WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


 

На правах рукописи

БОГОСЛОВСКАЯ

Елена Владимировна

комплекс молекулярно-генетических методов для мониторинга Вич-инфекции

14.03.10 – клиническая лабораторная диагностика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора медицинских наук

Санкт-Петербург - 2011

Работа выполнена в ФБУН «Центральный научно-исследовательский институт Эпидемиологии» Роспотребнадзора.

Научный консультант:

доктор медицинских наук  ЛУКАШОВ Владимир Владимирович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук МОЛЧАНОВ Олег Леонидович

доктор медицинских наук профессор  ДОЛГИХ Татьяна Ивановна

доктор медицинских наук ГУМИЛЕВСКАЯ Оксана Петровна

Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Защита диссертации состоится «20» марта  2012 г. в ____часов на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 215.002.08. при ФГВОУ ВПО «Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова» МО РФ (194044, Санкт-Петербург, ул. Академика Лебедева, д.6).

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке ФГВОУ ВПО «Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова» МО РФ

Автореферат разослан «____» ___________ 2012 года

Ученый секретарь

диссертационного совета

доктор медицинских наук

Митин Юрий Алексеевич

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ



Актуальность проблемы

В настоящее время в Российской Федерации продолжает развиваться самая крупная в Европе эпидемия ВИЧ (вируса иммунодефицита человека). Согласно данным Федерального научно-методического центра по профилактике и борьбе со СПИДом на конец 2010 года на территории РФ было зарегистрировано более 580 тысяч человек, живущих с ВИЧ-инфекцией (Информационный бюллетень № 34 «ВИЧ-инфекция», 2010). В связи с этим остро встают проблемы профилактики распространения ВИЧ-инфекции, своевременного выявления ВИЧ-инфицированных лиц и их эффективного лечения.

Одной из главных проблем диагностики ВИЧ-инфекции на сегодняшний день является неэффективность серологических методов в случае выявления инфекции у детей, рожденных от ВИЧ-инфицированных матерей, а также у лиц на ранней стадии ВИЧ-инфекции, у которых еще не выявляются антитела к ВИЧ (в период т.н. серологического окна).

Среди зарегистрированных в РФ случаев ВИЧ-инфекции на долю детей приходится более 5000 случаев, из них 3651 ребенок инфицирован при перинатальном контакте с матерью (данные на конец 2010 года). Еще более 25000 детей в возрасте до полутора лет, рожденных в 2009-2010 гг. от зараженных ВИЧ матерей, находятся под наблюдением до окончательного установления диагноза. Диагностика ВИЧ-инфекции у детей, рожденных от ВИЧ-инфицированных матерей, затруднена в связи с тем, что в крови таких детей в течение длительного времени сохраняются материнские антитела к ВИЧ (Rakusan, 1991; Palasanthiran, 1994; Moodley, 1995, 1997; Chantry, 1995). По существовавшим до 2011 года в России рекомендациям постановка или снятие диагноза ВИЧ-инфекции детям, рожденным от ВИЧ-инфицированных матерей, проводилась на основании результатов серологического обследования не ранее 18 месяцев (Инструкция по профилактике передачи ВИЧ-инфекции от матери ребенку и образца информированного согласия на проведение химиопрофилактики ВИЧ (Утверждено приказом МЗ РФ 19.12.2003, № 606)).

Проблема, связанная с наличием серологического окна, особенно актуальна в службе донорской крови. В 2009 году в нашей стране было обследовано 4 млн. доноров, среди них выявлено с помощью серологических методов 1240 ВИЧ-инфицированных, в то время как в 2008 году из 3,7 млн. обследованных доноров было выявлено 972 ВИЧ-инфицированных (Информационный бюллетень № 34 «ВИЧ-инфекция», 2010). Это свидетельствует о возрастающем риске переливания инфицированной ВИЧ крови.

Решением проблем серологической диагностики является внедрение прямых методов выявления инфекционного агента, в частности молекулярно-генетических методов, обладающих наибольшей чувствительностью (Schreiber GB, 1996). Из молекулярно-генетических методов диагностики наибольшее распространение получил метод ПЦР (полимеразная цепная реакция), направленный на выявление нуклеиновых кислот (НК) вирусов и других инфекционных агентов.

Проблема лечения ВИЧ-инфицированных пациентов решается в настоящее время за счет использования комплекса антиретровирусных (АРВ) препаратов, которые позволяют увеличить продолжительность и улучшить качество жизни пациентов (Mocroft, 1998; Palella FJ Jr, 1998; Vittinghoff, 1999). Под действием лекарственных препаратов удается подавить вирусную репликацию до минимального уровня (Bartlett JA, 2006; Hill A, 2009). Слежение за изменением содержания ВИЧ в крови (вирусной нагрузки) в процессе АРВ терапии позволяет вовремя оценить ее эффективность и в случае неудачи подобрать новую комбинацию препаратов. В настоящее время мониторинг вирусной нагрузки (концентрации РНК ВИЧ) является обязательной процедурой, как на этапе назначения терапии, так и в процессе терапии. Проведение такого рода исследований стало возможным после разработки и внедрения целого ряда количественных тест-систем, предназначенных для определения вирусной нагрузки ВИЧ.

Высокая стоимость зарубежных тест-систем ограничивает их широкое применение в России, поэтому не у всех пациентов, получающих АРВ терапию, удается адекватно оценить эффективность лечения, что в конечном итоге может приводить к развитию лекарственной устойчивости. Кроме того, далеко не все импортные тесты достаточно эффективно выявляют вирусные варианты, циркулирующие на территории РФ (в частности, наиболее распространенный субтип А, отличный от распространенного в Западной Европе и США субтипа В). Внедрение в практику дешевых отечественных тест-систем, апробированных на российских пациентах, позволит широко использовать критерий вирусной нагрузки в клинической практике.

Несмотря на использование высокоэффективных схем лечения, у достаточно большой части пациентов терапия становится неэффективной (Casado, 1998; Fatkenheuer, 1997; Moyle, 1996). Хотя причина неэффективности терапии может быть многофакторной, практически во всех случаях развивается устойчивость к используемым препаратам. Тестирование лекарственной устойчивости ВИЧ к АРВ препаратам является важным дополнением в общей схеме мониторинга пациентов, получающих специфическую терапию, так как в большинстве случаев такие методы позволяют объяснить причину неэффективности терапии и назначить оптимальную комбинацию препаратов. Одним из наиболее распространенных методов определения лекарственной устойчивости ВИЧ является метод, основанный на секвенировании РНК фрагментов генома ВИЧ.

На фоне быстро развивающейся эпидемии ВИЧ в России и активного использования АРВ препаратов для лечения большого числа пациентов в ряде регионов РФ возникает опасность увеличения распространенности резистентных вариантов ВИЧ среди ВИЧ-инфицированных пациентов, что в свою очередь может приводить к повышению частоты передачи лекарственно устойчивых вариантов вируса вновь инфицированным пациентам, для которых возможности противовирусной терапии становятся ограниченными. В Западной Европе и США частота первичной устойчивости ВИЧ колеблется в диапазоне 6-23% (Weinstock, 2004; Wensing, 2005; Cane, 2005; Wheeler, 2010; Ross, 2007; Little, 2002; Grant, 2002; Masquelier, 2005; Fox, 2006; Shet, 2006). Результаты дозорного эпидемиологического надзора, показывающие, что на популяционном уровне лекарственная устойчивость ВИЧ превышает 5%, необходимо принимать во внимание с целью адаптации национальных рекомендаций, касающиеся АРВ препаратов первой линии. Поэтому очень важно проводить регулярный эпидемиологический надзор за появлением и распространением устойчивых к АРВ-препаратам вариантов вируса и заблаговременно проводить профилактические мероприятия по снижению распространения лекарственно устойчивых вирусов. Такие исследования проводятся с использования молекулярно-генетических методов определения мутаций лекарственной устойчивости ВИЧ.

Следовательно, роль молекулярно-генетических методов в диагностике и лечении ВИЧ-инфекции значительна. Разработка дешевых, доступных и эффективных отечественных тестов позволит заменить импортные тест-системы, что в свою очередь приведет к активному и широкому внедрению таких анализов в клиническую практику.

Немаловажную роль молекулярно-генетические методы играют при проведении эпидемиологического надзора за ВИЧ-инфекцией, в частности при изучении распространенности различных субтипов ВИЧ. Изучение разнообразия субтипов ВИЧ, циркулирующих на различных территориях России, и определение их роли в эпидемическом процессе необходимы для выявления закономерностей развития эпидемии, совершенствования диагностики и создания вакцин. На сегодняшний день такие работы проводятся в России не в полном объеме, в частности по причине отсутствия доступных стандартных методик генотипирования, позволяющих с высокой точностью определять всевозможные субтипы ВИЧ и их рекомбинанты.

Цель исследования

Совершенствование лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции путем разработки и использования комплекса молекулярно-генетических подходов с учетом генетических особенностей вариантов ВИЧ, циркулирующих на территории России.

Задачи исследования

  1. Разработать молекулярно-генетические подходы и оценить возможность их использования для проведения ранней диагностики ВИЧ-инфекции у детей, рожденных от ВИЧ-инфицированных матерей.
  2. Обосновать необходимость проведения скрининга донорской крови с помощью молекулярно-генетических методов и предложить современные подходы повышения инфекционной безопасности при переливании крови.
  3. Обосновать и сконструировать оптимальный формат отечественных тест-систем для определения вирусной нагрузки ВИЧ, подтвердить их эффективность в клинической практике для прогнозирования течения ВИЧ-инфекции и оценки эффективности АРВ терапии в сравнении с зарубежными тест-системами.
  4. Разработать методические подходы, позволяющие стандартизовать молекулярно-генетические исследования при ВИЧ-инфекции.
  5. Разработать генотипический подход для определения лекарственной устойчивости ВИЧ и охарактеризовать возможность применения разработанного подхода для совершенствования АРВ терапии и проведения эпидемиологического надзора за первичной резистентностью.
  6. Предложить новую технологию генотипирования ВИЧ на основе метода секвенирования, позволяющую определять большинство генотипов ВИЧ, включая рекомбинантные формы. С помощью разработанной технологии оценить разнообразие вариантов ВИЧ на территории России.

Научная новизна и теоретическая значимость работы:

  1. Впервые в РФ разработана методология создания ПЦР-тест-систем для диагностики и мониторинга ВИЧ-инфекции с учетом генетических особенностей вариантов ВИЧ, циркулирующих на территории РФ.
  2. Впервые проведена оценка аналитических и диагностических показателей тестов, основанных на молекулярно-генетических методах и предназначенных для диагностики ВИЧ.
  3. На основе разработанных молекулярно-генетических подходов для диагностики и генотипирования ВИЧ создан алгоритм оценки лабораторных показателей эффективности АРВ терапии у пациентов, инфицированных ВИЧ.
  4. Определены частота и характер развившейся лекарственной устойчивости у ВИЧ-инфицированных пациентов, получавших различные схемы АРВ терапии в течение нескольких лет.
  5. Сформулированы теоретические положения, обосновывающие проведение скрининга донорской крови на наличие вирусных маркеров с помощью молекулярно-генетических методов.
  6. Получены новые данные о распространенности различных субтипов ВИЧ в России в 2003 и 2007 гг. и проведена оценка полученных результатов по сравнению с данными, полученными в более ранние годы.
  7. Показана высокая эффективность метода секвенирования для определения генотипа ВИЧ по сравнению с другими методами генотипирования.
  8. Разработаны методические подходы стандартизации лабораторных исследований для ВИЧ-инфекции, основанных на молекулярно-генетических методах.

