препаратов и их комбинаций.

Исследование параметров СРО и антиокислительной защиты (АОЗ) проводилось до и  после воздействия препаратов,  наиболее сильно подавляющих пролиферативную активность: пентоксифиллина, пирроксана, натрия селенита, сальбутамола, а также  смесей препаратов, состоящих из пентоксифиллина, пирроксана, натрия селенита – как наиболее активной и пентоксифиллина и натрия селенита – как наименее активной в отношении антипролиферативной деятельности. Поражённый и непоражённый участки кожи мы в данном исследовании не дифференцировли, т.к. ранее было установлено, что кератиноциты  с обоих участков у всех пациентов после добавления ростовых факторов обладали практически одинаковой способностью к росту и размножению.

Для исследования процессов свободнорадикального окисления и антиокидантной защиты клетки культур снимались с лунок 2 раза: после того как активно пролиферировали, т.е. перед воздействием липосомальных смесей и отдельных препаратов, и после воздействия, через 48 часов, т.е. после подавления пролиферации. В качестве контроля использовались культуры кератиноцитов здоровых доноров.

Для определения активности глуатионпероксидазы (ГП), глутатионредуктазы (ГР), супероксиддисмутазы (СОД) каталазы и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Гл-6ф-ДГ) использовали очищенную цитоплазматическую фракцию, которую получали дифференциальным центрифугированием.

Определение концентрации восстановленного глутатиона производили по методике G.L. Ellman (1959) [Карпищенко А.И., ред., 2002] в нашей модификации. Концентрацию восстановленного глутатиона выражали в мкмоль/г ткани.

Определение концентрации сульфгидрильных групп белков  в кератиноцитах производили по методу G.Bellomo (1990).  Содержание выражали в мкмоль/г ткани.

Определение концентрации диеновых конъюгатов  осуществляли по методике И.Д. Стальной (1977) [Карпищенко А.И., ред., 2002] в нашей модификации. Концентрацию ДК выражали в нмоль/г ткани.

Определение концентрации малонового диальдегида осуществляли  по методу M. Uchiyama (1978) в нашей модификации [Карпищенко А.И., ред., 2002]. Концентрацию ТБК-продуктов  выражали в нмоль/г ткани.

Определение общей антиокислительной активности производили методом Е.Б. Спектор, А.А. Ананенко и Л.Н. Политовой (1984) в модификации Н.С. Немченко (1989).

Определение активности глутатионпероксидазы (КФ 1.11.1.9) производили по методу А.Н. Гавриловой (1986). Активность фермента выражали в ммоль/(мин·г белка).

Определение активности глутатионредуктазы (КФ 1.6.4.2) осуществляли методом I. Carlberg и B. Mannervik (1985). Активность выражали в мкмоль/(мин·г белка).

Активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (КФ 1.1.1.49.) определяли по методу A.Kornberg и соавт. (1955). Результаты выражали в мкмоль/(мин·г белка).

Определение активности супероксиданиондисмутазы (КФ 1.15.1.1.) проводилось по методу Чумакова В.Н. (1977). Результаты выражали  в мкмоль/мин . г белка.

Для определение активности каталазы  (КФ 1.11.1.6.) использовался метод  М.А. Королюка и соавт.(1988).  Результаты выражали  в мкмоль/мин . г белка.

Содержание белка в пробах определяли методом Лоури в модификации G.L. Peterson (1977) и выражали в г/л.

4.  Методика проведения клинических исследований.

Клиническая характеристика больных.. Под нашим наблюдением находилось 2260 больных.  Больные отбирались из числа пациентов клиники кожных и венерических болезней Военно-медицинской академии, районных кожно-венерологических диспансеров и центра «Альтермед» г. Санкт – Петербурга. Критерием отбора являлось наличие заболевания в течение 12 месяцев и более, подтвержденное медицинской документацией (табл.1)

  Тяжесть болезни оценивалась по индексу площади и тяжести псориатических поражений PASI (Psoriasis Area and Severity Index) [Адаскевич В.П., 2004; Carlin C.S. et al., 2004] (легкая степень – < 12 баллов, средняя - 12 – 20 < баллов, тяжелая - 20 баллов). (табл. 2).

Сезонность псориаза оценивалась по данным медицинской документации и путем сбора анамнеза (табл.1).

Для оценки эффективности применения крема Липсор в качестве наружного средства для лечения псориаза использовался опросник оценки симптомов псориаза PSA (Psoriasis Symptom Assessment), который заполнялся больными до и после лечения.

Всем больным, находившимся на стационарном лечении, при поступлении  и перед выпиской проводилось исследование клинико-биохимического и сокращённого иммунологического статуса.

В качестве контроля использовался индифферентный крем, имевший идентичную  с Липсором основу, но без активных ингредиентов, т.н. «плацебо».

Таблица 1

Общая характеристика больных

Категории

Больные

Количество

%

Пол:

Мужской

1541

68

Женский

719

32

«Семейный» анамнез:

Есть

712

31,5

Нет

1548

68,5

Возраст начала болезни:

< 40 лет (I тип)

1723

76,2

40 лет (II тип)

537

23,8

Амбулаторное лечение

1680

74

Стационарное лечение

580

26

Всего:

2260

100

Контрольную группу составили 20 стационарных больных, одновременно получавшие крем Липсор и плацебо на различные, как правило, симметричные очаги поражения.

В ходе исследования пациенты были разделены на 3 группы: 2 основных и группу сравнения (табл. 2) В  первую группу вошли больные с ограниченными формами псориаза, во вторую – с распространённой и диффузными формами. Группу сравнения составили 260 амбулаторных больных вульгарным псориазом,  которым для наружной терапии назначались  «Элоком С», «Дайвонекс», «Скин-кап».

Крем  наносился на поражённые участки кожи два раза в сутки. Курсовая доза составила от 60 до 300 г препарата в зависимости от характера и распространённости поражения кожи. Больные также получали общую терапию, которая включала в себя фолиевую и аскорбиновую кислоты перорально

Таблица 2

Клиническая характеристика больных

Категории

Больные

Количество

Проценты

Клиническая форма:

ограниченный псориаз

1239

54,8

ограниченный экссудативный псориаз

82

3,6

распространённый псориаз

838

37

диффузный псориаз

101

4,4

Всего:

2260

100

Тяжесть болезни (по индексу PASI):

Легкой степени (< 12 баллов)

1594

70

Средней степени ( 12 - 20 < баллов)

401

17,7

Тяжелой степени ( 20 баллов)

265

11,7

Всего:

2260

100

Сезонность:

Летняя форма

331

14,6

Смешанная форма

409

18,1

Зимняя форма

1520

67,2

Всего:

2260

100

Течение:

Интермиттирующее

1542

68,2

Часторецидивирующее

718

31,8

Всего:

2260

100

цианкобламин и глюконат кальция внутримышечно. 40% амбулаторных больных использовали Липсор как монотерапию.

Эффективность лечения  оценивалась:  - по определению индекса PASI до начала терапии,  еженедельно и в конце срока наблюдения (число, размер и распространённость высыпаний, выраженность эритемы, инфильтрации, шелушения); - субъективным ощущениям больного (жжение, зуд, сухость кожи).

Окончательный итог исследования определялся на основании достигнутого результата лечения:  клиническая ремиссия, значительное улучшение, незначительное улучшение, без изменений, ухудшение;  определения индекса  PASI.

  Переносимость препарата оценивалась по следующим параметрам: очень хорошая, хорошая,  плохая, очень плохая.

5. Статистическая обработка результатов

Статистическую обработку полученных результатов проводили на персональном компьютере с помощью пакета прикладных программ «Microsoft Excel». В каждой группе рассчитывали средние значения и ошибку среднего. Достоверность различий с соответствующей контрольной группой оценивали по критерию t Стьюдента. Приведенные в тексте и таблицах значения представляли в виде Xср ± mx.

РЕЗУЛЬТАТЫ  ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Исследования в культурах клеток

1. Пролиферативно-дифференцировочная активность культур (контроль) кератиноцитов до воздействия липосомальными препаратами и их комбинациями.

Для выделения первичной культуры кератиноцитов использовались лоскуты кожи, взятые в стерильных условиях у больных псориазом из очага поражения и с неизмененного участка.

Кератиноциты, выделенные из пораженного участка кожи больных псориазом, пролиферировали более интенсивно и на 20-е сутки культивирования образовали 80-90% монослоя (рис.2), в то время как кератиноциты, выделенные с неизмененного участка кожи больных, образовали не более 40% монослоя (рис.3). Примечательно, что клетки, выделенные с непораженного участка кожи, через несколько дней под воздействием фактора роста, содержащегося в питательной среде, резко усиливали активность пролиферации, которую они приблизили к поведению клеток, выделенных из очагов поражения, и в дальнейшем степень их пролиферации не отличалась.

Частота включения 3Н-тимидина в кератиноциты поражённых и непоражённых участков эпидермиса составила 3178±126 и 2750±195 имп./мин (табл. 3), соответственно, и не имела достоверных отличий.

2. Результаты влияния отдельных липосомальных препаратов на

пролиферацию культур кератиноцитов.

С целью последующего выбора оптимальной лекарственной комбинации  для создания наружной лекарственной формы нами проведены исследования  и дана оценка антипролиферативного действия отдельных лекарственных препаратов, предварительно включённых в липосомы.

Были приготовлены и использованы липосомальные суспензии: пентоксифиллина, этмозина гидрохлорида (морицизин), пирроксана, кальция хлорида, глутатиона окисленного, сальбутамола и фторурацила в концентрациях, соответствующих среднетерапевтическим для парентерального введения [Машковский М.Д., 1998]. Выбор пал на эти препараты, так как теоретически они  позволяют воздействовать на патогенетические механизмы воз-

Таблица 3

Сравнительная характеристика подавления пролиферативой активности культур кератиноцитов при использовании отдельных липосомальных

препаратов (по результатам включения 3Н-тимидина)

Препарат

Поражённый участок (n 8)

Имп/мин.

Непоражённый участок (n 8)

Имп/мин.

Уменьшение по сравнению с контролем (во сколько раз)

Контроль (до применения липосомальных препаратов)

3178±126

2750±195

Пентоксифиллин

750±85 *

750±100 *

4,2/ 3,6

Этмозин

2530±400

2200±350

1,2/1,2

Селенит натрия

980±20 *

1150±500 *

3,2/2,4

Сальбутамол

1250±180 *

1600±90 *

2,5/1,7

Кальция хлорид

2580±300

2250±200

1,2/1,2

Глутатион (OГ)

1400±100 *

1420±90 *

2,2/1,9

Пирроксан

750±70 *

800±100 *

4,2/3,4

Флуороурацил

3000±250

2500±380

1,0/1,1

*- изменения достоверны по сравнению с контролем (р<0,005)

никших нарушений в кератиноцитах при псориазе за счёт стабилизации метаболического потенциала клетки, окислительно-востановительного статуса, регуляции митотической активности и механизмов апоптоза [Суворов А.П.,1988; Белушкина Н.Н., 1998; Бутов Ю.С. и соавт., 2001; Дмитренко К.В., 2003]. Выбранные  лекарственные средства обладают разными механизмами действия. Они хорошо известны и широко применяются парентерально для лечения сердечно-сосудистых, неврологических, аллергических, онкологических и других заболеваний, но в качестве средств для наружной терапии псориаза никогда не применялись.

