WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

 

ФГУ «НА­УЧ­НО-ИС­СЛЕ­ДО­ВА­ТЕЛЬ­СКИЙ  ИН­СТИ­ТУТ

ТРАНС­ПЛАН­ТО­ЛО­ГИИ  И  ИС­КУС­СТ­ВЕН­НЫХ  ОР­ГА­НОВ» РОСМЕДТЕХНОЛОГИИ

___________________________________________________________

На правах рукописи

Темнов

Андрей Александрович

Клеточная трансплантация при лечении хронической сердечной недостаточности

14.00.41. Транс­план­то­ло­гия и ис­кус­ст­вен­ные ор­га­ны

14.00.16. Патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ

Дис­сер­та­ции

на со­ис­ка­ние уче­ной сте­пе­ни

доктора ме­ди­цин­ских на­ук

На­уч­ные консультанты:

  Академик РАМН и РАН, профессор,

В.И. Шумаков,

               Доктор медицинских наук,

профессор Н.А.Онищенко

 

Моск­ва  2008

Работа выполнена в ФГУ «Научно-исследовательский институт

трансплантологии и искусственных органов Росмедтехнологии»

Научные консультанты:

Академик РАН и РАМН,

доктор медицинских наук, профессор Шумаков Валерий Иванович

доктор медицинских наук, профессор Онищенко Нина Андреевна

Официальные оппоненты:

Член-корр. РАМН,

доктор медицинских наук, профессор  Кирпатовский Игорь Дмитриевич

Академик РАМН,

доктор медицинских наук, профессор Мороз Борис Борисович

Доктор медицинских наук, профессор  Мазаев  Владимир Павлович

Ведущее учреждение:

ФГУ «Научно-исследовательский институт физико-химической медицины» Росздрава.

Защита диссертации состоится «___»_________ 2008 года в 14 часов на заседании диссертационного совета Д-208.055.01 при ФГУ «НИИ трансплантологии и искусственных органов Росмедтехнологии» по адресу: Москва, 123182, ул. Щукинская, д. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ «НИИ

трансплантологии и искусственных органов Росмедтехнологии».

Автореферат разослан «___» ___________ 2008 года.

Ученый секретарь

Диссертационного Совета Д-208.055.01

доктор медицинских наук, профессор       Шевченко Ольга Павловна

Актуальность работы.

Современная статистика заболеваемости населения показывает, что хроническая сердечная недостаточность (ХСН), возникающая чаще всего в результате острого инфаркта миокарда, остается одной из главных проблем здравоохранения всех экономически развитых стран мира, причем в XXI столетии прогнозируется дальнейший рост численности таких больных [Hunt et al. 2005].

       По данным американской ассоциации кардиологов в 2005 г. в  США насчитывалось около 5 млн. человек с ХСН, тогда как по прогнозам к 2050г количество таких больных возрастет до 16 млн. человек [Robbins, 1998]. В России исследование «Эпоха» показало, что клинические признаки ХСН имеют более 8,2 млн. человек [Беленков Ю.Н. и др 2003].

       В настоящее время для профилактики и лечения сердечной недостаточности используются 3 группы методов [Kirklin,  Young , 2002], которые обеспечивают:

1- профилактику тромбозов и торможение развития атеросклероза путем применения диеты, медикаментозной терапии и пропаганды здорового образа жизни;

2- ограничение зоны повреждения и сохранения функциональной активности  работоспособной зоны миокарда путем медикаментозной терапии (антиаггреганты, -блокаторы, ингибиторы ангиотензин превращающего фермента (АПФ)) и оперативного лечения (баллонная коронарная ангиопластика, операция аортокоронарного шунтирования);

3- замену несостоятельности сократительной функции сердца путем трансплантации сердца или имплантации искусственных аналогов левого желудочка.

       Однако перечисленные методы не могут в полной мере снизить рост заболеваемости и обеспечить адекватную социальную адаптацию этих больных.

       В связи с этим в последние годы получило развитие новое направление регенерационной терапии, направленное на стимуляцию регенерации миокарда путем возмещения дефицита функционально-активной ткани и/или стимуляции ее компенсаторной гипертрофии, а также стимуляции ангиогенеза с помощью современных клеточных технологий.

       Трансплантация в миокард мышечных клеток – фетальных кардиомиоцитов [Sakai et al. 1999; Ю.Л. Шевченко 1999], скелетных миобластов [Atkins et al. 1999; Taylor et al. 1998; Reinecke et al. 2000], а также гладкомышечных клеток  [Yoo et al. 2000, Li et al. 1996]  не подтвердила заместительного механизма регенерационного действия этих клеток, но позволила выдвинуть концепцию биорегуляторного воздействия пептидов, продуцируемых трансплантированными клетками. 

       Именно поэтому предметом пристального изучения стали возможности восстановительной регенерации миокарда с помощью доступных и легитимных аутологичных стволовых и прогениторных клеток костного мозга (ККМ).

       В настоящее  время эти клетки, преимущественно клетки гемопоэтической фракции ККМ, используются для лечения острой [Straer et al. 2001-2003; Schachinger et al. 2004; Assmus et al. 2003] и хронической [Perin et al. 2004; Patel et al. 2004; Lian Ru 2006] сердечной недостаточности.

       Улучшение насосной функции сердца после терапии аутологичными мононуклеарными ККМ авторы связывают преимущественно с обновленной  продукцией в организме больных проангиогенных и антиапоптических цитокинов [Kinnaird et al., 2004; Dimmeler et al., 2004; Kocher et al., 2001], с регуляцией воспаления и иммунной модуляцией [Dewald et al., 2005; Thum et al., 2005], с улучшением внутриклеточной регенерации кардиомиоцитов и повышением их устойчивости к апоптозу [Minatoguchi et al., 2004; Trial et al., 2004; Chazaud et al., 2003], а также  с их влиянием на пролиферацию кардиомиобластов [Anversa, 2004]. 

Между тем, наряду с позитивной оценкой применения ККМ у больных с ХСН в последние годы появились исследования, которые отрицают возможность улучшения сократительной функции левого желудочка у таких больных при использовании аутологичных мононуклеарных клеток костного мозга.

Отсутствие позитивного эффекта от применения аутологичных ККМ авторы этих исследований связывают с изменением состава и свойств стволовых и прогениторных ККМ больных под влиянием различных тяжелых сопутствующих заболеваний  [Rota et al., 2006; Award et al., 2006;  Rauscher et al., 2003; Karra et al., 2005; Messina, 2006; Lehrke et al., 2006; Gina et al., 2006; Sata, 2006; Epstein et al., 2004].

Создается впечатление, что в практике лечения ХСН разные исследователи применяют ККМ с разными и даже противоположными свойствами.

Для выяснения причин отсутствия у отдельных категорий больных позитивного эффекта от введения  мононуклеарных (МНК) ККМ, мы предположили, что при  ХСН как хроническом заболевании [Гольдберг Е.Д. и др. 2006] на фоне  системного воспаления [Шевченко О.П. и др. 2005], и сопутствующего вторичного иммунодефицита различной степени выраженности [Ермакова Л.П., 2001], а также  хронической гипоксии у больных  формируется  функциональная недостаточность самих гемопоэтических и иммунорегуляторных клеток КМ, которую необходимо диагностировать и корригировать до использования клеток КМ (мононуклеарной фракции клеток) в качестве терапевтического средства.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

       Разработать методы диагностики и коррекции функциональной активности клеток костного мозга для обеспечения стабильного позитивного эффекта клеточной трансплантации на сократительную функцию сердца и качество жизни у больных с хронической сердечной недостаточностью.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

  1. Изучить возможность применения мононуклеарных клеток (МНК)  аутологичного костного мозга в качестве эффективного вспомогательного метода коррекции  сократительной функции миокарда и повышения качества жизни у больных с хронической сердечной недостаточностью; выявить факторы, препятствующие реализации этих эффектов.
  2. Выявить нарушения функционального состояния МНК костного мозга и их взаимосвязь с дисфункцией клеток иммунной системы периферической крови, развивающейся у больных ХСН.
  3. Разработать метод индивидуальной оценки резервов функциональной устойчивости клеток иммунной системы периферической крови больных ХСН и предложить тест для прогнозирования клинической эффективности трансплантации аутологичных клеток костного мозга.
  4. Разработать и применить метод индивидуального подбора иммунномодуляторов для восстановления функциональной активности иммунной системы больных ХСН (клеток костного мозга и периферической крови), обеспечивающей реализацию позитивного клинического эффекта трансплантации ККМ.
  5. Показать возможность оптимизации клинического эффекта трансплантации аутологичных ККМ у больных ХСН путем 2-х этапного восстановления иммуно-биорегуляторной активности ККМ перед трансплантацией: за счет осуществления медикаментозной коррекции иммунного статуса больных in vivo и последующей активации функционального состояния МНК костного мозга in vitro при их культивировании.
  6. Установить клиническую эффективность трансплантации аутологичных клеток костного мозга у больных с терминальной стадией хронической сердечной недостаточности.
  7. Изучить влияние интраоперационной интрамиокардиальной трансплантации клеток  костного мозга на частоту и тяжесть развития послеоперационных иммунозависимых осложнений. 

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

Научное исследование было проведено в рамках государственного контракта № 02.435.11.3019 от «02»сентября 2005г «Использование стволовых клеток костного мозга для подержания функции сердца и поджелудочной железы» и выполнено по заказу Минздравсоцразвития РФ (регистрационный номер 0120.0 800279).

Впервые показано, что у больных с ХСН, нуждающихся в хирургической коррекции сократительной функции миокарда, состояние иммунной системы характеризуется не только вариабельными формами апоптотического иммунодефицита, но также снижением функциональной активности мононуклеарной фракции клеток костного мозга, что предопределяет отсутствие клинического эффекта от применения клеток костного мозга.

Установлено, что способность мононуклеарных клеток костного мозга к колониеобразованию находится в прямой зависимости от содержания CD25 и в обратной зависимости от содержания СD95 лимфоцитов в периферической крови.

На основании сопоставления интенсивности продукции активных форм кислорода (АФК)  нативными лейкоцитами крови без и при добавлении ингибитора цАМФ фосфодиэстеразы был предложен критерий, так называемый индекс стимуляции (ИС), для прогнозирования адаптационных резервов иммунной системы и оценки пригодности клеток костного мозга для целей клеточной терапии. Установлено, что у здоровых людей численное значение ИС больше 1.0, при выраженной патологии ИС становится меньше 1.0. Было предложено использовать индекс стимуляции для оценки степени тяжести иммунодефицита в организме, а также для подбора иммунокорректоров и контроля эффективности проводимой иммунокорригирующей терапии. Новизна указанных разработок подтверждена положительными решениями о выдаче 5 патентов (положительные решения от 7.05.2007, 29.08.2007, 28.09.2007, 03.08.2007, 03.12.2007).

Установлено, что при значении ИС<0.6 и необходимости выполнения хирургической операции у больных возникает опасность  возникновения тяжелых иммунозависимых осложнений в виде инфекционно-септических и органных дисфункций вплоть до развития полиорганной недостаточности.

Показано, что наиболее выраженная коррекция сократительной функции миокарда и улучшение качества жизни больных при использовании клеточной терапии достигается путем сочетанного предварительного применения индивидуально подобранной иммунокорригирующей терапии in vivo и культивирования выделенных клеток в питательных средах ex vivo перед введением их в миокард. При сочетанном применении этих процедур создаются оптимальные условия для восстановления биорегуляторной функции клеток костного мозга и клеток периферической крови, что создает условия для полной реализации регенерационных эффектов иммунной системы, как важнейшей интегративной системы регуляции гомеостаза.

Культивирование клеток костного мозга без предшествующей иммунокоррекции позволяет повысить их функциональную активность, что сопровождается изменением фенотипического состава клеток и продукцией цитокинов в культуральную среду. Однако регуляторные эффекты таких клеток после трансплантации являются недостаточными особенно у больных с выраженным иммунодефицитом.

Однократный курс иммунокоррекции без последующей трансплантации клеток, также не позволяет добиться выраженной и пролонгированной коррекции функции миокарда у больных ХСН.

