WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

 

На правах рукописи

ГУРЬЕВ АРТЕМ МИХАЙЛОВИЧ

Химико-фармакологическое исследование полисахаридов высших растений и Перспективы их использования в терапии злокачественных новообразований

14.04.02 фармацевтическая химия, фармакогнозия

14.03.06 фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора фармацевтических наук

Пятигорск 2011

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Сибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Научные консультанты:

доктор химических наук, профессор

Юсубов Мехман Сулейман оглы

доктор фармацевтических наук

Белоусов Михаил Валерьевич

Официальные оппоненты:

доктор фармацевтических наук, профессор

Коновалов Дмитрий Алексеевич

доктор медицинских наук, профессор

Болиева Лаура Зелимхановна

доктор фармацевтических наук, профессор

Куркин Владимир Александрович

Ведущая организация:

ГБОУ ВПО Ярославская ГМА Минздравсоцразвития России

Защита состоится «___» _________ 2011 г. в ___ часов на заседании диссертационного совета Д 208.069.01 в ГБОУ ВПО Пятигорская ГФА Минздравсоцразвития России (357532, Ставропольский край, г. Пятигорск, пр. Калинина, 11)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО Пятигорская ГФА Минздравсоцразвития России (357532, Ставропольский край, г. Пятигорск, пр. Калинина, 11).

Автореферат разослан «____» ____________ 2011 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета                                                Е. В. Компанцева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Онкологические заболевания занимают одно из первых мест в мире по уровню смертности, и одним из немногих способов их эффективного лечения является цитостатическая химиотерапия. Общеизвестно, что цитостатические препараты не оказывают избирательного действия на опухоль и обладают токсическим влиянием на активно обновляющиеся клетки организма. Следствием этого является целый ряд тяжелых побочных эффектов и осложнений, возникающих при применении цитостатиков. В связи с этим поиск и создание средств, повышающих эффективность и снижающих токсические эффекты цитостатической терапии, является актуальной проблемой современной медицинской и фармацевтической науки.

Одним из наиболее перспективных направлений в данной области является поиск агентов, препятствующих развитию иммунологической резистентности опухоли, которая формируется в результате опухолепротективного влияния макрофагов и дендритных клеток, инфильтрующих опухолевую ткань и, в силу своих регуляторных способностей, обуславливающих локальную иммуносупрессию и жизнеобеспечение опухолевых клеток (ангиогенез, пролиферацию, ремоделирование тканей и т.д.) [Shurin M.R. et al. 2001; Wyckoff J.B. et al. 2007]. Известно, что макрофаги и дендритные клетки способны изменять свое функциональное состояние под влиянием веществ микробного происхождения – липополисахариды, пептидогликаны, тейхоевые кислоты и т. д. Полисахариды высших растений являются структурными аналогами этих веществ и представляют значительный интерес для онкофармакологии, т.к. они, в отличие от препаратов бактериального происхождения, обладают низкой токсичностью, не вызывают пирогенной реакции, не обладают сенсибилизирующими свойствами. Исследования последних лет свидетельствуют о том, что растительные полисахариды являются перспективными кандидатами на роль средств комплексной терапии злокачественных новообразований [Chauhan D. et al. 2005; Xie J.T. et al. 2006; Lavi I. et al. 2009; Miao Y. et al. 2009; Hsu J.W. et al. 2009; Mao F. et al. 2010]. Вместе с тем, полисахариды, в силу особенностей химической структуры, являются весьма сложной для изучения группой биологически активных веществ. Существующие в настоящее время общепринятые в фармацевтической практике методики не позволяют селективно выделять индивидуальные полисахариды из растительного сырья, определять их химическую структуру и проводить стандартизацию исследуемых образцов, что значительно усложняет проведение адекватной оценки их фармакологической активности и затрудняет интерпретацию полученных данных. В связи с этим процесс поиска и разработки новых лекарственных средств на основе полисахаридов, в настоящее время, характеризуется низкой эффективностью ввиду отсутствия единой методологической схемы, обосновывающей оптимальные пути реализации каждого этапа таких исследований.

Цель работы. На основании химико-фармакологического исследования полисахаридов высших растений разработать рациональные методологические подходы к поиску, оценке эффективности и созданию новых лекарственных средств комплексной терапии злокачественных новообразований.

Задачи исследования:

  1. Выбрать растения, перспективные в качестве источников биологически активных полисахаридов, выделить и охарактеризовать полисахаридные комплексы из них.
  2. Провести скрининговое исследование влияния полученных полисахаридных комплексов на эффективность химиотерапии злокачественных новообразований и выбрать образцы, обладающие наибольшей биологической активностью для дальнейшего изучения.
  3. Провести углубленное изучение наиболее активных образцов в терапии злокачественных новообразований (выбор оптимальной дозы, эксперименты на разных видах лабораторных животных и различных моделях экспериментальных опухолей и т.д.).
  4. Выделить индивидуальные компоненты наиболее активных полисахаридных комплексов.
  5. Установить структуру веществ, ответственных за биологическую активность.
  6. Разработать методы стандартизации биологически активной субстанции и растительного сырья по содержанию действующих веществ.
  7. Исследовать механизмы антибластомного действия полисахаридов.
  8. Обосновать рациональные методологические подходы к поиску, оценке эффективности и разработке новых лекарственных средств терапии онкологических заболеваний на основе полисахаридов высших растений.

Научная значимость и новизна результатов: На основании полученных экспериментальных данных разработаны рациональные методологические подходы к поиску, оценке эффективности и разработке новых лекарственных средств комплексной терапии злокачественных новообразований на основе полисахаридов высших растений. Впервые предложена последовательная методологическая схема, обосновывающая оптимальные пути реализации каждого этапа исследований.

Впервые экспериментально обоснована и предложена универсальная методика извлечения полисахаридов из растительного сырья, позволяющая выделять максимальный спектр водорастворимых полисахаридов с минимальным количеством примесей.

Впервые охарактеризованы полисахаридные комплексы из сырья 10 видов высших растений по количественному соотношению и молекулярной массе входящих в их состав компонентов и содержанию уроновых кислот. Впервые показано, что:

  • полисахаридный комплекс из корневищ с корнями левзеи сафлоровидной содержит 3 основных компонента с молекулярной массой 700 кДа (12,8%), 250 кДа (80,9%) и 30 кДа (6,3%) (общее содержание уроновых кислот 38,91±0,22%);
  • полисахаридный комплекс из побегов багульника болотного также состоит из трех основных компонентов с молекулярной массой 500 кДа (8,66%), 360 кДа (73,23%) и 20 кДа (18,10%), с общим содержанием уроновых кислот 95,32±0,23%;
  • полисахаридный комплекс из корневищ с корнями родиолы розовой содержит 2 основных компонента с молекулярной массой 750 кДа (31,65%) и 380 кДа (68,45%) с содержанием уроновых кислот 10,25±0,11%;
  • полисахаридный комплекс из корневищ аира болотного состоит из 5 компонентов 720 кДа (8,82%), 460 кДа (8,96%), 370 кДа (46,92%), 290 кДа (4,76%), 40 кДа (30,53%) и содержит 24,36±0,04% уроновых кислот.

Впервые показано, что в корнях одуванчика, кроме инулина и инулиноподобных полисахаридов, в большом количестве (около 2,5%) содержатся кислые полисахариды с молекулярной массой 310 и 700 кДа.

Впервые детально изучен химический состав полисахаридного комплекса из корневищ аира болотного, показано, что в его составе содержится 3 нейтральных и 2 кислых полисахарида и установлена их химическая структура: α-(1,4)-D-глюкан с молекулярной массой 40 кДа; α-D-галакто-(1,4)-α-D-глюкан с разветвлениями, состоящими из остатков α-L-рамнопиранозы и молекулярной массой 280 кДа; (1,3)-D-ксилопиранозил-α(1,4)-D-галакто-α(1,4)-D-глюкан с молекулярной массой 440 кДа; рамно-α(1,4)-D-галактопиранозилуронан с разветвлениями из остатков нейтральных сахаров (ксилозы, галактозы и глюкозы) и молекулярной массой 370 кДа и сильноразветвленный рамногалактуронан I с молекулярной массой 740 кДа.

Экспериментально обоснованы и оптимизированы методические подходы к стандартизации полисахаридсодержащего растительного сырья по содержанию биологически активных полисахаридов.

Впервые предложено проводить стандартизацию корневищ аира болотного по содержанию галактуронана и разработана методика его количественного определения в растительном сырье и в субстанции, позволяющая селективно определять галактуронан в присутствии нейтральных полисахаридов.

Проведено исследование влияния полисахаридных комплексов из сырья 10 видов высших растений на развитие экспериментальной опухоли и её цитостатическое лечение. Впервые выявлено, что:

  • полисахаридные комплексы из цветков липы сердцевидной, побегов багульника болотного, корневищ аира болотного и листьев мать-и-мачехи повышают противоопухолевую и антиметастатическую активность циклофосфана в отношении карциномы легких Льюис у мышей;
  • полисахариды аира оказывают самостоятельное противоопухолевое действие, а полисахариды липы, багульника и солодки проявляют самостоятельный антиметастатический эффект;
  • полисахариды левзеи, одуванчика и подорожника потенцируют противоопухолевую и не влияют на антиметастатическую активность циклофосфана.

Впервые проведено углублённое фармакологическое изучение полисахаридов аира в комплексной терапии экспериментальных опухолей, показано, что:

  • полисахариды аира болотного повышают эффективность цитостатиков, отличающихся по механизму действия (циклофосфан и 5-фторурацил), в отношении различных моделей опухолевого роста (меланома В-16, карциносаркома 256 Уокера, карцинома легких Льюис) и на разных видах лабораторных животных (мыши и крысы).
  • рамно-α(1,4)-D-галактопиранозилуронан с молекулярной массой 370 кДа и содержанием уроновых кислот 84% потенцирует противоопухолевую и антиметастатическую активность циклофосфана;
  • рамногалактуронан I с молекулярной массой 740 кДа и содержанием уроновых кислот 32% потенцирует антиметастатическую активность циклофосфана в отношении частоты метастазирования, количества и площади метастазов;
  • галактоглюканы с молекулярной массой 280 кДа и 440 кДа также способны повышать антиметастатическую активность циклофосфана в отношении частоты метастазирования опухоли и площади метастазов.
  • антибластомная активность полисахаридов аира болотного обусловлена наличием в молекуле полисахарида чередующихся линейных участков α-1,4-связанных остатков D-галактуроновой кислоты и участков, состоящих из α-1,2-связанных остатков D-галактуроновой кислоты и остатков рамнозы с боковыми цепями из D-галактозы (соотношение галактуроновой кислоты и нейтральных сахаров в молекуле полисахарида 1:5).

На примере полисахаридов из корневищ аира болотного, изучены иммунологические механизмы антибластомного действия полисахаридов высших растений. Впервые установлено, что:

  • полисахариды высших растений стимулируют активность опухоле-специфических лимфоидных клеток и созревание Т- и В-лимфоцитов, в условиях иммуносупрессии, вызванной опухолевым ростом и применением цитостатиков;
  • полисахариды аира болотного вызывают классическую активацию макрофагов и стимулируют продукцию ими провоспалительных цитокинов IL-12 и TNFα;
  • одним из механизмов антибластомного действия полисахаридов высших растений является стимулирование Th1-типа и подавление Th2-типа иммунологического ответа.

Практическая значимость работы. На основании химико-фармакологического изучения полисахаридов из 10 видов лекарственных растений разработаны рациональные методологические подходы к поиску, оценке эффективности и созданию новых лекарственных средств повышающих эффективность химиотерапии злокачественных новообразований. Впервые предложена последовательная методологическая схема реализации каждого этапа исследований.

Данные фармакологического исследования свидетельствуют, что цветки липы сердцевидной, побеги багульника болотного, корневища аира болотного и листья мать-и-мачехи являются перспективными источниками полисахаридов, повышающих эффективность противораковой терапии. Разработка и внедрение в медицинскую практику новых лекарственных препаратов и биологически активных добавок на основе исследованных полисахаридов позволит расширить ассортимент средств комплексной терапии онкологических заболеваний.

