WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


 

На правах рукописи

МАРКОВА

Евгения Валерьевна

КЛЕТОЧНЫЕ МЕХАНИЗМЫ НЕЙРОИММУННЫХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ В РЕАЛИЗАЦИИ ОРИЕНТИРОВОЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКОГО ПОВЕДЕНИЯ

14.03.09 - Клиническая иммунология, аллергология

Автореферат

диссертации на соискание

ученой степени доктора медицинских наук

Новосибирск - 2010

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук научно-исследовательском институте клинической иммунологии Сибирского отделения РАМН.

Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор, академик РАМН Владимир Александрович Козлов

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Владимир Сергеевич Кожевников

доктор медицинских наук, профессор Иван Германович Козлов

доктор медицинских наук, профессор Анна Вениаминовна  Шурлыгина

Ведущее учреждение:

Учреждение Российской академии медицинских наук научно-исследовательский  институт психического здоровья Сибирского отделения РАМН

Защита состоится 03 марта 2011 г. в 14 часов на заседании диссертационного совета Д 001.001.01  НИИ клинической иммунологии СО РАМН по адресу: 630099  г.Новосибирск, ул. Ядринцевская, 14

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ клинической иммунологии СО РАМН.

Автореферат разослан «______»________________2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор биологических наук  О.Т. Кудаева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы. Новая интегративная наука, психонейроиммунология, появившаяся в последней трети XX века, с каждым годом все больше привлекает внимание исследователей. Это обусловлено тем, что понимание функционального единства нервной и иммунной систем, характера взаимодействия между ними открывает впечатляющие перспективы в самых различных областях экспериментальной и клинической медицины, позволяет пересмотреть лечебную тактику при борьбе со многими заболеваниями.

Общность иммунной и нервной систем к настоящему времени является хорошо известным фактом и подтверждается наличием у этих систем памяти, способности воспринимать и перерабатывать информацию, формировать ответ; а также существованием сетевых взаимоотношений и саморегуляции функций (Толкунов Б.Ф., 1978; Козлов В.А с соавт., 1982; Девойно Л.В. с соавт., 1998-2009; Акмаев И.Г., 1996; Wegent D.A., Blalock J.E., 1997;  Raber J. 1998; Cohen F. 1999; Yayley S 1999; Корнева E.А. 2000; Судаков К.В., 2000; Wong M. 2000; Turin N. 2001; Anisman M. 2002, 2003; Dantzer R. 2000, 2004; Elenkov J. et al., 2000, 2006; Wrona D. 2006; Мюльберг А.А. 2006 и др.).

Взаимодействие основных адаптационных систем  организма  подразумевает регулирующее влияние со стороны иммунной системы на функции центральной нервной системы; при этом одной  из ключевых проблем является расшифровка связи между процессами высшей нервной деятельности и иммунным статусом человека и животных. Однако,  именно этот аспект является одним из наименее изученных в нейроиммунологии.

Известно, что нервная система испытывает влияние со стороны иммунной системы. Исследования, проведенные в этом направлении в России и за рубе­жом, позволили установить, что как в интактном орга­низме, так и в процессе формирования иммунного ответа в централь­ной нервной системе (ЦНС) перманентно возникают закономерные мо­дуляции на уровне электрофизиологических, биохимических и молеку­лярно-биологических параметров. Показано, что продукты иммунокомпетентных клеток (ИКК) обладают психо- и нейротропной активностью; участвуют в физиологических механизмах памяти, регуляции сна и бодрствования, активности гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы, реализации стресс-реакции (Девойно Л.В. 1991, 1998; Raber J. 1998; Krueger J.V. et al., 1998; Cohen F. 1999; Yayley S. 1999; Корнева E.А. c соавт., 2000, 2003;Wong M. 2000; Turin N. 2001; Anisman M. 2002, 2003; Арушанян Э.Б., Бейер Э.В., 2004; Dantzer R. 2003, 2004, 2006; Elenkov J. 2006; Wrona D. 2006; Мюльберг А.А. 2006; Jaferi A., Bhatnager S., 2007; Quah N., Banks W.A. 2007 и др.). Формирование иммунного ответа на различные антигены сопровождается модуляцией процессов высшей нервной деятельности, в том числе поведения, модификация которого в процессе активации иммунной системы имеет адаптивное значение (Buttini M., Boddeke H., 1995; Хаитов Р.М., 1997; Dantzer R., Wollman E., 1998;  Blutte R. 1998;  Vidal J., 1999;  Клименко В.М.,1999; Hanisch U.K., 2001; Ветлугина Т.П. 2001; Мошкин М.П. с соав. 2003; Shen Y-A et al., 2004; Weil Z.V., et al, 2006; Lane E.L., et al, 2006; Ching S., et al, 2006; Hopkins S.J., 2007; Учакин П.Н. 2008 и др.).

Тем не менее, вопрос о том, какими путями  может реализоваться афферентное звено  взаимодействия иммунной и нервной систем остается спорным. В качестве триггерных факторов,  приводящих к  модуляции высшей нервной деятельности в процессе иммуногенеза, выступают по всей видимости изменение  мембранного потенциала активированных ИКК и продуцируемые ими цитокины (интерлейкины, интерфероны и др.), (Клименко В.М., 1999; Turrin N.P., Plata-Salaman C.R. , 2000; Larson S.J., Dunn A.J, 2001; Dantzer R. 2007 и др.). Показано, что строма и паренхима лимфоидных органов имеет богатое представительство афферентных нервных окончаний (Сапин М.Р.,1987; Филиппова Л.В., Ноздрачев А.Д., 2007; Билич Г.Л. Сапин М.Р., 2007; Орлов Р.С., Ноздрачев А.Д., 2009 и др.). При этом ИКК и нервные окончания образуют своеобразные синапсы, активирующиеся при изменении мембранного потенциала указанных клеток, а также при воздействии цитокинов, продуцируемых ИКК (Веселовский Н.С., Федулова С.А., 1983; Абрамов В.В., 1988; Felten S.Y., Felten D.L., 1991; Bluthe, R. M. et al., 1994, 1996; Dantzer R. et al., 1999).

Установлено,  что клетки мозга (нервные и глиальные) подобно клеткам иммунной системы, несут на мембране рецепторы цитокинов; причем,  синтез и продукция ряда цитокинов, равно как и экспрессия их рецепторов в головном мозге, изменяются при воздействии различных иммунных стимулов (Reinisch  N., еt.аl., 1994; Van Dam A., et.al., 1995;  Eriksson C., et.al., 2000; Carpenter D. 2002;  Dantzer R., 2004; Болдырев А. А., Тунева Е. О., 2005; Dantzer R., 2007;  Ader R., 2007; Siegel A., Zalcman S.S., 2009 и др.). Можно сказать, что мозг способен "чувствовать" продукцию цитокинов при развитии той или иной иммунной реакции в организме  и  отвечать на эту реакцию синтезом цитокинов в клетках нервной ткани, отражением чего  является модуляция процессов высшей нервной деятельности, в том числе и поведенческих реакций. Существенную роль при этом играют и  нейромедиаторные системы мозга, активность которых также подвержена влиянию со стороны иммунной системы (Hayles S. Et al., 1999; Brebnen K. еt.аl., 2000; Turrin N.P., Plata-Salaman C.R., 2000;  Larson S.J., Dunn A.J., 2001, 2006).

Более того, обнаружено, что синтез некоторых цитокинов, в том числе ИЛ-1,-2,-4,-6,-10,-18,-23, ИЛ-1-Р, ЭП-Р, ФНО и др.  в структурах мозга,  наблюдается не только в результате активации иммунной системы, но и у животных в нормальных физиологических условиях (Neveu P.J.,1998; Клименко В.М, 1999; Dantzer R., 2004, 2006; Siegel A., Zalcman S.S., 2009; Захаров Ю. М., 2007 - 2009 и др.). Следовательно, имеет место конститутивный уровень экспрессии цитокинов и их рецепторов, равно как и базовая выработка большинства про- и противовоспалительных цитокинов в мозге, что  предполагает их участие в реализации нормальных физиологических функций нервной системы в том числе и в формировании определенного стереотипа поведения.

В то же время, иммунная и нервная системы не  только обладают общим полем гуморальных факторов (включающим интерлейкины, интерфероны, простагландины, нейромедиаторы, нейропептиды и др.),  но и постоянно  контактируют посредством своих клеточных элементов, характеризующихся выраженным фенотипическим и функциональным сходством (Хаитов Р.М., 1997; Kadiiski D et al., 2001). Как указывалось выше,  в строме и паренхиме лимфоидных органов имеются отростки различных нейронов - сенсорные и вегетативные нервные окончания. В свою очередь, ИКК, как описано в ряде работ, обладают способностью проникать в паренхиму нервной ткани через неповрежденный гематоэнцефалический барьер и непосредственно контактировать с нейронами и глиальными клетками, модулируя их функциональную активность. (Gordon S., et all, 1993; Беляева И.А., с соавт 1999; Hickey W.F., 1999). Поскольку способность к непосредственному контакту и взаимодействию клеток иммунной и нервной систем приобретается  на ранних этапах эмбриогенеза (Hickey W.F., 1999), не исключено влияние иммунной системы и,  в частности ее клеточных элементов,  на формирование и регуляцию поведенческих реакций индивидуума. Тем не менее, именно этот аспект взаимодействия  указанных систем остается одним из наименее изученных.

Актуальность исследования афферентной организации взаимодействия иммунной и нервной систем, изучения механизмов ответа мозга на активацию иммунной системы, участия иммуногенных факторов и клеточных элементов иммунной системы  в реализации его  физиологических функций, в частности поведенческих реакций,  определяется как наличием широкого спектра неврозоподобных, аффективно-личностных, когнитивных и поведенческих нарушений, возникающих при вторичных иммунодефицитах вследствие повторных и хронически действующих экологических и социальных стрессоров; так и довольно активным проведением в настоящее время различных иммунотерапевтических мероприятий, в том числе и клеточной терапии, при инфекционных, иммунодефицитных, аллергических, аутоиммунных  и других заболеваниях.

Активное поведение в условиях неопределенности (поисковое поведение) – значимый фактор соматического здоровья, предотвращающий возникновение психосоматических заболеваний и повышающий устойчивость организма к стрессу. Напротив, отказ от поиска ведет к снижению сопротивляемости организма, подавляет иммунную систему, являясь тем самым неспецифической и универсальной предпосылкой к развитию самых разнообразных форм патологии (Ротенберг В.С., Аршавский В.В., 1976, 1999; Айрапетянц М.Г. с соавт., 1986;  Александер Ф. 2002 и др.) Ориентировочно-исследовательское поведение (ОИП), таким образом,  представляет собой один из важнейших типов поведения, который обеспечивает индивидуума знанием об окружающей среде и является  существенным  психологическим механизмом адаптации высших позвоночных. Изучение механизмов его регуляции со стороны иммунной системы и ее клеточных элементов  позволит расширить имеющиеся представления об интегративном взаимодействии иммунной и нервной систем и открывает новые перспективы в профилактике и коррекции психосоматических расстройств.

Ярким примером  психосоматической патологии является  хроническая зависимость от морфина. Морфин, как известно, взаимодействует с опиатными рецепторами головного мозга и обладает выраженным  влиянием на поведенческие реакции. Вместе с тем, известны и его супрессивные эффекты (как прямые, так и  опосредованные через центральные механизмы) на функции иммунной системы (Peterson P.K., et al., 1998; Ветлугина Т.П., 2001; Saurer T.B., et al., 2003); в связи с чем  актуальным и социально значимым является разработка эффективных методов профилактики и терапии патологии нервной и иммунной систем организма, возникающих у наркозависимых, равно как и поиск новых подходов к реабилитации последних.

В связи с вышеизложенным, цель исследования заключалась в  установлении особенностей функционирования иммунной системы у  экспериментальных животных с различным уровнем ОИП и выявлении закономерностей изменения ОИП при активации иммунной системы и при трансплантации ИКК с определенными функциональными характеристиками.

В рамках поставленной  цели решались следующие задачи:

  1. Определить характер ориентировочно – исследовательского поведения у экспериментальных животных и провести морфологическое исследование сенсомоторной коры головного мозга животных с различным уровнем  ОИП.
  2. Охарактеризовать уровень мРНК  ИЛ-1, рецептора ИЛ-1 первого типа (ИЛ-1-Р),  рецептора эритропоэтина (ЭП-Р) и содержание цитокинов в лизатах клеток головного мозга животных с активным и пассивным типом  ОИП.
  3. Исследовать интенсивность клеточного и гуморального иммунного ответа, пролиферативную активность иммунокомпетентных  клеток, уровень мРНК  ИЛ-1, ИЛ-1-РI и ЭП-Р и содержание цитокинов в лизатах селезенки, культуральных супернатантах моноцитарно-макрофагальных и лимфоидных клеток селезенки животных с активным и пассивным типом  ОИП.
  4. Определить характер изменения параметров ОИП у животных с его различным уровнем при стимуляции клеточного и гуморального звеньев иммунной системы.
  5. Исследовать влияние трансплантации неразделенных клеток селезенки на параметры  ОИП у сингенных животных с активным и пассивным типом  ОИП.
  6. Изучить влияние трансплантации моноцитарно-макрофагальных клеток селезенки на функциональную активность нервной системы (ОИП, экспрессию генов ИЛ-1, ИЛ-1-Р и ЭП-Р  в клетках головного мозга) и иммунной системы (клеточный и гуморальный иммунный ответ, пролиферативную активность иммунокомпетентных клеток, экспрессию генов ИЛ-1, ИЛ-1-Р и ЭП-Р  в спленоцитах) у сингенных животных с с активным и пассивным типом  ОИП.
  7. Изучить влияние трансплантации неприлипающих к пластику клеток селезенки на функциональную активность нервной системы (ОИП, экспрессию генов ИЛ-1, ИЛ-1-Р и ЭП-Р  в клетках головного мозга) и иммунной системы (клеточный и гуморальный иммунный ответ, пролиферативную активность иммунокомпетентных клеток, экспрессию генов ИЛ-1, ИЛ-1-Р и ЭП-Р  в спленоцитах) у сингенных животных с активным и пассивным типом  ОИП.
  8. Изучить влияние трансплантации иммунокомпетентных клеток на характерные проявления функциональной активности иммунной и нервной систем у экспериментальных животных в состоянии хронической зависимости от морфина.

Научная новизна:

В результате проведенных исследований продемонстрирована взаимосвязь  уровня ОИП с особенностями структурно- функциональной организации ЦНС  и функциональной активности иммунной системы у экспериментальных животных. 

Показано, что мыши (CBA x C57BL/6)F1 с активным типом ОИП  характеризуются относительно большим количеством нейронов в сенсомоторной коре головного мозга по сравнению с мышами с пассивным типом ОИП.  У последних, в свою очередь,  в коре мозга выявлены выраженные перицеллюлярные отеки, и  наличие групп сжатых клеток.

При этом установлено, что клетки головного мозга мышей (CBA x C57BL/6)F1 с пассивным типом ОИП отличаются от таковых у мышей с активным типом поведения более высокой экспрессией генов ИЛ-1 и ИЛ-1Р первого типа,  равно как и превалирующим содержанием цитокинов ИЛ-1,  ИЛ-6, ФНО, ИНФ в их лизатах. Впервые выявлена относительно высокая экспрессия гена ЭП-Р  в клетках головного мозга  мышей  (CBA x C57BL/6)F1 с активным типом ОИП. Показано стимулирующее влияние эритропоэтина (ЭП) на показатели моторного и исследовательского компонентов ОИП.

Впервые показаны различия синтеза и продукции ряда цитокинов ИКК мышей (CBA x C57Bl/6)F1 с активным и пассивным типом ОИП. Так, у мышей  с высоким уровнем ОИП выявлена более низкая экспрессия гена ЭП-Р как в макрофагальных, так и в лимфоидных клетках селезенки. В тоже время  у этих животных установлен относительно высокий уровень мРНК ИЛ-1-Р первого типа в спленоцитах и мРНК ИЛ-1 в их моноцитарно-макрофагальной фракции.  При этом в лизатах спленоцитов  мышей с активным типом ОИП показано более высокое содержание  цитокинов ИЛ-6,  ФНО и ИНФ,  равно как и  ИЛ-1,  ИЛ-6,  ФНО в культуральном супернатанте их моноцитарно-макрофагальной фракции. Спленоциты лимфоидного ряда мышей  (CBA x C57Bl/6)F1 с активным типом ОИП отличаются повышенной продукцией ИЛ-6.

