WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

 

На правах рукописи

СУГЛОБОВА ЕЛЕНА ДМИТРИЕВНА

КИНЕТИЧЕСКИЙ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЙ ПОДХОД К ОЦЕНКЕ

КАЧЕСТВА КЛЕТОЧНЫХ МЕМБРАН  У БОЛЬНЫХ

ХРОНИЧЕСКОЙ ПОЧЕЧНОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТЬЮ, ПОЛУЧАЮЩИХ ЛЕЧЕНИЕ  ГЕМОДИАЛИЗОМ

14.00.46 – клиническая лабораторная диагностика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

                                                       

Санкт-Петербург

2007 г.

       Работа выполнена в Научно-исследовательском институте нефрологии Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова» ФАЗСР.

Научный консультант:

доктор медицинских наук

профессор  Эмануэль Владимир Леонидович

ГОУ ВПО «СПбГМУ им. акад. И.П. Павлова» ФАЗСР

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук  Зыбина Наталья Николаевна

ФГУЗ «ВЦЭРМ им. А.М. Никифорова» МЧС России

доктор биологических наук

профессор Арутюнян Александр Вартанович

ГУ «НИИАГ им. Д.О. Отта» РАМН

доктор медицинских наук

профессор  Арьев Александр Леонидович

ГУ ДПО «СПбМАПО» ФАЗСР

Ведущая организация: Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова» МО РФ

Защита состоится  «11» октября 2007 г. в «…..» часов на заседании диссертационного совета Д 205.001.01 при Федеральном государственном учреждении здравоохранения «Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины им. А.М. Никифорова» МЧС России (194044, Санкт-Петербург, ул. Лебедева, 4/2).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного учреждения здравоохранения «Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины им. А.М. Никифорова» МЧС России по адресу: 194044, Санкт-Петербург, ул. Лебедева, 4/2.

Автореферат разослан «….»___________ 2007 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета С.С. Алексанин

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Гемодиализ как способ сохранения и, следовательно, организации жизни стал объективной реальностью для многих тысяч больных с терминальной стадией хронической почечной недостаточности (ХПН). Современный комплекс детоксикационной заместительной почечной терапии дает возможность продолжительной (в среднем до 10 – 12 лет) жизни пациентов даже без проведения трансплантации [Спиридонов В.Н. и др., 2005]. Известно, что экскреторная функция почек моделируется гемодиализом достаточно качественно, но имитировать инкреторный путь в полной мере не удается, что приводит к дальнейшему прогрессированию осложнений ХПН [Руководство по диализу, 2003]. Кроме того, и сам гемодиализ становится причиной целого перечня плохо корригируемых состояний [Vanholder R.C. et al., 2003]. Так, например, нарушения гемодинамики и электролитного баланса приводят к прогрессированию сердечно-сосудистых заболеваний [Descamps-Latscha B. et al., 2000; London G.M. et al., 2003; Marco M.P. et al., 2003; Zoccali C. et al., 2003]; кровопотери в ходе самой процедуры гемодиализа и при отключении аппарата «искусственная почка» усугубляют эритропоэтин-дефицитную анемию [Besarab A. et al., 2000; Locatelli F. et al., 2003; Добронравов В.А., Смирнов А.В., 2005]; постоянный контакт элементов крови с чужеродной поверхностью усиливает микровоспаление [Fernandez-Reyes M.J. et al., 2002; Bellomo G. et al., 2003; Liu Y. et al., 2004]; недостаточное выведение фосфатов провоцирует нарушения минерального обмена [Block G.A. et al., 1998; Lindsay R.M. et al., 2003] и т.д.

В такой ситуации для оценки качества медицинской помощи и адекватного ведения больных весьма актуальным является мониторинг, с одной стороны, всех технических систем диализа, а с другой стороны – клинических и клинико-лабораторных показателей пациентов. Среди последних широко представлены концентрационные величины, являющиеся маркерами эндогенной интоксикации, электролитной дисфункции, патологий белкового и липидного обменов; есть также расчетные величины, в основном описывающие очистку в ходе диализной сессии. При этом показатели, характеризующие качество клеточных мембран пациентов, получающих лечение хроническим гемодиализом, в данном перечне фактически отсутствуют. В то же время в работах, связанных с изучением ренальной патологии, все большее внимание уделяется проблемам эндотелиальной дисфункции как одной из основных причин возникновения и прогрессирования хронической болезни почек (ХБП) вплоть до терминальной стадии [Paisley K.E. et al., 2003; Annuk M. et al., 2003; Панина И.Ю., 2006]. Эндотелиальная дисфункция – это вариант «мембранной болезни», и именно поэтому мониторинг состояния мембранных систем из разряда желаемых перешел в ранг необходимых.

       Как любой диагностический метод, оценка качества плазматической мембраны должна быть не слишком сложна при выполнении. Очевидной обязательной моделью исследования оказываются эритроциты как наиболее доступные клеточные объекты у здоровых лиц и у больных ХПН, получающих заместительную почечную терапию хроническим гемодиализом.

       Для оценки общей резистентности мембран эритроцитов, как правило, используются кислотный гемолиз эритроцитов по И.А.Терскову – И.И.Гительзону [1957] и осмотический гемолиз по Л.И.Идельсону [Медицинские и лабораторные технологии, 1998].

Однако по своему механизму методы определения общей резистентности не вполне отвечают требованиям биофизического теста качества клеточных мембран больных, получающих регулярный гемодиализ, поскольку время кислотного гемолиза скорее говорит о способности поверхностных мембранных сайтов к протонированию с дальнейшей денатурацией [Трикуленко А.В., Пинишко У.В., 1999], чем о состоянии билипидного слоя, а осмотическая резистентность прежде всего зависит от условий ультрафильтрации, т.е. от количества и скорости переноса воды через мембрану [Candan F. et al., 2002; Kovacic V. et al., 2003]. Эти методы не отражают изменения разграничительной и транспортной функций мембран, происходящие при персистировании перекисного окисления липидов (ПОЛ), выделяемого в качестве одной из основных причин прогрессирования ХБП [Dasgupta A. et al., 1992; Canestrari F. et al., 1995; Bayes B. et al., 2003; de Gomez Dumm N.T. et al., 2003]. Не вполне пригодны для использования в целях характеристики функционирования мембран и чисто аналитический подход с выделением отдельных компонентов – продуктов деградации фосфолипидов, например, малонового диальдегида эритроцитов, или изолированное определение активности отдельных ферментативных систем [Mimic-Oka J. et al., 1995; Zima T. et al., 1996; Miyata T. et al., 2000; Ozden M. et al., 2002; Soejima A. et al., 2002; Vaziri N.D. et al., 2003]: в процессе адаптации к хроническому гемодиализу изменения, которым подвержены белковые или липидные соединения, могут привести к значимым отличиям свойств последних по сравнению со свойствами здоровых лиц, однако при этом при рассмотрении мембраны как целого ее компартментализующие качества будут лучше отвечать новому состоянию организма пациента.

Таким образом, описание свойств мембран в исключительно непопуляционной ситуации, в условиях необычной «искусственной» жизни, каковой и является хронический гемодиализ, требует использования нестандартных параметров оценки.

По теории А.А.Болдырева [1992], основой существования клеточных структур в смысле маркерной характеристики их целостности является градиент макронеорганических катионов в различных компартментах. Именно неправильное, патологическое распределение макронеорганических ионов в значительной мере определяет состояние организма пациента гемодиализа как макроструктуры [Flanigan M.J., 2000]. Поскольку компартментализация – фундаментальный процесс, протекающий в соответствии с законами неравновесной термодинамики, можно утверждать, что метаболизм мембранных систем полностью определяет гомеостаз организма [Структура и функции биологических мембран, 1975; Геннис Р., 1997]. В рамках представления о функционировании мембраны как единого целого тема настоящего исследования актуальна.

Цель исследования. На основе разработанного кинетического физико-химического (ионометрического) подхода выявить наиболее значимые клинико-лабораторные электролитные характеристики состояния клеточных мембран для создания системы оценки их состояния у больных хронической почечной недостаточностью, получающих лечение регулярным гемодиализом.

Задачи исследования:

1. Адаптировать ионометрические методики к измерению концентрации электролитов в динамике в модельных и нативных биологических жидкостях.

2. Обосновать физико-химический подход к оценке резистентности эритроцитарной мембраны человека к внешнему действию каналоформера.

3. Выявить информативные биофизические показатели резистентности, характеризующие состояние функционирующей плазматической мембраны эритроцита.

4. Сравнить резистентность эритроцитарных мембран к внешнему действию каналоформера полиенового антибиотика нистатина у здоровых лиц и у больных ХПН, получающих заместительную почечную терапию регулярным гемодиализом.

5. Изучить влияние эффекторов (специфического ингибитора Na,K-АТФ-азы уабаина, стимулятора эритропоэза пептидного гормона эритропоэтина, компонентов аутологичной плазмы крови) на показатели резистентности эритроцитов пациентов гемодиализа к внешнему действию нистатина.

6. Проанализировать корреляционные взаимосвязи между резистентностью к действию каналоформера, кислотной и осмотической резистентностью эритроцитов и клинико-лабораторными показателями у больных, получающих лечение регулярным гемодиализом.

7. Изучить состояние мембран эритроцитов больных ХПН на разных стадиях терапии хроническим гемодиализом.

8. Построить модели состояния больных «до диализа – после диализа», применяя метод статусметрии.

Научная новизна и теоретическая значимость исследования. Обоснован новый физико-химический подход к оценке качества плазматической мембраны эритроцитов человека. Разработан оригинальный биофизический эксперимент, позволяющий по изменению внеклеточной электролитной концентрации охарактеризовать суммарный процесс, протекающий при образовании в эритроцитарных мембранах неселективных гидрофильных нистатиновых каналов. Предложены пути разделения указанного интегрального процесса на отдельные составляющие, отвечающие различным стадиям резистентного ответа клеточной мембраны на внешнее воздействие каналоформера.

Установлено, что скорость взаимодействия нистатина с мембранными структурами эритроцитов человека весьма высока: за первые четыре минуты после его внесения в рабочую пробу с мембраной связывается до 96% от общего количества полиенового антибиотика.

Показана высокая степень зависимости стабильности мембраны в целом от состава внеклеточных изотоничных сред.

Предложен способ определения вклада инактивации нистатиновых каналов (self-treatment) в суммарный ответ мембраны эритроцита на внешнюю агрессию каналоформера.

Для динамического контроля внеклеточных ионных концентраций в минимизированных пробах биологических жидкостей наряду с миниионселективными электродами, снабженными мембранами специально подобранного состава, применены ионселективные полевые транзисторы (ИСПТ) с фотополимеризуемыми полиуретановыми валиномицинсодержащими мембранами.

Разработан новый способ оценки состояния билипидного слоя мембраны эритроцита – обобщенный показатель «интегральный нормированный выход калия» при использовании нистатина в качестве мембраноактивного агента. Выявлены достоверные различия данного параметра у пациентов хронического гемодиализа по сравнению с группой лиц без ренальной патологии.

Показано, что интегральный нормированный выход калия, характеризуя качество эритроцитарных мембран у больных, получающих заместительную терапию регулярным гемодиализом, не коррелирует с традиционными показателями кислотного, осмотического и ультразвукового гемолиза.

На основе проведения длительного (многолетнего) мониторинга состояния мембран эритроцитов у пациентов хронического гемодиализа с использованием показателя «интегральный нормированный выход калия» обнаружено, что в первые полтора-два года регулярных сеансов при адекватном ведении больных состояние эритроцитарных мембран не претерпевает существенных изменений, а в последующие два-три года даже достоверно улучшается.

Созданы модели классификаций состояний межгрупповых сравнений пациентов «до диализа – после диализа». Установлено, что показатели очистки наиболее информативны в начальный период лечения регулярным гемодиализом; в дальнейшем большее значение приобретают характеристики резистентности клеточных мембран.

Практическая значимость работы. Разработан новый лабораторный метод исследования клеточных эритроцитарных мембран, позволяющий не только определить их качество, но и оценить влияние различных эффекторов. Обосновано применение различных методов определения резистентности мембран (кислотной, осмотической, ультразвуковой и резистентности к внешнему действию каналоформера) для их характеристики.

Показана целесообразность мониторинга состояния клеточных мембран пациентов гемодиализа, а также необходимость мембранной протекции в начале лечения регулярным гемодиализом. Продемонстрирована принципиальная возможность построения моделей состояния пациентов «до диализа – после диализа» методом статусметрии, выявивших наиболее важную роль характеристик качества мембран в третий-четвертый год гемодиализной терапии.

