WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

 

На правах рукописи

МАЛОВА

Елена Сергеевна

ХРОНИЧЕСКИЕ ГЕПАТИТЫ В И С: ИММУНОПАТОГЕНЕЗ

И ИММУНОДИАГНОСТИКА ФИБРОЗНЫХ ИЗМЕНЕНИЙ

В ПЕЧЕНИ

14.03.09 – клиническая иммунология, аллергология

14.01.19 – инфекционные болезни

А в т о р е ф е р а т

диссертации на соискание учёной степени

доктора медицинских наук

Москва - 2011

Работа выполнена в ГОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет» Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию

Научные консультанты:

доктор медицинских наук                  ЕРЕМИНА

                                                                 Ольга Федоровна

академик РАМН,                                         ЮЩУК

доктор медицинских наук, профессор Николай Дмитриевич

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор БОРИСОВА

                                                                 Алла Михайловна


доктор медицинских наук, профессор                       ЯРИЛИН

                                                                 Александр Александрович

доктор медицинских наук, профессор ТОКМАЛАЕВ

Анатолий Карпович

Ведущая организация: ГОУ ВПО «Российский государственный медицинский университет» Росздрава

Защита диссертации состоится «16» февраля 2011 г. в «17» часов на заседании диссертационного совета Д 212.203.26 в ГОУ ВПО Российский университет дружбы народов (117198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д.6).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО Российский университет дружбы народов.

Автореферат  разослан  « »___________________ 2011 года

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор медицинских наук, профессор                                        Т.А.Славянская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ДИССЕРТАЦИИ

Актуальность проблемы

По данным Всемирной Организации Здравоохранения (ВОЗ) по меньшей мере 400 миллионов жителей планеты страдают хроническим гепатитом В (ХГВ) и около 2 миллиардов имеют серологические маркеры перенесенной или текущей инфекции вирусом гепатита В (ВГВ) [You J. et al., 2008; Das A. et al., 2008]. Среди инфицированных ВГВ у 10-40% взрослых и 90% новорожденных происходит хронизация инфекции [Pol S., 2006; Meuleman P. et al., 2006; You J. et al., 2008], в 10-30% случаев связанная с повышенным риском развития прогрессирующей болезни печени, включая фиброз, цирроз печени и гепатоцеллюлярную карциному [Chang J.J., Lewin S.R., 2007; Janssen H.L. et al., 2004; Ganem D., Prince A.M., 2004; Pol S., 2006]. Ежегодно в мире около миллиона инфицированных ВГВ погибает от неблагоприятных исходов заболевания [Dunn C. et al., 2007; Seeger C., Mason W.S., 2000; Das A. et al., 2008]. Тем не менее в последние годы отмечается падение частоты встречаемости прогрессирующего течения ХГВ в мире вообще и в России, в частности [Г.Г. Онищенко, А.Б. Жебрун, 2009; Rantala M., van de Laar M.J., 2008], и у 70-80% инфицированных на протяжении многих лет сохраняются нормальные показатели функции печени, что, однако, не предотвращает в полной мере вероятность формирования у них декомпенсации печеночной функции и развития гепатоцеллюлярной карциномы [Chen J.D., 2010; Shi Y.-H., Shi C.-H., 2009].

Вирусом гепатита С (ВГС), по последним данным ВОЗ, в мире инфицировано около 500 миллионов человек, причем не менее 170 миллионов из них имеют клинические проявления заболевания [Козлов В.К., Стельмах В.В., Радченко В.Г., 2009; Quiroga J.A. et al., 2006; Pham T.N., Michalak T.I., 2008; Boettler T. et al., 2005]. Хроническим гепатитом С (ХГС) инфицировано до 2% популяции развитых стран, в России число инфицированных ВГС составляет не менее 2 миллионов человек [Козлов В.К., Стельмах В.В., Радченко В.Г., 2009; Dolganiuc A., Szabo G., 2008]. Острая ВГС-инфекция в 75-85% случаев завершается формированием хронической формы заболевания с частотой неблагоприятных исходов в пределах 20-50% для цирроза печени и 20-30% для гепатоцеллюлярной карциномы [Murakami H. et al., 2004; Nahon P. et al., 2008].

Известно, что в основе патогенеза воспалительных и фиброзных изменений в печени при хронических гепатитах В и С, приводящих к неблагоприятным исходам данных инфекций, лежат сложные взаимодействия между вирусом и иммунной системой хозяина, и любое повреждение ткани печени при данных инфекциях является иммуноопосредованным [Ratnam D., Visvanathan K., 2008; Baumert T.F., Thimme R., von Weizscker F., 2007; Bertoletti A., Gehring A.J., 2006; Meuleman P. et al., 2006]. Тем не менее, большинство современных исследователей делает акцент на изучении специфических механизмов иммунного реагирования, что закономерно проявляется недостаточной изученностью роли факторов врожденного иммунитета, в частности, CD56+ клеток, в иммунопатогенезе хронических вирусных поражений печени и составляет актуальный аспект решения проблемы в целом.

При хронических гепатитах В и С прогноз заболевания и тактика ведения больных в большой степени зависят от выраженности фиброзного процесса в печени, который оказывает влияние на сроки проведения противовирусной терапии и дозы препаратов, служит критерием эффективности лекарственной терапии, определяет риск развития неблагоприятных исходов [Глушенков Д.В. и др., 2008; Павлов и др., 2006; Sporea I. et al., 2008]. Процедура биопсии печени, являющаяся на современном этапе «золотым стандартом» диагностики фиброза печени у больных хроническими гепатитами В и С, несет в себе определенный риск для здоровья пациентов, а современный уровень гистологической оценки образцов имеет ряд недостатков, снижающих ее диагностическую точность [Stauber RE, Lackner C., 2007; Павлов и др., 2008]. Кроме того, все существующие неинвазивные способы диагностики фиброза при хронических вирусных гепатитах не систематизированы, имеют ряд ограничений в применении и проявляют определенное несовершенство в сравнении с результатами биопсии печени [Poynard T., 2010; Gebo K.A., 2002; Rosenberg W.M. et al., 2004; Lambert J. et al., 2008]. Перечисленные аргументы подчеркивают актуальность поиска альтернативных путей диагностики фиброза печени у больных хроническими гепатитами В и С и объясняют причину повышенного интереса современных исследователей к неинвазивным методам прогнозирования стадий фиброза.

Таким образом, решение задач по совершенствованию методов неинвазивной диагностики фиброза и цирроза печени у больных хроническими гепатитами В и С на базе иммунологических концепций относится к числу актуальных проблем современного российского и мирового здравоохранения.

Цель исследования

Разработка методического подхода к способам неинвазивной иммунодиагностики стадий фиброза печени при хронических гепатитах В и С на основе оценки патогенетического значения CD56+ лимфоцитов, подтверждение диагностической и прогностической эффективности новых Иммунотестов.

Задачи исследования

  1. Сформировать новый методический подход к разработке способа неинвазивной иммунодиагностики стадий фиброза печени у больных хроническими вирусными гепатитами и апробировать его при исследовании крови больных хроническим гепатитом В.
  2. Апробировать методический подход к разработке способа неинвазивной иммунодиагностики стадий фиброза печени при исследовании крови больных хроническим гепатитом С.
  3. Разработать способ неинвазивной иммунодиагностики (Иммунотест) стадий фиброза печени у больных хроническим гепатитом В и дать оценку его диагностической точности, чувствительности и специфичности.
  4. Разработать способ неинвазивной иммунодиагностики (Иммунотест) стадий фиброза печени у больных хроническим гепатитом С и дать оценку его диагностической точности, чувствительности и специфичности.
  5. Установить влияние эпигенетических факторов (пола, возраста, уровня вирусной нагрузки, генотипического варианта ВГС) на оценку  способов неинвазивной иммунодиагностики стадий фиброза печени при хронических гепатитах В и С.
  6. Обосновать показания для применения предложенных способов неинвазивной иммунодиагностики стадий фиброза печени у больных хроническими гепатитами В и С в форме разработки диагностического алгоритма.
  7. Сопоставить диагностическую и прогностическую значимость разработанных способов неинвазивной иммунодиагностики стадий фиброза печени у больных хроническими гепатитами В и С с другими апробированными методами с использованием мета-анализа.

Научная новизна работы

При выполнении диссертационных исследований впервые:

Предложен новый методический подход к оценке иммунологических данных как критериальных признаков отдельных стадий фиброза печени у больных хроническими гепатитами В и С.

Уточнен иммунопатогенез хронических гепатитов В и С, а также фиброзных изменений в печени при данной патологии с участием CD56+ клеток.

Разработан оригинальный способ неинвазивной иммунодиагностики стадии F1 (начальной) фиброзных изменений в печени при хроническом гепатите В – Иммунотест ХГВ/F1.

Разработан оригинальный способ неинвазивной иммунодиагностики 3-й стадии (предцирротической) фиброзных изменений в печени при хроническом гепатите С – Иммунотест ХГС/F3.

Показаны диагностическая точность, чувствительность и специфичность разработанных Иммунотестов при неинвазивной диагностике соответствующих стадий фиброза печени у больных хроническими гепатитами В и С.

Выявлена зависимость оценки Иммунотеста ХГВ/F1 от пола больных и отсутствие зависимости Иммунотеста ХГС/F3 от половозрастных характеристик больных, вирусной нагрузки, генотипа вируса гепатита С.

Установлены основные направления диагностического применения Иммунотестов и алгоритм их использования при неинвазивной диагностике соответствующих стадий фиброза печени у больных хроническими гепатитами В и С.

Проведен мета-анализ неинвазивных методов диагностики фиброза печени при хронических гепатитах В и С в строгом соответствии со стадиями фиброза печени и показана высокая эффективность и конкурентоспособность разработанных Иммунотестов.

