WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


 

На правах рукописи

ВОРОНКОВ АНДРЕЙ ВЛАДИСЛАВОВИЧ

ЭНДОТЕЛИАЛЬНАЯ ДИСФУНКЦИЯ И ПУТИ ЕЕ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЙ КОРРЕКЦИИ

14.03.06. фармакология, клиническая фармакология

А В Т О Р Е Ф Е Р А Т

диссертации

на соискание ученой степени доктора медицинских наук

  ВОЛГОГРАД 2011

Работа выполнена в Государственном общеобразовательном учреждении высшего профессионального образования «Волгоградский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения и социального развития Российской федерации»

Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор

Тюренков Иван Николаевич

Официальные оппоненты: ЗДН РФ, доктор медицинских наук,

профессор Р.С. Мирзоян

  ЗДН РФ, доктор медицинских наук, профессор К.М. Резников

доктор медицинских наук,

профессор В.А. Косолапов

Ведущая организация:  «НИИ экспериментальной медицины СЗО РАМН» г.Санкт- Петербург

Защита состоится  «6» октября 2011 г. в 1100 часов

на заседании Диссертационного совета Д 208.008.02 при ГОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет Минздравсоцразвития Российской федерации» (Россия, 400131, Волгоградская область, г. Волгоград, пл. Павших Борцов, 1).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет Минздравсоцразвития Российской федерации» (400131, Волгоградская область, г. Волгоград, пл. Павших Борцов, 1).

Автореферат разослан «_____»_______________2011 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета

доктор медицинских наук          А.Р. Бабаева

Актуальность темы

В настоящее время считается общепризнанным, что в основе развития сердечно–сосудистой патологии различного генеза важную роль играет дисфункция эндотелия (ЭД) (Петрищев Н.Н., 2003; Ярек-Мартынова И.Р., Шестакова М.В., 2011; Ding H., 2010; Potenza M.A., 2010; Maltais S., et all., 2011). Эндотелий рассматривается как самостоятельная мишень терапевтического воздействия для коррекции различных сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ). Исходя из этого, актуальной проблемой экспериментальной и клинической фармакологии является поиск веществ с эндотелиопротекторным действием (ЭПД) как среди известных препаратов, так и новых соединений (Карпов Ю.А. 2010).

К настоящему времени установлено ЭПД препаратов, уменьшающих влияние РААС и СНС на сердечно-сосудистую систему (иАПФ, b-блокаторы и т.д.); снижающих уровень ХСобщ, ХСЛПНП, ХСЛПОНП (особенно статины); регулирующих работу Ca2+ каналов (блокаторы Ca каналов), что очевидно связано, как с прямыми эндотелий зависимыми механизмами действия так и их опосредованным комплексным фармакологическим влиянием (Luscher T.F., Noll G., 1995; Aikawa M., 2010; Egashira K., 2010; Jorge P.A., 2010). Многие из проведенных экспериментальных и клинических исследований по изучению ЭПД сердечно-сосудистых средств достаточно противоречивы и не дают однозначного ответа по направленности и выраженности действия препаратов из этих фармакологических групп. Это обусловлено тем, что многие как экспериментальные, так и клинические исследования выполнены с использованием различных методов оценки функционального состояния эндотелия (биохимических, функциональных, инвазивных, неинвазивных и т.д.), клинические же работы, кроме этого, отличаются выбором больных, различных по возрасту, тяжести заболевания, сопутствующим патологиям, протоколам исследований.

Можно предполагать, что вещества с ГАМК–ергической активностью ограничивающие симпатические влияния на сердце и сосуды, уменьшающие активность РААС, обладающие при этом антиоксидантной и антигипоксантной активностью (Перфилова В.Н., 2009; Тюренков И.Н., 2008; Narahashi T., 1999; Harrison 2000), могут улучшать функцию эндотелия (Недвицкий П.И., 2000; Ishide T., 2005). Однако изучение влияния ГАМК–ергических средств на эндотелий практически не выполнялось.

Учитывая важную роль в развитии ЭД оксидативного стресса, можно предположить, что и антиоксиданты также могут воздействовать на различные звенья развития ЭД: на систему синтеза и биодоступности NO, гемореологические параметры крови, липидный и углеводный обмен, воспаление, пролиферацию (Насибуллин Р.С.,2010; Yamamoto, M.2008; Schiffrin E. L., 2010; Wallace T. C., 2011). Поэтому поиск высоко активных эндотелиопротекторов среди антиоксидантов, в том числе и флавоноидов, вполне оправдан.

На основании изложенного представилось целесообразным провести комплексное сравнительное изучение ЭПД ряда сердечно-сосудистых средств, производных ГАМК, лекарственных средств, обладающих антиоксидантной активностью в том числе и флавоноидов в условиях ЭД различного генеза.

Целью исследования является разработка методологии поиска веществ с эндотелиопротекторным действием и проведение сравнительного изучения эндотелиотропных свойств, сердечно-сосудистых средств и веществ с различными механизмами действия.

Задачи исследования

    1. Провести тестирование эндотелия различных сосудистых регионов в условиях нормы и экспериментальной патологии (при недостаточности половых гормонов, экспериментальном сахарном диабете, хирургической травме).
    2. Изучить влияние сердечно-сосудистых средств, производных ГАМК, флавоноидов и препаратов, обладающих антиоксидантной активностью на вазодилатирующую функцию эндотелия в условиях ЭСД и НПГ.
    3. Изучить влияние сердечно-сосудистых средств, производных ГАМК, препаратов, обладающих антиоксидантной активностью, в том числе и флавоноидов на антитромботическую функцию эндотелия, гемореологию и основные параметры гемостаза в условиях ЭСД и НПГ.
    4. Изучить влияние сердечно-сосудистых средств, производных ГАМК, и препаратов, обладающих антиоксидантной активностью, в том числе и флавоноидов на углеводный, липидный и гормональный статус животных с ЭСД и НПГ.
    5. Изучить влияние наиболее активных веществ из вновь синтезированныхпроизводных ГАМК, флавоноидов и препаратов сравнения на противовоспалительную функцию эндотелия при ЭСД и НПГ.
    6. Дать морфологическую оценку состояния эндотелия при ЭСД и НПГ и изучить влияние наиболее активных веществ из вновь синтезированных и препаратов сравнения на морфологическую структуру эндотелия.
    7. Изучить механизм эндотелиопротективного действия наиболее активных веществ из вновь синтезированных и препаратов сравнения у животных с ЭСД и НПГ с помощью иммуногистохимического исследования, с оценкой уровня экспрессии e-NOS, эндотелина-1, каспазы -3, nF-kB, рецепторов TREIL.
    8. На основании сравнительного изучения влияния на эндотелиальную функцию средств из различных фармакологических групп в условиях нормы и экспериментальной патологии, дать оценку методологии к подходам оценки эндотелиальной функции/дисфункции и эндотелиопротективного действия фармакологически активных соединений.

Новизна исследования

Впервые разработан комплексный подход изучения эндотелиотропных эффектов биологически активных веществ, обоснована возможность моделирования эндотелиальной дисфункции с помощью стрептозотоцин индуцированного сахарного диабета и экспериментально вызванной недостаточности половых гормонов.

Впервые выполнено сравнительное комплексное изучение влияния представителей различных фармакологических групп, среди сердечно-сосудистых средств, в сопоставимых условиях,: -адреноблокаторов (небиволол, бисопролол), ингибиторов АПФ (лизиноприл), антагонистов кальциевых каналов (нифедипин), статинов (симвастатин), гипариноида сулодексида, ряда производных ГАМК (фенибут, пикамилон, РГПУ-189, РГПУ-147), веществ, обладающих антиоксидантной активностью (мексидол, предуктал, дибикор), а также флавоноидов (гесперидин, диосмин, кверцетин и флавицин), на вазодилатирующую, антитромботическую функции, на углеводный, липидный обмен и гормональный статус при ЭСД и НПГ. Показано их неоднозначное эндотелиопротекторное действие.

Впервые выявлена высокая эндотелиопротективная активность и комплексно изучено влияние нового производного ГАМК – соединения РГПУ-189 и флавоноида - флавицина на вазодилатирующую, антитромботическую, противовоспалительную и пролиферативную функции эндотелия при ЭСД и НПГ.

По выраженности эндотелиопротекторного действия РГПУ-189 и флавицин превосходят небилет, конкор, мексидол, предуктал, дибикор, нифедипин, фенибут, пикамилон, производное ГАМК - РГПУ-147 и флавоноиды, приближаясь по выраженности действия к Сулодексиду.

Впервые установлено усиление активности е-NOS, снижение эндотелина-1, а так же снижение экспрессии основных генетических маркеров запускающих апоптоз (каспаза-3, «доменов смерти», NF-kB) у животных с ЭСД и НПГ, под влиянием соединения РГПУ-189и флавоноида флавицина, что очевидно лежит в основе их эндотелиопротекторного действия.

Научно-практическая ценность работы

Используемый комплексный морфо-функциональный подход может применяться для оценки степени ЭД (вазодилатирующей, антитромботической, противовоспалительной, антипролиферативной функций эндотелия), мощности функционирования NO системы, дает возможность оценить эндотелиотропные свойства исследуемых веществ.

Сравнительный анализ полученных данных о влиянии известных сердечно-сосудистых средств, позволит более дифференцированно их использовать при лечении больных с различной кардиологической патологией, а на основе флавоноидов и производных ГАМК – разработать лекарственные средства для лечения ЭД различного генеза.

Полученные данные об эндотелиопротективном действии производных ГАМК и флавоноидов свидетельствуют о перспективности дальнейшей разработки на основе соединения РГПУ-189 и флавицина эндотелиопротекторов для применения в качестве средств профилактики и лечения сосудистых осложнений различного генеза, обусловленных ЭД.

Реализация результатов.

На основании данных диссертационного исследования разработана дальнейшая программа целенаправленного поиска веществ с сердечно-сосудистыми и эндотелиотропными свойствами среди структурных аналогов ГАМК (кафедра органической химии Российского Государственного Педагогического Университета им. А.И.Герцена (г. Санкт-Петербург)), предложен план поиска веществ флавоновой природы для профилактики и лечения сосудистых осложнений, обусловленных СД и НПГ (Пятигорская фармацевтическая академия).

Разработанная комплексная морфофункциональная система поиска и доклинического фармакологического изучения веществ с эндотелиопртективной активностью используется в научно-исследовательской работе кафедры фармакологии и биофармации ФУВ Волгоградского государственного медицинского университета (ВолгГМУ), НИИ фармакологии ВолгГМУ, кафедрах фармакологии ВолгГМУ и Пятигорской государственной фармацевтической академии. Полученные в ходе исследования результаты оформлены в виде методического пособия «Новая медицинская технология: Использование высокочастотной ультразвуковой допплерографии для изучения влияния фармакологических веществ на региональное кровообращение и эндотелиальную функцию (подписано в печать 04.2010)

Полученные результаты о эндотелиопротекторных свойствах новых производных гамма-аминомасляной кислоты и флавоноидов, а так же сравнительная эндотелиопротекторная активность сердечно-сосудистых средств и веществ, обладающих антиоксидантной активностью, включены в раздел учебных программ курса фармакологии на кафедрах фармакологии и биофармации ФУВ, фармакологии, клинической фармакологии и интенсивной терапии Волгоградского государственного медицинского университета, кафедре биохимии и микробиологии, кафедре органической химии Пятигорской государственной фармацевтической академии, кафедрах фармакологии Воронежской медицинской академии, Ростовского государственного медицинского университета, Белгородского государственного университета. Материалы работы оформлены в виде информационных писем “Изучение эндотелиопротекторных свойств флавоноидов при экспериментальном сахарном диабете”, «Эндотелиопротективные свойства производных ГАМК при недостаточности половых гормонов» которые используются в учебном процессе и научной работе кафедры фармакологии ВолгГМУ (акты о внедрении от 09.2010; 12.2010), фармакологии и биофармации ФУВ ВолгГМУ (акты о внедрении от 09.2010; 12.2010), лаборатории фармакологии сердечно-сосудистых средств НИИ фармакологии ВолгГМУ (акты о внедрении от 09.2010; 12.2010). По материалам настоящей работы получен 1 патент Российской Федерации на изобретение.