Положения, выносимые на защиту:

  1. Ионометрия является доступным и адекватным методом определения интегральных изменений содержания ионов (K+ и Na+) во внеклеточной среде суспензии эритроцитов человека при действии на них каналоформера – полиенового антибиотика нистатина. При этом для проб минимизированного объема наиболее удобным и предпочтительным является применение датчиков, выполненных на основе ионселективных полевых транзисторов.
  2. При взаимодействии неселективного каналоформера с плазматической мембраной эритроцита человека реализуется совокупность быстрых и медленных процессов, включающая функционирование активного транспорта и инактивацию ионных каналов (self-treatment), суммарный эффект которых может быть охарактеризован как резистентность по отношению к внешней агрессии нистатина.
  3. Оптимальной характеристикой ответа на воздействие каналоформера нистатина на эритроцитарную мембрану является «интегральный нормированный выход калия». Данная величина представляет собой суммарное изменение внеклеточной ионной нормированной концентрации за определенный отрезок времени: в первые минуты после начала каналообразования для оценки быстрых процессов и в более отдаленные временные интервалы для описания области стабилизации кинетических зависимостей.
  4. Интегральный нормированный выход калия из эритроцитов у больных ХПН, получающих заместительную почечную терапию хроническим гемодиализом, достоверно выше, чем у здоровых лиц. При этом у пациентов гемодиализа, как и у людей без ренальной патологии, аутологичная плазма оказывает стабилизирующее влияние на плазматическую мембрану. В то же время для эритроцитов больных, получающих лечение гемодиализом, результаты применения других эффекторов – уабаина и эритропоэтина – необычны. Уабаин, являясь специфическим ингибитором Na+,K+-АТФазы, оказывает парадоксальное мембранопротекторное действие, уменьшая интегральный нормированный выход калия, а эриропоэтин – традиционный стимулятор эритропоэза – в больших концентрациях значительно повышает данный показатель.
  5. Показатели резистентности к внешнему действию каналоформера не коррелируют с показателями кислотной, осмотической и ультразвуковой устойчивости эритроцитов, а при факторном анализе они входят в состав разных главных компонент, что позволяет говорить о принципиальном различии указанных параметров. Правомерность данного положения подтверждается неизменностью интегрального нормированного выхода калия и изменением осмотической резистентности эритроцитов при ведении больных на низкокальциевом гемодиализе.
  6. Величины различных типов резистентности эритроцитарных мембран не меняются в начальный период лечения больных ХПН регулярным гемодиализом. В дальнейшем, по прошествии 6-7 лет адекватной заместительной почечной терапии хроническим диализом, наблюдается положительная динамика устойчивости плазматических мембран клеток к внешним воздействиям.
  7. Статусметрический анализ комплекса клинических, клинико-лабораторных и биофизических данных пациентов гемодиализа позволяет выделить наиболее информативные показатели при построении моделей состояния больных «до диализа – после диализа». Наряду с характеристиками очистки к ним относятся величины резистентности клеточных мембран. Наибольшие различия в состоянии пациентов до и после сессии фиксируются в третий-четвертый год лечения регулярным гемодиализом.

Апробация. По материалам диссертации опубликовано 37 работ, в том числе 15 – в центральных журналах, рекомендованных ВАК.

Результаты исследования доложены на Рабочем совещании главных нефрологов и заведующих отделениями хронического гемодиализа «Диализное лечение больных с ХПН» (Санкт-Петербург, 1995), 4-ой Конференции нефрологов Северо-запада России «Проблемы ХПН» (Иматра, 1995), Рабочем совещании нефрологов Северо-запада России «Нефрология» (Санкт-Петербург, 1996), Научной конференции, посвященной 100-летию кафедры биохимии СПбГМУ им. акад. И.П.Павлова «Фундаментальные и прикладные аспекты современной биохимии» (Санкт-Петербург, 1998), 9-ой Всероссийской конференции по физиологии и патологии почек и водно-солевого обмена (Санкт-Петербург, 2001), Всероссийской научно-практической конференции «Нефрология и диализ» (Санкт-Петербург, 2003), Всероссийской научно-практической конференции «Болезни почек: эпидемиология, диагностика, лечение» (Кызыл, 2004), Научно-практической конференции, посвященной 10-летию медицинского факультета «Нефрология в XXI веке» (Санкт-Петербург, 2005), IV Конференции РДО (Санкт-Петербург, 2005).

Структура диссертации. Диссертация изложена на 312 страницах машинописного текста и состоит из введения, четырех глав, выводов, списка цитируемой литературы, включающего 133 отечественных и 362 иностранных источника, и приложения. Работа иллюстрирована 50 таблицами и 36 рисунками.

Содержание исследования

Ионометрическое определение концентраций электролитов в биологических средах в динамике

       Для определения концентрации ионов во внеклеточной среде использовали особые ионселективные мини-электроды (ИСЭ) с полимерными и силикатными мембранами, а также специфические, разработанные специально для исследования датчики – ионселективные полевые транзисторы с фотополимеризуемой валиномицин-содержащей полиуретановой мембраной (ИСПТ). Диаметр Na+, K+, Ca2+ и pH-метрических ИСЭ составлял 4 мм, а рабочая площадь поверхности ИСПТ не превышала 2,5 мм2.

       Для изготовления K+-селективных ИСПТ применяли уретандиакрилатную матрицу, пластифицированную диоктилсебацинатом; активными компонентами служили тетрахлорфенилборат калия и валиномицин. Герметизацию датчиков проводили тем же уретандиакрилатом.

       Все сенсоры калибровали по оригинальным, специально разработанным системам смешанных растворов; при этом угол наклона калибровочной прямой для ИСПТ был несколько ниже, чем для K+-ИСЭ, однако в области физиологических концентраций составлял не менее 52-53 мВ. Качество K+-ИСПТ оценивали также при параллельных сравнительных определениях концентрации калия в пробах диализирующего раствора, плазмы крови пациентов диализа. Референтными служили полимерные K+-ИСЭ и валиномицин-содержащие сенсоры анализатора-ионометра Fresenius EF.

       Отклик ИСЭ и ИСПТ как потенциометрических датчиков описывается уравнением Никольского:

где Е – э.д.с. гальванического элемента, Е0 – стандартный электродный потенциал, R – универсальная газовая постоянная, T – абсолютная температура, Z – заряд иона, F – постоянная Фарадея, Сi – концентрация определяемого иона, CS – концентрация мешающего иона, Ki-S – коэффициент селективности. В опытах контролировали эффект мешающих электролитов на выполнение электродной функции и учитывали влияние всех используемых в эксперименте агентов на стандартный электродный потенциал (Е0).

Уабаин, сапонин и эритропоэтин в применяемых концентрациях не оказывали влияния ни на полимерные, ни на стеклянные ИСЭ. Органический растворитель диметилформамид (ДМФА) в момент внесения его в пробу (0,1мл на 5,4мл пробы) смещал абсолютные значения потенциала K+- и Ca2+ пленочных электродов на 1,5-2 мВ в сторону уменьшения (то есть виртуально увеличивал числа переноса анионов) с последующим возвращением к исходным значениям в течение 5-10 с. При этом угловой коэффициент функции датчиков, селективных как к одно-, так и к двухзарядным ионам, практически не изменялся и составлял 59,3±0,4 и 28,9±0,3 мВ соответственно при 370С. Раствор нистатина в ДМФА действовал на сенсоры аналогичным образом.

Возможность определения концентраций ионов в плазме и сыворотке крови, а также в цельной крови была подтверждена методом стандартных добавок [Лакшминараянайах Н., 1979; Камман К., 1980]. В эксперименте для титрования были использованы как концентрированные, так и достаточно разбавленные растворы хлоридов (0,5 М и 0,05М KCl, 0,3 М и 0,01М NaCl).

Взаимодействие каналоформера нистатина с плазматическими мембранами эритроцитов человека

Разработка экспериментального подхода к мониторингу проницаемости мембран эритроцитов человека

       В кинетических экспериментах с эритроцитами здоровых лиц рабочая проба представляла собой суспензию отмытых от плазмы крови солевым раствором эритроцитов в солевых же растворах Тироде или Моргана [Cumberbatch M. et al., 1981], состав которых был несколько модифицирован (табл. 1). В некоторых экспериментах клетки были ресуспендированы с добавлением аутологичной плазмы крови.

                                                                                       Таблица 1

Составы растворов Тироде и Моргана

Состав раствора, ммоль/л

Раствор Тироде (рН=7,0)

Раствор Моргана (рН=7,34)

KCl

4

5

NaCl

141

104

NaHCO3

-

25

Na2HPO4

-

5

NaH2PO4

-

3.5

CaCl2

2

2

MgCl2

3

3

Глюкоза

10

10

Сахароза

-

27

Осмолярность, мосм/л

240

270

Эритроциты от плазмы отделяли однократным центрифугированием (3000 об/мин, 10 мин, 4°С), затем отмывали подряд три раза солевым раствором Моргана либо Тироде. Отмытые эритроциты вносили в ячейку, туда же добавляли солевые растворы Моргана или Тироде, а в части опытов – плазму крови. Объемы вносимых в ячейку эритроцитарной массы и соответствующего типу эксперимента солевого раствора либо плазмы в большинстве опытов составляли 4,5 и 0,9 мл, а иногда – 2,25 и 3,15 мл соответственно.

Общая схема экспериментальной установки представлена на рис. 1.

Рис. 1. Установка для регистрации внеклеточных концентраций Na+ и К+. 1 - фторопластовые ячейки; 2 – Na+ электрод; 3 - К+ сенсор; 4 - электролитические мостики, заполненные 1 М NН4NОЗ; 5 – насыщенный раствор КС1; 6 – электрод сравнения; 7 – 1 М NH4NОЗ; 8 – термостат с шейкером; 9 – электролитический мостик, заполненный насыщенным раствором КСl; 10 – суспензия эритроцитов (рабочая проба); 11 – коммутатор; 12 – иономер; 13 – самопишущий потенциометр.

       

       При работе с эритроцитами пациентов гемодиализа пробы были минимизированы, при этом в качестве датчиков использовали ионселективные полевые транзисторы.

       Реагенты уабаин (Fluka) и эритропоэтин (Boeringer Manheim) в виде водных растворов вносили в пробы через отверстия в крышках ячеек.

       Каналообразующим агентом служил нистатин. Его натриевую соль производства ВНИИ антибиотиков и ферментов медицинского назначения растворяли в ДМФА и 0,1 мл полученного раствора добавляли в пробу.

Для создания "равновесных" концентраций Na+ и К+ вне и внутри клеток в конце опыта использовали сапонин (Merck), 0,1 мл водного раствора которого в концентрации 40 мг сухого вещества на 1 мл дистиллированной воды вызывал лизис эритроцитов в пробе.

Динамика внеклеточных концентраций Na+ и K+ при модификации мембран эритроцитов нистатином

       В предварительных экспериментах было показано, что утечка ионов Na+ и K+ в направлении градиентов их концентраций через эритроцитарную мембрану в отсутствие ее модификаций незначительна и активность противоградиентного переноса ионов также чрезвычайно низка. При применении нистатина для провокации мембранных ионтранспортирующих систем было необходимо определить его оптимальную концентрацию в пробах, при  которой изменения трансмембранного градиента содержания ионов были бы заметны, но при этом не происходила бы тотальная перфорация мембраны с нарушением билипидного слоя и последующим быстрым лизисом.

       Результаты экспериментов при воздействии нистатина в различных его концентрациях на плазматические мембраны эритроцитов представлены на рис. 2 и 3. Как следует из приведенных данных, оптимальные для определения характеристик резистентности эритроцитарных мембран к внешнему воздействию антибиотика концентрации нистатина находятся в интервале 0,105 – 0,526 мг/мл внеклеточной жидкости (1,11·10-4 М - 5,56·10-4 М).

Рис. 2. Влияние концентрации нистатина на внеклеточную концентрацию K+ в суспензии эритроцитов человека в растворе Тироде.

По оси ординат: (CtK+- CtK+), где CtK+ - внеклеточная концентрация иона в пробе в момент времени t; CtK+ - разница между внеклеточной концентрацией иона в контрольной пробе в момент времени t и внеклеточной концентрацией иона в контрольной пробе в начальный момент времени.

По оси абсцисс: время (мин) с момента добавления нистатина в пробу.

Стрелкой указан момент внесения сапонина в пробу.

Концентрация нистатина в пробе:

1 – 0,026 мг/мл (2,78·10-5 М); 4 – 0,263 мг/мл (2,78·10-4 М);

2 – 0,053 мг/мл (5,56·10-5 М); 5 – 0,526 мг/мл (5,56·10-4 М);

3 – 0,105 мг/мл (1,11·10-4 М); 6 – 0,789 мг/мл (8,34·10-4 М).

Следует особо обратить внимание на форму полученных кинетических кривых. При средних и высоких концентрациях нистатина во внеклеточной жидкости первоначально наблюдалось достаточно быстрое увеличение внеклеточной концентрации K+ и уменьшение концентрации Na+. Однако через 30-40 минут после внесения каналоформера в пробу кинетические зависимости ионных концентраций достигали некоторого стационарного уровня. Этот уровень был тем выше для (CtK+ - CtK+) и, соответственно, тем ниже для (CtNa+ + CtNa+), чем выше было содержание каналоформера в пробе. При последующем тотальном лизисе под действием сапонина скачок ионной концентрации до «равновесного» значения был тем меньше, чем больше нистатина взаимодействовало с эритроцитами.

Причиной возникновения протяженного стационарного участка кинетической кривой могло быть компенсаторное действие трансмембранного ионного переноса, осуществляемого Na+,К+-АТФазой. Для проверки этого предположения была произведена предварительная инкубация эритроцитов со специфическим ингибитором фермента уабаином. Однако, как это показано на рис. 4, при ресуспендировании отмытых клеток и в растворе Тироде, и в растворе Моргана при предварительном воздействии уабаина стационарный участок на кинетических зависимостях сохранялся. При условии, что нистатин быстро взаимодействует с клеточными мембранами (табл. 2) возникновение стационарного состояния при движении ионов в соответствии с градиентами их концентраций возможно только при инактивации сформированных гидрофильных каналов. Подобный репаративный процесс (self-treatment) был предсказан D.C. Tosteson et al. [1985] для бислойных фосфолипидных мембран, а затем был продемонстрирован А.А. Львом и Л.В. Щагиной [1989] на примере холестерин-содержащих мембран эритроцитов. Процесс «self-treatment» происходит в основном за счет латеральной диффузии и возможен, если нарушения целостности мембраны эритроцита не превышают одной ячейки спектрин-актиновой сети.

Рис. 3. Влияние различных концентраций нистатина на внеклеточную концентрацию Na+ в суспензии эритроцитов человека в растворе Тироде.

По оси ординат: (CtNa+ + CtNa+), где CtNa+ – внеклеточная концентрация иона в пробе в момент времени t; CtNa+ – разница между внеклеточной концентрацией иона в контрольной пробе в момент времени t и внеклеточной концентрацией иона в контрольной пробе в начальный момент времени.

По оси абсцисс: время (мин.) с момента добавления нистатина в пробу.

Стрелкой указан момент внесения сапонина в пробу.

Концентрации нистатина в пробе: те же, что и на рис. 2.

Рис. 4. Динамика внеклеточной концентрации K+ при действии нистатина в концентрации 2,78·10-4M (0,263 мг/мл) на  ресуспендированные в растворах Тироде (кривые 1 и 2) и Моргана  (кривые 3 и 4) эритроциты человека, предварительно инкубированные с 5,62·10-4M (0,41 мг/мл) уабаином  (кривые 2 и 4) и без уабаина (кривые 1 и 3).