Теоретическая и практическая значимость

В процессе проведения исследований были получены новые научные данные о патогенетической роли CD56+ клеток в развитии реакций врожденного иммунитета и фиброза печени при хронических гепатитах В и С, что позволило создать уточненные схемы иммунопатогенеза названных заболеваний. Разработан и апробирован новый подход к оценке критериального значения отдельных показателей иммунного статуса при неинвазивной иммунодиагностике отдельных стадий фиброза печени у больных хроническими гепатитами В и С. Показана уникальность иммунологических сдвигов со стороны CD56+ лимфоцитов на стадии дебюта фиброзного процесса в печени при хроническом гепатите В и на стадии предцирротических изменений при хроническом гепатите С.

Разработаны Иммунотест ХГВ/F1 и Иммунотест ХГВ/F3 для использования в клинической практике в качестве методов неинвазивной иммунодиагностики хронических гепатитов В и С. Показана перспективность использования Иммунотестов в процессе диспансерного мониторинга больных данной инфекционной патологией. Показана конкурентоспособность Иммунотестов по диагностической точности, чувствительности и специфичности с другими неинвазивными методами диагностики фиброза печени при хронических гепатитах В и С. Проведен системный обзор (мета-анализ) современных данных о состоянии неинвазивной диагностики фиброза печени у больных хроническими гепатитами В и С.

Внедрение результатов работы в практику и учебный процесс

Новые сведения о роли CD56+ лимфоцитов в развитии реакций врожденного иммунитета и фиброза печени при хронических гепатитах В и С и уточненные схемы иммунопатогенеза названных заболеваний используются в учебном процессе на кафедрах инфекционных болезней Московского государственного медико-стоматологического университета (МГМСУ) и Российского университета дружбы народов (РУДН), а также на кафедре аллергологии и иммунологии ФПК медработников РУДН.

Разработанные Иммунотесты для неинвазивной диагностики фиброза печени у больных хроническим гепатитом В и прогноза цирроза печени у больных хроническим гепатитом С используются в научно-практической деятельности лаборатории патогенеза и методов лечения инфекционных заболеваний НИМСИ МГМСУ, а также медицинской компании «Гепатолог» (г. Самара).

На способ прогнозирования цирроза печени при хроническом гепатите С подана заявка на патент РФ (№ 2009144106 от 30.11.2009 г.) «Способ оценки фиброза печени у больных хроническим вирусным гепатитом С».

На способы прогнозирования цирроза печени при хроническом гепатите С и диагностики начала фиброзных изменений в печени при хроническом гепатите В получены разрешения Федеральной службы по надзору в сфере здравоохранения на применение медицинских технологий (ФС №  2009/392 от 08.12.2009 г. «Способ иммунопрогнозирования цирроза печени при хроническом вирусном гепатите С», ФС № 2010/029 от 24.02.2010 г. «Способ иммунопрогнозирования фиброза печени у больных хроническим вирусным гепатитом В»).

Положения, выносимые на защиту

  1. CD56+ лимфоциты играют значительную роль в иммунопатогенезе хронизации процесса и фиброзных изменений в печени при хронических гепатитах В и С, специфично проявляющуюся на стадии F1 фиброза печени у больных хроническим гепатитом В и на стадии F3 у больных хроническим гепатитом С и позволяющую сформулировать новый методический подход к оценке фиброзных изменений.
  2. Характерные изменения иммунологических показателей на стадии F1 фиброза печени у больных хроническим гепатитом В и на стадии F3 у больных хроническим гепатитом С могут служить критериальными признаками данных патологических состояний.
  3. Иммунотесты ХГВ/F1 и ХГС/F3, основанные на критериальных признаках фиброзного процесса в печени у больных хроническими гепатитами В и С, показаны при проведении неинвазивной диагностики указанных заболеваний, обладают высокой диагностической точностью, чувствительностью и специфичностью.
  4. Проведение мета-анализа неинвазивной диагностики фиброза печени при хронических гепатитах В и С подтверждило обоснованность включения в существующий арсенал методов Иммунотестов ХГВ/F1 и ХГС/F3 и установило их конкурентоспособность.

Апробация диссертации

Апробация диссертационной работы проведена на совместном научном заседании лаборатории патогенеза и методов лечения инфекционных заболеваний НИМСИ и кафедры инфекционных болезней и эпидемиологии Московского государственного медико-стоматологического университета. Материалы диссертации доложены и обсуждены в рамках International Congress «Advances in Immunology and Allergology at the Threshold of the XXI Century», 2000 (Eilat, Israel); VII Международного конгресса по иммунореабилитации «Аллергия, иммунология и глобальная сеть: взгляд в новое тысячелетие», 2001 (Нью-Йорк, США); IV съезда иммунологов и аллергологов СНГ, 2001 (Москва); I Съезда физиологов СНГ, 2005 (Сочи); International Symposium «Interaction of Neural and Immune Systems in Health and Disease», 2007 (Sankt-Petersburg); Национальной конференции «Аллергология и клиническая иммунология – практическому здравоохранению», 2010 (Москва); XVII Российского национального конгресса «Человек и лекарство», 2010 (Москва); ХV Международного конгресса по реабилитации в медицине и иммунореабилитации, 2010 (Дубай, ОАЭ); ХХI съезда физиологического общества им. И.П.Павлова, 2010 (Москва-Калуга); XV Российской конференции «Гепатология сегодня», 2010 (Москва); II Ежегодного Всероссийского Конгресса по инфекционным болезням, 2010 (Москва); 14th International Congress of Immunology, 2010 (Kobe, Japan); Межрегионального форума «Актуальные вопросы аллергологии и иммунологии – междисциплинарные проблемы, 2010 (Санкт-Петербург).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 26 научных работ, из них 10 в реферируемых журналах, в том числе в 2 зарубежных.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на  217 страницах и состоит из введения, обзора литературы, главы по материалам и методам исследования, 4 глав собственных исследований, заключения и обсуждения, выводов и практических рекомендаций. Работа иллюстрирована 31 таблицами и 59 рисунками. Список литературы содержит 496 источников, из которых  52 отечественных и  444 зарубежных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

Объем, характер и методы проведенных исследований

Для решения поставленных задач проведено обследование: в составе основных групп исследования 37 больных с верифицированным диагнозом хронического гепатита В (ХГВ) и 127 больных с верифицированным диагнозом хронического гепатита С (ХГС), в составе групп сравнения 10 пациентов с алкогольным циррозом печени и 6 больных первичным билиарным циррозом печени, в составе контрольной группы 32 доноров и добровольцев – клинически здоровых лиц. Пациенты наблюдались в инфекционных клинических больницах № 1 и № 2 г. Москвы, клинике пропедевтики внутренних болезней, гастроэнтерологии и гепатологии им. В.Х.Василенко ММА им. И.М.Сеченова, Медицинской Компании «Гепатолог» г.Самары. Включение в группы производилось в строгом соответствии с критериями включения и исключения и предполагало обязательное информированное согласие пациента на обследование.

Критериями включения в основные группы служили: верифицированный диагноз хронического гепатита В или С; отсутствие этиотропной терапии в течение последних 6 месяцев перед обследованием; наличие полученных в течение последнего месяца данных биопсии печени; наличие в течение 2-х недель положительных результатов на наличие в крови вируса гепатита В или С по данным ПЦР, а также позитивных результатов серологических исследований; возраст от 18 до 65 лет; информированное согласие на обследование. Критериями отбора в группы сопоставления являлись: наличие верифицированного диагноза заболевания; отсутствие по результатам обследования вирусных гепатитов В и С; наличие полученных в течение последних 2-х недель данных гематологических, биохимических исследований крови, ультрасонографического обследования брюшной полости; возраст от 18 до 65 лет; информированное согласие на обследование. Критериями отбора в контрольную группу являлись: отсутствие каких-либо жалоб и клинико-лабораторных признаков острых и хронических заболеваний на момент обследования; отсутствие в анамнезе сведений, позволяющих причислить обследуемых к категории часто и длительно болеющих лиц, лиц с хроническими заболеваниями, с признаками инфекционно-воспалительных, аллергических, аутоиммунных, иммунодефицитных состояний; отсутствие по данным анамнеза, результатам ПЦР, серологических и биохимических исследований вирусного гепатита В или С и других заболеваний печени; возраст от 18 до 65 лет; информированное согласие на обследование. Критерии исключения пациентов из исследования были следующие: наличие тяжелых соматических заболеваний, сопутствующих аутоиммунных заболеваний и заболеваний соединительной ткани, тяжелых заболеваний эндокринной системы, онкологических заболеваний, ВИЧ-инфекции, органических заболеваний центральной нервной системы; сочетание хронического гепатита В и С; возраст до 18 лет или старше 65 лет; отсутствие информированного согласия на обследование; нарушение больным протокола исследования.

Всем пациентам проводилось единое обследование, включавшее:

  1. Клиническое исследование периферической крови (гемометрия) на гематологическом анализаторе фирмы «BECMAN-COULTER» с определением стандартного набора показателей в составе: абсолютное число лейкоцитов, эритроцитов, тромбоцитов, абсолютное содержание гемоглобина, относительный показатель гематокрита, абсолютное и относительное число гранулоцитов, лимфоцитов, моноцитов.
  2. Биохимическое исследование крови с определением общего билирубина, холестерина, мочевины, креатинина, глюкозы, общего белка, альбуминов, протромбинового индекса, а также активности аспаратаминотрансферазы (АсАТ), аланинаминотрансферазы (АлАТ), гаммаглутамилтранспептидазы (ГТП) и щелочной фосфатазы на биохимических анализаторах Hitachi Roche (Япония), 902 Automatic analyzer, Erba XL-600 и A-25 Bio Systems (Испания).
  3. Определение в сыворотке крови маркеров вирусных гепатитов методом иммуноферментного анализа (ИФА) при помощи диагностических тест-систем ЗАО «Вектор-Бест», Sanofi Diagnostics Pasteur, НПО «Диагностические системы», «Lа Roche» (Швейцария), др.
  4. Качественное и количественное определение ДНК HBV и РНК HCV в крови и определение генотипа HCV методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с преимущественным использованием диагностических наборов ДНК-сорб, АмплиСенс-200, ЭФ-200 и РИБО-сорб, РЕВЕРТА, АмплиСенс-200, ЭФ-200.
  5. Ультрасонографическое исследование органов брюшной полости по месту наблюдения пациентов на аппаратах Esaote Megas, SonoFine, GE Logiq, др.

