WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

На правах рукописи

Винокуров Максим Григорьевич

ИССЛЕДОВАНИЕ МЕХАНИЗМОВ ДЕЙСТВИЯ ЛИПОПОЛИСАХАРИДА RHODOBACTER CAPSULATUS НА ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ОТВЕТЫ И АПОПТОЗ ФАГОЦИТОВ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА ПРИ АКТИВАЦИИ ЭНДОТОКСИНАМИ

14.00.16 – патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва 2007

Работа выполнена в лаборатории экстремальных состояний НИЦ ГОУ ММА им.

И.М. Сеченова Росздрава и в лаборатории регуляции апоптоза ИБК РАН

Научный консультант:

академик РАМН доктор медицинских наук, профессор Сергей Витальевич ГРАЧЕВ

Официальные оппоненты:

Чл.-корр. РАМН доктор медицинских наук, профессор Геннадий Васильевич ПОРЯДИН Чл.-корр. РАМН доктор медицинских наук, профессор Виталий Кузьмич РЕШЕТНЯК доктор биологических наук, профессор Юрий Владимирович АРХИПЕНКО

Ведущая организация:

Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии РАМН

Защита состоится « » _______________ 2007г. в « » часов на заседании Диссертационного совета Д 212. 203. 06 в Российском Университете дружбы народов по адресу:

117198, Москва, ул. Миклухо-Маклая, д.8, медицинский факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Российского Университета дружбы народов по адресу:

117198, Москва, ул. Миклухо-Маклая, д.

Автореферат разослан «……»…….…………….2007г.

Ученый секретарь Диссертационного совета Доктор медицинских наук, профессор Галина Александровна ДРОЗДОВА

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Эндотоксиновый шок является ведущей причиной смертности при грамотрицательном сепсисе, в патогенезе которого ключевая роль принадлежит эндотоксинам [Rietschel et al., 1994]. В США [Angus et al., 2001] и в странах Европы [Riederman et al., 2003] ежегодно более чем у 500000 пациентов развивается сепсис, причём количество подтверждённых случаев растёт на ~1,5% в год, несмотря на многолетние исследования, направленные на поиск подходов к лечению. Летальность при сепсисе (даже в условиях комплексной терапии) варьирует в пределах от 20% до 40%, а в случае развития инфекционно-токсического шока может достигать 40-80% [Bone, 1991;

Martin et al., 2003].

Попадая в кровоток, эндотоксины (несекретируемые липополисахариды (LPS)) взаимодействуют с миелоидными клетками - нейтрофилами и моноцитами, играющими важную роль в патогенезе сепсиса. Установлено, что в патогенезе сепсиса ключевую роль играет активация этих клеток [Ulmer et al., 2002; Weigand et al., 2004] и увеличение их числа. Активация клеток-мишеней эндотоксинами вызывает синтез провоспалительных цитокинов, обладающих ауто- и паракринным действием. Высвободившиеся циркулирующие свободные цитокины активируют клетки различных тканей и органов, индуцируя метаболические, гормональные и нейроэндокринные изменения в организме, что в конечном итоге приводит к развитию эндотоксинового шока [Rietschel et al., 1996].

Исследования действия эндотоксинов нашли отражение в развитии терапии бактериальных инфекций, начиная с применения сорбентов и заканчивая вмешательством в механизмы нарушения гемостаза. Современная терапия включает ингибирование синтеза простагландинов, блокирование медиаторов воспаления, использование кортикостероидов и ингибиторов коагуляции [Пак, 2003]. Следует, однако, отметить, что большинство клинических приёмов, направленных на блокаду специфических провоспалительных медиаторов, а также использование растворимых рецепторов для связывания цитокинов, оказались безуспешными [Riedermann et al., 2003; Van Amersfoort et al., 2003].

Поскольку клетки врожденного иммунитета в ответ на эндотоксины экспрессируют специфические для них рецепторы, в настоящее время пытаются для лечения эндотоксинового шока использовать вещества, способные конкурировать с эндотоксинами за рецепторы к ним.

В связи с этим в данной работе в качестве антагониста эндотоксинов использовался липополисахарид из Rhodobacter capsulatus PG (LPSRb.caps.). Ранее для LPS из Rhodobacter capsulatus B10 была показана способность защитного действия от некоторых эффектов эндотоксинов: на мышах линии C57/B16 - от ингибирующего действия эндотоксинов на ферментативную активность, связанную с системой цитохрома Р450, и на нейтрофилах человека – по подавлению Са+2-ответа, индуцируемого различными эндотоксинами [Грачёв и др., 1998, Асташкин и др., 1999].

Помимо воздействия на функциональную активность фагоцитов крови, эндотоксины изменяют регуляцию апоптоза этих клеток. Эндотоксины увеличивают время жизни нейтрофилов, ингибируя их апоптоз, и нарушают процесс клиренса этих клеток из тканей, что приводит к усилению повреждения тканей при воспалении [Keel et al., 1997; Jimenez et al., 1997; Sheth et al., 2001]. В настоящее время направленная регуляция апоптоза нейтрофилов рассматривается как возможный терапевтический подход для коррекции ряда заболеваний, в том числе сепсиса [Oberholzer et al., 2001; Perl et al., 2006], однако число работ, посвященных направленной модуляции апоптоза нейтрофилов при сепсисе, невелико [Oberholzer et al., 2001].

К настоящему времени исследованы различные механизмы активации апоптоза нейтрофилов. Установлено, что ключевая роль в его активации принадлежит суперсемейству TNF-альфа рецепторов, в том числе и Fasрецептору [Маянский и др., 2000; Hanna et al., 2005]. Выявлено, что индукция апоптоза нейтрофилов под действием Fas-лиганда снижает экстравазацию нейтрофилов и повреждение тканей при воспалении [Suzuki et al., 2006].

Тримеризация Fas-рецептора, помимо действия Fas-лиганда и анти-Fas моноклональных антител (анти-Fas АТ), может быть вызвана действием ультрафиолетового излучения диапазона С (УФС) [Rehemtulla et al., 1997], являющегося индуктором апоптоза в некоторых типах клеток [Martin et al., 1995;

Новожилова и др., 1996; Li et al., 2002; Takasawa et al., 2005].

До настоящего времени остаются малоисследованными аспекты взаимодействия разных хемотипов эндотоксина с клетками-мишенями. Для большинства клинических изолятов E. сoli характерен S-хемотип LPS [Heinrichs et al., 1998]. Вместе с тем известно, что структура эндотоксинов влияет на развитие патологических процессов, однако влияние олигосахаридов кора и полисахаридной составляющей (О-антигена) липополисахаридов на развитие патологических процессов, вызываемых эндотоксинами, изучено значительно меньше [Feist et al., 1989; Lentschat et al., 1999; Loppnow et al., 1989] по сравнению с эффектами, обусловленными липидом А [Mller-Loennies et al., 1998]. Число работ, посвященных выяснению влияния хемотипа эндотоксинов на активацию нейтрофилов, невелико. Отсутствуют работы, касающиеся изучения влияния хемотипа эндотоксинов на апоптоз нейтрофилов.

Все вышеизложенное обусловило необходимость проведения экспериментов, направленных на выявление возможного модулирующего действия липополисахарида Rhodobacter capsulatus PG и ультрафиолетового излучения на функционирование фагоцитов крови человека при действии эндотоксинов разной структуры. Полученные новые данные позволят расширить понимание закономерностей и особенностей функционирования миелоидных клеток при действии липополисахаридов разной структуры и разработать подходы для направленной коррекции функционального состояния клеток врожденного иммунитета периферической крови, вызванного действием эндотоксинов.

Цель и задачи диссертационного исследования. Цель данной работы заключалась в исследовании механизмов действия липополисахарида Rhodobacter capsulatus PG на функциональные ответы и апоптоз фагоцитов крови человека при действии эндотоксинов.

Задачи исследования:

1. Исследовать действие LPS Rhodobacter capsulatus PG на функциональные ответы миелоидных клеток при действии эндотоксинов, в том числе на:

1) адгезионные свойства нейтрофилов;

2) генерацию активных форм кислорода нейтрофилами и моноцитами;

3) фагоцитоз нейтрофилами различных объектов фагоцитоза.

2. Исследовать влияние LPS Rhodobacter capsulatus PG на регуляцию апоптоза фагоцитов при действии эндотоксинов.

3. Исследовать влияние хемотипа эндотоксинов на защитное действие Rhodobacter capsulatus PG.

4. Исследовать взаимодействие LPS разной структуры с рецепторами миелоидных клеток, входящими в рецепторный комплекс эндотоксинов.

5. Исследовать влияние Fas- и ультрафиолет С - опосредованного апоптоза на клеточный ответ нейтрофилов при действии эндотоксинов.

Научная новизна исследования. Значительная часть результатов, приведенных в данной работе, носит приоритетный характер. В работе впервые проведено систематическое исследование действия липополисахарида Rhodobacter capsulatus PG (LPSRb.caps.) на функциональные ответы миелоидных клеток периферической крови человека при действии эндотоксинов разной структуры. Показано, что LPSRb.caps. снижает адгезию нейтрофилов, индуцированную эндотоксинами, по механизму подавления экспрессии 2интегринов нейтрофилов.

В проведенных экспериментах установлена способность LPSRb.caps.

снижать эндотоксин-индуцируемое ингибирование апоптоза нейтрофилов.

Показано, что при действии LPSRb.caps. происходит подавление продукции активных форм кислорода (АФК) нейтрофилами и моноцитами, индуцированное эндотоксинами. LPSRb.caps. ингибирует эндотоксин-индуцированное увеличение фагоцитоза нейтрофилами различных объектов фагоцитоза. При этом у нейтрофилов, не активированных эндотоксином, не происходит увеличения фагоцитарной активности.

Обнаружено, что время защиты функциональных ответов нейтрофилов липополисахаридом Rhodobacter capsulatus PG реализуется в интервале 2-5 мин.

Установлено, что липополисахарид Rhodobacter capsulatus PG (в диапазоне концентраций от 10 нг/мл до 1000 нг/мл) в отсутствии эндотоксинов не вызывает изменения экспрессии мембранных рецепторов, участвующих в эндотоксининдуцируемой активации этих клеток.

Проведено сравнительное исследование действия разных хемотипов эндотоксина E. coli (S-, Ra-, Rc- и Re-) на продукцию АФК и апоптоз нейтрофилов. Показано, что возрастание величины продукции АФК нейтрофилами в ряду хемотипов (S-LPS > Ra-LPS > Rc-LPS > Re-LPS) зависит от длины полисахаридной цепи эндотоксина и максимальна для S- хемотипа исследованных эндотоксинов. С уменьшением длины полисахаридной цепи наблюдается увеличение ингибирования апоптоза нейтрофилов под действием исследованных эндотоксинов. Показано, что липополисахарид Rhodobacter capsulatus PG одинаково снижает активацию нейтрофилов при действии эндотоксинов независимо от их хемотипа.

Исследование механизмов действия LPSRb.caps. на фагоциты крови при их активации эндотоксинами показало, что защитные эффекты липополисахарида Rhodobacter capsulatus PG связаны с его способностью конкурировать с эндотоксинами за специфические клеточные рецепторы.

При сравнительном изучении эффективности задержки эндотоксининдуцированного ингибирования апоптоза нейтрофилов при действии индукторов апоптоза (УФС и анти-Fas АТ) установлена бльшая эффективность ультрафиолетового излучения.

Результаты, полученные при исследовании действия липополисахаридов разной структуры на функциональные ответы и апоптоз фагоцитов крови человека, являются важным дополнением к имеющимся литературным данным по взаимосвязи состава и биологической активности эндотоксинов и их антагонистов.

Практическая значимость работы 1. Результаты работы указывают на то, что липополисахарид из Rhodobacter capsulatus PG не только не активирует фагоциты крови человека в широком диапазоне исследованных концентраций, но и проявляет свойства антагониста эндотоксинов различных хемотипов, блокируя связывание эндотоксинов со специфическими рецепторами исследованных клеток-мишеней.

2. Оценка функциональной активности клеток врождённого иммунитета использованным в работе комплексом методов может быть применена для коррекции восстановительной терапии сепсиса.

3. LPSRb.caps. может быть рекомендован для разработки и создания препарата для профилактики и лечения эндотоксинового шока.

4. Полученные в результате проведённых исследований данные позволяют рекомендовать LPSRb.caps. в качестве инструмента для изучения механизмов действия антагонистов эндотоксинов, а также для тестирования потенциальных антагонистов эндотоксинов.