При исследовании функциональной активности ИКК у мышей (CBA x C57Bl/6)F1 с высоким и низким уровнем ОИП выявлены также достоверные различия в их пролиферативной активности. Показано, что животные с активным типом ОИП характеризуются более высокой спонтанной и митогениндуцированной пролиферативной активностью тимоцитов и спленоцитов..

Впервые установлено, что характер изменения параметров ОИП у мышей  (CBA x C57Bl/6)F1 при формировании как гуморального, так и клеточного  иммунного ответа определяется исходным поведенческим статусом животных.

Впервые выявлена тесная взаимосвязь между уровнем ОИП и выраженностью реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ), характеризующей состояние клеточного звена иммунного ответа, наблюдаемая  у мышей линий (CBA x C57BL/6)F1,  C57Bl/6, Balb/c  и у крыс Wistar и OXIS, характеризующихся высокими  и низкими параметрами поведения в тесте "открытое поле"  соответственно; у последних продемонстрировано также дозозависимое повышение показателей горизонтальной двигательной активности при стимуляции клеточного звена иммунного ответа.

Научная новизна работы заключается также в том, что впервые продемонстрирован феномен направленного изменения уровня ОИП у сингенных животных путем трансплантации иммунокомпетентных клеток (ИКК) с определенными функциональными характеристиками;  и показаны эффекты влияния моноцитарно-макрофагальных и лимфоидных клеток селезенки на параметры ОИП мышей  (CBA x C57Bl/6)F1 с активным и пассивным типом поведения в норме и в состоянии хронической зависимости от морфина.

Теоретическая и практическая значимость исследования.

Теоретическая значимость работы заключается в установлении принципиально нового феномена: направленного изменения параметров ОИП у экспериментальных животных  путем трансплантации ИКК с определенными функциональными характеристиками. Представленные в работе результаты, раскрывающие основные механизмы  влияния ИКК на ОИП, значительно расширяют существующие представления о процессах функционального взаимодействия двух важнейших гомеостатических систем организма - нервной и иммунной. Выявленные взаимосвязи между функциональной активностью иммунной системы и уровнем ОИП у интактных животных, а также закономерности влияния активации иммунной системы, ее клеточного и гуморального звеньев на параметры ОИП раскрывают  механизмы иммунорегуляции форм поведения как врожденных, так и приобретенных в ходе индивидуального опыта.

  Практическая значимость полученных результатов  заключается в обосновании необходимости оценки и учета индивидуально-типологических особенностей пациента при проведении иммунотерапевтических мероприятий, в частности, клеточной терапии, поскольку  имеются основания полагать, что при этом имеет место не только ожидаемый непосредственный эффект на уровне иммунной системы реципиента, но и опосредованный эффект на функции центральной нервной системы. Выявленные в работе  закономерности и взаимосвязи между параметрами поведения и функциональной активностью иммунной системы открывают новые перспективы в самых различных областях экспериментальной и клинической медицины;  позволяют  расширить возможности как иммунокоррекции (в том числе посредством коррекции поведенческих функций); так и регуляции поведения путем воздействия на параметры  иммунитета. Практическая  ценность работы  заключается также в том, что предложенная экспериментальная модель и полученные результаты могут быть использованы для разработки  новых биологических методов и стратегии патогенетической терапии различных форм психосоматических заболеваний, протекающих с нарушением нейроиммунных взаимодействий, в том числе и наркотической зависимости.

Положения, выносимые на защиту.

  1. У животных с активным и пассивным типами ОИП  различна функциональная активность клеточного звена иммунной системы.
  2. Уровень ОИП ассоциирован с уровнем синтеза цитокинов в клетках иммунной системы и ЦНС.
  3. Трансплантация иммунокомпетентных клеток является способом изменения ОИП  у экспериментальных животных.

Личный вклад автора в проведение исследования.

Все представленные результаты экспериментальных исследований получены лично автором, либо при его непосредственном участии.

Апробация материалов диссертации.

Материалы диссертации представлены  в виде докладов на следующих научных мероприятиях:  International Congress ISNIM – 99 (Lugano,  Switzerland, September, 1999); Eighth NIDA International Forum on Building International Research (Miami, USA, June, 2003); Съезде РНОИ  (Сочи, 2004); Drug Discovery Technology / InfoTech Pharma Conference (London, March 2005);  Российско-германском  симпозиуме «Патофизиология психических расстройств» (Томск, сентябрь 2006);  Симпозиуме «Дни иммунологии в Сибири» (Омск, 2007);  3-rd International Conference “Basic Science for Medicine” (Novosibirsk, September, 2007);  Съездах нейроиммунологов  (Санкт-Петербург, май-июнь 2005, 2007, 2009); Объединенном иммунологическом форуме (Санкт-Петербург, июнь-июль 2008);  “EHRLICH II  2nd World Conference on Magic Bullets“ (Nrnberg, Germany, October 2008); 2nd European Congress of Immunology (Berlin, September, 2009); шестой Российской конференции по нейроиммунопатологии (Москва, июнь, 2010).

Результаты работы представлены также на итоговых научных сессиях ГУ НИИ клинической иммунологии СО РАМН (Новосибирск, 2000, 2003,  2006); заседании Президиума СО РАМН  (Новосибирск, июнь 2009 г.); заседании проблемной комиссии МНС № 55.07 «Иммунология» СО РАМН (сентябрь 2010).

Публикации.  По теме диссертации опубликовано в российских и зарубежных изданиях 60 научных работ, в том числе 33 статьи (из них 25 в изданиях, рекомендуемых ВАК для публикации материалов диссертационных работ). Результаты исследований вошли также в монографии "Основы нейроиммунологии", М.,  2004; и "Патофизиология психических расстройств", Томск, 2006.

Структура и объем диссертации.

Диссертация написана в традиционном стиле и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования,  глав, содержащих результаты собственных исследований, обсуждения полученных результатов, заключения и выводов. Диссертация изложена на 251 странице машинописного текста, иллюстрирована 21 рисунком и 21 таблицей. Список цитируемой литературы включает 599 источников, из них 147 работ отечественных авторов.

Работа выполнена в лаборатории нейроиммунологии отдела экспериментальной иммунологии НИИ клинической иммунологии  СО РАМН.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

  1. Экспериментальные животные.

В работе использовались мыши-самцы (CBAxC57Bl)F1, BALB/c, С57Bl/6, в количестве 2140 особей; средний вес животных составлял 18 - 20 грамм, возраст 3 месяца; а также мыши (CBAxC57Bl)F1 в возрасте 7 и 14 месяцев. Животные были  получены из питомника НИЛЭМ СО РАМН (г.Томск) и  лаборатории экспериментальных животных (моделей) НИИКИ СО РАМН (г. Новосибирск). Крысы линий Вистар и OXYS, в количестве 110 особей, самцы, средний вес животных составлял 200 - 250 грамм, возраст 3 месяца;  получены из лаборатории разведения экспериментальных животных Института цитологии и генетики СО РАН (г.Новосибирск). Животные содержались в условиях лабораторного вивария в клетках по 5-10 особей, в течение не менее двух недель до начала эксперимента на стандартной диете, при свободном доступе к воде и нормальном  световом режиме.

2. Экспериментальные воздействия.

1. Иммунизация взвесью эритроцитов барана (ЭБ). ЭБ отмывали три раза пятью объемами среды 199. Затем готовили 5% взвесь на среде 199 и вводили внутрибрюшинно в объеме 0,5 мл.

2. В качестве стимулятора  реакции гиперчувствительности замедленного типа использовалась туберкулезная вакцина (БЦЖ) сухая (ФГУП «Аллерген»). Вакцину вводили внутрибрюшинно в дозе в дозе 50, 250, 600 мкг\кг веса животного в объеме 0,5 мл среды  RPMI-1640. Контрольной группе животных в аналогичных условиях эксперимента  и в том же объеме вводили растворитель – среду  RPMI – 1640.

3. Введение рекомбинантного эритропоэтина (Recormon, Boehringer Mannheim GmbH, Германия). Эритропоэтин (ЭП) вводили подкожно по 10 единиц 3 раза в неделю, общая доза препарата составила 30 единиц.

4. Формирование хронической морфиновой зависимости. У животных хроническая зависимость от морфина формировалась  методом принудительного спаивания в течение 25 дней. Морфин подавался в 2% растворе сахарозы, начиная с дозы 0,1 мг/мл, с последующим ее  увеличением до 0,2 мг/мл, 0,3 мг/мл, 0,4 мг/мл через каждые 48 часов. Доза морфина в 0,4 мг/мл оставалась неизменной до конца эксперимента.

В качестве контроля использовались группы животных, принимавшие в аналогичных условиях эксперимента 2 % раствор сахарозы. (Лицензия на деятельность, связанную с оборотом наркотических и психотропных веществ, регистрационный номер – 21/000003 от 19.11.02 г.)

3. Иммунологические методы.

3.1. Получение суспензии спленоцитов.

Животных забивали путем цервикальной дислокации; в стерильных условиях  вскрывали брюшную полость, извлекали селезенки, очищали их от соединительной ткани и помещали во флаконы с охлажденной до 4С средой 199 (5 мл на селезенку). Выделенные селезенки измельчали на мельчайшие кусочки при помощи ножниц. Образовавшуюся в результате измельчения суспензию клеток осторожно ресуспензировали с помощью шприца, для того, чтобы распались оставшиеся скопления клеток, центрифугировали 8 мин при 150 g. После удаления надосадочной жидкости, находящиеся в осадке спленоциты  ресуспензировали в среде  RPMI - 1640. Жизнеспособность клеток определяли при помощи окраски трипановым синим.

3.2. Трансплантация иммунокомпетентных клеток.

Иммунокомпетентные клетки для трансплантации выделяли из суспензии клеток селезенки мышей – доноров (CBA x C57 Bl/6)F1 с высоким или низким уровнем ориентировочно-исследовательского поведения (ОИП) в тесте "открытое поле".

Моноцитарно-макрофагальную фракцию спленоцитов выделяли адгезией  на пластике в течение двух часов при температуре 37С, предварительно удалив эритроциты методом гемолитического шока.  Затем, после 2-кратного отмывания холодной средой 199, оставшиеся клетки снимали с пластика  специальным шпателем Сell Scraper (Becton Dickinson) в пробирку. Полученная суспензия на 86 – 92% состояла из клеток системы мононуклеарных фагоцитов. Жизнеспособность клеток оценивалась по включению трипанового синего и составляла 93 – 95%.

Клетки неприлипающей к пластику фракции спленоцитов получали из суспензии клеток селезенки,  предварительно удалив моноцитарно-макрофагальную фракцию клеток адгезией  на пластике в течение двух часов при температуре 37С. Полученная суспензия на 88 – 93% состояла из клеток лимфоидного ряда.

Далее, клетки (8-10106 в 0,2 мл среды RPMI-1640) доноров с высоким уровнем ОИП (активный тип поведения) внутривенно вводили реципиентам с низким уровнем ОИП (пассивный тип поведения) и, наоборот. Для трансплантации применялась также и неразделенная суспензия спленоцитов в концентрации 15106  на одно животное.

Контролем в каждой опытной группе служили мыши, которым трансплантация ИКК проводилась в аналогичных условиях эксперимента, за исключением того, что доноры и реципиенты характеризовались одинаковым уровнем ОИП.

Концентрация трансплантируемых спленоцитов определялась путем предварительной серии экспериментов: использовалась максимальная концентрация клеток, не изменяющая после их внутривенного введения параметры поведения в "открытом поле" у реципиентов, аналогичных донорам по уровню ОИП.

  На 5-е сутки после трансплантации у реципиентов тестировались параметры ОИП, экспрессии генов цитокинов клетками головного мозга и селезенки, количество антителообразующих клеток селезенки (АОК), высота реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ), пролиферативная активность клеток тимуса и селезенки. 

3.3. Определение субпопуляционного состава спленоцитов.

Субпопуляционный состав спленоцитов определялся у мышей (CBA x C57Bl/6)F1 c высоким и низким уровнем ориентировочно-исследовательского поведения.  Фенотипирование клеток селезенки проводилось методом проточной цитофлюорометрии с помощью аналитической системы FACS Calibur (Becton Discinson, USA) согласно инструкции по эксплуатации, прилагаемой к прибору, с моноклональными антителами против CD4, CD8, CD45, CD116 (Becton Discinson, USA), помеченными  флюорохромами с отличающимися спектрами эмиссии. 

3.4. Определение количества антителообразующих клеток в селезенке мышей.

Способность мышей к иммунному ответу на Т-зависимый антиген (ЭБ) оценивали на 5-е сутки после внутрибрюшинной иммунизации ЭБ  по количеству локальных зон гемолиза в полужидкой среде модифицированным методом A.J. Cunningham (Cunningham A.J. 1965). Селезенку измельчали ножницами в бюксе со средой 199, взвесь кусочков ткани несколько раз пропускали с помощью шприца через стальную иглу. Полученную суспензию клеток фильтровали. Конечный объем суспензии доводили до 5 мл. Работы проводили при температуре + 4С. Равные объемы клеточной суспензии, 10% суспензии ЭБ и раствора комплемента смешивали в бюксе и заливали в стеклянные камеры. Камеры были изготовлены следующим образом: между двумя предметными стеклами прокладывали полоску бумаги, а верхние и нижние края склеивали между собой горячим парафином. Когда парафин остывал, полоску бумаги вынимали и в щель между стеклами шприцем заливали смесь из 0,5 мл клеточной суспензии, 0,5 мл ЭБ (10% суспензии) и 0,5мл комплемента. Комплемент готовили непосредственно перед заливкой камеры. Учитывали объём суспензии, залитой в камеры. Заполненные камеры инкубировали в течение 45 минут  в термостате при температуре 37С. После инкубации подсчитывали количество локальных зон гемолиза в камере под бинокулярной лупой (увеличение в 20 раз). Зона гемолиза (бляшка) представляет собой округлый участок, почти полностью свободный от эритроцитов. Учитывая число бляшек в камере, количество ядросодержащих клеток в 1 мл клеточной суспензии, объём заполненной камеры и клеточность селезенки, подсчитывали абсолютное число АОК во всей селезенке и относительное их число на 106 ядросодержащих клеток селезенки. Подсчет ядросодержащих клеток селезенки производили в камере Горяева.

3.5. Определение высоты реакции гиперчувствительности замедленного типа.

Мышей иммунизировали внутрибрюшинным введением эритроцитов барана  (0,5% - 0,5 мл.).  Разрешающую дозу  указанного антигена (50% - 0,05 мл.) вводили под апоневроз задней стопы через 96 часов. Формирование реакции ГЗТ оценивали через 24 часа после разрешающей инъекции по степени опухания лапы (изменения её толщины по сравнению с позитивно-контрольной задней лапой того же животного, в которую была введена среда  RPMI - 1640).  Индекс реакции (ИР) определяли для каждой мыши по формуле ИР = (Ро – Рк) / Рк и выражали в процентах (Yoshikai Y., et al, 1979).

3.6. Исследование пролиферативной активности клеток.

Пролиферативный ответ спленоцитов и тимоцитов оценивали стандартным  методом  по включению в нуклеопротеидные фракции клеток радиоактивной метки (Н3-тимидин). Суспензию клеток в полной культуральной  среде, содержащей RPMI-1640, 5% инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки, 2мМ L-глютамина, 10 мМ HEPES-буфера, 5х10-5 М 2-меркаптоэтанола (Sigma) и 80 мкг/мл гентамицина  вносили  в объеме 50 мкл в 96-луночные круглодонные планшеты (Linbro) в концентрации 5х105 тимоцитов и 105 спленоцитов на лунку. К суспензии добавляли по 50 мкл митогена (субоптимальные концентрации ЛПС E.coli 026:B6 (Sigma) и конкавалина А (Pharmacia) определялись в серии предварительных экспериментов и составляли соответственно 25 мкг/мл и 1 мкг/мл) и/или культуральной среды до полного объема 150 мкл на лунку. Клетки культивировались в течение 72 часов при 37°С и 5% содержании СО2 в атмосфере. За 18 часов до окончания периода культивирования ввносили Н3-тимидин (1мкКю на лунку). По окончании периода инкубации клетки собирали на специальные стекловолокнистые фильтры (Flow Lab.Inc.) c помощью автоматического 12-канального Cell harvester-530 (Flow Lab.Inc.). Оценку радиоактивности материала производили в жидкостном сцинтилляционном счетчике SL-30 (Intertechnic, Франция). Результаты представляли в виде среднего счета в имп/мин.