Наиболее сильным ингибитором пролиферации оказался пентоксифиллин, который уменьшал пролиферативную активность кератиноцитов как из поражённого, так и  непоражённого участков кожи более чем в 4,2 и 3,6 раза соответственно. Аналогичная эффективность в ингибировании пролиферации отмечена у пирроксана - в 4,2 и 3,4 раза. Далее следует селенит натрия – в 3,2 и 2,4 раза. Сальбутамол и глутатион окисленный  обладали несколько менее выраженным влиянием на пролиферацию – 2,5/1,7 и 2,2/1,9 раза соответственно (р < 0,005), (табл.3). Этмозин обладал крайне незначительной активностью, а хлорид кальция и флуороурацил антипролиферативной активностью практически не обладали.

3. Результаты влияния комбинаций липосомальных препаратов на

пролиферацию культур кератиноцитов

С целью создания комбинированного лекарственного средства в форме крема для наружной терапии псориаза проведено исследование антипролиферативного действия смесей лекарственных препаратов, предварительно включённых в липосомы, на культуры кератиноцитов, выращенных от больных псориазом. Комбинированные липосомальные смеси приготавливались из  липосомальных суспензий отдельных препаратов, каждый из которых обладает выраженным самостоятельным антипролиферативным эффектом, как было показано ранее. Исследовались комбинации препаратов в различных сочетаниях  на культурах выращенных как с пораженных, так и с интактных участков. Смесь № 1 – пентоксифиллин, селенит натрия, пирроксан. Смесь № 2 – пентоксифиллин, этмозин, селенит натрия. Смесь № 3 – пентоксифиллин, селенит натрия, сальбутамол, пирроксан. Смесь № 4 – пентоксифиллин, сальбутамол, пирроксан. Смесь № 5 – пентоксифиллин, селенит натрия.

Результаты полученных исследований позволяют сказать, что пролиферация кератиноцитов в культурах клеток кожи больных псориазом значительно подавлялась (р < 0,001) при использовании всех перечисленных комбинаций, однако наиболее эффективной оказалась смесь № 1, подавлявшая пролиферацию в 36 и 24 раза соответственно. Несколько уступали по активности смеси № 2 и № 3, что составило ингибирование пролиферативной активности в 23,0/18,3 и 22,6/15,0 раз по сравнению с контролем в поражённом/интактном участках кожи соответственно. Из числа исследованных несколько хуже, но достаточно эффективно подавляли рост клеток в культурах смеси №№ 4, 5, что составило 17,1/12,7 и 14,5/11,8 соответственно. При этом, как и в случае с изолированными лекарственными препаратами, захват 3Н-тимидина более активно осуществлялся кератиноцитами поражённых участков, что свидетельствует о более высокой митотической активности этих клеток. Отмечены также существенные различия между смесями в каждой группе (р < 0,05), за исключением №№ 2, 3 в культурах с поражённых участков и №№  4, 5 в культурах, выращенных из непоражённых клеток (табл. 4).

Из полученных результатов следует, что комбинации из пентоксифиллина, селенита натрия и пирроксана (смесь № 1), а также из пентоксифиллина, селенита натрия и этмозина (смесь № 2) наиболее целесообразны для использования в наружной терапии псориаза, что вероятно связано с синергичным усилением механизмов подавления пролиферации.

Наибольшую активность проявил пентоксифиллин вероятно потому, что его биологическое действие обусловлено влиянием на Р1 аденозиновые рецептроры, ингибированием фосфодиэстеразы (ФДЭ), что ведёт к увеличению

Таблица 4

Сравнительная характеристика подавления пролиферативной активности культур кератиноцитов смесями липосомальных препаратов (по результатам включения 3Н-тимидина)

№ смеси

Поражённый участок (n 8)

Имп/мин.

Непоражённый участок (n 8)

Имп/мин.

Уменьшение по сравнению с контролем (во сколько раз)

Контроль (до применения липосомальных препаратов)

14724±96

12456±40

1

406±32 *,  **

518,0±38*,  **

36,2/24,0

2

639±24* 

681,5±25 *,  **

23,0/18,3

3

649±35*

825±34*,  **

22,6/15,0

4

859±46 *,  **

974,5±27*

17,1/12,7

5

1011±39 *, **

1053±34*

14,5/11,8

*- изменения достоверны по сравнению с контролем (р < 0,001)

**- изменения достоверны внутри группы (p < 0,05)

содержания цАМФ в клетках и проявлению известного антипролиферативного эффекта этого соединения [Машковский М.Д., 1998; Дмитренко К.В., 2002; Voorhees J., 1974]. Достаточно логичным продолжением этого действия является уменьшение концентрации кальмодулина в кератиноцитах, так как этот кальций связывающий белок - одна из субъединиц ФДЭ, и снижение концентрации активированного ионизиованного кальция, через который реализуется действие фосфолипаз, а также секреция ряда хемокинов ведут как к снижению функциональной активности клеток вообще, так и пролиферативной в частности. Один из наиболее важных антипролиферативнвных эффектов пентоксифиллина, на наш взгляд, обусловлен ингибированием продукций фактора некроза опухолей (ФНО-) [Дмитренко К.В., 2003]. ФНО-  считается одним из главных  в процессе  развития патохимической, гистоморфологической  и клинической картины псориаза, а псориатический кератиноцит – активный продуцент этого цитокина. Являясь фактором активных кератитноцитов, моноцитов и цитотоксических лимфоцитов (Тс1) ФНО- участвует в повреждении эндотелия [Маркушева Л.И. и соавт., 1996; Шичкин В.П., 1998; Маркушева Л.И. и соавт., 2000;  Heymann W.R., 2007].  Т.о. при псориазе эндотелий капилляров сосочкового слоя дермы становится цитокин-генерирующим, вследствие чего инициируется экспрессия молекул клеточной адгезии. Сам эндотелий активно участвует в продукции цитокинов [Gottlieb A.B. et al., 2002; Кrueger J.G., 2002]. Следовательно, подавление пролиферации кератиноцитов может объясняться подавлением продукции ФНО- в культуре клеток, как одного из главных факторов аутокринной регуляции даже в отсутствие резидентных клеток кожи.  В коже больных псориазом при применении липосомального  пентоксифиллина выраженный антипролиферативный эффект вероятно  также обусловлен влиянием на экспрессию  гена ФНО-, не только в кератиноцитах, но в первую очередь в иммунокомпетентных клетках: КЛ, Тс1 и эндотелии сосудов [Bos J.D., 1999; Кrueger J.G., 2002; Bos J.D., 2007].

Пирроксан, являясь неселективным адреноблокатором, ингибирует пролиферацию благодаря блокированию преимущественно 2-адренорецепторов. Биохимические механизмы действия -адреноблокаторов обусловлены ингибированием мембранных клеточных систем аденилатциклаза - цАМФ с последующей модуляцией соответствующих ферментных систем внутри клеток [Машковский М.Д.,1998; Сергеев П.В. и соавт.,1999].  Механизмы действия селенита натрия и его основного биологического компонента  селена (Se4+) на процессы пролиферации кератиноцитов нам практически неизвестны. Есть указания на то, что большие концентрации этого иона подавляют полностью пролиферативно-митотическую активность любых клеток, включая и клетки кожи [Droge W. et al., 1998; Filomeni G. et al., 2005; Jordan P.A. et al., 2006]. Наиболее часто роль данного микроэлемента рассматривается во взаимосвязанных процессах СРО, тиол-дисульфидном обмене и функционировании системы глутатиона [Кулинский В.И. и соавт., 1990; 1993]. Учитывая известные на сегодня данные о селене, теоретически можно предположить, что он должен подавлять пролиферацию и улучшать дифференцировку клеток.

Известно, что селен улучшает процессы клеточного созревания за счёт стабилизации белков, активации тканевого дыхания, поддержания функционально активной формы цитохрома С [Скальный А.В., 2004]. Биологическая значимость селена в организме человека связана с физиологической активностью селен содержащих биологических макромолекул и его низкомолекулярных соединений. Отмечено, что в зависимости от концентраций, действие молекулярного селена на клетки проявляется снижением их митотической активности и удлинением митотического цикла.  Кроме того соединения селена способствуют формированию нормального соотношения между клетками иммунной системы; связывают ионы тяжелых металлов, вследствие чего препятствуют их взаимодействию с тиоловыми группами белков и ферментов [Басоло Ф. и соавт., 1971; Isaacs J.et al., 1977]. Вероятно, совокупность данных свойств и привела к получению нами достаточно выраженного антипролиферативного эффекта.

О роли системы глутатиона в метаболизме клеток кожи известно крайне мало. Так как окисленный и восстановленный глутатионы в целом являются участниками окислительно-восстановительной системы любой клетки, донорами сульфгидрильных групп и одними из главных участников антиоксидантной защиты, то, экстраполируясь от известного, можно сказать, что глутатион окисленный стимулирует процессы дифференцировки, смещая редокс-потенциал клетки в сторону окисления [Filomeni, G., 2002]. Это ведёт к появлению протонов, свободных электронов и способствует появлению активных форм кислорода, что ингибирует пролиферативную активность кератиноцитов. ОГ обладает выраженным влиянием на активность многих энзиматичеких систем: снижает активность ферментов синтеза гликогена, гликолиза, холестерина, белков, что ведёт к подавлению митотической активности [Кулинский В.И. и соавт., 1990].

Сальбутамол - 2-адреномиметик. Оказывает высокоселективное стимулирующие действие на 2-клеточные аденилатциклазные адренорецепторы, что ведёт к увеличению концентрации цАМФ [Машковский М.Д., 1998]. В результате ожидался яркий антипролиферативный эффект, однако его не получили ни в одном случае. Вероятно, полученный результат связан с недостаточно представленным рецепторным аппаратом на кератиноцитах, и что более вероятно, ограниченными возможностями клеток кожи, изолированных в культуре к наработке большого количества АТФ. Поэтому, в данном случае более эффективными оказываются те лиганды, которые сохраняют цАМФ от использвания за счёт блокады ФДЭ (пентоксифиллин), чем те, которые стимулируют его выработку из АТФ (сальбутамол).

Этмозин (этмозина гидрохлорид) является производным фенотиазина и относится к фармакологической группе препаратов-антиаритмиков I класса. Используется для лечения сердечно-сосудистых заболеваний. Он оказывает выраженное мембраностабилизирующее действие за счёт подавления транспорта ионов натрия через «быстрые» натриевые каналы клеточной мембраны, что ведёт к снижению активности ферментов, участвующих в репликации ДНК, и  в итоге, к снижению пролиферативной активности; снижает интенсивность поступления кальция в клетку, подавляя при этом активацию фосфолипаз, тем самым, вызывая противовоспалительный и антигистаминный эффект за счёт ингибирования липооксигеназной ферментной системы - продуцента лейкотриенов – медиаторов воспаления. [Шарапова Г.Я. и соавт., 1989; Машковский М.Д., 1998].  Применение этмозина не дало желаемого антипролиферативного эффекта в культурах кератиноцитов при его испытании как отдельно взятого препарата в липосомальной форме.