5. Ультрафиолетовое излучение диапазона С снижает время жизни активированных эндотоксином нейтрофилов, активируя их апоптоз.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Липополисахарид из Rhodobacter capsulatus PG обладает способностью блокировать эндотоксин-индуцированные функциональные ответы фагоцитов периферической крови человека при последующем действии эндотоксинов.

2. Хемотип эндотоксина влияет на характер ингибирования апоптоза и продукцию активных форм кислорода нейтрофилами.

3. Липополисахарид из Rhodobacter capsulatus PG подавляет эндотоксининдуцированную задержку апоптоза миелоидных клеток человека.

4. Липополисахарид Rhodobacter capsulatus PG снижает эндотоксининдуцируемую активацию миелоидных клеток по механизму взаимодействия со специфическими рецепторами эндотоксинов клеток-мишеней.

5. Ультрафиолетовое излучение диапазона С более эффективно, чем анти-Fas моноклональные антитела, снижает эндотоксин-индуцированное ингибирование апоптоза нейтрофилов.

Внедрение результатов в практику. Результаты проведенной работы дополняют представления о механизмах взаимодействия эндотоксинов разной структуры и их антагонистов с клетками врожденного иммунитета, а также о механизмах защиты организма на клеточном уровне. Полученные результаты используются в учебном процессе при преподавании раздела о патогенезе сепсиса магистрантам Пущинского ГУ, а также для выполнения магистерских и кандидатских диссертаций. Полученные результаты применяются также в отделении кардиологии Больницы Пущинского научного центра РАН при проведении терапии с использованием аутотрансфузии облученной ультрафиолетом крови.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на научно – практической конференции “Здоровье, профилактика и эндоэкологическая реабилитация. Новые медицинские технологии” (Пущино, 1998); III открытой городской научной конференции молодых ученых (Пущино, 1998); конференции ”Горизонты физико-химической биологии” (Пущино, 2000);

Международной конференции “Митохондрии, клетки и активные формы кислорода” (Пущино, 2000), конференции “Патофизиология и современная медицина” (Москва, 2000), Международном симпозиуме “Biological motility: new trends in research” (Pushchino, 2001), II Всероссийском симпозиуме по кардиологии (Москва, 2001), конференции “От современной фундаментальной науки к новым наукоёмким технологиям” (Пущино, 2001), XIV зимней международной научной школе “Перспективные направления физикохимической биологии и биотехнологии” (Москва, 2002); 6 Пущинской конференции молодых ученых «Биология – наука 21-го века» (Пущино, 2002);

конференции “От современной фундаментальной биологии к новым наукоемким технологиям” (Пущино, 2002); 7 Пущинской конференции молодых ученых «Биология – наука 21-го века» (Пущино, 2003); Международном семинаре «Экология и здоровье, экологическая медицина. Управление качеством жизни» (Москва, 2003); конференции “Инфекционные и паразитарные болезни в современном обществе” (Москва, 2003); международном симпозиуме «Biological motility» (Pushchino, 2004), I Международной конференции “Молекулярная медицина и биобезопасность” (Москва, 2004); конференции «Фундаментальные науки – медицине. Программа фундаментальных исследований Президиума РАН» (Москва, 2004); I Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (Москва, 2004), Всероссийской конференции «Преобразование энергии света при фотосинтезе» (Пущино, 2005); конференции «Фундаментальные науки – медицине. Программа фундаментальных исследований Президиума РАН» (Москва, 2005).

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 52 научные работы, из них 29 в рецензируемых журналах.

Объём и структура диссертации Диссертация изложена на 192 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения результатов, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, включающего работы отечественных и 379 зарубежных авторов. Диссертационная работа иллюстрирована 2 таблицами и 45 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования В качестве объектов исследования использовались нейтрофилы и моноциты, выделенные из крови здоровых доноров.

В работе исследовали липополисахариды, полученные из фотосинтезирующих бактерий Rhodobacter capsulatus (лаборатория молекулярной биомедицины ИФПБ РАН), относящиеся к -подклассу Proteobacteria [Wiese et al., 1998].

В работе были использованы Re-LPS E. coli JM103, Rc-LPS E. coli J5, RaLPS E. coli EH100, относящиеся к R- хемотипу бактерий, LPS E. coli O55:B5, относящийся к S-хемотипу (“Sigma”) и LPS Salmonella typhimurium, относящийся к S-хемотипу (“Sigma”). Re-LPS E. coli JM103 был изолирован из бактерий методом Галанос [Galanos еt al., 1969] экстракцией смесью фенол/хлороформ/петролейный эфир. Препараты Re-LPS были проверены на содержание белков и нуклеиновых кислот по поглощению при 260 нм и 280 нм [Thorne et al., 1978].

Нейтрофилы выделяли из периферической крови здоровых доноров с помощью метода дифференциального центрифугирования на 2-х слойном градиенте фиколла-верографина (1,119 и 1,077).

Моноциты выделяли по методике [Almeida et al., 2000] центрифугированием мононуклеарной фракции (полученной на градиенте фиколла-верографина плотностью 1,077 при выделении нейтрофилов) на градиенте перколла плотностью 1,064. Чистоту выделенных моноцитов контролировали с помощью проточной цитофлуориметрии, регистрируя CD14положительные клетки [Heinzelmann et al., 1998], а также с помощью светового микроскопа.

Жизнеспособность нейтрофилов и моноцитов контролировали методом проточной цитометрии c использование флуоресцентного зонда иодида пропидия (PI, 30 мкМ) путем измерения доли клеток, непроницаемых для PI от общего количества клеток (в присутствии 40 мкг/мл дигитонина) [Afanasyev et al., 1993] Для исследования апоптоза выделенные нейтрофилы (106/мл) культивировали в среде (КС), содержащей RPMI-1640, 1% L-глутамина, 1% пенициллина, 1% стрептомицина и 10% термоинактивированной эмбриональной сыворотки теленка (“Sigma”, США) при 370С в атмосфере с 5 % СО2 в течение часов.

Адгезию нейтрофилов проводили в 96-ти луночных плоскодонных планшетах (Nunc), покрытых фибриногеном (Shen et al., 1999), в присутствии 10% аутологической плазмы или 10% эмбриональной телячьей сыворотки. В опытную лунку (200 мкл) вносили 0,2x106 нейтрофилов. Величину адгезии определяли по количеству прилипших нейтрофилов и выражали в процентах (за 100% принимали максимальную адгезию). Жизнеспособность клеток во всех экспериментах по адгезии составляла 95–98% и соответствовала жизнеспособности контрольных клеток.

Величину адгезии определяли, регистрируя количество неприлипших клеток (методом проточной цитометрии с использованием флуоресцентномеченных латексов известной концентрации), а также регистрируя количество прилипших клеток. Для этого прилипшие клетки лизировали 1% холатом натрия и определяли их количество по содержанию общего белка по методу Лоури [Lowry et al., 1951], используя в качестве стандарта альбумин и лизат нейтрофилов в 1% холате натрия.

Кинетику образования АФК нейтрофилами и моноцитами определяли хемилюминесцентным методом [Владимиров, Шерстнёв, 1989] (с использованием люминола) в среде Хенкса, содержащей ионы Са2+ и Mg2+, 2% аутологической сыворотки. В качестве активатора продукции АФК нейтрофилами (0,2х106 клеток/мл) и моноцитами (0,1х106 клеток/мл) использовали 1 мкМ N-формил-метионил-лейцил-фенилаланина (fMLP), перед добавлением которого клетки инкубировали 25 мин при 370С (с и без добавления липополисахарида). Суммарную продукцию АФК рассчитывали как площадь под кривой зависимости интенсивности хемилюминесценции от времени.

Регистрацию хемилюминесценции осуществляли на люминометре 1250 LKB (Швеция) при 370С.

Образование АФК в нейтрофилах регистрировали также методом проточной цитофлуориметрии с использованием флуоресцентного зонда дигидрородамина 123 (1 мкМ) [Rothe et al., 1991].

Процент апоптозных клеток определяли методами проточной цитометрии с использованием флуоресцентного зонда Hoechst-33258. После окончания культивирования клетки фиксировали в 70% этаноле и хранили до регистрации при -200С. Фиксированные клетки окрашивали 1 мкг/мл флуоресцентного зонда Hoechst-33258 [Afanasyev et al., 1993]. Для регистрации апоптоза использовали Annexin V – FITC [Van Engeland et al., 1996], а также световую микроскопию (окраска по Романовскому).

Для изучения уровня экспрессии клеточных рецепторов CD11b/CD18, CD95, CD14 на поверхности нейтрофилов и моноцитов применяли метод проточной цитометрии с использованием соответствующих моноклональных антител, конъюгированных с флуоресцеинизотиоцианатом (FITC). Для регистрации экспрессии CD95 использовали вторичные козьи антитела, конъюгированные с R-фикоэритрином (Caltag, США).

Облучение ультрафиолетовым светом нейтрофилов проводили с использованием аппарата “Изольда” МФ-73М с бактерицидной лампой ДРБ-мощностью 6 Вт. Дозу облучения клеток регулировали, изменяя время экспозиции при постоянном расстоянии от окна прибора. Для дозиметрии использовали приборы «ULX-3W» и «Аргус-06». Клетки облучали в фосфатном буфере (рН 7,4) в силиконизированной стеклянной посуде.

Фагоцитарную активность нейтрофилов регистрировали на флуоресцентном микроскопе «Люмам» (ЛОМО, Россия). В качестве объекта фагоцитоза использовали FITC-меченные пекарские дрожжи [Zhang, 2003] и FITC-меченные, предварительно фиксированные, эритроциты барана [Винокуров и др., 1999). При приготовлении объектов фагоцитоза соотношение FITC/объект фагоцитоза контролировали с использование спектрофотометра “Specord M40” (“Carl Zeiss”, Германия) и проточного цитометра. Для регистрации флуоресценции FITC использовали светофильтры “Chroma” (США). Подсчет фагоцитированных пекарских дрожжей и эритроцитов вели в 1% растворе трипанового синего для тушения экстраклеточной флуоресценции FITC и для контроля жизнеспособности нейтрофилов после фагоцитоза.

Действие ингибиторов. Перед добавлением липополисахаридов и действием УФС, нейтрофилы инкубировали с ингибиторами PD98059, SB203580, Wortmannin, LY294002 в течение 30 мин.

Статистическую обработку результатов экспериментов проводили с помощью пакета статистических программ “Statgraphics”. Достоверность отличий контрольных и экспериментальных результатов оценивали при помощи t-критерия Стьюдента.

Результаты исследования и их обсуждение Исследование влияния структуры LPS на функциональные свойства клеток-мишеней привело к получению липополисахаридов (имеющих различия в структуре липида А), обладающих различной биологической активностью [Christian, Ulrich, 2002]. Однако механизмы взаимодействия этих соединений с клеточными рецепторами, а также их влияние на регуляцию функционирования клеток-мишеней в настоящее время изучены недостаточно.

В представленной работе проведены исследования действия эндотоксинов разной структуры и липополисахарида Rhodobacter capsulatus PG на активацию и реакции нейтрофилов и моноцитов, которые реализуются в организме при развитии эндотоксинового шока. В работе также исследовано действие индукторов апоптоза на апоптоз нейтрофилов, активированных эндотоксином.

1. Исследование действия LPS Rhodobacter capsulatus PG на функциональные ответы миелоидных клеток при действии эндотоксинов.

1.1. Изучение действия LPS разной структуры на адгезионные свойства нейтрофилов.

Бактериальные LPS вызывают в нейтрофилах разнообразные ответы, в том числе повышение уровня рецепторов [Vosbeck et al., 1990; Lundqvist et al., 1992], увеличение адгезии [Condliffe et al., 1999]. Известно, что под действием эндотоксинов происходит увеличение экспрессии 2–интегринов в мембране нейтрофилов [Lynn et al., 1991]. Эксперименты по адгезии нейтрофилов к поверхности были проведены в планшетах, покрытых фибриногеном, поскольку связывание нейтрофилов с фибриногеном реализуется через CD11b-рецепторы нейтрофилов [Ugarova et al., 2001]. Адгезия нейтрофилов при культивировании в течение 60-120 мин практически не изменялась.