3.7. Определение цитокинов. 

Количественное содержание цитокинов определяли в образцах культуральных супернатантов трансплантируемых (донорских) клеток, а также в лизатах головного мозга и селезенки животных с различным уровнем ориентировочно-исследовательского поведения. Для этого спленоциты культивировали в концентрации 2 х 106/мл в объеме 2 мл в 24-луночных планшетах для иммунологических исследований (Linbro) при температуре 37°С во влажной атмосфере, содержащей  5% СО2 в течение 24 часов для исследования продукции ИЛ-1 и ФНО; 48 часов для Ил-4 и ИЛ-6 и 72 часов для исследования продукции ИФН-. По окончании периода культивирования клеточную суспензию собирали, клетки осаждали центрифугированием, а культуральный супернатант использовали для исследования.

Лизаты головного мозга и селезенки животных получали путем гомогенизирования тканей в среде RPMI-1640 с добавлением 0,1%  Triton Х - 100 (GERBU Biotechnik GmbH), с последующим  центрифугированием в течение 3 минут при 10000 об/мин. Надосадочную жидкость использовали для исследования.

Содержание цитокинов в исследуемых образцах оценивали методом ИФА (ELISA) с использованием специфических компонентов к цитокинам мыши производства фирмы “R&D Systems” (Великобритания). Принцип анализа «sandwich» - вариант твердофазного трехстадийного иммуноферментного анализа на планшетах (моноклональные антитела на подложке, конъюгат поликлональных антител с биотином) по технологии, разработанной в ЗАО “Вектор-Бест” для определения цитокинов. Чувствительность наборов для ИЛ-1 и ИЛ-4  не превышает 5 пг/мл, для ИЛ-6 и ИНФ -2 пг/мл, для ФНО -1 пг/мл.

4. Молекулярно-биологические методы.

4.1. Выделение тотальной РНК.

Выделение тотальной РНК из клеток селезенки и головного мозга животных  проводили методом фенольной экстракции (Chomczynsy P., Sacchi N. 1987) с использованием тест - системы ВектоРНК - экстракция (Вектор - Бест, Новосибирск). С этой целью 200 мкл клеточной суспензии, содержащей 4 х106 клеток, смешивали с 200 мкл 4М раствора гуанидинтиоционата и 4 мкл РНК - носителя с концентрацией 0,5 мг/мл, встряхивали на «Вортексе» в течение 15 сек и охлаждали на снежной бане в течение 10 минут. Затем добавляли 200 мкл смеси фенол – хлороформ – изоамиловый спирт в соотношении 25:24:1 по объему, энергично встряхивали в течение 1 мин и замораживали пробирки со смесью при температуре - 18С в течение 40 минут. После размораживания смесей пробирки центрифугировали при 12 000 об/мин в течение 5 минут, осторожно собирали водную фазу, замеряя ее объем, добавляли 1/10 часть по объему 2М раствора ацетата натрия, рН 4,5, и равный объему водной фазы объем изопропилового спирта. Растворы тщательно перемешивали и замораживали при температуре -18С в течение ночи. Далее, после размораживания, полученную РНК осаждали центрифугированием при 12 000 об/мин в течение 5 мин, супернатант осторожно удаляли пипеткой, а к осадку добавляли 100 мкл 75% этилового спирта, предварительно охлажденного до -18С. Раствор РНК вновь центрифугировали; супернатант удаляли; осадок подсушивали при 45С и растворяли в 12 мкл DEPC-обработанной воды. Небольшую аликвоту отбирали для определения спектрофотометрических характеристик и степени деградации РНК.

  Для определения возможной деградации РНК в процессе экстракции использовали электрофорез на 2% геле агарозы в трис-ацетатном буфере, с добавлением 0,00001% бромистого этидия (ВектоДНК-ЭФ, Вектор-Бест, Новосибирск).  Пробы РНК визуализировали при помощи трансиллюминатора (Viber Lourmatt, Франция). Пробы с признаками деградации РНК (смещение и размытость полос 18S и 28S рибосомальных РНК) не использовались.

Для определения спектрофотометрических характеристик препаратов РНК оптическую плотность образцов определяли на спектрофотометре (Hitachi-320, Япония) при 260 нм и 280 нм, что позволяло судить о чистоте препаратов и о количестве РНК: 1 о.е. при 260 нм соответствует 40 мкг/мл (Маниатис Т. и соавт.,1984).

4.2. Проведение реакции обратной транскрипции.

Для проведения реакции обратной транскрипции к раствору РНК добавляли 3 мкл раствора случайных праймеров (OligoDT12 – 18) (Медиген, Новосибирск) c оптической плотностью 1 о.е.; инкубировали при температуре 65С в течение 15 минут; затем охлаждали при температуре -18С в течение 15 минут. После этого в каждую пробирку с РНК добавляли по 25 мкл раствора для ревертирования, состоящего из 2 мкл100 Мм MgCl2 (Медиген, Новосибирск), 1,5 мкл (75 ед) обратной транскриптазы M – MuLV RT (Promega, USA), 4мкл 10 – кратного буфера для обратной транскриптазы (Медиген, Новосибирск), 9,5 мкл деионизированной воды (Медиген, Новосибирск), 8 мкл смеси 20 Мм динуклеотидтрифосфатов (АTP, TTP, GTP, CTP) (Медиген, Новосибирск), 1 мкл раствора ингибитора РНКаз (20 ед/мкл) (Promega, USA). Реакцию проводили в течение 60 минут в термостате при температуре 37С. Фермент обратную транскриптазу инактивировали в конце реакции нагреванием 95о С 5 минут. Пробы замораживали при -18С в течение ночи.

4.3. Проведение полимеразной цепной реакции. 

Амплификацию полученной ДНК осуществляли в программируемом амплификаторе "Eppendorf", с использованием пар олигонуклеотидных праймеров, гомологичных консервативным участкам антипараллельных цепей ДНК. Праймеры к  ИЛ-1-Р первого типа и к ЭП-Р (Gui-Quan J., Gutierrez-Ramos J.C. 1995.), ИЛ-1β, и β-актину (Allen R.D., et al., 1993.) для полимеразной цепной реакции были синтезированы согласно структуре описанной вышеуказанными авторами. β-актин использовался в качестве внутреннего контроля для стандартизации и выравнивания результатов полуколичественного анализа исследуемых образцов ДНК.  Для проведения амплификации ДНК в каждую пробирку добавляли по 5 мкл 10 – кратного буфера для Taq ДНК – полимеразы (Медиген, Новосибирск), 2 мкл 100 Мм раствора MgCl2 (Медиген, Новосибирск), 2 мкл смеси 8 Мм динуклеотидтрифосфатов (Медиген, Новосибирск), 1мкл Taq ДНК – полимеразы (5 ед/мкл) (Promega, USA), по 2 мкл смеси соответствующих праймеров (sense, antisense, 1 о.е./мл), 2 мкл исследуемой ДНК, 34 мкл деионизированной воды (Медиген, Новосибирск).  Амплификацию проводили в режиме 30 циклов: 94 - 0,5 мин.; 69 - 1мин.; 72 - 1мин.

4.4. Анализ продуктов амплификации.

Полученные фрагменты кДНК анализировали методом электрофореза в 2% геле агарозы с добавлением 0,00001% бромистого этидия (ВектоДНК-ЭФ, Вектор-Бест, Новосибирск). Для этого 9 мкл каждого образца кДНК, полученного в результате проведения амплификации, смешивали с 1 мкл 10 - кратного буфера для нанесения образцов, состоящего из 50% раствора глицерина, 0,25% раствора  бромфенолового синего, 0,25% раствора  ксиленцианола. Полученную смесь вносили в карманы геля. Первый карман геля заполнялся 10 мкл раствора фрагментов кДНК (100 – 1000 п.н.), во второй – вносили отрицательный контрольный образец, представляющий собой реакционную смесь, в которую вместо исследуемой кДНК добавлено соответствующее количество деионизированной воды. Электрофорез проводили в трис – ацетатном буфере при напряжении 15 В/см геля. Полученный фрагмент кДНК соответствующего размера (659 п.н. для ИЛ - 1β, 334 п.н. для ИЛ-1-Р первого типа, 247 п.н. для ЭП-Р и 540 п.н. для β-актина) выявляли в виде дискретной полосы, соответствующей ожидаемому размеру ампликона, после электрофоретического разделения молекул ДНК. Продукты ПЦР визуализировали в денситометре (Pharmacia-LKB). Полуколичественная оценка результатов проводилась с использованием программы Image Master VDS Software (USA). Результаты выражались в относительных  единицах оптической плотности (единицы оптической плотности кДНК цитокина / единицы оптической плотности кДНК β-актина х 100).

5. Психофизиологические методы.

5.1. Изучение  поведения животных в  тесте “ открытое поле”.

Ориентировочно-исследовательское поведение (ОИП) животных оценивали в тесте "открытое поле" (Буреш Я., с соавт., 1991). Для этого использовалась большая прямоугольная  камера (100 х  100 см) с пластмассовыми  стенками высотой 40 см. Полом служил лист белого пластика, на который черной краской нанесена решётка, делящая поле на 100 (10 х 10) равных квадратов. Освещение проводилось бестеневой лампой мощностью 100 Вт, расположенной на высоте 100 см над центром поля. Животное помещалось в угол камеры и регистрировалась его моторная и исследовательская активность  в течение 5 минут с интервалом в 1 минуту. Для каждого животного подсчитывалось число пересеченных центральных и периферических квадратов, число вертикальных стоек (свободных и с опорой на стенку поля), суммарная горизонтальная и вертикальная двигательная активность. С целью определения степени эмоциональной реактивности  регистрировалось число фекальных болюсов.  Все эксперименты проводились в период времени с 10 до 14  часов.

6. Морфологические методы.

6.1. Морфологическое исследование тимуса. 

У крыс линий OXYS  и Вистар методами световой микроскопии исследовали состояние тимусов, которые  взвешивали для расчёта массового индекса (мг/100 г массы тела крысы), фиксировали в жидкости Теллесницкого  при температуре +4С и заливали в гистопласт. Серийные срезы окрашивали гематоксилином и эозином, азуром В, эозином Y. Проводили морфометрию структурных компонентов тимуса методом точечного счета с последующим вычислением абсолютных объемов (Conran R.M., Nickelson P.A., 1982).

6.2.  Гистологическое исследование  сенсомоторной коры больших полушарий головного мозга. 

Головной мозг мышей (CBA x C57 Bl/6)F1 с высоким и низким уровнем ОИП фиксировали в 10% нейтральном формалине, обезвоживали в спиртах восходящих концентраций, заливали в парафин и готовили срезы толщиной 5-8 мкм, которые окрашивали по методу Ниссля. Материалом исследования служила сенсомоторная кора больших полушарий головного мозга. В образцах проводили количественный и качественный анализ нейронов в 25 полях зрения..

6.3. Морфологическое исследование форменных элементов крови с дифференцированным подсчетом лейкоцитарной формулы.

Для приготовления мазка забирали кровь из хвостовой вены мышей (CBA x C57Bl/6)F1 с различным уровнем ОИП; фиксировали мазок в 96% этаноле в течение 5 минут; с последующей окраской по методу Романовского - Гимзе.  В окрашенных мазках периферической крови проводили подсчет процентного содержания моноцитов, лимфоцитов и нейтрофилов путем регистрации всех встречающихся в поле зрения лейкоцитов  раздельно по их принадлежности к тем или иным росткам.

7. Статистическая обработка результатов.

Статистическую обработку результатов исследований проводили с использованием t-критерия Стьюдента (при нормальном распределении изучаемого признака) и парного критерия Манна-Уитни в случае отклонения от нормального распределения  (компьютерные программы "Jandel Sigma Plot", "Statistica 6.0"); а также факторного анализа  ANOVA  в программной среде  STATGRAPHICS. Для оценки взаимосвязи между параметрами проводился корреляционный анализ. Различия между группами считались достоверными при уровне значимости p < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Структурно-функциональные особенности ЦНС у животных с различным уровнем ориентировочно - исследовательского поведения.

Параметры ориентировочно-исследовательского поведения у экспериментальных животных различных видов.

  В результате проведенных исследований были  охарактеризованы параметры и возрастные особенности  ОИП  у мышей линий C57Bl/6, Balb/c, (CBA x C57Bl/6)F1; крыс Вистар и OXYS .

Полученные результаты свидетельствуют о том, что мыши  линий C57Bl/6 и Balb/c являются оппозитными по проявлению изучаемой поведенческой реакции. При этом мыши линии C57Bl/6 характеризуются относительно  высоким уровнем ОИП,  выражающимся в высокой суммарной двигательной активности в тесте "открытое поле" (290±7) и низкой степенью эмоциональной реактивности (уровень дефекации - l, 1 ± 0,3). Мыши линии Balb/c характеризуются относительно  низкими параметрами суммарной двигательной активности (83±7, p<0,01) и высокой степенью эмоциональной реактивности  (6,0 ± 09,4;  p<0,01).

Аналогичный оппозитный характер поведения в тесте "открытое поле" присущ также  крысам  Вистар и OXYS.  Для крыс OXYS характерны относительно низкие показатели моторного и исследовательского компонентов ОИП. Об этом свидетельствует сниженные в 2,5 раза, по сравнению с крысами Вистар, показатели горизонтальной и вертикальной двигательной активности животных. Число дефекационных болюсов  у крыс OXYS в 1,4 раза больше, чем у Вистар, частота проявлений реакции груминга - в 3,4 раза ниже, что свидетельствует о  повышенной тревожности этих животных.

Исследование характера поведения мышей (CBA x C57Bl/6)F1 в тесте "открытое поле" выявило разнородность этих животных по параметрам моторного и исследовательского компонентов ОИП (табл. 1):

Для животных с высоким уровнем ОИП (активный тип поведения) свойственна высокая горизонтальная и вертикальная двигательная активность, отражающие моторный и исследовательский компоненты ОИП соответственно, с пиком горизонтальной двигательной активности на второй минуте тестирования. При этом  99% мышей  данной группы  характеризуются низким уровнем эмоциональной реактивности (число дефекационных болюсов за время тестирования составило 0,93 ± 0,2).

Таблица 1.

Параметры ОИП мышей (CBA x C57Bl/6)F1 в тесте "открытое поле" (M ± SD).

Группы

животных

Горизонтальная двигательная  активность

Вертикальная двигательная активность

перифериче-ская

централь- ная

суммарная

свобод-ная

с опорой на стенку

суммар-

ная

1

188,1±33,7

24,3±6,4

212,4±35,3

4,4±1,4

11,4±5,3

15,9±6,7

2

135,7±26,9*

10,2±3,1*

145,8±29,9**

1,9±0,4*

4,1±1,7*

5,96±2,2*

3

37,3±13,8*

0,0±0,1*

37,3±13,8*

0,0±0,0*

0,27±0,7*

0,27±0,7*

Примечание: n= 130-160 в каждой группе. 1 - группа животных с высоким уровнем ОИП; 2 - группа животных со средним  уровнем ОИП; 3 - группа животных с низким  уровнем ОИП.

* - p < 0, 05; * *- p < 0, 01 между группами животных.

Мыши (CBA x C57Bl/6)F1, характеризующиеся средним  уровнем ОИП, демонстрировали более низкие показатели моторного и исследовательского компонентов поведения по сравнению с таковыми у животных с активным типом ОИП. При этом максимум двигательной активности мышей наблюдался на 3-ей минуте тестирования. Мыши со средним уровнем ОИП более эмоциональны относительно животных с высоким уровнем ОИП  (число дефекационных болюсов за время тестирования  - 1,74 ± 0,4; р < 0,05 по сравнению с 1 группой).

Мыши с пассивным типом поведения характеризуются низким уровнем ОИП. Так, число пересеченных  ими  периферических квадратов "открытого поля" в 5-7 раз меньше по сравнению с таковыми во второй группе; пересечение центральных квадратов поля здесь практически не наблюдалось. Эти животные демонстрировали очень низкие показатели вертикальной двигательной  активности; причем характерно полное  отсутствие у животных этой группы свободных стоек. В то же время, животные с пассивным типом ОИП отличаются высоким уровнем  эмоциональной реактивности (число дефекационных болюсов  за время тестирования составляет 3,8 ± 0,5; p < 0,05 по сравнению со второй группой животных). 