Хронический гепатит В диагностировали в случае длительности заболевания более 6 месяцев, наличия HBs антигена, анти-HBcorIgG и ДНК HВV в крови. Хронический гепатит С диагностировали в случае длительности заболевания более 6 месяцев, наличия анти-HCV и РНК HCV в крови. Диагноз цирроза печени устанавливался на основании данных анамнеза и комплексной оценки клинико-лабораторных и инструментальные показателей: снижение общего количества тромбоцитов, протромбинового индекса, альбумина в крови, признаков портальной гипертензии при ультразвуковом исследовании брюшной полости, данных эзофагогастродуоденоскопии с оценкой состояния вен пищевода и кардиального отдела желудка.

  1. Все пациенты основных групп были подвергнуты в стационарных условиях чрезкожной пункционной биопсии печени иглами «Hepafix» (типа Menghini) диаметром 1,2-1,6 мм по методу Менгини под местной анестезией с последующим гистологическим исследованием биоптатов, проведенным в лабораториях стационарных баз по месту наблюдения пациентов. Оценка степени (стадии) фиброза печени в биоптатах при хронических гепатитах В и С проводилась полуколичественным методом с использованием критериев шкалы METAVIR.
  2. Изучение клеточного состава крови обследуемых выполнялось посредством иммунологического лабораторного исследования венозной крови в лаборатории патогенеза и методов лечения инфекционных заболеваний отдела клинической медицины НИМСИ МГМСУ с использованием проточного цитофлуориметра BD FACSCanto II (Becton Dickinson, США) после автоматизированной пробоподготовки цельной крови с помощью моноклональных антител (МКАТ) и включало определение: (1) типовой иммунограммы, (2) субпопуляционного состава и (3) функциональной активности CD56+ клеток в крови.

При определении типовой иммунограммы проводилось изучение абсолютного и относительного числа СD45+/CD3+ клеток (общего числа Т-лимфоцитов), СD3+/CD4+ (Т-хелперов), СD3+/CD8+ (цитотоксических Т- клеток), CD3+/CD56+ (ЕКТ), CD19+ (В-лимфоцитов), CD3-/СD16+/CD56+ (естественных киллеров) при использовании стандартизированного комплекта моноклональных антител (МКАТ) BD Multitest 6-Color TBNK Reagent (BD Biosciences).

Определение относительного содержания субпопуляций CD56bright и CD56dim естественных киллеров (ЕК) в крови проводился методом проточной цитофлуориметрии на основе проб с меченными РЕ-Су5 anti-CD56 МКАТ (IOTest, Beckman Coulter). Относительное число субпопуляций CD4+, CD8+ и CD8-/CD4- (DN) ЕКТ лимфоцитов выявлялось с использованием комплекта МКАТ BD Multitest 6-Color TBNK Reagent (BD Biosciences).

Для анализа функциональной активности СD56+ клеток регистрировались уровни экспрессии на их мембране следующих маркеров: 1) киллингингибирующие рецепторы (KIR) из суперсемейства иммуноглобулинов (CD158a,h), 2) ингибирующие рецепторы суперсемейства лектинов С-типа (CD94), 3) активирующие рецепторы суперсемейства лектинов С-типа (NKG2D), 4) гликопротеиды, ассоциированные с мембраной лизосом и отражающие состояние гранулярного аппарата клетки (CD107a), 5) рецепторы естественной цитотоксичности (NKp46), 6) CD16 рецепторы, опосредующие механизм антителозависимой клеточной цитотоксичности (АЗКЦТ). Определение относительного количества CD56+ клеток, экспрессирующих все перечисленные маркеры, за исключением CD107a, проводилось в раздельной пробе крови и использованием в каждом случае комплекта из двух моноклональных антител: меченных РЕ-Су5 anti-CD56 МКАТ (IOTest, Beckman Coulter) и меченных РЕ специфических МКАТ (IOTest, Beckman Coulter). Для регистрации CD56+ клеток, несущих маркер CD107a, производилось внутриклеточное определение данного рецептора с использованием пермабилизирующих компонентов фирмы Beckman Coulter и комплекта из двух моноклональных антител: меченных FITC anti-CD107a МКАТ (BD Biosciences) и меченных РerCP-Cy5-5 anti-CD56 МКАТ (BD Biosciences).

Тестирование уровней всех классов иммуноглобулинов (IgA, IgM, IgG, IgE), уровней интерферона (ИФН), интерлейкинов 10 и 13 (ИЛ10, ИЛ13) в сыворотке крови, а также трансформирующего фактора роста (ТФР) в плазме крови осуществлялось методом ИФА с использованием комплекта аппаратуры (планшетный фотометр «OPSYS MR» (ридер) фирмы «THERMOLABSYSTEMS», планшетный вошер ПП2-428 фирмы «ИММЕДТЕХ», принтер «EPSON») для раздельного определения в соответствии с инструкцией по применению аппаратуры и комплекта МКАТ.

  1. Для статистической обработки данных применялись методы дискриптивной статистики, сравнение величин осуществлялось приемами непараметрической статистики с использованием критериев Манна-Уитни и Колмогорова-Смирнова и критерия χ2 в соответствии с распределением данных. Для подтверждения информативности и диагностической значимости проведенных исследований проводился дискриминантый анализ с определением стандартизированного канонического коэффициента дискриминантной функции (СККДФ). Определение влияния отдельных факторов на гетерогенность данных для разработанных критериальных значений на основе критерия Фишера (F) проводилось методом дисперсионного анализа. Проверка гипотезы по соответствию полученных данных разработанным критериям осуществлялась на основе определения относительного риска несоответствия, а чувствительность и специфичность разработанных способов иммунодиагностики стадий фиброза печени характеризовались методом линейной регрессии с построением ROC-кривой и расчетом площади под кривой – AUROC. Математическая обработка данных проводилась на основе пакета статистических программ SPSS 17.0 (допустимая ошибка Е=5%). Мета-анализ способов неинвазивного определения стадий фиброза печени у больных хроническим гепатитом В и С осуществлялся с использованием программы Comprehensive Meta-Analyse Version 2.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Для реализации поставленной цели был сформирован новый методический подход к разработке способов неинвазивной иммунодиагностики стадий фиброза печени (Иммунотестов) у больных хроническими гепатитами В и С, основанный на предположении о том, что характер иммунного процесса при качественном изменении состояния фиброза вследствие перехода от одной стадии к другой в значительной степени отличается друг от друга. При этом каждой стадии соответствует свой уровень вовлечения отдельных компонентов иммунной системы в формирование фиброзных изменений.

Новый методический подход к разработке способа неинвазивной иммунодиагностики стадий фиброза печени у больных ХГВ. Группу обследования составили 37 больных ХГВ в возрасте от 18 до 65 лет, среди которых по данным пункционной биопсии печени отсутствие фиброза (F0) диагностировано у 4-х больных (10,8%), начальная стадия фиброзных изменений в печени (F1) у 16 больных (43,2%), умеренный фиброз (F2) у 5 пациентов (13,6%), выраженный (F3) – у 3 (8,1%), цирроз печени (F4) – у 9 (24,3%). Результаты исследований сопоставлялись с таковыми в контрольной группе из 32 здоровых людей, при этом, в связи с малочисленностью группы на стадии F3, значительно снижающей возможность статистической обработки данных, группы больных ХГВ на стадиях F2 и F3 были объединены в единую группу F2-F3 в составе 8 человек.

Типовое иммунологическое обследование больных ХГВ оказалось малоинформативным для выявления критериев перехода одной стадии фиброза в другую, однако отчасти подтвердило возможное участие CD56+ клеток в фиброгенезе в целом, а ЕК (CD16+/CD56+) в развитии цирроза печени, в частности. Последующее углубленное исследование CD56+ лимфоцитов у больных хроническими гепатитами В и С проводилось одновременно на нескольких уровнях: путем определения субпопуляционного состава этих клеток, регистрации их функционального состояния, а также путем выявления уровня секреции регуляторных цитокинов этих клеток – ИФН, ТФР, ИЛ10 и ИЛ13. Результаты иммунологического исследования по стадиям фиброза печени у больных ХГВ представлены на астрограмме рисунка 1.

Рис.1 Астрограмма соответствия иммунологических данных стадиям

фиброза печени у больных хроническим гепатитом В

Анализ показателей экспрессии рецепторов функционального состояния CD56+ лимфоцитов в крови больных ХГВ продемонстрировал динамическое изменение способности данных клеток к проявлению цитотоксических свойств на разных стадиях фиброза печени. Кроме того, в процессе проведения углубленных иммунологических исследований у больных ХГВ удалось подтвердить предположение о четком соответствии характера иммунологических сдвигов отдельным стадиям фиброзного процесса. При этом наиболее характерные изменения со стороны CD56+ клеток наблюдались на стадии фиброза F1, а 5 из набора тестированных параметров могли иметь критериальное значение в идентификации данной стадии в определенном диапазоне величин. К их числу принадлежали относительное число  CD3+/CD8+ клеток (Тцтл); СD4+ и CD8+ субпопуляций ЕКТ (СD3+.СD6+); CD56+ клеток, экспрессирующих рецепторы естественной цитотоксичности – NKp46+, уровень ТФР в крови больных ХГВ. Стойкое повышение уровня последнего в крови больных ХГВ относительно контроля сопровождало развитие фиброзных изменений в печени на всех стадиях, что согласовывалось с профиброзным действием данного цитокина по данным литературы [Галимова С.Ф. и др., 2001; Пинцани М., 2002].