Инкубирование культивируемых нейтрофилов в присутствии 100 нг/мл LPS Salmonella typhimurium (LPSS.typh.) (рис. 1, 4) и 500 нг/мл LPSS. typh. (рис. 1, 6) приводила к дозозависимому увеличению величины адгезии этих клеток при увеличении концентрации LPSS.typh.. Адгезия нейтрофилов при действии LPSRb.caps. (рис. 1, 1) была значительно меньше, чем адгезия в присутствии LPSS. typh. и близка к контролю (рис. 1, 2). Предварительное культивирование Рис. 1. Влияние различных LPS на 1адгезионные свойства нейтрофилов человека. 1, 3, 5 - 100 нг/мл LPSRb.caps.; 4 100 нг/мл LPSS. typh.; 6 - 500 нг/мл LPSS. typh..

2 - контроль. 3 и 5 - последовательное 40 инкубирование нейтрофилов с LPSRb.caps. и с 100 нг/мл (3) и 500 нг/мл (5) LPSS. typh..

Адгезия, % нейтрофилов в присутствии 100 нг/мл LPSRb.caps. (60 мин) значительно снижало величину адгезии нейтрофилов при последующем добавлении и культивировании (60 мин) с LPSS. typh. в концентрациях 100 нг/мл (рис. 1, 3) и 5нг/мл (рис. 1, 5) по сравнению с адгезией в присутствии только LPSS.typh..

Выраженный эндотоксин-активированнный ответ клеток человека характерен для липополисахаридов, полученных из E. сoli.

В состав липида А из E. сoli входит 6 остатков жирных кислот, распределенных несимметрично между двумя глюкозаминами (4+2), тогда как в состав липида А из Salmonella typhimurium входит 7 остатков жирных кислот, несимметрично распределенных между глюкозаминами.

Инкубация культивируемых нейтрофилов в течение 60 мин c липополисахаридом E. coli (LPSE. coli) (рис. 2, 1) приводила к дозозависимому увеличению адгезии нейтрофилов в интервале концентраций от 10 нг/мл 1Рис. 2. Действие липополисахаридов 1разной структуры на адгезию нейтрофилов человека. К- адгезия контрольных нейтрофилов. 1 - LPSE.coli; 2 последовательное инкубирование нейтрофилов с LPSRb.caps. и LPSE.coli; 3 20 LPSRb.caps..

0 101 102 1 Концентрация LPS, нг/мл до 1000 нг/мл. Количество адгезированных клеток изменялось от 25% (в контроле) до 100% при концентрации эндотоксина, равной 500 нг/мл. Действие LPSRb.caps. в этом же диапазоне концентраций не приводило к увеличению адгезии нейтрофилов при их культивировании в течение 2 часов (рис. 2, 3).

Предварительное культивирование клеток в течение 30 мин в присутствии LPSRb.caps. значительно снижало величину адгезии нейтрофилов при последующем добавлении LPSE.coli и культивировании (60 мин) по сравнению с адгезией в присутствии только LPSE.coli (рис. 2, 2).

Взаимодействие нейтрофилов с поверхностью, покрытой фибриногеном, идет с участием 2-интегриновых рецепторов, самой многочисленной Адгезия, % популяцией из которых являются CD11b/CD18 рецепторы [Ugarova & Yakubenko, 2001].

4Рис. 3. Связывание FITC3 конъюгированных K 3моноклональных антител к CD11b с нейтрофилами (1клеток/мл). К – контроль; 1 3LPSRb.caps.; 2 - LPSE.coli; 3 – нейтрофилы, инкубированные сначала с LPSRb.caps., затем с 2LPSE.coli.

K 10 100 10Концентрация LPS, нг/мл Связывание анти-CD11b-FITC меченых антител с контрольными нейтрофилами (рис. 3, К) практически не отличалось от связывания их с нейтрофилами, обработанными LPSRb.caps. (рис. 3, 1), но было существенно меньше величины связывания этих антител с нейтрофилами, обработанными LPSE.coli (рис. 3, 2). Предварительное инкубирование нейтрофилов с LPSRb.caps.

практически полностью отменяло эндотоксин-зависимое увеличение экспрессии CD11b/CD18 рецепторов этих клеток (рис. 3, 3).

Результаты проведенных исследований позволяют заключить, что LPSRb.caps. отменяет эндотоксин-активируемую адгезию нейтрофилов, обусловленную увеличением экспрессии CD11b/CD18 рецепторов этих клеток.

Эти данные могут иметь важное терапевтическое значение, поскольку известно, что при развитии грамотрицательного сепсиса происходит увеличение экстравазации нейтрофилов, нарушение процессов микроциркуляции и коагуляции, приводящие к тромбозу. В этих процессах важная роль принадлежит агрегации нейтрофилов друг с другом и с тромбоцитами, происходящая с участием CD11b/CD18 рецепторов [Anderson et al., 1986; Rinder et al., 1992].

Фуоресценция, отн.

ед.

1.2. Влияние LPS разной структуры на генерацию активных форм кислорода нейтрофилами и моноцитами.

Функциональные ответы фагоцитов в значительной степени зависят от их исходного функционального состояния. В организме эти клетки могут находиться в одном из трех функциональных состояний: покоящемся, праймированном (предактивированном) и активированном [Condliffe et al., 1998]. Эндотоксины оказывают праймирующее действие на клетки врожденного иммунитета, сопровождающееся усилением респираторного взрыва [Guthrie et al., 1984]. АФК, продуцируемые активированными нейтрофилами и макрофагами, связаны с воспалительными ответами клеток, которые сопровождаются повреждением тканей при септическом шоке [Oldner et al., 1999; Cheng et al., 1999; Lamarque and Whittle, 1995]. АФК играют также ключевую роль в патогенезе гемодинамической нестабильности и органной дисфункции [Haglund and Gerdin, 1991; Fukuyama et al., 1997; Omar et al., 1992].

Активацию фагоцитов проводили в присутствии 2% аутологической сыворотки, что позволило работать с физиологическими концентрациями эндотоксина, поскольку рецепторы фагоцитов распознают комплекс LPS-LBP в нанограммовых концентрациях [Antal-Szalmas, 2000].

Исследование действия липополисахаридов из E. coli и Rb. capsulatus на образование АФК в нейтрофилах (регистрируемое методом проточной цитометрии с использованием флуоресцентного зонда дигидрородамина123) показало, что LPSRb.caps. снижает эндотоксин-индуцированную продукцию АФК в исследованных клетках (рис. 4, 2) по сравнению с действием LPSE.coli (рис. 4, 1).

В отсутствии эндотоксина LPSRb.caps. в концентрации 100-1000 нг/мл даже незначительно уменьшает образование АФК (рис. 4, 3) по сравнению с контрольными клетками.

Анализ кинетики защитного действия LPSRb.caps. на образование АФК фагоцитами при воздействии эндотоксинов по регистрации люминол-зависимой хемилюминесценции (ХЛ) показал, что 80-ти процентное ингибирование эндотоксин-индуцированной активации происходит через 2 мин инкубирования и полная защита - через 4 минуты (данные не приведены). Величину ХЛ нейтрофилов в присутствии LPSRb.caps. принимали за 100%.

320 8K 280 624К 101 102 103 0 2 4 6 8 Концентрация LPS, нг/мл мин Рис. 4. Действие липополисахаридов Рис. 5. Последовательное действие разной структуры на генерацию активных LPSRb.caps. (20 нг/мл) и 20 нг/мл форм кислорода в нейтрофилах человека.

эндотоксина LPSS.typh. на генерацию АФК АФК регистрировали методом проточной нейтрофилами.

цитофлуориметрии. К-контроль; 1 LPSE.coli; 2 - последовательное инкубирование нейтрофилов с LPSRb.caps. и LPSE.coli (концентрации обоих LPS одинаковы- 100 нг/мл); 3 - LPSRb.caps..

В следующих экспериментах было проведено сравнительное исследование действия LPSRb.caps. и LPSE.coli на продукцию АФК миелоидными клетками. В этих экспериментах регистрировали величину ХЛ. Добавление LPSE.coli к нейтрофилам приводило к увеличению величины регистрируемой ХЛ, причем величина ХЛ достигала 90%-го насыщения при концентрации LPSE.coli, равной, соответственно, 20 нг/мл для нейтрофилов (рис. 6а, 1) и 2 нг/мл для моноцитов (рис. 6б, 1). LPSRb.caps. в диапазоне концентраций от 10 нг/мл до 2 мкг/мл не вызывал увеличения продукции АФК нейтрофилов (рис. 6а, 2) и моноцитов (рис.

6б, 2) по сравнению с генерацией АФК у контрольных клеток (в отсутствии LPS).

Для оценки эффективности подавления липополисахаридом Rb. capsulatus эндотоксин-зависимой продукции АФК миелоидными клетками были выполнены эксперименты, в которых исследовали защитное действие LPSRb.caps.

(от 0,2 нг/мл до 200 нг/мл) при постоянной концентрации эндотоксина E. coli (20 нг/мл и 2 нг/мл для нейтрофилов и моноцитов, соответственно).

Значительное ингибирование активации нейтрофилов наблюдалось уже при соотношении LPSRb.caps./LPSE. coli равном 1; при этом происходило снижение ХЛ, отн.

ед Флуоресценция, отн.

ед.

а) б) ХЛ, % ХЛ, % 11100 10 100 101 102 103 104 0 10-1 100 101 102 103 1Концентрация LPS, нг/мл Концентрация LPS, нг/мл Рис. 6. Действие LPSE.coli (1) и LPSRb.caps. (2) на продукцию активных форм кислорода нейтрофилами (а) и моноцитами (б). ХЛ - хемилюминесценция.

активации от 100% до 39% (в контроле –30%) (рис. 7а). Для моноцитов (рис. 7б) подобное снижение активации было получено при соотношении LPSRb.caps./LPSE.coli равном 10:1 отмечалось снижение активации от 100% до 68% (в контроле – 61,5%).

а б ХЛ, % ХЛ, % 120 1110 10-1 100 101 102 10 10-1 100 101 102 1 Концентрация LPS, нг/мл Концентрация LPS, нг/мл Рис. 7. Влияние концентрации LPSRb.caps. на дезактивацию нейтрофилов при последующем действии 20 нг/мл LPSE.coli (а) и на дезактивацию моноцитов при последующем действии 2 нг/мл LPSE.coli (б).

Для контроля возможного влияния LPSRb.caps. на пути внутриклеточной трансдукции сигналов от рецепторов эндотоксинов мы исследовали действие специфических ингибиторов сигнальных путей на продукцию активных форм ХЛ, % 1Рис. 8. Действие ингибиторов на fMLP-индуцируемую продукцию АФК нейтрофилами в отсутствие LPSRb.caps.

60 (1) и в его присутствие (2). PBS – контроль (принят за 100%); SB SB203580 (0,5 мкМ); PD - PD98059 (мкМ); LY - LY294002 (1 мкМ); Wort Wortmannin (50 нМ). Концентрация LPSRb.caps. – 1 мкг/мл.

PBS SB PD LY Wort кислорода нейтрофилами в присутствии и отсутствии LPSRb.caps.. Было исследовано действие SB203580 (ингибитор р38МАРК), PD98059 (ингибитор ERK), LY294002 и Wortmannin (ингибиторы фосфатидилинозитол-3-киназы (PI3K)). Сравнительный анализ полученных экспериментальных данных показывает, что все исследованные ингибиторы практически одинаково действуют как на контрольные нейтрофилы, так и на клетки, обработанные LPSRb.caps., что подтверждает отсутствие активации исследуемых клеток липополисахаридом Rb. capsulatus (рис. 8).

1.3. Влияние LPSRb.caps. и LPSE.coli на фагоцитоз дрожжей и эритроцитов миелоидными клетками.

Адгезия и генерация АФК являются важными компонентами фагоцитоза, играющего ключевую роль в механизмах защиты организма человека от бактериальной инфекции. При грамотрицательном сепсисе происходит увеличение фагоцитарной активности нейтрофилов [Heyderman et al., 1999;

Martins et al., 2003].

При концентрации LPSE.coli (200 нг/мл) наблюдалось увеличение фагоцитоза дрожжей нейтрофилами по сравнению с контрольными клетками на 35% (рис. 9, 2). Действие 500 нг/мл LPSRb.caps. вызывало уменьшение фагоцитоза на 10% по сравнению с контролем (рис. 9, 3). Предварительное инкубирование исследуемых клеток с 500 нг/мл LPSRb.caps. в течение 5 минут перед добавлением 200 нг/мл эндотоксина полностью отменяло увеличение фагоцитоза дрожжей нейтрофилами под действием LPSE.coli и было на 5% меньше, чем в контроле (рис. 9, 4).

