WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

 

На правах рукописи

Смелая

Тамара Валерьевна

ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ПРЕДРАСПОЛОЖЕННОСТЬ, ПАТОМОРФОЗ, ЛЕЧЕНИЕ ВНЕБОЛЬНИЧНОЙ И НОЗОКОМИАЛЬНОЙ ПНЕВМОНИИ

                               14.01.20 – анестезиология и реаниматология

А в т о р е ф е р а т

диссертации на соискание ученой степени

доктора медицинских наук

Москва - 2011

Работа выполнена в Учреждении Российской Академии медицинских наук Научно-исследовательском институте общей реаниматологии имени В.А. Неговского РАМН.

Научные консультанты:

доктор медицинских наук, профессор,

член-корреспондент РАМН,

заслуженный деятель науки России                        Мороз Виктор Васильевич

доктор медицинских наук, профессор                        Голубев Аркадий Михайлович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор                        Свиридов Сергей Викторович

доктор медицинских наук, профессор                        Спиридонова Елена Александровна

доктор медицинских наук                                        Хорошилов Сергей Евгеньевич                        

Ведущее учреждение:

ФГУ «Институт хирургии имени А.В.Вишневского» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита состоится  «__» «________» 2011 г., в … часов на заседании Диссертационного совета Д 001.051.01 при Учреждении Российской Академии медицинских наук НИИ общей реаниматологии имени В.А. Неговского РАМН по адресу: 103031, г.Москва, ул. Петровка, д. 25, стр. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской Академии медицинских наук НИИ общей реаниматологии имени В.А. Неговского РАМН.

Автореферат разослан ______________________________________

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук, профессор                                        В.И. Решетняк

Актуальность проблемы

Несмотря на достижения в изучении патофизиологических механизмов болезни, появление все новых генераций антибактериальных препаратов, устойчиво сохраняются высокие показатели летальности, возрастает число осложненных и затяжных форм пневмонии [Синопальников А.И., 2005; Чучалин А.Г. и соавт., 2006]. Заболеваемость острой внебольничной пневмонией (ВП) в России достигает 14-15‰, а общее число больных ежегодно превышает 1500000 человек. Но эти цифры не являются окончательными, поскольку у отдельных категорий обследуемых показатель заболеваемости ВП оказывается существенно выше. Так, по данным ежегодных отчетов медицинской службы Министерства обороны РФ, заболеваемость ВП у военнослужащих срочной службы в 2000-2003 гг. превышала 40‰ [Раков А.Л.и соавт, 2005]. Анализ российских данных свидетельствует, что в 2003 г. от пневмонии умерли 44438 человек, что составляет 31,0 случай на 100000 населения (данные Минздравсоцразвития России), наиболее высокая смертность от ВП регистрируется у мужчин трудоспособного возраста [Чучалин А.Г. и соавт., 2006; Torres a., Valencia M., Sellares J., 2006]. Пневмонии являются основной причиной летального исхода при инфекционных заболеваниях, и наиболее распространены среди нозокомиальных инфекций в отделениях анестезиологии-реаниматологии (ОАР) [Мороз В.В.,Григорьев Е.В., Чурляев Ю.А., 2006; Карпун Н.А.и соавт, 2007; Белобородов В.Б., 2009].

Особой проблемой стационаров является нозокомиальная пневмония (НП), которая занимает третье место в структуре всех нозокомиальных инфекций и составляет 20% всех пневмоний в ОАР, что удлиняет сроки лечения и ухудшает прогноз заболевания, а также существенно увеличивает материальные затраты лечебных учреждений [Голубев А.М., Цыганов С.В., Македонская И.В., 2004; Савельев В.С. и соавт 2005; Белобородова Н.В., 2008; Марченков Ю.В.и соавт, 2010; Сhiang W.C. et al. 2007; Magret M, et al, 2010]. В 2006 г в России было зарегистрировано 25582 случая НП. Наибольшие показатели летальности среди госпитальных инфекций также ассоциируется с НП, достигая от 30-60 до 80% [Хорошилов С.Е., 2009; Власенко А.В. и соавт, 2009; Rubinstein E., 2010; Dusemund F., 2010]. Впрочем, столь высокие цифры могут вводить в заблуждение, поскольку у большого числа пациентов с НП имеются тяжелые заболевания различных органов, и пневмония не является непосредственной причиной смерти, но всегда осложняет течение любого заболевания, утяжеляя его состояние и внося свой «вклад» в танатогенез в каждом конкретном случае. Согласно имеющимся данным, атрибутивная летальность у пациентов с НП колеблется в широких пределах – от 10 до 50% и более [Беляев Д.Л.и соавт, 2005; Chastre J., Fagon J., 2002].

Учитывая распространенность пневмонии и частоту развития жизнеугрожающих осложнений, вопросам ее диагностики и лечения посвящены многочисленные работы. Только за последний год было опубликовано 63662 статей. Накоплены обширные сведения о роли цитокинов в процессах реализации иммунной и воспалительной реактивности как при внебольничной, так и при развитии НП, в том числе, вентилятор-ассоциированной (ВАП) [Власенко А.В.и соавт., 2005; Гуманенко Е.К.и соавт., 2007; Чурляев Ю.А.и соавт., 2007; Manoel A.L., 2010]. Действуя в очаге воспаления и на территории реагирующих лимфоидных органов, цитокины ответственны за инициацию и разрешение процесса локального и системного воспаления [Павлов К.А., Дубова Е.А., Мишнев О.Д., Щеголев А.И., 2007]. Поэтому возникает необходимость анализа количественного и качественного состава цитокинов при патологии, отражающей локальный и системный характер воспаления.

В экспериментальных и клинических работах изучены изменения в легких, происходящие при различных критических состояниях [Рябов Г.А., 1988; Ливанов Г. А. и соавт., 2005; Голубев А.М. и соавт., 2006; Полушин Ю.С., Храпов К.Н., Майская М.Ю., Дикарев К.В., 2010; Черняев А.Л. и соавт., 2010; Brander L., Slutsky A.S., 2006]. Тем не менее, патоморфоз пневмоний в зависимости от генеза изучен не достаточно.

В тоже время, стремительное накопление знаний о генетической основе патологических процессов обогащает представления об этиологии и патогенезе распространенных болезней человека, существенно повышает возможности их диагностики. В последнее десятилетие наметилась позитивная тенденция к поиску подходов ранней диагностики различных заболеваний, созданию прогностических моделей и верификации критериев эффективности лечения [Пузырев В.П., Фрейдин М.Б.,2009; Kim S.H. et al., 2010]. Наиболее активно в этой связи изучают социально значимые заболевания, характеризующиеся наибольшим процентом заболеваемости, летальности, инвалидизации из-за тяжелых последствий, с точки зрения неблагополучия генетических механизмов: онкологические заболевания различной локализации [Белицкий Г.А., Якубовская М.Г., 2008; McIlwain C. C., Townsend D. M., Tew K. D., 2006; Tripathi S.et al, 2008; Palli D, et al., 2010] атеросклероз и ишемическая болезнь сердца [Назаренко Г.И., Клейменова Е.Б., Гущина Н.Н., 2009], сахарный диабет [Araki A. et al, 2003], бронхиальная астма [Vercelli D., 2008], муковисцидоз [Капранов Н.И., Каширская Н.Ю., Толстова В.Д., 2008], туберкулез легких [Гра О.А.и соавт., 2010], алкоголизм [Марусин А.В. и соавт, 2009].

В настоящее время не вызывает сомнений тот факт, что индивидуальный ответ на течение и исход инфекционного процесса наследственно детерминирован [Waterer GW, Wunderink RG., 2003]. Общая устойчивость организма зависит от многих факторов, в частности, от активности генов детоксикации ксенобиотиков (ГДК) [Habdous M. et al., 2004; Xue B. et al., 2005; Jnsson LS. et al., 2008]. Однако генетическая предрасположенность к острым инфекционным заболеваниям мало изучена, а в тех ассоциативных исследованиях, что проведены, круг изучаемых генов-кандидатов достаточно узок и ограничивается, в основном, генами цитокинов и хемокинов [Чердынцева Н. В. и соавт., 2006; Черкашина И.И. и соавт., 2009]. В последнем случае преобладают исследования, касающиеся изучения генетических характеристик возбудителей болезней, их геномов в формировании восприимчивости (устойчивости) человека к конкретной инфекции и клинического полиморфизма болезни. В тоже время, изучение генома самого человека, контактирующего с инфекцией, заболевшего или сохранившего здоровье, становится важной областью генетических исследований [Пузырев и др., 2002; Frodsham A. J., Hill A. S., 2004].

И лишь в последние годы появились исследования по изучению генов, связанных с пневмонией [Байгозина Е.А. и соавт. 2009; Sole-Violan J.et al., 2010]. Однако, в доступной нам литературе, мы не встретили данных о выявленных генах предрасположенности к риску возникновения пневмонии. Система ферментов метаболизма ксенобиотиков представляет собой сформировавшийся в процессе эволюции механизм адаптации организма к воздействию токсичных экзогенных и эндогенных веществ. Предполагается, что различия в скорости деградации различных субстратов ферментами метаболизма могут лежать в основе неодинаковой восприимчивости к ряду заболеваний [Ляхович В. В. и соавт., 2002]. Изучение полиморфизма генов, участвующих в различных процессах поддержания гомеостаза (ГДК, гены? Контролирующие иммунный ответ и др.) на предмет сопряженности с риском возникновения пневмонии позволит прогнозировать течение и исход данного заболевания.

Адекватная антибактериальная терапия – важный компонент лечения инфекционных заболеваний и нозокомиальных осложнений у пациентов ОАР [Shin J., Kayser S.R., Langaee T., 2009]. В последние годы в тактике антибиотикотерапии пневмонии наметилась отчетливая тенденция к более раннему назначению препаратов антимикробного действия. В тоже время, еще мало изучены механизмы индивидуальной чувствительности и переносимости лекарственных средств антимикробного действия. Особые надежды в решении этого вопроса возлагаются на изучение генетической детерминированности этих свойств.

Пристальное внимание исследователей направлено на изучение роли ферментативной системы метаболизма в биотрансформации лекарственных препаратов [Nebert D. W., Jorge-Nebert L., Vesell E. S., 2003]. Изучение полиморфизма генов этой системы в различных популяциях, обусловливающего существование индивидуальных особенностей метаболизма лекарственных препаратов, проявляющихся различиями в эффективности медикаментозной терапии, являются важными и перспективными в практическом применении.

Таким образом, изучение патоморфоза пнемоний, определение роли генетического полиморфизма в их возникновении актуально и предполагает исследование взаимосвязи аллельных вариантов генов-кандидатов с клиническими особенностями течения заболевания для понимания механизмов взаимодействия в процессе реализации наследственной информации. Выявление генотипов предрасположенности к риску возникновения внебольничной и нозокомиальной пневмонии, разработка принципов персонализированного подхода к назначению антибактериальной терапии с учетом индивидуальных, генетически обусловленных, особенностей поможет улучшить результаты лечения и снизить частоту развития осложнений.

Цель исследования

Улучшить результаты лечения больных внебольничной и нозокомиальной пневмонией на основании изучения патоморфоза заболевания, а также путем выявления групп повышенного риска с помощью молекулярно-генетических методов исследования и разработки принципов лечения с учетом индивидуальных генетических особенностей.

Задачи исследования

  1. Выявить особенности патоморфоза внебольничной и нозокомиальной пневмонии.
  2. Выявить генотипы предрасположенности к возникновению внебольничной пневмонии по следующим генам: гены детоксикации ксенобиотиков (CYP1A1 A4889G, CYP1A1 T606G, CYP1A1 T3801C, GSTM1 Ins/Del, GSTT1 Ins/Del, GSTP1 A313G); ген системы гемостаза – MTHFR C677T; ген ренин-ангиотензиновой системы – ACE Ins/Del, гены, контролирующие иммунный ответ (CCR5 Ins/Del, TNF- G308A, IL-6 G174C), ген трансмембранного P-гликопротеина - ABCB1 T3435C.
  3. Изучить роль полиморфизма генов детоксикации ксенобиотиков (CYP1A1 T606G, GSTM1 Ins/Del, GSTT1 Ins/Del, GSTP1 A313G) и гена ренин-ангиотензиновой системы – ACE Ins/Del  в развитии критических состояний (нозокомиальная пневмония, ОРДС, сепсис, органная недостаточность) у больных исследуемых групп.
  4. Изучить взаимосвязь инсерционно-делеционного полиморфизма гена ACE Ins/Del  с исходом при развитии критического состояния.
  5. Выявить влияние генетического полиморфизма на эффективность антибактериальной терапии при лечении больных внебольничной пневмонией.
  6. Определить протективные генотипы по изученным локусам в выборках больных исследуемых групп.
  7. Изучить динамику содержания IL-1, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10 и TNF- у больных внебольничной и нозокомиальной пневмонией в сыворотке венозной крови и бронхоальвеолярной лаважной жидкости в зависимости от генеза, течения и исхода заболевания во взаимосвязи с полиморфизмом генов TNF- G308A и IL-6 G174C.
  8. Разработать рекомендации обследования и лечения больных с учетом риска развития пневмонии и особенностей ее течения в зависимости от полиморфизма исследованных генов.

Новизна исследования

Впервые развитие пневмонии изучено с позиции взаимосвязи клинико-морфологических, молекулярных и генетических механизмов.

Изучение патоморфоза внебольничной и нозокомиальной пневмонии выявило изменение структуры осложнений, повышение роли микробных ассоциаций в развитии критических состояний.

Впервые у больных пневмонией различного генеза проведен анализ аллелей десяти генов (12 сайтов), участвующих в регуляции различных систем гомеостаза: система детоксикации (CYP1A1 (три сайта: A4889G, T606G и T3801C), GSTM1 Ins/Del, GSTT1 Ins/Del, GSTP1 A313G); система гемостаза (MTHFR C677T); ренин-ангиотензиновая система (ACE Ins/Del), система иммуннитета (CCR5 Ins/Del, TNF- G308A, IL-6 G174C) и ген трансмембранного Р-гликопротеина (ABCB1 T3435C), ответственный за выброс эндо- и экзогенных соединений и их метаболитов через клеточную мембрану против градиента концентрации. Получены новые знания о роли изученных генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков в развитии внебольничной и нозокомиальной пневмонии

Впервые выявлена ассоциация аллелей полиморфных генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков (CYP1A1 T606G, GSTM1 Ins/Del) и гена АСЕ Ins/Del с риском возникновения внебольничной пневмонии и ее течением.

Впервые выявлена сопряженность гена биотрансформации ксенобиотиков GSTP1 A313G с риском возникновения нозокомиальной пневмонии у больных с перитонитом, тяжелой сочетанной травмой и гнойно-воспалительными заболеваниями различной локализации.