Практически аналогичная картина была отмечена при применении кальция хлорида и фторурацила. Применяемые парентерально препараты кальция оказывают свой лечебный эффект за счёт стимуляции как коркового, так и мозгового вещества надпочечников. Резкое повышение концентрации данного катиона в крови ведёт к выбросу катехоламинов, и что особенно важно - глюкокортикоидов. Как следствие – выраженный противовоспалительный и антипролиферативный эффекты. Применение препаратов кальция в виде добавления к культуре клеток таким действием не обладает.

Флуороурацил (5-фторурацил), ингибируя фермент тимидилатсинтазу, нарушает синтез ДНК и РНК [Машковский М.Д.,1998]. Именно от данного соединения мы ожидали наиболее выраженного эффекта. Тем более, что цитостатики являются часто и успешно применяемыми в схемах лечения псориаза. Лечебное действие данного препарата, возможно, обусловлено только его иммуносупрессивными свойствами.

Таким образом, результаты исследований показали, что некоторые из использованных препаратов целесообразно применять в липосомальной форме в составе наружных средств для лечения вульгарного псориаза.

В каждую из составленных комбинаций входил пентоксифиллин как обязательный компонент с наиболее выраженным антипролиферативным эффектом. Как ни странно, в составе комбинации хорошие результаты получены с использованием этмозина, который не показал индивидуальной антипролиферативной активности в отношении культур клеток. Доказательством синергичного действия препаратов является сравнительный анализ между смесями № 2 и № 5, которые отличаются только отсутствием этмозина, но при этом № 5 подавляет пролиферацию почти в 2 раза хуже, не смотря на присутствие селенита натрия.

Анализ полученных результатов видимо позволяет сказать, что антипролиферативная  активность комбинаций липосомальных лекарственных препаратов наиболее выражена там, где не осуществлялось прямого воздействия на выработку цАМФ и следовательно, на энергетический статус достаточно изолированной клеточной системы. Так, смесь № 3 отличалась от № 1 наличием сальбутамола, что теоретически должно было усилить  антипролиферативный  эффект, однако он оказался хуже в 1,6 раза во всех группах наблюдения. Так же наличие сальбутамола в смеси № 4 при отсутствии селенита натрия ещё более ухудшило результат, что видимо, можно объяснить как отсутствием комплексного стабилизирующего действия селена на обмен белков и тканевое дыхание, так и цитостатическим эффектом данного соединения. Не исключено, что в данных условиях этот катион можно рассматривать как фактор прооксидантной системы, способствующий генерации АФК.

Результаты исследований  влияния липосомальных лекарственных препаратов и их комбинаций, проведенных с использованием клеточных культур кератиноцитов показали, что:

- культуры кератиноцитов, выращенные из поражённых и непоражённых участков кожи больных псориазом обладают высокой митотической активностью и способны долгое время пролиферировать без добавления специальных ростовых факторов;

- пролиферативная активность культур кератиноцитов, выращенных с поражённых и непоражённых участков кожи, практически не отличается друг от друга;

- самоподдержание культуры кератиноцитов в среде, лишенной фактора роста, свидетельствует о том, что одно (или несколько) биологически активных веществ, стимулирующих пролиферацию клеток, продуцируется самими кератиноцитами;

-  Са2+ не оказывает прямого антипролиферативного действия, а его терапевтическая эффективность вероятно обусловлена опосредованным влиянием через другие органы и системы (надпочечники, нервная, иммунная, сердечно-сосудистая системы и.т.д.);

- флуороурацил не проявляет прямого цитостатического эффекта к пролиферирующим кератиноцитам, поэтому применение цитостатиков при неосложненных формах псориаза, по-видимому, не оправдано, а их лечебное действие скорее всего обусловлено только иммуносупрессивными свойствами;

- наиболее ярким антипролиферативным действием обладают пентоксифиллин, пирроксан, селенит натрия, глутатион окисленный и сальбутамол (в порядке убывания), предварительно заключённые в лиосомальную форму;

- комбинации из липосомальных: пентоксифиллина, селенита натрия и пирроксана, а также из пентоксифиллина, селенита натрия и этмозина  наиболее целесообразны для использования в наружной терапии псориаза, так как наиболее эффективно подавляют пролиферацию в культурах кератиноцитов больных псориазом;

- лабораторный метод определения чувствительности кератиноцитов больного псориазом к различным препаратам и их смесям, может быть использован не только для тестирования лекарств, влияющих на эпидермис, но и для изучения пролиферативно-дифференцировочных процессов кожи с последующим созданием новых лекарственных препаратов с целью индивидуализации и оптимизации  наружной терапии.

Состояние системы свободнорадикального окисления и

антиоксидантной защиты в культурах кератиноцитов больных

псориазом

    1. 1. Состояние систем СРО и АОЗ культур до воздействия

липосомальными препаратами

Результаты представленные, в табл. 5, свидетельствуют о значительных изменениях состояния системы свободно-радикального окисления в культурах кератиноцитов, полученных и выращенных от больных псориазом. Прежде всего, отмечается резкое угнетение прооксидантной системы, о чём свидетельствуют результаты концентраций диеновых коньюгатов и малонового диальдегида по сравнению со здоровыми людьми. Эти показатели на пике пролиферации уменьшены по сравнению с нормой более, чем в 2 раза. (табл.5). При этом многие аналиты, характеризующие антиоксидантную систему в период активной пролиферации кератиноцитов, повышены, причём это касается как ферментов антиоксидантной защиты, так и субстратов. Мы считаем, что данные изменения свидетельствуют об изменении редокс-потенциала клеток в сторону восстановления и превалировании процессов биосинтеза над процессами катаболизма.

Изменения ферментов, обеспечивающих функционирование системы глутатиона, не подверглись столь значительным изменениям. (табл. 5). Наряду с ферментами системы глутатиона, активность ферментов, принимающих участие в дисмутации активных форм кислорода (АФК)  и перекиси водорода, образующихся в процессах СРО в больших количествах, изменилась 

Таблица 5

Влияние отдельных липосомальных препаратов на системы СРО и АОЗ 

культур кератиноцитов больных псориазом

Показатель

Контроль

(n 8)

До воздействия

(n 8)

После воздействия липосомальными препаратами на культуры кератиноцитов

Пентоксифиллин

(n 8)

Пирроксан

(n 8)

Селенит натрия (n8)

Сальбутамол

(n 8)

ДК (нмоль/г ткани)

68,16± 9,74

33,25±5,42*

74,25±6,48**

69,4±4,35**

52,7±5,79 **

64,2±3,49 **

МДА (нмоль/г ткани)

162,8±5,4

78,2±3,21*

136,4±3,65**

126,8±4,21**

144,5±3,58**

99,3±3,71**

ВГ (ммоль/г ткани)

3,46±0,21

11,23±1,22*

3,73±0,55**

3,58±0,34**

5,33±0,22***

8,91±0,31*

СГ (ммоль/г ткани)

10,34±0,33

34,7±2,34*

15,87±1,29* , **

18,9±2,51*, **

24,6±2,12*, **

28,3±2,81**

ГР (мкмоль/(мин·г белка)

96,12± 6,85

121±5,28 * (p<0,05)

101±5,33 **

104±5,76 **

93,4±4,65 **

118,7±5,87

ГП (ммоль/(мин·г белка)

2,34± 0,56

2,21±0,11

3,53±0,13 *, **

2,39±0,24

3,91±0,31 *, **

2,64±0,58

СОД (мкмоль/(мин·г белка)

188,8±16,1

275,4±13,3 *

233,8±12,3 **

205,7±16,9**

271±15,5 *

240,6±12,8*, **

Каталаза мкмоль/(мин·г белка)

36,72± 4,86

24,13±1,97*

47,0±4,08 *, **

35,22±2,26**

44,56±3,76 * , **

28,32±2,31*

ОАА (%)

36,72± 4,86

71,4±4,25*

41,4±3,86**

44,2±3,78 **

47,6±3,65**

67,3±4,58*

Гл-6ф-ДГ (мкмоль/(мин·г белка)

34,19± 4,22

52,7±4,13*

33,2±5,01**

30,8±4,65**

35,7±4,27  **

34,2±4,29**

*- различия достоверны по сравнению с контролем (р<0,001);

** - различия достоверны с результатами до воздействия (p<0,05)

более значительно. Уровень общей  антиокислительной активности (ОАА) кератиноцитов в период активной пролиферации, как суммарный показатель, оказался ожидаемо высоким. Он превышал контрольную норму практически в 2 раза (р <0,05). Особое внимание обращает на себя поведение глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы. В наших исследованиях его активность увеличена на 54 % по сравнению с кожей  здоровых людей. Полученные данные, прежде всего, свидетельствуют о высокой метаболической активности пролиферирующих кератиноцитов, что подтверждается не только высокой активностью Гл-6ф-ДГ, участвующей в прямом окислении глюкозы, но и в целом относительно спокойным поведением ферментов антиокислительной защиты. На наш взгляд, такое поведение системы свободнорадикального окисления может быть обусловлено изменённым редокс-потенциалом клеток, смещенным в сторону восстановления и поддерживающим высокую белковосинтетическую функцию кератиноцитов в период активной пролиферации.

2. Результаты влияния отдельных липосомальных препаратов на состояние

систем СРО и АОЗ культур кератиноцитов больных псориазом

После воздействия отдельных липосомальных форм на активно пролиферирующие клетки отмечена в целом обратная зависимость изменений  системы СРО и АОЗ (табл.5).  Аналогично концентрации ДК, достоверно значимо изменялось содержание малонового диальдегида – одного их конечных метаболитов ПОЛ. Однако наиболее высокие концентрации МДА нами были получены в культурах после внесения липосомального селенита натрия. Уровень МДА в 1,8 раза превысил его концентрации над тем, что был в клетках в период активной пролиферации. После воздействия пентоксифиллина  уровень МДА увеличился в 1,7 раза,  пирроксана в 1,62, а сальбутамола только в 1,26 раза, во всех случаях - (р<0,001). Ни в одном из  наблюдений уровень данного показателя не достиг значений  группы  контроля.

Метаболиты и ряд ферментов антиоксидантной системы, напротив, имели обратную динамику. Так, при внесении в культуры пентоксифиллина и пирроксана концентрации восстановленного глутатиона практически нормализовались до значений 3,73±0,55 и 3,58±0,34 ммоль/г ткани соответственно и не отличались от уровня этого метаболита в здоровой коже, при этом оказавшись ниже концентраций в активно пролиферирующих кератиноцитах в 3 раза (р<0,001).

