WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


 

На правах рукописи

ЛЕПЛИНА Ольга Юрьевна

Характеристика  интерферон-альфа-индуцированных дендритных клеток и их терапевтический потенциал в лечении онкологических и инфекционных заболеваний

14.03.09 – Клиническая иммунология, аллергология

А В Т О Р Е Ф Е Р А Т

диссертации на соискание ученой степени

доктора медицинских наук

Новосибирск - 2011

Работа выполнена в Учреждении
Российской академии медицинских наук

Научно-исследовательском институте клинической иммунологии

Сибирского отделения  РАМН

Научный консультант:

доктор медицинских наук,
профессор       Елена Рэмовна Черных

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук,
профессор Анна Вениаминовна Шурлыгина

доктор медицинских наук Константин Валентинович  Гайдуль

доктор медицинских наук,
член-корреспондент РАМН  Ирина Соломоновна Фрейдлин

Ведущая организация: Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н. И. Пирогова, г. Москва

Защита состоится  «_22_»_декабря__2011 г. в__14.00_часов на заседании диссертационного совета Д 001.001.01 при НИИ клинической иммунологии СО РАМН по адресу:

630099, г. Новосибирск, ул. Ядринцевская, 14

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке  НИИ  клинической иммунологии СО РАМН по адресу:

(630099, г. Новосибирск, ул. Ядринцевская, 14)

Автореферат разослан  «____»_________________2011г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор  биологических наук                О.Т. Кудаева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ 

 

Актуальность темы. Дендритные клетки (ДК) являются профессиональными антигенпрезентирующими клетками (АПК), играющими центральную роль в поддержании врожденного иммунитета. Благодаря высокой экспрессии MHC антигенов I и II класса, костимуляторных молекул (CD80, CD86) и продукции широкого спектра цитокинов и хемокинов  ДК обладают способностью активировать наивные Т-клетки и индуцировать антигенспецифический иммунный ответ [Massard G. et al, 1996; Peters J. et al, 1996]. Наряду со способностью индуцировать активацию иммунокомпететных клеток, ДК могут также ингибировать иммунный ответ. Толерогенные/супрессорные свойства ДК обусловлены различными механизмами, в том числе способностью ДК экспрессировать  коингибиторные молекулы и рецепторы (B7-H1, ILT-2, ILT-3, ILT-4, CD209, CD200R и HLA-G),  продуцировать иммуносупрессивные цитокины (IL-10, TGF-), [Reichardt W. et al, 2008; Fedoric B. et al, 2008]  и индуцировать генерацию  регуляторных Т-клеток (СD4+СD25+Т рег) [Suciu-Foca N. et al, 2005]. Недавние исследования также показали, что ДК могут подавлять пролиферацию и оказывать непосредственный цитотоксический эффект на клетки опухолевых линий [Wesa A. et al, 2008, Chauvin C. et al, 2008]. Противоопухолевая активность ДК опосредуется с участием различных молекул семейства фактора некроза опухоли-альфа (TNF-, lymphotoxin-12, FasL, TRAIL), а также перфорина и/или гранзима  [Wesa A. et al, 2008;  Korthals M. et al, 2007] и имеет, по-видимому, большое значение, поскольку высвобождающиеся опухолевые антигены могут сразу же презентироваться дендритными клетками Т-лимфоцитам, обеспечивая запуск специфического иммунного ответа.

  Изменения в количественном содержании и функциональной активности ДК выявлены при многих заболеваниях [Duan X.Z. et al, 2005; Pinzon-Charry A. et al, 2005; Yang L. et al, 2004]. При этом снижение стимуляторной активности ДК рассматривается в качестве возможного механизма персистенции вирусной и бактериальной инфекции, а также ускользания опухоли от иммунного надзора [Della Bella S. еt al, 2006;  Zhang  Z. et al, 2006; Ulsenheimer A. et al, 2005; Chen L. et al,  2007], тогда как нарушение толерогенных свойств ДК при гестации чревато  угрозой преждевременного прерывания беременности [Scholz C. et al, 2008; Darmochwal-Kolarz D. et al, 2003].

Способность ДК индуцировать антигенспецифический иммунный ответ и наличие цитотоксической активности сделали эти клетки привлекательными кандидатами для иммунотерапии опухолевых и инфекционных заболеваний. Действительно, исследования на животных [Akbar S.M. et al, 2004] и клинические испытания у человека [Steinman R.M. et al, 2001; Mashino K. et al. 2004, Chen L. et al, 2005] показали, что вакцинация миелоидными ДК, презентирующими вирусные или опухолевые антигены, приводит к индукции специфического иммунного ответа, что сопровождается  положительным клиническим эффектом. С другой стороны, толерогенные ДК представляют интерес в плане лечения аутоиммунных заболеваний, патологии беременности и трансплантации органов и тканей [Lim D-S.  et al, 2009].

Изучению ДК и их клинической апробации во многом способствовала разработка методов генерации ДК in vitro. При этом выяснилось, что условия культивирования существенно влияют на свойства генерируемых ДК [Hart D.N. et al, 1997; Bender A. et al, 1996]. Традиционно ДК получают путем культивирования прилипающей фракции мононуклеарных клеток (МНК) в присутствии двух ключевых цитокинов - GM-CSF и IL-4 [Thurner B. et al, 1999]. Генерируемые таким образом незрелые миелоидные дендритные клетки (ИЛ4-ДК) обладают высокой способностью к захвату антигена, но слабой способностью активировать Т-клетки. Дальнейшее культивирование ДК в присутствии TNF-, IL-1, LPS,  CD40-лиганда или коктейля «дозревающих» стимулов ведет к созреванию ДК и  повышению их способности стимулировать Т-клеточный ответ [Jonuleit H. et al, 2007]. Однако генерируемые in vitro ИЛ4-ДК обладают низкой миграционной активностью и в условиях дефицита ростовых факторов могут подвергаться обратной трансформации в моноциты.

Наряду с традиционным протоколом, Santini с соавт. продемонстрировали, что частично зрелые ДК можно генерировать при замене IL-4 интерфероном- [Paquette R. et al, 1998;  Santini S. et al, 2000; Santini S. et al, 2003; Santini S. et al, 2009; Santini S. et al, 2005]. Интерферон- индуцированные ДК (ИФН-ДК) генерируются быстрее по времени, обладают высокой поглотительной активностью, сохраняют стабильность в отсутствие цитокинов и превосходят ИЛ4-ДК по миграционной активности, способности стимулировать CD8 Т-лимфоциты. Кроме того, ИФН-ДК индуцируют более сбалансированный иммунный ответ, поскольку наряду с выраженной Th1-стимулирующей способностью обладают умеренной Th2-стимулирующей активностью [Parlato S. et al, 2001; Santini S. et al, 2003; Carbonneil C. et al, 2004]. Учитывая также, что интерфероны способны усиливать цитотоксический потенциал ДК [Lu G. et al,  2002;  Chauvin C. et al, 2008; Papewalis C. et al, 2008] и ИФН-ДК по некоторым данным могут обладать более выраженной цитотоксической активностью [Korthals M. et al, 2007], применение этого типа ДК при опухолевых и вирусных заболеваниях представляется весьма перспективным.

Однако до сих пор свойства этих клеток (включая спектр и уровень продуцируемых ДК цитокинов, экспрессию поверхностных молекул и способность активировать Th1 и Th2 ответ), особенно активированных ИФН-ДК, охарактеризованы недостаточно. Практически отсутствуют сравнительные данные о цитотоксической и толерогенной активности ИЛ4-ДК и ИФН-ДК. Неисследованным остается также вопрос, насколько эффективно могут генерироваться ИФН-ДК при патологии и отличаются ли ИФН-ДК пациентов по функциональной активности. Наконец, большой интерес представляет клиническая апробация ИФН-ДК в качестве адьювантной клеточной терапии, направленной на активацию специфического иммунного ответа у больных  с опухолевыми и инфекционными заболеваниями.

В связи с вышеизложенным, была сформулирована цель работы:

на основании сравнительной характеристики ИФН-ДК и ИЛ4-ДК, анализе свойств ИФН-ДК при физиологических и патологических состояниях, оценке возможности их регуляции in vitro и клинической апробации у больных с внутримозговыми опухолями и хроническими вирусными инфекциями обосновать возможность использования ИФН-ДК  в лечении онкологических и  инфекционных заболеваний.  Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

  1. Провести сравнительную оценку поверхностных маркеров (стадиоспецифические, активационные, костимуляторные, коингибиторные, проапотогенные молекулы) в популяции ИФН-ДК и ИЛ4-ДК в группе здоровых доноров
  2. Провести сравнительное исследование функциональной активности ИФН-ДК и ИЛ4-ДК (продукция цитокинов в культурах ДК, аллостимуляторная активность ДК, Th1- и Th2 – стимулирующая активность ДК),  генерируемых у здоровых доноров.
  3. Оценить  цитотоксическую и цитостатическую активность ИФН-ДК и ИЛ4-ДК здоровых доноров против клеток опухолевых линий.
  4. Исследовать способность ИФН-ДК и ИЛ4-ДК к индукции регуляторных Т-клеток в смешанной культуре лимфоцитов.
  5. Охарактеризовать поверхностные маркеры и функциональную активность ИФН-ДК у больных с онкологическими заболеваниями (злокачественные опухоли головного мозга, гемобластозы).
  6. Исследовать фенотипические и функциональные свойства ИФН-ДК у больных с хроническими инфекционными заболеваниями (хронические вирусные гепатиты В и С, туберкулез легких)
  7. Исследовать in vitro влияние цитокинов и иммуноактивных факторов (интерлейкин-2, смесь провоспалительных цитокинов, полиоксидоний, двуцепочечная ДНК человека) на аллостимуляторную активность и цитотоксический потенциал ИФН-ДК у больных с  онкологическими и инфекционными заболеваниями.
  8. Изучить фенотипические и функциональные свойства ИФН-ДК у женщин с физиологической гестацией и беременных с надпочечниковой гиперандрогенией.
  9. Оценить влияние гормона дегидроэпиандростерона сульфата на экспрессию поверхностных маркеров и функциональную активность ИФН-ДК доноров.
  10. Оценить безопасность и эффективность иммунотерапии с использованием ИФН-ДК в лечении больных злокачественными опухолями головного мозга.
  11. Провести апробацию ИФН-ДК-вакцин у больных с хроническими вирусными инфекциями (хронический гепатит В, герпесвирусная инфекция).

Научная новизна

Исследование свойств LPS-активированных интерфероном-α ДК в сравнении со стандартно генерируемыми ИЛ4-ДК показало, что популяция ИФН-ДК характеризуется более высоким содержанием клеток, экспрессирующих CD14, СD11c/CD123 и TRAIL, и меньшим количеством CD83+ клеток. При этом ИФН-ДК отличаются более высокой продукцией IFN-, IL-2, IL-17, IL-1, IL-10, IL-5, G-CSF и MCP-1, более активно индуцируют генерацию CD3+IFN+ T-клеток и способны активировать CD3+IL4+ Т-клетки. Кроме того, ИФН-ДК проявляют более выраженную цитостатическую активность против TRAIL-чувствительных опухолевых клеток и более высокую цитотоксическую активность в культурах TRAIL-резистентных опухолевых клеток. Сравнение способности ИФН-ДК и ИЛ4-ДК индуцировать регуляторные Т-клетки позволило получить новые данные о толерогенном/супрессорном потенциале анализируемых ДК. В частности, показано, что в отсутствие активации LPS интактные ИФН-ДК индуцируют не только генерацию СD4+FoxP3+, но также СD8+FoxP3+ и СD4+IL-10+- клеток, тогда как после активации LPS, ИФН-ДК теряют способность индуцировать генерацию СD4+FoxP3+- и обладают сходной с ИЛ4-ДК стимулирующей активностью в отношении СD8+FoxP3+ и СD4+IL-10+-клеток. В работе впервые исследована возможность генерации и свойства ИФН-ДК при различных онкологических и инфекционных заболеваниях. Продемонстрировано, что популяция ДК больных с онкопатологией (злокачественные внутримозговые опухоли, злокачественные лимфомы, множественная миелома) и хроническими инфекционными заболеваниями (хронические вирусные гепатиты В и С, туберкулез легких) отличается повышенным содержанием незрелых ДК и ДК промежуточной степени зрелости и уменьшением зрелых ДК; смещением баланса продуцируемых цитокинов в сторону Th2/противовоспалительных цитокинов; снижением аллостимуляторной активности; уменьшением стимулирующей активности в отношении CD3+IFN+ T-клеток и/или усилением способности активировать CD3+IL4+ Т-клетки и угнетением цитотоксической противоопухолевой активности (у больных с онкопатологией). Причем выраженность указанных изменений существенно варьирует при различных нозологических формах патологических состояний. Впервые изучены свойства ИФН-ДК, генерируемых у женщин с физиологической и осложненной беременностью. Показано, что ИФН-ДК при физиологической беременности отличаются признаками незрелости, смещением баланса продуцируемых цитокинов в сторону Th2-цитокинов, снижением аллостимуляторной и доминированием Th2-стимуляторной активности и наличием цитотоксической активности против активированных NK-клеток. В то же время ИФН-ДК беременных с надпочечниковой гиперандрогенией (с повышенным уровнем ДГЭАС) обладают более зрелым фенотипом ДК, сохранной аллостимуляторной активностью и способностью активировать Th1-ответ. При этом анализ влияния ДГЭАС на ИФН-ДК in vitro позволил получить новые данные о стимулирующем влиянии ДГЭАС на дифференцировку/созревание ИФН-ДК, продукцию IFN- и TNF-, Th1-стимуляторную активность ДК и ингибирующем эффекте на способность ИФН-ДК индуцировать гибель CD56+CD16+ клеток. Впервые проведена клиническая апробация вакцин на основе ИФН-ДК и показана их безопасность и эффективность в индукции иммунного и клинического ответа у больных злокачественными опухолями головного мозга и хроническими вирусными инфекциями (хронический гепатит В и герпесвирусная инфекция)