Интересно, что информативность 4 из 5 показателей как критериальных значений была установлена с использованием дискриминантного анализа и не выявлялась при общепринятом статистическом подходе. Оказалось, что практически все эти показатели, кроме уровня ТФР, на стадии F1 давали два варианта отклонения: в сторону повышения и в сторону снижения, что не улавливалось при анализе средних величин (рисунок 2).

Рис. 2. Разнонаправленные сдвиги величин критериальных параметров

стадии фиброза печени 1 у больных хроническим гепатитом В

На следующем этапе исследования выяснялось, могут ли критериальные показатели из числа иммунологических параметров при ХГВ быть дополнены данными, полученными в результате общеклинических исследований крови – гематологических и биохимических. Комплексный анализ гематологических сдвигов у больных ХГВ, включавший определение стандартизированного канонического коэффициента дискриминантной функции (СККДФ), дополнил перечень информативных параметров относительным содержанием моноцитов в крови. Данный показатель демонстрировал достоверные различия между группами больных ХГВ при их распределении в соответствии со стадиями фиброза печени и, таким образом, претендовал на роль прогностического критерия прогрессирования фиброза с переходом от одной стадии к другой. Биохимические показатели, несмотря на многочисленные отклонения от контроля, не показывали достоверных различий между группами обследованных, что определило их низкую информативность для диагностики стадий фиброза печени у больных ХГВ.

Анализ частоты встречаемости диапазонов каждого из информативных показателей на различных стадиях фиброза печени у пациентов ХГВ позволил подтвердить особую диагностическую значимость шести отобранных параметров только для начальной стадии фиброза печени (F1), поскольку каждый из отмеченных критериальных признаков регистрировался не менее чем у 81,2% больных.

Таким образом, углубленное изучение субпопуляционного состава и функциональной активности CD56+ клеток (ЕК и ЕКТ) крови показало возможность формирования набора критериальных признаков для иммунодиагностики, в первую очередь, начальных фиброзных изменений в печени (F1) при ХГВ. Было установлено 6 критериальных признаков для регистрации F1 стадии фиброза печени у больных ХГВ в виде диапазона значений показателей с частотой встречаемости выше 70%, не регистрируемых на других стадиях. Итоговая шкала критериев иммунодиагностики стадии F1 фиброза печени у больных ХГВ представлена на таблице 1.

Таблица 1. Шкала критериев иммунодиагностики стадии 1

фиброза печени у больных хроническим гепатитом В

Критериальные параметры

Диапазон критериальных значений

Частота

регистрации

ниже:

выше:

Моноциты, %

3,6%

-

81,2%

CD3+/CD8+, %

19,6%

30,8%

100%

CD3+/СD56+/CD4+, %

2,9%

9%

87,5%

CD3+/CD56+/CD8+, %

71,8%

82,4%

81,2%

CD56+/NKp46+, %

35%

62%

100%

ТФР, пг/л

-

10,3 пг/л

93,8%

Новый методический подход к разработке способа неинвазивной иммунодиагностики стадий фиброза печени у больных ХГС. На данном этапе наших исследований апробация нового методического подхода к разработке Иммунотестов для неинвазивного определения стадий фиброза печени была произведена на основе оценки патогенетического значения CD56+ лимфоцитов у больных хроническим гепатитом С (ХГС). Под нашим наблюдением находилось 127 больных ХГС в возрасте от 18 до 65 лет с различной выраженностью фиброзных изменений печени, подтвержденной гистологическим исследованием ткани органа. В соответствии с результатами пункционной биопсии печени и последующей полуколичественной оценкой индекса фиброза по системе METAVIR больные ХГС были распределены на следующие группы: (1) 14 больных (11,0%) с отсутствием фиброзных изменений в печени – стадия фиброза F0 по шкале METAVIR; (2) 56 больных (44,1%) со стадией фиброза F1; (3) 12 (9,4%) больных – F2; (4) 9 больных (7,1%) – F3; (5) 36 больных ХГС с исходом в цирроз печени (28,4%) – стадия фиброзных изменений F4. Контрольную группу составили 32 здоровых донора.

Первичный анализ динамики типовых иммунологических показателей выявил связь СD56+ клеток (ЕКТ и естественных киллеров – CD3+/CD56+ и CD16+/CD56+) с наличием фиброзных изменений в органе-мишени у больных ХГС, что диктовало необходимость более углубленного исследования участия популяции этих клеток в фиброгенезе печени при данной патологии. Уровни данного исследования CD56+ лимфоцитов при ХГС соответствовали таковым при ХГВ.

Посредством углубленного исследования состояния популяции CD56+ клеток на разных стадиях фиброза печени при ХГС были выявлены наиболее значимые сдвиги в их составе. На данном этапе работы нами были установлены достоверные различия между стадиями фиброзных изменений в печени по ряду тестированных параметров. Наибольшие отклонения касались роста доли субпопуляции CD3+/CD56+/CD4+ ЕКТ, снижения экспрессии CD94+ рецептора на поверхности ЕК клеток и маркера цитотоксических гранул CD107а, падения уровня ТФР в крови больных на 3-й стадии фиброза в сравнении с предыдущей стадией, и снижения продукции ИЛ-10 на протяжении стадий F1 – F3. Значимые изменения субпопуляций ЕКТ (CD3+/CD56+/CD4+ и CD3+/CD56+/CD8+) и показателей функциональной активности CD56+ клеток (экспрессии NKG2D и CD107а) проявлялись также на стадии развития цирроза печени в сравнении с 3-й стадией фиброза печени (рисунок 3). Эти данные вызывали особый интерес с позиций декларируемого нами подхода к разработке Иммунотестов, а наибольшего внимания с этих позиций заслуживала стадия фиброза F3, иммунологические сдвиги при которой требовали дальнейшего изучения роли CD56+ клеток в прогрессировании фиброза на этапах F2F3 и F3F4.

Рис. 3. Астрограмма соответствия иммунологических данных стадиям

фиброза печени у больных хроническим гепатитом В

Далее нами устанавливалось диагностическое значение возможных дополнительных критериальных параметров из состава гемограмм и биохимических тестов. Комплексное исследование гематологических и биохимических изменений при ХГС в зависимости от стадии фиброза печени выявило значимое число достоверных различий между группами обследованных больных, однако попытка установить информативность этих отклонений для дифференциации отдельных стадий фиброза печени с помощью дискриминантного анализа, показала довольно низкие (<0,3) значения СККДФ, что позволяет считать использованные в исследовании гематологические и биохимические параметры непригодными на роль критериальных признаков отдельных стадий фиброза печени у больных ХГС.

На следующем этапе работы посредством дискриминантного статистического анализа были выявлены иммунологические параметры, претендовавшие на статус информативных критериев фиброгенеза. Наибольшую значимость имели такие параметры как доля CD56+ клеток, экспрессирующих NKp46 рецептор, относительное содержание В-лимфоцитов (CD45+/CD19+) и ЕКТ (CD3+/CD56+) в крови, число ЕК, лишенных способности к АТЗЦТ (CD16-) и экспрессирующих маркер цитотоксических гранул (CD107а), то есть преимущественно показатели функциональной активности CD56+ клеток крови.

Для выявления конкретного диагностического и прогностического значения отмеченных информативных параметров анализировалась частота встречаемости диапазонов значений каждого из них на разных стадиях фиброза печени у больных ХГС. Стадия фиброза 0 была принята нами за исходную сравнительную позицию условного мониторинга больного, а принципом отбора того или иного признака в качестве диагностического критерия служила, как и в случае ХГВ, принятая нами относительно высокая (не менее 70%) частота регистрации критериальных значений показателя в исследуемой группе. В ходе анализа сопоставлялись диапазоны значений (минимум-максимум) показателей каждой последующей стадии по отношению к предыдущей, что позволило выделить такие критериальные значения параметра, которые не были зафиксированы на предыдущей стадии, а также установить частоту их встречаемости в каждой группе.

В итоге в качестве информативных показателей крови больных ХГС были отобраны девять признаков: (1) абсолютное и (2) относительное число ЕКТ (CD3+/ CD56+); содержание (3) CD4+ и (4) CD8+ субпопуляций ЕКТ; количество CD56+ клеток, экспрессирующих (5) CD94, (6) NKG2D, и (7) NKp46 рецепторы, а также (8) CD107а – маркер цитолитических гранул, (9) уровень ТФР в крови. При дальнейшем исследовании наиболее значимые сдвиги тестированных параметров были выявлены на 3-й стадии фиброзных изменений в печени (F3), что позволило перевести их в разряд критериальных, отличающих данную стадию фиброза печени при ХГС, и объединить в шкалу для иммунодиагностики данной стадии фиброза печени у больных ХГС (таблица 2).

Таблица 2. Шкала критериев иммунодиагностики стадии 3 фиброза

печени у больных хроническим гепатитом С (Иммунотест ХГС/F3)

Критериальные параметры

Диапазон критериальных значений

Частота

регистрации

ниже:

выше:

CD3+/ CD56+, %

-

3,7%

100%

CD3+/ CD56+, абс.

-

0,08*109/л

88,9%

CD3+/CD56+/CD4+, %

-

23,8%

100%

CD3+/CD56+/CD8+, %

47,6%

66,7%

100%

CD56+/ CD94+, %

46,7%

62%

100%

CD56+/ NKG2D+, %

95,9%

98,4%

100%

CD56+/ NKp46+, %

28,9%

40,5%

100%

CD56+/ CD107a+, %

98,2%

-

100%

ТФР, пг/л

11,0пг/л

-

100%

Таким образом, в процессе анализа удалось отобрать критериальные признаки 3-й стадии фиброзных изменений в печени при ХГС, что позволило с большой долей вероятности прогнозировать риск развития цирроза печени и, в ряде случаев, зафиксировать наступление цирротических сдвигов еще до появления клинических признаков этого состояния. Все отобранные критерии выявлялись при углубленном иммунологическом тестировании крови и имели четкие диапазоны значений, позволявшие проводить их диагностическую оценку.