Впервые выявлена ассоциация инсерционно-делеционного полиморфизма гена ACE с исходом при развитии таких критических состояний как ОРДС, сепсис и органная недостаточность у больных внебольничной и нозокомиальной пневмонией.

Впервые анализ частот генотипов изученных локусов и их комбинаций позволил выявить те из них, которые определяют протективные свойства организма относительно развития пневмонии.

Впервые показана связь полиморфного варианта 313A>G гена GSTP1 и 3435 T>C гена ABCB1 с эффективностью антибактериальной терапии при лечении внебольничной пневмонии.

При изучении цитокинового профиля у больных внебольничной и нозокомиальной пневмонией выявлены различия динамики уровня содержания цитокинов в сыворотке крови и БАЛЖ в зависимости от генеза, течения и исхода заболевания. Доказано, что маркерами неблагоприятного исхода заболевания являются TNF-, IL-6  и IL-1 .

Практическая значимость

Проведенное исследование показывает, что для более эффективного лечения больных пневмонией различного генеза следует использовать новые технологии – медико-генетические исследования. Полученные результаты исследования могут быть положены в основу разработки скрининговых программ по выявлению лиц с повышенным риском развития пневмонии.

Выявленные генотипы предрасположенности позволяют определить людей с высоким риском возникновения внебольничной и нозокомиальной пневмонии, а также осложненного течения заболевания, что способствует своевременной госпитализации больных, определения необходимого объема медицинской помощи.

Объективно подтверждена в настоящем исследовании высокая эффективность назначения антибактериальной терапии на основе результатов генотипирования по изученным генам. Это позволяет проводить лечение внебольничной пневмонии с учетом индивидуальных особенностей, что существенно снижает частоту развития осложнений, сокращает сроки госпитализации, уменьшает материальные и финансовые затраты лечебных учреждений на лечение больных данной нозологии.

Результаты исследования можно использовать для прогнозирования риска возникновения внебольничной пневмонии и особенностей ее течения.

Результаты исследования показали ассоциацию инсерционно-делеционного полиморфизма гена ACE с исходом при развитии критических состояний, таких как острый респираторный дистресс-синдром, сепсис, органная недостаточность у больных внебольничной и нозокомиальной пневмонией.

Сведения о связи полиморфных вариантов генов ферментов метаболизма ксенобиотиков с результатами антибактериальной терапии могут быть учтены при лечении данной категории больных с целью улучшения ее эффективности.

Результаты изучения патоморфоза легких показывают изменение структуры осложнений при пневмонии, высокую распространенность острого респираторного дистресс-синдрома как при нозокомиальной, так и внебольничной пневмонии, повышение роли микробных ассоциаций в развитии критических состояний, что необходимо учитывать в клинической практике. Выявленные морфологические изменения в легких у больных пневмонией различного генеза поволяют глубже понять патофизиологические механизмы различных стадий острого респираторного дистресс-синдрома.

Материалы работы могут быть использованы в учебно-методическом процессе на медицинских и биологических факультетах ВУЗов, а также на курсах последипломного образования врачей. Полученная информация о полиморфизме изученных генов может быть использована при проведении генетико-эпидемиологических исследований широко распространенных заболеваний.

Положения, выносимые на защиту

  1. Изучение потоморфоза внебольничной и нозокомиальной пневмоний выявило изменение структуры осложнеий, показало значение микробных ассоциаций в развитии критических состояний у больных с рахличной ннозологией. Результаты клинико-морфологического исследования свидетельствуют, что пневмония может быть как причиной, так и следствием критического состояния.
  2. Генетическими маркерами предрасположенности к риску возникновения внебольничной пневмонии являются аллельные варианты генов: CYP1A1 T606G, GSTM1 Ins/Del и АСE Ins/Del.
  3. Функциональный полиморфизм гена GSTP1 A313G  сопряжен с риском ризвития нозокомиальной пневмонии.
  4. Полиморфные варианты генов CYP1A1 T606G, GSTM1 Ins/Del и АСЕ Ins/Del ассоциированы с развитием осложненного течения внебольничной пневмонии.
  5. Инсерционно-делеционный полиморфизм гена ACE Ins/Del сопряжен с исходом критических состояний (ОРДС, сепсис, органная недостаточность).
  6. Аллельные варианты генов GSTP1 A313G и ABCB1 T3435C могут служить критерием выбора антибактериального средства при лечении внебольничной пневмонии, так как сопряжены с эффективностью терапии.
  7. Использование медико-генетических тестов позволяет выделить людей высокого риска возникновения внебольничной и нозокомиальной пневмонии, своевременно, с учетом индивидуальной чувствительности проводить лечение.
  8. Динамика цитокинов IL-1, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10 и TNF- в различных биологических средах (сыворотка венозной крови, бронхоальвеолярная жидкость) отражает характер течения пневмонии и ее исход.

Апробация работы

Работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ  Учреждения Российской Академии медицинских наук НИИ общей реаниматологии имени В.А. Неговского РАМН. Результаты работы были представлены на открытом заседании Ученого совета Учреждения Российской Академии медицинских наук НИИ общей реаниматологии имени В.А. Неговского РАМН 04 апреля 2010г., а также на международных симпозиумах: «Клиника, диагностика и лечение ОРДС, пневмонии» (Греция, Солоники, 2005г), Симпозиуме «Диагностика, лечение острого повреждения легких» (Словакия, Пиештяны, 2006г), «Острое повреждение легких, респираторный дистресс-синдром, пневмония» (Прага, 2007г) «Острая дыхательная недостаточность» (Будапешт, 2008г); «Критические состояния: патогенез, диагностика, лечение» (Черногория, Будва, 2010г), Всероссийском Съезде анестезиологов и реаниматологов (Санкт-Петербург, 2007 и 2008гг), 16 конгрессе анестезиологов и врачей интенсивной терапии Словакии с международным участием (Словакия, Пиештяны, 2009г), Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2008, 2009 и 2010 гг.), Научно-практической конференции «Технологии жизнеобеспечения при критических состояниях» (Москва, 2010г), XII съезде анестезиологов и реаниматологов России (Москва, 2010г), Российско-испанском инновационном бизнес-форуме (Мадрид, 2011), VI съезде Межрегиональной Ассоциации общественных объединений анестезиологов и реаниматологов Северо-Запада совместно с медицинскими сестрами-анестезистами (Санкт-Петербург, 2011г), Четвертом Беломорском симпозиуме анестезиологов и реаниматологов с международным участием (Архангельск, 2011г); Poster presentations на международном конгрессе «Евроанестезия» (Милан, 2009г) и 30-м Международном симпозиуме по интенсивной терапии (Брюссель, 2010г).

Внедрение

Результаты выполненного исследования внедрены в практическую работу НИИ общей реаниматологии имени В.А. Неговского РАМН, МГМСУ, Главного военного клинического госпиталя внутренних войск МВД у больных внебольничной пневмонией, пострадавших с ТСТ и раненых в критических состояниях, при развитии нозокомиальной пневмонии. Основные положения исследования включены в курсы лекций сертификационных циклов усовершенствования врачей, проводимых в НИИ общей реаниматологии имени В.А. Неговского РАМН и МГМСУ.

Публикации

Материалы проведенных исследований представлены в 32 научных работах (статьи, тезисы), в том числе 16 из них опубликованы в журналах, входящих в перечень, рекомендуемый ВАК.

Структура и объем диссертации

Диссертация представляет собой том машинописного текста объемом 265 страниц, состоит из введения, обзора литературы, материала и методов исследования, результатов собственных исследований и их анализа, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, содержащего 96 отечественных и 187 зарубежных источников, иллюстрирована 21 фотографиями, 28 рисунками и 20 таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Характеристика клинических наблюдений и методов исследования

В исследование включено 712 больных, которые были распределены на следующие группы. Критерии включения: возраст от 18 до 75 лет; информированное согласие; признаки внегоспитальной и нозокомиальной пневмонии согласно принятым классификациям [Чучалин А.Г. и соавт. 2006; Чучалин А.Г., Гельфанд Б.Р., 2009].

Критерии исключения: несоответствие критериям включения; наличие хронических заболеваний органов дыхания (бронхиальная астма, хроническая обструктивная болезнь легких); терминальная стадия онкологического заболевания; заболевания сердечно-сосудистой системы в стадии декомпенсации  (NYHA 4 класс); сахарный диабет в стадии декомпенсации; тяжелый неврологический дефицит, оценка по Шкале Ком Глазго (ШКГ) 8 баллов; наркомания; хронический алкоголизм; иммунодефицит;беременность.

Группу I составили 368 больных острой внебольничной пневмонией (ВП) в возрасте от 18 до 72 лет (26,0±13,9), среди которых 284 пациента – с осложненным течением.

Группа II - 344 пациента с различной нозологией в возрасте от 19 до 75 лет (39,0±15,9), среди которых в 255 случаях развилась нозокомиальная пневмония (НП), а в 89 - нет.

В зависимости от основного заболевания во второй группе были выделены четыре подгруппы:

  • «перитонит» - 110 больных в возрасте 48,5±13,9 года с общим перитонитом вследствие следующих причин (панкреонекроз – 33, кишечная непроходимость - 29, несостоятельность ранее выполненного межкишечного анастомоза - 6, перфорация полого органа – 11 (язвенная болезнь желудка и 12 перстной кишки, осложненная кровотечением и перитонитом - 5; острая трофическая язва кишечника – 3, инфекционный энтероколит, осложненный перфорацией кишечника в свободную брюшную полость - 1, перфорация кишечника во время операции на органах малого таза - 1, разрыв кисты почки - 1); тотальное нагноение лапаротомной раны - 4, абсцессы брюшной полости – 10, гангренозно-перфоративный аппендицит – 5, деструктивный холецистит – 12),
  • «травма» - 128 пострадавших в возрасте 35,3±15,7 лет (изолированная черепно-мозговая травма (ЧМТ) - 7; спинальная травма – 5; тяжелая сочетанная травма (ТСТ) без повреждения органов грудной полости - 87; ТСТ в сочетании с травмой груди - 29);
  • «ранения» - 72 человека в возрасте 27,5±9,1 лет (минно-взрывное - 61, пулевое - 6, ножевое – 3, дробовое - 2);
  • в подгруппу «другие» объединены 34 пациента в возрасте 33,4±17,8 лет, у которых НП развилась в результате манифестации инфекции из первичного гнойного очага внелегочной локализации (28 случаев) в период стационарного лечения основного заболевания. В качестве первичного локуса инфекции у данной категории больных были: обширная флегмона - 7, постинъекционные абсцессы - 2, карбункул почки, аппостемотозный пиелонефрит - 9, гангрена культи нижней конечности - 2, остеомиелит костей голени - 2, гнойно-некротический паротит - 1, аденофлегмона подчелюстной области - 2, карбункул затылочной области – 1, гнойный пансинусит – 1, гнойный эпидидимит – 1. Кроме того, в группу включены 6 случаев НП, которая развилась в раннем послеоперационном периоде после планового оперативного вмешательства (2-7-е сутки).

Группу контроля составили 178 здоровых добровольцев из числа доноров и сотрудников госпиталя в возрасте от 18 до 53 лет (21,5±5,5 лет), которые ранее не болели пневмонией.

Группы были сравнимы по полу и возрасту, но отличались по тяжести состояния в группах с нозокомиальной пневмонией при поступлении в ОРИТ (табл.1).

В группе I пневмония с односторонней локализацией – 141 (38,3%) случаев, из них 17 (12,1%) больным был выставлен диагноз крупозной ВП; в 227 (61,7%) случаев - двусторонняя с различным объемом инфильтративных изменений. Диагноз ВП выставляли на основании клинико-рентгенологических и лабораторных данных.

Таблица 1

Сравнительная характеристика больных исследованных групп, (M±)

Показатели

Группа I,

n = 368

Группа II, n = 344

перитонит, n=110

травма, n=128

ранения, n=72

другие, n=34

ВП, n=368

с НП,

n=76

без НП, n=34

с НП,

n=97

без НП, n=31

с НП,

n=54

без НП, n=18

с НП,

n=28

без НП, n=6

Число больных [абс.знач/% от общего числа в подгруппе]

368 (100,0)

76 (69,09)

34 (30,91)

97 (75,78)

31 (24,22)

54 (75,0)

18 (25,0)

28 (82,35)

6 (17,65)

Пол (мужчины/женщины), абс.знач

350/18

54/22

30/4

88/8

27/4

53/1

16/2

24/4

5/1

Возраст (лет, M±)

25,5±12,9

48,5±13,9

43,0±15,1

35,4±12,6

43,6±16,9

27,6±9,1

29,1±7,2

33,8±17,3

39,6±12,4

Тяжесть состояния при поступлении в РАО по шкале APACHE-II (баллы, M±)

12,7±3,2

14,6±3,7

13,8±3,1

15,6±4,3

14,3±4,2

15,3±3,1

13,2±1,1

18,6±3,7

13,1±3,1

Вариант поступления в РАО [абс.знач/%]:

  • из дома
  • из другого лечебного учреждения
  • внутригоспитальный переводс
  • места ранения или травмы

191 (51,9%)

168 (45,7%)

9 (2,5%)

-

15 (19,7%)

30 (39,5%)

31 (40,8%)

-

25 (73,5%)

5 (14,7%)

4 (11,8%)

-

6 (6,2%)

38 (39,2%)

13 (13,4%)

40 (41,2%)

3 (9,7%)

9 (29,0%)

3 (9,7%)

16 (51,6%)

-

5 (9,3%)

2 (3,7%)

47 (87,0%)

-

5 (27,8%)

-

13 (72,2%)

4 (14,3%)

8 (28,6%)

6 (21,4%)

10 (35,7%)

2 (33,3%)

3 (50,0%)

1 (16,7%)

-

Распространенность пневмонии [абс.знач/%]

  • односторонняя
  • двусторонняя

141 (38,3)

227 (61,7)

33 (43,4)

43 (56,6)

-

43 (44,3)

54 (55,7)

-

34 (63,0)

20 (37,0)

-

9 (32,1)

19 (67,9)

-

Длительность ИВЛ/ВВЛ

4,3±1,5

19,3±5,5

5,31±1,7

21,3±6,5

6,4±1,8

18,12±1,3

6,3±2,8

10,2±3,7

3,0±1,7

Длительность пребывания в стационаре/ из них в РАО

35,5±14,2/

4,5±3,6

53,2±19,9/

26,7±14,5

29,3±6,5/

7,3±1,7*

98,7±22,1/

26,8±17,5

44,8±11,3*/

15,4±12,1

116,6±89,8/

31,5±17,1

49,3±16,5*/

13,8±9,2*

55,3±15,4/

21,3±10,0

31,5±7,9/

7,8±4,21*

Летальность, [абс.знач/%]

32 (8,7%)

58 (76,3%)

1 (2,9%)

49 (50,5%)

1 (3,2%)

26 (48,2%)

-

18 (64,3%)

-

Примечание. Достоверность значений при внутригрупповом сравнении показателей: *р0,05

Тяжесть ВП оценивали по К.Г. Никулину (1975) и Niederman (1993): легкая степень -  84 (22,8%) пациента, среднетяжелая – 96 (26,01%), тяжелая – 188 (51,1%).