Практическая значимость исследования:

  1. Разработан комплекс отечественных диагностических препаратов на основе молекулярно-генетических методов, которые позволили усовершенствовать диагностику, мониторинг и лечение ВИЧ-инфицированных пациентов. На основе разработанных методологических подходов созданы наборы реагентов: «АмплиСенс ДНК-ВИЧ-96 М», «АмплиСенс ДНК-ВИЧ-FRT», «АмплиСенс ВИЧ Монитор» «АмплиСенс ВИЧ Монитор-FRT», «АмплиСенс ВИЧ-генотип-Eph», которые зарегистрированы Федеральной службой по надзору в сфере здравоохранения и социального развития РФ и внесены в государственный реестр изделий медицинского назначения и медицинской техники.
  2. Разработаны методические рекомендации по использованию тест-систем на основе молекулярно-генетических методов, позволяющие  оптимально использовать молекулярно-генетические тесты в клинической и лабораторной практике.
  3. Впервые в РФ разработаны и внедрены в клиническую практику молекулярно-генетический подход и алгоритм его использования для ранней диагностики ВИЧ-инфекции у детей, рожденных от ВИЧ-инфицированных матерей.
  4. Разработана стандартная панель контрольных образцов, содержащих РНК ВИЧ, для проведения внешнего и внутрилабораторного контроля качества молекулярно-генетических исследований в области ВИЧ-инфекции.
  5. Создана система эпидемиологического надзора за циркуляцией различных вариантов ВИЧ с помощью молекулярно-генетических методов для оценки генетического разнообразия вируса и эпидемиологических расследований новых случаев инфицирования ВИЧ.

Основные положения, выносимые на защиту

  1. Молекулярно-генетические методы лабораторной диагностики, учитывающие генетические особенности вариантов ВИЧ, циркулирующих на территории РФ, позволяют более эффективно проводить диагностику и мониторинг российских ВИЧ-инфицированных пациентов.
  2. Использование стандартной панели контрольных образцов, содержащих РНК ВИЧ, позволяет проводить внешний и внутрилабораторный контроль качества молекулярно-генетических исследований в области ВИЧ-инфекции.
  3. Разработанные с учетом генетического разнообразия ВИЧ тест-системы обладают высокими аналитическими и диагностическими показателями.
  4. Использование метода секвенирования для генотипирования ВИЧ позволяет проводить эпидемиологический мониторинг за циркулирующими в России вариантами ВИЧ, в том числе первично устойчивыми к АРВ препаратам, а также проводить эпидемиологические расследования, связанные с передачей ВИЧ.

Внедрения результатов работы

Разработанные ПЦР-тест-системы поставляются за счет федерального бюджета в региональные Центры СПИД по всей территории РФ в рамках Национальных приоритетных проектов и государственных контрактов.

В 2005 году была осуществлена поставка 123 наборов тест-системы «АмплиСенс ДНК-ВИЧ-96» в 46 регионов России (Государственный контракт № 04/1037 от 6.09.2005), 226 наборов тест-системы «АмплиСенс ВИЧ Монитор» в 46 регионов России (Государственный контракт № 04/1037 от 6.09.2005). В 2006 году было поставлено 167 наборов тест-системы «АмплиСенс ДНК-ВИЧ-96» в 47 регионов (Государственный контракт № 04/1307 от 11.08.2006), 2700 наборов тест-системы «АмплиСенс ВИЧ Монитор» в 55 регионов (Государственный контракт № 04/159 от 27.02.2006). В 2007 году было поставлено 340 наборов тест-системы «АмплиСенс ДНК-ВИЧ-96 М» в 59 регионов страны (Государственный контракт № 04/315 от 10.05.2007), 5261 набора тест-системы «АмплиСенс ВИЧ Монитор» в 31 регион (Государственный контракт № 04/316 от 10.05.2007), 168 наборов тест-системы «АмплиСенс ДНК-ВИЧ-FRT» в 23 региона (Государственный контракт № 04/315 от 10.05.2007), 1448 наборов тест-системы «АмплиСенс ВИЧ Монитор-FRT» в 26 регионов (Государственный контракт № 04/317 от 10.05.2007). В 2008 году ЦНИИЭ осуществил поставку 249 наборов тест-системы «АмплиСенс ДНК-ВИЧ-96 М» в 31 регион страны (Государственный контракт № 52-Д от 3.10.2008), 1172 наборов тест-системы «АмплиСенс ВИЧ Монитор» в 13 регионов (Государственный контракт № 54-Д от 3.10.2008), 452 наборов тест-системы «АмплиСенс ДНК-ВИЧ-FRT» в 43 региона (Государственный контракт № 53-Д от 3.10.2008), 2010 наборов тест-системы «АмплиСенс ВИЧ Монитор-FRT» в 35 регионов (Государственные контракты №№ 55-Д и 56-Д от 3.10.2008). В 2009 году ЦНИИЭ осуществил поставку 155 наборов тест-системы «АмплиСенс ДНК-ВИЧ-96 М» в 27 регионов страны (Государственный контракт № 84-Д от 10.06.2009), 266 наборов тест-системы «АмплиСенс ВИЧ Монитор» в 5 регионов (Государственный контракт № 86-Д от 10.06.2009), 339 наборов тест-системы «АмплиСенс ДНК-ВИЧ-FRT» в 52 региона (Государственный контракт № 85-Д от 10.06.2009), 1280 наборов тест-системы «АмплиСенс ВИЧ Монитор-FRT» в 36 регионов (Государственные контракты № 89-Д от 10.06.2009 и 129-Д от 11.06.2009). В 2010 году ЦНИИЭ осуществил поставку 104 наборов тест-системы «АмплиСенс ДНК-ВИЧ-96 М» в 17 регионов страны (Государственный контракт № SBR1010080549-00001833-01 от 1.11.2010), 204 наборов тест-системы «АмплиСенс ВИЧ Монитор» в 3 региона (Государственный контракт № SBR1011130915-00001833-01 от 30.08.2010), 344 наборов тест-системы «АмплиСенс ДНК-ВИЧ-FRT» в 62 региона (Государственный контракт № SBR1010080550-00001833-01 от 19.11.2010).

Алгоритмы проведения исследований на вирусную нагрузку и лекарственную устойчивость ВИЧ были опубликованы в Сборнике нормативно-правовых актов и методических документов по вопросам диагностики, лечения, эпидемиологического и поведенческого надзора ВИЧ/СПИД и сопутствующих заболеваний в 2007 году.

Основные положения диссертации используются при чтении лекций, проведении научно-практических конференций, практических занятий и семинаров, включены в программу тематических семинаров для специалистов лабораторной службы в рамках курсов повышения квалификации.

Апробация материалов диссертации

Материалы диссертации были доложены на 3-ей Всероссийской научно-практической конференции “Генодиагностика в современной медицине” в 2000 году, Москва; 1-ой Всероссийской научно-практической конференции «Генная диагностика особо опасных инфекций» в 2000 году, Саратов; совещании-семинаре “Лабораторная диагностика ВИЧ-инфекции” в 2001 году, Саратов; 4-й Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных заболеваний» в 2002 году, Москва; 5-ой Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных болезней» в 2004 году, Москва; Российской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных болезней» в 2005 году, Новосибирская обл.; совещании по вопросам лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции в 2005 году, Суздаль; III Российской научной конференции с международным участием «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера» в 2006 году, Новосибирск; Международной научно-практической конференции «Геномные технологии в медицине и медицинское образование на рубеже веков» в 2006 году, Алма-Аты, Республика Казахстан; Международной научно- практической конференции «Молекулярная диагностика инфекционных болезней» в 2007 году, Минск, Беларуссия; 6-ой Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика – 2007» в 2007 году, Москва; Второй конференции по вопросам ВИЧ/СПИД в Восточной Европе и Центральной Азии в 2008 году, Москва; 7-ой Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика – 2010» в 2010 году, Москва.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 57 работ, из них 12 – в изданиях, рекомендованных ВАК, 1 – патент на изобретение.

Личный вклад автора

Автором сформулирована концепция работы, составлен план её выполнения, сформулированы и обоснованы новые молекулярно-генетические подходы для диагностики ВИЧ-инфекции, лично разработаны основные компоненты тест-систем, составлен план экспериментальной части разработок молекулярно-генетических методик, проведена оценка результатов и предложены новые подходы молекулярно-генетического тестирования ВИЧ-инфицированных пациентов. Автор принимала участие в планировании и проведении лабораторных, клинических и Государственных испытаний разработанных тест-систем. Автором оценивались все первичные данные по проведенным исследованиям, лично собран клинический материал, произведена систематизация, статистическая обработка и анализ полученных результатов.

Автором разработаны и опубликованы методические рекомендации по использованию тест-систем на основе молекулярно-генетических методов в клинической практике. Большая часть опубликованных работ написана автором или при непосредственном ее участии.

Структура и объем диссертации

Диссертация представлена на 230 страницах, включая 25 рисунков, 25 таблиц, список литературы и приложения. Работа состоит из введения, обзора литературы, 7 глав собственных наблюдений, обсуждения полученных результатов, выводов. Список использованной литературы включает 16 отечественных и 176 зарубежных источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

В ходе работы было изучено 3297 образцов крови, полученных от следующих групп пациентов (табл.1):

Таблица 1.

Группы пациентов и число проанализированных от них образцов

Категория пациентов

Число пациентов

Число образцов

Регион наблюдения пациентов

Цель исследования

дети в возрасте 1дня-1,5лет

247

491

Москва

определение ДНК провируса ВИЧ

5

5

определение вирусной нагрузки

взрослые ВИЧ-инфицированные пациенты на разных стадиях заболевания

90

90

Москва

определение ДНК провируса ВИЧ

183

183

Москва

определение вирусной нагрузки

207

207

Московская, Брянская, Самарская, Нижегородская, Иркутская, Волгоградская, Тульская обл., Алтайский, Краснодарский, Хабаровский, Красноярский края, Якутия

определение

субтипа ВИЧ

205

определение ДНК провируса ВИЧ

взрослые ВИЧ-инфицированные пациенты, находящиеся на АРВ терапии

23

46

Москва

определение вирусной нагрузки

73

73

определение мутаций устойчивости ВИЧ

к АРВ препаратам

17

17

Новосибирская область

ВИЧ-инфицированные пациенты с недавней сероконверсией

и беременные женщины в возрасте до 25 лет

76

76

Москва и Московская обл.

определение мутаций устойчивости ВИЧ

к АРВ препаратам

297

297

Волгоградская, Иркутская, Ленинградская, Саратовская, Ульяновская обл., Алтайский край

154

определение субтипа ВИЧ

доноры крови

1303

1303

Московская областная станция переливания крови

одновременное определение РНК ВИЧ и ВГС и ДНК ВГБ

пациенты ЦМД (центра молекулярной диагностики) ЦНИИЭ

150

150

Москва

Для оценки аналитической и диагностической специфичности тестов были исследованы контрольные группы пациентов. Всего было протестировано 274 образца крови от лиц с подтвержденным отсутствием ВИЧ-инфекции. Также было протестировано 16 образцов, содержащих следующие микроорганизмы: вирусы гепатитов B, C, D, вирус Эпштейн-Барр, вирусы простого герпеса 1 и 2 типа, цитомегаловирус, папиломавирусы 11, 18, 16, 6 типов, аденовирус, Chlamydia trachomatis, Chlamydia psittaci, Coxiela burneti, Rickettsia prowazekii.





