WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


 

На правах рукописи

Сипливый Геннадий Вячеславович

ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ ЦЕЛЕСООБРАЗНОСТИ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ТЕХНОЛОГИЙ ИММОБИЛИЗАЦИИ В КЛЕТОЧНЫЕ НОСИТЕЛИ АНТИБИОТИКОВ ДЛЯ КОРРЕКЦИИ ИММУНОМЕТАБОЛИЧЕСКИХ НАРУШЕНИЙ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ НЕОБСТРУКТИВНОМ ПИЕЛОНЕФРИТЕ

14.03.06 - фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора медицинских наук

Курск - 2010

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию».

Научные консультанты:

доктор медицинских наук, профессор Лазарев Алексей Иванович

доктор медицинских наук, профессор Братчиков Олег Иванович

Официальные оппоненты:

1. Доктор медицинских наук, профессор Филиппенко Николай Григорьевич

2. Доктор медицинских наук, профессор Утешев Даниил Борисович

3. Доктор медицинских наук, профессор Хохлов Александр Леонидович

Ведущая организация:

Российский государственный медицинский университет

Защита состоится «__» _____________ 2010г. в «__» часов на заседании диссертационного совета Д 208.039.03 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (305041, г. Курск, ул. К.Маркса, 3).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО КГМУ Росздрава.

Автореферат разослан «__» ____________ 2010 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета                                                        Пашин Е.Н.

ВВЕДЕНИЕ



Актуальность проблемы

В настоящее время урологические инфекционные заболевания занимают одно из ведущих мест в клинике инфекционных патологий (Лопаткин Н.А., Переверзев А.С., 2006; Sobel J.D., Кауе Д., 2005). Пиелонефрит является одним из самых распространенных заболеваний почек в любых возрастных группах, частота которых за последние годы увеличилась и занимает второе место в структуре заболеваний после острой респираторно-вирусной инфекции (Калугина Г.В. и др., 1996; O’Donellj et al., 2002). Пиелонефрит имеет тенденцию к длительному течению, хронизации процесса и является основой глубоких морфологических и энзимопатических нарушений в почках, что в свою очередь, вызывает системные иммунометаболические изменения (Лопаткин Н.А. и др., 2000; Есилевский Ю.М., 2007).

При инфекционной патологии и, в частности, при необструктивном гематогенном пиелонефрите широко используются химиотерапевтические препараты, обладающие мощным бактериостатическим и бактерицидным действием и достаточно широким антимикробным спектром (Зубков М.Н., 2002; Рафальский В.В., 2004; Cilbert D., 2002; Emmеrson A.M., Jones H.M., 2003). Клинические наблюдения последних десятилетий свидетельствуют о значительном снижении эффективности антибиотиков (Неймарк А.И., Гаткин М.Я., 2005). Известно, что антибиотики являются ингибиторами синтеза нуклеиновых кислот, липидов и углеводов, а также активно влияют на функции цитоплазматической мембраны клеток (Навашин С.М., 1997). Применение антибиотиков нередко сопровождается осложнениями, связанными с подавлением иммунитета. Подтверждением этого являются данные о значительном учащении рецидивов и снижении общей реактивности у больных, принимающих антибактериальные препараты (Переверзев О.С., 2006).

Снижение токсичности и повышение эффективности химиотерапевтических препаратов возможно селективным действием фармакологических средств на определенные клетки и органы (Неймарк А.И., 2000; Симамкович А.В., 2007). Направленный транспорт лекарственных средств в охваченную патологическим процессом зону позволяет наряду с созданием в ней высоких концентраций вводимого препарата максимально уменьшить нежелательные реакции организма на медикаментозное воздействие, снизить терапевтическую дозу препарата и кратность введения (Останин А.А. и др., 2000; Карпушина И.А. и др., 2001; Кирдей Е.Г. и др., 2001; Кузьменко В.В. и др., 2009).

Для достижения поставленной цели применяют микроконтейнеры, в качестве которых могут выступать липосомы, капсулы из человеческого альбумина, магнитные микросферы или аутоклетки крови (Костюченко А.Л. и др., 2000; Аносова Ю.А., 2010). Однако большинство известных носителей имеют ограничения по диапазону и количеству лекарств, которые они могут связывать, а также обладают токсичностью и иммуногенностью. Наиболее выгодным и с точки зрения биологической совместимости считаются системы доставки, в которых используются собственные клетки организма. Реализация идеи направленного транспорта лекарств идет по линии использования эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов в качестве контейнеров для доставки лекарственных средств (Лохвицкий С.В. и др., 1999; Шевцова О.М., Денисова О.И., 2001; Бельский А.Н., Потапчук В.Б., 2001).

Органоспецифичность клеточных носителей, полученных из форменных элементов крови, будет определяться, в первую очередь, свойствами форменных элементов - способностью лейкоцитов мигрировать в очаг воспаления, эритроцитов фиксироваться эритрофагоцитирующими клетками, в основном печени и селезенки, способностью тромбоцитов к адгезии на поврежденных участках интимы сосуда (Генинг Т.П. и др., 1988; Костюченко А.Л., 2000; Третьяков Б.В. и др., 2000).

Цель работы

Разработка экспериментального и теоретического обоснования применения направленного транспорта антибактериальных препаратов, основанного на использовании клеточных носителей, с целью повышения их эффективности и снижения иммунометаболических нарушений при необструктивном пиелонефрите.

Задачи

1. Разработка лабораторной технологии получения клеточных эритроцитарных и лейкоцитарных форм некоторых антибиотиков и фторхинолонов для осуществления направленного транспорта лекарственных препаратов.

2. Моделирование экспериментального необструктивного гематогенного пиелонефрита и оценка сравнительной эффективности свободных и клеточных форм антибиотиков аминогликозидов и фторхинолонов в условиях данной патологии.

3. Установление иммунометаболических нарушений и взаимодействий клеточных и молекулярных структур в их реализации при необструктивном пиелонефрите.

4. Анализ путей реализации иммуносупрессии при необструктивном пиелонефрите и возможностей ее предотвращения с использованием антигипоксанта рибоксина и гликолитического фермента лизоцима.

5. Исследование влияния системного введения некоторых антибиотиков и фторхинолонов на иммунометаболические процессы при инфицировании и необструктивном пиелонефрите.

6. Анализ механизмов реализации иммунометаболических эффектов антибиотиков и фторхинолонов и возможностей их фармакологической коррекции с помощью антиагреганта дипиридамола, антигипоксанта рибоксина, гликолитического фермента лизоцима, дезинтоксиканта ПВП.

7. Изучение влияния антибиотиков и фторхинолонов, включенных в эритроцитарные носители, на иммунометаболические показатели лабораторных животных при необструктивном пиелонефрите.

8. Изучение влияния антибиотиков и фторхинолонов, иммобилизованных на лейкоцитарных носителях, на иммунометаболические показатели лабораторных животных при необструктивном пиелонефрите.

9. Изучение влияния предварительного экспонирования эритроцитов и лейкоцитов в ультрафиолетовых лучах и магнитном поле и обработки клеточных форм антибактериальных препаратов лизоцимом и ПВП на иммунометаболические показатели лабораторных животных при необструктивном пиелонефрите.

10. Сравнительное изучение влияния эритроцитарных и лейкоцитарных форм антибиотиков и фторхинолонов на активность метаболических маркеров эритроцитов, нейтрофилов, лимфоцитов и тромбоцитов при пиелонефрите.

Научная новизна

Впервые экспериментально обоснован метод направленного транспорта антибиотиков аминогликозидов или фторхинолонов, включенных в аллогенные эритроцитарные и лейкоцитарные носители, при необструктивном пиелонефрите с целью их селективного воздействия на орган и повышения эффективности, снижения системной токсичности и коррекции нарушенных иммунометаболических процессов.

Установлена высокая бактерицидная и протективная активность антибиотиков аминогликозидов и фторхинолонов, включенных в клеточные носители. Выявлено, что введение антибиотиков аминогликозидов или фторхинолонов, включенных в клеточные носители, оказывало более существенный фармакологический эффект, что выражалось в более ранней нормализации (5 – 7 сутки) клинических, лабораторных и гематологических показателей.

Установлено, что развитие необструктивного гематогенного пиелонефрита сопровождается резкими иммунометаболическими нарушениями – происходит дезинтеграция окислительно-восстановительных и энергетических процессов в эритроцитах, снижение функционально-метаболической активности нейтрофилов крови, угнетении ГИО и ГЗТ, появление иммуносупрессирующей активности у легких эритроцитов.

Впервые установлена клеточная кооперация в реализации иммунометаболических нарушений при пиелонефрите, которая заключается в том, что при инфекционном поражении почек усиливается выделение в сосудистое русло окислительно-модифицированных фосфолипопротеинов, под влиянием которых тромбоциты индуцируют у легких эритроцитов способность вызывать выделение прилипающей при 4 – 100С к стеклу фракции спленоцитов иммуносупрессирующих цитокинов, ММ 50 – 60 кДа (тромбоцитарно-эритроцитарный механизм).

Показано, что при пиелонефрите изменяется активность метаболических маркеров крови, участвующих в реализации иммунологических функций. Тромбоциты приобретают способность снижать активность Mg2+ - АТФазы стромы эритроцитов и ингибировать антителозависимую клеточную цитотоксичность.

Введение свободных антибиотиков аминогликозидов или фторхинолонов усиливало иммунометаболические изменения, вызванные пиелонефритом. Дипиридамол, рибоксин, лизоцим и ПВП снижали иммунометаболические нарушения при пиелонефрите и введении антибактериальных препаратов.

Впервые установлено, что введение клеточных (эритроцитарных и лейкоцитарных) форм антибактериальных препаратов нормализовало окислительно-восстановительные и энергетические процессы в эритроцитах, не вызывало процессов цитолиза и холестаза, в разной степени повышало функционально-метаболическую активность нейтрофилов крови, гуморальную и клеточную формы иммунного ответа. Введение клеточных форм аминогликозидов или фторхинолонов отменяло тромбоцито-эритроцитарный механизм иммуносупрессии: снижается иммуносупрессорный потенциал сыворотки крови, активность тромбоцитов, в крови появляются тяжелые эритроциты, индуцирующие выделение прилипающими при 32 – 370С и не прилипающими при 4 – 100С клетками селезенки иммуностимулирующих цитокинов ММ < 15 кДа. Иммуномодулирующее действие клеточных форм антибактериальных препаратов корригирует с показателями метаболической активности клеток крови. Установлены два метода усиления и пролонгации иммунометаболической активности клеточных носителей с антибактериальными препаратами. Первый – использование лекарственных средств, не вызывающих дополнительной фармакологической нагрузки: лизоцим и ПВП, второй – использование природных физических факторов: ультрафиолетовое облучение и магнитное поле.

Научная новизна подтверждена зарегистрированным открытием «Закономерность развития иммуносупрессии при нарушении энергетического гомеостаза организма человека и животных под действием тромбоцитов» (диплом № 397).

Практическая значимость

На основе экспериментальных данных разработана лабораторная технология получения эритроцитарных и лейкоцитарных форм антибактериальных препаратов для использования в клинической практике, включающая адаптированные методики иммобилизации антибиотиков и фторхинолонов в эритроцитарные и лейкоцитарные носители; экспрессные физико-химические методики их стандартизации по количеству включенного препарата; условия хранения клеточных носителей и клеточных форм антибактериальных препаратов; оптимальные сроки хранения клеточных носителей без и с включенными препаратами. Установлен и экспериментально подтвержден коэффициент включения антибиотиков аминогликозидов и фторхинолонов в клеточные носители и предложена формула для его расчета; предложены формулы расчета объема крови, необходимого для включения в клеточные носители требуемого количества антибактериальных препаратов и исходной концентрации антибактериальных препаратов, необходимой для их включения в клеточные носители в требуемых количествах. Получены клеточные (эритроцитарные и лейкоцитарные) формы антибиотиков аминогликозидов и фторхинолонов, стандартизованные по количеству действующего вещества. Установлена инверсия действия антибиотиков аминогликозидов или фторхинолонов, иммобилизованных в клеточные носители на активность иммунной системы, неспецифическую резистентность организма, окислительно-восстановительные, энергетические процессы в клетках, процессы цитолиза и холестаза при экспериментальном пиелонефрите.

Показана перспективность клинических испытаний эффективности клеточных (эритроцитарных и лейкоцитарных) форм антибиотиков аминогликозидов или фторхинолонов при необструктивном пиелонефрите или других видах патологии, характеризующихся иммунометаболическими нарушениями, на фоне микробной компрометации организма.

Материалы диссертации внедрены в научную работу ряда кафедр Курского государственного медицинского университета, Воронежской государственной медицинской академии, медицинских факультетов Белгородского и Орловского государственных университетов, ОАО «Фармстандарт-лексредства».

Получен патент на изобретение «Иммобилизованная форма доксорубицина».

Связь диссертационной работы с планом НИР

Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом НИР Курского государственного медицинского университета (номер государственной регистрации темы 01201056147).

Положения, выносимые на защиту

1. Лабораторная технология получения эритроцитарных и лейкоцитарных форм некоторых антибиотиков и фторхинолонов для осуществления направленного транспорта лекарственных препаратов и оценка их эффективности в условиях экспериментального необструктивного пиелонефрита.

2. При экспериментальном необструктивном пиелонефрите наблюдается усиление процессов перекисного окисления липидов, снижение активности антиоксидантной защиты и энергетического потенциала эритроцитов, увеличение в крови количества иммуносупрессорных субстанций, угнетение функционально-метаболической активности нейтрофилов крови, гуморальной и клеточной форм иммунного ответа. В развитии иммуносупрессии важную роль играют тромбоцито-эритроцитарные и эритроцито-лейкоцитарные взаимодействия.

3. Системное введение свободных антибиотиков аминогликозидов или фторхинолонов усиливает иммунометаболические нарушения при необструктивном пиелонефрите.

4. Дипиридамол, рибоксин, лизоцим и ПВП снижают иммунометаболические нарушения при пиелонефрите и введении антибактериальных препаратов.

5. Введение антибиотиков аминогликозидов или фторхинолонов, включенных в эритроцитарные носители, нормализует окислительно-восстановительные и энергетические процессы в эритроцитах, состояние гепатоцитов, повышает функционально-метаболическую активность нейтрофилов крови, гуморальную и клеточную формы иммунного ответа при необструктивном пиелонефрите.

6. Введение антибиотиков аминогликозидов или фторхинолонов, иммобилизованных на лейкоцитарных носителях без или в присутствии АТФ, нормализует окислительно-восстановительные и энергетические процессы в эритроцитах, нормализует или стимулирует функционально-метаболическую активность нейтрофилов крови, гуморальный и клеточный иммунный ответ при необструктивном пиелонефрите.

7. Иммунометаболическую активность антибиотиков аминогликозидов или фторхинолонов, включенных в клеточные носители, в разной степени корригирует лизоцим, ПВП, ультрафиолетовое облучение и магнитное поле.

