WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


 



На правах рукописи

ГРИГОРЬЕВА  Елена Юрьевна




КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ ПРОГНОСТИЧЕСКИЙ МОНИТОРИНГ

ЭФФЕКТИВНОСТИ  РАДИОТЕРАПИИ

ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ ОПУХОЛЕЙ

(экспериментальные исследования)

14.00.14. – онкология

Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
доктора биологических наук







МОСКВА 2009

Работа выполнена в Государственном Учрежлении Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина РАМН

Научные консультанты:

доктор биологических наук  Р.А. Спрышкова

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор  А.Ю.Барышников

доктор биологических наук С.Е.Ульяненко

доктор химических наук В.Н.Кулаков

Ведущая организация: Московский научно-исследовательский онкологический

институт им. П.А. Герцена МЗСР РФ.

Защита диссертации состоится «___»__________ 2009г. в ____ часов на заседании специализированного совета (Д.001.17.01) ГУ Россицского онкологического научного центра им. Н.Н.Блохина РАМН (115478, Москва, Каширское шоссе, 24).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ Российский онкологический научный центр им. Н.Н.Блохина РАМН.

Автореферат разослан «___» ____________ 2009г.

Ученый секретарь специализированного совета,

доктор медицинских наук, профессор  Ю.В. Шишкин

 



Актуальность проблемы. Современная онкология располагает большим арсеналом средств, позволяющих в зависимости от гистологии,  темпов  роста  опухоли, иммунологического  и  гормонального  статусов выбрать оптимальные способы лечения злокачественных новообразований.  Среди этих способов одним из основных является лучевое лечение. Примерно 70% от общего числа больных с онкологическими заболеваниями назначают лучевую терапию либо в виде самостоятельного курса лечения,  либо в сочетании с другими методами лечения.

  Эффективность лучевой терапии во многом  зависит от возможности раннего прогнозирования реакции опухоли на воздействие. Важным аспектом  проведения терапии является также наличие методов, способных обеспечить оптимальное индивидуальное планирование и контроль ее проведения. Кроме того, для выработки оптимального индивидуального плана лечения злокачественных опухолей и  коррекции ранее намеченной схемы в процессе курса терапии большое значение имеет возможность ранней оценки реакции опухоли на облучение. Однако в клинической практике нет метода, с помощью которого можно было бы быстро получить надежную количественную информацию.

  Разработка методов прогнозирования на основе цитокинетических параметров (общего числа клеток, фракции роста, распределения клеток по фазам клеточного цикла), а также таких биологических параметров, как скорость пролиферации, репопуляции, фракции выживших клеток и др., позволяющих осуществлять количественную оценку и прогнозирование ответа опухоли на воздействие в экспериментальной радиобиологии, в клинических условиях затруднено в силу различных причин. Большая вариабельность данных параметров даже для опухолей одного и того же типа, а также необходимость  частых биопсий в процессе лечения практически  не  позволяют  использовать эти важные параметры для раннего прогноза реакции опухоли. Применяющиеся в клинике  рентгенологические,  томографические,  эндоскопические и другие методы позволяют  получить ответ о реакции опухоли на терапевтическое воздействие лишь через  некоторое время после курса лечения,  когда оптимальное индивидуальное планирование уже исключено. Таким образом, терапевтическое воздействие на организм больного продолжают даже тогда, когда оно не приносит никакого положительного эффекта (в силу радио - или химиорезистентности опухоли), но приводит к тяжелым побочным эффектам. В этой связи создание, в первую очередь, раннего, простого, нетравматичного, информативного метода получения надежных количественных параметров, характеризующих ответ опухоли на воздействие,  является актуальной задачей современной онкологии. Мы считаем весьма перспективным для оценки эффективности лучевой терапии использование радионуклидных методов. В частности, применяя йод-дезоксиуридин (ЙДУР), меченный гамма-излучающими изотопами йода, можно с помощью внешних детекторов неинвазивно проследить за включением радиоактивной метки (РМ) в опухоль и  оценить уровень синтеза ДНК в ответ на противоопухолевое воздействие. Основанием для использования скорости выведения  ЙДУР из опухоли в качестве прогностического показателя эффективности терапии послужили особенности фармакокинетики ЙДУР, который  включается в ДНК, особенно, активно пролиферирующих клеток, претерпевает в основном все биохимические превращения в течение 15 минут после введения и покидает эти клетки только после их гибели. Измерение включения ЙДУР в ДНК опухоли, т.е. количественная оценка пролиферативной активности опухоли неинвазивным способом, может стать инструментом для подбора оптимальных схем лечения опухолевых больных и обеспечить более раннюю и, возможно, более точную оценку реакции опухоли на проводимую терапию, а также предоставить информацию для составления клинического прогноза.

Цель настоящей  работы повышение эффективности лучевой терапии на основе индивидуального количественного прогнозирования реакции опухоли на противоопухолевое воздействие. 

Задачами работы являются: 

1. Оценка эффективности  лучевой  терапии с использованием ЙДУР, меченного радиоизотопами йода.

  • оценка уровня потери,  включившегося 125I-ЙДУР в опухолевые клетки (перевиваемая опухоль мышей меланома В-16 и культура клеток HеLа), после рентгеновского облучения;
  • оценка влияния локального рентгеновского излучения на уровень включения в опухоль  (перевиваемые опухоли мышей меланома В-16 и саркома-180) 125I-ЙДУР после ее облучения.

2. Разработка параметров количественной оценки реакции опухоли индивидуального животного на облучение с использованием меченного различными изотопами йода ЙДУР.

Для этого:

  • на перевиваемой опухоли мышей меланома В-16 методами радиометрии провести сравнительное изучение параметров выведения 125I-ЙДУР из зоны опухоли при различных дозах ее локального рентгеновского облучения, облучения тепловыми нейтронами  и тепловыми нейтронами в присутствии введенного Na210B12H11SH (10BSH);
  • на перевиваемой опухоли мышей меланома В-16 методами радиометрии провести сравнительное изучение параметров выведения из зоны опухоли 131I-ЙДУР, введенного до облучения опухоли, и 125I-ЙДУР, введенного тому же животному после рентгеновского облучения опухоли;
  • на перевиваемой опухоли мышей меланома В-16 методами радиометрии провести сравнительное изучение параметров выведения 125I-Na+I-  и 125I-ЙДУР из зоны опухоли после ее локального облучения в различных дозах рентгеновского излучения;
  • разработать количественные параметры, характеризующие включение ЙДУР в ДНК опухолевых клеток на основе анализа кинетических кривых выведения  радиоактивной метки ЙДУР  из меланомы В-16 и саркомы-180;
  • определить количественную зависимость между изменением параметров включения ЙДУР в опухоль и уровнем изменения синтеза ДНК опухоли при ее локальном рентгеновском облучении, при облучении тепловыми нейтронами и тепловыми нейтронами в присутствии введенного 10BSH;

3. Оценка эффективности использования разработанной  модели для раннего индивидуального неинвазивного мониторинга лучевой терапии опухоли.

Для этого:

  • оценить противоопухолевый эффект (меланома В-16 и саркома-180) действия рентгеновского излучения, тепловых нейтронов и тепловых нейтронов в присутствии введенного 10BSH;
  • определить количественную взаимосвязь между разработанными  параметрами включения ЙДУР, параметрами роста опухоли и дозой облучения опухоли для отдельных животных;
  • разработать схему оценки индивидуального количественного прогноза эффективности  лучевого воздействия на опухоль с использованием параметров выведения меченого ЙДУР.

Научная новизна

Все исследования выполнены в нашей стране впервые, часть исследований выполнена впервые в мире.

  • Разработаны критерии  ранней неинвазивной оценки эффективности лучевой терапии индивидуальных опухолей на основе параметров,  характеризующих  скорость выведения из опухоли 131I-ЙДУР, введенного в организм до облучения опухоли, и 125I-ЙДУР, введенного тому же животному после облучения опухоли. 
  • Определены количественные параметры зависимости включения ЙДУР в опухолевые клетки от уровня изменения синтеза ДНК опухоли при ее локальном рентгеновском облучении в различных дозах, а также при облучении тепловыми нейтронами и облучении тепловыми нейтронами в присутствии с 10BSH - W1(d/0).
  • Показано, что отношения угловых коэффициентов (К) начального участка (до 48 часов) кривых, построенных по регистрируемой над зоной опухоли радиоактивности после введения 131I-ЙДУР до облучения и 125I-ЙДУР после облучения опухоли одному и тому же животному,  коррелируют с параметрами роста опухоли.
  • Определены функциональные зависимости между параметрами выведения радиоактивной метки ЙДУР (К), параметрами роста опухоли и дозой облучения для отдельных животных.
  • Для оценки биологической эффективности разработаны в наших экспериментах  и применены биологические критерии:

-  параметр К, рассчитываемый по скорости выведения из опухоли радиоактивной метки  введенного в организм ЙДУР, регистрируемой  внешним детектором над зоной опухоли  и функционально связанный с показателем W1(d/0), характеризующим зависимый от дозы  облучения уровень синтеза ДНК в опухоли  после ее  облучения;

- параметр М, характеризующий зависящую от дозы долю объёма опухоли, клетки которого сохранили  пролиферативную активность после облучения. Он  вычисляется на основании анализа  закономерностей  роста опухоли  в ответ на облучение, позволяет нетравматично получать оценку  реакции опухоли на облучение и  заменить во многих случаях  сложный  метод изучения выжившей  после облучения фракции опухоли клеток.

  Научно-практическая значимость работы

  Разработана система индивидуального количественного прогноза эффективности  лучевого воздействия на опухоль с использованием параметров выведения меченного гамма-излучающими  радиоактивными изотопами ЙДУР, что позволяет неинвазивно прогнозировать  эффективность как лучевого воздействия на опухоль, так и других видов консервативного лечения в онкологии в течение первых двух суток. 

  Практическая значимость экспериментальных результатов заключается в возможности получить  дополнительные  сведения  об  индивидуальной чувствительности опухоли на терапевтическое  лучевое  воздействие  с  элементом  предсказания дальнейшего развития опухоли, и, соответственно, позволит более точно  выбирать для каждого пациента оптимальный режим облучения. Результаты данного  исследования  могут быть инструментом, дающим возможность обеспечить более раннее распознавание ответа опухоли на проводимую терапию, то есть позволяют количественно  оценить индивидуальную чувствительность опухоли и прогнозировать  эффективность  лучевого воздействия на нее через 48 часов  после облучения

  Принципиально важно отметить,  что разработанная и предлагаемая методика может быть  использована  не только при оценке лучевого воздействия,  но и при других видах противоопухолевой терапии.

  Апробация работы. Результаты работы были представлены и докладывались на следующих международных и отечественных конференциях и совещаниях:

Х1 International Symposium on Laboratory Animals and Experimental medicine (Riga, 2-4 October, 1990); Всероссийский съезд онкологов (Ростов-на-Дону, 10-12 октября 1995); 2-я Национальная конференция «Медицинская физика-95 с международным участием» (г. Москва, 4-8 декабря, 1995); совещание с международным участием «Применение нейтронов ядерных реакторов в лучевой терапии, состояние и перспективы» (г. Обнинск, 17-19 октября, 1995); Seventh International Symposium on Neutron Capture Therapy for Cancer (Zurich, Switzerland, 4-7 September, 1996); Сателлитный симпозиум «Актуальные вопросы радиобиологии нейтронов и нейтронной терапии» в рамках 3 Съезда по радиационным исследованиям (радиобиология, радиоэкология, радиационная безопасность), г. Обнинск,  16 октября, 1997; Международный коллоквиум по проблеме INTAS (Москва, ИОНХ РАН, 4 июня 1998); Международное совещание по проблеме INTAS-96-1114 (г.Обнинск, 14 ноября 1998); Eighth International Symposium on Neutron Capture Therapy for Cancer (13-18 September 1998, La Jolla, California, U.S.A.); ХY1 Менделеевский съезд по общей и прикладной химии, «Научная сессия по проектам INTAS» (25-29 мая 1998г., Санкт-Петербург); Seventh International Radiopharmaceutical Dosimetry Symposium (April 17-19, 2002, The Department of Radiology and Radiological Sciences of Vanderbilt University Medical Center, Nashvilli, TN); Second Int. Conference on X-Ray and Neutron Capillary Optics (22-26.09 2004, Zvenigorod, Russia; III-й съезд онкологов и радиологов СНГ (Минск, 24-28.05 2004); Семинар «Радионуклидные технологии  в физике и медицине» (Москва,  ГУ РНЦ «Курчатовский институт», 28 октября, 2004г); IV Всероссийская научно-практическая конференция «Отечественные противоопухолевые препараты» (Москва, 16-18 марта, 2005); Всероссийская конференция  «Радиобиологические основы  лучевой  терапии» (Москва, 19-20 апреля, 2005);  VI Всероссийская научно-практическая конференция «Отечественные противоопухолевые препараты» (Москва, 24-26 марта, 2007).

Отдельные разделы настоящих исследований вошли в работы, отмеченные премией имени И.В. Курчатова за лучшую научную работу 2004 года и премией ГУ РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН в области клинической онкологии за лучшую прикладную научную работу (2005 г.).

Личный вклад автора состоял в постановке целей и задач исследования, выполнении основного обьема экспериментальной работы. Автором проведены обработка и анализ полученных результатов, формулировка общих выводов и основных положений, выносимых на защиту.