Анализ поведения половозрелых мышей (CBA x C57Bl/6)F1 с различным уровнем ОИП в процессе онтогенеза (до 14 месяцев) показал сохранение выявленных  различий в уровне ОИП, что указывает на стабильность данной поведенческой характеристики для каждой отдельной особи  в силу того, что исследовательское поведение является внутренней, биологически детерминированной потребностью, а не просто ситуативным явлением, вызванным внешними обстоятельствами.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что не только генетически разнородные, но и животные с одинаковым генотипом также могут отличаться вариабельностью поведения, причина которой, по всей видимости,  кроется в средовых, т.е. внешних по отношению к геному факторах. Следовательно, на формирование определенного стереотипа поведения у отдельного индивидуума, помимо генетических,  оказывают  влияние эпигенетические факторы, причем значимость генетических факторов в организации реагирования не одинакова у разных особей (Kafkafi N. et al., 2005); вследствие чего мы и наблюдаем разнородность ОИП у мышей (CBA x C57Bl/6)F1.

Структурно-функциональные особенности сенсомоторной коры головного мозга экспериментальных  животных с различным уровнем  ориентировочно-исследовательского поведения.

  Изучение  морфологической картины сенсомоторной коры головного мозга мышей (CBA x C57BL/6)F1 с активным и пассивным типами ОИП выявило  наличие у исследуемых групп животных некоторых особенностей. Так, мыши с пассивным типом ОИП,  по сравнению с таковыми с активным типом ОИП,  характеризуются  меньшим  количеством нейронов (93,6 ± 16,5 и 133,2 ± 25,5 соответственно; p < 0,05) - основных структурно-функциональных единиц ЦНС, способных принимать, обрабатывать, хранить, передавать и воспроизводить информацию, организовывать реакции на раздражения. У животных с пассивным типом поведения  в сенсомоторной коре головного мозга регистрировались  также выраженные перицеллюлярные отеки (93,7 ± 23,0 и 69,0 ± 9,4 у мышей с низким и высоким уровнем ОИП соответственно; p < 0,05); и  наличие групп сжатых клеток.  У мышей (CBA x C57BL/6)F1 с активным типом поведения, характеризующихся высоким  уровнем ОИП, помимо большего количества нейронов в сенсомоторной коре, отмечается их гипертрофия с гиперхромией ядер, что отражает повышенную функциональную активность указанных клеток.  Полученные  результаты свидетельствуют  о высокой морфофункциональной пластичности корковых структур ЦНС, обусловленной индивидуально-типологическими особенностями экспериментальных  животных.

Экспрессия генов ИЛ-1, ИЛ-1-Р первого типа, ЭП-Р и содержание цитокинов в лизатах головного мозга животных с различным уровнем  ориентировочно-исследовательского поведения.

Участие в регуляции поведенческих реакций показано для многих про - и противовоспалительных цитокинов, при этом среди провоспалительных цитокинов лидирующее место здесь отводится ИЛ-1 (Sparado F., Dunn A.J., 1990; Anforth H.R., et al, 1998; Vitkovic L., et al,  2000; Larson S.L., Dunn A.J., 2001;  Dunn A.J., 2002, 2006; Dantzer R., Wollman E.E., 2003; Gamero A.M., Oppengeim J.J., 2006 и др.), который не только сам  индуцирует повышение температуры, сомногенность, снижает двигательную активность, аппетит коммуникативное и половое поведение, то есть  вызывает симптомы “болезненного поведения”, но и вмешивается в продукцию и эффекты других цитокинов в головном мозге (ИЛ-6, ИФН, ПГЕ2 и др.), которые действуют как самостоятельные регуляторы поведения (Crestani F.et al,  1991;Aloisi F., Care A., 1992; Cambronero J.C.et al., 1992; Schobitz B.et al, 1994; Kubota T.et al., 2001 Dunn A.J., 2006; Ader  R., 2007  и др.).  Учитывая вышеизложенное,  представляло интерес оценить экспрессию генов ИЛ-1 и рецептора ИЛ-1 (ИЛ-1Р)  первого типа, посредством которого цитокин реализует свое действие на поведенческие реакции; равно как и содержание этого и других цитокинов в головном мозге животных с различным уровнем ОИП.

Нами выявлены достоверные  различия в экспрессии клетками головного мозга  мышей (CBA x C57BL/6)F1 с активным и пассивным типом ОИП генов ИЛ-1β , ИЛ-1Р первого типа и гена рецептора эритропоэтина  (рис.1-А). Что касается такого важного цитокина и гормона  как эритропоэтин (ЭП), то главная его функция, несомненно,  заключается в стимуляции эритропоэза. В то же время, ЭП на этапе эмбрионального развития организма стимулирует пролиферацию и  дифференцировку клеток головного мозга;  а  в дальнейшем, на более поздних этапах онтогенеза, он обладает выраженным нейротрофическим, антигипоксическим и  антиапоптотическим эффектом в отношении клеток нервной ткани (Sasaki R., et al, 2000;  Erbayraktar S., et al, 2003; Захаров Ю. М., 2007,2008, 2009), что не может не сказаться на функциональной активности ЦНС, в том числе и на реализации поведенческих реакций. Для ЭП показана также стимуляция функции мотонейронов коры головного мозга, регулирующих локомоторную активность (Mennini T. et al., 2006).  Доказательством участия эритропоэтина в реализации ОИП у экспериментальных животных могут служить собственные результаты, свидетельствующие о стимулирующем влиянии экзогенного эритропоэтина на параметры указанной поведенческой реакции у мышей (CBA x C57 Bl/6)F1. 

 

А  Б

Рис. 1. Содержание цитокинов в головном  мозге мышей  (CBA x C57Bl/6)F1 c различным уровнем ориентировочно-исследовательского поведения в тесте "открытое поле".

Примечание:  А -  Уровень мРНК ИЛ-1 (1), рецептора  ИЛ-1 первого типа (2) и рецептора эритропоэтина (3) в головном мозге мышей  (CBA x C57Bl/6)F1 c различным уровнем ОИП. По оси ординат – относительные единицы оптической плотности (единицы оптической плотности кДНК цитокина / единицы оптической плотности кДНК β-актина х 100);

Б -  Содержание цитокинов (пг/мл) в лизатах головного мозга мышей  (CBA x C57Bl/6)F1 c различным уровнем ОИП. 

  -  группа животных с  высоким уровнем ОИП;  группа животных с низким  уровнем ОИП; 

n=18-24  в каждой группе ; *- p < 0,05 между группами животных.

Выявлено также различное содержание ряда цитокинов в лизатах головного мозга мышей (CBA x C57 Bl/6)F1 с активным и пассивным типами ОИП;  причем  для  последних характерно относительно высокое  количество провоспалительных цитокинов (рис. 1-Б). В связи с этим обращает на себя внимание тот факт, что именно для провоспалительных цитокинов (ИЛ-1,  ИЛ-6, ФНО) показано ингибирующее влияние на экспрессию гена ЭП-Р в нейронах, астроцитах и микроглиальных клетках головного мозга (Nagai A., et al, 2001), что согласуется с представленными выше собственными результатами, свидетельствующими об относительно низком количестве мРНК ЭП-Р у животных с пассивным типом  ОИП (рис. 1-А). 

Следовательно,  установлено, что мыши (CBA x C57 Bl/6)F1, различающиеся по уровню ОИП, различны также по экспрессии клетками головного мозга генов ИЛ-1, ИЛ-1-Р первого типа, ЭП-Р; равно как и по количественному содержанию в мозге цитокинов  ИЛ-1, ИЛ-6, ФНО и ИНФ-; что, по всей видимости,  играет определенную роль в степени выраженности указанной поведенческой реакции у этих животных.

Функциональные особенности иммунной системы у экспериментальных животных с различным уровнем  ориентировочно-исследовательского поведения.

Клеточный и гуморальный  иммунный ответ, пролиферативная активность ИКК  у  экспериментальных животных с различным уровнем  ориентировочно-исследовательского поведения.

При исследовании функциональной активности иммунной системы у мышей (CBA x C57Bl/6)F1 с различным уровнем ОИП выявлены достоверные различия в пролиферативной активности ИКК. При этом животные с активным типом ОИП характеризуются более высокой спонтанной и митогениндуцированной пролиферативной активностью тимоцитов и спленоцитов относительно мышей с оппозитным типом поведения (табл. 2).

Таблица 2.

Пролиферативная активность клеток тимуса и селезенки мышей (CBA x C57Bl/6)F1 с различным уровнем ОИП (M ± SD).

Группы животных

Спленоциты ( имп/мин )

Тимоциты (имп/мин)

спонтанная

Кон А-индуцированная

ЛПС-стимулирован-ная

спонтанная

Кон А-индуцированная

1

1611,8±282,4

71938± 30854

11551,3±1403

527,8±86,6

12935,2 ±3684,8

2

609,7±73,9**

39880±10160*

3228,7±396,3**

242,0±77,0**

3109,3±447,1*

Примечание: 1 - группа животных с активным типом ОИП; 2 - группа животных с пассивным типом ОИП. * - p < 0,05; ** - p < 0,01 между соответствующими показателями в группах животных с оппозитными типами ОИП.

При исследовании развития первичного гуморального иммунного ответа  на Т-зависимый антиген (ЭБ)  ус­тановлено, что мыши (СВА х C57BL/6)F1, разли­чаюшиеся по поведению в тесте "открытое поле", не имеют достоверных различий ни по относи­тельному числу антителообразующих клеток (АОК/106), ни  по абсолют­ному числу АОК на селезенку. В то же время оценка интенсивности развиваемой реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) мышами  (CBA x C57Bl/6)F1 с различным  уровнем ОИП, свидетельствует о превалирующем показателе индекса реакции (ИР) в группе животных с высоким уровнем ОИП над таковым у животных со средним и низким уровнем ОИП (табл. 3). 

Таблица 3.

Гуморальный и клеточный иммунный ответ у мышей  (CBA x C57Bl/6)F1 с различным  уровнем ОИП (M ± SD).

Группы животных (n = 45-50  в группе)

Исследуемый  параметр

высокий уровень ОИП

средний уровень ОИП

низкий уровень ОИП

Число АОК/106  ядросодержащих клеток  селезенки

Число АОК на  селезенку

367 ± 56

96300 ± 10656

347 ± 29

79161± 6172

436 ± 53

96837 ± 6084

Реакция  ГЗТ ( ИР  %)

80,3±7,4

39,0 ±6,5**

12,7±2,9**

Масса тимуса (мг)

56, 4  ± 8,1

45,0 ± 3,6

37,1 ± 5,0*

Примечание: ИР - индекс реакции; n=25-30  в каждой группе;  * - p < 0,05 по сравнению с аналогичным показателем у животных с высоким уровнем ОИП; ** - p < 0,01 между соответствующим показателем в группах животных с различным уровнем ОИП.

При этом, у мышей (СВА х C57Bl/6)F1 выявлена прямая зависимость между суммарной двигательной активностью, определяющей уровень ОИП, и выраженностью реакции ГЗТ (коэффициент корреляции 0,94; p < 0,05); а также об­ратная зависимость указанных показателей  от степени эмоциональной реактивности (коэффициент корреляции - 0,79; p < 0,05).  Данная зависимость прослеживается также у мышей линий C57Bl/6 и Balb/c, у крыс Wistar и OXIS, характеризующихся высокими  и низкими параметрами поведения в тесте «открытое поле» соответственно,  что указывает на ее универсальный характер.

Полученные результаты указывают на  существование тесной связи между особенностями поведения и активностью клеточного звена  иммунной системы: чем выше уровень ОИП и ниже степень эмоциональной реактивности, тем более выражена реакция ГЗТ и пролиферативная активность ИКК.

Экспрессия генов  ИЛ-1,  ИЛ-1-Р первого типа,  ЭПО-Р и продукция цитокинов клетками селезенки экспериментальных животных с различным уровнем  ориентировочно-исследовательского поведения.

Установлено, что ИКК животных с активным и пассивным типами ОИП, различны не только в степени пролиферативной активности, как было показано выше,  но и по экспрессии генов, синтезу и продукции основных регуляторных цитокинов.

Так, в клетках  селезенки мышей (CBA x C57Bl/6)F1 с активным типом ОИП выявлен относительно высокий уровень мРНК рецептора ИЛ-1 первого типа при относительно низкой  экспрессии ЭП-Р (рис. 2-А).

 

А Б

Рис. 2. Содержание цитокинов в селезенке мышей  (CBA x C57Bl/6)F1 c различным уровнем ориентировочно-исследовательского поведения в тесте "открытое поле".

Примечание: А - Уровень мРНК ИЛ-1 (1), рецептора  ИЛ-1 первого типа (2) и рецептора ЭП (3)  в селезенке мышей  (CBA x C57Bl/6)F1 c различным уровнем ОИП в тесте "открытое поле". По оси ординат – относительные единицы оптической плотности.

Б - Содержание цитокинов (пг/мл) в лизатах клеток селезенки мышей  (CBA x C57Bl/6)F1 c различным уровнем  ОИП .

группа животных с  высоким уровнем ОИП; -  группа животных с  низким  уровнем ОИП;

n=18-24  в каждой группе;  *- p < 0,05 между группами животных.

Спленоциты указанной группы животных характеризуются также более высоким содержанием  провоспалительных цитокинов ИЛ-6,  ФНО и ИНФ  в их лизатах по сравнению с таковым у мышей с пассивным типом ОИП (рис. 2-Б).  Принимая во внимание тот факт, что именно ФНО и ИНФ- являются одними из ключевых элементов вызываемого БЦЖ иммунного ответа (Беклемишев Н.Д. Суходoева Г.С. , 1979;  Flynn J.L. et al., 1993; Flesch I.E. et al., 1993 и др.), можно предположить, что более высокий уровень реакции ГЗТ у животных с активным типом ОИП обусловлен, в частности,  высокой продукцией этих цитокинов ИКК.

Различия в экспрессии изучаемых генов (рис.3) и продукции цитокинов (рис.4)  у мышей  (CBA x C57Bl/6)F1 c активным и пассивным типами ОИП выявлены также для моноцитарно-макрофагальных и лимфоидных клеток  в составе спленоцитов.

 

  А Б

Рис. 3. Уровень мРНК ИЛ-1 (1), рецептора  ИЛ-1 первого типа (2) и рецептора эритропоэтина (3)  в моноцитарно-макрофагальных (А) и лимфоидных (Б) клетках селезенки мышей  (CBA x C57Bl/6)F1 c различным уровнем ОИП.

Примечание: по оси ординат – относительные единицы оптической плотности; 

группа животных с  высоким уровнем ОИП;  -  группа животных с  низким  уровнем ОИП;

*- p < 0,05;  **- p < 0,01  между группами животных.

 

А  Б

Рис. 4. Спонтанная продукция цитокинов моноцитарно-макрофагальными (А) и лимфоидными (Б) клетками селезенки мышей  (CBA x C57Bl/6)F1 c различным типом ОИП (пг/мл).

Примечание:

группа животных с  высоким уровнем ОИП; -  группа животных с  низким  уровнем ОИП;

*- p < 0,05 между группами животных.

Выявленное преобладание экспрессии генов и продукции провоспалительных цитокинов, равно как и относительно низкая экспрессия гена противоспалительного цитокина (ЭП-Р) селезеночными макрофагами мышей с активным типом ОИП, позволяет предположить превалирование у этих животных  клеток М1 фенотипа в моноцитарно-макрофагальной фракции спленоцитов (Martinez F. O. et al., 2008; Е.Н. Вассерман с соавт., 2010).

Что касается клеток лимфоидного ряда в составе спленоцитов мышей (CBA x C57Bl/6)F1 c активным и пассивным типами ОИП, то они отличаются экспрессией гена рецептора ЭП, о чем свидетельствует относительно более высокий уровень  мРНК  ЭП-Р в группе животных с пассивным типом поведения (рис.3);  а также относительно низкой продукцией ИЛ-6, о чем свидетельствует меньшее содержание этого цитокина в их культуральных супернатантах по сравнению с таковыми  у мышей с высоким ОИП (рис. 4).

Следовательно,  клетки селезенки мышей (CBA x C57Bl/6)F1 c активным и пассивным типом ОИП характеризуются различной функциональной активностью, определяемой по экспрессии генов ИЛ-1, рецептора ИЛ-1 первого типа и ЭП-Р, равно как и по продукции ими ряда  провоспалительных цитокинов.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что мыши (CBA x C57Bl/6)F1 с активным и пассивным типами ОИП,  различны по параметрам функциональной активности иммунной системы, выражающимися в различной пролиферативной активности, экспрессии  генов и продукции цитокинов ИКК; интенсивности развиваемых клеточных иммунных реакций. Учитывая выявленные взаимосвязи между структурно-функциональной организацией ЦНС и функциональной активностью иммунной системы у экспериментальных животных, следующим этапом исследования было изучение влияния стимуляции клеточного и гуморального звеньев иммунной системы на параметры ОИП у экспериментальных животных с различным поведенческим статусом.

