WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

 

На правах рукописи

головков

Дмитрий Анатольевич

Клиническая значимость ключевых маркеров ангиогенеза,

апоптоза и системы активации плазминогена в сыворотке крови и опухоли больных колоректальным раком

14.00.46 - клиническая лабораторная диагностика
14.00.14 - онкология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени
доктора медицинских наук

Москва - 2008 г.

Работа выполнена на кафедре клинической биохимии и лабораторной диагно-
стики ФПДО «Московский государственный медико-стоматологический уни-
верситет» Росздрава

Научные консультанты:

член-корреспондент РАМН, профессор  Н.Е.Кушлинский
доктор медицинских наук В.В.Делекторская

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук  Н.Ю.Полонская

доктор медицинских наук  М.Н. Обушева

доктор медицинских наук, профессор  Ю.А.Барсуков
Ведущая организация: Московская медицинская академия им. И.М.Сеченова

Защита диссертации состоится «____»______________2008г. на заседании Диссертационного Совета Д.208.071.04 при Российской медицинской
академии последипломного образования по адресу: (123995 Москва,
ул.Баррикадная, д. 2/1).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российской медицинской академии последипломного образования (125445, г. Москва, ул.Беломорская ,19).  Автореферат разослан «____»_____________208г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета

доктор медицинских наук, профессор В.Т.Морозова 

  ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. В последние годы в большинстве стран мира, в том числе и в нашей стране наблюдается рост заболеваемости колоректальным раком (Г.И.Воробьев и соавт., 2005; Hawk Е.Т. et al., 2002; Levin В. et al., 2005). Ежегодно в мире регистрируется около 1 млн. новых случаев рака прямой и ободочной кишки (3-й по частоте показатель заболеваемости среди онкологических болезней), а умирает почти 500 тыс. человек (4-е место по показателю смертности) (Engstrom P.F., 2000; Parkin D.M. et al., 1999; В.В.Мартынюк, 2000; Н.Н.Симонов и соавт., 2000; Н.Н.Трапезников и соавт., 2000).

По прогнозу ожидается, что в XXI веке в России рак данной локализа-
ции займет первое место в структуре онкологической заболеваемости
(Н.Н.Симонов и соавт., 1997; Н.А.Яицкий и соавт., 2004; Е.М.Аксель и со-
авт., 2004). В России ежегодно колоректальным раком заболевают 50 тыс.
человек (3-е место у мужчин после рака легких и желудка и 2-е место у жен-
щин после рака молочной железы) при ежегодной смертности, равной 35 тыс.

Метастазы являются основным фактором, отягощающим прогноз коло-
ректального рака. Поэтому, в настоящее время проводится активный поиск дополнительных маркеров, которые предсказывают высокий риск опухолевой прогрессии (В.И.Киселев и соавт., 2005).

В настоящее время бурно развивается направление молекулярной ди-
агностики и оценки прогноза этих опухолей, а исследование особенностей
биологического поведения опухоли является в настоящее время одной из
наиболее актуальных областей онкологии (А.А.Новик и соавт., 2004; Von
Kleist S., 2008). Расширяются возможности иммуногистохимического выявления в клетках колоректального рака и в структурах внеклеточного матрикса особенностей экспрессии молекулярных маркеров, отражающих специфику биологической активности опухоли (В.В.Делекторская и соавт., 2008; Muller W. et al., 1998; Sarris M. et al., 2001; Ahmed F.E. et al., 2005). Среди опухолеассоциированных протеолитических ферментов ведущую роль играет система активаторов плазминогена, представленная двумя протеазами – тканевым и урокиназным активаторами плазминогена (uРА и tPA), а также металлопротеиназная система, состоящая из 25 представителей (Н.Е.Кушлинский и соавт., 2008). Ключевую роль в семействе металлопротеиназ играют ММР-2 и ММР-9, функция которых связана с гидролизом коллагена базальных мембран (Е.С.Герштейн и соавт., 2008). uРА и tPA превращают неактивный зимоген плазминоген в плазмин, расщепляющий фибрин и белки внеклеточного матрикса, а также активирующий ММР-2 и ММР-9. Эти процессы способ-
ствуют разрушению базальных мембран и облегчают инвазию опухолевых
клеток. При этом важную роль в опухолевой прогрессии играют и их эндо-
генные ингибиторы (TIMP и PAI), которые могут способствовать протеоли-
тическому действию ферментов (Gershtein E. et al., 2007). ММР, сериновые
протеазы (uPA, tPA) не только облегчают опухолевый рост, раковую инвазию
и метастазирование, но и могут являться мишенью для противоопухолевой
терапии и лечения метастазов (Е.С.Герштейн и соавт., 2007; Mysliwill A.G. et
al., 2002; Waas E.T. et al., 2002; Gontero P. et al., 2004).

Основные белки базальных мембран (коллаген IV типа и ламинин) яв-
ляются не только структурным барьером для метастатического распростра-
нения раковых клеток, но и важной функциональной единицей, участвующей
в опухолевой прогрессии (Galbavy S. et al., 2002).

При этом деградирующие матрикс протеиназы не только ремоделиру-
ют архитектуру внеклеточного матрикса, но и воздействуют на различные

пути передачи сигнала в клетке, усиливают ангиогенез и способствует укло-
нению опухоли от программы апоптоза (Г.И.Абелев и соавт., 2008). Так, из-
вестно, что ключевым проангиогенным фактором является VEGF - гликопро-
теин, стимулирующий пролиферацию эндотелиальных клеток. Этот фактор
усиленно продуцируется также клетками ряда новообразований, способствуя
неоваскуляризации опухоли и усилению проницаемости сосудов (Gershtem
E.S. et al., 2006; Shin J.E. et al., 2007).

Апоптоз или его отдельные элементы выполняют важные физиологи-
ческие функции, при этом преодоление апоптоза является необходимым ус-
ловием успешного развития опухоли (С.Г.Аббасова и соавт., 2007). Один из
механизмов, регулирующих эти процессы в опухоли, связан с активностью
апоптоз-специфических белков системы Fas/FasL (Bennett M.W. et al., 2001;
O'Connell J. et al. 2000; Zhu Q. et al., 2005; Song E. et al., 2001).

Относительно недавно получены первые клинические исследования по
неоангиогенезу и Fas-зависимому апоптозу при солидных опухолях, в том
числе и колоректальном раке (С.Г.Аббасова и соавт., 2007). Показано, что
повышенный уровень продукции ключевого активатора ангиогенеза - VEGF
и ингибитора апоптоза - растворимого Fas-антигена (sFas) у больных некото-
рыми злокачественными новообразованиями может свидетельствовать о вы-
соком «метастатическом потенциале» опухоли, что является неблагоприят-
ным прогностическим фактором (А.А.Фильченков и соавт., 1999;
С.М.Киселев и соавт., 2003). Однако эти данные основаны пока на незначи-
тельном числе наблюдений. Кроме того, не изучали одновременно факторы
ангиогенеза и апоптоза с использованием малоинвазивных биохимических
методов исследования в сыворотке крови, что также затрудняет обсуждение
представленных в литературе результатов.

Несмотря на то, что накапливается все больше данных о нарушениях
нормальной экспрессии и функционирования молекулярных факторов при
раке толстой кишки, их влияние на клиническое течение и прогноз заболева-
ния изучено недостаточно. Многие вопросы, касающиеся корреляции клини-
ко-морфологических характеристик опухоли и изменений биологических по-
казателей, происходящих в процессе прогрессирования рака толстой кишки,
нуждаются в уточнении. Этим определяется актуальность изучения молеку-
лярных критериев, прогнозирующих агрессивность течения колоректального
рака.

Цель работы.

Изучение особенностей экспрессии молекулярно-биологических мар-
керов внеклеточного матрикса, ангиогенеза, апоптоза в опухоли, сыворотке
крови больных раком толстой кишки и роли комплекса этих факторов в
оценке прогноза заболевания.

Задачи исследования.

1.        Изучить биохимические и иммуногистохимические особенности
экспрессии ММР-9 в первичных опухолях больных раком толстой кишки и в
прилежащей к опухоли непораженной слизистой оболочке.

2.        Исследовать особенности экспрессии структурных компонентов ба-
зальных мембран (коллагена IV типа) в злокачественных опухолях толстой
кишки.

3.        Провести сравнительный анализ особенностей экспрессии фермен-
тов внеклеточного матрикса и компонентов базальных мембран и выявить их
взаимосвязь с основными клиническими и морфологическими параметрами
заболевания.

4.        Провести иммуноферментное определение молекулярно-
биологических маркеров неоангиогенеза (VEGF) и апоптоза (sFas) в сыво-
ротке крови больных раком толстой кишки и изучить корреляцию биохими-ческих показателей с основными клинико-морфологическими параметрами
заболевания.

  1. Провести иммуноферментное определение содержания компонентов
    системы активации плазминогена (uPA, tPA, PAI-1) в опухоли больных коло-
    ректальным раком и изучить корреляцию биохимических показателей с ос-
    новными клинико-морфологическими характеристиками заболевания.
  2. Определить прогностическую значимость биохимических и имму-
    ногистохимических особенностей экспрессии белковых маркеров у больных
    раком толстой кишки.
  3. Провести статистическую обработку данных и на основании много-
    факторного анализа результатов исследования выделить значимые и незави-
    симые прогностические показатели при раке толстой кишки.

Научная новизна.

Проведен комплексный клинический, морфологический и
биохимический анализ современных молекулярно-биологических маркеров у
больных раком толстой кишки, таких как протелитические ферменты и ком-
поненты внеклеточного матрикса, факторы неоангиогенеза и апоптоза.

Обнаружена повышенная экспрессия ММР-9 в ткани опухоли больных
раком толстой кишки у 48,7% пациентов. При этом, частота выявления высо-
кой экспрессии белка достоверно повышалась до 80% у больных при мета-
стазах в печени, при низкой степени дифференцировки опухоли (80%) и при
наличии инвазии опухоли в кровеносных сосудах (82,4%).

У 57,2% больных раком толстой кишки выявлена низкая экспрессия
коллагена IV типа в опухоли, причем частота выявления низкой экспрессии
белка достоверно повышалась у пациентов с метастазами в печени (85%),
при низкой степени дифференцировки опухоли (76%), при выраженной глу-
бине инвазии в стенку кишки (75%), а также при наличии инвазии клеток ра-
ка в кровеносные сосуды (86,3%).

Обнаружено что уровень ключевого активатора неоангиогенеза VEGF в сыворотке крови больных раком толстой кишки был достоверно выше по сравнению с контролем. Причем, достоверно более высокое содержание VEGF выявлено в сыворотке крови больных при местнораспространенной и IV стадии колоректального рака, тогда как концентрация VEGF у больных раком толстой кишки при I и Па стадиях опухоли не отличалась от содержания маркера у практически здоровых людей.

Содержание маркера достоверно повышалось при увеличении глубины инвазии опухоли в стенку кишки и при наличии инвазии опухоли в кровеносных сосудах. Содержание VEGF при низкой степени дифференцировки колоректального рака было достоверно выше, чем при высокой. Одновременно с увеличением концентрации VEGF в сыворотке крови больных раком толстой кишки обнаружено достоверное повышение в опухоли уровня неблагоприятно высокой экспрессии ММР-9 и одновременно низкая экспрессия коллагена IV типа.

Впервые обнаружено, что sFas выявлялся в 2 раза чаще у больных ко-
лоректальным раком по сравнению с контролем, а его содержание в сыво-
ротке крови практически здоровых людей было ниже, чем у больных. При
этом, уровни sFas в сыворотке крови больных раком толстой кишки зависели
от стадии заболевания, хотя при I стадии не отличались от содержания мар-
кера у практически здоровых людей. Достоверно выше было содержание sFas
при значительной глубине инвазии, при наличии инвазии в кровеносные со-
суды, при неблагоприятных уровнях экспрессии белков ММР-9 и коллагена
IV типа.

Обнаружено, что содержание uРА и tPA в ткани опухоли больных ра-
ком толстой кишки было достоверно выше, чем в неизмененной слизистой.
При этом, уровни uРА и tPA в ткани первичной опухоли зависели от ряда
клинико-морфологических характеристик опухоли.