Теоретическая и практическая значимость

Сравнение фенотипа клеток в популяциях LPS-активированных ИФН-ДК и ИЛ4-ДК позволило выявить ряд особенностей, которые свидетельствуют о менее зрелом, «промежуточном» фенотипе ИФН-ДК и их более высоком цитотоксическом потенциале, ассоциированном с экспрессией молекулы TRAIL. В свою очередь, выявленные функциональные отличия ИФН-ДК, в частности, их более высокая цитокин-продуцирующая активность и способность к индукции CD3+IFN+ Т-клеток при сохранении умеренной Th2-стимуляторной активности, а также более высокая цитостатическая и цитотоксическая активность против опухолевых клеток при сходной способности к индукции регуляторных Т-клеток, указывают на более высокий потенциал ИФН-ДК в индукции/опосредовании иммунного ответа. Выявленные при онкологических и инфекционных заболеваниях фенотипические и функциональные изменения ИФН-ДК свидетельствуют о нарушении дифференцировки/созревания ДК и снижении их способности индуцировать и опосредовать реакции клеточного иммунитета при данных патологических состояниях. При этом взаимосвязь нарушений ИФН-ДК со степенью злокачественности (у больных ЗОГМ) и угнетением антигенспецифического ответа (у больных ТБ) свидетельствует о патогенетической значимости дисфункций ДК при данных патологиях. Исследования свойств ИФН-ДК при физиологической и осложненной надпочечниковой гиперандрогенией беременности показало, что в условиях физиологической гестации ИФН-ДК приобретают толерогенные/супрессорные свойства, которые утрачиваются на фоне повышенного уровня ДГЭАС при надпочечниковой гиперандрогении. При этом способность ДГЭАС индуцировать in vitro созревание ДК и активировать их иммуностимулирующую активность свидетельствует о важной роли гормонов в регуляции ИФН-ДК, и в частности значении ДГЭАС в ослаблении толерогенных/супрессорных свойств ДК. Выявленные отличительные  свойства ИФН-ДК обосновывают перспективы их использования в качестве ДК-вакцин для иммунотерапии. При этом установление принципиальной возможности генерации ИФН-ДК у больных с онкологическими и инфекционными заболеваниями, а также возможности коррекции дисфункций ИФН-ДК, в частности, усиление их аллостимуляторной активности и повышение  цитотоксической активности in vitro c помощью различных медиаторов/соединений (интерлейкин-2, полиоксидоний, двуцепочечная ДНК человека), является важной составляющей практической значимости работы. Значение работы в прикладном аспекте заключается также в разработке протокола иммунотерапии на основе ИФН-ДК и его клинической апробации у больных со злокачественными опухолями головного мозга и хроническими инфекциями (хроническим вирусным гепатитом В и герпесвирусной инфекцией). При этом полученные результаты о хорошей переносимости и отсутствии побочных эффектов/осложнений при проведении иммунотерапии на основе ИФН-ДК, а также данные об индукции  специфического иммунного ответа, который сопровождается улучшением показателей качества жизни/выживаемости у больных со злокачественными внутримозговыми опухолями, прекращением репликации вируса/нормализации биохимической активности (соответственно, в 22 и 55%) при хроническом вирусном гепатите В и увеличением продолжительности безрецидивного периода при хронической герпесвирусной инфекции свидетельствуют о безопасности и терапевтическом потенциале ИФН-ДК-вакцин и обосновывают принципиальную возможность их использования в лечении онкологических и инфекционных (вирусных) заболеваний человека.

  Основные положения, выносимые на защиту:

  1. Активированные ИФН-ДК отличаются от ИЛ4-ДК менее зрелым фенотипом, повышенной экспрессией проапоптогенных молекул, а также более высоким уровнем продукции цитокинов (с преобладанием Th1/провоспалительных цитокинов), Th1- стимуляторной и цитотоксической активности.
  2. При онкологических и инфекционных заболеваниях ИФН-ДК имеют признаки задержки дифференцировки/созревания и нарушения функциональной активности, наличие и выраженность которых существенно варьирует в зависимости от нозологической формы заболевания и может корригироваться in vitro рядом цитокинов или иммуноактивных факторов.
  3. ИФН-ДК являются мишенями гормональной регуляции и опосредуют иммуностимулирующий эффект ДГЭАС, повышенный уровень которого у беременных с гиперандрогенией обусловливает снижение толерогенного потенциала ДК, характерного для физиологической беременности.
  4. Использование ДК-вакцин характеризуется хорошей переносимостью, является безопасным, приводит к индукции специфического иммунного ответа, что сопровождается улучшением показателей качества жизни/выживаемости у больных со злокачественными внутримозговыми опухолями; прекращением репликации вируса/нормализации биохимической активности при хроническом вирусном гепатите В и увеличением продолжительности безрецидивного периода при хронической герпесвирусной инфекции.

Апробация работы

Основные результаты работы доложены и обсуждены на конференциях: Всероссийской научно-практической конференции «Многопрофильная больница: проблемы и решения», Ленинск-Кузнецкий, 2003 г, на 14-ой научно-практической конференции врачей «Актуальные вопросы современной медицины», Новосибирск, 2004 г, на Всероссийском научном симпозиуме «Цитокины, стволовая клетка, иммунитет. Новосибирск, 2005 г, на  15-й научно-практической конференции «Актуальные вопросы современной медицины». Новосибирск, 2006 г; на международном конгрессе  «International conference  Basic Science for Biotechnology and Medicine», Новосибирск 2006 г, на Всероссийской научно-практической конференции «Дни иммунологии в Сибири» в Красноярске  2005 г, 2006 г; в Томске 2008 г; на 11 Всероссийском научном форуме «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» - 2007 г; на  III Международной конференции "Фундаментальные науки - медицине" Новосибирск 2007 г; на 2nd World Conference on Magic Bullets Celebrating the 100th Anniversary of the Nobel Prize Award to Paul Ehrlich. Nrnberg 2008; на Объединенном иммунологическом форуме – Санкт-Петербург 2008 г, на Всероссийской научной конференции «Молекулярно-генетические основы функционирования цитокиновой  сети в норме  и при патологии», Новосибирск 2010г.

  Публикации

По теме диссертации опубликовано 64  печатных работы, в том числе 20 статей в центральной печати, получен 1 патент.

Объем и структура диссертации

Диссертация написана в традиционном стиле и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 9 глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов, заключения и выводов. Материал изложен на 255 страницах машинописного текста, включающего 49 таблиц, 17 рисунков, 3 схемы. Прилагаемая библиография содержит ссылки на 300 литературных источника, в том числе 287 иностранных. Работа выполнена в лаборатории клеточной иммунотерапии НИКИ СО РАМН, руководитель – профессор Черных Е.Р. в рамках НИР 032: «Структурно-функциональная характеристика клеток иммунной системы и разработка  клеточных биотехнологий иммунодиагностики и иммунотерапии инфекционно-воспалительных, аутоиммунных, аллергических и онкологических заболеваний», НИР 037: «Разработка новых клеточных технологий в лечении онкологических, аутоиммунных и инфекционных заболеваний человека на основе изучения биологических свойств и молекулярно-генетических механизмов регуляции стволовых и иммунокомпетентных клеток», грантов РФФИ №09-04-00525-а «Гормонально-опосредованная регуляция толерогенной активности дендритных клеток» и №07-04-00967 «Роль дегидроэпиандростерона сульфата в регуляции дифференцировки, созревания и функциональной активности дендритных клеток», гранта ФЦП  госконтракт № 14.740.11.0007. - «Разработка технологии создания индивидуальных вакцин на базе инновационных подходов генерации дендритных клеток с использованием интерферона для лечения онкологических и инфекционных (вирусных) заболеваний человека».

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Характеристика больных, включенных в исследование. Диссертационная работа основана на результатах клинико-иммунологического обследования 145 доноров крови и больных с онкологическими (94) и инфекционными (142) заболеваниями. Группа пациентов с онкологическими заболеваниями включала 68 больных с внутримозговыми опухолями, в том числе  46 больных со злокачественными опухолями головного мозга (ЗОГМ) и 22 - с опухолями низкой степени злокачественности и 26 пациентов со злокачественными лимфомами (ЗЛ), включая 5 пациентов с лимфомой Ходжкина, 7 больных с агрессивными вариантами неходжкинских лимфом и 14 пациентов с множественной миеломой (ММ). В группу с инфекционными заболеваниями вошли 37 пациентов с хроническими вирусными гепатитами В (ХВГВ, n=18) и С (ХВГС, n=19), у 15 из которых диагностировался цирроз печени (ЦП) как исход хронической вирусной инфекции; 90 больных туберкулезом легких (ТБ) и 15 пациентов с герпесвирусной инфекцией. Кроме того, в исследование были включены 60 женщин с физиологической беременностью и 36 беременных с гиперандрогенией надпочечникового генеза (все беременные со сроком гестации до 22 недель).

Иммунологические исследования.

Мононуклеарные клетки (МНК) периферической крови выделяли стандартным методом и в концентрации 0,1×106/лунку культивировали в 96-луночных круглодонных планшетах для иммунологических исследований в полной культуральной среде RPMI-1640 при 37°С в СО2–инкубаторе. Для стимуляции клеток использовали  конканавалин А (КонА, Sigma, 15 мкг/мл), рекомбинантный IL-2 (50 ЕД/мл, Ронколейкин, ООО «Биотех», Санкт-Петербург), ППД (очищенный дериват туберкулина, РАО «Биопрепарат», Санкт-Петербург) в концентрации 50 мкг/мл, лизат опухолевых клеток (0,01- 0,1мг/мл ), специфический рекомбинантный антиген HSV1gD  (НПО «Диагностические системы», г.Нижний Новгород) 5 мкг/мл, HВs Ag (вакцинальный АГ «Энджерикс В» Смит-Кляйн-Бичем-Биомед, Бельгия) 5 мкг/мл.

  Дендритные клетки генерировали путем культивирования прилипающей фракции МНК в присутствии GM-CSF (Sigma-Aldrich, 40 нг/мл), INF-α (Роферон-А, Roche, Швейцария, 1000 Ед/мл) – ИФН-ДК и в присутствии GM-CSF и IL-4 (Sigma-Aldrich, 40 нг/мл) – ИЛ4-ДК течение 3 и 5 сут, соответственно. На последующие 24 ч в качестве дозревающего стимула вносился LPS  (Е.colli 0114:B4, Sigma-Aldrich, 10 мкг/мл). Влияние ДГЭАС (Sigma-Aldrich, кат. № D5297) на фенотип и функциональную активность ДК оценивали, добавляя гормон (10-6М) либо в начале культивирования, либо на стадии дозревания за 24 ч до окончания культивирования.

Оценку поверхностных маркеров проводили методом проточной цитофлуориметрии, используя меченные фикоэритрином (PE) анти-СD1а, анти-СD123 мАТ (BD PharMingen, США), анти-СD14, анти-CD16 мАТ (Сорбент, Москва), меченные АРС анти-СD11с мАТ (BD PharMingen, США), меченныеFITC анти-CD25, анти-СD83, анти-CD80, анти-CD86 мАТ (BD PharMingen, США) и анти-HLA-DR мАТ (Сорбент, Москва).

Оценку способности ДК к эндоцитозу проводили методом проточной цитофлюориметрии по захвату FITC-декстрана (мол. вес 40 000, Sigma).

Аллостимуляторную активность ДК  оценивали в реакции смешанной культуры лимфоцитов (СКЛ). В качестве отвечающих клеток использовались МНК доноров (0,1х106/лунку), стимуляторами служили дендритные клетки в соотношении 10:1 и 100:1. Пролиферативный ответ оценивался на 3-5 сут радиометрически по включению 3H-тимидина (1 мкКю/лунку), вносимого за 18 ч до окончания культивирования

Продукцию цитокинов (IL-1, IL-6, IL-7, IL-8, IL-12p70, TNF-, IFN-, IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, IL-13, IL-17, G-CSF, GM-CSF, MCP, MIP-1) в цельных культурах ДК оценивали методом проточной цитофлюориметрии на 2-х лучевом лазерном автоматизированном анализаторе (Bio-Plex Protein Assay System, Bio-Rad, США) с использованием коммерческих тест-систем 17Plex (определяемый динамический диапазон  2 – 32000 пкг/мл) В отдельной серии экспериментов концентрацию цитокинов TNF-, IL-4, IFN-, IL-6 («Вектор-Бест», Новосибирск) и IL-10 («Цитокин»; Санкт-Петербург) определяли методом иммуноферментного анализа.

Определение внутриклеточной экспрессии цитокинов в CD3+-популяции лимфоцитов периферической крови проводили методом трехцветной проточной цитометрии (FACSCalibur, Becton Dickinson) с использованием APC-меченных моноклональных анти-CD3-антител, FITC-коньюгированных анти-INF-γ и PE-меченных анти-IL-4 антител.