Апробация работы

Основные положения диссертации представлены на III, IX, XIV, российских национальных конгрессах «Человек и лекарство» (Москва, 1996, 2002, 2007), научно-практической конференции, посвященной 35-летию фармацевтического факультета (Курск, 2001); 67-й межвузовской научной конференции студентов и молодых ученых (Курск, 2002), 67-й, 72-й, 73-й, 74-й научных сессиях КГМУ и отделения медико-биологических наук Центрально-Черноземного центра РАМН (Курск, 2002, 2004, 2005, 2006), Всероссийской научной конференции с международным участием «Сорбенты как фактор качества жизни и здоровья» (Белгород, 2004), пленуме правления Российского общества урологов (Саратов, 2004), II Всероссийском съезде фармацевтических работников (Сочи, 2005), юбилейной межвузовской научной конференции студентов и молодых ученых «Молодежная наука и современность» (Курск, 2005), региональной научно-практической конференции, посвященной 20-ле­тию факультета постдипломного образования (Курск, 2006), международной научно-практической конференции «Современные проблемы и пути их решения в науке, транспорте, производстве и образовании» (Одесса, 2007), международной научно-практической конференции «Кластерные подходы в современной фармации и фармобразовании» (Белгород, 2008), международной конференции «Физиология и патология иммунной системы» и IV международной конференции по иммунотерапии, посвященных 100-летию присуждения И.И. Мечникову Нобелевской премии (Москва, 2008), VII съезде аллергологов и иммунологов (Санкт-Петербург, 2009), X международном конгрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии», посвященном 100-летию со дня рождения академика АМН А.Д. Адо (Казань, 2009), II и III Всероссийских научно-практических конференциях «Биотехнология, биомедицинская инженерия и технология современных социальных практик» (Курск, 2009, 2010), научной конференции «Актуальные вопросы фармакологии», посвященной памяти профессора В.В. Пичугина (Курск, 2009), III Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Рациональная фармакотерапия в урологии» (Москва, 2009), межкафедральной научно-практической конференции кафедр фармакологии, микробиологии, биологической химии, клинической фармакологии и фармакотерапии, клинической иммунологии и аллергологии, ЛОР-болезней, кожных и венерических болезней, урологии, патофизиологии, акушерства и гинекологии, спортивной медицины и реабилитации, инфекционных болезней, мобилизационной подготовки здравоохранения и медицины катастроф, фармацевтической, токсикологичес­кой и аналитической химии, НИИ экологической медицины, хирургических болезней № 2 Курского государственного медицинского университета.

Публикации

Опубликовано 55 научных работ, в том числе 15 в реферируемых изданиях, в двух монографиях и учебно-методическом пособии. Работы содержат полный объем информации, касающейся темы диссертации. Зарегистрировано открытие и получены 2 патента.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 316 страницах машинописного текста, иллюстрирована 80 таблицами и 21 рисунком. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения собственных результатов, заключения, выводов, практических рекомендаций. Список использованных работ включает 444 источника, 310 - на русском, 134 - на иностранных языках.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объект исследования

Исследования проведены на крысах Вистар массой 180 - 200г и мышах СВА массой 19-21г. Все животные содержались в одинаковых условиях, на обычном пищевом режиме. Для получения статистически достоверных результатов группы формировали из 8 - 9 животных. В контрольные и опытные группы входили животные одного возраста. Разброс в группах по исходной массе не превышал ± 10%. Все исследования проводили в одно и то же время суток с 8 до 12 ч с соблюдением принципов, изложенных в Конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других целей (г. Страсбург, Франция, 1986).

Экспериментальные модели

1. Экспериментальный необструктивный гематогенный пиелонефрит воспроизводили путем внутрибрюшинного введения арахидоновой кислоты в дозе 2,5 мг/кг массы тела, ежедневно раз в сутки в течение 10 дней, на 10 сутки внутрибрюшинно вводили микробный агент Staphyloccocus aureus в количестве 1108 микробных тел в 0,5 мл раствора (Есилевский Ю.М. и др., 1982) (первая модель).

2. Экспериментальный необструктивный гематогенный пиелонефрит воспроизводили путем перорального введения индометацина в течение 30 дней в дозе 2 мг/кг массы тела ежедневно, на 30 сутки внутрибрюшинно вводили микробный агент Staphylococcus aureus в количестве 1108 микробных тел в 0,5 мл раствора (Есилевский Ю.М. и др., 1977) (вторая модель).

3. Токсическое поражение почек, осложненное инфицированием, моделировали путем однократного внутрижелудочного введения ртути дихлорида в дозе 2 мг/кг и внутрибрюшинной инъекции предварительно оттитрованных доз суточной агаровой культуры Staphylococcus aureus, содержащих 1108 микробных тел в 0,5 мл раствора (третья модель).

4. Модель генерализованной стафилококковой инфекции воспроизводили путем заражения животных суточной агаровой культурой Staphylococcus aureus, выделенной от больного с нагноением раны и приготовленной на 0,9% растворе натрия хлорида. Животных инфицировали предварительно оттитрованными дозами стафилококка, содержащими 1108 или 2109 микробных тел (летальная доза) в объеме 0,5 или 0,2 мл. Наблюдение за инфицированными летальной дозой стафилококка мышами проводили в течение 10 дней с момента инфицирования. На протяжении этого периода определяли выживаемость мышей в процентах по отношению к контролю.

Выделение, фракционирование и обработка эритроцитов

Эритроциты выделяли двукратным настаиванием в 10 мл натрий-фосфатного буфера (рН = 7,4), содержащего 0,9% натрия хлорид и 3% декстран Т-500, и последующей очисткой с помощью HBS-целлюлозы в натрий-фосфатном буфере (B. Beutler et al., 1985). Эритроциты фракционировали  в градиенте плотности яичного альбумина (Кобозев Т.В. и др., 1978). Получали фракции легких эритроцитов (плотность ниже 1,097г/см3), промежуточные по плотности (1,091-1,105г/см3) и тяжелые эритроциты с плотностью, превышающей 1,117 г/см3. Полученные фракции тщательно отмывали от альбумина изотоническим раствором натрия хлорида. В части опытов эритроциты крыс обрабатывали сывороткой опытных аллогенных животных или препаратами. В качестве контроля использовали сыворотки здоровых животных. Обработку проводили способом, разработанным Л.Г. Прокопенко и Ю.О. Яхонтовым (Прокопенко Л.Г., Яхонтов Ю.О., 1976). Иммуномодулирующие свойства интактных, обработанных сывороткой или препаратами эритроцитов и их фракций определяли путем двукратного (с интервалом 24 ч) внутрибрюшинного введения (1x107 клеток на 1 кг массы) интактным или опытным аллогенным реципиентам. Иммунизацию животных ЭБ проводили в последний день введения аллогенных эритроцитов.

Получение эритроцитарных и лейкоцитарных форм антибактериальных препаратов

Для включения антибиотиков аминогликозидов или фторхинолонов в строму эритроцитов использовали метод гипоосмотического гемолиза, позволяющий ввести максимально возможное количество препаратов (Гениг Т.П. и др., 1988; Жумадилов Ж.Ш., Макаренкова Р.В., 1990). Для получения аллогенных эритроцитов использовали 3 мл крови. После оседания эритроцитов удаляли плазму вместе с лейкоцитарной пленкой. Эритроциты крыс, выделенные из 3 мл крови, дважды отмывали изотоническим раствором натрия хлорида путем центрифугирования при 500 g в течение 5 мин при 4°С. К осадку эритроцитов добавляли семикратный объем охлажденной до 0°С воды очищенной и центрифугировали при 1500 g в течение 25 мин. К полученной строме приливали пятикратный объем антибиотика аминогликозида или фторхинолона, растворенного в охлажденной до 5°С воде очищенной. Концентрация препарата в инкубационной среде соответствовала их разовым дозам в пересчете на крысу. Взвесь инкубировали в течение 20 мин при 4°С, затем добавляли 1/10 объема 10% натрия хлорида для восстановления целостности стромы и инкубировали в течение 30 мин при 37°С. После включения препаратов в стромальные сферы, последние дважды отмывали изотоническим раствором натрия хлорида, затем осаждали при 1500g в течение 10 мин (эритроцитарная форма). В части опытов ЭН обрабатывали лизоцимом (0,5 мг лизоцима в изотоническом растворе натрия хлорида) или инкубировали в ПВП. Время инкубации составляло 20 мин при 370С.

Для получения суспензии лейкоцитов гепаринизированную кровь (25ЕД/мл крови) смешивали с 3% желатином (0,1 мг/мл) и выдерживали 15-20 мин при 37 °С. После оседания эритроцитов слой плазмы, обогащенный лейкоцитами, переносили в силиконизированные пробирки. Клетки осаждали центрифугированием в течение 10 мин при 1500 g. Количество клеток подсчитывали под микроскопом в камере Горяева. Для включения антибиотиков или фторхинолонов в ЛН использовали методику С.В. Лохвицкого, (1999). В соответствии с методикой лейкоциты после выделения инкубировали с антибиотиками аминогликозидами или фторхинолонами в разовой дозе в течение 20 мин при комнатной температуре и периодическом встряхивании (лейкоцитарная форма). Для повышения связывания антибиотиков или фторхинолонов лейкоцитами в инкубационную среду добавляли 0,5 мл 1% раствор АТФ.

В отдельных экспериментах аллогенные лейкоциты и эритроциты предварительно помещали в кварцевые кюветы и облучали световыми волнами в УФ-спектре (250 нм) в течение 20 мин. В качестве источника УФ-излучения использовали кварцевую лампу НКН-11, которую помещали на одном горизонтальном уровне с кварцевой кюветой на расстоянии 20 см. Интенсивность воздействия УФ излучения на клеточные носители выражали в энергии излучения Q, которую определяли по формуле Q = E·Aпр·t, где Е – поверхностная плотность потока излучения для данного источника, Апр – площадь кюветы, открытая для облучения (м2), t – время облучения, с. Исходя из расчетов, интенсивность воздействия УФ лучей составляла: Q = 90Дж/м2 (120Дж/с 0,00006 м2 ·1200 с) (Х. Кухлинг , 1982).

В части опытов эритроциты и лейкоциты предварительно подвергали действию постоянного магнитного поля напряженностью 500 эрстед в течение 20 мин. Постоянное магнитное поле создавали стационарным электромагнитом, питающимся от трансформатора с выпрямителем при силе тока 1,3 А и напряжении 15 В. Конструкции используемых установок обеспечивали равномерное воздействие физических факторов на весь объем клеток.

Для определения антибиотиков аминогликозидов в биоматериале была использована спектрофотометрическая методика (Кукурека А.В., 2000).

Для определения фторхинолонов была использована спектрофотометрическая методика (Карлов П.М., 2009).

Иммунометаболическую активность клеточных форм препаратов устанавливали при внутривенном однократном или двукратном, с интервалом 24 часа, введении (в количестве, содержащем разовую дозу препарата) интактным или опытным животным. В части опытов одновременно с последней инъекцией тестируемых объектов животных иммунизировали ЭБ. Контролем служили крысы, получавшие клеточные носители с физиологическим раствором, не содержащим препараты.1

Выделение тромбоцитов и определение их иммуносупрессирующей активности

Плазму, дефицитную и обогащенную тромбоцитами, получали путем центрифугирования гепаринизированной крови (25 ЕД гепарина на 1 мл крови) в течение 5 мин при 180 g. После расслоения крови на плазму, лейкоцитарный слой и эритроциты, отбирали первый слой и центрифугировали в течение 10 мин при 600 g. Супернатант представлял собой плазму, обогащенную тромбоцитами (ПОТ). Для получения плазмы, дефицитной по тромбоцитам (ПДТ), последние осаждали центрифугированием ПОТ в течение 15 мин в градиенте плотности человеческого альбумина при 1000 g (Коган А.Х. и др., 1999; Кубатиев А.А., 1999). После выделения ПДТ и тромбоцитов взвесь последних пропускали через колонку с сефарозой 2В, получая концентрированную и очищенную взвесь тромбоцитов (Ермолаева Т.А. и др., 1991). Метаболическим маркером активности тромбоцитов служила концентрация в них МДА (Негреску Е.В. и др., 1992).

ПОТ и ПДТ использовали для обработки легких эритроцитов (1x107 клеток инкубировали в 1 мл плазмы в течение 1 часа при 37 °С). Тромбоциты и легкие эритроциты инкубировали в плазме крови (1х108 тромбоцитов с 1x107 эритроцитов в 1 мл плазмы, 30 мин при 37 °С). Иммуномодулирующую активность инкубата определяли путем двукратного (с шестичасовым интервалом) внутривенного введения здоровым аллогенным реципиентам, которых иммунизировали ЭБ при последнем поступлении инкубата.

Выделение, фракционирование и изучение функциональной активности клеток селезенки и лимфоцитов периферической крови

Клетки селезенки фракционировали по их способности прилипать к стеклянной поверхности (Дерфлинг П., Вихнер 3., 1987). Прилипающие к стеклу

1Примечание: определение содержания антибиотиков аминогликозидов и фторхинолонов в клеточных носителях и других биологических объектах проведено на кафедре фармацевтической, токсикологической и аналитической химии Курского государственного медицинского университета, за что мы выражаем сотрудникам данной кафедры глубокую признательность.

клетки дополнительно фракционировали при температурном градиенте (Родионов С.В. и др., 1985). Определение количества клеток и их жизнеспособности проводили с помощью теста поглощения трипанового синего. Приготовленная таким образом суспензия клеток селезенки содержала 85-90% жизнеспособных клеток, что соответствует литературным данным.

Прилипающие и не прилипающие клетки селезенки культивировали в среде 199 (5x107 клеток на 3 мл среды), содержащей 5% телячьей эмбриональной сыворотки и антибиотики (пенициллин и стрептомицин), в течение 4 ч в ламинарном боксе при периодическом обновлении газовой среды 95% кислорода и 5% углекислого газа. По истечении срока инкубации клетки осаждали центрифугированием (15 мин при 400 g) и готовили пул супернатантов прилипающих и не прилипающих к стеклу клеток селезенки, содержащих равные объемы супернатантов 5-6 животных. Пул жидкости диализовали 12-15 ч против 50-кратного объёма 0,05 М трис-НС1-буфера (рН 8,0), приготовленного на 0,15 М растворе натрия хлорида. После диализа надосадочную жидкость концентрировали полиэтиленгликолем (молекулярная масса 40 кД) и повторно диализовали против трис-НС1-буфера. Очищенную от низкомолекулярных веществ и сконцентрированную надосадочную жидкость освобождали от образовавшегося при концентрировании осадка центрифугированием (20 мин при 800 g). Концентрацию белка в супернатантах определяли с использованием красителя Кумасси О-250 по Бредфорду (Шишков С.С., 1989).





Иммуномодулирующую активность СПКС и СНКС оценивали путём однократного внутрибрюшинного введения интактным аллогенным реципиентам из расчета 1 мг/кг белка супернатанта одновременно с иммунизацией ЭБ.

Лимфоциты периферической крови выделяли по Т.В. Федосеевой и др. (1993) и определяли в них содержание ФДФ (Коровкин Б.Ф. и др., 1999). Клетки культивировали с аллогенными эритроцитами в соотношении 1:2 (5x107 лимфоцитов и 1x108 эритроцитов в 3 мл среды 199). Активность надосадочной жидкости определяли путем добавления ее к взвеси нейтрофилов (1x107 клеток на 100 мкг белка надосадочной жидкости) и последующего определения показателей ФМА нейтрофилов.