Влияние стимуляции гуморального и клеточного звеньев иммунной системы на параметры ориентировочно-исследовательского поведения.

В вопросах, касающихся афферентной организации взаимодействия иммунной и нервной систем, немаловажное значение имеет  изучение механизмов ответа мозга на активацию иммунной системы, участия иммуногенных факторов в регуляции его нормальных физиологических функций.  Изучение влияния процесса формирования иммунного ответа на интегральные показатели высшей нервной деятельности, в частности на поведение, является одним из наиболее интересных и актуальных, на наш взгляд, направлений научных исследований в данной области.

Анализ поведения  в "открытом поле"  мышей (CBA x C57 Bl/6)F1, с активным и пассивным типами ОИП  на пике  развития первичного гуморального иммунного ответа  на введение Т-зависимого антигена (ЭБ)  выявил разнонаправленные изменения параметров указанной поведенческой реакции, характер которых определялся исходным поведенческим статусом животных  (рис. 5 - А).

   

А Б

Рис. 5. Изменение поведения мышей (CBA x C57Bl/6)F1 с различным уровнем ориентировочно исследовательского поведения при стимуляции клеточного и гуморального иммунного ответа.

Примечание: А - Суммарная двигательная активность после стимуляции клеточного иммунного ответа  вакциной  БЦЖ;  Б - Суммарная двигательная активность после стимуляции гуморального иммунного ответа  введением эритроцитов барана.

1- высокий уровень ОИП; 2- средний уровень ОИП; 3 – низкий уровень ОИП.

– группа контрольных животных  -  группа животных, после воздействия антигена.

Поведение тестировалось на пике выраженности иммунного ответа; n=25-30  в каждой группе; 

* - p< 0,05; ** - p< 0,01 – по сравнению с контрольной группой.

Так, мыши с исходно высоким уровнем ОИП  реагируют на введение указанного антигена  снижением моторного и исследовательского компонентов ОИП. У животных  со средним уровнем ОИП, напротив,  наблюдается активация изучаемой поведенческой реакции, выражающаяся в стимуляции моторного и исследовательского компонентов ОИП. Анализ поведения в “открытом поле”  мышей с низким уровнем ОИП  не выявил каких-либо достоверно-значимых изменений параметров данной поведенческой реакции в ответ на введение ЭБ.  Как известно,  реакции ЦНС,  включая поведенческие, на активацию иммунной системы в значительной степени опосредуются цитокинами и нейромедиаторными системами мозга, степень активности которых, как показывают литературные и наши собственные данные, различна у животных с активным и пассивным типами ОИП. Не исключено, что выявленное нами снижение параметров ОИП после иммунизации ЭБ у мышей с активным типом поведения может являться проявлением подавляющего действия на нее ИЛ-1; поскольку, как установлено, иммунизация мышей (CBAxC57Bl/6)F1  ЭБ сопровождается достоверным увеличением экспрессии гена ИЛ-1 и его рецептора первого типа в головном мозге (Повещенко А.Ф., 2003).  В то же время, относительно низкий базовый уровень экспрессии гена рецептора ИЛ-1 первого типа в головном мозге мышей со средним  уровнем ОИП  может являться одной из причин, по которой в данной ситуации превалируют эффекты на поведение животных других цитокинов, синтезирующихся в процессе иммуногенеза, в частности ИЛ-2, ИЛ-10,  и оказывающих стимулирующее влияние на изучаемую поведенческую реакцию (Nava F. et al., 1997; Zalcman S. et al., 1998).

  Следовательно, вопрос о влиянии гуморального иммунного ответа на поведение животных является достаточно сложным и неоднозначным,  в силу  существования  многостороннего комплекса относительно независимых механизмов реализации поведенческих эффектов активации клеток иммунной системы. Вместе с тем, полученные нами данные показывают, что характер изменений уровня ОИП  у мышей,  в процессе формирования первичного гуморального иммунного ответа, зависит от индивидуально-типологических особенностей поведения животных.

Развитие клеточного иммунного ответа при введение вакцины БЦЖ у мышей с исходно низким и средним уровнем ОИП сопровождалось стимуляцией моторного и исследовательского компонентов поведения. При этом эффект был выражен тем сильнее, чем ниже был исходный уровень ОИП животных (рис. 5 -Б).

Установлено, что введение вакцины БЦЖ, стимулирующей клеточное звено иммунной системы, вызывает дозозависимое увеличение параметров ОИП крыс  OXYS с пассивным типом поведения до уровня, не отличающегося достоверно от свойственного крысам Вистар  (табл. 4)

Таблица 4.

Воздействие вакцины БЦЖ на ориентировочно-исследовательское поведение крыс Вистар и OXYS в тесте "открытое поле" (М ± m).

 

n

Горизонтальная двигательная активность

Вертикальная  двигательная активность

Груминг

Дефекации

Вистар

1-й тест

10

119 ± 19,6

15,2 ± 3,0

4,2±0,82

2,1±0,73

2-ой тест

10

57,9±17

3,6±0,94

2,9±0,65

0,60±0,22

OXYS

1-й тест

30

60,6±6,9* F1,47=12,2, p<0,001

9,5 ± 0,96* F1,47=5,6, p<0,022

4,90±0,52

2,62±0,35

2-й тест,

контроль

10

8,7±1,4* F1,18=7,5, p<0,013

1,4±0,37* F1,18=4,7, p<0,044

0,90±0,34* F1,18=7,2, p=0,015

3,00±0,51* F1,18=18,2, p<0,0001

2-й тест. БЦЖ

(50 мкг/кг)

10

16,6±5,7

1,1±0,35

1,00±0,23* F1,18= 6,8, p<0,019

3,89±0,86* F1,18=15, p<0,001

2-й тест. БЦЖ

(600 мкг/кг)

10

28,8±9,1#

F1,18=4,7, p<0,043

2,60±1,1

1,9±0,7

2,80±0,81* F1,18=6,8 p<0,018

Примечание:  * достоверные отличия по сравнению с крысами Вистар; # - достоверные отличия между контрольными и иммунизированными  БЦЖ крысами OXYS.

Введение вакцины БЦЖ вызывает, как известно, развитие выраженной реакции гиперчувствительности замедленного типа, характеризующейся селективной активацией макрофагов и CD4+  лимфоцитов, принадлежащих, в основном, к Т-хелперам Ι типа (Hsieh C.S. et al, 1993). Ключевыми элементами вызываемого БЦЖ иммунного ответа являются продуцируемые этими клетками ИНФ-γ, ФНОα и ИЛ-12 (Беклемишев Н.Д. Суходoева Г.С. , 1979;  Flynn J.L. et al., 1993; Flesch I.E. et al., 1993 и др.).  По всей видимости,  именно эти цитокины и являются, в основном, ответственными за выявленные  изменения ОИП экспериментальных животных.

Таким образом, представленные результаты свидетельствуют  о  том, что стимуляция гуморального и клеточного звеньев иммунной системы сопровождается изменениями ОИП, характер которых  определяется исходным поведенческим статусом животных.

Влияние трансплантации иммунокомпетентных клеток на параметры  ориентировочно-исследовательского поведения у сингенных животных с активным и пассивным типами поведения.

Как показали представленные выше результаты  функциональная активность иммунной системы и, в частности, ее  клеточных элементов, связана с уровнем ОИП, в связи с чем, представляло интерес исследовать  возможность  изменения параметров поведения трансплантацией ИКК с определенными функциональными характеристиками. В экспериментах использовались две группы мышей (CBA x C57Bl/6 )F1 с активным и пассивным типами ОИП.  Внутривенное введение  спленоцитов, выделенных у мышей-доноров с пассивным типом ОИП сингенным животным  с активным типом ОИП сопровождалось  достоверным снижением  уровня ОИП у мышей - реципиентов.  Напротив, трансплантация спленоцитов от доноров, характеризующихся  активным типом ОИП  сингенным реципиентам с пассивным типом ОИП приводила к  достоверному повышению у реципиентов  уровня данной поведенческой реакции. При перекрестной трансплантации спленоцитов у мышей - реципиентов наблюдались разнонаправленные изменения как моторного так и исследовательского компонентов ОИП, сохраняющиеся в течение двух недель после  введения ИКК (табл.5).

Таблица  5.

Параметры ориентировочно исследовательского поведения мышей реципиентов в тесте "открытое поле" после  трансплантации спленоцитов  (M ± m).

Суммарная двигательная активность животных

Вариант трансплантации

1  (n =50)

2  (n =30)

Контрольная группа животных

Опытная группа животных

Контрольная группа животных

Опытная группа животных

горизонтальная

5- сутки

14 - сутки

10,З±5,5

11,8±6,4

9,7±5,1

115,6±12,6**

99,1±4,6**

10З,З±8,1**

160,З±З,2

158,З±17,5

210,8±29,З

181,З±20,5

118,З±15,0**

79,4±1З,З*

78,З±14,4*

47,4±1,2**

вертикальная

5- сутки

14 - сутки

0,0±0,0

0,6±0,4

0,0±0,0

10,6±1,8**

10,7±1, 7**

8,4±1,2**

12,8±1,1

17,5±2,7

20,0±0,8

16,8±5,1

2,6±0,7**

2,6±0,7**

1,8±1,2**

1,2±0,7**

Примечание:  вариант трансплантации 1 – доноры с активным типом ОИП,  реципиенты с пассивным типом ОИП; вариант трансплантации 2 – доноры с пассивным типом ОИП, реципиенты с активным типом ОИП. Контрольная группа животных - доноры и реципиенты с одинаковым  уровнем ОИП. В числителе и знаменателе приведены результаты двух повторяющихся экспериментов, выполненных на раз­ных животных и в разное время;  * - p < 0,05, ** - p < 0,01 между соответствующими показателями в контрольной и опытной группах животных.

В то же время  трансплантация клеток селезенки не сопровождалась изменением поведения в случае, если донор и реципиент относились к одинаковому типу ОИП (контрольные группы животных).

Таким образом, установлено, что при перекрестной трансплантации иммунокомпетентных клеток с определенными функциональными характеристиками между сингенными животными с активным и пассивным типами ОИП наблюдается направленное изменение параметров ОИП реципиентов.

Влияние трансплантации моноцитарно-макрофагальных клеток селезенки  на функциональную активность нервной и иммунной систем у экспериментальных животных.

Трансплантация прилипающей к пластику  фракции спленоцитов, состоящей преимущественно из клеток системы мононуклеарных фагоцитов (86 - 92 % от общего числа прилипших к пластику клеток), от мышей - доноров (CBA x C57Bl/6)F1 с высоким уровнем ОИП сингенным реципиентам с низким уровнем ОИП сопровождалась стимуляцией у последних моторного и исследовательского компонентов ОИП, выражающейся  в достоверном повышении параметров горизонтальной и вертикальной двигательной активности  в тесте "открытое поле".  В случае если донорами служили мыши с низким уровнем ОИП, а реципиентами – таковые с высоким уровнем ОИП, наблюдалась обратная реакция; а именно – снижение  показателей  ОИП реципиентов (табл. 6).

При трансплантации клеток системы мононуклеарных фагоцитов наблюдались также разнонаправленные изменения степени эмоционального напряжения мышей-реципиентов, регистрируемой по числу фекальных болюсов: снижение у реципиентов с пассивным типом  ОИП (4.7±1,4 и 2,5±1,6  в контрольной и опытной группах животных соответственно; p < 0,05) и повышение у реципиентов с активным типом ОИП (0,5±0,8 и 3,6±1,4; p < 0,05).  В контрольных группах животных, где доноры и реципиенты характеризовались одинаковым типом ОИП,  равно как и аналогичной функциональной активностью ИКК, параметры ОИП при трансплантации указанных клеток достоверно не изменялись. Тот факт, что подобные  изменения параметров ОИП были получены при трансплантации неразделенной суспензии спленоцитов, свидетельствует о том, что клетки системы мононуклеарных фагоцитов играют в механизмах направленного изменения уровня ОИП существенную роль.

Таблица 6. 

Параметры ОИП мышей реципиентов после трансплантации спленоцитов моноцитарно-макрофагального ряда (M ± SD).

Группы

реципиентов

Горизонтальная двигательная  активность

Вертикальная двигательная активность

перифе-рическая

централь- ная

суммарная

свободная

с опорой на стенку

суммарная

контроль 1

(n = 80)

12,7±5,8

0,0±0,0

12,7±5,8

0,0±0,0

0,27±0,7

0,27±0,7

опыт 1

(n = 80)

67,7±27,9**

3,2±2,8**

70,9±29,9**

0,9±0,8**

4,1±4,0**

4,96±5,0**

контроль 2

(n = 90)

188,1±33,7

24,3±6,4

212,4±35,3

4,4±1,4

11,4±6,6

15,9±9,2

опыт 2

(n = 90)

93,9±26,5**

6,6±5,7**

100,6±29,9**

2,4±1,0*

6,1±1,8*

8,4±1,8*

Примечание: контроль 1 – доноры и реципиенты с низким уровнем ОИП; опыт 1 – доноры с высоким  уровнем ОИП, реципиенты с низким уровнем ОИП; контроль 2 – доноры и реципиенты с высоким уровнем ОИП; опыт 2 – доноры с низким уровнем ОИП, реципиенты с высоким уровнем ОИП. Приведены результаты трех повторяющихся серий экспериментов.

* - p < 0,05; ** - p < 0,01 между контрольными и опытными группами животных.

Указанные изменения параметров поведения животных сопровождались  разнонаправленными изменениями уровней мРНК цитокинов в клетках головного мозга мышей-реципиентов: повышение уровня ОИП происходит на фоне снижения уровня мРНК ИЛ-1 и  повышения уровня мРНК ИЛ-1-Р и ЭП-Р; снижение уровня ОИП при обратном варианте трансплантации сопровождается противоположными изменениями экспрессии указанных генов цитокинов (рис. 6), что свидетельствует о влиянии клеток системы мононуклеарных фагоцитов на  показатели моторного и исследовательского компонентов ОИП и экспрессию генов цитокинов в клетках головного мозга.

 

Рис. 6. Уровень  мРНК  ИЛ-1 (1), рецептора ИЛ-1 первого типа (2)  и рецептора эритропоэтина (3) в клетках головного мозга мышей-реципиентов с различным исходным  уровнем ОИП после трансплантации спленоцитов моноцитарно-макрофагального ряда.

Примечание: А - доноры с активным типом ОИП,  реципиенты с пассивным типом ОИП; Б - доноры с пассивным типом ОИП, реципиенты с активным типом ОИП.

По оси ординат – относительные единицы оптической плотности.

Светлые столбики  -  контрольная группа животных (доноры и реципиенты с одинаковым уровнем ОИП, соответствующим уровню ОИП реципиента);  темные столбики  –  опытная  группа животных  (доноры и реципиенты с оппозитным типом ОИП). n=15-18  в каждой группе; * - p< 0,05;

** - p< 0,01 между контрольными и опытными  группами животных.

При оценке функциональной активности иммунной системы  мышей-реципиентов после трансплантации клеток моноцитарно-макрофагальной фракции спленоцитов  выявлены изменения со стороны активности ее клеточного  звена. Так,  наблюдается усиление реакции ГЗТ в случае, если донорами служили животные с высоким уровнем ОИП, и снижение высоты реакции  при трансплантации клеток от доноров с низким уровнем ОИП (табл. 7).

Таблица 7.

Показатели гуморального и клеточного звена иммунного ответа у мышей-реципиентов с различным уровнем ОИП после трансплантации спленоцитов моноцитарно-макрофагального ряда (M ± SD; n = 30-34).