Исследование иммунотропной активности образцов позволило выявить факт снижения продукции иммуноглобулинов класса E и G1 под влиянием полисахаридов аира, мать-и-мачехи и календулы, что дает основания для их дальнейшего исследования с целью разработки на их основе новых лекарственных средств, предназначенных для терапии аллергических заболеваний.

С использованием предложенной методологической схемы поиска и разработки новых лекарственных средств для комплексной терапии злокачественных новообразований, разработан новый лекарственный препарат Полистан на основе полисахаридов аира: проведено изучение специфической фармакологической активности, общетоксических свойств и возможного мутагенного действия биологически активной субстанции.

На основе химико-фармакологических и фармакогностических исследований разработана методика извлечения полисахаридов из растительного сырья. На основании полученных данных разработана лабораторная технология и лабораторный регламент биологически активной субстанции полисахаридов аира.

На основании фитохимического анализа разработан проект Фармакопейной статьи предприятия «Аира болотного корневища», который является основой нормативной документации, регламентирующей стандартизацию растительного сырья для производства препарата на основе полисахаридов аира болотного.

Результаты фитохимических и фармакологических исследований позволили обосновать, в соответствии с современными требованиями, аналитические подходы в решении проблемы стандартизации полисахаридсодержащего лекарственного растительного сырья и лекарственных препаратов на его основе. Разработаны валидированные методики количественного определения полисахаридов растительном сырье и субстанции. Унификация и внедрение разработанной методики в практику контрольно-аналитических лабораторий позволит расширить арсенал методов стандартизации полисахаридсодержащего растительного сырья.

На основные практически значимые результаты диссертационной работы получено 8 патентов РФ: Патент №2308285, №2311918, №2329821, №2337700, №2337699, №2379047, №2378004, №2397774.

Материалы внедрения: На основе материалов Патента № 2308285 от 14.12.2005 г. «Средство, на основе полисахаридов аира болотного, повышающее противоопухолевую и противометастатическую активность цитостатических препаратов» компанией «Инноком» (г. Томск) ведется разработка нового лекарственного препарата Полистан, предназначенного для комплексной терапии злокачественных новообразований. Разработанные в рамках требований Департамента государственного регулирования обращения лекарственных средств Минздравсоцразвития России материалы (лабораторный регламент «Субстанция Полистан», проект Фармакопейной статьи предприятия «Аира болотного корневища» и отчеты по изучению специфической фармакологической активности, острой и хронической токсичности, возможных мутагенных свойств нового лекарственного препарата) используются для составления регистрационного досье (акты внедрения от 17.05.2011 г.).

Материалы Патентов №2397774 от 17.06.2009 г. «Средство, снижающее гематотоксичность цитостатических препаратов» и №2329821 от 14.03.2007 г. «Средство, обладающее иммуномодулирующей активностью» используются компанией «БиоСистемы» (г.Томск) для разработки биологически активной добавки, обладающей иммуномодулирующим эффектом и предназначенной для профилактики побочных эффектов химиотерапии (акт внедрения от 20.05.2011 г.)

Разработанная методика количественного определения кислых полисахаридов в растительном сырье, включенная в проект ФСП «Аира болотного корневища», апробирована в контрольно-аналитической лаборатории Центра по сертификации и контролю качества лекарственных средств Томской области (акт апробации от 05.05.2010 г.).

Результаты диссертационной работы включены в монографию Зуевой Е.П.. Лопатиной К.А. Разиной Т.Г., Гурьева А.М. «Полисахариды в онкологии» и в учебные пособия «Методы количественного определения поли- и олигосахаридов», «Роль поляризации антигенпрезентирующих клеток в механизмах развития иммунологической толерантности опухолей», «Разработка новых противоопухолевых лекарственных средств на основе природных БАВ», «Применение аира болотного в официнальной и народной медицине», которые внедрены в образовательный процесс Самарского государственного медицинского университета, Сибирского государственного медицинского университета и Новосибирского государственного медицинского университета (акты внедрения от 31.05.2011 г., 30.05.2011 г., 26.05.2011 г. и 24.09.2004 г.).

На защиту выносится: Научно-методическое обоснование использования растительных полисахаридов в качестве средств комплексной терапии злокачественных новообразований в т.ч.:

  • результаты изучения влияния полисахаридов из 10 видов лекарственных растений на развитие карциномы легких Льюис и эффективность лечения циклофосфаном;
  • результаты изучения химической структуры полисахаридов из корневищ аира болотного;
  • результаты изучения влияния полисахаридов из корневищ аира болотного на эффективность циклофосфана и 5-фторурацила, на различных моделях опухолевого роста и на разных видах лабораторных животных;
  • обоснование методических подходов к разработке методов стандартизации растительного сырья и проекта Фармакопейной статьи предприятия «Аира болотного корневища»;
  • результаты изучения механизмов антибластомного действия полисахаридов из корневищ аира болотного.

Апробация работы. Материалы диссертации апробированы на V конгрессе молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (Томск, 2004); Российской научно-практической конференции «Современное состояние и перспективы развития экспериментальной и клинической онкологии» (Томск, 2004); II международной конференции по природным и физиологически активным веществам «Natural Products and Phisiologically Active Substances» ICNPAS-2004 (Новосибирск, 2004); Российско-китайской Международной конференции по фармакологии (Китай, Харбин, 2005); конференции молодых ученых НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической фармакологии» (Томск, 2005);. IV всероссийской научной конференции «Химия и технология растительных веществ» (Сыктывкар, 2006); 43-й Республиканской научной конференции ”Создание новых лекарственных препаратов” (Томск, 2007); II международной конференции "Natural Products: Chemistry, Technology & Medicinal Perspectives" (Алматы, 2007), конференции молодых ученых «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины» (Санкт-Петербург, 2010); XVIII международной конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии» (Украина, Крым, 2010); I всероссийской молодежной конференции «Фундаментальные и прикладные аспекты современной биологии» (Томск, 2010); XIV всероссийской медико-биологической конференции с международным участием. (Санкт-Петербург, 2011); юбилейной научно-практической конференции молодых ученых «Медицина XXI века». (Новокузнецк, 2011), XII Российского конгресса молодых ученых с международным участием «Науки о человеке» (Томск, 2011), XIX международной конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии» (Украина, Крым, 2011).

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Работа выполнена в соответствии с планом научных исследований кафедры фармации ФПК и ППС и Лаборатории инновационных фармацевтических технологий ЦНИЛ Сибирского государственного медицинского университета и в рамках комплексной целевой программы СО АМН РФ «Здоровье человека в Сибири» (№ Гос.регистрации 01.9.2002479).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 55 научных работ, отражающих основное содержание диссертации, из них 25 в журналах, рекомендуемых ВАК, 1 монография и 8 патентов на изобретения.

Экспериментальные исследования по теме диссертации выполнялись в Лаборатории инновационных фармацевтических технологий совместно с кафедрами химии, фармации, фармакогнозии с курсами ботаники и экологии, фармацевтической технологии Сибирского государственного медицинского университета, а также в сотрудничестве с коллективами других научных организаций: НИИ фармакологии СО РАМН г. Томск (лаборатория онкофармакологии, лаборатория экспериментального биомоделирования, лаборатория лекарственной токсикологии); НИИ органической химии СО РАН г. Новосибирск (лаборатория терпеноидов). НИИ физиологии УроРАН г.Сыктывкар.

Исследования по теме диссертации выполнены при поддержке грантов Российского фонда фундаментальных исследований (Грант   06-04-96968-офи), Фонда содействия развитию малых форм предпринимательства в научно-технической сфере (ГК № 4213р/6607 от 26.06.2006 г.), Администрации Томской области в сфере научно-исследовательских и инновационных разработок (ГК № 101 от 20.09. 2005 г. и № 255 от 23.06. 2008 г.), Федеральной целевой программы "Научные и научно-педагогические кадры инновационной России" на 2009-2013 годы (ГК № 02.740.11.5211 от 10.07.2010 г.).

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 293 страницах машинописного текста и состоит из введения, восьми глав, выводов, списка литературы и приложений. Работа иллюстрирована 57 таблицами и 61 рисунком. Библиографический указатель включает 448 источников литературы, из них 382 зарубежных.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Для исследования были использованы образцы растительного сырья десяти видов лекарственных растений. Характеристика исследуемых образцов представлена в таблице 1.

Таблица 1 – Характеристика исследуемых образцов лекарственного растительного сырья

Наименование растительного сырья

Латинское название растения

Стандартизовано по нормативной документации

корневища с корнями левзеи

Rhaponticum carthamoides Wild.

ФС 42-2707-90

корни одуванчика

Taraxacum officinale Wed.

ГФ XI, в.2, статья 69.

листья подорожника большого

Plantago major L.

ГФ XI, в.2, статья 20.

цветки липы

Tilia cordata Mill.

ГФ XI, в.2, статья 12.

побеги багульника болотного

Ledum palustre L.

ГФ XI, в.2, статья 1.

корневища и корни родиолы розовой

Rhodiola rosea L.

ГФ XI, в.2, статья 75.

корень солодки

Glycyrrhiza glabra L.

ГФ X, статья 573.

корневища аира

Acorus calamus L.

ГФ XI, в.2, статья 72.

листья мать-и-мачехи

Tussilago farfara L.

ГФ XI, в.2, статья 16.

цветки ноготков

Calendula officinalis L.

ГФ XI, в.2, статья 5.

Растительное сырье было собрано в местах естественного произрастания и на площадках культивирования на территории Томской области и Алтайского края. Сбор материала производили в период 2000-2003 гг. После сбора растительное сырье было высушено на воздухе, под навесом, при температуре 15-25С, в течение 3-10 суток. Образцы упаковывали и хранили в соответствии с требованиями нормативной документации (ГОСТ 17768-90 и ГФ ХІ).

Суммарные полисахаридные комплексы получали из высушенного растительного сырья экстракцией подкисленной водой с последующим осаждением этанолом и очисткой методом диализа, после диализа образцы высушивали методом лиофильной сушки. Общее содержание углеводов в исследуемых образцах определяли спектрофотометрическим методом [Dubois M. et al. 1956]. Для количественного определения белковых примесей использовали метод Брэдфорда [Bradford M.M. 1976] и метод Лоури [Lowry O. et al. 1951]. Нуклеиновые кислоты определяли спектрофотометрическим методом [Спирин А.С. 1958.]; уроновые кислоты – карбазол-серным методом [Galambos, J.T. 1967]. Измерение оптической плотности растворов проводили на спектрофотометре UNICO 2800 (США). Молекулярно-массовое распределение в образцах определяли методом эксклюзионной ВЭЖХ по времени удерживания, в соответствии с калибровочными значениями, определенными по стандартным образцам декстранов с молекулярной массой 15 кДа, 40 кДа, 60 кДа, 90, 110 кДа, 250 кДа и 500 кДа («Sigma-Aldrich», Германия). Разделение полисахаридных комплексов на фракции и выделение индивидуальных компонентов проводили методами ионообменной хроматографии на DEAE-целлюлозе, ультрафильтрации и порционного осаждения. Идентификацию моносахаридов, входящих в состав образцов, осуществляли после полного кислотного гидролиза трифторуксусной кислотой. Моносахариды в гидролизате идентифицировали хроматомасс-спектрометрическим методом в виде соответствующих ацетатов полиолов или триметилсилильных производных. Спектры ЯМР (13С и Н) образцов записывали на приборах DRX-500 и DRX-300.

Фармакологические исследования проведены на 744 мышах-самках и 48 самцах линии C57Вl/6, 24 мышах-самцах линии CBA/CaLac и 53 крысах-самцах линии Вистар. Для оценки противоопухолевого действия образцов использовали модели перевиваемых опухолей: карциному легких Льюис, меланому В-16 у мышей и карциносаркому 256 Уокера у крыс. Трансплантацию опухолевых клеток проводили общепринятыми методами [Софьина З.П. и др., 1980]. Эффективность проведенных курсов лечения оценивали по противометастатическому и противоопухолевому действию образцов у мышей с меланомой В-16 – на 24 сутки, с карциномой легких Льюис – на 21-22 сутки, у крыс с карциносаркомой 256 Уокер - на 17 сутки после перевивки. Оценка функциональной активности клеток лимфатических узлов в тесте нейтрализации опухолевых клеток Винна проводилась у мышей линии C57Вl/6 с карциномой легких Льюис [Winn H.J. 1961]. Показатели периферической крови исследовали общепринятыми гематологическими методами [Гольдберг Е.Д. и др., 1992]. Продукцию NO оценивали по содержанию нитритов в супернатантах при помощи реактива Грейса [Green L.C. et al. 1982]. Активность аргиназы определяли по модифицированной методике [Munder M. et al. 1998]. Цитокины в исследуемых супернатантах определяли твердофазным иммуноферментным методом при помощи тест-систем («R@D Systems», США) согласно прилагаемым протоколам.