Положения, выносимые на защиту:

  1. Стрептозотоцин-индуцированный сахарный диабет в большей степени, а экспериментально вызванная недостаточность половых гормонов, в меньшей степени, приводят к выраженным нарушениям всех функций эндотелия. Операционная травма так же приводит к эндотелиальным нарушениям, однако они носят кратковременный и обратимый характер. Полученные результаты позволяют рекомендовать данные патологические модели для моделирования эндотелиальной дисфункции в эксперименте.
  2. Используемый в работе комплексный морфо-функциональный подход к изучению вазодилатирующей, антитромботической, противовоспалительной, антипролиферативной функций эндотелия, позволяет оценить стабильность и мощность функционирования NO системы и выраженность ЭД, а также может использоваться для изучения эндотелиотропных эффектов исследуемых веществ и различных патологических воздействий на эндотелий.
  3. Сердечно-сосудистые средства, гепариноид – сулодексид, производные ГАМК, флавоноиды и вещества, обладающие антиоксидантными свойствами, в разной степени выраженности проявляют эндотелиопротективную активность, что проявляется в улучшении вазодилатирующей, антитромботической функций эндотелия. По степени улучшения вазодилатирующей функции эндотелия все исследуемые соединения можно расположить следующим образом: Вессел Дуэ Ф (сулодексид) > Диротон Симвагексал Небилет > РГПУ-189 > Флавицин РГПУ-147 > Кверцетин Мексидол > Конкор > Гесперидин > Диосмин > Предуктал > Пикамилон > Нифедипин Фенибут Дибикор, а по степени влияния на антитромботическую функцию эндотелия изучаемые соединения можно расставить в следующем порядке: Вессел Дуэ Ф (сулодексид) Симвагексал РГПУ-189 > Диротон > Небилет > РГПУ-147 Флавицин > Кверцетин Конкор > Нифедипин > Мексидол > Фенибут Гесперидин Дибикор > Диосмин Предуктал > Пикамилон.
  4. РГПУ-189 и флавицин выражено улучшают противовоспалительную, антипролиферативную функции эндотелия, уменьшают метаболические нарушения у животных с ЭСД и НПГ (снижают гипергликемию, гиперхолестеринемию, индекс атерогенности), в большей степени эти эффекты выражены у флавицина. Эндотелиопротективное действие отмеченных веществ очевидно обусловлено угнетением экспрессии маркеров апоптоза (TRАIL, каспаза-3, nF-kB), снижением эндотелина-1 и усилением активности е-NOS.
  5. Вессел Дуэ Ф по совокупности всех проведенных исследований оказал наиболее выраженное эндотелиопротекторное действие по сравнению со всеми исследуемыми веществами. Полученные результаты позволяют рекомендовать Вессел Дуэ Ф в качестве эталонного препарата сравнения при сопоставлении эндотелиотропных эффектов изучаемых лекарственных препаратов.
  6. Сравнительный анализ полученных данных о влиянии известных сердечно-сосудистых средств, флавоноидов, веществ, обладающих антиоксидантной активностью, и производных ГАМК на эндотелиальную дисфункцию в условиях гормональных нарушений различного генеза, свидетельствуют о целесообразности применения Весел Дуэ Ф, диротона, симваГЕКСАЛА, небилета, мексидола, для комплексной терапии сердечно-сосудистых заболеваний, профилактики и лечения сосудистых осложнений, связанных с СД и НПГ. Результаты исследований позволяют рекомендовать проведение дальнейшего изучения соединения РГПУ-189 и флавицина, для создания на их основе новых препаратов с эндотелиопротекторной активностью.
  7. Проведенное тестирование вазодилатирующей функции эндотелия различных сосудистых регионов (мозг, печень, почка и кожно мышечная область) позволяет говорить о том, что направленность эндотелиального ответа одинакова во всех областях, но выраженность разная. Результаты исследования дают возможность экстраполировать полученные в ходе эксперимента данные по изменению функции эндотелия в одной сосудистой области и на другие регионы с разным типом эндотелия.

Апробация работы

Материалы работы докладывались и обсуждались на 5-ой научно-практической конференции «Методы исследования регионального кровообращения и микроциркуляции в клинике» (Санкт-Петербург, 2005); на II международной научной конференции «Химия, технология и медицинские аспекты природных соединений» (Алматы, Казахстан, 2007); на 13 Всероссийском съезде сердечно-сосудистых хирургов (Москва, 2007); Научно-практической конференции «Диагностика и коррекция нарушений регионального кровообращения и микроциркуляции в клинической практики» (Саратов, 2008); на 14 Всероссийском съезде сердечно-сосудистых хирургов (Москва, 2008); на VIII съезде кардиологов южного федерального округа «Совершенствование оказания медицинской помощи больным с сердечно-сосудистыми заболеваниями. Новые подходы и перспективы» (Ростов-на-Дону, 2009); 56-ой региональной научно-практической конференции Волгоградского государственного медицинского университета «Инновационные достижения фундаментальных и прикладных медицинских исследований в развитии здравоохранении волгоградской области» (Волгоград 2009); Научно практической конференции «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической морфологии» (Волгоград, 2010); II Всероссийском научно-практическом семинаре “Методологические аспекты экспериментальной и клинической фармакологии” (Волгоград, 2010). По материалам диссертации опубликовано 60 печатных работ, в том числе 21 работ в журналах, рекомендуемых ВАК, получен 1 патент на изобретение №2374699 от 27 ноября 2009 года.

Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, 6 глав собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и списка используемой литературы, включающего 493 источника, из них 189 отечественных и 304 зарубежных авторов. Диссертация изложена на 296 страницах машинописного текста, содержит таблиц –27, рисунков –55, схем – 1.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследование выполнено на 1090 крысах самках и самцах, которые содержались в условиях вивария с естественным световым режимом, на стандартной диете лабораторных животных (ГОСТР 50258-92), с соблюдением Международных рекомендаций Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых при экспериментальных исследованиях, а также правил лабораторной практики при проведении доклинических исследований в РФ (ГОСТ З 51000.3-96 и 51000.4-96) и Приказу МЗ РФ №267 от 19.06.2003г. «Об утверждении правил лабораторной практики» (GLP). Животные были получены из питомников «Столбовая», «Рапполово». Эксперименты были одобрены комитетом по этической экспертизе доклинических исследований ВолгГМУ (протокол № 54-2007 от 28.04.2007).

Исследование было проведено с помощью комплексного морфо-функционального подхода, используемого для оценки эндотелиальной дисфункции (ЭД) и эндотелиотропного действия (ЭПД) веществ. Комплексный морфо-функциональный подход включал в себя определение вазодилатирующей, антитромботической, противовоспалительной и антипролиферативной функций эндотелия. При изучении эндотелиопротекторного действия на животных с ЭСД дополнительно оценивались нарушения в углеводном и липидном обмене, с целью оценки влияния соединений на развитие ЭД. Кроме этого, у всех групп животных с экспериментально-вызванной недостаточностью половых гормонов определялся уровень половых гормонов в плазме крови.

ЭД на всех этапах исследования моделировалась двумя патологиями стрептозотоцин-индуцированным СД и недостаточностью половых гормонов (НПГ).

Экспериментальный сахарный диабет (ЭСД) вызывали введением стрептозотоцина в дозе 45 мг/кг внутривенно в хвостовую вену. Через 72 часа производили количественное определение глюкозы в крови ферментативным (глюкозооксидазным методом) с измерением величины оптической плотности надосадочной жидкости в кюветах с длиной оптического пути 10 мм при длине волны 500 на спектрофотометре (ПЭ-5400В, ЭКРОС) с использованием наборов «Глюкоза ФКД» (Россия). За 18 часов до введения цитотоксина крысам ограничивали доступ к пище при свободном доступе к воде. В дальнейшее исследование отбирали животных с уровнем сахара крови 12-15 ммоль/л и выше, то есть крыс с развившимся СД (Баранов В.Г., 1983).

Недостаточность половых гормонов (НПГ) как модель нарушения функции эндотелия воспроизводилась путем экстирпации матки с придатками у крыс самок. Исследование проводилось на крысах-самках, рандомизированных по массе (180-210 гр.) и возрасту (половозрелые – 3 месяца) (патент на изобретение №2374699). С целью оценки изменения уровня гормонов в исследуемых группах при моделировании недостаточности половых гормонов был использован иммуноферментный анализ (ИФА) с помощью автоматического ридера Elx800 и с использованием наборов: Прогестерон ELISA EIA-1561, Пролактин ELISA EIA-1291, Фолликулостимулирующий гормон ELISA EIA-1288, Эстрадиол ELISA EIA-2693 (DRG Instruments GmbH, Германия).

Контроль эффективности кастрации производился с использованием цитологического метода определения стадии полового цикла у самок. Для анализа разного уровня эндогенных эстрогенов после операции были выбраны три наиболее характерные фазы полового цикла: диэструс, проэструс и эструс. Определение фаз полового цикла (диэструс, проэструс, эструс) у интактных крыс проводили с помощью характерных морфологических признаков по влагалищным мазкам согласно описанию Я. Д. Киршенблата.

       Все проведенные нами исследования проходили тремя блокаи в несколько этапов.

       В первом блоке, на первом этапе работы, проводили сравнительное изучение вазодилатирующей функции эндотелия сосудов головного мозга, печени, почек и кожно- мышечной области, на фоне модификации синтеза эндогенного оксида азота у интактных животных. На втором этапе работы оценивалась выраженность и продолжительность эндотелиальной дисфункции у животных с экспериментально вызванными - сахарным диабетом, недостаточностью половых гормонов и операционной травмой (операционным стрессом), как патологии сопутствующей хирургической кастрации (для исключения ее влияния на развитие эндотелиальных нарушений). В ходе проведения второго этапа исследований использовались методические приемы, позволяющие оценить вазодилатирующую и антитромботическую функции эндотелия (таблица 1).

Дальнейшие эксперименты проводились еще двумя отдельными блоками. Так, во втором и третьем блоке исследований изучалось эндотелиопротективное действие сердечно-сосудистых средств: ингибиторов АПФ, антагонистов кальциевых каналов, статинов, сулодексида, флавоноидов, производных ГАМК у животных с ЭСД и НПГ (3 этап) (таблица 1).