Оценку клеточного цикла в различных субпопуляциях NK-клеток проводили с помощью окрашивания клеток Aсtinomycin D, 7-Amino (50 мкг/мл, Calbiochem, Германия) методом проточной цитофлюориметрии. Уровень клеточного цикла оценивали среди CD56+СD16+ клеток в популяции МНК, культивированных в течение 24 ч в отсутствие и присутствии интактных или ДГЭАС-модифицированных ИФН-ДК.

Цитостатическую активность ДК в отношении опухолевых клеток оценивали по способности ДК ингибировать пролиферацию клеток опухолевых линий HEp-2 (клетки эпителиальной карциномы гортани человека), Jurkat (T-клеточная лимфома), U-87 (клетки глиобластомы человека). Интенсивность пролиферации оценивали по включению 3Н-тимидина (1 мКю/лунку), вносимого за 18 ч до окончания культивирования. Индекс влияния ДК (ИВДК) рассчитывали как отношение пролиферативного ответа в опыте к контролю, а цитостатическую активность ДК определяли по формуле (1-ИВДК) х 100%. Цитотоксическую активность оценивали по лизису клеток-мишеней дендритными клетками в соотношениях 40:1, 20:1 и 10:1. Процент цитотоксичности рассчитывали по формуле: [1 - (имп/мин в культурах с эффекторными клетками/имп/мин в контрольных культурах в отсутствие эффекторных клеток)] x 100% .

Толерогенные свойства ДК оценивали по их способности индуцировать регуляторные Т-клетки в алло-СКЛ при совместном культивировании ДК с аллогенными МНК в соотношении 1:10. Относительное содержание CD4+FoxP3+, CD8+FoxP3+ и CD4+IL-10+ клеток в культурах оценивали на 5 сутки методом проточной цитофлюориметрии

Клинические испытания иммунотерапии (ИТ) с использованием ИФН-ДК были проведены в соответствии с разработанным протоколом, утвержденным Ученым советом Института (протокол №1, апрель 2003г.) и одобренным локальным этическим комитетом. В исследование были включены 32 человека (основная группа) с гистологически верифицированным диагнозом внутримозговых опухолей высокой степени злокачественности, включая 20 пациентов с анапластической астроцитомой (Grade III) и 12 пациентов с глиобластомой (GradeIV), которым оперативное лечение и радиотерапия были дополнены иммунотерапией с использованием ДК. ИТ включала курс адоптивной иммунотерапии и курс вакцинаций дендритными клетками согласно разработанному патенту «Способ комбинированной иммунотерапии злокачественных опухолей головного мозга» (патент на изобретение № 2262941 от 27.10.2005). Антигенный материал (лизат опухолевых клеток) для нагрузки ДК получали из фрагмента аутологичной опухоли больного, в результате 5-кратного замораживания/размораживания суспензии опухолевых клеток, и использовали в концентрации 0,1 мг/мл по белку. Исследование общего состояния включало изучение общемозговой симптоматики и оценку индекса качества жизни.

Клинические испытания иммунотерапии в лечении инфекционных заболеваний проводились в дизайне открытого проспективного пилотного исследования с контролем «до-после» в соответствии с разработанными протоколами, утвержденными Ученым советом Института (протокол № 6 от 26 сентября 2006 г для ХВГВ и протокол №9 от 11 декабря 2007 для герпесвирусной инфекции) и одобренными локальным этическим комитетом. Группа пациентов составляла 9 больных ХВГВ и 7 женщин с орофациальной локализацией герпетической инфекции. ИТ включала два курса вакцинации дендритными клетками. Первый -4-6 вакцинаций ИФН-ДК, нагруженных HВs Ag (вакцинальный АГ «Энджерикс В» Смит-Кляйн-Бичем-Биомед, Бельгия) или рекомбинантными антигенами вируса герпеса HSV1gD (НПО «Диагностические системы», г.Нижний Новгород) c 2-недельным интервалом. Второй курс - 3-6 вакцинаций с кратностью 1 раз в месяц. Количество ДК на одну вакцинацию – 5-х106. При проведении вакцинаций в качестве адьюванта использовался ронколейкин в дозе 250 000. Ед. Интенсивность антигенспецифического ответа оценивали на 3 сут по пролиферации МНК больных в ответ на стимуляцию Hbs Ag антигеном (5 мг/мл) либо HSV1gD антигеном в отсутствие и присутствии ронколейкина (100 Ед/мл). Неспецифический ответ оценивали по пролиферации МНК в ответ на стимуляцию  конканавалином А. 

Реакцию гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) in vivo оценивали по выраженности кожной пробы в ответ на введение лизата опухолевых клеток. Реакцию ГЗТ in vitro оценивали в модифицированном тесте миграции лейкоцитов в ответ на аналогичную стимуляцию клеток лейковзвеси.

  Статистическая обработка полученных результатов проводилась методами описательной, параметрической и непараметрической статистики на персональном компьютере с использованием программы «STATISTICA 6.0».

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Отправной точкой исследования стало сравнительное исследование фенотипа LPS-активированных ИФН-ДК и ИЛ4-ДК. Поскольку дифференцировка моноцитов в ДК сопровождается закономерной сменой фенотипов, в частности, появлением молекулы СD1а и утратой СD14, а созревание ДК ассоциировано с экспрессией молекул CD83 и СD25 и утратой СD1а, а также усилением экспрессии молекул HLA-DR и CD86, оценка указанных маркеров послужила основой фенотипического анализа (табл.1).

Таблица 1

Фенотипическая характеристика  ИЛ4-ДК и ИФН-ДК

Маркер

ИЛ4-ДК (n=14)

ИФН-ДК (n=14)

M ± SE

Median

LQ – UQ

M ± SE

Median

LQ– UQ

CD14

11,1 ± 2,4

8,0

3 – 19

22,2 ± 3,6*

23,0

10 – 27

CD83

52,8  ±  6,2 

47,4

36 – 51

34,6 ± 3,7 *

36,0

22 – 46

СD86

58,3 ± 3,6

50,0

49 – 62

65,2 ± 4,2

54,0

48 – 71

CD25

29,4  ±  2,6

27,8

14 – 38

25,1 ± 3,5

26,0

13 – 36

СD1a

48,8  ± 2,3 

38,2

28 – 54

10,4 ± 2,0 *

10,0

7,5 – 11

CD123

6,7 ± 1,8

6,1

2 – 12

40,1 ± 3,4 *

36,5

25 – 49

HLA-DR

91,8 ± 7,4

89,4

80 – 97

86,4 ± 9,2

90,1

76 - 92

Примечание: относительное содержание (%) различных субпопуляций ДК представлено в виде средних (M±SE.),  медианных (Median) и диапазона 25-75% квартильных значений (LQ – UQ). * рt< 0,01 - достоверность различий показателей (t-критерий Стьюдента для связанных выборок)

ИФН-ДК были сходны с ИЛ4-ДК по количеству CD86, HLA-DR и CD25-позитивных клеток, однако содержали большее количество CD14 и меньшее - CD83 клеток, т.е. имели менее зрелый - промежуточный фенотип. Значительная доля ИФН-ДК экспрессировала молекулу CD123, что также указывало на меньшую зрелость, поскольку экспрессия данного маркера снижается по мере дифференцировки миелоидных ДК. Промежуточный фенотип ИФН-ДК подтверждался также их достаточно высокой фагоцитарной активностью, в частности, способностью поглощать FITC-меченный декстран, Так 74,9±6,2% интактных ДК активно поглощали FITC-декстран, но и после активации дозревающим стимулом (LPS) доля клеток с внутриклеточным содержанием FITC-декстрана оставалась высокой (62,0±8,6%).

Исследование поверхностных молекул, способных опосредовать цитотоксическую и/или супрессорную активность ДК  (табл. 2), показало, что как интактные, так и LPS-стимулированные ИФН-ДК отличались более высокой экспрессией цитотоксической молекулы TRAIL. Интактные ИФН-ДК содержали большее количество B7-H1–позитивных и меньшее  HLA-G –позитивных клеток. Однако после активации LPS экспрессия B7-H1 на ИФН-ДК снижалась, и эти клетки уже не отличались от ИЛ4-ДК по экспрессии толерогенных молекул.

Таблица 2

Экспрессия TRAIL, B7-H1 и HLA-G молекул на ИЛ4-ДК и ИФН-ДК

Маркер

ИЛ4-ДК

ИФН-ДК

(0)

LPS(+)

(0)

LPS(+)

TRAIL (n=12)

10,6±1,1

8,8±1,9

18,3±2,0 *

16,1±1,6 *

B7-H1  (n=12)

27,5±4,7

36,0±5,7 #

37,3±3,4 *

27,5±4,7 #

HLA-G  (n=8)

16,3±4,9

7,1±2,0 #

8,5±1,4 *

10,0±1,9

Примечание:относительное содержание (%) интактных и LPS-активированных ДК, экспрессирующих соответствующие маркеры, представлено в виде средних значений (M ± SE), # рU < 0,05 - достоверность различий  интактных и LPS-активированных ДК, *рU<0,05 - достоверность различий ИФН-ДК и ИЛ4-ДК (U–критерий Вилкоксона-Манна-Уитни).

Исследование функциональной активности ДК включало оценку продукции цитокинов в культурах ДК, аллостимуляторной и Th1/Th2-стимуляторной активности ДК по их способности индуцировать в СКЛ возрастание количества IFN- и IL-4-продуцирующих Т-клеток, а также продукции  Th1- и Th2 цитокинов. Культуры ИФН-ДК характеризовались более высоким содержанием  IFN-, IL-2, IL-1, TNF-, IL-17, а также более высоким уровнем IL-10 и IL-5. т.е. ИФН-ДК могли более активно стимулировать Th1 и Th2 ответ (табл. 3). При этом соотношение концентрации TNF-/IL-10 в супернатантах ИФН-ДК 2-кратно превышало аналогичный показатель в культурах ИЛ4-ДК, свидетельствуя о доминировании провоспалительного потенциала. Наконец, ИФН-ДК отличались более высокой продукцией G-CSF и MCP-1, но более низким уровнем IL-12p70 и IL-7, что могло указывать на более высокую способность рекрутировать моноциты и поддерживать их выживаемость, но меньшую эффективность в поддержании гомеостатической пролиферации.

Таблица 3

Продукция цитокинов дендритными клетками, генерированными в присутствии IL-4 и IFN-

Цитокины

(пг/мл)

ИЛ4-ДК (n=17)

ИФН-ДК (n=17)

M ± S.E.

Median

M ± S.E.

Median

Th1/провоспалительные цитокины

IFN-

3326 ± 1270

1406

4916 ± 1707 *

2277

IL-2

828 ± 102

830

1177 ± 78 *

1121

  Окончание таблицы 3

IL-1

274 ± 55

197

503 ± 47 *

456

TNF-

11605 ± 3281

8504

19980 ± 2684 *

19806

IL-12(p70)

796 ± 196

504

435 ± 61 **

300

IL-17

402 ± 48

433

489 ± 19 *

480

Th2/противовоспалительные цитокины

IL-5

13,1 ± 2,0

10

41,4 ± 14,2 **

22

IL-6

28082 ± 3249

34561

35580 ± 1412

38135

IL-10

496 ± 210

181

658 ± 138 *

422

IL-13

178 ± 40

145

133 ±  16

109

Факторы иммуногемопоэза

IL-7

44,2 ± 2,3

48

38,4 ± 1,6 *

38

G-CSF

3884 ± 1500

1378

4291 ± 512 *

4045

Хемокины 

IL-8

26514 ± 759

27962

27606 ± 46

27697

MCP-1

11254 ± 1760

11453

29167 ± 1598 **

28948

MIP-1

15539 ± 519

16285

16274 ± 8

16285

Примечание: представлены средние (M±SE) и медианные (Median) значения концентрации цитокинов (пг/мл) в супернатантах цельных культур ДК. * рU < 0,05,  **  рU < 0,01  - достоверность различий значений между ИФН-ДК и ИЛ4-ДК (U–критерий Вилкоксона-Манна-Уитни).

Сравнение аллостимуляторной активности не выявило различий ИЛ4-ДК и ИФН-ДК (18625±909 и  18922±1743, соответственно, n=14). Вместе с тем ИФН-ДК более активно стимулировали генерацию IFN--продуцирующих Т-клеток, т.е. активировали Th1-клетки и в отличие от ИЛ4-ДК обладали умеренной Th2-стимуляторной активностью (табл. 4).

Таблица 4

Содержание Т-клеток с внутриклеточной экспрессией  IFN- и  IL-4 в культурах СКЛ, индуцированных ИЛ-4-ДК и ИФН-ДК

% клеток

СКЛ, индуцированная

ИЛ-4ДК (n=21)

СКЛ, индуцированная

ИФН-ДК (n=21)

ДК(-)

ДК(+)

ИВДК

ДК(+)

ИВДК

CD3+Т-IFN-+

1,8±0,11

7,5±0,6*

4,9±0,8

10,5±0,5*#

11,1±2,2#

CD3+Т- IL-4+

1,75±0,2

2,96±0,42

1,9±0,37

5,1±0,6*#

4,8±1,7#

Примечание: данные представлены в виде средних (M±SE), ИВДК – индекс влияния ДК, рассчитанный по формуле: ИВДК = ДК(+)/ДК(-), * - достоверность различий показателей по сравнению с контролем, #  - достоверность различий  между ИФН-ДК и ИЛ4-ДК (pU <0,05, U- критерий Вилкоксона-Манна-Уитни).