Структура и объем работы

Диссертационная работа изложена на 210 страницах и состоит из введения,  обзора литературы,  описания материалов,  методов и техники экспериментов, трех глав, содержащих собственные экспериментальные данные с обсуждением их результатов, заключения, выводов и указателя цитируемой литературы.  Список цитируемой литературы включает  267 наименований отечественных и иностранных источников. Диссертация иллюстрирована 27 рисунками,  фотографиями и  11  таблицами.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во «Введении» обоснованы актуальность темы диссертационной  работы, сформулированы цели и задачи работы. Освещены научная новизна и практическая значимость результатов исследований.

В главе  «Обзор литературы» обобщены и проанализированы литературные данные по теме «Оценка эффективности лучевой терапии опухолей».

Глава «Материалы и методы исследований» состоит из 8 разделов. 

2.1. Постановка экспериментов. В разделе описаны два подхода для оценки  эффективности  лучевой  терапии с использованием меченого ЙДУР, основанные на метаболическом поведении ЙДУР: а) Оценка уровня потери из опухоли радиоактивного ЙДУР, включившегося в ДНК опухоли. б) Оценка уровня включения радиоактивного ЙДУР в ДНК опухоли. 2.2. Экспериментальные животные и опухолевые модели. Эксперименты по оценке ответа опухоли на  облучение  выполнены на мышах линии С57BL/6 с перевивной опухолью меланома В-16 и на беспородных мышах SHK с перевивной опухолью саркома-180. Средняя масса животных – 20 г. Возраст животных 2 ÷ 3 месяца.  Суспензию опухолевых клеток перевивали внутримышечно в правую заднюю лапку животного в объеме  0,1мл,  который содержал 3,5 ÷ 4 млн. клеток. По достижении опухолью объема 700÷900 мм3 (10-11 день после перевивки меланомы и 8-9 день после перевивки саркомы) проводили ее локальное  облучение.  Каждая  из групп, сформированных для экспериментальных исследований, включала по 10 ÷ 12 животных с опухолями приблизительно равных объемов. Объемы опухолей вычисляли как произведение константы 0,56 и размеров трех взаимно перпендикулярных осей эллипсоида. Для каждой временной точки t объем опухоли (Vt) нормализовали к ее объему на момент облучения (V0) и строили кривые Vt/V0 в зависимости от t (время от начала облучения) для каждой дозы D и для каждого отдельного животного с соответствующим ему контролем (D=0). Монослой клеток HeLa выращивали в питательной среде 199 с добавлением 10% сыворотки крупного рогатого скота, согласно стандартным методикам работы с клеточными штаммами. Сформированные экспериментальные группы составляли по 5-6 флаконов на точку. Каждый флакон содержал 100000 клеток в 2 мл среды. 2.3. Используемые радиоизотопные маркеры. В исследованиях применяли  меченый  5-йод-2'-дезоксиуридин (ЙДУР). Для радиоактивной маркировки ЙДУР использовали как 125I,  так и 131I. Период полураспада 125I  - 60 дней,  он излучает гамма-кванты с сопровождаемым характеристическим рентгеновским излучением в диапазоне энергий 27 ÷ 32 КэВ, то есть является источником мягкого фотонного излучения и электронов Оже. Период полураспада 131I составляет 8 дней, он также является гамма-излучающим изотопом с энергией гамма-квантов 0,364 МэВ. Периоды полураспада 125I  и 131I  учитывались при обработке результатов исследований.  Количество введенного внутрибрюшинно ЙДУР на мышь составляло 7,1 ÷ 7,3 мкг в объеме 0,2 мл. Выравнивание концентраций ЙДУР в рабочих растворах  проводили  добавлением  рассчитанного количества нерадиоактивного ЙДУР.  Общая величина радиоактивности в расчете на одно животное не превышала 0,7 ÷ 0,9 МБк. Такая активность дает возможность с достаточной точностью регистрировать уровень радиоактивности  в зоне опухоли и при этом не вызывает радиотоксичности. Для снижения включения 125I  и 131I  в щитовидную железу и уменьшения тканевого потребления меченого йодида, образующегося в процессе метаболизма радиоактивного ЙДУР, за 3 дня до введения препарата и до окончания эксперимента в питьевую  воду животным добавляли 1% раствор NaI. 2.4. Облучение опухолей. Локальное облучение опухоли проводили тремя видами излучения: рентгеновским, тепловыми нейтронами и тепловыми нейтронами в сочетании с 10BSH, предварительно введенным в организм мышей. Облучение опухолей рентгеновским излучением в диапазоне доз 2 ÷ 40 Гр проводили на установке «Стабилипан» (мощность дозы 3,7 Гр в минуту, V=200 кВ, I=18 мА, фильтр 2мм Al). Животных неподвижно фиксировали на подложке из оргстекла толщиной 6 мм.  Экранировали мышей свинцовым коллиматором толщиной 10 ÷ 20 мм с отверстием под зоной  опухоли,  добиваясь  тем самым облучения только опухолевой области. Погрешность в определении дозы облучения не превышала 3%. Для контроля дозы, подводимой на опухоль, использовали термолюминисцентные дозиметры ТLD-100. Неравномерность по дозе в пределах объема опухоли и поглощения в нем излучения не превышала 6%. Облучение тепловыми нейтронами проводили на касательном пучке нейтронов реактора ИР-8 РНЦ ФГУ «Курчатовский институт». Мощность флюенса тепловых нейтронов составляла 1,2·108 н/cм2 сек. Примесь промежуточных и быстрых нейтронов не превышала 8% от полной мощности флюенса. Вклад фотонного излучения в полную поглощенную дозу был не больше 1,2%. За 11,5-12 ч до облучения нейтронами животным внутрибрюшинно вводили 0,2 мл раствора 10BSH в дозе 100 мкг/г массы мыши.  Животных-опухоленосителей без анестезии помещали в тефлоновую клетку,  которая ограничивала движение животных, но не препятствовала физиологическим отправлениям и приему пищи. Лапку, несущую опухоль, оттягивали, фиксировали и проводили локальное облучение опухоли в диапазоне следующих доз: тепловыми нейтронами - 0,51 ÷ 8,94 Гр, тепловыми нейтронами в сочетании с 10BSH -  0,21 ÷ 9,5 Гр. Поскольку из-за невысокой мощности флюенса облучение тепловыми нейтронами было растянуто во времени, то для каждой группы животных или отдельного животного, облучаемых в данный день, использовали свою группу контрольных животных, по отношению к которым и проводили в дальнейшем необходимые расчеты. 2.5. Радиометрия и дозиметрия. Образцы с культурой клеток HеLа для радиометрических измерений готовили следующим образом: меченую среду и 3-х кратные смывные воды собирали во флакон, затем к радиоактивным клеткам добавляли 2 мл свежей среды и вновь проводили радиометрические измерения как флаконов с клетками, включившими 125I-ЙДУР, в свежей нерадиоактивной среде, так и флаконов с радиоактивной средой и  промывками. Поскольку при замене среды в ней могут содержаться  меченые клетки, то для сбора так называемых «плавающих клеток» проводили центрифугирование и фильтрацию среды.  Радиометрию зоны опухоли и аналогичного участка интактной лапки животного проводили «in vivo» с  помощью  детектора  со сцинтилляционным кристаллом NaI[TL],  многоканального анализатора типа BZ-27 (фирма «Бертольд»), используя набор свинцовых экранов с отверстиями различных диаметров и столика, для фиксации животных.  Расстояние от детектора до опухоли рассчитывали,  основываясь на двух основных требованиях: 1. необходимость превышения результатов измерений над фоном не менее чем в 4÷5 раз;  2. максимальное уменьшение влияния геометрических факторов на  результаты  радиометрии.  Исходя  из  вышесказанного, расстояние от детектора до опухоли составляло 80÷90 мм.  Тело животного экранировали свинцовой пластиной толщиной 10÷20 мм с отверстием, соответствующим размеру опухоли. Для проверки точности  показаний  детектора (калибровки) радиоактивность  эталонного образца измеряли в различных точках столика для фиксации животных.  Положение точки над центром детектора определяли с помощью  центратора, соединенного  с  корпусом детектора с точностью ±1 мм. Учитывая, что размер эталонного образца (0,5см3) много  меньше  его расстояния до детектора,  различия показаний по отношению к центральной точке должны соответствовать закону  обратных  квадратов  расстояний  от  них  до детектора (статистическая ошибка 5%).  При проведении экспериментов животное фиксировали по отношению  к детектору так,  чтобы зона опухоли не попадала в область, где это условие нарушается. Использование многоканального анализатора позволяло одновременно проводить измерения двух различающихся по энергиям  радиоизотопов в двух независимых окнах, настроенных на максимальное отношение образец/фон. Измерение радиоактивного  фона проводилось перед началом радиометрии опухоли. Время радиометрии составляло 1мин. По мере уменьшения  разницы  между значением уровня радиоактивности, измеряемой в зоне опухоли, и значением фона время измерения увеличивали в соответствии с таблицей  Белла, чтобы погрешность измерения за счет этого фактора не превышала 10 %.  Радиоактивность «N» (имп/мин) измеряли через 0,25 ч,  3 ч,  6 ч, 10 ч,  24 ч  и далее ежесуточно до 240 ч  от момента введения ЙДУР. Данные (Nt), полученные для каждой временной точки t, после вычитания  фона  и поправки на распад выражали как процент оставшейся ко времени t радиоактивности от фиксируемой в зоне  опухоли через 0,25 ч после введения меченого ЙДУР (N 0,25). Дозиметрия. Поглощенную дозу фотонного излучения измеряли термолюминисцентными дозиметрами ТLD-100. Отклонения от средней дозы не превышали 15%. Поглощенную дозу от тепловых нейтронов контролировали методом нейтронно-радиационной дозиметрии, разработанным в совместных исследованиях с ГУ РНЦ «Курчатовский институт».  Средняя мощность дозы в нативной ткани (без введения 10BSH) cоставляла 0,25 Гр/ч. Суммарная поглощенная доза в опухоли определялась по трем ядерным реакциям, дающим основной вклад в поглощенную дозу  при взаимодействии тепловых нейтронов с нуклидами биологической ткани - 1H (n,)2H;  14N (n,p)14C;  10B (n,)7Li  -  и составила 95-97%. При этом, вклад в дозу от нейтронно-захватных реакций на нативном 10B  составлял примерно 4%, на 1H - 30%, на 14N - 60-65%. Доза от реакции на 10B, введенном с препаратом 10BSH, составляла около 25% общей поглощенной дозы.  2.6. Параметры изменения роста опухоли. Для оценки изменения роста опухоли в течение всего эксперимента ежедневно проводили измерение трех взаимоперпендикулярных диаметров опухоли и, принимая форму опухолей эллипсоидальной, их объемы вычисляли по формуле V= /6·d1·d2·d3, где d1, d2, d3  - линейные размеры трех осей эллипсоида. Ошибка при измерении линейных размеров составляла ±2 мм.  Для каждой временной точки t объем опухоли (Vt) нормализовали к ее объему на момент облучения (V0) и строили кривые Vt/V0 в зависимости от t (время от начала облучения) для каждой дозы D и для каждого отдельного животного с соответствующим ему контролем (D=0). По этим кривым вычисляли параметры: М = [ Vt/V0 (D)]/[ Vt/V0 (0)], время задержки роста опухоли (Т(з))  - время дорастания объема опухоли до своего первоначального значения в момент облучения, и время дорастания  ее  до двойного объема (Т(дор)) по сравнению с Vo. Параметры определяли графически по кривым изменения  Vt/V0  от  t для каждого животного. 2.7. Включение ЙДУР в ДНК опухолевых клеток. Выделение ДНК из опухолевых клеток осуществляли по методу Шмидта и Тангаузера. Концентрацию ДНК определяли спектрофотометрическим методом А.С. Спирина. Активность фракций измеряли в пробирках на гамма-спектрометре MAG-510 (фирма «Бертольд»). Измеренная радиоактивность выражалась как процент от введенной дозы на грамм ткани. На все результаты радиометрических измерений делали поправки на радиоактивный распад изотопа после его введения животным. 2.8. Методы оценки экспериментальных данных. Поскольку доверительные  оценки  как  средних значений, так и дисперсий основаны на гипотезе нормальности закона  распределения случайных ошибок измерения, мы проверяли нормальность распределения используя критерий К, Пирсона χ2 (хи-квадрат) и  методом оценки центральных моментов третьего  и  четвертого порядков  М3 и М4.  Показателем асимметрии AS считали отношение центрального момента третьего порядка к кубу  среднего  квадратического отклонения. AS = Σ(p * a 3) / n * δ 3 (a - отклонение вариант от средней арифметической, p - повторяемость отдельных вариант). Величина этого показателя колеблется от 0 до 1;  при совершенно симметричных распределениях  этот  коэффициент равен 0; асимметрия считается незначительной, если AS ≤0,25; при АS ≥  0,5 скошенность распределения оказывается уже значительной. Величину  эксцесса EX  (EX = Σ(p * a 4) / n * δ 4 - 3) измеряли как центральный момент четвертого порядка,  отнесенный к среднему квадратическому отклонению в четвертой  степени минус 3 (для строго симметричных нормальных распределений показатель эксцесса равен 3). При ЕX ≤ 0,2 эксцесс практически отсутствует. Если ЕX ≥ 0.5, но ≤  1, эксцесс считается уже заметным.  Крайняя степень отрицательного эксцесса равна -2,  что указывает на наличие двух вариационнах рядов. Частотная гистограмма распределения значений  Nt/N0.25  у контрольной группы животных  показала, что ряд Nt/N0.25  подчиняется закону нормальных распределений.  Аналогичная ситуация характерна и для распределения относительных объемов опухолей Vt/V0, поэтому выбор способа усреднения не принципиален. Достоверность различий, наблюдаемых между двумя средними, производили на основе нормирования,  то есть по оценке критерия достоверности t или по сравнению с доверительными  границами  случайных  колебаний, среднюю квадратическую ошибку разности между средними арифметическими вычисляли по формулам в зависимости от величины сравниваемых выборок, исходя из 95% уровня доверительной вероятности.  Для сравнительной оценки  выборочных  данных небольшого объема использовали непараметрический критерий статистической значимости различий (критерий Уайта), не требующий нормальности распределения исследуемых рядов. Динамику связи между двумя признаками характеризовали с  помощью  регрессионного анализа.  Для построения кривых регрессий и получения функций регрессий применяли метод наименьших квадратов. Доверительная зона регрессии определяла ошибку нахождения прогнозируемой величины при 95%  уровне значимости.  Принимая во внимание, что, как правило, линия регрессии – нелинейна и коэффициент регрессии не может служить  ее  надежным показателем,  степень зависимости между переменными оценивали с помощью коэффициента корреляции r.  Приняли следующую градацию  r:  от 0,1 до 0,5 - слабая связь между признаками,  от 0,5 до 0,7 - средняя степень сопряженности,  свыше 0,7 - сильная. r  = 1 означает уже не коррелятивную, а функциональную связь между переменными. Достоверность коэффициента корреляции определяли показателем преобразования Фишера. Площади под кривыми выведения радиоактивной  метки  из  зоны опухоли рассчитывали аналитически. Для этого проводили анализ эмпирических значений и выбирали аппроксимирующую функцию с наилучшим  приближением.  После  определения параметров искомой функции вычисляли ее определенный интеграл.  Пределы интегрирования задавались  от  0,25 ч  до  72 ч.  Чтобы охарактеризовать изменение уровня накопления меченого соединения в опухоли при ее  локальном облучении различными дозами в сравнении с необлученными, полученные значения площадей (Sd) нормировали на значения площадей  (S0)  в  контрольных  группах (Sd / S0).  Оценка параметров моделей для приближения экспериментальных данных производилась с помощью  нелинейного метода наименьших квадратов.  Глава 3. «Кинетика выведения 5-йод-2'-дезоксиуридина» посвящена анализу различных подходов для оценки эффективности  лучевой  терапии с использованием ЙДУР, меченного радиоизотопами йода.