Обозначения по осям абсцисс и ординат те же, что и на рис. 2.

Нистатин внесен в пробу в момент времени t=0. Доверительные 95%-ые интервалы не превышают 4% от средних значений.

Таблица 2

Связывание  нистатина с мембранами эритроцитов человека

Время, мин.

Количество нистатина, связанного с мембраной (% от общего количества, внесённого в пробу)

0

0

2

88±2

4

89±2

8

96±1

15

97±3

30

97±2

60

97±2

Примечание:  Начальная концентрация нистатина во внеклеточной среде  –  2,78·10-4M (0,263 мг/мл). Отсчет времени – от момента внесения нистатина в суспензию эритроцитов.

Оценить интенсивность резистентного ответа фосфолипидного двойного слоя по отношению к внешнему действию каналоформера позволяет применение модели одномерной диффузии. По скорости изменения внеклеточной ионной концентрации можно рассчитать коэффициент диффузии K+ (или Na+) через мембрану эритроцита по нистатиновым каналам (рис. 5). Наибольшая его величина соответствует состоянию, когда облегченному направленному трансмембранному переносу ионов ничто не препятствует. При решении обратной задачи, считая указанную наибольшую величину коэффициента диффузии постоянной, можно получить теоретическую кинетическую зависимость концентрации K+, характеризующую процесс в отсутствие резистентного ответа мембраны. Отношение расчетной ионной концентрации к экспериментальной в какой-либо момент времени t определяет интенсивность противодействия внешней агрессии антибиотика. Следует отметить, что резистентность мембран тем выше, чем более физиологичной оказывается среда ресуспендирования.

Рис. 5. Теоретические (1 и 3) и экспериментальные (2 и 4) кривые  зависимости внеклеточной концентрации К+ в присутствии 2,78·10-4 M (0,263 мг/мл) нистатина при инкубации суспензии эритроцитов в растворах Тироде (кривые 1 и 2) и Моргана (кривые 3 и 4).

По оси абсцисс: время (мин.). По оси ординат: CtK+ – внеклеточная концентрация K+. Доверительные 95%-интервалы не превышают 4% от средних значений.

При изучении действия каналоформера на эритроциты, отмытые раствором Моргана и ресуспендированные в аутологичной плазме, были получены кинетические кривые, оказавшиеся весьма индивидуальными для каждого образца донорской крови. Однако в целом можно выделить два основных типа зависимостей, которые условно были обозначены как «инверсионный» и «неинверсионный» (рис. 6). «Неинверсионный» ответ на действие каналоформера, как в случае предварительной инкубации с уабаином, так и без нее характеризовался сглаженными кинетическими кривыми, демонстрирующими монотонное возрастание концентрации K+ во внеклеточной среде. Хотя при сравнении результатов измерений для разных доноров различия между «уабаиновыми» и «безуабаиновыми» ячейками значительно варьировали в диапазоне от нескольких десятых до 25-30 ммоль/л, все же, как правило, при использовании уабаина значения СtК+ были выше.

Ответ «инверсионного» типа встречался достоверно реже: из 39 доноров – лишь у 9-ти человек (2 =17,52; p = 0,0001).

Рис. 6. Динамика внеклеточных концентраций K­+ при действии уабаина и нистатина на эритроциты человека, ресуспендированные в аутологичной плазме:

а – зависимость «неинверсионного» типа; б – зависимость «инверсионного» типа.

По оси абсцисс – время, мин. По оси ординат – СtК+ – внеклеточная концентрация K+ в суспензии в момент времени t. Отсчет времени – от момента внесения нистатина в суспензию. Начальные концентрации нистатина и уабаина в суспензии 5,56·10-4 M (0,526 мг/мл) и 7,12·10-3 М (5,20 мг/мл) соответственно. Доверительные 95%-ные интервалы не превышают 4% от средних значений.

1 – без уабаина; 2 – с уабаином.

       

Следует отметить, что при всем разнообразии полученных кинетических кривых в «инверсионном» варианте для «безуабаиновых ячеек» в координатах «концентрация K+ – время» четко наблюдался максимум концентрации K+, а при наличии в пробе ингибитора Na+, K+-АТФазы он отсутствовал. И высота пика концентрационной кинетической кривой, и скорость уменьшения внеклеточной ионной концентрации, наблюдающиеся после достижения максимума, индивидуальны для разных доноров; наибольшая внеклеточная концентрация K+, зафиксированная при концентрации нистатина во внеклеточной среде 0,526 мг/мл, составила 60 ммоль/л.

При сравнительном изучении резистентности эритроцитов, ресуспендированных в солевом растворе и в аутологичной плазме, к внешнему воздействию каналоформера было обнаружено, что концентрация K+, соответствующая положению квазистационарного состояния в ячейках с солевым раствором, примерно в 2-2,5 раза превышала аналогичный концентрационный уровень в ячейках с нативной средой. При этом взаимное расположение квазистационарных концентрационных уровней не зависело от типа ответа на действие антибиотика. Вероятно, различные типы отклика на внешнее воздействие каналоформера на эритроцитарную мембрану при ресуспендировании отмытых клеток в нативной среде обитания – аутологичной плазме – демонстрируют различную степень активации Na+, K+-АТФазы. Если процессу выхода K+ из эритроцитов ничего не препятствует, концентрация  этого иона во внеклеточной среде должна  непрерывно возрастать. Поэтому при ингибировании транспортного фермента Na+, K+-АТФазы уабаином, когда главные барьеры для выхода калия из эритроцита сняты, концентрация K+ монотонно увеличивается. В ячейке без ингибитора противоградиентное перемещение ионов приводит к двукратному уменьшению внеклеточной концентрации K+. При «неинверсионном» типе кинетической кривой подобное противодействие утечке ионов по сформированным нистатиновым каналам, по всей видимости,  выражено значительно слабее.  В целом же стабилизирующая роль нативной среды в отношении плазматической мембраны эритроцитов доноров весьма значительна.

Таким образом, разработанный эксперимент с использованием в качестве датчиков ионселективных электродов и ИСПТ позволяет оценить резистентность эритроцитарной мембраны по отношению к внешнему воздействию каналоформера.

Резистентность к внешнему действию нистатина как характеристика мембран эритроцитов больных ХПН, получающих лечение регулярным гемодиализом

Группы пациентов

При изучении резистентности эритроцитов по отношению к внешнему воздействию каналоформера обследовали группу из 147 человек, получавших заместительную терапию регулярным гемодиализом. Контрольной группой служили 24 здоровых добровольца. По возрастному и половому составу исследуемая и контрольная группы достоверно не отличались друг от друга.

       В исследуемой группе у 121 человека в качестве основной патологии был диагностирован хронический гломерулонефрит, у 3 человек – первичный хронический пиелонефрит, у 12 человек – диабетический нефросклероз, у 5 человек – поликистоз почек и вторичный пиелонефрит, и еще у 4 человек – прочие заболевания почек.

       Сеансы стандартного бикарбонатного гемодиализа выполнялись на аппаратах «искусственная почка» Fresenius 4008B и 4008H, Braun HD-Secura A, Hospal Integra и Bellco Formula 2000 с применением полисульфоновых полиметилметакрилатных диализаторов и диализаторов с мембраной из модифицированной целлюлозы площадью 1,3–1,8 м2. Скорость потока крови составляла в среднем 300 мл/мин, диализирующего раствора – 500 мл/мин. Сеансы проводились 3 раза в неделю по 4-4,5 часа. Количество полученных сеансов колебалось от 3 до 2580 и составляло в среднем 560,5±49,4.

       При изучении влияния аутологичной плазмы на резистентность мембран эритроцитов при действии на них нистатина из указанного контингента больных выделили группу из 114 человек. У 40 больных из общей группы пациентов  исследовали влияние эритропоэтина на выход калия из эритроцитов при внешнем действии каналоформера. В данной группе количество полученных сеансов гемодиализа составило в среднем 323,5±59,0.

       При длительном наблюдении первую группу составили 20 человек. Первое исследование скорости выхода калия из эритроцитов было выполнено через 3,2 ± 0,8 лет после начала заместительной терапии гемодиализом. Повторное исследование этой группы больных было проведено после 5,1 ± 0,8 лет пребывания в отделении гемодиализа. Таким образом, интервал между исследованиями не превышал 2 лет.

       Вторая группа состояла из 30 больных. Первое исследование было выполнено у них при среднем сроке пребывания в отделении гемодиализа 3.7±0,8 лет, второе измерение было произведено при среднем сроке лечения гемодиализом  7,8 ± 1,1 лет, то есть интервал между исследованиями составил 4 года.

При изучении различных типов общей резистентности эритроцитов в течение 201 сеанса регулярного гемодиализа обследовали 108 больных с ХПН. Обследованная группа состояла из 66 мужчин и 42 женщин в возрасте от 17 до 69 лет. У 94 больных был диагностирован хронический гломерулонефрит, у двух больных – хронический пиелонефрит, у пяти – поликистоз почек и вторичный пиелонефрит, у трех больных – сахарный диабет, диабетическая нефропатия, у двух больных – мочекаменная болезнь и вторичный пиелонефрит, и еще двое страдали «прочими» заболеваниями почек.

Все больные получали сеансы стандартного гемодиализа. Количество сеансов колебалось в пределах от 3 до 2580 и составило в среднем 589±42. Резистентность эритроцитов определяли до и после сеанса.

       У 36 больных измерения проводили повторно после первичного определения резистентности взятых у них эритроцитов. В начале наблюдения средний срок лечения регулярным гемодиализом составлял 2,6±0,5 лет. К этому времени количество сеансов, полученных больными, варьировало от 4 до 1313, составляя в среднем 400±73, а при повторном измерении – уже от 28 до 1938 (в среднем 623±82 сеанса), поскольку продолжительность лечения регулярным гемодиализом к моменту повторного обследования возросла до 4,0±0,5 лет.

       Из 36-ти наблюдаемых больных у 22-х измерения показателей были проведены еще раз через 5-6 лет лечения. На момент начала наблюдения количество полученных сеансов варьировало от 7 до 1178 (в среднем 423±83), что соответствовало 2,7±0,5 года лечения регулярным гемодиализом. Через 5-6 лет наблюдения число сеансов, полученных больными, составило уже от 668 до 2048 (в среднем 1275±86) при продолжительности лечения 8,2±0,5 лет.

Группу сравнения образовали добровольцы без ренальной патологии в количестве 25 человек.

Для изучения состояния мембран при ведении больных на низкокальциевом гемодиализе (НКГД) (концентрация Ca2+ в диализирующем растворе составляла 1,25 ммоль/л против 1,75 ммоль/л при стандартном сеансе) из всего контингента пациентов отделения хронического гемодиализа отобрали 43 человека с наиболее выраженными клинико-лабораторными и, в большинстве случаев, рентгенологическими признаками нарушений фосфорно-кальциевого обмена. Отобранную группу больных разделили на две подгруппы: основную (21 пациент; 8 мужчин и 13 женщин; средний возраст 43,7±3,0 года) и контрольную (22 пациента; 7мужчин и 15 женщин; средний возраст 45,9±2,5 лет). Длительность лечения гемодиализом в обеих подгруппах достоверно не различалась и составляла 86,6±7,84 и 91,9±12,7 сеансов для основной и контрольной подгрупп соответственно. Основная подгруппа была переведена на низкокальциевый диализ (в комплексе с терапией -D3 и карбонатом кальция в качестве фосфат-баиндера). Продолжительность наблюдения в этой части исследования составила 18 месяцев.

Методика работы с эритроцитами пациентов гемодиализа при минимизации исследуемых проб

При работе с эритроцитами пациентов гемодиализа и здоровых лиц клетки отмывали солевым раствором Моргана и по 1 мл полученной эритроцитарной массы переносили в ячейки и добавляли либо 0,5 мл раствора Моргана, либо 0,5 мл аутологичной плазмы, в зависимости от условий эксперимента.

В качестве провокатора трансмембранных потоков Na+ и K+ использовали нистатин: 0,04 мл его раствора в перегнанном ДМФА с концентрацией 5 мг/мл (3,0·10-4М) вносили в ячейку для индуцирования интенсивного выхода внутриклеточного K+ во внешнюю среду по сформированным каналам. Концентрация нистатина в пробе, таким образом, составляла 0,222 мг/мл внеклеточной жидкости (2,34·10-4 М).

Эффекторами эритроцитарной мембраны в экспериментах служили следующие вещества:

  1. Уабаин – специфический ингибитор Na+,K+-АТФазы. 0,04 мл его раствора в деионизированной воде (14,6 мг/мл деионизированной воды) добавляли в ячейку за 10 мин до внесения в нее раствора нистатина. В «безуабаиновые» ячейки при этом вносили 0,04 мл деионизированной воды.
  2. Рекормон – рекомбинантный человеческий эритропоэтин, пептид с молекулярной массой 34 кДа (Boeringer Manheim). В экспериментах в ячейку вносили 0,04 мл его готового раствора, что соответствовало 160 IU. Таким образом, конечная концентрация препарата в ячейке в 24 раза превышала достигаемую в плазме крови при его однократном внутривенном введении. Содержание эритропоэтина в рабочей пробе выбирали с тем расчетом, чтобы оно имело тот же порядок, что и содержание остальных эффекторов, т.е. чтобы количество его молекул и молекул других агентов, взаимодействующих с одной клеткой, было примерно одинаковым.
  3. Мембраноактивные компоненты, входящие в состав аутологичной плазмы крови.

В качестве ячеек применялись фторопластовые бюксы с внутренним диаметром 12 мм, в пластиковых крышках которых закреплялись либо ионоселективные электроды (диаметр корпусов 4 мм), либо ИСПТ (пластина толщиной 0,8 мм).

Определение э.д.с. выстраиваемых рабочих гальванических элементов производили на иономере И-130 (в случае использования в качестве датчиков ионоселективных электродов) и на специальном устройстве, разработанном в Барселонском институте микроэлектроники (в случае применения ИСПТ).