Подготовка проб крови.

Кровь забирали из локтевой вены утром натощак в пробирки с 1/10 объема 3% ЭДТА. Для качественных исследований, а также генотипирования цельную кровь хранили при температуре +2-80С не более 3 дней. Для количественных исследований цельную кровь хранили при температуре +2-80С не более 6 часов. Для получения плазмы крови (в случае исследований, связанных с РНК ВИЧ) цельную кровь центрифугировали при 800-1600 g в течение 20 минут. Хранили образцы плазмы при температуре минус 700С.

Для стандартизации разрабатываемых тестов, проведения внутрилабораторного контроля качества, а также количественной калибровки тестов были использованы стандартные образцы:

  1. Панель образцов, содержащих варианты ВИЧ-1 различных субтипов.

Панель образцов, содержащих ВИЧ-1, была предоставлена Национальным институтом биологических стандартов и контроля Великобритании (NIBSC) (кат. № 01/466). В панели представлены следующие субтипы ВИЧ-1: A, B, C, D, Е (А/Е), F, G, H, группы О и N. Образцы представляли собой плазму крови.

  1. Международный стандарт ВИЧ.

Международный стандарт, предоставленный Национальным институтом биологических стандартов и контроля Великобритании (NIBSC) (кат. № 97/656), представляет собой высушенный образец плазмы крови с содержанием РНК ВИЧ 105 копий.

  1. Панель образцов, содержащих штаммы ВИЧ с определенным набором мутаций, вызывающих устойчивость к АРВ препаратам.

Панель, предоставленная организацией QCMD (Quality Control for Molecular Diagnostics), состояла из 5 образцов плазмы крови, содержащих ВИЧ различных субтипов (2 образца – субтип С, 2 образца – субтип В и 1 образец – субтип F). Один из образцов содержал вставку из 6 нуклеотидов после 67 положения в гене обратной транскриптазы. Два образца представляли собой смесь квазивидов ВИЧ, поэтому несколько позиций в их нуклеотидной последовательности (10, 20, 43 и 89) представляли собой смесь нуклеотидов.

Помимо международных стандартных образцов и панелей были использованы собственные стандартные образцы предприятия (СОП), которые в дальнейшем были использованы для проведения внутрилабораторного контроля качества, а также для оценки аналитических показателей в рамках Государственных испытаний:

1. СОП РНК ВИЧ, предназначенный для проведения лабораторного контроля тест-систем, выявляющих РНК ВИЧ, представляет собой криопреципитированную плазму крови человека, содержащую вирус иммунодефицита человека 1 типа (ВИЧ-1) в концентрации 44000 копий/мл. Концентрацию РНК в СОП определяли с помощью тест-системы «Cobas Amplicor HIV-1 Monitor v. 1.5» фирмы «Хоффманн-Ла Рош» (США). Данный препарат был аттестован в ГИСК им. Л.А. Тарасевича.

2. СОП ДНК ПКО ВИЧ-1, предназначенный для проведения лабораторного контроля тест-систем, выявляющих ДНК провируса ВИЧ,  представляет собой плазмиду pBluescript II SK+/-, несущую 2 фрагмента генома ВИЧ – генов gag и pol. Концентрацию ДНК ВИЧ в препарате измеряли методом лимитирующих разведений (Sykes, 1992) с использованием двух пар праймеров, комплиментарных области гена pol ВИЧ-1, и она составляла 106 копий/мл.

Для разработки молекулярно-генетических тестов был использован метод полимеразной цепной реакции (ПЦР). Продукты амплификации детектировали, используя три различных подхода: электрофорез, гибридизационно-ферментный анализ (ГИФА) и гибридизационно-флюоресцентный анализ в режиме реального времени (Real-Time ПЦР). Традиционную ПЦР проводили на приборах GeneAmp PCR System 2400, 2700 («Applied Biosystems», США), Терцик («ДНК-технология», Россия), Palm-Cycler («Corbett Research», Австралия), Real-Time ПЦР проводили на приборах RotorGene 3000 или 6000 («Corbett Research», Австралия) и iQ5 («BioRad», США).

При подборе праймеров использовали базы данных нуклеотидных последовательностей национальной лаборатории Los Alamos и программу BLAST. А также были использованы собственные базы данных нуклеотидных последовательностей ВИЧ, полученных из образцов от российских ВИЧ-инфицированных пациентов. При выборе праймеров принимали во внимание возможность образования вторичных структур с помощью программ Oligos и Mfold.

Для определения нуклеотидной последовательности фрагментов ВИЧ использовали метод секвенирования ДНК. Для проведения реакции циклического секвенирования были использованы наборы реагентов фирмы «Applied Biosystems» (США): Big Dye ® Terminator v1.1 Sequencing Standard Kit. Разделение меченых фрагментов ДНК осуществляли с помощью автоматического секвенатора ABI Prism® 3100 («Applied Biosystems», США).

Анализ нуклеотидных последовательностей ВИЧ, полученных в результате секвенирования ДНК, осуществляли с помощью программ, представленных в свободном доступе в Интернете. Для определения субтипа ВИЧ использовали программы RIP 2.0 и 3.0 (www.hiv.lanl.gov) и NCBI Genotyping (www.ncbi.nlm.nih.gov). Для определения мутаций устойчивости ВИЧ к противоретровирусным препаратам использовали программу, представленную на сайте Госпиталя Стенфордского Университета (http://hivdb6.stanford.edu).

Для сравнительной оценки аналитических и диагностических характеристик разработанных тестов были проанализированы тест-системы зарубежных производителей, следуя прилагаемым инструкциям. ДНК провируса ВИЧ выявляли в образцах крови с помощью тест-системы «Amplicor HIV 1 test» («Хоффманн-Ла Рош», Швейцария). Для измерения концентрации РНК ВИЧ в плазме крови использовали несколько коммерческих тестов: «Amplicor HIV-1 Monitor» и «Cobas Amplicor HIV-1 Monitor» версии 1.5 («Хоффманн-Ла Рош», Швейцария); «LCx HIV RNA Quantitative assay» («Эбботт», США); «Abbott Real-Time HIV-1» («Эбботт», США).

Лекарственную устойчивость ВИЧ определяли с помощью тест-системы Viroseq HIV-1 Genotyping System («Эбботт», США) согласно инструкции к тест-системе. Расшифрованную нуклеотидную последовательность анализировали с помощью программы Viroseq.

Статистическую обработку полученных результатов осуществляли с помощью программы SPSS 11.5 for Windows. Вычисляли следующие параметры: коэффициент корреляции Спирмена, коэффициент регрессии, коэффициент вариации. Графические рисунки сделаны также с помощью программы SPSS 11.5 for Windows и Microsoft Office Excel.

Результаты исследования и их обсуждение

Новые молекулярно-генетические подходы, позволяющие проводить раннюю диагностику ВИЧ-инфекции у детей, рожденных от ВИЧ-инфицированных матерей

Для проведения ранней диагностики ВИЧ-инфекции у детей, рожденных от ВИЧ-инфицированных матерей, был предложен новый молекулярно-генетический подход на основе метода ПЦР, позволяющий выявлять ДНК провируса ВИЧ в лейкоцитах периферической крови.

Разработка ПЦР-тест-систем для выявления ДНК провируса ВИЧ состояла из четырех этапов:

  1. этап - выбор оптимальных способов экстракции ДНК из цельной крови;
  2. этап - подбор праймеров и зондов, позволяющих с высокой чувствительностью и одинаковой эффективностью выявлять наиболее распространенные субтипы ВИЧ-1, в том числе циркулирующие по территории РФ;
  3. этап - разработка внутреннего контрольного образца (ВКО);
  4. этап - разработка методов детекции продуктов ПЦР на основе ГИФА и в режиме реального времени (Real-Time ПЦР).

В ходе разработки тест-систем было предложено три варианта выделения ДНК из цельной крови, один из которых автоматизирован, были подобраны праймеры, комплиментарные наиболее консервативной области генома ВИЧ – гену полимеразы, которые позволяют выявлять с высокой эффективностью большинство субтипов ВИЧ-1, в особенности субтип А, наиболее распространенный на территории РФ. Для оценки эффективности экстракции ДНК из клинического материала, а также контроля возможного ингибирования ПЦР были разработаны праймеры для амплификации участка клеточной ДНК – гена b-глобина, который таким образом выполнял функцию эндогенного внутреннего контроля (ВКО). Использование ВКО позволило полностью исключить риск получения ложноотрицательных результатов, приближая эффективность ДНК-диагностики ВИЧ-инфекции к 100%.

В результате проведенных исследований было разработано две ПЦР-тест-системы, предназначенные для выявления ДНК провируса ВИЧ, и отличающиеся способом детекции продуктов амплификации. Первая тест-система «АмплиСенс ДНК-ВИЧ-96 М» основана на методе ПЦР с гибридизационно-ферментной детекцией продуктов амплификации. Вторая разработанная тест-система, «АмплиСенс ДНК-ВИЧ-FRT», основана на методе Real-Time ПЦР.

Для оценки возможности использования разработанных тест-систем в клинической практике было проведено исследование 465 образцов цельной крови от 230 детей, рожденных от ВИЧ-инфицированных матерей, в результате чего было выявлено 26 детей, инфицированных ВИЧ (11,3%). 205 образцов крови из 465 от новорожденных детей были исследованы параллельно с помощью тест-систем «АмплиСенс ДНК-ВИЧ-96 М» и «Amplicor HIV-1 test». При этом не было выявлено ни одного дискордантного результата, что свидетельствует об одинаковой диагностической чувствительности тестов.

Для оценки диагностической информативности тест-системы «АмплиСенс ДНК-ВИЧ-96 М» (в рамках государственных испытаний на базе ГИСК им. Л.А. Тарасевича) были протестированы образцы крови детей, рожденных от ВИЧ-инфицированных матерей: 12 детей с неустановленным диагнозом ВИЧ-инфекции и 5  детей с установленным диагнозом. Из 12 образцов от детей в возрасте до 6 месяцев с неустановленным диагнозом ВИЧ-инфекции в 5 была обнаружена ДНК провируса ВИЧ. У остальных 7 детей были отрицательные результаты ПЦР-анализа. При повторном исследовании образцов крови через 6 месяцев после первого исследования у тех же детей были получены такие же результаты, что и в первый раз. Для образцов крови от 5 детей с установленным диагнозом ВИЧ-инфекции были получены положительные результаты ПЦР-анализа.

Результаты, полученные с помощью ПЦР-анализа, были подтверждены исследованием сывороток от этих детей в иммунном блоте (ИБ). Все дети, получившие положительный результат ПЦР-анализа, имели полный белковый профиль антител к ВИЧ. У детей с отрицательным результатом ПЦР-анализа при первом исследовании сывороток в ИБ наблюдался весь спектр антител к ВИЧ, при повторном исследовании результаты ИБ у этих детей были отрицательными, кроме одного образца, в котором были выявлены только антитела к р24-антигену.

Для определения места разработанного молекулярно-генетического подхода в диагностике ВИЧ-инфекции была исследована кровь от 205 взрослых ВИЧ-инфицированных лиц, проживающих в различных регионах Российской Федерации. Исследование показало, что с помощью тест-системы «АмплиСенс ДНК-ВИЧ-96 М» в 100% случаев была выявлена ДНК провируса ВИЧ. Исследование тех же пациентов на наличие РНК ВИЧ в плазме крови показало, что в 11 образцах (5%) РНК ВИЧ не выявлялась (при использовании тест-системы «LCx HIV RNA Quantitative assay» с чувствительностью 178 копий/мл). Этот факт еще раз доказывает необходимость использования ДНК-тестов для верификации диагноза ВИЧ-инфекции.