Сравнение концентрации различных цитокинов в СКЛ, индуцированной ИЛ4-ДК или ИФН-ДК, также показало, что ИФН-ДК более активно стимулируют Т-клетки к продукции IFN, IL-5 и MIP-1, что дополнительно свидетельствует о более выраженной способности этих клеток стимулировать Th1 и Th2 ответ, а также хемоаттрактивную активность Т-клеток.

       Учитывая, что ИФН-ДК характеризуются повышенной экспрессией TRAIL и более высокой продукцией IL-10, на следующем этапе было проведено сравнительное исследование цитотоксической/статической активности анализируемых ДК против опухолевых клеток, а также их способности индуцировать регуляторные Т-клетки. ИФН-ДК обладали более высокой цитотоксической активностью против TRAIL-чувствительных клеток Jurkat и более высоким цитостатическим эффектом против TRAIL-резистентных клеток НЕр-2 (рис. 1).

Рисунок 1. Цитотоксическая активность ИФН-ДК и ИЛ4-ДК здоровых доноров против опухолевых линий НЕр-2 (A)  и Jurkat (Б)

Представлены средние значения (M±SE) цитотоксической активности ДК против опухолевых клеток линий Jurkat и НЕр-2, n=9,  *- pU<0,05 - достоверность различий между цитостатической активностью ИФН-ДК и ИЛ4-ДК (U - критерий Вилкоксона-Манна-Уитни).

Оценка способности ДК индуцировать генерацию Трег в СКЛ показала, что в отсутствие LPS стимуляции интактные ИФН-ДК обладали более высоким толерогенным/супрессорным потенциалом, поскольку стимулировали генерацию всех трех типов Трег. (CD4+FoxР3+. CD8+FохP3+ CD4+IL10+). В то же время после активации LPS ИФН-ДК теряли способность индуцировать CD4+FoxР3+ Т-клетки и не отличались от ИЛ4-ДК по способности стимулировать генерацию CD8+FохP3+ и CD4+IL10+ Т-лимфоцитов. Таким образом, LPS-активированные ИФН-ДК не отличались по толерогенному потенциалу от ИЛ4-ДК (табл. 5).

Таблица 5

Сравнительная характеристика  процентного содержания регуляторных

клеток, индуцированных  ИЛ-4ДК и ИФН-ДК в СКЛ

% клеток

МНК

СКЛ, индуцированная

ИЛ4-ДК(n=12)

СКЛ, индуцированная ИФН-ДК(n=14)

ДК(0)

ДК(LPS)

ДК(0)

ДК(LPS)

CD4+FохP3+

3,7±0,4

6,9 ± 0,9*

4,8 ± 0,6

7,1±0,8*

5,8±0,8*

CD8+FохP3+

6,6±1,7

7,7 ± 1,6

10,1 ± 2,0*

14,7±2,5*#

13,4±2,6*

CD4+IL-10+

2,2±0,5

2,3±0,6

5,0 ± 1,8*

4,6±0,6*,#

5,6±0,9*

Примечание: представлены средние значения (M±SE) относительного содержания клеток (%) в СКЛ, индуцированной ИЛ4-ДК либо ИФН-ДК. ДК(0) – интактные, ДК(LPS)-после добавления дозревающего стимула. МНК-свежевыделенные МНК периферической крови, *- PU<0,05 – статистические различия по сравнению с МНК периферической крови, # - pU<0,05 –различия ИФН-ДК по отношению к ИЛ4-ДК, (U- критерий Вилкоксона-Манна-Уитни)

       Суммируя полученные, данные можно заключить, что,  несмотря на активацию LPS, ИФН-ДК сохраняют промежуточный фенотип и высокую поглотительную активность, отличаются более высоким провоспалительным и цитотоксическим потенциалом, более эффективно и сбалансированно активируют Т-клетки к продукции цитокинов 1 и 2 типа и при этом не обладают повышенной толерогенной активностью, что обосновывает перспективы использования данного типа клеток в качестве клеточных вакцин. Поэтому следующим этапом работы явилась оценка возможности генерации и характеристика свойств ИФН-ДК у больных с онкологическими и инфекционными заболеваниями.

ИФН-ДК больных злокачественными опухолями головного мозга (ЗОГМ) характеризовались повышенным содержанием CD14+ и CD1а+ клеток, включая незрелые-(CD1а+CD83-) и промежуточные (CD83+CD1а+/СD123+ CD11c+) ДК, а с другой стороны - снижением доли CD83+ и CD25+ ДК. ИФН-ДК у больных лимфомами также отличались признаками задержки дифференцировки и созревания. Эти изменения были наиболее выражены у больных злокачественными лимфомами (ЗЛ), что проявлялось  снижением доли зрелых (СD83+), в том числе терминально дифференцированных (CD83+CD1a-), активированных (CD25+) ДК и увеличением ДК с незрелым (CD14+/CD1a+/CD1а+CD83-) и промежуточным (CD83+CD1a+) фенотипом. В то же время у больных множественной миеломой (ММ) ИФН-ДК фенотипически не отличались по структуре от таковых у здоровых доноров (рис. 2). 

Рисунок 2. Фенотипическая характеристика ИФН-ДК у  больных онкологического профиля

Представлены  средние значения (М±SE) относительного содержания субпопуляций ДК (%)* -pU<0,05 – достоверность различий по сравнению с донорами, U – критерий Вилкоксона-Манна-Уитни.

Сравнение цитокин-продуцирующей функции показало, что культуры ДК у больных ЗОГМ не отличались по уровню продукции Th1 и Th2 цитокинов, у больных ЗЛ характеризовались снижением IFN- и повышением IL-10, у больных ММ - только усилением продукции IL-10. Аллостимуляторная активность ДК больных ЗОГМ не отличалась от таковой у доноров, тогда как у больных ЗЛ была существенно снижена. Угнетение аллостимуляторной активности у пациентов ММ было выражено существенно в меньшей степени. При этом ДК больных ЗОГМ и ММ обладали сходной с донорами Th1-стимуляторной активностью и не индуцировали Th2 ответ, тогда как ДК больных ЗЛ имели повышенную Th2-стимуляторную  активность (табл. 6).

Таблица 6

Функциональные особенности ИФН-ДК у больных онкологического профиля

 

Доноры

ЗОГМ

ЗЛ

ММ

Продукция цитокинов

(пг/мл) - IFN-

113 ± 55

146 ± 39

35 ± 17 *

127± 35,0

-  IL-10

82 ± 12

153 ± 48

444 ± 59 *

110 ± 12,3 *

Аллостимуляторная активность (имп/мин)

12877± 1109

11494± 1400

3825 ± 852*

7093± 913 *

Th1-стимулирующая  активность (ИВДК)CD3+T-IFN+

5,4 ± 1,1

3,9 ± 1,2

5,4 ± 1,4

5,5 ± 1,4

Th2-стимулирующая  активность (ИВДК)CD3+T-IL-4+

2,7 ± 0,25

1,3 ± 0,24

4,2 ± 0,6 *

2,0 ± 0,2

Примечание: данные представлены в виде средних (M±SE),  ИВДК – индекс влияния ДК, * - достоверность различий показателей по сравнению с донорами  (pU <0,05, U- критерий Вилкоксона-Манна-Уитни)

       Отличительным свойством ДК у больных глиомами явилось также снижение цитотоксической активности против опухолевых клеток линии HЕp-2 (рис. 3А).

А  Б

Рисунок 3. Цитотоксическая активность ИФН-ДК у онкологических больных

А - представлены средние значения (M±SE) цитотоксической активности ДК против опухолевых клеток линий НЕр-2, *- pU<0,05 - достоверность различий между цитостатической активностью доноров и больных ЗОГМ(n=28), # pU<0,05-достоверность различий доноров и больных ЗЛ (n=9), (U - критерий Вилкоксона-Манна-Уитни)

Б - представлены средние значения(M±SE) цитотоксической активности ДК против опухолевых клеток линий НЕр-2 у больных ЗОГМ разной степени злокачественности (n=16) *- pU<0,05 - достоверность различий

Анализ пациентов с учетом степени злокачественности опухолей показал выраженную гетерогенность цитотоксического потенциала. При этом снижение цитотоксической активности ДК было характерно для пациентов с высокой степенью злокачественности (Grade III-IV), тогда как больные с опухолями низкой степени злокачественности (Grade I-II)  характеризовались сохранной цитотоксической активностью (рис. 3Б). Снижение цитотоксической активности ДК наблюдалось также у больных злокачественной лимфомой.

Исследования ИФН-ДК у больных с инфекционными заболеваниями выявило сходные закономерности. Так, ДК больных хроническими вирусными гепатитами имели признаки задержки созревания и активации ДК, повышенный уровень продукции IL-10, угнетение аллостимуляторной активности и повышение Th-2 стимуляторной активности. Эти признаки  регистрировались у больных  гепатитом С, максимально проявлялись у пациентов с циррозом печени (независимо от типа инфекции) и практически не наблюдались у пациентов с хроническим гепатитом В (табл. 7).

Таблица 7

Характеристика ИФН-ДК  у больных хронической  вирусной инфекцией

Параметры

Доноры

HBV

HCV

HBV+ ЦП

HCV + ЦП

Фенотип - CD25 (%)

25,5±3,5

17,7±3,0*

16,6±3,7*

15,2±4,8*

11,0±3,2

Продукция цитокинов (пг/мл)  -IFN

94 ± 46

250 ± 87

146 ± 42

58 ± 12

214 ± 18

-IL-10

82 ± 13

122 ± 34

566 ± 99 *

124 ± 24

584 ± 112*

Аллостимуляторная

активность (имп/мин)

12820±1110

9020 ±1020

13895±1870

7200 ±987*

3220 ±584*

Th1-стимулирующая  (ИВДК)CD3+T-FN+

5,0 ± 1,0

4,5 ± 0,6

3,9 ± 0,9

3,9 ± 1,1

2,8 ± 1,1*

Th2-стимулирующая  (ИВДК)CD3+T-IL-4+

1,8 ± 0,6

1,9 ± 0,8

1,7 ± 0,7

2,9 ± 0,1 *

2,7 ± 0,7 *

Примечание: данные представлены в виде средних (M±SE), ИВДК – индекс влияния ДК, * - достоверность различий показателей по сравнению с донорами (pU <0,05, U- критерий Вилкоксона-Манна-Уитни).

ДК больных ТБ (табл. 8) также характеризовались признаками меньшей зрелости, о чем свидетельствовало более высокое содержание CD14+ клеток в исследуемых культурах и снижение числа зрелых активированных ДК, экспрессирующих CD25+-молекулу. Кроме того, ИФН-ДК больных отличались повышенной продукцией IL-10 и IL-6, угнетением аллостимуляторной активности, снижением способности активировать IFN-γ-продуцирующие Т-клетки и усилением Th2-стимуляторной активности. Эти изменения были более выражены в группе пациентов со сниженным антигенспецифическим ответом на ППД  (табл. 8).

Таблица 8

Характеристика ИФН-ДК у больных туберкулезом легких

Параметр

Доноры

Больные ТБ

Больные туберкулезом

ППД(+)

ППД(-)

Фенотип (%) CD14

CD25

8,7 ± 1,4

25,1 ± 3,5

19,6 ± 2,5*

9,6 ± 1,2*

12,2 ± 2,7*

8,8 ± 1,3*

30,0 ± 5,4*

12,1 ± 2,9*

Продукция цитокинов (пг/мл)  - IFN 

  - IL-10

  - IL-6

110 ± 60

121 ± 56

9248 ± 2487

19 ± 1,6*

500 ± 50 *

12950 ± 795*

20 ± 2,1 *

411 ± 68*

13468 ±859

14 ± 3,7 *

604 ± 64 *

10685 ±1953

Аллостимуляторная

  активность (имп/мин)

12820 ± 1192

4200 ± 192

6230 ± 124

1890 ± 47

Th1-стимулирующая

(ИВДК) CD3+T-IFN+

5,0 ± 1,0

4,8 ± 0,9

2,4 ± 0,3 *

1,3 ± 0,2 *

Th2-стимулирующая

(ИВДК) CD3+T-IL-4+

1,8 ± 0,6

1,3 ± 0,2

1,6 ± 0,1

2,8 ± 0,3 *

Примечание: данные представлены в виде средних (M±SE), ИВДК – индекс влияния ДК, * - достоверность различий показателей по сравнению с донорами (pU <0,05, U- критерий Вилкоксона-Манна-Уитни).

Обнаруженные нами изменения фенотипа и функций ИФН-ДК при онкопатологии и инфекционных заболеваниях ставят вопрос о полноценности генерируемых ДК при использовании их в качестве клеточных вакцин и разработке подходов к коррекции нарушений ДК, генерируемых у больных с онкопатологией и инфекционными заболеваниями. Поэтому с целью изучения возможности коррекции функциональной активности ДК было проанализировано влияние различных иммуноактивных факторов на аллостимуляторную активность ДК, полученных от больных злокачественными лимфомами и туберкулезом легких. В качестве потенциальных модуляторов использовались рекомбинантный интерлейкин-2 человека («Ронколейкин»), сополимер N-окси-1,4-этиленпиперазина и (N-карбоксиэтил)-1,4-этиленпиперазиний бромида («Полиоксидоний»), комплекс провоспалительных цитокинов («Суперлимф») и двуцепочечная ДНК человека («Панаген»). Добавление указанных факторов на этапе созревания к ДК больных злокачественной лимфомой и ТБ повышало исходно низкий уровень аллостимуляторной активности. При этом ДК больных ТБ отличались меньшей чувствительностью к рИЛ-2 и ДНК, чем ДК больных ЗЛ (табл. 9).