3.1. Выведение 5-йод-2'-дезоксиуридина из опухолевой  и здоровой  ткани. Способность 5-йод-2'-дезоксиуридина  встраиваться в ДНК,  а не  в  другие  биологические макромолекулы,  является  определяющим фактором для использования этого соединения как маркера реакции опухоли на противоопухолевое воздействие. После введения ЙДУР накопление соединения в опухолевой ткани наблюдается на протяжении 15 – 90 мин в зависимости от метода введения и достигает 12 % от радиоактивности, измеренной  во всем теле. Уже в первые сутки существует преимущественное накопление  ЙДУР в  опухоли,  в сравнении с различными органами и тканями животных. Согласно результатам радиометрических измерений in vitro,  коэффициент дифференциального накопления (КДН) радиоактивного ЙДУР для различных органов и тканей к 30 ч убывает согласно следующей последовательности: опухоль – 29 %, кишечник – 13 %, селезенка – 9 11 %,  кость бедренная – 5 7 %,  кожа – 6,5 4 %, кровь – 5 6 %, почки – 3,5 %, печень – 1,52 %, жир – 12 %, мышцы – 1,5 %.  При этом, через 15 мин после введения в организм  90 – 94 % находящегося в опухоли ЙДУР связано с ее ДНК, где он удерживается при медленном клиренсе в течение 1 – 4 суток.

  Для определения количества 125I-ЙДУР, включающегося в ДНК при облучении опухолей, была выделена ДНК опухолевых клеток. Радиоактивность  образца ДНК выражали как % от дозы на 1 г опухолевой ткани и сравнивали со значениями общей радиоактивности в первоначальной ткани. В таблице 1 приведены данные включения 125I-ЙДУР в ДНК необлученных опухолей для 24 ч, 48 ч, 96 ч  от момента введения 125I  ЙДУР (количество образцов на точку – 6). Оставшиеся 7% приходятся на долю меченых метаболитов (преимущественно йодида и йодированных белков).

Таблица 1

Включение 125I  ЙДУР в ДНК опухолевой ткани


Время взятия образца (после введения 125I  ЙДУР), ч

Радиоактивность опухолевой ткани

(% от дозы на 1 г опухолевой

ткани)

Радиоактивность ДНК

(% от дозы на 1 г опухолевой

ткани)

Вклад радиоактивности ДНК в радиоактивность опухолевой ткани (%)

24

0,48±0,13

0,44±0,12

91±1,29

48

0,49±0,13

0,46±0,13

93±1,33

96

0,47±0,11

0,44±0,14

93±1,18

На рисунке 1 представлены  результаты  измерений внешним детектором опухоли (меланома В-16) и аналогичной зоны коллатеральной безопухолевой лапки животного. Кривые зависимости Nt/N0,5 от t даны для групп однородных животных и представляют собой динамику отношений уровней РМ в импульсах в минуту в момент времени t  (Nt)  и через 0,5 мин после введения ЙДУР, меченного 125I (N0,5). Измеренная радиоактивность приведена к общему количеству введенной  РМ.

Кривая 2 изменения РМ зоны интактной лапки животного  не  показывает  накопления РМ, и спустя уже 10 ч значение РМ уменьшается на порядок. Зарегистрированная в интактной лапке радиоактивность преимущественно локализована в ДНК красного костного мозга  бедра, что и обусловливает медленный спад кривой в дальнейшем.  Кривая 1  изменения  радиоактивности опухоли характеризуется 4-мя выраженными участками: быстрое увеличение РМ,  спад, значительное замедление скорости выведения – «плато», затем некоторое увеличение скорости выведения. В пределах первых  суток на фоне включенного в  ДНК  опухолевых  клеток ЙДУР происходит спад радиоактивности в зоне опухоли, который обусловлен  в первую очередь потерей  меченого материала за счет выведения из организма радиоактивных продуктов метаболизма ЙДУР, не включившихся в ДНК, главным образом, быстро экскретируемого почками йодида. Возникающее  затем  между 24 ч и 80 ч «плато» отражает уровень включенного в  ДНК  опухолевых  клеток ЙДУР и остаточной радиоактивности выводимого йодида и может  характеризовать количество ДНК-синтезирующих клеток. Дальнейший медленный спад кривой (80 часов и далее) является следствием суммы нескольких процессов: «вымывание» радиоактивных метаболитов, репарация ДНК с последующим дейодированием ЙДУР, клеточная смерть, приводящая к катаболизму ДНК с  соответствующим высвобождением РМ. Реутилизация ЙДУР во время нормального клеточного цикла по данным Lee D. составляет менее 10% и, следовательно, уровень ЙДУР, вступившего в повторный цикл не должен привносить значительную ошибку в оценку фармакокинетики включения  и задержки ЙДУР. Оценить эффективность  лучевой  терапии с использованием меченого ЙДУР возможно с помощью двух  подходов.

Рисунок 1. Изменение во времени уровня радиоактивности  над зоной опухоли (1) и аналогичной зоной интактной лапки (2) у мышей линии С57Bl/6 с привитой меланомой В-16 после введения 125I-ЙДУР;

Nt/N0,5 /ΣРМ - отношение радиоактивности (имп. / мин), измеренной в момент времени t к радиоактивности через 0,5 мин после введения 125I-ЙДУР и приведенное к общему количеству введенной  РМ.


При первом подходе – облучить опухоль через несколько суток после введения в организм радиоактивного ЙДУР, когда  РМ в опухоли практически вся связана с ЙДУР, включенным в ДНК и оценить уровень потери  ЙДУР, включившегося в опухолевые клетки. Потеря радиоактивности в опухоли после ее облучения может служить количественной мерой гибели опухолевых клеток в ответ на противоопухолевое воздействие. При втором подходе радиоактивный ЙДУР следует ввести в организм после облучения опухоли и далее регистрировать уровень включения РМ в опухоль. Снижение радиоактивности в зоне опухоли в ответ на облучение будет характеризовать уровень подавления синтеза ДНК.

3.2. Оценка уровня потери из опухоли радиоактивного 5-йод-2'-дезоксиуридина, включившегося в опухоль до облучения. Принципиальная возможность оценки реакции опухоли на лучевое воздействие с помощью 125I-ЙДУР, включившегося в клетки до облучения  была нами показана на культуре клеток HeLa и на перевиваемой опухоли меланома В-16. 3.2.1. Культура клеток HeLa. Во флаконы с культурой клеток  добавляли  содержащую 125I-ЙДУР среду  из расчета  74 кБк /мл (148 КБк на флакон) и инкубировали при температуре +37°С. Спустя 44 ч – 46 ч проводили радиометрические измерения, затем клетки подвергали рентгеновскому облучению с последующей ежедневной радиометрией до 200 часов от момента мечения клеток ЙДУР-м. Облучение клеток, включивших 125I-ЙДУР, проводили различными дозами рентгеновского излучения (5 Гр, 10 Гр, 30 Гр). Данные радиометрических измерений после радиационного воздействия приводили к измеренной перед облучением образцов радиоактивности, принятой за 100%. В этом случае по снижению радиоактивности облученных клеток  можно было оценить степень поражения, и рассчитать число погибших клеток. Однако в проведенных нами исследованиях дисперсионный анализ показал, что различия между данными контрольной и опытных групп недостоверны.  3.2.2. Меланома В-16.  Оценку потери радиоактивного ЙДУР из опухоли после облучения мы повторили на привитой мышам линии С57 BL/6 меланомы В-16. Опухоли облучали локально рентгеновским излучением в дозах 5, 10, 20, 30 Гр через 5 сут  после введения  125I-ЙДУР. Снижение  уровня  радиоактивности можно было заметить через 1-2 суток  после  облучения  опухолей, однако, как  и  в экспериментах с культурой клеток HeLa различия между данными опытных и контрольных групп не являются достоверными  (Табл.2).

Можно заключить, что полученные нами результаты, при этом подходе, не позволяют  достоверно судить о различиях в выведении РМ из опухоли в контрольных и облученных группах раньше чем через 6 – 9 дней после введения ЙДУР, что не отвечает задаче ранней оценки ответа опухоли на терапевтическое воздействие. Результаты потери радиоактивности в опухоли после ее облучения несколько занижены, то есть занижено число погибших клеток, а, следовательно, уменьшена разница между уровнями радиоактивности  в контроле и опыте. Причина этого заключается в том, что РМ, высвобождающаяся из погибших раковых клеток, в силу ряда факторов (поглощение ее в этом месте макрофагами, задержка в некротических зонах) не всегда быстро удаляется из места гибели клетки, что и приводит к искажению результатов анализа.  Таблица 2 

  Значения  критерия  F для  разницы  в  дисперсиях результатов измерений  125I-ЙДУР в  клетках HeLa и меланоме В-16  при  рентгеновском  облучении


клетки HeLa

меланома В-16

Группы:  Контроль, 5 Гр, 10 Гр, 30 Гр

Группы:  Контроль, 5 Гр, 10 Гр, 30 Гр

Дисперсия

внутри-групповая

Дисперсия меж-групповая


F


F крит.

Дисперсия

внутри-групповая

Дисперсия меж-групповая


F


F крит

76,92


91,14


1,18


2,74


334,02


307,35


0,92


2,67

Fкрит.  для уровня статистической значимости p< 0,05 

временные точки: от 1сут до 8 сут после облучения.

Fкрит.  для уровня статистической значимости p< 0,05 

временные точки: от 1 сут до 9 сут после облучения.

3.3. Оценка уровня включения радиоактивного 5-йод-2'-дезоксиуридина в опухоль. Наиболее адекватна разработке быстрого, чувствительного метода in vivo оценки реакции индивидуальной опухоли на противоопухолевое воздействие схема, когда опухоль облучают до введения радиоактивного ЙДУР и регистрируют уровень включения РМ в опухоль. При этом наибольший эффект достигается при введении метки в интервале 2 – 4 ч после облучения. В экспериментах использовали две разные по радиочувствительности опухоли: меланома В-16 и саркома-180. Локальное облучение меланомы В-16 проводили различными дозами рентгеновского излучения, тепловыми нейтронами  и тепловыми нейтронами в сочетании с 10BSH. Саркому-180 облучали различными дозами только рентгеновского излучения (2 Гр, 10 Гр, 20 Гр ). Динамика изменения отношений  уровней  радиоактивности в зоне опухоли меланомы В-16 в  момент  времени t (Nt) и в момент первого измерения t0 через 15 мин  (0,25 ч) после введения  125I-ЙДУР  (N0,25) для усредненных по группам однородных животных  для различных доз 3-х видов облучения и для рентгеновского облучения  саркомы-180 представлены  на рисунке 2.