В результате проведенных исследований было показано, что разработанные тест-системы не уступают импортным тест-системам по аналитическим и диагностическим характеристикам. Кроме того, отечественные тесты обладают такими преимуществами как наличие стандартизованного метода выделения, эндогенного внутреннего контроля, использование праймеров, комплиментарных наиболее консервативной области генома ВИЧ, и эффективно выявляющих варианты вируса, представленные на территории РФ.

Наличие зарегистрированных тест-систем в России и продемонстрированная их высокая эффективность для ранней диагностики ВИЧ у новорожденных детей способствовали появлению в 2011 году санитарно-эпидемиологических правил СП 3.1.5. 2826-10 «Профилактика ВИЧ-инфекции», согласно которым диагноз ВИЧ-инфекции может быть снят новорожденному ребенку в возрасте 4-6 месяцев на основании результатов ПЦР-диагностики.

Использование нового подхода, основанного на одновременном выявлении нуклеиновых кислот ВИЧ и вирусов гепатита В и С, для повышения инфекционной безопасности донорской крови

При разработке молекулярно-генетического подхода, предназначенного для скрининга донорской крови, учтены особенности работы различных станций переливания крови от крупных, обрабатывающих более 200-300 образцов крови в день, до небольших лабораторий.

В основу разработанного подхода был положен метод Real-Time ПЦР и использование многоканального (не менее 4 каналов) прибора, что позволило одновременно выявлять нуклеиновые кислоты (НК) трех наиболее актуальных вирусных агентов (ВИЧ, вирусов гепатита В и С). Для экстракции НК из плазмы крови предложено две методики, обладающие одинаковой эффективностью. Кроме того, предложен автоматический способ пробоподготовки, предполагающий использование прибора easyMAG (bioMerioux, Франция), который позволяет проводить экстракцию НК из 240 образцов крови в формате мини-пула менее чем за 1 час. Одной из ключевых особенностей разработанного подхода является формат тестирования мини-пулов. В отличие от общепринятого понятия о мини-пул-тестировании (когда анализируется аликвота из общего пула, состоящего из нескольких индивидуальных образцов, чаще от 8 до 24), использование прибора easyMAG позволяет тестировать мини-пул из 10 образцов целиком, что способствует сохранению высокой эффективности выявления инфекционных агентов при увеличении пропускной способности теста.

В результате была разработана ПЦР-тест-система, позволяющая одновременно выявлять три вирусных маркера (РНК вирусов гепатита С и ВИЧ и ДНК вируса гепатита В) в одном образце крови, обладая при этом высокими аналитическими показателями (табл. 2) и низкой себестоимостью.

Таблица 2.

Аналитическая чувствительность тест-системы на модельных образцах, содержащих НК ВГС, ВИЧ и ВГВ

Концентрация препарата

Результат-ВИЧ

Результат-ВГС

Результат-ВГВ

ВГС

(МЕ/мл)

ВИЧ

(копий/мл)

ВГВ

(копий/мл)

10

105

106

+

+

+

106

105

20

+

+

+

106

50

106

+

+

+

Для оценки возможности использования молекулярно-генетических методов для скрининга донорской крови было протестировано 1303 образца донорской крови в формате мини-пулов на базе Московской Областной станции переливания крови. В результате было выявлено 2 пула, позитивных по РНК HCV, в ходе расшифровки этих пулов были выявлены индивидуальные образцы, содержащие РНК HCV. В одном из этих образцов (и, соответственно, пулов) была также выявлена РНК ВИЧ. Одновременный анализ этих образцов с помощью ИФА показал наличие антител к HCV в обоих образцах и антитела к ВИЧ в одном образце. Также был выявлен один мини-пул, позитивный по ДНК HBV, выявленный после расшифровки индивидуальный образец содержал HBs антиген (подтверждено ИФА).

Несмотря на то, что в процессе исследования донорской крови не было выявлено ни одного образца от донора, находящегося в фазе серологического окна, полученные результаты продемонстрировали полную сходимость результатов ИФА и ПЦР. ПЦР-анализ в данном случае позволил увеличить надежность серологических исследований.

Для снижения риска вирусного инфицирования донорской крови, связанного с наличием серологического окна, был разработан алгоритм использования  молекулярно-генетических методов для скрининга донорской крови, начиная с этапа забора крови у донора и заканчивая интерпретацией результатов и выбраковкой инфекционно опасных образцов.

Обоснование молекулярно-генетических подходов при конструировании тест-систем для определения вирусной нагрузки ВИЧ и оценка их эффективности при АРВ терапии у ВИЧ-инфицированных пациентов

В третьей главе диссертации представлены результаты разработки ПЦР-тест-систем «АмплиСенс ВИЧ Монитор» и «АмплиСенс ВИЧ-Монитор-FRT», предназначенных для определения вирусной нагрузки ВИЧ, которые с одной стороны не уступают по своим аналитическим характеристикам зарубежным тест-системам, а с другой стороны отличаются низкой себестоимостью и являются «открытыми» системами, т.е. для работы с ними не требуется приобретение специального оборудования. Разработанные тест-системы рассчитаны на лаборатории с разным уровнем оснащения и степенью загруженности.

Разработка количественных тест-систем состояла из 4 основных этапов:

1 этап - разработка нескольких методов выделения РНК из образца плазмы крови, позволяющих проводить экстракцию РНК с одинаковой эффективностью. (Возможность проведения экстракции разными способами дает возможность врачам-лаборантам самостоятельно выбирать удобный для них метод в зависимости от предпочтений и наличия оборудования.);

2 этап - выбор праймеров для ПЦР и оптимизация условий ОТ-ПЦР (реакция обратной транскрипции, совмещенная с ПЦР);

3 этап - разработка методов детекции продуктов ПЦР;

4 этап - разработка количественных стандартов.

Для экстракции РНК ВИЧ из плазмы крови было разработано два «ручных» варианта пробоподготовки (один основан на методе сорбции НК на силикагеле, второй – на методике осаждения НК с помощью изопропанола) и один автоматический вариант с использованием прибора easyMAG, который позволяет не только увеличить производительность анализа, но и повысить чувствительность в 10 раз за счет возможности тестирования большого объема клинического материала, вплоть до 1 мл.

Эффективность работы выбранных праймеров (описанных в главе 1 диссертации) была проанализирована на панели образцов, содержащих ВИЧ 10 субтипов, в сравнении с двумя зарубежными коммерческими тест-системами (табл. 3).

Таблица 3.

Количественное определение РНК 10 субтипов ВИЧ-1 с помощью тест-системы «АмплиСенс ВИЧ Монитор» в сравнении с двумя коммерческими тест-системами

Субтипы ВИЧ-1

Концентрация РНК ВИЧ (копии/мл), измеренная с помощью трех тест-систем

«Amplicor HIV-1 Monitor v. 1.5»

«LCx HIV RNA Quantitative assay»

«АмплиСенс ВИЧ Монитор»

С

3,68x103

3,54х103

1,62х104

H

1,25x104

5,40х103

1,58х104

A

4,31x103

3,80х103

1,17х104

N

2,63x103

596

500

B

2,26x103

2,51х103

4,18х103

E

5,05x103

3,89х103

1,12х104

O

-

-

-

D

2,81x103

6,68х103

1,47х104

G

4,82x103

3,36х103

2,46х103

F

5,08x103

5,12х103

5,96х103

Результаты оценивали, рассчитывая разницу lg (копий РНК/мл) между результатами, значимыми отличиями считали разницу в более чем 0,5 lg. Для большинства образцов, содержащих ВИЧ группы М (A, B, C, E, F, G, H) значимых отличий между результатами, полученными с помощью трех проанализированных тест-систем, выявлено не было.

Для проведения реакций обратной транскрипции (ОТ) и ПЦР было разработано два варианта одностадийной ОТ-ПЦР, отличающихся используемым ферментом обратной транскриптазой (AMV либо MLV).

Главной частью разработки количественных тестов является создание РНК-стандартов, в частности, положительных контрольных образцов (ПКО) и внутреннего контрольного образца (ВКО). Для создания РНК-стандартов, защищенных от действия РНКаз, было предложено два метода упаковки РНК: в ретровирусные частицы и РНК-фаги. Во все РНК-конструкции клонировали фрагмент гена gag ВИЧ-1, который был необходим для последующего определения концентрации РНК в созданных препаратах с помощью тест-системы «Amplicor HIV-1 Monitor» (Хоффманн-Ла Рош), поскольку используемые в данной тест-системе праймеры комплиментарны области gag генома ВИЧ.

В основе разработанных количественных тест-систем лежит подход, основанный на амплификации исследуемого образца в присутствии ВКО, который проходит через все этапы ПЦР-анализа и выполняет функцию количественного стандарта. При разработке ВКО была сконструирована последовательность, максимально похожая по нуклеотидному составу на анализируемый фрагмент генома ВИЧ. Для каждой из разработанных тест-систем была подобрана оптимальная концентрация ВКО, которая бы не конкурировала с исследуемой матрицей ВИЧ в ходе амплификации и детекции.

В результате было разработано две тест-системы с разным способом детекции продуктов амплификации: традиционная ПЦР с ГИФА-детекцией («АмплиСенс ВИЧ Монитор») и Real-Time ПЦР («АмплиСенс ВИЧ-Монитор-FRT»). Разработанные тест-системы не дублируют, а дополняют друг друга. Так, для работы с тест-системой, основанной на традиционной ПЦР с ГИФА-детекцией, не требуется закупка дорогостоящего оборудования, и поэтому она незаменима в небольших лабораториях. Тест-система, основанная на методе Real-Time ПЦР, позволяет увеличить возможности лаборатории в несколько раз, однако для работы с ней требуется соответствующий прибор. Поэтому данная тест-система предназначена для более крупных лабораторий. Кроме того, для работы с этой тест-системой предусмотрена автоматизация этапа пробоподготовки ПЦР-анализа, что упрощает работу крупных лабораторий.

В ходе Государственных испытаний тест-системы «АмплиСенс ВИЧ Монитор», которые проходили в ГИСК им. Л.А. Тарасевича, была продемонстрирована высокая корреляция количественных результатов (коэффициент корреляции составил 0,93; pv < 0,001), полученных с помощью разработанной тест-системы, и результатов, полученных с помощью наиболее активно используемой в мире тест-системы «Cobas Amplicor HIV-1 Monitor v. 1.5» (рис. 1).

Рис. 1. Корреляция результатов измерения вирусной нагрузки (в lg копий/мл) с помощью тест-систем «Cobas Amplicor HIV-1 Monitor v. 1.5» и «АмплиСенс ВИЧ Монитор».

По оси абсцисс: концентрация РНК ВИЧ (lg копий РНК/мл), измеренная с помощью тест-системы «Cobas Amplicor HIV-1 Monitor v. 1.5»; по оси ординат: концентрация РНК ВИЧ (lg копий РНК/мл), измеренная с помощью тест-системы «АмплиСенс ВИЧ Монитор».

Высокая степень совпадения результатов была также выявлена при тестировании международного стандарта и стандартного образца предприятия (разница не превышала 0,2 lg) (табл. 4).

Таблица 4.