Использование фармакологических препаратов

Амикацин - раствор для инъекций ампулы (500 мг - 2 мл), Болгария, Pharmachin Holding EAD Spharma; гентамицин раствор для инъекций, ампулы (80 мг - 2 мл), Индия, Agio Pharmaceuticals Ltd; дипиридамол 0,5 % раствор в ампулах по 2 мл (0,01 г), Венгрия, Gedeon Richter; доксорубицин – порошок для приготовления инъекционного раствора, флакон 10 мг, Индия, Dolphen Laboratories Ltd; лизоцим - флаконы с содержанием активного вещества 100 мг, Россия, ФАО «Фереин»; офлоксацин (офло) - раствор для инфузий 0,2 % (200 мг - 100 мл) флаконы, Индия, Unique Pharmmaceutical Laboratories; ПВП - гемодез (6% водно-солевой раствор низкомолекулярной ПВП, ММ 2600-2700), Россия, Курская биофабрика; рибоксин (инозин), Россия, ОАО "Дальхимфарм"; рифампицин (рифогол) – раствор для инъекций, ампулы (500 мг - 10 мл) – Югославия, JCN Galeneka; цефалексин - порошок для приготовления инъекционного раствора, флаконы 1 г, Словения, КРКА; ципрофлоксацин 1% раствор в ампулах по 10мл или раствор для инъекций 0,2% (200 мг - 100 мл), флаконы, Индия, Wockhardt Ltd.

Способ введения препарата соответствовал рекомендациям, приведённым в пособии по фармакотерапии М.Д. Машковского «Лекарственные средства» и аннотациях к использованию препаратов. Используемые дозы препаратов соответствовали рекомендованным терапевтическим дозам, пересчитанным с учетом соотношения поверхности тела биологического объекта и его массы по общепринятой формуле межвидового переноса доз с применением коэффициента пересчета в зависимости от массы тела. При выборе разовых доз также учитывались экспериментальные данные, приведённые в литературе о влиянии препаратов на состояние мембран клеток, в первую очередь, эритроцитов.

Определение показателей, характеризующих иммунометаболическое состояние экспериментальных животных

Иммунологическую реактивность животных оценивали по количеству АОК в селезенке (Мальберг К., Зигль Э., 1987) и выраженности ГЗТ по РМЛ и РКЛ (Федосеева В.Н. и др., 1993). ФМА нейтрофилов оценивали по фагоцитарной и кислородзависимой активностям, ФАН оценивали по определению ФИ и ФЧ (Медведев А.Н., Чаленко В.В., 1991). Кислородзависимую активность нейтрофилов определяли по НСТ-сп. НСТ-инд. (Щербаков В.И., 1989). Энергообеспечение эритроцитов определяли по содержанию в них АТФ и БФГ (Виноградова И.Л. и др., 1980). Антиоксидантный статус эритроцитов характеризовали по активности СОД, ГР (Макаренко Е.В., 1988). ПОЛ определяли по содержанию в крови ДК и МДА (Стальная И.Д., 1977), АГП (Бенисевич В.И., Идельсон И.А., 1973). Определяли метаболические маркеры клеток крови: активность НАДФН-оксидазы нейтрофилов (Никанкина Л.В. и др., 2001), содержание ФДФ в лимфоцитах (Коровкин Б.Ф. и др., 1999), активность Mg+2 – АТФазы в эритроцитах (Рыжкова Г.Ф., Вишняков С.И., 2005), содержание МДА в тромбоцитах (Негреску Е.В., 1992). Метаболическое состояние гепатоцитов оценивали по активности АЛТ, АСТ, ЩФ и содержанию ОБ (Меньшиков В.В., 1987). Оценивали иммуномодулирующие соединения крови по содержанию ЛНП (Меньшиков В.В., 1987), ААП и АМГ (Нартикова В.Ф., Пасхина Г.С., 1979), ГАГ (Мурашев Б.Ф. и др., 1986). АЗКЦ лейкоцитов оценивали по величине индекса цитотоксичности (Зимин Ю.И., Ляхов В.Ф., 1985). О состоянии выделительной функции почек судили по концентрации мочевины и креатинина в крови (Меньшиков В.В., 1987). Активность ферментов в почках оценивали по методики Меньшикова В.В. (1987).

Статистическая обработка полученных результатов

Статистическую обработку результатов исследования проводили путем вычисления средних арифметических изучаемых показателей и их стандартных ошибок. Существенность различий средних величин оценивали по критериям Стьюдента и Вилкоксона-Манна-Уитни (Гублер Е.В., Генкин А.А., 1973; Гублер Е.В., 1978; Лакин Г.Ф., 1980).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Получение эритроцитарных и лейкоцитарных форм антибиотиков аминогликозидов и фторхинолонов для их направленного транспорта

в организм

Одним из направлений, сформировавшимся в результате исследования возможности транспортировки лекарственных средств к очагу повреждения, является разработка методов, основанных на использовании клеточных носителей, полученных из форменных элементов крови. Такими клетками являются аутологичные или донорские эритроциты, лейкоциты и тромбоциты.

Для получения эритроцитарной формы антибиотиков аминогликозидов и фторхинолонов использовали методику Т.П. Генинга и др. (1998). Для отработки лабораторной технологии получения эритроцитарных форм антибактериальных препаратов изучены особенности включения гентамицина, амикацина, ципрофлоксацина и офлоксацина в ЭН здоровых животных и животных с пиелонефритом. С этой целью ЭН здоровых крыс и крыс с пиелонефритом инкубировали с растворами гентамицина, амикацина и фторхинолонов в различных концентрациях в течение 10, 30 и 60 мин при 40С. В начале инкубацию проводили с меньшей концентрацией, а затем концентрацию препаратов в инкубационной жидкости увеличивали в 2 раза. Устойчивость ЭН на десорбцию и выделение препаратов из ЭН определяли путем двукратного предварительного отмывания и инкубации их в аутологичной плазме при 370С в течение 30 мин.

Было установлено, что в ЭН здоровых доноров включается гентамицина 22,4% и 20,2% амикацина, а в ЭН крыс с пиелонефритом 20,1% и 18,2% соответственно для гентамицина и амикацина. Определено, что в ЭН здоровых крыс включается 17,9% ципрофлоксацина и 16,4% офлоксацина, а в ЭН животных с пиелонефритом соответственно 14,5% и 12,3%.

Доказано, что антибиотики аминогликозиды и фторхинолоны в большей степени включаются в ЭН здоровых доноров. Полученные результаты свидетельствовали о более высоком включении антибиотиков аминогликозидов в ЭН животных с пиелонефритом в сравнении с фторхинолонами. Мы не обнаружили выраженной зависимости степени включения антибиотиков и фторхинолонов в ЭН от длительности инкубации (рекомендуемое время 30 мин). Повышение концентрации препаратов в 2 раза привело к увеличению их содержания в ЭН как здоровых крыс, так и животных с пиелонефритом в пределах 1,3-1,5 раза.

Изучение стабильности ЭН к возможной десорбции и выделению антибиотиков или фторхинолонов в плазму крови показало достаточную их устойчивость, что позволяет использовать ЭН для направленного транспорта антибиотиков аминогликозидов и фторхинолонов в органы и, в частности, почки.

При направленном транспорте лекарственных средств в организм обсуждаются возможности использования различных векторов, одним из которых является применение лейкоцитов.

С этой целью выделенные из крови лейкоциты инкубировали с растворами препаратов в различных концентрациях в течение 10, 20 и 60 мин при комнатной температуре (200С). Затем концентрацию препаратов увеличивали в 2 раза. Установлено, что с ЛН здоровых крыс связывается соответственно 18,3%, 19,1%, 12,6% и 13,4% от используемого количества гентамицина, амикацина, ципрофлоксацина и офлоксацина. Отмечена более высокая иммобилизация препаратов на ЛН здоровых животных. Установлено, что введение АТФ в инкубационную среду повышает связывание антибиотиков аминогликозидов и фторхинолонов с ЛН как здоровых крыс, так и крыс с пиелонефритом на 30 – 50%. Мы установили, что при 20 мин инкубации в присутствии АТФ количественное содержание препаратов в ЛН здоровых крыс и крыс с пиелонефритом было максимально.

Увеличение концентрации препаратов в 2 раза привело к увеличению их содержания в ЛН в 2,2 – 2,8 раза. Изучение процессов десорбции аминогликозидов и фторхинолонов из ЛН в плазму крови показало их достаточную устойчивость и тем самым подтвердило возможность использования лейкоцитов для направленного транспорта антибактериальных препаратов.

Использование различных технологий введения лекарственных средств изменяет их фармакокинетику. При введении свободных антибиотиков отмечена их высокая пиковая концентрация в крови через один час, а через три часа концентрация антибиотика резко снижалась.

При введении гентамицина и офлоксацина, включенных в ЭН и ЛН, в крови через один час концентрация антибиотиков была незначительна. Концентрация препаратов в почечной ткани при введении их в ЭН была выше в 1,4 для гентамицина и в 1,5 раза для офлоксацина, а введенных в ЛН была соответственно в 1,7 для гентамицина и 1,9 раза для офлоксацина выше, чем при введении свободных препаратов. Содержание препаратов в почечной ткани оставалось высоким в течение 24 ч (время наблюдения) и снижалось постепенно.

Важным условием применения клеточных форм антибактериальных препаратов является их стабильность, сроки и условия хранения. Пригодность свободных ЭН и ЛН определяли по способности включать антибактериальные препараты, а ЭН и ЛН с включенными антибиотиками – по способности сохранять терапевтическую концентрацию лекарственных средств. В результате было установлено, что свободные ЭН и ЛН сохраняют способность включать антибактериальные препараты в течение 10 дней в условиях хранения при 5°С, а клеточные носители с включенными препаратами хранятся не более двух-трех суток.

Одним из определяющих значений при использовании клеточных форм антибактериальных препаратов является сохранение их антимикробной активности. Установлено, что бактерицидная активность сыворотки животных, в которой инкубировали клеточные носители с включенными гентамицином, амикацином, офлоксацином, была высокой и составляла соответственно 89%, 94% и 97% по сравнению с бактерицидной активностью сыворотки животных, в которой инкубировали сводные антибиотики или фторхинолоны.

Проведенные исследования показали, что животные, инфицированные летальной дозой стафилококка, не получавшие или получавшие клеточные носители, не содержавшие антибиотиков, погибали в течение 10 суток и средняя продолжительность жизни равнялась 3,2; 3,3 суток. В то же время введение клеточных носителей с включенными аминогликозидами или фторхинолонами обеспечивало выживаемость от 60 до 65% инфицированных животных, что свидетельствует об их достаточно высокой протективной активности.

Экспериментальное моделирование необструктивного гематогенного пиелонефрита. Оценка эффективности свободных и клеточных форм аминогликозидов и фторхинолонов при пиелонефрите

Для подтверждения развития необструктивного пиелонефрита проведены определения изменений клинических, лабораторных и гематологических показателей, морфологических нарушений в почках.

Введение арахидоновой кислоты, индометацина или ртути дихлорида совместно с микробным агентом вызывало развитие необструктивного гематогенного пиелонефрита, подтверждающееся клиническими показателями: гипертермия, снижение веса на 12-14%, нарушение выделительной функции почек. Анализ выделительной функции почек показал появление лейкоцитов и белка в моче и резкое повышение в крови уровня мочевины в 1,75-2,2 раза и креатинина в 1,8-3,2 раза.

Установлены изменения лейкоцитарной формулы: увеличение количества лейкоцитов на 30-35%, уменьшение количества лимфоцитов на 20-24% и повышение количества нейтрофилов крови на 21-23%. В почках отмечены снижение активности СДГ, ГДГ, ЩФ в 1,9-2,3 раза, на фоне высокой активности ЛДГ и морфологические изменения (очаговые скопления лейкоцитов в виде микроабсцессов).

При необструктивном пиелонефрите отмечались сладжирование и агрегация эритроцитов и тромбоцитов. Известно, что основной причиной агрегации эритроцитов является снижение их электрокинетического потенциала. Установлено, что введение животным арахидоновой кислоты, индометацина или ртути дихлорида совместно с микробным агентом приводило к снижению дзета-потенциала эритроцитов: у здоровых животных он равнялся 17,8±1,5 мВ, у крыс с экспериментальным необструктивным пиелонефритом 11,2±1,1 мВ, 11,8±1,3 мВ и 10,4±1,1 мВ соответственно. Полученные результаты свидетельствовали о развитии инфекционного воспалительного процесса в почках, весьма близкого к естественной картине необструктивного пиелонефрита.

Для сравнительной оценки эффективности свободных и клеточных форм антибиотиков аминогликозидов и фторхинолонов при экспериментальном пиелонефрите (вторая модель) использовали рекомендованные в клинике способы введения, разовые дозы препаратов, пересчитанные по общепринятой методике на крысу. При этом температуру тела определяли один раз в сутки в одно и то же время (9-10 ч) до ее полной нормализации и последующие два дня, выделительную функцию почек и массу тела определяли на 4 и последующие дни. Лабораторные показатели и морфологические изменения определяли во всех группах на 5 и 10 сутки после развития пиелонефрита.

Установлено, что пятикратное введение животным с пиелонефритом гентамицина в дозе 2 мг/кг, амикацина в дозе 12 мг/кг, ципрофлоксацина и офлоксацина в дозах 3 мг/кг нормализовало температуру тела на 10-12 сутки, выделительную функцию почек на 12-14 сутки, при этом вес животных достоверно не изменялся. На 10 сутки в крови количество лейкоцитов было повышено на 10-12%, количество лимфоцитов снижено на 8-9%, количество нейтрофилов не изменялось, уменьшался, но не нормализовался, дисбаланс активности ферментов в почках, снижалось количество и выраженность очагов скопления лейкоцитов.

В отличие от этого, однократное введение крысам с пиелонефритом эритроцитарных или лейкоцитарных форм антибактериальных препаратов в разовых дозах нормализовало температуру тела на 7-8 или 5-6 сутки, выделительную функцию почек на 8-9 или 5-6 сутки соответственно, вес животных увеличивался незначительно, на 10 сутки отмечена полная нормализация количества лейкоцитов, лимфоцитов, нейтрофилов в крови, активности ферментов в почках, отсутствие очагов скопления лейкоцитов в почках.

Иммунометаболические нарушения и взаимодействие клеток

и молекулярных структур в их реализации при необструктивном пиелонефрите

Однотипность полученных изменений при различных моделях пиелонефрита позволила в дальнейшем проводить исследования на одной модели: введение индометацина и микробного агента (вторая модель). Определены показатели ПОЛ (МДА и АГП) и активность антиокислительных ферментов СОД и ГР в эритроцитах при необструктивном пиелонефрите. Полученные данные убедительно показали, что уровень МДА и АГП был повышен, а активность СОД и ГР снижена. Установлено, что в эритроцитах крыс с пиелонефритом концентрация макроэргических соединений БФГ и АТФ была достоверно ниже, чем в контроле. Оценка иммуносупрессорного потенциала крови при пиелонефрите показала увеличение концентрации ЛНП, ГАГ, ААП и АМГ.