Эндотелиопротекторные свойства изучались среди:

- сердечно-сосудистых средств: ингибитор АПФ – лизиноприл (диротон, «Гедеон Рихтер А.О., Будапешт – Венгрия») - 5мг/кг; b - блокаторы – небивалол (небилет, «Berlin-Chemie», Берлин, Германия)– 2,5мг/кг, и бисопролол (конкор «Nykomed», МеркКГаА, Германия для Никомед) – 5мг/кг; антагонист кальциевых каналов – нифедипин (BalkanpharmaR) – 10мг/кг; гипохолестеринимический препарат –симвастатин ( симваГЕКСАЛ,

Таблица 1 - Дизайн проведения экспериментов

1 блок

1 этап  гетерогенность эндотелия  #

Вазодилатирующая функция эндотелия

доплеровская флоуметрия при модификации синтеза NO (оценка ЭЗВД при введении ацетилхолина, N-L-аргинина)

2 этап изучение эндотелиальной дисфункции  при ЭСД, НПГ* и ХТ.**

Вазодилатирующая функция эндотелия

-доплеровская флоуметрия при модификации синтеза NO (оценка ЭЗВД при введении ацетилхолина, L-аргинина, N-L-аргинина; ЭНЗВД при введении нитроглицерина; мощности и стабильности NO-синтазной системы при многократном введении АЦХ)

Антитромботическая функция эндотелия

-скорость образования тромба (артериальный тромбоз)

- измерение вязкости крови

-оценка агрегации тромбоцитов

- тромбиновое время

- протромбиновое время

-активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ)

-содержание фибриногена

-определение фактора Виллебрандта

2-ой и 3-й блок*

3 этап Изучение эндотелиопротективного действия исследуемых веществ при ЭСД и НПГ

Вазодилатирующая функция эндотелия

-доплеровская флоуметрия при модификации синтеза NO (оценка ЭЗВД при введении ацетилхолина, L-аргинина, N-L-аргинина; ЭНЗВД при введении нитроглицерина; мощности и стабильности NO-синтазной системы при многократном введении АЦХ)

Антитромботическая функция эндотелия

-скорость образования тромба (артериальный тромбоз)

- измерение вязкости крови

-оценка агрегации тромбоцитов

- тромбиновое время

- протромбиновое время

-активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ)

-содержание фибриногена

-определение фактора Виллебрандта

Оценка метаболических эффектов

-уровень глюкозы в крови

-липидный спектр (ХСобщ, ХСЛПВП, ХСЛПНП  ТГ, индекс атерогенности)

Оценка гормонального статуса у животных с НПГ

-уровень эстрогенов

Противоспалительная функция эндотелия

-уровень СРБ

Антипролиферативная функция эндотелия

-морфометрическая оценка мозговых сосудов с наличием признаков пролиферации, а так же воспаления, тромбообразования

Структурные изменения эндотелиоцитов

- ультраструктурная оценка эндотелиальных повреждений

Определение уровня е-NOS и эндотелина-1, TRAIL, NF-kB, каспаза-3

- иммуногистохимическая оценка по степени экспрессии и уровню оптической плотности антител

Примечание: #-исследование проведено на интактных животных; *- исследование проведено через 4 недели после ЭСД и НПГ; **-исследование проведено в течении 4-х дней после оперативного вмешательства

HEXAL, Германия) – 10 мг/кг. Дозы препаратов выбраны на основе литературного анализа многочисленных экспериментальных исследований, в которых эти вещества проявили высокую эндотелиопротекторную, антигипертензивную, противоишемическую и гипохолестеринемическую активность.

- производных ГАМК: РГПУ-147 (50мг/кг), РГПУ-189 (15мг/кг), фенибут - (25мг/кг), пикамилон (ОАО «Фармстандарт-УфаВИТА») - 100мг/кг. Использовались наиболее эффективные дозы данных веществ, выявленные при изучении нейропротекторной, антистрессорной, антиишемической и кардиотропной активности данных соединений. Вещества синтезированы на кафедре органической химии Российского государственного педагогического университета им. А.Н. Герцена (Санкт-Петербург, Россия)1.

- веществ, обладающих антиоксидантными свойствами: мексидол (“НПК Фармасофт”, Россия) в дозе 100 мг/кг; предуктал МВ (триметазидин, “Servier”, Франция) в дозе 6 мг/кг; дибикор (таурин “ПИК-ФАРМА ПРО”) в дозе 168 мг/кг.

- индивидуальных флавоноидов: кверцетин (фирмы Merck), а также флавицин, диосмин, полученные из надземной части растения рода Vicia, сем. Fabaceae) и гесперидин, полученный из кожуры цитрусовых, выделенные на кафедре органической химии Пятигорской фармацевтической академии под руководством доктора фармацевтических наук, профессора Э.Т. Оганесяна, за что выражаем ему искреннюю благодарность. Все флавоноиды вводились в дозе - 100мг/кг, способ введения - per os.

Так же был исследован Сулодексид (Весел Дуэ Ф)– 30 ЕВЛ (единицы высвобождения липопротеинлипазы) (Аlfa Wassermann, Италия) (Комелягина Е.Ю., 2005). Способ введения всех перечисленных веществ - per os, в течении месяца, в первую половину дня. В качестве растворителя использовали 0,9% раствор хлорида натрия. Контрольным группам животных: интактным, ложнооперированным (ЛО), а также животным с НПГ и ЭСД вводился физиологический раствор в эквивалентном объеме.

Оценка вазодилатирующей функции эндотелия осуществлялась путем регистрации изменений скорости кровотока (СК) при модификации синтеза эндогенного оксида азота введением ацетилхолина (АЦХ) (0,01 мг/кг), L-аргинина (300 мг/кг), нитро-L-аргинина («Acros organics», США) (10 мг/кг). Для оценки эндотелионезависимой вазодилатации (ЭНЗВД) в/в вводили нитроглицерин (НТГ) (МТХ, Москва) (0,007 мг/кг). Для оценки мощности и стабильности NO-синтазной системы был использован метод многократного (10-кратного) введения АЦХ в фиксированной дозе (0,01 мг/кг). СК регистрировали в теменной области мозга крыс, в проекции среднемозговой артерии с помощью ультразвукового допплерографа, датчика УЗОП-010-01 (рабочая частота 25МГц, диаметром 0,3 см) и компьютерной программы ММ-Д-КMinimax Doppler v.1.9. (Санкт-Петербург, Россия), которая дополнительно позволяла анализировать периферическое сопротивление (индекс Пурселло) и эластичность мозговых сосудов (индекс Гослинга).

Оценка антитромботической функции исследуемых соединений осуществлялась с помощью комплексного подхода для оценки как сосудисто-тромбоцитарного, так и плазменного (коагуляционного) гемостаза. Артериальный тромбоз вызывался по методике Angelillo-Scherrer A., 2004. Показатели вязкости крови изучались на анализаторе крови реологическом АКР-2 (Россия), показатели агрегации тромбоцитов на двухканальном лазерном анализаторе агрегации тромбоцитов фирмы "Биола" (г. Москва) по методу Born G. (1962) в модификации Габбасова З.А. (1989). Тромбиновое время (ТВ), протромбиновое время (ПВ), активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ) и содержание фибриногена определяли хронометрически на анализаторе показателей гемостаза АПГ2-01 “МИНИЛАБ 701” с использованием наборов НПО «Ренам» (Россия). Определение фактора Виллебранда проводилось на двухканальном лазерном анализаторе агрегации тромбоцитов "Биола" (наборы “Ренам” для определения фактора Вллебранда).

Оценка липидного профиля (ХСобщ, ХСЛПВП, ХСЛПНП, ТГ) осуществлялась с использованием ферментативных колориметрических тестов “Ольвекс Диагностикум”), значение концентрации ХСЛПНП вычисляли по формуле Фридвальда (1972), индекс атерогенности (ИАТ) по А.Н. Климову (1999). Уровень глюкозы в плазме крови крыс определялся глюкозооксидантым способом с использованием набора «Глюкоза-ФКД» (Россия). 

Противовоспалительная функция эндотелия оценивалась по уровню С-реактивного белка (СРБ) с помощью набора реагентов для качественного и полуколичественного определения СРБ в сыворотке крови методом латекс-агглютинации (”Ольвекс Диагностикум”).

Антипролиферативная функция эндотелия оценивалась с помощью комплексного морфологического подхода, основанного на морфометрической оценке параметров эндотелиальных клеток (размеры ядер (ус.ед.) и  ядерно-цитоплазматическое отношение (ЯЦО)), степени сосудистых и эндотелиальных нарушений на базе компьютерной системы «ВидеоТестМорфо-4» (Россия), по соотношению интимы/медии эндотелиальной выстилки, признаков пролиферации сосудистой стенки и воспалительной инфильтрации в микроциркуляторном русле, а также явлений периваскулярного и перицеллюлярного отёка.

Для определения степени повреждения эндотелия проводилась гистологическая оценка десквамации (циркулирующие эндотелиоциты). Определение количества десквамированных эндотелиоцитов осуществлялось с помощью метода, основанного на изоляции клеток эндотелия вместе с тромбоцитами с последующим осаждением тромбоцитов с помощью АДФ (Петрищев Н.Н., 2001; Hladovec J., 1978).

Для электронномикроскопического исследования эндотелия забор фрагментов головного мозга производили с областей, где по данным световой микроскопии наблюдались наибольшие патологические изменения в микроциркуляторном русле, наиболее сильно затрагивающие эндотелиальную выстилку. Фрагмент объемом около 1 мм3 фиксировали в 1 % растворе глютарового альдегида 4 часа, и в течение 2 часов в 1 % растворе четырехокиси осмия на веррналацетатном буфере при температуре + 4° С. Затем материал подвергали дегидратации в серии спиртов возрастающей концентрации, проводили в окиси пропилена и заливали в эпоксидную смолу ERL-4206 (A.Spurr, 1968).

Определение уровня еNOS и эндотелина-1, маркеров апоптоза: каспазы-3, рецепторов TRАIL, NF-kB. Для гистологического исследования под эфирным наркозом производили забор головного мозга крыс. Материал фиксировали в течение 48 часов в 10% растворе нейтрального забуференного формалина (рН 7,4). После фиксации материал проводили по общепринятой гистологической методике через батарею спиртов возрастающей концентрации, хлороформ и заливали в парафин.

На роторном микротоме изготавливали серийные срезы толщиной 5-6 мкм. В дальнейшем производили окрашивание гематоксилином и эозином по общепринятой гистологической методике (депарафинизация в ксилоле, проводка по спиртам убывающей концентрации до воды, окраска гематоксилином Бёмера, дифференцировка солянокислым спиртом, окраска эозином, проводка по спиртам возрастающей концентрации до абсолютного этанола, просветление в ксилоле, заключение в канадский бальзам).

Для выявления степени функционирования эндотелия мозга в условиях стрептозотоцинового сахарного диабета, экспериментально вызванной недостаточности половых гормонов и эндотелиопротективного действия изучаемых веществ при данных патологиях оценивали оптическую плотность и использовали моноклональные антитела к эндотелину-1 (Endothelin-1 Receptor (ETA), Clone RJT 24, NCL-L-ETA P (HIER)) и моноклональные антитела к эндотелиальной NOS (Nitric Oxid Synthase, Clone RN5, NCL-NOS-3 F P (HIER)), к каспазе 3 (клон JHM62, Novocastra), к рецептору TRAIL - апоптоз-индуцирующий лиганд (клон 27B12, Novocastra), к транскрипционному фактору NF-kB (NF-kappa B p65, BioGenex). Визуализацию проводили с помощью непрямого иммунопероксидазного метода с высокотемпературной и ферментной демаскировкой антигенов. Индекс апопотоза рассчитывали как отношение эндотелиальных клеток с имуногистохимическими признаками апопотоза к нормальным эндотелиоцитам (%). Для достоверности полученных результатов применяли позитивные контроли антигенов (лимфатические узлы, печень при недифференцированном лейкозе), негативные контроли антигенов (предстательная железа, головной мозг) и негативные контроли антител (обработка срезов без нанесения первичных антител).