Полученные экспериментальные данные обрабатывали с использованием пакета программ Statistica 8.0. Для количественных показателей вычисляли среднее значение (Х) и стандартную ошибку среднего (m). Для качественных признаков определяли частоту (%). Достоверность различий между показателями оценивали при помощи непараметрического критерия Вилкоксона-Манна-Уитни. Достоверность различий между качественными признаками проверяли при помощи точного теста Фишера. Различия считали достоверными при Р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

ВЫБОР ОБЪЕКТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ

Комплексному химико-фармакологическому исследованию были подвергнуты полисахаридные комплексы, выделенные из 10 видов официнального растительного сырья, которые на основании ряда критериев были отобраны из 126 видов лекарственных растений, произрастающих или интродуцированных на территории Западной Сибири. Критериями отбора перспективных видов явились: количественное содержание полисахаридов (более 1,0%), достаточная сырьевая база, фармакопейный статус, наличие противоопухолевой или иммунотропной активности (по данным литературы), применение в традиционной медицине для лечения онкологических заболеваний.

ВЫДЕЛЕНИЕ ПОЛИСАХАРИДНЫХ КОМПЛЕКСОВ ИЗ РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ И ИХ ХАРАКТЕРИСТИКА

Полисахаридные комплексы (ПСК) выделяли из растительного сырья по оригинальной методике, подобранные нами параметры извлечения позволили получить максимальный набор полисахаридов в одном образце с минимальным количеством примесей растительного происхождения (рис.1).

Рисунок 1. Схема выделения полисахаридных комплексов из растительного сырья.

В полученных образцах было определено количество общих углеводов, уроновых кислот, общего белка и нуклеиновых кислот. Результаты определения представлены в таблице 2.

Таблица 2 – Характеристика полисахаридных комплексов исследуемых растений

Название

образца

Выход ПСК,

% от массы воздушно-сухого сырья

Содержание в ПСК, %

Углеводы

Уроновые кислоты

Белок

Нуклеиновые  кислоты

ПСК левзеи

2,3±0,5

97,2±1,2

38,9±0,2

0,10±0,04

0,034±0,010

ПСК одуванчика

2,5±0,3

99,8±0,2

93,6±2,9

1,17±0,44

0,132±0,012

ПСК подорожника

3,3±0,1

98,0±1,1

11,4±0,1

0,21±0,05

0,022±0,013

ПСК липы

3,9±1,2

99,9±0,1

12,9±0,1

0,08±0,01

0,010±0,005

ПСК багульника

1,3±0,2

95,9±4,1

95,3±0,2

0,14±0,08

0,032±0,007

ПСК родиолы

2,6±0,5

98,9±1,2

10,3±0,1

0,13±0,02

0,011±0,001

ПСК солодки

4,3±1,5

98,4±3,2

14,3±0,1

0,82±0,06

0,030±0,008

ПСК аира

3,7±1,1

99,8±3,2

24,4±0,1

0,12±0,02

0,062±0,012

ПСК мать-и-мачехи

2,9±0,2

97,9±2,3

26,4±0,2

0,21±0,06

0,021±0,003

ПСК календулы

1,5±0,2

97,8±1,1

11,2±0,1

1,68±0,26

0,165±0,024

Выход полисахаридных комплексов из воздушно-сухого сырья составил от 1,3±0,2 до 4,3±1,5%. Высокое содержание общих углеводов (от 95,9±2,9 до 99,8±3,2%) и низкое содержание примесей белка (от 0,10±0,04 до 1,68±0,26%) и нуклеиновых кислот (от 0,010±0,005 до 0,165±0,024%) свидетельствует об эффективности используемых подходов выделения и очистки полисахаридов из растительного сырья. Наличие уроновых кислот в составе полисахаридных комплексов (до 95,32%) свидетельствует об эффективном извлечении водорастворимых фракций кислых полисахаридов. Исследование образцов методом эксклюзионной ВЭЖХ показало, что молекулярная масса полисахаридов варьирует в пределах 30-750 кДа, преобладающие компоненты всех полисахаридных комплексов имеют молекулярную массу 290-380 кДа.

Полученные экспериментальные данные дополняют имеющиеся в литературе сведения о полисахаридах исследуемых растений. Так, нами впервые выделены и охарактеризованы полисахаридные комплексы левзеи сафлоровидной, багульника болотного, родиолы розовой, аира болотного. Впервые показано, что в корнях одуванчика, кроме инулина и инулиноподобных полисахаридов, в большом количестве (около 2,5%) содержатся кислые полисахариды с молекулярной массой 310 и 700 кДа. Полученные нами характеристики полисахаридного комплекса из листьев подорожника совпадают с данными литературы о содержании высокомолекулярных пектиновых полисахаридов, однако нами показано, что в составе полисахаридного комплекса подорожника присутствуют также и нейтральные полисахариды и установлена их молекулярная масса. Относительно полисахаридов липы, мы подтвердили имеющиеся в литературе сведения о присутствие в его составе одного преобладающего компонента и, в дополнение к этому, впервые показали, что его молекулярная масса составляет 310 кДа. Впервые показано, что ПСК мать-и-мачехи состоит из двух основных компонентов с молекулярной массой 690 и 350 кДа с общим содержанием уроновых кислот около 25%.

Таким образом, на данном этапе работы были выделены и охарактеризованы полисахаридные комплексы из десяти видов лекарственных растений. Следующим этапом работы является скрининговое исследование влияния полученных образцов на развитие и эффективность химиотерапии экспериментальных опухолей.

Скрининговая оценка влияния полисахаридов высших растений на развитие перевиваемой опухоли у мышей и эффективность цитостатической терапии

При оценке влияния исследуемых полисахаридов на развитие перевиваемых опухолей и эффективность химиотерапии показано, что при самостоятельном применении исследуемые образцы не оказали влияния на рост карциномы легких Льюис. Исключение составили полисахариды аира, которые достоверно, по сравнению с контролем, снижали массу первичного опухолевого узла. В отношении процесса метастазирования, полисахариды липы, багульника и солодки достоверно снижали количество метастазов по сравнению с группой животных, не получавших лечения. При сочетанном применении с циклофосфаном, почти все исследуемые образцы достоверно стимулировали противоопухолевую активность циклофосфана. Исключение составили полисахариды родиолы, солодки, календулы, которые проявили эффект на уровне тенденции. Противометастатическую активность циклофосфана достоверно стимулировали полисахариды липы, багульника, аира и мать-и-мачехи (табл. 3).

Полученные данные свидетельствуют о том, что противоопухолевое и антиметастатическое действие изучаемых полисахаридов наиболее эффективно реализуется на фоне цитостатической терапии, и позволяют условно разделить изученные полисахариды на 4 группы: (1) вещества, оказывающие ингибирующее влияние на рост основного опухолевого узла – полисахариды левзеи, одуванчика и подорожника; (2) вещества, преимущественно оказывающие воздействие на процесс метастазирования опухоли – полисахариды родиолы и солодки; (3) вещества, ингибирующие как рост первичного опухолевого узла, так и процесс метастазирования – полисахариды аира, мать-и-мачехи, липы и багульника; (4) вещества, не активные в отношении карциномы легких Льюис – полисахариды календулы. По результатам исследования установлено, что полисахариды аира оказывают наиболее выраженное потенцирующее влияние на активность циклофосфана, проявляя при этом, еще и самостоятельное противоопухолевое действие, поэтому мы выбрали этот объект для дальнейшего изучения.

Таблица 3 – Влияние полисахаридов высших растений на развитие карциномы легких Льюис у мышей линии С57Bl/6 и эффективность лечения циклофосфаном

Название растения, доза ПСК

Масса опухоли

Частота метастази-рования

Количество метастазов

Площадь метастазов

1

2

3

4

5

ПСК одуванчика, 10мг/кг

-

-

-

-

ПСК одуванчика, 10мг/кг + ЦФ

  P2<0,05

-

ПСК левзеи, 10мг/кг

-

-

-

-

ПСК левзеи, 10мг/кг + ЦФ

  P2<0,05

-

-

-

ПСК подорожника, 10мг/кг

-

-

-

-

ПСК подорожника, 10мг/кг + ЦФ

  P2<0,05

-

-

-

ПСК родиолы , 10мг/кг

-

-

-

-

ПСК родиолы, 10мг/кг + ЦФ

-

  P2<0,001

-

-

ПСК солодки, 10мг/кг

-

-

  P1<0,05

ПСК солодки, 10мг/кг + ЦФ

-

-

  P2<0,05

ПСК липы, 10мг/кг

-

-

-

-

ПСК липы, 10мг/кг + ЦФ

  P2<0,01

  P1<0,001

-

-

ПСК багульника, 10мг/кг

-

-

-

  Р1<0,05

ПСК багульника, 10мг/кг + ЦФ

  P2<0,05

ПСК мать-и-мачехи

-

-

-

-

ПСК мать-и-мачехи, 10 мг/кг + ЦФ

  P2<0,05

  P2<0,001

ПСК аира, 10 мг/кг

  P1<0,01

-

-

-

ПСК аира, 10мг/кг + ЦФ

  P2<0,01

  P1<0,001

  P2<0,05

  P2<0,05

ПСК календулы, 10 мг/кг

-

-

-

-

ПСК календулы, 10 мг/кг + ЦФ

-

-

-

-

Примечание. “” – ингибирующее влияние; “” - стимулирующее влияние; “-“ – эффекта не обнаружено. Р 1 – достоверность различий показателей с группой нелеченых животных; Р2 - достоверность различий показателей с группой мышей, получавших только цитостатик.

Для углубленного изучения влияния полисахаридов аира на эффективность цитостатической терапии перевиваемых опухолей была исследована их противоопухолевая и антиметастатическая активность при изолированном введении и на фоне применения цитостатиков на трех различных моделях перевиваемых опухолей (карцинома легких Льюис, меланома В-16 и карциносаркома 256 Уокера) и разных видах лабораторных животных (мыши и крысы). В качестве химиотерапевтических агентов использовались цитостатические препараты с различным механизмом действия – циклофосфан и 5-фторурацил. Полисахариды вводились внутрибрюшинно в дозе 5, 10, 25 и 50 мг/кг и перорально в дозе 75 мг/кг веса животных. Показано, что наиболее эффективная дозировка полисахаридов аира – 10 мг/кг и ее повышение не приводит к увеличению эффективности воздействия. Полученные результаты демонстрируют как самостоятельное противоопухолевое действие полисахаридов аира, так и их способность повышать противоопухолевую и антиметастатическую активность циклофосфана и 5-фторурацила в отношении карциномы легких Льюис, меланомы В-16, и карциносаркомы 256 Уокер.

Выделение индивидуальных полисахаридов и исследование их химической структуры

Согласно полученным данным о компонентном составе изучаемых образцов, полисахаридный комплекс аира болотного представляет собой смесь полисахаридов с различной молекулярной массой, с общим содержанием уроновых кислот – 24,4±0,1%. Для идентификации компонентов, отвечающих за фармакологическое действие полисахаридного комплекса, необходимо было выделить их в чистом виде и установить их химическую структуру. В результате разделения полисахаридного комплекса аира методом ионообменной хроматографии на колонке с DEAE-целлюлозой было получено около 40 фракций, из которых при объединении получили 5 основных фракций (рис.2).

Рисунок 2. Хроматограмма полисахаридного комплекса аира болотного. (DEAE-целлюлоза (Cl--форма), подвижная фаза – 0.01, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4 и 0.5 М растворы натрия хлорида.

В полученных фракциях было определено содержание белка и уроновых кислот спектрофотометрическим методом, методом эксклюзионной ВЭЖХ установлено, что фракции представляют собой индивидуальные вещества с различной молекулярной массой (табл. 4).