Установлено, что у животных с необструктивным пиелонефритом снижается поглотительная способность и окислительный резерв нейтрофилов крови, ГИО и ГЗТ (табл. 1).

Постоянной составной частью микроокружения иммуноцитов в крови являются эритроциты и тромбоциты, которые активно участвуют в реализации биохимических и иммунологических процессов в организме как в норме, так и при патологиях.

Таблица 1

Изменение ФМА нейтрофилов крови у животных с необструктивным пиелонефритом

Условия опыта

ФЧ

ФИ

НСТ-сп.

НСТ-инд.

1. Контроль

(здоровые крысы)

1,7±0,2

44,4±4,8

11,7±1,2

33,4±3,3

2. Крысы с пиелонефритом

1,1±0,2*

35,4±3,2*

8,9±0,9*

24,5±1,5*

Примечание: * и цифра рядом в этой и последующих таблицах указывают на достоверность различий между группами.

Изучена иммуномодулирующая активность эритроцитов крыс с необструктивным пиелонефритом. Полученные результаты убедительно показали, что введение их интактным животным вызывало угнетение ФМА нейтрофилов, ГИО, ГЗТ. Эритроциты, циркулирующие в сосудистом русле, представляют собой гетерогенную популяцию клеток, отличающихся по возрасту и соответственно этому по плотности и функциональной активности. Аллогенный перенос фракций эритроцитов животных с пиелонефритом показал, что выраженной иммуносупрессирующей активностью обладает легкая фракция эритроцитов, остальные фракции были иммунологически неактивны (табл. 2).

Таблица 2

Иммуномодулирующая активность эритроцитов и их фракций крыс с пиелонефритом

Условия опыта

ФАН

ОРН

АОК

РМЛ

1. Контроль

65,2±6,7

16,2±1,6

26,4±2,8

4,9±0,5

2. Введение эритроцитов крыс с пиелонефритом

51,3±4,9*

12,4±1,2*

21,4±2,4*

3,8±0,3*

3. Введение легких эритроцитов крыс с пиелонефритом

42,3±3,9*1,2

9,4±0,8*1,2

17,5±1,6*1,2

3,1±0,3*1,2

4. Введение промежуточных по плотности эритроцитов крыс с пиелонефритом

64,1±5,9

15,9±1,8

27,8±2,1

5,1±0,5

5. Введение тяжелых эритроцитов крыс с пиелонефритом

66,4±6,9

17,1±1,8

27,3±2,9

4,8±0,6

Примечание: фракции эритроцитов здоровых крыс были иммунологически интактны.

Супрессирующий эффект эритроцитов животных с пиелонефритом, по-видимому, обусловлен связыванием с их мембраной сывороточных факторов, а также способностью индуцировать выделение спленоцитами иммуносупрессирующих цитокинов.

Аллогенный перенос фракций супернатанта спленоцитов крыс, получавших инъекции эритроцитов животных с пиелонефритом, показал, что иммуносупрессирующей и прооксидантной активностью обладала фракция II (50 – 60 кДа) клеток, прилипающих к стеклу при 4 – 10С. Фракция III клеток (менее 15 кДа), прилипающих к стеклу при 32 – 37С, проявляла нерезко выраженную иммуностимулирующую активность (табл. 3).

Таблица 3

Влияние фракций супернатантов клеток селезенки крыс, получавших инъекции эритроцитов крыс с пиелонефритом, на развитие иммунного ответа и окислительные процессы у интактных крыс

Условия опыта

АОК

РМЛ

СОД

МДА

1. Контроль

29,4 ± 3,0

4,8 ± 0,5

56,6 ± 5,1

36,7 ± 3,2

Введение фракций супернатанта клеток, прилипающих к стеклу

при 4 - 10С

2. Фракция I

28,6 ± 3,2

4,6 ± 0,4

57,9 ± 6,1

37,9 ± 3,7

3. Фракция II

20,4 ± 2,2*

3,9 ± 0,3*

42,8 ± 4,1*

46,1 ± 4,2*

4. Фракция III

30,2 ± 3,1

5,1 ± 0,5

54,9 ± 5,2

34,9 ± 3,4

Введение фракций супернатанта клеток, не прилипающих к стеклу

при 4 - 10С

5. Фракция I

28,2 ± 2,9

5,0 ± 0,4

55,6 ± 5,5

35,2 ±3,5

6. Фракция II

29,1 ± 3,0

4,7 ± 0,5

57,1 ± 6,3

38,1 ± 4,1

7. Фракция III

27,9 ± 2,8

4,9 ± 0,5

58,1 ± 6,0

36,9 ± 4,0

Введение фракций супернатанта клеток, прилипающих к стеклу

при 32 - 37С

8. Фракция I

28,5 ± 2,7

4,6 ± 0,5

54,8 ± 0,5

34,8 ± 0,4

9. Фракция II

30,6 ± 3,1

4,9 ± 0,6

57,6 ± 0,6

38,0 ± 0,5

10. Фракция III

36,3 ± 3,2*

5,6 ± 0,5*

60,3 ± 5,9

37,4 ± 3,1

Введение фракций супернатанта клеток, не прилипающих к стеклу

при 32 - 37С

11. Фракция I

30,3 ± 3,1

4,7 ± 0,5

58,4 ± 0,6

36,1 ± 0,4

12. Фракция II

29,9 ± 3,0

4,5 ± 0,4

59,1 ± 0,6

38,2 ± 0,5

13. Фракция III

28,7 ± 3,4

4,9 ± 0,6

56,2 ± 0,5

35,9 ± 0,4

Обработка интактных эритроцитов и их фракций сывороткой животных с пиелонефритом показала появление иммуносупрессирующей активности у легких эритроцитов.

Имеющиеся в литературе данные свидетельствуют об участии тромбоцитов в реализации взаимосвязи между гемостазом, неспецифической резистентностью и иммунологической реактивностью организма.

Приведенные сведения об увеличении содержания в крови животных с пиелонефритом иммуносупрессирующих субстанций свидетельствуют в пользу того, что иммуносупрессирующие свойства эритроциты приобретают, по-видимому, в результате связывания на их мембране ЛНП и тромбоцитов. Подтверждением этого является обнаруженный факт, что сыворотка крови крыс с пиелонефритом теряет способность индуцировать иммуносупрессирую­щую активность у эритроцитов после осаждения ЛНП или тромбоцитов.

Изучена иммуномодулирующая активность тромбоцитов и их инкубатов с эритроцитами и сывороткой, полученными от интактных животных и крыс с пиелонефритом. Установлено, что инъекции тромбоцитов, выделенных из крови крыс с пиелонефритом, а также инъекции легкой фракции эритроцитов, инкубированной в плазме крыс, обогащенной тромбоцитами крыс с пиелонефритом, инкубата эритроцитов интактных крыс с тромбоцитами крыс с пиелонефритом, супрессировали развитие неспецифической резистентности и обеих форм иммунного ответа, что является доказательством повышения их активности (рис. 1).

Рис. 1. Иммуномодулирующая активность тромбоцитов животных с пиелонефритом.

Примечания: по оси ординат: А – ФАН, Б – ОРН, В – АОК, Г – РМЛ;

по оси абсцисс: 1 – контроль, 2 – введение тромбоцитов здоровых крыс, 3  введение тромбоцитов крыс с пиелонефритом.

Сопоставление их иммуносупрессирующей активности показало, что она выше при введении инкубата эритроцитов интактных крыс и тромбоцитов крыс с пиелонефритом. Выраженность этой активации в значительной степени определяется уровнем содержания в крови продуктов ПОЛ, в первую очередь ЛНП. Обращает на себя внимание тот факт, что окислительно-модифицированные ЛНП в определенной степени определяют как появление иммуносупрессирующих свойств у легких эритроцитов, так и повышение функциональной активности тромбоцитов. В связи с этим обоснованным является предположение о взаимосвязи между этими феноменами при пиелонефрите и о важной роли ЛНП и, возможно, других продуктов окисления липидов в реализации этой взаимосвязи.

Для выяснения этого вопроса поставлено два варианта экспериментов. В первом – эритроциты интактных крыс обрабатывали ФЛП животных с пиелонефритом, а затем инкубировали с тромбоцитами интактных крыс, во втором – эритроциты интактных крыс инкубировали с тромбоцитами интактных животных, предварительно обработанных ФЛП сыворотки крыс с пиелонефритом. В первом варианте экспериментов эритроциты не приобретали иммуносупрессирующей активности, во втором – они становились способными вызывать при аллогенном переносе супрессирующий эффект.

Результаты этих наблюдений позволяют считать, что феномен тромбоцито-эритроцитарной иммуносупрессии возникает вследствие появления у тромбоцитов под влиянием ФЛП свойства индуцировать появление иммуносупрессирующей активности у эритроцитов.

Иммунорегулирующая функция лимфоцитов крови и её коррекция при необструктивном пиелонефрите

Установлено, что введение лимфоцитов, интракорпорально активированных эритроцитами крыс с пиелонефритом, супрессировало развитие ГИО и ГЗТ у интактных крыс. Аналогичный эффект вызывал супернатант прилипающих к стеклу спленоцитов крыс реципиентов лимфоцитов, активированных эритроцитами крыс с пиелонефритом. Лимфоциты крыс, получавших неактивированные эритроциты, такого эффекта не вызывали.

Большой интерес представляет вопрос о возможности предотвращения угнетающего влияния эритроцитов крыс с пиелонефритом на выделение лимфоцитами цитокинов, подавляющих ФМА нейтрофилов крови интактных крыс, путем экстракорпорального воздействия на эритроциты крыс с пиелонефритом лизоцима и рибоксина. Перспективность изучения эффективности действия такой фармакологической композиции обусловлена особенностями влияния препаратов на структуру и метаболизм эритроцитов. Лизоцим модифицирует конформацию гликопептидов цитоплазматической мембраны эритроцитов, а рибоксин регулирует энергетический обмен этих клеток, существенно изменяющийся при пиелонефрите. Установлено, что рибоксин ослаблял способность эритроцитов крыс с пиелонефритом индуцировать выделение лимфоцитами интактных крыс цитокинов, угнетающих ФМА нейтрофилов крови интактных крыс. Лизоцим не оказывал влияния на свойства эритроцитов крыс с пиелонефритом, но усиливал эффект, вызываемый рибоксином. Принципиально важно было изучить влияние препаратов на чувствительность лимфоцитов к супрессирующим сигналам, индуцируемым активированными эритроцитами. Оказалось, что обработка лимфоцитов интактных крыс лизоцимом или рибоксином снижала чувствительность, но не обеспечивала полной резистентности этих клеток к эритроцитам крыс с пиелонефритом. В отличие от этого совместное действие лизоцима и рибоксина на лимфоциты приводило к полной анергии этих клеток в отношении эритроцитов крыс с пиелонефритом.

Иммунометаболические нарушения, вызываемые некоторыми антибиотиками и фторхинолонами при инфицировании

и необструктивном пиелонефрите

Применение антибиотиков нередко сопровождается осложнениями, связанными с подавлением иммунитета. Учитывая изложенное, были изучены иммунометаболические нарушения у здоровых и инфицированных животных при введении антибиотиков различных групп: цефалоспорины – цефалексин; аминогликозиды – гентамицин, амикацин; рифампицин; антрациклины – доксорубицин и фторхинолонов - ципрофлоксацин, офлоксацин. Для получения объективных результатов исследованы две дозы препаратов с постановкой необходимых контрольных опытов. Установлено, что введение цефалексина, аминогликозидов, рифампицина, фторхинолонов в максимальных дозах здоровым животным оказывало незначительное, но достоверное супрессорное влияние на выраженность ГИО и ГЗТ, индуцируемых ЭБ. У инфицированных животных при ведении указанных препаратов отмечено значительное дозозависимое угнетение ГИО и ГЗТ. Введение доксорубицина вызывало резкое подавление обеих форм иммунного ответа как у здоровых крыс, так и у инфицированных животных.

Введение эритроцитов инфицированных крыс, получавших антибиотики или фторхинолоны, интактным животным вызывало выраженный иммуносупрессорный эффект. Наиболее выраженное иммуносупрессорное действие проявляли эритроциты инфицированных животных, получавших инъекции доксорубицина и антибиотиков аминогликозидов. Фракционирование эритроцитов инфицированных крыс, получавших антибактериальные препараты, показало, что значительной иммуносупрессирующей активностью обладают легкие эритроциты.

Установлено, что эритроциты здоровых животных после инкубации с антибиотиками или фторхинолонами проявляют иммуностимулирующую активность, а эритроциты инфицированных крыс после обработки изучаемыми препаратами – слабо выраженную иммуностимулирующую активность. Наиболее выраженные иммуностимулирующие свойства проявляют эритроциты как здоровых животных, так и инфицированных крыс, инкубированных с фторхинолонами. Фракционирование эритроцитов показало, что стимулирующую активность проявляют тяжелые эритроциты (рис. 2).

Иммуностимулирующее действие эритроцитов, обработанных антибиотиками или фторхинолонами, по-видимому, можно объяснить взаимодействием активных функциональных групп препаратов с рецепторами, ферментами и другими функционально-активными белками мембран, приводящим к инверсии их влияния на иммунологическую реактивность организма.

Рис. 2. Влияние фракций эритроцитов здоровых крыс, инкубированных с офлоксацином, на ГИО и ГЗТ интактных животных.

Примечания: по оси ординат: А – АОК, Б – РМЛ; по оси абсцисс: 1 – контроль, 2 — введение эритроцитов здоровых крыс, 3, 4, 5 — введение, соответственно, легких, промежуточных по плотности и тяжелых фракций эритроцитов.

Целью следующих исследований было установить, влияют ли in vivo антибиотики непосредственно на мембраны клеток или их действие в целом или в определенной степени опосредовано сывороточными субстанциями. Полученные результаты свидетельствуют о выраженной иммуносупрессирую­щей активности легких эритроцитов и слабовыраженной иммуностимулирую­щей активности тяжелых эритроцитов как здоровых, так и инфицированных животных, инкубированных в сыворотке крыс, получавших антибиотики или фторхинолоны.

Накопление в сосудистом русле инфицированных животных, получавших антибиотики, субстанций, вызывающих появление иммуносупрессирующей активности у эритроцитов, может быть следствием усиления свободно-радикальных процессов или нарушения состояния гепатоцитов, играющих важную роль в патогенезе инфекционных заболеваний. Установлено, что введение антибиотиков или фторхинолонов вызывает усиление ПОЛ и снижение АОС, повышение уровня АЛТ, АСТ, ЩФ, ОБ. Особенно выраженный дисбаланс этих процессов вызывают антибиотики аминогликозиды и доксорубицин.

Одно из ведущих мест инфекционных патологий занимает необструктивный пиелонефрит. Наиболее часто из химиотерапевтических средств для лечения необструктивного пиелонефрита используют антибиотики аминогликозиды и фторхинолоны. Интересно было выяснить как изменятся нарушенные иммунометаболические процессы при пиелонефрите и введении антибактериальных препаратов. Установлено, что в эритроцитах крыс с необструктивным пиелонефритом, получавших антибактериальные препараты, концентрация АТФ, активности антиокислительных ферментов (СОД и ГР) были ниже, а содержание продуктов ПОЛ (АГП и МДА) выше, чем у животных с пиелонефритом (рис. 3).