   Рисунок 2. Изменение во времени уровня радиоактивности над зоной опухоли после введения 125I-ЙДУР при локальном облучении различными дозами

рентгеновского излучения меланомы В-16 (А), саркомы-180 (Б),

при локальном облучении меланомы В-16 различными дозами тепловых нейтронов (В) и тепловых нейтронов в сочетании с 10ВSH (Г);


Nt/N0,25 - отношение радиоактивности (имп/мин), измеренной над зоной опухоли в момент времени t к радиоактивности через 0,25 ч после введения 125I-ЙДУР

Форма этих кривых в целом согласуется с метаболическим поведением ЙДУР: как правило, вслед за быстрым снижением радиоактивности в первые двое суток выведение РМ значительно замедляется так, что в интервале между 24 - 48 ч  и  70 - 80 ч на кривых возникает плато, после которого скорость выведения метки вновь немного возрастает. В некоторых случаях плато на кривой менее выражено, что особенно характерно для опухолей, облученных в больших дозах. При идентичности формы кривых зависимости Nt/N0,25 от t у необлученных опухолей и  у опухолей, подвергнутых воздействию доз  3-х видов излучения, скорости выведения РМ различаются.  При времени t более одних суток различия в скоростях выведения РМ  становятся  достоверными (табл.3), при  этом  с увеличением подводимой к опухоли дозы падает уровень оставшейся к этому времени радиоактивности. Также следует обратить внимание на различие параметров кривых Nt/N0,25 для одной и той же дозы (например 2 Гр) для разных видов излучения. Уровень включения 125I-ЙДУР в опухоль на 48 ч составляет по средним данным примерно 14 – 16 % для рентгеновского облучения опухоли, 4,5 – 5 % - для тепловых нейтронов и 3 – 3,5 % - для тепловых нейтронов в сочетании с 10BSH, что свидетельствует о разнице биологического эффекта  трех видов поражающих факторов. Наличие  зависимости радиометрических параметров  от дозы говорит о достаточной чувствительности  данного метода в использовании ЙДУР как маркера  ответа опухоли  и позволяет предположить возможность использования динамики РМ ЙДУР для установления количественной связи между  дозой  облучения и пролиферативной активностью индивидуальной опухоли.

Таблица 3

Значения  критерия  F для  разницы  в  дисперсиях результатов измерений  125I-ЙДУР в опухолях необлученных и при их рентгеновском облучении


меланома В-16

саркома - 180

Группы:Контроль,2 Гр, 10 Гр, 20 Гр,

40Гр

Группы:  Контроль, 2 Гр, 10 Гр, 20 Гр

Дисперсия

внутри-групповая

Дисперсия меж-групповая

F

F крит.

Дисперсия

внутри-групповая

Дисперсия меж-групповая

F

F крит.

15,06


212,37


14,1


2,866


231,05


1019,85


4,41


2,70

F крит.  для уровня статистической значимости p< 0,05 

временные точки: от 15 мин до 120 ч после введения 125I-ЙДУР.

Таким образом, мы показали возможность оценки  эффективности  лучевой  терапии с использованием меченого ЙДУР по уровню включения радиоактивного ЙДУР в опухоль, когда ЙДУР вводят в организм после облучения. В отличие от первого подхода, в этом случае достоверно установлена  зависимость радиометрических параметров  от дозы облучения как для разных видов излучения - рентгеновского, тепловых нейтронов  и тепловых нейтронов в сочетании с 10BSH, так и для двух различных по радиочувствительности опухолей - меланомы В-16 и саркомы-180. Достоверное различие скоростей выведения ЙДУР из зоны опухоли при локальном  воздействии на нее предполагает возможность установления количественной связи между величиной скорости выведения и дозой облучения. 

3.4. Сравнительная кинетика  выведения 125I-ЙДУР и 131I-ЙДУР  при локальном лучевом воздействии на опухоли. Применение ЙДУР,  меченного только одним изотопом йода (125I), для оценки реакции опухоли на воздействие для одного и того же животного невозможно из-за  наложения  радиометрических данных.  Для того  чтобы обойти эту проблему можно дополнительно использовать ЙДУР,  меченный 131I. Одним и тем же животным за 24 ч до облучения ввести 131I-ЙДУР, при этом уровень измеренной радиоактивности в зоне опухоли будет соответствовать «нормальному» состоянию данной опухоли (контроль).  Через 3 ч после облучения ввести 125I-ЙДУР, который будет характеризовать  реакцию опухоли в ответ на облучение.  Прдварительно мы показали, что разница в дисперсиях величин (Nt/N0.25), для 131I-ЙДУР и 125I-ЙДУР во всех временных точках является недостоверной, т.е. при исследованиях in vivo,  массовое число метящего изотопа  йода  не оказывает влияния на кинетику выведения ЙДУР. На рисунке 3  представлены характерные кривые зависимости Nt/N0.25 от t для отдельных животных.


Рисунок 3. Изменение во времени уровня радиоактивности над зоной опухоли у отдельных животных после введения 131I-ЙДУР  до облучения и 125I-ЙДУР  после локального облучения меланомы В-16, привитой мышам С57Bl/6, рентгеновским излучением в дозе 10 Гр;


Nt/N0,25 - отношение радиоактивности (имп/мин), измеренной над зоной опухоли в момент времени t к радиоактивности через 0,25 ч после введения ЙДУР


Результаты измерений 131I-ЙДУР и 125I-ЙДУР  фиксировались в двух независимых каналах многоканального анализатора, соответствующих энергиям этих радиоизотопов. Видно, что параметры кривых выведения  РМ 131I-ЙДУР  (до  облучения)  и 125I-ЙДУР (после облучения опухолей дозой 10 Гр) из зоны опухоли существенно различаются даже при  наличии  вариабельности уровней радиоактивности, которая отражает индивидуальную реакцию опухолей, привитых сингенным животным и связана с различным балансом в них двух независимых процессов: синтезом ДНК и индукцией апоптоза. Проведенный дисперсионный анализ совокупностей  параметров  этих кривых  показал  достоверность  различий  их  парных  вариант,  начиная  с 10  ч (F=3,09  при Fкрит. =1,56 для p< 0,05  и n (количество животных) =25).

  На основании полученных данных можно заключить, что применение ЙДУР, меченного двумя различными радиоизотопами йода, позволяет оценить реакцию опухоли на облучение  для  каждого  отдельного животного, то есть индивидуальную реакцию организма. При этом методика прижизненного определения параметров, характеризующих  кинетику  выведения меченного радиоизотопами йода ЙДУР,  при воздействии на опухоль различными дозами облучения обладает удовлетворительной разрешающей способностью.

В главе 4 рассмотрены  параметры выведения 5-йод-2'-дезоксиуридина и

Na+ 125I- и предложена методика оценки реакции опухоли на облучение.  Особенности метаболизма ЙДУР указывают на то,  что в первые 70 - 80  часов  после инъекции этого соединения мы имеем дело с суперпозицией двух основных процессов:  выведение продуктов трансформации ЙДУР (главным образом йодида) и включение ЙДУР в опухолевые клетки (что является показателем изменения активности синтеза ДНК опухолевых клеток). Разделение этих процессов, а также определение параметров  последнего позволило нам дать количественную оценку изменения синтеза ДНК при противоопухолевом воздействии. 4.1. Сравнение выведения меченого йодида в форме Na+I- и 5-йод-2'-ЙДУР из зоны опухоли. Ранее упоминалось,  что одним из основных  продуктов  трансформации ЙДУР является свободный йодид-ион.  Несмотря на то, что количество йодида-иона не превышает 3-7% от исходного количества ЙДУР, но его влияние должно в некоторой степени сказываться на результатах измерений РМ внешним детектором и, следовательно, необходимо оценить вклад йодид-иона в суммарный процесс. Проведенные эксперименты с использованием  NaI,  меченного 125I, показали, что параметры выведения РМ из зоны опухоли зависят от величины радиационного воздействия. Несмотря на то, что эта зависимость менее выражена,  чем при введении ЙДУР (рис.4), ее существование не позволяет напрямую, без должного анализа, вычленить из получаемых при радиометрии ЙДУР данных радиоактивность,  относящуюся к иодиду. Следовательно,  встает вопрос о сравнении параметров экспериментальных кривых в том и другом случае, и одним из возможных  решений этого вопроса является применение метода моделирования. Для этого необходимо по отдельным точкам реконструировать  ход всей кривой или интересующего нас участка и подобрать аппроксимирующую функцию с наиболее близким  приближением. Далее - выделить параметры, характеризующие отдельные процессы,  и использовать полученные параметры моделей для предсказания изменения уровня ЙДУР в ДНК опухолевых клеток.

 

Рисунок 4. Изменение во времени уровня

радиоактивности над зоной опухоли меланома

В-16 привитой мышам  С57Bl/6

- при введении 125I-ЙДУР: без облучения (1),

после рентгеновского облучения дозой 20 Гр (3);

- при введении Na125I: без облучения (2),

после рентгеновского облучения дозой 20 Гр. (4);

Nt/N0,25 - отношение радиоактивности (имп/мин), измеренной над зоной опухоли в момент времени t к радиоактивности через 0,25 ч после введения 125I-ЙДУР или Na125I

Математический анализ  кривых выхода РМ NaI (Nt / N0.25 от t) из опухоли как для контроля, так и для различных режимов облучения показал,  что эти кривые хорошо аппроксимируются функцией вида: Y =A*e-ax + B*e-bx (коэффициент  детерминации  r2=93 ÷ 98 при 95%  достоверности).  Оценка параметров  моделей для приближения экспериментальных данных производилась с помощью нелинейного метода наименьших квадратов. Ход кривой  определялся по 1011 точкам при 812 значениях на каждую. Такое двухфазное падение величины Nt / N0,25 отражает процесс выведения из зоны опухоли свободного йодида (быстрая – вторая экспонента). Клиренс остаточной радиоактивности является быстрым, поскольку обусловлен активностью главного продукта трансформации ЙДУР – йодида. Первая экспонента – медленная – отражает выведение йодида «условно  связанного», то есть вступившего в обменные процессы большей частью представлена кислоторастворимой фракцией йодированного белка плазмы. Напомним, что щитовидная железа животных во время проведения экспериментов блокирована нерадиоактивным йодом и не может депонировать радиоактивный йод. Кривая изменения РМ (Nt/N0.25 от времени) в опухолевой зоне при введении меченого ЙДУР имеет более сложную  форму, чем аналогичная зависимость, полученная при введении NaI. Однако, как показал анализ экспериментальных данных,  в интервале от 0,25 до 72 часов также проявляются две основные фазы, и оба эти участка аппроксимируются экспоненциальными функциями с  высокой  степенью соответствия (r2=9698 при 95%  достоверности). Эмпирические формулы при обработке результатов каждого эксперимента находились по 810 значениям на каждую из 1112 пар зависимых величин.

В фармакокинетических исследованиях при оценке  степени  изменения  количества препарата  в  тканях  используется такой параметр как площадь под фармакокинетической кривой (AUC) «концентрация-время» - интегральный параметр пропорциональный общему количеству лекарственного средства в организме. Мы  использовали площадь под фармакокинетической кривой в качестве условной количественной характеристики содержания меченого йодида и ЙДУР в зоне опухоли.

Математическая величина  площади (S)  равна интегралу аппроксимирующей функции или,  в нашем случае, сумме двух интегралов экспоненциальных функций в интервале от 0,25 ч  до 72 ч. Выбор данного временного интервала обусловлен удержанием в опухоли включенного в ДНК ЙДУР  (Гл.3). 

72  72

S() =  A*e-at dt  + B*e-bt dt = S  (1) + S  (2), где

  0,25  0,25

S()  -  площадь под суммарной кривой  Nt / N0.25 отражает совокупный процесс выведения РМ; S (1)  = A/a * (e -a*0,25 - e- -a*72) -  площадь под медленной экспонентой; S(2) = B/b * (e -b*0,25 - e- -b*72) - площадь под быстрой  экспонентой.

Следует отметить,  что  при  радиометрии in vivo практически невозможно регистрировать уровень радиоактивности только опухоли, поскольку на результаты радиометрии влияет также РМ, содержащаяся в органах и тканях,  непосредственно находящихся в зоне «видимости» детектора (кожа, бедренная кость), и РМ прилегающей к опухоли ткани.  При нормировании значений радиометрических  данных  к  их контрольному значению,  влияние этого фактора сказывается в меньшей степени,  чем для абсолютных значений. Кроме того, нахождение  относительных значений позволяет оценить влияние доз облучения на индивидуальную реакцию опухоли. Поэтому, учитывая вышесказанное, вместо абсолютной величины площади под кривой выхода РМ мы использовали относительное изменение площади, условно обозначив его  коэффициентом W. Коэффициент W рассчитывается как:

1. W(d/0) = S()d /  S() 0 - отношение площади  под  общей кривой выхода РМ при облучении опухоли  дозами 2, 10, 20 или 40 Гр  [S()d  ] к соответствующей площади РМ контроля [S() 0 ].

2.  W1(d/0) = S(1)d /  S(1)0  - отношение площади под первой экспонентой при облучении опухоли  дозами 2, 10, 20 или 40 Гр [S(1)d ] к соответствующей площади контроля [S(1)0 ].

3. W2(d/0) = S(2)d /  S(2)0 -  отношение площади под второй  экспонентой при облучении опухоли  дозами 2, 10, 20 или 40 Гр [S(2)d ] к соответствующей площади контроля [S(2)0 ].

  Согласно описанной в главе 2 технике проведения экспериментов при оценке изменения радиоактивности в зоне опухоли для индивидуальных животных использовали одну группу животных с последовательным введением двух разномеченных ЙДУР:  РМ 131I (контроль до облучения) и РМ 125I  (параметр после облучения). В ходе исследований было установлено, что параметры быстрых экспонент кривых выведения РМ ЙДУР из меланомыВ-16, саркомы-180 и свободного йодида из меланомы В-16 для одних и тех же доз облучения идентичны.

  Это позволяет расценивать процесс, описываемый 2-ой экспонентой,  как процесс выведения из зоны опухоли основного продукта,  возникающего при метаболизме ЙДУР, - свободного йодида, что согласуется с литературными данными по метаболизму ЙДУР. Ниже (Табл.4) приведены коэффициенты W2(d/0) (средние по 8 экспериментам)  полученные  в исследованиях с использованием ЙДУР и NaI.