Квалификация всех использованных реактивов была не ниже «ХЧ».

Определение величины интегрального нормированного выхода калия

При анализе кинетических зависимостей внеклеточной концентрации K+ при действии нистатина на эритроциты больных с ХПН, получающих терапию регулярным гемодиализом, выяснилось, что взаимное расположение концентрационных кривых весьма разнообразно и зависит от индивидуальных особенностей эритроцитов и плазмы крови конкретного пациента гемодиализа. Однако к числу общих признаков таких кривых можно отнести немонотонность, практически исключающую возможность их динамического сглаживания как функций времени. Такая особенность оказалась характерной именно для крови больных, получающих заместительную почечную терапию гемодиализом.  Поэтому расчет положения теоретических точек концентрации K+, соответствующих отсутствию резистентного ответа плазматических мембран на внешнее действие каналоформера, сложен.

       Для оценки указанной резистентности эритроцитов по отношению к нистатину мы предложили использовать другой показатель, получивший описательное название «интегральный нормированный выход K+» (ИНВК) (рис. 7), который рассчитывался следующим образом:

1. Нормировка внеклеточной концентрации K+. Несмотря на то, что рабочие ячейки готовили стандартно и количество эритроцитов в пробах одной серии было примерно одинаковым (в каждой ячейке определяли значение гематокрита), для нивелирования возникающих различий фиксируемую в каждый следующий момент величину концентрации K+ относили к конечному (лизисному) значению.

2. При определении «интегрального выхода» K+ вычисляли площадь области диаграммы, расположенную под кривой зависимости «нормированной концентрации K+» от времени.

Рис. 7. Способ определения интегрального нормированного выхода калия.

По оси абсцисс: время  (мин.), прошедшее с момента внесения нистатина в рабочую пробу.

Для характеристики быстрых процессов рассчитывали «интегральный нормированный выход K+» за 3 и 10 минут, прошедших с момента внесения в пробу нистатина. Для описания эффекта резистентности в целом наиболее адекватными оказались временные интервалы от 25-ой до 35-ой минуты и от 40-ой до 45-ой минуты от начала воздействия каналоформера.

Некоторая часть экспериментальных кривых носила инверсионный характер. Для оценки глубины инверсии, т.е. непосредственного проявления функционирования активного противоградиентного транспорта, была разработана специальная компьютерная программа, позволяющая построить участок кривой между точками A и B (см. рис. 7), соответствующими моментам изменения знака производной Cнорм.K+=f(t). Положение точек A и B определяли для каждой экспериментальной кривой визуально. Разность между площадями участка области диаграммы, расположенного под зависимостью, полученной расчетным путем, и участка под реальной опытной кривой Cнорм.K+=f(t) и была определена как «площадь инверсии» (SI).

Таким образом, перечень характеристик резистентности мембран к внешнему действию каналоформера включает:

  • Ny (0-3), Ny (0-10), Ny (25-35), Ny (40-45) – ИНВК за 3, 10 минут, с 25-ой по 35-ую и с 40-ой по 45-ую минуту при действии только нистатина на эритроциты, ресуспендированные в солевом растворе;
  • Ou+Ny (0-3), Ou+Ny (0-10), Ou+Ny (25-35), Ou+Ny (40-45) – ИНВК за 3, 10 минут, с 25-ой по 35-ую и с 40-ой по 45-ую минуту при действии  нистатина на эритроциты, предварительно инкубированные с уабаином;
  • Pl+Ny (0-3), Pl+Ny (0-10), Pl+Ny (25-35), Pl+Ny (40-45) – ИНВК за 3, 10 минут, с 25-ой по 35-ую и с 40-ой по 45-ую минуту при действии  нистатина на эритроциты, ресуспендированные в аутологичной плазме;
  • Epo+Ny (0-3), Epo+Ny (0-10), Epo+Ny (25-35), Epo+Ny (40-45) – ИНВК за 3, 10 минут, с 25-ой по 35-ую и с 40-ой по 45-ую минуту при действии  нистатина на эритроциты, предварительно инкубированные с эритропоэтином;
  • Ny (SI), Ou+Ny (SI), Pl+Ny (SI) – площадь инверсии при действии только нистатина на эритроциты, ресуспендированные в солевом растворе, при действии нистатина на эритроциты, предварительно инкубированные с уабаином, и при действии  нистатина на эритроциты, ресуспендированные в аутологичной плазме, соответственно.
Определение показателей общей резистентности эритроцитов

В работе применяли три типа гемолиза: кислотный, осмотический и ультразвуковой.

Кислотный гемолиз проводили по Терскову и Гительзону [1957] 0,1N раствором соляной кислоты; временной интервал между измерениями составлял 10 секунд. Регистрацию гемолиза продолжали до момента прекращения процесса, то есть до получения постоянного значения светопоглощения.

Ультразвуковой гемолиз проводили с использованием аппарата для ультразвуковой терапии УЗТ-1.03У в условиях, оптимальных для регистрации динамики светопоглощения: интенсивность излучения – 1,0 Вт/см, режим работы – импульсный 2 мс. Регистрировали время 50%-ного ультразвукового гемолиза таким же образом, как и кислотного.

Осмотический гемолиз проводили по Идельсону [Медицинские и лабораторные технологии, 1998], используя в качестве гипотонического раствора 0,45% раствор хлористого натрия, приготовленный из стандартного физиологического раствора.

Статистическую обработку полученных данных выполняли с использованием параметрических и непараметрических методов при применении стандартных пакетов программ (Statistica for Windows v. 6.0, SPSS v. 12.0). Критический уровень достоверной нулевой статистической гипотезы (об отсутствии значимых различий или факторных влияний) принимали равным 0,05.

Оценку эффективности процедуры диализа у больных с ХПН, получающих заместительную почечную терапию, по комплексу лабораторных и клинических показателей состояния пациентов проводили с использованием математических моделей статусметрии [Андерсон Т., 1963; Разоренов Г.И., Поддубский Г.А., 1985, 1986; Разоренова Т.С., 1998]. Все обследованные были разделены на 7 групп по общему количеству пройденных процедур диализа (примерно 150 в год). Для каждой из них строили математические модели, по которым оценивали «весомость» информативных показателей и выбирали критерий различий. Модели представляли в виде дискриминантных функций Z:

Z = b0 + b1X1 + b2X2 +  b3X3 + … + bkXk ,

преобразующих комплекс показателей (Х1,, Х2, Х3, …,  Хk) в критерий классификации. Знак при коэффициенте (b1, b2, b3, …, bk)  указывает, в каком из классов имеют место более высокие значения средних.

Результаты и обсуждение

Действие нистатина на эритроциты лиц без ренальной патологии

       Результаты оценки резистентности эритроцитов здоровых лиц по отношению к внешнему воздействию каналоформера всецело подтвердили адекватность показателя «интегральный нормированный выход калия» (табл. 3)

       В первые минуты после внесения нистатина в пробах, предварительно инкубированных с уабаином,  наблюдалось 18-20%-ное увеличение скорости выхода K+ по сформированным каналам по сравнению с пробами, в которых отсутствовал специфический ингибитор Na+,K+-АТФазы, что, по-видимому, связано с практически полным ингибированием уабаин-чувствительной компоненты активного транспорта. В дальнейшем различия между динамикой выхода K+ из эритроцитов и при наличии уабаина в пробе, и без него уменьшаются: для периода стабилизации транспортных процессов (25-35 мин с момента внесения нистатина в пробу) и в заключительной части фиксируемой кинетической зависимости (40-45 мин.) указанное превышение составляет 14%.

Таблица 3

Интегральный нормированный выход калия для эритроцитов здоровых лиц

M±m

Медиана (min – max)

Показатель

Доноры (n =24)

t критерий

Стьюдента

(Ny)

(Ou + Ny)

(Pl + Ny)

(0-3) мин

12,0±1,1

12,1 (1,5-22,9)

14,6±1,2

14,3 (1,6-30,5)*

4,7±0,9

3,8 (0,4-21,2)*

p<0,0001

(0-10) мин

89,0±6,1

91,7 (34,4-140,4)

105,4±5,6

106,6 (43,6-151,2) *

39,9±5,1

42,4 (7,0-88,6) *

p<0,0001

(25-35) мин

238,5±12,1

249,7 (125,9-406,5)

272,2±9,4

282,3 (181,5-345,2)*

96,8±10,8

85,6 (25,5-227,9)*

p<0,0001

(40-45) мин

125,3±6,7

128,2 (65,5-209,5)

143,6±4,9

148,4 (94,0-179,7) *

50,2±5,6

45,1 (9,2-115,3)*

p<0,0001

SI

0,5±0,1

0,0 (0,0-12,6)

Не определяется

Не определяется

3,3±2,9

0,0 (0,0-69,0)

p=0,772

Примечание: * – достоверно отличается от проб, в которые внесен только нистатин.

       

Как уже обсуждалось, уабаин не препятствует процессу инактивации нистатиновых каналов. Следует отметить, что ингибирование активного транспорта становится более заметным при мониторинге быстрых процессов. По-видимому, снижение скорости переноса ионов при нарушении целостности гидрофильных структур несколько запаздывает во времени по сравнению с взаимодействием специфического ингибитора с калиевым сайтом Na+,K+-АТФазы. При наличии в пробе уабаина площадь инверсии равна нулю, что вполне соответствует теоретическим представлениям. Стабилизация мембран эритроцитов, выражающаяся в почти трехкратном уменьшении динамики нарастания внеклеточной концентрации K+ в случае добавления в ячейку аутологичной плазмы по сравнению с чисто «солевыми» пробами, скорее всего, говорит об усилении в ее присутствии противодействия нативного гликокаликсного покрытия клеточной мембраны процессу каналообразования: осложняется процесс построения системы связей между молекулами нистатина и холестерина и уменьшается вероятность существования чередующейся последовательности стеранового и полиенового компонентов.

Действие нистатина на эритроциты пациентов, получающих терапию хроническим гемодиализом

В таблицах 4 и 5 представлены результаты определения величин интегрального нормированного выхода K+ из эритроцитов больных ХПН, получающих лечение регулярным гемодиализом, в сравнении с показателями, зафиксированными для клеток здоровых лиц контрольной группы строго в тех же условиях эксперимента.

Выход калия из эритроцитов у пациентов, получающих почечную заместительную терапию регулярным гемодиализом, при формировании в мембранах нистатиновых каналов оказался выше, чем у здоровых лиц; однако достоверные отличия обнаруживаются только в отдаленной, стабилизированной области экспериментальной кинетической зависимости. В области быстрых процессов, несмотря на сходную направленность различий ИНВК, разброс данных весьма велик.

Таблица 4

Интегральный нормированный выход калия из эритроцитов здоровых лиц и эритроцитов пациентов гемодиализа до и после сеанса

M±m

Медиана (min-max)

Показа-тель

Доноры (n = 24)

Пациенты (n =147)

Критерий U Манна-Уитни


До ГД

После ГД

1

2

3

Ny (0-3)

12,0±1,1

12,1 (1,5-22,9)

23,0±1,8

15,6 (0,1-120,5)

25,0±2,4

14,7 (0,7-154,6)

p1,2 = 0,088

p1,3 = 0,059

p2,3 = 0,517

Ny (0–10)

89,0±6,1

91,7 (34,4-140,4)

132,2±8,4

104,9 (5,1-538,3)

141,2±9,8

116,4 (10,5-774,5)

p1,2 = 0,147

p1,3 = 0,104

p2,3 = 0,532

Ny

(25–35)

238,5±12,1

249,7 (125,9-406,5)

312,7±12,7

290,3 (44,1-741,5) *

321,3±13,7

330,0 (11,1-909,8) *

p1,2 = 0,044

p1,3 = 0,008

p2,3 = 0,616

Ny

(40– 45)

125,3±6,7

128,2 (65,5-209,5)

177,0±6,6

174,8 (2,8-396,2) *

182,6±7,3

181,2 (9,8-472,5) *

p1,2 = 0,002

p1,3 = 0,001

p2,3 = 0,499

Ny(SI)

0,5±0,5

0 (0,0-12,6)

24,3±4,6

0 (0,0-329,6) *

25,6±6,8

0 (0,0-758,2) *

p1,2 = 0,006

p1,3 = 0,021

p2,3 = 0,635

Ou+Ny

(0-3)

14,6±1,2

14,3 (1,6-30,5)

24,5±2,2

14,0 (0,2-165,9)

21,2±1,6

13,4 (2,1-94,8)

p1,2 = 0,676

p1,3 = 0,848

p2,3 = 0,116

Ou+Ny

(0–10)

105,4±5,6

106,6 (43,6-151,2)

136,6±9,4

101,9 (0,9-633,8)

128,4±8,3

105,2 (1,1-549,0)

p1,2 = 0,986

p1,3 = 0,931

p2,3 = 0,399

Ou+Ny

(25–35)

272,2±9,4

282,3 (181,5-345,2)

308,3±15,5

272,3 (10,1-898,6)

309,2±14,4

166,7 (174,5-726,3)

p1,2  = 0,982

p1,3 = 0,749

p2,3 = 0,689

Ou+Ny

(40–45)

143,6±4,9

148,4 (93,9-179,7)

171,1±8,2

152,6 (0,0-493,0)

174,4±7,9

162,0 (0,0-505,3)

p1,2 = 0,536

p1,3 = 0,259

p2,3 = 0,839

Ou+Ny (SI)

0

0

23,5±5,1

0 (0,0-510,2) *

12,9±3,0

0 (0,0-283,5) *

p1,2 = 0,002

p1,3 = 0,018

p2,3 = 0,111

Примечание: * – достоверно отличается от величины, полученной для эритроцитов доноров.

Таким образом, формирование каналов в мембранах эритроцитов пациентов и в количественном, и в качественном отношении – чрезвычайно неоднородный процесс, демонстрирующий индивидуальность состояния билипидного мембранного слоя. В целом же увеличение ИНВК из эритроцитов пациентов гемодиализа по сравнению со здоровыми лицами свидетельствует о сниженной резистентности мембранных систем по отношению к действию нистатина. На фоне интенсивного образования самих каналов, по-видимому, у больных снижается эффективность систем активного транспорта и, что особенно важно, не реализуется в полной мере процесс самозалечивания мембран, т.е. замедляется инактивация каналов. Следует особо отметить, что при ресуспендировании эритроцитов в солевом растворе различий между додиализным и последиализным интегральным выходом калия нет.