Исследуемый показатель

Вариант трансплантации

1

2

Контрольная группа животных

Опытная группа животных

Контрольная группа животных

Опытная группа животных

Относительное число АОК (АОК/106 )

85,3 ± 131,4

425,5 ± 209,7

410,6 ± 186,5

463,3 ± 193,2

Число клеток селезенки х106 

250,0  ± 94,0

265,0  ± 63,0

167,9  ± 23,0

179,2  ± 21,8

Абсолютное число АОК

87190,7±8117,0

121981,0±37438

68062,5±29220,7

87147,3±41051,1

Реакция ГЗТ (ИР - %)

14,3 ± 8,4

45,9 ± 17,6*

77,2  ± 16,1

34,8  ± 12,9* 

Примечание: вариант трансплантации 1 – доноры с высоким уровнем ОИП,  реципиенты с низким уровнем ОИП; вариант трансплантации 2 – доноры с низким уровнем ОИП, реципиенты с высоким уровнем ОИП. Контрольная группа животных - доноры и реципиенты с одинаковым  уровнем ОИП; * - p < 0,01 между соответствующими показателями в контрольной и опытной группах животных.

Ранее были установлены различия в  синтезе и продукции цитокинов селезеночными макрофагами мышей (CBA x C57Bl/6)F1 с высоким и низким уровнем  ОИП, позволяющие предположить превалирующее содержание в  моноцитарно-макрофагальной фракции спленоцитов  животных с активным типом поведения клеток с М1 фенотипом, интегрированных в клеточный Th1 ответ. Указанные клетки, посредством продуцируемых  ими провоспалительных цитокинов IL-1, TNF-, IL-12 и IFN- потенцируют развитие Th0 клеток в Тh1 клетки (Е.Н. Вассерман с соавт., 2010), ответственные за индукцию гиперчувствительности замедленного типа, чем можно объяснить продемонстрированное  повышение интенсивности реакции ГЗТ у реципиентов  после трансплантации указанных клеток. Снижение высоты реакции ГЗТ при трансплантации макрофагальных клеток селезенки мышей с пассивным типом ОИП, продуцирующих низкое количество провоспалительных цитокинов, может быть следствием действия других монокинов, в частности ПГЕ2, продуцируемых этими клетками, и обладающих ингибирующим действием на  иммунный ответ. Изменение баланса нейромедиаторных систем головного мозга в сторону усиления активности серотонинергической системы, сопровождающей снижение ОИП, также может посредством активации гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы с последующим выбросом гормонов надпочечников в кровь,  привести к снижению интенсивности иммунного ответа.

При перекрестной трансплантации моноцитарно-макрофагальной фракции спленоцитов выявлены также разнонаправленные изменения в экспрессии генов цитокинов  в клетках селезенки мышей – реципиентов с различным типом ОИП. Так, в случае если донорами были животные с высоким уровнем ОИП,  в спленоцитах реципиентов наблюдается  снижение уровня мРНК ИЛ-1 и повышение уровня мРНК ЭП-Р; при обратном варианте трансплантации, когда донорами служили мыши с низким уровнем ОИП в клетках селезенки реципиентов выявлено повышение уровня мРНК ИЛ-1 и снижение уровня мРНК ЭП-Р (рис.7).

 

Рис. 7. Уровень  мРНК  ИЛ-1 (1), рецептора ИЛ-1 первого типа (2) и рецептора эритропоэтина (3) в клетках селезенки мышей-реципиентов с различным исходным  уровнем ОИП после трансплантации спленоцитов моноцитарно-макрофагального ряда.

Примечание: А - доноры с высоким  уровнем ОИП, реципиенты с низким уровнем ОИП; Б - доноры с низким уровнем ОИП, реципиенты с высоким уровнем ОИП. По оси ординат – единицы оптической плотности.

Светлые столбики  - контрольная группа животных (доноры и реципиенты с одинаковым уровнем ОИП, соответствующим уровню ОИП реципиента);  темные столбики –  опытная  группа животных  (доноры и реципиенты с оппозитным типом ОИП.  n=15-18  в каждой группе;  * - p< 0,05;

** - p< 0,01 между контрольными и опытными  группами животных.

При перекрестной трансплантации макрофагальных клеток селезенки  наблюдаются  также разнонаправленные изменения пролиферативной активности ИКК мышей-реципиентов: увеличивается спонтанная пролиферативная активность тимоцитов и снижается ЛПС-стимулированная активность спленоцитов у реципиентов с исходно низким уровнем ОИП. Аналогичные, но противоположные по направленности изменения пролиферативной активности указанных клеток  выявлены у мышей с исходно высоким уровнем ОИП.

Вышеизложенное указывает на существенную роль,  клеток системы мононуклеарных фагоцитов в механизмах направленного изменения параметров ОИП у животных при трансплантации ИКК.

Влияние трансплантации клеток неприлипающей к пластику фракции спленоцитов на  функциональную активность иммунной и нервной систем у экспериментальных животных.

Трансплантация клеток неприлипающей к пластику фракции спленоцитов, состоящей преимущественно из клеток лимфоидного ряда (88 – 93% от общего числа клеток), от доноров с высоким уровнем ОИП реципиентам с низким уровнем ОИП сопровождалась стимуляцией  только исследовательского компонента данной поведенческой реакции, выражающейся в достоверном повышении параметров вертикальной двигательной активности  мышей-реципиентов  в тесте "открытое поле".  В случае если донорами служили мыши с низким уровнем ОИП, а реципиентами – таковые с высоким уровнем ОИП, наблюдалась обратная реакция; а именно – снижение  вышеуказанных параметров поведения реципиентов и числа посещений центральных квадратов поля (табл. 8).  В контрольных группах животных, где доноры и реципиенты характеризовались одинаковым уровнем ОИП, параметры ОИП после трансплантации указанных клеток селезенки достоверно не изменялись.

Таблица 8. 

Параметры ориентировочно исследовательского поведения мышей реципиентов после трансплантации неприлипающих к пластику спленоцитов (M ± SD).

Группы

реципиентов

Горизонтальная двигательная  активность

Вертикальная двигательная активность

перифери-ческая

централь- ная

суммарная

свобод-ная

с опорой на стенку

суммар-

ная

контроль 1

(n = 72)

18,1±9,1

0,6±0,1

18,7±9,2

0,0±0,0

0,4±0,2

0,4±0,2

опыт 1

(n = 81)

23,5±16,1

2,6±1,6

26,2±17,4

1,2±0,6**

2,1±0,7**

3,2±1,2**

контроль 2

(n = 61)

72,6±29,2

12,6±6,7

80,6±34,4

2,7±2,0

4,3±1,8

6,9±3,8

опыт 2

(n = 90)

80,1±33,3

8,1±7,1*

93,4±37,8

0,6±0,8*

1,9±2,0*

2,5±2,6*

Примечание: контроль 1 – доноры и реципиенты с низким уровнем ОИП; опыт 1 – доноры с высоким  уровнем ОИП, реципиенты с низким уровнем ОИП; контроль 2 – доноры и реципиенты с высоким уровнем ОИП; опыт 2 – доноры с низким уровнем ОИП, реципиенты с высоким уровнем ОИП.  Приведены результаты трех повторяющихся серий экспериментов.* - p < 0,05; ** - p < 0,01 между соответствующими показателями в контрольной и опытной группах животных.

Изменения исследовательского компонента ОИП при трансплантации лимфоидных клеток селезенки  сопровождались  разнонаправленными изменениями уровня мРНК ЭП-Р в клетках головного мозга мышей – реципиентов: возрастание параметров вертикальной двигательной активности происходило на фоне повышения экспрессии указанного гена и  снижения уровня мРНК ИЛ-1Р первого типа; снижение указанных параметров поведения реципиентов  регистрировалось на фоне снижения уровня  мРНК ЭП-Р  (рис. 8).

При оценке иммунного ответа на введение ЭБ  мышей-реципиентов после трансплантации клеток селезенки  лимфоидного ряда  выявлены определенные изменения со стороны активности его гуморального  звена. Так,  наблюдается достоверное увеличение количества антителообразующих клеток (как относительное, так и абсолютное) в случае, если донорами служили животные с высоким уровнем ОИП (табл. 9).

При обратном варианте трансплантации, когда донорами служили мыши с низким уровнем ОИП, достоверных различий  между контрольной и опытной группами животных по указанным показателям не выявлено. При перекрестной трансплантации указанных клеток между мышами с оппозитными типами ОИП наблюдались также разнонаправленные изменения пролиферативной активности ИКК.  У животных - реципиентов с пассивным типом ОИП достоверно повышалась спонтанная пролиферативная активность тимоцитов и митоген – индуцированная активность спленоцитов. У животных - реципиентов с активным типом ОИП трансплантация лимфоидных клеток селезенки сопровождалась повышением спонтанной пролиферации клеток тимуса и снижением Кон А-индуцированной пролиферативной активности спленоцитов.

 

Рис. 8. Уровень  мРНК  ИЛ-1 (1) , рецептора ИЛ-1 первого типа (2) и ЭП-Р (3) в клетках головного мозга мышей-реципиентов с различным исходным  уровнем ОИП после трансплантации неприлипающих к пластику спленоцитов.

Примечание: А - доноры с активным типом ОИП, реципиенты с пассивным типом ОИП.  Б - доноры с пассивным типом ОИП, реципиенты с активным типом ОИП.

По оси ординат – относительные единицы оптической плотности. Светлые столбики -  контрольная группа животных (доноры и реципиенты с одинаковым уровнем ОИП, соответствующим уровню ОИП реципиента). Темные столбики опытная  группа животных  (доноры и реципиенты с оппозитными типами ОИП).  n=15-18  в каждой группе;  * - p< 0,05;  ** - p< 0,01 между контрольными и опытными  группами животных.

Таблица 9.

Показатели гуморального и клеточного звена иммунного ответа у мышей-реципиентов с различным уровнем ориентировочно-исследовательского поведения вследствие трансплантации неприлипающих к пластику спленоцитов (M ± SD; n = 24-30).

Исследуемый показатель

Вариант трансплантации

1

2

Контрольная группа животных

Опытная группа животных

Контрольная группа животных

Опытная группа животных

  АОК/106 

263,7 ± 131,5

604,3 ± 176,3**

420,7 ± 154,8

319,4± 113,7

Число клеток селезенки / 106

196,4  ± 61,6

240,2  ± 71,2*

175,6 ± 62,3

180,1 ± 68,8

Абсолютное число АОК

47655,0±27033,9

125017,9±27763**

78700,6±50336,2

56201,1±25369,1

Реакция ГЗТ  (ИР - %)

20,8 ± 18,0

24,3 ± 14

38,4 ± 22,2

35,4 ± 18,5 

Примечание:  вариант трансплантации 1 – доноры с высоким уровнем ОИП,  реципиенты с низким уровнем ОИП; вариант трансплантации 2 – доноры с низким уровнем ОИП, реципиенты с высоким уровнем ОИП. Контрольная группа животных - доноры и реципиенты с одинаковым  уровнем ОИП, соответствующим уровню ОИП реципиента. * - p < 0,05;  ** - p < 0,01 между соответствующими показателями в контрольной и опытной группах животных.

При трансплантации указанных клеток селезенки  выявлены также изменения в экспрессии генов цитокинов  в спленоцитах мышей – реципиентов. Так, в случае если донорами были животные с активным типом ОИП,  в спленоцитах реципиентов наблюдалось  снижение уровня мРНК ЭП-Р. При обратном варианте трансплантации, в клетках селезенки реципиентов выявлено снижение  экспрессии гена ИЛ-1Р первого типа (рис.9).

Рис. 9. Уровень  мРНК  ИЛ-1 (1), рецептора ИЛ-1 первого типа (2) и рецептора эритропоэтина (3) в клетках селезенки мышей-реципиентов с различным  типом ОИП после трансплантации неприлипающих к пластику спленоцитов.

Примечание: А - доноры с активным типом ОИП,  реципиенты с пассивным типом ОИП; Б - доноры с пассивным типом ОИП, реципиенты с активным типом ОИП.

По оси ординат – относительные  единицы оптической плотности. Светлые столбики -  контрольная группа животных (доноры и реципиенты с одинаковым типом ОИП, соответствующим типу ОИП реципиента); темные столбики опытная  группа животных  (доноры и реципиенты с оппозитными типами ОИП). n=15-18  в каждой группе; * - p< 0,05;  ** - p< 0,01 между контрольными и опытными  группами животных.

Как указывалось  выше, лимфоидные клетки селезенки мышей с активным типом ОИП отличались от таковых у животных с оппозитным типом поведения высокой продукцией ИЛ-6, фактора дифференцировки В-клеток, способствующего созреванию В-лимфоцитов в антителопродуцирующие клетки. Трансплантация  клеток, с высокой продукцией  ИЛ-6 может объяснить описанные выше изменения в интенсивности гуморального иммунного ответа у реципиентов. Последнее может быть вызвано также снижением после трансплантации экспрессии гена ЭП-Р в селезенке реципиентов, и, следовательно, некоторым ослаблением  супрессирующего влияния эритропоэтина на гуморальный иммунный ответ. Изменение экспрессии гена ЭП-Р в селезенке и в головном мозге животных - реципиентов, может также являться одной из причин выявленных изменений показателей  их вертикальной двигательной активности; поскольку введение экзогенного эритропоэтина, как установлено, оказывает  стимулирующее влияние на исследовательский компонент поведения. Повышение параметров вертикальной двигательной активности у мышей-реципиентов после трансплантации указанных клеток может быть  связано в том числе и с активацией под действие ИЛ-6 дофаминергической системы головного мозга (Zalcman S, 1994; Dunn A.J., 2006). Косвенным подтверждением  этому служат регистрируемые стимуляция пролиферативной активности клеток тимуса  и селезенки данной группы реципиентов, равно как и стимуляция гуморального иммунного ответа ( Qiy Y.H. et al., 2005; Девойно Л.В., Идова Г.В., Альперина Е.Л., 2009).

Таким образом,  клетки селезенки,  попадая в организм сингенного, но отличающегося по психофизиологическим показателям реципиента, вызывают  у последнего изменения функциональной активности  ЦНС, о чем свидетельствуют изменение ОИП и экспрессии генов цитокинов в клетках  головного мозга, на фоне изменения функциональной активности иммунной системы, проявляющейся в модуляции пролиферативной активности клеток тимуса и селезенки, экспрессии генов цитокинов в клетках селезенки и  интенсивности  иммунного ответа. Можно  полагать, что цитокины,  продуцируемые ИКК,  при трансплантации  последних могут выступать в качестве триггерных факторов,  приводящих к  изменениям функциональных параметров ЦНС у мышей-реципиентов. По всей видимости, в реализации поведенческих эффектов цитокинов на первый план выступает  центральное действие последних (на уровне мозговых структур). Можно сказать, что мозг реагирует на изменение цитокинового профиля на периферии  и  отвечает на этот стимул изменением активности нейромедиаторных систем  и локального синтеза цитокинов (Dantzer R. 2004, 2006, 2007; Dunn AJ., 2006; Herringa R.J. et al., 2006; Jaferi A., Bhatnagar S., 2007; Sanford L.D. et al., 2007  и др.)  отражением чего являются  изменения поведенческих реакций. Учитывая двусторонний характер нейроиммунных взаимодействий, наблюдаемое в собственных исследованиях изменение параметров функциональной активности иммунной системы реципиентов после трансплантации ИКК может быть следствием как непосредственного воздействия трансплантируемых клеток и продуцируемых ими цитокинов, так и опосредованного влияния ЦНС.

  Влияние трансплантации иммунокомпетентных клеток на характерные проявления функциональной активности нервной и иммунной систем у животных в состоянии хронической зависимости от морфина.

Морфин, как известно, взаимодействует с опиатными рецепторами головного мозга и обладает выраженным  влиянием на поведенческие реакции. Вместе с тем, известны и его супрессивные эффекты (как прямые, так и  опосредованные через центральные механизмы) на иммунитет (Peterson P.K., et al., 1998; Ветлугина Т.П., 2001; Saurer T.B., et al., 2003). Выявленные взаимосвязи между показателями функциональной активности иммунной и центральной нервной систем у животных с различным типом ОИП, равно как и закономерности влияния ИКК на параметры поведения у экспериментальных животных послужили  обоснованием  для предпринятых попыток коррекции поведенческих и иммунологических расстройств, возникающих при синдроме хронической зависимости от морфина методом трансплантации клеток иммунной системы с определенными функциональными характеристиками от здоровых сингенных доноров.

Выраженность эффектов морфина на поведенческие реакции у животных, как известно,  в значительной мере обусловлена их генетическими особенностями (Frischknecht H.R. et al., 1988; Mayo-Michelson L., Young G.A., 1992; Cabib S., 1993; Berrettini W.H., et al., 1994; Stohr T., et al, 1998 и др.).  В настоящем исследовании установлено, что изменения поведения при хроническом воздействии морфина у генетически однородных животных также могут быть неоднозначны; причем характер этих изменений определяется индивидуально-типологическими особенностями ОИП.