Для оценки эффективности подавления липополисахаридом Rb. capsulatus PG эндотоксин-зависимого фагоцитоза нейтрофилами объектов фагоцитоза были выполнены эксперименты, в которых исследовали защитное действие LPSRb.caps. (в концентрации от 50 нг/мл до 500 нг/мл) при постоянной концентрации эндотоксина E. coli (200 нг/мл).

Значительное ингибирование фагоцитоза нейтрофилами дрожжей наблюдалось уже при соотношении LPSRb.caps./LPSE. coli равном 0,5; при этом происходило снижение величины фагоцитоза от 134% до 106% (в контроле – 100%) (рис. 10). При соотношении LPSRb.caps./LPSE. coli равном 1, величина фагоцитоза была равна контролю. При изменении соотношения LPSRb.caps./LPSE.coli от 1 до 2,5 величина фагоцитоза изменялась от 100% до 95%, не достигая при этом величины фагоцитоза при действии одного LPSRb.caps..

Нами показано, что при действии липополисахаридов E. coli и Salmonella typhimurium величина адгезии достигает максимальных значений при концентрации эндотоксина, равной 500 нг/мл. Эта концентрация значительно 111110 100 200 300 400 5Концентрация LPSRb.caps., нг/мл Рис. 9. Действие липополисахаридов Рис. 10. Ингибирование эндотоксинразной структуры на фагоцитоз дрожжей индуцированного фагоцитоза дрожжей нейтрофилами человека. 1 – контроль; 2 - нейтрофилами липополисахаридом Rb.

200 нг/ мл LPSE.coli; 3 - 500 нг/мл capsulatus. Концентрация LPSE.coli - 2LPSRb.caps.; 4 - последовательное нг/мл.

инкубирование нейтрофилов с 500 нг/мл LPSRb.caps. и 200 нг/ мл LPSE.coli.

Фагоцитоз, % Фагоцитоз, % выше, чем концентрация эндотоксина, требуемая для достижения максимальной продукции активных форм кислорода этими клетками (рис. 6а и 6б). Вероятно, это связано с тем, что при исследовании адгезионных свойств нейтрофилов в связи с более длительным временем эксперимента, процесс интернализации CD14 рецепторов вносит больший вклад в исследуемый процесс, чем при регистрации АФК. Кроме того, не следует исключать возможность связывания некоторой доли как эндотоксина, так и LPSRb.caps. не только с нейтрофилами, но и с дрожжевыми клетками, что может снизить концентрацию свободных липополисахаридов.

Учитывая эти результаты, в экспериментах по исследованию влияния липополисахаридов разной структуры на фагоцитарные свойства нейтрофилов была использована концентрация липополисахарида E. coli, равная 200 нг/мл.

Снижение фагоцитоза нейтрофилов под действием LPSRb.caps., (по сравнению с контрольными клетками (рис. 9 и 10)), вероятно, обусловлено с взаимодействием этого липополисахарида с рецепторным комплексом эндотоксинов в мембране нейтрофилов. Это предположение подтверждается нашими экспериментальными данными по уменьшению продукции АФК нейтрофилами при действии 500 нг/мл LPSRb.caps. Учитывая, что установлено существование непосредственного взаимодействия Tool like 4 рецептора (TlR4) и НАДФН-оксидазы [Kitchens et al., 1999] и то, что TlR4 влияет на экспрессию CD11b/CD18 рецепторов [Ugarova et al., 2001], не исключено, что LPSRb.caps.

несколько снижает фагоцитоз за счет своего непосредственного взаимодействия с рецептором эндотоксина.

2. Исследование действия LPS Rhodobacter capsulatus PG на регуляцию апоптоза фагоцитов, опосредованную действием эндотоксинов.

Помимо воздействия на функциональные свойства нейтрофилов, эндотоксины увеличивают продолжительность жизни активированных клеток, Рис. 11. Действие LPSRb.caps. на апоптоз нейтрофилов в присутствии мкг/мл LPSE.coli (1) и в отсутствии LPSE.coli (2).

10 101 102 1 Концентрация LPSRb.caps., нг/мл ингибируя их апоптоз. Исследование действия LPSRb.caps. на регуляцию апоптоза нейтрофилов показало, что этот липополисахарид оказывает небольшое ингибирующее действие на апоптоз культивируемых нейтрофилов (10% при мкг/мл) (рис. 11, 2). При предварительном инкубировании (в течение 30 мин) нейтрофилов с LPSRb.caps. (перед добавлением 1 мкг/мл LPSE.coli) происходит дозозависимое уменьшение эндотоксин-индуцированного ингибирования апоптоза этих клеток (с 50% при 10 нг/мл до 20% при 10 мкг/мл LPSRb.caps., соответственно (рис. 11, 1)). Но даже при максимальном соотношении исследуемых липополисахаридов (LPSRb.caps./LPSE. coli=10) не достигается полная отмена эндотоксин-индуцированного ингибирования апоптоза нейтрофилов:

LPSRb.caps. примерно на 75% подавлял действие эндотоксина (рис. 11, 1).

Полученные результаты позволяют предположить, что наблюдаемая разница в эффективности защитного действия LPSRb.caps. по подавлению активирующего действия эндотоксина может быть связана с различием в механизмах взаимодействия исследуемых липополисахаридов с клеткамимишенями. Быстрое ингибирование образования активных форм кислорода при действии LPSRb.caps. в течение нескольких минут после воздействия, возможно, объясняется прямым взаимодействием TlR4 рецептора (после связывания LPS) и НАДФН-оксидазы, что согласуется с результатами работы [Park et al., 2004].

Исследование действия ингибиторов на регуляцию апоптоза нейтрофилов показало, что предварительное инкубирование нейтрофилов с ингибитором ERK Ингибирование апоптоза, % 11K PD 10mkM PD 50mkM SB 1mkM SB 10mkM Рис. 12. Действие ингибиторов МАРК на апоптоз нейтрофилов при действии LPS разной структуры. K – без ингибиторов; PD-PD98059, 10 мкМ и 50 мкМ; SBSB203580, 1 мкM и 10 мкМ. Концентрации LPS E. coli и Rb. caps. равны 1 мкг/мл. 1контроль; 2 - LPSE. coli; 3 - LPSRb.caps..

(PD98059, 10 мкМ и 50 мкМ) отменяло ингибирование апоптоза при действии LPSE.coli и не оказывало влияния на апоптоз в присутствии LPSRb.caps. (рис. 12, PD 10 мкМ). При концентрации PD98059, равной 50 мкМ, наблюдалось небольшое ингибирование апоптоза при действии LPSRb.caps. и LPSE.coli. Инкубирование нейтрофилов с ингибитором p38MAPK (SB203580, 1 мкМ) практически не оказывало влияния на апоптоз контрольной пробы и пробы с LPSRb.caps., но увеличивало ингибирование апоптоза в пробе с LPSE.coli (рис. 12, SB 1 мкМ).

SB203580 в концентрации 10 мкМ незначительно ингибировал апоптоз во всех пробах (рис. 12, SB 10 мкМ).

Таким образом, полученные нами данные показали, что PD98059 снижает эндотоксин-индуцированную задержку апоптоза нейтрофилов, а SB2035увеличивает ингибирование апоптоза под действием LPSE. coli. Это указывает на то, что существует взаимодействие между ERK и p38MAPK сигнальными путями в регуляции апоптоза нейтрофилов при действии эндотоксинов, что подтверждается литературными данными [Klein et al., 2001].

Результаты ингибиторного анализа в присутствии LPSRb.caps. (рис. 12) показывают, что этот липополисахарид, в отличие от LPSE. coli, не оказывает существенного влияния на передачу внутриклеточного сигнала с участием ERK и p38MAPK сигнальных путей.

Апоптоз, % 3. Исследование влияния хемотипа эндотоксинов на защитное действие Rhodobacter capsulatus PG.

Для большинства клинических изолятов E. сoli характерен S-хемотип (колонии микроорганизмов гладкой формы), включающий трёхкомпонентную структуру эндотоксина, имеющего в своем составе гидрофобный компонент липид А - фосфорилированный неповторяющийся олигосахарид, известный под названием олигосахаридный кор, и полисахарид, который находится над поверхностью бактериальной клетки (О-антиген), определяемый по серотипированию [Christian, 2002]. Микроорганизмы, формирующие колонии шероховатой формы, синтезируют LPS без О-антигена (R-хемотип). В пределах R-хемотипа возможны структуры кора, отличающиеся количеством и составом сахаров – от максимально усеченного Re-хемотипа до полного кора (Raхемотип).

В настоящее время влияние олигосахаридов кора и полисахаридной составляющей (О-антигена) липополисахаридов на развитие патологических процессов, вызываемых эндотоксинами, изучено значительно меньше по сравнению с эффектами, обусловленными липидом А [Mller-Loennies et al., 1998].

Исследование действия различных хемотипов липополисахарида E. coli на генерацию АФК нейтрофилами показало, что все эндотоксины вызывали значительное увеличение люминол-зависимой ХЛ по сравнению с контролем (рис. 13). S-LPS хемотип E. coli вызывал наибольшее увеличение продукции АФК нейтрофилами. Возрастание величины регистрируемой ХЛ наблюдалось в ряду: контроль < Rc-LPS < Re-LPS < Ra-LPS < S-LPS. При этом различия между численными значениями хемилюминесценции между Re-LPS (219%) и Rc-LPS (209%) были существенно меньше, чем между Ra-LPS (256%) и S-LPS (285%) (рис. 13). Таким образом, изменения величины ХЛ в ряду: S- LPS > Ra-LPS > ReLPS (рис. 13) коррелирует с увеличением длины цепи полисахарида исследованных хемотипов эндотоксина E. coli.

Ранее было показано, что кинетика интернализации разных хемотипов LPS коррелирует с увеличением длины цепи полисахарида в составе молекулы LPS и, как следствие, с уменьшением гидрофобности эндотоксинов [Brandenburg et al., 1995]. Однако липид А имеет меньшую скорость интернализации, чем ReLPS и Rd-LPS. Это может быть связано с тем, что липид А, вследствие своих гидрофобных свойств, образует крупные мицеллы, которые медленнее интернализуются по сравнению с хемотипами LPS, имеющими в своем составе внутренний (Re) и внешний (Rd) кор.

Несколько большая величина ХЛ нейтрофилов в присутствии Rc-LPS по сравнению с Re-LPS (рис. 13), по-видимому, связана со структурными свойствами этих эндотоксинов и с особенностями их взаимодействия с эндотоксиновыми рецепторами миелоидных клеток.

33Рис. 13. Действие разных хемотипов LPS 2E. coli (20 нг/мл) на генерацию АФК 2нейтрофилами. K – контроль. Re-, Rc-, 1Ra-, S- хемотипы LPS.

1K Re Rc Ra S В следующей серии экспериментов было проведено сравнительное исследование действия разных хемотипов эндотоксина E. coli на величину апоптоза культивируемых нейтрофилов. Было показано, что величина ингибирования апоптоза под действием этих эндотоксинов возрастает в ряду:

Re-LPS > Rc-LPS > Ra-LPS > S-LPS (рис. 14). Из полученных результатов следует, что эндотоксин, структура которого имеет только липид А и молекулы 3-дезокси-D-манно-октулозоновой кислоты (КДО) оказывает на апоптоз нейтрофилов максимальный ингибирующий эффект.

Максимальное ингибирование апоптоза нейтрофилов наблюдается для Re-LPS, не имеющего внешнего кора и полисахаридной цепи из исследованных хемотипов (рис. 14, а) и имеющего более низкую скорость интернализации по сравнению с Ra-LPS [Lentschat et al., 1999] и S-LPS [Kitchens, Munford et al., 1999].

Таким образом, наблюдаемое увеличение величины продукции АФК в ряду хемотипов (S-LPS > Ra-LPS > Rc-LPS > Re-LPS > контроль) связано, повидимому, с особенностями механизма взаимодействия этих липополисахаридов ХЛ, % а б 110 1 2 1 2 1 2 1 K Re Rc Ra S Re Rc Ra S Рис. 14. Действие разных хемотипов LPS E. coli (200 нг/мл) на апоптоз нейтрофилов в отсутствии (а) и присутствии LPSRb.caps. (б). K – контроль. Re-, Rc-, Ra-, S- хемотипы LPS. Время культивирования нейтрофилов – 9 час. Пунктирная линия – апоптоз нейтрофилов в присутствии 1 мкг/мл LPSRb.caps.. 1 – 100 нг/мл эндотоксина (Re-, Rc-, Ra-, S); 2 – последовательное действие 1 мкг/мл LPSRb.caps. и 100 нг/мл эндотоксина (Re, Rc-, Ra-, S).