Интраоперационное использование аутологичных ККМ как после культивирования, так и после культивирования в сочетании с иммунокоррекцией оказывает выраженное иммуномодулирующее действие, что проявляется снижением иммунозависимых осложнений в послеоперационном периоде, таких как гнойно-септические осложнения и полиорганная недостаточность даже при наличии инфекционно-септического анамнеза. 

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ

       Создана медицинская технология лечения больных ХСН с помощью МНК аутологичного костного мозга. Технология предусматривает контроль степени иммунной дизрегуляции в организме больных, предварительное проведение иммунокоррекции индивидуально подобранными препаратами in vivo и  последующее культивирование клеток костного мозга ex vivo. Такая технология предварительной подготовки ККМ позволяет повысить сократительные свойства миокарда (увеличение ФИ и снижение КДО и КСО), а также улучшить качество жизни больных ХСН (индекс MLHFQ) и повысить их физическую активность (индекс DASI).

       Предложен метод оценки степени иммунной дизрегуляции, основывающийся на определении активности лейкоцитарной суспензии в хемилюминесцентном тесте, отражающем состояние суммарных адаптационных резервов организма  у больных с ИБС и ХСН. Этот показатель назван индексом стимуляции, величина его коррелирует с уровнем иммунодефицита и поэтому может использоваться для быстрой диагностики иммунной дизрегуляции. Этот показатель использован также для индивидуального подбора иммунокорректоров и контроля эффективности терапии иммуномодуляторами.  Установлено, что при ИС<0.6 у больного прогнозируется выраженный иммунодефицит, сопровождающийся опасностью развития инфекционных осложнений и отсутствием эффекта от клеточной терапии. Именно таким больным должна заблаговременно проводится курсовая иммунокорригирующая терапия.

       При проведении у больного полного комплекса подготовки иммунной системы и клеток костного мозга эффективность клеточной терапии достоверно повышается и сохраняется в течение 6 месяцев. Безопасность клеточной терапии позволяет рекомендовать повторные курсы клеточной терапии у больных ХСН для восстановления и поддержания сократительной функции миокарда. 

       Интраоперационное введение клеток костного мозга снижает летальность кардиохирургических больных и частоту развития иммунозависимых послеоперационных осложнений, а также способствует гладкому течению госпитального периода.        

Положения, выдвигаемые на защиту

  1. Трансплантация аутологичных клеток костного мозга достоверно повышает сократительную функцию миокарда и улучшает качество жизни у больных хронической сердечной недостаточностью, только после предварительного осуществления коррекции иммунной дизрегуляции в организме и последующего культивирования in vitro клеток костного мозга.
  2. Использование индекса стимуляции позволяет оценивать адаптационные резервы организма и может быть использован для индивидуального подбора иммунокоррегирующих препаратов.
  3. Интрамиокардиальное введение клеток костного мозга во время операции аортокоронарного шунтирования достоверно снижает частоту развития послеоперационных инфекционных осложнений и летальность больных с хронической сердечной недостаточностью. 

Ре­а­ли­за­ция ре­зуль­та­тов ра­бо­ты

Ос­нов­ные вы­во­ды и ре­ко­мен­да­ции ис­поль­зу­ют­ся в прак­ти­че­с­кой и на­уч­ной ра­бо­те отделения коронарной хирургии и трансплантации сердца ФГУ НИ­ИТ и ИО Росмедтехнологии.

Ап­ро­ба­ция ра­бо­ты

Материалы и основные положения работы доложены и обсуждены: на IX, X, XI, XII  Всероссийских съездах сердечно-сосудистых хирургов (Москва 2003, 2004, 2005, 2006 годы соответственно); на конференции  «Новые оперативные технологии (анатомические, экспериментальные и клинические аспекты)» (Москва 2002); на VIII  Всероссийском форуме с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге», 2004; на V Ежегодной конференции «Сердечная недостаточность» (Москва, декабрь 2004); на III Российском конгрессе по патофизиологии (Москва, ноябрь 2004); на II-ой международной конференции «Патофизиология и современная медицина» (Москва, апрель 2004); на IX и X Всероссийском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва 2002, 2003); Ежегодных Всероссийских и международных научных конференциях «Стволовые клетки и перспектива их использования в здравоохранении» (Москва май 2006, май 2007); на II и III Всероссийском съезде по трансплантологии и искусственным органам (Москва, октябрь 2002, ноябрь 2005);  на четвертой межд. конф. “Лечение кардиомиопатий”, (Москва, 27-28 мая 2005г.); на XIII сессии общего собрания РАМН (Москва, 17-20 Февраля 2004г.); на 1 межд. конф.“Альтернативные методы реваскуляризации миокарда“, (Москва,  5 апреля 2004г.); на  13th World congress of Heart Disease , International academy of cardiology annual scientific sessions 2007, Vancouver, B.C., Canada, July 28-31, 2007. Апробация работы состоялась на  межлабораторной научной конференции ФГУ НИИТ и ИО Росмедтехнологии  5 февраля 2008г.

Пуб­ли­ка­ции

По те­ме дис­сер­та­ции опуб­ли­ко­ва­но 37  работ, из них  22 в центральной периодической печати. 13 ра­бот в ма­те­ри­а­лах все­рос­сий­ских и 1 в материалах зарубежной  кон­фе­рен­ций. Получено положительные решения по 5 патентам.

Объ­ем  и  струк­ту­ра  дис­сер­та­ци­он­ной  ра­бо­ты

  Дис­сер­та­ция содержит 7 глав и со­сто­ит из вве­де­ния, об­зо­ра ли­те­ра­ту­ры (I глава), общей характеристики проведенных лабораторных и клинических исследований (II глава), 4 глав собственных ис­сле­до­ва­ний (главы III, IV, V, VI) с одновременным обсуждением полученных результатов, а также развернутого заключения (глава VII), вы­во­дов и прак­ти­че­с­ких ре­ко­мен­да­ций.

Диссертация имеет библиографический указатель, который содержит 292 источников, включающих в себя 145 оте­че­ст­вен­ный  и  147  зарубежный ис­точ­ни­к. Ра­бо­та из­ло­же­на на  240  стра­ни­цах ма­ши­но­пис­но­го тек­с­та, со­дер­жит  44  таб­ли­цы и 34 рисунка.

Диссертация выполнена в отделении коронарной хирургии и трансплантации сердца (руководитель – профессор, д.м.н. Э.Н. Казаков), а также в лаборатории  биотехнологии стволовых клеток (руководитель – профессор, д.м.н. Н.А. Онищенко); при научном сотрудничестве с отделениями Института: иммунодиагностики и иммунокоррекции (руководитель – профессор, д.м.н. В.С.Сускова); радиоизотопной диагностики - профессор, д.м.н. Е.Н. Остроумов (руководитель - профессор, д.м.н. А.Е. Ермоленко); рентгенфункциональной диагностики – И.Ю. Тюняева и д.м.н. Б.Л. Миронков (руководитель - профессор, д.м.н. Честухин В.В.), а также другими отделениями и лабораториями ФГУ НИИТ и ИО Росмедтехнологии.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ХАРАКТЕРИСТИКА КЛИНИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА И ИСПОЛЬЗОВАННЫХ МЕТОДОВ ИССЛЕДОВАНИЯ У БОЛЬНЫХ С ХРОНИЧЕСКОЙ СЕРДЕЧНОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТЬЮ

Для решения поставленных задач нами с 2002 по 2007 гг. проводились исследования по нескольким направлениям, сгруппированным в таблице 1.

Первоначально у 154 больных с ИБС и ХСН различной степени тяжести нами было проведено развернутое исследование иммунного статуса и сопоставление его показателей с фенотипическими и функциональными характеристиками мононуклеарных клеток аутологичного костного мозга.

На основании клинических и лабораторных исследований лейкоцитарной взвеси, полученной у 250 кардиохирургических больных, была разработана методика и тесты, позволяющие оценивать адаптационные резервы организма и тем самым прогнозировать эффективность применения аутологичных клеток костного мозга для лечения ХСН.

На основании клинических и лабораторных данных, полученных у 107 больных с ИБС и ХСН был разработан и применен метод индивидуального подбора иммунокорректоров, что обеспечивало повышение функциональной иммунорегуляторной активности всех клеток иммунной системы, в том числе и клеток костного мозга (КМ).

Оценка клинической эффективности лечения больных ИБС с ХСН с помощью мононуклеарных клеток (МНК) аутологичного КМ была проведена у 148 больных; у 89 (29+60) из этих больных проводили интрамиокардиальную трансплантацию МНК КМ во время операции аортокоронарного шунтирования (АКШ) без и с проведением иммунокоррекции. Контролем служили 50 больных с АКШ без ККМ. У 15 больных с АКШ (без трансплантации ККМ) изучено влияние предварительной (1 курс) иммунокоррекции на сократительную функцию миокарда.

У 59 (42+17) больных проводили динамическое наблюдение за восстановлением функции миокарда после интракоронарного введения МНК.

8 больных вошли в так называемую группу «пилотных исследований», которые положили начало работе по применению ККМ у больных ИБС с ХСН в клинике (у 4 больных были проведены интракоронарные инфузии и у 4 больных МНК вводили интрамиокардиально) и позволили установить безопасность метода клеточной терапии, а также расширить его изучение в клинике.

Отдельный раздел работы был посвящен оценке влияния трансплантации МНК на частоту развития иммунозависимых послеоперационных осложнений у больных, перенесших операцию АКШ (50 больных).

Контролем этой группы исследований служили 475 больных с АКШ без трансплантации МНК.

Таблица 1. Общий объем исследований, проведенных для повышения эффективности терапии больных с ХСН  аутологичными ККМ.

Серия  исследования

Группа исследования

Больные с АКШ или протезированием клапанов сердца

Больные с коронарографией или ангиопластикой

Всего

1. Изучение иммунного статуса кардиохирургических больных и сопоставление показателей с характеристиками МНК КМ.

-

95

59

154

2. Разработка методики и тестов для прогнозирования резервов индивидуальной устойчивости организма к стрессорному воздействию

-

250

0

250

3. Отработка метода индивидуального подбора иммунокорректоров

-

107

0

107

4. «Пилотные исследования» влияния ККМ у больных ХСН

Ведение ККМ интракоронарно

-

4

8

Введение ККМ интрамиокардиально

4

-

5. Применение МНК у больных ХСН

Применение культивированных МНК интракоронарно

42

-

71

Применение культивированных МНК интрамиокардиально

-

29

Применение иммунокоррекции и культивированных МНК интракоронарно

17

-

77

Применение иммунокоррекции и культивированных МНК интрамиокардиально

-

60

Больные с АКШ без ККМ (контроль)

50

-

50

Больные с АКШ без ККМ (с иммунокоррекцией)

15

-

15

6. Влияния ККМ на частоту развития иммунозависимых п/о осложнений

Больные АКШ +ККМ

50

-

50

Больные с АКШ без ККМ (контроль)

475

-

475

Всего исследований

1257

В целом результаты проведенной работы основываются на анализе результатов клинического и лабораторного исследования 869 кардиохирургических больных, у которых было проведено 1257 исследований.

       Поиск путей оптимизации терапии аутологичными ККМ был выполнен у 156 больных, клиническая характеристика которых представлена в таблице 2.

Таблица 2.  Клиническая характеристика больных, отобранных на трансплантацию МНК аутологичного костного мозга. (n=156).

Параметр

Численные значения

Возраст

51 + 3,2

Количество ИМ

1,6+0,6

ФК ХСН по NYHA

2,5+0,3

ФК стенокардии

3+0,3

ББИ (безболевая ишемия)

15%

Длительность ИБС,мес.

25+11

Длительность ХСН,мес.

14+3

Индекс DASI, баллы

35,7+3,8

Артериальная гипертония,

61%

Синусовый ритм

100 %

Наджел. экстрасистолы

26 %

Жел. экстрасистолы

14 %

- блокаторы

100%

Диуретики

32%

Кор. ангиопластика

9%

Включение в лист на ТС

16

При сравнении численных значений исходных параметров клинического состояния этих больных и больных, наблюдаемых в контрольной группах (без терапии ККМ) не было выявлено достоверных различий.

Методы клинического обследования кардиохирургических больных.

Обследование больных проводилось по утвержденному протоколу, включающему перечень общеклинических и специальных методов исследования.