Диагностику нозокомиальной пневмонииику осуществляли на основании критерий, изложенных в российских национальных рекомендациях (2009г), и шкале CPIS (Clinical Pulmonary Infection Score). Во II-й группе из 255 случаев НП: односторонняя локализация зарегистрирована в 46,7% случаев, двусторонняя – в 53,3%.

Длительность стационарного лечения пациентов обеих групп колебалась в широких пределах, составив в I-й группе 31,6±13,1 суток (от 2-х до 128), в случаях госпитализации в ОАР - 5,0±3,4 (от 2-х до 31). Длительность госпитализации больных и пострадавших с НП составила от 6-ти до 323-ти суток (79,1±28,3, из них  в ОАР 25,6±18,1); в группе без НП – от 24-х до 118-ти суток (44,7±13,3, из них в ОАР 11,6±5,9).

В каждой группе были выделены подгруппы с благоприятным исходом «выжившие» и с неблагоприятным - «умершие». Летальность в группе I составила – 8,7% (32 из 368), в группе II – 44,8% (153 из 344).

Оценку степени тяжести состояния больных осуществляли по оценочным шкалам APACHЕ-II. Диагностика сепсиса, инфекционно-токсического шока (ИТШ) и полиорганной недостаточности (ПОН) осуществляли в соответствии с критериями Американского Колледжа Пульмонологов и Общества Реаниматологов, Согласительной Комиссии Российского Общества Реаниматологов, Согласительной конференции ACCP/SCCM в 1992 г., дополненные в 2001 г.

Материалом для бактериологического исследования были: бронхоальвеолярный лаваж (БАЛЖ), венозная кровь, содержимое плевральной полости при ее пункции или дренировании, гнойное отделяемое из ран у пациентов группы II, а также участки ткани легкого и содержимое трахеобронхиального дерева во время патоморфологичекого исследования.

Клинический и биохимический анализы крови выполняли на автоматическом гематологическом анализаторе Advia 60 (Bayer, Германия). Для проведения мониторинга газового состава смешанной венозной и артериальной крови, кислотно-основного и электролитного баланса использовали газоанализаторы «Ciba – Corning/Diagnostics (348)», «Ciba – Corning 644 Na+/K+/Cl- Analyzer» (США), Bayer 865 Blood Gas Analyzer (Bayer, Германия) и Radiometer ABL800 Flex (Австрия).

Регистрацию острого респираторного дистресс-синдрома (ОРДС) у пациентов исследованных групп осуществляли по совокупности результатов клинических данных, лабораторных и рентгенологических исследований: степень повреждения легких по шкале J. Murray et al. (1988), критерии Американо-Европейской согласительной конференции по ОРДС (1994), критерии ОРДС, предложенные НИИ общей реаниматологии имени В.А. Неговского РАМН (2006). Стадию ОРДС определяли в соответствии с классификацией НИИ общей реаниматологии имени В.А. Неговского РАМН (2007).

Морфологическое исследование

Для выявления особенностей патоморфологических изменений в легких были проанализированы 118 протоколов патологоанатомического исследования (ПАИ). Среди изученных результатов были 25 случаев внебольничной пневмонии и 93 - нозокомиальной. Во всех наблюдениях были оценены макро- и микроскопические изменения в легких.

Определение содержания цитокинов

Определено содержание провоспалительных и противовоспалительных (IL–1, IL-1, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10 и TNF-) цитокинов у 138 больных пневмонией различного генеза на 1-3-7-14-е суткам госпитализации и у 28 человек из контрольной группы. Среди больных были: 42 пациента с ВП (из группы I) и 96 - с НП (из группы II).

Материалом исследований были: сыворотка венозной крови и бронхоальвеолярная лаважная жидкость (БАЛЖ). Забор венозной крови для определения цитокинов проводили в утренние часы, натощак, до введения антибактериальных средств. БАЛЖ получали при бронхоскопии. Содержание цитокинов определяли методом твердого иммуноферментного анализа с использованием моноклональных антител на вертикальном фотометре Stat Fax 2100 (AWARENESS TECHNOLOGY Inc., США) c использованием тест-систем BioSonroe International (Франция) для IL-4, IL-8 IL-10, BioSource International (Австрия) для TNF-, IL-6, IL-1 согласно прилагаемой инструкции. Единица измерения пикограмм в миллилитре (пг/мл) биологической жидкости.

Генетическое исследование

Молекулярно-генетическое исследование выполнено в лаборатории экологической генетики Учреждения Российской академии наук Института общей генетики им. В.Н. Вавилова РАН.

Изучен полиморфизм десяти генов у 702 человек, среди которых:

  • 277 больных внебольничной пневмонией (из группы I) – ВП, из них 193 пациента с осложненным течением заболевания – группа ВП-осл.
  • 158 пациентов с нозокомиальной пневмонией (из группы II: «перитонит» – 51, «травма» - 62, «ранения» - 29, «другие» - 16) – группа IIА;
  • 89 больных с анологичной нозологией, что и во второй группе, но у которых не развилась нозокомиальная пневмония («перитонит» - 34, «травма» - 31, «ранения» - 18, «другие» - 6) – группа IIВ
  • 178 здоровых доноров. Группа контроля для всех исследований была идентична.

Больные и здоровые доноры были включены в исследование добровольно (либо получено согласие родственников), принадлежат к европеоидной расе, большая часть (83,4%) проживает в Центральной части России. Во всех группах превалировали мужчины молодого возраста.

Основные характеристики изученных генов

Гены, аллельные варианты которых при наличии определенных условий предрасполагают к определенным заболеваниям, получили название генов предрасположенности, то есть это измененные гены (аллели), которые совместимы с рождением и жизнью в постнатальном периоде, но при определенных неблагоприятных условиях способствуют развитию того или иного заболевания. Именно аллельные варианты генов предрасположенности составляют основу таких частых заболеваний как атеросклероз, ишемическая болезнь сердца, диабет, бронхиальная астма, опухоли и др. Сочетания аллельных вариантов различных генов, вовлеченных в развитие каждой конкретной патологии, получили название «генных сетей» [Баранов В.С. и соавт., 2008].

Многообразие функций легких обусловило выбор широкого спектра генов-кандидатов. Система биотрансформации ксенобиотиков при согласованном функционировании защитных механизмов служит эффективной защитой от различных токсикантов внешней среды, поступающих с вдыхаемым воздухом. Глутатион S-трансферазы - суперсемейство ферментов, участвующих в метаболизме большого числа электрофильных ксенобиотиков через конъюгацию с глутатионом, а также в метаболизме ряда эндогенных субстратов (гормонов, липидов, простагландинов, лейкотриенов). Поэтому, метаболизм ксенобиотиков через глутатионопосредованную детоксикацию играет важную роль в обеспечении устойчивости клеток к перекисному окислению жиров, свободным радикалам, алкилированию белков, в формировании резистентности к лекарственным препаратам и предотвращении поломок ДНК [Брагина Е.Ю., 2005].

  Таблица 2

Характеристика исследованных генов

Гены

Вид полимор-физма

Локализация в геноме/ идентификационный номер SNP

Функция фермента

Фенотип минорного варианта

Средние частоты генотипов

(данные OMIM)

CYP1A1-

ген цитохрома 1a 1

A4889G

Ile462Val

15q22-q24

rs1048943

1фаза детоксикации ксенобиотиков цитохром P-450-зависимыми монооксигеназами: окисление стероидов, жирных кислот, многочисленных генотоксикантов

Активность фермента повышена для генотипа G/G

A/A-0.9

A/G-0.09

G/G-0.01

T3801C

15q22-q24

rs4646903

Увеличенная индуцибельность фермента для генотипа T/C и C/C

T/T-0.62 T/C-0.38 C/C-0.00

606G>T=

A606C

15q22-q24

rs2606345

Данный SNP находится в 1 интроне, влияние на активность неизвестно

A/A-0.2, A/C-0.7 C/C-0.1

GSTM1-

ген глутатион S-трансферазы мю1

Инсерция (+) - делеция (0)

1p13.3

-

2 фаза детоксикации ксенобиотиков: присоединение восстановленного глутатиона к широкому спектру экзогенных и эндогенных гидрофобных электрофильных соединений

Отсутствие фермента: 0/0.

Наличие фермента: +/0 либо +/+

+/+-0.12

+/0-0.38

0/0-0.50

GSTT1-

ген глутатион S-трансферазы тетта1

Инсерция (+) - делеция (0)

22q11.2

-

Отсутствие фермента: 0/0.

Наличие фермента: +/0 либо +/+

+/+-0.38

+/0-0.42

0/0-0.20

GSTP1-

ген глутатион S-трансферазы пи1

A313G

Ile105Val

11q13

rs1695

Различная  активность относительно разных субстратов  для фермента, продуцируемого альтернативными аллелями.

Пониженная активность фермента для генотипа G/G

A/A-0.47 A/G-0.40

G/G-0.13

MTHFR-

ген метилен-тетрагидрофолат-редуктазы

C677T

Ala222Val

1p36.3

rs1801133

Катализирует единственную внутриклеточную реакцию

образования 5,10-метилентетрагидрофолата в 5-метилтетрагидрофолат, который необходим для восстановления гомоцистеина до метионина

Пониженная на 70% активность и повышенная термолабильность фермента для генотипа T/T

С/С-0.49 C/T-0.45

T/T-0.06

ACE-

ген

ангеотензин-1 конвертирующего фермента (АПФ)

Alu-элемент ins/del (287 п.о.)

17q23.3

rs4340

Катализирует превращение ангиотензина I в физиологически активный пептид ангиотензин II. АПФ играет ключевую роль в ренин-ангиотензиновой системе.

Делеционный полиморфизм ассоциирован с повышенным: уровнем АПФ, индексом массы тела, кардиоваскулярным риском.

I(ins)-0.7

D(del)-0.3

CCR5-

ген хемокинового

рецептора 5

del-32 п.о.

3p21.31

rs333

Рецептор для воспалительных CC-хемокинов. Передача сигнала осуществляется за счет увеличения концентрации внутриклеточного Ca. Экспрессируется T лимфоцитами и макрофагами, является ко-рецептором для макрофаг-тропных вирусов, включая HIV, необходим для проникновения вируса в клетки хозяина. Носители дефектных аллелей (делеция 32 п.о.) резистентны к HIV инфекции.

В результате делеции наступает сдвиг рамки считывания и преждевременная терминация трансляции, образуется сильно усеченный фермент, который  не обнаруживается на поверхности клеток

I(ins)-0.95

D(del)-0.05

TNF-- ген

фактора некроза опухолей

G308A

6p21.3

rs1800629

TNF- –  цитокин, оказывающий действие на разные типы клеток благодаря модуляции экспрессии генов ростовых факторов, цитокинов, факторов транскрипции, рецепторов клеточной поверхности и острофазовых белков; играет важную роль в иммунном ответе против инфекции и опухолевого роста; стимулирует катаболизм; является ключевым медиатором воспаления

Полиморфный вариант G308A находится в промоторе гена, аллель A ассоциирован с увеличенной продукцией белка

G/G-0.68

A/G-0.32

IL-6 – ген интерлейкина 6

G174C=

G236C

7p21

rs1800795

IL-6 - цитокин, участвует в иммунном ответе и острофазовой реакции. Может модифицировать эффекты других цитокинов и взаимодействовать с глюкокортикоидами.

Предковый аллель G ассоциирован с большей активностью транскрипции, более высокой индуцибельностью и более высокими концентрациями соответствующего белка в плазме крови

G/G-0.26

C/G-0.48

C/C-0.26

ABCB1 - ген Р-гликопротеина

T3435C

7q21.1

rs1045642

3-я фаза детоксикации. Мембранный белок, гликопротеин из семейства ABC-переносчиков. Обеспечивает перенос многих веществ (липиды, стероиды, пептиды, билирубин и др.) через мембрану клетки.

Предполагается уменьшенная активность P-гликопротеина у носителей T-аллеля

T/T-0.23

T/C-0.62

C/C-0.15

Наиболее полно ферменты детоксикации представлены в печени, но для большинства из них, характерна экспрессия и в других органах, в том числе, в легких и бронхах, например, глутатион-S-трансфераз (GST) и цитохромов Р-450. CYP1A1 – индуцибельный фермент 1 фазы детоксикации, который под воздействием многих вредных факторов в наиболее высоких концентрациях регистрируется в легких. Выбор генов детоксикации ксенобиотиков в качестве генов-кандидатов был обусловлен, с одной стороны, их участием в развитии воспаления, органоспецифичностью некоторых из них к легочной ткани, с другой стороны, широкой распространенностью минорных вариантов и их комбинаций, что может быть использовано в качестве прогностического критерия при определении тактики ведения пациентов с пневмонией.

Была изучена генетическая изменчивость для следующих генов-кандидатов (табл.2): гены первой фазы детоксикации ксенобиотиков (3 полиморфных сайта гена CYP1A1: A4889G, T606G и T3801C), второй фазы (GSTM1 Ins/Del, GSTT1 Ins/Del, GSTP1 A313G), ген трансмембранного P-гликопротеина - ABCB1 T3435C, гены цитокинов (TNF- G308A, IL-6 G174C). Учитывая мнообразие функций органов дыхания, в исследование также были включены гены, участвующие в регуляции других систем гомеостаза, и которые, по литературным данным, обуславливают риск развития острых и хронических заболеваний органов дыхания: ключевой ген ренин-ангиотензиновой системы (ACE Ins/Del), ген хемокинового рецептора 5 (CCR5 Ins/Del) и ген, ответственный за синтез и метилирование ДНК, (MTHFR C677T).

Методической основой генотипирования явилась аллель-специфическая тетрапраймерная полимеразная цепная реакция (ПЦР). Метод позволяет в одной пробирке амплифицировать фрагменты ДНК различной длины, соответствующие альтернативным аллелям. Усложненная система подбора праймеров обеспечивает быстрое, надежное и дешевое генотипирование, которое проводится в один этап на стандартном оборудовании для ПЦР-лаборатории.

Подбор генов-кандидатов осуществлялся с учетом функционального характера полиморфизма, наличием сопряженности с изменением активности и/или количества соответствующего фермента, а также ассоциаций с различными биологическими эффектами и заболеваниями. Частота минорного варианта не менее 5%. Для исключения вероятности ингибирования ПЦР-реакции образцы проб с делеционными вариантами GSTM1 0/0 GSTT1 0/0 дополнительно проверяли отдельной ПЦР с внутренним контролем.