с рецепторами эндотоксинов и хорошо коррелирует с длиной полисахаридной цепи этих LPS. С уменьшением длины полисахаридной цепи наблюдается увеличение ингибирования апоптоза нейтрофилов под действием исследованных эндотоксинов, что коррелирует с увеличением гидрофобности этих хемотипов.

Таблица 1.

Действие липополисахарида Rhodobacter capsulatus PG на продукцию АФК нейтрофилами при действии разных хемотипов эндотоксина E. coli Хемотип Продукция АФК нейтрофилами (% к контролю) Re- 100 ± 5,Rc- 100 ± 4,Ra- 100 ± 5,S- 100 ± 5,Предварительное инкубирование нейтрофилов с 1 мкг/мл LPSRb.caps. в течение 5 мин отменяло эндотоксин-индуцированное увеличение продукции АФК (таблица 1) и ингибирование апоптоза нейтрофилов (рис. 14, б) при последующем действии 100 нг/мл исследованных хемотипов эндотоксина E. coli.

Апоптоз, % Апоптоз, % Полученные экспериментальные результаты свидетельствуют о том, что защитное действие LPSRb.caps. практически не зависит от исследованных хемотипов (табл. 1 и рис. 14, б).

4. Исследование влияния LPSRb.caps. на взаимодействие эндотоксинов с CD14 рецепторами моноцитов.

Полученные результаты по защитному действию липополисахарида Rhodobacter capsulatus PG на эндотоксин-индуцированную активацию адгезии, продукцию АФК и фагоцитоз исследованных клеток позволяют предположить, что LPSRb.caps. нарушает сборку рецепторного комплекса, происходящую при связывании эндотоксинов с клетками-мишенями [Ulmer et al., 2002] (или уменьшает его экспрессию в клеточной мембране). Для проверки этого предположения было исследовано влияние нетоксичного LPS на связывание FITC- меченного LPSE.coli с моноцитами.

Из данных рис. 15 видно, что предварительное инкубирование моноцитов с LPSRb.caps. в течение 20 мин (рис. 15, 1) значительно уменьшает связывание LPSE.coli - FITC (рис. 15, 2) с CD14 рецепторами моноцитов, что, вероятно, объясняется связыванием с этим рецептором нетоксичного LPSRb.caps., что, в свою очередь, ингибирует сборку рецепторного комплекса эндотоксинов этих клеток.

С целью оценки величины связывания LPSRb.caps. с мембраной клетокмишеней и интернализации этого липополисахарида в клетки-мишени были выполнены эксперименты по определению связывания FITC-меченного LPSRb.caps. с моноцитами (FITC-LPSRb.caps.). С увеличением концентрации FITCLPSRb.caps. наблюдалось увеличение флуоресценции, что свидетельствует об увеличении связывания этого липополисахарида с моноцитами (рис. 16, 1). В присутствии 1% раствора трипанового синего (тушащего флуоресценцию FITCLPSRb.caps., связавшегося с мембраной) рост флуоресценции FITC начинался с концентрации FITC-LPSRb.caps., равной 100 нг/мл, что свидетельствует об интернализации части FITC-LPSRb.caps., связавшегося с клеткой (рис. 16, 2).

Для оценки влияния LPSRb.caps. на экспрессию CD14 рецепторов в мембране моноцитов в присутствии (и отсутствии) эндотоксинов были выполнены эксперименты с использованием моноклональных анти-CDантител. При действии LPSE. coli (100 нг/мл) наблюдалось некоторое увеличение экспрессии CD14 рецепторов в мембране моноцитов (рис. 17, 2) по сравнению с контролем (рис. 17, 1). Инкубирование моноцитов с 1 мкг/мл LPSRb.caps. в течение 180 1170 1160 1111111110 101 102 103 10 101 102 1 Концентрация FITC-LPSRb.caps., нг/мл Концентрация FITC-LPSE.coli, нг/мл Рис. 15. Связывание с моноцитами FITC- Рис. 16. Связывание с моноцитами FITCLPSE.coli. 1 - FITC-LPSE.coli; 2 – моноциты LPSRb.caps. 1 - FITC-LPSRb.caps.; 2 - в предварительно инкубировали с 1 мкг/мл присутствии 1% трипанового синего.

LPSRb.caps..

10 – 60 мин не приводило к увеличению экспрессии этих рецепторов – наблюдалось даже некоторое снижение их экспрессии по сравнению с контролем (рис. 17, 3). Предварительное инкубирование моноцитов с 1 мкг/мл LPSRb.caps. в течение 10 мин перед добавлением LPSE.coli (и последующей инкубацией моноцитов 20 мин с эндотоксином) отменяло увеличение экспрессии CD14 рецепторов моноцитов практически до уровня флуоресценции при действии LPSRb.caps. (рис. 17, 4).

4Рис. 17. Влияние LPSRb.caps. (1 мкг/мл) и 3 LPSE.coli (100 нг/мл) на экспрессию CDрецепторов в мембране моноцитов. 13контроль; 2 - LPSE.coli; 3 - LPSRb.caps.; 4последовательное добавление LPSRb.caps., затем - LPSE.coli.

2Результаты проведенных экспериментов показывают, что LPSRb.caps.

отменяет связывание эндотоксина с моноцитами и уменьшает эндотоксинФлуоресценция, отн.

ед.

Флуоресценция, отн.

ед.

Флуоресценция, отн.ед активируемую экспрессию CD14 рецепторов этих клеток. Эти рецепторы, как и 2-интегрины, также участвуют в процессах распознавания фагоцитами объектов фагоцитоза [Gregory, Devitt, 2004]. Отмена эндотоксин-индуцированной активации фагоцитоза нейтрофилов липополисахаридом Rb. capsulatus, повидимому, связана с незначительным подавлением уровня экспрессии CD11b/CD18 и CD14 рецепторов в этих клетках. Увеличение уровня экспрессии этих рецепторов не наблюдалось ни в одном из экспериментов. При действии LPSRb.caps. в нейтрофилах снижается эндотоксин-активируемое увеличение экспрессии CD11b/CD18 рецепторов (рис. 3), увеличение экспрессии которых обусловлено образованием рецепторного комплекса в мембране клеток-мишеней после их активации эндотоксинами [Christian, Ulrich, 2002].

Полученные экспериментальные результаты показывают способность LPSRb.caps. незначительно снижать экспрессию рецепторов, входящих в состав рецепторного комплекса, а также нарушать эндотоксин-зависимую сборку этого комплекса.

5. Исследование влияния Fas- и ультрафиолет С – опосредованного апоптоза на клеточный ответ нейтрофилов при действии эндотоксинов.

С целью выяснения закономерностей и особенностей воздействия УФ излучения на апоптоз нейтрофилов было проведено исследование действия УФС в широком диапазоне доз (от 0 до 600 Дж/м2) на продолжительность жизни культивируемых нейтрофилов. Нами было обнаружено, что в диапазоне доз от до 300 Дж/м2 происходит активация апоптоза исследуемых клеток. При дальнейшем увеличении дозы облучения (до 600 Дж/м2) процент апоптозных клеток не увеличивается. Доля живых нейтрофилов в этом диапазоне доз изменяется незначительно (94-98%). Культивируемые нейтрофилы, не облученные УФС, погибают медленнее, чем после действия ультрафиолета С.

Увеличение дозы УФС облучения клеток приводит к более быстрой гибели этих клеток (рис. 18, 1, 2) по сравнению с контролем (рис. 18, 3). Характер дозовой зависимости апоптоза при действии УФС (рис. 19, а) близок к зависимости 1600 4а б 534300 2220 110 0 5 10 15 20 25 30 0 300 600 0 100 2час Анти-Fas АТ, нг/мл Доза УФС, Дж/мРис. 18. Действие УФС и LPSE.coli на кинетику Рис. 19. Действие индукторов на апоптоз апоптоза нейтрофилов. По оси ординат - доля нейтрофилов. Влияние дозы УФС (а) и апоптозных клеток, %. 1, 2, 3 – 320, 80, 0 анти-Fas АТ (б).

Дж/м2, соответственно. 4- 100 нг/мл LPSE.coli. Время культивирования нейтрофилов – По оси абсцисс – время культивирования 5 часов.

нейтрофилов.

величины апоптоза нейтрофилов от концентрации анти-Fas-АТ (рис. 19, б).

С целью выяснения закономерностей и особенности взаимосвязи механизмов регуляции апоптоза нейтрофилов при действии эндотоксинов и индукторов апоптоза было исследовано совместное и раздельное действие эндотоксинов, УФ излучения и анти-Fas моноклональных антител. Из полученных данных зависимости апоптоза от дозы УФС и концентрации антиFas-АТ (рис. 19) были выбраны оптимальные экспериментальные условия.

В первой серии экспериментов нейтрофилы сначала обрабатывали 1нг/мл LPSE.coli и затем через 1 час и 2 часа воздействовали индукторами апоптоза.

В отсутствии LPSE.coli. (рис. 20, а) УФС (70 Дж/м2) и анти-Fas-АТ (100 нг/мл) вызывали увеличение апоптоза нейтрофилов по сравнению с контролем (рис. 20, г, 1) на 250% и 230 %, соответственно. Ингибирование спонтанного апоптоза нейтрофилов липополисахаридом (рис. 20, г, 2) составляло 55% от контроля (рис. 20, г, 1). В присутствии LPSE. coli. (100 нг/мл) происходило постепенное снижение величины апоптоза нейтрофилов при добавлении анти-Fas-АТ и действии УФС через один час (рис. 20, б) и через два часа культивирования нейтрофилов (рис. 20, в). При замене культуральной среды нейтрофилов, культивируемых с эндотоксином (через 2 часа культивирования), на среду того Апоптоз, % Апоптоз, % Апоптоз, % же состава, но без LPSE.coli, не происходило изменения величины апоптоза исследуемых нейтрофилов, что свидетельствует о максимальном ингибировании апоптоза нейтрофилов эндотоксином в этих экспериментальных условиях.

Рис. 20. Действие УФС (1) и анти400 Fas-АТ (2) на апоптоз нейтрофилов а б в г после добавления эндотоксина. а - в отсутствии LPSE.coli; б и в – 3воздействие УФС и анти-Fas-АТ после культивирования нейтрофилов 2с 100 нг/мл LPSE.coli через 1 час (б) и 2 часа (в), соответственно. г – без УФС и анти-Fas-АТ, 1г – контроль, 12г – 100 нг/мл LPSE. coli.

1 2 1 2 1 2 1 При воздействии анти-Fas-АТ и УФС на нейтрофилы (которые культивировались с эндотоксином в течение двух часов) наблюдалось значительное увеличение апоптоза по сравнению с величиной апоптоза этих клеток только в присутствии эндотоксина (рис. 20, г, 2). Действие анти-Fas-АТ и УФС вызывало увеличение апоптоза нейтрофилов в присутствии LPSE.coli в 2,раза и 5,1 раза, соответственно (рис. 20, в).

а б в 4Рис. 21. Действие УФС (1) и анти-Fas-АТ (2) на апоптоз нейтрофилов до добавления 3эндотоксина. а - в отсутствии LPSE.coli; б и в – воздействие УФС и анти-Fas-АТ перед 2культивированием нейтрофилов с 1нг/мл LPSE.coli в течение 1 час и 2 часов, 1соответственно.

1 2 1 2 1 Во второй серии экспериментов (рис. 21) на нейтрофилы вначале воздействовали индукторами апоптоза, а затем через 1 час (рис. 21, б) и через часа (рис. 21, в) добавляли эндотоксин. Оба индуктора апоптоза задерживали эндотоксин-индуцированное ингибирование апоптоза этих клеток более эффективно, чем при воздействии после эндотоксина (рис. 20). Однако действие УФС (рис. 21, 1 б и 1 в) было более эффективно по сравнению с использованием Апоптоз, % Апоптоз, % анти-Fas-АТ (рис. 21, 2 б и 2 в).

Таким образом, полученные нами данные показали, что УФС и анти-FasАТ уменьшают эндотоксин-индуцированное ингибирование апоптоза нейтрофилов. При этом УФС действует более эффективно, чем анти-Fas-АТ, что связано, вероятно, с участием разных механизмов регуляции апоптоза нейтрофилов при действии этих индукторов на эндотоксин-индуцированное ингибирование апоптоза этих клеток.