Полученные данные свидетельствуют о том, что новый подход к про-
гнозированию клинического течения колоректального рака основан на ис-
пользовании комплексного анализа согласованных изменений экспрессии изученных молекулярно-биологических маркеров в опухоли и сыворотке крови больных с целью определения связи данных показателей с инвазивным и метастатическим потенциалом опухоли, а стало быть, и выживаемостью пациентов. На основании исследования молекулярно-биологических характеристик колоректального рака разработаны критерии, позволяющие идентифицировать случаи с повышенным риском развития отдаленных метастазов.

Впервые при раке толстой кишки изучена корреляция между экспрессией белков базальных мембран, факторов неоангиогенеза, апоптоза, активностью матриксных металлопротеиназ и компонентов системы активации плазминогена. Изучение особенностей экспрессии белковых маркеров в опухоли и сыворотке крови больных колоректальным раком позволило уточнить некоторые патогенетические механизмы прогрессирования опухоли.

Практическая значимость.

На основе анализа некоторых молекулярно-биологических характери-
стик опухоли определены критерии для выявления наиболее прогностически
неблагоприятных случаев и предрасположенности, больных колоректальным
раком к развитию метастазов. Так, показатели общей выживаемости больных
колоректальным раком при высоком уровне экспрессии ММР-9 в первичной
опухоли в 3 раза достоверно ниже, чем при низкой экспрессии белка, а 5-
летняя безрецидивная выживаемость пациентов ниже в 1,5 раза. Показатели
общей 5-летней выживаемости больных раком толстой кишки зависели от
уровня исходной концентрации ключевого активатора неоангиогенеза VEGF
в сыворотке крови и при высоких его значениях (от 800 пг/мл и более), они
были достоверно ниже, чем при значении VEGF менее 400 пг/мл. При этом,
высокий уровень экспрессии ММР-9 в первичной опухоли больных колорек-
тальным раком был связан с повышенными исходными уровнями VEGF в
сыворотке крови. Общая 5-летняя выживаемость больных колоректальным
раком при уровнях sFas в сыворотке крови от 10 нг/мл и более была досто-
верно ниже. Кроме того, обнаружено, что безрецидивная выживаемость
больных раком толстой кишки достоверно различалась между больными по пороговому уровню 3 нг/мг белка для иРА, 2 нг/мг белка для tPA и 2 нг/мг
белка для PAI-1. Многофакторный анализ выявил наиболее неблагоприятные
сочетания маркеров при оценке общего прогноза рака толстой кишки: ММР-
9-коллаген IV типа, MMP-9-uPA, MMP-9-PAI-1, коллаген IV типа-PAI-l и
при прогнозе отдаленных метастазов MMP-9-sFas.

Таким образом, настоящее исследование представляет практический
интерес для оценки послеоперационного прогноза больных раком толстой
кишки и выделения групп повышенного риска развития метастазов и реци-
дивов, требующих дополнительного лечения или более тщательного динами-
ческого наблюдения.

Апробация работы.

Апробация диссертации проведена на совместной научной конферен-
ции с участием сотрудников кафедры клинической биохимии и лабораторной диагностики Московского государственного медико-стоматологического
университета, лаборатории клинической биохимии, хирургического отделе-
ния проктологии, отдела патологической анатомии опухолей человека НИИ
клинической онкологии ГУ Российского онкологического научного центра
им. Н.Н.Блохина РАМН 12 июня 2008г.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 19 научных
работ, в том числе в изданиях, рекомендуемых ВАК – 7 печатных работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 177 стра-
ницах и состоит из введения, обзора литературы, описания материала и ме-
тодов исследования, 4 глав результатов собственных исследований, обсуж-
дения полученных результатов, выводов и практических рекомендаций.
Текст иллюстрирован 58 таблицами и 23 рисунками. Указатель литературы
содержит 74 работ отечественных и 186 зарубежных авторов.
  Положения, выносимые на защиту;

  1. Наиболее высокие уровни экспрессии ММР-9 выявлены в опухоли у пре-
    обладающего большинства больных раком толстой кишки при поздних
    стадиях заболевания, при низкой степени дифференцировки опухоли, а также при наличии инвазии карциномы в кровеносных сосудах. При этом, общая 5-летняя выживаемость больных раком толстой кишки при высоком уровне экспрессии ММР-9 достоверно ниже, чем при низкой экспрессии белка.
  2. Низкий уровень экспрессии коллагена IV типа достоверно чаще выявляли
    в опухолях у больных колоректальным раком при распространенном
    процессе, при низкой степени дифференцировки опухоли, при выражен-
    ной глубине инвазии опухоли в стенку кишки, а также при наличии инва-
    зии опухоли в кровеносных сосудах. Показатели общей 5-летней выжи-
    ваемости больных с низкой экспрессией коллагена IV типа в опухоли бы-
    ли достоверно ниже, чем при высокой экспрессии маркера.
  3. Исходная концентрация ключевого активатора неоангиогенеза VEGF в
    сыворотке крови больных раком толстой кишки была достоверно выше по сравнению с практически здоровыми людьми. При этом, уровень маркера
    достоверно повышался в сыворотке крови больных с увеличением глуби-
    ны инвазии опухоли в стенку кишки, при прорастании опухоли в крове-
    носные сосуды, при низкой степени дифференцировки опухоли.
  1. Самые низкие показатели общей 5-летней выживаемости отмечены среди
    больных раком толстой кишки с высокими уровнями VEGF (от 800 пг/мл
    и более). При этом, высокий уровень экспрессии ММР-9 в первичной опу-
    холи был связан с повышенными исходными показателями VEGF в сыво-
    ротке крови, тогда как при низких исходных значениях VEGF чаще выяв-
    ляли высокую экспрессию коллагена IV типа в первичной опухоли.
  2. Почти в 2 раза чаще sFas выявляли в сыворотке крови больных колорек-
    тальным раком, а его уровни были достоверно выше по сравнению с прак-
    тически здоровыми людьми,  при этом общая  5-летняя выживаемость
    больных раком толстой кишки при уровнях sFas в сыворотке крови от 10
    нг/мл и более была достоверно ниже.
  3. Содержание uРА и tPA в ткани опухоли больных раком толстой кишки
    было достоверно выше, чем в неизмененной слизистой и зависело от ос-
    новных клинико-морфологических характеристик заболевания, а именно, распространенности опухолевого  процесса, степени  дифференцировки опухоли, глубины прорастания в стенку кишки и кровеносные сосуды.
  4. Безрецидивная выживаемость больных колоректальным раком достовер-
    но различалась по порогу уровню 3 нг/мг белка для uРА, 2 нг/мг белка для
    tPA и 2 нг/мг белка для PAI-1.
  5. Выявлены наиболее неблагоприятные сочетания маркеров при оценке об-
    щего прогноза у больных раком толстой кишки: ММР-9/коллаген IV типа,
    MMP-9/uPA, MMP-9/PAI-1, коллаген IV типа/PAI-l и при прогнозе отда-
    ленных метастазов - MMP-9/sFas.

Содержание диссертации

Материал и методы исследования

Общая характеристика больных раком толстой кишки. В исследо-
вание включено 187 больных раком толстой кишки в возрасте от 34 по 79
лет, проходивших обследование и лечение в ГУ РОНЦ им. Н.Н.Блохина
РАМН в период с 1986 по 2006 гг. и наблюдавшихся после окончания лечения не менее двух лет. Количество больных мужского и женского пола составило 86 (46%) и 101 (54%), соответственно, средний возраст пациентов - 60,5±0,8 лет, медиана - 62 года. Средний возраст больных мужчин и женщин не различался и составил 60,8±1,0 и 60,2±1,1 лет, соответственно.

Распределение больных раком толстой кишки с учетом стадии заболевания представлено в таблице 1. Как видно из данных, приведенных в таблице 1, в группе больных в IVb стадии количество пациентов мужского и женского пола было примерно равным (55 мужчин и 50 женщин), тогда как в группах пациентов с более ранними стадиями - преобладали женщины. Минимальный средний возраст был характерен для больных раком толстой кишки IV стадии.

Таблица 1.

Распределение больных раком толстой кишки
с учетом стадии заболевания

Стадия

Кол-во

Частота (%)

Пол (абс.)

Возраст, годы

больных

м/ж

(М±т)

I

3

1,6

0/3

63,3±3,0

Па

9

4,8

3/6

64,4±1,6

IIb

29

15,5

13/16

65,8±1,5

IIIa

11

5,9

4/7

64,2±3,0

IIIb

21

11,2

  8/13

59,3±2,4

IVa

9

4,8

3/6

58,8±3,2

IVb

20

10,7

6/14

59,9±2,0

IVb с резекцией

85

45,5

49/36

58,3±1,2

печени

Всего:

187

100

86/101

60,5±0,8

Все больные раком толстой кишки подвергнуты хирургическому лече-
нию различного объема: право/левосторонняя гемиколэктомии, резекции
сигмовидной, поперечно-ободочной, прямой кишки.

Отметим, что у 141 (75,4%) больного раком толстой кишки выявлены
единичные и множественные регионарные метастазы в лимфатических узлах.
У 98 (52,4%) пациентов были обнаружены метастазы в печени. При этом, 85
пациентам выполнена резекция печени по поводу метастазов, эти пациенты
выделены нами в отдельную группу с целью анализа прогноза заболевания.

Клинико-морфологическую характеристику больных раком толстой
кишки, вошедших в исследование, проводили в соответствии с Международ-
ной гистологической классификацией опухолей кишечника ВОЗ (1989). Для
определения гистологического типа и варианта строения опухоли, степени ее
дифференцировки, глубины инвазии в кишечную стенку, наличия сосудистой
инвазии изучали парафиновые срезы, окрашенные гематоксилином и эози-
ном. Слизеобразование оценивали с помощью окраски альциановым синим
по Крейбергу. Исследовали также наличие участков некроза, лимфоидной и
воспалительной инфильтрации в опухоли.

При гистологическом исследовании материала у всех больных были
диагностированы аденокарциномы, которые были представлены различными вариантами строения: железистым, папиллярным, трабекулярным и солидноалвеолярным. Из 187 больных раком толстой кишки у 124 (66,3%) пациентов наблюдали железистый вариант строения опухоли, у 43 (23,0%) - преобладали папиллярные структуры, у 7 (3,7%) - выявлен трабекулярный вариант строения аденокарциномы, у 13 (7%) - опухоль была представлена солидными или солидно-альвеолярными структурами.

Высоко дифференцированные аденокарциномы выявлены у 24 (12,8%)
пациентов, умереннодифференцированные - у 138 (73,8%) больных, низко-
дифференцированные - у 25 (13,4%) пациентов.

Опухоли больных раком толстой кишки имели различную глубину ин-
вазии в кишечную стенку: прорастание слизистого и подслизистого слоев наблюдали у 6 (3,2%) больных, врастание опухоли в мышечную оболоч-
ку - у 21 (11,2%) пациента, прорастание всех слоев стенки кишки - у
61 (32,6%) больного, опухоль прорастала все слои и врастала в жировую
клетчатку - 87 (46,5%) пациентов. Глубина инвазии была достоверно свя-
зана со стадией заболевания (р=0,0001). Прорастание опухоли в соседние ор-
ганы и ткани обнаружили у 12 (6,6%) больных раком толстой кишки.

Важной клинико-морфологической характеристикой рака толстой
кишки является наличие у больного инвазии опухоли в кровеносные и лим-
фатические сосуды. У 51 из 187 (27,3%) больных раком толстой кишки обна-
ружена сосудистая инвазия в первичной опухоли. Существенное повышение
частоты выявления сосудистой инвазии (более чем у половины больных) об-
наружено у больных раком толстой кишки при 1ПЬ и IV стадиях по сравне-
нию с более ранними стадиями заболевания.

Слизеобразование в той или иной степени выраженности выявлено в
опухолях 61 из 107 пациентов (57%), страдающих раком толстой кишки, при
этом частота его обнаружения не была связана со стадией заболевания.

Методы определения иммуногистохимических маркеров. Опреде-
ление иммуногистохимических показателей содержания белковых маркеров в опухоли больных раком толстой кишки проведено в лаборатории гистохимии и электронной микроскопии НИИ клинической онкологии ГУ Российского онкологического научного центра им. Н.Н.Блохина РАМН.

Таблица 2.