Влияние эпигенетических факторов на результаты Иммунотестов для неинвазивной диагностики стадий фиброза печени у больных хроническими гепатитами В и С. Апробированный на предыдущих этапах исследования новый методический подход не только позволил разработать критерии иммунологической диагностики фиброза и прогноза цирроза печени у больных хроническими гепатитами В и С, но и создал предпосылки для получения на основе этих критериев оригинальных неинвазивных способов определения некоторых стадий фиброзных изменений в печени при названных заболеваниях – Иммунотестов, а также сопоставить эти способы с другими схожими по целям диагностическими приемами с использованием мета-анализа. Для осуществления последнего потребовалось уточнить способ оценки результатов иммунодиагностики по отобранным критериям в соответствии с исследованиями других авторов, а также охарактеризовать гетерогенность полученных данных путем выявления их зависимости от отдельных эпигенетических факторов, входящих в индивидуальную характеристику каждого пациента и способных повлиять на особенности течения у него фиброзного процесса при хронических гепатитах В и С. Оценивалось влияние таких эпигенетических факторов как пол, возраст пациента, уровень вирусной нагрузки и генотипический вариант ВГС на диагностическое значение Иммунотестов при хронических гепатитах В и С.

Изучение влияния эпигенетических факторов пациентов на гетерогенность полученных критериев отдельных стадий фиброза печени при хронических гепатитах В и С проводилось методом дисперсионного анализа (F-тест) с определением критерия Фишера и соответствующего ему р неоднородности: при р неоднородности <0,05 группа больных с наличием того или иного признака считалась гетерогенной. Помимо этого, была проанализирована частота встречаемости каждого диагностически значимого критериального признака для стадий фиброза печени F1 при ХГВ и F3 при ХГС, поскольку была доказана возможность их иммунологической индикации.

Предварительно разрабатывался способ оценки результатов определения критериально значимых признаков для стадии фиброза печени 1 у больных ХГВ и стадии фиброза 3 у больных ХГС. С этой целью была предпринята попытка оценивать тест по иммунологическому определению отдельных стадий по шкале баллов. Определение весового коэффициента для каждого показателя с помощью регрессионного анализа успеха не принесло, в то время как соответствие каждого индивидуального показателя иммунограммы у больного диапазону значений одного из критериальных признаков, оцененная в 1 балл, оказалась высоко эффективной.

В результате такого подхода была зарегистрирована гетерогенность по половому признаку у больных ХГВ для критериев стадии фиброза печени 1, прежде всего, на уровне содержания моноцитов в крови. При хроническом гепатите С половые различия не влияли ни на один из критериев индикации стадии фиброза F3, а относительный риск (ОР) несоответствия критериев неинвазивной и инвазивной диагностики, определенный по шкале оценки теста в целом в баллах, был примерно одинаков у мужчин и у женщин.

Дисперсионный анализ влияния других факторов на оценку тестов в баллах ни в одной группе больных хроническими вирусными гепатитами не выявил гетерогенности тестируемых критериальных показателей по возрастному признаку, уровню вирусной нагрузки и генотипу ВГС. Что касается деталей определения влияния уровня вирусной нагрузки, то по нашим наблюдениям у больных ХГВ регистрировалась низкая вирусная нагрузка (<10000 копий/мл), за исключением 1 случая умеренной нагрузки (в интервале от 10000 до 100000 копий/мл) на стадии цирроза печени (F4), которая не влияла на достоверность различий показателей. Что касается хронического гепатита С, то низкая вирусная нагрузка (менее 2000000 копий/мл) преобладала на всех рассматриваемых в данном разделе стадиях, а «не 1b» генотип выявлен только у 3-х из 36 пациентов на стадии F4, что также не сопровождалось влиянием на достоверность наблюдаемых различий.

Таким образом, оценка критериальных признаков в баллах оказалась наиболее рациональным способом определения отдельных стадий фиброза печени у больных хроническими гепатитами В и С и единственным критерием, который позволил рассчитать относительные риски (ОР) несоответствия полученных данных целям исследования. В целом, ОР без учета пола колебались от 0,93 до 1,05 для F1 стадии ХГВ и от 0,89 до 1,33 для F3 стадии ХГС, что позволяет предполагать значение общей оценки разработанных тестов в баллах (Иммунотестов ХГВ/F1 и ХГС/F3) как достоверных способов неинвазивной иммунодиагностики названных стадий фиброза печени у больных хроническими гепатитами В и С. Что касается влияния пола на Иммунотест ХГВ/F1, то его способность снизить оценку данного теста на 1 балл была учтена нами в процессе дальнейшего анализа диагностической точности способа.

Иммунотест ХГВ/F1 как неинвазивный способ иммунодиагностики начала фиброзных изменений в печени у больных хроническим гепатитом В. На данном этапе исследований был проведен расширенный многокомпонентный статистический анализ соответствия значений Иммунотеста ХГВ/F1 различным стадиям фиброза печени как у больных ХГВ, так и у пациентов групп сопоставления. Последние были представлены больными ХГС (127 человек), алкогольным циррозом печени (10 человек), первичным билиарным циррозом печени (6 человек), контрольной группой клинически здоровых лиц (32 человека), что позволило оценить диагностическую точность, чувствительность и специфичность предлагаемого способа неинвазивной диагностики начала фиброзных изменений в печени у больных ХГВ. Проведенный анализ показал, что по максимальному количеству баллов (6) критериям Иммунотеста ХГВ/F1 удовлетворяли 75% больных ХГВ на данной стадии заболевания, причем данную группу пациентов почти целиком составляли мужчины.

Дальнейший статистический анализ по оценке диагностической точности метода неинвазивной иммунодиагностики фиброза печени у больных ХГВ (Иммунотеста ХГВ/F1) предполагал расчет 95% доверительного интервала (95%ДИ) для параметров использованного теста. Сравнительный анализ Иммунотеста ХГВ/F1 по 95%ДИ (рисунок 4) подтвердил его достоверное отличие (в сторону повышения) от аналогичных интервалов во всех других группах сопоставления при использовании непараметрического критерия Колмогорова-Смирнова, при этом ни в одной другой группе сопоставления показатель 95% ДИ не достигал нижней границы такового на стадии F1 у больных ХГВ. Благодаря этому, Иммунотест ХГВ/F1 характеризовался довольно высокой чувствительностью и специфичностью.

Рис. 4. 95% доверительные интервалы оценки в баллах разных стадий

фиброза печени при различных заболеваниях с помощью критериев

для F1 у больных хроническим гепатитом В

За чувствительность способа принималась доля его ложнопозитивных результатов среди всех больных групп сопоставления, за специфичность способа – доля его ложнонегативных результатов при сравнении с группой здоровых людей [Altman D.G., Bland J.M., 1994]. В основной группе больных ХГВ на стадии F1 у 75% обследованных регистрировалась величина Иммунотеста ХГВ/F1 в 6 баллов, которая ни разу не была отмечена в группах сопоставления, то есть чувствительность способа в этом случае составляла 100%. У 25% больных основной группы, у которых сказывалось, в первую очередь, влияние пола (женщины) на число моноцитов, величина Иммунотеста ХГВ/F1 составляла 5 баллов. Такой же результат был отмечен у 19 из 142 больных (14%) групп сопоставления, в связи с этим чувствительность метода при 5 баллах снижалась до 86%. Что касается специфичности способа, то в основной группе при 5-6 балльной оценке ни разу не было отмечено ложнонегативного результата, предполагаемого у здоровых людей, то есть специфичность также была на уровне 100%.

При проведении мета-анализа соотношение чувствительности/ специфичности способа и, соответственно, его диагностическую и прогностическую значимость принято характеризовать путем построения ROC-кривой и выражать в величинах AUROC. При таком статистическом подходе, чем выше уровень величин и соответствия чувствительности и специфичности способа, тем больше площадь пространства под ROC-кривой – AUROC, а способ, у которого AUROC <0,5, не должен рассматриваться в качестве диагностически значимого [Long E.R., De Long D.M., Clarke-Pearson D.L.б 1988; Poynard T., Morra R., Halfon P. et al., 2007; Zhou X., Obuchowski N., McClish D, 2002]. На рисунке 5 представлена ROC-кривая и значения AUROC при использовании Иммунотеста ХГВ/F1 у больных ХГВ на диагностируемой стадии фиброза печени. AUROC, равный 0,978, подтверждает высокий уровень соответствия чувствительности и специфичности, а также диагностическую точность Иммунотеста ХГВ/F1 на начальной стадии фиброзных изменений в печени. В то же время на остальных стадиях диагностическая точность Иммунотеста ХГВ/F1 находилась за пределами положительной оценки. Прогностическая ценность предложенного теста позволила отнести его качество по величине AUROC (>0,90) в разряд«отличных» неинвазивных методов иммунодиагностики стадии фиброза F1 при ХГВ [Павлов Ч.С. и др., 2007].

Рис. 5. ROC-кривая оценки в баллах Иммунотеста ХГВ/F1

на 1-й стадии фиброза печени у больных ХГВ

Кроме того, проведенный статистический анализ предлагаемого способа иммунодиагностики позволил уточнить алгоритм определения начальной стадии фиброза печени (F1) у больных ХГВ, который складывался из нескольких этапов: (1) верификация диагноза «хронический гепатит В»; (2) определение в крови больного 6 иммунологических критериев, включающих относительное содержание моноцитов, цитотоксических CD3+/CD8+ лимфоцитов, CD4+ и CD8+ субпопуляций ЕКТ, количество CD56+ клеток, экспрессирующих NKp46 рецептор, и уровень ТФР; (3) определение соответствие каждого из 6 показателей у данного больного диапазону их критериальных значений; (4) оценка иммунодиагностического теста в баллах; (5) определение соответствия оценки в баллах доверительному интервалу иммунодиагностического теста (5,46 – 6,04); (6) вывод о соответствии или несоответствии иммунодиагностического теста 1-й стадии фиброза печени у больного хроническим гепатитом В.