Таблица 4 – Содержание уроновых кислот и белка во фракциях полисахаридного комплекса аира болотного

Фракция

ПСК аира

Выход,

% от массы ПСК

Характеристики

Содержание уроновых кислот, %

Содержание

белка, %

Молекулярная масса, кДа

PSF-101

42,0±4,6

-

-

40

PSF-102

7,3±1,2

3,5±0,7

-

280

PSF-103

27,2±3,0

83,9±2,1

-

370

PSF-104

11,2±1,2

7,3±0,7

-

440

PSF-105

6,0±1,3

31,7±1,2

1,7±0,1

740

Для хроматомасс-спектрометрического исследования моносахаров, полученных при гидролизе исследуемых полисахаридов, осуществляли их химическую модификацию, переводя в «летучие» триметилсилилированные производные. В качестве реагента использовали раствор N-триметилсилилимидазола в пиридине, что позволило значительно сократить время и увеличить эффективность дериватизации по сравнению с общепринятыми методиками пробоподготовки (использование триметилсилилхлорида и ацетилирующих агентов). В результате хроматомасс-спектрометрического анализа выделенных компонентов полисахаридного комплекса аира, был установлен их мономерный состав (табл. 5).

Таблица 5 – Мономерный состав фракций полисахаридного комплекса аира болотного

Моносахарид

Содержание моносахаридов, %

PSF-101

PSF-102

PSF-103

PSF-104

PSF-105

D-арабиноза

-

-

0,6

0,4

-

D-рамноза

-

0,2

6,5

1,7

11,1

D-ксилоза

-

1,3

7,4

5,2

4,7

D-манноза

-

2,1

0,4

2,5

1,7

D-галактоза

-

31,3

12,5

38,8

25,9

D-глюкоза

99,9

63,8

5,1

41,0

30,9

D-галактуроновая кислота

-

-

67,5

3,2

25,7

неидентиф. компоненты

-

-

-

7,2

-

Как следует из таблицы 5, вещество PSF-101 на 99,9% состоит из остатков глюкозы. Основные сахара, формирующие структуру вещества PSF-102 – глюкоза и галактоза, в связи с этим мы отнесли данный образец к числу нейтральных полисахаридов, предположительно, по структуре он является галактоглюканом. В составе вещества PSF-103 было найдено 67% галактуроновой кислоты (что позволило нам отнести этот образец к кислым полисахаридам), 12,5% галактозы и небольшие количества ксилозы, рамнозы и глюкозы. Вещество PSF-104, также как и фракция PSF-102, представлена в основном глюкозой и галактозой, кроме того, в его составе найдена ксилоза (около 5%) и небольшие количества рамнозы, арабинозы и галактуроновой кислоты. Вещество PSF-105 состоит из трех основных сахаров – глюкозы, галактозы и галактуроновой кислоты, также в его составе присутствует рамноза, ксилоза и манноза.

Согласно современным представлениям о химической структуре пектиновых веществ [Оводов Ю.С. 2009], главная цепь их макромолекулы состоит из -1,4-связанных остатков D-галактопиранозилуроновой кислоты, между которыми могут располагаться остатки -L-рамнопиранозы, включенными в основную цепь галактуронана -1,2-связями и образующими линейную область рамногалактуронана; разветвленная часть пектинов, как правило, представлена нейтральными сахарами (глюкоза, галактоза, арабиноза). Такая структура называется рамногалактуронан I-го типа. В связи с этим мы предполагаем, что фракции PSF-103 и PSF-105 по химической структуре представляют собой рамногалактуронаны I-го типа с различной степенью разветвленности: PSF-103 представляет собой линейную молекулу с небольшим количеством разветвлений т.к. содержит меньшее количество нейтральных остатков (соотношение нейтральные сахара : галактуроновая кислота, примерно, 1:4); PSF-105, по-видимому, представляет собой сильноразветвленную молекулу, в которой разветвленная часть, состоящая из нейтральных сахаров, преобладает над линейной областью рамногалактуронана (соотношение, примерно, 3:1).

Для установления характера гликозидных связей в макромолекулах полисахаридов использовался ЯМР-спектрометрический анализ. Положение гликозидных связей вычисляли по сдвигам сигналов соответствующих атомов углерода в 13С-ЯМР спектрах исследуемых соединений (табл. 6). Спектры 13С-ЯМР и 1Н-ЯМР вещества PSF-105 имели большое количество сигналов, что не позволяло достоверно интерпретировать структуру этого вещества. По нашему мнению, это связано с высокой разветвленностью и нерегулярностью полимерной молекулы данного полисахарида. В связи с этим выводы о химической структуре PSF-105 мы делали на основании данных, полученных хроматомасс-спектрометрическим методом.

Таблица 6 – Положение сигналов основных углеводных остатков в спектрах 13С- и 1Н-ЯМР компонентов полисахаридного комплекса аира болотного

п/п

Углеводный остаток

Спектр

Углеродный атом

1

2

3

4

5

6

PSF-101

1

4)-D-Glc(1

13С

99.5

71.3

73.1

76.5

70.1

60.3

4.68

3.54

5.28

3.62

3.85

3.72

PSF-102

1

4)-D-Gal(1

13С

100.0

68.5

69.2

77.9

72.8

60.5

5.30

3.86

3.86

-

-

3.68

2

4)-D-Glc(1

13С

98.50

71.6

73.4

76.5

70.3

60.7

4.68

3.56

-

3.64

-

3.74

3

2)-L-Rha(1

13С

101.3

70.7

79.2

72.9

69.8

17.4

-

-

-

-

3.4-3.2

1.28

PSF-103

1

4)-D-GalAc(1

13С

99.7

68.9

69.6

78.6

72.0

176.1

5.00

3.88

4.01

4.30

4.68

-

2

2)-L-Rha(1

-

-

-

-

3.67

1.20

PSF-104

1

4)-D-Gal(1

13С

99.5

68.1

68.7

78.1

72.8

60.5

-

3.72

-

-

-

3.72

2

4)-D-Glc(1

13С

98.3

71.5

73.0

76.9

70.4

59.9

4.68

-

-

-

-

3.72

3

3)-D-Xyl(1

13С

97.3

74.2

85.7

-

65.8

-

-

-

-

-

3.46

-

Таким образом, методами ионообменной колоночной хроматографии и эксклюзионной ВЭЖХ установлено, что в составе полисахаридного комплекса аира содержится 5 основных компонентов, методами ЯМР и хроматомасс-спектрометрии идентифицирована их химическая структура. Нейтральные полисахариды: α-(1,4)-D-глюкан с молекулярной массой 40 кДа (PSF-101); α-D-галакто-(1,4)-α-D-глюкан с разветвлениями, состоящими из остатков α-L-рамнопиранозы и молекулярной массой 280 кДа (PSF-102); -D-ксилопиранозил-α(1,3)-D-галакто-α(1,4)-D-глюкан с молекулярной массой 440 кДа (PSF-104). Кислые полисахариды: рамно-α(1,4)-D-галактопиранозилуронан с разветвлениями из остатков нейтральных сахаров (ксилозы, галактозы и глюкозы) и молекулярной массой 370 кДа (PSF-103) и сильноразветвленный рамногалактуронан I с молекулярной массой 740 кДа (PSF-105).

Влияние КОМПОНЕНТОВ Полисахаридного комплекса аира на эффективность цитостатической терапии перевиваемых опухолей

При исследовании влияния выделенных компонентов полисахаридного комплекса аира на эффективность цитостатической терапии карциномы легких Льюис у мышей, наибольшее влияние на противоопухолевую и антиметастатическую активность циклофосфана проявило вещество PSF-103. Вещество PSF-105 достоверно усиливало только противометастатическую активность циклофосфана у мышей с LLC. Вещества PSF-102 и PSF-104  обладают менее выраженным влиянием на эффективность химиотерапии, однако их использование приводит к снижению частоты метастазирования (PSF-102) и площади метастатического поражения  легких мышей с LLC (PSF-104). Фракция PSF-101 в эксперименте не оказывала влияния на эффективность терапии циклофосфаном карциномы легких Льюис у мышей (табл.7).

Таблица 7 – Влияние компонентов полисахаридного комплекса аира болотного на эффективность лечения циклофосфаном мышей-самок линии С57Вl/6 с карциномой легких Льюис

Группа наблюдения,

режим введения

препаратов,

(количество животных)

Масса

опухоли

(Х ± m),

г

Частота метастази-рования,

%

Количество метастазов

(Х ± m)

Площадь метастазов

(Х ± m),

мм2

1. Контроль (10)

6,41±0,45

100

27,80±8,30

73,20±33,53

2. Циклофосфан (ЦФ),

125 мг/кг х 1 (9)

4,87±0,50

1-2Р<0,05

89

5,78±1,66

1-2Р<0,01

2,97±0,91

1-2Р<0,01

3. PSF-101 5 мг/кг х 9 + ЦФ 125 мг/кг х 1 (10)

4,55±0,17

80

7,90±2,98

3,78±1,97

4. PSF-102 5 мг/кг х 9 + ЦФ 125 мг/кг х 1 (10)

4,31±0,44

40

2-4Р<0,01

3,60±1,95

2,53±1,63

5. PSF-103 5 мг/кг х 9 + ЦФ 125 мг/кг х 1 (10)

4,13±0,33

2-5Р0,05

40

2-5Р<0,01

1,00±0,54

2-5Р<0,01

0,19±0,10

2-5Р<0,01

6. PSF-104 5 мг/кг х 9 + ЦФ 125 мг/кг х 1 (10)

4,54±0,33

60

3,00±1,26

1,07±0,73

2-6Р<0,05

7. PSF-105 5 мг/кг х 9 + ЦФ 125 мг/кг х 1 (10)

4,50±0,17

30

2-7Р<0,01

0,70±0,37

2-7Р<0,01

0,06±0,04

2-7Р<0,01

Примечание: здесь и далее перед уровнем значимости (Р) указанны номера сравниваемых групп

Из результатов данного эксперимента следует, что основными действующими веществами полисахаридного комплекса аира являются соединения PSF-103 и PSF-105, представляющие собой галактуронаны. В связи с этим мы полагаем, что стандартизацию растительного сырья и биологически активной субстанции целесообразно проводить по содержанию кислых полисахаридов в пересчете на галактуроновую кислоту.

Разработка методИК стандартизации корневищ аира болотного И биологически активной субстанции

Разработка методики количественного определения галактуронана. Из числа рассмотренных нами методов количественного определения кислых полисахаридов, достаточной чувствительностью и селективностью обладает спектрофотометрический метод. При определенных условиях этот метод позволяет с высокой точностью определить содержание уроновых кислот в присутствии нейтральных сахаров. Карбазольный метод определения кислых полисахаридов, основан на реакции продуктов дегидратации уроновых кислот (5-формил-2-фуранкарбоновая кислота) с карбазолом. По данным литературы, присутствие в образце нейтральных сахаров оказывает минимальное влияние на результаты определения [Bitter, H.M. Muir, 1962]. Однако в проведенном нами эксперименте было установлено иное. Полосы поглощения в УФ-спектрах растворов нейтральных сахаров и уроновых кислот после реакции с карбазолом и концентрированной серной кислотой налагались друг на друга (рис.3). Это свидетельствует о том, что присутствие нейтральных сахаров в образце будет оказывать существенное влияние на результаты определения.

Рисунок 3. УФ-спектры продуктов реакции

(а) галактуроновой кислоты,

(b) глюкозы,

(c) арабинозы

с конц. серной кислотой и карбазолом.

Известно, что в присутствии сульфаминовой кислоты влияние нейтральных сахаров может снижаться [Galambos J.T. 1967]. В проведенном нами эксперименте использование сульфаминовой кислоты (0,4 моль/л) значительно снижало интенсивность поглощения продуктов реакции нейтральных сахаров, и практически не влияло на поглощение продуктов реакции галактуроновой кислоты (рис.4).

Рисунок 4. УФ-спектры продуктов реакции

(а) галактуроновой кислоты,

(b) глюкозы,

(c) арабинозы

с конц. серной кислотой и карбазолом в присутствии сульфаминовой кислоты (0,4 моль/л).