Таблица 4

Относительное изменение площади [W 2(d/0)] под быстрой  экспонентой  при рентгеновском облучении опухоли


W 2(d/0)%

2 Гр

10 Гр

20 Гр

40 Гр

NaI  меланома В-16

98,7 ± 4,3

84,3 ± 3,8

77,9 ± 2,1

75,4 ± 1,5

ЙДУР  меланома В-16

97  ± 3,6

83  ± 2,5

78,9 ± 2,0

76  ± 2,8

ЙДУР  саркома-180

98,2 ± 3,8

84,9 ± 3,6

76,3 ± 3,7


Участок кривой, описываемый медленной экспонентой, представляет для нас наибольший интерес, поскольку именно он,  как мы полагаем, отражает динамику  уровня  радиоактивности в опухоли,  связанную с ДНК,  а SЙДУР (1) соответственно – количество ЙДУР, включенного в ДНК опухолевых  клеток в интервале времени от 15 минут до 72 часов. В это время ЙДУР связан с ДНК опухоли и где он удерживается при медленном клиренсе в течение 1- 4 суток. Для того чтобы оценить вклад РМ,  связанной с медленной экспонентой, в измеряемую в зоне опухоли радиоактивность, при воздействии каждой дозы мы использовали отношение  площади под первой экспонентой к площади под суммарной кривой выхода РМ. W(1/) = W1[0, 2, 10, 20, 40] / W[0, 2, 10, 20, 40].  Вычисление коэффициентов W для каждой дозы позволило установить,  что при введении в организм NaI процент «условно связанного» йодида W(1/), находящегося в опухолевой зоне,  по отношению к общему количеству йодида в радиометрируемой области является постоянной величиной, не зависящей от дозы рентгеновского облучения и равен 17%.  При использовании ЙДУР существует зависимость коэффициента W(1/)d ЙДУР от дозы  радиационного  воздействия, при которой коэффициент уменьшается с 39%  в контроле (без облучения) до 33%, 28%, 23%, и 17% при рентгеновском облучении меланомы В-16 в дозах 2, 10, 20, и 40 Гр соответственно. Критерии достоверности различий величин W(1/)d между группами,  равные 7,35;  8,95;  8,54;  21,64,  значительно превосходят свое критическое значение t=2,30,  что говорит  о статистически значимых отличиях полученных данных.  (Число степеней свободы определяли  по формуле для малых выборок.  Уровень статистической значимости p< 0,05). При рентгеновском облучении саркомы-180 дозами 2, 10 и 20 Гр значения  коэффициента W(1/)d ЙДУР также различаются с высокой степенью достоверности и составили: 29%, 24%, 16%.  Следовательно,  надо полагать, что W(1/) равный 17% - это вклад радиоактивности, которая не связана с синтезом ДНК, а является результатом метаболизма йодида,  образующегося в процессе распада ЙДУР.

Таким образом,  участок кривой выведения РМ ЙДУР из зоны опухоли характеризующийся медленной экспонентой отражает совокупную РМ как ЙДУР включенного в ДНК опухоли, так и количество РМ «условно связанного» йодида (или продуктов его трансформации), который задерживается в области радиометрического измерения.

4.2. Количественная in vivo оценка включения 5-йод-2'-ЙДУР в ДНК опухолевых клеток. Если наша гипотеза верна, и уровень изменения количества ЙДУР в ДНК опухолевых клеток модельно можно представить через изменение площади под первой экспонентой кривой Nt/N 0,25 во времени,  то необходимо выполнение двух основных условий: первое - значение подинтегральной функции не должно существенно меняться в интервале от 0,25 до 72 часов,  поскольку не должно существенно меняться количество ЙДУР,  включенного в ДНК,  на протяжении первых  70 - 80 часов после введения ЙДУР (в дальнейшем возможно увеличение скорости выведения РМ  за счет дейодирования ДНК при гибели клеток вследствие облучения); второе - должна  существовать  зависимость  величины  коэффициента W1(d/0)  ЙДУР от дозы облучения опухоли аналогичная зависимости уровня синтеза ДНК от дозы облучения.

Рассчитанное значение скорости убывания функции медленной экспоненты для временного участка от 0,25 до 72 часов, равное приращению этой функции (dy/dt=0,2) указывает на то, что в заданном временном интервале скорость убывания является несущественной и будет приближаться  к  постоянной величине, оставаясь меньше ее. Что касается выполнения второго условия, то здесь прослеживается четкая  закономерность  снижения коэффициента W1(d/0) ЙДУР при увеличении подводимой к опухоли дозы.  Ниже (Табл. 5) приведены значения доз и соответствующие  им  значения  коэффициентов  W1(d/0),  усредненных по 5 экспериментам для рентгеновского облучения, облучения тепловыми нейтронами и комбинации облучения тепловыми нейтронами с  введением бор-содержащего соединения 10BSH.

Таким образом,  предложенный нами коэффициент  W1(d/0) отвечает двум основным требованиям,  предъявляемым к модельным параметрам, характеризующим  уровень  изменения синтеза ДНК в опухоли. Данные, полученные в результате in vivo измерений, практически идентичны результатам, полученным из выделенной ДНК опухолевых клеток, т.е. значения коэффициентов W1(d/0) для рентгеновского излучения соответствуют содержанию 125I-ЙДУР в выделенной опухолевой ДНК (Рис.5).  Разница  же между  параметрами W1(d/0) и количеством ЙДУР в выделенной ДНК для каждой дозы воздействия представляет собой величину, определяемую  нами  как  количество «связанного»  йодида.

Таблица 5

Влияние дозы облучения на коэффициент относительного изменения площади под медленной экспонентой (W1(d/0)

Меланома  В 16

Саркома - 180

Рентгеновское облучение

Облучение тепловыми нейтронами

10BSH +

Нейтронное

облучение

Рентгеновское облучение

Доза (Гр)

W1(d/0)

( %)

Доза (Гр)

W1(d/0) 

( %)

Доза (Гр)

W1(d/0) 

( %)

Доза (Гр)

W1(d/0)

( %)

2


10


20


40

78,4 ±4,1


53,9±3,4


39,6±3,1


19,9±1,04

0,51

1,19

2,04

2,93

5,44

8,94

84,66 ±  4,9

68,20 ±  3,0

49,25 ±  3,2

41,28 ±  3,8

31,47 ±  1,7

27,79 ±  2,0

0,21

0,79

1,09

1,55

2,76

5,39

6,07

9,62

62,41 ±  3,1

51,32 ±  3,2

49,78 ±  1,3

44,60 ±  1,4

32,23 ±  2,1

12,38 ±  1,2

12,15 ±  1,3

11,80 ±  0,9

2


10


20

75,54 ±3,4


51,0±2,3


28,6 ±2,1


Основываясь на  проведенном  анализе  полученных экспериментальных данных,  можно сказать, что предложенный нами параметр W 1(d/0)  связан с количеством ЙДУР, включенного в ДНК опухолевых клеток, отражает степень изменения пролиферативной активности злокачественного новообразования и может рассматриваться как условная  характеристика подавления синтеза ДНК индивидуальной опухоли,  а зависимость W1(d/0) от дозы - как зависимость ДОЗА — ЭФФЕКТ. 


Рисунок 5. Зависимость уровня

включения 125I-ЙДУР в ДНК меланомы

В-16 от дозы рентгеновского облучения

- значение параметра W1(d/0) - 1,

- выделенная ДНК опухолевых клеток - 2

(48 ч после введения 125I-ЙДУР)

Поскольку вычисление коэффициента W1 для экспресс-ответа  индивидуальной опухоли на противоопухолевое воздействие достаточно громоздко,  целесообразно найти  связь  между этим коэффициентом и параметрами,  характеризующими суммарный процесс, регистрируемый нами с помощью внешнего детектора.

4.3. Параметры включения ЙДУР для in vivo оценки уровня синтеза ДНК опухолевых клеток. В заданном временном интервале количество РМ, измеряемой в зоне опухоли,  может быть выражено как площадь под кривой Nt/N0, то есть

t2

  S=N(t)dt ,

  t1

Зависимость N от t (N= Nt/N0) в интервале времени 0,25 ч – 48 ч носит экспоненциальный характер,  который  сохраняется  при всех изученных видах облучения опухоли: рентгеновском, облучении тепловыми нейтронами и при сочетанном  действии тепловых нейтронов с бор-содержащим препаратом. В таком случае N(t) можно выразить через ее производную по времени [N'] и угловой коэффициент кривой [tg()], поскольку в полулогарифмическом масштабе экспонента представляет собой прямую линию с углом наклона к оси абсцисс, равным .  tg() = dY/dt = d lnN(t)/dt = 1/N*dN(t)/dt = 1/N*N'(t)

Полученный параметр  функционально связан с количеством РМ в зоне опухоли и, кроме того, просто и легко вычисляется в процессе радиометрии по формуле:

tg() = [ln N(t1)-ln N(t2)] / (t1-t2),

где N(t1) и N(t2) - величина измеряемой радиоактивности для времени 0,25 и соответственно 24 или 48 часов (рис.3). Далее, взяв отношения угловых коэффициентов кривых выведения РМ у животных с облученной опухолью к их контрольным значениям до облучения [tg()  выведения РМ 125I-ЙДУР / tg() выведения РМ 131I-ЙДУР] и обозначив его К,  мы получаем параметр,  который отражает уровень изменения включения ЙДУР в опухоль при воздействии на нее.

[ln N(t1)-ln N(t2)]  (125I-ЙДУР)

К= --------------  (1)

[ln N(t1)-ln N(t2)]  (131I-ЙДУР )

  Графическое исследование корреляционных полей  значений параметров W1(d/0), отражающих степень изменения пролиферативной активности злокачественного новообразования и коэффициента К, который рассчитывается непосредственно  по  результатам радиометрии  in vivo  в  первые двое суток после введения ЙДУР, выявило, что эти поля концентрируются вокруг линии связи,  которая на графике в логарифмическом масштабе - прямая  линия  и наиболее точно регрессионное уравнение описывается степенной функцией: W1(d/0)  = А* К(- b),  где А и b - регрессионные коэффициенты. Степень соответствия  индивидуальных значений W1(d/0) и К линии регрессии,  определяющаяся коэффициентом  корреляции  Пирсона (rxy),  стандартная  ошибка оценки (sr), а также расчетные значения коэффициентов регрессии для каждой из указанных  доз радиационного воздействия приведены в следующей таблице:

Таблица 6

Коэффициенты уравнений регрессии между коррелирующими признаками W1(d/0) и К для рентгеновского облучения меланомы В-16



Доза (Гр)


А


b

коэффициент  корреляции 

rxy

стандартная  ошибка оценки sr

2

98,9

- 1,96

0,89

0,03

10

102,8

- 2,16

0,94

0,05

20

111,9

- 2,32

0,98

0,056

40

100,1

- 2,26

0,96

0,06

p< 0,05  n= 1518 на точку  W1(d/0)  = А* К(- b)


Монотонность зависимости факторов, показанных для отдельных животных,  как  для крайних точек, так и для точек внутри дозового диапазона,  позволяет интерполировать данную зависимость на  весь изучаемый  диапазон.  На  рисунке 6 представлено корреляционное поле индивидуальных значений W1(d/0) и К для 64 животных при облучении меланомы В-16 рентгеновским излучением в диапазоне доз от 2 до 40 Гр. Уравнение линии регрессии определяется следующей формулой:

W1(d/0)  = 109,9*К (- 2,37)  или  ln W1(d/0) = ln 109,9 – 2.37 * ln K.


Рисунок 6. Корреляционное поле

индивидуальных значений W1(d/0) и

К = tgα(D)/tgα(0)  при локальном

облучении меланомы В-16 привитой

мышам С57Вl/6, различными дозами рентгеновского излучения;

____________ линия регрессии

- - - - - - - доверительные границы

линии  регрессии

, ,    облучение опухоли в дозах 2, 10, 20, 40 Гр.

Вычисленные коэффициенты уравнений регрессии между коррелированными признаками для рентгеновского, нейтронного и сочетанного бор-нейтронного облучения меланомы В-16, а также для рентгеновского облучения саркомы-180 (Табл. 7)  указывают на сильную,  близкую к функциональной, связь этих признаков, причем, независимую как от типа радиационного воздействия, так и от штамма опухоли. Уравнение линии регрессии определяется следующей формулой:

W1(d/0)  = 113,6*К(-2,48). Данное выражение получено при анализе 96 пар коррелирующих признаков, коэффициент  корреляции  rxy=0,98 при уровне статистической значимости p< 0,05. 

Таблица 7

Коэффициенты уравнений регрессии между  коррелирующими признаками W1(d/0)  и К

Вид излучения

Диапазон доз (Гр)

А

b

коэффициент  корреляции rxy

стандартная  ошибка оценки sr

Рентгеновское

(меланома В-16)

  1. ÷ 40

109,9

-2,4

0,98

0,054

Нейтронное

(меланома В16) 

0,51 ÷  8,9

112,3

-2,1

0,99

0,059

10BSH

+ нейтронное

(меланома В16) 

0,21 ÷  9,5

120,9

-2,6

0,98

0,085

Рентгеновское

(саркома 180)

  2 ÷  20

103,6

-2,1

0,96

0,08

p< 0,05  W1(d/0)  = А* К(- b)

Использование аппроксимации и уменьшение числа  экспериментальных  точек,  безусловно,  несколько снижает точность конечных результатов по сравнению с результатами,  получаемыми при использовании предложенного нами ранее модельного параметра W1(d/0), но такое упрощение позволяет довольно быстро и просто получить необходимые сведения  для расчетов  количественной оценки реакции опухоли на облучение.