Таблица 9

Влияние иммуноактивных факторов на аллостимуляторную активность пациентов злокачественной лимфомой

Пролиферативная активность в СКЛ (имп/мин)


ЗЛ (n=14)

ТБ (n=19)

МНК (спонтан)

575 ± 44

687 ± 75

МНК+ДК(0)

3178 ± 325

5331 ± 638

МНК+ДК (+)рИЛ-2 (100ЕД/мл)

12211 ± 977*

10562 ± 2491 *

МНК+ДК(+)полиоксидоний (2 нг/мл)

5771 ± 472

6281 ± 798*

Окончание таблицы 9

МНК+ДК(+)суперлимф (20 нг/мл)

5014 ± 361*

-

МНК+ДК(+) панаген (5 мкг/мл)

7433,3 ± 357,4*

5861,5 ± 948,4

Примечание: представлены средние значения (M±SE) пролиферативной активности в СКЛ. Респондеры – аллогенные МНК, стимуляторы -интактные (ДК0) и предобработанные ДК (+), *-PU<0,05- достоверность различий показателей по отношению к культурам ДК(0), U-критерий Вилкоксона-Манна-Уитни.

Наряду с аллостимуляторной активностью, важным свойством ДК, особенно в аспекте их использовании в качестве противоопухолевых вакцин, является прямая противоопухолевая цитотоксическая активность. Выявление дефектности указанной функции у больных с глиомами головного мозга высокой степени злокачественности и пациентов злокачественными лимфомами побудило исследовать возможность стимуляции цитотоксической активности ДК in vitro с помощью анализируемых факторов. Как следует из данных таблицы 10, анализируемые факторы усиливали исходно сниженную цитотоксическую активность ДК больных ЗОГМ и ЗЛ против клеток линии  Hep-2. Таким образом, стимуляция ДК в культуре in vitro рядом иммуноактивных препаратов позволяет частично или полностью восстановить сниженную цитотоксическую активность ДК у больных онкологическими заболеваниями.

Таблица 10

Влияние иммуноактивных факторов на цитотоксическую активность ДК больных ЗОГМ (Grade IV) и ЗЛ против клеток линии НЕр-2

Больные ЗОГМ

(Grade IV) (n=8)

Больные ЗЛ  (n=7)

(%)

ИВ

  (%)

ИВ

ДК (0)

8 ± 2,5

-

29 ± 8,4

-

ДК (+р-ИЛ-2 100 Ед/мл))

27 ± 4,7*

7,5 ± 2,6

30 ± 4,8

2,1 ± 1,2

ДК (+панаген 5 мкг/мл)

16 ± 2,9 *

6,1 ± 3,7

31 ± 3,9

2,3 ± 1,3

ДК(+полиоксидоний 2 нг/мл)

20 ± 4,3*

7,4 ± 4,1

30 ± 3,3

1,8 ± 0,8

Примечание: представлены средние значения (M±SE) цитотоксической активности ДК (%) больных ЗОГМ (Grade IV) и ЗЛ в присутствии различных иммуностимулирующих факторов в МТТ-тесте, ИВ- (индекс влияния) – отношение цитотоксичности в присутствии  стимулов к ДК (0)*-рU<0,05 – достоверность различий по сравнению с ДК (0), U - критерий Вилкоксона-Манна-Уитни.

Полученные выше данные продемонстрировали, что, несмотря на выраженную способность к стимуляции Th1-ответа, ИФН-ДК могут обладать супрессорной/толерогенной активностью. При онкологических и инфекционных заболеваниях данная активность ДК является неблагоприятным фактором. Однако толерогенная активность ДК может играть позитивную роль в индукции иммунологической толерантности при беременности, при этом функции ДК могут быть подвержены гормональной регуляции. Проведенные нами ранее исследования показали, что угроза прерывания беременности при надпочечниковой гиперандрогении (ГА) сопряжена с дефектом супрессорной перестройки [Селедцова и др., 2006 г]. Учитывая стимулирующее действие дегидроэпиандростерон сульфата (ДГЭАС) на Th1-ответ и NK-клетки [Powell J.M. et al, 2006] и экспрессию на ДК рецепторов к стероидным гормонам, можно предположить, что физиологическая беременность ассоциирована с доминированием толерогенной активности дендритных клеток, тогда как у беременных с ГА ДК проявляют иммуностимулирующую активность, индуцированную ДГЭАС. Соответственно, следующий раздел был посвящен сравнительному исследованию ДК при физиологической гестации и у беременных с ГА, а также оценке влияния ДГЭАС на созревание и функции ИФН-ДК in vitro (табл. 11).

Таблица 11

Особенности ИФН-ДК при физиологической беременности и беременности, осложненной гиперандрогенией

Параметр

Женщины

(n=20)

Физиологическая

беременность (n=18)

Беременные ГА (n=18)

Фенотип  (%)  СD83

CD25 

23 ± 4,1

23 ± 4,1

11 ± 1,2*

9 ± 1,3*

26 ± 1,8 #

27 ± 2,9 #

Продукция цитокинов (пг/мл)

- IFN

- IL-4

340 ± 63

92 ± 5

33 ± 7*

174 ± 17*

2303 ± 518 * #

31 ± 8 * #

Аллостимуляторная активность (ИВ)

24 ± 3,9

8 ± 0,9*

22 ± 8,7#

Th1-стимулирующая активность(ИВДК)CD3+IFN+

5,2 ± 0,9

1,1 ± 0,2*

2,0 ± 0,4*#

Th2-стимулирующая  активность (ИВДК)CD3+IL-4+

1,3 ± 0,2

3,5 ± 0,4*

2,4 ± 0,5*

Продукция в СКЛ(ИВ) - IFN

  - IL-4

22 ± 3,1

2,0 ± 1,0

3,4 ± 0,9*

4,6 ± 2,2*

13,3 ± 3,1*

5,4 ± 2,0*#

Апоптоз CD16CD56

4.2 ± 0,6

21,5 ± 3,8

-

Примечание: данные представлены в виде средних значений (M±SE), ИВДК – индекс влияния ДК, * - достоверность различий показателей по сравнению со здоровыми женщинами, # - достоверность различий по сравнению с физиологической беременностью, (pu <0,05, u- критерий Вилкоксона-Манна-Уитни).

По сравнению с небеременными женщинами ДК беременных отличались меньшим содержанием CD83+ - и CD25+- клеток, сниженной продукцией IFN-γ и повышенной – IL-4, меньшей аллостимуляторной активностью, отсутствием способности индуцировать генерацию IFN- продуцирующих Т-клеток и продукцию IFN- и повышенной способностью индуцировать IL4-продуцирующие клетки и секрецию IL-4. Следует отметить, что одним из интересных проявлений толерогенной активности ДК беременных была их способность индуцировать апотоз активированных NK-клеток, что, видимо, объясняет снижение количества этих клеток при беременности. По сравнению с физиологической гестацией ДК беременных с ГА  характеризовались нормальной экспрессией CD83- и CD25, более высокой продукцией IFN-γ и низкой – IL-4, сохранной аллостимуляторной активностью и, наряду с Th2-стимуляторной активностью, индуцировали возрастание числа IFN- продуцирующих клеток и секрецию  IFN- в СКЛ (табл. 11).

Эффект ДГЭАС на экспрессию поверхностных маркеров оценивался в культурах ДК, генерируемых из периферической крови женщин с физиологической беременностью. Добавление ДГЭАС в культуры ДК на этапе дозревания (совместно с LPS)  приводило к значимому возрастанию доли CD1a+,  CD83+ и CD25+ ДК (таблица  12) , усилению аллостимуляторной активности (9354±1916 в присутствии ДГЭАС против 4640±1007 в отсутствие гормона) и индуцировало появление Th1-стимулирующей активности.

Таблица 12

Влияние дегидроэпиандростерона сульфата на дифференцировку и созревание ИФН-ДК беременных женщин

СD маркер (%)

В отсутствие ДГЭАС (n=10)

В присутствии ДГЭАС (10-6М)

В течение всего периода генерации ДК (n=10)

На стадии дозревания ДК (n=10)

CD83

17,0 ± 2,4

17,5 ± 2,8

21,5 ± 3,1**

CD1а

4,1 ± 0,3

4,9 ± 0,7

6,3 ± 0,8*

CD11с

18,4 ± 2,8

19,6 ± 3,0

19,3 ± 3,0

CD123

21,6 ± 3,4

23,0 ± 3,8

21,5 ± 4,1

CD14

14,3 ± 2,2

12,8 ± 1,9

14,4 ± 2,2

CD25

8,8 ± 2,2

9,4 ± 1,6

12,0 ± 2,1*

Примечание: данные представлены в виде  средних значений (M±S.E); *рU<0,05, **рU<0,01 - достоверность различий по сравнению с ДК, полученными в стандартных условиях (U- критерий Вилкоксона-Манна-Уитни)

Так, концентрация  IFN-  в культурах СКЛ, индуцированных ДГЭАС-модифицированными  ДК более чем в 2 раза превышала таковую в культурах СКЛ, индуцированных интактными ДК (344±160 против 144±90 пг/мл; (n=14); рU <0,05), т.е. гормон индуцировал свойства, характерные  для  ДК беременных с ГА. Обработка ДК ДГЭАС приводила также к ослаблению проапоптогенной активности ИФН-ДК, т.е. их способности индуцировать апоптоз CD16+CD56+ клеток (с 4,1±0,7 до 21,1±5,0%; pU<0,05). Аналогичным образом ДГЭАС влиял и на ДК доноров, т.е. стимулировал созревание ДК и усиливал их Th1-стимуляторную активность. Тем не менее, ДК беременных обладали большей чувствительностью к стимулирующему эффекту гормона. Так, в культурах ДК доноров  ДГЭАС практически не влиял на аллостимуляторную активность (18780 ± 1190 имп/мин в отсутствие ДГЭАС против 19910 ± 1870 имп/мин в присутствии ДГЭАС) и не менял баланса цитокинов.

Полученные данные свидетельствуют о том, что ДГЭАС может оказывать иммуностимулирующий эффект опосредованно через ДК, индуцируя их дифференцировку/созревание, усиливая Th1 стимуляторную активность и подавляя способность индуцировать апоптоз NK-клеток.

Следующий этап работы  был посвящен клинической апробации ИФН-ДК в лечении больных ЗОГМ и хроническими вирусными инфекциями (ХВГВ и герпесвирусная инфекция). Клинические испытания безопасности и эффективности иммунотерапии  (ИТ) с использованием ИФН-ДК были проведены на базе ФГУ НИИТО Росмедтехнологий в период с 2003 до 2007 гг в соответствии с разработанным протоколом, утвержденным Учеными советами Института клинической иммунологии и ФГУ НИИТО Росмедтехнологий (протокол № 1, апрель 2003 г) и одобренным локальным этическим комитетом. Клинические испытания проводились в дизайне пилотного контролируемого нерандомизированного исследования с историческим контролем. Основным критерием эффективности служило развитие антигенспецифического  противоопухолевого иммунного ответа, дополнительным - улучшение  показателей выживаемости и качества жизни. ИТ как дополнение к оперативному лечению и радиотерапии проводилась 32 пациентам (основная группа). Группу сравнения (исторический контроль) составил 91 пациент, которые получали хирургическое лечение и радиотерапию. ИТ включала курс адоптивной иммунотерапии (2-кратное локорегиональное введении лимфокин-активированных киллерных клеток и цитотоксических Т-клеток в ложе удаленной опухоли) и курс вакцинотерапии (6 подкожных инъекций ДК, нагруженных опухолевыми антигенами, в дозе 5-10х106/введение с кратностью вакцинаций – 1 раз в 2 недели  в сочетании с подкожным введением Ронколейкина в дозе 250000 МЕ). Проводимая терапия характеризовалась хорошей переносимостью, поскольку не вызывала выраженных цитокиновых реакций и ухудшения общемозговой симптоматики, а также каких-либо осложнений, связанных с интрацеребральным введением клеток и вакцинацией пациентов.

Таблица 13

Индукция антиген-специфического ответа в процессе вакцинации дендритными клетками больных злокачественными глиомами

До вакцинации

После трех вакцинаций

После шести вакцинаций

Спонтанная пролиферация

425 ± 74

321 ± 88

666 ± 145

Опухолевый АГ

0,01 мг/мл

663 ± 154

(1,65 ± 0,4)

363 ± 121

(1,3 ± 0,3)

5170 ± 1507 *

(10,9 ± 4,9)

Примечание: представлены средние значения пролиферативного ответа (имп/мин) МНК больных (n=10) на специфический опухолевый антиген. В скобках - индексы влияния (отношение  индуцированной  антигеном пролиферации к спонтанной пролиферации), *- рU<0,05 – достоверность различий по сравнению с состоянием до начала вакцинаций (U – критерий Вилкоксона-Манна-Уитни).