Для анализа морфологических показателей производили микрофотосъемку цифровой камерой Canon (Japan, 5.0 мегапикселей) на базе микроскопа Axiostar plus (Карл Цейс, Германия) с использованием объектива х40, х100 и окуляра х10. Оценивали процентное отношение иммунопозитивных клеток к общему количеству эндотелиальных клеток мозга.

Статистическая обработка результатов исследования: нормальность распределения выполнялась с использованием W критерия Шапиро-Уилка; анализ статистической значимости различий проводился с применением t-критерия Стьюдента; однофакторного дисперсионного анализа, критерия Стьюдента с поправкой Бонферрони; однофакторного дисперсионного анализа Крускала-Уоллиса, критерия Дана для множественных сравнений; дисперсионного анализа повторных измерений, критерия Тьюки; критерия Фридмана для анализа повторных измерений, критерия Ньюмена—Кейлса

Обработка данных производилась с помощью пакетов программ Microsoft Office Excel, BioStat 2008 5.2.5.0.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Оценка вазодилатирующей функции эндотелия различных сосудистых регионов.

Проведённый этап исследований позволяет дать суммарную оценку функционирования эндотелия различных сосудистых регионов, как в норме, так и при патологии различного генеза.

Существенно то, что один и тот же датчик, размещенный над тканью органа, регистрирует кровоток в определенной, сопоставимой по массе ткани, а не во всем органе, поэтому возможно корректное сравнение скоростей кровотока или изменений (прироста/падения) кровотока в разных сосудистых регионах.

А.

Б.

Примечание: АЦХ - прирост кровотока в ответ на введение ацетилхолина; н-Л-арг- падение кровотока в ответ на введение нитро-Л-аргинина.

Рисунок 1. Изменение мозгового, почечного, печеночного кровотока и кровотока в кожно-мышечной области при активации (А) (ацетилхолином) и подавлении (Б) (нLа) синтеза оксида азота.

При введении АЦХ интактным животным скорость мозгового кровотока повышалась на 25%, в почечной ткани на 20%, в сосудах печеночной области (36%), в кожно-мышечной области кровоток увеличился на 19 % от исходного уровня. Введение нитро-L-аргинина приводило к снижению скорости кровотока в проекции среднемозговой артерии на 24,6%, в почке на 18,2%, в печени на 32,2%, в кожно - мышечной области на 16,5% (рисунок 1 А,Б).

Таким образом, введение АЦХ вызывало достоверное по отношению к исходным данным повышение, а нитро-L-аргинина - снижение скорости кровотока во всех изучаемых сосудистых регионах, однако наиболее сильный прирост и падение наблюдались в печеночной ткани, органе с наименьшей исходной скоростью кровотока. Такая сосудистая реакция, возможно, связана с анатомическим строением микроциркуляторного русла печени и нахождением там клеток Купфера, принимающих дополнительное участие в синтезе NO и активирующихся в результате воздействия различных стимулов (Маянский Д.Н., Висе Э., Декер К., 1993). Следует отметить, что регистрация кровотока в печени требует вскрытия брюшной полости и осложняется помехами связанными с близким расположением аорты, задней полой вены и диафрагмы легких. Исходя из этого, нами были выбраны в качестве объекта изучения эндотелиальных функций сосуды мозга т.к. в течение опыта, легче обеспечить регистрацию мозгового кровотока, а полученные в ходе работы результаты свидетельствуют о том, что направленность изменений сосудистого тонуса гетерогенных эндотелиальных областей одинакова.

Оценка влияния ЭСД, НПГ и операционной травмы на эндотелиальную дисфункцию.

У животных с ЭСД и НПГ наблюдается снижение стабильности и мощности эндотелиальной NO-синтазной системы, ослабление эндотелиозависимой вазодилатации на фоне ЭСД и НПГ в 1,7 раза и 2,3 раза, соответственно (Рисунок 2).

Так же у животных с ЭСД и НПГ наблюдаются нарушения как со стороны коагуляционного (плазменного) гемостаза, так и со стороны сосудисто-тромбоцитарного (Рисунок 3,4).

А)

Б)

Примечание: АЦХ – введение ацетилхолина; НТГ-введение нитроглицерина; nLarg-введение нитроLаргинина; НПГ-оперированные животные с удаленными маткой и придатками, ЛО – ложнооперированные крысы; ЭСД – животные с стрептозотацированным сахарным диабетом, Интак – интактные крысы, * - (P0,05); ** - (P0,01); достоверно по отношению к группам интактных и ЛО животных (Достоверность оценивалась с помощью критерия Манна-Уитни)

Рисунок 2. Изменения церебрального кровотока животных с НПГ (А) и с ЭСД (Б) при модификации выделения и синтеза эндогенного оксида азота.

Примечание: НПГ-оперированные животные с удаленными маткой и придатками, ЛО – ложнооперированные крысы; ЭСД – животные с стрептозотацированным сахарным диабетом, Интак – интактные крысы, * - (P0,05); ** - (P0,01); достоверно по отношению к группам интактных и ЛО животных (ранговый однофакторный анализ Крускала-Уоллиса, критерий Данна для множественных сравнений, непараметрический U- критерий Манна-Уитни).

Рисунок 3. Изменения индексов агрегации / дезагрегации тромбоцитов и максимального наклона у животных с недостаточностью половых гормонов и с сахарным диабетом.

Антикоагулянтный и антитромбогенный потенциал сосудистого эндотелия смещается в сторону повышения показателей агрегации тромбоцитов (повышение индекса агрегации тромбоцитов в 1,75 раза при НПГ и 2,25 раза при ЭСД, скорости агрегации в 1,6 раза при НПГ и 1,79 раза при ЭСД, снижение индекса дезагрегации тромбоцитов в 2,86 раза при НПГ и 3,14 раза при ЭСД). Увеличения скорости образования тромба на модели артериального тромбоза в 1,7 раза при НПГ и 2,6 раза при ЭСД (Рисунок 3,4). Под влиянием изучаемых патологий происходит достоверное (Р<0,05) укорочение тромбинового и протромбинового, а также активированного частичного тромбопластинового времени, повышение уровня фибриногена и фактора Виллебранда в крови (Рисунок 9), увеличение вязкости крови на всех скоростях сдвига (Таблица7,8,9).

Примечание: ЭСД – животные с стрептозотацированным сахарным диабетом, Интак – интактные крысы, НПГ-оперированные животные с удаленными маткой и придатками * - (P0,05); ** - (P0,01); достоверно по отношению к группам интактных животных (ранговый однофакторный анализ Крускала-Уоллиса, критерий Данна для множественных сравнений, непараметрический U- критерий Манна-Уитни)

Рисунок 4. Скорость образования тромба в сонных артериях у животных с НПГ и ЭСД, при аппликации хлорида железа на адвентицию сосуда.

При оценке вазодилатирующей функции эндотелия при хирургической травме, у интактных животных, отмечено, что в ответ на введение анализаторов СК у животных в первые и четвертые сутки после операции не достоверно отличались друг от друга. Введение же модификаторов синтеза эндогенного оксида азота животным на второй и третий день после операции вызывало повышение скорости кровотока значительно ниже по сравнению со скоростью кровотока животных, тестируемых в первый и четвертый день. Введение L-аргинина животным на вторые и третьи сутки после операции приводило к достоверно значимому усилению кровотока в брюшине в отличии от животных прооперированных в первые сутки. Полученные данные свидетельствуют о физиологически обратимом процессе нарушения эндотелиальной функции при хирургическом вмешательстве (Рисунок 5).

Примечание: 1,2,3,4 - сутки-после проведенного оперативного вмешательства; АЦХ – введение ацетилхолина; Ларг-введение Lаргинина; НТГ-введение нитроглицерина; нЛарг-введение нитроLаргинина;

Рисунок 5. Изменения кровотока брюшины у животных в различные сроки после оперативного вмешательства при модификации синтеза эндогенного оксида азота.

Стоит отметить, что ЭСД (Таблица 2) и НПГ сопровождаются существенным повышением уровня ТГ, ХСЛПНП, ХСобщ и снижением ХСЛПВП, что приводит к увеличению индекса атерогенности (Таблица 2).

Таблица 2. - Влияние ЭСД на показатели липидного спектра крови у животных (ммоль/л)

Группы животных

ХСобщ

ХС ЛПВП

ХС ЛПНП

ТГ

ИАТ

Интакт

2,58±0,07

0,85±0,05

1,42±0,09

0,68±0,03

2,09±0,17

ЭСД

3,8±0,15**

0,61±0,03**

2,83±0,15**

0,8±0,03*

5,5±0,46**

Примечание - * - (P0,05); ** - (P0,01); достоверно по отношению к группам интактных животных (ранговый однофакторный анализ Крускала-Уоллиса, критерий Данна для множественных сравнений, непараметрический U- критерий Манна-Уитни).

Существенно то, что активация атерогенных процессов, на фоне ЭСД и НПГ может лежать в основе нарушения эндотелиальной функции и увеличения вязкости крови (Таблица 3) и, соответственно, скорости напряжения сдвига, так как деформабельность эритроцитов прямо коррелирует с гиперглицерхолестеринемией и повышением содержания липопротеидов низкой плотности (Ефимов А.С., 1989; Балашова Т.С., 1996; Patel R. P., Hogg N., Kim-Shapiro D. B., 2011).

Нарушение функции эндотелия при ЭСД и НПГ, кроме всех выше перечисленных патофизиологических сдвигов, сопровождается выраженными патологическими изменениями его морфологического состояния (Загидуллин Ш.З., и д.р., 2010; Ohtani K., Dimmeler S., 2011). При световой и электронной микроскопии, у животных с ЭСД и НПГ, выявлено усиление тромбообразования и лейкоцитарной инфильтрации, увеличение соотношения интима/медиа и количества циркулирующих эндотелиоцитов. Кроме этого, при НПГ в 1,5 раза и при ЭСД в 2,2 раза наблюдалось увеличение С-реактивного белка и, соответственно, усилении провоспалительного статуса эндотелия.

Таблица 3. Влияние ЭСД и НПГ на вязкость крови крыс

Группы

животных

Скорость сдвига, сПз

300с-1

100с-1

50с-1

10с-1

Интакт

3,64±0,35

4,58±0,31

6,78±0,41

8,41±0,34

ЭСД

4,95±0,18**

6,72±0,34**

9,8±0,67***

15,12±0,7***

ЛО

3,55±0,14

4,7±0,32

5,91±0,36

7,69±0,45

НПГ

4,15±0,19*

6,5±0,23**

7,12±0,34**

12,01±0,78**

Примечание НПГ-оперированные животные с удаленными маткой и придатками, ЛО – ложнооперированные крысы; ЭСД – животные с стрептозотацированным сахарным диабетом, Интак – интактные крысы, * - (P0,05); ** - (P0,01); *** - (P0,001); достоверно по отношению к группам интактных и ЛО животных (ранговый однофакторный анализ Крускала-Уоллиса, критерий Данна для множественных сравнений, непараметрический U- критерий Манна-Уитни).