Если при действии на клетки только нистатина ИНВК у пациентов гемодиализа выше, чем у здоровых, то при предварительном экспонировании с уабаином достоверных различий нет;  у пациентов гемодиализа в «уабаиновых» пробах отмечалось даже некоторое снижение выхода K+ по сравнению с «безуабаиновыми» (см. табл. 4). Продолжительная уремическая интоксикация может приводить к изменению нормального количественного соотношения молекулярных форм Na+,K+-АТФазы, различающихся по чувствительности к уабаину, а регулярные сеансы интенсивной экстракорпоральной детоксикации – к изменению сродства уабаинсвязывающего центра, находящегося в составе -субъединицы фермента, к ингибитору. Чувствительность Na+,K+-насоса к уабаину напрямую зависит от липидного состава выделенного участка мембраны, а формирование участков «повышенной гидрофильности» при включении кислорода в углеводородные цепи значительно изменяет локальное окружение Na+,K+-АТФазы. Можно предполагать, что при локальной модификации поверхностной архитектоники, в том числе вследствие изменения заряда и стерических трансформаций, некоторые участки билипидного слоя становятся доступными для встраивания в них молекул уабаина, содержащего стерановую группировку. Возможным итогом может стать некоторая стабилизация бислоя, в результате чего действие уабаина в отношении утечки K+ по каналам, сформированным нистатином, является парадоксальным.

При ресуспендировании отмытых эритроцитов с добавлением аутологичной плазмы крови кинетическая картина совершенно иная (см. табл. 5). Присутствие нативных компонентов плазмы увеличивает резистентность мембран эритроцитов по отношению к внешнему действию каналоформера и приводит к снижению ИНВК даже в додиализных пробах почти в два раза для коротких процессов и более чем в два раза – для отдаленных областей, по сравнению с «чисто солевыми» пробами (12,3±1,5 против 23,0±1,8, p=0,006 и 153,0±12,2 против 312,7±12,7, p=0,005). Следовательно, плазма крови, даже имеющая в своем составе токсические компоненты, создает на поверхности эритроцитарной мембраны некое подобие «барьера», препятствующего интенсивному образованию нистатиновых каналов. Естественно, здесь могут присутствовать как моменты формирования внешнего примембранного слоя из низкомолекулярных белков, пептидов и липопротеиновых комплексов, так и репарация конформационно измененных липидных участков. Такой своеобразный «барьер» у здоровых лиц достоверно эффективнее в первые 3 минуты после внесения нистатина, чем у больных как до сеанса гемодиализа, так и после него. В последующий же период, когда в общую кинетическую картину включаются активный транспорт ионов, осуществляемый Na+,K+-АТФазой, и процесс инактивации каналов, различия уже не столь значимы, и это несмотря на превышение интегрального выхода калия у пациентов по сравнению с лицами без ренальной патологии на 50% до сессии и на 20% – после нее. Последний факт, по-видимому, означает, что у пациентов мембранопротекторные процессы начинают действовать в разные моменты времени и с различной интенсивностью. Впервые проявившееся достоверное изменение выхода калия во внеклеточную среду за время сеанса гемодиализа с наибольшей вероятностью указывает на присутствие в плазме крови эндогенных ингибиторов Na+,K+-насоса, которые удаляются в ходе гемодиализной сессии. Вполне вероятно, что параллельно происходит и активация процесса «self-treatment». Запуск и интенсификация репаративных процессов приводит к очевидной стабилизации мембраны, что становится особенно заметным в отдаленной части кинетической зависимости, когда действие всех механизмов резистентности проявляется с наибольшей интенсивностью.

                                                                                       Таблица 5

Интегральный нормированный выход калия из эритроцитов здоровых лиц и эритроцитов пациентов гемодиализа при ресуспендировании клеток в аутологичной плазме и действии нистатина

M±m

Медиана (min – max)

Показа-тель

Доноры (n = 24)

Пациенты (n = 114)

Критерий U Манна-Уитни

До ГД

После ГД

1

2

3

Pl+Ny (0-3)

4,7±0,9

3,8 (0,4-21,2)

12,3±1,5

6,2 (0,1-77,5) *

8,5±1,0

5,4 (0,0-77,5) *

p1,2 = 0,007

p1,3 = 0,024

p2,3 = 0,163

Pl+Ny (0–10)

39,9±5,1

42,4 (7,0-88,6)

68,1±7,3

42,1 (1,4-500,9)

47,5±4,3

36,4 (0,7-342,6) #

p1,2 = 0,322

p1,3 = 0,821

p2,3 = 0,014

Pl+Ny (25–35)

96,8±10,8

85,6 (25,5-227,9)

153,0±12,2

121,5 (6,4-713,9) *

124,7±8,4

95,2 (5,8-550,3)

p1,2 = 0,046

p1,3 = 0,277

p2,3 = 0,055

Pl+Ny (40-45)

50,2±5,6

45,1 (9,2-115,3)

88,7±6,7

67,5 (4,4-393,4) *

73,8±4,8

60,7 (3,2-303,4) *

p1,2 = 0,004

p1,3 = 0,030

p2,3 = 0,063

Pl+Ny (SI)

3,3±2,9

0,0 (0,0-69,0)

15,7±4,2

0,0 (0,0-313,0)

9,5±2,6

0,0 (0,0-147,5)

p1,2 = 0,118

p1,3 = 0,328

p2,3 = 0,203

Примечания: * – достоверно отличаются от величин, полученных для эритроцитов здоровых лиц;

# – величины достоверно различаются до и после гемодиализа

При сопоставлении данных, полученных при ресуспендировании отмытых эритроцитов с добавлением аутологичной плазмы, с параметрами, характеризующими мембранный статус эритроцитов, находящихся в солевом растворе, разнонаправленность изменений, происходящих в ходе диализной сессии, становится очевидной (табл. 6). Если при действии нистатина на эритроциты, ресуспендированные в растворе Моргана, после сеанса диализа ИНВК несколько увеличивался, что, вероятно, является следствием изменений поверхности клеточных мембран при движении крови по экстракорпоральным магистралям через диализатор, то при ресуспендировании в плазме уменьшение указанной величины является результатом включения высокоинтенсивных превентивных процессов, препятствующих облегченной диффузии ионов по сформированным каналам. Вышесказанное дает возможность представить разность =ИНВКNy–ИНВКPl+Ny в качестве характеристики влияния диализа на мембранный билипидный слой. Различия между указанными величинами , полученными до сеанса и после него, составляют в среднем 35-37%; они значимы почти для всех областей кинетической зависимости, но поскольку отношение ’=(после-до)/после уменьшается с 0,42 для первых трех минут с момента внесения нистатина в пробу до 0,22 для последнего этапа эксперимента, наиболее вероятно, что именно стабилизирующая функция компонентов очищенной в ходе диализной сессии плазмы крови играет наиболее важную роль в резистентном ответе клеток на внешнюю агрессию каналоформера.

Таблица 6

Разности интегральных нормированных выходов калия при действии нистатина на отмытые эритроциты, ресуспендированные в солевом растворе Моргана и в аутологичной плазме, до и после сеанса гемодиализа

M±m

Медиана (min-max)

Показатель

(Ny)до-(Pl+Ny)до

(Ny)лосле-(Pl+Ny)после

Критерий Уилкоксона z (p)

0 – 3 мин

7,1±2,1

4,6 (-61,6 – 77,9)

12,6±2,3

6,9 (-43,3 – 152,2)

-1,75 (0,-80)

0 – 10 мин

50,7±10,0

34,1 (-439,1 – 413,2)

79,0±11,0

57,7 (-217,3 – 769,5)

-2,02 (0,043)

25 – 35 мин

134,9±15,3

137,5 (-525,7 – 543,5)

172,5±14,6

172,2 (-283,4 – 666,8)

-2,47 (0,014)

40 - 45 мин

75,3±8,0

78,1 (-251,9 – 311,5)

97,8±8,2

96,4 (-187,4 – 395,7)

-2,43 (0,015)

Сравнительно неожиданными оказались результаты экспериментов, в которых действию нистатина предшествовала экспозиция эритроцитов пациентов с рекомбинантным человеческим эритропоэтином (табл. 7). По сравнению с опытами, в которых использовался только каналоформер, достигалось значительное увеличение ИНВК: при быстрых процессах превышение более чем в два раза, а в отдаленных областях – в полтора. Это означает, что наибольший эффект препарата наблюдается при формировании каналов. Взаимодействие пептидных цепей эритропоэтина с ионогенными группами, находящимися на поверхности клетки, приводит к модификации  открытых липопротеиновых участков мембраны, делая их более доступными для гидрофобных группировок молекулы антибиотика. Процесс инактивации в присутствии эритропоэтина протекает с меньшей интенсивностью, чем при действии на эритроциты только нистатина. Очевидно, что высокоэффективное лекарственное средство, являющееся препаратом выбора при коррекции анемии в процессе лечения больных с ХПН регулярным гемодиализом, перитонеальным диализом, гемофильтрацией и т.д., в высоких концентрациях (в 24 раза превышающих возникающие при однократном внутривенном введении препарата) становится сильным клеточным ядом. Таким образом, приведенные результаты могут служить дополнительным косвенным аргументом в пользу применения эритропоэтина в малых дозах при выборе алгоритма лечения.        

Таблица 7

Влияние эритропоэтина на интегральный нормированный выход калия из эритроцитов

M±m

Медиана (min-max)                                                        

Пока-затель

(Ny)до

(Epo + Ny)до

Критерий Фридмана

(Ny)после

(Epo+Ny)после

Критерий Фридмана

Пациенты (n = 147)

Пациенты

(n = 40)

Пациенты (n = 147)

Пациенты

(n = 40)

(0-3) мин

23,0±1,8

15,6 (0,1-120,5)

57.7±5.8

22,4 (0,0-159,0)*

p<0,0001

25,0±2,4

14,7 (0,7-154,6)

54.5±4.5

43,6 (0,9-163,9)*

p<0,0001

(0-10) мин

132,2±8,4

104,9 (5,1-538,3)

268.6±20.2

149,8 (0,0-663,7)*

p<0,0001

141,2±9,8

116,4 (10,5-774,5)

261.3±12.7

189,3 (9,2-648,1) *

p<0,0001

(25-35) мин

312,7±12,7

290,3 (44,1-741,5)

468.9±22.0

408,3 (0,0-803,6)*

p<0,0001

321,3±13,7

330,0 (11,1-909,8)

481.3±16.0

435,6 (50,3-831,1) *

p<0,0001

(40-45) мин

177,0±6,6

174,8 (2,8-396,2)

226.0±14.5

199,5 (0,0-598,5)

p<0,0001

182,6±7,3

181,2 (9,8-472,5)

222.9±15.2

170,8 (41,7-438,6)

p<0,0001

SI

24,3±4,6

0,0 (0,0-329,6)

36.1±11.9

0,0 (0,0-294,4)

p=0,327

25,6±6,8

0 (0,0-758,2)

27.2±12.3

0 (0,0--369,6)

p=0,224

Примечание: * – величина достоверно отличается от значения интегрального нормированного выхода калия, полученного при действии только нистатина

Показатели общей резистентности у пациентов, получающих регулярный  гемодиализ

Среди общих тестов резистентности (табл. 8) наиболее значимые отличия от контрольной группы обнаруживаются для показателей кислотного гемолиза. Увеличение времени кислотного гемолиза эритроцитов у пациентов диализа по сравнению со временем, характерным для клеток людей без ренальной патологии, прежде всего указывает на дополнительное протонирование поверхностных слоев гликокаликса (предположительно, за счет наличия ионогенных групп, формируемых остатками сиаловых кислот). Вероятно, при наблюдающемся относительном ацидозе у больных состояние добавочного поверхностного протонирования является постоянно существующим фактором, во многом определяющим свойства мембран эритроцитов. Только в этом случае скорость достижения протонами билипидного мембранного слоя с последующим формированием протонных каналов будет в основном определяться электростатическим взаимодействием свободно диффундирующих ионов водорода с фиксированными поверхностными зарядами.

Сокращение времени кислотного гемолиза после процедуры, по всей видимости, является результатом ускорения диффузии протонов к центрам связывания после диализного депротонирования поверхности клетки и указывает на лимитирующую роль именно первого этапа кислотного гемолиза.

Динамика данных кислотного гемолиза, представленная в табл. 8,  может быть расценена, наряду со снижением концентрации креатинина и мочевины в плазме, как показатель уменьшения уремической интоксикации в результате сеанса гемодиализа.

Таблица 8

Показатели общей резистентности эритроцитов доноров и пациентов гемодиализа

Показатель

Доноры (n = 25)

Пациенты (n =201)

Критерий

Уилкоксона

До ГД

После ГД

1

2

3

Время кислотного гемолиза

2,6±0,1

2,6 (2,3±3,3)

3,4±0,1

3,4 (2,1-5,4)

3,0±0,04

2,9 (2,1-4,7)

p1,2<0,0001

p1,3<0,0001

p2,3<0,0001

Осмотическая резистентность

25,3±2,5

22,3 (13,6-70,9)

31,3±1,7

25,9 (4,6-84,3)

38,9±1,9

35,8 (3,8-92,9)

p1,2=0,458

p1,3=0,014

p2,3<0,0001

Время осмотического гемолиза

12,4±0,4

13,2 (6,0-15,0)

12,8±0,2

13,5 (4,8-18,0)

12,9±0,3

14,0 (3,5-19,0)

p1,2=0,163

p1,3=0,021

p2,3=0,249

Время ультразвукового гемолиза

2,5±0,2

2,7 (0,6-4,3)

2,8±0,1

2,8 (1,2-5,8)

2,8±0,1

2,6 (1,3-6,5)

p1,2=0,404

p1,3=0,722

p2,3=0,189

Результаты экспериментов по исследованию осмотической резистентности позволяют говорить об «одноэтапности» лизиса и трактовать интенсивность самого процесса как характеристику прочности  белок-белковых взаимодействий, связанных, как правило, с глубокими изменениями в структурных элементах цитоскелета. Как известно, мембранный скелет содержит около 50% всех белков, присутствующих в мембране. Особая роль здесь также принадлежит ионам Ca2+, которые контролируют не только взаимодействие спектрина и анкирина, но и трансмембранное передвижение ионов K+.