Рис. 3. Влияние антибиотиков аминогликозидов на энергетические и окислительные процессы эритроцитов крыс с экспериментальным пиелонефритом.

Обозначения: 1 – контроль, 2 – пиелонефрит, 3 – пиелонефрит + гентамицин.

Введение свободных антибиотиков или фторхинолонов опытным крысам с пиелонефритом снижало ФМА нейтрофилов и подавляло ГИО и ГЗТ.

Аллогенный перенос фракций эритроцитов животных с пиелонефритом, получавших антибактериальные препараты, показал, что выраженной иммуносупрессирующей активностью обладает легкая фракция эритроцитов. Введение крысам с пиелонефритом свободных антибиотиков аминогликозидов, в отличие от фторхинолонов, вызвало появление иммуносупрессирующей активности у промежуточной по плотности фракции эритроцитов (табл. 4).

Обработка фракций эритроцитов интактных крыс сывороткой животных с пиелонефритом, получавших антибактериальные препараты, вызывала появление иммуносупрессирующей активности как у лёгких, так и у промежуточных по плотности эритроцитов. Инъекции эритроцитов крыс с пиелонефритом, получавших антибактериальные препараты, усиливали выделение иммуносупрессирующих цитокинов ММ 50 – 60 кДа спленоцитами прилипающими к стеклу по 4 – 100С.

Ранее проведенные исследования доказали, что у животных с пиелонефритом иммуносупрессирующие свойства эритроциты приобретают в результате взаимодействия с ЛНП и тромбоцитами.

Введение здоровым крысам тромбоцитов животных с пиелонефритом, получавших антибиотики аминогликозиды (гентамицин, амикацин) или фторхинолоны (ципрофлоксацин и офлоксацин) усиливало иммуносупрессию, которая была наиболее выражена при введении тромбоцитов крыс с пиелонеф-

Таблица 4

Иммуномодулирующая активность фракций эритроцитов крыс с пиелонефритом, получавших гентамицин

Условия опыта

ФАН

ОРН

АОК

РМЛ

1. Эритроциты интактных крыс

65,2±6,7

16,2±1,6

26,4±2,8

4,9±0,5

2. Легкие эритроциты крыс с пиелонефритом

49,4±4,1*1

11,2±1,3*1

20,1±2,1*1

3,4±0,3*1

3. Промежуточные по плотности эритроциты крыс с пиелонефритом

64,1±5,9

15,9±1,8

27,8±2,1

5,1±0,5

4. Тяжелые эритроциты крыс с пиелонефритом

66,4±6,9

17,1±1,8

27,3±2,9

4,8±0,6

5. Легкие эритроциты крыс с пиелонефритом, получавших гентамицин

37,9±3,3*2

8,9±1,1*2

16,4±2,0*2

2,2±0,2*2

6. Промежуточные по плотности эритроциты крыс с пиелонефритом, получавших гентамицин

51,3±4,9*1

12,3±1,2*1

21,4±2,2*1

3,6±0,4*1

7. Тяжелые эритроциты крыс с пиелонефритом, получавших гентамицин

63,9±7,1

17,6±1,7

28,9±2,5

4,7±0,4

ритом, получавших гентамицин. Эти данные свидетельствуют о том, что введение антибиотиков аминогликозидов или фторхинолонов крысам с пиелонефритом повышает функциональную активность тромбоцитов, одним из проявлений которой является появление у них иммуносупрессирующих свойств. Приведенные выше результаты показывают, что введение антибиотиков аминогликозидов или фторхинолонов животным с пиелонефритом приводит к усилению иммуносупрессирующей активности легких эритроцитов. Естественно возник вопрос о взаимодействии тромбоцитов и эритроцитов в реализации иммуносупрессорного эффекта аминогликозидов или фторхинолонов при пиелонефрите. Анализ выраженности иммуносупрес­сорной активности тромбоцитов крыс с пиелонефритом, легкой фракции эритроцитов, инкубированных в плазме крыс, обогащенной тромбоцитами, инкубата эритроцитов интактных крыс и тромбоцитов крыс с пиелонефритом, получавших аминогликозиды или фторхинолоны, показал, что введение инкубата эритроцитов здоровых крыс с тромбоцитами крыс с пиелонефритом, получавших антибактериальные препараты, наиболее выражено супрессировало ГИО и ГЗТ. Неясным оставался вопрос о последовательности влияния сывороточных соединений на отдельные клеточные элементы инкубата.

Принимая во внимание изложенное, из крови крыс с пиелонефритом, получавших гентамицин, выделяли ЛНП и тромбоциты. Эритроциты интактных крыс инкубировали с этими компонентами плазмы, а затем определяли их иммуномодулирующие свойства. Установлено, что после инкубации с ЛНП интактных и опытных крыс, а также с тромбоцитами интактных крыс, эритроциты интактных животных не приобретали иммуносу­прессиирующих свойств. В отличие от этого эритроциты интактных крыс, инкубированные с тромбоцитами животных с пиелонефритом, получавших гентамицин, обладали иммуносупрессирующей активностью. Таким образом, результаты проведенных исследований свидетельствуют о том, что тромбоциты участвуют в развитии иммуносупрессии как при пиелонефрите, так и у животных с пиелонефритом, получавших антибактериальные препараты, а также, что это действие усиливается эритроцитами и ЛНП, накапливающимися в сосудистом русле животных с пиелонефритом.

Обобщение приведенных данных позволяет прийти к заключению, что ФЛП играют роль ключевого звена в развитии тромбоцито-эритроцитарного механизма иммуносупрессии при пиелонефрите и введении химиотерапевтических препаратов.

Иммунометаболические эффекты дипиридамола, рибоксина, ПВП и лизоцима при необструктивном пиелонефрите и введении антибиотиков аминогликозидов или фторхинолонов

Установлено, что введение дипиридамола или рибоксина животным с пиелонефритом и получавшим антибактериальные препараты снижает выраженность иммунометаболических нарушений. Совместное введение дипиридамола и рибоксина крысам с пиелонефритом, получавшим антибиотики или фторхинолоны, было значительно эффективнее, чем их раздельное введение.

Инъекции дипиридамола крысам с пиелонефритом уменьшали выраженность снижения активности СОД и ГР, снижали содержание АГП и МДА, но не влияли на содержание БФГ и АТФ в эритроцитах. Инъекции рибоксина повышали уровень БФГ и АТФ, но не изменяли активность СОД и продуктов ПОЛ в эритроцитах. Совместное введение препаратов нормализовало энергетический и антиоксидантный потенциал эритроцитов. Дипиридамол или рибоксин, введенные животным с пиелонефритом, получавшим гентамицин, снижали иммуносупрессорную активность легких эритроцитов. Совместное введение дипиридамола и рибоксина отменяло иммуносупрессорную активность легких эритроцитов и вызывало появление иммуностимулирующих свойств у тяжелых эритроцитов.

Сыворотка крыс с пиелонефритом, получавших гентамицин и дипиридамол при экстракорпоральной обработке эритроцитов, снижала иммуносупрессирующую активность легких эритроцитов и индуцировала появление иммуностимулирующих свойств у тяжелой фракции эритроцитов интактных крыс. Сыворотка крыс с пиелонефритом, получавших гентамицин и рибоксин, не вызывала появление иммуносупрессирующей активности при обработке легких эритроцитов интактных животных. Обработка эритроцитов интактных крыс сывороткой крыс с пиелонефритом, получавших гентамицин, дипиридамол и рибоксин, не вызывала появления иммуносупрессирующих свойств у легких эритроцитов и индуцировала появление иммуностимулирую­щей активности у тяжелых эритроцитов. Введение дипиридамола и рибоксина раздельно не индуцировало появление иммуномодулирующих свойств у тромбоцитов здоровых крыс и снижало, но не отменяло полностью иммуносупрессирующую активность тромбоцитов крыс с пиелонефритом, получавших инъекции химиопрепаратов. Совместное введение препаратов, нормализовало иммуномодулирующую активность тромбоцитов. Обнаруженная активность дипиридамола и рибоксина, по-видимому, обусловлена их влиянием на различные звенья иммуносупрессорного механизма, зависимого от тромбоцитов, эритроцитов и сывороточных факторов. Для подтверждения данного предположения изучали влияние дипиридамола и рибоксина на иммуносупрессорную активность инкубатов тромбоцитов и эритроцитов интактных крыс в сыворотке крыс с пиелонефритом или в сыворотке крыс с пиелонефритом, получавших гентамицин. Установлено, что введение дипиридамола отменяло появление иммуносупрессирующих свойств как у легких эритроцитов, так и у тромбоцитов. Инъекции рибоксина не влияли на тромбоциты, но отменяли способность легких эритроцитов интактных крыс приобретать иммуносупрес­сирующие свойства после инкубации с тромбоцитами интактных крыс и сывороткой крови крыс с пиелонефритом, получавших гентамицин.

Введение крысам с пиелонефритом антибиотиков аминогликозидов с ПВП вызывало нормализацию показателей ПОЛ и АОС. Введение фторхинолонов с ПВП снижало интенсивность ПОЛ, повышало активность ферментов АОС, однако полной нормализации не происходило. Совместное введение лизоцима как с фторхинолонами, так и с аминогликозидами нормализовало показатели ПОЛ, АОС у крыс с пиелонефритом.

Введение ПВП крысам с пиелонефритом, получавшим антибактериаль­ные препараты, усиливало ГИО и ГЗТ. Наиболее эффективным при пиелонефрите было совместное введение ПВП и антибиотиков аминогликозидов. Лизоцим нормализовал иммунологическую реактивность при совместном введении как с фторхинолонами, так и с аминогликозидами. Введение животным с пиелонефритом аминогликозидов или фторхинолонов с ПВП вызывало более эффективное снижение показателей цитолиза и холестаза, чем при введении их с лизоцимом.

Иммунометаболические изменения при направленном транспорте антибиотиков и фторхинолонов, включенных в эритроцитарные носители у животных с необструктивным пиелонефритом

Выявленные иммунометаболические нарушения при пиелонефрите позволили нам определить направление и выделить наиболее информативные показатели для изучения иммунометаболической активности клеточных форм антибактериальных препаратов.

Установлено, что введение ЭН здоровых доноров с включенными препаратами значительно уменьшало интенсивность ПОЛ, повышало энергетический и антиоксидантный потенциал эритроцитов крыс с пиелонефритом снижало концентрацию иммуносупрессорных субстанций. У животных этой группы повышались, но не нормализовались ФАН и ОРН. Введение антибиотиков или фторхинолонов, включенных в ЭН здоровых доноров, значительно снижало иммунодефицит у животных с экспериментальным пиелонефритом (табл. 5). При этом не обнаружено достоверной разницы между показателями групп животных, получавших антибиотики аминогликозиды и фторхинолоны, включенные в ЭН.

Таблица 5

Изменение ФМА нейтрофилов, ГИО, ГЗТ животных с необструктивным пиелонефритом, получавших ЭН здоровых животных с включенными аминогликозидами или фторхинолонами

Группа

ФАН

ОРН

АОК

РМЛ

1. Контроль (здоровые крысы)

64,3±6,2

17,8±1,5

29,1±2,8

5,4±0,4

2. Крысы с пиелонефритом

42,2±4,1*1

9,2±1,2*1

18,1±1,9*1

3,6±0,3*1

3. Введение ЭН с гентамицином

63,2±5,5

17,1±1,7

28,4±2,6

5,1±0,5

4. Введение ЭН с амикацином

65,1±6,0

16,9±1,6

29,6±3,1

5,8±0,6

5. Введение ЭН с офлоксацином

64,8±5,8

18,3±1,8

27,2±2,7

5,7±0,5

6. Крысы с пиелонефритом + ЭН с гентамицином

54,6±3,3*1,2

13,1±1,2*1,2

24,4±2,1*1,2

4,6±0,4*1,2

7. Крысы с пиелонефритом + ЭН с амикацином

55,2±3,5*1,2

13,8±1,1*1,2

23,9±1,9*1,2

4,4±0,3*1,2

8. Крысы с пиелонефритом + ЭН с офлоксацином

53,8±3,1*1,2

12,9±1,3*1,2

24,2±2,1*1,2

4,5±0,4*1,2

Изучено влияние ЭН здоровых доноров с включенными препаратами на выделение иммуномодулирующих цитокинов клетками селезенки крыс с пиелонефритом. Оказалось, что при введении ЭН с включенными антибиотиками или фторхинолонами, прилипающие при 32 – 370С и не прилипающие при 4 – 100С к стеклу клетки селезенки выделяют иммуностимулирующий фактор. Можно предположить, что часть ЭН, возможно, старых эритроцитов, после включения антибиотиков или фторхинолонов претерпевает достаточно серьезные структурные изменения мембраны. Такие ЭН поступают в основном в печень, усиливают выделение гепатоцитами протеаз, активирующих продукцию цитокинов различными популяциями спленоцитов.

Нами установлено, что в отличие от эритроцитов крыс с пиелонефритом, получавших свободные аминогликозиды или фторхинолоны, эритроциты, выделенные из крови животных с пиелонефритом, получавших клеточные (эритроцитарные) формы антибиотиков аминогликозидов или фторхинолонов, обладали иммуностимулирующей активностью.

Изучение иммуномодулирующей активности отдельных фракций эритроцитов крыс, получавших включенные в ЭН антибиотики или обработанных сывороткой этих животных, показало, что фракция легких эритроцитов проявляла иммуносупрессирующую активность, а фракция тяжелых эритроцитов – высокую иммуностимулирующую способность.

Ранее установлена значительная роль тромбоцитов в развитии иммуносупрессии при пиелонефрите. Введение же здоровым животным тромбоцитов крыс с пиелонефритом, получавших эритроцитарные формы антибактериальных препаратов, не вызывало выраженных иммунометаболичес­ких нарушений.

Инкубация эритроцитов здоровых крыс с плазмой крыс с пиелонефритом, получавших эритроцитарные формы антибиотиков аминогликозидов или фторхинолонов, обогащенной тромбоцитами, не вызывала появления у них иммуносупрессирующей активности (рис. 4).

         А  Б  В  Г

Рис. 4 Иммуномодулирующая активность тромбоцитов крыс с пиелонефритом, получавших ЭН с включенными антибактериальными препаратами и эритроцитов инкубированных в плазме крови этих животных, обогащенной тромбоцитами.

Примечание: по оси ординат: А – ФАН, Б – ОРН, В – АОК, Г – РМЛ;

по оси абсцисс: 1 – контроль, 2 - введение тромбоцитов здоровых крыс, 3 - введение тромбоцитов крыс с пиелонефритом, получавших ЭН с антибактериальными препаратами, 4 - введение эритроцитов, инкубированных в плазме этих животных, обогащенной тромбоцитами.

Установленный факт свидетельствовал о снижении функциональной активности тромбоцитов у животных с пиелонефритом, получавших инъекции эритроцитарных форм антибактериальных препаратов.