Проведенный комплексный морфо-функциональный анализ развития и выраженности эндотелиальной дисфункции при ЭСД и НПГ позволяет говорить о высокой валидности предложенных нами моделей формирования нарушений функции эндотелия и адекватности подходов к выявлению эндотелиопротекторной активности фармакологических веществ.

Оценка влияния сердечно-сосудистых средств, производных ГАМК, веществ, обладающих антиоксидантной активностью и флавоноидов на вазодилатирующую функцию эндотелия у животных с ЭСД и НПГ.

У животных с ЭСД и НПГ, диротон, симвагексал, небилет достоверно улучшали вазодилатирующую функцию эндотелия, повышали стабильность системы синтеза NO. Конкор и нифедипин также положительно влияли на вазодилатирующую функцию эндотелия, хотя и в меньшей степени (Таблица 4).

Полученные результаты о положительном влиянии сердечно-сосудистых средств на вазодилатирующую функцию эндотелия подтверждают ранее выполненные исследования (Стрюк Р.И., Воронков Л.Г., 2002, 2003, Jorge PA., 2010; Kalipada Pahan, Weis M, Yamasaki, 2010) и впервые позволяют провести сравнительное ранжирование по данному виду активности как внутри группы сердечно-сосудистых средств, так и между другими классами фармакологических веществ, изучаемых в данном исследовании.

Таблица 4. Изменения кровотока у животных с ЭСД при модификации синтеза NO на фоне введения сердечно-сосудистых средств

Группы животных

Изменения кровотока при введении анализаторов от исходного уровня, в %

Прирост кровотока

Падение кровотока

Ацетилхолин

L-аргинин

Нитро-глицерин

N-L-аргинин

Интакт

44,05±2,35

11,24±1,34

50,25±3,25

37,84±2,23

ЭСД

12,08±1,41*

53,19±4,34**

48,52±2,2

17,34±1,9*

ЭСД +Вессел Дуэ Ф

28,54±2,54

13,15±1,49

47,7±3,27

32,03±2,18

ЭСД +Диротон

24,13±3,19

17,32±1,85

49,52±2,46

31,5±2,29

ЭСД+Симвагексал

23,45±1,51        

21,86±2,35

46,58±4,09

30,6±2,52

ЭСД +Небилет

22,97±3,11

23,91±2,21

49,62±3,77

29,13±2,5

ЭСД+Конкор

17,71±2,43

36,54±3,93

50,19±3,51

24,88±1,91

ЭСД +Нифедипин

14,15±2,03

40,81±2,5

56,05±4,16

19,89±1,52

ЛО

32,85±4,79

9,74±1,21

47,7±1,37

45,79±6,75

НПГ

13,81±2,16**

58,41±6,47**

51,67±1,87

15,03±2,91**

НПГ+Вессел Дуэф

36,85 ±3,78

15,23±1,84

52,61±1,75

27,5±3,09

НПГ +Диротон

30,28±2,37

17,29±2,4

51,55±2,07

25,7±2,62

НПГ +Симвагексал

27,35±2,00

21,47±1,75

48,07±1,68

25,53±3,36

НПГ +Небилет

26,37±2,09

20,26±2,1

47,91±2,35

25,0±2,57

НПГ +Конкор

19,45±1,73

33,37±2,65

51,05±1,64

21,02±2,92

НПГ+Нифедипин

16,46±1,29

44,53±2,08

55,58±1,33

17,01±2,05

Примечание НПГ-оперированные животные с удаленными маткой и придатками, ЛО – ложнооперированные крысы; ЭСД – группа животных с экспериментальным сахарным диабетом без лечения; интакт - интактная группа животных; * - (P0,05); **-(P0,01) достоверно по отношению к группе интактных и ЛО животных; - (P0,05); (P0,01)- достоверно по отношению к группе  животных с ЭСД и НПГ (ранговый однофакторный анализ Крускала-Уоллиса, критерий Данна для множественных сравнений, непараметрический U- критерий Манна-Уитни)

Исследуемые производные ГАМК - соединения РГПУ-189 и РГПУ-147, достоверно улучшают ЭЗВД, фенибут и пикамилон в меньшей степени улучшают вазодилатирующую функцию эндотелия (Таблица 5) у животных с НПГ и ЭСД.

Таблица 5. Изменения кровотока при модификации синтеза NO у животных с ЭСД, получавших производные ГАМК

Группы

животных

Изменения кровотока при введении анализаторов от исходного уровня, в %

Ацетилхолин

L-аргинин

Нитроглицерин

N-L-аргинин

Интакт

44,05±2,35

11,24±1,34

50,25±3,25

-37,84±2,23

ЭСД

10,23±0,51*

50,2±4,52**

50,91±2,15

-14,05±1,34*

ЭСД +РГПУ-189

17,61±0,73

25,53±2,28

53,22±4,25

-22,86±2,19

ЭСД +РГПУ-147

16,23±0,75

27,38±2,09

47,48±2,74

-20,59±1,79

ЭСД +Пикамилон

11,83±0,89

40,17±3,48

52,37±5,62

-16,6±1,98

ЭСД +Фенибут

11,77±0,94

41,46±3,21

49,45±3,43

-15,45±1,84

ЛО

36,24±1,94

8,81±0,94

46,73±3,01

-43,88±4,92

НПГ

12,41±2,1*

63,54±6,26**

43,02±3,46

-13,55±2,93*

НПГ +РГПУ-189

22,28±3,04

27,45±2,58

46,38±2,59

-20,69±2,76

НПГ +РГПУ-147

20,73±2,11

29,7±2,71

43,71±2,71

-19,47±2,52

НПГ +Пикамилон

14,82±1,71

50,42±5,18

49,34±2,5

-15,89±1,86

НПГ +Фенибут

14,21±2,07

50,07±5,37

57,33±4,43

-14,76±1,33

Примечание – обозначения как в таблице 4.

Таблица 6. - Изменения прироста кровотока у животных с ЭСД на фоне введения веществ с анитоксидантной активностью

Группы животных

Изменения кровотока при введении анализаторов от исходного уровня, в %

Ацетилхолин

L-аргинин

Нитроглицерин

N-L-аргинин

Интакт

39,41±2,24

7,48±1,09

43,95±2,77

-35,66±2,11

ЭСД

11,04±1,58*

45,56±5,87**

48,61±3,27

-15,07±2,17**

ЭСД +Флавицин

18,48±1,93

21,89±2,84

47,55±3,64

-23,4±2,3

ЭСД +Диосмин

14,14±1,61

32,92±4,03

49,94±4,00

-18,74±1,76

ЭСД+Кверцетин

17,2±2,37

25,25±3,36

50,47±3,03

-21,52±2,05

ЭСД+Гесперидин

15,03±1,95

34,34±3,06

52,48±1,68

-20,25±1,74

ЭСД +Мексидол

15,74±1,48

29,71±3,51

54,85±2,57

-21,51±1,92

ЭСД+Предуктал

13,65±1,3

36,21±3,62

49,92±3,38

-18,63±1,38

ЭСД +Дибикор

12,36±1,3

38,75±3,54

50,17±3,37

-16,35±1,69

ЛО

41,79±5,38

8,69±1,41

48,51±0,98

-38,09±4,51

НПГ

14,57±2,03*

50,22±6,94**

50,76±1,93

-13,65±2,27*

НПГ +Флавицин

25,02±2,46

20,88±2,48

48,94±1,3

-20,0±2,09

НПГ +Диосмин

19,0±1,16

32,31±3,69

47,54±2,33

-16,3±1,71

НПГ +Кверцетин

23,92±1,43

24,23±1,37

50,99±2,21

-19,5±0,82

НПГ +Гесперидин

19,51±1,13

35,87±2,33

45,69±3,3

-18,67±1,42

НПГ +Мексидол

20,59±1,4

30,69±3,21

53,11±1,58

-19,14±1,73

НПГ +Предуктал

18,07±1,8

38,45±4,07

48,3±1,3

-16,84±1,45

НПГ +Дибикор

16,5±1,65

38,76±4,59

47,54±2,33

-14,72±1,5

Примечание – обозначения как в таблице 4.

Среди исследуемых флавоноидов (кверцетин, флавицин, диосмин, гесперидин) и соединений с антиоксидантным действием (мексидол, предуктал и дибикор) наиболее выраженное действие на ЭЗВД оказали флавицин, кверцетин и мексидол. Другие вещества менее выражено улучшали ЭЗВД у животных с ЭСД и НПГ (Таблица 6).

Сравнивая параметры прироста и падения скорости кровотока в ответ на активацию и блокаду синтеза NO у контрольных животных с ЭСД и НПГ без фармакологической поддержки и у животных, получавших изучаемые соединения, можно расположить вещества из разных фармакологических групп в порядке убывания по степени улучшения ЭЗВД в следующем порядке: Вессел Дуэ Ф > Диротон Симвагексал Небилет > РГПУ-189 > Флавицин РГПУ-147 > Кверцетин Мексидол > Конкор > Гесперидин > Диосмин > Предуктал > Пикамилон > Нифедипин Фенибут Дибикор.

Оценка влияния сердечно-сосудистых средств, производных ГАМК, веществ, обладающих антиокидантной активностью и флавоноидов на антитромботическую функцию эндотелия у животных с ЭСД и НПГ.

Так как ЭПД одних и тех же соединений при разных экспериментальных патологиях была сопоставима, а более выраженная ЭД наблюдалась при ЭСД, то в дальнейшем в автореферате нами представлены рисунки и таблицы по изучению ЭПД веществ только в условиях данной патологии.

Сосудистый эндотелий обладает высокой тромборезистентностью и играет важную роль в сохранении жидкого состояния крови и предупреждении тромбозов, обеспечении адекватной потребностям тканей микроциркуляции (Fitzgerald D.J. 2001; Zaheer Z., Robinson T., Mistri A.K., 2011). Поэтому в комплексном изучении эдотелиотропного действия исследуемых соединений мы изучали их влияние на антитромботическую функцию эндотелия.

Изучение влияния сердечно-сосудистых средств, производных ГАМК, флавоноидов и веществ, обладающих антиоксидантными свойствами, на тромбоцитарный и коагуляционный гемостаз, показало, что все исследуемые соединения обладают способностью повышать антитромбогенный и антикоагуляционный потенциал эндотелия при эндотелиальной дисфункции, вызванной ЭСД (Рисунок 6,7,8,9) и НПГ.

А)

Б)

Примечание - ЭСД – группа животных с экспериментальным сахарным диабетом без лечения; интакт - интактная группа животных; * - (P0,05); **-(P0,01) достоверно по отношению к группе интактных животных; - (P0,05); (P0,01)- достоверно по отношению к группе  животных с ЭСД; (ранговый однофакторный анализ Крускала-Уоллиса, критерий Данна для множественных сравнений, непараметрический U- критерий Манна-Уитни).

Рисунок 6. - Влияние сердечно-сосудистых средств на индекс агрегации и индекс дезагрегации тромбоцитов у животных с ЭСД

А)

Б)

Примечание - обозначения, как на рисунке 6.