Результаты измерения концентрации РНК ВИЧ в образцах международного стандарта и СОП РНК ВИЧ

Образцы

Разведение

Концентрация РНК ВИЧ (копии/мл), измеренная с помощью двух тест-систем

«АмплиСенс ВИЧ Монитор»

«Cobas Amplicor HIV-1 Monitor»

Международный стандарт

Исходное

35000

55000

1:10

6000

5600

1:100

< 500

417

СОП

Исходное

38000

54000

60000

52000

1:10

7600

10000

9300

НД*

1:100

1700

2200

НД*

1100

2000

1300

* нет данных

Другая задача исследования заключалась в сравнительной оценке двух разработанных и двух импортных тест-систем на образцах, полученных от российских пациентов. Высокая степень корреляции результатов (коэффициенты корреляции превышали 0,9 (pv>0,001) свидетельствует о сходных диагностических показателях разработанных тестов и импортных. Анализ выявленных дискордантных результатов показал, что большая их часть (9 образцов из 15) связана с получением «заниженных» результатов в тест-системе «Abbott Real-Time HIV-1», что говорит о недостатках данного теста при использовании на территории РФ. Что касается разработанных тест-систем «АмплиСенс», была продемонстрирована высокая степень корреляции результатов, полученных с помощью обеих тест-систем и «Cobas Amplicor HIV-1 Monitor v. 1.5».

Из 95 образцов, в которых концентрация РНК находилась внутри линейного диапазона четырех тест-систем, было выявлено 15 дискордантных образцов (табл. 5). Для 6 образцов из 15 были получены значительно отличающиеся результаты в тест-системе «Abbott Real-Time HIV-1» по сравнению с тремя другими тест-системами (lg превышала 0,5 во всех случаях). Еще в 3 образцах из 15 (№№ 11, 65 и 35) были получены более низкие значения в тест-системе «Abbott Real-Time HIV-1», однако lg превышала 0,5 только при сравнении с одной из трех тест-систем (либо «Cobas Amplicor HIV-1 Monitor v. 1.5», либо одной из тест-систем «АмплиСенс»).

Таблица 5.

Дискордантные результаты (в lg копий РНК/мл), полученные при исследовании вирусной нагрузки в образцах с помощью четырех тест-систем.

№ образца

«Cobas Amplicor»

«Abbott Real-Time»

«АмплиСенс ВИЧ Монитор»

«АмплиСенс ВИЧ-Монитор-FRT»

Генотип

1

4,56

3,51

4,39

4,47

А

54

4,57

3,59

4,32

4,61

А

112

3,24

2,5

3,49

3,73

А

115

3,8

3,28

4,11

4,14

А

167

3,09

4,03

2,9

2,9

АG

113

3,19

2,61

3,37

3,7

A

48

4,86

5,34

5,4

5,4

А

164

3,6

3,68

2,86

2,69

G

11

4,4

3,85

4,3

4,45

А

65

5,05

4,51

4,88

5

А

35

4,59

4,23

4,8

4,76

НД

* Жирным шрифтом выделены результаты, достоверно отличающиеся от остальных (т.е. lg>0,5); НД – нет данных.

Разработанные тест-системы прошли Государственные испытания в ГИСК им. Л.А. Тарасевича и разрешены к использованию на территории РФ. С 2005 года данные тест-системы поставляются в региональные Центры СПИД за счет федерального бюджета наравне с импортными тестами.

Разработан алгоритм проведения лабораторного исследования, связанного с определением вирусной нагрузки ВИЧ. Впервые описаны в деталях требования по организации лаборатории и правила работы в ней, а также очень подробно описан алгоритм интерпретации результатов анализа.

Стандартизация молекулярно-генетических исследований при диагностике ВИЧ-инфекции

В главе 4 диссертации представлены результаты разработки первой в России стандартной панели контрольных образцов, содержащих ВИЧ. Данная панель содержит варианты ВИЧ наиболее распространенного в России субтипа А, кроме того, образцы панели различаются содержанием РНК ВИЧ в диапазоне от 103 до 105 копий/мл. Для того чтобы количественно охарактеризовать контрольные образцы, они были протестированы с помощью коммерческих тест-систем, широко используемых в России для определения концентрации РНК ВИЧ в плазме крови: «Abbott Real-Time HIV-1», «Cobas Amplicor HIV-1 Monitor v.1.5», «АмплиСенс ВИЧ Монитор» и «АмплиСенс ВИЧ Монитор-FRT» (рис. 2).

Рис. 2. Результаты тестирования образцов панели контрольных образцов, содержащих РНК ВИЧ, с помощью четырех тест-систем.

A)        образец ВИЧ субтипа А с концентрацией 103 копий/мл;

B)        образец ВИЧ субтипа G с концентрацией 103 копий/мл;

C)        образец ВИЧ субтипа А с концентрацией 104 копий/мл;

D)        образец ВИЧ субтипа А с концентрацией 105 копий/мл.

Из полученных результатов видно, что имеет место зависимость результатов измерения вирусной нагрузки в образцах от используемой для измерения тест-системы. Во всех случаях наблюдались более низкие значения, полученные с помощью тест-системы Cobas Amplicor HIV-1 Monitor v.1.5. Однако, стоит отметить, что статистически достоверных отличий между результатами, полученными с помощью разных тест-систем, выявлено не было.

В ходе приготовления образцов панели исходный препарат очищали криопреципитированием и фильтрованием, добавляли консервант. Приготовленные образцы аликвотили, высушивали и хранили при температуре минус 700С. Образцы панели продемонстрировали стабильность при хранении (табл. 6), что позволяет транспортировать образцы в отдаленные регионы страны без соблюдения строгих требований к температурному режиму.

Таблица 6.

Характеристика стабильности* образцов панели, содержащих РНК ВИЧ, при различных температурах

Температура хранения

1 месяц

2 месяца

4 месяца

- 70 С

+

+

+

- 20 С

+

+

+

+ 2-8 С

+

+

+/- (0,25-0,3 lg)

комнатная

+

+

*стабильность образцов оценивали путем измерения концентрации РНК ВИЧ

Разработанная панель контрольных образцов впервые в России была использована в цикле ФСВОК (Федеральная система внешней оценки качества клинических лабораторных исследований) для проведения контроля качества исследований в области ПЦР-диагностики ВИЧ-инфекции. Первые результаты, полученные от участников цикла, подтвердили необходимость тщательной количественной аттестации образцов панели (рис. 3).

Рис. 3. Сопоставимость результатов определения концентрации РНК ВИЧ, полученных лабораториями-участниками, с аттестованными значениями.

A)        образец ВИЧ субтипа А с концентрацией 103 копий/мл;

B)        образец ВИЧ субтипа G с концентрацией 103 копий/мл;

C)        образец ВИЧ субтипа А с концентрацией 104 копий/мл;

D)        образец ВИЧ субтипа А с концентрацией 105 копий/мл.

Из рисунков видна высокая сходимость результатов, что позволяет полагать, что разработанная панель правильно аттестована и может быть рекомендована для изучения в качестве отраслевого стандартного образца.

Результаты, полученные от лабораторий-участников, были проанализированы на предмет правильности определения положительных и отрицательных контрольных образцов. Ложноположительных результатов не получила ни одна лаборатория. В тоже время ложноотрицательных результатов было получено много, в основном, для образцов с низкой концентрацией РНК ВИЧ (табл. 7).

Таблица 7.

Анализ ложноотрицательных (ЛО) результатов, полученных лабораториями-участниками

Контрольные образцы

Количественные методы

Качественные методы

число ЛО ответов

число лабораторий

число ЛО ответов

число лабораторий

ВИЧ субтипа А 1,3х103коп/мл

1

2

1

2

2

1

ВИЧ субтипа G 1,9х103коп/мл

2

1

1

1

2

1

ВИЧ субтипа А ВИЧ субтипа G ~103коп/мл

2

6

1

Образцы с концентрацией порядка 105 и 104 копий/мл были выявлены практически всеми участниками, образцы с концентрацией порядка 103 копий/мл были выявлены в 100% случаев только в 26 лабораториях из 37 (70%).

В результате проведенных исследований удалось сделать предварительные выводы по качеству проводимых исследований в различных лабораториях, включая качество используемых тест-систем.

Использование генотипических методов определения лекарственной устойчивости ВИЧ для совершенствования АРВ-терапии и эпидемиологического надзора за первичной резистентностью ВИЧ

Создание тест-системы для определения мутаций устойчивости ВИЧ к АРВ препаратам проводилось в несколько этапов:

  1. этап - выбор фрагментов ВИЧ, необходимых для анализа основных мутаций, ответственных за устойчивость вируса к наиболее распространенным АРВ препаратам;
  2. этап - выбор праймеров для амплификации выбранных фрагментов ВИЧ;
  3. этап - подбор оптимальных условий и формата амплификации;
  4. этап - разработка маркера молекулярных масс;
  5. этап - разработка оптимального алгоритма определения концентрации продукта амплификации;
  6. этап - выбор оптимального способа очистки продуктов амплификации для последующего секвенирования ДНК;
  7. этап - разработка алгоритма интерпретации результатов секвенирования.

Поскольку основными препаратами для лечения ВИЧ-инфекции являются ингибиторы двух ферментов ВИЧ: обратной транскриптазы и полимеразы, были выбраны праймеры, фланкирующие последовательность всего гена протеазы и последовательность участка гена обратной транскриптазы длиной более 700 п.н. (кодоны 30 - 285).

При выборе праймеров пришлось ограничиться областями ВИЧ с достаточно высокой изменчивостью, поэтому был выбран формат амплификации - Nested ПЦР (или двухраундная ПЦР), которая позволяет решить проблему изменчивости и наработать достаточное количество ампликонов для последующего анализа нуклеотидной последовательности.

Для проведения визуальной оценки количества продукта амплификации был разработан маркер молекулярных масс. Для этого был амплифицирован неспецифический фрагмент размером 800 п.н., его концентрацию определили спектрофотометрически. Далее исходный препарат разводили до концентраций 20 и 10 нг/мкл. Был разработан алгоритм визуальной оценки концентрации продуктов амплификации путем сравнения интенсивности окраски ампликона в агарозном геле и двух маркеров.

Для дальнейшего проведения реакции циклического секвенирования необходимо проводить очистку продуктов амплификации. При подборе оптимального варианта очистки ампликонов изменяли следующие параметры: число отмывок, состав отмывочных буферов, объем и температуру элюции ДНК. В результате был выбран оптимальный вариант, включающий сорбцию ДНК на силикагеле, две отмывки и элюцию в 50 мкл деионизованной воды.

Реакцию циклического секвенирования, очистку продуктов реакции секвенирования и автоматическую детекцию продуктов проводили согласно инструкции к набору реагентов и прибору, используемого для секвенирования. Для секвенирования могут быть использованы реактивы и приборы различных фирм-производителей (например, «Applied Biosystems» и «Beckman Coulter»).

Полученную в результате секвенирования нуклеотидную последовательность анализировали с помощью программы, представленной в свободном доступе на сайте лаборатории диагностической вирусологии Госпиталя Стенфордского Университета (Stanford University Hospital) http://hiv-4.stanford.edu/cgi-bin/hivseq-web.pl. Данная программа позволяет не только выявлять все мутации, ответственные за устойчивость ко всем известным противоретровирусным препаратам, но и дает клиническую интерпретацию выявленных мутаций (виртуальное фенотипирование).

Таким образом, была разработана первая в России тест-система, позволяющая выявлять мутации, связанные с устойчивостью ВИЧ к АРВ-препаратам из классов ингибиторов протеазы и обратной транскриптазы. На сегодняшний день это единственная отечественная тест-система, разрешенная к использованию на территории РФ, и, в отличие от зарубежных тест-систем, имеет низкую себестоимость (стоимость реагентов ниже более чем в 10 раз).