При этом ИТ с использованием ИФН-ДК сопровождалась индукцией антигенспецифического иммунного ответа. Об этом свидетельствовало существенное возрастание пролиферативного ответа МНК на опухолевые антигены после 3, и особенно после 6 вакцинаций (табл. 13). Кроме того, развитие иммунного ответа подтверждалось появлением положительной кожной пробы на опухолевые антигены в реакции ГЗТ. Так, исходно кожная проба на ОА была отрицательной у всех 25 обследованных пациентов. В то же время после 3 и 6 иммунизаций положительная кожная проба регистрировалась у 7 (28%) и 16 (64%) пациентов, соответственно. При этом значительных различий среди пациентов с опухолями Grade IV и Grade III не наблюдалось. При статистическом анализе показателей выживаемости в сравниваемых группах оказалось, что относительное количество выживших больных в основной группе к исходу 12, 24 и 36 мес. было достоверно выше, чем в группе сравнения (65,6%, 50%, 37% против 48,4%, 23%, 7,7%, соответственно). Анализ кривых выживаемости у пациентов с глиобластомой и анапластической астроцитомой показал, что выживаемость больных, получивших ИТ, в обеих группах была достоверно выше, чем у больных при проведении стандартного лечения (рис.4). Показатель продолжительности жизни больных глиомами Grade III составил в основной группе 30,7±3,1 мес, что значимо превышало таковую в группе сравнения (20,0±2,3; р 2=0,01). Средняя продолжительность жизни в основной группе больных Grade IV составила 12,8±1,9 мес, что также значимо превышало аналогичный показатель в группе исторического контроля (7,2±0,28 мес; р=0,002). При сравнении показателей качества было установлено, что при равных исходных значениях индекса Карновского показатели  качества жизни через 6, 12 и 24 мес. в основной группе были достоверно выше (84 ± 1,4; 86 ± 1,6; 91 ± 2,3 балла), чем  в группе сравнения (66 ± 1,6; 66 ± 1,8 и 61 ± 3,7 баллов, соответственно).

А  Б

Рисунок 4.  Показатели выживаемости (мес) больных глиомами

А - Grade III- Основная  группа - пунктирная линия, группа сравнения сплошная линия. Достоверность различий кривых – р=0,001. Б - Grade IV. Достоверность различий кривых – р=0,009

Таким образом, ИТ больных ЗОГМ с использованием ИФН-ДК показала хорошую переносимость и отсутствие побочных токсических реакций, а также возможность индуцировать иммунный ответ, что ассоциировалось с улучшением показателей выживаемости и качества жизни пациентов

Апробация ДК-вакцин у больных хроническими вирусными инфекциями была проведена в дизайне открытых проспективных пилотных исследований с контролем «до-после» в группе 9 пациентов хроническим вирусным гепатитом В (ХВГВ) и 7 больных с герпесвирусной инфекцией в соответствии с протоколами (протокол № 6 от 26 сентября 2006 г. для ХВГВ и протокол № 9 от 11 декабря 2007 г. для герпесвирусной инфекции). Отбор больных и лечение проводились  на базе  отделения иммунологии Клиники Института клинической иммунологии СО РАМН в период с сентября 2006 по ноябрь 2008 г. Основным критерием эффективности лечения у больных гепатитом служило прекращение репликации вируса, дополнительными - нормализация биохимических показателей и индукция антигенспецифического ответа. У больных герпесвирусной инфекцией основным критерием эффективности являлось удлинение межрецидивного периода после завершения 2-х курсов ИТ, дополнительным – индукция антигенспецифического ответа. Иммунотерапия включала два курса: первый состоял из 4-6 вакцинаций ИФН-ДК, нагруженными рекомбинантными вирусными антигенами (HВsAg - вакцинальный АГ «Энджерикс В» Смит-Кляйн-Бичем-Биомед, Бельгия и рекомбинантный антиген вируса герпеса -HSV1gD, соответственно) c 2-недельным интервалом. Второй курс - 4-6 вакцинаций с кратностью 1 раз в месяц. Количество ДК на одну вакцинацию составляло 5х106 клеток.

В группе больных с ХВГВ к моменту завершения исследования 2 из 9 больных гепатитом имели полный стабильный ответ (прекращение репликации вируса и нормализация биохимических показателей), у 3 пациентов отмечалось временное прекращение репликации вируса, сопровождающееся устойчивой нормализацией биохимической активности. ИТ сопровождалась достоверным усилением антигенспецифического ответа, который сохранялся повышенным до 6 мес после завершения терапии. При этом у больных не отмечалось усиления биохимической активности, а также исходно сохранной митогенной реактивности или реактивности к IL-2 (табл. 14).

Таблица 14

Динамика пролиферативного ответа МНК больных ХВГВ на HВs-антиген

Пролиферативная активность (имп/мин)

МНК(0)

МНК(АГ+)

МНК(IL2+)

МНК(IL2+АГ)

КонА(15 мкг/мл)

До лечения

272±65

354±109

2624±532(

3632±881

34379±6071

После 1 курса ИТ

296±51

424±51

2406±541

4393±82

40185±6525

После 2 курса ИТ

183±98

695±220*

2892±892

3506±934

36830±7689

Через 6 мес.п/е ИТ

215±96

956±289*

2987±789

3870±987

39879±8950

Примечание: данные представлены в виде средних значений пролиферативного ответа (М±SE) МНК больных ХВГВ в отсутствие антигена (МНК0), в присутствии АГ- МНК(АГ+), интерлейкина-2 в дозе 100 Ед/мл МНК(IL2+) и сочетания стимулов МНК(IL2+АГ), *-достоверность различий по отношению к МНК(0), рU<0,01, U-критерий Вилкоксона-Манна-Уитни

Как известно, стандартная противовирусная терапия у больных ХВГВ не всегда позволяет достичь прекращения репликации вируса и нормализации биохимических показателей. С этой точки зрения активация специфического иммунного ответа с помощью иммунизации ДК, нагруженными HВs-антигеном, может рассматриваться в качестве дополнительной стратегии противовирусной терапии.

  У больных герпесвирусной инфекцией ИТ с использованием ДК сопровождалась достоверным увеличением межрецидивного периода за время лечения (9 мес) и 6-месячного срока последующего наблюдения. При анализе клинической эффективности у больных герпесвирусной инфекцией было показано достоверное уменьшение числа обострений на фоне лечения (4,0±0,7 против 5,93±0,48 эпизодов до лечения; рU<0,05) и в течение последующих 6 месяцев наблюдения (2,4±0,97; рU<0,05). Соответственно, межрецидивный период на фоне терапии возротал до 81,6±13,8 дней, и в период 6 мес наблюдения после терапии составил 67,1±16,2 дня, что было достоверно выше соответствующего показателя до лечения (18,7±3,2; pU<0,05) При этом у 3 пациентов после лечения не было зарегистрировано ни одного обострения, а у остальных 4-х обострения протекали более мягко, с меньшей площадью высыпаний и менее выраженной интоксикацией. Исследование антигенспецифического и митогениндуцированного пролиферативного ответа в культурах МНК больных показало, что исходно пациенты с герпесвирусной инфекцией характеризовались сниженным уровнем Кон-А стимулированной пролиферации и отсутствием реактивности при стимуляции вирусным антигеном. Проведение ИТ сопровождалось достоверным усилением антигенспецифического ответа, который сохранялся повышенным до 6 мес после завершения терапии. Кроме того, у больных отмечалось значимое усиление исходно сниженной митогенной реактивности на конканавалин А (табл. 15).

Таблица  15

Динамика пролиферативного ответа МНК больных на HSV1gD антиген и конканавалин А

Пролиферативная активность (имп/мин)

  МНК(0)

МНК(АГ+)

МНК(КонА+)

До лечения

198 ± 44

208,1 ± 44

12314 ± 1840

После 1 курса ИТ

167 ± 45

932,0 ± 280*

16444 ± 2861

После 2 курса ИТ

150 ± 27

598 ± 222*

25979 ± 4453*

Через 6 мес после ИТ

208 ± 43

1196 ± 552*

64450 ± 18050*

Примечание: данные представлены в виде средних значений пролиферативного ответа (М±SE) МНК больных герпесвирусной инфекцией в отсутствие (МНК0) и в присутствии АГ - МНК(АГ+), *-достоверность различий, рU<0,05, U-критерий Вилкоксона-Манна-Уитни

  Таким образом, ИТ хронических вирусных инфекций с использованием ДК позволяет уменьшить число рецидивов и, соответственно, увеличить продолжительность безрецидивного периода, а также снизить тяжесть рецидивов, что сопряжено с активацией специфического и неспецифического иммунного ответа.


ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенное исследование позволило охарактеризовать ДК, генерируемые  в условиях замены интерлейкина-4 интерфероном-α, причем впервые сравнить ИФН-ДК и ИЛ4-ДК, активированные LPS. Полученные результаты продемонстрировали, что ИФН-ДК имеют отличительные особенности, ряд из которых делает эти клетки  привлекательными для  клинического  использования. ИФН-ДК сохраняют промежуточный по степени зрелости фенотип и высокую эндоцитарную активность, характеризуются более высокой цитокинсекреторной, Тh1/Тh2-стимулирующей  и цитотоксической активностью против опухолевых клеток, в том числе, ассоциированной с экспрессией молекулы  TRAIL. Исследование ИФН-ДК при патологии показало, что ИФН-ДК, генерируемые у больных с онкологическими и инфекционными заболеваниями могут существенно отличаться по фенотипическим и функциональным свойствам, в частности, приобретать толерогенную/супрессорную активность, обусловленную повышенной продукцией  IL-10, снижением Th1- и усилением Th-2 стимуляторной активности. Эти изменения наиболее выражены у пациентов злокачественными лимфомами, хроническим вирусным гепатитом С и больных туберкулезом легких со сниженным антигенспецифическим ответом. Исследование влияния различных иммуноактивных препаратов на функции ДК показало, что  обработка ДК в культуре in vitro интерлейкином-2,  комплексом провоспалительных цитокинов, двуцепочечной ДНК, полиоксидонием значимо усиливала  аллостимуляторную активность ДК у больных  со злокачественными лимфомами и туберкулезом легких, а также  цитотоксическую активность ДК у больных онкологического профиля. Эти данные обосновывают  принципиальную возможность коррекции дисфункций  ИФН-ДК у больных  с онкопатологией и инфекционными заболеваниями. Кроме того, было показано, что ИФН-ДК являются мишенями гормональной регуляции и опосредуют иммуностимулирующий эффект ДГЭАС, повышенный уровень которого у беременных с гиперандрогенией обусловливает снижение толерогенного потенциала ДК, характерного для физиологической беременности. Итогом работы стала апробация  иммунотерапии  на основе ИФН-ДК в лечении больных злокачественными опухолями головного мозга и хроническими вирусными инфекциями. Использование ДК-вакцин характеризовалось хорошей переносимостью и приводило к индукции специфического иммунного ответа, что сопровождалось улучшением показателей качества жизни/выживаемости у больных со злокачественными внутримозговыми опухолями; прекращением репликации вируса/нормализации биохимической активности при хроническом вирусном гепатите В и увеличением продолжительности безрецидивного периода при хронической герпесвирусной инфекции, что обосновывает возможность и перспективность использования ИФН-ДК в качестве клеточной основы при создании индивидуальных лечебных вакцин.