Характеристика антител

Антиген

Антитело,

Фирма

Рабочее

Функция белка

клон

разведение

ММР-9

Mouse mAb

Novocastra

1 :80

Фермент внеклеточно-

15W2

го матрикса

Коллаген

Mouse mAb

Novocastra

1 :200

Компонент базальных

IV типа

РИМ- 12

мембран

Иммуногистохимическое исследование белковых маркеров в опухолях
больных раком толстой кишки выполняли на серийных парафиновых срезах
с помощью биотин-стрептавидинового иммунопероксидазного метода с при-
менением антител к ММР-9 и коллагену IV типа (фирма «Novocastra», Вели-
кобритания). Характеристика использованных в исследовании антител дана в
таблице 2.

Для иммуногистохимического окрашивания образцы тканей рака тол-
стой кишки и пограничных с опухолью участков слизистой оболочки толстой
кишки фиксировали в 10% забуференном формалине (рН 7.2), проводили по
спиртам и ксилолам, заливали в парафин и готовили серийные срезы толщи-
ной 3-5 мкм, которые наносили на стекла с адгезивным покрытием (Polysine
Menzel-Glaser). Срезы депарафинировали и регидратировали по стандартной
схеме. Для демаскировки антигенов проводили предварительную обработку
парафиновых срезов в микроволновом режиме при мощности 650W 2 раза по
5' с использованием восстанавливающего раствора рН 6,0 (фирма «Dako»,
Дания) с перерывом 2' между процедурами для охлаждения. Для выявления
коллагена IV типа дополнительно проводилась обработка трипсином (фирма
«Dako», Дания) в течение 30". Срезы инкубировали с первичными антитела-
ми на протяжении 18 часов при +4°С. В качестве вторичных антител и пероксидазного комплекса использовали стандартный набор реагентов LSAB + Kit(фирма «Dako», Дания). Для визуализации реакции применяли раствор диаминобензидина DAB+ (фирма «Dako», Дания). Ядра клеток докрашивали гематоксилином Майера. Контрольный срез оставляли без первой инкубации.

Оценка реакции проводилась полуколичественным методом с учетом
интенсивности окрашивания и количества антиген-позитивных клеток, кото-
рые в совокупности определяли уровень экспрессии белковых маркеров (вы-
сокий или низкий). Иммуногистохимическая реакция оценивалась как нега-
тивная («-» - нет реакции), слабопозитивная («+» - <10% окрашенных кле-
ток), умереннопозитивная («++» - >10% клеток средней интенсивности окра-
ски) и сильнопозитивная или сверхэкспрессия («+++» - >10% клеток высокой интенсивности окраски). Для дальнейшего сравнительного иммуногистохи-
мического исследования опухолей выделяли два основных уровня иммуноре-
активности: низкий уровень, включающий опухоли с отсутствием реакции и
слабопозитивной экспрессией (-/+) и высокий уровень, включающий опухо-
ли с умеренной реакцией и сверхэкспрессией маркеров (++/+++).

Для каждого антигена оценивали тип специфического окрашивания,
который зависел от локализации продукта реакции в клетках или строме
опухоли. Специфическую реакцию маркеров в волокнах и клетках стромы
опухолей расценивали как позитивную или негативную. Иммунореактив-
ность коллагена IV типа выявляли по модели экспрессии белка в базальных
мембранах опухолей.

Методы определения биохимических маркеров. Определение био-
химических показателей активности белковых маркеров в опухоли и сыво-
ротке крови больных раком толстой кишки проведено в лаборатории клини-
ческой биохимии НИИ клинической онкологии ГУ Российского онкологиче-
ского научного центра им. Н.Н.Блохина РАМН.

Для биохимического исследования VEGF и sFas использовали образцы
сыворотки крови больных раком толстой кишки, включенных в исследова-
ние, и в качестве контроля - образцы сыворотки крови 60 практически здоро-
вых людей (30 мужчин и 30 женщин) в возрасте 19-70 лет (средний возраст - 61,3±8,6года).

Кровь для определения концентрации VEGF и sFas у больных РТК до
начала лечения и у практически здоровых лиц брали натощак из локтевой ве-
ны с 8°° до 9°° часов утра. После свертывания крови пробирки центрифугиро-
вали при 2500xg в течение 10', сыворотку отбирали и хранили при -20°С до
проведения исследования.

sFas в сыворотке крови определяли иммуноферментным методом, раз-
работанным в Институте биоорганической химии им. М.М.Шемякина и
Ю.А.Овчинникова РАН и лаборатории клинической биохимии ГУ РОНЦ им.
Н.Н.Блохина РАМН (С.Г.Аббасова и соавт., 1999, 2007).

Концентрацию sFas определяли с использованием моноклональных ан-
тител против Fas SA-8 (IgGl-k); (8.8±0.6)xl07, которые сорбировали на
планшетах (Linbro) в 0.05М карбонатном буфере (рН 9.6) в концентрации 5.0
мкг/мл в течение ночи при 4°С. Для инактивации свободных центров связы-
вания планшеты инкубировали с 1% раствором бычьего сывороточного аль-
бумина (БСА) в фосфатно-солевом буфере (PBS) (рН7.2) 1ч при 37°С. Затем в
планшеты вносили сыворотки. В качестве положительного контроля в каж-
дый планшет вносили последовательные двукратные разведения полнораз-
мерного рекомбинантного Fas от 40.0 до 0.15 нг/мл. Планшеты инкубирова-
ли 1.5 ч при 37°С. После инкубации планшеты 6 раз интенсивно промывали
раствором PBS, содержащим 0.1% Tween 20 («Sigma», США) (буфер для от-
мывки). Процедуру отмывки далее повторяли после каждой стадии теста.
После отмывки в планшеты вносили биотинилированные моноклональные
антитела против Fas SA-7 (IgGl-k); (9.52±1.4)хЮ8 в концентрации 12 мкг/мл
в буфере для отмывки, содержащем 0.1% БСА. Планшеты с биотинилиро-
ванными антителами инкубировали 2 ч при 37°С или ночь при 4°С. Затем в
планшеты вносили раствор стрептавидин-пероксидазы («Amersham») в рабо-
чем разведении в буфере для отмывки. Планшеты инкубировали 1ч при 37°С.
Далее в планшеты вносили свежеприготовленный раствор 0.04% ортофени-
лендиамина в 50мМ цитрат-фосфатном буфере (рН 5.0), содержащем 0.03%
перекиси водорода. Планшеты инкубировали 15-20' при комнатной темпера-
туре до развития окраски. Реакцию останавливали добавлением в каждую
лунку 50 мкл 10% серной кислоты, оптическую плотность измеряли по длине
волны 492нм на спектрофотометре MR 700 Microplate Reader («Dynatech
Labs»). Концентрацию sFas определяли по калибровочной кривой, соответст-
вующей каждому планшету.

Концентрацию VEGF в сыворотке крови больных раком толстой кишки
определяли иммуноферментным методом с использованием реактивов фир-
мы «DRG» (США).

Определение uPA, tPA, PAI-1 в опухоли проводили иммунофермент-
ным методом с использованием наборов реактивов, разработанных в лабора-
тории проф. T.Benraad'a (г. Ниймеген, Нидерланды).

Кусочки опухолевой ткани доставляли на льду и сразу же подвергали
гомогенизации в лаборатории клинической биохимии НИИ клинической он-
кологии ГУ РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН. Перед гомогенизацией ткань
тщательно очищали от участков некроза и жира, взвешивали, а затем измель-
чали и растирали в жидком азоте. Полученный порошок переносили в цен-
трифужные пробирки, помещенные в ледянную баню и добавляли TED-
буфер (10 мМ Трис-НС1, 1,5 мМ ЭДТА, 0,5 мМ дитиотреитол; рН 7,4), со-
держащий 10% глицерина (по объему), из расчета 1 мл буфера на 100мг тка-
ни. Гомогенат центрифугировали 30' (центрифуга Optima TM-TLC,
«Beckman», США). Надосадочную жидкость (цитозоль) использовали для
определения концентрации белка, а аликвоты по 0,5 мл замораживали в по-
лиэтиленовых пробирках и хранили при -70°С до определения концентрации
соответствующих маркеров (не более 1 месяца). Порядок проведения анализа
был одинаков для всех наборов: по 0,1мл растворов стандартов (лунки А].2-
Gi-2) и разведенных цитозолей инкубировали при +4°С в течение ночи. Про-
мывали 4 раза и добавляли в лунки по 0,1мл рабочих растворов соответст-
вующих "фиксирующих" антител. Инкубировали при комнатной температуре в течение 2 часов. Промывали и добавляли в каждую лунку по 0,1мл рабочего раствора детекторных антител. Инкубировали при комнатной температуре в течение 2 часов. Промывали и добавляли в лунки по 0,1мл раствора субстрата. Инкубировали в течение 30' в темноте при комнатной температуре. Останавливали реакцию, добавляя в каждую лунку по 0,1 мл 1М H2SO4. Измеряли оптическую плотность растворов в лунках при 492/620нм. Измерения проводили на автоматическом универсальном ридере для микроплашек ELx-SOO фирмы «Bio-Tek Instruments Inc.» (США). В соответствии с инструкциями производителя, обработку результатов измерений проводили по формуле Y^a+bX+cX , где X - концентрация анализируемого белка (нг/мл), a Y - оптическая плотность при 492нм. При окончательных расчетах учитывали десятикратное разведение цитозолей и выражали концентрации анализируемых белков в нг/мг цитозольного белка.

Статистический анализ результатов исследования. Математический
анализ полученных результатов проводили с использованием пакета стати-
стических программ SPSS 7.0 for Windows и Microsoft® Office Excel 2003.
Рассчитывали среднее значение показателей, стандартную ошибку среднего,
а также их медианы. Определение достоверности различий частот признаков
в изучаемых группах проводили с использованием критерия %. Различия ме-
жду показателями считались статистически значимыми при < 0,05.

Анализ прогностической значимости содержания маркеров и построе-
ние кривых выживаемости проводили методом Каплан-Майера [Kaplan E.L.,
Meier P.  // J. Am. Stat. Assn. - 1958. - Vol.53. - p.457-481]. Достоверность различий в выживаемости оценивали с помощью "Лог-ранк теста" ("Log-rank test"). Многофакторный анализ проводили методом регрессионного анализа по Сох Proportional hazard (Cox) regression model). На основе данных однофакторного анализа проведен многофакторный анализ прогностической значимости комплекса клинико-морфологических признаков с учетом показателей экспрессии биохимических и иммуногистохимических маркеров.

Результаты исследования и их обсуждение

Иммуногистохимические и биохимические маркеры в опухоли
и сыворотке крови больных раком толстой кишки

Содержание ММР-9 в опухоли больных раком толстой кишки.
Экспрессия ММР-9 определена в первичной опухоли у 187 больных раком
толстой кишки. Больные раком толстой кишки по уровню экспрессии ММР-9
разделились примерно поровну. Так 51,3% пациентов были с низкой экс-
прессией ММР-9 в опухоли и 48,7% пациентов - с высокой экспрессией этого
белка. Накопление фермента в опухоли больных раком толстой кишки про-
исходило в цитоплазме раковых клеток и компонентах стромы вокруг опухолевых комплексов (фибробластах, макрофагах, стенках сосудов, лейкоцитарных элементах). Цитоплазматическая реакция высокой интенсивности часто наблюдалась в низко- и умереннодифференцированных аденокарциномах толстой кишки, а редуцированная или очаговая экспрессия маркера - в структурах высокодифференцированных аденокарцином. Как правило, выявлялось гомогенное окрашивание цитоплазмы раковых клеток (рис. 1).

Интенсивность окрашивания компонентов внеклеточного матрикса не
была связана со степенью дифференцировки опухоли и зависела от характера
стромы и выраженности десмопластической реакции.

Экспрессия протеазы в нормальных тканях толстой кишки была слабо-
позитивной.

Рис. 1. Экспрессия ММР-9 в структурах умеренннодифференцированной
аденокарциномы толстой кишки (х150). Стрептавидин-биотиновый им-
мунопероксидазный метод. Ядра клеток докрашены гематоксилином
Майера.

Экспрессия фермента в опухолях больных раком толстой кишки зави-
села от ряда клинико-морфологических характеристик заболевания. В табли-
це 3 представлены данные об экспрессии ММР-9 в опухоли больных раком
толстой кишки с учетом основных клинико-морфологических признаков бо-
лезни.

Отметим, что высокая экспрессия ММР-9 выявлена достоверно чаще в
опухоли пациентов при IVb стадии рака толстой кишки (в 2 раза), при солид-
ном и солидно-альвеолярном гистологическом варианте строении опухоли (в
2 раза), при низкой степени дифференцировки опухоли (в 4 раза), при про-
растании опухолью всех слоев стенки кишки и врастании в жировую клет-
чатку (в 1,7 раза чаще), при наличии инвазии опухоли в сосуды (в 4 раза).