Для изученных генов характерны 2 вида полиморфизма:

  • инсерционно-делеционный – то есть наличие (инсерция), либо отсутствие (делеция) участка гена: для GSTM1~15000 п.н., для GSTT1 ~54000 п.н., для ACE – 287 п.н., для CCR5 – 32 п.н.
  • однонуклеотидный полиморфизм (Single Nucleotide Polymorphism – SNP) – для всех трех сайтов гена CYP1A1  и генов GSTP1, MTHFR, TNF-, IL-6, ABCB1.

В случае делеционно-инсерционного полиморфизма (GSTM1, GSTT1) выявлялись два генотипа: «нулевой» - гомозигота по делеции (D/D) и «положительный», несущий функциональный аллель в гомо- или гетерозиготном состоянии (I/*).

Основные компоненты лечения

Всем исследуемым больным проводили лечение в зависимости от тяжести основного заболевания и развившихся осложнений согласно современным рекомендациям.

Респираторную поддержку проводили аппаратами «Puritan Bennett 7200, 800» (Puritan-Bennett Corporation, США), Evita-XL (Draeger, Германия). Применяли вспомогательные режимы вентиляции SIMV и BIPAP в режиме с контролем по объему или по давлению. При развитии ОРДС применяли рекрутмент, в одном случае применяли эндобронхеальное введение сурфактанта BL (Санкт-Петербург, Россия) с последующим маневром «открытия легких». Параметры ИВЛ ежедневно регистрировали и корригировали в соответствии с клинической ситуацией. У больных с сепсисом, органной недостаточностью применяли экстракорпоральные методы дезинтоксикации (гемодиафильтрация, гемодиализ, дискретный плазмаферез). При выборе антибактериальной терапии основывались на Российские Рекомендации по лечению внебольничной и нозокомиальной пневмонии.

Группа I: в случаях неосложненного течения ВП назначали амоксициллин/клавулановая кислота (аугментин в/в) или цефтриаксон; при осложненном течении - в зависимости от тяжести состояния больного и вида осложнения - левофлоксацин (таваник), цефепим, тиенам, сульперазон - в/в капельно.

Группа II: применение антибактериальных препаратов начинали с момента поступления больного в зависимости от основной нозологии. Как правило, в качестве «стартовой» терапии использовали цефтриаксон, левофлоксацин (таваник) в сочетании с метронидазолом, а в случаях исходного тяжелого состояния и при развитии осложнений -  тиенам или меронем. В дальнейшем, антимикробная терапия зависела от результатов микробиологического исследования и результатов антибиотикограммы.

Больным пневмонией из группы контроля антибактериальную терапию назначали с учетом выявленных генотипов.

Критерии эффективности лечения:

  • Выздоровление определяли как полное исчезновение всех субъективных и объективных клинических признаков заболевания и положительная динамика по данным рентгенологических методов исследования. Применительно к пациентам с ВАП выздоровление заключалось в нормализации температуры, снижении количества лейкоцитов, повышении респираторного индекса, улучшении аускультативной картины, положительной динамике ранее выявленных рентгенологических изменений
  • Отсутствие эффекта определяли на основе следующих критериев: персистировние или усиление выраженности клинико-лабораторных признаков заболевания через 3-5 дней от начала терапии; развитие новых очагов инфекции или прогрессирование рентгенологических изменений; смерть от пневмонии; необходимость дополнительной антибактериальной терапии.
  • Рецидив инфекции расценивали как отсутствие эффекта.

Методы статистического анализа данных

Статистическую обработку материала проводили с использованием программных средств пакетов «STATISTICA v.6.0», «Statgraphics v.2.1». Использовали общепринятые математико-статистические методы расчета основных характеристик выборочных распределений: среднее арифметическое (M), ошибка среднего (m), стандартное отклонение (), t-критерий Стьюдента. Проведен корреляционный анализ с использованием коэффициентов парной линейной корреляции (r), тетрахорического показателя связи для качественных признаков и анализа уровня их статистической достоверности (р). Достоверным считалось различие при p<0,05.

Оценки частот гаплотипов и их эффектов были получены с помощью компьютерной программы SNPStats. Программа позволяет строить регрессионные модели количественных и бинарных признаков для произвольных типов детерминации (доминантный, рецессивный, аддитивный). Значимость различий частот генотипов оценивали с помощью точного критерия Фишера и трендового теста Армитажа.

Степень асоциации генотипов с заболеванием определяли с помощью показателя «odd ratio» (OR – мера коррелятивной связи), равного:

,

где - частота генотипа среди больных,  - частота генотипа среди здоровых.

Полученные результаты трактовали следующим образом:

  • OR=1 – указывает на отсутствие корреляций между генотипом и заболеванием.
  • OR>1 - означает повышенный риск заболевания при данном генотипе.
  • OR<1 – указывает на протективный эффект данного генотипа относительно риска
    • развития заболевания.

При определении прогностических факторов для каждого из них были рассчитаны характеристики: чувствительность, специфичность, доля правильных прогнозов, относительный риск (relative risk).

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Патоморфоз внебольничной и нозокомиальной пневмонии

Изучение патоморфоза вносит коррективы в критерии диагностики, классификацию и описание болезней. Изменения клинических и морфологических проявлений болезни по сравнению с классическими их описаниями под влиянием различных факторов внешней среды, биологических и социальных, в том числе в результате совершенствования методов лечения называется патоморфозом [Малая медицинская энциклопедия, 1991—96 гг.]. Термин «патоморфоз» ввел немецкий психолог Вильям Гельпах (Willy Hellpach) в 1929 году. Преимущественно в понятие патоморфоза вкладывают значение появившегося под воздействием внутренних и внешних факторов стойкого изменения патогенетической сущности процесса заболевания, которое находит свое отражение в изменении форм, клинической картины, течения заболеваний, вплоть до исчезновения некоторых нозологий. В связи с длительными лечебно-профилактическими мероприятиями возникает терапевтический патоморфоз. Наиболее существенна и достоверно доказана роль активных профилактических и лечебных мероприятий, особенно антибиотической терапии. Современная активная химиотерапия, гормонотерапия и другие методики изменяют картину болезни, лишая ее типичных черт. Это, так называемый, терапевтически обусловленный патоморфоз, резко изменивший не только картину многих болезней, но и заболеваемости. Под влиянием лекарственного патоморфоза происходят существенные изменения синдромогенеза заболевания [Никифоров А.С., 2010].

В результате проведенного исследования выявлены изменения в этиологическом спектре пневмоний и в структуре осложнений. Так, возросла роль микробных ассоциаций не только при развитии нозокомиальной пневмонии, но и при возникновении внебольничной, особенно в случаях осложненного течения и неблагоприятного исхода заболевания.

Результаты бактериологического исследования БАЛЖ и ткани легких умерших свидетельствуют о преобладании пневмококков (45,5%) среди выявленных возбудителей ВП, но в качестве монофлоры верифицирован лишь в трех случаях.

Возросла роль сочетаний различных стрептококков со стафилококками и грибами рода Candida. Следует отметить, что на долю ассоциаций микробной флоры пришлось 81,3%. В качестве этиологического фактора при деструктивной пневмонии были регистрированы St.aureus и Kl.pneumoniae в виде монофлоры или в ассоциации с другими патогенами. Обнаружение в БАЛЖ таких возбудителей, как St.aureus МRSA, Ac.baumannii, Ps.aerogenes было расценено как суперинфицирование больных с внебольничной пневмонией, длительно находившихся в стационаре.

Бактериологическое исследование БАЛЖ группы II выявило в 83,3% случаев микробные ассоциации, где 61,0% составил St.aureus, в том числе метициллинрезистентные St.aureus (MRSA), в 52,5% - Ps.aerugenosa. Грамотрицательная флора в 80,6% представлена за счет Kl.pneumoniae, Acinetobacter spp. и E.coli.

По результатам лечения больных летальность в группе I составила – 8,69% (32 из 368), в группе II – 44,48% (153 из 344). Патологоанатомическое исследование проведено в 118 случаях: 25 – внебольничной пневмонии и 93 – нозокомиальной. При бактериологическом исследовании БАЛЖ среди умерших микробные ассоциации были верифицированы в большинстве случаев (табл.3).        

Таблица 3

Разновидности микробных ассоциаций, выделенных из БАЛЖ, умерших пациентов исследованных групп.

Виды микробных ассоциаций в исследуемых группах

частота выявления

Группа I, n = 13:

  • Str. pneumoniae/ pyogenius + Haemophilus influenza/ hemolythycus ±  Candida tropicalis ± Neisseria
  • Str. pneumoniae + St.aureus ± E.coli
  • St.pneumoniae + Kl. pneumonia ± H.hemolythycus ± Candida
  • St.aureus MRSA+ Ps.aeruginosa + Kl. pneumoniae + Proteus mirabilis + Candida spp
  • Kl.pneumoniae + Haemophilus influenza + Morganella morganii + Neisseria

5

3

2

1

2

Группа II, n=59:

  • St.aureus/др.стафилококки + Ps.aeruginosa + E. coli ± Enterococcus ± Candida albicans
  • St. aureus MRSA + Ps.aeruginosa+ Ac.baumannii/calcoaticus  ± Enterococcus
  • St.aureus MRSA + Candida alb./другие+ Neisseria
  • Ps.aeruginosa + Kl. pneumoniae ± E. coli ± Candida alb/другие ± Ac.baumanni
  • Kl.pneumoniae + E.coli
  • Kl.pneumoniae + St.aureus/MRSA ± Ac.baumanni ± Candida alb./другие
  • Str.hemolythycus + Ac.baumannii

12

13

3

11

6

11

3

В качестве непосредственной причины смерти были:

в группе I: пневмония (68,0%) и ОРДС на фоне пневмонии (12,0%)

во II-й группе: токсемия вследствие основного заболевания (22,6%), сочетание нескольких причин (21,5%), пневмония (15,1%), сепсис (12,9%) и прогрессирование органной недостаточности (17,3%) (таб.4).

       Таблица 4

Непосредственные причины смерти у больных исследованных групп

по результатам аутопсии

Показатели

Частота встречаемости показателя, [абс.зн/%]

Непосредственная причина смерти

Группа I, n=25

Группа II, n=93

Пневмония

17 (68,0)

14 (15,1)

Токсемия вследствие основного заболевания

-

21 (22,6)

Сепсис

-

12 (12,9)

Органная недостаточность

1 (4,0)

16 (17,2)

ОРДС

3 (12,0)

4 (4,3)

Некардиогенный отек легких

2 (8,0)

1 (1,1)

Геморрагический шок (кровопотеря)

1 (4,0)

2 (2,1)

ТЭЛА

-

2 (2,1)

Отек головного мозга

-

1 (1,1)

Сочетание различных осложнений

1 (4,0)

20 (21,5)

Анализ клинико-лабораторных и морфологических данных показал, что ОРДС, включая острое повреждение легких, у больных пневмонией различного генеза, встречался чаще, по сравнению с традиционными представлениями.

При внебольничной пневмонии ОРДС зарегистрирован в 36,0% (13 из 25) наблюдений, в двенадцати случаях - на фоне прогрессирования воспаления в легких, в одном – после гемотрансфузии у больного с двусторонней полисегментарной пневмонией, осложненной острой перфорацией язвы желудка, внутрибрюшным кровотечением.

Разнообразие нозологических форм основного заболевания у пациентов II-й группы обусловило разнообразие причин развития острой дыхательной недостаточности (ОДН). В группе нозокомиальной пневмонии ОДН в 44,1% случаев (41 из 93) была обусловлена различными стадиями ОРДС, что самостоятельно или в сочетании с другими осложнениями послужило причиной летального исхода. В 46,3% случаев (19 из 41) ОРДС предшествовал появлению пневмонической инфильтрации, в остальных  - на фоне нозокомиальной пневмонии.

При этом, независимо от причины, вызвавшей ОРДС, морфологические изменения в легких носили схожий характер. В случаях нозокомиальной пневмонии в различных участках легких можно было увидеть практически все стадии развития процесса.

При гистологическом исследовании легких умерших на ранних стадиях ОРДС, отмечали ателектазы, отек межальвеолярных перегородок, в некоторых из них – диапедезные кровоизлияния, в просветах альвеол обнаруживаются полинуклеары, макрофаги и фибрин. Во всех случаях отмечены признаки расстройства кровообращения: расширение просвета сосудов, утолщение стенок, наличие в просвете сосудов агрегированных эритроцитов.

На вторые-третьи сутки ОРДС преобладал интерстициальный отек, выявляли гиалиновые мембраны. Через пять суток превалировали воспалительные изменения, отмечался резкий альвеолярный отек (субтотальный или тотальный), многочисленные кровоизлияния, увеличивалось количество гиалиновых мембран. В таких случаях развития ОРДС на фоне внебольничной пневмонии на первый план выступали процессы воспаления, так как распространение инфильтрации приводило к углублению структурных нарушений в легких и сопровождалось характерными клиническими и лабораторными признаками (наростанием дыхательной недостаточность, гипоксемии, лейкоцитоза и т.д.).

Анализ результатов патологоанатомических исследований легких пациентов, длительно находившихся на ИВЛ (более 10 суток), показал, что в большинстве случаев при небольшой продолжительности респираторной поддержки (до 7 суток) доминируют изменения, присущие ОРДС: увеличение массы легких, интерстициальный и альвеолярный отек, стаз и сладжирование форменных элементов крови в капиллярах, лейкостазы, фибриновые тромбы, кровоизлияния, гиалиновые мембраны, ателектазы и дизтелектазы.

По мере увеличения продолжительности ИВЛ превалировали изменения воспалительного характера: наличие гнойных очагов, скопление экссудата, состоявшего из полиморфноядерных нейтрофилов, макрофагов, фибрина и слущенного эпителия в альвеолах, нейтрофильная инфильтрация межальвеолярных перегородок с их последующим формированием абсцессов, эмпиемы плевры.

Причины патоморфоза сложны и многообразны. Предполагаемая возможная причина естественной эволюции болезни (естественный патоморфоз) кроется в эволюции патогенных свойств возбудителя (мутаций бактерий и вирусов), а также сдвигов в иммунном статусе человека (генетически закрепленная иммунизация организма) [Блейхер В.М., Крук И.В., 2002].

Роль полиморфизма генов-кандидатов в предрасположенности к риску возникновения пневмонии различного генеза

Одним из методов генетики мультифакториальных заболеваний, к которым относится и пневмония, является исследование ассоциации полиморфных вариантов генов, продукты которых предположительно задействованы в развитии и регуляции тех или иных звеньев патогенеза заболевания [Silverman E., Palmer L., 2000, Hall I., 2002; Wright C.M....Fong K.M.  2010]. Современные представления о генетической составляющей мультифакториальных заболеваний во многом связаны с концепцией подверженности и порогового проявления многофакторного фенотипа [Dorman S.E., Holland S.M , 2000]. Согласно этой концепции подверженность заболеванию наследственно обусловлена, но реализация ее возможна только при взаимодействии с факторами среды. С позиции изучения роли «общих» генов в развитие различных болезней особую актуальность приобретает исследование системы генов метаболизма ксенобиотиков, поскольку ферментами этой системы осуществляется метаболизм не только большинства разнообразных по химической структуре экзогенных молекул, но и многочисленных эндогенных веществ, например, медиаторов воспаления.