       Характерная для уремической интоксикации при ХПН стомацитарная трансформация эритроцитов [Самойлов М.В. и др, 2002] усугубляется поступлением дополнительных количеств воды внутрь клетки в междиализный период, что приводит к уменьшению энергии связей белков цитоскелета с разрывом некоторых из них.

       Литературные данные, касающиеся изменения осмотической стойкости эритроцитов во время сеанса гемодиализа, достаточно противоречивы. Сообщается о ее снижении к концу сеанса; результаты других работ свидетельствуют, что осмотическая стойкость эритроцитов у больных до гемодиализа снижена по сравнению со здоровыми лицами, а к концу сеанса гемодиализа она достоверно не отличается от соответствующего показателя у контрольной группы.

       В то же время, как следует из данных табл. 8, у больных, получающих лечение регулярным гемодиализом, до сеанса при внеклеточной концентрации NaCl 0,045% не подвергается лизису значительно большее число эритроцитов, чем у здоровых лиц. Более того, при дегидратации эритроцитов в ходе сеанса гемодиализа у больных осмотическая резистентность продолжает расти. Вероятной причиной этого явления может служить повышение отношения площади поверхности эритроцитарной мембраны к внутреннему объему клетки как результат ультрафильтрации. При этом при стабилизации связей между белковыми структурами и белково-липидными комплексами происходит упрочение цитоскелета эритроцита даже по сравнению с клетками доноров. Подобную селективность, непосредственно связанную с массированным трансмембранным перемещением воды и выраженной лабильностью связей между различными компонентами плазматической мембраны, можно трактовать как вариант приспособительной реакции эритроцитов к существованию в жестких условиях длительного контакта с системой экстракорпоральной детоксикации.

       Ультразвуковая резистентность оказалась неожиданно маловариабельной при проведении гемодиализной процедуры и, более того, практически одинаковой и у больных, и у здоровых лиц, что указывает на большой запас прочности эритроцитов пациентов диализа в отношении механической устойчивости.

Взаимосвязи между клинико-лабораторными показателями и показателями общей резистентности эритроцитов и резистентности эритроцитов к внешнему действию нистатина

       При анализе корреляционных взаимоотношений между показателями различного типа резистентности эритроцитов пациентов диализа и клинико-лабораторными данными было установлено, что практически все эти связи относятся к разряду слабых, что в целом соответствует представлениям об эритроците как автономной, достаточно независимой единице, для которой не характерен быстрый метаболический ответ на изменения параметров внеклеточной среды.

       Осмотическая резистентность, определяемая до сеанса диализа, связана слабыми отрицательными корреляционными связями с концентрациями мочевины и креатинина, также определенными до диализной сессии (rs=-0,232, p=0,013 и rs=-0,236, p=0,018 соответственно) и положительной – с концентрацией альбумина в плазме крови (rs=0,273, p=0,004); а определяемая после сеанса – также отрицательными связями с концентрациями мочевины и креатинина до диализа (rs=-0,228, p=0,015 и rs=-0,227, p=0,015 соответственно) и положительной – с концентрацией альбумина (rs=0,266, p=0,005). С концентрацией кальция после диализа коррелирует время кислотного гемолиза до гемодиализа (rs=-0,236, p=0,012) и время ультразвукового гемолиза после сессии (rs=0,231, p=0,000).

       Отрицательная корреляционная связь между показателями осмотического гемолиза и концентрацией креатинина, являющегося маркером присутствия веществ с молекулярной массой ~ 100Да, предполагает стабилизацию белково-липидных взаимодействий и усиление осмотической резистентности при удалении уремических токсинов соответствующих размеров; повышение осмотической резистентности при уменьшении содержания мочевины подчеркивает важность качественной очистки во время сеанса. Положительная корреляция концентрации альбумина крови с осмотической резистентностью эритроцитов как до, так и после гемодиализа, в данном случае, скорее всего, говорит о том, что, несмотря на снижение резерва связывания альбумина и, наоборот, увеличение индекса токсичности, именно этот белок необходим для преодоления осмотического шока. Увеличение общего содержания кальция в целом повышает сопротивляемость клетки мембранному стрессу, спровоцированному изменением pH внешней среды, и механическому удару.

Показатели общей резистентности также связаны между собой, однако в основном слабыми связями: время кислотного гемолиза отрицательно коррелирует со временем ультразвукового гемолиза (rs=-0,301, p=0,001), осмотическая резистентность до гемодиализа – со временем осмотического гемолиза (rs=0,418, p<0,001), а после диализной сессии – со временем осмотического гемолиза и до, и после сеанса (rs=0,337, p<0,001 и rs=0,366, p<0,001 соответственно).

Величины резистентности к действию нистатина, напротив, тесно взаимосвязаны между собой, чаще сильными и средними корреляционными связями, но из общих клинико-лабораторных данных только три характеристики: концентрации холестерина, билирубина и мочевой кислоты в крови, – коррелируют со значениями интегрального выхода K+ из эритроцитов при различных вариантах воздействия на клетки. При этом с увеличением содержания холестерина в плазме крови мембрана слабее сопротивляется организации гидрофильных каналов именно в первые минуты после внесения нистатина в пробу (табл. 9).

Создается впечатление, что дислипидемия, сопровождающая ХБП, приводит к эффекту «нецелевого» использования холестерина: повышение концентрации последнего в плазме лишь ухудшает «текучесть» мембраны при сравнительно высоком его содержании в билипидном слое. Предварительная экспозиция эритроцитов с уабаином еще более усугубляет ситуацию: до сеанса гемодиализа плазматическая мембрана, уже провзаимодействовавшая с уабаином, тем уязвимее для действия нистатина, чем выше концентрация транспортных холестериновых форм в плазме крови, а после диализа явно снижена активность компенсаторных процессов. Само по себе внесение уабаина в пробу, как уже обсуждалось выше, уменьшает ИНВК из клеток пациентов. У основной массы обследуемых больных общая концентрация холестерина в плазме не была низкой и составляла в среднем 5,4±0,3 ммоль/л; и поскольку содержание холестерина в плазме крови – это U-формирующий фактор, вполне возможно, что вилка «оптимальных» величин концентраций липидов в крови пациентов гемодиализа же, чем в общей популяции. В данной ситуации уже при относительно невысоком содержании липидов в плазме холестерин начинает восприниматься мембранными системами как нечто чужеродное. Возникает относительный дефицит холестерина в билипидном слое, и предполагаемая стабилизация последнего при взаимодействии с уабаином не является достаточной для оказания необходимого сопротивления агрессии нистатина. Одновременно сокращается и время ультразвукового гемолиза, то есть снижается механическая прочность клеточной мембраны. Нехватка молекул холестерина приводит к снижению интенсивности процесса инактивации, а также, возможно, и к уменьшению активности функционирования транспортных ферментов вследствие изменения их фосфолипидного окружения.

Таблица 9

Коэффициенты корреляции  общей концентрации холестерина в сыворотке крови и показателей резистентности эритроцитов пациентов гемодиализа

Показатель

r Пирсона (p)

Кендалла (p)

rs Cпирмена (p)

Время ультразвукового гемолиза после

– 0,206 (0,029)

– 0,150 (0,023)

– 0,223 (0,018)

Ny (0-3) до

0,442 (0,000)

0,174 (0,007)

0,298 (0,008)

Ny (0-10) до

0,389 (0,000)

0,184 (0,004)

0,266 (0,005)

Ou+Ny (0-3) до

0,299 (0,001)

0,149 (0,022)

0,218 (0,021)

Ou+Ny (0-10) до

0,273 (0,004)

0,146 (0,024)

0,217 (0,021)

Ou+Ny (25-35) после

0,241 (0,011)

0,134 (0,039)

0,207 (0,028)

Ou+Ny (40-45) после

0,223 (0,018)

0,140 (0,031)

0,212 (0,025)

       

Корреляционных связей между величинами общей резистентности эритроцитов и резистентности к внешнему действию каналоформера не выявлено. Это, вероятно, обусловлено тем, что показатели кислотной и осмотической устойчивости характеризуют главным образом прочность белок-белковых и белок-липидных взаимодействий, относящихся, в том числе, к цитоскелету клетки, а «интегральный нормированный выход калия», в силу особенностей эксперимента, следует соотнести с качеством липидного бислоя, то есть со способностью мембраны сопротивляться организации и существованию в ней чужеродного гидрофильного канала.

Последнее положение было подтверждено результатами, полученными при изучении эритроцитов больных, получавших заместительную почечную терапию низкокальциевым гемодиализом.

При определении резистентности эритроцитов у пациентов гемодиализа  до начала и по истечении срока лечения НКГД ни одна из величин (в экспериментах при действии только нистатина, при предварительной экспозиции с уабаином и при ресуспендировании отмытых клеток в аутологичной плазме) в области стабильности транспортных процессов  достоверно не отличалась от соответствующего значения, определяемого при лечении этих же пациентов нормокальциевым ГД. Неизменность свойств билипидного слоя без усугубления дефектности скорее указывает на малое влияние ион-ионных взаимодействий на способность к организации трансмембранных транспортных единиц и возможность противостоять агрессии антибиотика по отношению к гидрофобной части мембранной фазы.

В то же время за восемнадцать месяцев терапии низкокальциевым гемодиализом произошло достоверное уменьшение осмотической резистентности (с 33,8±3,5 до 19,8±3,0, p<0,01 до диализа и с 37,1±3,6 до 21,5±3,4, p<0,01 после диализа) и времени ультразвукового гемолиза (с 3,0±0,1 до 2,6±0,1, p<0,01 до сеанса и с 2,9±0,1 до 2,6±0,1, p<0,05 после), что свидетельствует об утрате большого числа валентных взаимодействий между белковыми структурами, формирующими сетчатый каркас.

Следовательно, тесты общей резистентности эритроцитов и резистентности к внешнему действию каналоформера отражают различные аспекты качества клеточной мембраны. К таким же выводам приводят и результаты факторного анализа: величины интегрального нормированного выхода калия и показатели общей резистентности одновременно не входят ни в один из первых шести факторов системы, объединяющей клинические, биохимические и биофизические показатели, степень структурированности которой составляет чуть более 50%. Количество выбранных факторов соответствует критерию «каменистой осыпи» Кеттеля (табл. 10).

Объединение в первом факторе характеристик резистентности эритроцитов исключительно к действию нистатина, причем только тех, которые относятся к мембране, не взаимодействующей с нативным окружением, подчеркивает компартментализующую роль мембранной фазы. Следует отметить, что здесь присутствуют как показатели быстрых процессов, так и отдаленных временных интервалов при установлении «квазиравновесного» состояния в отношении трансмембранного перемещения ионов калия, то есть и на долю процессов формирования канала, и на долю компенсаторных процессов приходятся примерно равные вклады.

Вторая компонента объединяет показатели, отражающие состояние сердечно-сосудистой системы пациентов, и показатели их красной крови.

Величины ИНВК при взаимодействии клеток с компонентами окружающей их нативной плазмы формируют третий фактор, причем основная факторная нагрузка ложится на додиализные характеристики, отвечающие такому состоянию, при котором поверхностные мембранные молекулы взаимодействуют с уремическими токсинами, присутствующими в относительно высоких концентрациях. Здесь в составе фактора появляется «площадь инверсии», что указывает на безусловную значимость процессов активного транспорта в поддержании электролитного статуса эритроцитов в экстремальных условиях быстрой смены состава окружающей среды.

Таблица 10

Структура системы клинических, клинико-лабораторных показателей и показателей резистентности к внешнему действию каналоформера

КОМПОНЕНТЫ

I

II

III

Показатель

Факторная

нагрузка

Показатель

Факторная

нагрузка

Показатель

Факторная

нагрузка

Ny (0-3) до

0.48

Число сеансов

0.36

Pl+Ny (0-3) до

0.64

Ny (0-3) после

0.61

АД систолич. до

0.89

Pl+Ny (0-10_ до

0.79

Ny (0-10) до

0.70

АД систолич. после

0.90

Pl+Ny (25-35) до

0.75

Ny (0-10) после

0.79

АД диастолич. до

0.81

Pl+Ny (40-45) до

0.70

Ny (25-35) до

0.84

АД диастол. после

0.83

Pl+Ny (SI)

0.54

Ny (25-35) после

0.88

АД пульсовое до

0.78

Ny (40-45) до

0.84

АД пульсовое после

0.83

Ny (40-45) после

0.88

АД среднее до

0.88

Ou+Ny (0-3) до

0.46

АД среднее после

0.90

Ou+Ny (0-3) после

0.70

Натрий до

0.38

Ou+Ny (0-10) до

0.55

Гематокрит до

0.50

Ou+Ny (0-10) после

0.67

Гематокрит после

0.59

Ou+Ny (25-35) до

0.76

Эритроциты

0.50

Ou+Ny (25-35) после

0.75

Гемоглобин

0.53

Ou+Ny (40-45) до

0.76

Ou+Ny (40-45) после

0.73

Собств. значение: 14.98

9.73

6.81

                                                                       

Продолжение таблицы 10

КОМПОНЕНТЫ

IV

V

VI

Показатель

Факторная

нагрузка

Показатель

Факторная

нагрузка

Показатель

Факторная

Нагрузка

Вес до

0.65

Число сеансов

0.42

Осмотическая резистентность до

0.39

Вес после

0.63

Длительность сеанса

0.42

Осмотическая резистентность после

0.42

Na после

0.41

Изменение веса за сеанс

0.83

Время осмотического гемолиза после

0.34

Фосфаты до

0.39

Na до

0.50

Альбумин

0.49

Фосфаты после

0.45

Ca до

0.37

Относительное содержание альбумина

0.46

Мочевина до

0.52

Креатинин до

0.49

Креатинин до

0.48

Мочевая к-та

0.33

Креатинин после

0.63

Время кислотного гемолиза до

0.34

KT/V

0.37

Время кислотного гемолиза  после

0.36

Эритроциты

0.51

Гемоглобин

0.51

Собств. значение: 5.40

4.96

4.37

Четвертая компонента  характеризует эффективность проводимого сеанса гемодиализа.