Таблица 3.

Экспрессия ММР-9 в опухоли больных раком толстой кишки

с учетом основных клинических признаков

Признак

Градация

Число

больных

Экспрессия ММР-9

Р

+++/++ Высокая

+/-Низкая

Пол

мужской

86

46 (53,5)

40 (46,5)

0,5

женский

101

50 (49,5)

51 (50,5)

Возраст

<60

82

37 (45,1)

45 (54,9)

0,1

≥60

105

59 (56,2)

46 (43,8)

Стадия

I

3

-

3 (100)

0,001

IIa

9

3 (33,3)

6 (66,7)

IIb

29

11 (37,9)

18 (62,1)

IIIa

11

4 (36,4)

7 (63,6)

IIIb

21

6 (28,6)

15 (71,4)

IVa

9

3 (33,3)

6 (66,7)

IVb

20

16 (80)

4 (20,0)

IVb с р. п.

85

53 (62,4)

32 (37,7)

Гистологический вариант строения опухоли

железистый

124

60 (48,4)

64 (51,6)

0,1

папиллярный

43

21 (48,8)

22 (51,2)

трабек-ный

7

6 (85,7)

1 (14,3)

солидный

13

9 (69,2)

4 (30,8)

Степень дифференцировки опухоли

высокая

24

7 (29,2)

17 (70,8)

0,001

умеренная

138

69 (50,0)

69 (50,0)

низкая

25

20 (80,0)

5 (20,0)

Глубина инвазии опухоли

Р1

6

1 (16,7)

5 (83,3)

0,03

Р2

21

11 (52,4)

10 (47,6)

Р3

61

24 (39,3)

37 (60,7)

Р4

87

54 (62,1)

33 (37,9)

Наличие инвазии опухоли в сосуды

Да

51

42 (82,4)

9 (17,7)

0,0001

Нет

136

54 (39,7)

82 (60,3)

Всего:

96 (51,3)

91 (48,7)

Таким образом, экспрессия белка ММР-9 в опухоли достоверно отра-
жала наиболее важные клинические признаки рака толстой кишки (табл. 3).

Содержание коллагена IV типа в опухоли больных раком толстой кишки. Экспрессия коллагена IV типа определена в опухоли у 187 больных раком толстой кишки. У 42,8% больных раком толстой кишки выявлена высокая экспрессия коллагена IV типа, у 57,2% пациентов - низкая экспрессия белка.

Рис. 2. Экспрессия коллагена IV типа в базальных мембранах вокруг железистых структур и сосудов высокодифференцированной аденокарциномы толстой кишки (х150). Стрептавидин-биотиновый иммунопероксидазный метод. Ядра клеток докрашены гематоксилином Майера.

В опухолях больных раком толстой кишки коллаген IV типа был выявлен в базальных мембранах вокруг железистых раковых комплексов, а также кровеносных сосудов (рис. 2). Эпителий нормальной слизистой оболочки толстой кишки не был окрашен маркером. Экспрессия белка в части высоко- и умереннодифференцированных аденокарцином толстой кишки была представлена непрерывными линиями или отдельными фрагментами коллаген IV-содержащих базальных мембран.

Эпителий нормальной слизистой оболочки толстой кишки не был ок-
рашен маркером. Экспрессия белка в части высоко- и умереннодифференцированных аденокарцином толстой кишки была представлена непрерывными линиями или отдельными фрагментами коллаген IV-содержащих базальных мембран. В низкодифференцированных опухолях в большинстве случаев контуры базальных мембран не выявлялись, а структуры коллагена IV типа в
большом количестве присутствовали в тонких волокнах внеклеточного мат-
рикса опухоли.

Таблица. 4.

Экспрессия коллагена IV типа в опухоли больных раком толстой кишки с учетом основных клинических признаков

Признак

Градация

Кол-во больных

Экспрессия Coll IV

Р

+++

Высокая

++

Низкая

Пол

мужской

86

34 (39,5)

52 (60,5)

0,4

женский

101

46 (45,5)

55 (54,5)

Возраст

<60

82

40 (48,8)

42 (51,2)

0,1

≥60

105

40 (38,1)

65 (61,9)

Стадия

I

3

3 (100)

-

0,005

IIa

9

6 (66,7)

3 (33,3)

IIb

29

17 (58,6)

12 (41,4)

IIIa

11

6 (54,6)

5 (45,5)

IIIb

21

12 (57,1)

9 (42,9)

IVa

9

3 (33,3)

6 (66,7)

IVb

20

3 (15)

17 (85)

IVb с р. п.

85

30 (35,3)

32 (64,7)

Гистологический вариант строения опухоли

железистый

124

62 (50)

62 (50)

0,04

папиллярный

43

12 (27,9)

31 (72,1)

трабек-ный

7

2 (28,6)

5 (71,4)

солидный

13

4 (30,8)

9 (69,2)

Степень дифференцировки опухоли

высокая

24

14 (58,3)

10 (41,7)

0,049

умеренная

138

60 (43,5)

78 (56,5)

низкая

25

6 (24)

19 (76)

Глубина инвазии опухоли

1

6

5 (83,3)

1 (16,7)

0,1

2

21

11 (52,4)

10 (47,6)

3

61

28 (45,9)

33 (54,1)

4

87

33 (37,9)

54 (62,1)

5

12

3 (25)

9 (75)

Наличие инвазии опухоли в сосуды

да

51

7 (13,7)

44 (86,3)

0,0001

нет

136

73 (53,7)

63 (46,3)

Всего:

96 (51,3)

91 (48,7)

В таблице 4 представлены данные об экспрессии коллагена IV типа в
опухоли больных раком толстой кишки с учетом основных клинико-
морфологических признаков заболевания. Отметим, что низкая экспрессия
коллагена IV типа выявлялась достоверно чаще в опухоли пациентов при IVa
и IVb стадиях заболевания (примерно в 2-5 раз), при солидном варианте гис-
тологического строения (в 2-3 раза чаще), при низкой степени дифференци-
ровки опухоли (в 3 раза чаще), при прорастании опухолью всех слоев стенки
кишки и жировой клетчатки (в 2-2,5 раза чаще), при наличии инвазии опухо-
ли в сосуды (в 6 раз).

Таким образом, экспрессия коллагена IV типа в опухоли достоверно
отражала наиболее важные клинические признаки рака толстой кишки. При
этом, слабая реактивность или отсутствие коллаген IV-содержащих базаль-
ных мембран часто сочетались с повышенной экспрессией ММР-9 в цито-
плазме клеток рака толстой кишки.

Содержание VEGF в сыворотке крови больных раком толстой
кишки. VEGF определен в сыворотке крови 187 больных раком толстой
кишки. Содержание маркера колебалось от 100 до 1800 пг/мл, в среднем со-
ставляя 752,2±26,2 пг/мл, медиана показателя равнялась 700 пг/мл.

В группе практически здоровых людей содержание VEGF в сыворотке
крови в среднем составило 311,4±18,9 пг/мл, медиана 301 пг/мл и было дос-
товерно ниже, чем в сыворотке крови больных раком толстой кишки
(р=0,0001).

Следует отметить, что содержание VEGF в' сыворотке крови больных
раком толстой кишки по половому признаку не различалось и составило
735,8±38,0 пг/мл в группе мужчин и 766,1±36,3 пг/мл в группе женщин.

Анализ содержания VEGF в сыворотке крови больных раком толстой
кишки с учетом стадии заболевания показал, что концентрация маркера от-
ражает стадию опухолевого процесса (рЮ,0001) (табл. 5). При этом концен-
трация VEGF у больных раком толстой кишки I и Па стадии не отличалась от
содержания маркера у здоровых людей и, таким образом, показатель не об-
ладал диагностической способностью при ранних стадиях заболевания.

Таблица 5.

Содержание VEGF в сыворотке крови больных раком толстой кишки с учетом стадии заболевания

Стадия

Кол-во больных

VEGF, пг/мл

(M±m)

Пределы колебания

Медиана, пг/мл

I

3

220,0±60,0

100,0-280,0

280

IIa

9

375,9±39,2

240,0-610,0

380

IIb

29

509,1±24,0

290,0-760,0

520

IIIa

11

610,5±49,0

400,0-910,0

600

IIIb

21

839,3±66,6

420,0-1610,0

810

IVb

20

957,5±102,9

390,0-1780,0

930

IVa

9

961,1±144,3

500,0-1690,0

800

IVb с резекцией печени

85

820,1±37,0

280,0-1800,0

780

Всего:

187

752,2±26,2

100-1800

700

Медиана содержания маркера достоверно повышалась при увеличении
показателя местной распространенности Т (система TNM) (табл. 6).

Таблица 6.

Содержание VEGF в сыворотке крови больных раком толстой
кишки с учетом показателя Т системы TNM

Стадия

Кол-во

VEGF, пг/мл

Пределы

ко-

Медиана,

Т (TNM)

больных

(M±m)

колебания

пг/мл

1

3

220,0±60,0

100,0-280,0

280

2

38

477,6±22,3

240,0-760,0

495

3

126

810,2±31,5

280,0-1800,0

770

4

20

988,5±76,7

500,0-1690,0

910

Всего:

187

752,2±26,2

100-1800

700

Концентрация маркера в сыворотке крови больных раком толстой
кишки повышалась по мере увеличения количества регионарных метастазов -
показателя N (система TNM), однако все выявленные различия не были ста-
тистически достоверными (р>0,05) (табл. 7).

При наличии у больного раком толстой кишки отдаленных метастазов
в печени содержание VEGF в сыворотке крови было достоверно выше. Отме-
тим, что у больных раком толстой кишки с отсутствием отдаленных метаста-
зов содержание маркера могло быть высоким при значительной распростра-
ненности заболевания (показатель Т3-Т4).

Таблица 7.

Содержание VEGF в сыворотке крови больных раком толстой
кишки с учетом показателя N системы TNM

Стадия

Кол-во

VEGF, пг/мл

Пределы

Медиана,

N (TNM)

больных

(M±m)

Колебания

пг/мл

0

46

672,1±59,3

100,0-1690,0

540

1

118

740,3±131,5

280,0-1800,0

632,5

2

14

939,3±74,6

700,0-1710,0

880

3

9

1026,7±174,4

780,0-1520,0

970

Всего:

187

752,2±126,2

100-1800

700

Выявлено достоверно более высокое содержание VEGF в сыворотке
крови больных раком толстой кишки в возрасте до 60 лет по сравнению с па-
циентами старше 60 лет (901,9±144,0 и 635,3±126,6 пг/мл, соответственно)
(р=0,001), что косвенно может свидетельствовать о более агрессивном тече-
нии заболевания у пациентов моложе 60 лет.

Дисперсионный анализ содержания VEGF в сыворотке крови больных
раком толстой кишки показал достоверно более высокие его значения в
группе пациентов с тубулярным вариантом гистологического строения опу-
холи по сравнению с группой больных с солидным гистологическим вариан-
том (р=0,02) (табл. 8). Однако эти гистологические варианты относятся к
редким, в то же время наиболее частые варианты гистологического строения
опухоли не отличались достоверно по содержанию VEGF в сыворотке крови.

Достоверно выше был уровень VEGF у больных раком толстой кишки
с низкой степенью дифференцировки опухоли по сравнению с группой паци-
ентов с высокой степенью дифференцировки опухоли (табл. 9).

Содержание VEGF достоверно повышалось по мере увеличения глуби-
ны инвазии опухоли в кишечную стенку и при наличии инвазии опухоли в
кровеносные сосуды (p=0,001).

Таблица 8.

Содержание VEGF в сыворотке крови больных раком толстой кишки
с учетом варианта гистологического строения опухоли

Вариант гистоло-
гического
строения опухоли

Количество
больных

VEGF, пг/мл
(M±m)

Пределы
колебания
VEGF

Медиана
VEGF

1

124

751,5±31,5

100,0-1800,0

700

2

43

765,1±56,8

290,0-1710,0

680

3*

7

1067,1±178,8

500,0-1780,0

910

4*

13

546,2±47,3

260,0-800,0

560

Всего:

187

752,2±26,2

100-1800

700

Примечание: *р=0,02.

Таблица 9.