Методы оценки кардиологического статуса больных включали: эле­к­т­ро­кар­ди­о­графические, эхо­кар­ди­о­графические, до­плер-эхо­кар­ди­о­гра­фические исследования; зон­ди­ро­ва­ние пра­вых и ле­вых от­де­лов серд­ца; ко­ро­на­ро­гра­фию; рентгеноконтрастную вен­т­ри­ку­ло­гра­фию; ра­дио­изо­топ­ные ис­сле­до­ва­ния серд­ца и вну­т­ри­сер­деч­ные ис­сле­до­ва­ния, которые вы­пол­ня­лись по спе­ци­аль­ной про­грам­ме, вклю­ча­ю­щей ре­т­ро­град­ную ка­те­те­ри­за­цию пра­вых и ле­вых от­де­лов серд­ца с ре­ги­с­т­ра­ци­ей кри­вых вну­т­ри­по­ло­ст­но­го дав­ле­ния.

Функциональный класс стенокардии оценивали по классификации Канадской ассоциации кардиологов [Захаров В.Н., 2001]; функциональный класс хронической сердечной недостаточности – по Международной (Нью-Йоркской) классификации кардиологов [Ольбинская Л.И., Сизова Ж.М., 2001].

Физическую активность и качество жизни больных оценивали по:

6-минутному тесту; индексу физической активности  (The Duke Activity Status Index-индекс DASI) в баллах и показателю качества жизни больных ХСН (Minnesota Living with Heart Failure Questionnaire – MLHFQ) в баллах.

Иммунологическое обследование больных (крови и костного мозга) проводили с использованием стандартных тестов, рекомендованных ВОЗ, в соответствии с разработанной схемой иммунологического обследования, адекватной для диагностики типа и степени вторичной  иммунной недостаточности [Manchini et al., 1965; Новиков Д.К. 1996; Фрейдлин И.С. 1986; Ершов Ф.И. 1996; Пинегин Б.В., Ярилин В.А., 2001].

Контроль частоты возникновения послеоперационных иммунозависимых осложнений у больных, включал оценку следующих показателей:

Общую летальность (ЛЕТ); частоту развития послеоперационных инфекционных осложнений (ПИО); летальность, ассоциированную с инфекцией (ЛАИ); тяжесть инфекции (ТИ), которая рассчитывалась, как отношение количества больных, умерших от инфекции, к общему числу больных с инфекционными осложнениями; развитие полиорганной недостаточности (ПОН).

Индивидуальный подбор иммуномодуляторов для кардиохирургических больных осуществляли с помощью метода люминолзависимой хемилюминесценции (ХЛ) лейкоцитарной суспензии in vitro [Владимиров Ю.А., Шерстнев М.П. 1989] при инкубации ее с иммуномодуляторами.

Для проведения иммунокоррекции были использованы следующие препараты:

Полиоксидоний, ООО «Иммафарма»  (Москва), по 6 мг в\м 1 раз в день в течение 10 дней; Имунофан, НПП «Бионокс» (Москва), по 1 мл 0, 005% р-р в/м, 1 раз в день в течение 10 дней; Циклоферон, ООО «НТФФ Полисан» (Санкт-Петербург), по 2 мл (250 мг) в/м 1 раз в день 10 дней; Реаферон, ЗАО «Вектор-Медика» (Россия), по 1 млн. МЕ в/м 1 раз в два дня 10 дней; Т-активин ОАО «БИОМЕД» (Россия), по 4-5 мкг/кг (0,04- 0,05 мл/кг) 1 раз в день подкожно 1 раз в день 5-7 дней; Тимоген, «НПО Микроген» (Россия), по 100 мкг в/м 1 раз в день в течение 10 дней.

Иммуномодуляторы назначались по стандартным схемам, рекомендованным в аннотациях к препаратам.

Технология получения, подготовки и применения аутологичных клеток КМ для трансплантации.

Технологический процесс включал: получение костномозговой взвеси клеток из подвздошной кости под местной анестезией в условиях операционной; выделение и культивирование клеток костного мозга (ККМ) в асептических условиях в ламинарном боксе с использованием чашек Петри и посевом клеток в концентрации 2,5-3*106 кл/мл сроком на 5-7 суток;  подготовку взвеси аутологичных ККМ для трансплантации больному.

Трансплантацию МНК в миокард осуществляли строго по показаниям с учетом регламентированных абсолютных и относительных противопоказаний.

Об­ра­бот­ка ма­те­ри­а­ла и ста­ти­с­ти­че­с­кий анализ про­во­дил­ся с помощью программы обработки данных “Cтатистка 6.0” (США, 2002г.), сред­ст­ва­ми ко­то­рой вы­пол­ня­лось так­же гра­фи­че­с­кое пред­став­ле­ние дан­ных. Все расчеты выполнялись автоматически на компьютере  с процессором Pentium 4 в среде Windows  XP Professional., c использованием функции статистического анализа базы данных  программы “Статистика 6,0” (США, 2002).

Результаты исследования

ОСОБЕННОСТИ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ИММУННОГО СТАТУСА У БОЛЬНЫХ ХСН.

У всех больных ХСН (n=154), которые поступили на лечение, в том числе с применением ККМ, было проведено полное обследование крови на  иммунный статус, наиболее значимые результаты представлены в таблицах 3 и 4 и рис.1.

Таблица 3. Характеристика популяционного состава лимфоцитов у больных с ХСН.

Иммунологические показатели, %

Здоровые  доноры, n=25

Больные ХСН, (n=154),

Группа больных ХСН

<N

N

>N

Лейкоциты, кл/мкл

6646±451

6830±552

3614±210*

6749±254

9215±422*

(15%)

(61%)

24%

Лимфоциты

32,5±4,8

25,1±4,2

15,3±2,7*

30,5±4,4

44,6±4,8*

(62%)

(7%)

(31%)

Т-лимф. (CD3+)

67,5±4,6

57,9±6,6

42,2±4,5*

65,2±3,5

79,6±4,7*

(58%)

(8%)

(34%)

Т-хел.  (CD4+)

43,1±3,7

35,9±4,8

27,7±4,4*

42,5±2,5

55,5±4,6*

(68%)

(14%)

(18%)

Т-цит. (CD8+)

25,1±3,6

20,3±4,8

13,5±4,2*

27,1±4,8

39,6±4,3*

(68%)

(10%)

(22%)

NK–кл. (CD16+)

13,9±1,6

17,5±3,5

6,7±2,7*

13,5±2,0

26,6±5,0*

(20%)

(42%)

(38%)

В-лим. (CD20+)

10,1±1,5

6,7±3,5

6,1±2,0*

10,2±1,2

14,2±2,2*

(84%)

(10%)

(6%)

Обозначения: * - достоверное различие по сравнению с группой здоровых доноров крови (р<0,05); в скобках указан % больных, включенных в группу, от общего числа больных ХСН 

<N – группа больных со сниженными значениями исследуемого показателя; >N  - группа больных с повышенными значениями исследуемого показателя; N – группа больных с нормальными значениями исследуемого показателя.

Таблица 4. Показатели функциональной активности Т-клеток крови  у больных с ХСН.

Иммунологические показатели, %

Здоровые  доноры, n=25

Больные ХСН, (n=154),

Группа больных ХСН

<N

N

>N

HLA DR+ кл.

11,5±3,5

13,5±3,3

5,2±3,2*

13,1±2,0

26,9±4,4*

(19%)

(65%)

(16%)

IL2-R

(CD25+)

3,2±1,6

2,9±1,1

1,3±0,4*

3,8±1,0

8,1±2,2*

(60%)

(25%)

(15%)

CD 71+

3,0±0,5

3,7±0,2

1,4±0,7*

3,5±0,8

8,8±3,2*

(25%)

(60%)

(15%)

CD 95+

13,1±3,1

17,5±2,2

7,2±2,7*

13,9±3,3

25,3±3,9*

(17%)

(40%)

(43%)

Обозначения: см. таблицу 3.

Распределив всех больных в группы, различающиеся между собой по степени отклонения исследуемых показателей от нормы, нам удалось выделить те варианты отклонения показателей популяционного состава лимфоцитов и функциональной активности Т-лимфоцитов, которые были наиболее типичны для больных ХСН, поступивших на лечение в кардиохирургическую клинику (рис. 1). 

Рис. 1. Распределение больных ХСН по группам (в %) в зависимости от численных значений показателей клеточного звена иммунитета. Белая часть столбиков – больные со сниженным значениями показателей; черная часть столбиков – больные с повышенными значениями показателей; серая часть столбиков – больные с нормальным значением показателей.

Мы установили, что у преобладающего большинства больных ХСН выявляется: снижение (или тенденция к снижению) общего числа Т-клеток (CD3+) в периферической крови (у 58% больных) на фоне относительной (%) и абсолютной (х109)  лимфопении; снижение числа Т-хелперов (CD4+) (у 68% больных) и цитотоксической фракции CD8+-клеток (у 68% больных); повышение фракции NK-клеток (CD16+) у 38% больных; снижение В-лимфоцитов (CD20+) у 84% больных.

У 16% больных с прогрессирующей формой ХСН отмечается повышение количества активированных Т-клеток (HLA DR+), а также  клеток, экспрессирующих рецептор к ИЛ-2 (CD25+кл) и CD71+; но у значительного числа обследованных пациентов, т.е. у 19%, 60% и 25% соответственно выявлено снижение этих показателей ниже принятой нормы; установлено также повышение готовности Т-клеток к активационному апоптозу более чем у 43% (CD95+-клетки с экспрессией FAS-R).

Среди показателей гуморального звена свыше 50% больных имели повышенный уровень ЦИК в крови; более 80% кардиологических больных имели сниженные значения фагоцитарного числа и фагоцитарного индекса.

Результаты проведенных исследований крови позволили заключить, что больные ХСН имеют признаки общего вариабельного иммунодефицита по клеточному звену со снижением фагоцитарной активности нейтрофилов. Полагая, что выявленные изменения иммунного статуса должны найти отражения в изменении популяционного состава ККМ этих больных нами было проведено сравнительное исследование миелограммы больных и здоровых доноров костного мозга. Было установлено, что миелограммы этих двух сравниваемых групп достоверно не различались. В тоже время при фенотипической характеристике свежевыделенных МНК КМ больных было установлено снижение CD25 клеток по сравнению со здоровыми донорами КМ. Кроме того, была установлена сильная прямая корреляционная зависимость между количеством CD25 клеток в крови и числом колониеобразующих единиц МНК КМ после их культивирования (r=0,72), а также сильная обратная корреляционная зависимость между количеством CD95 клеток крови и числом колониеобразующих единиц МНК КМ этих больных (r=-0,59).

Результаты приведенного исследования позволили нам сделать предположение, что у больных ИБС с резкой дисфункцией иммунной системы и сопутствующим снижением функциональной активности ККМ – эффект от терапевтического применения мононуклеарных клеток аутологичного костного мозга будет снижен или отсутствовать.

На основании полученных данных можно заключить, что:

- для прогнозирования результатов терапии аутологичных МНК у больных ХСН должен быть разработан и использован информативный метод, основывающийся на предварительной индивидуальной оценке общих адаптационных резервов организма по состоянию биологической реактивности клеток иммунной системы;

- под контролем разработанного биологического теста должен быть разработан метод повышения адаптационных резервов организма, в том числе иммунной системы и костного мозга, что позволит повысить биологические регуляторные возможности аутологичных клеток КМ для эффективной терапии ХСН.

РАЗРАБОТКА МЕТОДА ПРОГНОЗИРОВАНИЯ АДАПТАЦИОННЫХ РЕЗЕРВОВ И ИНДИВИДУАЛЬНОЙ УСТОЙЧИВОСТИ ОРГАНИЗМА К СТРЕССОРНОМУ ВОЗДЕЙСТВИЮ У БОЛЬНЫХ С ХСН.

Описание выполнения способа прогнозирования адаптационных резервов.

В качестве клеточной модели использовали лейкоциты крови (ЛК), устойчивость которых к стрессорному повреждению оценивали in vitro в хемилюминесцентном тесте. Критерием устойчивости служил индекс стимуляции (ИС) ядросодержащих клеток под действием ингибитора ц-АМФ фосфодиэстеразы (иФДЭ) (10-карбоксиметил-9-акриданон), способствующего повышению уровня ц-АМФ в клетке.