Взаимосвязь параметров W1(d/0)  и К при некоторых допущениях может  быть представлена функциональной зависимостью. Поскольку изменение уровня радиоактивности N(t) в интервале времени 0,25 ч – 72 ч носит экспоненциальный характер, то:  N(t)d =A*e-at (125I-ЙДУР), N(t)0 =A*e-at (131I-ЙДУР), а отношение угловых коэффициентов  К = ad/a0. Тогда, исходя из того, что площадь под медленной экспонентой  SЙДУР(1) = A/a *(e -a*0,25 - e- -a*72), параметр W1(d/0) = S(1)d / S(1)0 и обозначив t = 0,25 ч  -  через 0, а  t = 72 ч  -  через  T  , мы получаем следующее уравнение: W1(d/0) = [Ad*a0 / A0*ad] * [(1 – e-ad*T) /  (1 – e-a0*T)]  (2)

Поскольку значение Т  велико,  то различие между значениями e-ad*T  и  e-ao*T будет мало, вследствие чего  второй член уравнения (2) примерно равен 1, т.е.

[(1 e-ad*T) / (1 e-a0*T)] 1. Приняв эти условия, уравнение (2)  будет выглядеть так: W1(d/0)=[Ad*a0 / A0*ad]= (Ad / A0) * (1/К) (3)

Или: ln W1(d/0) = ln (Ad / A0) ln K, что согласуется с уравнением линии регрессии, полученной при исследовании корреляционных полей.

Таким образом, нами определена количественная взаимосвязь параметра W1(d/0), отражающего степень изменения пролиферативной активности злокачественной опухоли с коэффициентом К,  который рассчитывается непосредственно  по  результатам радиометрии  с помощью внешних детекторов  в  первые двое суток после введения ЙДУР. Кроме того, независимость параметров корреляционного уравнения между W1(d/0) и К от типа  облучения позволяет сделать вывод,  о возможности применения коэффициента К при любом противоопухолевом воздействии, поскольку фактически отражает сохранившийся уровень синтеза ДНК опухолевых клеток.

Глава 5 посвящена практическому использованию разработанных параметров для прогнозирования динамики роста опухоли после терапевтического воздействия.

Для оценки реакции опухоли на лучевое  воздействие были изучены закономерности роста опухоли в зависимости от дозы рентгеновского,  нейтронного и комбинации нейтронного облучения с 10BSH  для меланомы В-16 и для различных доз рентгеновского облучения саркомы-180. Усредненные данные некоторых экспериментов по динамике роста опухоли (Vt/V0) во времени для различных доз исследуемых излучений представлены на рисунке 7.

5.1. Влияние облучения на параметры роста опухолей. Кинетика роста опухоли является важным показателем как  для диагностики,  так и для процесса лечения в ходе терапии опухолевых новообразований.  От нее в значительной степени зависит эффективность терапевтических методов лечения и,  в том числе,  эффективность лучевой терапии. Для оценки реакции опухоли на лучевое  воздействие  достаточно часто  используются  такие  параметры как продолжительность задержки роста опухоли Т(з) и время дорастания опухоли до двойного объема Т(дор). 


Риcунок 7.  Динамика роста опухоли от момента ее облучения:

облучение меланомы В-16 тепловыми  нейтронами  - (А);

облучение меланомы В-16 тепловыми  нейтронами в сочетании с 10ВSH  (Б);

рентгеновское облучение саркомы 180 - (В).

Vt/V0 (%) - отношение объемов опухоли

в момент времени t к ее объему на момент облучения; время (сутки) рассчитано от начала облучения.


При использовании этих критериев строятся кривые в координатах доза -  время  дорастания  до  определенного объема или время задержки роста опухоли.  Форма  полученных  кривых  дает возможность  судить об относительной радиочувствительности субпопуляций клеток в опухоли и,  вместе с тем, служит для оценки данных биологической эффективности излучений.  Кроме того, для характеристики  доли объема опухоли, клетки которой сохранили способность к пролиферации  после лучевого воздействия, нами был разработан параметр М=[Vt/V0 (D)] / [Vt/V0 (0)]. 

Параметр М и его оценка.

Параметр М представляет собой отношение  нормированных  к  начальным  величинам  объемов (облученных  [Vt/V0 (D)] и необлученных [Vt/V0(0)]) опухолей на экспоненциальных участках кривых возобновленного после облучения роста опухолей. Он характеризует долю объема опухоли,  клетки  которого  сохранили  способность  к  пролиферации после облучения (условно говоря, доля «выжившего» после облучения объема опухоли). К этому утверждению приводят следующие рассуждения:

Полный объем экспоненциально растущей опухоли после однократного облучения можно описать уравнением:

  V = V0 (1- e -aD). e-t  + V0 e -aD . e t , где  (4)

V0 - объем опухоли  на момент облучения;

D  - поглощенная доза;

t  - время от начала облучения;

а  - коэффициент, характеризующий зависимость между дозой и объемом опухоли, клетки которого сохранили способность к пролиферации после облучения;

V0 (1- e -aD) - объем опухоли, клетки которого получили нерепарируемые повреждения, будут гибнуть и выбывать из опухоли;

  - коэффициент, характеризующий cкорость уменьшения объема опухоли за счет клеток, потерявших способность к пролиферации после облучения;

  - коэффициент, характеризующий cкорость увеличения объема опухоли за счет прироста количества клеток, сохранивших способность к пролиферации после облучения;

V0e-aD - объем опухоли, клетки которого сохранили способность к пролиферации и с которого возобновляется рост опухоли после облучения  («выживший» объем).

Первый член уравнения (4) характеризует объем опухоли, связанный с убыванием клеток, потерявших способность к пролиферации в результате облучения. Второй член уравнения (4) характеризует объем опухоли, связанный с приростом клеток, сохранивших способность к пролиферации после облучения.  Через некоторое, зависящее от дозы время, когда процесс роста опухоли значительно превалирует над процессом выведения погибших клеток влияние процесса убыли клеток на общий объем опухоли, т.е. первый член уравнения (4), снижается до величин, которыми можно пренебречь. С этого момента кривая роста опухоли будет характеризоваться вторым членом уравнения (4). Для определения объема опухоли клетки которого после облучения сохранили способность к пролиферации, или объема опухоли с которого возобновляется ее рост после облучения, достаточно определить показатель  . Поскольку показатель  – угловой коэффициент экспоненциальной кривой возобновленного после облучения роста опухоли - является угловым коэффициентом кривой роста, построенной в полулогарифмических координатах (по оси ординат - объем опухоли), то на практике определить этот объем можно путем экстраполяции экспоненциального участка кривой до пересечения с полулогарифмической осью ординаты. Отрезок, отсекаемый на оси ординат, и будет характеризовать объем опухоли, клетки которого остались жизнеспособными после облучения. Наиболее удобно такие расчеты проводить по кривым, построенным для нормированных к начальным величинам объемов.  Тогда отсекаемая на ординате величина указывает долю объема, клетки которого сохранили способность к пролиферации после облучения.  Эта доля «выжившего» объема опухоли

фактически соответствует доле выживших после облучения клеток (Рис.8).

Риcунок 8.  Динамика роста меланомы В-16 после ее рентгеновского облучения.


Vt/V0 (%) - отношение объемов опухоли

в момент времени t к ее объему на момент облучения; время (сутки) рассчитано от начала облучения.


Для определения предложенным способом доли «выжившего» объема опухоли не требуется построение кривой роста контрольных (необлученных) опухолей. Достаточно знать объем опухоли на момент облучения данной дозой. Однако в этом случае не будут учтены возможные влияния различных факторов, связанных с проведением экспериментов в разное время, на разных группах животных, с использованием опухоли от разных пассажей и т.п.

  Для того чтобы нивелировать ошибки, обусловленные вышеперечисленными факторами, при определении доли «выжившего» объема опухоли мы использовали отношения объемов облученных опухолей, нормированных к начальным величинам объемов в контроле:  [Vt/V0(D)]/[Vt/V0(0)]  (5),

и назвали это отношение параметром «М».  В случае равенства скоростей роста опухолей в контроле и возобновленного роста опухолей после облучения, эти отношения на экспоненциальном участке кривых роста постоянны для данной дозы и не зависят от времени. Величину М для каждой дозы вычисляли из экспериментально найденных отношений [Vt/V0 (D)]/[Vt/V0 (0)]  как среднее значение для нескольких временных точек на участках экспоненциального роста опухолей. Эту величину в дальнейшем использовали для построения кривой ДОЗА—ЭФФЕКТ.

Кривые ДОЗА - ЭФФЕКТ по параметру Т(з)  для трех вышеуказанных типов излучения представлены на рисунке 9. Кривые достаточно хорошо описываются линейной зависимостью (r=0,92-0,96). Из сравнения этих зависимостей в рабочем диапазоне доз 2 9,5 Гр находим, что биологический эффект воздействия тепловых нейтронов в сравнении с рентгеновским излучением составляет 3,7 3,8, тогда как тепловых нейтронов в сочетании с 10ВSH - 4,5 4,7.

Различия в 1,5 – 2 раза в степени воздействия рентгеновского излучения на саркому-180  по сравнению с меланомой В-16 отражает представленная на том же рисунке зависимость Т(з)  от дозы облучения, такое различие вполне характерно для саркомы, как более резистентной опухоли. 

Риcунок 9.  Зависимость  Т(зад)  от дозы локального облучения меланомы В-16 (1,2,3) и саркомы-180 (4)

1. Тепловые нейтроны в сочетании с 10ВSH (3-5 мкг В/г опухоли)

2. Тепловые нейтроны (1,2·108 н/см2 сек)

3. Рентгеновское излучение (200 кВ)

4. Рентгеновское излучение (200 кВ)

Риcунок 10.  Зависимость  Т(дор)  от дозы локального облучения меланомы В-16 (1,2,3) и саркомы-180 (4)

1. Тепловые нейтроны в сочетании с 10ВSH (3-5 мкг В/г опухоли)

2. Тепловые нейтроны (1,2·108 н/см2 сек)

3. Рентгеновское излучение (200 кВ)

4. Рентгеновское излучение (200 кВ)

Кривые ДОЗА — Т(дор) (рис. 10) тех же животных также имеют вид линейных зависимостей (r = 0,85-0,90). Биологический эффект действия облучения на опухоль в том же диапазоне доз 2 9,5 Гр по отношению к рентгеновскому излучению для тепловых нейтронов составляет  3,03 3,3, и действия тепловых нейтронов в сочетании с 10BSH -  4,2 4,0.

Предложенный ранее параметр М может быть показателем жизнеспособности  опухоли, поскольку,  как  уже  отмечалось,  на участке экспоненциального роста опухоли после ее облучения этот параметр характеризует долю объема опухоли, клетки которого сохранили cпособность  к пролиферации. В таком случае кривая ДОЗА — ln M в сущности соответствует кривой ДОЗА - доля выживших  клеток.

Как видно из представленных на рисунке 11 графиков, параметр М для каждого типа излучения зависит от дозы. При облучении тепловыми нейтронами (2) и в сочетании тепловых нейтронов с 10ВSH (1) эта зависимость носит практически линейный характер, а кривая выживаемости не имеет плеча. Это отражает влияние излучения с высокой линейной потерей энергии и указывает на то, что клетки меланомы В-16 не восстанавливаются от сублетальных повреждений при этих  видах облучения. Кривая выживаемости в этом случае представляется простым экспоненциальным уравнением  М(D) = е -k*D. При рентгеновском облучении кривая выживаемости имеет плечо и представляет зависимость вида:  М(D) = 1 - (1-  е -kn*D)n , где kn – постоянная инактивации каждой из  n мишеней, которые все должны быть поражены, чтобы убить клетку. 

Риcунок 11. Зависимость М от дозы локального облучения меланомы В-16, привитой мышам С57Bl/6, рентгеновским излучением, тепловыми нейтронами и тепловыми нейтронами в сочетании с 10ВSH

1. Тепловые нейтроны в сочетании с 10ВSH (3-5 мкг В/г опухоли)

2. Тепловые нейтроны (1,2·108 н/см2 сек)

3. Рентгеновское излучение (200 кВ)

Параметр М =  [Vt/V0(D)]/[Vt/V0(0)]  - отношение нормированных на начальные величины объемов облученных опухолей к таковым без облучения на экспоненциальном участке роста опухоли после воздействия.

Среднюю инактивирующую дозу D0 (величина обратная k) для каждого типа излучения находили из соответствующих дозовых кривых M - поглощенная доза. При рентгеновском облучении М(D) = 1 - (1-  е -0,06* D)1,1; при облучении тепловыми нейтронами М(D) = е –0,25*D; при облучении тепловыми нейтронами в сочетании с 10ВSH  М(D) = е –0,36*D.

Значения D0, найденные из решения уравнений кривых ДОЗА - lnM для каждого вида излучения, составили:

рентгеновское излучение 16,6 Гр

тепловые нейтроны  4,0 Гр

тепловые нейтроны + 10ВSH  2,8 Гр

Путем сравнения величин D0 определили биологический эффект действия облучения на опухоль. Так, для тепловых нейтронов и тепловых нейтронов с 10ВSH по отношению к рентгеновскому излучению значения биологического эффекта составили 4,2 и 6, соответственно.