Для оценки аналитической чувствительности разработанной тест-системы, получившей название «АмплиСенс ВИЧ-генотип-Eph», были проанализированы стандартные образцы плазмы крови, содержащие ВИЧ субтипов А, B и G, с известной концентрацией РНК ВИЧ (табл. 8).

Таблица 8.

Аналитическая чувствительность тест-системы «АмплиСенс ВИЧ-генотип»

Субтип

Концентрация РНК (копии/мл)

Число повторов/число положительных результатов

фрагмент гена протеазы

фрагмент гена обратной транскриптазы

А

1000

3/3

3/3

500

3/2

3/3

В

1000

3/3

3/3

500

3/2

3/3

G

1000

3/3

3/3

500

3/1

3/2

С помощью разработанной тест-системы проводилось выявление лекарственной устойчивости ВИЧ у пациентов, у которых АРВ терапия стала неэффективной, и для которых требовалось изменение терапевтической схемы. Проведенные исследования продемонстрировали, что смена терапии без учета данных о развившейся устойчивости к используемым препаратам приводит к развитию перекрестной резистентности ВИЧ к большинству известных лекарств, что является серьезной проблемой в выборе дальнейшей схемы лечения. У таких пациентов чаще встречались следующие первичные мутации в гене протеазы: M46I (100%), L90M (71%). Эти мутации приводят к возникновению разной степени устойчивости ко всем ингибиторам протеазы. У 5 пациентов из 7 (получавших в составе комбинированной терапии какой-либо препарат из группы ненуклеозидных ингибиторов обратной транскриптазы) была выявлена высокая степень устойчивости ко всем ненуклеозидным ингибиторам обратной транскриптазы. Чаще всего встречались первичные мутации K103N (71%), L100I (43%). У 10 пациентов из 11, получавших нуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы, была выявлена разной степени устойчивость к различным препаратам из данной группы. У 3 пациентов была выявлена устойчивость разной степени ко всем препаратам данного класса, у 3 – ко всем препарата, кроме 3ТС. Чаще всего выявляли устойчивость к препаратам АЗТ (90%), 3TC (60%), ко всем остальным препаратам (60%). Частота выявления специфичных мутаций была следующей: T215Y (60%) - вызывает устойчивость к АЗТ, абакавиру и D4T, M184V (60%) - вызывает устойчивость к 3ТС, абакавиру, DDI, и DDC, M41L (50%) и D67N (40%) - вызывают устойчивость к АЗТ.

Было показано, что все пациенты, которые когда-либо получали ингибиторы протеазы, имели перекрестную устойчивость ко всем препаратам этой группы. Исключение составили только 3 пациента, которые принимали единственный препарат из группы ингибиторов протеазы нельфинавир не больше 1,5 лет. У этих пациентов были выявлены те мутации, которые вызывают устойчивость только к нельфинавиру. Остальные пациенты получали несколько разных ингибиторов протеазы более 2-3 лет.

Похожая картина наблюдалась у пациентов, получавших препараты из группы ненуклеозидных ингибиторов обратной транскриптазы. Особенность заключалась в том, что для развития перекрестной резистентности к группе ненуклеозидных ингибиторов достаточно было всего одной мутации, а длительность приема этих препаратов у некоторых пациентов не превышала 1 года.

Другим важным направлением возможного использования разработанной тест-системы является изучение первичной резистентности ВИЧ к лекарственным препаратам, что было показано в сравнительных испытаниях с коммерческой тест-системой «ViroSeq HIV-1 Genotyping System» (Эбботт, США). Был проанализирован 101 образец. Показана более высокая диагностическая чувствительность отечественного теста, так в тест-системе «Viroseq» не удалось получить фрагменты для дальнейшего секвенирования для 8 образцов (табл. 9).

Таблица 9.

Концентрация РНК ВИЧ в образцах с отрицательным результатом, полученным с помощью тест-системы «ViroSeq HIV-1 Genotyping System»

№ образца

Концентрация РНК (копии/мл)

177

6,57х105

30

1,23х105

139

3,90х104

141

6,44х103

160

3,33х103

118

835

114

менее 500

135

менее 500

Как видно из приведенной таблицы, в большинстве образцов концентрация РНК превышала 1000 копий/мл (заявленная аналитическая чувствительность тест-системы «ViroSeq»).

Для 86 образцов был проведен анализ нуклеотидных последовательностей, с целью установления степени соответствия спектров мутаций,  выявленных для одного и того же образца при использовании тест-систем «АмплиСенс ВИЧ-генотип-Eph» и «ViroSeq HIV-1 Genotyping System». Рассматриваемые спектры мутаций включали как мутации, вызывающие лекарственную устойчивость, так и мутации полиморфизма.

По результатам анализа количество полностью конкордантных образцов составило 81. Было выявлено 6 несоответствий в 5 образцах (табл. 10). В ходе детального анализа результатов секвенирования ДНК было выявлено несколько причин, в соответствии с которыми дискордантные мутации были разделены на 3 группы.

Таблица 10.

Анализ дискордантных результатов, полученных с помощью двух тест-систем, предназначенных для выявления мутаций устойчивости ВИЧ

№ п/п

№ образца

Дискордантный кодон

Ген

Тест-система «ViroSeq»

Тест-система «АмплиCенс»

1

144

L63

pro

L63PT*

L63T

2

165

L63

pro

L63PL*

L63

3

165

(перестановка)

L63

pro

L63

L63

4

165

V77

pro

V77I

V77IV*

5

165

(перестановка)

V77

pro

V77IV*

V77IV*

6

123

G333

rt

G333D

не выявляется, т.к. анализируется участок до 285 кодона

7

155

G333

rt

G333E

8

1

T74S

pro

Разная клиническая интерпретация

* на хроматограмме выявляется два пика, соответствующих разным нуклеотидам;

pro – ген протеазы, rt – ген обратной транскриптазы.

Было показано, что первая группа дискордантов (пп. 1-5 таблицы 10) появилась из-за возможного присутствия в популяции вируса нескольких квазивидов, которые в ряде случаев распознавались на хроматограмме в виде нескольких пиков.

Во второй группе образцов (№№ 123 и 155) дискордантность мутаций была связана с различием в длинах анализируемых фрагментов гена обратной транскриптазы, в результате чего мутация полиморфизма G333D/E не может быть выявлена с помощью тест-системы «АмплиСенс». Поскольку мутации полиморфизма не вызывают развития устойчивости ВИЧ к АРВ препаратам, отсутствие данных по мутации G333D/E не влияет на результаты о наличии или отсутствии лекарственной устойчивости.

Наибольший интерес представляет мутация T74S в гене протеазы (образец № 1): программа «ViroSeq» расценивает эту мутацию как неизвестную или новую. По данным программы Stanford HIVDB, мутация T74S в присутствии других мутаций вызывает снижение чувствительности к нельфинавиру, которое программа интерпретирует как потенциально низкий уровень устойчивости к данному препарату. Этот факт свидетельствует о том, что на данный момент информация, заложенная в программе «ViroSeq», начинает устаревать.

Тесты по определению лекарственной устойчивости ВИЧ были использованы для оценки распространенности первичной резистентности ВИЧ в 2005 и 2007 годах. В результате проведенного исследования из 76 проанализированных образцов крови, собранных в 2005 году в Московском регионе, в 57 образцах был получен специфический амплификационный сигнал, в 19 образцах такой сигнал получен не был. В результате секвенирования фрагментов ВИЧ в 57 образцах не было обнаружено ни одной первичной мутации устойчивости ВИЧ. Поскольку в московском регионе АРВ терапия применяется с 1997 года, это позволяет делать оптимистические прогнозы относительно эффективности массового применения терапии в обследуемом регионе без предварительного тестирования резистентности у каждого пациента.

В ходе второго исследования в 2007 году из 297 образцов нуклеотидную последовательность гена pol ВИЧ-1 удалось определить в 257 (86,5%) образцах, 40 образцов дали отрицательный результат ПЦР. В результате секвенирования 257 образцов лекарственная устойчивость ВИЧ-1 высокого уровня встречалась с низкой частотой – 0,8% (ЛУ к ненуклеозидным ингибиторам обратной транскриптазы) и выражалась наличием мутации K103N в гене обратной транскриптазы. Лекарственная устойчивость низкого уровня, направленная на препараты класса ингибиторов протеазы (нельфинавир и атазанавир) обнаружена у 3 пациентов (1,2%), и была вызвана заменами M46I и M46L в гене протеазы.

Эпидемиологический надзор за распространением ВИЧ с использованием молекулярно-генетических методов

Для проведения надзора за распространением различных субтипов ВИЧ на территории РФ была разработана методика типирования, основанная на секвенировании ДНК.

Разработанная методика генотипирования ВИЧ, основанная на секвенировании четырех фрагментов генома (gag, pro, rev и env), позволяет идентифицировать с высокой точностью большинство известных подтипов ВИЧ, включая рекомбинантные формы. Для амплификации фрагмента gag были выбраны праймеры, фланкирующие область гена р24, длиной 530 п.н. Для амплификации фрагмента env были выбраны праймеры, фланкирующие область гена gp120 длиной либо 1100 п.н., либо 410 п.н. (при невозможности получения большего фрагмента). Амплификация фрагментов генома ВИЧ протеазы и обратной транскриптазы описана в главе 5 диссертации. Полученные продукты могут быть использованы как для генотипирования, так и для определения лекарственной устойчивости ВИЧ. Для генотипирования фрагменты полимеразы играют вспомогательную роль, однако для более точной идентификации некоторых рекомбининатов, например, AG, BC, BF и многих мозаичных форм, их использование целесообразно.

Амплификацию всех фрагментов проводили в два раунда (Nested - ПЦР), что позволило решить проблему чувствительности теста, связанную с изменчивостью вируса. Расшифровку нуклеотидной последовательности проводили методом секвенирования ДНК. Анализ нуклеотидных последовательностей ВИЧ, полученных в результате секвенирования ДНК, осуществляли с помощью программ, представленных в свободном доступе в Интернете: RIP 3.0 (www.hiv.lanl.gov) и NCBI Genotyping (www.ncbi.nlm.nih.gov). Эти программы позволяют определять не только все известные субтипы ВИЧ, но и их рекомбинантные формы. Выявлению рекомбинантных форм способствует также одновременный анализ четырех фрагментов генома ВИЧ.

Данная методика была использована для изучения распространенности различных вариантов ВИЧ в России в 2003 и 2007 годах. В результате было показано, что ВИЧ подтипа А сохраняет доминирующее положение: 92,3% в 2003 году и 90,3% в 2007 году. Результаты типирования ВИЧ в образцах, полученных от пациентов в разные годы, практически не менялись с 1997 года, когда субтип А стал доминировать в популяции наркоманов (Bobkov, 1997; Lukashov, 1998). В 2003 году распространенность субтипа А среди пациентов с разными путями передачи ВИЧ была сходной с данными, полученными в 1997-2003 гг. при анализе пациентов из группы наркоманов (Bobkov, 2001, 2004). Это косвенно может свидетельствовать о том, что данный субтип стал распространяться и половым путем. Рекомбинантная форма АВ, обнаруженная впервые у наркоманов, в общей популяции пациентов стала составлять небольшой процент (не более 1%).