       Показатели общей резистентности входят лишь в пятый и шестой факторы. В пятой компоненте время кислотного гемолиза присутствует вместе с характеристиками сеанса гемодиализа: изменением веса пациента, длительностью сессии, концентрациями Na+, Ca2+ и креатинина в сыворотке крови больных. Объединение в шестой главной компоненте величин осмотической резистентности, абсолютной и относительной концентрации альбумина представляется вполне логичным: защитные свойства этого белка предопределяют и высокую осмотическую устойчивость. Отнесение величин, характеризующих осмотический гемолиз, лишь к шестому фактору, скорее всего, говорит о хорошей адаптации клеточных систем пациентов к трансмембранным перемещениям больших объемов воды. Следовательно, риск дестабилизации мембранных структур при осмотических воздействиях на эритроциты не столь велик, как при мембранном окислительном стрессе и связанном с ним ПОЛ, приводящим к изменениям липофильных свойств билипидного слоя.

Долговременные наблюдения за состоянием клеточных мембран пациентов гемодиализа

При анализе данных о резистентности мембран, определенной в разные периоды лечения регулярным гемодиализом, еще раз проявились моменты несхожести механизмов различных типов резистентности. Как показатели общей резистентности, так и величины интегрального нормированного выхода K+ через четыре и через пять лет с начала диализной терапии соответственно, достоверно не отличались от исходных значений (через 2,5 и 3,2 года лечения соответственно) (рис. 8).

Рис. 8. Исходные и повторные значения показателей резистентности к внешнему действию нистатина эритроцитов пациентов гемодиализа.

По прошествии же 4-5 лет с момента исходного обследования различия большинства величин, характеризующих трансформации мембран, становились достоверными. Однако если показатели времени кислотного гемолиза, как и показатели интегрального нормированного выхода калия, «улучшались», приближаясь к значениям, присущим донорским эритроцитам (с 3,82±0,41 до 3,16±0,17, p=0,002 до диализа и с 3,49±0,15 до 2,83±0,12, p<0,001 после диализа соответственно), то осмотическая устойчивость интенсивно возрастала (с 26,02±5,14 до 41,58±5,63, p=0,032). Именно подобная разнонаправленность изменений заставляет предполагать, что химические трансформации, затрагивающие молекулы фосфолипидов, формирующих бислой, и диспропорции в количественных соотношениях содержания конкретных липидных компонентов мембраны не всегда суть ухудшение: скорее это варианты адаптации к необычным условиям существования. Клеточные мембраны пациентов гемодиализа должны быть осмотически устойчивыми и резистентными к иным внешним воздействиям. Адаптация к многократной и быстрой смене состава внеклеточной среды, к массированным трансмембранным потокам растворителя: воды и растворенных в ней веществ, – сопровождающимся изменениями осмоляльности, приводит к необходимости «принесения в жертву» лабильности клетки в угоду выполнению эритроцитом своей основной транспортной функции.

Построение моделей «до диализа – после диализа» позволило выявить наиболее информативные показатели, характеризующие состояние пациента в ходе проведения сессий заместительной почечной терапии (табл. 11). Как и следовало ожидать, самыми важными оказываются параметры очистки организма пациента; большая роль в концепции модели отводится также величинам, характеризующим электролитный статус больного, в том числе и кальций-фосфорному балансу. При этом на всех временных этапах достаточно существенный вклад вносится показателями общей резистентности. Что касается величин интегрального нормированного выхода калия, то в первые два года с начала заместительной почечной терапии их вклад составляет 28% и 32% от суммарного вклада характеристик очистки. В дальнейшем, начиная с третьего года хронического гемодиализа, их роль становится важнее: суммарная величина приходящихся на их долю “весов” достигает 54% от суммарных весов показателей очистки и затем сохраняется достаточно  высокой, но с тенденцией понижения (48% и 43% в четвертый и пятый годы соответственно), за исключением периода 5-7 года пребывания на диализе. В последний изученный временной промежуток – от семи до десяти лет регулярного гемодиализа – весовой вклад показателей интегрального нормированного выхода калия значительно возрастает: сумма абсолютных значений величин резистентности к действию нистатина превышает 80% от абсолютной величины вклада концентрации креатинина.

Критерием качества моделей в статусметрии служит число неверных классификаций; в рассматриваемом же случае все модели классифицируют состояние пациентов без ошибок. Таким образом, возникла задача поиска нового критерия различия состояний «до диализа – после диализа». Был применен критерий Махаланобиса, который позволяет определить расстояние между центрами двух сравниваемых групп в многомерном пространстве показателей. Результаты анализа показали, что наиболее радикальное влияние диализной сессии на состояние пациента наблюдается во второй-третий годы пребывания на заместительной почечной терапии (табл. 12).

Таблица  11

Наиболее информативные показатели в моделях состояния пациентов «до диализа – после диализа»

Показатель

Коэффициент bk

Показатель

Коэффициент bk

1 150 диализов

151 300 диализов

Время осмотического гемолиза

0,2141

Гематокрит

-0,1791

Калий

0,274

Осмотическая резистентность

-0,1853

Кальций

-0,6263

Масса тела больного

0,6263

Мочевина

0,4981

Кальций

-0,4638

Креатинин

0,4158

Мочевина

0,7726

Ny(SI)

0,2566

Pl+Ny (SI)

0,2456

301 450 диализов

451 600 диализов

Время осмотического гемолиза

-0,1832

Время кислотного гемолиза

0,0318

Время ультразвукового гемолиза

0,1177

АДдиаст

0,0764

Натрий

-0,1407

Натрий

-0,1184

Креатинин

0,8906

Мочевина

0,8922

Ny(0-10)

0,1289

Pl+Ny(40-45)

0,4279

Pl+Ny(25-35)

0,3508

601 750 диализов

751 1050 диализов

Осмотическая резистентность

-0,2341

Время кислотного гемолиза

0,0989

Время осмотического гемолиза

0,1756

Время ультразвукового гемолиза

0,1000

Фосфаты

0,0294

Калий

0,2433

Кальций

-0,1204

Фосфаты

0,0866

Мочевина

0,8719

Кальций

-0,3912

Ny(SI)

0,3726

Мочевина

0,8721

1051 1500 диализов

Натрий

-0,368

Фосфаты

0,283

Кальций

-0,2369

Креатинин

0,7331

Ou+Ny(0-3)

-0,3547

Ou+Ny(0-10)

0,2553

Примечание: для всех моделей ошибка 0%

Таблица 12

Интегральная оценка степени изменения состояния больных до и после  процедуры диализа с помощью критерия Махаланобиса

Число процедур диализа

Критерий Махаланобиса

1-150

17,714

151-300

64,992

301-450

165,680

451-600

32,804

601-750

38,894

751-1050

33,484

1051-1500

28,952

                                       

Вполне объяснимо, почему уровень критерия Махалонобиса, указывающего на степень различия между состояниями до и после процедуры, невелик в первый год: организм больного еще не успевает приспособиться к физиологическим и метаболическим сдвигам, происходящим при регулярном гемодиализе. На следующем этапе – в течение второго года пребывания на заместительной почечной терапии – происходит максимально возможное нивелирование последствий метаболической катастрофы, имеющей место при прогрессирующей уремии.

После трех лет пребывания на заместительной почечной терапии различия между состояниями «до диализа» и «после диализа» резко уменьшаются с дальнейшим постепенным медленным снижением. Подобный скачок можно трактовать двояко: с одной стороны, он может служить сигналом исчерпания возможностей качественных позитивных изменений при диализной терапии, с другой же – маркером позиционирования пациента как уже адаптированного к диализу, а не просто релаксирующего при снижении манифестирования симптомокомплекса ХПН. В пользу последнего утверждения говорит постепенное повышение стабильности мембран эритроцитов в интервале с 5 до 7 лет, прошедших с начала гемодиализной терапии. Однако определенная разнонаправленность изменений качества билипидного слоя (с увеличением резистентности к действию нистатина) и качества мембраны в целом (с увеличением осмотической резистентности) может быть воспринята как вариант негативного воздействия самого гемодиализа.

Следует отметить, что вплоть до 6-го – 8-го года диализной терапии (до 1050 диализных сессий) из всех типов ИНВК наиболее информативными являются показатели, связанные либо с действием на плазматическую мембрану компонентов нативной плазмы, либо с ферментативной ионтранспортирующей способностью, то есть с величиной площади инверсии кинетической кривой. После указанного временного рубежа среди информативных показателей появляются величины интегрального нормированного выхода калия, но только при предварительном воздействии уабаина. При таких длительных сроках гемодиализной терапии, вероятно, собственные ресурсы мембраны уже недостаточны для реализации ее защитных свойств, а поскольку первоочередной задачей клетки остается сохранение своей целостности, даже в ущерб функционированию мембранного транспортного звена, осуществляется стабилизация внутреннего слоя. Возможно, в этот момент необходимо специфическое мембранопротекторное применение не только антиоксидантов, но и препаратов, являющихся поставщиками субстратов для формирования гидрофобных протяженных структур. Таким образом, поддерживающая мембраностабилизирующая терапия весьма актуальна на всех этапах лечения регулярным гемодиализом.

Снижение величины критерия Махалонобиса, то есть различий между состояниями пациента до и после диализной сессии, к восьмому-десятому году диализной терапии с одновременным увеличением значимости показателей резистентности может служить сигналом к изменению формы экстракорпоральной детоксикации.

Результаты исследования позволили обосновать следующие выводы и практические рекомендации.

Выводы

1. Применение метода ионометрии с использованием миниатюрных ионселективных электродов и ионселективных полевых транзисторов позволяет получить концентрационные динамические характеристики транспорта ионов через мембраны эритроцитов человека.

2. Динамика изменения внеклеточной концентрации электролитов при формировании в мембране эритроцита человека неселективных гидрофильных каналов характеризует резистентность мембран по отношению к действию каналоформера.

3. Резистентный ответ эритроцитов человека на внешнее действие нистатина включает в себя активный противоградиентный ионный транспорт и инактивацию каналов, совокупный вклад которых может быть оценен с помощью модели одномерной диффузии. При этом интенсивность действия каналоформера дозозависима, однако механизм отклика мембраны не зависит от содержания каналоформера в пробе.

4. Показатель «интегральный нормированный выход калия» адекватно характеризует резистентность мембраны эритроцита по отношению к внешнему действию каналоформера и может быть использован для оценки качества мембраны.

5. «Интегральный нормированный выход калия» для мембран эритроцитов пациентов гемодиализа значимо отличается от этого показателя для мембран эритроцитов лиц без ренальной патологии.

6. Синтетические и нативные эффекторы могут существенно изменять резистентность мембран эритроцитов больных, получающих лечение регулярным гемодиализом, по отношению к внешнему действию каналоформера, как повышая, так и понижая устойчивость клеточных структур; в отдельных случаях их действие парадоксально.

7. Резистентность по отношению к действию каналоформера и все типы общей резистентности эритроцитов: кислотная, осмотическая, ультразвуковая, – суть разные характеристики эритроцитарной мембраны; при оценке качества ее функционирования эти показатели дополняют друг друга.

8. Качество мембран эритроцитов у больных, получающих заместительную почечную терапию гемодиализом, не меняется на начальном этапе лечения регулярным гемодиализом, но имеет положительную динамику по прошествии 6-8 лет адекватного диализа.

9. Метод статусметрии позволяет создать модель состояния больного «до диализа – после диализа»; при этом в различные периоды заместительной терапии регулярным гемодиализом наиболее информативными становятся разные клинические и биофизические показатели, связанные с качеством очистки во время сеанса и с интенсивностью функционирования мембранных систем.

Практические рекомендации

1. Для оценки качества плазматических мембран пациентов гемодиализа рекомендуется наряду с определением показателей общей резистентности использовать определение интегрального нормированного выхода калия, позволяющего охарактеризовать состояние билипидного мембранного слоя, подвергающегося наибольшим изменениям при хронической болезни почек.

2. Наиболее тщательный мониторинг качества мембран следует проводить на начальном этапе терапии регулярным гемодиализом, а затем на 3-4-ый год пребывания пациента на заместительной почечной терапии.