Были сформированы выборки и создана база ДНК для 524 больных и 178 доноров. Изучена генетическая изменчивость 10 генов у больных с различной нозологией (внебольничноя пневмония, перитонит, тяжелая сочетанная травма и ранения, гнойно-воспалительные заболевания различной локализации) и здоровых доноров.

Анализ частот встречаемости однолокусных генотипов 12 полиморфных сайтов для контрольной популяции и больных ВП выявил, что риск развития внебольничной пневмонии ассоциирован с инсерционным вариантом GSTM1 Ins/Del (генотип I/*) (p=0,012, OR=1,65), мажорным аллелем 606T в гомозиготном состоянии  гена CYP1A1 T606G (генотип 606T/T) (p=0,016, OR=1,61) и делеционным аллелем гена ACE Ins/Del в гомозиготном состоянии (генотип D/D) (p=0,002, OR=1,97) (табл. 5).

Таблица 5

Частоты однолокусных генотипов в исследованных группах.

Локусы

Генотипы

Частота встречаемсти генотипа в группах, [абс.зн/%]

Контроль

(N=178)

ВП

(N=277)

ВП-осл

(N=193)

CYP1A1

A4889G

A/A

167 (93,8)

218 (89,7)

178 (92,2)

A/G

11(6,2)

25 (10,3)

15 (7,3)

CYP1A1

T3801C

C/C

0 (0,0)

1 (0,4)

1 (0,5)

T/C

39 (21,9)

46 (19,0)

30 (15,6)

T/T

139 (78,1)

195 (80,6)

161 (83,9)

CYP1A1

T606G

T/T

77 (43,2)

134 (55,1) #

115 (59,6) #

T/G

74 (41,6)

81 (33,3)

62 (32,1)

G/G

27 (15,2)

28 (11,5)

16 (8,3)

ACE

Ins/Del

D/D

40 (22,5)

82 (33,7) ##

61 (31,6) #

D/I

89 (50,0)

103 (42,4)

79 (40,9)

I/I

49 (27,5)

58 (23,9)

53 (27,5)

CCR5

Ins/Del

D/D

1 (0,6)

1 (0,4)

1 (0,5)

I/D

31 (17,4)

40 (16,5)

36 (18,7)

I/I

146 (82,0)

202 (83,1)

156 (80,8)

GSTM1

Ins/Del

D/D

92 (51,7)

94 (38,7)

74 (38,3)

I/*

86 (48,3)

149 (61,3) #

119 (61,7) #

GSTT1

Ins/Del

D/D

32 (18,0)

49 (20,2)

42 (21,8)

I/*

146 (82,0)

194 (79,8)

151 (78,2)

GSTP1

A313G

A/A

78 (44,1)

45 (48,4)

32 (54,2)

A/G

87 (49,1)

45 (48,4)

26 (44,1)

G/G

12 (6,8)

3 (3,2)

1 (1,7)

ABCB1

T3435G

T/T

93 (70,99)

128 (69,94)

109 (68,99)

T/G

35 (26,72)

49 (26,78)

41 (25,95)

G/G

3 (2,29)

6 (3,28)

8 (5,06)

MTHFR

C677T

C/C

74 (41,6)

40 (44,0)

23 (39,0)

C/T

88 (49,4)

43 (47,2)

32 (54,2)

T/T

16 (9,0)

8 (8,8)

3 (6,8)

TNF-a

G308A

G/G

126 (71,6)

207 (79,6)

141 (77,5)

G/A

50 (28,4)

53 (20,4)

41 (22,5)

A/A

0 (0,0)

0 (0,0)

0 (0,0)

IL-6

G174C

G/G

54 (30,5)

82 (29,7)

60 (31,1)

G/C

93 (52,5)

134 (48,6)

88 (45,6)

C/C

30 (17,0)

60 (21,7)

45 (23,3)

  # р0,05 - относительно контрольной группы

  ## р0,01 - относительно контрольной группы

Примечание. Число лиц, генотипированных по отдельным локусам, может несколько отличаться. Светло-серым цветом выделены случаи достоверного отклонения от распределения Харди-Вайнберга (дефицит гетерозигот); темно-серым цветом отмечены генотипы, ассоциированные с риском возникновения внебольничной пневмонии. Контрольная выборка в ассоциативных исследованиях внебльничной и нозокомиальной пневмонии полностью совпадает.

Косвенным подтверждением этих наблюдений является сильное нарушение распределения Харди-Вайнберга (дефицит гетерозигот, p<10-6)  в группе больных для локуса CYP1A1 T606G (и только для него). В контрольной популяции все изученные локусы находились в состоянии равновесия по Харди-Вайнбергу.

Для двух локусов зарегистрирован эффект дозы гена: в группах больных и здоровых достоверно отличаются частоты встречаемости аллелей 606T и 606G гена CYP1A1 (p=0,049, OR=1,34), а также частоты делеционных и инсерционных аллелей гена ACE (p=0,017, OR=1,39).

В ходе исследования была получена важная информация о взаимодействии ферментов системы метаболизма первой и второй фаз для оценки их вклада в подверженность к риску развития заболевания у носителей определенных сочетаний генотипов.

Проведенный анализ показал, что в ряде случаев однолокусные эффекты усиливались при рассмотрении комбинаций локусов. Относительно предрасположенности к возникновению ВП наиболее значимой оказалась комбинация локусов GSTM1 I/* - CYP1A1 606Т (p=0,006; OR=1,9) (рис.1).

Рис.1. Частота распределения генотипов предрасположенности и их комбинаций к возникновению внебольничной пневмонии в группах больных и контрольной выборке (группа ВП и группа К-ВП).

Примечание. CYP1A1 606T – сокращенное название гена CYP1A1 T606G.

В результате сравнительного анализа частот встречаемости генотипов предрасположенности к ВП среди контрольной выборки (178 человек) была выделена группа риска, которую составили 137 человек (76,9%), имеющие один из генотипов или их комбинацию. Гомозиготы по аллелю 606Т/T гена CYP1A1 составили 75 случаев (54,74%); гомозиготы по делеции в локусе ACE D/D – 35 (25,55%), «положительные» генотипы локуса GSTM1 I/* - 84 случая (61,31%). Комбинация двух генотипов CYP1А1 606Т/T - GSTM I/* выявлена у 36 человек (26,28%), сочетание трех генотипов предрасположенности зарегистрировано у 7 человек (5,11%).

Анализ наблюдений, зарегистрированных в течение четырех лет, показал, что с диагнозом «острая внебольничная пневмония» в госпиталь поступили 47 человек из контрольной группы (К-ВП). После детального обследования диагноз пневмонии был верифицирован в 44 случаях, в двух – острый бронхит, синусит, в одном диагностирован очаговый туберкулез легких.

Среди заболевших внебольничной пневмонией из контрольной выборки - 39 человек (88,64%)  из группы «риска». По частоте встречаемости среди заболевших из группы «риска» генотипы предрасположенности распределились следующим образом:

CYP1A1 606T/T – 74,36%; GSTM1 I/* - 61,54%; ACE D/D – 34,38%.

Анализ частот генотипов у заболевших из группы контроля (К-ВП) выявил высокую степень сопряженности мажорного варианта гена CYP1A1 с риском развития ВП, различия по отношению к общему контролю высоко достоверны (р=0,0013 по трендовому тесту Армитажа). Этот факт является независимым подтверждением ассоциации аллеля 606T гена CYP1A1 с риском развития внебольничной пневмонии.

Среди заболевших из контрольной группы было выявлено 15 носителей комбинации локусов GSTM1 I/* - CYP1A1 606Т, что составило 34,09% от всей группы и 65,2% среди других вариантов сочетаний генотипов.

Взаимосвязь полиморфизма генов детоксикации ксенобиотиков и ренин-ангиотензиновой системы с развитием осложнений в исследованных группах

В ходе исследования у пациентов I и II групп были зарегистрированы различные осложнения основного заболевания. Среди больных ВП - 193 (69,68%) случая осложненного течения. В группе ВП-осл (193 больных) чаще всего регистрировались инфекционно-токсический шок (ИТШ) – 61,66%, плеврит – 50,78% и токсический миокардит – 15,47%, а в 16 случаях они сочетались у одного и того же больного; деструктивные (абсцесс легкого, эмпиема плевры, пневмоторакс) составили – 4,66%, ПОН – 1,55%, сепсис – 0,5%.

Обращает на себя внимание большая частота развития ОРДС среди больных внебольничной пневмонией и некардиогенного отека легких – 7,25%. Во второй группе частота развития ОРДС, ПОН и сепсиса была значительно выше, что обусловлено основной нозологией (тяжелая сочетанная травма, минно-взрывные ранения, гнойно-воспалительные заболевания различной локализации).  Сравнение частоты развития критических состояний в группах показало, что различные стадии ОРДС в подгруппе IIВ развились в 13% случаев, тогда как в группе IIA – в 36,7%; ПОН – 3,0% против 29,8%; сепсис – 1,0% против 15,8% соответственно.

Результаты сравнительного анализа по исследованным генам свидетельствует, что выявленные гены предрасположенности статистически достоверно ассоциированы с развитием осложнений при внебольничной пневмонии: GSTM1 I/* (p=0,045, OR=1,4), CYP1A1 606T (p=0,0017, OR=1,62), ACE D/D (p=0,048, OR=1,7).

Во II группе - 234 (94,75%) случаев, из них 158 (53,97%) - нозокомиальной пневмонии. Риск развития НП ассоциирован с генами: GSTP1 A313G и ABCB1 T3435C.

По гену GSTP1 (генотип G/G) результаты значимы относительно популяционного контроля (по тесту Армитажа p=0,03, имеет место аддитивный эффект). При сопоставлении частот аллельных вариантов по тесту Фишера в подгруппах IIA и IIB различия достоверны по рецессивной модели (p=0,05, OR=3,42). Зарегистрированы отличия по C-аллелю гена ABCB1 в отношении развития нозокомиальной пневмонии на уровне тенденции (р=0,08 по Фишеру). В группе IIB генотип C/C по локусу ABCB1 не выявлен (рис.2).

По аллелю 606T гена CYP1A1, ассоциированному с повышенным риском возникновения ВП, в отношении нозокомиальной пневмонии наблюдается тенденция. Частота генотипа T/T гена CYP1A1 повышена в группе IIA по сравнению с контролем (тест Армитажа, рецессивная модель, p=0,082) и относительно группы IIB (тест Армитажа, доминантная модель, p=0,075).

Рис.2. Встречаемость различных генотипов генов GSTP1 A313G и ABCB1 T3435G среди больных IIA, IIB групп и контрольной выборке.

Сравнительный анализ результатов генотипирования не выявил у больных исследованных групп статистически значимых различий в частоте встречаемости генотипов по изученным генам в зависимости от вида развившихся осложнений. Однако, было зарегистрированно, что аллельные варианты локуса ACE достоверно отличаются в группе «выживших» при развитии таких критических состояний как ОРДС, сепсис и органной недостаточности.

В группе IIA наибольшее число случаев критических состояний – 84,8% (134 из 158). Этот факт подчеркивает, что развитие нозокомиальной пневмонии всегда утяжеляет стояние больного, являясь, в ряде случаев, причиной или следствием критического состояния.

В группе ВП-осл тяжелые осложнения (ОРДС, сепсис, ПОН) развились в 19 случаях (9,84%), выжили менее половины (8 пациентов), семь из них носители аллеля I/* (87,5%).

В группе IIA благоприятный исход при критических состояниях был в 57 случаях (из 134), обладателями аллеля I/* были пятьдесят два из них (91,23%) (рис.3,4). В группе IIB достоверных различий преобладания одного из вариантов в зависимости от исхода критического состояния не получено.

В ходе проведенного исследования выявлено, что благоприятный исход в группе IIA ассоциирован с инсерционным аллелем гена ACE (генотип I/*) (p=0,01 по доминантной модели), тогда как альтернативный генотип D/D – с летальным исходом (р=0,01). В группе осложненного течения внебольничной пневмонии (ВП-осл) все случаи летального исхода при ОРДС сопряжены с D-аллелем в гомо-или гетерозиготном вариантах (p=0,047, по доминантной модели) (табл.6).

Таблица 6

Частота встречаемости различных вариантов генотипов гена ACE Ins/Del в исследованных группах больных при развитии критических состояний (ОРДС, ПОН, сепсис)

Показатели

Значение показателей

Группы

ВП-осл

группа IIА

группа IIB

Количество случаев осложнений

n=19

n=134

n=34

в=8

у=11

в=57

у=77

в=30

у=4

ACE I/I, [абс.зн/%]

3 (37,5)

2 (18,18)

27(47,37)

11 (14,28) ##

24 (80,0)

4 (100,0)

ACE I/D, [абс.зн/%]

4 (50,0)

2 (18,18)

25 (43,86)

25 (32,47)

4 (13,33)

0 (0,0)

ACE D/D, [абс.зн/%]

1 (22,5)

7 (77,78)#

5 (8,77)

41 (53,25)##

2 (6,67)

0 (0,0)

Примечание. Использованные в таблице «в» и «у» - сокращенное обозначение исхода основного заболевания (выжившие/умершие). Достоверность значений при внутригрупповом сравнении «выжил»/«умер»: #  - р< 0,05; ##  - р< 0,01.

Полученные результаты ассоциативного исследования свидетельствуют в пользу того, что в этиологии и патогенезе пневмонии задействовано множество генов, каждый из которых в отдельности вносят свой вклад в общую генетическую подверженность к пневмонии, особенностям ее течения и лечения.

Генотипы протективной направленности среди изученных локусов в отношении развития внебольничной и нозокомиальной пневмонии

Сравнительный анализ распространенности аллельных вариантов генов CYP1A1 G600T и GSTM1 Ins/Del показал, что G-аллель гена CYP1A1 в гомо- или гетерозиготном варианте и гомозиготы по делеции локуса GSTM1 (генотип D/D) достоверно чаще встречаются у здоровых доноров (OR=0,66 при p=0,005), что трактовали как протективный эффект. При сочетании протективных генотипов эффект усиливается (табл.7). Наиболее значим в этом отношении вариант CYP1A1 606G/* - GSTM1 D/D, который ассоциирован с уменьшением шансов заболеваемости внебольничной пневмонией в 2 раза по сравнению с генотипом “риска”  CYP1A1 606T/T – GSTM1 I/* (OR=0,50 при p=0,003). Необходимо отметить, что протективный эффект генотипа 606G/G гена CYP1A1 в гомозиготном варианте проявился лишь в случаях внебольничной пневмонии (OR=0,50 при p=0,001), тогда как гетерозиготный вариант 606T/G встречается достоверно реже как при внебольничной, так и при нозокомиальной пневмонии (OR=0,50 при p=0,003).