ВЫВОДЫ

  1. По сравнению с LPS-активированными ИЛ4-ДК популяция генерированных in vitro ИФН-ДК характеризуется более высоким содержанием клеток, экспрессирующих CD14, СD11c/CD123 и TRAIL и меньшим количеством CD83+ клеток, что в совокупности с высокой эндоцитарной активностью ИФН-ДК свидетельствует об их промежуточной степени зрелости и более выраженном  цитотоксическом потенциале.
  2. ИФН-ДК обладают более высокой, чем ИЛ4-ДК, цитокин-продуцирующей активностью (продукция IFN-, IL-2, IL-1, TNF-, IL-10, IL-5, MCP-1 и G-CSF), более активно индуцируют генерацию CD3+IFN+ Т-клеток и способны активировать CD3+IL4+ Т-клетки, что обусловливает их высокий потенциал в индукции/регуляции иммунного ответа.
  3. ИФН-ДК более эффективно ингибируют пролиферацию TRAIL-резистентных опухолевых клеток HEp-2 и обладают большей цитотоксической активностью против TRAIL-чувствительных клеток Jurkat, что свидетельствует о более высоком противоопухолевом потенциале  этих ДК по  сравнению с ИЛ4-ДК. При этом отсутствие прямой взаимосвязи между цитотоксической и цитостатической активностью ИФН-ДК указывает на возможное вовлечение различных механизмов в реализацию данных эффектов.
  4. В отсутствие стимуляции LPS ИФН-ДК обладают более высокой способностью к индукции регуляторных Т-клеток, о чем свидетельствует более высокое содержание не только CD4+Foxp3+ , но и CD8+FохP3+ и CD4+IL-10+ Т-клеток в культурах СКЛ, индуцированных ИФН-ДК. После активации LPS ИФН-ДК теряют способность индуцировать CD4+Foxp3+ Т-клетки и в одинаковой с ИЛ4-ДК степени индуцируют генерацию CD8+FохP3+ и CD4+IL-10+ Т-лимфоцитов, что свидетельствует о схожей толерогенной/супрессорной активности активированных ДК.
  5. ИФН-ДК у больных с онкопатологией характеризуются увеличением доли незрелых/промежуточной степени зрелости и уменьшением зрелых ДК; повышением продукции IL-10 и уменьшением - IFN-; снижением аллостимуляторной активности, ослаблением Th1- или возрастанием Th2-стимуляторной активности, а также уменьшением цитотоксической активности, что свидетельствует о задержке дифференцировки/созревания ДК и снижении способности ДК активировать/опосредовать реакции клеточного иммунитета. При этом спектр и выраженность указанных изменений при различных нозологических формах онкологических заболеваний варьирует от минимальных до выраженных.
  6. ИФН-ДК при HBV-инфекции сходны с таковыми у доноров, тогда как у больных HCV-инфекцией, ЦП (независимо от природы вируса) и туберкулезом легких характеризуются признаками задержки дифференцировки/созревания, смещением баланса в сторону продукции Th2-цитокинов и усилением Th2-стимуляторной активности, что указывает на снижение способности ДК активировать реакции клеточного иммунитета при данных патологиях.
  7. ИФН-ДК при физиологической беременности характеризуются признаками незрелости, смещением баланса в сторону продукции Th2-цитокинов, снижением аллостимуляторной- в сочетании с усилением Th2-стимуляторной активности и наличием цитотоксической активности против CD56+CD16+ NK-клеток, тогда как у беременных с надпочечниковой гиперандрогенией не отличаются по количеству зрелых/активированных ДК от таковых у небеременных женщин и обладают сохранной аллостимуляторной-/Th1-стимулирующей активностью, что свидетельствует о толерогенных/супрессорных свойствах ДК при физиологической гестации и потери этой активности на фоне повышенного уровня ДГЭАС при надпочечниковой гиперандрогении.
  8. ДГЭАС в культурах in vitro стимулирует созревание ИФН-ДК, продукцию IFN- и TNF- и Th1-стимуляторную активность ДК и подавляет их проапоптогенную активность против CD56+CD16+ NK-клеток, что свидетельствует об участии ДГЭАС в гормональной регуляции ДК и его возможной роли в изменении свойств ИФН-ДК у беременных с надпочечниковой гиперандрогенией.
  9. Интерлейкин-2, комплекс провоспалительных цитокинов, двуцепочечная ДНК и полиоксидоний усиливают in vitro аллостимуляторную активность ДК больных злокачественными лимфомами и туберкулезом легких и цитотоксическую активность ИФН-ДК против TRAIL-резистентных опухолевых клеток у больных злокачественными глиомами и лимфомами, что обосновывает принципиальную возможность коррекции функциональной активности ДК у больных с онкопатологией и инфекционными заболеваниями.
  10. Иммунотерапия на основе ИФН-ДК у больных ЗОГМ сопровождается индукцией специфического иммунного ответа (усилением пролиферативного ответа МНК и появлением реакции ГЗТ в ответ на опухолевые антигены). Отсутствие выраженных побочных реакций, улучшение показателей качества жизни и выживаемости свидетельствует о безопасности и клинической эффективности ДК вакцин в лечении больных с онкопатологией.
  11. Использование вакцин на основе ИФН-ДК в качестве монотерапии у больных HBV- и герпесвирусной инфекцией характеризуется хорошей переносимостью, приводит к индукции антиген-специфического иммунного ответа и сопровождается прекращением репликации вируса/нормализацией биохимической активности при ХВГВ (соответственно, в 22 и 55% случаев) и удлинением межрецидивного периода у пациентов с герпесвирусной инфекцией.
  12. ИФН-ДК могут быть использованы в качестве новой технологической платформы для создания индивидуальных дендритноклеточных вакцин с целью генерации эффективного антигенспецифического иммунного ответа у больных онкологическими и инфекционными заболеваниями.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