Влияние различных доз облучения опухоли на изменение предложенного в главе 4 параметра К проиллюстрировано на рисунке 12, где представлены усредненные кривые изменения значения К при действии на опухоль трех видов излучения.

Рисунок 12. Зависимость  К = tgα(D)/tgα(0)  от дозы локального облучения меланомы В-16 (1,2,3) и саркомы-180 (4)

1. Тепловые нейтроны в сочетании с 10ВSH (3-5 мкг В/г опухоли)

2. Тепловые нейтроны (1,2·108 н/см2 сек)

3. Рентгеновское излучение (200 кВ)

4. Рентгеновское излучение (200 кВ)

Анализ полученных данных показал,  что: 1. в исследуемых нами диапазонах доз отношение  угловых  коэффициентов К от  дозы  наиболее точно описывается степенной зависимостью К = С*Df; 2. значения коэффициента  f идентичны таковым для рентгеновского облучения меланомы В-16, облучения тепловыми нейтронами и тепловыми нейтроны в сочетании с 10ВSH. Определенный по этому параметру биологический эффект действия на опухоль облучения тепловыми нейтронами составил по отношению к рентгеновскому излучению 3,153,5 и действия тепловых нейтронов в сочетании с 10BSH -  5,5 6,0.

По приведенным в этом разделе данным видно, что биологический эффект облучения опухоли варьирует в достаточно широких пределах в зависимости от способа оценки. Кроме того, при бинарной терапии, например при облучении опухоли тепловыми нейтронами в присутствии  бор-содержащего соединения, на биологический эффект будет влиять химическая структура и внутриклеточная локализация применяемого соединения.

5.2.  Взаимосвязь роста опухоли и параметров выведения ЙДУР.

В данном разделе  рассматривается возможность использования параметров,  связанных со скоростью  выведения  радиоактивного ЙДУР из опухоли,  в качестве показателей, характеризующих ответ индивидуальной опухоли на облучение.

В качестве показателя изменения уровня радиоактивности  ЙДУР  во времени ранее нами был принят параметр К= [ln N(t1)-ln N(t2)] / (t1-t2). С его помощью можно дать количественную оценку эффективности применения лучевой терапии для индивидуальных животных. Для этого с помощью регрессионного анализа определили количественную взаимосвязь между параметрами, характеризующими реакцию опухоли на облучение (Т(з) или Т(дор)),  с параметром,  характеризующим скорость выведения РМ ЙДУР из  зоны  опухоли (К). Графическое исследование  корреляционных  полей  значений Т(дор), Т(з)  и  К показало, что наиболее точно условия связи параметров отражает уравнение в  виде  экспоненциальной функции.

Соответствие индивидуальных значений К и Т(дор)  линии регрессии определялась корреляционным коэффициентом Пирсона.  При высокой степени соответствия

(r = 0,930,95 при 95%  достоверности) регрессионные зависимости  для  рентгеновского и нейтронного облучения практически не различаются,  что еще раз указывает на показатель К, как на параметр, связанный с изменением опухолевой реакции при любом типе облучения.

  На рисунке 13  приведено  корреляционное поле индивидуальных значений Т(з) и К для 198 животных  с опухолью меланома В-16, подвергнутой локальному рентгеновскому облучению, облучению тепловыми нейтронами и тепловыми нейтронами в сочетании с 10BSH, а также при  рентгеновском  облучении саркомы-180.  Очевидно, что несмотря на вариабельность полученных индивидуальных показателей, для большинства варьирующих признаков (примерно 96% всех точек на графике) существует значительная корреляция (r= 0,920,98).

Риcунок 13. Корреляционное поле индивидуальных параметров задержки роста опухоли Т(зад) и К = tgα(D)/tgα(0)  при локальном облучении меланомы В-16 привитой мышам С57Вl/6,

различными дозами рентгеновского излучения, тепловыми нейтронами и тепловыми нейтронами в сочетании с 10BSH, а также при  рентгеновском  облучении саркомы-180

____________  линия регрессии

- - - - - - -  доверительные границы

линии  регрессии 

Используя коэффициент К и его функциональную связь с параметром W1(d/0), можно определить степень подавления синтеза ДНК опухоли (гл.4). Кроме того, коэффициент К связан с параметром М, который, как уже отмечалось, характеризует долю «выжившего» после облучения опухоли объема. Поскольку М(D) = е–m*D, К(D) = С*Df  при одних дозах облучения, то мы получаем следующее уравнение:

ln М = - m/С*К 1/f. Таким образом, параметр К,  характеризующий скорость выведения РМ из опухоли в первые двое суток после введения радиоактивного ЙЛУР,  может быть  использован в качестве показателя индивидуального ответа опухоли на облучение по параметрам Т(з), Т(дор), W1(d/0), или М. Для решения  этой  задачи необходимо осуществить следующий порядок действий: 1. для отдельного животного,  исходя из данных радиометрии  до  и после облучения, определить К по формуле (1); 2. подставить значение К в уравнение регрессии и,  с учетом ее доверительной зоны, определить ожидаемую величину Т(з)  или вычислить через W1(d/0)  степень изменения пролиферативной активности опухоли, или по параметру М —  долю «выжившего» после облучения опухоли объема.  Ниже приведена сводная таблица (Табл.8) определения по коэффициенту К ряда показателей индивидуального ответа опухоли на облучение: процент включения ЙДУР в ДНК опухолевых клеток; степень подавления пролиферативной активности; доля объема опухоли, клетки которого сохранили после облучения способность к пролиферации;  ожидаемую задержку роста опухоли. Данные приведены для меланомы В-16 при ее облучении рентгеновским излучением, при облучении тепловыми нейтронами и облучении тепловыми нейтронами в присутствии введенного 10BSH, а также для рентгеновского облучения саркомы-180. Значения доз в данной таблице приведены для удобства сравнения интересующих параметров, положим, различных типов облучения. Диапазон значений величины параметра К является  отражением биологической сущности действия облучения на опухолевые клетки и определяется уровнем подавления синтеза ДНК.

  Принципиально важно отметить,  что разработанная и предлагаемая методика может быть  использована  не только при оценке лучевого воздействия,  но и при других видах противоопухолевой терапии, поскольку зависимость параметров W1(d/0) и К фактически отражает сохранившийся уровень синтеза ДНК опухолевых клеток.

Таблица 11

Показатели индивидуального ответа опухоли на облучение, определенные по параметру К



К

K

W1(d/0)

%

Подавление пролифе-ративной активности

(%)

меланома В-16

саркома-180

рентгеновское облучение

тепловые нейтроны

10BSH + тепловые нейтроны

рентгеновское облучение

Доза

(Гр)

M

%

Т(зад.)

сут

Доза

(Гр)

M

%

Т(зад.)

сут

Доза

(Гр)

M

%

Т(зад.)

сут

Доза

(Гр)

Т(зад.)

сут

1

100

0

0

100

0

0

100

0

0

100

0

0

0

1,1

89,2

26,8

2,1

88,3

1,2

0,6

85,6

2,2

0,2

92,0

3,1

2,3

1,8

1,2

71,9

44,1

3,2

82,5

1,6

1,0

78,7

2,7

0,4

87,7

3,5

4,2

2,1

1,3

59,0

55,7

4,8

75,0

2,2

1,4

69,9

3,4

0,6

82,0

3,7

7,5

2,6

1,4

49,1

64,1

7,0

65,9

3,1

2,1

59,5

4.3

0,8

74,8

4,0

12,8

3,5

1,5

41,3

71,3

9,8

55,5

4,2

2,9

48,1

5.6

1,1

66,1

4,5

20,9

4,8

1,6

35,2

77,5

13,6

44,3

5,6

4,0

36,4

7.2

1,6

56,3

5,0

33,2

6,7

1,7

30,3

82,9

18,3

33,3

7,5

5,5

25,4

9.3

2,2

45,8

5,8

51,1

9,6

1,8

26,3

87,5

24,4

23,1

9,8

7,3

16,2

12.0

2,9

35,3

6,2

76,9

13,7

1,9

23,0

91,5

32,0

14,7

12,8

9,5

9,2

15.3

3,8

25,5

7,8

113,2

19,5

2

20,3

94,9

41,4

8,4

16,5

12,3

4,6

19.4

4,9

17,0

9,8

163,3

27,6

2,1

17,9

97,8

52,8

4,2

20,9

15,7

2,0

24.4

6,3

10,4

12,3

2,2

16,0

100,4

66,6

1,8

26,3

19,9

0,7

30.5

7,9

5,8

15,4

ВЫВОДЫ

  1. Предложены и разработаны параметры количественной неинвазивной оценки реакции индивидуальной опухоли на облучение с использованием меченного различными изотопами йода ЙДУР.
  1. Модельный параметр W1(d/0), связанный с количеством  ЙДУР,  включенного  в  ДНК опухолевых клеток,  и отражающий степень изменения пролиферативной активности в индивидуальной опухоли.
  2. Коэффициент К (отношения угловых коэффициентов кривых выведения РМ из  облученной  опухоли  к их значениям до облучения), который рассчитывается непосредственно  по  данным радиометрии  с помощью внешних детекторов  в  первые двое суток после введения ЙДУР.
  1. Определена функциональная (количественная) взаимосвязь параметра W1(d/0) с коэффициентом К и показана независимость параметров корреляционного уравнения между W1(d/0) и К от типа  облучения, что позволяет сделать вывод  о возможности применения коэффициента К при любом противоопухолевом воздействии, поскольку фактически он отражает сохранившийся уровень синтеза ДНК опухолевых клеток.
  2. Установлены корреляционные зависимости коэффициента К с параметрами роста опухоли меланомы В-16 и саркомы-180, с дозой облучения опухоли для отдельных животных  при рентгеновском облучении, облучении тепловыми нейтронами и облучении тепловыми нейтронами в сочетании с 10ВSH. Эта зависимость может служить количественной мерой индивидуального ответа опухоли на противоопухолевое воздействие. 
  3. Для оценки биологической эффективности разработан и применен биологический критерий – параметр М (отношения объемов опухолей на экспоненциальной фазе возобновленного после облучения роста опухолей к их значениям до облучения), характеризующий зависящую от дозы долю объема опухоли, клетки которого сохранили  пролиферативную активность после облучения. Он позволяет нетравматично получать оценку  реакции опухоли на облучение и  заменить во многих случаях  сложный  метод изучения выжившей  после облучения фракции опухоли клеток.
  4. В результате проведенного комплекса исследований научно обоснована, разработана и внедрена в экспериментальную практику система раннего (48ч) индивидуального прогностического количественного мониторинга эффективности  лучевого воздействия на опухоль с использованием параметров выведения меченого ЙДУР.  Метод прост, относительно быстр и универсален. Он может быть применен для оценки реакции опухоли на  любое воздействие, приводящее к изменению уровня синтеза ДНК.

Основное содержание работы изложено в следующих публикациях:

статьи

    1. Р.А.Спрышкова, А.И.Севастьянов, М.Г.Найденов, Н.Г.Серебряков, Е.Ю.Григорьева. «125I-йоддезоксиуридин в реакции экспериментальных опухолей на облучение», Медицинская радиология, 1989, N 9, с.40-45.
    2. R.A.Spryshkova, E.Yu.Grigoryeva, M.G.Naidenov, A.S.Yagoubov, «The use of 5-iodo-2-deoxyuridine for evaluation of individual tumour in response to irradiation to biological models», Лабораторные животные, 1991, т.1, N3, с.53-57.
    3. Р.А.Спрышкова, Е.Ю.Григорьева, В.А.Братцев, А.И.Севастьянов, М.Г.Найденов, «5-йод-2-дезоксиуридин в оценке индивидуальной реакции экспериментальных опухолей на облучение», Вопросы онкологии, 1992, N 9, c.327-334.
    4. А.В. Андреев, А.И.Гусев, Е.Ю.Григорьева, «Аналитические характеристики набора ИРМА АФП для  определения альфа-фетопротеина человека», Клиническая лабораторная диагностика, 1993,N3, с.54-58.
    5. Р.А.Спрышкова, А.С.Ягубов, Е.Ю.Григорьева, Е.Ю.Колдаева, «Настоящее  положение бор-нейтроннозахватной терапии опухолей», Вопросы онкологии, 1995, т.41, N 2, с.106-107.
    6. R.A.Spryshkova, E.Yu.Grigorieva, M.G.Naidenov, G.I.Borisov, «Biological efficacy of BSH-thermal neutron irradiation estimated with different methods on the model of B-16 melanoma», Frontiers  in Neutron Capture Therapy, Chemistry and Biology, Eds. B.Larsson, J.Crawford, R.Weinreich, 1997, v.2, pp.563-567.
    7. E.Yu.Grigorieva, R.A.Spryshkova, «Methodological principles for the use of 5-iodo-2-deoxyuridine labelled with radioactive iodine for in vivo evaluation of individual tumour response to irradiation», Frontiers  in Neutron Capture Therapy, Chemistry and Biology, Eds. B.Larsson, J.Crawford, R.Weinreich, 1997, v.2, pp.557-562.
    8. А.В. Андреев, Е.Ю.Григорьева, «Вариант моноклонального радиоиммунологического анализа альфа-фетопротеина»,  Клиническая лабораторная диагностика,1998, N2, с. 43-45.
    9. Л.И. Захаркин, В.A. Oльшевская, Р.А. Спрышкова, E.Ю. Григорьевa, В.И. Рябкова, Г.И. Борисов, «Синтез бис (диалкиламинометил) –о – и –m- карборанов и исследование их в качестве возможных препаратов для боронейтронозахватной терапии», Хим.фарм. журнал, 2000, т.34, N6, с. 21-23.
    10. A.V.Tultaev, O.A.Yuminov, R.A.Spryshkova, E.Yu.Grigorieva at.all «About radiotherapy of the thyroid gland cancer with use of alpha-emitter radionuclides: prognosis of the 211At radiation dose in the organs and whole patent body calculated on the base the laboratory investigation data on the pharmacokinetic of “Astatine chloride, 211At” with rats». Preprint INP MSU 2000, 31/635  МГУ им. М.В.Ломоносова  НИИ Ядерной Физики  им. Д.В.Скобельцева.
    11. E. Grigorieva, R. Spryshkova, V. Riabkova, K. Zhizhin, E. Malinina, A. Chernyavsky, E. Luk’yanets, K. Solntsev, N. Kuznetsov, G. Borisov, «Biodistribution study of novel dodecaborate-phtalocyanines in the B-16 mouse melanoma», Frontiers in Neutron Capture Therapy. Ed. M.F. Hawthorhe, K. Shelly, R.J. Wiersema. Kluwer Academic/plenum Publishers, NY.2001, V.2, pp.1027-1032.
    12. А.В.Тултаев, О.А.Юминов, Р.А.Спрышкова, Е.Ю.Григорьева «Радионуклидная терапия рака щитовидной железы с использованием альфа-эмиттеров: прогноз значений поглощенной дозы излучения (экспериментальное исследование)», Медицинская радиология и радиационная безопасность, 2001,т.46, с. 11-17.
    13. А.В.Андреев, Е.Ю.Григорьева, «Количественноеопределение моноклональных  антител с помощью твердофазного конкурентного радиоиммуноанализа с использованием нативного антигена», Иммунология, 2001, № 1  с.60-63. 
    14. Е.Ю. Григорьева, Т.Г. Николаева, Е.Ю. Колдаева, М.Г. Найденов, Р.А. Спрышкова «Na210B12H11SH (BSH) – препарат для нейтронозахватной терапии: биораспределение и влияние на клеточный цикл меланомы В-16», Российский Биотерапевтический Журнал, 2005, N 3, с.30-33.
    15. Е.Ю.Григорьева, Е.Ю Колдаева, М.Г. Найденов «Экспериментальные подходы к количественному мониторингу терапии злокачественных опухолей». Российский Биотерапевтический Журнал, 2007, N 3, с.60-66.
    16. Е.Ю.Григорьева, Е.Ю Колдаева, М.Г. Найденов, Г.И.Борисов, К.Ю.Жижин «Нейтронозахватная терапия меланомы мышей при использовании линзы Кумахова», Российский Биотерапевтический Журнал, 2007 N4, с.13-16.