Хроническая морфиновая зависимость была сформирована у двух групп мышей (CBA x C57Bl/6)F1 c активным и пассивным типами  ОИП. Установлено, что потребление морфина (мг) указанными группами животных, как среднесуточное (1,01 ± 0,2 и 1,2 ± 0,3  соответственно; p > 0,05), так и общее за курс (22,85 ± 5,3 и 26,16 ± 6,7 соответственно; p > 0,05) было примерно одинаковым. Тем не менее, наблюдались существенные различия в изменений параметров поведения: у животных с пассивным типом ОИП регистрировалась стимуляция  моторного и исследовательского компонентов ОИП; у мышей с активным типом ОИП достоверных изменений  указанных показателей не выявлено (табл. 10). 

Модуляция  локомоторной активности при синдроме хронической зависимости от морфина связана также с изменением активности дофамин – и серотонинергических систем мозга (Tseng L.F. et al., 1976; Murphy N.P., et al., 2001; Saurer T.B., et al., 2003). Различный уровень их активности у животных с высоким и низким уровнем ОИП (Stohr T., et al, 1998; Доведова Е.Л., Монаков М.Ю., 2000 и др.), может служить причиной выявленного неоднозначного  действия морфина на животных с различным типом поведения. Вместе с тем,  установленный в собственных исследованиях различный уровень содержания в клетках головного мозга этих животных  цитокинов, в частности ИЛ-1, может влиять как на активность нейромедиаторных систем головного мозга (Kaur D. et al., 1998;  Mohankumar S.M.J., 1998; Dunn AJ., 1988, 2006 и др.), так и, вероятно, на поведенческие  эффекты указанного наркотического вещества; поскольку его хроническое воздействие сопровождается достоверным снижением уровня мРНК ИЛ-1 в  клетках головного мозга мышей с пассивным типом  ОИП (рис.10). По всей видимости, общий нейромедиаторный и цитокиновый фон организма,  на который попадает воздействие морфина и определяет выраженность его поведенческих эффектов.

У мышей, независимо от типа ОИП,  в состоянии хронической морфиновой зависимости наблюдалось значительное (более чем на 40%) подавление гуморального иммунного ответа, выражающееся в уменьшении количества антителообразующих клеток селезенки (табл. 11) на фоне снижения в клетках селезенки экспрессии гена ИЛ-1 (рис. 10 ).

Таблица 10.

Параметры ориентировочно исследовательского поведения мышей (CBA x C57Bl/6)F1 с различным исходным поведенческим статусом при синдроме хронической зависимости от морфина и после трансплантации  иммунокомпетентных клеток (M ± SD; n = 12 - 19).

Группы

животных

Суммарная горизонтальная двигательная активность

Суммарная вертикальная двигательная активность

Дефекация

мыши с активным типом  ОИП

мыши с пассивным типом  ОИП

мыши с активным типом  ОИП

мыши с пассивным типом  ОИП

мыши с активным типом  ОИП

мыши с пассивным типом  ОИП

Контроль

270,9  ± 41,1

24,3 ±  7,2

21,1 ±  3,2

2,7  ± 2,1

1,1 ±  1,1

4,8 ±  0,9

Хроническая зависимость от морфина

245,6 ± 28,1

138,3 ±  37,4*

23,3  ± 4,6

8,8 ±  3,8*

1,3  ± 1,9

2,2  ± 1,9*

Трансплантация  1

259,8 ±  47,3

41,2 ±  9,1

24,3 ±  1,2

2,9  ± 1,2

1,2  ± 0,3

4,3 ±  1,3

Трансплантация  2

247,2 ±  31,3

31,2 ±  8,5

24,3 ±  1,2

1,9  ± 1,2

0,9  ± 0,5

5,3 ±  1,7

Примечание: трансплантация 1 – трансплантация неразделенной суспензии спленоцитов; 2 – трансплантация клеток моноцитарно-макрофагальной фракции спленоцитов; * - p < 0,05 по сравнению с контрольной группой животных.

Таблица 11.

Гуморальный иммунный ответ у мышей (CBA x C57Bl/6)F1 с синдромом хронической зависимости от морфина и вследствие трансплантации моноцитарно-макрофагальной фракции  спленоцитов (M ± SD; n = 12 - 15).

Группы животных

Число АОК/106 ядросодержащих клеток селезенки

Число клеток селезенки/106

Число АОК на селезенку

Контроль

1121,2 ± 172,8

135,7 ± 34,7

148533,5 ± 21109,0

Хроническая зависимость от морфина

675,8 ± 131,7*

163,5 ± 31,5

108724 ± 21312*

Трансплантация

1159,6 ± 238,2

123,0 ± 17,4

142165,8 ± 34073

Примечание: * -  p < 0,01 по сравнению с контрольной  группой животных.

Трансплантация спленоцитов от здоровых доноров  сингенным реципиентам с синдромом хронической зависимости  от морфина приводила к коррекции у последних как поведенческих, так и иммунологических сдвигов,  при условии, что доноры и реципиенты  характеризовались одинаковым  исходным типом ОИП. Аналогичные результаты были получены при трансплантации суспензии спленоцитов, состоящей преимущественно из клеток системы мононуклеарных фагоцитов, что, с одной стороны,  подтверждает сделанный ранее вывод о существенной роли этих клеток в механизмах реализации поведения; а с другой, указывает на определенную роль макрофагов в патогенезе  наркотической зависимости.  Так, после трансплантации указанных клеток у реципиентов с пассивным типом ОИП параметры поведения и уровень мРНК ИЛ-1 в клетках головного мозга достоверно не отличаются от таковых в контрольной группе животных (табл.11; рис.10).  Наблюдается также восстановление уровня гуморального иммунного ответа у всех животных, регистрируемое по количеству АОК селезенки (табл. 11) и экспрессии гена ИЛ-1 в спленоцитах (рис.10).  В группе животных с синдромом хронической зависимости от морфина, которым трансплантация  иммунокомпетентных клеток не была  проведена, указанные выше поведенческие и иммунологические расстройства сохранялись.

Рис. 10. Уровень мРНК  ИЛ-1 в клетках головного мозга (А) и селезенки (Б) мышей (CBA x C57Bl/6)F1 с синдромом хронической  зависимости от морфина и после трансплантации клеток моноцитарно-макрофагальной фракции  спленоцитов от здоровых доноров.

Примечания: По оси ординат – единицы оптической плотности; по оси абсцисс –  животные с активным типом ОИП (1),  животные с пассивным типом ОИП (2).  Светлые столбики -  контрольная группа животных; заштрихованные столбики – животные с синдромом  хронической зависимости от морфина;  темные столбики   животные после трансплантации иммунокомпетентных клеток. 

*- p< 0,05  по сравнению с контрольной группой животных.

  Представленные экспериментальные данные позволяют сделать заключение о том, что характер изменений параметров ОИП при синдроме хронической зависимости от морфина у животных  определяется  их исходным типом поведения.  Наблюдаемые  при этом поведенческие сдвиги,  равно как и супрессия гуморального иммунного ответа, снижение пролиферативной активности спленоцитов и экспрессии ими и клетками головного мозга гена ИЛ-1,  могут  быть скорректированы  трансплантацией иммунокомпетентных клеток от здоровых доноров с соответствующим уровнем ОИП. Полученные результаты  позволяют рассматривать трансплантацию иммунокомпетентных клеток в качестве возможного перспективного биологического метода терапии наркотической зависимости.

Таким образом, полученные  результаты позволяют заключить, что нейроиммунные взаимодействия лежат в основе формирования индивидуально-типологических особенностей поведения экспериментальных животных. Выявленные взаимосвязи между показателями функциональной активности иммунной и центральной нервной систем у животных с различным типом ОИП, равно как и закономерности изменения поведения при активации иммунной системы и при трансплантации ИКК с определенными функциональными характеристиками позволяют расширить имеющиеся представления об интегративном взаимодействии двух важнейших регуляторных систем организма, выполняющих в организме базисные функции по адаптации к изменяющимся условиям внешней и внутренней среды и открывают новые перспективы в профилактике и коррекции психосоматических расстройств, расширяя  возможности как иммунокоррекции,  в том числе посредством коррекции поведенческих функций; так и регуляции поведения путем воздействия на параметры  иммунитета.

ВЫВОДЫ.

  1. Мыши (CBA x C57Bl/6)F1 с активным и пассивным типом ОИП отличаются структурно-функциональными параметрами центральной нервной системы, о чем свидетельствуют  относительно низкое количеством нейронов в сенсомоторной коре головного мозга, низкая экспрессией гена ЭПО-Р и более высокая экспрессией генов ИЛ-1 и ИЛ-1-Р первого типа в клетках головного мозга,  превалирующее содержание в их лизатах цитокинов ИЛ-1,  ИЛ-6, ФНО, ИНФ, регистрируемое у животных с пассивным типом  ОИП по сравнению с мышами с активным типом ОИП.
  2. Мыши (CBA x C57Bl/6)F1 с активным и пассивным типами ОИП характеризуются различной функциональной активностью ИКК, о чем свидетельствуют: более высокая спонтанная и митогениндуцированная пролиферативная активность клеток тимуса и селезенки  у животных с активным типом ОИП  по сравнению с таковыми у мышей с пассивным типом ОИП;  а также  различия в синтезе и продукции ряда цитокинов, оцениваемые  по экспрессии генов, содержанию цитокинов в лизатах и культуральных супернатантах ИКК. У мышей с активным типом ОИП относительно животных с оппозитным типом поведения регистрируется низкий уровень мРНК ЭПО-Р при более высоком уровне мРНК ИЛ-1-Р первого типа в спленоцитах и мРНК ИЛ-1 в их моноцитарно-макрофагальной фракции.  В лизатах спленоцитов  мышей с активным типом ОИП установлено более высокое содержание  цитокинов ИЛ-6,  ФНО и ИНФ,  равно как и  ИЛ-1,  ИЛ-6,  ФНО в культуральном супернатанте их моноцитарно-макрофагальной фракции.
  3. Выявлена тесная взаимосвязь между активностью клеточного звена иммунной системы и уровнем ОИП, демонстрируемая соответствием интенсивности реакции ГЗТ и уровня ОИП, наблюдаемым  у мышей линий Balb/c, C57Bl/6, (CBA x C57BL/6)F1 и у крыс Wistar и OXIS, а также  дозозависимым  повышением уровня ОИП у животных с пассивным типом поведения при стимуляции клеточного звена иммунной системы.
  4. Трансплантация клеток неразделенных клеток селезенки мышей (CBA x C57Bl/6)F1 от доноров, характеризующихся пассивным типом ОИП, сингенным реципиентам с активным типом ОИП приводит к  снижению уровня ОИП реципиентов; трансплантация спленоцитов от доноров, характеризующихся  активным типом ОИП  сингенным реципиентам с пассивным типом ОИП приводит к  повышению у реципиентов  уровня данной поведенческой реакции, что свидетельствует о влиянии периферических ИКК на параметры ОИП.
  5. Трансплантация моноцитарно-макрофагальных клеток селезенки от мышей (CBA x C57Bl/6)F1 с активным типом ОИП сингенным реципиентам с пассивным типом ОИП приводит у реципиентов  к повышению параметров вертикальной и горизонтальной двигательной активности на фоне снижения уровня мРНК ИЛ-1 и  повышения уровня мРНК ИЛ-1-Р и ЭПО-Р в клетках головного мозга. Трансплантация  клеток от доноров с пассивным типом ОИП реципиентам с активным типом ОИП сопровождпется противоположными изменениями параметров ОИП и экспрессии указанных генов цитокинов в клетках головного мозга, что свидетельствует о влиянии клеток системы мононуклеарных фагоцитов на  показатели моторного и исследовательского компонентов ОИП и экспрессию генов цитокинов в клетках головного мозга.
  6. Трансплантации моноцитарно-макрофагальных клеток селезенки между сингенными животными с оппозитным уровнем ОИП приводит к разнонаправленным изменениям функциональных показателей иммунной системы реципиентов, о чем свидетельствуют повышение спонтанной пролиферативной активности тимоцитов, снижение ЛПС-стимулированной пролиферативной активности спленоцитов, повышение уровня мРНК ЭПО-Р, снижение уровня мРНК ИЛ-1 в клетках селезенки и усиление реакции ГЗТ в случае, если донорами служили мыши с активным типом ОИП. При обратном варианте трансплантации, когда донорами выступали животные с пассивным типом ОИП, а реципиентами - мыши с активным типом ОИП, у последних регистрировались противоположные по направленности изменения указанных параметров.
  7. Трансплантация неприлипающих к пластику спленоцитов с превалирующим содержанием клеток лимфоидного ряда от мышей (CBA x C57Bl/6)F1 с активным типом ОИП сингенным реципиентам с пассивным типом ОИП приводит у реципиентов к усилению вертикальной двигательной активности на фоне  повышения уровня мРНК ЭПО-Р и  снижения уровня мРНК ИЛ-1-Р в клетках головного мозга; трансплантация  указанных клеток от доноров с пассивным типом ОИП реципиентам с активным типом ОИП сопровождается  снижением параметров вертикальной двигательной активности на фоне  снижения уровня мРНК ЭПО-Р в клетках головного мозга, что свидетельствует о влиянии указанных клеток на  параметры  исследовательского компонентов ОИП и экспрессию гена ЭПО-Р в клетках головного мозга.
  8. Перекрестная трансплантации фракции спленоцитов, состоящей преимущественно из лимфоидных клеток,  между сингенными животными с оппозитным типом ОИП сопровождается изменением функциональных показателей иммунной системы реципиентов, о чем свидетельствует стимуляция пролиферативной активности клеток тимуса и селезенки, снижение экспрессии гена ЭПО-Р в спленоцитах и стимуляция гуморального иммунного ответа, оцениваемого по числу АОК в селезенке в случае, если донорами выступали животные с активным типом ОИП. При обратном варианте трансплантации  у реципиентов регистрируется повышение спонтанной пролиферативной активности клеток тимуса, снижение митогениндуцированной пролиферативной активности клеток селезенки, равно как и экспрессии в них гена ИЛ-1-Р.
  9. Трансплантация моноцитарно-макрофагальных клеток селезенки от здоровых сингенных доноров, соответствующих животным в состоянии хронической зависимости от морфина по их исходному поведенческому статусу, приводит у реципиентов к коррекции параметров ОИП до значений, аналогичных здоровым животным, на фоне стимуляции гуморального иммунного ответа, о чем свидетельствует повышение числа АОК селезенки, и  восстановления сниженной под действием морфина экспрессии гена ИЛ в селезенке и в головном мозге, что подтверждается повышением уровней соответствующих мРНК.
  10. Индивидуально-типологические особенности поведения связаны с функциональными характеристиками иммунной системы, клетки которой  при трансплантации способны изменять  уровень ОИП.

Список научных работ, опубликованных  по теме диссертации.