Рисунок 7. - Влияние производных ГАМК на индекс агрегации и индекс дезагрегации тромбоцитов у животных с ЭСД

Стоит отметить, что наиболее выраженное влияние на антитромботическую функцию эндотелия среди сердечно-сосудистых средств проявил Весел Дуэ Ф, симвагексал, из группы производных ГАМК – соединение РГПУ-189 и из флавоноидов – флавицин, которые лишь незначительно уступали по влиянию на антитромботическую функцию эндотелия гепариноиду - Вессел Дуэ Ф (Рисунок 6,7,8,9).

А)

Б)

Примечание - обозначения, как на рисунке 6.

Рисунок 8. - Влияние антиоксидантов на индекс агрегации и индекс дезагрегации тромбоцитов у животных с ЭСД

А.

Б.

В.

Примечание: ЭСД – группа животных с экспериментальным сахарным диабетом без лечения; интакт - интактная группа животных; * - (P0,05); **-(P0,01) достоверно по отношению к группе интактных животных; - (P0,05); (P0,01)- достоверно по отношению к группе  животных с ЭСД; (ранговый однофакторный анализ Крускала-Уоллиса, критерий Данна для множественных сравнений, непараметрический U- критерий Манна-Уитни)

Рисунок 9. Влияние изучаемых веществ на уровень фактора фон Виллебранда у животных с ЭСД

При ЭСД (таблица 7,8,9) и НПГ, оценивалась вязкость крови, и соответственно влияние на этот показатель исследуемых веществ. Все изучаемые соединения в той или иной мере снижали вязкость крови, однако наиболее существенное влияние среди сердечно-сосудистых средств оказал Весел Дуэ Ф, симвагексал, среди производных ГАМК - РГПУ-189, среди флавоноидов – флавицин.

Таблица 7. Влияние сердечно-сосудистых средств на вязкость крови крыс с ЭСД

Группы животных

Скорость сдвига, сПз

300с-1

100с-1

50с-1

10с-1

Контроль-интакт

3,41±0,18

4,9±0,25

6,4±0,38

8,54±0,55

ЭСД

4,85±0,22*

6,85±0,56*

9,51±0,71**

15,48±0,6**

ЭСД+Вессел Дуэ Ф

3,8±0,21

5,1±0,44#

6,81±0,75##

9,7±0,72##

ЭСД +Симвагексал

3,85±0,34

5,15±0,45#

7,13±0,41#

10,03±0,56##

ЭСД+Диротон

3,86±0,41

5,25±0,56#

7,55±0,71

10,46±0,82#

ЭСД +Небилет

3,93±0,31

5,41±0,53

7,87±0,23

10,75±0,73#

ЭСД + Конкор

4,08±0,21

5,9±0,41

8,15±0,23

12,31±0,67

ЭСД + Нифедипин

4,1±0,13

6,13±0,31

8,41±0,42

12,22±0,78

Примечание - ЭСД – группа животных с экспериментальным сахарным диабетом без лечения; интакт - интактная группа животных; * - (P0,05); **-(P0,01) достоверно по отношению к группе интактных животных; - (P0,05); (P0,01)- достоверно по отношению к группе  животных с ЭСД; (ранговый однофакторный анализ Крускала-Уоллиса, критерий Данна для множественных сравнений, непараметрический U- критерий Манна-Уитни)

Таблица 8. - Влияние производных ГАМК на вязкость крови крыс с ЭСД

Группы животных

Скорость сдвига, сПз

300с-1

100с-1

50с-1

10с-1

Контроль-интакт

3,64±0,35

4,58±0,31

6,78±0,41

8,41±0,34

ЭСД

4,95±0,18*

6,72±0,34*

9,8±0,67*

15,12±0,7**

ЭСД +РГПУ-189

3,91±0,33

4,7±0,51#

7,11±0,31#

10,39±0,81##

ЭСД + РГПУ-147

4,08±0,22

4,98±0,51

7,45±0,67

11,4±0,65#

ЭСД + Фенибут

4,15±0,41

5,18±0,32

7,9±0,32

11,97±0,71

ЭСД + Пикамилон

4,61±0,18

6,3±0,34

8,91±0,45

13,59±0,72

Примечание - обозначения, как в таблице 7.

Таблица 9 Влияние антиоксидантов на вязкость крови крыс с ЭСД

Группы животных

Скорость сдвига, сПз

300с-1

100с-1

50с-1

10с-1

Контроль-интакт

3,81±0,28

4,72±0,21

6,15±0,45

9,11±0,67

ЭСД

4,75±0,23*

6,12±0,25*

9,6±0,56*

14,68±0,55**

ЭСД +Флавицин

4,02±0,23

5,1±0,14

6,95±0,31#

10,73±0,77#

ЭСД +Кверцетин

4,2±0,18

5,61±0,23

7,15±0,3

11,28±0,28#

ЭСД + Мексидол

4,25±0,18

5,78±0,34

7,44±0,31

11,39±0,71#

ЭСД + Гесперидин

4,31±0,14

5,91±0,33

7,56±0,52

11,72±0,69

ЭСД + Дибикор

4,44±0,14

5,98±0,31

8,1±0,38

11,57±0,43

ЭСД + Диосмин

4,4±0,19

6,02±0,34

8,31±0,56

12,03±0,78

ЭСД + Предуктал

4,56±0,19

6,0±0,31

8,79±0,56

12,61±0,78

Примечание - обозначения, как в таблице 7.

По степени влияния на тромбоцитарный и коагуляционный гемостаз все изучаемые вещества из исследуемых фармакологических групп можно распределить следующим образом: Вессел Дуэ Ф > Симвагексал РГПУ-189 > Диротон > Небилет > РГПУ-147 Флавицин > Кверцетин Конкор > Нифедипин > Мексидол > Фенибут Гесперидин Дибикор > Диосмин Предуктал > Пикамилон.

Оценка влияния сердечно-сосудистых средств, производных ГАМК, веществ, обладающих антиокидантной активностью и флавоноидов на метаболический профиль у животных с ЭСД и НПГ.

Учитывая выраженные нарушения углеводного и жирового обмена при НПГ и, особенно, при ЭСД и их важной роли в развитии ЭД, представлялось важным дать оценку влияния изучаемых веществ на метаболический профиль на фоне экспериментально вызванного сахарного диабета и недостаточностью половых гормонов, что может расширить представления о возможных механизмах эндотелиотропного эффекта исследуемых веществ (таблица 10).

Таблица 10 - Влияние антиоксидантов на уровень глюкозы в крови у крыс с ЭСД (ммоль/л)

День

3 день

7 день

14 день

21 день

30 день

Группа

Интакт

2,5±0,24

2,81±0,19

2,75±0,32

2,6±0,28

2,64±0,35

ЭСД

13,1±0,47**

15,55±0,64**

16,18±0,47**

18,14±0,56**

19,71±0,4**

ЭСД

+Флавицин

12,87±0,29

10,77±0,46

13,12±0,5

14,48±0,7

15,37±0,6

ЭСД

12,42±0,6

11,87±0,65

14,07±0,6

15,52±1,16

16,2±0,62

+Кверцетин

ЭСД

12,92±0,53

14,11±0,72

15,22±0,69

16,48±0,53

17±0,68

+Гесперидин

ЭСД

12,61±0,36

14,68±0,58

15,9±0,61

16,6±0,39

17,28±0,37

+Диосмин

ЭСД

+Мексидол

13,02±0,34

14,07±0,3

15,3±0,73

16,51±0,87

17±0,74

ЭСД

+Предуктал

12,42±0,7

15,08±0,75

17,21±0,4

17,01±0,9

17,65±0,61

ЭСД

+Дибикор

13,12±0,53

12,47±0,51

14,32±0,58

15,31±0,66

16,5±0,48

Примечание – обозначения, как на рисунке 7.

У животных с ЭСД применение соединений с антиоксидантными свойствами приводило к статистически значимому снижению сахара в крови только под влиянием флавицина, кверцетина, дибикора. Все остальные изучаемые соединения влияния на уровень гипергликемии не оказывали.

Значительный гиполипидемический эффект наблюдался у симвагексала и флавицина, снижавших ИА в 2,2 и 2 раза, соответственно, а так же мексидола 1,7 раза и РГПУ-189 1,5 раза, которые превосходили по степени влияния на липидный обмен все другие исследуемые вещества.

Оценка влияния изучаемых веществ на противовосполительную и антипролиферативную функции эндотелия у животных с ЭСД и НПГ.

Под воздействием многих повреждающих факторов происходит изменение целостности и структуры эндотелия с нарушением практически всех его функций, в том числе противоспалительной и антипролиферативной функций (Maltais S., Perrault L. P., Ly H. Q., 2011).

Под влиянием исследуемых соединений, с помощью световой микроскопии, было выявлено достоверное снижение признаков воспаления (уменьшение лейкоцитарной инфильтрации и т.д.), повышенной тромбогенности – снижение количества и размеров пристеночных тромбов и т.д. (что согласуется с данными по изучению влияния РГПУ-189, фенибута, флавицина, мексидола, Вессел Дуэ Ф на антитромботическую функцию эндотелия), отека стенки сосуда, пролиферации, соотношения комплекса интима/медиа, проницаемости сосудистой стенки, нарушения структуры эндотелиальных клеток, в большей степени в группах, получавших Вессел Дуэ Ф, РГПУ-189 и флавицин.

Одним из маркеров повреждения эндотелия является количество циркулирующих эндотелиоцитов (ЦЭ) (Шумахер Г.И., 2008; Hladovec J. 1978). Исследование показало, что соединения РГПУ - 189 и флавицин статистически значимо снижают число ЦЭ (таблица 11).

Таблица 11. - Влияние РГПУ-189, фенибута, флавицина, мексидола и Вессел Дуэ Ф на количество циркулирующих эндотелиоцитов у животных с ЭСД и НПГ

Группы

ЦЭ /100 мкл

Группы

ЦЭ /100 мкл

Контроль-интакт

3,2±0,85

Контроль- ЛО

3,0±0,9

ЭСД

11,3±0,74* *

НПГ

8,7±0,83* *

ЭСД+РГПУ189

4,4±0,98##

НПГ+РГПУ-189

5,3±0,81#

ЭСД +Фенибут

9,8±0,75

НПГ+Фенибут

7,2±1,01

ЭСД+Флавицин

6,4±1,01##

НПГ+Флавицин

6,0±0,71 #

ЭСД+Мексидол

8,8±0,75#

НПГ+Мексидол

7,5±0,61

ЭСД+Вессел Дуэ Ф

4,8±0,97# #

НПГ+Вессел Дуэ Ф

4,3±1,01# #

Примечание: ЦЭ - циркулирующие эндотелиоциты; НПГ-оперированные животные с удаленными маткой и придатками, ЛО – ложнооперированные крысы; ЭСД – животные с стрептозотацированным сахарным диабетом, Интак – интактные крысы, * - (P0,05); ** - (P0,01) достоверно по отношению к группам интактных и ЛО животных; - (P0,05); (P0,01)- достоверно по отношению к группе  животных с ЭСД и НПГ (ранговый однофакторный анализ Крускала-Уоллиса, критерий Данна для множественных сравнений, непараметрический U- критерий Манна-Уитни)

Кроме этого, при электронной микроскопии эндотелиальных повреждений было выявлено, что ЭСД и НПГ приводит расслоению базальной мембраны, изменению ядер эндотелиоцита по типу апоптоза, вакуолизации митохондрий с уменьшением количества митохондриальных крист. По всей видимости, такого рода нарушения связаны с активацией «внешнего апоптоза», запуск которого ассоциирован с действием свободно-радикальных процессов, активацией провоспалительных агентов (цитокинов и интерлейкинов) и т.д. (Непомнящих Л.М., и др., 2011; Ong S.-B., Hausenloy D. J., 2010). Введение изучаемых соединений РГПУ-189 и флавицина животным с ЭСД и НПГ приводило к достоверному снижению признаков апоптоза клеток эндотелиоцитов с восстановлением их ультраструктуры.