Аналогичным образом претерпела изменения концентрация сульфгидрильных групп в исследуемых культурах. В кератиноцитах под действием пентоксифиллина она уменьшилась с 34,7±2,34 до 15,87±1,29 ммоль/г ткани, т.е. в 2,2 раза. Следует также отметить, что  ни в одном из наблюдений концентрация СГ не снизилась до значений контрольной группы, превышая её в наилучшем случае на 35 %.

Глутатионредуктаза показала наибольшее снижение активности по сравнению с периодом активной пролиферации после применения селенита натрия на 33 %, что соответствовало значениям контрольной группы. Напротив, поведение селен-зависимой глутатионпероксидазы было несколько иным. При внесении в среду пентоксифиллина активность фермента резко  возросла на 60 % по сравнению с периодом активной пролиферации и на 50 % по отношению к значениям контрольной группы. Под действием селенита натрия активность фермента претерпела наиболее значимые изменения. Увеличилась на 77 % по отношению к периоду пролиферации и на 66 % превысила значения группы контроля.

Активность супероксиддисмутазы наиболее выражено снижалась после применения пирроксана и пентоксифиллина в культуре  кератиноцитов – на 25,3%  и 15 % соответственно. Напротив, активность каталазы в культурах клеток имела  выраженные тенденции к росту. Внесение липосомальных пентоксифиллина и селенита натрия привело к повышению активности этого гемохромопротеина в 2 и 1,8 раза по сравнению со значениями в период пролиферации и в 1,3 и 1,2 раза по сравнению с культурами, использованными в качестве контрольных соответственно (табл.5). 

Общая тенденция в поведении антиокислительной клеточной системы наиболее отчётливо прослеживается в изменениях показателя общей антиокислительной активности. В среднем, уменьшение ОАА по сравнению с периодом наивысшей пролиферативной активности составило 1,7 раза.

Все использованные липосомальные препараты вызвали значительное подавление активности  Гл-6ф-ДГ. Так, после введения в культуру активно пролиферирующих клеток пирроксана ее активность снизилась наиболее значительно и составила 58 % от значений контроля. Натрия селенит, сальбутамол и пентоксифилин подавляли активность на 33 %, 35 % и 37 % соответственно. Во всех случаях активность основного фермента пентозофосфатного цикла не отличалась от значений контрольной группы (табл. 5).

Изменения, отмеченные нами в культурах кератиноцитов после применения липосомальных препаратов, обладающих регуляторной активностью на процессы пролиферации и метаболизма, трудно поддаются однозначной трактовке, несмотря на ряд отчётливо прослеживаемых тенденций. Отмечено, что наиболее выраженные изменения, вызывал пентоксифиллин. Неселективный -адреноблокатор – пирроксан, отстал от него крайне незначительно. На наш взгляд, это можно объяснить единой концепцией конечного влияния на регуляторные системы клеток через системы вторичных посредников. И тот, и другой препарат являются цАМФ и АТФ сберегающими. Только пентоксифиллин делает это, блокируя фосфодиэстеразы, а пирроксан – прикрывая постсинаптические рецепторы на мембранах клеток. Напротив,  сальбутамол – -адреномиметик, активирует аделнилатциклазу с последующим синтезом цАМФ из АТФ, что должно приводить к ожидаемым антипролиферативным эффектам, что мы и наблюдали в ряде случаев. Однако из всех наблюдений, изменения, происходящие под влиянием этого соединения, оказались наименее выраженными. Под влиянием сальбутамола значимо увеличивалась концентрация ДК и МДА, а также снижалась активность СОД.

Также отмечено, что полученные изменения подтвердили  общую закономерность в поведении системы СРО при псориазе, которая ранее упоминалась в работах отдельных авторов [Хышиктуев Б.С. и соавт., 2000; Шилов В.Н. и соавт., 2000; Шинин В.В. и соавт., 2002]. Активно пролиферирующие псориатические кератиноциты обладают высокой степенью антиокислительной активности, о чём свидетельствует как низкая концентрация продуктов ПОЛ (ДК, МДА), так и высокий уровень метаболитов и активность некоторых ферментов антиоксидантной защиты. Применяемые препараты оказывали выраженное влияние на пролиферацию, а, следовательно, и на дифференцировку клеток кожи, при этом изменялись показатели, характеризующие поведение про-антиоксидантной систем, а значит и окислительно-восстановительного статуса и энергетического метаболизма клеток. Сейчас, мы можем с уверенностью сказать, что полученные и наблюдаемые нами изменения предшествовали снижению пролиферации и уменьшению клеточного пула в культуре. Следовательно, вначале метаболизм, а затем морфологические проявления.

Полученные результаты позволяют сказать, что подавление пролиферации вводимыми  в культуральную среду липосомальными препаратами, сопровождается активацией процессов свободнорадикального окисления, о чём свидетельствуют увеличенные концентрации ДК, МДА, падение значений ОАА. 

В период активной пролиферации кератиноциты содержали высокий уровень ВГ. На наш взгляд это вполне логично. Мы знаем, что за счет превращения восстановленной формы глутатиона в окисленную эта система  принимает ведущее участие в поддержании тиол-дисульфидного равновесия в тканях [Кулинский В.И.,1990], необходимого для осуществления таких процессов жизнедеятельности клеток, как работа мембранных структур, деятельность цитоскелета, клеточное деление, регуляция активности гормонов пептидной природы [Cotgreave I.A. et al., 1998; Ghibelli L. Et al., 1999; Filomeni G., 2002]. В нашем случае все перечисленное необходимо для ускоренной пролиферации и успешного клеточного деления, для обеспечения активной белковосинтетической функции, что и отмечается при псориазе [Беляев Г.М. и соавт., 2005; Goldberg N., 1974; Roenigk H.H. et al., 1999]. Следовательно, высокий уровень ВГ может свидетельствовать о подержании высокого восстановительного потенциала, что дополнительно подтверждается высокой концентрацией сульфгидрильных групп, отмеченной во всех культурах на пике пролиферации и уменьшением содержания этого показателя параллельно со снижением концентраций ВГ при внесении в культуральную среду липосомальных препаратов. При падении концентраций глутатиона клетка меняет свой восстановленный статус на окисленный, что характеризуется интенсификацией ПОЛ.

Снижение концентрации ВГ в клетках связано с работой мембранной -глутамилтранспептидазы (-ГТП) и цАМФ зависимых протеинкиназных механизмов. Рост содержания цАМФ в тканях вызывает снижение активности -ГТП и повышение внутриклеточной концентрации ВГ [Корнеев А.А. и соавт., 1993]. Следовательно, в нашем случае при действии пентоксифиллина и сальбутамола концентрация ВГ должна расти, а она почти во всех случаях достоверно падает, что объяснить на первый взгляд достаточно трудно. Можно предположить, что количество -адренергических рецепторов на псориатических кератиноцитах  генетически снижено, что косвенно подтверждается их слабой реакцией на сальбутамол. В случае действия пентоксифиллина на культуры клеток можно сказать, что действие  цАМФ-зависимых протеинкиназных механизмов на регуляцию концентрации ВГ неоднозначно, и видимо не только от них зависит изменение уровня этого трипептида в клетках. Об этом, например, свидетельствуют данные, полученные при действии селенита натрия и пирроксана, которые не имеют прямого отношения к регуляции цАМФ. Пролиферирующий кератиноцит нуждается в аминокислотах, возможно, этим и объясняется достоверно высокий уровень этого метаболита даже в условиях подавления пролиферативной активности.

Se-зависимая глутатионпероксидаза - фермент, который в ходе выполнения своих функций осуществляет обратимое окисление восстановленной формы глутатиона в окисленный (ОГ), а также принимает участие в антиоксидантной защите и регуляции тиол-дисульфидного равновесия в тканях. Активация фермента осуществляется цАМФ-зависимой протеинкиназой [Колесниченко Л.С. и соавт.,1987;1989;  Isaacs J.et al., 1977].  Наиболее выраженное повышение активности фермента при добавлении в среду натрия селенита вероятно связано с его активирующим влиянием на этот фермент. Известно, что дефицит селена приводит к снижению активности ГП более чем в 65 раз [Кулинский В.И. и соавт., 1993]. Однако существуют данные, свидетельствующие о том, что неорганический селен не включается в состав данного фермента [Flohe L., 1978]. Избыток, как и недостаток селена, подавляет активность этого фермента. Повышение активности ГП после воздействия пентоксифиллина отчётливо свидетельствует об увеличении уровня цАМФ в клетке, коррелирует с падением концентрации ВГ и повышением антипролиферативного потенциала. Рост активности ГП при интенсификации ПОЛ является компенсаторным и может быть связан с необходимостью утилизации различных видов перекисей, которые образуются в избытке в этот период. Кроме того, активация ПОЛ ещё не говорит о повышении концентрации АФК и самого кислорода, т.к. известно, что снижение концентрации кислорода также как и его избыток ведут активизации процессов СРО [Владимиров Ю.А.  и соавт., 1972; Зозуля Ю.А. и соавт., 2000].

Глутатионредуктаза и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа являются ферментами, поддерживающими высокий уровень глутатиона в клетке. В наших наблюдениях ГР и Гл-6ф-ДГ проявляют свою активность на пике пролиферации, а затем теряют её под воздействием вводимых в среду веществ, причём ГР теряет активность в большей степени.

Активность ГР регулируется цАМФ-зависимым механизмом [Кулинский В.И. и соавт., 1990; Isaacs J.et al., 1977] и зависит также от состояния ее SH-групп, поэтому при физиологических концентрациях ВГ оказывает ингибирующее влияние на фермент [Latta K. et al., 1984; Mannervik B., 1987; Chang S.W. et al., 1989]. Следовательно, при низких концентрациях ВГ активность фермента должна компенсаторно расти, а в наших наблюдениях при внесении липосомальных пирроксана, сальбутмола и натрия селенита она падает.

Мы знаем, что скорость НАДФ·Н-зависимого восстановления окисленного глутатиона в ВГ под действием глутатион-редуктазы (ГР) намного превосходит возможности его синтеза de novo в тканях [Кулинский В.И.  и соавт., 1990; De Almeida A., 1989]. Необходимым условием для осуществления глутатионредуктазной реакции является наличие в тканях достаточного уровня НАДФ·Н, так как его расходование при этом в 6 раз выше, чем на биосинтез жирных кислот и обеспечение процессов микросомального окисления [Уайт А., 1981]. Основным источником восстановленной формы НАДФ является ключевая реакция пентозофосфатного пути метаболизма углеводов - глюкозо-6-фосфатдегидрогеназная, которая и лимитирует возможности редокс-циклирования глутатиона [Тиунов Л.А., 1988; Tate S.S. et al.,1985]. В наших исследованиях активность Гл-6ф-ДГ достоверно снижена под влиянием всех вводимых препаратов, что может свидетельствовать об ингибировании механизма восстановления глутатиона вследствие недостаточного количества восстановленного НАДФ. Этим можно объяснить низкий уровень ВГ во всех группах наблюдения после воздействия липосомальных лекарственных препаратов. С другой стороны, активность данного энзима может  быть подавлена возросшим прооксидантным статусом и окислением сульфгидрильных групп ГР. Это подтверждается и данными, свидетельствующими о том, что оксидативное повреждение тканей Н2О2 развивается при дефиците глутатиона и ГП [Flohe L. 1982; Simmons Th.W., 1988].