Содержание VEGF в сыворотке крови больных раком толстой кишки
с учетом степени дифференцировки опухоли

Степень диффе-
ренцировки опу-
холи

Кол-во
больных

VEGF, пг/мл
(M±m)

Пределы
колебания
VEGF

Медиана
VEGF

Высокая *

24

660,0±44,8

250,0-1000,0

690

Умеренная

138

747,7±30,1

100,0-17100,0

670

Низкая**

25

865,6±92,6

350-1800

700

Всего:

187

752,2±26,2

100-1800

700

Примечание: *р =0,045.

Таким образом, содержание VEGF в сыворотке крови больных раком
толстой кишки достоверно было связано с определяющими клиническими
признаками - стадией заболевания, глубиной инвазии опухоли, наличием ин-
вазии опухоли в кровеносные сосуды, возрастом больных, степенью диффе-
ренцировки опухоли.

Кроме того, наряду с увеличением концентрации VEGF в сыворотке
крови больных раком толстой кишки обнаружено достоверное повышение в
опухоли уровня неблагоприятно высокой экспрессии ММР-9 и одновременно
низкая экспрессия коллагена IV типа.

В группе из 58 больных раком толстой кишки с одновременно благо-
приятными уровнями ММР-9 и коллагена IV типа содержание VEGF в сыво-
ротке крови было минимальным и составило 658,0±45,5 пг/мл, напротив, при
одновременно неблагоприятных уровнях этих маркеров (74 пациента) — мак-
симальным (823,6±42,6 пг/мл), различия достоверны (р=0,008). В то же вре-
мя, если уровни экспрессии белков были противоположны, то содержание
VEGF практически не различалось (762,6±67,5 пг/мл и 750,5163,3 пг/мл)
(р=0,9). Таким образом, у большей части больных раком толстой кишки - 132
(70,6%), изменение VEGF происходит синхронно с такими маркерами как
ММР-9 и коллаген IV типа, что указывает на неблагоприятное течение забо-
левания.

Содержание sFas в сыворотке крови больных раком толстой киш-
ки. sFas определен в сыворотке крови 187 больных раком толстой кишки.
sFas обнаружен у 108 больных (57,8%), его содержание колебалось от 0,8 до
28,9 нг/мл, в среднем составляя 10,1±0,5 нг/мл, медиана показателя равнялась
9,1 нг/мл.

Таблица 10.

Содержание sFas в сыворотке крови больных раком толстой кишки

с учетом стадии процесса

Стадия

Кол-во

sFas, нг/мл

Пределы 

Медиана,

больных

(M±m)

колебания

пг/мл

I

3(100%)

1,0+0,1

0,8-1,2

0,9

Па

5 (55,6%)

2,8±0,8

1,3-5,6

2,1

IIb

14 (48,3%)

8,7±0,9

4,6-14,0

9,1

IIIa

4 (36,4%)

7,0±1,0

4,7-9,0

IIIb

15(71,4%)

10,6±1,2

5,1-19,4

8,0

IVb

13 (65,0%)

12,3±1,1

6,8-20,4

10,6

IVa

4 (44,4%)

12,9±4,2

7,4-25,4

9,3

IVb с резекцией

50 (58,8%)

11,1±0,8

4,0-28,9

9,8

печени

Всего:

108(57,8%)

10,1±0,5

0,8-28,9

9,1

В группе практически здоровых людей содержание sFas в сыворотке
крови выявлено с частотой 28,6%, средний уровень составил 1,2±0,9 нг/мл,
медиана - 0,9 нг/мл и был достоверно ниже, чем в сыворотке крови больных
раком толстой кишки (р=0,0001).

Анализ содержания sFas в сыворотке крови больных раком толстой
кишки с учетом стадии заболевания показал, что концентрация маркера от-
ражает стадию опухолевого процесса (р=0,0001) (табл. 10).

Однако, частота выявления sFas в сыворотке крови больных раком тол-
стой кишки не была связана со стадией заболевания. При этом концентрация sFas у больных раком толстой кишки I стадии
не отличалась от содержания маркера у практически здоровых людей.

Медиана содержания маркера sFas достоверно повышалась при увели-
чении показателя распространенности Т (система TNM) с 1,0 нг/мл в группе
больных с распространением Т до значения 12,9 нг/мл в группе больных с
распространением Т4 (р=0,001).

Обнаружена выраженная тенденция к повышению концентрации sFas в
сыворотке крови больных раком толстой кишки по мере увеличения количе-
ства регионарных метастазов - показатель N (система TNM) (р=0,06). Отме-
тим, что в группе больных раком толстой кишки с отсутствием регионарных
метастазов в лимфатических узлах могли выявляться высокие значения sFas
(максимальное значение - 25,4 нг/мл) при значительной местной распростра-
ненности заболевания (показатель Т3-Т4).

Таблица 11.

Содержание sFas в сыворотке крови больных раком толстой кишки
с учетом глубины инвазии опухоли

Глубина инва-

Кол-во

sFas, нг/мл

Пределы ко-

Медиана

зии опухоли

больных

(M±m)

лебания sFas

sFas

1

4

1,6±0,6

0,8-3,4

2

9

6,4±1,1

2,1-12,1

5,0

3

38

9,7±0,7

1,6-19,4

9,0

4

50

11,6±0,8

1,3-28,9

10,2

5

7

11,1±2,4

7-25,4

9,5

Всего:

108

10,1+0,5

0,8-28,9

9,1

При наличии у больного раком толстой кишки отдаленных метастазов
в печени содержание sFas в сыворотке крови было достоверно выше (медиа-
на 10,1 нг/мл), чем без таковых (медиана 7,4 нг/мл) (р=0,003).

Cодержание sFas достоверно повышалось по мере увеличения глубины
инвазии опухоли в окружающие ткани (р=0,0001) (табл. 11).

Достоверно выше было содержание sFas в сыворотке крови больных
раком толстой кишки при наличии инвазии опухоли в кровеносные сосуды
(р=0,0008).

Таким образом, содержание sFas в сыворотке крови больных раком
толстой кишки достоверно было связано с основными клиническими призна-
ками - стадией заболевания, глубиной инвазии опухоли, наличием инвазии
опухоли в кровеносные сосуды, возрастом пациентов.

В то же время содержание sFas не было связано со степенью диффе-
ренцировки опухоли, а также с наличием и отсутствием слизеобразования, с
наличием лимфоидной инфильтрации.

Кроме того, обнаружено, что при неблагоприятной (высокой) экспрес-
сии ММР-9 содержание sFas в сыворотке крови больных раком толстой киш-
ки было достоверно выше (р=0,01). При значениях sFas выше 10 нг/мл, почти
у % больных раком толстой кишки обнаружена высокая экспрессия ММР-9.

При неблагоприятной низкой экспрессии белка коллагена IV типа со-
держание sFas в сыворотке крови больных раком толстой кишки достоверно
выше (р=0,02).

В группе из 30 больных раком толстой кишки с одновременно благо-
приятными уровнями ММР-9 и коллагена IV типа содержание sFas в сыво-
ротке крови было минимальным и составило 8,0±0,9 нг/мл, напротив, при
одновременно неблагоприятных уровнях белков (49 пациентов) - макси-
мальным (11,5±0,8 нг/мл), различия достоверны (р=0,005). В то же время, ес-
ли уровни экспрессии белков были противоположны, то содержание sFas
практически не различалось (10,2±1,3 нг/мл и 10,0±1,3 нг/мл) (р=0,9).

Таким образом, у большинства больных раком толстой кишки (73,1%)
изменение sFas в сыворотке крови происходило синхронно с изменением
уровня экспрессии ММР-9 и коллагена IV типа в опухоли.

Содержание uPA, tPA и PAI-1 в ткани опухоли и неизмененной
слизистой оболочке толстой кишки. Иммуноферментное определение со-
держания uPA проведено в ткани опухоли 187 больных раком толстой киш-
ки. Уровни маркера в опухоли колебались от 0,17 до 8,9 нг/мг белка, соста-
вив в среднем 3,5±0,2 нг/мг белка, медиана была равна 4,0 нг/мг белка. Рас-
пределение маркера отличалось от распределения Гаусса, поэтому в качестве
центральной характеристики использовали медиану.

Содержание uPA в неизмененной ткани (пограничной с опухолью сли-
зистой оболочке толстой кишки) 35 больных раком толстой кишки составило
0,71 ±0,14 нг/мг белка, медиана - 0,6 нг/мг белка. Различие содержания uPA в
неизмененной и опухолевой ткани больных раком толстой кишки статисти-
чески достоверны (р=0,001). При иммуноферментном определении tPA со-
держание белка в ткани опухоли 187 больных раком толстой кишки досто-
верно отличалось от распределения Гаусса, для анализа различий применяли
непараметрические критерии, в качестве центральной характеристики пока-
зателя применяли медиану. У 89 (47,6%) больных раком толстой кишки со-
держание tPA в ткани опухоли не превышало 2 нг/мг белка, среднее содер-
жание составило 4,3+0,4 нг/мг белка, медиана - 2,3 нг/мг белка. Содержание
tPA в неизмененной ткани 187 больных раком толстой кишки составило 4,98±0,79 нг/мг белка, медиана - 2,68 нг/мг белка. Различия содержания tPA в
неизмененной и опухолевой ткани больных раком толстой кишки были ста-
тистически недостоверными (р=Ю,18). При иммуноферментном определении
PAI-1 у 9 из 187 (4,8%) больных раком толстой кишки маркер не был выяв-
лен, у 54 (28,9%) его содержание не превышало 0,5 нг/мг белка. Таким обра-
зом, у трети обследованных пациентов содержание маркера было невысоким,
либо белок полностью отсутствовал в ткани опухоли. Среднее содержание
PAI-1 у 178 больных раком толстой кишки составило 1,6±0,1 нг/мг белка, ме-
диана - 1,9 нг/мг белка. Содержание PAI-1 в неизмененной ткани 35 больных
раком толстой кишки составило 0,99±0,1 нг/мг белка, медиана 0,61 нг/мг
белка. Различия содержания PAI-1 в неизмененной и опухолевой ткани боль-
ных раком толстой кишки были статистически достоверными (р=0,001).

Выявлена корреляционная зависимость высокой степени тесноты свя-
занности между содержанием uPA, tPA и PAI-1 в ткани опухоли больных ра-
ком толстой кишки (г=0,76; рЮ,001).

Содержание компонентов системы активации плазминогена в опу-
холи больных раком толстой кишки с учетом клинико-морфологических
признаков заболевания. Оценили содержание основных компонентов сис-
темы плазминогена в опухоли больных раком толстой кишки с учетом кли-
нико-морфологических признаков заболевания.

При изучении содержания компонентов системы активации плазмино-
гена с учетом возраста больных раком толстой кишки выявлено достоверно
более высокое их содержание в опухоли больных в возрасте до 60 лет по
сравнению с группой пациентов от 60 лет и старшее, что косвенно может
указывать на более агрессивное течение заболевания у пациентов моложе 60
лет.

Наибольший интерес для практикующих врачей представляет изучение
связи показателей системы активации плазминогена в опухолевой ткани
больных раком толстой кишки со стадией заболевания. Выявлено достоверное повышение uPA при увеличении местной распространенности заболевания (Т) - более чем в 10 раз, при наличии отдаленных метастазов (М) – более чем в 4 раза. Обнаружено повышение tPA при увеличении местной распространенности опухолевого процесса (показатель Т), при наличии отдаленных метастазов (М). Выявлено достоверное повышение PAI-1 в первичной опухоли больных раком толстой кишки при увеличении местной распространенности процесса (Т) - более чем в 3 раза, при наличии регионарных метастазов (N) - примерно в 2 раза и отдаленных метастазов (М) - более чем в 3 раза.

Степень дифференцировки опухоли была достоверно связана с содер-
жанием активатора плазминогена uPA в ткани опухоли больных раком тол-
стой кишки. При низкой степени дифференцировки опухоли содержание uPA
и PAI-1 в опухоли было наибольшим, однако достоверные различия обнару-
жены только для uPA.

Гистологический вариант строения опухоли не был достоверно связан
с содержанием компонентов системы активации плазминогена в ткани опу-
холи больных раком толстой кишки. Содержание uPA и PAI- было наиболь-
шим в опухолях с преобладанием железистого варианта строения.

Все показатели системы активации плазминогена в опухоли больных
раком толстой кишки были высокодостоверно связаны с одним наиболее
важным клинико-морфологических фактором заболевания - глубиной инва-
зии опухоли в кишечную стенку (р<0,001).