Иммунотест ХГС/F3 как неинвазивный способ иммунодиагностики начала фиброзных изменений в печени у больных хроническим гепатитом С. В данном разделе исследований проверялась гипотеза о том, что определение критериальных признаков стадии F3 у больных ХГС можно представить в виде Иммунотеста – оценки теста в баллах, где соответствие каждого индивидуального показателя иммунограммы у больного диапазону значений одного из критериальных признаков оценивается в 1 балл. В этом случае на стадии F3 максимальная суммарная оценка критериального теста в баллах была равна девяти. Для подтверждения эффективности разработанного способа иммунодиагностики ХГС/F3 группами сопоставления в данном фрагменте исследования служили больные с другими стадиями фиброза печени при ХГС, с различными стадиями фиброза печени при ХГВ, с циррозами печени невирусной этиологии (алкогольный, первичный биллиарный), контрольная группа здоровых доноров.

Статистическая обработка результатов соответствия балльной иммунологической оценки стадии фиброза у больных хроническими заболеваниями печени критериям ХГС/F3 проводилась в четырех основных направлениях: (1) подсчет количества удовлетворяющих критериям баллов для каждой группы пациентов (из расчета один признак равен одному баллу); (2) вычисление в каждой группе обследования 95% доверительного интервала (ДИ) оценки в баллах с помощью указанных критериев ХГС/F3; (3) оценка достоверности различий доверительных интервалов в разных группах по сравнению со стадией ХГС/F3 с использованием критерия Колмогорова-Смирнова; (4) определение чувствительности и специфичности метода по доле ложнопозитивных тестов в группах сопоставления и ложнегативных тестов при сравнении с контрольной группой.

Проведенный анализ показал, что по 8-9 баллам критериям Иммунотеста ХГС/F3 удовлетворяли 100% больных одноименной группы, а также 18,8% контингента из группы больных ХГВ с начальной стадией фиброзных изменений в печени (F1), то есть 3% по отношению к 142 больным, вошедшим в группы сопоставления (ложнопозитивный результат). В связи с этим при оценке Иммунотеста ХГС/F3 в 9 баллов чувствительность метода составляла 100%, а в 8 баллов – 97%, то есть была очень высокой. Это же касалось и специфичности метода, оцениваемой в 100%.

Диагностическая точность Иммунотеста ХГС/F3 подтвердилась и при анализе 95% доверительного интервала для основной группы больных, поскольку балльная оценка на 3-й стадии фиброза при ХГС по 95%ДИ достоверно превышала таковую во всех других группах сопоставления (рисунок 6). Отмечено было также выраженное расхождения критериальных признаков у больных ХГС на стадии фиброза F2 с критериями ХГС/F3. На этой стадии Иммунотест ХГС/F3 показывал минимальный интервал, также значительно отличавшийся от такового в группах сопоставления, что создавало в перспективе возможности мониторингового определения прогрессирования фиброза печени на этапе F2F3. Столь же высокое диагностическое значение приобретало резкое падение 95%ДИ при переходе стадии предцирротических изменений (F3) в цирроз печени (F4).

Рис. 6. 95% доверительные интервалы оценки в баллах разных стадий фиброза при хронических заболеваниях печени с помощью

критериев F3 у больных хроническим гепатитом С

ROC-кривые в случае применения Иммунотеста ХГС/F3 в отношении всех стадий данного заболевания подтвердили наибольшую прогностическую ценность, чувствительность и специфичность (AUROC=0,993) предложенного способа иммунодиагностики для стадии фиброза F3 при ХГС (рисунок 7) и позволили оценить его качество как отличное. На других стадиях фиброзного процесса в печени, взятых в данном случае у больных ХГС для сравнения, указанные критерии не являлись диагностически и прогностически значимыми.

Рис. 7. ROC-кривая оценки в баллах Иммунотеста ХГС/F3

на 3-й стадии фиброзапечени у больных ХГС

Таким образом, проведенный статистический анализ предлагаемого способа иммунодиагностики позволил уточнить алгоритм определения стадии F3 фиброза печени у больных ХГС: (1) верификация диагноза «хронический гепатит С»; (2) определение в крови больного 9 иммунологических критериев, включающих абсолютное и относительное число ЕКТ (CD3+/ CD56+), содержание CD4+ и CD8+ субпопуляций ЕКТ, количество CD56+ клеток, экспрессирующих CD94, NKG2D, NKp46 и CD107а рецепторы, уровень ТФР в крови; (3) определение соответствие каждого из 9 показателей у данного больного диапазону их критериальных значений; (4) оценка иммунодиагностического теста в баллах; (5) определение соответствия оценки в баллах доверительному интервалу иммунодиагностического теста (8,15 – 8,96); (6) вывод о соответствии или несоответствии иммунодиагностического теста 3-й стадии фиброза печени у больного хроническим гепатитом С.

Использование Иммунотеста ХГС/F3 для определения у больных ХГС стадии предцирротических изменений является высокоэффективным приемом неинвазивной диагностики фиброза печени и позволяет в процессе мониторинга иммунологических данных больных сформировать группу риска развития цирроза печени, что чрезвычайно важно при данном заболевании. Кроме того, данный фрагмент исследования создал возможность использования полученных нами данных для сравнения с исследованиями способов неинвазивной диагностики, рассматриваемых другими авторами, в процессе мета-анализа.

Мета-анализ неинвазивных способов определения стадий фиброза печени у больных хроническими гепатитами В и С. Целью мета-анализа в наших исследованиях послужило обобщение данных систематического обзора исследований, посвященных неинвазивным способам определения стадий фиброза печени у больных хроническими гепатитами В и С, а также сопоставительная оценка Иммунотестов ХГВ/F1 и ХГС/F3 с другими приемами неинвазивной диагностики путем выявления различий в результатах исследований.

В соответствии с обозначенной целью в процессе проведения мета-анализа использовались две базы данных, одна из которых содержала все доступные исследования в форме рандомизированных моделей, опубликованные другими авторами за 2005-2010 гг., а вторая – результаты собственных исследований, приведенных в результате статистической обработки к варианту, сопоставимому с данными других исследователей.

Предварительный отбор включал поиск данных литературы по запросам «Liver fibrosis diagnosis & chronic viral hepatitis b & c» «Liver fibrosis diagnosis & chronic viral hepatitis b & c» («диагностика фиброза печени при хронических вирусных гепатитах В и С»), «Liver fibrosis noninvasive diagnosis» («неинвазивная диагностика фиброза печени»), «Noninvasive markers of liver fibrosis» («неинвазивные маркеры фиброза печени»), «Noninvasive markers of liver fibrosis & liver biopsy» («неинвазивные маркеры фиброза печени и биопсия печени»), полученных из следующих источников информации: PubMed/MedLine, Embase, Google Scholar, Cochrane library, Фонды Центральной научной медицинской библиотеки ММА им.И.М.Сеченова (ЦНМБ), Портал межбиблиотечной информации «Сигла», Библиотечный каталог российских диссертаций, официальный сайт ФГУ ФИПС (Федеральной службы по интеллектуальной собственности, патентам и товарным знакам), сайт Европейского Патентного Бюро (European Patent Office). Поиск проводился среди работ, относящихся к предметным областям биологии, медико-биологических наук, медицины. Ссылки по всем отобранным источникам оценивались на соответствие предмету поиска, в частности, возможности использования неинвазивных методов диагностики фиброза печени при хронических гепатитах В и С.

Для детального ознакомления с отобранными источниками нами были разработаны критерии включения данных в мета-анализ. Критериями включения оригинальных исследований в метаанализ служили: (1) рандомизированный характер клинического исследования; (2) материалом для исследования служили: больные хроническим гепатитом В или С в возрасте старше 18 лет без сопутствующих инфекционных заболеваний (ВИЧ, туберкулез, др.) и иммунопатологических состояний, не получавшие последние 6 месяцев противовирусного лечения; (3) наличие сопоставления неинвазивного и инвазивного (биопсия) методов исследования печени с определением в ходе последнего стадии фиброза органа по шкале METAVIR; (4) цифровые данные, полученные неинвазивным методом, четко распределены по стадиям фиброза; (5) данные подвергнуты соответствующей статистической обработке с обязательным построением ROC-кривой и указанием AUROC.

В процессе ознакомления с источниками литературы по предмету проведенных исследований было проанализировано 1570 публикаций, из них 1464 зарубежных и 106 отечественных источников, в том числе 41 патентное  исследование. Для детального полнотекстового ознакомления было отобрано 117 источников, дальнейший анализ которых проводился в четком соответствии с критериями включения работ в мета-анализ. В результате 86 публикаций были исключены из дальнейшего анализа как несоответствующие выбранным критериям включения. В конечном итоге мета-анализ проводился на основе 31 статьи, включающих 21 проспективное исследование, выполненное как на базе одного клинического центра, так и многоцентровое, 5 масштабных ретроспективных исследований. Кроме того, были использованы данные трех обзоров литературы и двух мета-анализов.

Для неинвазивной диагностики ХГС различными авторами было применено три варианта эластографии печени, 8 вариантов сочетания неспецифических биохимических и гематологических тестов, дыхательный тест, 7 разновидностей прямых тестов индикации фиброзных и цирротических изменений в печени, было предложено три специальных индекса для прогнозирования фиброза и цирроза. Все эти методы были рассмотрены в 18 источниках широкой географии исследования, а общее число обследованных пациентов составило 11328 человек, имеющих средний возраст от 35 до 55 лет.