Таблица 7

Частота встречаемости протективных генотипов в исследованных группах

Локус, сайт

Частота встречаемости генотипа в исследованных группах, [абс.зн/%]

контроль, не заболели ВП, N=134

К-ВП

N=44

ВП

N=277

группа IIA

N=158

группа IIB

N=89

CYP1A1 606T/G

63 (47,01) ##

11 (25,0)

81 (33,3)

14 (8,92)

48 (53,93) *

CYP1A1 606G/G

25 (18,66) #

3 (6,82)

28 (11,5)

70 (44,59)

10 (11,24) *

GSTM1 D/D – CYP1A1 606G/G

14 (10,45)

2 (4,55)

11 (3,97)

4 (2,53)

8 (8,99) *

GSTM1 D/D – CYP1A1 606T/G

33 (24,63) #

5 (11,36)

33 (11,91)

8 (5,06)

19 (21,35) *

# р< 0,05 - относительно контрольной популяции, не заболевшей пневмонией

## р< 0,01 – относительно контрольной популяции, не заболевшей пневмонией

* р< 0,01 – внутригрупповое сравнение (при сравнении IIA и IIB)

Еще более значителен этот эффект у носителей комбинации генотипов:

GSTM1 D/D – CYP1A1 606G/G (р< 0,01);

GSTM1 D/D – CYP1A1 606T/G (р< 0,01);

GSTM1 D/D – CYP1A1 606G/G - CYP1A1 606T/G (р<0,001).

Протективный эффект по локусам CYP1A1 G600T и GSTM1 Ins/Del наиболее убедителен в группе «отрицательного» контроля по отношению к возникновению НП (табл.6). В группе IIB были пострадавшие с тяжелыми сочетанными травмами, ранениями, а также больные с различными воспалительными заболеваниями, которые при поступлении имели интрапульмональные осложнения (гидроторакс, травматический пневмо- и/или гемоторакс, травматический пульмонит, различные стадии ОРДС), но в дальнейшем, нозокомиальная пневмония у них не развилась. Носителей протективных генотипов в этой группе было 65,17%, в том числе сочетаний - 30,34%.

Роль аллелей генов детоксикации ксенобиотиков в различной эффективности антибактериальной терапии при лечении больных внебольничной пневмонией.

Одна из основных тенденций современной фармакотерапии — выработка индивидуального подхода к назначению лекарственных препаратов, направленная на повышение эффективности лечения. На основании данных ранее проведенных исследований установлено, что при воспалении и инфекции происходит изменение уровня активности цитохромов Р450, авторы предполагают задействование системы метаболизма в защите организма от последствий развертывания воспалительных реакций при заболевании [Сибиряк С.В., 2003; Бикмаева А.Р. и соавт., 2004; Prandota J, 2002]. Знания об участии ферментов системы метаболизма в биотрансформации лекарственных препаратов, позволяют найти и избежать причины, определяющие нежелательные проявления терапевтического действия лекарств [Dickinson D.S. et al., 1981; Roy B. et al., 2001; Huang Y. S. et al., 2002, 2003].

Основным органом, участвующим в метаболизме лекарств, является печень, где обозначены самые высокие концентрации ферментов метаболизма по сравнению с другими органами и наибольшее разнообразие экспрессируемых форм [Райс, Гуляева, 2000]. Полиморфизм генов метаболизма ксенобиотиков в настоящее время активно изучается в отношении индивидуальной чувствительности к лекарственной терапии и, особенно в проявлении многообразных побочных реакций, связанных с лечением.

Межиндивидуальная изменчивость до 104 раз характеризует эффективность и безопасность применения большинства лекарственных препаратов [Guengerich F.P. 2003]. Одна из причин, определяющих такую вариабельность - генетически детерминированные различия в активности ферментов детоксикации ксенобиотиков, метаболизирующих лекарственные вещества. Система детоксикации ксенобиотиков состоит из двух стадий. На 1-ой стадии происходит активация соединений посредством цитохромов P-450 и ряда других ферментов, на 2-ой фазе – собственно детоксикация реактивных гидрофильных метаболитов с участием глутатион-S трансфераз и других белков. Кроме детоксикации токсичных экзо- и эндогенных соединений ферментами 1 и 2 стадий, осуществляется также активный выброс этих веществ и их реактивных метаболитов из клеток против градиента концентрации посредством работы белков – транспортеров [Cole SP, Deeley RG., 2006]. У ферментов детоксикации ксенобиотиков чрезвычайно широкий спектр субстратов, индукторов и ингибиторов [Schilling C, et al., 2007]. При ряде заболеваний вариабельность индивидуального ответа сопряжена с аллелями генов 2-ой стадии детоксикации ксенобиотиков GSTM1, GSTT1, GSTP1 и гена транспортера ABCB1 (ген P-гликопротеина, другое название – ген полилекарственной резистентности MDR-1) [Zheng H., et al., 2002; Asano T, et al., 2003; Kishi S., et al., 2007; Maggini V, et al., 2008].

В проведенном исследовании по оценке роли фармакогенетического статуса организма были изучены гены II-й фазы детоксикации ксенобиотиков - GSTM1 I/D,  GSTP1 A313G и ген ABCB1 T3435C, участвующие в регуляции метаболизма различных лекарственных препаратов и процессах утилизации метаболитов (ксенобиотиков и эндогенных субстратов).

Сопоставление генетических данных с параметрами эффективности антибиотикотерапии позволило выявить сопряженность полиморфизма гена GSTP1 A313G с результатами лечения больных внебольничной пневмонией. Статистически значимыми оказались различия в частотах генотипов гена GSTP1 в группах с альтернативными вариантами терапевтического ответа, а по локусу  ABCB1 T3435C – ассоциации получены на уровне тенденции.

Как и в основной группе больных в качестве этиологического фактора в группе К-ВП превалировали пневмококки, составив 48,4%. Среди других возбудителей были выделены:

Haemophilus influenza – 22,6%, Staphylococcus aureus – 16,1%, Neisseria perflora – 6,5%, Streptococcus -haemolyticus и Morganella morganii – по 3,2%.

Причем, в 33,3% в посевах БАЛЖ были выявлены грибы Candida tropicalis, в 13,3% - Klebsiella pneumoniae, по 6,6% - Pseudomonas spp. и Moraxella catarrhalis, что было расценено как контаминация материала микрофлорой ротовой полости.

Оценка результатов лечения больных с ВП показала, что применение амоксициллина/клавуланата (аугментин) наиболее эффективно у носителей гомозиготного варианта GSTP1 A/A (по точному критерию Фишера р=0,000[3,7Е-4]; OR=2,13; аддитивно р=0,00014).

В ходе исследования выявлено, что обладатели данного аллельного варианта (А/А) хуже переносят лечение цефалоспоринами (р=0,003; OR=2,42 по точному критерию Фишера) (рис.3). Достоверно хороший эффект получен при лечении осложненных форм пневмонии левофлоксацином (таваник) в случаях наличия генотипа А/А гена GSTP1 (р=0,003; OR=1,73, зафиксирован аддитивный эффект на уровне тенденции, р=0,06). У больных с минорным аллелем G в гомо- либо гетерозиготном состоянии отмечался положительный эффект применения  цефалоспоринов (р=0,00010 по критерию Фишера; OR=2,08) (рис.4).

Рис.3. Встречаемость различных генотипов по локусу GSTP1 A313G среди больных группы ВП (277) в зависимости от эффекта применения амоксициллина/клавуланата (аугментин).

Рис.4. Встречаемость различных генотипов по локусу GSTP1 A313G среди больных группы ВП (277) в зависимости от эффекта применения цефалоспоринов.

Относительно роли аллелей гена ABCB1 T3435C получены следующие результаты. Эффективность лечения амоксициллином/клавуланатом лучше у обладателей гомозиготного варианта гена (Т/Т), а в случаях гетерозиготного носительства (T/С) достоверно лучше эффективность при назначении цефалоспоринов (цефтриаксон, цефепим) (p=0,043; OR=0,97 по Фишеру;  аддитивный эффект р=0,08 по трендовому тесту Армитаж).

При гетерозиготном носительстве также лучше эффективность при лечении карбопенемами/имипенемами (тиенам, меронем), но достоверность результатов не представлена из-за небольшого числа случаев применения препаратов у больных внебольничной пневмонией.

Выявив сопряженность генотипа с эффективностью применения лекарственными препаратами, лечение больных, позднее заболевших из контрольной выборки, осуществляли в зависимости от выявленного генотипа.

Результаты лечения группы К-ВП подтвердили ранее полученные результаты:

  • достоверно лучше эффект применения амоксициллина/клавуланата у носителей мажорного варианта гена GSTP1 (генотип А/А) (p=0,000 [7,1E-7] по точному критерию Фишера; OR=2,58) (рис.5);
  • лучше эффективность применения цефалоспоринов III-IV поколения по доминантной модели минорного аллеля гена GSTP1 (генотип G/G) (p=0,000 [3,5E-5] по точному критерию Фишера; OR=2,37) (рис.6);
  • недостоверно лучше эффект применения таваника у носителей А-аллеля в гомо- или гетерозиготном варианте (малое число наблюдений) (рис.7).

Рис.5. Встречаемость различных генотипов по локусу GSTP1 A313G среди больных группы К-ВП в зависимости от эффекта применения амоксициллина/клавуланата (аугментин).

Рис.6. Встречаемость различных генотипов по локусу GSTP1 A313G среди больных группы К-ВП в зависимости от эффекта применения цефалоспоринов.

Рис.7. Встречаемость различных генотипов по локусу GSTP1 A313G среди больных группы К-ВП в зависимости от эффекта применения левофлоксацина (таваник).

Значение полиморфизма генов TNF-, IL-6 у больных исследованных групп

Результаты анализа вклада генотипической изменчивости по генам цитокинов (TNF- G308A, IL-6 G174C) в фенотипическое варьирование количественных, патогенетически значимых для пневмонии признаков (распространенность инфильтрации легких, степень дыхательной недостаточности, выраженность воспалительной реакции по клинико-лабораторным показателям) не выявили достоверных различий в частоте встречаемости аллельных вариантов данных генов среди больных пневмонией в зависимости от ее генеза или особенностей течения основного заболевания

Однако, среди больных обеих групп летальный исход чаще регистрировали у носителей генотипа G/G по локусу TNF- (р=0,143), но эти данные статистически не достоверны (табл.7). Различий в частоте встречаемости аллелей гена IL-6 в группах с различным течением или исходом основного заболевания выявлено не было.

Таблица 7

Частота встречаемости генотипов генов TNF-a и IL-6 в I и II группах в зависимости от исхода основного заболевания

Показатели

Значение показателей

Локус

Генотип, [абс.зн/%]

Больные исследованных групп, n=524

выжившие, n=445

умершие, n=79

TNF-a  G308A

G/G

337 (76,07)

65 (82,28)

G/A

106 (23,92)

14 (17,72)

A/A

0 (0,0)

0 (0,0)

IL-6  G174C

G/G

122 (27,54)

30 (39,47)

G/C

201 (45,37)

30 (39,47)

C/C

120 (27,09)

16 (21,06)

Анализ выраженности цитокинемии и частоты встречаемости аллельных вариантов генов TNF-a G308A и IL-6 G174C не выявил статистически достоверных различий.

Была изучена динамика содержания цитокинов в сыворотке венозной крови и бронхо-альвеолярной лаважной жидкости (БАЛЖ) у больных пневмонией различного генеза, а также при развитии критических состояний.

Содержание цитокинов в сыворотке венозной крови и бронхоальвеолярной жидкости у больных внебольничной и нозокомиальной пневмонией

Анализ результатов исследования показал, что содержание цитокинов в сыворотке венозной крови и БАЛЖ у больных пневмонией различного генеза при поступлении в ОРИТ был достоверно выше, чем у лиц группы контроля в 3,5-922 раза. Исключение составил уровень IL-4 в БАЛЖ, который в группе больных на момент начала исследования и в контрольной выборке почти не различались (табл.8). Мониторинг цитокинового профиля у больных выявил различия в зависимости от генеза пневмонии преимущественно в сыворотке венозной крови, наиболее значимые различия зарегистрированы для  IL-8 (р=0,008) и IL-1 (р=0,001) в сыворотке крови у больных II группы на 7-е и 14 сутки исследования.

  Таблица 8

Уровень цитокинов в сыворотке венозной крови и БАЛЖ у больных исследованных

групп при поступлении в ОРИТ и в контрольной группе (M±m, пг/мл)

Цитокины,

(пг/мл)

Контроль

n=28

Больные

(ВП+НП, n=137)

Контроль,

n=28

Больные

(ВП+НП, n=137)

  Венозная кровь

  БАЛЖ

IL-6

2,40±0,41

(1,0 – 3,86)

214,07±34,00***

(2,0 - 2182,0)

7,07±1,71

(0,73 – 20,28)

358,23±53,00**

(12,18 – 1800,60)

IL-1

2,21±0,49

(0,14 – 4,95)

8,98±1,43**

(1,66 – 103,0)

28,31±7,99

(0,86 – 79,18)

217,30±29,52**

(12,38 – 512,84)

IL-8

19,61±4,30

(4,79 – 34,32)

235,68±43,86***

(11,08 – 2834,0)

132,0±17,76

(70,0 – 168,0)

2751,80±242,09***

(9,41 – 4973,48)

TNF-

5,27±1,01

(0,01 – 10,62)

32,05±4,99***

(3,9 – 360,0)

9,50±2,53

(0,1 – 19,41)

60,17±13,48***

(2,01 – 2014,0)

IL-10

3,40±0,38

(1,96 – 6,19)

13,14±1,94***

(0,3 – 92,10)

8,67±2,37

(3,94 – 28,45)

33,99±11,61***

(2,01 – 530,0)

IL-4

2,34±0,99

(0,1 – 7,71)

6,03±0,69**

(0,68 –35,45)

5,81±1,33

(0,11 – 10,99)

6,00±0,49

(0,86 – 15,46)

Примечание. В скобках указаны минимальные и максимальные значения.

Достоверность значений по отношению к контрольной группе:

*р<0,05 **р<0,01, ***р<0,001

Результаты исследования показали, значимое повышение IL-8 (р=0,008) и IL-1 (р=0,001) в сыворотке крови у больных II группы на 7-е и 14 сутки исследования. Уровень этих же цитокинов достоверно повышался во второй группе и в БАЛЖ: IL-8 (р=0,018); IL-1 (р=0,05) (таб.7). При этом динамика изменений цитокинов была неодинаковой и зависела от течения основного заболевания, степени тяжести пневмонии, вида развившихся осложнений.