Однако оптическая плотность растворов нейтральных сахаров при длине волны 525 нм, все еще была достаточна, чтобы вызвать серьезные погрешности при количественном анализе кислых полисахаридов. Поэтому на следующем этапе мы провели оценку влияния различных концентраций сульфаминовой кислоты в анализируемой пробе на УФ-спектры нейтральных сахаров после реакции с конц. серной кислотой и карбазолом (рис. 5). Из рисунка 5 следует, что при концентрации сульфаминовой кислоты 0,16 моль/л интенсивность поглощения продуктов, образованных нейтральными сахарами подавляется, а образованных галактуроновой кислотой остается на прежнем уровне.

В следующем эксперименте было показано, что 1-, 5- и 10-кратный избыток глюкозы не оказывал влияния на результаты количественного определения галактуроновой кислоты карбазольным методом, в присутствии 0,16 моль/л сульфаминовой кислоты. Поэтому данная методика была выбрана нами для количественного определения галактуронана аира.

Основным компонентом галактуронана аира является D-(+)-галактуроновая кислота, поэтому мы использовали ее в качестве стандарта для построения градуировочного графика. Содержание уроновых кислот в составе галактуронана составляет 84%, поэтому для пересчета концентрации галактуроновой кислоты на концентрацию галактуронана мы предлагаем использовать поправочный коэффициент, который, в данном случае, будет равен 1,19.

(I)

(II)

(III)

(IV)

(V)

(VI)

Рисунок 5. УФ-спектры продуктов реакции а) галактуроновой кислоты; (b) глюкозы и (c) арабинозы с конц. серной кислотой и карбазолом в присутствии разных концентраций сульфаминовой кислоты. (I) – 0,08 моль/л (5 мкл); (II) – 0,16 моль/л (10 мкл); (III) – 0,24 моль/л (15 мкл); (IV) – 0,32 моль/л (20 мкл); (V) – 0,4 моль/л (25 мкл); (VI) – 0,48 моль/л (30 мкл).

Отработка параметров извлечения галактуронана из растительного сырья. Оптимальные параметры извлечения биологически-активных веществ из растительного сырья могут быть установлены индивидуально, с учетом морфолого-анатомических особенностей сырья и физико-химических свойств извлекаемого компонента. Принимая во внимание физико-химические свойства галактуронана аира, мы предложили оптимальную, по нашему мнению, схему его пробоподготовки для количественного анализа спектрофотометрическим методом:

  • т.к. галактуронан является кислым полисахаридом и находится в цитоплазме растительных клеток в связанном состоянии (в виде нерастворимых солей с ионами 2-х и 3-х валентных металлов), мы использовали для его экстракции слабые водные растворы хлороводородной кислоты (рН=4);
  • галактуронан является высокомолекулярным веществом (370 кДа) и характеризуется медленной растворимостью в воде. Поэтому при его экстракции, особенно из высушенного сырья, необходимо использовать стадию набухания, которая обеспечит количественный переход галактуронана в раствор;
  • для очистки полученного извлечения от большинства примесей, мешающих определению, мы использовали ультрафильтрацию через мембрану с размером пор 300 кДа (концентратор Vivaspin20-300кDа («Sartorius», Франция)). Анализируемый полисахарид имеет молекулярную массу 370 кДа и не проходит через мембрану, тогда как большинство веществ, присутствующих в извлечении (в т.ч. неорганические соли, полифенольные соединения, крахмал  т.д.), проходят через поры и удаляются. Кроме того, таким образом достигается концентрирование галактуронана в растворе, что в дальнейшем упрощает проведение количественного определения. Параметры экстракции, влияющие на извлечение галактуронана из корневищ аира болотного, представлены в таблице 8.

Установлено, что максимальное извлечение галактуронана из высушенных корневищ аира болотного достигается при степени измельчения растительного сырья – 0,5-1,0 мм; соотношении сырья и экстрагента – 1:100; концентрации хлористоводородной кислоты в экстрагенте – 0,5%; времени нагревания сырья с экстрагентом – 120 мин.; и продолжительности настаивания извлечения – 24 часа.

Разработанная методика количественного определения галактуронана в корневищах аира болотного валидирована по показателям: повторяемость (RSD = 1,98%), внутрилабораторная прецизионность (RSD=1,86 %), межлабораторная прецизионность (RSD=4,06%) правильность (100,26 %) и линейность (у=0,653х - 0,105, R2=0,999). На основании полученных результатов предложенную методику количественного определения галактуронана в корневищах аира болотного можно считать валидной, что позволяет включить ее в проект Фармакопейной статьи предприятия «Аира болотного корневища».

Таблица 8 – Влияние параметров экстракции на выход галактуронана из корневищ аира болотного

Параметры экстракции

Содержание галактуронана в корневищах аира, %

серия 1

серия 2

серия 3

серия 4

серия 5

Размер частиц сырья

0,1-0,5 мм

0,47

0,65

0,18

0,21

0,10

0,5-1,0 мм

0,55

0,71

0,23

0,28

0,13

1,0-3,0 мм

0,52

0,70

0,20

0,21

0,12

3,0-5,0 мм

0,47

0,68

0,18

0,24

0,11

5,0-7,0 мм

0,46

0,63

0,16

0,22

0,11

Соотношение сырья и экстрагента

1:50

0,68

0,65

0,22

0,27

0,13

1:100

0,74

0,73

0,30

0,36

0,17

1:150

0,73

0,73

0,31

0,34

0,18

1:200

0,74

0,72

0,30

0,35

0,16

1:300

0,72

0,72

0,29

0,36

0,16

Время настаивания извлечения

3 часа

0,68

0,74

0,22

0,28

0,14

6 часов

0,67

0,73

0,25

0,29

0,14

12 часов

0,64

0,68

0,22

0,25

0,13

24 часа

0,74

0,78

0,27

0,34

0,18

36 часов

0,72

0,79

0,26

0,29

0,16

Время нагревания

30 мин

0,57

0,69

0,16

0,27

0,11

60 мин

0,49

0,68

0,22

0,32

0,15

120 мин

0,64

0,75

0,25

0,35

0,17

180 мин

0,62

0,75

0,21

0,30

0,15

Концентрация хлористоводородной кислоты

0,05 моль/л

0,62

0,55

0,21

0,23

0,09

0,10 моль/л

0,81

0,78

0,32

0,34

0,18

0,25 моль/л

0,66

0,75

0,30

0,38

0,16

0,50 моль/л

0,64

0,73

0,27

0,36

0,13

С использованием разработанной методики было поведено количественное определение галактуронана в 5 партиях корневищ аира болотного. Показано, что содержание галактуронана в разных промышленных партиях корневищ аира может варьировать от 0,148±0,018% до 0,796±0,024%. На основании этого, считаем возможным установить в проекте Фармакопейной статьи предприятия норму содержания галактуронана – не менее 0,1 %.

Изучение механизмов антибластомного действия полисахаридов аира

Известно, что механизмы опухолеиндуцированной иммуносупрессии реализуются во многом благодаря отрицательной регуляторной активности антиген-презентирующих клеток (макрофагов и дендритных клеток), находящихся под влиянием опухоли, и формированию, в результате этого, Th2-типа иммунологического ответа. Влияние полисахаридов аира на функции клеток иммунной системы до настоящего времени не изучалось. Поэтому исследование механизмов их антибластомного действия мы проводили в три этапа: (1) изучение влияния на функциональную активность и баланс популяций лимфоцитов в условиях опухолевого роста и химиотерапии; (2) изучение влияния на функциональное состояние антиген-презентирующих клеток; (3) оценка влияния на развитие и протекание Th1- и Th2-типов иммунного ответа.

Влияние полисахаридов аира на функциональную активность клеток лимфоузлов мышей с карциномой легких Льюис при их изолированном введении и на фоне цитостатической терапии. Оценка влияния полисахаридов аира на функциональную активность клеток лимфоузлов проводилась с использованием теста нейтрализации опухолевых клеток Винна. Результаты эксперимента представлены в таблице 9.

Таблица 9 – Влияние полисахаридов аира на функциональную активность клеток лимфоузлов мышей-самок линии С57Bl/6 при их изолированном введении и на фоне терапии циклофосфаном

Группа наблюдения,

режим введения

препаратов,

(количество животных)

Масса

опухоли

(Х ± m),

г

Частота метастази-рования,

%

Количество метастазов

(Х ± m)

Площадь метастазов

(Х ± m),

мм2

1.Контроль (9)

5,55±0,22

100

32,8±5,2

121,3±41,0

2. Опухоль + лимфоузлы интактных мышей (10)

5,70±0,15

100

28,1±3,1

105,4±23,5

3.Опухоль + лимфоузлы нелеченых мышей с LLC (9)

5,70±0,36

100

46,8±8,2

2-3Р<0,05

177,5±46,0

4. Опухоль + лимфоузлы леченных ЦФ мышей (9)

6,47±0,30

3-4Р<0,05

100

35,3±2,6

171,2±17,6

5. Опухоль + лимфоузлы леченных ПСК аира мышей (10)

4,50±0,51

3-5Р<0,05

100

28,7±4,7

3-5Р<0,05

113,9±26,0

6. Опухоль + лимфоузлы леченных ЦФ и ПСК аира мышей (10)

4,03±0,40

3-6Р<0,01

4-6Р<0,01

100

27,3±2,6

3-6Р<0,05

52,6±12,6

3-6Р<0,05

4-6Р<0,01

Проведенный эксперимент позволил сделать следующие заключения: (1) активность клеток лимфоузлов животных с карциномой легких Льюис снижена по сравнению со здоровыми животными; (2) полисахариды аира способны повышать активность клеток лимфоузлов на фоне иммуносупрессии, вызванной опухолевым ростом и применением циклофосфана.

Влияние полисахаридов аира на содержание популяций лимфоцитов в периферической крови мышей с карциномой легких Льюис. В эксперименте показано, что у интактных мышей в периферической крови лимфоциты по субклассам распределялись равномерно. Развитие злокачественного новообразования в организме животных приводило к значительному увеличению количества лимфоцитов в периферической крови (в 1,4 раза), за счет накопления незрелых форм лимфоцитов (в 2,6 раза), количество В-лимфоцитов, при этом, было несколько снижено по сравнению с контролем (рис. 6).

Рисунок 6. Распределение лимфоцитов периферической крови мышей линии С57Bl/6 на субпопуляции (Т, В, О) при развитии карциномы легких Льюис и лечении полисахаридами аира (ВРПС аира).

Примечание. ''*'' – значимое (Р0,05) различие с интактной группой; ''**'' – значимое (Р0,05) различие с группой нелеченых мышей с карциномой легких Льюис.

Эти данные свидетельствуют о стимуляции лейкопоэза у животных с опухолью, и одновременной ингибиции процессов созревания наивных лимфоцитов в зрелые формы. При введении полисахаридов аира мышам с опухолью, картина популяционного состава лимфоцитов изменялась: резко увеличивалось количество Т-клеток и В-клеток за счет значительного снижения количества О-лимфоцитов. Эти данные ясно свидетельствуют о том, что полисахариды аира стимулируют трансформацию незрелых лимфоцитов в Т- и В-клетки. Наряду с этим, усиление опухоле-специфической цитотоксичности лимфоцитов, показанное в предыдущем эксперименте, свидетельствует о том, что антибластомная активность полисахаридов аира реализуется через активацию специфического звена иммунитета.

В результате проведенного эксперимента нами были сделаны следующие заключения: (1) у мышей с карциномой легких Льюис активирован лейкопоэз, однако подавлены процессы созревания Т- и В-лимфоцитов; (2) полисахариды аира стимулируют созревание опухоле-специфических Т- и В-лимфоцитов в условиях опухолевого роста и применения цитостатиков.

Вместе с тем известно, что лимфоциты не имеют специфических рецепторов к полисахаридным структурам. Поэтому наиболее вероятной может быть их опосредованная активация лимфоцитов через антиген-презентирующие клетки.

Влияние полисахаридов аира на функциональное состояние антиген-презентирующих клеток. В эксперименте полисахариды аира стимулировали активность индуцибельной NO-синтазы перитонеальными макрофагами мышей, что свидетельствует об их классической активации (М1) (табл.10).