Обнаружено, что при наличии инвазии опухоли в кровеносные сосуды
содержание uPA и PAI-1 также достоверно повышается.

Наличие слизеобразования, участков некроза, лимфоидной и воспали-
тельной инфильтрации в опухоли не изменяло достоверно показатели содер-
жания компонентов системы активации плазминогена в опухоли больных ра-
ком толстой кишки.

Связь содержания компонентов системы активации плазминогена
с экспрессией ММР-9 и коллагена IV типа в опухоли больных раком
толстой кишки. При неблагоприятных (высоких) уровнях экспрессии ММР-9 содержание uPA в ткани опухоли было достоверно выше, чем при благоприятных (табл. 12).

Таблица 12.

Содержание компонентов системы активации плазминогена в опухоли больных раком толстой кишки с учетом уровня экспрессии ММР-9

Показатель

Уровень экспрессии ММР-9

Высокий +++/++

Низкий +/-

N

M±m (медиана)

Пределы колебания

N

M±m (медиана)

Пределы колебания

uPA *

96

4,1±0,2

(4,3)

0,17-8,9

91

2,9±0,3 (1,6)

0,17-8,6

tPA *

96

5,3±0,5

(4,9)

0,14-22,1

91

3,3±0,5

(0,2)

0,14-19,4

PAI-1 *

49

1,9±0,1

(2,1)

0,05-3,6

129

1,3±0,1

(1,3)

0,05-3,5

Примечание: *p=0,01.

Таблица 13.

Содержание компонентов системы активации плазминогена в опухоли больных раком толстой кишки с учетом экспрессии коллагена IV типа

Показатель

Уровень экспрессии коллагена IV типа

Высокий +++/++

Низкий +/-

N

M±m (медиана)

Пределы колебания

N

M±m (медиана)

Пределы колебания

uPA *

96

2,9±0,3

(1,5)

0,17-8,2

91

3,9±0,2

(4,1)

0,17-8,9

tPA *

96

3,5±0,5

(0,2)

0,14-19,4

91

4,9±0,5

(4,0)

0,14-22,1

PAI-1 *

49

1,3±0,1

(1,2)

0,05-3,5

129

1,8±0,1

(2,0)

0,05-3,6

Примечание: *p=0,01.

При неблагоприятных (низких) уровнях экспрессии коллагена IV типа содержание компонентов системы активации плазминогена также было достоверно выше (табл. 13).

Связь содержания компонентов системы активации плазминогена в опухоли уровнями белков VEGF и sFas в сыворотке крови больных
раком толстой кишки. Обнаружены корреляционные зависимости средней степени тесноты связанности между содержанием VEGF в сыворотке крови и
иРА в опухоли (г=0,51; р=0,001), а также между VEGF и PAI-1 (г=0,42;
р=001). Важно отметить, что данная корреляционная зависимость выявлена
только в группе больных раком толстой кишки III-IV стадий заболевания.

Содержание sFas в сыворотке крови не было связано с показателями
содержания компонентов системы активации плазминогена в ткани опухоли
больных раком толстой кишки.

Подводя итоги настоящему разделу исследования, следует отметить,
что показатели компонентов системы активации плазминогена, определен-
ные в ткани опухоли больных раком толстой кишки, тесно взаимосвязаны
между собой, отражают основные клинико-морфологические характеристики
рака толстой кишки, но не обладают достаточной информативностью при на-
чальных стадиях заболевания. При этом при поздних (III-IV) стадиях заболе-
вания выявлена корреляционная зависимость между компонентами системы
активации плазминогена и белковыми маркерами: ММР-9, коллаген IV типа
и VEGF.

Отдаленные результаты лечения с учетом содержания иммуногистохи-
мических и биохимических маркеров

Отдаленные результаты лечения проанализированы у 187 больных ра-
ком толстой кишки. Обследованные пациенты прослежены от 2 до 6 лет от
начала проводимого лечения. Из 187 пациентов в течение 1-го года наблюде-
ния после лечения умерло 20 (10,7%) больных, на 2-м году жизни - 29
(15,5%) больных.

Медиана общей выживаемости больных раком толстой кишки состави-
ла 76,7±11,3 мес., то есть примерно 6 лет. 5-летняя общая выживаемость со-
ставила 57,6+4,1%. Анализ функции риска смерти у больных раком толстой
кишки показал, что наибольший риск обнаружен в первый год после прове-
денного лечения, в последующие 5 лет риск смерти неуклонно снижался.

Общая выживаемость больных раком толстой кишки достаточно хоро-
шо изучена. В таблице 14 приведены краткие данные по общей выживаемо-
сти больных раком толстой кишки, включенных в настоящее исследование (в
общей группе и с учетом наиболее важных клинико-морфологических при-
знаков, достоверно связанных с отдаленными результатами лечения).

Так, стадия заболевания была достоверно связана с отдаленными ре-
зультатами лечения больных раком толстой кишки (р=0,0001). У пациентов в
I-IIb стадиях 5-летняя общая выживаемость была 84,5% и выше, а медиана не
была достигнута на 5-летнем сроке наблюдения.

Существенно снижались показатели общей выживаемости у больных
при IIIa стадии (около половины больных умерло в течение 5-лет после про-
веденного лечения). Медиана длительности жизни после проведенного лече-
ния в данной группе больных составила 34,7 мес. (около 3-х лет), а у пациен-
тов в IVb стадии - всего 14,4 мес., то есть чуть более одного года.

Отметим, что при выполнении резекции печени больным раком тол-
стой кишки в IVb стадии медиана выживаемости увеличивалась примерно в 4
раза и приближалась к 5 годам, а 5-летняя общая выживаемость была сопос-
тавима с выживаемостью больных при 1ПЬ стадии.

Вариант гистологического строения опухоли не был достоверно связан
с отдаленными результатами лечения больных раком толстой кишки (р=0,1),
а степень дифференцировки опухоли была достоверно связана с отдаленны-
ми результатами лечения больных раком толстой кишки (р=0,0002). Так, в
группе больных с низкой степенью дифференцировки опухоли медиана вы-
живаемости составила 20,1 мес., а 5-летняя общая выживаемость - 11,2±9,2%.

Отдаленные результаты лечения больных раком толстой кишки досто-
верно ухудшались при увеличении глубины инйазии опухоли в кишечную
стенку (р=0,0001). Так, при наибольшей глубине инвазии, при прорастании
опухолью всех слоев стенки кишки и врастании в жировую клетчатку медиа-
на общей выживаемости составила всего 33,3 мес., а 3-х летняя выживае-
мость - 38,1±14,7%.

Высокодостоверно различалась общая выживаемость больных раком
толстой кишки при наличии и отсутствии инвазии опухоли в кровеносные и
лимфатические сосуды (р=0,0001). Медианы выживаемости и 5-летняя вы-
живаемость различались в этих группах более чем в 5 раз.

Таблица 14.

Общая выживаемость больных раком толстой кишки

Клинический признак

Градация признака

N

Медиана выживаемости, мес.

Общая выживаемость, %

1-летняя

3-летняя

5-летняя

Вся группа

187

76,7±11,3

89,3±2,3

70,2±3,4

57,6±4,1

Стадия

р=0,0001

I+IIa

3

Не достигнута

100

100

-

IIb

29

Не достигнута

100

92,1±5,3

84,5±8,8

IIIa

11

Не достигнута

100

90,0±9,5

53,3±17,6

IIIb

21

Не достигнута

100

80,4±8,8

-

IVa

9

34,7

77,8±13,9

40±13,4

-

IVb

20

14,4

60±11

20±8,9

-

IVb с рез.печени

85

54,9

88,2±3,5

62,7±5,3

47,1±6,2

Вариант гистологического строения опухоли

1

124

82,4

91,9±2,4

71,4±4,1

60,8±4,8

2

43

Не достигнута

83,7±5,6

63,5±7,6

52,3±9,4

3

7

22,8

57,1±18,7

28,6±17,1

0

4

13

Не достигнута

76,9±11,9

57,7±18,8

55,4±19,1

Степень дифференцировки опухоли

Высокая

24

Не достигнута

95,8±4,1

87,1±7,0

64,8±11,0

Умеренная

138

83,0

89,9±2,6

72,0±3,9

61,5±4,8

Низкая

25

20,1

68,0±9,3

30,6±9,8

11,2±9,2

Глубина инвазии опухоли в кишечную стенку

Слиз./подслизистый

6

Не достигнута

100

100

-

Мышечн.

21

Не достигнута

95,2±4,6

90,2±6,6

78,9±12,1

Все слои

61

Не достигнута

95,1±2,8

81,4±5,1

65,9±7,3

Жировая клетчатка

87

50,6

81,6±4,2

55,9±5,4

45,8±5,8

Инвазия в сосуды

Есть

51

18,9

68,6±6,5

24,5±6,4

14,4±6,1

Нет

136

96,0

95,6±1,8

85,0±3,1

71,9±4,6

Пол и возраст больных раком толстой кишки, наличие слизеобразова-
ния, участков некроза, лимфоидной и воспалительной инфильтрации в опу-холи не были достоверно связаны с отдаленными результатами лечения
больных раком толстой кишки.

Обнаружено, что медиана общей выживаемости при неблагоприятной
высокой экспрессии ММР-9 была в 3 раза меньше, а 5-летняя общая выжи-ваемость в 3,1 раза меньше, чем при благоприятной низкой его экспрессии.
Таким образом, данный белок при иммуногистохимическом определении в
опухоли больных раком толстой кишки обладает выраженной прогностиче-
ской способностью.

Выявлено, что медиана и 5-летняя общая выживаемость при неблаго-
приятной низкой экспрессии коллагена IV типа в опухоли была почти в 3
раза меньше, чем при благоприятной высокой его экспрессии. Таким обра-
зом, данный белок при иммуногистохимическом определении в ткани опухо-
ли больных раком толстой кишки также обладает выраженной прогностиче-
ской способностью.

Проанализировали отдаленные результаты лечения больных раком
толстой кишки с учетом содержания VEGF в сыворотке крови. Больные раз-
делены на 3 группы: 1) группа - уровень VEGF в сыворотке крови менее 400
пг/мл; 2) группа - уровень VEGF от 400 до 800 пг/мл; 3) группа - уровень
VEGF 800 и более пг/мл. Отметим, что у пациентов со значениями VEGF,
равными 400-600 пг/мл и 600-800 пг/мл, отдаленные результаты лечения бы-
ли сходны и эти пациенты были объединены в одну группу.

Убедительно доказано, что исходные уровни VEGF в сыворотке крови
достоверно связаны с отдаленными результатами лечения больных раком
толстой кишки (р=0,019). Так, неблагоприятными следует считать уровни
VEGF в сыворотке крови выше 400 пг/мл (5-летняя общая выживаемость
снижается в 1,3 раза) и, особенно, выше 800 пг/мл (5-летняя общая выживае-
мость снижается почти в 2 раза). Таким образом, содержание VEGF в сыво-
ротке крови, определенное до начала лечения, может являться фактором про-
гноза и учитываться при выборе объема и методов лечения больных раком
толстой кишки.

Кроме того, показано, что исходный уровень sFas в сыворотке крови
больных раком толстой кишки выше 10 нг/мл также является высокоинфор-
мативным неблагоприятным фактором прогноза заболевания.

Рис. 3. Общая выживаемость больных раком толстой кишки с учетом содержания tPA в ткани опухоли.

Обнаружено, что низкие (менее 0,85 нг/мг белка) уровни uРА в ткани
опухоли больных раком толстой кишки, соответствующие его содержанию в
неизмененной ткани, можно считать прогностически благоприятными. Отме-
тим, что наиболее часто такие уровни выявляли в опухоли больных при 1-ПЬ
стадиях (31 пациент из 36, 86,1%) и реже у больных с III стадией (10 из 32,
31,3%), у больных IV стадии низкие значения uРА в опухоли не были выяв-
лены.

Показано, что высокие (более 2 нг/мг белка) уровни tPA в ткани опухо-
ли больных раком толстой кишки можно считать прогностически благопри-
ятными (рис. 3).

Обнаружено, что медиана общей выживаемости больных раком тол-
стой кишки при неблагоприятных значениях PAI-l (>0,5нг/мг белка) соста-
вила немного более 3-х лет, а количество пациентов, проживших 5 лет, со-
кратилось в 1,7 раза по сравнению с больными с благоприятными низкими
значениями PAI-1 (<0,5 нг/мг белка) в ткани опухоли, соответствующими
значениям маркера в неизмененной слизистой.