Доказано, что активность основного фермента антиоксидантной защиты – супероксиддисмутазы (СОД), прогрессивно уменьшается с увеличением степени тяжести повреждения клеток и развития гипоксии.  Возможно,  угнетение активности СОД развивается по механизму обратной связи - ингибирование избытком субстрата, являющегося, в свою очередь, продуктом ксантиноксидазной и пероксидазной реакций. Таким субстратом являются  супероксидный анион-радикал и перекись водорода. В нашем случае  возрастание их концентраций в системе можно предположить с большой долей вероятности, так как на фоне увеличения активности ГП, каталазы  и роста концентраций продуктов ПОЛ накопление перекисей и АФК вполне очевидно. Рост активности каталазы, вероятно является временным и имеет в основном компенсаторный характер в связи с увеличением концентраций Н2О2 во внутриклеточной среде.

Мы считаем, что полученные нами изменения в системе СРО и глутатиона во многом обусловлены тем, что кератиноцит с приостановленной пролиферативной активностью готовится к вступлению в апоптоз, а значит к последующей гибели. Кроме того, нельзя не учесть, что  кератиноциты, живущие в культуре, к которой экстраполяция процессов, хорошо описанных для тканей внутренних органов, изъятых у животных в ходе эксперимента, не всегда в полной мере подходит.

3. Результаты влияния комбинаций липосомальных препаратов на про- и

антиоксидантную активность культур кератиноцитов

Для оценки состояния системы СРО в культурах кератиноцитов мы провели определение её параметров после воздействия комбинациями липосомальных препаратов, состоящих из пентоксифиллина, пирроксана, натрия селенита (смесь № 1) – как наиболее активной и пентоксифиллина и натрия селенита  (смесь № 5) – как наименее подавляющей пролиферацию. Таким образом, было создано 2 группы клеточных культур, в одну из которых добавлялась липосомальная смесь № 1, в другую – смесь № 5. Результаты исследований представлены в табл. 6.

Таблица 6

Влияние комбинаций липосомальных препаратов на системы СРО и АОЗ

культур кератиноцитов больных псориазом

Показатель

Контроль

До воздействия

(n 8)

После воздействия липосомальными препаратами на культуру кератиноцитов

Пентоксифиллин Пирроксан Селенит натрия

№1 (n 8)

Пентоксифиллин

Селенит натрия

№5 (n 8)

ДК (нмоль/г ткани)

68,16± 9,74

27,65±5,79*

84,28±3,49**

79,16±4,19**

МДА (нмоль/г ткани)

162,8±5,4

62,16±5,33*

195,52±6,25**

188,44±4,87**

ВГ (моль/г ткани)

3,46±0,21

15,28±1,87*

2,87±0,24**

2,73±0,92**

СГ (ммоль/г ткани)

10,34±0,33

22,76±1,36*

6,33±1,86**

7,24±0,87**

ГР (мкмоль/(мин·г белка)

96,12± 6,85

111,67±5,72

84,76±4,36**

89,24±4,61**

ГП (ммоль/(мин·г белка)

2,34± 0,56

2,13±0,12

3,47±0,22*

**

(p<0,05)

3,21±0,31**

СОД (мкмоль/(мин·г белка)

188,8±16,1

296,43±19,3*

208,18±15,3**

237,53±13,5**

Каталаза мкмоль/(мин·г белка)

36,72± 4,86

19,27±1,97* (p<0,05)

44,0±4,08

**

38,12±3,16**

ОАА  (%)

36,72± 4,86

73,45±4,16*

33,29±3,87**

41,25±5,19**

Гл-6ф-ДГ (мкмоль/(мин·г белка)

34,19± 4,22

61,76±4,74*

24,72±2,95**

27,82±4,65**

*- различия достоверны по сравнению с контролем (р<0.001);

** - различия достоверны с результатами до воздействия (p<0,05)

  Сопоставляя данные, полученные в обеих группах наблюдений с отдельными липосомальными препаратами и их комбинациями, хочется отметить единую тенденцию в поведении системы антирадикальной защиты и ПОЛ в их изменениях, при этом по многим показателям изменения, полученные при действии смесей препаратов, более значительны.

В первую очередь это проявляется в активации свободно-радикальных процессов по результатам ДК и МДА, которые значительно превалируют под

влиянием лекарственных комбинаций, чем отдельных препаратов.

Также более значимым было падение концентраций ВГ и сульфгидрильных групп после применения  липосомальных смесей. Динамика изменений остальных показателей как после применения смесей, так и отдельных препаратов различий не имела.

В целом следует также отметить, что изменения, происходившие в системе свободнорадикального окиления и АОЗ кератиноцитов, оказались более значимыми под влиянием липосомальных комбинаций и особенно  № 1, что совершенно чётко коррелирует с данными, полученными при радиометрическом измерении пролиферативной активности, и клиническими данными, полученными при применении у больных препарата Липсор, изготовленного на базе именно этой антипролиферативной комбинации как наиболее эффективной.

Так как полученные результаты достаточно трудно поддаются трактовке и метаболические изменения, под влиянием липосомальных препаратов и их комбинаций  не укладываются в цепь стандартных  и хорошо известных биохимическиих превращений, способных пояснить механизмы поведения систем СРО и АОЗ. Мы сделали попытку подойти к объяснению полученных результатов с иных позиций.

Одной из важнейших составляющих псориаза как патологического процесса, является подавление дифференцировки кератиноцитов. При этом клетки сохраняют  способность дифференцироваться, однако это требует дополнительного воздействия, которым может быть и внешний фактор в виде средств терапии в их числе и те, которые усиливают окислительное давление [Filomeni G. et al., 2002; 2005].  Иными словами, кератиноциты при псориазе располагают комплексом регуляторных и метаболических возможностей для дифференцировки, однако в определенных условиях не способны или ограниченно способны к их инициации. В этой связи закономерным является вопрос о содержании молекулярных механизмов  ингибирования дифференцировки кератиноцитов и возможности воздействия на них.

Окислительно-восстановительное состояние клетки – баланс между эквивалентными уровнями окисления и восстановления. Определяется суммарным соотношением концентраций восстанавливающих и окисляющих агентов.  При этом система главного  редокс-буфера – глутатиона моделирует ответ клетки на окислительно-восстановительные изменения, вызванные внешними или внутриклеточными стимулами [Buuke T.M. et al., 1994; Wang X. et al., 1998]. Внутриклеточное окислительно-восстановительное состояние определено вкладом различных окислительно-восстановительных пар (редокс-пар). Каждая пара способна обменивать электроны таким образом, что может представлять необходимые в каждом конкретном случае кофакторы в окислительно-восстановительных ферментативных реакциях. Относительное количество восстановленной и окисленной формы каждой пары может определять изменения в клеточном окислительно-восстановительном состоянии, смещая его как в одну, так и в другую сторону [Filomeni G. et al., 2002]. В клетках, включая и кератиноциты  существуют три самых важных окислительно-восстановительные системы: никотинамидадениндинуклеотидфосфатная (НАДФН/НАДФ+), тиоредоксиновая (TRXred/TRXox) и глутатиона (ВГ/ОГ). Среди них, последняя является самой важной, так как концентрация глутатиона приблизительно в 500 – 1000 раз выше, чем TRX и НАДФН [Кулинский В.И. и соавт., 1990]. Таким образом, изменения в ВГ/ОГ буфере глутатиона непосредственно отражают внутриклеточное окислительно-восстановительное состояние и его изменения. 

  Одно из возможных объяснений схожего действия различных по химической природе и фармакологической активности соединений, содержащих азот, окси- и гидрокси- группы,  может быть связано с их способностью образовывать комплексные координационные соединения (КС) с переходными биометаллами (железо, медь и некоторые др.), обладающими способностью в ультра малых количествах в присутствии кислорода и его производных или активных форм азота катализировать окислительные реакции в физиологических условиях [Басоло Ф., 1971; Костромина Н.А. и соавт., 1990]. В этом аспекте объяснимы эффекты селенита натрия, который способен координироваться с эндогенными азот- и серосодержащими органическими молекулами в комплексное соединение с каталитическим действием. Лигандом для селена может выступать молекула ВГ, комплексные соединения которой катализируют окислительно-восстановительные процессы.

Не исключено, что каталитическая активность координационных соединений приводила к снижению уровня восстановительных эквивалентов в цитозоле и, соответственно их экспорта в микроокружение клетки.  Наличием подобного действия препаратов в составе липосом можно объяснить характер изменения прооксидантных процессов, а именно активацию  СРО, приводящую в итоге к увеличению концентрации ДК и МДА.  Мягкое окислительное воздействие на сульфгидрильные группы изучаемых внутриклеточных ферментов также объясняет  изменение их активности.

Увеличение окислительной активности в цитозоле приводит к снижению уровня внутриклеточной концентрации ВГ. Так, в период активной пролиферации он достаточно высок. Величина снижения  концентрации ВГ  при каталитическом действии ультра малых концентраций координационных соединений лекарственных препаратов, введенных в  составе липосом, вероятно определяется стабильностью образующихся (КС). Так, пентоксифиллин, способный образовывать более устойчивые КС, будет обладать более сильным действием на уровень ВГ. Пирроксан в совокупности с селенитом натрия значительно усиливают его действие.  Особенности влияний селенита натрия обусловлены молекулярной массой координируемых молекул, возможностью их перемещения в различные клеточные компартменты, его возможным непосредственным воздействием на активность селен-зависимых ферментов.

ГР и Гл-6ф-ДГ являются ферментами, поддерживающими высокий уровень глутатиона в клетке. Установлено, что ГР и Гл-6ф-ДГ проявляют свою активность на пике пролиферации, а затем теряют её под воздействием вводимых в среду веществ, что может быть объяснено окислительной модификацией сульфгидрильных групп с участием КС, образуемых вводимыми лекарственными препаратами.

При воздействии окислительных стимулов отношение ВГ/ОГ имеет тенденцию к уменьшению, однако, в ответ на окислительное напряжение, глутатион поддерживает окислительно-восстановительное состояние клетки через различные механизмы. Так, активность ГР должна  увеличиваться, или избыток ОГ, сформированный в ответ на  атаку окислительных эквивалентов, должен быть вытеснен во внеклеточную среду. В наших исследованиях отмечено падение активности ГР, что вероятно связано с механизмами ингибирования этого энзима, каким образом это происходит пока не ясно. В тех случаях, когда окислительное напряжение становится длительным и массивным, а клеточные системы более не способны противодействовать генетически установленным для них дозам АФК, вероятно, как в случае воздействия пентоксифиллином и пирроксаном, количество  ВГ уменьшается, что приводит к остановке пролиферации и последующему запуску  апоптоза клетки.  Уменьшение содержания ВГ считается доказанным звеном запуска митохондриально-зависимымых апоптотических сигнальных путей [Ghibelli L. et al., 1999].