3. Для определения концентрации ионов щелочных и щелочноземельных металлов в минимизированных пробах биологических жидкостей рекомендуется наряду с миниионселективными электродами использовать ионселективные полевые транзисторы с фотополимеризуемой полиуретановой сенсорной мембраной.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ


Статьи в журналах по перечню ВАК России
  1. Борисов Ю.А. Ионометрическое  изучение потоков Na+ и К+ через мембрану эритроцитов человека, модифицированную нистатином. / Ю.А. Борисов, О.Ю. Соболева, Е.Д. Суглобова, А.И. Щербак. // Цитология. – 1991. – Т. 33, №1. – С. 24-32.
  2. Борисов Ю.А. Транспорт ионов Na+ и К+ через мембрану эритроцитов при формировании в ней нистатиновых каналов в условиях in vitro: некоторые  особенности и анализ процессов. / Ю.А. Борисов, О.Ю. Соболева, Е.Д. Суглобова, Е.Е. Федорович // Цитология. – 1994. – Т. 36, № 5. – C. 427-436.
  3. Суглобова Е.Д. Биофизические характеристики мембран эритроцитов у больных, получающих лечение регулярным гемодиализом. 1. Резистентность к действию внешнего каналоформера. / Е.Д. Суглобова, В.Н. Спиридонов, Ю.А. Борисов, Э.Б. Лебедева, П.В. Гавриленков // Нефрология. – 1998. – Т.2, № 4. – C. 68-75.
  4. Legin A. Chemical sensor array for multicomponent analysis of biological liquids. / A. Legin, A. Smirnova, E. Suglobova, A. Rudnitskaya, L. Lvova, Y.Vlasov // Anal. Chim. Acta. – 1999. – V. 385. – P. 131-135.
  5. Абрамова Н.Ю. Применение ионселективных полевых транзисторов (ИСПТ) с фотополимеризуемыми полиуретановыми мембранами в нефрологии для определения концентрации (активности) ионов калия. / Н.Ю. Абрамова, Ю.А. Борисов, А.В. Братов, П.В. Гавриленков, К. Домингес, В.Н. Спиридонов, Е.Д. Суглобова // Вопросы медицинской химии. – 1999. – Т. 45, № 6. – С. 530-538.
  6. Рябов С.И. Варианты коррекции нарушений фосфорно-кальциевого обмена у больных, получающих лечение регулярным гемодиализом. / С.И. Рябов, В.Н. Спиридонов, Е.Д. Суглобова, И.А. Ракитянская, Т.М. Бурова, М.М. Парастаева, И.М. Кузнецова, Э.Б. Лебедева, П.В. Гавриленков // Нефрология. – 2000. – Т.4, № 2. – С. 82-86.
  7. Abramova N. Application of an ion-selective field effect transistor with a photocured polymer membrane in nephrology for determination of potassium ions in dialysis solutions and in blood plasma. / N. Abramova, Yu. Borisov, A. Bratov, P. Gavrilenkov, C. Dominguez, V. Spiridonov, E. Suglobova // Talanta. – 2000. – V.52. – P. 533-538.
  8. Абрамова Н.Ю. Ионоселективные полевые транзисторы (ИСПТ, ISFET) с фотополимеризуемыми полиуретановыми мембранами как новые перспективные датчики для мониторинга диализирующих растворов и определения концентрации электролитов у больных на хроническом гемодиализе. / Н.Ю. Абрамова, Ю.А. Борисов, А.В. Братов, П.В. Гавриленков, К. Домингес, В.Н. Спиридонов, Е.Д. Суглобова // Нефрология. – 2000. – Т. 4, № 4. – С. 91-97.
  9. Васильев А.Н. Современные подходы к коррекции нарушений фосфорно-кальциевого обмена у больных, получающих лечение регулярным гемодиализом. / А.Н. Васильев, П.В. Гавриленков, В.Н. Спиридонов, Е.Д. Суглобова // Нефрология – 2003. – Т.7, Прил. 1. – С. 79-84.
  10. Смирнов А.В. Артериальная гипертензия как фактор риска повышенной летальности у больных, получающих лечение методом хронического гемодиализа, и подходы к ее коррекции. / А.В. Смирнов, В.Г. Рыков, Е.Д. Суглобова, А.Н. Васильев // Нефрология – 2003. – Т.7, №3. – С. 7-13.
  11. Спиридонов В.Н. Кислотная, осмотическая и ультразвуковая резистентность эритроцитов больных, получающих лечение регулярным гемодиализом. / В.Н. Спиридонов, Ю.А. Борисов, Е.Н. Левыкина, Е.Д. Суглобова // Нефрология. – Т. 8, № 3. – 2004. – С. 22-31.
  12. Борисов Ю.А. Динамика выхода калия из эритроцитов человека в присутствии нистатина в среде Моргана и аутологичной плазме. / Ю.А. Борисов, Е.Д. Суглобова, А.И. Щербак // Ученые записки СПбГМУ им. акад. И.П.Павлова. – 2004. – Т. 11,  № 1. – С. 76-79.
  13. Смирнов А. В. Хронический гемодиализ и артериальная гипертензия. / А.В. Смирнов, В.Г. Рыков, Е.Д. Суглобова, А.Н. Васильев // Нефрология. – 2004. – Т. 8, Приложение 2. – С. 7-13.
  14. Спиридонов В.Н. Годы и жизнь (как объективная реальность) на регулярном гемодиализе. / В.Н. Спиридонов, Ю.А. Борисов, Э.Б. Лебедева, Е.Н. Левыкина, Е.Д. Суглобова // Нефрология – 2005. – Т.9, № 3. – С. 35-47.
  15. Борисов Ю.А. Резистентность к внешнему действию каналоформера как характеристика клеточных мембран пациентов гемодиализа. / Ю.А. Борисов, Э.Б. Лебедева, В.Н. Спиридонов, Е.Д. Суглобова // Нефрология – 2007. – Т.11, № 1. – С. 38-54.

Методические указания

  1. Галебская Л.В. Методические указания к лабораторному практикуму по биохимии. / Л.В. Галебская, Т.С. Фрейдлин, Е.Д. Суглобова, П.П. Бельтюков, В.В. Дорофейков // Л.: 1 ЛМИ, 1990. – 84 с.

Прочие публикации

  1. Борисов Ю.А. Калибровочные системы растворов при ионометрическом  определении концентраций  Na+  и К+ в биологических жидкостях. / Ю.А. Борисов, О.Ю. Соболева, Е.Д. Суглобова // Материалы 17-ой Межвузовской Конференции. – Л.: ЛГУ, 1989. – C. 56-57.
  2. Борисов Ю.А. Изменение внеклеточных концентраций Na+ и К+ при действии нистатина на эритроциты человека, ресуспендированные в различных солевых средах. / Ю.А. Борисов, О.Ю. Соболева, Е.Д. Суглобова // Материалы 18-ой Межвузовской Конференции. – Л.: ЛГУ, 1990. – С. 23-24.
  3. Борисов Ю.А. Использование метода ионометрии для изучения функционирования К,Na-АТФ-азы. / Ю.А. Борисов, О.Ю. Соболева, Е.Д. Суглобова. // Научно-техническое творчество молодежи – практическому здравоохранению. –  Л.: 1 ЛМИ им. Павлова, 1990. – С. 28-29.
  4. Борисов Ю.А. Скорость взаимодействия полиенового антибиотика нистатина с эритроцитарными мембранами. / Ю.А. Борисов, О.Ю. Соболева, Е.Д. Суглобова. // Материалы 19-ой Межвузовской Конференции. –  Л.: ЛГУ, 1991. – С. 36-37.
  5. Спиридонов В.Н. Резистентность мембран эритроцитов больных, получающих лечение регулярным гемодиализом, по отношению к внешнему химическому воздействию. / В.Н. Спиридонов, П.В. Гавриленков, Э.Б. Лебедева, Е.Д. Суглобова // Материалы Рабочего совещания главных нефрологов и заведующих отделениями хронического гемодиализа «Диализное лечение больных с ХПН». – СПб., 1995. – С. 71.
  6. Спиридонов В.Н. Функциональные особенности мембраны эритроцитов у больных с хронической почечной недостаточностью, получающих лечение регулярным гемодиализом. / В.Н. Спиридонов, Е.Д. Суглобова, Е.В. Буякина, Н.Н. Будучина // Материалы 4-ой Конференции нефрологов Северо-запада России «Проблемы ХПН». – Иматра, 1995. – С. 122-123.
  7. Суглобова Е.Д. Действие гемодиализа на функционирование эритроцитарной мембраны, перфорированной нистатином, у больных с хронической почечной недостаточностью. / Е.Д. Суглобова, В.Н. Спиридонов, Е.В. Буякина, А.В. Гирев // Впервые в медицине. – 1995. – № 1. – C. 5.
  8. Суглобова Е.Д. Изменение резистентности мембраны эритроцитов больных, получающих лечение регулярным гемодиализом, при действии полиенового каналоформера. / Е.Д. Суглобова, В.Н. Спиридонов, Э.Б. Лебедева, П.В. Гавриленков // Сборник материалов Рабочего совещания нефрологов Северо-запада России «Нефрология». – СПб., 1996. – С. 92-93
  9. Суглобова Е.Д. Исследование функции К+-ионселектив-ных полевых транзисторов на основе фотополимеризуемых полиуретановых мембран в биологических средах. / Е.Д. Суглобова, В.Н. Спиридонов, П.В. Гавриленков // Сенсоры. Сенсорные системы. Часть 1. – СПб.: СПбГУ, 1997. – С. 38-40.
  10. Борисов Ю.А. Применение датчиков нового поколения – ионоселективных полевых транзисторов (ИСПТ, ISFET) – для определения активности ионов К+ в биологических жидкостях. / Ю.А. Борисов, П.В. Гавриленков, Е.Д. Суглобова // Фундаментальные и прикладные аспекты современной биохимии: Труды  научной конференции, посвященной 100-летию кафедры биохимии СПбГМУ им. Акад. И.П. Павлова. – СПб.: СПбГМУ, 1998. – Т. 2. – С. 522-526. 
  11. Борисов Ю.А. Взаимосвязь между некоторыми биофизическими характеристиками эритроцитарных мембран у пациентов на хроническом гемодиализе. Фундаментальные и прикладные аспекты современной биохимии. / Ю.А. Борисов, П.В. Гавриленков, Е.Д. Суглобова // Фундаментальные и прикладные аспекты современной биохимии: Труды научной конференции, посвященной 100-летию кафедры биохимии СПбГМУ им. Акад. И.П.Павлова. – СПб.: СПбГМУ, 1998. – Т. 2. – С. 526-530.
  12. Спиридонов В.Н. Кислотный гемолиз эритроцитов как характеристический метод оценки эффективности процедуры гемодиализа на уровне клетки. / В.Н. Спиридонов, Ю.А. Борисов, П.В. Гавриленков, И.В. Кузнецова, Э.Б. Лебедева, Е.Д. Суглобова // Актуальные вопросы клиники, диагностики и лечения: Тезисы докладов научной конференции, посвященной 200-летию ВМА. – СПб., 1999. – С. 472-473.
  13. Борисов Ю.А. Перспективы применения новых технологий для мониторинга электролитного состава диализирующих растворов и плазмы крови больных, получающих лечение хроническим гемодиализом. / Ю.А. Борисов, П.В. Гавриленков, Е.Д. Суглобова, И.Г. Щербак // Материалы 6-ой конференции нефрологов Северо-запада России. – Нефрология. – 2000. – Т. 4, № 2. – С. 97-98.
  14. Спиридонов В.Н. Резистентность эритроцитов к кислотному, осмотическому и ультразвуковому воздействию у больных, получающих лечение гемодиализом. / В.Н. Спиридонов, Е.Д. Суглобова, И.М. Кузнецова, Э.Б. Лебедева, П.В. Гавриленков // Материалы 6-ой конференции нефрологов Северо-запада России. – Нефрология. – 2000. – Т. 4, № 2. – С. 127.
  15. Гавриленков П.В. Проблемы адекватного определения концентрации ионизированного кальция и рН крови у больных на регулярном гемодиализе. / П.В. Гавриленков, Н.Я. Губарь, И.М. Кузнецова, В.Н. Спиридонов, Е.Д. Суглобова // Материалы 6-ой конференции нефрологов Северо-запада России. – Нефрология. – 2000. – Т. 4, № 2. – С. 98-99.
  16. Гавриленков П.В. Сравнительная оценка состояния мембран эритроцитов у больных, получающих лечение нормокальциевым и низкокальциевым хроническим гемодиализом./ П.В. Гавриленков, Е.Д. Суглобова, В.Н. Спиридонов, Ю.А. Борисов, И.М. Кузнецова, Э.Б. Лебедева //  9-ая всероссийская конференция по физиологии и патологии почек и водно-солевого обмена: Материалы. – СПб., 2001. – С. 124-125.
  17. Спиридонов В.Н. Воздействие плазмы крови на функции эритроцитарной мембраны в процессе сеанса гемодиализа. / В.Н. Спиридонов, Е.Д. Суглобова, И.М. Кузнецова, Э.Б. Лебедева, П.В. Гавриленков //  9-ая всероссийская конференция по физиологии и патологии почек и водно-солового обмена: Материалы. – СПб., 2001. – С. 153-154.
  18. Спиридонов В. Н. Динамика гемолиза и некоторых лабораторных показателей у больных ХПН в процессе лечения заместительной почечной терапией / В.Н. Спиридонов, Е.Д. Суглобова, Ю.А. Борисов, Е.Н. Левыкина // «Болезни почек: эпидемиология, диагностика, лечение». Всероссийская научно-практическая конференция (27-28 сентября 2004 г., г. Кызыл): Материалы. –  Нефрология. – 2004. – Т. 8, Приложение 2. – С. 225.
  19. Смирнов А.В. Микроэлементы и гемодиализ: концентрации не изменяются после сеанса. / А.В. Смирнов, Ю.А. Борисов, Н.Я. Губарь, В.Н. Спиридонов, Е.Д. Суглобова //«Болезни почек: эпидемиология, диагностика, лечение». Всероссийская научно-практическая конференция (27-28 сентября 2004 г., г. Кызыл): Материалы. –  Нефрология. – 2004. – Т. 8, Приложение 2. – С. 222-223.
  20. Суглобова Е.Д. Функциональное состояние эритроцитарной мембраны у  больных с ХПН, получающих заместительную терапию регулярным гемодиализом. / Е.Д. Суглобова, Ю. А. Борисов, В.Н. Спиридонов, Э.Б. Лебедева, Е.Н. Левыкина // IV Конференция РДО (11-13 сентября 2005 г., г. Санкт-Петербург): Материалы. – Нефрология и диализ. – 2005. – Т. 7, № 3. – С. 299.
  21. Борисов Ю.А. Концентрация холестерина в крови и качество эритроцитарных мембран больных, получающих лечение регулярным гемодиализом./ Ю.А. Борисов, Е.Д. Суглобова // Научная сессия общего собрания СЗО РАМН «Фундаментальные и прикладные исследования в области атеросклероза» (8 – 9 ноября 2006 г.): Материалы, – Мед. Акад. Журн. – 2006. – Т.7, № 1, Приложение. – С. 39.

Автор считает своим долгом выразить искреннюю благодарность проректору СПбГМУ им. акад. И.П. Павлова по лечебной работе, директору НИИ нефрологии, заведующему кафедрой пропедевтики внутренних болезней, доктору медицинских наук, профессору Алексею Владимировичу Смирнову за неоценимую помощь в организации этой работы.






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.