Практический интерес представляет вопрос о возможности использования для включения антибиотиков аминогликозидов или фторхинолонов ЭН крыс с пиелонефритом, что позволило бы исключить или сократить использование донорской крови. Не установлено существенной разницы в иммунометаболической активности ЭН здоровых доноров и ЭН животных с пиелонефритом с включенными антибиотиками или фторхинолонами.

Исследования показали, что клеточные эритроцитарные формы антибиотиков аминогликозидов или фторхинолонов не оказывали влияния на метаболические показатели гепатоцитов у здоровых животных и нормализовали их у крыс с пиелонефритом. Большое значение представляет выяснение вопроса, как долго сохраняются выявленные позитивные сдвиги при введении эритроцитарных форм антибиотиков аминогликозидов или фторхинолонов. Для ответа на этот вопрос определяли изучаемые показатели спустя 10 суток. Определение показателей ГИО, ГЗТ, ФАН, ОРН, а также ПОЛ, АОС через 10 суток показало их дестабилизацию при применении ЭН животных с пиелонефритом с включенными препаратами.

Иммунометаболические изменения при направленном транспорте в организм антибиотиков аминогликозидов или фторхинолонов, иммобилизованных на лейкоцитарных носителях у животных с необструктивным пиелонефритом

У животных с пиелонефритом установлена дезинтеграция биохимических процессов в клетках, выражающаяся в нарушениях энергетического и антиоксидантного потенциала эритроцитов. Введение ЛН с аминогликозидами или фторхинолонами значительно уменьшало, а введение ЛН с иммобилизованными в присутствии АТФ препаратами нормализовало антиоксидантный и энергетический потенциал эритроцитов.

Установлено, что введение крысам с пиелонефритом ЛН здоровых животных с аминогликозидами или фторхинолонами, нормализовало ФАН, ОРН, ГИО и ГЗТ. ЛН с иммобилизованными в присутствии АТФ аминогликозидами или фторхинолонами, стимулировали ФАН, ОРН, ГИО и ГЗТ у животных с пиелонефритом (табл. 6).

Введение аминогликозидов или фторхинолонов, иммобилизованных на ЛН в присутствии или без АТФ, нормализовало концентрацию в крови иммуносупрессорных субстанций. Установлено, что введение эритроцитов или их фракций крыс, получавших лейкоцитарные формы химиопрепаратов, не вызывало иммуносупрессирующий эффект. Обработка интактных эритроцитов и их фракций сывороткой животных с пиелонефритом, получавших инъекции лейкоцитарной формы аминогликозидов или фторхинолонов также не приводила к

Таблица 6

Изменение ФМА нейтрофилов, ГИО и ГЗТ животных с пиелонефритом, получавших ЛН здоровых животных с иммобилизованными аминогликозидами и фторхинолонами

Условия опыта

ФАН

ОРН

АОК

РМЛ

1. Контроль (здоровые крысы)

65,8±6,1

18,4±1,6

28,4±2,7

5,3±0,5

2. Крысы с пиелонефритом

39,6±3,4*1

9,8±0,9*1

16,8±1,8*1

3,9±0,4*1

3. Введение ЛН с гентамицином

63,9±5,9

17,1±1,8

26,9±2,9

4,9±0,5

4. Введение ЛН с амикацином

61,4±6,8

16,9±1,6

25,9±3,1

5,1±0,6

5. Введение ЛН с ципрофлоксацином

66,2±7,1

19,2±2,1

30,2±3,4

5,5±0,6

6. Введение ЛН с офлоксацином

67,1±7,8

19,4±2,4

29,8±2,9

5,4±0,5

7. Введение ЛН с гентамицином и АТФ

79,8±7,1*1

26,4±2,1*1

39,4±3,4*1

6,8±0,6*1

8. Введение ЛН с амикацином и АТФ

80,1±8,0*1

27,5±2,4*1

40,1±4,1*1

6,9±0,6*1

9. Введение ЛН с ципрофлоксацином и АТФ

76,4±7,2*1

28,1±2,5*1

42,4±3,9*1

7,2±0,7*1

10. Введение ЛН с офлоксацином и АТФ

75,4±7,1*1

29,4±2,9*1

43,1±4,5*1

6,9±0,8*1

появлению иммуносупрессорной активности у легких эритроцитов и индуцировала появление иммуносупрессирующей активности у тяжелых эритроцитов.

Установлено, что супернатант прилипающих при 32 – 37°С клеток крыс с пиелонефритом, получавших ЛН с антибиотиками или фторхинолонами, проявлял иммуностимулирующую активность, аналогичной, но менее интенсивной активностью обладал супернатант не прилипающих при 4 – 10°С к стеклу спленоцитов крыс с пиелонефритом, получавших ЛН с аминогликозидами или фторхинолонами. Нами установлено, что введение тромбоцитов крыс с пиелонефритом, получавших инъекции ЛН с антибактериальными препаратами или эритроцитов, инкубированных в плазме этих животных, обогащенной тромбоцитами, не вызывало угнетение ФМА нейтрофилов, ГИО и ГЗТ. Однотипные результаты наблюдались при использовании ЛН крыс с пиелонефритом с иммобилизованными химиопрепаратами. При этом не установлено достоверной разницы между группами животных, получавших антибиотики аминогликозиды или фторхинолоны иммобилизованными на ЛН.

Для ответа на вопрос о стабильности наблюдаемых сдвигов нами были определены показатели иммунологической реактивности, ФАН и ОРН спустя 10 суток после введения ЛН с гентамицином или офлоксацином. Как видно из полученных результатов, показатели были стабильны в группах животных, получавших инъекции ЛН с иммобилизованными в присутствии АТФ препаратами.

Коррекция иммунометаболической активности антибиотиков аминогликозидов или фторхинолонов, иммобилизованных в клеточные носители лизоцимом, ПВП, ультрафиолетовыми лучами и магнитным полем

Введение ЭН здоровых доноров, дополнительно обработанных лизоцимом или ЭН крыс с пиелонефритом, обработанных ПВП, животным с пиелонефритом, нормализовало окислительно-восстановительные и энергетические процессы в эритроцитах.

Введение животным с пиелонефритом ЭН здоровых доноров с включенными аминогликозидами или фторхинолонами, дополнительно обработанных лизоцимом, нормализовало ФМА нейтрофилов, ГИО и ГЗТ.

Обработка лизоцимом ЭН крыс с пиелонефритом с включенными химиопрепаратами существенно не изменяла их иммунометаболической активности при введении крысам с пиелонефритом.

Дополнительная обработка ПВП ЭН крыс с пиелонефритом, в отличие от ЭН здоровых доноров, существенно повышала их иммунометаболическую активность. Введение ЭН крыс с пиелонефритом с включенными аминогликозидами или фторхинолонами, обработанных ПВП, нормализовало ФАН, ОРН, ГИО и ГЗТ.

Введение антибиотиков, включенных в ЭН, полученных из эритроцитов, экспонированных в ультрафиолетовых лучах или магнитном поле, значительно усиливало их влияние на выраженность иммунного ответа на ЭБ, нормализовало показатели, характеризующие состояние гепатоцитов, интенсивность ПОЛ, повышало антиоксидантный потенциал эритроцитов у животных с пиелонефритом. Выраженность иммуномодулирующего действия была выше у ЭН с включенными антибиотиками или фторхинолонами, полученными из эритроцитов, подвергнутых действию магнитного поля.

В отличие от ЭН предварительное экспонирование лейкоцитов в магнитном поле не вызывало повышения активности полученных из них ЛН с антибиотиками или фторхинолонами, а воздействие ультрафиолетового облучения значительно усиливало их влияние на выраженность изучаемых процессов у крыс с пиелонефритом.

Исследования показали, что иммуностимулирующая, гепатопротекторная и антиоксидантная активность ЭН и ЛН с антимикробными препаратами здоровых животных была сопоставима с аналогичными носителями животных с пиелонефритом, подвергнутых действию ультрафиолетовых лучей и магнитного поля, что позволяет исключить или свести к минимуму использование донорских клеток для получения носителей.

Оценка эффективности влияния эритроцитарных и лейкоцитарных форм антибактериальных препаратов на функциональную активность клеток крови при необструктивном пиелонефрите

У животных с пиелонефритом установлено значительное подавление активности НАДФН-оксидазы нейтрофилов, Mg2+-АТФазы эритроцитов, снижение концентрации ФДФ в лимфоцитах и повышение содержания МДА в тромбоцитах. Системное введение антибиотиков аминогликозидов и фторхинолонов животным с пиелонефритом достоверно снижало активность метаболических маркёров нейтрофилов, лимфоцитов, эритроцитов и повышало уровень МДА в тромбоцитах.

Введение эритроцитарных форм антибактериальных препаратов повышало активность НАДФН-оксидазы нейтрофилов, Mg2+-АТФазы эритроцитов, концентрацию ФДФ в лимфоцитах и снижало содержание МДА в тромбоцитах. Введение лейкоцитарных форм антибактериальных препаратов оказывало аналогичный эффект, за исключением активности Mg2+-АТФазы эритроцитов, активность которой повышалась незначительно (табл. 7). Оказалось, что активность Mg+2-АТФазы повышается только в случае введения ЛН с иммобилизованными в присутствии АТФ аминогликозидами или фторхинолонами.

Таблица 7

Влияние эритроцитарных и лейкоцитарных форм антибактериальных препаратов на показатели функциональной активности клеток крови при пиелонефрите

Условия опыта

НАДФН-оксидаза

ФДФ

Mg2+

АТФаза

МДА

1. Здоровые животные

1,34±0,23

1,1±0,21

0,76±0,06

0,68±0,05

2. Животные с пиелонефритом

0,61±0,07*1

0,71±0,06*1

0,42±0,04*1

0,92 ±0,07*1

3. Животные с пиелонефритом +ЭН с гентамицином

0,82±0,06*2

0,85±0,072

0,84±0,05*2

0,76±0,06*2

4. Животные с пиелонефритом +ЭН с офлоксацином

0,81±0,07*2

0,84±0,06*2

0,65±0,06*2

0,77±0,06*2

5. Животные с пиелонефритом +ЛН с гентамицином

0,82±0,06*2

0,83±0,06*2

0,53±0,05*3

0,78 0,06*2

6. Животные с пиелонефритом +ЛН с офлоксацином

0,86±0,07*2

0,82±0,07*2

0,51±0,05*4

0,79±0,07*2

Важное значение для понимания механизмов иммунологических взаимодействий в целостном организме имеет АЗКЦ. Изучение выраженности феномена АЗКЦ при пиелонефрите показало существенное сниже­ние её показателей с 12,3 ± 1,2% (в контроле) до 4,4 ± 0,5% у крыс с пиелонефритом. Системное введение антибактериальных препаратов приводило к ее дальнейшему снижению с 4,4±0,5% до 3,2±0,3% при введении гентамицина и до 3,4±0,3% при введении офлоксацина. Ведение эритроцитарных форм антибактериальных препаратов повышало, а лейкоцитарных форм нормализовало индекс АЗКЦ у животных с пиелонефритом.

Принимая во внимание полученные данные о тромбоцито-эритроцитарной механизме иммуносупрес­сии при пиелонефрите, можно было ожидать, что тромбоциты крыс с пиело­нефритом оказывают влияние на активность белков и, в первую очередь, ферментов, ин­тегрированных в мембрану эритроцита. Установлено, что инкубация тромбоцитов крыс с пиелонефритом, не получавших и получавших свободные антибиотики (гентамицин) с цельными эритроцитами интактных животных или с их стромой (соотношение тромбоцитов и эритроцитов или стромальных частиц 10:1), существенно снижает активность Mg2+-АТФазы в стромальных частицах (активность Mg2+-АТФазы в строме равнялась 0,63 ±0,08, активность фермента после инкубации стромы с тромбоцитами 0,42 ±0,06 или 0,34±0,03 мкмоль фосфата на 1г белка в час). В связи с изложенным возник вопрос о возможном влиянии тромбоцитов на функциональную активность лейкоцитов периферической крови. Оказалось, что тромбоциты снижали выраженность феномена АЗКЦ (до инкубации – 11,6±1,3, после инкубации – 7,2±0,85 или 6,2±0,61).

Введение эритроцитарных и лейкоцитарных форм антибактериальных препаратов снижало способность тромбоцитов крыс с пиелонефритом угнетать активность Mg2+-АТФазы стромы эритроцитов интактных животных и феномена АЗКЦ. Введение ЛН с иммобилизованными в присутствии АТФ антибактериальными препаратами отменяло свойство тромбоцитов снижать активность Mg2+-АТФазы эритроцитов и ингибировать АЗКЦ. Выполненные эксперименты свидетельствуют о сложном механизме влияния тромбоцитов на иммунометаболические процессы при необструктивном пиелонефрите.

Результаты проведенных исследований могли бы лежать в основе разработки нового направления химиотерапии при различных инфекционных заболеваниях, а именно технологии направленного транспорта в организм, основанной на создании и использовании клеточных (эритроцитарных и лейкоцитарных) форм антимикробных средств, стандартизованных по количеству действующего препарата. Клеточные формы антимикробных препаратов (антибиотики аминогликозиды или фторхинолоны) сохраняют спектр бактерицидной активности, нормализируют нарушенные иммунометаболические процессы и не вызывают системное токсическое действие на организм.

ВЫВОДЫ

1. Технология использования клеточных носителей для направленного транспорта антибиотиков и фторхинолонов включает методики получения клеточных форм препаратов, стандартизации их по количеству действующего вещества, установления условий и сроков хранения, математический расчет. Технология позволяет получать клеточные формы антибактериальных препаратов. Направленный транспорт антибактериальных препаратов подтверждается кинетикой их распределения с максимальной концентрацией в почках через 1 час после введения и ее сохранения в почках в течение 24 часов. Применение антибиотиков и фторхинолонов, включенных в клеточные носители, позволяет предложить схему однократного их введения в дозе в 5 раз меньшей, чем курсовое назначение препаратов.

2. Экспериментальное моделирование необструктивного гематогенного пиелонефрита вызывало развитие клинических, лабораторных, гематологических признаков воспалительного процесса в почках, снижение в почках активности СДГ, ГДГ, ЩФ в 1,9 – 2,3 раза на фоне высокой активности ЛДГ, что подтверждалось характерной морфологической картиной почек.

3. Системное введение гентамицина 2 мг/кг, амикацина 12 мг/кг, ципрофлоксацина 3 мг/кг и офлоксацина 3 мг/кг 1 раз в сутки курсом 5 дней после моделирования пиелонефрита нормализовало температуру тела, выделительную функцию, гематологические показатели, активность ферментов и морфологическую картину в почках к 10 – 12 суткам наблюдения.

Использование эритроцитарных и лейкоцитарных форм антибактериальных препаратов в соответствующих их системному введению дозах оказывало более существенный фармакологический эффект, что выражалось в более ранней нормализации (на 5 – 7 сутки) клинических, лабораторных, гематологических и морфологических показателей.

4. Развитие экспериментального пиелонефрита сопровождалось резкими иммунометаболическими нарушениями: усилением процессов ПОЛ, снижением активности антиокислительных ферментов, концентрации макроэргических соединений и снижением дзета-потенциала в эритроцитах, а также функционально-метаболической активности нейтрофилов крови, ГИО и ГЗТ. Усиливалось выделение в сосудистое русло окислительно-модифицированных фосфолипопротеинов, под влиянием которых тромбоциты индуцировали у легких эритроцитов способность вызывать выделение спленоцитами иммуносупрессирующих цитокинов (тромбоцитарно-эритроцитарный механизм иммуносупрессии).