Для изучения данного вопроса была исследована роль отдельных путей внутриклеточной сигнализации, участвующих в регуляции апоптоза при действии эндотоксинов, анти-Fas-АТ и УФС (рис. 22). В присутствии ингибитора ERK (PD98059) происходила практически полная отмена ингибирования апоптоза, вызванного эндотоксином. При этом величина апоптоза, активированного УФС и анти-Fas антителами, практически не изменялась. При действии ингибитора p38 МАРК (SB203580) происходило увеличение эндотоксин-индуцированного ингибирования апоптоза (на 37%) и ингибирование УФС- индуцированного апоптоз нейтрофилов (на 36%).

Ингибитор SB203580 не оказывал существенного влияния на апоптоз этих клеток, опосредованный действием анти-Fas-АТ. Ингибиторы PI-3K (Wortmannin и LY294002) сильнее ингибировали апоптоз, активированный антиFas-АТ, чем апоптоз, индуцированный УФС (рис. 22).

4Рис. 22. Действие ингибиторов на апоптоз нейтрофилов: PBS – без 3ингибиторов; PD-30 мкМ PD98059;

SB-10 мкМ SB203580; Wort – 50 нМ 2Wortmannin; LY – 1 мкМ LY 294002. – контроль; 2 – LPS; 3 – 100 нг/мл анти1Fas моноклональные антитела; 4 – УФС, 70 Дж/м2.

PBS PD SB Wort LY Результаты ингибиторного анализа показали, что ERK участвуют только в LPS-индуцированном ингибировании апоптоза нейтрофилов и не принимают участия в активации апоптоза при действии УФС и анти-Fas-АТ. р38МАРК Апоптоз, % участвуют в регуляции УФС-индуцированного апоптоза, а также в регуляции апоптоза при действии эндотоксинов, так как ингибитор SB203580 увеличивает ингибирование апоптоза нейтрофилов эндотоксинами. PI-3K вносит больший вклад в регуляцию апоптоза, активированного анти-Fas-АТ по сравнению с регуляцией УФС-индуцированного апоптоза.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о способности ультрафиолетового излучения более эффективно по сравнению с анти-Fas моноклональными антителами снижать эндотоксин-индуцированное ингибирование апоптоза нейтрофилов. Более эффективное действие УФС (по сравнению с анти-Fas-АТ) связано, по-видимому, как с активацией Fasрецептора, так и с активацией p38МАРК.

Защита организма человека от воздействия эндотоксинов - одна из актуальных проблем современной медицины. Это обусловлено ключевой ролью этих компонентов клеточной стенки грамотрицательных бактерий в патогенезе эндотоксинового шока, являющегося ведущей причиной смертности при грамотрицательном сепсисе.

В данной работе было исследованы эффекты, вызываемые разными эндотоксинами в клетках врождённого иммунитета – нейтрофилах и моноцитах, т.к. эти клетки являются основными клеточными мишенями эндотоксинов в периферической крови человека.

Действие эндотоксинов на клетки-мишени является сложным комплексным механизмом, включающим внеклеточное распознавание эндотоксина, сборку мультирецепторного комплекса, проведение сигнала через мембрану, внутриклеточное распознавание, последующий сигнальный процессинг, транскрипцию и экспрессию генов. Все эти события сопровождаются выраженной и быстрой активацией клеток-мишеней.

В связи с этим мы изучили функциональные ответы нейтрофилов и моноцитов при действии эндотоксинов, протекающие за относительно короткие промежутки времени: адгезию, генерацию активных форм кислорода (АФК), фагоцитоз, экспрессию клеточных рецепторов, участвующих в распознавании эндотоксинов клетками. Кроме того, было исследовано действие эндотоксинов разной структуры на апоптоз нейтрофилов.

Обнаружено, что ответы нейтрофилов на эндотоксины разных бактерий семейства Enterobacteriacea, в частности, на LPS E. coli и LPS S. typhimurium, носили близкий характер. Оба эндотоксина усиливали адгезивную активность нейтрофилов. При этом сравнение результатов регистрации величины адгезии нейтрофилов при действии LPSS.typh. и LPSE.coli показывает, что LPSE.coli при концентрации 100 нг/мл вызывает большее увеличение адгезии нейтрофилов, чем LPSS.typh. в той же концентрации (соответственно, 80% и 48%). Эти различия связаны, по-видимому, с особенностями структуры исследованных эндотоксинов, определяющими их биологическую активность.

Одним из ранних проявлений активности клеток врожденного иммунитета является синтез АФК. Образование АФК является важным функциональным ответом фагоцитов в связи с ролью свободных радикалов в большом количестве физиологических и патологических процессов. В условиях тяжелого сепсиса и септического шока эта защитная реакция фагоцитов переходит в патологическую, выходящую из-под контроля организма, что приводит к окислительному повреждению тканей и органов, характерному для эндотоксинового шока. В таких условиях эндотоксин-индуцированное ингибирование апоптоза нейтрофилов приводит к нарушению их клиренса тканевыми макрофагами и усиливает повреждение тканей активированными фагоцитами.

Эндотоксины из E. coli и S. typhimurium активировали клетки к респираторному взрыву в ответ на вторичный стимул. Следует отметить, что максимальная продукция АФК нейтрофилов достигалась при концентрациях эндотоксинов, значительно более низких (в 20 раз), чем при концентрациях, необходимых для максимального увеличения адгезии. Это может быть связано с различными путями передачи сигнала в клетку и участием разных рецепторов.

Сравнительное исследование действия липополисахаридов из E. coli различных хемотипов на генерацию АФК нейтрофилами показало, что все эндотоксины вызывали значительное увеличение продукции АФК. S-LPS хемотип E. coli вызывал наибольшее увеличение продукции АФК нейтрофилами. Возрастание величины регистрируемой ХЛ наблюдалось в ряду:

контроль < Rc-LPS < Re-LPS < Ra-LPS < S-LPS. При этом различия между численными значениями хемилюминесценции между Re-LPS (219%) и Rc-LPS (209%) были существенно меньше, чем между Ra-LPS (256%) и S-LPS (285%).

Таким образом, изменения величины ХЛ в ряду: S- LPS > Ra-LPS > Re-LPS коррелирует с увеличением длины кора и цепи полисахарида эндотоксина E.

coli исследованных разных хемотипов.

Эндотоксины влияют на время жизни фагоцитов, замедляя апоптоз нейтрофилов. Используя ингибиторы к p38MAPK- и ERK-сигнальным путям, взаимодействие между которыми, как полагают, влияет на развитие воспалительного процесса при грамотрицательном сепсисе, мы показали, что именно эти киназы играют важную роль в механизмах регуляции апоптоза. Под действием S-хемотипа эндотоксина из E. coli (1 мкг/мл) происходило ингибирование апоптоза нейтрофилов на ~ 50 %.

Сравнительное исследование действия эндотоксинов E. coli разных хемотипов на апоптоз нейтрофилов показало, что величина апоптоза под действием этих эндотоксинов возрастает в ряду: Re-LPS > Rc-LPS > Ra-LPS > SLPS). Из полученных результатов следует, что эндотоксин Re-LPS, структура которого имеет только липид А и 2 молекулы КДО оказывает на апоптоз нейтрофилов максимальный ингибирующий эффект. Из исследованных хемотипов этот эндотоксин не обладает внешним кором и полисахаридной цепью и имеет более низкую скорость интернализации по сравнению с Ra-LPS и S-LPS.

Исследование функциональной активности фагоцитов в ответ на липополисахарид из бактерии Rhodobacter capsulatus PG (LPSRb.caps) (который отличается по своему строению от использованных в работе эндотоксинов) показало, что LPSRb.caps не влиял ни на один из исследованных функциональных ответов фагоцитов в диапазоне концентраций, превышающем диапазон концентраций эндотоксинов. Для выяснения вопроса о том, сопровождается ли отсутствие токсичности проявлением антагонистических свойств у липополисахарида из Rhodobacter capsulatus PG, были выполнены эксперименты по исследованию влияния этого LPS на функциональные ответы фагоцитов при действии эндотоксинов.

Результаты проведенных исследований показали, что LPSRb.caps.

значительно снижал эндотоксин-индуцированную адгезию нейтрофилов, что связано c отменой увеличения экспрессии CD11b/CD18 рецепторов в клеточной мембране этих клеток под действием эндотоксинов. LPSRb.caps. проявлял антагонистические свойства по снижению эндотоксин-индуцированной продукции АФК исследованными фагоцитами, а также отменял активацию эндотоксином фагоцитоза нейтрофилами дрожжей.

Исследование действия LPSRb.caps. на апоптоз нейтрофилов человека показало, что этот липополисахарид оказывает небольшое ингибирующее действие на апоптоз культивируемых нейтрофилов.

Обнаружено, что время защиты функциональных ответов нейтрофилов липополисахаридом Rhodobacter capsulatus PG реализуется в интервале 2-5 мин.

Полученные данные указывают на то, что LPSRb.caps достаточно быстро блокирует передачу активационного сигнала от эндотоксинов внутрь клетки, что может быть обусловлено связыванием LPSRb.caps с рецепторами эндотоксинов клеток-мишеней или с нарушением процесса сборки рецепторного комплекса эндотоксинов. Это предположение было подтверждено результатами исследования влияния липополисахарида Rb. caps. на взаимодействие эндотоксинов с клеточными рецепторами, на экспрессию клеточных рецепторов и активацию внутриклеточных сигнальных путей.

Было показано, что LPSRb.caps не вызывает активации сигнальных путей при эндотоксин-индуцированном увеличении продукции АФК нейтрофилами и ингибировании их апоптоза.

Результаты проведенных экспериментов по изучению роли рецепторов в действии LPSRb.caps. показывают, что этот липополисахарид незначительно снижает экспрессию CD14- и CD11b/CD18 - рецепторов моноцитов и нейтрофилов, участвующих в доставке эндотоксинов к TLR4 рецепторам.

Установлено, что LPSRb.caps. отменяет связывание эндотоксина (меченного FITC) с моноцитами. LPSRb.caps. также отменяет эндотоксин-обусловленную экспрессию CD11b/CD18-рецепторов нейтрофилов, что может указывать на антагонистическую активность LPSRb.caps.. Исследование связывания LPSRb.caps. с моноцитами показало, что этот LPS, меченный FITC, связывается с моноцитами и частично интернализуется в клетки.

CD14-рецепторы, как и CD11b/CD18-рецепторы, участвуют в процессах распознавания фагоцитами объектов фагоцитоза. Отмена эндотоксининдуцированной активации фагоцитоза нейтрофилов липополисахаридом Rhodobacter capsulatus PG, по-видимому, связана с блокированием увеличения экспрессии этих рецепторов под действием эндотоксинов, а также с незначительным снижением уровня экспрессии этих рецепторов в исследованных клетках.

Полученные экспериментальные результаты показывают способность LPSRb.caps. незначительно подавлять экспрессию рецепторов, входящих в состав рецепторного комплекса, а также нарушать эндотоксин-зависимую сборку этого комплекса. Эти структурно-функциональные свойства липополисахарида Rhodobacter capsulatus PG обеспечивают его способность блокировать связывание эндотоксинов со специфическими эндотоксин-связывающими рецепторами; отменяют эндотоксин-зависимую экспрессию клеточных рецепторов; ингибируют эндотоксин-индуцированную адгезию и продукцию активных форм кислорода фагоцитами крови, а также подавляют ингибирование апоптоза этих клеток под действием эндотоксинов.

В настоящее время направленная регуляция апоптоза нейтрофилов рассматривается как возможный терапевтический подход для коррекции ряда заболеваний, в том числе сепсиса. Сравнительное исследование двух индукторов апоптоза нейтрофилов: анти-Fas АТ и УФС показало, что эти индукторы задерживают эндотоксин-индуцированное ингибирование апоптоза нейтрофилов как до, так и после его воздействия эндотоксина на клетки. Величина апоптоза нейтрофилов при действии индукторов апоптоза через 2 часа после обработки клеток эндотоксином превышает апоптоз контрольных клеток. При этом эффект ультрафиолетового облучения проявляется более выражено, чем действие антиFas антител.