Многофакторным анализом обнаружено, что из 7 изучаемых показате-
лей независимыми факторами прогноза можно считать ММР-9, коллаген IV
типа и uРА.

Следует также отметить, что только у 6 (3,2%) больных раком толстой
кишки все исследованные биохимические маркеры были неблагоприятными, при этом медиана выживаемости в данной группе пациентов составила 37,9
месяцев. У 6 (3,2%) больных все исследованные маркеры были благоприят-
ными.

Среди наиболее неблагоприятных сочетаний следует выделить:

  • высокие значения ММР-9 с низким значением коллагена IV типа
    (74 пациента, 39,6%; медиана 23,5 мес., 5-летняя выживаемость 15,7±5,5%);
  • высокие значения ММР-9 с высоким значением иРА (80 пациен-
    тов, 42,8%; медиана 22,0 мес., 5-летняя выживаемость 20,1±5,9%);
  • высокие значения ММР-9 с высоким значением PAI-1 (75 паци-
    ентов, 40,1%, медиана 22,0 мес., 5-летняя выживаемость 17,3±5,7%);
  • высокие значения коллагена IV типа с высоким значением PAI-1
    (82 пациентов, 43,9%, медиана 26,4 мес., 5-летняя выживаемость 25,8±5,9%).

Эти сочетания можно рекомендовать для применения в клинической
практике с целью определения индивидуального прогноза клинического те-
чения рака толстой кишки.

Тканевые и сывороточные маркеры у больных раком толстой кишки и риск развития метастазов в печени.

Наиболее частой причиной смерти больных раком толстой кишки яв-
ляется прогрессирование заболевания в виде метастазов в печени. Развитие
метастазов в печени оценено у 187 больных раком,толстой кишки. Из 187 па-
циентов в течение 1-го года наблюдения после лечения метастазы в печени
развились у 24 (12,8%) больных, на 2-м году жизни - у 19 (10,2%) пациентов.

Медиана безрецидивной выживаемости больных раком толстой кишки
составила 84,7±3,1 мес. 5-летняя общая выживаемость составила 63,8±4,8%.

Анализ функции риска развития метастазов в печени у больных раком
толстой кишки показал, что наибольший риск обнаружен в первые два года
после проведенного лечения, в последующие 3 года риск развития метастазов
был существенно ниже и вновь возрастал только на 7 году наблюдения.

В таблице 15 приведены данные по выживаемости без метастазов
больных раком толстой кишки, включенных в настоящее исследование (в
общей группе и с учетом наиболее важных клинических признаков, досто-
верно связанных с отдаленными результатами лечения).

Так, стадия заболевания была достоверно связана с безрецидивной вы-
живаемостью больных раком толстой кишки (р=0,01). При этом у больных при I-IIIa стадиях 3-летняя безрецидивная выживаемость составила 100%.
Существенно снижались показатели безрецидивной выживаемости у боль-
ных при 1ПЬ стадии (5-летняя безрецидивная выживаемость снижалась до
69,7±14,6%).

В группе больных раком толстой кишки в IVb стадии с резекцией пе-
чени по поводу единичных метастазов опухоли медиана безрецидивной вы-
живаемости была минимальной (33,7 мес.), а 5-летняя безрецидивная выжи-
ваемость составила 29,9±9,5%.

Таблица 15.

Безрецидивная выживаемость больных раком толстой кишки с учетом основных клинико-морфологических признаков опухолевого процесса

Клинический признак

Градация признака

N

Медиана выживаемости, мес.

Безрецидивная выживаемость, %

1-летняя

3-летняя

5-летняя

Вся группа

187

84,7±3,1

86,0±2,6

70,3±3,7

63,8±4,8

Стадия

р=0,01

I+IIa

12

Не достигнута

100

100

-

IIb

29

Не достигнута

100

100

100

IIIa

11

Не достигнута

100

100

-

IIIb

21

Не достигнута

89,2±7,2

75,4±11,8

69,7±14,6

IVa

9

Не достигнута

82,6±10,5

74,1±16,1

-

IVb

20

Не достигнута

82,1±9,4

70,1±12,7

-

IVb с рез.печени

85

33,7

77,0±4,6

46,4±6,1

29,9±9,5

Степень дифференцировки опухоли

высокая

24

Не достигнута

91,7±5,6

77,9±8,8

64,9±8,8

умеренная

138

84,6

87,1±2,9

71,9±4,2

60,5±10,9

низкая

25

46,1

71,3±10,0

50,5±12,6

-

Глубина инвазии

слизист.

6

Не достигнута

100

100

-

мышечн.

21

Не достигнута

95,0±4,9

94,2±5,0

94,0±5,1

все слои

61

Не достигнута

86,4±4,5

81,4±5,1

65,9±7,3

жир.клет.

87

62,1

80,2±4,4

62,0±6,0

48,8±7,9

Инвазия в сосуды

есть

51

34,0

74,6±6,5

43,5±11,4

30,4±16,7

нет

136

86,4

88,8±2,7

74,6±3,9

68,9±5,1

Вариант гистологического строения опухоли не был достоверно связан
с показателем безрецидивной выживаемости больных раком толстой кишки
(р=0,7). Так, 3-летняя безрецидивная выживаемость составила в группах
больных с опухолями железистого, папиллярного, тубулярного и солидно-
альвеолярного строения рака толстой кишки 69,9±14,6%, 69,9±7,7%,
66,7±19,2% и 72,4±12,% соответственно.

Выявлена сильная тенденция к различию в показателях безрецидивной
выживаемости больных раком толстой кишки в группах с различной степе-
нью дифференцировки опухоли (р=0,08). Так, в группе больных раком тол-
стой кишки с низкой степенью дифференцировки опухоли медиана безреци-
дивной выживаемости составила 20,1 мес., а 5-летняя безрецидивная выжи-
ваемость составила 11,2±9,2%.

Большая глубина инвазии опухоли в кишечную стенку достоверно
ухудшала безрецидивную выживаемость больных раком толстой кишки
(р=0,02). Так, при наибольшей глубине инвазии, при прорастании всех слоев
стенки кишки и врастании опухоли в жировую клетчатку, 5-летняя безреци-
дивная выживаемость составила 48,817,9%.

Достоверно различалась безрецидивная выживаемость у больных ра-
ком толстой кишки при наличии и отсутствии инвазии опухоли в кровенос-
ные и лимфатические сосуды (р=0,01). Так, медиана безрецидивной выжи-
ваемости в группе больных с наличием сосудистой инвазии не достигала 3-х лет,  а  показатель  5 -летняя  безрецидивной  выживаемости  составил
30,4±16,7%.

Рис. 4. Безрецидивная выживаемость больных раком толстой кишки с учетом уровня экспрессии ММР-9 в опухоли.

Пол, возраст больных раком толстой кишки, наличие слизеобразова-
ния, участков некроза, лимфоидной и воспалительной инфильтрации в опу-
холи не были достоверно связаны с безрецидивной выживаемостью больных
раком толстой кишки.

На рисунке 4 представлены данные безрецидивной выживаемости
больных раком толстой кишки с учетом экспрессии ММР-9 в ткани опухоли
(р=0,001). Так, медиана безрецидивной выживаемости при неблагоприятной
(высокой) экспрессии ММР-9 в опухоли была в 1,5 раза, а 5-летняя - в 1,7
раза меньше, чем при благоприятной (низкой) экспрессии маркера. Таким
образом, данный белок при иммуногистохимическом определении в опухоли
больных раком толстой кишки обладает способностью прогнозировать раз-
витие метастазов в печени.

Показатели безрецидивной выживаемости при неблагоприятно низкой
экспрессии коллагена IV типа в ткани опухоли были почти в 3 раза ниже, чем
при благоприятно высоком уровне его экспрессии. Однако, данный белок
при иммуногистохимическом определении в опухоли больных раком толстой кишки обладает недостаточно выраженной прогностической способностью
относительно раненного развития метастазов в печени.

Показано, что исходные уровни VEGF в сыворотке крови высокодос-
товерно связаны с безрецидивной выживаемостью больных раком толстой
кишки (р=0,0001). Неблагоприятными следует считать уровни VEGF в сыво-
ротке крови более 800 пг/мл, когда показатель 5-летней выживаемости сни-
жается в 2,7 раза, а медиана времени выявления метастазов в печени соста-
вила чуть более 2-х лет. Таким образом, содержание VEGF в сыворотке кро-
ви, определенное до начала лечения, может служить фактором прогноза без-
рецидивной выживаемости и учитываться при выборе объема и методов ле-
чения у больных раком толстой кишки.

Получены высокодостоверные различия в показателях безрецидивной
выживаемости больных раком толстой кишки с учетом исходных уровней
sFas в сыворотке крови (р=0,0001). Показано, что содержание sFas более 10
нг/мл в сыворотке крови больных раком толстой кишки также является вы-
сокоинформативным неблагоприятным фактором прогноза у этой категории
пациентов относительно развития метастазов в печени.

Также выявлено, что уровни uРА в ткани опухоли больных раком тол-
стой кишки менее 3,0 нг/мг белка можно считать благоприятными в оценке
прогнозе риска развития отдаленных метастазов. Высокие (более 2 нг/мг
белка) уровни tPA в ткани опухоли больных раком толстой кишки следует
считать прогностически благоприятными относительно развития метастазов
в печени. Анализ связи содержания PAI-1 в ткани опухоли больных раком
толстой кишки с развитием отдаленных метастазов показал высокодостовер-
ные различия по пороговому уровню маркера равному 2,0 нг/мг белка
(р=0,0001). Медиана безрецидивной выживаемости больных раком толстой
кишки при неблагоприятных значениях PAI-1 (<2,0 нг/мг белка) составила
немного более 2-х лет. Следовательно, высокие значения PAI-1 (более 2,0
нг/мг белка) в ткани опухоли следует считать благоприятным прогностиче-ским фактором относительно развития метастазов в печени у больных раком
толстой кишки.

Многофакторным анализом обнаружено, что из 7 изученных нами по-
казателей независимыми факторами прогноза следует считать ММР-9, sFas и
иРА. Среди наиболее неблагоприятных сочетаний маркеров у больных раком
толстой кишки необходимо выделить: высокие значения экспрессии ММР-9
в первичной опухоли с высокими исходными уровнями sFas в сыворотке
крови (71 пациента, 39,6%, медиана 24,9 мес., 5-летняя безрецидивная выжи-
ваемость 21,2±15,4%). Сочетание выше указанных маркеров следует реко-
мендовать в клинической практике для определения индивидуального про-
гноза течения рака толстой кишки.