Для определения ИС использовали две кюветы - контрольную и  опытную, куда вносили по 40*103 ЛК. В опытную кювету дополнительно вносили 1 мкл раствора иФДЭ (12,5% р-р). В контрольную ячейку вносили 1 мкл раствора Хэнкса. Обе кюветы инкубировали в термостате в течение 60 мин при 37оС, после чего проводили запись кривых хемилюминесцентной реакции (ХЛР) клеток в контрольной и опытной кюветах с использованием хемилюминометра  «Хемилюминометр -2001/01» (Россия) в комплексе с компьютером IBM-PC при температуре счетной камеры 37оС, в течение 15 мин, после добавления активатора образования активных форм кислорода -  PMA (форбол-12-миристат-13-ацетат).

Суммарную продукцию (S) активных форм кислорода (АФК) ядросодержащими клетками вычисляли  как площадь под кривой  ХЛР отдельно в контрольной и опытной пробах. Затем, рассчитывали ИС, как отношение площади ХЛР в опытной и контрольной пробах (ИС=Sингибитор /Sконтроль), для нивелирования индивидуальных отклонений в продукции АФК у разных больных (рис.2).

Рис 2. Запись кривых ХЛР для расчета индекса стимуляции

Для выявления связи тяжести нарушения кинетических характеристик кривых ХЛР ЛК с уровнем адаптационных резервов организма нами проводилась также количественная оценка состояния иммунного статуса.

Оценка индивидуальной устойчивости больных к стрессу – проводилась на ЛК 250 больных, которым выполнялись реконструктивные операции на сердце (аортокоронарное шунтирование, протезирование клапанов сердца). Контролем служили исследования устойчивости ЛК 25 клинически здоровых доноров.

       Проведенное исследование показало, что ХЛР ЛК на инкубацию с ингибитором у здоровых доноров и у больных с тяжелыми хроническими заболеваниями сердца имеет достоверные количественные и качественные различия.

       Добавление к клеткам ингибитора у здоровых доноров повышало продукцию АФК, тогда как у больных с тяжелой хронической патологией сердца наоборот снижало ее по сравнению с контролем. Нарастание тяжести клинического состояния больных приводило к практически полному ингибированию продукции АФК при добавлении ингибитора.

Было отмечено, что больные, у которых в послеоперационном периоде развились послеоперационные осложнения имели в предоперационном периоде резко сниженный ИС, который колебался от 0,01 до 0,6. Выбрав за реперную точку ИС=0.6 и разбив всех оперированных больных по группам в зависимости от исходного значения ИС, мы отметили (таблица 6), что при ИС>0,6 процесс выздоровления больных шел достоверно быстрее, опасность развития осложнений (инфекционно- септические, органные дисфункции) была достоверно ниже, чем у больных с исходном значением ИС <0,6.

       Нами было отмечено (таблица 5), что у больных с ИС <0.6 после перенесенной операции достоверно снижается уровень лимфоцитов, преимущественно СД4+ лимфоцитов, относящихся к Т- клеточной популяции.

Таблица 5. Показатели хемилюминесцентной реакции и клеточного звена иммунной системы у кардиохирургических больных до и на 7 сутки в зависимости от значений ИС в предоперационном периоде.

Показатель

Здоровые

доноры 

(n=25)

Кардиохирургические больные

ИС<0.6 (n=104)

ИС>0.6  (n=146)

До операции

После операции

До операции

После операции

S, (103/у.е.)

352,1±55,2

277,1±15,9

151,1±33,2*

333,0±11,1+

240,2±30,3*+

ИС

2,50±0,31

0,57±0,04

0,08±0,02*

0,86±0,08+

0,44±0,10*+

Лейк. кл/мкл

6646±451

6850±854

10750±450*

6920±655

9840±955

Лимф., %

32,5±4,8

20,3±2,3

14,4±2,6*

27,1±2,1

25,4±3,3+

Т-лим.,%

67,5±4,6

56,2±3,1

44,5±1,1*

63,3±1,1

58,2±1,2+

Т-хел.,%

43,1±3,7

35,1±4,2

30,0±1,1*

41,3±2,7

37,3±3,2+

Т-цит.,%

25,1±3,6

22,2±3,5

14,1±3,1

20,3±2,2

21,1±2,1+

В-лим.,%

10,1±1,5

6,4±1,1

6,3±2,1

6,9±1,7

6,5±2.2

NK-лим.,%

13,9±1,6

15,1±2,2

13,1±1,4

18,9±2,0

16,1±1,3

CD71+, %

3,0±0,5

3,8±1,4

7,2±2,3*

3,1±2,3

6,4±1,1*

*-  достоверно, по сравнению с исходным уровнем (р<0,05) 

+ - достоверно, по сравнению с группой ИС<0,6 (р<0,05) 

Сопоставление результатов клинического наблюдения и лабораторных исследований позволяет придти к заключению, что степень исходного снижения ИС и других показателей ХЛР прогнозирует не только опасность развития и тяжести иммунозависимых осложнений в послеоперационном периоде, но и степень дисфункции иммунной системы.

Рассматривая ИС в качестве показателя адаптивных резервов устойчивости организма мы полагали, что подбор иммуномодуляторов и контроль медикаментозно  регулируемого восстановления сниженных адаптационных резервов организма с помощью иммунокорректоров также должен осуществляться путем динамического измерения ИС, который, по сути, отражает резервы клеток иммунной системы к продукции АФК.

ПУТИ ВОССТАНОВЛЕНИЯ БИОРЕГУЛЯТОРНОЙ АКТИВНОСТИ КЛЕТОК АУТОЛОГИЧНОГО КОСТНОГО МОЗГА У БОЛЬНЫХ ХСН.

Оценка эффективности иммунокоррекции в организме при индивидуальном подборе иммуномодуляторов методом хемилюминесценции.

В исследование были включены пациенты, у которых была выполнена кардиологическая операция (АКШ или протезирование клапанов сердца) и которые нуждались в проведении иммунокоррекции (на основании анализа результатов клинического и лабораторного обследования больных). Все больные были разделены на две группы:

В I-ю - основную группу  – были включены пациенты, получавшие курсовую терапию подобранным иммуномодулятором (10 инъекций), который в ХЛ-тесте был определен, как предпочтительный препарат  (n=53) для иммунокоррекции.

Препаратом выбора считали иммуномодулятор, индекс стимуляции лейкоцитов которым был больше 1,1.

Во II-ю группу – сравнения были включены пациенты, также получавшие курсовую терапию иммуномодулятором (10 инъекций), который назначался произвольно при выявлении  отклонений в иммунограмме без специального подбора (n=54).

       Препараты у больных каждой группы назначались в средне терапевтических суточных дозах, указанных в аннотациях.

       Результаты изменения лейкоцитарной формулы и показателей клеточного звена иммунитета, наступающие при индивидуально подобранной и произвольно назначенной иммунокоррекции, представлены в таблице 6 и таблице 7.

Таблица 6 Динамика показателей лейкоцитарной формулы крови у  больных при проведении иммунокоррекции на основе индивидуального подбора и произвольного назначения иммуномодулятора (ИМ).

Показатель, %

Здоровые доноры (контрольная группа) (n=25)

Индивидуальный подбор ИМ (группа I) (n=53)

Произвольное назначение ИМ (группа II) (n=54)

Исходные значения

Через 14 дней после начала лечения

Исходные значения

Через 14 дней после начала лечения

Лимфоциты

32,5±6,8

16,7±2,2*

30,0±2,0+

17,3±1,6*

24,2±1,9+

Нейтр. (с/я)

60,5 ±1,6

61,0±2,8

62,3±2,6

60,5±2,3

59,3±1,9

Нейтр. (п/я)

4,5±1,1

11,1±0,7*

6,1±1,3+

12,2±2,5*

9,0±1,4*

Моноциты

2,9±0,5

7,3±1,7*

2,6±0,5  +

7,3±0,6*

4,6±0,8+

Базофилы

0,8±0,1

0,1±0,2

0,1±0,2

0,2±0,4

0,1±0,4

Эозинофилы

2,9±0,4

3,2±0,5

2,1±0,6

3,2±0,6

3,8±0,6

* - достоверное различие со здоровыми донорами  (р<0,05)

+ -  достоверное различие с исходным уровнем (р<0,05)

       Из таблиц видно, что предварительный индивидуальный подбор ИМ in vitro  способствовал развитию у больных достоверно более благоприятных изменений ряда исследуемых показателей: в лейкоцитарной формуле наступало  достоверное снижение палочкоядерных нейтрофилов, в иммунограмме - повышение уровня лимфоцитов, Т-лимфоцитов и их основных субпопуляций, В-лимфоцитов. Уменьшались признаки воспалительной реакции (снижение HLA-DR) и  нормализовался уровень CD25 лимфоцитов. При этом нормализация клеточного звена проходила с нарастанием пролиферативной способности лимфоидных клеток (CD71+).

Таблица 7. Динамика показателей клеточного звена иммунитета у кардиологических больных при курсовом проведении иммунокоррекции на основе индивидуального подбора (основная группа) и произвольного назначения (группа сравнения) иммуномодуляторов.

Показатель, %

Здоровые доноры (контроль) (n=25)

Индивидуальный подбор ИМ (группа I) (n=53)

Произвольное назначение ИМ (группа II) (n=54)

Исходные значения

Через 14 дней после начала лечения

Исходные значения

Через 14 дней после начала лечения

Лейк., кл/мкл

6646±451

10218±675*

8705±675*+

10358±567*

7850±555*

Лимфоциты,%

32,5±6,8

16,7±2,2*

30,0±2,0+

17,3±1,6*

24,2±1,9*+

Т-лим. (CD3)

67,5±4,6

50,2±4,3*

69,8±2,5+х

49,5±4,1*

58,4±4,4

Т-хел. (CD4)

43,9±3,7

34,4±3,1*

45,5±1,4+х

33,4±3,4*

40,1±5,1

Т-цит.(CD8)

25,1±3,6

16,1±2,5*

25,7±2,0+х

17,0±2,2*

18,7±1,2*

В-лим.(CD20)

10,1±1,5

6,9±1.9*

8,6±0,9 +

6,1±2,0*

6,3±1,1*

NK-кл (CD16)

13,9±1,6

13,8±1,4

16,5±2,0

11,7±2,9

19,5±2,9*+

HLA-DR

11,5±3,5

13,0±1,1

15,7±1,7

16,8±2,5

17,6±2,1*

CD25-кл

3,2±1,6

2,0±0,1

6,6±0,9*+

1,9±1,1

2,8±1,2

CD71

3,0±0,5

6,6±1,7*

11,0±2,8* +

3,1±1,2

8,7±2,0*

СD 95

13,1±3,1

15,0±2,8

8,3±2,9+

17,2±2,7

16,9±3,3

  *  - достоверное различие по сравнению со здоровыми донорами (р<0,05);

  Х  -  достоверное различие с группой сравнения (р<0,05);

+ - достоверное различие по сравнению с исходным уровнем (р<0,05);

        Таким образом, проведенное исследование показало, что индивидуальный подбор иммунокорректоров больным ХСН существенно и достоверно повышает иммунорегуляторные свойства клеток крови этих больных по сравнению с произвольным назначением иммунокорригирующих препаратов.        

Повышение функциональной активности клеток костного мозга при проведении иммунокоррекции.

Использовав для оценки адекватности иммунокоррекции разработанный нами показатель – индекс стимуляции (ИС) в хемилюминесцентном тесте мы сопоставили содержание клеток CD25+, CD95+ и количество колониеформирующих единиц (КОЕ) в свежевыделенных МНК костного мозга у больных с ИС <1.0 и больных, у которых ИС стал >1.0, через 14 суток после иммунокоррекции (рис 3). 

       

Рис. 3 Влияние значений ИС лейкоцитарной взвеси периферической крови на взаимозависимые показатели функциональной активности МНК костного мозга (колониеобразующие единицы) у больных ХСН с ИС <1 (черный столбик); восстановление ИС>1 (черно-белый столбик); здоровые доноры (белый столбик).