Анализ, проведенный для образцов от ВИЧ-инфицированных пациентов в 2007 году, не выявил ни одного субтипа G (характерного для Волгоградской области), а рекомбинантная форма A/B была обнаружена только в 1 образце, что составляет менее 1%.

В 2007 году наблюдалось появление новых вариантов ВИЧ, которое требует дальнейшего детального изучения с целью выяснения их роли в общем эпидемическом процессе. Новая находка обнаружена в Алтайском крае, где с высокой частотой встречалась рекомбинантная форма A/G (более 42%). Существует вероятность того, что данный вариант ВИЧ был привнесен из Казахстана, где по данным 2001-2003 гг. рекомбинант A/G встречался с частотой 4,7% (Eyzaguirre, 2007).

ВЫВОДЫ

  1. Разработанные молекулярно-генетические подходы, предназначенные для выявления ДНК провируса ВИЧ в лейкоцитах крови, позволяют: сократить время постановки диагноза детям, рожденным от ВИЧ-инфицированных матерей, до 4-6 месяцев вместо 12-18 месяцев и подтвердить сомнительные результаты ИБ, а также проводить раннюю диагностику ВИЧ-инфекции у контактных лиц при подозрении на недавнее инфицирование.
  2. Доказана эффективность нового комплексного подхода для решения проблемы инфекционной безопасности донорской крови, включающего разработку методики и алгоритма проведения молекулярно-генетического скрининга донорской крови параллельно с уже используемым серологическим скринингом. Предложенный подход и методы его реализации позволяют повысить производительность исследования до 200-300 образцов в день при сохранении высокой эффективности выявления инфекционных агентов.
  3. Разработанные тест-системы для количественного определения РНК ВИЧ обладают высокими аналитическими и диагностическими характеристиками при более низкой по сравнению с зарубежными тест-системами себестоимости. Показана возможность их использования для оценки прогноза течения заболевания и эффективности АРВ терапии.
  4. Разработанные алгоритмы приготовления и аттестации стандартных образцов позволили создать панель стандартных образцов ВИЧ, которая может быть использована для проведения внешнего и внутрилабораторного контроля качества исследований, связанных с молекулярной диагностикой ВИЧ-инфекции.
  5. Разработанная тест-система для выявления мутаций устойчивости ВИЧ к АРВ препаратам обладает более высокими аналитическими и диагностическими показателями, а также более низкой стоимостью по сравнению с зарубежными тест-системами. Показана возможность ее использования как для раннего выявления причин неэффективности АРВ терапии и дальнейшей коррекции схемы лечения, так и для проведения эпидемиологического надзора за распространением первичной резистентности ВИЧ.
  6. Разработанная методика генотипирования ВИЧ позволяет определять большинство известных субтипов ВИЧ-1, включая рекомбинантные формы, что в свою очередь позволяет усовершенствовать эпидемиологический надзор за распространением различных вариантов ВИЧ на территории РФ, процедуру эпидемиологических расследований новых случаев инфицирования, а также диагностику ВИЧ-инфекции.
  7. С помощью разработанной методики генотипирования ВИЧ показана распространенность различных субтипов ВИЧ по России в разные годы. ВИЧ субтипа А сохраняет доминирующее положение, начиная с 1997 года, и составляет более 90% всех случаев ВИЧ-инфекции. С 2007 года показано распространение нового для России варианта ВИЧ - рекомбинантной формы A/G (7%). На остальные варианты ВИЧ приходится менее 3% всех случаев ВИЧ-инфекции.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