Учитывая, что при пневмонии очаг воспаления локализован в легких, получены достоверные различия в содержании цитокинов непосредственно в БАЛЖ. В группе I значительное повышение TNF- зарегистрировано в 1-е сутки - 116,85±31,89 (р=0,004) и на 7-е сутки – 221,90±112,16 (р=0,003), с последующим их снижением, а во II-й группе – увеличение на 3-и сутки с 34,85±11,85 до 81,91±29,07, на 14-е сутки достигало  191,95±87,09 (р=0,05) (таб.8).

Наиболее распространенный временной промежуток манифестации НП, в том числе вентилятор-ассоциированной (ВАП), соответствовал 7-10-м суткам, а сепсиса и органной недостаточности – 7-14-м суткам и позже.

Динамика уровня цитокинов в группах I и II при развитии критических состояний (ОРДС, сепсис, органная недостаточность)

Сравнительный анализ показал, что динамика уровня цитокинов (IL-6, IL-8, IL-1, TNF-, IL-10 и IL-4) в сыворотке крови у больных исследованных группах при развитии критических состояний схожа независимо от вида осложнений, но несколько отличается количественно, что свидетельствует об общих механизмах развития.

При развитии критических состояний (ОРДС, сепсис, органная недостаточность) содержание цитокинов TNF-, IL-6 и IL-1 характеризуется высокими величинами на протяжении всего периода исследования. В случаях развития ОРДС динамика уровня цитокинов в обеих группах схожа, наибольшее число достоверных различий в крови и БАЛЖ, как правило, лишь к 10-14 суткам исследования. Так, повышение содержании IL-6 в крови во все сроки исследования: в 1-е (р=0,02), 3-и (р=0,02), 7-е (р=0,009), 10-е (р=0,002) и 14-е сутки (р=0,0007), а в БАЛЖ лишь на 14-е сутки (р=0,004). Однако при развитии различных степеней ОРДС количественно содержание интерлейкинов превышала аналогичные значения в два и более раза (рис.8,9).

Рис.8. Динамика содержания IL-6 в сыворотке крови с 1 по 14-е сутки исследования у больных I - II групп.

Рис.9. Динамика содержания IL-6 в БАЛЖ с 1 по 14-е сутки исследования у больных I - II групп.

Выявлено повышение уровня IL-8 в крови при ОРДС на 3-и сутки (р=0,01), 7-е (р=0,03) и 14-е сутки (р=0,00001), а в БАЛЖ на 14-е (р=0,0009). Зарегистрирована аналогичная динамика уровня IL-1 в крови на 3-и сутки (р=0,00004), 7-е (р=0,000000), 10-е (р=0,0002) и 14-е сутки (р=0,0002), а в БАЛЖ в 1-е сутки (р=0,035) и 10-е сутки (р=0,003).

Рис.10. Динамика содержания IL-1 в сыворотке крови с 1 по 14-е сутки исследования у больных I - II групп в случаях развития ОРДС.

Рис.11. Динамика содержания IL-1 в БАЛЖ с 1 по 14-е сутки исследования у больных I - II групп групп в случаях развития ОРДС.

Среди наиболее ранних маркеров развития критических состояний выявлен уровень TNF- в крови. Так, при развитии ОРДС его содержание постоянно повышалось, начиная с первых суток исследования, составив: в 1-е сутки (р=0,02), 3-и (р=0,009) и 7-е (р=0,01), а концентрация данного цитокина в БАЛЖ достоверно менялась лишь к 10-м суткам исследования (р=0,0005) (рис.12,13).

Рис.12. Динамика содержания TNF- в сыворотке крови с 1 по 14-е сутки исследования у больных I - II групп.

Рис.13. Динамика содержания TNF- в БАЛЖ с 1 по 14-е сутки исследования у больных I - II групп.

Динамика интерлейкинов противоположной направленности в крови при ОРДС была следующей: уровень IL-4 снижался к 14-м суткам (р=0,004), при этом его содержание в БАЛЖ существенно не менялось; содержание IL-10 снижалось по сравнению с исходным и в крови (с 18,26±3,57 до 4,81±9,65, р=0,02), и в БАЛЖ (с 65,88±38,67 до 17,23±5,81, р=0,045).

Рис.14. Динамика содержания IL-4 в сыворотке крови с 1 по 14-е сутки исследования у больных I - II групп групп в случаях развития ОРДС..

Рис.15. Динамика содержания IL-4  в БАЛЖ с 1 по 14-е сутки исследования у больных I - II групп групп в случаях развития ОРДС..

Установлена сильная корреляционная связь между динамикой цитокинов в крови при развитии ОРДС и исходом основного заболевания (r=0,69).

Аналогичная тенденция наблюдалась и при оценке лабораторных показателей общее количество лейкоцитов в периферической крови, уровень средних молекул и значение лейкоцитарного индекса интоксикации (рис.16, 17).

Рис.16. Динамика количества лейкоцитов у больных ВП при развитии ОРДС в зависимости от исхода.

Достоверность значений: **р0,02; ***р0,001

Рис.17. Динамика температуры тела у больных ВП при ОРДС в зависимости от исхода.

Достоверность значений: *р0,05; ***р0,001

При развитии сепсиса наиболее ранние отличия зарегистрированы в содержании IL-10 в сыворотке крови: его значения были достоверно выше уже в первые сутки исследования по сравнению с теми, у кого не развился сепсис, составив 23,44±6,02 (р=0,002), с последующим снижением к 14-м суткам до 7,17±2,71 пг\мл. Статистически значимо различался уровень IL-1 в сыворотке крови на 3-и сутки 8,83±0,71 (р=0,03), 7-е сутки 9,31±1,06 (р=0,001) и 14-е сутки составил 10,44±2,0 (р=0,0002). В более поздние сроки зарегистрированы отличия в динамике уровня следующих цитокинов в сыворотке венозной крови: достоверное повышение IL-6 на 10-е сутки 328,02±61,98  (p=0,004) и 14-е сутки 393,11±121,65 (p=0,01) (рис.18,19).

Рис.18. Динамика содержания IL-1 в сыворотке крови с 1 по 14-е сутки исследования у больных I - II групп.

Рис.19. Динамика содержания IL-6 в сыворотке крови с 1 по 14-е сутки исследования у больных I - II групп.

Статистически значимое увеличение уровня TNF- на 14-е сутки 207,68±141,37 (р=0,02); достоверное снижение содержания  на 14-е сутки IL-8 (273,39±77,30, р=0,04) и IL-4 (1,84±0,6, р=0,001) (рис.20, 21).

Рис.20. Динамика содержания TNF- в сыворотке крови с 1 по 14-е сутки исследования у больных I - II групп.

Рис.21. Динамика содержания IL-4 в сыворотке крови с 1 по 14-е сутки исследования у больных I - II групп.

Уровень IL-10 в БАЛЖ при сепсисе был также выше в первые сутки (р=0,02) с последующим снижением к 14-м суткам с 86,91 до 9,0 пг\мл. К 14-м суткам в БАЛЖ достоверно повышался IL-6 с 286,91 до 1465,83 (p=0,02); IL-8 с 2338,72 до 3513,82 (р=0,02) и TNF-   с 21, 87 до 409,57 (р=0,01) (рис.22, 23).

Рис. 22. Динамика уровня цитокинов БАЛЖ на этапах исследования у больных пневмонией различного генеза при сепсисе.

Достоверность при сравнении: *р0,05; **р0,02; ***р0,001

Рис. 23. Динамика уровня цитокинов БАЛЖ на этапах исследования у больных пневмонией различного генеза при сепсисе.

Достоверность при сравнении: *р0,05; **р0,02; ***р0,001

Развитие органной недостаточности сопровождалось достоверным увеличинием всех исследованных цитокинов провоспалительного действия, но с 1-суток выявлены изменения уровня IL-6 (p=0,003), на 7-е сутки  (р=0,04), на 10-е (p=0,002), на 14-е (p=0,0001); IL-8 на 3-и сутки (р=0,01), на 7-е (р=0,002), на 14-е (р=0,00002); TNF- на 3-и сутки (р=0,003), на 7-е (р=0,02); IL-1 на 3-и сутки (р=0,00001), на 7-е (р=0,000000), на 10-е (р=0,0007), на 14-е сутки (р=0,00001). Одновременно достоверно снижался уровень противовоспалительных цитокинов: IL-4 в 1-е сутки (р=0,01) и 14-е (р=0,00002); IL-10 в 1-е сутки (р=0,0004) и на 14-е (р=0,004).

Содержание IL-1 в БАЛЖ было достоверно выше с первых суток (р=0,004) исследования среди тех, у кого развилась в последующем органная недостаточность, составив в 1-е сутки 293,72±53,76, а на 10-е сутки 424,55±90,17 (р=0,005).  Статистически значимо повышается уровень IL-8 в БАЛЖ на 7-е сутки с 3072,51±284,11до 3179,40±535,0 на 10-е сутки (р=0,03) и на 14-е сутки составил 3236,75±343,61 (p=0,00002). На 14-е сутки повышался уровень IL-6 (p=0,004), IL-10 (р=0,001), TNF- (р=0,002).

В ходе исследования выявлена взаимосвязь уровня цитокинов в сыворотке крови с исходом основного заболевания. Так, в группе умерших по сравнению с выжившими зарегистрированы изначально более высокие значения противовоспалительных интерлейкинов (IL-4, IL-10) в крови и БАЛЖ с последующим их достоверным снижением к 14-м суткам. Одновременно, уровень провоспалительных цитокинов (TNF-, IL-6, IL-8, IL-1) характеризовался повышением к 10-14-м суткам. Выявлена сильная корреляционная зависимость между уровнем цитокинов TNF- и IL-1 в сыворотке крови на 3-7-10-14-е сутки исследования и исходом заболевания:

TNF-: на 3-и сутки (r=0,69), 7-е (r=0,8), 10-е (r=0,92) и 14-е сутки (r=0,98)

IL-1: на 7-е сутки (r=0,68), 10-е (r=0,95) и 14 (0,96).

В целом, полученные результаты свидетельствуют, что наличие определенных генотипов генов ферментов метаболизма ксенобиотиков, гена ангиотензин-превращающего фермента их комбинаций может оказывать существенное влияние на предрасположенность к риску возникновения внебольничной и нозокомиальной пневмонии. Результаты ассоциативного исследования показали участие генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков и гена ACE Ins/Del в развитии осложненного течения пневмонии, выявлена связь с исходом критических состояний, что позволило раскрыть некоторые генетические аспекты пневмонии как многофакториального заболевания.

В ходе исследования показано влияние изученных генов, задействованных в формировании клинического фенотипа заболеваний: гены GSTM1 Ins/Del, GSTP1 A313G , CYP1А1 G606T и  ACE Ins/Del связаны с особенностями течения и исходом заболевания. Одним из предполагаемых функциональных механизмов, лежащих в основе полученных ассоциаций, может быть участие белковых продуктов соответствующих генов в метаболизме эндогенных ксенобиотиков, в том числе многочисленных медиаторов воспаления. Актуальность продолжения исследований сравнительного характера клинически различных групп заболеваний не вызывает сомнения, поскольку полученные результаты позволяют не только приблизиться к пониманию молекулярно-генетических основ подверженности к ним, но и в дальнейшем открывают перспективы профилактики их развития.

Выводы

  1. Изучение патоморфоза пневмоний выявило изменение структуры осложнений в виде увеличения числа случаев респираторного дистресс синдрома и снижения частоты развития гнойно-деструктичных осложнений, а также повышения роли микробных ассоциаций (St. aureus MRSA ± Ps.aeruginosa+ Ac.baumannii; Kl. pneumoniae ± E. coli + Ac.baumanni) в развитии критических состояний.
  2. Аллельные варианты генов детоксикации ксенобиотиков и гена ангиотензин-превращающего фермента сопряжены с риском возникновения внебольничной пневмонии: CYP1A1 606T/T (р=0,016; OR=1,61), GSTM1 I/* (р=0,012; OR=1,65) ACE D/D (р=0,002; OR=1,97).
  3. Аллельные варианты изученных генов ассоциированы с развитием осложненного течения внебольничной пневмонии: CYP1A1 (606T/T) (р=0,0017; OR=1,62), GSTM1 (I/*) (р=0,045; OR=1,4) и ACE (D/D) (р=0,048; OR=1,7).
  4. Минорный аллель гена GSTP1 A313G (генотип G/G) сопряжен с повышенным риском развития нозокомиальной пневмонии (р=0,03; OR=3,42).
  5. Инсерционно-делеционный полиморфизм гена ACE Ins/Del ассоциирован с исходом критических состояний: генотипы I/I и I/D сопряжены с благоприятным исходом (р=0,01), а генотип D/D – с летальным (р=0,01).
  6. Генотип 606G/* гена CYP1A1 обладает протективной направленностью относительно риска развития пневмонии различного генеза (р=0,005; OR=0,66).
  7. Однолокусные эффекты усиливаются в случаях комбинации генотипов: относительно предрасположенности к риску возникновения внебольничной пневмонии значимо сочетание CYP1A1 606T/T - GSTM1 I/* (р=0,006; OR=1,9); более выраженное протективное влияние при выявлении комбинации GSTM1 D/D - CYP1A1 G606T (р=0,003; OR=0,5).
  8. Аллельные варианты гена детоксикации ксенобиотиков GSTP1 A313G сопряжены с эффективностью антибактериальной терапии при лечении внебольничной пневмонии: у носителей генотипа A/A лучше результаты лечения амоксициллином/клавуланатом (р=0,00004; OR=2,13) и левофлоксацином (р=0,003; OR=1,73); у носителей G-аллеля в гомо- и гетерозиготном состоянии лучше результаты лечения цефалоспоринами 3-4 поколений (р=0,00010; OR=2,08).
  9. Результаты ассоциативного исследования позволили выявить группу людей повышенного риска возникновения внебольничной пневмонии, госпитализировать больных на ранних стадиях заболевания, осуществить индиндивидуальный подход к назначению антибактериальной терапии по данным генотипирования, что способствовало уменьшению количество случаев осложненного течения заболевания с 69,7% до 9,1% и сокращению длительности госпитализации с 28,7±3,1 до 16,6±1,9 суток.
  10. Прогностическим маркером развития критических состояний (ОРДС, сепсис, органная недостаточность) является проградиентное увеличение уровня провоспалительных цитокинов в сыворотке крови: TNF- (р=0,035), IL-1 (р=0,00001) и IL-6 (р=0,0001).
  11. Выявлена сильная корреляционная зависимость между уровнем TNF- (r=0,96), IL-1 (r=0,92) в сыворотке крови и неблагоприятным исходом.