Результаты измерения содержания CD25 и CD95 в крови, а также число колониеформирующих единиц в мононуклеарной фракции КМ подтвердили, что медикаментозная иммунокоррекция является эффективным  способом повышения функциональной активности ККМ.

Культивирование мононуклеарных клеток костного мозга  in vitro - дополнительный способ повышения их функциональной активности.

Проведенные исследования позволили установить, что культивирование МНК КМ in vitro всегда изменяет фенотипический состав клеток (рис.4) и этот факт мы стали рассматривать как доказательство изменения функциональных характеристик клеток в процессе культивирования.

Рис. 4 Фенотипический состав мононуклеарной фракции клеток костного мозга двух больных до и после культивирования. Темные столбики – до культивирования; Светлые столбики – после культивирования. А- клинический эффект на применения ККМ – был отчетливо выражен (ИС>1.0); В- клинический эффект на применения ККМ отсутствовал (слабо выражен) (ИС<1.0).

       Вместе с тем мы отметили, что характер и выраженность возникающих изменений у разных больных различна и коррелирует с исходным значением ИС ЛК крови этих больных и клиническим эффектом после их применения.

Так у больного с тяжелой ХСН (рис. 4Б)  клинический эффект на применение аутологичных культивированных клеток был слабо выраженным и этот эффект соответствовал ИС <1.0. У другого больного, также с ХСН (рис. 4 А), ККМ отреагировали на культивирование резким увеличением практически всех популяций клеток, а после применения этих клеток у больного был получен отчетливо выраженный позитивный клинический эффект (ИС его лейкоцитов был > 1.0).

У больного с позитивной клинической реакцией на введение ККМ, наступали не только отчетливые количественные изменения в популяционном составе клеток, но и резко увеличивалось в культуральной среде содержание TGF- и G-CSF. У больного с отсутствием выраженной позитивной реакции на введение аутологичных ККМ – накопление цитокинов в культуральной среде было незначительным также как невыраженными были изменения в фенотипическом составе клеток после культивирования (рис. 5).

Рис. 5. Интенсивность накопления цитокинов в культуральной среде (за 5 суток культивирования) мононуклеарными клетками костного мозга, оказывающих различный клинический эффект при их аутологичном применении. Светлые столбики- позитивный клинический результат (ИС >1.0); черные столбики – клинический эффект отсутствовал, ИС 1.0.

Результаты проведенного исследования позволили нам признать пригодность хемилюминесцентного метода и процедуры культивирования клеток для прогнозирования функциональных (адаптационных) резервов иммунной системы больных (в том числе МНК КМ), а также возможность повышения этих резервов с помощью медикаментозной иммунокоррекции в организме больного и в меньшей степени путем предварительного культивирования МНК КМ in vitro.

ВЛИЯНИЕ КУЛЬТИВИРОВАННЫХ МОНОНУКЛЕАРНЫХ КЛЕТОК АУТОЛОГИЧНОГО КОСТНОГО МОЗГА НА ПОКАЗАТЕЛИ СОКРАТИТЕЛЬНОЙ ФУНКЦИИ СЕРДЦА И КАЧЕСТВО ЖИЗНИ БОЛЬНЫХ ХСН (I ЭТАП ИССЛЕДОВАНИЯ).

Интракоронарное введение культивированных клеток костного мозга в миокард.

         Анализ результатов интракоронарного применения ККМ без хирургической коррекции был выполнен в двух группах больных ХСН. В 1-ю группу были включены больные, внесенные в лист ожидания трансплантации сердца (n=13), т.е. имели терминальную стадию поражения миокарда. Среди них было 3 больных с ишемической кардиомиопатией (ИКМП) и 10 больных с дилатационной кардиомиопатией (ДКМП). Этим больным интракоронарно вводили 150-500*106 МНК  аутологичного КМ однократно (n=11) или многократно (n=2) (3-4 раза) в тех же дозах.

Во вторую группу было включено 29 больных с ИКМП, причем у 25 из них был поставлен диагноз ИБС с постинфарктным кардиосклерозом и ХСН  (ФК II-IV по NYHA); у 4 больных – ИБС с рефрактерной стенокардией (ФК II-IV по NYHA). Эти больные получали интракоронарно ту же дозу клеток, что и в I группе, но всегда однократно.

Как в первой, так и во второй группе больных  проводилась традиционно используемая медикаментозная терапия миокарда, без его хирургической реваскуляризации. 

В 1-й группе уже через 2 месяца после введения ККМ отчетливо позитивно менялись клиническое состояние, качество жизни и индекс физической активности (таблица 8).

Таблица 8. Изменение показателей клинического состояния больных, ожидающих пересадку сердца до и через 2 мес. после интракоронарной трансплантации аутологичных МНК костного мозга, n=13. 

Показатель

До введения МНК КМ

М±м

Через 2 мес. после введения МНК КМ М±м

Значение p (по критерию Манна-Уитни)

Индекс физической активности DASI,баллы

21,7±6,1

38,2±7,6

0,002

Качество жизни,  MLHFQ, баллы

76,2±12,4

46±11,4

0,0025

Проба с 6-минутной ходьбой, м

150±76

315±52

0,03

Примечание: индекс DASI - более высокие показатели соответствуют более высокой физической активности. Индекс MLHFQ - более высокие показатели соответствуют менее высокому качеству жизни.

       Однако, позитивная динамика  указанных  показателей сохранялась не более 2-3 мес., после чего требовались повторные интракоронарные инфузии клеток, которые позволили 2 больным с ДКМП в течение 2 лет дождаться трансплантации донорского сердца.

Во II группе больных влияние клеточной терапии на показатели функции сердца оценивали через 6 месяцев после трансплантации, причем первоначально при оценке результатов клеточной терапии не учитывались исходные индивидуальные характеристики больного и прежде всего исходный ИС лейкоцитов крови, отражающий функциональную активность используемых ККМ. В результате при такой оценке достоверного улучшения показателей функции миокарда нами не было обнаружено.

Проведя корреляционный анализ между показателями насосной функции сердца  - конечным диастолическим и систолическим объемами (КДО и КСО) через 6 месяцев после трансплантации с одной стороны и исходной функциональной активностью клеток костного мозга (Индекс стимуляции), возрастом больного, длительностью СН, количеством вводимых клеток, показателями Т- клеточного звена иммунной системы, показателями функциональной активности лимфоцитов периферической крови с другой стороны – нами было выявлено существование сильной корреляционной связи в следующих 6 парах (таблица 9).

Таблица 9. Факторы, влияющие на ремоделирование ЛЖ у больных с ИБС через 6 мес. после интракоронарного введения МНК КМ.

Корреляционные пары

Spearman R

p-level

Длительность СН - КСО ЛЖ 6 мес.

0,73

0,04

Длительность СН - ФИ ЛЖ 6мес.

-0,40

0,049

Индекс стимуляции - КДО ЛЖ 6 мес.

-0,78

0,0005

Индекс стимуляции - КСО ЛЖ 6 мес.

-0,59

0,008

Индекс стимуляции - DASI мес.

0,45

0,04

Индекс стимуляции - УО ЛЖ 6 мес.

0,58

0,01

Примечание: – дельта изменения показателя, %, рассчитывалась по Ребровой О.Ю (2002).

Установив значимость ИС в реализации терапевтического эффекта введенных МНК на миокард мы для выявления результатов клеточной терапии разделили всех этих больных на две подгруппы: с ИС <1 и ИС>1 (таблица 10).

Таблица 10 Значения параметров сократительной функции сердца и индекса физической активности у больных ХСН через 6 мес. после интракоронарного введения культивированных клеток костного мозга в зависимости от значений ИС лейкоцитов крови больных.

Параметры

Больные ИБС

Исходный ИС<1

  (n=11)

Исходный ИС>1 

  (n=18)

p Манна-Уитни

КДО ЛЖ, %, 6 мес.

1,2±4.1

-9,1±5.1

0,049

ФИ ЛЖ, %, 6 мес.

7,1±4.9

10,2±8.7

0,12

КСО ЛЖ,%,  6 мес.

3,9±8.08

-15,0±7.3

0,049

УО ЛЖ, мл, 6 мес.

4,6±1.1

10,5±2.2

0,01

Индекс DASI

44,3±11.1

68,5±9.9

0,04

Обозначения: КСО – конечно-систолический объем; КДО ЛЖ – конечно-диастолический объем; УО – ударный объем; ФИ ЛЖ – фракция изгнания левого желудочка; DASI – индекс физической активности; - дельта изменений, рассчитывалась по Ребровой О.Ю. (2002).

       В результате нам удалось подтвердить, что высокие исходные значения ИС играют определяющую роль в развитии позитивных эффектов клеточной терапии миокарда при ХСН. В тоже время позитивное влияние клеточной терапии на показатели общего клинического состояния больных не зависело от исходных значений их ИС (таблица 11).

Таблица 11 Динамика клинического состояния больных ИКМП, через 6 мес. после изолированного  интракоронарного введения клеток костного мозга, n=29

Показатели

До введения МНК КМ

Через 6 мес. после введение МНК КМ

p =

Mann-Whitney

Тест с нагрузкой, МЕТS.

5,0±1,5

8,0±1,5

0.047

DASI, баллы.

27,7±10,2

44,2±6,1

0.002

MLHFQ, баллы

68±11,4

25±15,2

0.0025

Частота ангинозных приступов в неделю

7,13±3,1

2,15±1,4

0.0001

6-и минутная проба, метры.

212±75

350±72

0.03

Примечание: METS – метаболический эквивалент, один MET равен количеству кислорода, которое в среднем потребляет сидящий человек. DASI – индекс физической активности. Индекс MLHFQ –  Миннесотский  опросник качества жизни больных ХСН;

Интрамиокардиальное введение культивированных клеток костного мозга в миокард при операции аортокоронарного шунтирования (АКШ)

В настоящий раздел исследования были включены больные ишемической ХСН, которые поступили в клинику для плановой операции АКШ.

Больные были разделены на 2 группы.  1-ю группу  (контрольную) было включено  50 больных, которым выполнялась АКШ по стандартному плану. Во 2-ю группу клеточной терапии (АКШ+ККМ) было включено 29 больных, которым во время операции АКШ интрамиокардиально вводили аутологичные, предварительно культивированные МНК в количестве 200*106 клеток в 5 мл физиологического раствора.

Через 6 месяцев после операции в обеих группах больных было проведено сравнительное изучение изменения наиболее информативных показателей функции миокарда и показателей общеклинического состояния (таблица 12).

Таблица 12. Значения параметров сократительной функции сердца и индекса физической активности у больных ХСН через 6 мес. после интрамиокардиального введения культивированных клеток костного мозга во время операции АКШ.

Параметры

Больные ИБС

АКШ (n=50)

АКШ+ККМ

(n=29)

p Манна-Уитни

КДО ЛЖ, %, 6 мес.

-3,9+2.1

-7,5+2.6

0,65

ФИ ЛЖ, %, 6 мес.

9,1+2.9

18,2+10.7

0,02

КСО ЛЖ,%,  6 мес.

-10,2+8.08

-12,6+1.26

0,51

УО ЛЖ, мл, 6 мес.

7,05+6.9

6,7+4.2

0, 2

Индекс DASI

8,3+1.9

18,6+3.1

0,04

Обозначения: см. таблицу 10

Оказалось, что в группе АКШ+ККМ достоверно позитивно изменялись только два показателя: ФИ ЛЖ и индекс DASI. Прирост ФИ ЛЖ через 6 мес. в группе АКШ+ККМ составил 18,2% вместо 9,1% в контроле (р=0.021), а индекс DASI 18,6% и 8,3% (р=0.04) соответственно в исследуемой и контрольной группах.

Корреляционный анализ между гемодинамическими параметрами насосной функции сердца (КДО, КСО) в группе АКШ+ККМ через 6 месяцев после операции с одной стороны и функциональной активностью клеток КМ (индекс стимуляции), возрастом больных, длительностью СН и другими показателями с другой – позволил установить существование сильной корреляционной связи в парах, включающих значения ИС (таблица. 13).

Таблица 13. Факторы, влияющие на ремоделирование ЛЖ у больных ИБС через 6 месяцев после интрамиокардиального введения ККМ при операции АКШ+ККМ (по результатам ЭхоКГ).