Таблица 10 – Влияние полисахаридов аира и мурамилдипептида на продукцию оксида азота перитонеальными макрофагами мышей (Хm)

Вещество

Время культивирования

(часы)

Концентрация нитритов (мкМ)

контроль

10 мкг/мл

ПСК аира

20 мкг/мл

ПСК аира

ПСК аира,

10 и 20 мг/кг

24

24,0±1,1

30,1±0,8*

30,0±1,9*

48

46,5±1,7

54,3±1,8*

50,8±0,8*

Мурамилдипептид, 5 и 10 мг/кг

24

2,4±0,1

5 мкг/мл

10 мкг/мл

5,1±1,0*

4,4±0,2*

48

2,7±0,2

5,7±0,6*

4,7±0,5*

Примечание: * - здесь и далее различия показателя с контролем достоверны, p<0,05.

Экспрессия аргиназы, которая является маркером альтернативной активации, на первом этапе увеличивалась, но затем происходило ее снижение (табл.11).

Таблица 11 – Влияние полисахаридов аира и мурамилдипептида на экспрессию аргиназы перитонеальными макрофагами мышей (Хm)

Вещество

Время культивирования

(часы)

Единицы активности аргиназы

контроль

10 мкг/мл

ПСК аира

20 мкг/мл

ПСК аира

ПСК аира,

10 и 20 мг/кг

24

5,0±0,9

9,8±1,6*

8,9±1,4*

48

11,5±0,9

5,7±2,1*

4,7±1,5*

Мурамилдипептид, 5 и 10 мг/кг

24

8,2±1,0

5 мкг/мл

10 мкг/мл

7,2±1,0

8,0±1,9

48

13,9±1,7

10,6±1,0

21,4±2,5*

Влияние полисахаридов аира на продукцию ИЛ-12 и ИЛ-10 перитонеальными макрофагами мышей. В эксперименте полисахариды аира значительно стимулировали (в 5,3 раза) ЛПС-индуцированную продукцию ИЛ-12 и не влияли на продукцию ИЛ-10 перитонеальными макрофагами мышей (табл.12).

Таблица 12 – Влияние полисахаридов аира на ЛПС-индуцированную продукцию ИЛ-12 и ИЛ-10 перитонеальными макрофагами интактных мышей (Хm)

Исследуемое вещество

Концентрация

ИЛ-12 (пг/мл)

Концентрация

ИЛ-10 (мкг/мл)

контроль (ЛПС – 1 мкг/мл)

4,4 ± 0,51

2,28 ± 0,06

ПСК аира 20 мкг/мл + ЛПС, 1 мкг/мл

23,3 ± 2,7*

2,57 ± 0,03

Однако реакция макрофагов на регуляторные воздействия у животных и человека может существенно отличаться, поэтому на следующем этапе мы провели оценку влияния полисахаридов аира на продукцию ключевых про- и противовоспалительных цитокинов (TNF- (фактор некроза опухоли) и ИЛ-10) мононуклеарами человека. Полисахариды аира увеличивали продукцию TNF- в 1,8 раза и подавляли ЛПС-стимулированную продукцию ИЛ-10 практически до уровня спонтанного контроля (табл.13).

Таблица 13 – Влияние полисахаридов аира на продукцию TNF- и ИЛ-10 мононуклеарами периферической крови здоровых доноров (Хm)

Исследуемое вещество

Концентрация TNF- (пг/мл)

Концентрация ИЛ-10 (пг/мл)

контроль 1 (спонтанная продукция)

33,8 ± 0,8*

45,6 ± 2,1

контроль 2 (ЛПС 1мкг/мл)

47,3 ± 4,1*

69,0 ± 2,9*

ПСК аира 20 мкг/мл + ЛПС 1 мкг/мл

84,9 ± 7,8*#

45,1 ± 5,5#

Примечания:  * - различия с контролем 1 достоверны, p<0,05, n=6;

# - различия с контролем 2 достоверны, p<0,05, n=6.

Как видно из результатов проведенных экспериментов, полисахариды аира стимулируют продукцию NO, ИЛ-12 и TNF- и подавляют экспрессию аргиназы и ИЛ-10 макрофагами, что свидетельствует об их классической активации (М1) и должно, по-видимому, способствовать формированию Th1-типа иммунного ответа. Для подтверждения этого предположения, мы провели эксперимент по оценке влияния полисахаридов аира на развитие и протекание Th1- и Th2- типов иммунного ответа у мышей.

Влияние полисахаридов аира на протекание Th1-зависимого иммунного ответа. Влияние полисахаридов и мурамилдипептида на клеточное звено Th1-типа иммунного ответа оценивали по интенсивности реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ), индуцированной эритроцитами барана [Yokozeki H. 2000]. В качестве позитивного контроля был использован мурамилдипептид. В эксперименте курсовое введение полисахаридов аира усиливало реакцию ГЗТ в 2 раза по сравнению с контролем (табл. 14).

Таблица 14 – Влияние полисахаридов аира и мурамилдипептида на интенсивность реакции ГЗТ, индуцированной эритроцитами барана у мышей (Хm)

Исследуемое вещество, дозировка (количество животных в группе)

Группа

Величина реакции ГЗТ (мг)

ПСК аира, 10 мг/кг (12)

контроль

опыт

9,85 ± 1,73

19,36 ± 2,86*

Мурамилдипептид, 2 мкг/кг (10)

контроль

опыт

16,7 ± 5,3

36,4 ± 4,0*

Примечание: * - здесь и далее различия показателя с контролем достоверны, p<0,05.

Влияние полисахаридов аира на гуморальное звено Th1-типа иммунного ответа оценивали по количеству антителообразующих клеток (АОК) и по их функциональной активности (количеству продуцируемых гемагглютининов). В эксперименте полисахариды аира увеличивали число АОК и не влияли на уровень продуцируемых гемагглютининов (табл.15).

Таблица 15 – Влияние полисахаридов аира и мурамилдипептида на количество антителообразующих клеток (АОК) и продукцию ими гемагглютининов у мышей, иммунизированных эритроцитами барана (Хm)

Исследуемое вещество, дозировка (количество животных в группе)

Группа

Число АОК

(103/селезенку)

Титр гемагглю-тининов (log2)

ПСК аира, 10 мг/кг (12)

контроль

опыт

22,3 ± 8,5

60,7 ± 5,0*

10,3 ± 1,3

9,0 ± 0,7

Мурамилдипептид,

2 мкг/кг (10)

контроль

опыт

36,7 ± 6,0

66,9 ± 9,3*

5,5 ± 0,5

6,0 ± 0,8

При этом возник вопрос: не связан ли такой эффект с прямым митогенным действием полисахаридов на В-лимфоциты? Для ответа на этот вопрос и для выяснения наличия у полисахаридов аира костимуляторных свойств, было оценено их влияние на пролиферацию лимфоцитов селезенки интактных мышей (прямое митогенное действие) и на пролиферацию В-лимфоцитов, индуцированную липополисахаридом (костимуляторное действие). В качестве положительного контроля использовали мурамилдипептид. В эксперименте показано, что мурамилдипептид стимулировал пролиферацию лимфоцитов, культивированных как в присутствии В-клеточного митогена (ЛПС), так и без него. Полисахариды аира не оказывали самостоятельного митогенного действия и не стимулировали митогениндуцированную пролиферацию В-лимфоцитов (табл.16).

В результате проведенного эксперимента было сделано заключение, что полисахариды аира стимулируют развитие Th1-типа иммунного ответа, вызывая увеличение активности клеточного и гуморального звена, но не влияют на продукцию гемагглютининов и не оказывают митогенное действие на лимфоциты.

Таблица 16 – Влияние полисахаридов аира и мурамилдипептида на пролиферацию лимфоцитов селезенки мышей (Хm)

Исследуемое вещество

Оптическая плотность супернатанта, нм

культивирование

без митогена

культивирование в присутствии митогена

(1 мкг/мл ЛПС)

контроль

473 ± 46

648 ± 42

ПСК аира, 20 мкг/мл

498 ± 43

597 ± 48

Мурамилдипептид, 5 мкг/мл

817 ± 90*

823 ± 45*

Влияние полисахаридов аира на протекание Th2-зависимого иммунного ответа. Влияние полисахаридов аира на Th2-зависимый иммунный ответ оценивали по тяжести анафилактического шока, вызванного введением овальбумина [Retini C. 2001] и по количеству продуцируемых иммуноглобулинов классов E и G1, характерных для данного типа поляризации [Gehlhar K. et al. 1999]. В качестве положительного контроля использовали мурамилдипептид. В эксперименте полисахариды аира на 25%, а мурамилдипептид на 10% снижали летальность животных в результате анафилактического шока. Полисахариды аира уменьшали концентрацию IgE в 1,7 раза при однократной иммунизации и в 3,6 раза при двукратной иммунизации. У дважды иммунизированных животных курсовое введение полисахаридов аира и препарата сравнения вызывало понижение концентрации IgG1: мурамилдипептид уменьшал данный показатель в 1,8 раза, полисахариды аира в 2,1 раза (табл. 17).

В результате проведенного эксперимента было сделано заключение, что полисахариды аира обладают способностью ингибировать продукцию В-лимфоцитами иммуноглобулинов классов Е и G1 и развитие Th2-типа иммунного ответа.

Таблица 17 - Влияние полисахаридов аира и мурамилдипептида на содержание IgE и IgG1 в сыворотке крови иммунизированных овальбумином мышей (Хm)

Исследуемое вещество, дозировка (количество животных в группе)

Количество иммунизаций

Группа

Содержание IgE

(мкг/мл)

Содержание IgG1

(мг/мл)

ПС аира,

10 мг/кг (10)

1

контроль

опыт

4,90 ± 0,64

2,92 ± 0,45*

-

2

контроль

опыт

7,36 ± 0,81

2,05 ± 0,49*

4,22 ± 0,28

2,00 ± 0,50*

Мурамилдипептид,

2 мкг/кг (10)

1

контроль

опыт

4,90 ± 0,64

4,36 ± 1,11

-

2

контроль

опыт

7,36 ± 0,81

2,17 ± 0,47*

4,22 ± 0,28

2,38 ± 0,32*

Таким образом, на основании результатов проведенных экспериментов установлено, что одним из механизмов реализации антибластомного эффекта полисахаридов аира является активация антиген-презентирующих клеток по «классическому» типу и развитие Th1-типа иммунологического ответа.

Обоснование рациональных методологических подходов к поиску, оценке эффективности и разработке новых лекарственных средств комплексной терапии злокачественных новообразований на основе полисахаридов высших растений

Результатом обобщения и структурирования всех выполненных в рамках данной работы исследований стала предложенная нами последовательная методологическая схема поиска, оценки эффективности и разработки новых лекарственных средств комплексной терапии онкологических заболеваний на основе полисахаридов высших растений, которая базируется на трех основных этапах:

1 этап - Выявление перспективных источников полисахаридов – включает в себя 4 последовательных стадии: (1) Отбор перспективных видов растений: в данном случае, по нашему мнению, рационально использование предложенных нами критериев отбора. (2) Выделение полисахаридных комплексов: разработанная и используемая нами оригинальная методика, позволяет получать максимальный спектр водорастворимых полисахаридов в одном образце, что позволило существенно упростить проведение скрининговых фармакологических исследований, увеличить достоверность и воспроизводимость получаемых результатов. (3) Скрининг противоопухолевой активности: на основании результатов проведенных исследований с использованием нескольких экспериментальных моделей опухолевого роста, мы пришли к выводу, что наиболее информативной для оценки противоопухолевой активности полисахаридов является карцинома легких Льюис. (4) Выбор объектов для углублённого изучения: основным критерием выбора, по нашему мнению, является не выраженность единичного эффекта, а влияние на все показатели развития опухоли (масса первичного опухолевого узла, частота метастазирования, количество и площадь метастазов).