Иммуногистохимический анализ влияния изучаемых веществ на уровень экспрессии e-NOS, эндотелина-1 и маркеров апоптоза:TRАIL, каспаза-3, nF-kB.

На сегодняшний день известно, что в не зависимости от причины активации апоптоза, определяющую роль в его развитии занимают каспазы, образующие взаимно активирующий друг друга, разветвленный, многократно дублирующий себя каскад. В результате взаимодействия каспазного каскада активируется эффекторная каспаза 3, которая вызывает расщепление внутриклеточных белков и влечет гибель клетки (Мушкамбаров Н.Н., Кузнецов С.Л., 2003). Кроме этого, в запуске программы апоптоза важную роль играют расположенные на клеточной мембране специфические рецепторы TRАIL (TNF-Related Apoptosis-Inducing Ligand), являющиеся важнейшим сигнальным путем запуска апоптоза различными факторами: физиологическими; агентами, вызывающими повреждение; лечебными препаратами; токсинами (этанол и др.); другими специфическими лигандами. Активация TRАIL рецепторов через ряд биохимических процессов неразрывна связана с усилением работы «доменов смерти», что в конечном счете приводит к гибели клетки (Мушкамбаров Н.Н., Кузнецов С.Л., 2003).

Кроме этого стоит отметить, что в основе апоптотического повреждения эндотелиоцитов при различных патологических состояниях лежит активация ядерного фактора каппа В (NFkB) – потенциал-чувствительного транскрипционного фактора, регулирующего, в частности, ген экспрессии многих цитокинов, фактора роста, молекул адгезии и ферментов, включенных в процессы иммунитета и антивоспалительный ответ (H. F. Galley and N. R. Webster, 2004; Biswas S. K., Lewis C. E., 2010; Taylor C. Wallace, 2011).

При выполнении блока иммуногистохимических исследований были получены следующие результаты. Стрептозотоцин индуцированный сахарный диабет, в большей степени, и экспериментально вызванная недостаточность половых гормонов, в меньшей степени, приводит к снижению экспрессии эндотелиальной NOS и увеличение экспрессии эндотелина-1, как специфических маркеров эндотелиальных нарушений (таблица 12). Кроме этого у животных с ЭСД и НПГ по сравнению с интактными животными, было отмечено достоверное увеличение экспрессии маркеров апоптоза (каспазы-3, TRАIL, NFkB) (таблица 13).

Таблица 12. Морфометрическая оценка экспрессии эндотелина и эндотелиальной-NOS по оптической плотности у животных с экспериментальной недостаточностью половых гормонов, сахарным диабетом и животных получавших изучаемые соединения.

Эндотелин (Clone RJT)

Эндотелиальная-NOS (Clone RN5)

Оптическая плотность (единицы яркости)^

Контроль интактные

35,9±3,5

86,3±3,2

НПГ

68,7±3,7

43,7±2,5*

СД

79,2±3,6*

34,4±2,7* *

НПГ+Вессел Дуэ Ф

43,7±2,1##

76,3±2,8##

СД+Вессел Дуэ Ф

50,2±2,6#

69,4±2,4#

НПГ+РГПУ189

51,9±3,6#

54,0±3,5#

СД+ РГПУ189

52,0±2,4#

58,3±2,3#

НПГ+Мексидол

49,1±2,7#

60,1±3,2#

СД+Мексидол

50,2±1,9#

62,8±3,1#

НПГ+Флавицин

50,4±1,8#

67,9±2,3##

СД+Флавицин

45,7±4,4##

74,4±2,4##

НПГ+Фенибут

60,6±2,1

54,8±1,8

СД+Фенибут

59,8±2,8

50,3±1,3

Примечание: ^- оптическую плотность рассчитывали с помощью программы морфометрического анализа изображений ВидеоТест-Морфо 4.0 (Россия). НПГ-оперированные животные с удаленными маткой и придатками, ЭСД – животные с стрептозотацированным сахарным диабетом, Интак – интактные крысы; *  - р<0,05; * * - р<0,01-достоверно по отношению к группе интактных животных; # - р<0,05; ##- р<0,01 достоверно по отношению к группам животных с недостаточностью половых гормонов и сахарным диабетом (критерий Уайта-Вилкоксона)

Таблица 13. Иммуногистохимические характеристики эндотелиоцитов по Allred D.C. et al. (1998).

Интенсивность экспрессии

Количество клеток

Интакт

ЭСД

Флавицин

РГПУ-189

Интакт

ЭСД

Флавицин

РГПУ-189

Каспаза 3

+

+++

+

++

+

+++

+

+

TRAIL

+

+++

++

++

+

++

+

+

nF-kB

+

+++

++

+

+

++

+

+

Примечание: ЭСД – животные с стрептозотацированным сахарным диабетом, Интак – интактные крысы

Представленные в таблице данные о влиянии соединения РГПУ-189 и флавицина и свидетельствующие об увеличении концентрации e-NOS и снижении уровня эндотелина, обьясняют их эндотелиопротекторное действие. Кроме этого, в ходе работы было отмечено, что РГПУ-189 и флавицин достоверно снижали уровень экспрессии каспазы-3, TRАIL и NF-kB у животных со стрептозотоцин индуцированным сахарным диабетом (таблица 13,14), что может лежать в основе их антиапоптопического действия.

Таблица 14. Индекс апоптоза эндотелиоцитов.

Группы

Апоптотический индекс %

Интактная

3,6±0,2

ЭСД

36,2±2,9* *

РГПУ-189

14,3±1,2##

Флавицин

19,25±1,9#

Примечание: ЭСД – животные с стрептозотацированным сахарным диабетом, Интак – интактные крысы*  - р<0,05; * * - р<0,01-достоверно по отношению к группе интактных животных; # - р<0,05; ##- р<0,01 достоверно по отношению к группам животных с недостаточностью половых гормонов и сахарным диабетом (критерий Уайта-Вилкоксона)

Следует отметить, что полученные в при электронной микроскопии данные и в связи с ними выдвинутые ранее предположения о прямом влиянии изучаемых веществ РГПУ-189 и флавицина на систему синтеза эндогенного оксида азота и снижении процессов апоптоза полностью подтвердили результаты имуногистохимического исследования.

Таким образом, соединение РГПУ- 189 и флавицин у животных с ЭСД и НПГ вызывают улучшение вазодилатирующей, антитромботической, антипролиферативной, противовосполительной функций эндотелия. В основе высокой эндотелиопротекторной активности соединения РГПУ-189 и флавицина по всей видимости лежит снижение апоптоза (каспазы-3, TRAIL, NF-kB), увеличении активности e-NOS и снижении экспрессии эндотелина-1.

ВЫВОДЫ:

  1. При экспериментальном сахарном диабете (ЭСД) и недостаточности половых гормонов (НПГ) отмечается выраженная эндотелиальная дисфункция (ЭД), что проявляется в снижении вазодилатирующей в 2,5 и 1,7 раза, соответственно, антитромботической в 1,7 и 1,3 раза, противовоспалительной функций в 2,2 и 1,5 раза, и увеличение количества циркулирующих эндотелиоцитов в 3,5 раза и 2,9 раза. При операционной травме также наблюдается выраженная эндотелиальная дисфункция, однако она носит относительно кратковременный, обратимый характер и через трое – четверо суток нормальная функция восстанавливается. Полученные результаты позволяют рекомендовать ЭСД и НПГ для моделирования эндотелиальной дисфункции в эксперименте.
  2. При проведении тестирования вазодилатирующей функции эндотелия различных сосудистых регионов (мозг, печень, почка и кожно- мышечная область), выявлен однонаправленный ответ сосудов. Наибольшая вазодилатирующая реакция наблюдалась в сосудах печени и мозга, в меньшей степени в почке и кожно мышечной области. Результаты исследования позволяют экстраполировать полученные в ходе эксперимента данные по изменению функции эндотелия в одной сосудистой области и на другие сосуды с разным типом эндотелия.
  3. Разработанный комплексный морфо-функциональный подход изучения эндотелиальной функции/дисфункции может применяться для оценки вазодилатирующей, антитромботической, противовоспалительной, антипролиферативной функций эндотелия, позволяет оценить мощность функционирования NO системы и выраженность ЭД, а также эндотелиопротективное действие изучаемых веществ.
  4. По степени улучшения вазодилатирующей функции эндотелия под влиянием исследуемых соединений их можно расположить следующим образом: Вессел Дуэ Ф > Диротон Симвагексал Небилет > РГПУ-189 > Флавицин РГПУ-147 > Кверцетин Мексидол > Конкор > Гесперидин > Диосмин > Предуктал > Пикамилон > Нифедипин Фенибут Дибикор.
  5. По степени улучшения антитромботической функции эндотелия под влиянием изучаемых соединений их можно расставить в следующем порядке: Вессел Дуэ Ф Симвагексал РГПУ-189 > Диротон > Небилет > РГПУ-147 Флавицин > Кверцетин Конкор > Нифедипин > Мексидол > Фенибут Гесперидин Дибикор > Диосмин Предуктал > Пикамилон.
  6. Новое производное ГАМК - РГПУ-189 и флавицин выражено улучшают противовоспалительную и антипролиферативную функции эндотелия, что проявляется в снижении уровня С-реактивного белка, уменьшении морфологических признаков воспаления, уменьшении соотношения интима/медиа, пролиферации и проницаемости сосудистой стенки, восстановлении структуры эндотелиоцитов, снижении их десквамации, апоптоза и некроза у животных с ЭСД и НПГ.
  7. Исследуемые производные ГАМК - соединения РГПУ-189 и РГПУ-147 и флавоноиды уменьшают гиперхолестеринемию, индекс атерогенности у животных с ЭСД и НПГ. Флавицин и в меньшей степени другие исследуемые флавоноиды снижают гипергликемию.
  8. Соединения РГПУ-189 и флавицин вызывают угнетение экспрессии маркеров апоптоза (TRAIL, каспаза-3, NF-kB), снижение экспрессии эндотелина-1 и усиление активности е-NOS, что очевидно лежит в основе их эндотелиопротекторного действия.
  9. Из всех исследуемых веществ Вессел Дуэ Ф оказал наиболее выраженное эндотелиопротекторное действие, что позволяет рекомендовать его в качестве эталонного препарата сравнения при сопоставлении эндотелиотропных эффектов различных исследуемых веществ.

Практические рекомендации.

       Разработанный комплексный морфо-функциональный подход может применяться для оценки степени ЭД (вазодилатирующей, антитромботической, противовоспалительной, антипролиферативной функций эндотелия), мощности функционирования NO системы, а также дает возможность оценить эндотелиотропные свойства исследуемых веществ.