На основании выполненных работ и литературных данных можно выделить несколько механизмов или уровней воздействия на клетки врожденного иммунитета для снижения их активации при действии эндотоксинов. Первый заключается в использовании нетоксичных соединений, обладающих способностью блокировать действие эндотоксинов на клеткимишени. Второй - воздействие на механизмы регуляции апоптоза клетокмишеней. И в первом и во втором случае следует выделить два уровня возможного терапевтического влияния:

1. на специфические мембранные рецепторы, участвующие в регуляции апоптоза клеток-мишеней;

2. на внутриклеточные пути регуляции апоптоза. На этом уровне важная роль принадлежит взаимосвязи сигнальных путей.

Физиологический смысл существования разнообразных механизмов регуляции апоптоза заключается не только в удалении лишних или функционально поврежденных клеток, но и, по-видимому, в целенаправленной регуляции численности популяций различных клеток в зависимости от “потребностей” организма. Вместе с тем ингибирование апоптоза нейтрофилов является одной из причин неэффективного клиренса этих клеток из тканей и вследствие этого повреждения тканей нейтрофилами при воспалении.

Исследование действия липополисахарида Rhodobacter capsulatus PG на активацию фагоцитов крови человека при действии эндотоксинов разной структуры показало высокую эффективность этого вещества по снижению эндотоксин-индуцированной активации функционального состояния нейтрофилов и моноцитов.

Выводы 1. Липополисахарид Rhodobacter capsulatus PG снижает адгезию нейтрофилов, индуцированную эндотоксинами, по механизму подавления экспрессии 2интегринов нейтрофилов.

2. Под воздействием липополисахарида Rhodobacter capsulatus PG на миелоидные клетки происходит подавление продукции активных форм кислорода нейтрофилами и моноцитами, вызываемое эндотоксинами.

3. Липополисахарид Rhodobacter сapsulatus PG ингибирует эндотоксининдуцированное увеличение фагоцитоза нейтрофилами объектов фагоцитоза и не вызывает увеличения фагоцитоза не активированных эндотоксином нейтрофилов.

4. Время защиты функциональных ответов нейтрофилов липополисахаридом Rhodobacter capsulatus PG реализуется в интервале 2-5 мин для исследованных эффектов действия эндотоксинов.

5. Липополисахарид Rhodobacter capsulatus PG дозозависимо снижает эндотоксин-индуцируемое ингибирование апоптоза миелоидных клеток.

Максимальное защитное действие LPS Rhodobacter capsulatus PG наблюдается при 5–10-кратном его избытке по сравнению с концентрацией эндотоксина.

6. Липополисахарид Rhodobacter capsulatus PG ингибирует влияние исследованных хемотипов эндотоксина E. coli (S-, Ra-, Rc-, Re) на продукцию активных форм кислорода и апоптоз нейтрофилов.

7. Липополисахарид Rhodobacter capsulatus PG (в диапазоне концентраций от нг/мл до 1000 нг/мл) в отсутствии эндотоксинов не вызывает изменения экспрессии мембранных рецепторов, участвующих в эндотоксин-индуцируемой активации этих клеток.

8. Активация апоптоза нейтрофилов анти-Fas –антителами и ультрафиолетовым излучением диапазона С уменьшает эндотоксин-индуцированное ингибирование апоптоза нейтрофилов. Эффект ультрафиолетового облучения проявляется более выражено, чем действие анти-Fas антител.

9. Полученные результаты указывают, что защитные эффекты липополисахарида Rhodobacter capsulatus PG от действия эндотоксинов на миелоидные клетки периферической крови человека связаны с его способностью конкурировать с эндотоксинами за специфические клеточные рецепторы.

10. Применение Rhodobacter capsulatus PG и индукторов апоптоза нейтрофилов позволяет уменьшить продолжительности жизни нейтрофилов при действии эндотоксинов.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 1. Липополисахарид Rhodobacter capsulatus PG может быть рекомендован для разработки и создания препарата для профилактики и лечения эндотоксинового шока.

2. Проведенное исследование обосновывает целесообразность применения LPSRb.caps. в качестве инструмента для изучения механизмов действия антагонистов эндотоксинов, а также для тестирования потенциальных антагонистов эндотоксинов.

3. Комплекс методов, использованный в работе с целью оценки функциональной активности клеток врождённого иммунитета, может быть применен коррекции восстановительной терапии сепсиса.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Винокуров М.Г., Афанасьев В.Н., Печатников В.А., Николаева Н.Н., Долгачев В.А Связывание анти-М - и анти-N-моноклональных антител с эритроцитами человека // Вестник новых медицинских технологий, 1998, № 1, с.

31.

2.Nicolaeva N. N, Dolgachev V. A., Lonskaya I. A, Afanasyev V. N., Tyazhelova V.G, Vinokurov M.G. Апоптоз тимоцитов, индуцированный УФ облучением: исследование механизма // Вестник новых медицинских технологий, 1998, № 1, с. 67.

3. Dolgachev V.A., Nikolaeva N.N., Afanasyev V.N., Lonskaya I.A., Vinokurov M.G. Изучение апоптоза тимоцитов, индуциро-ванного ультрафиолетовым облучением // Вестник новых медицинских технологий, 1998, № 1, с. 63.

4. Печатников В.А., Косякова Н.И., Винокуров М.Г., Николаева Н.Н., Долгачев В.А., Афанасьев В.Н. Действие ультрафиолета С на иммунокомпетентные клетки человека и животных // “Здоровье, профилактика и эндоэкологическая реабилитация (новые медицинские технологии”. Тезисы докладов научно – практической конференции. Пущино-Серпухов, 1998, стр. 22.

5. Николаева Н.Н., Афанасьев В.Н., Долгачев В.А., Лонская И.А., Винокуров М.Г., Печатников В.А. Изучение апоптоза иммунокомпетентных клеток под действием ультрафиолета С // III открытая городская научная конференция молодых ученых. Тезисы докладов. Пущино, 1998, стр. 112-113.

6. Винокуров М.Г., Афанасьев В.Н., Николаева Н.Н., Семенов В.С., Корнеев В.Н., Печатников В.А. Связывание анти-М и анти-N-моноклональных антител с эритроцитами человека // Иммунология, 1999, N 3, с. 18-21.

7. Винокуров М.Г., Николаева Н.Н., Косякова Н.И., Печатников В.А.

Действие ультрафиолета С на лимфоциты и нейтрофилы периферической крови человека.// Медицинская иммунология, 1999, N 3-4, с. 10.

8. Винокуров М.Г., Косякова Н.И., Николаева Н.Н., Печатников В.А.

Модуляция апоптоза нейтрофилов периферической крови человека ультрафиолетовым излучением диапазона С и гамма-излучением.// Биофизика, 1999, т. 44, с. 929-930.

9. Винокуров М.Г., Долгачева Н. Н., Юринская М.М., Анисимов Р.Л., Прохоренко И.Р., Сахно И.В., Гражданкин Е.Б., Печатников В.А. Влияние ультрафиолета С и липополисахаридов на апоптоз нейтрофилов человека.// Медицинская иммунология, 2000, т. 2, N 2, с. 126.

10. Винокуров М.Г., Долгачева Н.Н., Печатников В.А. Апоптоз нейтрофилов периферической крови модулируется гамма – излучением// Медицинская иммунология, 2000, т. 2, N 2, с. 127-128.

11. Долгачева Н.Н., Винокуров М.Г., Печатников В.А. Влияние гамма излучения на апоптоз нейтрофилов человека.// Конференция ”Горизонты физико-химической биологии”, Пущино, 2000 г., 30 мая - 1 июня, с.28-29.

12. Долгачева Н.Н., Винокуров М.Г., Анисимов Р.Л., Ванина В.Н., Печатников В.А. Действие УФС на апоптоз нейтрофилов человека.// Конференция ”Горизонты физико-химической биологии”, Пущино, 2000 г., мая - 1 июня, с.128-129.

13. Винокуров М.Г., Долгачева Н.Н., Юринская М.М., Анисимов Р.Л., Печатников В.А. Изучение действия ультрафиолета С на апоптоз нейтрофилов человека.// Международная конференция “Митохондрии, клетки и активные формы кислорода”, Пущино, 2000 г., с. 30-32.

14. Винокуров М.Г., Прохоренко И.Р., Юринская М.М., Долгачева Н.Н., Косякова Н.И., Гражданкин Е.Б., Печатников В.А. Действие эндотоксинов на регуляцию ультрафиолет С - индуцированного апоптоза нейтрофилов человека.// Конференция “Патофизиология и современная медицина”, Москва, 2000 г., 1314 октября, с. 54-56.

15. Винокуров М.Г., Прохоренко И.Р., Юринская М.М., Долгачева Н.Н., Печатников В.А. Действие липополисахаридов и ультрафиолета С на регуляцию апоптоза нейтрофилов человека.// Иммунология, 2001, N 2, С. 25-27.

16. Юринская М.М., Винокуров М.Г., Долгачева Н.Н., Гражданкин Е.Б., Косякова Н.И., Печатников В.А Цинк ингибирует ультрафиолет С-зависимое ускорение апоптоза нейтрофилов человека.// Медицинская иммунология, 2001, т.

3, № 2, с. 137-138.

17. Винокуров М.Г., Юринская М.М., Прохоренко И.Р. Гражданкин Е.Б.

Косякова Н.И. Печатников В.А. Действие ультрафиолета С на кинетику модулированного апоптоза нейтрофилов человека.// Медицинская иммунология, 2001, т. 3, № 2, с. 309.

18. Vinokurov M.G., Yurinskaya M.M., Pechatnikov V.A. The role of apoptosis in the function of the human neutrophils.// International symposium “Biological motility: new trends in research”, Pushchino, 2001, p. 172-173.

19. Винокуров М.Г., Юринская М.М., Сусликов А.В., Садикова Д.Г., Печатников В.А. Влияние ультрафиолетового излучения диапазона С на активацию и апоптоз нейтрофилов человека.// II Всероссийский симпозиум по кардиологии, Москва, 9-11 октября 2001, с. 75.

20. Винокуров М.Г., Юринская М.М., Косякова Н.И., Гражданкин Е.Б., Сусликов А.В. Прохоренко И.Р., Печатников В.А. Индукция апоптоза в нейтрофилах человека ультрафиолетовым излучением.// Конференция “От современной фундаментальной науки к новым наукоёмким технологиям”, Пущино, 2001, с. 47.

21. Прохоренко И.Р., Гражданкин Е.Б., Косякова Н.И., Мурашев А.Н., Винокуров М.Г., Юринская М.М., Грачев С.В. Влияние структуры эндотоксинов на развитие воспалительного процесса у крыс Sprague-Dowly.// Конференция “От современной фундаментальной науки к новым наукоёмким технологиям”, Пущино, 2001, с. 93.

22. Винокуров М.Г., Юринская М.М., Долгачева Н.Н, Печатников В.А.

Динамика индуцированного ультрафиолетом С апоптоза нейтрофилов при действии липополисахарида и цинка.// Биофизика, 2001, № 6, 1150-1152.

23. Винокуров М.Г., Юринская М.М., Сусликов А.В., Садикова Д.Г., Печатников В.А. Исследование апоптоза культивируемых нейтрофилов человека, индуцированного коротковолновым излучением.// Цитология, 2001, т.

43, № 9, с. 845-846.

24. Винокуров М.Г., Юринская М.М., Печатников В.А. Ионы ртути ингибируют апоптоз нейтрофилов человека, индуцированный ультрафиолетовым излучением диапазона С // Биофизика, 2002, № 4, с. 683-685.

25. Садикова Д.Г., Винокуров М.Г., Юринская М.М., Беляева Т.В., Печатников В.А. Исследование влияния ультрафиолетового излучения диапазона С на фагоцитоз и время жизни нейтрофилов человека.// XIV зимняя международная научная школа “Перспективные направления физикохимической биологии и биотехнологии”, Москва, 2002, с. 104.

26. Садикова Д.Г., Винокуров М.Г., Юринская М.М., Беляева Т.В.

Печатников В.А. Действие ультрафиолета С на образование активных форм кислорода активированных нейтрофилов. Сборник тезисов 6 Пущинской конференции молодых ученых «Биология – наука 21-го века», Пущино, 20-мая 2002 г., т. 1, с. 31-32.

27. Винокуров М.Г., Юринская М.М., Прохоренко И.Р., Печатников В.А.

Взаимодействие механизмов активации и ингибирования апоптоза нейтрофилов человека при действии эндотоксинов // Цитокины и воспаление, 2002, № 2, с. 78.