Корреляционная пара

Spearman R

p-level

ИС- КДО ЛЖ

-0.63

0.005

ИС- КСО ЛЖ

-0.62

0.007

ИС- ФИ ЛЖ

0.74

0.001

Длит. ХСН- КСО ЛЖ

0.73

0.043

Разделив всех больных  группы АКШ+ККМ на две подгруппы в зависимости от значения ИС (с исходным ИС >1 (n=10) и с ИС<1 (n=19)), мы подтвердили наши предположения о том, что именно от исходного функционального состояния ККМ зависит эффект их клинического применения у больных ХСН (таблица 14).

Таблица 14.Значения параметров сократительной функции сердца и индекса физической активности у больных ХСН через 6 мес. после операции АКШ с интрамиокардиальным введением культивированных клеток костного мозга в зависимости от исходного функционального состояния МНК КМ (ИС)

Параметры

Больные ИБС

Исходный ИС<1

  (n=19)

Исходный ИС>1  (n=10)

p Манна-Уитни

КДО ЛЖ, %, 6 мес.

-5,0+2.1

-11,8+2.6

0,006

ФИ ЛЖ, %, 6 мес.

13,8+1.8

25,2+5.3

0,0017

КСО ЛЖ,%,  6 мес.

-7,6+3.1

-20,4+5.4

0,049

УО ЛЖ, мл, 6 мес.

6,2+1.3

7,7+4.2

0,71

Индекс DASI

16,3+2.4

22,4+1.3

0,04

Обозначения: см. таблицу 10        

Оптимизация биорегуляторной активности мононуклеарных ККМ путем предварительной иммунокоррекции in vivo (индивидуально подобранными иммуномодуляторами) и культивирования ex vivo в питательных средах (II этап исследования).

Для оптимизации биорегуляторной активности МНК КМ у всех больных ХСН (n=60) в предоперационном периоде (до выполнения АКШ) был изучен исходный иммунный статус, установлены значения ИС и проведена иммунокоррекция с целью подготовки больных к операции с позитивным результатом применения клеточной терапии.

Характеристика показателей иммунного статуса больных ХСН до и после иммунокоррекции. 

Разделив всех больных (n=(60+29), которым планировалась операция АКШ в сочетании с клеточной терапией на подгруппы в зависимости от исходного значения ИС (ИС<1 и ИС1), мы выявили скрытые ранее различия в усредненной карте показателей иммунной системы этих больных (таблица 15).

Таблица 15. Исходные показатели иммунограммы кардиохирургических больных (29 больных I этапа исследования и 60 больных II этапа исследования) в зависимости от индекса стимуляции их мононуклеарных клеток крови.

Показатель

Здоровые доноры (n=25)

Кардиохирургические больные

Общая группа (n=89)

Группа с ИС1.0 (n=34)

Группа с ИС <1.0 (n=55)

Лейкоциты, кл/мкл

6646±451

6893±354

6820±245

6890±145

Лимфоциты, %

32,5±4,8

22,7±3,1*

30,0±3,6

18,1±1,1*

Т-лимф.(CD3+)%

67,5±4,6

57,1±5,5

67,1±6,6

53,5±3,1*+

Т-хел. (CD4+)%

43,9±3,7

36,5±4,5

43,3±5,4

32,4±3,5*+

Т-цит. (CD8+) %

25,1±3,6

20,6±2,3

25,2±3,5

18,0±4,9+

В-лимф. (CD20+) %

10,1±1,5

8,2±2,1

9,1±1,1

6,9±1,0

NK-кл. (CD16+),  %

13,9±1,6

16,8±3,1

18,9±3,2

15,0±1,4+

HLA-DR,%

11,5±3,5

15,5±1,1

20,1±2,7*

13,1±2,2

IL2-R+-кл., %

3,2±1,6

2,8±0,9

4,0±2,1

1,8±1,0+

CD71+

3,0±0,5

3,4±1,2

4,5±0,5*

2,5±0,1

CD 95+

13,1±3,1

17,2±2,2

12,8±1,2

22,4±1,2*+

*-достоверное различие  по сравнению со здоровыми донорами (р<0,05);

+-достоверное различие по сравнению с показателями больных с ИС 1.0 ( р<0,05);

Оказалось, что из 60 больных II этапа исследования у 36 изначально (еще до забора клеток костного мозга) ИС был <1. Однако, у этих больных после курса иммунотерапии одним из подобранных иммунокорректоров, уже на 10-14-е сутки  происходило достоверно благоприятное изменение большинства изученных нами показателей; причем часть показателей достигала значений, присущих значениям здоровых доноров (таблица 16).

Таблица 16. Изменение иммунологических показателей у больных с ИС<1.0  группы после курса иммунокорригирующей терапии (n=36)

Иммунологические

показатели, %

Здоровые доноры

(n=25)

Больные с ИС <1 до и после иммунокоррекции (n=36)

До

Через 14 дней

Лейкоциты, кл/мкл

6646±451

6790±130

7750±210

Лимфоциты

32,5±4,8

19,4±1,1*

30,0±2,0х

Т-лимфоциты (CD3+)

67,5±4,6

54,5±2,1*

69,8±2,5х

Т-хелперы (CD4+)

43,9±3,7

33,0±2,1*

45,5±2,4х

Т-цит. CD8+)

25,1±3,6

19,7±1,2*

25,7±2,0х

В-лимфоциты (CD20+)

10,1±1,5

7,0±2,2

8,6±0,9

NK-клетки  (CD16+)

13,9±1,6

15,5±1,9

16,5±2,0

HLA-DR

11,5±3,5

13,5±1,1

15,7±1,7

IL2-R+-кл. (CD25+)

3,2±1,6

1,7±0,9*

3,3±0,1х

CD71+        

3,0±0,5

2,5±0,4

11,0±2,8*х

CD95+

13,1±3,1

21,8±2,1*

15,1±1,1х

*- достоверное различие по сравнению с группой здоровых доноров  (р<0,05);

Х  - достоверное различие с исходным уровнем (до иммунокоррекции)  (р<0,05);

Влияние предварительной иммунокоррекции на результаты операции аортокоронарного шунтировании.

В своей работе мы проанализировали эффективность предварительной иммунокоррекции на сократительную функцию миокарда у больных с операцией аортокоронарного шунтировании. У 15 больных в предоперационном периоде была проведена иммунокорригирующая терапия индивидуально подобранными препаратами с целью профилактики иммунозависимых инфекционных осложнений. В контрольной группе иммунокоррекция не проводилась. Сопоставление результатов состояния сократительной функции миокарда в исследуемых группах больных показало, что через 6 месяцев однократный курс иммунокоррекции не вызывает достоверных улучшений сократительных функций миокарда (таблица 17).

Таблица 17. Значения параметров сократительной функции сердца и индекса физической активности у больных ХСН через 6 мес. после однократного курса индивидуально подобранной иммунотерапии в предоперационном периоде.

Параметры

Больные ХСН

АКШ (n=50)

АКШ + иммунокоррекция (n=15)

p Манна-Уитни

КДО ЛЖ, %, 6 мес.

-3,9+2.1

-4,7+3.3

0,71

ФИ ЛЖ, %, 6 мес.

9,1+2.9

11,1+7.8

0,31

КСО ЛЖ,%,  6 мес.

-10,2+8.08

-9,3+3.8

0,5

УО ЛЖ, мл, 6 мес.

7,05+6.9

7,1+5.3

0, 67

Индекс DASI

8,3+1.9

14,4+4.2

0,1

Обозначения: см. таблицу 10

Влияние предварительной комплексной активации МНК КМ на результаты интрамиокардиальной трансплантации этих клеток больным ХСН.

Интрамиокардиальное применение ККМ, во время операции АКШ (АКШ+ККМ), которые были предварительно 2-х этапно активированы (in vivo с помощью иммунокорректоров и ex vivo путем культивирования), позволило достоверно улучшить значения показателей функционального состояния миокарда и качество жизни больных ХСН через 6 месяцев после операции по сравнению с аналогичной группой больных, в которой ККМ были только культивированы (без предварительной иммунокоррекции) (таблица 18).

Таблица 18. Значения параметров сократительной функции сердца и индекса физической активности у больных ХСН через 6 мес. после операции АКШ+ККМ, при использовании культивированных клеток (контрольная группа) и при использовании клеток, подвергнутых активационной терапии  (in vivo и  ex vivo) (основная группа).

Параметры

Больные ИБС

АКШ+ККМ (контрольная группа – культивированные ККМ I этап исследования) (n=29)

АКШ+ККМ (основная группа- иммунокоррекция + культивирование ККМ II этап исследования) (n=60)

p Манна-Уитни

КДО ЛЖ, %, 6 мес.

-7,5+2.6

-16,21+4.6

0,001

ФИ ЛЖ, %, 6 мес.

18,2+10.7

28,2+5.4

0,02

КСО ЛЖ,%,  6 мес.

-12,6+1.26

-21,5+4.4

0,044

УО ЛЖ, мл, 6 мес.

6,7+4.2

20,7+14.3

0,01

Индекс DASI

18,6+1.1

20,3+1.1

0,052

Обозначения: см. таблицу 10

Полученные результаты показывают, что активация функционального состояния мононуклеарных ККМ, комплексно и последовательно сначала in vivo, под контролем ИС, а затем ex vivo на этапе культивирования позволяет добиться повышения эффективности трансплантации аутологичных ККМ у больных ХСН, что выразилось достоверно положительным изменением КСО, КДО и ФИ ЛЖ в сравнении с контрольной группой – активация ККМ только ex vivo.

Влияние предварительной комплексной активации МНК КМ на результаты интракоронарной трансплантации этих клеток больным ХСН.

Проведенная нами иммунокоррекция у больных ХСН (n=17) перед забором клеток костного мозга и последующее культивирование привело к достоверному улучшению результатов ремоделирования сердца по сравнению с контролем (таблица 19) при введении клеток интракоронарно. 

Таблица 19 Показатели внутрисердечной гемодинамики и сократительной функции миокарда у больных через 6 мес. после интракоронарной трансплантации, при использовании культивированных клеток (контрольная группа) и при использовании клеток, подвергнутых активационной терапии  (in vivo и  ex vivo) (основная группа).

Параметры

Больные ИБС

Контрольная группа (контрольная группа – культивированные ККМ I этап исследования) (n=29)

Опытная группа (иммунокоррекция + культивирование ККМ II этап исследования) (n=17)

p Манна-Уитни

КДО ЛЖ, %, 6 мес.

-5,2±5,3

-12,5+4.6

0,0006

ФИ ЛЖ, %, 6 мес.

8,9±2,8

31,2+10.7

0,02

КСО ЛЖ,%,  6 мес.

-7,7±4,3

-26,8+21.26

0,049

УО ЛЖ, мл, 6 мес.

8,2±3,2

9,9+14.2

0, 12

Индекс DASI

62,3±15,1

64,1+33.1

0,44

Обозначения: см. таблицу 10

Проведение активации мононуклеарных ККМ, последовательно in vivo и ex vivo позволило нам повысить эффективность трансплантации аутологичных ККМ у больных ХСН, что привело к более значимым положительным изменениям КСО, КДО, ФИ ЛЖ  по сравнению с контрольной группой.

Влияние мононуклеарной фракции аутологичных клеток костного мозга на развитие иммунозависимых осложнений у больных после операции АКШ.

Анализ частоты развития послеоперационных осложнений показал, что в группе АКШ+ККМ развитие полиорганной недостаточности полностью нивелировалось, а количество  инфекционных осложнений становилось достоверно ниже, чем в контрольной группе  (таблица 20).

Этот факт является особенно примечательным, если учесть, что сравниваемые группы больных (АКШ и АКШ+ККМ), достоверно не различались между собой ни по возрасту, ни по длительности искусственного кровообращения и искусственной вентиляции легких, но достоверно  различались по  наличию очагов хронической инфекции в организме, выявленных до операции.  Очаги хронической инфекции в контрольной группе (АКШ) исходно были выявлены у 27% больных, тогда как в группе (АКШ +ККМ) – у 54%, т.е. встречались в два раза чаще, и эта разница была статистически достоверной (p<0,05).