2 этап - Химико-фармакологическое изучение. В задачи этого этапа входит (1) идентификация структуры действующих веществ полисахаридного комплекса, для чего его необходимо разделить на индивидуальные компоненты, что, как правило, является сложной задачей. Использование в работе различных методов разделения полисахаридов (фракционное осаждение, гель-фильтрация, осаждение ионами 2-х валентных металлов, электрофорез и т.д.) показало, что наиболее эффективным и универсальным методом является ионообменная хроматография в комплексе с ультрафильтрацией. Изучение химической структуры компонентов полисахаридного комплекса наиболее эффективно реализуется с сочетанным использованием двух методов – хроматомасс-спектрометрия и ЯМР-спектроскопия. Результаты проведенных исследований свидетельствуют, что наиболее эффективным и экспрессным, для пробоподготовки при хроматомасс-спектрометрическом анализе полисахаридов, является использование N-триметилсилилимидазола для дериватизации моносахаров, полученных при гидролизе полисахаридов. (2) Исследование антибластомной активности компонентов полисахаридного комплекса целесообразно проводить на той же модели, которая использовалась для скрининга. (3) При выборе метода стандартизации главным критерием является возможность селективного определения действующих полисахаридов в присутствии балластных веществ (в нашем случае галактуронанов в присутствии нейтральных сахаров). Использованная нами спектрофотометрическая методика может быть адаптирована для селективного определения кислых полисахаридов и в других объектах. (4) Разработанный нами дизайн и результаты углубленного фармакологического исследования, по нашему мнению, позволяют обосновать дальнейшее изучение объекта и проведение доклинических испытаний. (5) Результаты, полученные при выявлении механизмов действия, обосновывают методологические подходы к поиску противоопухолевых средств среди растительных полисахаридов на основании определенных видов их иммунотропной активности (влияние на активность и баланс популяций лимфоцитов, на функциональное состояние антиген-презентирующих клеток и на развитие Th1- и Th2-типов иммунологического ответа).

3 этап - Разработка документации и подготовка регистрационного досье на новый лекарственный препарат: планирование эксперимента в соответствии с предложенной нами методологической схемой, позволит использовать полученные материалы для разработки основных элементов регистрационного досье – отчетов по изучению специфической фармакологической активности, Фармакопейных статей и технологических регламентов.

Таким образом, в результате решения поставленных задач была показана перспективность использования полисахаридов высших растений в качестве средств вспомогательной терапии злокачественных новообразований; разработаны рациональные методологические подходы к поиску, оценке эффективности и созданию новых лекарственных средств комплексной терапии злокачественных новообразований на основе полисахаридов высших растений и предложена последовательная методологическая схема, обосновывающая оптимальные пути реализации каждого этапа исследований (рис. 7).

Рисунок 7. Методологическая схема поиска, оценки эффективности и разработки новых лекарственных средств комплексной терапии онкологических  заболеваний на основе полисахаридов высших растений.

ВЫВОДЫ

  1. Перспективными источниками полисахаридов для разработки средств комплексной терапии злокачественных новообразований являются корневища с корнями левзеи сафлоровидной, корни одуванчика лекарственного, листья подорожника большого, цветки липы сердцевидной, побеги багульника болотного, корневища и корни родиолы розовой, корни солодки голой, корневища аира болотного, листья мать-и-мачехи обыкновенной, цветки календулы лекарственной.
  2. Полисахаридные комплексы исследуемых видов лекарственного растительного сырья характеризуются содержанием кислых полисахаридов (от 10,25±0,11 до 95,32±0,23%), молекулярной массой компонентов в диапазоне от 30 до 750 кДа (преобладающими компонентами являются вещества с молекулярной массой 290-380 кДа).
  3. Полисахариды цветков липы сердцевидной, побегов багульника болотного, корневищ аира болотного и листьев мать-и-мачехи повышают цитостатическую и антиметастатическую активность циклофосфана в отношении карциномы легких Льюис у мышей. Полисахариды аира оказывают наиболее выраженное потенцирующее влияние на активность циклофосфана, проявляя при этом, еще и самостоятельное противоопухолевое действие.
  4. Полисахариды аира повышают эффективность терапии карциномы легких Льюис циклофосфаном и 5-фторурацилом у мышей и ингибируют развитие других видов опухолей (меланома В-16, карциносаркома 256 Уокера) у разных видов животных (мыши и крысы).
  5. Полисахаридный комплекс из корневищ аира болотного состоит из 5 основных компонентов: 3 компонента являются нейтральными полисахаридами: α-(1,4)-D-глюкан с молекулярной массой 40 кДа; α-D-галакто-(1,4)-α-D-глюкан с разветвлениями, состоящими из остатков α-L-рамнопиранозы и молекулярной массой 280 кДа; (1,3)-D-ксилопиранозил-α(1,4)-D-галакто-α(1,4)-D-глюкан с молекулярной массой 440 кДа; а 2 представляют собой кислые полисахариды: α(1,2)-L-рамно-α(1,4)-D-галактопиранозилуронан с разветвлениями из остатков нейтральных сахаров (ксилозы, галактозы и глюкозы) и молекулярной массой 370 кДа и сильноразветвленный рамногалактуронан I с молекулярной массой 740 кДа.
  6. За реализацию антибластомного действия полисахаридов аира ответственны преимущественно кислые полисахариды. Наиболее выраженной активностью обладает рамно-α(1,4)-D-галактопиранозилуронан с молекулярной массой 370 кДа и содержанием галактуроновой кислоты 84%. Нейтральные полисахариды аира также потенцируют антиметастатическую активность циклофосфана.
  7. Стандартизацию корневищ аира болотного и биологически активной субстанции (полисахаридов аира) целесообразно проводить по содержанию галактуронанов в пересчёте на галактуроновую кислоту.
  8. Использование спектрофотометрического метода для количественного определения галактуронанов аира после реакции с карбазолом и концентрированной серной кислотой в присутствии сульфаминовой кислоты (0,16 моль/л) позволяет проводить измерения в присутствии нейтральных сахаров и, при валидации методики, дает приемлемые отклонения, позволяющие включить ее в состав Фармакопейной статьи предприятия «Аира болотного корневища».
  9. Полисахариды аира стимулируют активность и созревание опухоле-специфических Т- и В-лимфоцитов в условиях опухолевого роста и применения цитостатиков, не влияя на их пролиферацию.
  10. Одним из механизмов реализации антибластомного эффекта полисахаридов аира является активация антиген-презентирующих клеток по «классическому» типу и развитие Th1-типа иммунологического ответа.
  11. Разработанные методологические подходы определяют оптимальные пути реализации поиска, оценки эффективности и создания новых лекарственных средств комплексной терапии злокачественных новообразований на основе полисахаридов высших растений.

список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Монография:

  1. Полисахариды в онкологии / Е.П. Зуева, К.А. Лопатина, Т.Г. Разина, А.М. Гурьев. – Томск: Печатная мануфактура, 2010. – 108 с.

2. Патенты:

  1. Средство, на основе полисахаридов аира болотного, повышающее противоопухолевую и противометастатическую активность цитостатических препаратов : пат. 2308285 Рос. Федерация : МПК A61K36/882, A61P35/00 / Т.Г. Разина, А.М. Гурьев [и др.] – № 2005139073/15 ; заявл. 14.12.2005 ; опубл. 20.10.2007, Бюл. № 29.
  2. Средство, обладающее иммуностимулирующей активностью : пат. 2311918 Рос. Федерация : МПК A61K36/882, A61K125/00, A61P37/04 / Е.Ю. Шерстобоев, Н.В. Масная, Д.А. Климентова, К.А. Лопатина, Е.П. Зуева, А.М. Гурьев [и др.] – № 2006113347/15 ; заявл. 9.04.2006 ; опубл. 10.12.2007, Бюл. № 34.
  3. Средство, обладающее иммуномодулирующей активностью : пат. 2329821 Рос. Федерация, МПК A61K36/185, A61K31/715, A61P37/02 / Е.Д. Гольдберг, А.М. Дыгай, М.Г. Данилец, А.М. Гурьев [и др.] – № 2007109361/15 ; заявл. 14.03.2007 ; опубл. 27.07.2008, Бюл. № 21.
  4. Средство, обладающее иммуномодулирующей активностью : пат. 2337700 Рос. Федерация, МПК A61K36/28, A61K31/715, A61P37/02 / Е.Д. Гольдберг, А.М. Дыгай, М.Г. Данилец, А.М. Гурьев [и др.] – № 2007109200/15 ; заявл. 12.03.2007 ; опубл. 10.11.2008, Бюл. № 31.
  5. Средство, обладающее противоаллергическим действием : пат. 2337699 Рос. Федерация, МПК A61K36/28, A61K31/715, A61P37/08 / Е.Д. Гольдберг, А.М. Дыгай, М.Г. Данилец, А.М. Гурьев [и др.] – № 2007109359/15 ; заявл. 14.03.2007 ; опубл. 10.11.2008, Бюл. № 31.
  6. Средство, обладающее противоаллергическим действием : пат. 2379047 Рос. Федерация, МПК A61K36/48, A61K31/715, A61P37/08 / М.Г. Данилец, А.М. Гурьев [и др.] – № 2008124685/15 ; заявл. 16.06.2008 ; опубл. 20.01.2010, Бюл. № 2.
  7. Средство, обладающее противоаллергическим действием : пат. 2378004 Рос. Федерация, МПК A61K 36/48, A61K 31/715, A61P 37/08 / М.Г. Данилец, А.М. Гурьев [и др.] – № 2008124685/15 ; заявл. 16.06.2008 ; опубл. 20.01.2010, Бюл. № 2.
  8. Средство, снижающее гематотоксичность цитостатических препаратов / пат. 2397774 Рос. Федерация, МПК A61K36/28, A61P43/00 / К.А. Лопатина, Е.А. Сафонова, А.М. Гурьев [и др.] – № 2009123171/15 ; заявл. 17.06.2009 ; опубл. 27.08.2010, Бюл. № 24.

3. Статьи:

  1. Изменение состава эфирного масла при разных сроках хранения сырья / А.В. Ткачев, Е.А. Королюк, М.С. Юсубов, А.М. Гурьев // Химия растительного сырья. – 2002. – № 1. – С. 19–30.
  2. Аир болотный в комплексной терапии злокачественных новообразований / А.М. Гурьев [и др.] // Фармация. – 2003. – № 3. – С. 32–34.
  3. Растительные полисахариды в экспериментальной онкологии / К.А. Лопатина, Т.Г. Разина, Н.В. Шилова, А.М. Гурьев // Российский биотерапевтический журнал. – 2006. – Т. 5, № 1. – С. 17.
  4. Действие водорастворимых полисахаридов корневищ аира болотного на функциональную активность клеток лимфоузлов в условиях цитостатической терапии перевиваемой опухоли / К.А. Лопатина, А.М. Гурьев [и др.] // Сибирский онкологический журнал. – 2006. – № 3. – С. 59–63.
  5. Tkachev, A.V. Acorafuran, a new sesquiterpenoid from Acorus calamus essential oil / A.V. Tkachev, A.M. Guriev, M.S. Yusubov // Chemistry of Natural Compounds. – 2006. – Vol. 42, N 6. – С. 696–698.
  6. Влияние настойки эхинацеи пурпурной (Echinacea purpurea L.) и ее полисахаридного комплекса на эффективность цитостатической терапии перевиваемой опухоли / Т.Г. Разина, К.А. Лопатина, Е.П. Зуева, А.М. Гурьев [и др.] // Экспериментальная и клиническая фармакология. – 2007. – Т. 70, № 3. – С. 33–35.
  7. Растительные полисахариды в комплексной терапии перевиваемых опухолей / К.А. Лопатина, Т.Г. Разина, Е.П. Зуева, С.Г. Крылова, Е.Н. Амосова, А.М. Гурьев // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2007. – Т. 143, прил. 1. – С. 30–34.
  8. Водорастворимые полисахариды растений Сибири совместно с циклофосфаном в комплексной терапии перевиваемой опухоли Льюиса у мышей / К.А. Лопатина, Т.Г. Разина, Е.П. Зуева, С.Г. Крылова, Е.Н. Амосова, А.М. Гурьев А.М. // Растительные ресурсы. – 2008. – Вып. 2. – С. 108–116.
  9. Роль Р38 и PI38K в активации макрофагов водорастворимыми полисахаридами календулы и клевера / М.Г. Данилец, Ю.П. Бельский, Е.Г. Учасова, Н.В. Бельская, А.А. Лигачева, Е.С. Трофимова, А.М. Гурьев, [и др.] // Сибирский медицинский журнал. – 2008. – Т. 23, № 3. – Вып. 1. – С. 92.
  10. Влияние растительных водорастворимых полисахаридов на продукцию IgE и IgG1 / А.А. Лигачева, М.Г. Данилец, Н.В. Бельская, Ю.П. Бельский, Е.С. Трофимова, Е.Г. Учасова, А.М. Гурьев [и др.] // Сибирский медицинский журнал. – 2008. – Т. 23, № 3. – Вып. 1. – С. 102.
  11. Влияние водорастворимых полисахаридов девясила на продукцию NO и экспрессию аргиназы макрофагами мыши / Е.Г. Учасова, А.А. Лигачева, М.Г. Данилец, Н.В. Бельская, Ю.П. Бельский, Е.С. Трофимова, А.М. Гурьев [и др.] // Сибирский медицинский журнал. – 2008. – Т. 23, № 3. – Вып. 1. – С. 121–122.
  12. Влияние растительных водорастворимых полисахаридов на продукию иммуноглобулинов классов Е и G1 лимфоцитами мышей, стабилизированных овальбумином / М.Г. Данилец, Н.В. Бельская, Ю.П. Бельский, Е.Г. Учасова, Е.С. Трофимова, А.А. Лигачева, А.М. Гурьев [и др.] // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2008. – Т. 146, № 11. – С. 520–522.
  13. Противоатопическое действие полисахаридов аира / М.Г. Данилец, Н.В. Бельская, Ю.П. Бельский, Е.Г. Учасова, Е.С. Трофимова, А.А. Лигачева, А.М. Гурьев [и др.] // Российский аллергологический журнал. – 2009. – № 3. – Вып. 1. – С. 442.
  14. Влияние растительных полисахаридов на NO-синтазу и аргиназу макрофагов мыши / М.Г. Данилец, А.М. Гурьев [и др.] // Вестник Уральской медицинской академической науки. – 2009. – Т. 25, № 2. – С. 49–50.
  15. Исследование острой токсичности комплекса водорастворимых полисахаридов корневищ аира болотного (Acorus calamus L.) / А.М. Гурьев [и др.]// Бюллетень сибирской медицины. – 2010. – Т. 9, № 1. – С. 36–39.
  16. Исследование влияния длительного введения водорастворимых полисахаридов аира болотного (Acorus calamus L.) на состояние внутренних органов лабораторных животных (патоморфологические аспекты) / А.М. Гурьев [и др.] // Бюллетень сибирской медицины. – 2010. – Т. 9, № 3. – С. 57–64.
  17. Water-soluble polysaccharide obtained from Acorus calamus L.>
  18. Влияние полисахаридов из растительного сырья на Th1-зависимый иммунный ответ (скрининговое исследование) / М.Г. Данилец, Ю.П. Бельский, А.М. Гурьев [и др.] // Экспериментальная и клиническая фармакология. – 2010. – Т. 73, № 6. – С. 19–22.
  19. Исследование мутагенных свойств водорастворимых полисахаридов аира болотного / А.М. Гурьев [и др.] // Экспериментальная и клиническая фармакология. – 2010. – Т. 73, № 8. – С. 43–45.
  20. Снижение токсического эффекта паклитаксела на систему крови водорастворимыми полисахаридами мать-и-мачехи обыкновенной и аира болотного / Е.А. Сафонова, Т.Г. Разина, К.А. Лопатина, Е.П. Федорова, Е.П. Зуева, А.М. Гурьев // Сибирский онкологический журнал. – 2010. – № 2. – Вып. 38. – С. 42–46.
  21. Исследование влияния длительного введения водорастворимых полисахаридов аира болотного (Acorus calamus L.) на функциональные показатели лабораторных животных / А.М. Гурьев [и др.] // Бюллетень сибирской медицины. – 2010. – Т. 9, № 6. – С. 18–23.
  22. Количественное определение полисахаридов в корневищах аира болотного (Acorus calamus L.) / А.П. Корж, А.М. Гурьев [и др.] // Фармация. – 2011. – № 4. – С. 22–23.
  23. Водорастворимые полисахариды подземной части Inula helenium L. / А.П. Корж, А.М. Гурьев [и др.] // Растительные ресурсы. – 2011. – Вып. 3. – С. 88–92.

4. Публикации:

  1. Макрофаги как фармакологическая мишень для регуляции баланса Th1/Тh2 / М.Г. Данилец, Ю.П. Бельский, Н.В. Бельская, Е.С. Трофимова, Е.Г. Учасова, А.А. Лигачева, А.М. Гурьев [и др.] // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2008. – № 2, прил. 1. – С. 63–68.
  2. Корж, А.П. Содержание кислых моносахаридов в полисахаридном комплексе Inula helenium. / А.П. Корж, А.М. Гурьев // Вестник Российского Государственного медицинского университета. – 2011. – Спецвып. 1. – С. 178–179.
  3. Лопатина, К.А. Экстракт из корневищ аира болотного и его биологически активные вещества в экспериментальной онкологии / К.А. Лопатина, Т.Г. Разина, А.М. Гурьев // Сборник статей по материалам конференции «Современное состояние и перспективы развития экспериментальной и клинической онкологии». – Томск, 2004. – C. 202–203.
  4. Lopatina, K.A. The influence of preparation Echinacea purpurea L. and its polysaccharide complex on efficacy of cytostatic therapy of transplanted tumors / K.A. Lopatina, T.G. Razina, A.M. Guryev // Сборник статей по материалам «China-Russia International Conference on Pharmacology». – Harbin, China, 2005. - P. 26-27.
  5. Лопатина, К.А. Влияние водорастворимых полисахаридных комплексов растительного происхождения на эффективность цитостатической терапии перевиваемых опухолей / К.А. Лопатина, А.М. Гурьев // Сборник статей по материалам конференции «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической фармакологии»: – Томск, 2005. – С. 23-25.
  6. Лопатина, К.А. Способность полисахаридов из подорожника большого и липы сердцевидной повышать эффективность цитостатической терапии перевиваемой опухоли / К.А. Лопатина, А.М. Гурьев // Сборник статей по материалам конференции «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической фармакологии». – Томск, 2005. – С. 26-28.
  7. Фармакогностическое исследование аира болотного и перспективы создания на его основе новых лекарственных средств / А.М. Гурьев [и др.] // Сборник статей по материалам IV всероссийской научной конференции «Химия и технология растительных веществ». – Сыктывкар, 2006. – С. 242.
  8. Исследование иммунорегуляторных свойств полисахаридов из растительного сырья / М.Г. Данилец, Ю.П. Бельский, Е.С. Трофимова, Н.В. Бельская, Е.Г. Учасова, В.И. Агафонов, А.М. Гурьев, М.В. Белоусов // Сборник статей по материалам конференции «Создание новых лекарственных препаратов». – Томск, 2007. – С. 53-55.
  9. Растительные полисахариды в комплексной терапии перевиваемых опухолей / К.А. Лопатина, Е.П. Зуева, Т.Г. Разина, Е.Н. Амосова, С.Г. Крылова, А.М. Гурьев // Сборник статей по материалам II International Conference «Natural Products: Chemistry, Technology & Medicinal Perspectives». – Алматы, 2007. – С. 164.
  10. Химический состав водорастворимых полисахаридов из корневищ аира болотного / А.М. Гурьев [и др.]// Сборник статей по материалам II International Conference «Natural Products: Chemistry, Technology & Medicinal Perspectives». – Алматы, 2007. – С. 282.
  11. Лопатина, К.А. Коррекция нейтропенического эффекта паклитаксела у животных с перевиваемой опухолью / К.А. Лопатина, Е.А. Сафонова, А.М. Гурьев // Сборник статей по материалам конференции «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины». – СПб., 2010. – С. 71–72.
  12. Выделение и исследование строения водорастворимых полисахаридов из цветков календулы лекарственной Calendula officinalis L. / А.П. Корж, А.М. Гурьев [и др.] // Труды Томского государственного университета. – 2010. – Т. 275. – С. 275–277.
  13. Определение содержания уроновых кислот в полисахаридном комплексе мать-и-мачехи (Tussilago farfara L.) / А.П. Корж, А.М. Гурьев [и др.] // Вестник ПГФА. – 2010. – № 7. - С. 95-97.
  14. Гурьев, А.М. Полисахариды как регуляторы баланса Th1/Th2 при онкологических заболеваниях / А.М. Гурьев [и др.]// Сборник статей по материалам XVIII международной конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии». – Гурзуф, 2010. – С. 58–59.
  15. Определение содержания уроновых кислот в полисахаридах календулы лекарственной / А.П, Корж, А.М. Гурьев [и др.]// Cборник статей по материалам 68 конференции с международным участием «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины». – Волгоград, 2010. – С. 311–313.
  16. Выделение и исследование строения водорастворимых полисахаридов из цветков календулы лекарственной Calendula officinalis L. / А.П. Корж, А.М. Гурьев [и др.] // Сборник статей по материалам первой Всероссийской молодежной конференции «Фундаментальные и прикладные аспекты современной биологии». – Томск, 2010. – С. 60–61.
  17. Определение содержания уроновых кислот в полисахаридах Trifolium pratense L. / А.П. Корж, А.М. Гурьев [и др.] // Сборник статей по материалам международной конференции «Актуальные проблемы химии природных соединений». – Ташкент, 2010. – С. 244.
  18. Водорастворимые полисахариды корневищ с корнями Inula helenium / А.П. Корж, А.М. Гурьев [и др.]// Сборник статей по материалам конференции «66-я региональная конференция по фармации и фармакологии».– Пятигорск, 2011 – С. 121.
  19. Корж, А.П. Полисахариды Trifolium pretense L. / А.П. Корж, А.М. Гурьев // Сборник статей по материалам XII научно-практической конференции «Молодежь и медицинская наука в XXI веке». – Киров, 2011 – С. 198.
  20. Корж, А.П. Полисахариды Inula helenium / А.П. Корж, А.М. Гурьев // Сборник статей по материалам юбилейной научно-практической конференции молодых ученых «Медицина XXI века». – Новокузнецк, 2011. – С. 197-199.
  21. Корж, А.П. Водорастворимый полисахаридный комплекс Trifolium pratense L. / А.П. Корж, А.М. Гурьев // Сборник статей по материалам XIV Всероссийской медико-биологической конференции с международным участием «Фундаментальная наука и клиническая медицина – человек и его здоровье». – Санкт-Петербург, 2011. – C. 127–128.
  22. Корж, А.П. Выделение и исследование мономерного состава полисахаридного комплекса из травы Trifolium pratense L. / А.П. Корж, А.М. Гурьев // Сборник статей по материалам XII Российского конгресса молодых ученых с международным участием «Науки о человеке». – Томск, 2011. – С. 82–83.
  23. Изучение химической структуры водорастворимых полисахаридов некоторых растений Сибири / А.М. Гурьев [и др.] // Сборник статей по материалам XIX международной конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии». – Гурзуф, 2011. – С.175–177.

Автор выражает глубокую признательность и благодарность коллективам лаборатории онкофармакологии и лаборатории экспериментального биомоделирования НИИ фармакологии СО РАМН; заведующему лабораторией терпеноидов НИИ органической химии СО РАН (г.Новосибирск) доктору хим. наук, профессору А.В. Ткачеву, заведующей кафедрой фармакогнозии с курсами ботаники и экологии ГБОУ ВПО СибГМУ Минздравсоцразвития России доктору фарм. наук, профессору Г.И. Калинкиной и консультантам данной диссертационной работы: заведующему кафедрой химии ГБОУ ВПО СибГМУ Минздравсоцразвития России доктору хим. наук, профессору М.С. Юсубову и заведующему кафедрой фармации ФПК и ППС ГБОУ ВПО СибГМУ Минздравсоцразвития России доктору фарм. наук М.В. Белоусову.

ГУРЬЕВ АРТЕМ МИХАЙЛОВИЧ

Химико-фармакологическое исследование полисахаридов высших растений и Перспективы их использования в терапии злокачественных новообразований

14.04.02 фармацевтическая химия, фармакогнозия

14.03.06 фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора фармацевтических наук

Подписано к печати «___» __________2011 г.,

формат 60 х 84 1/16

Бумага книжно-журнальная.

Печать офсетная. Усл. печат. л. 3,0

Тираж 100 экз. Заказ № 142

ООО «Печатная мануфактура»

634055, Россия, г. Томск, ул. Королева, д. 4, оф. 81




© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.