  1. Богословская, Е.В. Концентрирование вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) методом ультрацентрифугирования – как способ повышения чувствительности ПЦР-тест-систем для диагностики ВИЧ-инфекции. / Е.В. Богословская [и др.] // Тезисы доклада пятого Российского съезда врачей-инфекционистов. – М., 1998. – С. 40.
  2. Кравченко, А.В. Тимазид в сочетании с хивидом и инвиразой в комплексной терапии больных с ВИЧ-инфекцией. / А.В. Кравченко, Л.В. Серебровская, Е.Л. Голохвастова, Г.А. Шипулин, Е.В. Богословская и др. // Эпидемиология и инфекционные болезни. 1998. - № 5. - С. 51-53.
  3. Шипулин, Г.А. Место полимеразной цепной реакции в диагностике ВИЧ-инфекции. / Г.А. Шипулин, К.А. Саркисян, Е.В. Богословская и др. // Эпидемиология и инфекционные болезни. 1998. - № 5. - с. 59-62.
  4. Галина, М.В. Опыт двухлетнего проведения высокоэффективной антиретровирусной терапии (ВААРТ) ВИЧ-инфекции. / М.В. Галина, Е.Л. Голохвастова, Н.М. Моргунова, А.В. Кравченко, Б.М. Груздев, Е.В. Богословская. // Русский журнал ВИЧ/СПИД и родственные проблемы. - 1999. – Т. 3. - № 1. - с. 126-127.
  5. Богословская, Е.В. Разработка и апробация ПЦР-тест-системы для качественного обнаружения РНК ВИЧ. / Е.В. Богословская, Г.А. Шипулин, О.Ю. Шипулина, В.В. Покровский. // Аллергия, астма и клиническая иммунология. – 1999. - № 9. – с. 142-144.
  6. Богословская, Е.В. Определение концентрации РНК ВИЧ с помощью ПЦР-тест-системы «Ампликор ВИЧ-1 Монитор» для оценки эффективности комбинированной терапии ВИЧ-инфекции. / Е.В. Богословская [и др.] // Сборник тезисов докл. 3-й Всероссийской научно-практической конференции. – М., 2000. – с. 236-237.
  7. Шипулин, Г.А. Разработка методики для количественного определения РНК ВИЧ в плазме крови и сравнение ее с зарубежными аналогами. / Г.А. Шипулин, Е.В. Богословская, В.В. Покровский. // Тезисы докладов 1-ой Всероссийской научно-практической конференции. Генная диагностика особо опасных инфекций. – Саратов, 2000. – с. 50.
  8. Kravtchenko, A.V. The first experience of HAART with Phosphazid+Didanosine+Nevirapin in HIV-infected patients in Russia. / A.V. Kravtchenko, G.G. Salamov, L.V. Serebrovskaya, E.V. Bogoslovskaya et al. // AIDS. – 2000. – Vol. 14. – Suppl. 4. – S 17.
  9. Богословская, Е.В. Определение концентрации РНК ВИЧ для оценки эффективности комбинированной терапии ВИЧ-инфекции. / Е.В. Богословская, Г.А. Шипулин, В.В. Покровский и др. // Клиническая лабораторная диагностика. 2001. - № 2. с. 15-19.
  10. Шипулин, Г.А. Отечественная ПЦР-тест-система для количественного определения РНК ВИЧ в плазме крови. / Г.А. Шипулин, Е.В. Богословская, Г.М. Цыганова и др.// Эпидемиология и инфекционные болезни. 2001. - № 1. с. 40-43.
  11. Кравченко, А.В. Трехкомпонентная комбинированная антиретровирусная терапия с применением ингибиторов обратной транскриптазы ВИЧ. / А.В. Кравченко, Г.Г. Саламов, Е.В. Богословская и др. // Эпидемиология и инфекционные болезни. 2001. - № 4. с. 32-35.
  12. Богословская, Е.В. Первый опыт определения мутаций, вызывающих лекарственную устойчивость ВИЧ при противоретровирусной терапии ВИЧ-инфицированных пациентов в России. / Е.В. Богословская [и др.] // Материалы 8-ого съезда Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. – Москва, 2002. – с. 94-95.
  13. Богословская, Е.В. Развитие лекарственной устойчивости ВИЧ у пациентов, получавших противоретровирусную терапию больше года. / Е.В. Богословская [и др.] // Сборник тезисов 4-й Всероссийской научно-практической конференции. Генодиагностика инфекционных заболеваний. – Москва, 2002. – с. 104-105
  14. Шипулин, Г.А. Создание РНК-стандартов, защищенных от действия РНКаз. / Г.А. Шипулин, Е.В. Богословская. // Сборник тезисов 4-й Всероссийской научно-практической конференции. Генодиагностика инфекционных заболеваний. – Москва, 2002. – с. 419-420
  15. Богословская, Е.В. Автоматизация методов экстракции нуклеиновых кислот из биологических образцов. / Е.В. Богословская [и др.] // Сборник тезисов 4-й Всероссийской научно-практической конференции. Генодиагностика инфекционных заболеваний. – Москва, 2002. – с. 398-399
  16. Богословская, Е.В. Первый опыт использования отечественной ПЦР-тест-системы для скрининга донорской крови. / Е.В. Богословская [и др.] // Сборник тезисов 4-й Всероссийской научно-практической конференции. Генодиагностика инфекционных заболеваний. – Москва, 2002. – с. 142-143
  17. Кравченко, А.В. Комбинированная антиретровирусная терапия больных ВИЧ-инфекцией с использованием «усиленных» ингибиторов протеазы ВИЧ. / А.В. Кравченко, Ю.Р. Ситдыкова, Л.В. Серебровская, Е.В. Богословская и др. // Инфекционные болезни. 2003. - № 1. с. 14-19.
  18. Богословская, Е.В. Оценка диагностической эффективности первой Российской тест-системы для количественного определения РНК ВИЧ в плазме крови «АмплиСенс ВИЧ Монитор». / Е.В. Богословская [и др.] // Материалы 1-й Международной научно-практической конференции «Специфическая диагностика инфекционных болезней» - Киев, 2004. – с. 6.
  19. Bogoslovskaya, E. Multiplex real-time PCR assay for detection of HCV and HIV RNA and HBV DNA in blood donations. / E. Bogoslovskaya, G. Tsyganova, G. Shipulin. // 1st International qPCR Symposium and Application Workshop. Freising-Weihenstephan, Germany, 3-6 March 2004; Abstract 5.
  20. Кравченко, А.В. Антиретровирусная терапия острой ВИЧ-инфекции. / А.В. Кравченко, А.В. Мирошниченко, В.В. Беляева, Л.В. Серебровская, Е.В. Богословская и др. // Терапевтический архив. - 2004. -  № 4.- С.15-18.
  21. Кравченко, А.В. Эффективность и безопасность схемы ВААРТ, содержащей препарат «Калетра». / А.В. Кравченко, Ю.Р. Ситдыкова, Е.В. Богословская и др. // Материалы Международной научно-практической конференции по вопросам ВИЧ-инфекции и вирусных парентеральных гепатитов – Суздаль, 2004. – с. 166-168.
  22. Богословская, Е.В. Определение лекарственной устойчивости ВИЧ у пациентов, получавших противоретровирусную терапию. / Е.В. Богословская, Г.А. Шипулин, Л.Ю. Башкирова и др. // Эпидемиология и инфекционные болезни. 2004. - № 4. с. 38-42.
  23. Башкирова, Л.Ю. Оптимизация метода выделения провирусной ДНК вируса иммунодефицита человека из цельной крови. / Л.Ю. Башкирова, Е.В. Богословская, Г.А. Шипулин. // Сборник трудов 5-ой Всероссийской научно-практической конференции. Генодиагностика инфекционных болезней. – Москва, 2004. – с. 169-172.
  24. Богословская, Е.В. Разработка модифицированной версии тест-системы «АмплиСенс-ДНК-ВИЧ-96 М». / Е.В. Богословская, Л.Ю. Башкирова, Г.А. Шипулин. // Сборник трудов 5-ой Всероссийской научно-практической конференции. Генодиагностика инфекционных болезней. – Москва, 2004. – с. 173-180.
  25. Богословская, Е.В. Сравнение двух тест-систем для количественного определения РНК ВИЧ в плазме крови «Cobas Amplicor HIV-1 Monitor v. 1.5» и «LCX HIV RNA Quantitative Assay» в процессе клинических испытаний с использованием образцов крови от Российских пациентов, инфицированных ВИЧ. / Е.В. Богословская [и др.] // Сборник трудов 5-ой Всероссийской научно-практической конференции. Генодиагностика инфекционных болезней. – Москва, 2004. – с. 180-188.
  26. Покровский, В.И. Использование молекулярно-биологических тестов для скрининга донорской крови: Российский опыт. / В.И. Покровский, Е.В. Богословская, Г.А. Шипулин. // Здравоохранение и медицинская техника. – 2004. - № 8(12). – с. 20-22.
  27. Богословская, Е.В. Результаты испытаний отечественной ПЦР-тест-системы «АмплиСенс ВИЧ Монитор» для количественного определения РНК ВИЧ в плазме крови пациентов. / Е.В. Богословская, И.Н. Манзенюк, К.А. Саркисян и др. // Биопрепараты. –2005. - №2(18), стр.21-25.
  28. Sukhanova, A.L. The IDU-A HIV-1 variants harbouring both V77I protease and A62V RT mutations are spreading rapidly within the territory of Russia. / A.L. Sukhanova, E.V. Bogoslovskaya, N. I. Roudinskii et al. // Abstract book of the 3rd IAS Conference on HIV Pathogenesis and Treatment. Rio de Janeiro, Brazil, 24-27 July 2005, p.280. Abstract WePe4.1C13.
  29. Cуханова, А.Л. Полиморфизм области генома, кодирующей протеазу и обратную транскриптазу, вариантов ВИЧ-1 подтипа А, распространенных на территории СНГ. / А.Л. Cуханова, Н.И. Рудинский, Е.В. Богословская и др.  // Молекулярная биология. 2005 - № 39 (6), с. 1063-1071.
  30. Bogoslovskaya, E.V. Genetic polymorphism of HIV-1 in Russia. / E.V. Bogoslovskaya [et al.] // The 10-th European AIDS Conference (EACS). Dublin, Ireland. 17-20 November, 2005. – Abstract book. P. 31.
  31. Башкирова, Л.Ю. Определение мутаций устойчивости при применении комбинированной терапии ВИЧ-инфекции. / Л.Ю. Башкирова, А.И. Круглова, Е.В. Богословская и др. // Материалы Российской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных болезней». – Новосибирская обл. – 2005 – с. 31-33.
  32. Зайцев, В.С. Разработка тест-системы «АмплиСенс ДНК-ВИЧ-FRT» на основе метода Real-time ПЦР для выявления ДНК ВИЧ в цельной крови. / В.С. Зайцев, А.И. Круглова, Е.В. Богословская и др. // Материалы Российской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных болезней». – Новосибирская обл. – 2005 – с. 41-43.
  33. Зайцев, В.С. Разработка тест-системы «АмплиСенс РНК-ВИЧ-FRT» на основе метода Real-time ПЦР для выявления РНК ВИЧ в плазме крови. / В.С. Зайцев, А.И. Круглова, Е.В. Богословская и др. // Материалы Российской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных болезней». – Новосибирская обл. – 2005 – с. 44-47.
  34. Цыганова, Г.М. Клинические испытания тест-системы «VERSANT HIV-1 RNA 3.0 Assay (bDNA)» на территории РФ. / Г.М. Цыганова, Е.В. Богословская, А.И. Круглова и др. // Материалы Российской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных болезней». – Новосибирская обл. – 2005 – с. 75-78.
  35. Зайцев, В.С. Разработка и апробация тест-системы «АмплиСенс ДНК-ВИЧ-FRT» на основе метода Real-time ПЦР для выявления ДНК ВИЧ в цельной крови. / В.С. Зайцев, А.И. Круглова, Е.В. Богословская и др. // Материалы Международной научно-практической конференции «Геномные технологии в медицине и медицинское образование на рубеже веков». – Республика Казахстан, Алматы. – 2006 – с. 28-30.
  36. Круглова, А.И. Выявление  мутаций устойчивости ВИЧ к антиретровирусным препаратам: российский опыт. / А.И. Круглова, Е.В. Богословская, Л.Ю. Башкирова и др. // Материалы Международной научно-практической конференции «Геномные технологии в медицине и медицинское образование на рубеже веков». – Республика Казахстан, Алматы. – 2006 – с. 31-33.
  37. Круглова, А.И. Разработка тест-систем для комплексной диагностики в Службе переливания крови. / А.И. Круглова, Е.В. Богословская, Г.М. Цыганова и др. // Материалы Международной научно-практической конференции «Геномные технологии в медицине и медицинское образование на рубеже веков». – Республика Казахстан, Алматы. – 2006 – с. 202-205.
  38. Богословская, Е.В. Разработка и клиническая апробация тест-системы для  выявления мутаций устойчивости ВИЧ к противоретровирусным препаратам. / Е.В. Богословская [и др.] // Тезисы докладов III Российской научной конференции с международным участием «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера». – Новосибирск, 2006 – с. 67-68.
  39. Круглова, А.И. Результаты порогового исследования по резистентности к антиретровирусным препаратам в г. Москве и Московской области. / А.И. Круглова, Е.В. Богословская, Л.Ю. Башкирова, Г.А. Шипулин. // Тезисы докладов III Российской научной конференции с международным участием «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера». – Новосибирск, 2006 – с. 72-74.
  40. Богословская, Е.В. Разработка и клиническая апробация тест-системы «АмплиСенс ВИЧ Монитор-FRT» для определения концентрации РНК ВИЧ в плазме крови на основе метода Real-Time ПЦР. / Е.В. Богословская [и др.] // Молекулярная диагностика инфекционных болезней. Международная научно- практическая конференция, Минск. 2007. - с. 36-37
  41. Богословская, Е.В. Использование автоматического экстрактора easyMAG для выделения РНК ВИЧ из плазмы крови с последующим количественным определением с помощью тест-системы «Cobas AMPLICOR HIV-1 Monitor v.1.5». / Е.В. Богословская [и др.] // Молекулярная диагностика инфекционных болезней. Международная научно- практическая конференция, Минск. 2007. - с. 35
  42. Богословская, Е.В. Разработка тест-системы для одновременного выявления РНК ВИЧ и вируса гепатита С (HCV) и ДНК вируса гепатита В (HBV) в образцах донорской крови. / Е.В. Богословская  [и др.] // Сборник трудов 6-ой Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика – 2007». – Москва, 2007. – том 3. - с. 215-218.
  43. Богословская, Е.В. Первая российская панель контрольных образцов плазмы крови, содержащих РНК ВИЧ. / Е.В. Богословская [и др.] // Сборник трудов 6-ой Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика – 2007». – Москва, 2007. – том 1. - с. 103-106.
  44. Богословская, Е.В. Использование прибора easyMag как универсального экстрактора нуклеиновых кислот из клинического материала для последующего ПЦР-анализа с помощью коммерческих тест-систем разных производителей. / Е.В. Богословская [и др.] // Сборник трудов 6-ой Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика – 2007». – Москва, 2007. – том 1. - с. 35-37.
  45. Зайцев, В.С. Адаптация автоматического экстрактора easyMag к тест-системам АмплиСенс для выявления и количественного определения РНК ВИЧ и вируса гепатита С. / В.С. Зайцев, Е.В. Богословская, Л.Ю. Башкирова и др. // Сборник трудов 6-ой Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика – 2007». – Москва, 2007. – том 1. - с. 41-44.
  46. Богословская, Е.В. Разработка и клиническая апробация тест-системы для количественного определения РНК ВИЧ на основе метода real-time пцр. / Е.В. Богословская [и др.] // Сборник трудов 6-ой Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика – 2007». – Москва, 2007. – том 1. - с. 107-112.
  47. Саркисян, К.А. Результаты государственных испытаний тест-системы «АмплиСенс ВИЧ-генотип». / К.А. Саркисян, Е.В. Богословская, Л.Ю. Башкирова и др. // Сборник трудов 6-ой Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика – 2007». – Москва, 2007. – том 1. - с. 137-140
  48. Ладная, Н.Н. Распространенность штаммов ВИЧ, резистентных к антиретровирусным препаратам, передающихся от пациента к пациенту на территории 6 субъектов России. / Н.Н. Ладная, Е.В. Богословская, А.Л. Суханова и др. // Сборник трудов 6-ой Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика – 2007». – Москва, 2007. – том 1. - с. 121-123
  49. Самохина, Е.Н. Использование реакции ДНК полимеризации (элонгации) на поверхности микрочипа для выявления точечных мутаций в гене протеазы ВИЧ-1, отвечающих за возникновение лекарственной резистентности. / Е.Н. Самохина, Е.В. Богословская, М.Л. Маркелов, Г.А. Шипулин. // Сборник трудов 6-ой Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика – 2007». – Москва, 2007. –том 1. – с. 55-58
  50. Богословская, Е.В. Распространенность первичной резистентности ВИЧ к антиретровирусным препаратам у ВИЧ-инфицированных пациентов в Москве и Московской области. / Е.В. Богословская, Г.А. Шипулин, Л.Ю. Башкирова и др. // Эпидемиология и инфекционные болезни. - 2007. № 6 с. 39-42.
  51. Богословская, Е.В. Результаты государственных испытаний тест-системы, предназначенной для выявления мутаций устойчивости ВИЧ к антиретровирусным препаратам. / Е.В. Богословская, Г.А. Шипулин, К.А. Саркисян и др. // Эпидемиология и инфекционные болезни. - 2008. № 3 с. 54-57.
  52. Богословская, Е.В. Скрининг донорской крови с помощью молекулярно-генетических методов. / Е.В. Богословская, Г.М. Цыганова, Г.А. Шипулин. // Лабораторная медицина. – 2008. № 9 – с. 31-33
  53. Богословская, Е.В. Сравнительные испытания коммерческих тест-систем для определения концентрации РНК ВИЧ в плазме крови на клиническом материале, полученном от Российских ВИЧ-инфицированных пациентов. / Е.В. Богословская, Г.А. Шипулин, Л.Ю. Башкирова и др. // Эпидемиология и инфекционные болезни. 2008. N 6 . С. 56-57.
  54. Богословская, Е.В. Распространенность делеции в гене, кодирующем хемокиновый рецептор CCR5, у ВИЧ-инфицированных пациентов. / Е.В. Богословская [и др.] // Международный Евро-Азиатский Конгресс по Инфекционным Болезням. – Витебск, 2008. – с. 80-81
  55. Богословская, Е.В. Разработка и апробация отечественной тест-системы для определения лекарственной устойчивости ВИЧ к АРВ препаратам. / Е.В. Богословская [и др.] // Материалы I Ежегодного Всероссийского Конгресса по Инфекционным болезням. – Москва, 2009. - с. 30.
  56. Богословская, Е.В. Изучение распространенности различных субтипов ВИЧ на территории РФ. / Е.В. Богословская [и др.] // Сборник трудов VII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная Диагностика - 2010». – Москва, 2010. – том 1. – с. 16-19
  57. Патент на изобретение «Генетические конструкции для анти-ВИЧ терапии». - № 2426788. – Авторы: Д.В. Глазкова, А.С. Ветчинова, Е.В. Богословская, М.Л. Маркелов, Г.А. Шипулин, Д.А. Куевда, В.И. Покровский, В.В. Покровский. Заявка № 2010107321/10(010203) от 01.03.2010.





© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.