Полагая, что активация микрофлоры в очагах хронической инфекции, в условиях операционного стресса может являться одной из основных причин развития иммунозависимых осложнений, была проанализирована частота развития послеоперационных инфекционных осложнений в каждой группе больных, в зависимости от наличия или отсутствия очагов хронической инфекции в организме в предоперационном периоде.

Таблица 20. Частота развития послеоперационных осложнений у больных после  аортокоронарного шунтирования (АКШ) и у больных с АКШ в сочетании с интрамиокардиальным введением клеток костного мозга (АКШ+ККМ) за 2004-2006гг.

 

Группа АКШ (n=479)

Группа АКШ+ККМ (n=50)

Исходно с хроническими

очагами инфекции (n=131/27% )

Исходно без хронических очагов инфекции (n=348/73%)

Исходно с хроническими очагами инфекции (n=27/54%)

Исходно без хронических очагов инфекции

(n=23/46%)

ЛЕТ,%(кол-во чел)

10(13)

7(23)

0(0)*

0(0)

ПИО,%(кол-во чел)

20(26)

15(54)

4(1)*

9(2)

ЛАИ,%(кол-во чел)

7(9)

4(15)

0(0)

0(0)

ТИ,%(кол-во чел)

34(9)

28(15)

0(0)*

0(0)*

ПОН,%(кол-во чел)

10(13)

7(25)

0(0)*

0(0)

Обозначения: *- достоверно по сравнению с группой АКШ (p<0.05)

Анализ показал (таблица 20), что общее снижение иммунозависимых осложнений в основной группе происходило как за счет снижения таких осложнений в подгруппе больных без очагов хронической инфекции в организме (тяжесть инфекционного поражения больных), так и особенно в подгруппе больных исходно имеющих очаги хронической инфекции. У исследуемых больных дополнительно осуществляемая трансплантация ККМ достоверно снижала уровень летальности, частоту послеоперационных осложнений, тяжесть инфекции и частоту развития полиорганной недостаточности.

ВЫВОДЫ

  1. Трансплантация мононуклеарной фракции клеток аутологичного костного мозга  является эффективным вспомогательным методом восстановления сократительной функции миокарда и улучшения качества жизни больных с хронической сердечной недостаточностью, но только при использовании клеток костного мозга с высокой иммуно-биорегуляторной активностью. Фактором, препятствующим реализации терапевтического эффекта ККМ у больных служит сниженный уровень иммуно-биорегуляторной активности аутологичных ККМ, который обусловлен дизрегуляцией иммунной системы у этих больных.
  2. У больных с хронической сердечной недостаточностью часто развивается вариабельный иммунодефицит с выраженными нарушениями в крови Т- клеточного звена иммунной системы (снижение СD25, повышение CD95), степень проявления которых коррелирует со снижением колониеобразующей активности клеток костного мозга.
  3. Для восстановления колониеобразующей и биорегуляторной активности еще до стадии применения ККМ должна проводится диагностика функциональных резервов иммунной системы и коррекция вторичного иммунодефицита у больных ХСН.
  4. Для индивидуальной оценки функциональных резервов иммунной системы больных ХСН разработан тест – индекс стимуляции, вычисление которого основано на измерении продукции АФК нативными ЛК крови больных без и при добавлении к ним ингибитора цАМФ-фосфодиэстеразы.
  5. Численные значения индекса стимуляции служат количественной мерой неспецифической устойчивости организма больного к стрессорному воздействию. ИС 1 прогнозирует адекватную адаптационную реакцию организма; ИС < 1 – снижение адаптационных резервов и опасность развития осложнений в послеоперационном периоде.
  6. Для повышения функциональной активности клеток костного мозга и  клеток иммунной системы периферической крови, а также для обеспечения клинической  эффективности клеточной трансплантации у больных с хронической сердечной недостаточностью необходимо предварительно в организме больного проводить иммунокорригирующую терапию медикаментозными препаратами, выбор которых осуществляется на основании разработанного метода индивидуального подбора иммуномодуляторов. 
  7. Культивирование ККМ в обогащенных питательных средах in vitro, также способствует восстановлению их функциональной активности, однако, процедура культивирования является лишь вспомогательным способом повышения функциональной активности ККМ до трансплантации.
  8. Проведение двух этапного восстановления иммуно-биорегуляторной активности ККМ перед трансплантацией путем сочетанного применения контролируемой медикаментозной иммунокоррекции in vivo и последующей активации функционального состояния МНК костного мозга in vitro при культивировании позволяет оптимизировать иммуно-биорегуляторную подготовку клеточного материала  к трансплантации и добиться достоверного улучшения насосной функции сердца  и качества жизни у больных ХСН; предварительная иммунокоррекция не может заменить эффект трансплантации МНК в миокард у больных ХСН.
  9. Трансплантация клеток костного мозга у больных с терминальной стадией сердечной недостаточности, ожидающих пересадку сердца, в течение 2-3 месяцев улучшает качество жизни. Клеточная терапия для  данной категории больных служит «биологическим мостом» к трансплантации сердца и должна повторяться каждые 2-3 месяца,  что позволяет больному дождаться трансплантации донорского сердца.
  10. Интрамиокардиальная трансплантация мононуклеарной фракция клеток аутологичного костного мозга во время операции АКШ достоверно снижает частоту развития инфекционно-септических осложнений и связанную с этим летальность, а также препятствует развитию полиорганной недостаточности в послеоперационном периоде.

  ПРАК­ТИ­ЧЕ­С­КИЕ РЕ­КО­МЕН­ДА­ЦИИ

  1. Для улучшения показателей насосной функции сердца и качества жизни у больных с хронической сердечной недостаточностью показано интракоронарное и/или интрамиокардиальное введение аутологичных клеток костного мозга с высокой биорегуляторной активностью.
  2. Для контроля уровня биорегуляторной активности аутологичного ККМ и прогнозирования клинической эффективности их трансплантации у больных ХСН необходимо наряду с определением иммунного статуса оценивать резервы функциональной активности клеток иммунной системы, используя предложенный нами показатель - индекс стимуляции (ИС).
  3. Сниженные значения ИС (ИС <1) позволяют прогнозировать сниженную биорегуляторную активность ККМ и отсутствие или слабо выраженный терапевтический эффект от трансплантации таких клеток у больных ХСН.
  4. Сниженные значения ИС (ИС <1) позволяют также прогнозировать высокий риск развития послеоперационных инфекционных осложнений. При ИС<0,6 и необходимости выполнения хирургической операции возникает опасность развития тяжелых иммунозависимых осложнений в п/операционном периоде в виде инфекционно-септических и органных дисфункций вплоть до полиорганной недостаточности.
  5. При снижении значения ИС для обеспечения выраженного терапевтического эффекта трансплантации аутологичного ККМ необходимо заблаговременно проводить иммунокорригирующую терапию индивидуально подобранными препаратами.
  6. Для индивидуального подбора иммунокорригирующих препаратов необходимо использовать метод, основанный на хемилюминесцентной реакции лейкоцитов крови больных.
  7. Для оптимизации иммунно-биорегуляторной активности аутологичных ККМ и обеспечения выраженного позитивного результата после их трансплантации следует применять 2-х этапную подготовку ККМ – контролируемую иммунокоррекцию индивидуально подобранными препаратами in vivo и проводить последующее культивирование ККМ в питательных средах в течение 5-7 суток in vitro. Иммунокоррекция не может заменить трансплантацию культивированных МНК КМ.
  8. Для улучшения качества жизни и снижения темпа прогрессирования  сердечной недостаточности у больных с дилятационной и ишемической кардиомиопатией, в том числе у пациентов, включенных в “лист ожидания” на трансплантацию сердца, показано интракоронарное и/или интрамиокардиальное введение специально подготовленных аутологичных клеток костного мозга.  У таких больных, однако, улучшение клинического состояния после терапии аутологичными ККМ ограничивается 2-3 месяцами и требует повторных введений культивированных клеток.
  9. Для снижения частоты возникновения инфекционных иммунозависимых осложнений после операции аортокоронарного шунтирования следует проводить интраоперационное  введение аутологичных клеток костного мозга.

Список основных работ, опубликованных по теме диссертации.