Практические рекомендации

  1. Использование молекулярно-генетических тестов расширяет возможности ранней диагностики внебольничной и нозокомиальной пнеамонии. Выявление групп повышенного риска возникновения пневмонии снижает частоту развития осложнений, позволяет разработать лечебно-профилактические мероприятия, что может значительно повысить эффективность специализированной помощи и существенно снизить затраты на лечение и обследование данной категории больных
  2. Выявление генотипа 606T/T по локусу CYP1A1 , генотипа I/* по локусу GSTM1, а также выявление гомозитот по делеции (генотип D/D) гена ренин-ангиотензиновой системы ACE сопряжено с высоким риском развития осложненного течения внебольничной пневмонии.
  3. Персонализированный подход к назначению антибактериальной терапии по данным генотипирования повышает эффективность патогенетического лечения внебольничной терапии. Так, носителям генотипа A/A гена GSTP1 при неосложненном течении пневмонии рекомендовано назначать амоксициллин/клавуланат (аугментин), при развитии осложнений - левофлоксацин (таваник). В случаях наличия генотипа A/G или G/G по локусу GSTP1 у больного пневмонией рекомендовано назначать цефалоспорины 3-4 генераций.
  4. Изучение динамики уровня цитокинов позволяет прогнозировать исход заболевания на основе сильной корреляционной зависимости содержания TNF- и IL-1 в сыворотке крови.
  5. Изучение патоморфоза заболеваний выявляет признаки, которые необходимо учитывать при диагностике и лечении больных внебольничной и нозокомиальной пнебольнией.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в журналах из списка ВАК

  1. Т.В. Смелая. Острое повреждение легких при огнестрельных ранениях // Общая реаниматология. 2006. – Т. II. - № 4. – С. 45-49.
  2. Голубев А.М., Смелая Т.В., Мороз В.В., Голубев М.А., Велиган Е.П., Марсова Л.А., Шаршавых М.В., Лазарева Н.М. Провоспалительные цитокины при пневмониях различного генеза // Общая реаниматология. – 2007. – Т. III - № 3. – С. 72-76
  3. Смелая Т.В., Шестопалов А.Е. Особенности интенсивной терапии острого повреждения при огнестрельных ранения на этапе оказания квалифицированной медицинской помощи // Медицинский вестник МВД. 2008. - № 3. – С. 28-31.
  4. Мороз В.В., Смелая Т.В., Голубев А.М., Голубев МА., Велиган Е.П., Марсова Л.А., М.В. Шаршавых, Лазарева Н.М., Савельева Т.В. Динамика уровня провоспалительных цитокинов при пневмониях различного генеза // Медицинский вестник МВД. 2008. - № 3. – С. 32-36.
  5. Смелая Т.В., Мороз В.В., Голубев А.М., Азаров Г.В., Кузовлев А.Н., Марсова Л.А., Гаджиева Л.Р., Тихонов Ю.Г., Велиган А.Н. Клинико-морфологические особенности нозокомиальной пневмонии у больных с перитонитом // Общая реаниматология. 2008. – Т. IV. - № 3. – С. 59-65
  6. Мороз В.В., Голубев А.М., Кузовлев А.Н., Смелая Т.В. Острое повреждение легких при пневмониях (обзор) // Общая реаниматология. 2008. – Т. IV. - № 3. – С. 77-82
  7. Сальникова Л.Е., Смелая Т.В., Мороз В.В., Голубев А.М., Понасенков Н.Х., Хоменко Р.В., Харламова И.В., Лаптева Н.Ш., Кузнецова Г.И., Порошенко Г.Г., Рубанович А.В. Гены детоксикации ксенобиотиков и их роль в развитии пневмонии // Общая реаниматология. 2008. – Т. IV. - № 6. – С. 9-15.
  8. Кузовлев А.Н., Мороз В.В., Голубев А.М., Половников С.Г., Смелая Т.В. Диагностика острого респираторного дистресс-синдрома при нозокомиальной пневмонии // Общая реаниматология. 2009. – Т. V. - № 6. – С. 5-12
  9. Сальникова Л.Е., Смелая Т.В., Мороз В.В., Голубев А.М., Лаптева Н.Ш., Порошенко Г.Г., Рубанович А.В. Генетическая предрасположенность к развитию острой внебольничной пневмонии // Общая реаниматология. 2010. – Т. VI. - № 1. – С. 5-10.
  10. Голубев А.М., Смелая Т.В., Мороз В.В., Попов А.А, Толбатов А.А., Медунецкая С.В. Внебольничная и нозокомиальная пневмония: клинико-морфологические особенности // Общая реаниматология. 2010. – Т. VI. – № 3. – С. 5-14.
  11. Смелая Т.В., Мороз В.В. Сальникова Л.Е., Голубев А.М., Хоменко Р.В., Рубанович А.В. Помогут ли гены в изучении пневмонии? // Медицинский вестник МВД. 2010. - № 6. – С. 33-39.
  12. Смелая Т.В., Мороз В.В., Голубев А.М., Азаров Г.В., Медунецкая С.В., Демкина Е.Ю., Велиган Е.П., Гаджиева Л.Р., Велиган А.Н. Нозокомиальная пневмония: особенности развития и течения у больных с распространенным перитонитом // Медицинский вестник МВД. 2011. - № 5. – в печати.
  13. Смелая Т.В., Сальникова Л.Е., Мороз В.В., Голубев А.М., Заржецкий Ю.В., Рубанович А.В.Генетический полиморфизм и частота развития осложнений при пневмонии различного генеза // Общая реаниматология. 2011. – Т. VII. - № 2. – С. 10-16.
  14. Смелая Т.В., Мороз В.В., Голубев А.М., Медунецкая С.В. Перитонит и нозокомиальная пневмония: частота развития и клинико-морфологические особенности // Вестник РНЦРР. 2011. - №11 (http://vestnik.rncrr.ru/...).
  15. Мороз В.В., Власенко А.В., Голубев А.М., Яковлев В.Н., Алексеев В.Г., Булатов Н.Н., Смелая Т.В. Патогенез и дифференциальная диагностика респираторного дистресс-синдрома // Общая реаниматология. 2011. - Т. VII. - № 3. – С. 5-13.
  16. Мороз В.В., Власенко А.В., Голубев А.М., Яковлев В.Н., Алексеев В.Г., Булатов Н.Н., Смелая Т.В. Дифференциальное лечение острого респираторного дистресс-синдрома, обусловленного прямым и непрямым этиологическими факторами // Общая реаниматология. 2011. - Т. VII. - № 4. – в печати.

Тезисы в сборниках

  1. Мороз В.В., Голубев А.М., Смелая Т.В., Голубев М.А., Азаров Г.В., Тихонов Ю.Г., Велиган А.В. Динамика уровня цитокинов при лечении пневмонии различного генеза // XV Рос. нац. конгр. «Человек и лекарство», 14—18 апр. 2008 г. Москва: Сб. мате риалов конгр., тез докл. — М., 2008. — С. 234.
  1. Смелая Т.В., Шестопалов А.Е., Войновский Е.А., Ковалев А.С. Вероятность развития полиорганной недостаточности у раненых с минно-взрывной травмой в раннем посттравматическим периоде // XI съезд Федерации анестезиологов и реаниматологов: Сб. материалов, тез докл., Санкт-Петербург, 2008. - С. 218.
  2. Smelaya T., Golubev A., Moroz V., Azarov G., Tikhonov Y. Cytokine dynamics in treatment of pneumonias of various etiologies - №12АР8-1// Европейский конгресс «Euroanaesthesia 2009», Milan, Italy, June 6-9, 2009: Сб. материалов конгресса: European Journal of Anaesthesiology, 2009. – V. 26 Supplement 45. - P. 174-175.
  3. Salnikova L.E., Smelaya T.V., Moroz V.V., Golubev A.M., Ponasenkov G.K, Khomenko R.V., Kharlamova I.V., Lapteva N.S., Kuznecova G.I., Poroshenko G.G., Rubanovich A.V. Predispositions to pneumonias in various xenobiotiocs detoxication genes genotypes // Мат.конф. Novinky v anesteziologii a intenzivnej medicine. Zbornik vychadza pri prilezitosti 16. medzinarodnego kongresu Slovenskej spolocnosti anesteziologie a intensivnej mediciny komanom v Piestanoch 20-22 maja 2009. Пиештяны. - С. 50-51
  4. Golubev A.M., Smelaya T.V., Moroz V.V., Popov A.A., Kuzovlev A.N., Tolbatov A.A. Primary and nosocomial pneumonias: clinical and morphological analysis // Мат.конф. Novinky v anesteziologii a intenzivnej medicine. Zbornik vychadza pri prilezitosti 16. medzinarodnego kongresu Slovenskej spolocnosti anesteziologie a intensivnej mediciny komanom v Piestanoch 20-22 maja 2009. Пиештяны. - С. 64-65.
  5. Smelaya T., Moroz V., Golubev A., Salnikova L., Rubanovich A. Current progress in pneumonia research. Critical care. Мат.конф. 30th International Symposium on intensive care and emergency medicine. 2010. Брюссель. – С. 27.
  6. Смелая Т.В., Сальникова ЛЕ., Мороз В.В., Голубев А.М., Рубанович А.В. Изучение предрасположенности к развитию пневмонии по генам детоксикации ксенобиотиков // Медицинская генетика. VI съезд Российского общества медицинских генетиков 15-18 мая 2010г., Роснов-на-Дону: Сб. материалов, тез докладов. – С. 167.
  7. Смелая Т.В., Сальникова Л.Е., Мороз В.В., Голубев А.М., Рубанович А.В. Роль генетического полиморфизма в развитии острой внебольничной пневмонии // XII съезд Федерации анестезиологов и реаниматологов, Москва 19-21 сентября 2010г. – Сб. материалов, науч.тез. –М., 2010. - С. 415.
  8. Голубев А. М., Смелая Т. В., Мороз В. В., Попов А. А., Толбатов А. А. Клинико-морфологические особенности при пневмонии различного генеза // XII съезд Федерации анестезиологов и реаниматологов, Москва 19—22 сент. 2010 г.: науч. тез. — М., 2010. —С. 114—115.
  9. Смелая Т.В., Сальникова Л.Е., Мороз В.В., Голубев А.М., Заржецкий Ю.В., Рубанович А.В. Изучение влияния полиморфизма генов первой и второй фаз детоксикации ксеноьиотиков, генов ACE, MTHFR, CCR5 на возникновение внебольничной и нозокомиальной пневмонии // Российско-испанский инновационный бизнес-форум 12-14 мая 2011г., Мадрид: Сб.материалов симпозиума, тез докладов. – электронная версия.
  10. Белопольская О.Б., Смелая Т.В., Сальникова Л.Е. Ассоциативные исследования генов детоксикации с внебольничной пневмонией // 2-я Всероссийская научно-практическая конференцияс международным участием «Медико-биологические аспекты мультифакториальной патологии» 19-21 мая 2011г, Курск: Сб. материалов, науч тез. – С. 34-35.
  11. Смелая Т.В., Хоменко Р.В., Сальникова Л.Е. Существуют ли гены предрасположенности к возникновению внебольничной пневмонии? // Седьмая ежегодная Московская конференция «Гнойно-септические заболевания у детей» 2-3 июня 2011г., Москва. – М.: Сб. материалов, тез докладов. – С.127-129.
  12. Смелая Т.В., Мороз В.В.,  Голубев А.М.,  Сальникова Л.Е. Влияние генетического полиморфизма в развитии внебольничной пневмонии // Четвертый Беломорский симпозиум 23-24 июня 2011г, Архангельск: Сб. материалов, тез докладов – С.105-106.
  13. Смелая Т.В.,  Хоменко Р.В., Сальникова Л.Е. Результаты ассоциативного исследования по изучению генетической предрасположенности к риску возникновения пневмонии // Международная конференция ''Актуальные достижения науки'' 25-27 июня 2011 года, Прага: Сб. материалов конфер, науч тез. - принято к печати
  14. Асланян М.М., Сальникова Л.Е., Смелая Т.В., Зелинская Н.М., Белопольская О.Б., Замулаева И.А., Иванова Т.И., Рубанович А.В. Дизруптивный характер ассоциирования генов детоксикации ксенобиотиков с мультифакториальными заболеваниями // Глава в монографии «Пост-геномные исследования и технологии» в 2-х томах.  Под редакцией чл.-корр. РАН С.Д.Варфоломеева. М., 2011.
  15. Смелая Т.В., Хоменко Р.В., Кузовлев А.Н., Сальникова Л.Е. Изучение генетической предрасположенности к возникновениювнебольничной и нозокомиальной пневмонии // VI съезд Межрегиональной Ассоциации общественных объединений анестезиологов и реаниматологов Северо-Запада совместно с медицинскими сестрами-анестезистами, Санкт-Петербург 12-14 сентября 2011 года: Сб.материалов конфер. – принято к печати.
  16. Смелая Т.В., Заржецкий Ю.В., Хоменко Р.В. Цитокиновый профиль в сыворотке крови и бронхоальвеолярной лаважной жидкости у больных внебольничной и нозокомиальной пневмонией // VI съезд Межрегиональной Ассоциации общественных объединений анестезиологов и реаниматологов Северо-Запада совместно с медицинскими сестрами-анестезистами, Санкт-Петербург 12-14 сентября 2011 года: Сб.материалов конфер. – принято к печати.

Список сокращений

БАЛЖ бронхоальвеолярная лаважная жидкость

ВП внебольничная пневмония

ВАП вентилятор-ассоциированная нозокомиальная пневмония

ГДК гены детоксикации ксенобиотиков

ИВЛ – искусственная вентиляция легких

ЛИИ – лейкоцитарный индекс интоксикации

НП нозокомиальная пневмония

ОАР – отделение анестезиологии-реаниматологии

ОРДС – острый респираторный дистресс-синдром

ПОН – полиорганная недостаточность

СрМ – уровень средних молекул

ЧСС – частота сердечных сокращений

ЧДД – частота дыхательных движений

CYP1A1 A4889G, CYP1A1 T606G, CYP1A1 T3801C – три сайта гена цитохрома 1a 1

GSTM1 Ins/De – ген семейства глутатио-трансфераз класса мю1

GSTT1 Ins/Del - ген семейства глутатио-трансфераз класса тетта1

GSTP1 A313G - ген семейства глутатио-трансфераз класса пи1

MTHFR C677T - ген метилен-тетрагидрофолат-редуктазы

ACE Ins/Del - ген ренин-ангиотензиновой системы

CCR5 Ins/Del -  гены хемокинового рецептора CCR5

TNF- G308A – ген цитокина TNF-

IL-6 T3435C – ген цитокина IL-6

ABCB1 T3435C - ген трансмембранного P-гликопротеина.






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.