Спектр исследований, посвященных неинвазивной диагностике ХГВ, был значительно уже и сориентирован, в основном, на использование биохимических и гематологических тестов. В 8 литературных источниках, освещающих эту проблему, были проанализированы 9 тестов на основе неспецифических показателей, 4 варианта сочетания подобных тестов с эластографией, и только в одном случае имелись указания на использование методов прямой индикации маркеров фиброза в печени, еще в одном источнике был предложен специальный прогностический индекс. Всего в рамках рассмотренных исследований было обследовано 2120 пациентов хроническим гепатитом В со средним возрастом от 33 до 48 лет.

В 5 исследованиях данные по неинвазивной диагностике фиброза печени описывались при хронических гепатитах В и С без разграничения последних. Эти данные касались преимущественно методов визуализации – два варианта эластографии, два вида ультразвуковой доплерографии (УЗДГ), в одном случае использовался Фибротест, еще в одном случае проводилось комбинированное исследование (эластография в сочетании с Фибротестом). Эта категория исследований охватывало 5444 больных со средним возрастом от 35 до 54 лет.

Особенностью всех исследований, являлся определенный методический подход к определению соответствия между неинвазивным методом диагностики и результатами биопсии печени. Как правило, анализировались следующие группы: (1) наличие фиброза печени в целом (F1), (2) значимый фиброз печени (F2), (3) выраженный фиброз (F3), (4) цирроз печени (F4). Регистрация фиброза печени со стадии начальных фиброзных изменений в печени встречалось исключительно редко и распространялось при ХГС только на эластографию печени, а при ХГВ на воспроизведение Фибротеста/Актитеста на фоне низких значений AUROC. К сожалению, современные неинвазивные методы диагностики фиброза печени не позволяют четко регистрировать дебют фиброзного процесса, что было бы очень важно с точки зрения адекватной терапии указанных заболеваний. Значимый фиброз печени (F2) охарактеризован на уровне неинвазивных методов диагностики достаточно полно и рассмотрен практически во всех источниках литературы. Несколько меньше внимания исследователи уделяли прогностической значимости на уровне AUROC при выраженном фиброзе (F3) и циррозе печени. При этом, начиная со стадии F2, соотношение чувствительности и специфичности методов проявлялось примерно на одном уровне. Большинство современных методов неинвазивной диагностики фиброза печени при хронических гепатитах В и С было нацелено на индикацию фиброзных изменений печени как таковых без учета их степени выраженности. В этом неинвазивная диагностика в значительной мере уступает по своей диагностической точности «золотому стандарту» регистрации степени фиброзного и цирротического процесса – биопсии печени.

Мета-анализ прогностического значения неинвазивных методов диагностики ХГС показал, что наиболее эффективным диагностическим приемом при определении степени фиброза печени являются транзиентная эластография и другие методы визуализации, диагностическая значимость которых нарастает по мере развития фиброзных изменений в печени от стадии F1 к циррозу печени. Диагностическое значение других распространенных приемов неинвазивной диагностики на основе прямых и непрямых биохимических и гематологических маркеров фиброза, по данным большинства исследователей, имеют при ХГС достаточную степень информативности только на стадиях значимого фиброза печени (F2) и, особенно, при циррозе (рисунок 8а).

Рис. 8. Форест-график AUROC методов неинвазивеной диагностики хронических гепатитов С (а) и В (б)

При ХГВ диагностическая значимость широко используемых неинвазивных методов была значительно ниже и проявлялась, как правило, только на поздних этапах фиброзного процесса (рисунок 8б). С этой точки зрения при более оправданным при данном заболевании было применение комбинации эластографии печени с другими тестами (Фибротестом, Фктитестом, APRI и др.), что продемонстрировано авторами в виде высоких значений AUROC и относительно узким диапазоном 95%ДИ уже начиная со стадии фиброза F2.

Таким образом, мета-анализ, проведенный на большом массиве научных данных, позволил установить наибольшую диагностическую эффективность методов, основанных на визуализации результатов исследования печени и их комбинации с другими тестами. Тем не менее, как уже подчеркивалось, диагностическая точность неинвазивных методов диагностики весьма относительна, поскольку позволяет зарегистрировать только значимый фиброз печени без четкого разграничения его отдельных стадий. Только в трех публикациях нам удалось найти сведения о соответствии данных биопсии по стадиям фиброза печени неинвазивным методам диагностики. Именно эти данные были сопоставимы с результатами наших наблюдений и, в связи с этим, анализировались отдельно (рисунок 9).

Из 31 публикации, отобранной для детального анализа в виде полного текста, только в двух отечественных работах (Ч.С.Павлов и др., 2007; О.Н.Коновалова, 2009) и одной зарубежной публикации (Т.Poynard et al., 2007) была сделана попытка провести сопоставление неинвазивных методов диагностики фиброза печени с конкретными стадиями фиброза по шкале METAVIR от F1 до F4. Поскольку именно такой подход был использован нами в данной работе, мы сочли возможным провести сопоставление наших данных по апробации Иммунотестов ХГВ/F1 и ХГС/F3 с результатами исследований указанных авторов с использованием приемов мета-анализа.

Довольно весомым и диагностически точным представляется исследование, проведенное Ч.С.Павловым и др., 2008, по оценке транзиентной эластографии печени при ХГС. Уже на стадии фиброза F1 значения AUROC были довольно высоки (0,90), хотя и имелся более значительный, чем на остальных стадиях диапазон 95%ДИ. На 2-й и 3-й стадиях фиброза печени диагностическая точность метода в значениях AUROC была примерно одинаковой и несколько выше, чем на стадии F1. Наиболее высокая диагностическая точность эластографии достигалась на стадии цирроза печени (F4), что в полной мере соответствует клиническому опыту применения этого метода. Данные О.Н.Коноваловой, 2009, по использованию этого же метода при ХГС были менее точными, поскольку характеризовались очень большим интервалом 95%ДИ. Следующее довольно объемное по массиву данных исследование было выполнено Т.Poynard et al., 2007, и посвящено диагностическому значению Фибротеста. По величине и 95% ДИ AUROC оно было примерно одинаковым на разных стадиях фиброза печени, а средние значения показателя колебались в пределах 0,64-0,66, то есть были относительно невысоки. Полученные нами данные по Иммунотесту ХГС/F3 принципиально отличались от характера оценки других методов. На стадиях F1, F2 и F4 значения AUROC были чрезвычайно низки, но на стадии F3 уровень соотношения чувствительности и специфичности метода (AUROC=0,993) были значительно выше, чем при других методах (рисунок 9а). Проведенное нами сравнение по величине AUROC Иммунотеста ХГС/F3 с различными индексами на стадии F3 также показало преимущество тестируемого параметра.

Таким образом, Иммунотест ХГС/F3 имеет относительно узкую область применения – для диагностики стадии предцирротических изменений F3 при ХГС, но именно благодаря этому обстоятельству предлагаемый нами способ обладает чувствительностью и специфичностью около 100% и может использоваться с прогностической целью – для отнесения больных ХГС в группу риска по развитию цирроза печени.

У больных ХГВ аналогичное сопоставление удалось провести лишь с использованием двух источников данных, принадлежащих другим авторам – О.Н.Коноваловой, 2009 и Т.Poynard et al., 2007 (рисунок 9б). Кроме того, нами по собственным данным были рассчитаны индексы – AAR, Forns, FIB-4, APRI, HLT-C. Иммунотест ХГВ/F1 продемонтрировал уникальную высокую диагностическую точность на стадии начала фиброзных изменений в печени (F1) при ХГВ и по средним значениям AUROC значительно опережал другие методы. На стадиях F2-F3 величины и 95%ДИ AUROC снижались ниже 0,8 и практически утрачивали свое диагностическое значение при циррозе печени.

Рис. 9. Форест-график AUROC с учетом собственных данных

при ХГС (а) и ХГВ (б)

Следовательно, мета-анализа подтвердил выраженную конкурентоспособность Иммунотеста ХГВ/F1 по сравнению с наиболее часто применяемыми методами неинвазивной диагностики фиброза печени при ХГВ. Рекомендуемый набор критериальных признаков и диапазонов их значений, оцененный в баллах, позволяет с высокой диагностической точностью установить начало фиброзных изменений в печени, что является актуальной диагностической задачей при данном заболевании.

Выводы

1. Методический подход к созданию Иммунотестов для неинвазивной диагностики определенных стадий фиброза печени при хронических гепатитах В и С включает определение ключевой роли одного из компонентов иммунной системы в патогенезе отдельных стадий фиброза печени, определение критериальных показателей и диапазонов их значений для ключевого компонента иммунной системы, определение возможных дополнительных критериальных признаков из числа неиммунологических параметров заболеваний, разработку Иммунотеста в виде способа оценки совокупности критериальных признаков, системный статистический анализ диагностической точности, чувствительности и специфичности способа в сопоставлении с другими методами неинвазивной диагностики фиброза печени.

2. Роль ключевого компонента иммунной системы в развитии дебюта фиброзных изменений в печени при хроническом гепатите В и стадии предцирротических изменений в печени при хроническом гепатите С выполняют CD56+ лимфоциты (ЕК и ЕКТ).

3. В состав Иммунотеста ХГВ/F1 для диагностики дебюта фиброза печени при хроническом гепатите В вошли относительное число моноцитов, CD3+/CD8+ Т-клеток, CD3+/СD56+/CD4+ ЕКТ, CD3+/СD56+/CD8+ ЕКТ, CD56+/NKp46+ ЕК, уровень ТФР в крови.

4. В состав Иммунотеста ХГС/F3 для диагностики предцирротических изменений в печени при хроническом гепатите С вошли относительное и абсолютное число CD3+/CD56+ Т-клеток (ЕКТ), CD3+/СD56+/CD4+ ЕКТ, CD3+/СD56+/CD8+ ЕКТ, CD56+/CD94+ клеток (ЕК/ЕКТ), CD56+/ NKG2D+ клеток (ЕК/ЕКТ), CD56+/NKp46+ ЕК, CD56+/ CD107a+ клеток (ЕК/ЕКТ), уровень ТФР в крови.