  1. Хонина Н.А., Центнер М.И., Леплина О.Ю., Тихонова М.А., Ступак В.В., Никонов С.Д., Черных Е.Р., Останин А.А. Характеристика и механизмы иммунных нарушений у больных со злокачественными опухолями головного мозга //Вопросы онкологии.- 2002.- Т. 48, № 2.- С. 196-201.
  2. Черных Е.Р., Ступак В.В., Центнер М. И., Хонина Н. А., Леплина О. Ю., Тихонова М.А., Никонов С.Д., Останин А.А. Комбинированная иммунотерапия в лечении злокачественных опухолей головного мозга //Медицинская иммунология.- 2002.- Т. 4, № 4/5. -  С. 583-592.
  3. Черных Е.Р., Леплина О.Ю., Тихонова М.А., Сычева Н.В., Останин А.А., Козлов Ю.П., Никонов С.Д., Ступак В.В. Новые клеточные технологии  иммунотерапии в лечении злокачественных глиом головного мозга//Мат. Всероссийской научно-практической конференции «Многопрофильная больница: проблемы и решения», Ленинск-Кузнецкий -  2003. – С. 306-307.
  4. Останин А.А., Центнер М.И., Хонина Н.А., Леплина О.Ю., Шевела Е.Я., Никонов С.Д., Ступак В.В., Черных Е.Р. Антигенспецифическая иммунотерапия в комплексном лечении больных со злокачественными опухолями головного мозга//Вопросы онкологии.- 2003. - Т. 49, № 2.- С. 170-175.
  5. Крючкова И.В., Лисуков И.А., Кулагин А.Д., Сизикова С.А, Гилевич А.В,  Леплина О.Ю., Черных Е.Р., Козлов В.А. Опыт использования талидомида и вакцины на основе аутологичных дендритных клеток у больного с рецидивом множественной миеломы после аутологичной трансплантации стволовых кроветворных клеток//Abstracts of Russian-Norwegian Conference in Hematology. Saint-Petersburg. - 2003. – P.48-50.
  6. Леплина О.Ю., Хонина Н.А., Останин А.А., Центнер М.И., Ступак В.В., Никонов С.Д., Черных Е.Р. Комбинированная иммунотерапия в лечении злокачественных глиом головного мозга//Отчет ИКИ СО РАМН,  Hовосибирск. - 2003. - С. 97-101.
  7. Леплина О.Ю., Ступак В.В., Хонина Н.А, Центнер М.И., Козлов Ю.П., Останин А.А, Черных Е.Р. Ретроспективный анализ эффективности комбинированной иммунотерапии в комплексном лечении злокачественных глиом головного мозга//Материалы VII международного симпозиума «Новые технологии в нейрохирургии»- Санкт-Петербург. - 2004. - С. 172.
  8. Черных Е.Р., Ступак В.В., Центнер М.И., Хонина Н.А., Леплина О.Ю., Тихонова М.А., Никонов С.Д., Останин А.А. Эффективность комбинированной иммунотерапии в комплексном лечении злокачественных глиом головного мозга//Сибирский онкологический журнал. - 2004. - № 2/3.- С. 85-88.
  9. Ступак В.В., Леплина О.Ю., Тихонова М.А., Останин А.А., Козлов Ю.П., Никонов С.Д., Черных Е.Р. Опыт использования частично-зрелых дендритных клеток в лечении больных злокачественными глиомами головного мозга //Вопросы онкологии. 2004. - № 3-4. - С. 107-109.
  10. Ступак В.В., Леплина О.Ю., Тихонова М.А., Останин А.А., Козлов Ю.П., Никонов С.Д., Черных Е.Р. Возможность генерации и клиническое использование вакцин на основе частично-зрелых дендритных клеток у больных злокачественными опухолями головного мозга // Тезисы докладов на 16-ом Пленуме Ассоциации нейрохирургов России, Екатеринбург. - 2004. - С. 101-102.
  11. Леплина О.Ю., Центнер М.И., Шевела Е.Я., Тихонова М.А., Останин А.А., Козлов Ю.П., Ступак В.В., Черных Е.Р. Фенотипическая и функциональная характеристика антигенпрезентирующих клеток при злокачественных  глиомах //Материалы XIII Всероссийской научно-практической конференции «Нейроиммунология», Санкт-Петербург. - 2004.- №2. - С. 60.
  12. Леплина О.Ю., Ступак В.В., Шевела Е.Я., Тихонова М.А., Центнер М.И., Козлов Ю.П., Останин А.А.,  Черных Е.Р. Эффективность комбинированной иммунотерапии в комплексном лечении злокачественных глиом головного мозга//Материалы XIII Всероссийской научно-практической конференции «Нейроиммунология», Санкт-Петербург. - 2004.- №2. - С. 110.
  13. Леплина О.Ю., Ступак В.В., Шевела Е.Я., Тихонова М.А., Центнер М.И., Козлов Ю.П., Останин А.А., Черных Е.Р. Характеристика антигенпрезентирующих клеток у  больных злокачественными  глиомами//14-ая научно-практическая конференция врачей «Актуальные вопросы современной медицины», Новосибирск. - 2004. - С. IX-9-10.
  14. Черных Е.Р., Леплина О.Ю., Останин А.А., Никонов С.Д., Ступак В.В., Козлов Ю.П. Способ  иммунотерапии злокачественных опухолей головного мозга//Патент на изобретение №2262941, приоритет от 05.01.2004 г.
  15. Леплина О.Ю., Тихонова М.А., Козлов Ю.П., Ступак  В.В., Никонов С.Д, Останин А.А., Черных Е.Р. Частично-зрелые дендритные клетки как потенциальная основа  для индукции противоопухолевого ответа у больных злокачественными глиомами//Медицинская иммунология. – 2005. – Т. 7. - № 4. – С .365-374.
  16. Леплина О.Ю., Сахно Л.В., Тихонова М.А., Никонов С.Д., Жданов О.А., Останин А.А., Черных Е.Р. Характеристика частично-зрелых дендритных клеток у больных туберкулезом легких//Цитокины и воспаление. – 2005.– Т.4., № 2.– С. 86 (Материалы Всероссийского научного симпозиума «Цитокины, стволовая клетка, иммунитет», Новосибирск. 2005 г).
  17. Леплина О.Ю, Сахно Л.В., Тихонова М.А., Жданов О.А., Никонов С.Д., Останин А.А., Черных Е.Р. Дендритные клетки в лечении прогрессирующих форм туберкулеза легких//Тезисы Всероссийской научно-практической конференции «Дни иммунологии в Сибири», Красноярск.- 2005.- С. 132-133.
  18. Леплина О.Ю., Тихонова М.А., Козлов Ю.П., Ступак В.В., Останин А.А., Черных Е.Р. Генерация частично зрелых дендритных клеток и их использование в лечении злокачественных глиом головного мозга// Материалы  конференции «Клинические и фундаментальные проблемы клеточных биотехнологий». Новосибирск. - 2005.- С. 19-20.
  19. Леплина О.Ю., Тихонова М.А., Козлов Ю.П., Ступак В.В., Останин А.А., Черных Е.Р. Дендритные клетки в комбинированной иммунотерапии злокачественных глиом головного мозга//Научный отчет ГУНИИКИ СО РАМН. - Новосибирск. - 2006. – С. 256-259.
  20. Крючкова И.В., Кулагин А.Д., Сизикова С.А., Денисова В.В., Гилевич А.В., Леплина О.Ю., Черных Е.Р., Лисуков И.А. Иммунотерапия с использованием дендритных клеток у больных множественной миеломой после аутологичной трансплантации периферических стволовых клеток//Научный отчет ГУНИИКИ СО РАМН, Новосибирск. – 2006. – С. 253-256.
  21. Леплина О.Ю., Тихонова М.А., Сахно Л.В., Распай Ж.М., Никонов С.Д., Старостина Н.М.,  А.А.Останин, Черных Е.Р. Фенотипическая характеристика дендритных клеток при различных патологиях //Медицинская иммунология. – 2006. – Т.8. - №2-3. – С. 420-421. («Материалы 10 всероссийского научного форума» Дни иммунологии в Санкт-Петербурге»).
  22. Сахно Л.В., Леплина О.Ю., Тихонова М.А, Распай Ж.М., Никонов С.Д., Жданов О.А., Останин А.А., Черных Е.Р. Фенотипические особенности дендритных клеток у больных туберкулезом легких//Материалы Всероссийской научно-практической конференции «Дни иммунологии в Сибири, Красноярск - 2006 – С. 79-81.
  23. Леплина О.Ю., Тихонова М.А, Козлов Ю.П., Ступак В.В., Останин А.А., Черных Е.Р. Характеристика дендритных клеток у больных злокачественными  глиомами головного мозга//Материалы Всероссийской  научно-практической конференции «Дни иммунологии в Сибири, Красноярск. - 2006 – С. 97-99.
  24. .Leplina O.Yu, Tikhonova M.A.,.Kozlov Yu.P, Stupak V.V., Ostanin A.A., Chernykh E.R. Dendritic cells in the combined immunotherapy of malignant brain gliomas//«International conference  Basic Science for Biotechnology  and Medicine» – Novosibirsk, Russia - 2006. – P. 38
  25. Леплина О.Ю., Ступак В.В, Козлов Ю.П., Пендюрин И.В., Никонов С.Д., Тихонова М.А., Сычева Н.В, Останин А.А, Черных Е.Р. IFN-индуцированные дендритные клетки в лечении больных злокачественными глиомами головного мозга//Клеточные технологии в биологии и медицине.  – 2007. - № 2. – С. 92-98.
  26. Леплина О.Ю., Тихонова М.А., Козлов Ю.П., Ступак В.В., Останин А.А., Черных Е.Р. Характеристика IFN-индуцированных дендритных клеток у больных злокачественными глиомами головного мозга//Бюллютень СО РАМН. – 2007.- (№2) Т.124. – С. 27-33.
  27. Ступак В.В., Козлов Ю.П., Пендюрин И.В., Леплина О.Ю., Тихонова М.А., Останин А.А., Черных Е.Р. Применение дендритных клеток в комплексной иммунотерапии больных злокачественными глиомами головного мозга// Материалы всероссийской научно-практической  конференции «Поленовские чтения», Санкт-Петербург. - 2007 . – С. 246.
  28. Черных Е.Р., Леплина О.Ю., Ступак В.В., Козлов Ю.П., Пендюрин И.В., Останин А.А. IFN--индуцированные дендритные клетки в лечении больных злокачественными глиомами головного мозга.//Медицинская иммунология. – 2007. – Т.9. - №. 2-3. – С. 290-291. (Материалы 11 всероссийского научного форума «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге»).
  29. Леплина О.Ю., Ступак В.В., Козлов Ю.П., Пендюрин И.В., Останин А.А., Черных Е.Р. Иммунотерапия злокачественных опухолей головного мозга.// BULLETIN of the International Scientific Surgical Association. - 2007. - V. 2(№1) - P.75-77.
  30. Леплина О.Ю., Тихонова М.А., Старостина Н.М., Григорьева А.Е., Останин А.А., Черных Е.Р. Фенотипические и функциональные свойства дендритных клеток у больных хроническими вирусными гепатитами и циррозом печени// Медицинская иммунология. – 2007. – Т.9. - №. 2-3. – С.233-234.  (Материалы 11 всероссийского научного форума «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге»).
  31. Сахно Л.В., Распай Ж.М., Леплина О.Ю., Тихонова М.А., Курганова Е.В., Никонов С.Д., Жданов  О.А., Останин А.А., Черных Е.Р. Функциональные свойства IFN- –индуцированных  дендритных клеток  у больных туберкулезом легких// Медицинская иммунология. – 2007. – Т.9. - №. 2-3. – С.245-246. (Материалы 11 всероссийского научного форума «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге»).
  32. Леплина О.Ю., Григорьева А.Е., Тихонова М.А., Cтаростина Н М., Останин А.А, Черных Е.Р. Генерация дендритных клеток  у больных хроническими вирусными гепатитами  и циррозами печени//Материалы III Международной конференции «Фундаментальные науки – медицине», Новосибирск. – 2007. - С.38.
  33. Леплина О.Ю., Тихонова М.А., Григорьева А.Е., Старостина Н.М.,  Останин А.А., Черных Е.Р.  Характеристика дендритных клеток у больных хроническими вирусными гепатитами и гепатитами с исходом в цирроз// Омский научный вестник – 2007 – №3 – С. 97. (Материалы межрегиональной научно-практической конференции  « Дни иммунологии в Сибири»).
  34. Распай  Ж.М., Сахно Л.В., Леплина О.Ю., Никонов С.Д., Жданов О.А., Черных Е.Р. Интерферон- –индуцированные дендритные клетки в лечении больных  туберкулезом легких //Омский научный вестник  – 2007 –  №3 – С. 117 (Материалы межрегиональной научно-практической конференции  «Дни иммунологии в Сибири»).
  35. Насонова Г.В., Леплина О.Ю., Тихонова М.А., Крючкова И.В., Сергеевичева В.В., Лисуков И.А., Останин А.А.. Черных Е.Р. Свойства IFN-– индуцированных дендритных клеток у больных  злокачественными  лимфомами//Омский научный вестник – 2007 –  №3 – С. 242 (Материалы межрегиональной научно-практической конференции  «Дни иммунологии в Сибири»).
  36. Леплина О.Ю., Ступак В.В., Козлов Ю.П., Пендюрин И.В., Останин А.А., Черных Е.Р. Иммунотерапия злокачественных опухолей головного мозга// Bulletin of the International Scientific Surgical Association.- 2007.- Vol. 2, N 1.- P.75-77.
  37. Сахно Л.В., Леплина О.Ю., Тихонова М.А., Распай Ж.М., Гилева И.П., Никонов С.Д., Жданов О.А., Останин А.А., Черных Е.Р. Характеристика дендритных клеток, генерируемых в присутствии  интерферона – у больных туберкулезом легких//Проблемы туберкулеза. – 2007. - №3 – С.42-46.
  38. Сахно Л.В., Леплина О.Ю., Распай Ж..М., Тихонова М..А., Курганова Е.В., Гилева И.П., Никонов С.Д., Жданов О.А., Останин А.А., Черных Е.Р. Функциональные свойства IFN--индуцированных дендритных клеток у больных туберкулезом легких// Медицинская  иммунология. – 2008.-  Т. 10, № 2-3.- С. 151-158.
  39. Леплина О.Ю., Насонова Г.В, Тихонова М.А., Крючкова И.В., Лисуков И.А., Останин А.А., Черных Е.Р. Характеристика IFN-индуцированных дендритных клеток у больных злокачественными лимфомами//Гематология и трансфузиология. – 2008 - №3- C. 24-29.
  40. Chernykh E, Stupak V., Leplina O., Shevela E., Pendurin I., Nikonov S., Ostanin A. Dendritic cell-based immunotherapy for patients with malignant glioma// Bone Marrow Transplantation. – 2008. – V.41. – S.1. – P. 161
  41. Черных Е.Р,  Курганова Е.В., Леплина О.Ю, Сахно Л.В, Тихонова М.А,  Останин А.А. Дегидроэпиандростерон  сульфат усиливает дифференцировку и созревание дендритных клеток//Российский иммунологический журнал. – 2008. – Т.2 (11). - №2-3. – С. 126.
  42. Хонина Н.А., Селедцова Н.В., Леплина О.Ю., Пасман Н.М., Черных Е.Р. Иммуномодулирующее влияние  дегидроэпиандростерона сульфата на функции дендритных клеток беременных//Российский иммунологический журнал. – 2008. – Т.2 (11), №2-3. – С. 299.
  43. Леплина О.Ю., Тихонова М.А., Сахно Л.В., Курганова Е.В., Останин А.А., Черных Е.Р. Влияние дегидроэпиандростерона сульфата на  генерацию и свойства IFN--индуцированных дендритных клеток//Сибирский медицинский журнал. – 2008. - №3. – С. 101-102.
  44. Leplina O.Yu., Stupak V.V., Pendurin I.V., Nikonov S.D., Ostanin A.A. Chernykh E.R Dendritic cell immunotherapy of malignant gliomas // Abstractbook EHRLICH II –2nd World Conference on Magic Bullets Celebrating the 100th Anniversary of the Nobel Prize Award to Paul Ehrlich. - Nrnberg, October 3-5 - 2008 - P.178.
  45. Леплина О.Ю., Тихонова М.А., Сахно Л.В., Тыринова Т.В., Останин А.А., Черных Е.Р. Эффект дегидроэпиандростерона сульфата на созревание и функциональные свойства ИНФ--индуцированных дендритных клеток// Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2009. – Т.147. - №7. – С. 80-85.
  46. Леплина О.Ю., Тихонова М.А., Борисова А.Е., Старостина Н.М., Останин А.А., Черных Е.Р., Козлов В.А. Фенотип и функции дендритных клеток у больных хроническими вирусными гепатитами//Медицинская  иммунология. – 2009. - Т.2/3. – С. 191-196..
  47. Леплина О.Ю., Насонова Г.В., Тихонова М.А., Крючкова И.В., Лисуков И.А., Останин А.А, Черных Е.Р. «IFN-индуцированные дендритные клетки у больных множественной миеломой»//Сибирский онкологический журнал. – 2009. - №6(36). – С.37-43..
  48. Леплина О.Ю., Селедцова Н.В., Тихонова М.А., Сахно Л.В., Хонина Н.А., Останин А.А., Пасман Н.М., Черных Е.Р. Эффект дегидроэпиандростерона сульфата на Тh1/Th2-стимуляторную активность дендритных клеток// Вестник НГУ. – 2009. – Т.7. - №2. – С.3-8.
  49. Черных Е.Р., Селедцова Н.В., Леплина О.Ю., Тихонова М.А., Тыринова Т.В., Курганова Е.В., Хонина Н.А., Останин А.А., Пасман Н.М. Дендритные клетки как возможные регуляторы иммунной перестройки при беременности //Медицинская иммунология. - 2009. - Т. 11, № 6.- С. 541-548.
  50. Черных Е.Р., Леплина О.Ю., Ступак В.В., Пендюрин И.В., Никонов С.Д., Тихонова М.А., Останин А.А. Клеточные технологии в лечении злокачественных глиом головного мозга//«Клеточные технологии. Теоретические и прикладные аспекты», Сборник трудов под ред. Козлова В.А., Сенникова С.В., Черных Е.Р., Останина А.А.- Новосибирск: Наука, 2009.- С. 240-276.
  51. Черных Е.Р., Леплина О.Ю., Тыринова Т.В., Тихонова М.А., Ступак В.В., Мишинов С.В., Пендюрин И.В., Останин А.А. Опухоль-ингибирующая активность интерферон- индуцированных дендритных клеток у здоровых доноров и больных злокачественными опухолями головного мозга//Материалы конференции «Поленовские чтения», Санкт-Петербург. -  2010. –  С. 295.
  52. Леплина О.Ю., Тыринова Т.В., Тихонова М.А., Ступак В.В., Мишинов С.В, Пендюрин И.В., Останин А.А. Черных Е.Р. Противоопухолевая активность интерферон-индуцированных дендритных клеток у здоровых доноров и больных с опухолями головного мозга //Медицинская иммунология. – 2010. – Т.12- №3. – С. 199-206.
  53. Черных Е.Р., Леплина О.Ю., Тыринова Т.В., Тихонова М.А., Сахно Л.В., Останин А.А. Участие дегидроэпиандростерона сульфата и прогестерона в регуляции толерогенной активности интерферон-- индуцированных дендритных клеток в культуре in vitro//Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2011. – Т.151. - №2. – С. 168-171.
  54. Леплина О.Ю., Тихонова М.А, Насонова Г.В., Мишинов С.В., Ступак В.В., Крючкова И.В.,Останин А.А, Черных Е.Р. Характеристика функциональной активности интерферон-индуцированных дендритных клеток у здоровых доноров и больных злокачественными заболеваниями//Цитокины и воспаление. – 2010. – Т.9. - №3. –  С. 78 .
  55. Тыринова Т.В,.Леплина О.Ю,.Мишинов С.В, Ступак В.В., Пендюрин И.В., Останин А.А., Черных Е.Р. Цитотоксическая активность IFN--индуцированных дендритных клеток у здоровых доноров и  больных опухолями головного мозга// Цитокины и воспаление. – 2010. – Т.9. - №3. –  С.80 .
  56. Черных Е.Р., Леплина О.Ю., Селедцова Н.В., Тихонова М.А., Останин А.А., Пасман Н.М. Участие дендритных клеток в реализации иммуномодулирующего эффекта дегидроэпиандростерона у беременных с надпочечниковой гиперандрогенией// Цитокины и воспаление. – 2010. – Т.9. - №3. –  С.82 .
  57. М.А.Тихонова, О.Ю.Леплина, Н.И.Борисенкова, А.А.Останин, Е.Р.Черных. Возможность использования 4-цветной цитофлюориметрии для количественного определения циркулирующих дендритных клеток в периферической крови здоровых доноров// Цитокины и воспаление. – 2010. – Т.9. - №3. – С.73 .
  58. Tyrinova T.V., Leplina O.Yu., Mishinov S.V., Stupak V.V., Pendyurin I.V., Ostanin A.A., Chernyckh E.R. Cytotoxic activity of IFN--indused dendritic cells in healthy donors and patients with  brain gliomas//DC2010: Forum on Vaccine Science -11-th international Simposium on Dendritic Cells in Fundamental and Clinical Immunology -26-30 Sept. 2010 – Lugano, Switzeland- Poster Sesion Abstract. – P05-030.
  59. Леплина О.Ю, Желтова О.И., Борисова А.Е.. Старостина Н.М, Останин А.А., Черных  Е.Р. Вакцины на основе дендритных клеток в лечении герпетической инфекции// Вестник Уральской  медицинской академической науки. - 2011. – №2/2 (35). – С. 38-39.
  60. Сахно Л.В., Тихонова М.А., Леплина О.Ю., Тыринова Т.В., Никонов С.Д., Жданов О.А., Останин А.А., Черных Е.Р. Роль PD-1/B7-H-1-сигнального пути в нарушении антигенспецифического ответа  у больных туберкулезом легких// Иммунология. – 2011. – Т.32. – С.89-93. .
  61. Насонова Г.В., Леплина О.Ю., Тихонова М.А., Крючкова И.В., Останин А.А., Черных Е.Р. Экспрессия B7-H1 на IFN--индуцированных дендритных клетках у больных злокачественными лимфомами//Материалы всероссийской научно-практической конференции «Дни иммунологии в Сибири», Абакан. – 2011.- С.101-103.
  62. Тыринова Т.В., Леплина О.Ю., Тихонова М.А., Останин А.А., Черных Е.Р. Влияние дегидроэпиандростерона сульфата и прогестерона на цитотоксическую активность интерферон-альфа-индуцированных дендритных клеток в культуре in vitro// Материалы всероссийской научно-практической конференции «Дни иммунологии в Сибири», Абакан. – 2011. - С. 214-216.
  63. Мишинов С.В., Черных Е.Р., Леплина О.Ю., Тыринова Т.В., Тихонова М.А., Останин А.А., Ступак В.В., Пендюрин И.В. Анализ взаимосвязи  выживаемости  больных и цитотоксической активности интерферн-альфа-индуцированных дендритных клеток  при внутримозговых опухолях//  Российский нейрохирургический журнал. – 2011. – Т.III., специальный выпуск, - С.324-325 (Материалы конференции «Поленовские чтения», Санкт-Петербург).
  64. Леплина О.Ю., Тыринова  Т.В., Тихонова М.А,  Останин А.А.,  Черных Е.Р. Сравнительная характеристика дендритных клеток, генерируемых в присутствии ИЛ-4 и ИФН-α// Материалы 8-й отчетной конференции НИКИ СО РАМН, Новосибирск. – 2011. – С. 38-39.






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.