Химическое и физическое воздействие (УФО, лекарственные препараты) или взаимодействие лиганд/рецептор – лишь некоторые из процессов, в которых окислительное напряжение должно быть фактором трансдукции, приводящим к апоптозу, пролиферации, дифференцировке и регуляции клеточного цикла. Доказано,  что АФК являются  посредниками в  передаче клеточных сигналов. Ряд  исследователей выдвигали гипотезу относительно роли  окислительно-восстановительного состояния окружающей среды в регуляции многих сигнальных путей [Buuke T.M. et al., 1994; Schulze-Osthoff K. et al., 1998].

Окисление,  приводящее к истощению ВГ, вызывает формирование межмолекулярных дисульфидов, что приводит к конформационным изменениям, увеличивающим сродство и специфику глутаматного  участка ОГ к различным лигандам. Такие изменения способствуют увеличению чувствительности рецепторного аппарата клетки, который может быть заблокирован при излишней восстановленности как наружной, так и внутриклеточной среды псориатичесого кератиноцита [282, 316]. Этим можно объяснить эффективность действия препаратов и методов лечения, которые смещают редокс-потенциал в сторону окисления.

Активные молекулы, способные изменять  окислительно-восстановительный фон,  непосредственно изменяют внутриклеточную среду, входя в клетку и действуя на функциональные белки. Известно, что взаимодействие лиганд/рецептор вызывает  клеточный ответ по механизму, который может произвести активацию нескольких процессов без прямой коммуникации с внутренней частью клетки [Filomeni G.et al., 2002]. Следовательно, тиол/дисульфидный обмен может быть представлен как новый способ преобразования  и передачи сигналов из внеклеточной среды до внутриклеточных процессов и отдельных реакций. С этой точки зрения тиол-содержащие молекулы могут быть сигнальными, когда акт передачи происходит на определенных трансмембранных белках. С другой стороны, богатые цистеином мембранные белки могут представлять предполагаемые рецепторы, особенно если они вовлечены в активацию некоторых известных путей трансдукции сигнала [Cotgreave I.A.et al., 1998]. Известно, что десенситизация поверхностно-клеточных рецепторов,  в числе прочих причин,  может быть обусловлена избыточной восстановленностью среды, формируемой за счет  экспорта восстановительных эквивалентов из клеток  в свое  микроокружение [Filomeni G.et al., 2002]. С участием  этих соединений  осуществляется процесс восстановления дисульфидных связей целого ряда поверхностно-клеточных рецепторов. Рецептор при отсутствии дисульфидных сшивок приобретает функционально неактивную конформацию, что означает неспособность клеток физиологически адекватно отвечать на регуляторные внеклеточные воздействия [Schulze-Osthoff K. et al., 1998].

Таким образом, обобщенные  данные могут предложить новый подход в объяснении  действия внеклеточного окислительно-восстановительного фона и передаче клетке различных сигналов, влияющих, в том числе, на её цикл. Внеклеточный окислительно-восстановительный фон ведёт к возникновению перекрестных связей с клеточными рецепторными системами и вызывает ответ по механизмам, которые не являются основными, но используют прямое действие окислительно-восстановительных эквивалентов во внутриклеточных процессах. В частности, внеклеточные окислительно-восстановительные сигналы могут действовать через системы вторичных посредников, которые в свою очередь могут быть представлены или трансмембранными богатыми цистеином рецепторами или специализированными низкомолекулярными веществами.

Результаты, полученные  при изучении процессов СРО и АОЗ в культурах кератиноцитов до и после воздействия различных молекулярных комбинаций свидетельствуют о том, что:

-  состотояние гиперпролиферации кератиноцитов сопровождается резким угнетением процессов ПОЛ и высоким уровнем антиокислительной активности клеток, о чем свидетельствует  низкая концентрация продуктов СРО: ДК и МДА, высокий уровень восстановленного глутатиона и сульфгидрильных групп, а также уровень активности ферментов, участвующих в регуляции антиокислительной защиты;

- угнетение клеточной пролиферации характеризуется резким возрастанием прооксидантного статуса и угнетением АОЗ культур эпидермальных кератиноцитов;

- процессы свободнорадикального окисления и антиоксидантной защиты принимают самое непосредственное участие в регуляции пролиферативно-дифференцировочной активности клеток кожи при псориазе таким образом, что увеличение интенсивности СРО ведёт к остановке пролиферации, а высокий уровень АОЗ ее поддерживает.

Клиническое исследование

1. Результаты изучения клинической эффективности липосомального крема

Липсор на течение вульгарного псориаза в различных группах больных

в стационарных условиях.

На основе выбранной комбинации в наибольшей степени подавляющей пролиферацию из пентоксифиллина, пирроксана и селенита натрия  был создан липосомальный крем для наружной терапии псориаза, получивший авторское название Липсор.

Результаты изучения препарата в стационарных условиях показали, что полная клиническая ремиссия была достигнута у 388 (67%) больных, значительное улучшение у 116 (20%),  незначительное улучшение у 40 (7%) и без изменений у 35 (6%) пациентов.  Изменение индекса  PASI в сторону улучшения отмечалось у 502 стационарных больных (86,6%): в 4,5 раза – у больных с ограниченным псориазом и  более чем в 2,6 раза - у больных с распространёнными формами болезни  (2 раза – у больных с распространённым псориазом; в 6 раз – у больных с  экссудативным псориазом;  в 3,5 раза - у больных  с диффузным псориазом) (рис.9). Отсутствие эффекта отмечалось у нескольких больных, страдающих, как правило, диффузным псориазом с торпидным течением,  незначительное улучшение от применения крема отмечалось у больных с ограниченным экссудативным псориазом, с длительным сроком лечения  - от 10 и более лет (табл. 7).

Таблица 7

Динамика значений индекса PASI у стационарных больных

Форма заболевания

Значения индекса PASI

1 неделя

2 недея

3 неделя

4 неделя

Распространённый

(n = 335)

34,0±8,2

34,0±6,3

18,3±3,2*

12,8±5,2*

Ограниченный

(n = 245)

19,6±6,3

18,2±4,2

10,2±3,1

4,34±3,1*

*-различия достоверны по сравнению с началом наблюдения (р<0,05)

Таким образом, результаты проведённых исследований показали, что данное наружное средство может эффективно и безопасно применяться для лечения вульгарного псориаза, о чём свидетельствует высокий суммарный процент клинической ремиссии и значительного улучшения  в исследуемой группе больных (87%).

За время наблюдения у десяти больных на фоне применения Липсора появлялись свежие псориатические высыпания, которые при детальном анализе нами трактовались как обострения псориатического процесса, связанные с воздействиями, обусловленными другими причинами.

2. Результаты изучения клинической эффективности липосомального крема  Липсор на течение вульгарного псориаза у  больных в  амбулаторных условиях

Результаты, полученные согласно данных кожно-венерологических учреждений г. Санкт - Петербурга были следующими: полное разрешение процесса наблюдалось у 405 (45%) больных, значительное клиническое улучшение у 243 (27%), незначительное улучшение было отмечено у 162 (18 %), а без заметных изменений у 90 (10%) пациентов.

У лиц, проходивших амбулаторное лечение в ВМедА, результаты несколько отличались от городских. Так полное разрешение процесса наблюдалось у 315 (52%) больных, значительное клиническое улучшение у 153 (30%), незначительное улучшение было отмечено у 73 (14 %), а без заметных изменений у 21 (4%) больного.

Таким образом, высокая эффективность препарата наблюдалась в 72% случаев наблюдений в КВД и 82% случаев наблюдений в ВМедА. Слабая эффективность и отсутствие положительной динамики в 28%  и 18% случаев соответственно.

Анализ показал, что  в большинстве случаев недостаточная эффективность действия крема была связана с нерегулярным применением,  отсутствием общей терапии в остром периоде псориаза,  предшествующем длительным лечением наружными кортикостероидными средствами, а также  личностными особенности пациента, требующими от врача детальных разъяснений о правильном  и иногда настойчивом применении препарата.  Нельзя также не учитывать низкую информативность  врачей-специалистов лечебных учреждений, которым недостаточно своевременно доводились как способ применения, так и механизм действия препарата.

Следует также отметить, что в число лиц, у которых действие крема оказалось недостаточно эффективным входили больные, как правило, с ограниченным экссудативным  и  с диффузным псориазом. Динамика течения  болезни у этих больных при применении комплексного лечения неоднозначна и изменения индекса PASI,  при применении крема «Липсор»  в качестве наружного средства (как и других современных препаратов)  не всегда давали достоверно значимые различия (табл. 8).

  Таблица 8

Динамика значений индекса PASI у амбулаторных больных

Форма заболевания

Значения индекса PASI

1 неделя

2 неделя

3 неделя

4 неделя

Распространённый

(n = 519)

24,2±3,2

22,8+2,7

15,2+3,2*

10,3±5,2*

Ограниченный

(n = 901)

10,2±2,1

10,2±3,2

6,2±2,1

2,3±1,8*

* различия достоверны по сравнению с началом наблюдения (р < 0,05)

Изменение индекса  PASI в сторону улучшения отмечалось более чем у 90%  амбулаторных больных:  в 2 раза – у больных с распространённым псориазом;  в 4,4 раза – у больных с ограниченным псориазом.

При этом, достоверные изменения в сторону улучшения отмечены начиная с 3 недели у больных с распространённым псориазом и с 4-ой при ограниченных формах заболевания (табл. 8).

3. Сравнительная характеристика динамики разрешения псориатических высыпаний у больных, получавших различные препараты для наружной терапии  вульгарного псориаза.

Под нашим наблюдением находились 260 больных с вульгарным псориазом, которым в качества наружной терапии назначались наиболее эффективные  препараты, наиболее часто используемые в клинике: «Элоком С» - 69 больных, «Дайвонекс» – 120, «Скин-Кап» - 71 человек.  Все пациенты получали  амбулаторное лечение.  Назначение  того или иного препарата проводилось с учётом анамнестических данных.

По форме заболевания больные  распределились следующим образом:  с распространённым псориазом – 38, с ограниченным - 175,  с диффузным  - 47 пациентов.  В ходе наблюдения пациенты с распространенной и диффузной формами вульгарного псориаза были объединены в одну группу, так как динамика течения болезни и разрешения сыпи в этих группах достоверных отличий не имела.