5. Анализ путей развития иммуносупрессии при экспериментальном пиелонефрите показал, что лимфоциты периферической крови выполняли роль связующего звена между эритроцитами и клетками макрофагального ряда. Обработка эритроцитов крыс с пиелонефритом рибоксином и лизоцимом снижала или полностью предотвращала их способность индуцировать выделение лимфоцитами интактных крыс цитокинов, угнетающих функционально-метаболическую активность нейтрофилов крови здоровых животных. Обработка лимфоцитов интактных крыс лизоцимом и рибоксином снижала или приводила к полной их анергии в отношении эритроцитов крыс с пиелонефритом.

6. Системное введение инфицированным животным антибиотиков различных групп в широком диапазоне доз: цефалексин (30; 60 мг/кг); гентамицин (2; 4 мг/кг); амикацин (12; 24 мг/кг); рифампицин (10; 20 мг/кг); доксорубицин (1,5; 3,0 мг/кг); ципрофлоксацин (3; 6 мг/кг); офлоксацин (3; 6 мг/кг) дозозависимо усиливало свободнорадикальные процессы в эритроцитах, выраженность цитолиза и холестаза, существенно угнетало ГИО и ГЗТ. Иммуносупрессорная активность реализовалась гуморальными факторами сыворотки крови посредством эритроцитов.

7. Системное введение животным с необструктивным пиелонефритом антибактериальных препаратов усиливало процессы ПОЛ, цитолиза и холестаза, снижало активность антиокислительных ферментов, накопление макроэргических соединений в эритроцитах функционально-метаболическую активность нейтрофилов, ГИО и ГЗТ. При этом отмечалось усиление тромбоцитарно-эритроцитарного механизма иммуносупрессии. При обработке эритроцитов антибиотиками и фторхинолонами наблюдалась инверсия их иммуномодулирующей активности.

8. Введение животным с пиелонефритом, получавших антибактериальные препараты, дипиридамола (3 мг/кг), рибоксина (2мг/кг), лизоцима (1 мг/кг) и ПВП (0,5 мг/кг) снижало выраженность иммунометаболических нарушений. При этом в сочетании с аминогликозидами наиболее эффективным оказался ПВП, а лизоцим был эффективным как с аминогликозидами, так и с фторхинолонами.

9. Введение крысам с пиелонефритом антибиотиков аминогликозидов или фторхинолонов, включенных в эритроцитарные носители здоровых доноров и крыс с пиелонефритом, нормализовало энергетические и антиокислительные процессы в эритроцитах, показатели цитолиза и холестаза. Эритроцитарные формы антибактериальных препаратов повышали функционально-метаболическую активность нейтрофилов, ГИО, ГЗТ, индуцировали появление иммуностимулирующей активности у эритроцитов, усиливали выделение не прилипающими при 4 – 10°С и прилипающими при 32 – 37°С к стеклу клетками селезенки иммуностимулирующих цитокинов, отменяли иммуносупрессорную активность у тромбоцитов. Определение показателей через 10 суток показало их дестабилизацию при использовании эритроцитарных носителей животных с пиелонефритом.

10. Введение животным с пиелонефритом лейкоцитарных форм антибактериальных препаратов нормализовало антиоксидантный и энергетический потенциал эритроцитов, стимулировало функционально-метаболическую активность нейтрофилов, отменяло тромбоцито- эритроцитарный механизм иммуносупрессии.

11. Обработка эритроцитарных носителей с включенными антибиотиками аминогликозидами или фторхинолонами лизоцимом или ПВП усиливала и пролонгировала их иммунометаболическую активность. При использовании эритроцитарных носителей здоровых крыс наиболее эффективным был лизоцим, а для эритроцитарных носителей животных с пиелонефритом – ПВП. Предварительное экспонирование клеток в ультрафиолетовых лучах или магнитном поле повышало иммунометаболическую активность эритроцитарных и лейкоцитарных форм антибактериальных препаратов. Отмечено, что наиболее эффективными были эритроцитарные формы аминогликозидов и фторхинолонов, полученные из эритроцитов, экспонируемых в магнитном поле и лейкоцитарные формы антибактериальных препаратов, предварительно подвергнутые действию ультрафиолетовых лучей.

12. Введение клеточных форм антибактериальных препаратов изменяло нарушенную при пиелонефрите активность метаболических маркеров: повышалась активность Mg2+ - АТФазы эритроцитов, НАДФН- оксидазы лейкоцитов, ФДФ в лимфоцитах и снижался уровень МДА в тромбоцитах. Введение лейкоцитарных форм антибактериальных препаратов, полученных в присутствии АТФ, отменяло свойство тромбоцитов снижать активность Mg2+ - АТФазы эритроцитов и ингибировать АЗКЦ.

Практические рекомендации

Отработать методику получения стандартизованных клеточных (эритроцитарных и лейкоцитарных) лекарственных форм химиотерапевтических средств в условиях клинической лаборатории.

Получить экстемпоральные лекарственные клеточные формы химиотерапевтических препаратов и изучить возможности их стабилизации и пролонгации во времени хранения.

Изучить эффективность совместного использования фармацевтических препаратов и физических факторов для коррекции имуннометаболической активности свободных и иммобилизованных в клеточные носители химиотерапевтических препаратов в клинической урологической практике.

Выяснить значение определения активности Mg+2-АТФазы эритроцитов, НАДФН-оксидазы нейтрофилов и содержания ФДФ в лимфоцитах в качестве критериев для прогнозирования иммуномодулирующей эффективности эритроцитарных и лейкоцитарных форм химиопрепаратов в условиях гематогенного необструктивного пиелонефрита.

Изучить механизм взаимодействия тромбоцитов, эритроцитов и лейкоцитов и выяснить роль этого взаимодействия при необструктивном пиелонефрите и введении клеточных форм антибиотиков и фторхинолонов.