Выводы

  1. При иммуногистохимическом исследовании в 48,7% опухолей толстой кишки выявили высокий (неблагоприятный) уровень экспрессии ММР-9, при этом частота выявления высокой экспрессии маркера в опухоли достоверно повышалась: при IVb стадии заболевания (80,0%), при низкой степени дифференцировки опухоли (80,0%), при наличии инвазии опухоли в кровеносные сосуды (82,4% больных).
  2. Выявлено достоверное снижение показателей выживаемости среди больных раком толстой кишки с высокими уровнями экспрессии ММР-9 в опухоли по сравнению с низким содержанием фермента: общая 5-летняя выживаемость примерно в 3 раза, а безрецидивная выживаемость - в 1,5 раза.
  3. Обнаружили низкий (неблагоприятный) уровень экспрессии коллагена IV
    типа в опухоли 57,2% больных раком толстой кишки, при этом частота выяв-
    ления низкой экспрессии белка достоверно повышалась: при IVb стадии за-
    болевания (85,0%), при низкой степени дифференцировки опухоли (76,0%),
    при большой глубине инвазии опухоли в кишечную стенку с прорастанием
    всех слоев и врастанием в жировую клетчатку (75,0%), при наличии инвазии
    опухоли в сосуды (86,3% больных).
  4. Показатель общей 5-летней выживаемости больных раком толстой кишки был достоверно ниже (примерно в 3 раза) при низкой экспрессии коллагена IV типа в опухоли, по сравнению с пациентами с высокой экспрессией маркера, а безрецидивная 5-летняя выживаемости достоверно не различалась между этими группами больных.
  5. Обнаружен, достоверно высокий исходный уровень ключевого актива-
    тора неоангиогенеза VEGF в сыворотке крови больных раком толстой кишки
    (медиана 700 пг/мл) относительно группы контроля (медиана 301 пг/мл), при
    этом концентрация маркера достоверно повышалась: при IV стадии заболе-
    вания по сравнению с I и Па стадиями (показатели не отличались от группы
    контроля), при низкой степени дифференцировки опухоли по сравнению с
    высокой, при увеличении глубины инвазии опухоли в кишечную стенку, дос-
    тигая максимальных значений при врастании в жировую клетчатку и при на-
    личии инвазии опухоли в сосуды.
  6. Показатели выживаемости больных раком толстой кишки достоверно
    снижались при высоких исходных уровнях VEGF в сыворотке крови (800
    пг/мл и более) по сравнению с низкими его значениями (менее 400 пг/мл), а
    общая 5-летняя выживаемость составила 46,2±6,2% и 80,1±9,1%, соответст-
    венно, при этом 5-летняя безрецидивная выживаемость снизилась в 2,5 раза.
  7. Наряду с увеличением концентрации VEGF в сыворотке крови больных
    раком толстой кишки обнаружено достоверное повышение в опухоли уровня
    неблагоприятно высокой экспрессии ММР-9 и одновременно низкая экспрес-
    сия коллагена IV типа.
  8. Обнаружено более частое выявление sFas в сыворотке крови больных раком
    толстой кишки (57,8%) по сравнению с практически здоровыми людьми
    (28,6%), а содержание маркера было достоверно выше у больных (медиана -
    9,1 нг/мл), чем в контроле (медиана - 0,9 нг/мл). При этом показатели sFas
    были тесно связаны с основными клинико-морфологическими характеристи-
    ками болезни и достоверно повышались при неблагоприятной высокой экс-прессии белков ММР-9 и низкой экспрессии коллагена IV типа в опухоли
    (медианы - 10,4 и 10,0 нг/мл, соответственно).
  9. При высоком исходном уровне sFas в сыворотке крови больных раком тол-
    стой кишки (10 нг/мл и более) выявлены достоверно низкие показатели вы-
    живаемости: общая 5-летняя выживаемость составила 37,6±7,1% (медиана
    25,4 мес.), а безрецидивная - (медиана 18,0 мес.).
  10. Содержание активатора плазминогена урокиназного типа (uРА) и его инги-
    битора (PAI-1) в ткани опухоли больных раком толстой кишки было досто-
    верно выше, чем в неизмененной слизистой оболочке толстой кишки. Их
    уровни достоверно повышались: при IV стадии болезни, при низкой степени
    дифференцировки опухоли и ее прорастании всех слоев стенки кишки, при
    наличии инвазии опухоли в сосуды, а также при неблагоприятно высоких
    уровнях экспрессии ММР-9 и низком содержании коллагена IV типа.
  11. Общая 5-летняя выживаемость больных раком толстой кишки достоверно
    уменьшалась: при значениях uРА в ткани опухоли более 0,85 нг/мг белка
    (47,8±4,7%, медиана - 58,9 мес.); при значениях PAI-1 более 0,5 нг/мг белка
    (44,3±5,0%, медиана - 39,1 мес.), при значениях tPA менее 2 нг/мл
    (44,1±5,4%, медиана - 38,8 мес.). Безрецидивная выживаемость больных ра-
    ком толстой кишки достоверно различалась при пороговых значениях марке-
    ров, которые составляли: для uРА - 3 нг/мг белка; для tPA - 2 нг/мг белка; для
    PAI-1-2 нг/мг белка.
  12. Установлены наиболее значимые комбинации маркеров, сочетания которых
    указывают на: неблагоприятный прогноз общей выживаемости — ММР-
    9/коллаген IV типа, MMP-9/uPA, MMP-9/PAI-1, коллаген IV типа/PAI-l; вы-
    сокий риск развития отдаленных метастазов - MMP-9/sFas.

Практические рекомендации

На основе анализа некоторых молекулярно-биологических характери-
стик опухоли определены критерии для выявления наиболее прогностически
неблагоприятных случаев и предрасположенности больных колоректальным раком к развитию метастазов. Так, показатели общей выживаемости больных
колоректальным раком при высоком уровне экспрессии ММР-9 в первичной
опухоли в 3 раза достоверно ниже, чем при низкой экспрессии белка, а 5-
летняя безрецидивная выживаемость пациентов ниже в 1,5 раза. Показатели
общей 5-летней выживаемости больных раком толстой кишки зависели от
уровня исходной концентрации ключевого активатора неоангиогенеза VEGF
в сыворотке крови и при высоких его значениях (от 800 пг/мл и более) они
были достоверно ниже, чем при значении VEGF менее 400 пг/мл. При этом,
высокий уровень экспрессии ММР-9 в первичной опухоли больных колорек-
тальным раком был связан с повышенными исходными уровнями VEGF в
сыворотке крови. Общая 5-летняя выживаемость больных колоректальным
раком при уровнях sFas в сыворотке крови от 10 нг/мл и более была досто-
верно ниже. Кроме того, обнаружено, что безрецидивная выживаемость
больных раком толстой кишки достоверно различалась между больными по
пороговому уровню 3 нг/мг белка для uРА, 2 нг/мг белка для tPA и 2 нг/мг
белка для PAI-1. Многофакторный анализ выявил наиболее неблагоприятные
сочетания маркеров при оценке общего прогноза рака толстой кишки: ММР-
9-коллаген IV типа, MMP-9-uPA, MMP-9-PAI-1, коллаген IV типа-PAI-l и
при прогнозе отдаленных метастазов MMP-9-sFas.

Работы, опубликованные по теме диссертации

  1. Делекторская В.В., Перевощиков А.Г., Головков Д.А., Кушлинский Н.Е. Иммуногистохимическое исследование экспрессии Е-кадгерина, -катенина и CD44v6 в клетках первичного рака толстой кишки и его метастазов // Архив патологии. – 2005. – том 67, №6 - c.34-38.
  2. Делекторская В.В., Перевощиков А.Г., Головков Д.А., Кушлинский Н.Е. Экспрессия молекул клеточной адгезии Е-кадхерина, β-катенина и CD-44v6 в первичных опухолях и метастазах аденокарциномы толстой кишки // БЭБМ. - 2005. - том 139, №6. - с.675-679.
  3. Делекторская В.В., Перевощиков А.Г., Головков Д.А., Кушлинский Н.Е. Экспрессия молекул клеточной адгезии в первичных опухолях и метастазах рака толстой кишки // Материалы Российской научно-практической конференции с международным участием «Новые технологии в онкологии» (Барнаул, 7-8 июня 2005 г.). – Барнаул. – 2005. - с.219-220.
  4. Делекторская В.В., Перевощиков А.Г., Головков Д.А., Кушлинский Н.Е. Экспрессия молекул клеточной адгезии в метастазах аденокарциномы толстой кишки // В материалах VI Всероссийского съезда онкологов (Ростов-на-Дону, 9-14 октября 2005г.). Ростов-на-Дону - 2005. - с.303.
  5. Делекторская В.В., Перевощиков А.Г., Головков Д.А. Экспрессия молекулярно-биологических факторов прогноза и метастазирования при раке толстой кишки // В материалах II Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (Москва, 20-21 октября 2005г.). - М. - 2005. - с.115.
  6. Делекторская В.В., Перевощиков А.Г., Головков Д.А., Кушлинский Н.Е. Прогностическая значимость молекул межклеточной адгезии при раке толстой кишки // В материалах XIII Российского национального конгресса «Человек и лекарство» (Москва, 3-7 апреля 2006г.). - М. - 2006. - с.116.
  7. Делекторская В.В., Перевощиков А.Г., Головков Д.А., Гольдберг В.Е., Кушлинский Н.Е. Иммуногистохимическое исследование межклеточных и клеточно-матриксных взаимодействий в аденокарциномах толстой кишки // Сибирский онкологический журнал. – 2006. - № 3(19). - с.99.
  8. Делекторская В.В., Перевощиков А.Г., Головков Д.А. Прогностическая значимость молекул межклеточной адгезии при раке толстой кишки // В тезисах международной научно-практической конференции «Ведущий многопрофильный госпиталь страны: основные функции, достижения и направления развития» (Москва, 1-2 июня 2006г.) // Вопросы клинической онкологии и онкогематологии. - М. - 2006. том 1-2, №6. - с.169.
  9. Делекторская В.В., Перевощиков А.Г., Головков Д.А. Значение системы межклеточной и клеточно-матриксной адгезии в метастазирующих аденокарциномах толстой кишки // В материалах Российской научно-практической конференции с международным участием: «Современные методы лечения онкологических больных: достижения и неудачи» (Барнаул, 4-5 июля 2006г.). – Барнаул. -2006. - с.182-183.
  10. Делекторская В.В., Перевощиков А.Г., Головков Д.А., Кушлинский Н.Е. Молекулярные маркеры инвазии и метастазирования при раке толстой кишки // В материалах IV съезда онкологов и радиологов СНГ (Баку, 28 сентября - 1 октября 2006г.). – Баку. – 2006. - с.41.
  11. Делекторская В.В., Перевощиков А.Г., Головков Д.А., Кушлинский Н.Е. Особенности экспрессии матриксных металлопротеиназ в аденокарциномах толстой кишки и их метастазах // В материалах Х Российского онкологического конгресса (Москва, 21-23 ноября 2006г.). - М. - 2006. - с.217.
  12. Делекторская В.В., Перевощиков А.Г., Головков Д.А. Молекулы межклеточной адгезии как факторы инвазии и метастазирования при раке толстой кишки // Молекулярная медицина. - 2007. - №1 - с.50-54.
  13. Делекторская В.В., Перевощиков А.Г., Головков Д.А., Кушлинский Н.Е. Прогностическая значимость экспрессии матриксных металлопротеиназ в аденокарциномах толстой кишки и их метастазах // БЭБМ. - 2007. – том 143, №4. - с.434-438.
  14. Делекторская В.В., Перевощиков А.Г., Головков Д.А. Роль компонентов базальных мембран в процессе метастазирования аденокарцином толстой кишки // В материалах XIV Российского национального конгресса «Человек и лекарство» (Москва, 16-20 апреля 2007г.). – М. - 2007. – с.85.
  15. Делекторская В.В., Перевощиков А.Г., Головков Д.А., Кушлинский Н.Е. Влияние матриксных металлопротеиназ на инвазивно-метастатический потенциал клеток рака толстой кишки // В материалах XIV Российского национального конгресса «Человек и лекарство» (Москва, 16-20 апреля 2007г.). – М. - 2007. – с.85-86.
  16. Герштейн Е.С., Короткова Е.А., Щербаков А.М., Пророков В.В., Головков Д.А., Кушлинский Н.Е. Матриксные металлопротеиназы 7 и 9 и их тканевые ингибиторы 1 и 4 типа в опухолях и плазме крови больных раком толстой кишки // БЭБМ. - 2007. – том 143, №4. - с.438-442.
  17. Делекторская В.В., Кушлинский Н.Е., Головков Д.А. Молекулярные маркеры инвазии и особенности прогноза рака толстой кишки // Тезисы докладов в материалах XV Российского национального конгресса «Человек и лекарство» (Москва, 14-18 апреля 2008г.). - М. - 2008. - с.395.
  18. Делекторская В.В., Головков Д.А., Кушлинский Н.Е. Прогностическая значимость содержания белка nm23 в опухолях больных раком толстой кишки // Вопросы биологической медицинской и фармацевтической химии.-2008.-№5.-с.35-41.
  19. Делекторская В.В., Головков Д.А., Кушлинский Н.Е. Иммуногистохимические, биохимические и ультраструктурные особенности метастазирующих аденокарцином толстой кишки // Клиническая лабораторная диагностика.-2008.-№9.-с.19-20.

Список условных сокращений

ИЛ - интерлейкин

ИФА - иммуноферментный анализ

ИГХ  - иммуногистохимическое исследование

КРР - колоректальный рак

НК - натуральные киллеры

МА  -  моноклональные агонистические антитела

ПКГ - программированная клеточная гибель

РТК - рак толстой кишки

ЦТЛ  - цитотоксические лимфоциты

VEGF  - фактор роста  эндотелия сосудов

FasL  - Fas-лиганд

sFas  - растворимый Fas

uPA  - активатор плазминогена урокиназного типа

tPA - активатор плазминогена тканевого типа

PAI-1 - ингибитор активатора плазминогена 1 типа

MMP-9 – матриксная металлопротеиназа 9

TIMP  - тканевой ингибитор металлопротеиназ




© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.