Анализ полученных результатов показал, что все средства для наружной терапии псориаза, использующиеся наиболее часто в клинике, достаточно эффективны, однако,  как при распространённых формах  так и при ограниченной форме болезни наиболее эффективными являются «Элоком С» и Липсор. Так у больных с ограниченным псориазом при применении «Элокома С» индекс  PASI  резко и достоверно снижался на 3-ей неделе наблюдения в 2,5 раза, в период 4-ой недели составлял всего лишь 24% от исходного, а к концу 5-ой недели приближался к нулю. Похожая динамика  была также характерна и для «Липсора». На 3-ей неделе наблюдения показатели были ниже исходных уже 2,17 раза и к концу 4-ой недели  индекс PASI составлял всего лишь 20% от исходного, а к концу 5-ой  был почти таким же низким как и у пациентов получавших «Элоком С». При применении препаратов «Дайвонекс» и «Скин-кап» отмечалась  более вялая динамика в разрешении сыпи. Так, достоверное уменьшение показателей в группах больных, получавших данные средства, отмечается  только на  4-ой неделе наблюдения в 1,8 и 2,2 раза соответственно. А окончательное снижение показателей индекса PASI было зафиксировано лишь к концу 6-ой недели применения препаратов (табл. 9).  При этом нельзя не  отметить, что достоверные отличия  в  динамике разрешения высыпаний  во всех группах наблюдений достаточно от

четливо начинают проявляться  в течение 3-ей, начале  4-ой недели наблюдения, что свидетельствует о высокой терапевтической эффективности всех препаратов (табл.9).  Лечение диффузных форм псориаза  характеризовалось более торпидным течением, о чём свидетельствует более медленные изменения индекса PASI, отмеченные практически во всех группах. Однако тенденции в скорости

Таблица 9

Динамика изменений индекса PASI у больных псориазом при применении различных препаратов для наружной терапии

Форма

Препарат

Время наблюдения

Поступление

1 неделя

2 неделя

3 неделя

4 неделя

5 неделя

6 неделя

8 неделя

9 неделя

Расп-ространённый

(n=85)

Элоком С (n= 19)

24,5±3,1

23,8±3,2

20,9±3,3

19,3±2,9

12,2±2,7*

6,4±1,8*

**

3,2±1,3*

2,4±1,1*

0,18±0,04 *, **

Дайвонекс (n=24)

24,5±2,9

24,2±3,2

23,5±2,7

20,9±3,2

18,6±5,2

11,8±2,3*

5,4±1,5*

3,8±0,8*

2,2±0,8*

Скин-кап (n=42)

24,5±2,6

24,2±3,2

23,5±3,9

20,6±4,1

18,0±4,6

11,6±2,4*

5,2±1,6*

3,1±1,4*

1,5±0,9*

Липсор

24,5±3,2

23,5±3,2

19,3±3,1

11,3±2,7 **

6,2±2,3*

**

3,3±1,1*

**

1,74±0,7*, **

0,22±

0,07 *,**

-

Огра-ниченный

(n=175)

Элоком С (n=50)

11,3±2,9

11,3±2,5

10,13±2,1

4,5±1,9*

2,7±1,1 *

0,13±

0,02 *,**

-

Дайвонекс (n=96)

11,3±3,7

11,2±3,1

10,6±2,3

8,2±3,1

6,1±2,4

2,8±1,1*

0,11±

0,05*

-

Скин-кап (n=29)

12,0±3,2

11,7±2,8

10,5±2,6

7,8±2,8

5,4±2,3*

2,4±1,3*

0,17±

0,04*

-

Липсор

11,3±3,5

10,2±2,1

10,2±3,2

5,2±2,1*

2,3±1,8*

0,21±0,04*,**

-

*- различия достоверны по сравнению с началом наблюдения (р<0,05);

**- различия достоверны в группе больных, получавших разные препараты в один и тот-же период наблюдения (р<0,05)

разрешения сыпи, уменьшении шелушения, отёка эпидермиса и улучшении общего состояния пациентов в целом совпадают с той картиной, которая отмечалась у больных с ограниченными формами заболевания. Так достоверные уменьшения индекса PASI  отмечены у пациентов применявших «Элоком С» в течение 4-ой недели лечения в 2 раза, при этом у больных использовавших Липсор, интенсивное разрешение сыпи начиналось немного ранее и уже на 3-ей неделе PASI был меньше исходного в 2,1 раза. В конце первого месяца наблюдения, у этих больных  индекс РASI  был достоверно ниже чем в других группах в этот же период. В течение  последующего месяца скорость разрешения высыпаний в группах «Элокома С» и Липсора была практически одинаковой, но процесс полного разрешения сыпи завершился у больных, получавших Липсор неделей раньше, т.к. раньше начался.

Достоверно значимые изменения в группах, где применялись «Дайвонекс» и «Скин-кап» нами отмечены начиная с 5-ой недели наблюдения (уменьшение в 2 раза).  В последующем динамика снижения показателей, несмотря на высокую интенсивность отличалась от таковой в группе «Элокома С» и наиболее сильно от группы где использовался Липсор. Связано это с тем, что начало интенсивного разрешения сыпи и следовательно снижения индекса РASI у этих больных началось на неделю позже чем у тех кто использовал «Элоком С» и почти на две недели чем у пациентов применявших «Липсор». Так к концу 9-ой недели наблюдений индекс PASI  у пациентов,  получавших «Дайвонекс» и «Скин-кап» составлял от исходного почти 9%  и 6%  соответственно. Эти показатели были получены в группе где применялся «Элоком С» на 8-ой неделе, а в группе где использовался «Липсор» уже в течение 6-ой применения. Достоверные отличия в эффективности действия препаратов при их сравнении друг с другом отмечаются с 3-ей недели наблюдения. В этот период эффективность Липсора превосходит «Элоком С», не говоря уже о «Дайвонексе» и «Скин-капе».

Следует также отметить, что результаты полученные у больных при применении Липсора на 3-ей неделе наблюдения при лечении распространённых форм псориаза, достигаются при лечении «Элокомом С» только  на четвёртой, а при лечении «Дайвонексом» и «Скин-капом» только на 5-ой.  В течение второго месяца лечения «Элоком С» и Липсор действуют одинаково эффективно, судя по скорости регресса индекса PASI, однако результаты исследования показали несколько более высокую эффективность «Липсора»,  нежели «Элокома С» при лечении диффузных форм псориаза.

Наблюдения за больными в течение столь длительного срока также показали, что среди  получавших «Элоком С», практически не было лиц, у которых данный препарат не оказывал бы положительный лечебный эффект, т.е. 98% чувствительность к препарату, тогда как во всех остальных группах такие пациенты встречались (от 3 до 8% в разных группах больных).

Мы считаем,  что скорость разрешения псориатического процесса безусловно зависит от исходной величины индекса PASI и общей площади поражённой кожи. Но как показали результаты проведённых исследований, в больших группах наблюдения в течение длительного периода, где показатели индекса PASI нивелированны как и общая площадь поражения кожи, отчётливо проявляется значение  механизмов действия каждого отдельного препарата, что и определяет эффективность его применения.

Полученные клинические наблюдения  позволяют сказать что:

  - крем Липсор  является высокоэффективным средством для наружной терапии псориаза и может быть использован как в остром, так и в стационарном периоде заболевания;

- по сравнению с традиционными наружными средствами  крем Липсор обладает большей терапевтической эффективностью, что в первую очередь сказывается на скорости разрешения псориатического процесса.

ВЫВОДЫ

1. Наиболее выраженным антипролиферативным действием на культуры кератиноцитов больных псориазом обладают пентоксифиллин, пирроксан, селенит натрия, глутатион окисленный и сальбутамол (подавление включения 3Н-тимидина в 4,2; 4,2; 3,2; 2,5 и 2.2  раза соответственно;  р < 0,001), предварительно переведённые в липосомальную форму.

2. Комбинации из липосомальных: пентоксифиллина, селенита натрия и пирроксана, а также из пентоксифиллина, селенита натрия и этмозина  наиболее целесообразны для использования в качестве лекарственных средств наружной терапии псориаза, так как наиболее эффективно подавляют пролиферацию в культурах кератиноцитов больных псориазом (подавляя включение 3Н-тимидина в 36,2 и в 23 раза соответственно; р < 0,001).

3. Комбинированный препарат в состав которого входят липосомальные пентоксифиллин, пирроксан и селенит натрия  является высокоэффективным средством для наружной терапии псориаза и может быть использован как в остром, так и в стационарном периоде заболевания, так как не обладает раздражающим эффектом (клиническая ремиссия – 87%  у стационарных и 82% у амбулаторных больных, переносимость  очень хорошая – 100%).

4. Комбинированный препарат в состав которого входят липосомальные пентоксифиллин, пирроксан и селенит натрия, по скорости разрешения псориатических высыпаний не уступает современным наружным средствам,  что доказано на высокой чувствительности  к нему (93,9 % стационарных и 90% амбулаторных)  больных,  и на быстрой скорости  разрешения псориатических элементов кожной сыпи (4-5 недель у больных с ограниченной  и  до 8 недель при распространённой формах болезни).

5. Процессы свободнорадикального окисления и антиоксидантной защиты участвуют в регуляции пролиферативно-дифференцировочной активности клеток кожи при псориазе таким образом, что увеличение интенсивности свободнорадикального окисления ведёт к остановке пролиферации, а высокий уровень антиоксислительной защиты ее поддерживает:

- состотояние гиперпролиферации кератиноцитов сопровождается резким угнетением процессов свободнорадикального окисления и высокой  антиокислительной активностью клеток, о чем свидетельствует  низкая концентрация  диеновых коньюгатов и малонового диальдегида, повышенное содержание восстановленного глутатиона и сульфгидрильных групп, а также возрастание активности ферментов, участвующих в регуляции антиокислительной защиты (уменьшение содержания малонового диальдегида и диеновых коньюгатов в клетках более чем в 2 раза и увеличение концентраций восстановленного глутатиона и сульфгидрильных групп  в 3,3 раза);

- подавление пролиферации кератиноцитов липосомальными препаратами и их комбинациями сопровождается преимущественной нормализацией параметров антиокислительной защиты и увеличением интенсивности свободнорадикального окисления (снижение концентрации восстановленного глутатиона и сульфгидрильных групп в 3 и 2,2 раза соответственно  и увеличение содержания малонового диальдегида и диеновых коньюгатов в 1,8 и 2,2  раза соответственно.  Приведены  результаты применения пентоксифиллина, как наиболее активного антипролиферативного препарата). 

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Лабораторный метод определения чувствительности кератиноцитов больных псориазом к различным препаратам следует применять  как для  определения индивидуальной терапевтической эффективности средств наружной терапии, так и  для изучения пролиферативно-дифференцировочных, морфологических и метаболических процессов кожи с последующим созданием новых лекарственных препаратов с целью оптимизации  наружной терапии.

2. Определение показателей процессов свободнорадикального окисления и антиокислительной защиты, как высокоинформативных  и диагностически значимых  наиболее целесообразно проводить на изолированных клеточных культурах кератиноцитов с целью установления  их окислительно-восстановительного потенциала  и пролиферативной активности.

3. В наружной терапии вульгарного псориаза целесообразно использовать антипролиферативный липосомальный крем вне зависимости от периода заболевания. Препарат может применяться в виде монотерапии, так и в комплексном лечении в качестве основного средства  наружной терапии.