Список опубликованных работ

  1. Острый пиелонефрит гестационного периода. Анализ патологии и результатов лечения / С.Д. Долженков, О.В. Катунина, Г.В. Сипливый и др. // Экстренная специализированная медицинская помощь: сб. - Курск, 1999.-С. 295-297.
  2. Прокопенко, Л.Г. Иммуномодулирующее, антиоксидантное и гепатопротекторное действие некоторых антибиотиков, инкапсулированных в эритроцитарные носители / Л.Г. Прокопенко, Г.В. Сипливый // Метаболическая иммуномодуляция: монография / под ред. Л.Г. Прокопенко, А.И. Конопля. - Курск, 2000. - С. 212-219.
  3. Сипливый, Г.В. Протективная и антиоксидантная активность иммобилизированной формы аминогликозидных антибиотиков / Г.В. Сипливый, Л.Е. Сипливая, А.В. Кукурека // Достижения, проблемы, перспективы фармацевтической науки и практики: материалы науч. – практ. конф., посвящ. 35 – летию фармац. ф-та. – Курск, 2001. – С. 267 – 268.
  4. Сипливый, Г.В. Сравнительная оценка иммуномодулирующей активности некоторых антибиотиков при различных технологиях введения / Г.В. Сипливый, А.В. Кукурека, Е.Н. Карпенко // Материалы 67-й межвуз. науч. конф. студентов и молодых ученых. В 2-х чч. – Ч. II. – Курск, 2002.- С.142.
  5. Разработка и исследование иммуномодулирующей активности пленок с доксорубицином / Л.Е. Сипливая, Л.Н. Ерофеева, Г.В. Сипливый и др. // Тез. докл. IX-й Рос. нац. конгр. «Человек и лекарство» (апрель 2002г., г. Москва. – М., 2002. - С.67.
  6. Разработка спектрофотометрического определения доксорубицина в субстанции и лекарственных форма / Л.Е. Сипливая, Л.Н. Ерофеева, Г.В. Сипливый и др. // Тез. докл. IX-й Рос. нац. конгр. «Человек и лекарство»( апрель 2002г., г. Москва). – М., 2002. - С. 68.
  7. Сипливый, Г.В. Иммуномодулирующая антиоксидантная активность антибиотиков, иммобилизованных в пленки / Г.В. Сипливый // Тр. 67-й науч. сессии КГМУ и отд-ния мед.-биолог. наук Центр.-Чернозем. науч. центра РАМН. В 2-х чч. – Ч. 1. – Курск: Изд-во КГМУ, 2002. - С. 38-39.
  8. Спектрофотометрическое определение эритромицина / А.В. Кукурека, Л.Е. Сипливая, Г.В. Сипливый и др. // Фармация. - 2003. - №4. - С. 7-9.
  9. Пленки с рифампицином для лечения ЛОР-заболеваний / Л.Н. Ерофеева, Н.Д. Афонина, Г.В. Сипливый и др. // Фармация. - 2003. - №4. - С. 23-25.
  10. Сипливый, Г.В. Длительность и объемы стационарного обследования больных гиперплазией простаты пожилого и старческого возраста / Г.В. Сипливый, Е.А. Шумакова, О.И. Братчиков // Рос. науч.-прак. конф. «Реабилитация в геронтологии, гериатрии». - Курск, 2003. - С. 135-137.
  11. Сипливый, Г.В. Особенности стационарного обследования больных гиперплазией простаты пожилого и старческого возраста / Г.В. Сипливый О.И. Братчиков, Е.А. Шумакова // Материалы тр. XI Междунар. науч.-практ. конф. - Харьков, 2003. - С. 332-334.
  12. Сипливый, Г.В. Экспериментальное обоснование использования новых лекарственных форм доксорубицина для коррекции его гепатотоксического, прооксидантного и иммуносупрессорного действия / Г.В. Сипливый // Антибиотики и химиотерапия. - 2004. - №4. - С. 16-20.
  13. Иммуномодулирующее, антиоксидантное и гепатопротекторное действие иммобилизованных форм рифампицина и цефалексина / Л.Г. Прокопенко, А.И. Лазарев, Г.В. Сипливый и др. // Антибиотики и химиотерапия. - 2004. - Т.49, №8-9. - С. 21-24.
  14. Сипливый, Г.В. Изучение иммуномодулирующего, антиоксидантного и гепатопротекторного действия иммобилизированных форм рифампицина и цефалексина / Г.В. Сипливый, Л.Е. Сипливая, А.В. Кукурека // Сб. работ 69-й итог. науч. сессии КГМУ и отд-ния мед.-биолог. наук Центр.-Чернозем. науч. центра РАМН,. – Курск: Изд-во КГМУ, 2004. – Т. 1. – С.113-114.
  15. Сипливый, Г.В. Экспериментальное обоснование использования иммобилизированной формы доксорубицина для коррекции его гепатотоксического, прооксидантного и иммуносупрессорного действия / Г.В. Сипливый, Л.Е. Сипливая, А.В. Кукурека // Сб. работ 69-й итог. науч. сессии КГМУ и отд-ния мед.-биолог. наук Центр.-Чернозем. науч. центра РАМН. – Курск: Изд-во КГМУ, 2004. – Т. 1. – С. 114-115.
  16. Изучение цитотоксического действия доксорубицина, иммобилизированного в пленках / В.Т. Дудка, Е.Н. Карпенко, Г.В. Сипливый, Т.И. Ананьева // Сб. работ 69-й итог. науч. сес. КГМУ и от­д-ния мед.-биолог. наук Центр.-Чернозем. науч. центра РАМН. - Курск: КГМУ, 2004. – Т. 2. – С. 260 – 261.
  17. Изучение устойчивости эритроцитарных носителей с доксорубицином / И.Н. Карпенко, Л.Е. Сипливая, Г.В. Сипливый, Л.Н. Ерофеева // Сб. работ 69-й итог. науч. сессии КГМУ и отд-ния мед.-биолог. наук Центр.-Чернозем. науч. центра РАМН,. – Курск: КГМУ, 2004. – Т. 2. – С. 271 - 272.
  18. Разработка технологии иммобилизации рифампицина и цефалексина / Л.Г. Прокопенко, А.И. Лазарев, Г.В. Сипливый и др. // Сорбенты как фактор качества жизни и здоровья: материалы Всерос. науч. конф. с междунар. участием (Белгород, 11-14 окт. 2004г.). - Белгород: Изд-во БелГУ, 2004.- С. 156-158.
  19. Разработка иммобилизированных лекарственных форм доксорубицина с целью коррекции его гепатотоксического, прооксидантного и иммуносупресорного действия / Л.Г. Прокопенко. А.И. Лазарев, Г.В. Сипливый и др. //Сорбенты как фактор качества жизни и здоровья: материалы Всерос. науч. конф. с междунар. участием (Белгород, 11-14 окт. 2004г.). - Белгород: Изд-во БелГУ, 2004. - С. 158-160.
  20. Санация ложи аденомы простаты и послеоперационного простатита как профилактика гнойно-воспалительных осложнений простатэктомии / О.И. Братчиков, Д.А. Тисцов, Г.В. Сипливый и др. // Материалы пленума правления Рос. об-ва урологов (г.Саратов, 8 -10 июня 2004г.). – М., 2004. – С. 117 -118.
  21. Сипливый, Г.В. Разработка методики количественного определения цифалексина, иммобилизованного в эритроцитарные носители / Г.В. Сипливый Л.Е. Сипливая, А.В. Кукурека // II Всерос. съезд фармацевтических работников: сб. материалов. – Сочи, 2005. – С. 135-136.
  22. Разработка иммобилизованных лекарственных форм доксорубицина и методик его анализа / Л.Е. Сипливая, В.К. Шорманов, Г.В. Сипливый и др. // II Всерос. съезд фармацевтических работников: сб. материалов. – Сочи, 2005. – С. 136-137.
  23. Получение иммобилизованной формы рифампицина, обладающей иммуномодулирующим, антиоксидантным и гепатопротекторным действием / Л.Е. Сипливая, А.И. Лазарев, Г.В. Сипливый, А.В. Кукурека // II Всерос. съезд фармацевтических работников: сб. материалов. – Сочи, 2005. – С. 138-139.
  24. Динамика изменения чувствительности возбудителей инфекции мочевыводящих путей при терапии цефиксимом / Г.В. Сипливый, Е.А. Шумакова, А.Ю. Бобнева, В.В. Приходько // Молодежная наука и современность: юбилейная межвуз. науч. конф. студентов и молодых ученых, посвящ. 70-летию КГМУ. В 2-х чч. – Курск: Изд-во КГМУ, 2005. - Ч.1. – С. 233-234.
  25. Оценка антибиотикорезистентности возбудителей инфекции мочевыводящих путей в урологическом стационаре / Г.В. Сипливый, Е.А. Шумакова, А.Ю. Бобнева, В.В. Приходько // Молодежная наука и современность: юбилейная межвуз. науч. конф. студентов и молодых ученых, посвящ. 70-летию КГМУ. В 2-х чч. – Курск: Изд-во КГМУ, 2005. - Ч.1. – С. 234-235.
  26. Иммуномодулирующая активность некоторых иммобилизованных антибиотиков при экспериментальной почечной недостаточности, осложненной стафилококковой инфекцией / О.И. Братчиков, Е.А. Шумакова, Г.В. Сипливый, А.В. Кукурека // Факультет последипломного образования: 20 лет на службе здравоохранения: материалы регион. науч.-практ. конф., посвящ. 20-летию ф-та постдипломного образования КГМУ(24 марта 2006г.) / под ред. проф. А.И. Лазарева. – Курск: Изд-во КГМУ, 2006. – С. 171-172.
  27. Протективная активность иммобилизованных антибиотиков аминогликозидов при острой почечной недостаточности и инфицировании / О.И. Братчиков, Е.А. Шумакова, Г.В. Сипливый, А.В. Кукурека // Факультет последипломного образования: 20 лет на службе здравоохранения: материалы регион. науч.-практ. конф., посвящ. 20-летию ф-та постдипломного образования КГМУ(24 марта 2006г.) / под ред. проф. А.И. Лазарева. – Курск: Изд-во КГМУ, 2006. – С. 173-174.
  28. Бактериологическое исследование отделяемого послеоперационных ран у больных острым пиелонефритом на фоне сахарного диабета / Е.А. Шумакова, А.Ю. Бобнева, Г.В. Сипливый и др.// Факультет последипломного образования: 20 лет на службе здравоохранения: материалы регион. науч.-практ. конф., посвящ. 20-летию ф-та постдипломного образования КГМУ(24 марта 2006г.) / под ред. проф. А.И. Лазарева. – Курск: Изд-во КГМУ, 2006. – С.463-454.
  29. Исследование некоторых видов активности иммобилизованных форм амминогликозидных антибиотиков при токсическом поражении почек, осложненном стафилококковой инфекцией / А.В. Кукурека, Л.Е. Сипливая, Г.В. Сипливый, П.М. Карлов // Сб. тр. 72 науч. конф. КГМУ и сессии Центр. – Чернозем. науч. центра РАМН. - Курск: Изд-во КГМУ, 2007. – Т.3. - С. 182 – 184.
  30. Изучение иммуномодулирующей, гепатопротекторной и антиоксидантной активности иммобилизованных форм аминогликозидных антибиотиков при токсическом поражении почек, осложненном стафилококковой инфекцией / Л.Е. Сипливая, А.В. Кукурека, Г.В. Сипливый, В.И. Михайленко // XIV Рос. нац. конгр. «Человек и лекарство»: сб. материалов конгр. (тез. докл). – М., 2007. - С. 582 – 583.
  31. Использование направленного транспорта аминогликозидных антибиотиков при пиелонефрите / Г.В. Сипливый, А.В. Кукурека, Л.Е. Сипливая // Сб. науч. тр. по материалам междунар. науч.-практ. конф. «Современные проблемы и пути их решения в науке, транспорте, производстве и образовании 2007». – Т. 18. Медицина, ветеринария и фармацевтика. Химия. История. – Одесса: Черноморье, 20007. – С. 36-37.
  32. Иммунометаболическая активность направленного транспорта фторхинолонов при инфекционном и токсическом поражении почек / О.И. Братчиков, П.М. Карлов, Л.Е. Сипливая, Г.В. Сипливый // Университетская наука: теория, практика, инновации: сб. тр. 73-й науч. конф. КГМУ и сессии Центр.-Чернозем. науч. центра РАМН. В 3-х тт. – Курск: Изд-во КГМУ, 2008. – Т.1. – С. 137 – 140.
  33. Изменение иммунометаболической активности некоторых антибиотиков, иммобилизованных в клеточные носители, под влиянием физических факторов / А.И. Лазарев, А.В. Кукурека, Л.Е. Сипливая, Г.В. Сипливый // Университетская наука: теория, практика, инновации: сб. тр. 73-й науч. конф. КГМУ и сессии Центр.-Чернозем. науч. центра РАМН. В 3-х тт. – Курск: Изд-во КГМУ, 2008. – Т.1. – С. 150 – 154.
  34. Перспективы использования направленного транспорта аминогликозидов при экспериментальном необструктивном пиелонефрите / О.И. Братчиков, Л.Е. Сипливая, Г.В. Сипливый, А.В. Кукурека // Университетская наука: теория, практика, инновации: сб. тр. 73-й науч. конф. КГМУ и сессии Центр.-Чернозем. науч. центра РАМН. В 3-х тт. – Курск: Изд-во КГМУ, 2008. – Т.1. – С. 185 – 188.
  35. Сипливый, Г.В. Тромбоэритроцитарная иммуносупрессия при экспериментальном необструктивном пиелонефрите / Г.В. Сипливый // Аллергология и иммунология. - 2008. – Т. 9, №3. – С. 311.
  36. Сипливый, Г.В. Коррекция иммунометаболических нарушений при необструктивном пиелонефрите антибиотиками-аминогликозидами, иммобилизованными в лейкоцитарные носители / Г.В. Сипливый // Аллергология и иммунология. - 2008. – Т. 9, №3. – С. 311.
  37. Иммуномодулирующая, гепатопротекторная и антиоксидантная активность иммобилизованных форм аминогликозидных антибиотиков при токсическом поражении почек, осложненном стафилококковой инфекцией / О.И. Братчиков, А.И. Лазарев, Г.В. Сипливый и др. // Урология. – 2008. - №5. – С. 8 – 12.
  38. Эритроцитзависимые эффекты лекарственных и физиотерапевтических средств: монография / А.И. Лазарев, И.Л. Бровкина, Г.В. Сипливый и др.; ГОУ ВПО КГМУ Росздрава. - Курск: Изд-во КГМУ, 2008. – 336 с.
  39. Effect of UV irradiation and magnetic field on immunometabolic effects of antibiotics immobilized in cell carries / А.И. Лазарев, А.В. Кукурека, Л.Е. Сипливая, Г.В. Сипливый // Bulletin of experimental biology and medicine. - New York, 2008. – Vol. 145. – № 6. – Р. 717 – 720. [USA, June, 2008].
  40. Влияние ультрафиолетового облучения и магнитного поля на иммунометаболические эффекты антибиотиков, иммобилизованных в клеточные носители / А.И. Лазарев, А.В. Кукурека, Л.Е. Сипливая, Г.В. Сипливый // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2008. – Т.145, №6. – С. 663 – 667.
  41. Братчиков, О.И. Острый пиелонефрит: учеб.-методич. пособие / О.И. Братчиков, Г.В. Сипливый, Е.А. Шумакова. – Курск: Изд-во КГМУ, 2008. – 166 с.
  42. Влияние ультрафиолетового облучения и магнитного поля на иммунометаболические эффекты антибиотиков, иммобилизованных в клеточные носители при пиелонефрите / А.В. Кукурека, Л.Е. Сипливая, Г.В. Сипливый //Кластерные подходы в современной фармации и фармацевтическом образовании: сб. материалов междунар. науч.-практ. конф. (г. Белгород, 20-21 ноября. 2008г.) / под ред. проф. И.В. Спичак. – Белгород: Изд-во БелГУ, 2008. – С. 324 - 325.
  43. Изменение иммунометаболических показателей в условиях пиелонефрита и направленного траспорта антибиотиков-аминогликозидов / А.В. Кукурека, Л.Е. Сипливая, В.И. Михайленко, Г.В. Сипливый // Кластерные подходы в современной фармации и фармацевтическом образовании: сб. материалов междунар. науч.-практ. конф. (г. Белгород, 20-21 ноября. 2008г.) / под ред. проф. И.В. Спичак. – Белгород: Изд-во БелГУ, 2008. – С. 326 – 327.
  44. Иммунометаболическая активность антибиотиков-аминогликозидов или фторхинолонов, иммобилизованных в эритроцитарные и лейкоцитарные носители, при пиелонефрите / О.И. Братчиков, Л.Е. Сипливая, Г.В. Сипливый, А.В. Кукурека // Университетская наука: теория, практика, инновации: сб. тр. 74-й науч. конф. КГМУ, сессии Центр.-Чернозем. науч.о центра РАМН и отд-ния РАЕН. В 3-х тт. – Курск: Изд-во КГМУ, 2009. – Т. 1. – С. 146 – 149.
  45. Сипливый, Г.В. Иммунометаболические эффекты поливинилпирролидона (ПВП) и лизоцима при необструктивном пиелонефрите и введении антибиотиков-аминогликозидов / Г.В. Сипливый // Аллергология и иммунология.- 2009. – Т. 10, №2. – С. 291.
  46. Сипливый, Г.В. Коррекция иммуномодулирующего, антиоксидантного и гепатопротекторного действия иммобилизованных в эритроцитарные носители антибиотиков-аминогликозидов при пиелонефрите / Г.В. Сипливый // Аллергология и иммунология. - 2009. – Т. 10, №2. – С. 292.
  47. Иммунометаболическая активность фторхинолонов, иммобилизованных в клеточные носители при токсическом поражении почек в условиях стафилококковой инфекции / О.И. Братчиков, А.И. Лазарев, Г.В. Сипливый и др. //Урология. – 2009. №2. – С. 13 – 18.
  48. Братчиков, О.И. Обоснование использования направленного транспорта аминогликозидных антибиотиков при экспериментальном необструктивном пиелонефрите / О.И. Братчиков, Г.В. Сипливый, Е.А. Шумакова // Рациональная фармакотерапия в урологии 2009: III всерос. науч.- практ. конф.: тез. (г. Москва, 12 – 13 февраля 2009 г.). – М., 2009. - С. 65 – 66.
  49. Сипливый Г.В. Иммуномодулирующая активность дипиридамола и АТФ при необструктивном пиелонефрите / Г.В. Сипливый, О.И. Братчиков, Л.Е. Сипливая, // Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии: сб. тр. Х междунар. конгр. (г. Казань 20 – 23 мая 2009г.) // Российский аллергологический журнал – 2009. - №3. – С. 454 – 455.
  50. Сипливый, Г.В. Экспериментальное обоснование использования клеточных носителей для направленного транспорта антибиотиков при необструктивном пиелонефрите / А.И. Лазарев, Г.В. Сипливый, А.В. Кукурека // Российский медико-биологический вестник им. акад. И.П. Павлова. – 2009. - №1. – С. 58 – 62.
  51. Сипливый, Г.В. Корригирующее влияние лизоцима и поливинилпирролидона на иммунометаболическую активность эритроцитарных носителей с включенными аминогликозидами или фторхинолонами при пиелонефрите / Г.В. Сипливый, Л.Е. Сипливая, А.В. Кукурека // Актуальные вопросы фармакологии и фармации: сб. тр. межвуз. науч. конф., посвящ. памяти проф. В.В. Пичугина и 75-летию КГМУ. – Курск: Изд-во КГМУ, 2009. – С. 318 – 320.
  52. Влияние дипиридамола и АТФ на иммуносупрессирующие свойства эритроцитов и тромбоцитов при экспериментальном необструктивном пиелонефрите / А.И. Лазарев, Л.Е. Сипливая, А.В. Кукурека, Г.В. Сипливый // Российский медико-биологический вестник им. акад. И.П. Павлова. – 2009. - №4. – С. 19 – 23.
  53. Тактика ведения больных с острыми воспалительными заболеваниями почек: учеб.- методич. пособие / О.И. Братчиков, Е.А. Шумакова, Г.В. Сипливый. – Курск: ОАО «ИПП «Курск», 2009. – 231 с.

Открытие и изобретения

  1. Закономерность развития иммуносупрессии при нарушении энергетического гомеостаза организма человека и животных под действием тромбоцитов: диплом на открытие № 397 / Бровкина И.Л., Конопля А.И., Конопля Н.А., Лазаренко В.А., Прокопенко Г.В., Сипливый Г.В. - № А-497; заявл.: 09.04.2010.
  2. Иммобилизованная форма доксорубицина: пат. 2262923 Рос. Федерация: МПК7 А61 К 9/26, 31/704, А 61 Р 35/00 / Ерофеева Л.Н., Карпенко Е.Н., Сипливая Л.Е., Дудка В.Т., Печенин О.Д., Ананьева Т.И.; заявитель и патентообладатель ГОУ ВПО КГМУ Росздрава. - №2003137539/15(040253); заявл. 25.12.2003; опубл. 25.10.2005, Бюл.№ 30.
  3. Устройство для операции методом троакарной цистостомии под ультразвуковым контролем: пат. 85 324 Рос. Федерация: МПК7 А61В 17/34 / Братчиков О.И., Серегин С.П., Долженков С.Д., Шумакова Е.А., Криковцов С.И., Басов П.Д., Новиков А.В., Коцарь А.Г., Пахомов В.В.; заявители и патентообладатели Серегин С.П., Долженков С.Д.. - № 2008146897/2; заявл. 27.11.2008; опубл. 10.08.2009, Бюл. №22.

Принятые сокращения

ААП - альфа-1-антипротеаза, мкмоль/л

ААТ – альфа-1-антитрипсин, мкмоль/л

АГП – ацилгидроперекиси, D233 на 1 мл плазмы

АЗКЦ – антителозависимая клеточная цитотоксичность в %

АЛТ – аланинаминотрансфераза, ммоль/чл

АМГ – альфа-2-макроглобулины, мкмоль/л

АМК – активные метаболиты кислорода

АОК – антителообразующие клетки, 103/селезенку

АСТ – аспартатаминотрансфераза, ммоль/чл

АТФ – аденозинтрифосфат, мкмоль/мл эритроцитов

БФГ – 2,3-бифосфоглицерат, мкмоль/мл эритроцитов

ГАГ – гликозаминогликаны, г/л

ГДГ – глютаматдегидрогеназа, моль/чл

ГЗТ – гиперчувствительность замедленного типа

ГИО – гуморальный иммунный ответ

ГР – глутатионредуктаза, мкмоль/мл эритроцитов

ДК – диеновые коньюгаты, нмоль/л

ЛДГ – лактатдегидрогеназа, моль/чл

ЛН – лейкоцитарные носители

ЛНП – липопротеины низкой плотности, условные единицы

ЛОНП – липопротеины очень низкой плотности, условные единицы

МДА – малоновый диальдегид, мкмоль/л

ММ – молекулярная масса, кД

НТСсп – тест восстановления нитросинего тетразолия спонтанный и

НТСинд – индуцированный, %

ОБ – общий билирубин, мкмоль/л

ОРН(НСТинд – НСТсп) – окислительный резерв нейтрофилов

ПОЛ – перекисное окисление липидов

РКЛ – разница кариоцитов лимфоузлов, 106

РМЛ – разница массы лимфоузлов, мг

СНКС – супернатант не прилипающих к стеклу клеток селезенки

СПКС – супернатант прилипающих к стеклу клеток селезенки

СОД – супероксиддисмутаза, ЕД на мл эритроцитов

СДГ – сукцинатдегидрогеназа, моль/чл

ФАН (ФИФЧ) – индекс активности фагоцитов

ФДФ – фруктоза-2,6-дифосфат, пМ/106 лимфоцитов

ФИ – фагоцитарный индекс, %

ФЛП – фракция липопротеинов низкой и очень низкой плотности

ФМА – функционально-метаболическая активность

ФЧ – фагоцитарное число

ЩФ – щелочная фосфатаза, ммоль/чл

ЭБ – эритроциты барана

ЭН – эритроцитарные носители






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.