Тезисы докладов

  1. R.A.Spryshkova, E.Yu.Grigoryeva, M.G.Naidenov, A.S.Yagoubov, «The use of 5-iodo-2-deoxyuridine for evaluation of individual tumour response to irradiation», Abstracts Х1 International Symposium on Laboratory Animals and Experimental medicine, Riga, 2-4 October, 1990.
  2. Р.А. Спрышкова, А.С. Ягубов, Е.Ю. Григорьева, Е.Ю. Колдаева «Современное состояние нейтронозахватной терапии опухолей», Материалы Всероссийского Съезда Онкологов, Ростов – на –Дону, 10-12 октября 1995.
  3. Р.А. Спрышкова, Е.Ю. Григорьева, Е.Ю.Колдаева, «Перспективы 10В-нейтронозахватной терапии опухолей», Медицинская физика, техника, биология, клиника. 1995, N 2, с.54.
  4. R.A.Spryshkova, E.Yu.Grigorieva and G.I.Borisov, «Biological efficacy of BSH-thermal neutron irradiation estimated with different methods on the model of B-16 melanoma», Seventh International Symposium on Neutron Capture Therapy for Cancer. Programme and Abstracts the International Society for NCT, Zurich, Switzerland, 4-7 September, 1996, B 26, p.43.
  5. E.Yu.Grigorieva and R.A.Spryshkova, «Methodological principles for the use of 5-iodo-2-deoxyuridine labelled with radioactive iodine for in vivo evaluation of individual tumour response to irradiation», Seventh International Symposium on Neutron Capture Therapy for Cancer. Programme and Abstracts the International Society for NCT, Zurich, Switzerland, 4-7 September,1996, B 25, p.43.
  6. R.Spryshkova, E.Yu.Grigorieva, V.Riabkova, K.Zhizhin, E.Malinina, «Pharmacokinetic study of novel dodecaborate-phthalocyanines in the B-16 mouse melanoma model», Eighth International Symposium on Neutron Capture Therapy for Cancer. 13-18 September 1998, La Jolla, California, U.S.A., Program and Abstracts, E12, E-12, p.43.
  7. R.Spryshkova, E.Yu.Grigorieva, V.Riabkova, M.G.Naidenov G.I.Borisov, Е.V.Egorov, «Chemistry,Biological Studies and Medical Application of  Boron Compounds», ХY1 Менделеевский съезд по общей и прикладной химии, "Научная сессия по проектам INTAS в области химии" программа, 25-29 мая 1998г., Санкт-Петербург, стр.153, 961-1114.
  8. О.V.Fotina, A.V.Tultaev, O.A.Yuminov, R.A.Spryshkova, S.Y.Platonov, E.O.Eremenko, V.A.Drozdov, E.Yu.Grigorieva, V.I.Riabkova, I.P.Petrova «At alpha-emitter in isotonic solution as a valuable tool for cancer therapy», Seventh International Radiopharmaceutical Dosimetry Symposium, October 17-19, 2002, p.55.
  9. G.I. Borisov, M.G. Naidenov,E.Yu. Koldaeva, E.Yu. Grigorieva, S.A. Petrov, K.Yu. Zhizhin, V.A. Brattsev «Neutron capture therapy (NCT) of melanoma in mice using new boron carriers and neutron capillary optics», Second Int. Conference on X-Ray and Neutron Capillary Optics, Zvenigorod, Russia, 22-26.09 2004, pp.15-16.
  10. Е.Ю. Григорьева, Е.Ю. Колдаева, Е.А. Барышникова, Г.И. Борисов,

М.Г. Найденов, Р.А. Спрышкова «Фармакокинетика натриевой, магниевой и кальциевой солей поликарбораниленпроизводного бета-аланина – носителей бора для нейтронозахватной терапии», Материалы Всероссийской научно-практической конференции «Отечественные противоопухолевые препараты», Москва, 17-19.03 2004, Российский Биотерапевтический Журнал, 2004, N 2, с. 21.

  1. Е.Ю.Григорьева, Т.Г.Николаева,  Е.Ю. Колдаева, В.Н.Братцкв  «Кинетика клеточной популяции меланомы В-16 при действии BSH – препарата для нейтронно-захватной терапии», Материалы Всероссийской научно-практической конференции «Отечественные противоопухолевые препараты», Москва, 16.03-18.03 2005, Российский Биотерапевтический Журнал, 2005, N 1,  с.23.
  2. Е.Ю.Григорьева, М.Г. Найденов, Г.И.Борисов, Е.Ю. Колдаева «Количественное определение бора в процессе нейтронно-захватной терапии», Материалы Всероссийской научно-практической конференции «Отечественные противоопухолевые препараты» ,Москва,16.03-18.03.2005, Российский Биотерапевтический Журнал, 2005, N 1, с.26.
  3. М.Г. Найденов, Е.Ю. Колдаева, Е.Ю. Григорьева,  С.А. Петров, Н.Т. Кузнецов, К.Ю. Жижин, В.А. Братцев, Г.И. Борисов «Нейтронозахватная терапия (НЗТ) меланомы мышей на новых носителях бора с использованием капиллярной нейтронной оптики», Материалы Всероссийской конференции «Радиобиологические основы  лучевой терапии», Москва, 19.04-20.04 2005, с.48.
  4. Е.Ю. Григорьева, Е.Ю. Колдаева, М.Г. Найденов «Параметры оценки индивидуального ответа опухоли на облучение», Материалы VI Всероссийского съезда онкологов, т.II «Современные технологии в онкологии», Ростов-на-Дону, 2005, с.295-296.
  5. Е.Ю. Колдаева, Е.Ю. Григорьева, М.Г. Найденов, Ю.В. Стукалов, В.А. Братцев, Г.И. Борисов «Сравнительное изучение  трех новых отечественных бор-содержащих соединений для нейтронозахватной терапии рака», Материалы VI Всероссийского съезда онкологов, т.II «Современные технологии в онкологии», Ростов-на-Дону, 2005, с.294.
  6. Е.Ю. Колдаева, Е.Ю. Григорьева,  М.Г. Найденов, Ю.В. Стукалов, В.А. Ольшевская, А.В. Зайцев, Рами Аюб «Биораспределение борированного гема – носителя бора при нейтронозахватной терапии (НЗТ)», Материалы Всероссийской научно-практической конференции «Отечественные противоопухолевые препараты», Москва, 21.03-24.03 2006, Российский Биотерапевтический Журнал, 2006, N 1, с.36.
  7. Е.Ю. Колдаева, Е.Ю. Григорьева, А.С. Масько, В.А. Ольшевская, А.В. Зайцев, Рами Аюб «Общая токсичность карборан-производных порфиринового ряда – препаратов для нейтронозахватной терапии (НЗТ)», Материалы Всероссийской научно-практической конференции «Отечественные противоопухолевые препараты», Москва, 21.03-24.03 2006, Российский Биотерапевтический Журнал, 2006, N 1, с.37.
  8. Е.Ю Колдаева,  М.Г. Найденов,  Е.Ю. Григорьева, Г.И. Борисов, Н.Т.Кузнецов, К.Ю. Жижин «Нейтронозахватная терапия (НЗТ) меланомы мышей В-16 с использованием  новых препаратов 10В  и линзы Кумахова», Материалы IV съезда онкологов и радиологов СНГ, Баку, 28.09-01.10 2006.
  9. Е.Yu.Grigorieva, Е.Yu. Коldaeva, T.G. Nikolaeva «ВSH  - B10- carrier for neutron capture therapy: influence on cell cycle of melanoma B-16», Twelth International Symposium on NeutronCapture Therapy for Cancer .Programme and Abstracts the International Society for NCT, Tokio, Japan, 4-7 October, 2006, E 60, p.84.
  10. Е.Yu.Grigorieva, Е.Yu. Коldaeva, I.P. Shabalkin «The study of ultrastructural alterations in the melanoma B-16 cells after administration of 10B-compounds to mice», Twelth International Symposium on Neutron Capture Therapy for Cancer .Programme and Abstracts the International Society for NCT, Tokio, Japan, October, 2006, E 60, p.84.
  11. Е .Ю. Колдаева, Е.Ю. Григорьева, В.А. Братцев, Дж.Моррис, А.С. Масько, Г.И. Борисов, Р.А. Спрышкова «Острая  токсичность и биораспределение роданододекабората натрия – препарата для нейтронозахватной терапии (НЗТ)», Материалы Всероссийской научно-практической конференции «Отечественные противоопухолевые препараты», Москва, 24.03-26.03 2007, Российский Биотерапевтический Журнал, 2007, N 1 , с.46.
  12. Е.Ю.Григорьева, Е.Ю Колдаева, М.Г. Найденов, Ю.С. Стукалов, А.С. Масько, С М. Лисовский, Н.Т. Кузнецов, К.Ю. Жижин , Г.И. Борисов «Нейтронозахватная терапия  мышиной меланомы В-16  на новых  носителях  10В”, Материалы Всероссийской научно-практической конференции «Отечественные противоопухолевые препараты», Москва, 24.03-26.03 2007, Российский Биотерапевтический Журнал, 2007, N 1 , с.82.
  13. Е.Ю.Григорьева, Е.Ю Колдаева, М.Г. Найденов,  А.С. Масько «Взаимосвязь роста опухоли и параметров выведения йод-дезоксиуридина.». Материалы Всероссийской научно-практической конференции «Отечественные противоопухолевые препараты», Москва, 24.03-26.03 2007, Российский Биотерапевтический Журнал, 2007, N 1, с.82.
  14. Е.Ю Колдаева, Е.Ю.Григорьева М.Г. Найденов,  А.С. Масько, Н.Т. Кузнецов, К.Ю. Жижин, С.М. Лисовский, Г.И. Борисов «Биораспределение производного клозо-борат-аниона – носителя бора (ПКА) при нейтронозахватной терапии (НЗТ) в организме мышей С57Bl/6 с трансплантированной меланомой В-16», Материалы Всероссийской научно-практической конференции «Отечественные противоопухолевые препараты», Москва,17.03-19.03 2008, Российский Биотерапевтический Журнал, 2008, N 1, с.58.
  15. Е.Ю.Григорьева, Е.Ю Колдаева, М.Г. Найденов,  А.С. Масько, Н.Т. Кузнецов, К.Ю. Жижин, С.М. Лисовский, Г.И. Борисов «Субклеточное распределение производного клозо-борат-аниона – препарата для нейтронозахватной терапии», Материалы Всероссийской научно-практической конференции «Отечественные противоопухолевые препараты», Москва,17.03-19.03 2008, Российский Биотерапевтический Журнал, 2008, N 1, с.57.
  16. Е.Ю. Григорьева, Ю.В. Стукалов, Е.Ю. Колдаева «Сравнительная токсикология вновь разработанных конструкций на основе дендримеров нового класса в таргетной терапии злокачественных опухолей», Материалы VI  симпозиума «Биологические основы терапии онкологических заболеваний». – Москва, 29-31.01.2009, Онкогематология,  2008, N 4, стр. 42-43.





© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.