4. Применение липосомального антипролиферативного крема целесообразно назначать  до 2-х раз в сутки в максимальной суточной дозе до 300 г в зависимости от площади поражения кожи.  Крем наносить на поражённые участки кожи, слегка втирая.  Применять крем необходимо до полного разрешения элементов сыпи. Первый эффект препарата проявляется на 5-7 день после начала терапии в виде уплощения бляшек. 

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

  1. Гуманенко Е.К. Эндотрахеальное применение препаратов супероксиддисмутазы при тяжёлой сочетанной травме патогенетически обоснованная мера профилактики посттравматических бронхолёгочных осложнений / Е.К. Гуманенко, Н.С. Немченко, А.М. Фахрутдинов, Р.А. Грашин // Вестн хир. им.  Грекова. 2004. Т.163, №1. С. 65-68.
  2. Терлецкий О.В. Cлучай эффективного применения кремов «Липсор» и «Липэк» у больного, страдающего тяжёлой формой  псориаза / О.В. Терлецкий., Р.А. Грашин // Вестник СПбГМА им. И.И.  Мечникова. 2006. № 1. С. 175-178. 
  3. Барбинов В.В. Влияние липосомальных и обычных мыл на функциональную активность апокриновых потовых желёз человека /  В.В. Барбинов, Р.А. Грашин [и др.] // Вестник Военно-медицинской академии. 2007. № 1(17). С. 40-45. 
  4. Барбинов В.В. Новые подходы к наружной терапии псориаза / В.В. Барбинов, Р.А. Грашин // Росс. ж-л. кож. и вен. болезней. 2008. №3 С. 23-28.
  5. Грашин Р.А. Регуляция пролиферации кератиноцитов больных псориазом в культурах клеток с использованием липосом / Р.А. Грашин., В.В. Барбинов, А.О. Данилов, А.В. Самцов // Вестник дерматологии и венерологии. 2008. № 6. С. 13-20.
  6. Грашин Р.А. Активность про- и антиоксидантных процессов в культурах кератиноцитов больных псориазом / Грашин Р.А. [и др.] //  Вестник Российской Военно-медицинской академии. 2008. №4(24). С. 125-130.
  7. Шилов Ю.В. Токсические эффекты циклофосфана и подходы к их фармакологической коррекции / Ю.В. Шилов, В.А. Кашуро, Л.В. Минаева, Р.А. Грашин. // Вестник Российской Военно-медицинской академии. 2008. №3 (23). С. 68-72.
  8. Хайрутдинов В.Р. Роль полиморфных генов программируемой клеточной гибели в формировании риска развития псориаза / В.Р. Хайрутдинов, А.С.  Жуков, И.А. Пономарев, Р.А. Грашин, А.В. Самцов, Е.Н. Имянитов // Вестник дерматологии и венерологии. 2009. № 4. С. 4-9.
  9. Ольшамовская А.О. Новые возможности комбинированной наружной терапии при атопическом дерматите / А.О. Ольшамовская, Р.А. Грашин, В.В. Барбинов // Росс. ж-л. кож. и вен. болезней. 2009. № 6. С. 8-11.
  10. Грашин Р.А. Системы свободнорадикального окисления и антиоксидантной защиты как индикаторы активности пролиферации  кератиноцитов при псориазе / Р.А. Грашин, В.Г. Антонов, А.И. Карпищенко, В.Р. Хайрутдинов / Клиническая лабораторная диагностика. 2009. № 12. С. 11-15.
  11. Атаманчук В.Н. Использование липосомального крема «Липро» в лечении вульгарных и розовых угрей / В.Н Атаманчук. [и др.] // Вторая науч.-практ. конф. «Санкт-Петербургские дерматологические чтения»: Тезисы конференции / Под ред. проф. Самцова А.В., проф., Соколовского Е.В., проф. Разнатовского К.И.; Военно-мед. акад. им. С.М. Кирова. – СПб.:  «Человек и здоровье», 2008. – С.10 .
  12. Барбинов В.В. Результаты изучения клинической  эффективности рецептуры «Липсор» у больных  псориазом / В.В Барбинов [и др.] // Тез. докл. VI Всероссийской науч.-практ. конф. «Актуальные вопросы лечения в многопрофильных учреждениях". – СПб., 2003. – С.180.
  13. Барбинов В.В.  Оценка антипролиферативного действия препаратов, включённых в липосомы, на культуру кератиноцитов больных псориазом  / В.В. Барбинов [и др.] // Тез. докл. VI Всероссийской науч.-практ. конф. «Актуальные вопросы лечения в многопрофильных учреждениях". – СПб., 2003. – С.181.
  14. Барбинов В.В. Новые патогенетически обоснованные подходы в наружной терапии псориаза / В.В. Барбинов., Р.А.  Грашин // Тез. докл. 1-ого Росс. конгр. дерматовенерологов.– СПб. – 2003.– С. 23-26. 
  15. Барбинов В.В. Оценка влияния отдельных липосомальных препаратов на пролиферацию культур кератиноцитов больных псориазом по состоянию систем свободнорадикального окисления и антиоксидантной защиты / В.В. Барбинов, Р.А.  Грашин // Тез. научн. работ Всеросс. научн.-практ. конф. «Актуальные проблемы лабораторной диагностики".–  СПб. –2008. – С. 15-17.
  16. Барбинов В.В. Оценка эффективности применения крема  «Липэк» в комплексной терапии больных атопическим дерматитом / В.В. Барбинов., Р.А. Грашин., В.Н. Атаманчук., А.О. Ольшамовская // Вторая научно-практическая конференция «Санкт-Петербургские дерматологические чтения»: Тезисы конференции / Под ред. проф. Самцова А.В., проф., Соколовского Е.В., проф. Разнатовского К.И.; Военно-мед. акад. им. С.М. Кирова. – СПб.: «Человек и здоровье», 2008.– С.12.
  17. Барбинов В.В. Сравнительная клиническая эффективность современных лекарственных средств, применяемых в наружной терапии псориаза / В.В Барбинов, Р.А. Грашин, Р.А. Раводин, Д.В.  Барбинов // Вторая научно-практическая конференция «Санкт-Петербургские дерматологические чтения»: Тезисы конференции / Под ред. проф. Самцова А.В., проф., Соколовского Е.В., проф. Разнатовского К.И.; Воен.-мед. акад. им. С.М. Кирова. – СПб.: «Человек и здоровье», 2008. – С.12-13.
  18. Внутрилабораторный контроль качества лабораторных исследований: Медицинские  лабораторные технологии и  диагностика // Под ред. проф. А.И. Карпищенко. –  СПб: Интермедика, 2002.– С.119-154.
  19. Грашин Р.А. Сравнительная оценка влияния липосомальных и обычных мыл на функциональную активность апокриновых потовых желез и химический состав пота человека / Р.А. Грашин, А.В. Бабкин /. Журнал дермато-венерологии и косметологии. – 2004. – №1.– С. 39-43. 
  20. Грашин Р.А. Системы свободнорадикального окисления и антиоксидантной защиты как показатели пролиферативно-дифференцировочной активности кератиноцитов больных псориазом / Р.А. Грашин., В.В. Барбинов  // Тез. науч. работ II-ого  Всеросс. Конгр. дерматовенерологов.–  СПб., 2007.–  С.47. 
  21. Грашин Р.А. Состояние процессов свободнорадикального окисления в культурах кератиноцитов больных псориазом / Р.А. Грашин., В.В. Барбинов  // Тез. науч. работ II-ого  Всеросс. Конгр. дерматовенерологов.–  СПб., 2007.–  С. 47. 
  22. Грашин Р.А. Использование культур кератиноцитов  больных псориазом  для оценки про- и антиоксидантного статуса клеток. / Р.А.  Грашин, В.В. Барбинов., А.О. Данилов // Тез. научн. работ Всеросс. научн.-практ. конф. «Актуальные проблемы лабораторной диагностики". –  СПб.– 2008. – С.17. 
  23. Грашин Р.А. Оценка влияния смесей липосомальных препаратов на  состояние систем свободнорадикального окисления и антиоксидантной защиты в  культурах кератиноцитов больных псориазом. / Р.А.  Грашин, В.В. Барбинов. // Тез. научн. работ Всеросс. научн.-практ. конф. «Актуальные проблемы лабораторной диагностики". – СПб.–2008.– С. 17. 
  24. Методы клинической биохимии: Медицинские  лабораторные технологии и  диагностика // Под ред. проф. А.И. Карпищенко. – СПб: Интермедика, 2002. – С.243-282.
  25. Николаева А.Ш. Эффективность супероксиддисмутазы в терапии экспериментальной поздней кожной порфирии, вызванной у животных / А.Ш. Николаева, А.В. Самцов, В.В. Барбинов, Грашин Р.А. // Журнал дерматовенерологии и косметологии.  – 2002.– №1.– С. 20-23.
  26. Ольшамовская А.О. Преимущество использования липосомального крема «ЛИПЭК» в комплексной терапии атопического дерматита /  Барбинов В.В., Р.А. Грашин // Вестник Российской Военно-медицинской академии. – 2009. – №1(25).– С. 667. (приложение)
  27. Самцов А.В.  Результаты изучения возможности использования мыла, содержащего липосомальный диоксидин, в профилактике инфекционных заболеваний кожи / А.В. Самцов, А.В. Бабкин, Д.В. Чернышёв, Р.А. Грашин // Тез. научн. работ VIII съезда Итало-Российского об-ва по инфекционным болезням: «Проблема инфекции в клинической медицине». – СПб., 2002.– С. 63.
  28. Самцов А.В.  Оценка эффективности применения препарата «Липсор» в наружной терапии псориаза / А.В. Самцов [и др.] // М-лы, юб. науч.-практ. конф. «Актуальные вопросы дерматологии, косметологии и ИППП»: посв. 10-летию кафедры кожных и венерических болезней с курсом дерматокосметологии ФУВ. – М.: РГМУ, 2003. – С. 68-69.
  29. Сбойчаков В.Б. Воздействие антибактериального мыла с липосомальным диоксидином на аутомикрофлору кожи / В.Б. Сбойчаков [и др.] //  Тез.  докл. юбилейной науч. конф. посвящённой 80-летию кафедры микробиологии ВМедА и 300-летию основания Санкт-Петербурга «Современная микробиология клинической  медицине». – СП-б., 2003. – С.149-150.
  30. Barbinov V.V. Nonsteroid bioregulating liposomic preparations in the topical therapy of psoriasis/ V.V. Barbinov, R.A. Grashin // JEADV.– 2004.–Vol. 18, № 6.– Р. 794

Авторские свидетельства (патенты):

1. Средство для наружной терапии псориаза и способ его изготовления / Барбинов В.В., Грашин Р.А. Самцов А.В., Атаманчук В.Н. [и др.]// Патент на изобретение №2196583. Приоритет от 29.05.2001.

2. Способ определения чувствительности кератиноцитов больного псориазом к лекарственным препаратам / Грашин Р.А., Барбинов В.В., Данилов А.О., Иванов А.М.// Патент на изобретение № 2361219. Приоритет от 16.04.2008 г.






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.