  1. Маркова Е.В., Абрамов В.В., Козлов В.А. Взаимозависимость  иммунологических и поведенческих параметров у мышей. //Russian J. of Immunology.- 1999.- N.4.- Suppl.1.-  P.319.
  2. Markova E.V., Gromykhina N.Yu.,  Abramov V.V Kozlov V.A. Dependence of behavior reaction on the initial immune state in mice. Annual of the International Congress ISNIM – 99.  Switzerland, Lugano, 1999.-  P. 58.
  3. Markova E.V., Gromykhina N.Yu.,  Abramov V.V Kozlov V.A. The peculiarities of the immune status in mice with different level of behavioral reaction. //Russian J. of Immunology.- 2000.- V.5.- N.1.- P.89-95.
  4. Маркова Е.В., Громыхина Н.Ю.,  Абрамов В.В., Козлов В.А. Иммунологические параметры у мышей с различным поведением в тесте «открытого поля».// Иммунология.-  2000.- №.3.- С.15-18.
  5. Маркова Е.В., Короткова Н.А., Абрамов В.В., Козлов В.А. Показатели гуморального и клеточного звеньев иммунного ответа у мышей с различным исходным уровнем поведенческих реакций. Иммунная система: функционирование в норме, при экстремальных экологических воздействиях, при патологии. Тез. докладов научной  конференции. Новосибирск,  2000.-  С.74-75.
  6. Абрамов В.В., Повещенко А.Ф., Маркова Е.В., Гонтова И.А., Якушенко Е.В., Козлов В.А. ИМЭН – система: факты и предположения. //Аллергология и иммунология.-  2000.- Т.1.- №.2.- С.165.
  7. Повещенко А.Ф., Маркова Е.В., Короткова Н.А.,Якушенко Е.В.,Абрамов В.В., Козлов В.А. Экспрессия генов цитокинов в полушариях головного мозга и поведенческие реакции у мышей (CBAxC57BL)F1. //Сибирский вестник психиатрии  и наркологии.- 2001. -  №3. – С. 38-39.
  8. Abramov V.V., Markova E.V., Gontova I.A., Yakushenko E.V., Korotkova N.A., Abramova T.Ya., Kozlov V.A. The interdependence of behavior and immunity: possible mechanisms and significance. //Russian J. of Immunology.- 2001. – V.6. – N.2. -  Р. 215-220.
  9. Yakushenko E.V., Poveschenko A.F., Markova E.V., Korotkova N.A., Abramov V.V. The expression of mRNA of cytokines in hemispheres and behavior reactions of (CBA x C57Bl/6)F1 mice. //Scand. J. of Immunol., 11th International Congress of immunology.- 2001.-V.54, Suppl. 1.- A3, 5.15, 1322.- P.115.
  10. Маркова Е.В., Абрамов В.В., Короткова Н.А., Гольдина И.А., Козлов В.А. Модуляция исследовательского поведения у мышей при активации клеточного звена иммунного ответа. //Бюллетень экспериментальной биологии и медицины.-  2001.- Т.132.- №10.- С.424-426.
  11. Маркова Е.В., Абрамов В.В., Повещенко А.Ф., Якушенко Е.В., Короткова Н.А., Козлов В.А. Модуляция ориентировочно-исследовательского поведения у мышей в процессе развития гуморального иммунного ответа. //Бюллетень экспериментальной биологии и медицины,.- 2002.- Т.133.- №5.- С.534-536.
  12. Повещенко А.Ф., Маркова Е.В., Короткова Н.А., Якушенко Е.В., Абрамов В.В., Козлов В.А. Экспрессия генов цитокинов в полушариях головного мозга и поведенческие реакции у мышей (СBAxC57Bl)F1. //Бюллетень экспериментальной биологии и медицины.-  2002.-Т.133.-№1.-С.78-80.
  13. Абрамов В.В., Маркова Е.В., Короткова Н.А., Козлов В.А. Модуляция ориентировочно-исследовательского поведения мышей (CBA x C57BL/6)F1 иммунокомпетентными клетками. //Бюллетень экспериментальной биологии и медицины.-2002.- Т.134.- №9.- С.319-321.
  14. Повещенко А.Ф., Маркова Е.В., Якушенко Е.В., Короткова Н.А., Абрамов В.В., Козлов В.А. Влияние введения эритропоэтина на экспрессию генов цитокинов (IL-1, IL-1R, EPO-R) в лимфоидной и нервной тканях и их функциональные параметры у мышей  (CBA x C57BL/6)F1. //Цитокины и воспаление.-  2002.- Т.1.- №.2.- С.17.
  15. Маркова Е.В., Короткова Н.А., Абрамов В.В., Козлов В.А. Регуляция поведенческих реакций у мышей путем трансплантации иммунокомпетентных клеток. Иммунология, иммуногенетика, иммунопатология. Тез. докладов научной  конференции. Новосибирск,  2003.- С.114-115.
  16. Маркова Е.В., Обухова Л.А. Колосова Н.Г. Показатели активности клеточного звена иммунного ответа крыс линий Вистар и OXYS и особенности их поведения в тесте «открытого поля». //Бюллетень экспериментальной биологии и медицины.-  2003.-Т.135.- №10.- С.427-429.
  17. Markova E.V., Abramov V.V.  Neuroimmunoregulation and new perspective in the correction of drug – induced behavior changes. Building International Research: Emerging Trends and Pattern in drug Abuse Around the World. Miami, Florida, 2003.- P.45-47.
  18. Маркова Е.В., Обухова Л.А. Колосова Н.Г. Клеточный иммунный ответ крыс  ВИСТАР и OXYS и особенности их поведения в тесте «открытого поля». //Бюллетень экспериментальной биологии и медицины.-  2003.- Т.136.- №12.- С.667-669.
  19. Маркова Е.В., Короткова Н.А., Абрамов В.В., Козлов В.А. Регуляция поведенческих реакций у мышей путем трансплантации иммунокомпетентных клеток. //Russian Journal of Immunology.-  2004.- V.9, Suppl.1.- P.90.
  20. Markova E.V., Abramov V.V Kozlov V.A. Regulation of the Behavior Reactions by the Immune Cells Transplantation. //Clinical and Investigative Medicine.- 2004.-Vol.27.- № 4.- 729 AM.- W 50..53 (817).
  21. E. Markova, N. Michnevich, I. Goldina, V. Abramov, V Kozlov. Behavior and immune disorders in mice with morphine withdrawal: mechanisms and correction. Abstracts of CPDD 66th Annual Scientific Meeting, Sun Juane, Puerto Rico, 2004.-  Abstract 948.
  22. Основы нейроиммунологии.: учебное пособие / В.В. Абрамов и др. - Новосибирск: Изд. НГПУ,  2004.-264с.
  23. Маркова Е.В., Чернова Т.Г, Филлимонов П.Н., Короткова Н.А., Абрамов В.В. Козлов В.А. Иммуноморфологические особенности животных с разным уровнем ориентировочно-исследовательского поведения. //Бюллетень экспериментальной биологии и медицины.- 2004.- Т.138.- №10.- С.466-469.
  24. Основы нейроиммунологии. / Абрамов В.В. и др. - М.: Академия наук о Земле.  Золотая серия национальных научных достижений.- 2004.- 100 с.
  25. Е.В.Маркова, В.В.Абрамов, М.В.Старостина, Н.Михневич, В.А.Козлов. Иммунологические и поведенческие расстройства при хронической морфиновой зависимости: механизмы и возможные подходы к коррекции. //Цитокины и воспаление.- 2005.- Т. 4.-№.2.- С.76.
  26. Маркова Е.В., Абрамов В.В., Козлов В.А. Экспрессия генов цитокинов в головном мозге животных при трансплантации иммунокомпетентных клеток.// Цитокины и воспаление.- 2005.- Т. 4.-№.2.- С.86.
  27. Маркова Е.В., Абрамов В.В., Козлов В.А. Регуляция ориентировочно-исследовательского поведения животных путем трансплантации иммунокомпетентных клеток. //Нейроиммунология.- 2005.-Т.2.-№.2.-С.165.
  28. Маркова Е.В., Абрамов В.В., Козлов В.А. Трансплантация иммунокомпетентных клеток как возможный перспективный метод терапии наркотической зависимости. //Нейроиммунология.- 2005.-Т.2.-№.2.-С.196.
  29. E. Markova, M. Starostina, Abramov V.V Kozlov V.A. A new approach in the correction of morphine-induced behavior and immune disorders. Drug Discovery Technology/ InfoTech Pharma Conference. London, March 2005, Abstract booklet.- part II.- P. 38.
  30. Маркова Е.В., В.А.Козлов, Н.А.Трофимова, Н.Г.Колосова. Стимуляция клеточного звена иммунного ответа активизирует исследовательское поведение преждевременно стареющих крыс OXYS. //Бюллетень экспериментальной биологии и медицины.- 2005.- Т.140.- № 9.- С.332-334.
  31. Маркова Е.В., Старостина М.В., Абрамов В.В., Козлов В.А. Влияние трансплантации иммунокомпетентных клеток на поведенческие и иммунологические параметры у животных с синдромом хронической морфиновой зависимости. //Наркология.- 2006.- № 5.- С.27-31.
  32. Козлов В.А., Маркова Е.В., Абрамов В.В. Регуляция ориентировочно–исследовательского поведения у животных путем трансплантации иммунокомпетентных клеток // Патофизиология психических расстройств: коллект. монография под научн.  ред. акад. РАМН В.Я Семке и проф. Ф. Ланга.- Томск: Изд. ГУ НИИ ПЗ ТНЦ СО РАМН,  2006.-  С. 233-241.
  33. Маркова Е.В., Абрамов В.В., Старостина М.В., Михневич Н.Д., Козлов В.А. Влияние трансплантации иммунокомпетентных клеток на поведенческие и иммунологические параметры у животных с синдромом хронической зависимости от морфина.  //Сибирский вестник психиатрии и наркологии.- 2006.- Т.3.- С.43-47.
  34. Маркова Е.В., Абрамов В.В., Короткова Н.А., Козлов В.А. Влияние трансплантации иммунокомпетентных клеток на ориентировочно-исследовательское поведение и экспрессию генов цитокинов в головном мозге у животных.  //Бюллетень экспериментальной биологии и медицины.- 2006.- Т.142.- №9.- С.309-312.
  35. Маркова Е.В., Старостина М.В., Абрамов В.В., Козлов В.А. Влияние трансплантации иммунокомпетентных клеток на поведенческие и иммунологические параметры  у животных в норме и при синдроме хронической морфиновой зависимости. //Иммунопатогенез и иммунотерапия основных заболеваний человека: от эксперимента к клинике. Новосибирск,  2006.- С.110-113.
  36. Markova E.V., Abramov V.V Kozlov V.A. Regulation of the behavior reactions by the immune cells transplantation. 3-rd International Conference “Basic Science for Medicine”. Novosibirsk, 2007.- C. 148
  37. E. Markova, M. Starostina, Abramov V.V Kozlov V.A. Immune cell transplantation: new perspectives in the correction of morphine-induced immune and behavior disorders. -3rd International Conference “Basic Science for Medicine”. Novosibirsk, 2007.- C. 147.
  38. Маркова Е.В., Абрамов В.В., Козлов В.А. Влияние трансплантации клеток системы мононуклеарных фагоцитов на поведенческие и иммунологические параметры у животных.// Нейроиммунология.- 2007.-Т.5.-№.2.-С.77.
  39. Маркова Е.В., Абрамов В.В. Козлов В.А. Иммунокомпетентные клетки и регуляция поведения у животных. //Бюллетень Сибирского отделения РАМН.- 2007.- №.2 (124).- С.6-9.
  40. Маркова Е.В., Абрамов В.В. Козлов В.А. Клетки иммунной системы в  регуляции ориентировочно-исследовательского поведения у экспериментальных животных. //Омский научный вестник.- 2007.-№3 (61).- С.36-39.
  41. Маркова Е.В., Абрамов В.В., Старостина М.В., Козлов В.А. Влияние трансплантации клеток иммунной системы на поведенческие и иммунологические параметры у животных в норме и в состоянии хронической зависимости от морфина. Современные проблемы биологической психиатрии и наркологии. Томск, 2008.- С.150-152.
  42. Абрамов В.В., Маркова Е.В., Козлов В.А. Регуляция ориентировочно–исследовательского поведения у животных иммунокомпетентными клетками.  //Патогенез.- 2008.- № 2.- С. 16-20.
  43. Маркова Е.В., Абрамов В.В., Козлов В.А. Регуляция ориентировочно–исследовательского поведения у мышей (CBA x C57Bl/6)F1 иммунокомпетентными клетками. //Российский иммунологический журнал.- 2008.- Т.2(11).- № 2-3.- С.152.
  44. Markova E.V., Kolosova N. G. , Abramov V.V Kozlov V.A.  Activation of exploratory behavior in senescence accelerated OXYS rats by stimulation of cell-mediated immune response with BCG vaccine. EHRLICH II –2nd World Conference on Magic Bullet.0Celebrating the 100th Anniversary of the Nobel Prize Award to Paul Ehrlich. Nrnberg, Germany, October 3-5, 2008. Abstract book, p.200.
  45. Маркова Е.В., Старостина М.В., Абрамов В.В., Козлов В.А. Трансплантация иммунокомпетентных клеток в качестве  возможного метода терапии хронической зависимости от морфина. //Нейроиммунология.-  2009.- Т. VII.-№. 1.- С.65.
  46. Маркова Е.В., Абрамов В.В., Козлов В.А. Влияние трансплантации лимфоидных клеток селезенки на поведенческие и иммунологические параметры у животных. //Нейроиммунология.- 2009.- Т.VII .-№. 1.- С.64.
  47. E. Markova, M. Starostina, V.Abramov, V Kozlov. Immune Cell Transplantation: New Perspectives in the Correction of Morphine - Induced  Immune and Behavior Disorders. 2nd European Congress of Immunology, Berlin, September 13, 2009.- p.552.
  48. E. Markova, V.Abramov, V Kozlov. Regulation of the behavior reactions by the immune cells transplantation. 2nd European Congress of Immunology, Berlin, September 13, 2009.- p.274.
  49. Маркова Е.В., Абрамов В.В., Рябичева Т. Г., Козлов В.А. Влияние трансплантации лимфоидных клеток селезенки на  функциональную активность иммунной и нервной систем у экспериментальных животных.  //Бюллетень экспериментальной биологии и медицины.- 2009.- Т.147.- № 4.- С.435-441.
  50. Маркова Е.В., Старостина М.В., Абрамов В.В., Козлов В.А. Коррекция иммунологических и поведенческих расстройств при синдроме хронической зависимости от морфина путем трансплантации иммунокомпетентных клеток.//Вестник уральской медицинской академической науки.- 2009, №2/1.-С.217-219.
  51. Маркова Е.В., Абрамов В.В. Козлов В.А. Регуляция ориентировочно-исследовательского поведения у животных клетками системы мононуклеарных фагоцитов. //Вестник уральской медицинской академической науки.- 2009, №2/1.-С.271-273.
  52. Маркова Е.В., Старостина М.В., Абрамов В.В., Козлов В.А. Трансплантация иммунокомпетентных клеток в качестве  возможного метода коррекции поведенческих и иммунологических расстройств при синдроме хронической зависимости от морфина.// Клеточные технологии: Теоретические и прикладные аспекты: сб. науч. тр. Под ред. В.А. Козлова, С.В. Сенникова, Е.Р. Черных, А.А. Останина.- Новосибирск: Наука, 2009.- С.114-122.
  53. Абрамов В.В., Маркова Е.В., Козлов В.А. Регуляция ориентировочно-исследовательского поведения мышей (CBA x C57/Bl/6)F1 клетками системы мононуклеарных фагоцитов. //Клеточные технологии: Теоретические и прикладные аспекты: сб. науч. тр. Под ред. В.А. Козлова, С.В. Сенникова, Е.Р. Черных, А.А. Останина.- Новосибирск: Наука, 2009.- С.105-113.
  54. Маркова Е.В., Фомичева М.А., Абрамов В.В., Козлов В.А. Параметры функциональной активности иммунной и нервной систем при трансплантации иммунокомпетентных клеток, обработанных нейролептиком. //Якутский медицинский журнал.-2009, № 3.- С.33-34.
  55. Маркова Е.В., Абрамов В.В. Козлов В.А. Регуляция ориентировочно-исследовательского поведения у животных путем трансплантации иммунокомпетентных клеток. //Успехи современной биологии.- 2009.- Т.129.- №.4- С.348-355.
  56. E. Markova, M. Starostina, V. Abramov, V. Kozlov. Immune Cell Transplantation: New Perspectives in the Correction of Morphine - Induced  Immune and Behavior Disorders. Proceedings of the 2nd European Congress of Immunology. Free Papers. Editors Reinhold E. Schmidt. MEDIMOND S.r.l., Bolonga, Italy, 2009.- Р. 423-429.
  57. E. Markova,.V. Abramov, V. Kozlov. Regulation of the behavior reactions by the immune cells transplantation. Proceedings of the 2nd European Congress of Immunology. Free Papers. Editors Reinhold E. Schmidt. MEDIMOND S.r.l., Bolonga, Italy, 2009.- Р.551-555.
  58. Маркова Е.В., Козлов В.А. Механизмы регуляции ориентировочно–исследовательского поведения у экспериментальных животных трансплантацией иммунокомпетентных клеток. //Патогенез.- 2010.- Т.8.- № 1.- С. 52.
  59. Маркова Е.В., Колосова Н.Г.,  Козлов В.А. Клеточный иммунный ответ и ориентировочно-исследовательское поведение у экспериментальных животных. //Вестник уральской медицинской академической науки.- 2010, №2/1.-С.48-49.
  60. Маркова Е.В., Козлов В.А. Механизмы регуляции ориентировочно-исследовательского поведения  мышей (СBA x C57Bl/6)F1 иммунокомпетентными клетками. //Вестник уральской медицинской академической науки.- 2010, №2/1.-С.49-51.

Соискатель:







© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.