5. Иммунотест ХГВ/F1 (1 критериальный признак = 1 балл) обладает высокой диагностической точностью при 95% доверительном интервале 5,46 – 6,04, чувствительностью 86% у женщин и около 100% у мужчин, специфичностью около 100% при высоком уровне взаимосвязи чувствительности и специфичности (AUROC) 0,978.

6. Иммунотест ХГC/F3 (1 критериальный признак = 1 балл) обладает высокой диагностической точностью при 95% доверительном интервале 8,15 – 8,96, чувствительностью 97-100%, специфичностью около 100% при высоком уровне взаимосвязи чувствительности и специфичности (AUROC) 0,993.

7. Иммунотесты ХГВ/F1 и ХГC/F3 предназначены для неинвазивного мониторинга больных хроническими гепатитами В и С и, по данным мета-анализа, обладают высокой конкурентоспособностью, диагностической и прогностической значимостью по отношению к другим методам неинвазивной диагностики фиброза печени при данных заболеваниях. 

Список научных работ, опубликованных по теме диссертации

  1. И.П.Балмасова, М.И.Панина, Е.С.Ефратова. Аминорегуляторные взаимосвязи лимфоцитов различных категорий // International  Journal of Immunorehabilitation. – 2000. – Vol. 2. – № 2. – Р. 94.
  1. I.P.Balmasova, M.I.Panina, E.S. Efratova. Amine-regulatory interaction of various categories of lymphocytes // International  Journal of Immunorehabilitation. – 2000. – Vol.2. – №3. – Р.129.
  1. М.В.Калышенко, Е.С.Ефратова, О.В.Лавров. Иммунологические особенности ряда вирусных инфекций у больных с наркотической зависимостью // International  Journal of Immunorehabilitation. – 2001. – Vol.3. – №1. – Р. 86.
  1. М.В.Калышенко, И.П.Балмасова, Е.С.Ефратова. Влияние наркотической зависимости на иммунологическую перестройку организма при некоторых вирусных инфекциях // Аллергология и иммунология. – 2001. –Т.2. – N 2. - С.58.
  1. Е.В.Кабанова, Е.С.Малова, И.П.Балмасова, Р.И. Сепиашвили. Система больших гранулярных лимфоцитов при носительстве вирусов гепатитов В и С //  Аллергология и иммунология. – 2005. – Т.6. – № 4. – С. 472-479.
  1. Т.А.Славянская, Е.В.Кабанова, Е.С.Малова, Е.В.Плескановская. Иммунодиагностика носительства вирусов гепатитов В и С в нагрузочных тестах с биогенными аминами // Научные т руды I Cъезда физиологов СНГ / Сочи. – 2005. – Т. 2. – С. 106.
  1. И.В.Нестерова, И.П.Балмасова, В.А.Козлов, Е.С. Малова, Р.И. Сепиашвили. Синдром хронической усталости и иммунной дисфункции у лиц с рецидивирующими инфекциями: клинико-иммунологические черты и особенности серотонинергической регуляции // Цитокины и воспаление. – 2006. Т. 5. - № 2.  -С. 3-14.
  1. Р.И.Сепиашвили, И.П. Балмасова, Е.В.Кабанова, Е.С.Малова, Т.А. Славянская. Вирус гепатита В: биология, иммунопатогенез, система ЕК/ЕКТ при вирусной персистенции // ЖМЭИ. - 2006. - № 6. – С. 76-83.
  1. Р.И.Сепиашвили, И.П. Балмасова, Е.В.Кабанова, Е.С.Малова, Е.В. Плескановская. Вирус гепатита С: биология, иммунопатогенез, система ЕК/ЕКТ при вирусной персистенции // ЖМЭИ. - 2006. - № 7. – С. 109-116.
  1. I.P.Balmasova, N.D.Yushchuk, O.O.Znoiko, E.V. Shmeleva, E.S. Malova, M.N. Zaitseva, N.I. Dunda, O.F.Eremina, S.L. Maksimov, Ya.R. Sepiashvili. NK/NKT Ratio as a Prognostic Marker of Chronic Hepatitis C // New Horizons in Allergy, Asthma & Immunology. Editor R.Sepiashvili. Medimond International Рroceedings. – 2009. – Р. 183-188.
  1. I.V.Nesterova, I.P.Balmasova, E.S.Malova. Peculiarities of disorders of antiviral immunity in chronic fatigue syndrome in association with viral infections // Abstracts of International Symposium «Interaction of Neural and Immune Systems in Health and Disease». – 2007. – Sankt-Petersburg. – P. 13.
  1. И.П. Балмасова, Н.Д. Ющук, О.О.Знойко, Е.В. Шмелева, Н.И.Дунда, О.Ф.Еремина, С.Л.Максимов, М.В.Зайцева, Е.С. Малова, Я.Р.Сепиашвили. Соотношение субпопуляций ЕК/ЕКТ как прогностический критерий хрони-ческого гепатита С // Аллергология и иммунология. – 2009. – Т. 10. – № 3. – С. 340-343.
  1. И.П.Балмасова, Е.С.Малова, Е.В.Шмелева, О.Ф. Еремина, Н.Д. Ющук. Состояние рецепторного аппарата естественных киллеров в начале фиброзных изменений в печени у больных хроническим вирусным гепатитом В // Российский аллергологический журнал. – 2010. – № 1, вып. 1. – С. 18-19.
  1. Е.С.Малова, И.П.Балмасова, Е.В.Шмелева, Н.И. Дунда, М.Н.Зайцева, Н.Д.Ющук. Естественная цитотоксичность на разных стадиях фиброза печени  у больных хроническим вирусным гепатитом С // Российский аллергологический журнал. – 2010. - № 1, вып. 1. – С. 114-115.
  1. Е.С.Малова, И.П.Балмасова, Е.В.Шмелева, О.Ф.Еремина, Н.Д.Ющук, В.Г.Морозов. Функциональное состояние CD56+ клеток при фиброзе печени у больных хроническим вирусным гепатитом В // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. Приложение № 35. Материалы XV Российской конференции «Гепатология сегодня». 15-17 марта 2010 г. Москва. С. 39.
  1. Е.С.Малова, Е.В.Шмелева, И.П.Балмасова, Н.Д. Ющук, В.Г.Морозов. Естественная цитотоксичность при фиброзе печени у больных хроническим вирусным гепатитом С // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. Приложение № 35. Материалы XV Российской конференции «Гепатология сегодня». 15-17 марта 2010 г. Москва. С. 40.
  1. И.П.Балмасова, Е.С.Малова, Е.В.Шмелева, О.Ф. Еремина. Иммунодиагностика начала фиброзных изменений в печени при хроническом вирусном гепатите В // Сборник материалов XVII Российского национального конгресса «Человек и лекарство», Москва, 12-16 апреля 2010 г. – С. 40.
  2. Е.В.Шмелева, Е.С.Малова, И.П.Балмасова, Н.И. Дунда, М.Н.Зайцева. Характеристика рецепторного аппарата естественных киллеров при хроническом вирусном гепатите С // Сборник материалов XVII Российско- го национального конгресса «Человек и лекарство», Москва, 12-16 апреля 2010 г. – С. 306.
  1. И.П.Балмасова, Н.Д. Ющук, Е.С.Малова, О.Ф. Еремина, М.Н.Зайцева, Е.В.Шмелева, Н.И. Дунда, М.М.Гультяев. Иммунологические признаки дебюта фиброзных изменений в печени у больных хроническим гепатитом В // Международный журнал по иммуно-реабилитации. – 2010. – Т. 12. – № 2. – С. 104.
  1. Е.С.Малова, Е.В.Шмелева, И.П.Балмасова, Н.Д. Ющук. ЕКТ на разных стадиях фиброза печени у больных хроническим гепатитом С // Международный журнал по иммуно-реабилитации. – 2010. – Т. 12. – № 2. – С. 127.
  1. E.S.Malova, E.V.Shmeleva, I.P.Balmasova, N.D. Yushchuk, O.F. Eremina, O.O.Znoiko, M.N.Zaitseva, N.I.Dunda, M.M.Gultyaev. Immunologic signs of fibrous changes debut in the liver of patients with chronic hepatitis B // Advances in allergy, asthma & immunology: from basic science to clinical management. Ed. Revas Sepiashvili. MEDIMOND International Proceedings. – 2010. – P. 115-119.
  1. И.П.Балмасова, Е.В.Шмелева, Е.С.Малова, О.Ф.Еремина, М.Н. Зайцева, Н.И.Дунда, М.М.Гультяев. Естественные киллеры во взаимодействиях врожденного и приобретенного иммунитета // Тезисы докладов ХХI съезда физио-логического общества им. И.П.Павлова. Москва-Калуга. 19-25 сентября 2010 г. – С. 48.
  1. I.P.Balmasova, E.S.Malova, N.D.Yushchuk, E.V. Shmeleva. Expression of C-lectin-type receptors with natural killers in prognosis of cirrhosis in chronic hepatitis C patients // International Immunology. – 2010. – Vol. 22, N 1. 14th International Congress of Immunology, Kobe, Japan. Day 2. – PP-025-115.
  1. И.П.Балмасова, Е.С.Малова, Е.В.Шмелева, Н.И. Дунда, М.Н.Зайцева, О.Ф.Еремина. Трансформирующий фактор роста и цитотоксичность CD56+ клеток при фиброзе и циррозе печени у больных хроническими вирусными гепатитами В и С // Российский аллергологический журнал. – 2010. – № 5. – Вып. 1. – С. 21-22.
  1. Е.С.Малова, Н.Д.Ющук, И.П.Балмасова, Е.В.Шмелева. CD56+ лимфоциты и иммунопатогенез хронического гепатита С // Иммунология. – 2010. – Т. . – № 6. – С.





© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.