  1. Шумаков В.И., С.В.Гуреев, Онищенко Н.А., Темнов А.А., Васильев К.Н., Сухачев А.А. //Факторы, влияющие на эффективность трансплантации аутологичных стволовых клеток костного мозга больным хронической сердечной недостаточности. // Сборник тезисов с Ежегодной Всероссийской и международной научной конференции «Стволовые клетки и перспектива их использования в здравоохранении» 24-25 мая 2006г. Стр. 81-82
  2. Темнов А.А., Никольская А.О., Габриелян Н.И., Савостьянова О.А., С.В.Гуреев, Онищенко Н.А., Васильев К.Н., Сухачев А.А. // Использование аутологичных клеток костного мозга для профилактики и лечения иммунозависимых осложнений у кардиохирургических больных.  // Сборник тезисов с Ежегодной Всероссийской и международной научной конференции «Стволовые клетки и перспектива их использования в здравоохранении» 24-25 мая 2006г. Стр. 83-84
  3. Шумаков В.И., Темнов А.А., Никольская А.О., Габриелян Н.И., Савостьянова О.А., С.В.Гуреев, Онищенко Н.А. //Трансплантация аутологичных клеток костного мозга снижает частоту осложнений у больных после операции аортокоронарного шунтирования. // Ж. «Бюллетень НЦССХ им.А.Н.Бакулева РАМН», Том 7, №3 Май-Июнь Москва, 14-16 мая 2006, стр.48
  4. Темнов А.А., Никольская А.О.,Артамонов С.Д., Новиков В.К., Башкина Л.В., Онищенко Н.А. // Трансплантация мононуклеарной фракции клеток аутологичного костного мозга восстанавливает взаимосвязь иммунного статуса, соматического состояния и качества жизни больных с хроническими заболеваниями внутренних органов.  // Ж. «Бюллетень НЦССХ им.А.Н.Бакулева РАМН», Том 7, №3 Май-Июнь Москва, 14-16 мая 2006, стр.167
  5. Шумаков В.И., Темнов А.А., С.В.Гуреев, Онищенко Н.А., Васильев К.Н., Сухачев А.А. // Состояние иммунного гомеостаза, как фактор ремоделирования левого желудочка у больных с хронической сердечной недостаточностью при проведении клеточной терапии. // Ж. «Бюллетень НЦССХ им.А.Н.Бакулева РАМН», Том 7, №3 Май-Июнь Москва, 14-16 мая 2006, стр.177
  6. Онищенко Н.А., Крашенинников М.Е., Расулов М.Ф., Темнов А.А., Потапов И.В., Берсенев А.В., Зайденов В.А. и др. // Применение  стволовых и прогениторных клеток костного мозга для регуляции восстановительных процессов в поврежденных органах. // Сборник тезисов 2-ой международной конференции «Патофизиология и современная медицина», Москва 22-24 апреля 2004, стр.298
  7. Артамонов С.Д., Темнов А.А., Никольская А.О., Тарабарко Н.В. и др. //Влияние трансплантации аутогенных гемопоэтических клеток костного мозга на течение диабетической нефропатии у больных с хронической почечной недостаточностью в терминальной стадии ХПН. // Сборник тезисов Третий российский конгресс по патофизиологии. Москва, 9-12 ноября, 2004, стр.219 
  8. Сускова В.С., Онищенко Н.А., Емец В.И., Темнов А.А. и др. // Иммунофенотипическая и цитокиновая характеристика клеточных трансплантатов аутологичного костного мозга у кардиохирургических больных. // Сборник тезисов Третий российский конгресс по патофизиологии. Москва, 9-12 ноября, 2004, стр.238
  9. Хубутия М.Ш., Сускова В.С., Подвальнюк В.В., Темнов А.А. и др. //Применение имунофана, полиоксидония и спленопида у кардиохирургических больных при подготовке к операции // Сборник тезисов X Российского национального конгресса «Человек и лекарство» // Москва, 2003, стр.555.
  10. Темнов А.А.,  Хубутия М.Ш., Сускова В.С. и др. //Использование хемилюминесценции для подбора иммунокорректоров у кардиологических больных со вторичными иммунодефицитами перед операцией // Сборник тезисов IХ Российского национального конгресса «Человек и лекарство»// Москва, 2002, стр.448-449.
  11. Хубутия М.Ш., Сускова В.С., Подвальнюк В.В., Темнов А.А. //Хемилюминесцентный анализ клеток крови для прогноза развития послеоперационных осложнений у кардиологических больных //  IX Всероссийский съезд сердечно-сосудистых хирургов. Тезисы докладов.// Москва, 2003, том 4, №11, стр. 278.
  12. Подвальнюк В.В., Хубутия М.Ш., Сускова В.С., Темнов А.А. и др. //Иммунный статус как интегральный показатель адаптационных резервов организма у кардиологических больных // Сборник тезисов конференции «Новые оперативные технологии (анатомические, экспериментальные и клинические аспекты)» // Москва, 2002, стр.224-226.
  13. Сускова В.С., Онищенко Н.А., Емец В.И., Ермакова В.И., Сусков С.И., Темнов А.А., Казаков Э.Н., Гуреев С.В. // Анализ иммунофенотипических и цитокиновых параметров клеточных трансплантатов аутологичного костного мозга у кардиохирургических больных. // Ж. «Медицинская иммунология», 2004, N3, т.5 (6)  стр.439
  14. Шумаков В.И., Казаков Э.Н., Гуреев С.В., Онищенко Н.А., Остроумов Е.Н., Темнов А.А., Тюняева И.Ю., Крашенинников М.Е.,Васильев К.Н., Сухачев А.А., Хубутия М.Ш., Ильинский И.М. //Аортокоронарное шунтирование и трансплантация аутологичных стволовых клеток  костного мозга в лечении ишемической сердечной недостаточности. // Сборник тезисов общероссийский съезд • v ежегодная конференция общества специалистов по сердечной недостаточности «сердечная недостаточность 2004», Москва 7–9 декабря 2004 г. стр.43
  15. Антониев В.Ф., Матела И.И., Темнов А.А., Нажмудинов И.И. // Повышение эффективности иммунокоррекции методом индивидуального подбора иммунологических препаратов у больных папилломой гортани. //Материалы XVII съезда оторинолагингологов России. г. Нижний Новгород 7-9 июня 2006 г. с. 365.
  16. Темнов А.А., Никольская А.О., Башкина Л.В., Гуреев С.В., Онищенко Н.А., Сухачев А.А., Васильев К.Н. // Предварительная иммунокоррекция и культивирование клеток костного мозга повышают функциональную активность и изменяют фенотипический состав мононуклеарной фракции клеток костного мозга у больных с хронической патологией. // Ежегодная Всероссийская и международная научная конференция «Стволовые клетки и перспективы их использования в здравоохранении»; Москва 30-31мая 2007. стр. 109-110
  17. Шумаков В.И., Казаков Э.Н., Гуреев С.В., Онищенко Н.А., Темнов А.А., Тюняева И.Ю.,  Васильев К.Н.,  Остроумов Е.Н.,  Сухачев А.А.,  Арзуманов В.С., Хубутия А.Ш., Ильинский И.М., Миронков А.Б. //Комплексная оценка результатов трансплантации аутологичных стволовых клеток костного мозга у  кардиохирургических  больных с  сердечной недостаточностью. // Ж. «Бюллетень НЦССХ им.А.Н.Бакулева РАМН», Том 5 №11, ноябрь 2004г. стр. 328
  18. Шумаков В.И., Онищенко Н.А., Темнов А.А., Казаков Э.Н.,  Гуреев С.В., Шевченко О.П., Сускова В.С., Сухачев А.А.,  Хубутия М.Ш., Крашенинников М.Е., Тюняева И.Ю., Васильев К.Н., Остроумов Е.Н. // Связь функциональной  активности стволовых клеток костного мозга с ремоделированием левого желудочка при их трансплантации  кардиохирургическим  больным.//  Ж. «Бюллетень НЦССХ им.А.Н.Бакулева РАМН», Том 5 №11, ноябрь 2004г. стр. 328
  19. Онищенко  Н.А., Поздняков О.М., Темнов А.А., Остроумов Е.Н., Сускова В.С., Гуреев С.В., Казаков Э.Н. // Транспозиция стволовых  и прогениторных  клеток аутологичного костного мозга как способ коррекции патогенетических нарушений при острой и хронической сердечной недостаточностью // Ж. «Бюллетень НЦССХ им.А.Н.Бакулева РАМН», Том 6 №5, ноябрь 2005г. стр. 295.
  20. Шумаков В.И., Гуреев С.В., Казаков Э.Н. Онищенко Н.А., Сухачев А.А., Васильев К.Н., Темнов А.А., Остроумов Е.Н.  //Трансплантация аутологичных стволовых клеток костного мозга для лечения хронической сердечной недостаточности.// Ж. «Бюллетень НЦССХ им.А.Н.Бакулева РАМН», Том 6 №5, ноябрь 2005г. стр. 296.
  21. А.А.Темнов, С.В.Гуреев, Н.А.Онищенко, В.И.Шумаков // Контролируемая иммунокоррекция больного и последующая активирование мононуклеранных клеток костного мозга, улучшает функцию миокарда при хронической ишемической сердечной недостаточности // Ж. «Клеточная трансплантология и тканевая инженерия.» т.2, №1, 2007, стр. 65-73.
  22. Темнов А.А., Габриэлян Н.И., Никольская А.О., Савостьянова О.А., Сускова В.С., Онищенко Н.А., Гуреев С.В., Васильев К.Н., Сухачев А.А., Сибякина А.А. //Транспозиция культивированных клеток аутологичного костного мозга способствует профилактике и лечению иммунозависимых осложнений у кардиохирургических больных.// Ж. «Патологическая физиология и экспериментальная терапия», №2, 2007, стр.7-9.
  23. Темнов А.А., Онищенко Н.А.// Контроль продукции активных форм кислорода лейкоцитами позволяет прогнозировать устойчивость организма к стрессорному повреждению. //  Ж. «Патологическая физиология и экспериментальная терапия», №2 2007 стр.9-11
  24. Темнов А.А., С.В.Гуреев, Н.А.Онищенко, В.И.Шумаков. // Улучшение ремоделирования и функции миокарда при хирургическом лечение хронической сердечной недостаточности путем двухэтапного повышения иммунорегуляторных резервов клеток аутологичного костного мозга и их интрамиокардиального применения.// Ж. «Вестник РАМН», 2008, №1, стр.3-9
  25. Темнов А.А. Значение взаимосвязи функционального состояния клеток костного мозга и показателей клеточного звена иммунитета у больных с хронической сердечной недостаточностью при проведении терапии аутологичными клетками костного мозга.// Ж. «Вестник трансплантологии и искусственных органов», №1(39), 2008, стр. 37-39
  26. Остроумов Е.Н., Крашенинников М.Е., Гуреев С.В., Темнов А.А., Сухачев А.А., Ермоленко А.Е., Онищенко Н.А. // Визуализация распределения в миокарде  аутологичных стволовых клеток костного мозга при их интракоронарном и интрамиокардиальном введении. // Ж. «Вестник трансплантология и искусственных органов» -2004.-№1.–С.26-29.
  27. Шумаков В.И, Онищенко Н.А., Гуреев С.В., Темнов А.А., Остроумов Е.Н., Васильев К.Н., Сухачев А.А., Никольская А.О., Шумаков Д.В.// Клеточная трансплантация.// Ж. «Вестник трансплантологии и искусственных органов», №4, 2006, стр 94-102.
  28. Шумаков В.И, Остроумов Е.Н., Губенок Т.В., Темнов А.А., Гуреев С.В., Онищенко Н.А., Сускова В.С., Аврамова Н.Н., Казаков Э.Н. // Результаты интракоронарного введения аутологичных клеток костного мозга при диастолической  сердечной недостаточности.// Ж. «Вестник трансплантологии и искусственных органов», №5(37), 2007, стр 3-10.
  29. Шумаков В.И., Онищенко Н.А., Гуреев С.В., Темнов А.А. Глава «Клеточная трансплантология» в «Руководство по трансплантологии» под редакцией В.И.Шумакова. стр.431-457
  30. Хубутия М.Ш., Сускова В.С., Подвальнюк В.В., Темнов А.А., Емец В.И., Ермакова Л.П.Индивидуальный подбор иммунокорректоров у кардиохирургических больных для профилактики инфекционных осложнений в послеоперационном периоде // Ж. «Медицинская иммунология» // 2003, том 5, №3-4, стр.409-410
  31. Хубутия М.Ш., Подвальнюк В.В., Темнов А.А. и др Комплексный подход к оценке адаптационных резервов организма у кардиохирургических больных в дооперационном периоде // Ж. «Вестник трансплантологии и искусственных органов», 2002, №3, стр. 34.
  32. Матёла И.И., Антониев Т.В, Темнов А.А., Темнова В.В.// Индивидуальный подбор иммунокорректоров у больных папилломатозом гортани методом хемилюминисценции.// «Российский медицинский журнал», 2, 2007, стр. 36-39
  33. Никольская А.О., Артамонов С.Д., Темнов А.А., Шахов Н.Л., Новиков В.К., Башкина Д.В. //Взаимосвязь соматического состояния и качества жизни больных сахарным диабетом 1-го типа при трансплантации мононуклеарной фракции клеток аутологичного костного мозга. // Ж. «Вестник трансплантологии и искусственных органов», 2006, №1, с. 51-52.
  34. Сускова В. С., Онищенко Н.А, Шальнев Б.И., Емец В.И., Ермакова Л.П., Сусков С.М., Темнов А.А., Гуреев С.В. //Трансплантация аутологичных стволовых клеток костного мозга у кардиологических больных: иммунофенотипическая и цитокиновая характеристика аутотрансплантатов.// Ж. «Вестник трансплантологии и искусственных органов», №3, 2005 стр.42
  35. Шумаков В.И., Казаков Э.Н., Гуреев С.В., Онищенко Н.А, Остроумов Е.Н., Темнов А.А, Шевченко О.П., Васильев К.Н., Сухачев А.А., Хубутия М.Ш.. Трансплантация аутологических клеток костного мозга как биологический мост к трансплантации сердца. \\ Ж. «Вестник трансплантологии и искусственных органов», №3, 2005, стр.10
  36. V.I. Shumakov, S.V. Gureev, A.A. Temnov, N.A. Onishenko, // BONE MARROW MONONUCLEAR CELLS ACTIVATED CONSECUTIVELY IN VIVO AND EX VIVO IMPROVE MYOCARDIAL FUNCTION IN ISCHEMIC HEART FAILURE // 13th World congress on Heart Disease , international academy of cardiology annual scientific sessions 2007, Vancouver, B.C., Canada, July 28-31, 2007
    Institute of Transplantology and Artificial Organs, Moscow, Russia
  37. Шумаков В.И., Казаков Э.Н., Гуреев С.В., Онищенко Н.А., Темнов А.А. и др.  Трансплантация аутологичных стволовых клеток костного мозга для восстановления функции поврежденного миокарда// 1-я международная конференция “Альтернативные методы реваскуляризации миокарда”. Москва, Научный центр ССХ им. А.Н.Бакулева,  5 апреля 2004.

патенты:

  1. Патент «Способ лечения хронических заболеваний (варианты), способ получения биотрансплантата (варианты), биотрансплантат (варианты).» Подан 09.02.2006 рег. Номер №2006103865. Положительное решение о выдаче патента 03.08.2007
  2. Патент «Способ профилактики и лечения иммунозависимых осложнений у кардиохирургических больных в послеоперационном периоде». Подан 17.10.2006 Рег.номер№ 2006136463 Положительное решение о выдаче патента 03.12.2007
  3. Патент «Способ лечения больных с хронической сердечной недостаточностью» Подан 17.10.2006 Рег.номер№ 2006136466 Положительное решение о выдаче патента 28.09.2007
  4. Патент «Способ прогнозирования устойчивости организма к стрессорному воздействию» Подан 8.11.2006 Рег.номер№ 2006139185 Положительное решение о выдаче патента 29.08.2007
  5. Патент «Способ индивидуального подбора иммунокорригирующих препаратов у больных папилломатозом гортани». Подан 27.04.2006 рег номер № 2006114325 Положительное решение о выдаче патента 7.05.2007



© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.