28. Винокуров М.Г., Юринская М.М., Садикова Д.Г., Беляева Т.В., Сусликов А.В., Печатников В.А. Действие ионов ртути на респираторный взрыв и регуляцию апоптоза нейтрофилов человека // Цитокины и воспаление, 2002, № 2, с. 8.

29. Grachev S.V., Prokhorenko I.R., Grazhdankin E.B., Murashev A.N., Vinokurov M.G., Zembatov M.R., Sechenov I.M. Structure of endotoxin influences the vascular system of rats// Acta Physiologica Hungarica, 2002, v. 89, N. 1-3, p. 293.

30. Печатников В.А., Винокуров М.Г., Юринская М.М., Сусликов А.В.

Молекулярные механизмы апоптоза нейтрофилов человека. Медицинские аспекты. //Труды конференции “От современной фундаментальной биологии к новым наукоемким технологиям”, Пущино, 2002 г, с. 111.

31. Бурковецкая М.Е., Винокуров М.Г., Юринская М.М., Беляева Т.В., Печатников В.А., Сусликов А.В. Влияние ультрафиолетового облучения крови на активность миелопероксидазы нейтрофилов больных сердечно-сосудистыми заболеваниями. Сборник тезисов 7 Пущинской конференции молодых ученых «Биология – наука 21-го века», Пущино, 14-18 апреля 2003 г., с. 55.

32. Печатников В.А., Винокуров М.Г., Юринская М.М., Беляева Т.В., Сусликов А.В. Молекулярные механизмы апоптоза нейтрофилов человека // В кн.: Медицинские аспекты. Горизонты биофизики. От теории к практике, Пущино, 2003, с. 225-228.

33. Винокуров М.Г., Беляева Т.В., Юринская М.М., Сусликов А.В., Печатников В.А. Совместное действие ультрафиолетового излучения и ионов ртути на реактивность нейтрофилов человека // Медицинская иммунология, 20г., Т. 5, № 3-4, с. 195.

34. Винокуров М.Г., Юринская М.М., Беляева Т.В., Сусликов А.В., Косякова Н.И., Печатников В.А.. Совместное действие ионов ртути и ультрафиолета С на регуляцию апоптоза нейтрофилов человека. Сборник научных трудов международного семинара «Экология и здоровье, экологическая медицина. Управление качеством жизни», Москва, 2003, с. 102-104.

35. Винокуров М.Г., Прохоренко И.Р., Юринская М.М., Прохоренко С.В., Грачев С.В. Влияние липополисахаридов разной структуры на адгезию и генерацию активных форм кислорода нейтрофилами человека // Доклады Академии наук, 2003, Т. 393. № 2. С. 273-275.

36. Винокуров М.Г., Прохоренко И.Р., Юринская М.М., Прохоренко С.В., Грачев С.В. Модулирование функциональных свойств нейтрофилов человека липополисахаридами разной структуры. Материалы конференции “Инфекционные и паразитарные болезни в современном обществе”. Москва, 2003, С. 45-46.

37. Винокуров М.Г., Юринская М.М., Прохоренко И.Р., Косякова Н.И., Гражданкин Е.Б., Грачев С.В. Взаимодействие липополисахаридов разной структуры с нейтрофилами человека в присутствии белков плазмы крови // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2003. Том 5. С. 1314.

38. Беляева Т.В., Винокуров М.Г., Юринская М.М., Сусликов А.В., Печатников В.А. Влияние ультрафиолета С и ионов ртути на функционирование нейтрофилов человека // Цитология, 2003, т. 45, № 9, с. 849-850.

39. Vinokurov M.G., Yurinskaya M.M., Pechatnikov V.A. Modulation of apoptosis among the neutrophils of peripheral human blood by ultraviolet C irradiation and lipopolysaccharide. International Symposium. Biological motility. Pushchino, 2004. P. 203-204.

40. Винокуров М.Г., Юринская М.М., Прохоренко И.Р., Прохоренко С.В., Грачев С.В. Функциональная активность моноцитов человека при действии липополисахаридов разной структуры // Доклады Академии наук, 2004, Т. 395, № 3, С. 418-420.

41. Прохоренко И.Р., Винокуров М.Г., Юринская М.М., Кабанов Д.С., Гражданкин Е.Б., Кустанова Г.А., Зубова С.В., Прохоренко С.В., Волошина Е.В., Грачев С.В. Изучение защитного действия нетоксичных ЛПС от эффектов эндотоксинов в экспериментах in vivo и in vitro. I международная конференция “Молекулярная медицина и биобезопасность”. Москва, 2004 г., с. 159.

42. Грачев С.В., Прохоренко И.Р., Винокуров М.Г., Гражданкин Е.Б., Зубова С.В., Кабанов Д.Б., Кустанова Г.А., Прохоренко С.В. Исследование антагонистических активностей липополисахарида из Rhodobacter в целях создания препаратов для лечения эндотоксинового шока. Конференция “Фундаментальные науки – медицине”. Программа фундаментальных исследований Президиума РАН. Москва, 2-3 декабря. Тезисы докладов, 172-1(2004).

43. Прохоренко И.Р., Винокуров М.Г., Юринская М.М., Кабанов Д.С., Гражданкин Е.Б., Кустанова Г.А., Зубова С.В., Прохоренко С.В., Волошина Е.В., Грачев С.В. Изучение защитного действия нетоксичных LPS от эффектов эндотоксинов в экспериментах in vivo и in vitro. I Международная конференция “Молекулярная медицина и биобезопасность”. Москва 2004. Сборник тезисов, 159 (2004).

44. Винокуров М.Г., Юринская М.М., Прохоренко И.Р., Грачев С.В.

Регуляция апоптоза нейтрофилов при действии эндотоксинов. XVIII Пущинские чтения по фотосинтезу и Всероссийская конференция «Преобразование энергии света при фотосинтезе», Пущино, 2005, с. 11-12.

45. С.В. Грачёв, И.Р. Прохоренко, М.Г. Винокуров, С.В. Зубова, Е.В.

Золотущенко, С.В. Прохоренко Изучение влияния нетоксичного ЛПС из Rhodobacter capsulatus (ЛПСRb.caps.) на активационные механизмы эндотоксинового шока. Конференция “Фундаментальные науки – медицине”.

Программа фундаментальных исследований Президиума РАН. Москва, 14 -декабря. Тезисы докладов, 160-162 (2005).

46. Прохоренко И.Р., Зубова С.В., Волошина Е.В., Гражданкин Е.Б., Винокуров М.Г., Мурашев А.Н., Грачев С.В. Эндотоксины- потентные активаторы клеток врожденного иммунитета XVIII Пущинские чтения по фотосинтезу и Всероссийская конференция «Преобразование энергии света при фотосинтезе», Пущино, 2005, с. 44-45.

47. Vinokurov M.G., M. M. Yurinskaya, and I. G. Akoev. Effect of Ionizing Radiation on Activation and Inhibition of Human Neutrophil Apoptosis. Biophysics, Vol. 50, Suppl. N 1, 2005, p. S86-S89.

48. Винокуров М.Г., Юринская М.М., Прохоренко И.Р., Грачев С.В.

Действие липополисахарида из Rb. Capsulatus и из E. coli на фагоцитарную активность нейтрофилов человека // Патогенез, 2005, № 3, С. 41-45.

49. Винокуров М.Г., Юринская М.М., Прохоренко И.Р., Прохоренко С.В., Грачев С.В. Липополисахарид Rb. capsulatus подавляет эндотоксининдуцированную задержку апоптоза миелоидных клеток человека // Доклады Академии наук, 2006, Т. 406, № 3, С. 398-401.

50. Винокуров М. Г., Юринская М. М., Прохоренко И. Р., Грачев С.В.

Липополисахарид Rhodobacter capsulatus нейтрализует эндотоксининдуцированные ответы нейтрофилов и моноцитов периферической крови человека // Молекулярная медицина, 2006, N.4. – С. 56-62.

51. Винокуров М.Г., Юринская М.М. Сусликов А.В., Печатников В.А., Грачев С.В. Исследование динамики Fas- и стресс-индуцированного апоптоза нейтрофилов человека при действии эндотоксинов // Доклады Академии наук, 2006, Т. 410, № 1, С. 124-126.

52. Винокуров М.Г., Юринская М.М., Прохоренко И.Р., Грачев С.В.

Действие различных хемотипов липополисахарида E. coli на апоптоз и активацию нейтрофилов человека // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2006, № 8, стр. 136-138.

Аннотация Винокуров Максим Григорьевич ИССЛЕДОВАНИЕ МЕХАНИЗМОВ ДЕЙСТВИЯ ЛИПОПОЛИСАХАРИДА RHODOBACTER CAPSULATUS НА ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ОТВЕТЫ И АПОПТОЗ ФАГОЦИТОВ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА ПРИ АКТИВАЦИИ ЭНДОТОКСИНАМИ Липополисахариды (эндотоксины) играют ключевую роль при сепсисе и септическом шоке в патогенезе грамотрицательных инфекций. В активационных процессах сепсиса значительная роль принадлежит миелоидным клеткам периферической крови. Целью данного исследования являлось изучение механизма защитного действия липополисахарида из фотосинтезирующих бактерий Rhodobacter capsulatus (LPSRb.caps.) на активацию миелоидных клеток человека под действием эндотоксина E. coli (LPSE.coli.) и его хемотипов (Ra-, Rc-, Re-). Предварительное инкубирование клеток с LPSRb.caps. отменяло эндотоксининдуцированную продукцию активных форм кислорода и значительно снижало 2-интегрин-зависимую адгезию нейтрофилов. Методом проточной цитометрии показано, что LPSRb.caps. значительно уменьшает эндотоксин-индуцированное ингибирование апоптоза нейтрофилов человека, отменяет увеличение экспрессии CD11b/CD18 рецепторов нейтрофилов и связывание LPSE.coli с моноцитами. Полученные результаты показывают, что защитное действие LPSRb.caps, реализуется на уровне сборки мембранного рецепторного комплекса эндотоксинов исследованных клеток. Исследовано сравнительное действие ультрафиолета С (УФС) и анти-Fas моноклональных антител на регуляцию апоптоза нейтрофилов человека при действии эндотоксинов. Показано, что УФС и анти-Fas моноклональные антитела ингибируют LPS-зависимую задержку апоптоза нейтрофилов. При этом действие УФС более эффективно по сравнению с действием анти-Fas моноклональных антител. Полученные результаты показали, что липополисахарид из Rhodobacter capsulatus PG может быть эффективным терапевтическим средством для предупреждения и лечения грамотрицательного шока у людей.

Summary Vinokurov Maxim Grigorievich RESEARCH OF MECHANISMS OF THE RHODOBACTER CAPSULATUS LIPOPYSACCHARIDE ACTION ON FUNCTIONAL ANSWERS AND APOPTOSIS OF HUMAN BLOOD PHAGOCYTES AT ENDOTOXIN ACTIVATION Lipopolysaccharides (endotoxins) play a key role in a sepsis and a septic shock in pathogenesis of Gram-negative infections. In activation processes of a sepsis the significant role belongs to myeloid cells of peripheral blood. The purpose of the given research was studying the mechanism of protective action of lipopolysaccharide from photosynthesizing bacteria Rhodobacter capsulatus PG (LPSRb.caps.) on activation of the human myeloid cells under action of endotoxins E. coli (LPSE.coli), its chemotypes (Ra-, Rc-, Re-) and Salmonella typhimurium. Preliminary incubation of cells with LPSRb.caps. cancelled endotoxins -induced production of reactive oxygen species and considerably reduced 2-integrin-depended adhesion of neutrophils. By a method of flow cytometry it is shown, that LPSRb.caps. considerably reduces endotoxins-induced inhibition of the human neutrophil apoptosis, cancels increase of CD11b/CDreceptors expression of neutrophils and binding of LPSE.coli with monocytes. The received results demonstrate, that protective action of LPSRb.caps is realized at a level of assembly membrane receptor a complex endotoxins of the investigated cells.

Comparative research of an ultraviolet C (UVC) action and anti-Fas monoclonal antibody on apoptosis regulation of human neutrophils at action endotoxins was carried out. It is shown, that at action UVC and anti-Fas monoclonal antibody inhibition of LPS-dependent neutrophil apoptosis considerably decreases. Thus UVC is more effective in comparison with action anti-Fas monoclonal antibody. LPS from Rhodobacter capsulatus PG may be an effective therapeutic agent for human septic shock due to Gram-negative bacteria.






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.