       Проведенный сравнительный анализ полученных данных о влиянии известных сердечно-сосудистых средств, флавоноидов, веществ, обладающих антиоксидантной активностью, и производных ГАМК и гепариноида на эндотелиальную дисфункцию в условиях гормональных нарушений различного генеза позволил выявить соединения с высокой эндотелиопротективной активностью: Весcел Дуэ Ф, диротон, симваГЕКСАЛ, небилет, мексидол, которые могут применяться в комплексной терапии ЭД при ассоциированных с нею сердечно-сосудистых заболеваниях, а также для профилактики и лечения сосудистых осложнений, связанных с СД и НПГ. Полученные данные свидетельствуют о перспективности дальнейшего изучения соединения РГПУ-189 и флавицина, для создания на их базе новых препаратов с эндотелиопротекторной активностью. Полученные в ходе работы результаты также позволяют рекомендовать проведение целенаправленного поиска высоко эффективных эндотелиопротекторов среди производных ГАМК и флавоноидов.

Список опубликованных работ по теме диссертации:

Статьи, опубликованные в научных журналах и изданиях рекомендованных ВАКРФ

  1. Тюренков, И.Н. Влияние нового производного фенибута на церебральное кровообращение в условиях модификации синтеза оксида азота на фоне ишемии мозга / И.Н. Тюренков, А.В. Воронков, М.Н. Багметов, Л.Е. Бородкина // ж. «Регионарное кровообращение и микроциркуляция».-2005.-Т.4.-№1(18).-С.139-141.
  2. Тюренков, И.Н. Сравнительная оценка нейропротекторного действия фенибута и пирацетама в условиях экспериментальной ишемии мозга у крыс / И.Н. Тюренков, М.Н. Багметов, В.В. Епишина, Л.Е. Бородкина, А.В. Воронков // ж. «Экспериментальная и клин. фармакология».-М.-2006.-С.19-22.
  3. Тюренков, И.Н. Влияние гесперидина и флавицина на печеночный кровоток в норме и условиях активации и блокады синтеза эндогенного оксида азота / И.Н. Тюренков, А.В. Воронков, Е.Г. Доркина // ж. «Регионарное кровообращение и микроциркуляция».-СПб.-2006.-Т.5.-№3(13).-С.84-87.
  4. Воронков А.В. Изменение кровотока в различных сосудистых регионах при стимуляции и блокаде синтеза эндогенного оксида азота / И.Н. Тюренков, А.В. Воронков // ж. «Регионарное кровообращение и микроциркуляция».-СПб.-2006.-Т.5.-№3(19).-С.93-95.
  5. Тюренков, И.Н. Допплерографическое изучение эндотелиальной дисфункции церебральных сосудов крыс при недостаточности половых гормонов / И.Н. Тюренков, А.В. Воронков, А.И. Робертус, С.А. Воскресенский, Д.В. Куркин // Региональное кровообращение и микроциркуляция.-2007.-Т.6.-№1(21).-С.175-176.
  6. Тюренков, И.Н. Методический подход к оценке эндотелиальной дисфункции в эксперименте / И.Н. Тюренков, А.В. Воронков // Экспериментальная и клиническая фармакология.-2008.-Т.71.-№1.-С.49-51.
  7. Воробьев, А.А. Послеоперационная функциональная дисрегуляция брюшины и ее морфологический субстрат / А.А. Воробьев, С.В. Поройский, И.Н. Тюренков, А.В. Воронков, В.Б. Барканов, Б.Б. Полуосьмак // Вестник ВолГМУ.-2008.-№3.-С.34-37.
  8. Воронков, А.В. Изучение «L-аргининового парадокcа» для оценки эндотелиальной функции в норме и патологии / А.В. Воронков, А.И. Робертус, И.Н. Тюренков // Региональное кровообращение и микроциркуляция. .-2008.-Т.7.-№3(27).-С.54-58.
  9. Тюренков, И.Н. Использование многократного введения ацетилхолина для оценки эндотелиальной функции и возможной стабильности системы синтеза оксида азота / И.Н. Тюренков, А.В. Воронков, А.И. Робертус // Региональное кровообращение и микроциркуляция.-2009.-Т.8.-№1(29).-С.50-53.
  10. Тюренков, И.Н. Изучение дисфункции эндотелия у животных с экспериментально вызванной недостаточностью половых гормонов / И.Н. Тюренков, А.В.Воронков, А.И. Робертус // Кардиология.-2009.-№5.-С.64 65.
  11. Тюренков, И.Н. Недостаточность половых гормонов. Эндотелиальная функция и ее коррекция эстрогенами / И.Н. Тюренков, А.В.Воронков, А.И. Робертус // Экспериментальная и клиническая фармакология.- 2009.-Т.72.-№6.-С.57-59.
  12. Тюренков, И.Н. Развитие эндотелиальной дисфункции при недостаточности половых гормонов // И.Н. Тюренков, А.В. Воронков, А.И. Робертус //Патологическая физиология и экспериментальная теpапия.-2009.-№4.-С.33-36.
  13. Тюренков, И.Н. Зависимость между антиоксидантным действием флавоноидов и их влиянием на вазодилатирующую функцию эндотелия в условиях эндотелиальной дисфункции / И.Н. Тюренков, А.В. Воронков, Е.В. Петрова, Е.Г. Доркина // Экспериментальная и клиническая фармакология. 2010. - Т. 73,№10. С.14-17.
  14. Тюренков, И.Н. Влияние флавицина на вазодилатирующую и антитромботическую функции эндотелия у животных с экспериментальным сахарным диабетом / И.Н. Тюренков, А.В. Воронков, Е.В. Петрова, А.А. Слиецанс, Э.Т. Оганесян // Экспериментальная и клиническая фармакология. 2010. - Т. 73,№12. С.17-20.
  15. Тюренков, И.Н. Сравнительная оценка влияния небиволола и бисопролола на вазодилатурующую и антитромботическую функции эндотелия мозговых сосудов у животных с сахарным диабетом / И.Н. Тюренков, А.В. Воронков // Вестник новых медицинских технологий.-Тула.-2010.- №4(36).-С.152-155.
  16. Тюренков, И.Н. Влияние лизиноприла на вазидилатирующую и антитромбическую функции эндотелия при сахарном диабете / И.Н. Тюренков, А.В. Воронков // ж. «Врач».-2011.-№2.-С.35-37.
  17. Тюренков, И.Н. Морфологические и функциональные критерии оценки эндотелиальной дисфункции сосудов головного мозга крыс при гормональных патологиях различного генеза / И.Н. Тюренков, А.В. Воронков, Г.Л. Снигур, С.В. Поройский, А.А. Слиецанс, А.И. Робертус // Вестник новых медицинских технологий.-Тула.-2011.- №1.-С.197-200.
  18. Тюренков, И.Н. Влияние симвастатина на эндотелийзависимую вазодилатацию мозговых сосудов у животных со стрептозотацин-индуцированным сахарным диабетом / И.Н. Тюренков, А.В. Воронков // Вестник ВолГМУ.-2010.-№4. С.87-90.
  19. Воронков, А.В. Коррекция эндотелиальной дисфункции, вызванная экспериментальным сахарным диабетом соединениями с антиоксидантным действием / А.В. Воронков, И.Н. Тюренков, А.А. Слиецанс // Региональное кровообращение и микроциркуляция.-2011.-в печати.
  20. Тюренков, И.Н. Сравнительная оценка вазодилатирующей функции эндотелия при патологиях различного генеза / И.Н. Тюренков, А.В. Воронков, Е.В. Петрова, А.А. Слиецанс, А.И. Робертус, Е.В. Волотова // Региональное кровообращение и микроциркуляция.-2011.-в печати.
  21. Воронков, А.В. Влияние сердечно-сосудистых средств на вазодилатирующую функцию животных с экспериментальной недостаточностью половых гормонов /А.В. Воронков, И.Н. Тюренков // Экспериментальная и клиническая фармакология. 2011. - в печати.

Статьи, опубликованные в научных сборниках и журналах:

  1. Воронков, А.В. Эффективность влияния мефебута на скорость церебрального кровотока по результатам доплерографического исследования у крыс с острой ишемической патологией головного мозга / А.В. Воронков, И.Н. Тюренков, Л.Е. Бородкина, М.Н. Багметов, В.В. Епишина // Материалы научной конференции «Современные проблемы экспериментальной и клинической медицины», Паттайя, (Тайланд), ж. «Успехи современного естествознания», Москва «Академия естествознания».-2004.-№12.-С.41.
  2. Тюренков, И.Н. Защитное действие фенильных производных кислоты гамма-аминомасляной в условиях тотальной и региональной ишемии / И.Н. Тюренков, Л.Е. Бородкина, В.Н. Перфилова, А.В. Воронков // «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции». Сборник научных трудов  (Пятигорская государственная фармацевтическая академия), Вып. 60.-Пятигорск.-2005.-С.429-431.
  3. Воронков А.В. Влияние блокады и активации синтеза эндогенного оксида азота на мозговой и печеночный кровоток / А.В. Воронков, Л.Е. Бородкина // Материалы научной конференции с международным участием «Фундаментальные и прикладные проблемы медицины и биологии», Тунис, ж. «Фундаментальные исследования», Москва «Академия Естествознания».-2005.-№5.-С.44.
  4. Тюренков, И.Н. Влияние активации и блокады выработки нитрооксида на кровообращение мозга, печени, почек и костно-мышечной области / И.Н. Тюренков, А.В. Воронков // 13-ый Российский национальный конгресс «Человек и лекарство». Сборник материалов конгресса.-Москва.-2006.-С.307.
  5. Воронков, А.В. Влияние недостаточности половых гормонов на структуру эндотелия сосудов почек у крыс обоего пола / А.В. Воронков, И.Н. Тюренков, Г.Л. Снегур // Бюллютень Волгоградского научного центра РАМН.-Волгоград.-2006.-С.13-15.
  6. Тюренков, И.Н. Изучение скорости локального мозгового кровотока с модификацией синтеза эндогенного оксида азота на фоне недостаточности половых гормонов у крыс обоего пола/ Тюренков И.Н., Воронков А.В., РобертусА.И.,. Воскресенский С.А,.Куркин Д.В, Слиецанс А.А., Драгилев Г.В. // Научные труды VII международной научно-практической конференции «Здоровье и образование в XXI веке», – Москва, 2006. – С. 510-511.
  7. Воронков, А.В. Влияние нового производного ГАМК на мозговой кровоток в условиях подавления и усиления синтеза эндогенного оксида азота на фоне ишемии мозга/ А.В. Воронков, А.И. Робертус, С.А. Воскресенский, Д.В. Куркин // Сборник трудов III Международной медико-фармацевтической конференции студентов и молодых ученых Черновцы.- Украина.- 2006.-С.115.
  8. Тюренков, И.Н. Оценка эндотелиальной дисфункции методом высокочастотной допплерографии для профилактики послеоперационных нарушений микроциркуляции и тромбоэмболических осложнений / И.Н. Тюренков, А.В. Воронков, А.А. Воробьев, С.В. Поройский // Бюллетень НЦССХ им. А.Н. Бакулева РАМН. Сердечно сосудистые заболевания.-Москва.-2007.-Т.8.-№6.-С.348.
  9. Воробьев, А.А. Использование высокочастотной допплерографии для оценки эндотелиальной функции и рисков спаечной болезни у больных сахарным диабетом в полеоперационном периоде (экспериментальное исследование) / А.А. Воробьев, С.В. Поройский, И.Н. Тюренков, А.В. Воронков // Симпозиум «Регионарное кровообращение и микроциркуляция в клинической практике», на базе Всероссийского съезда хирургов НЦССХ им. Бакулева, 2007.-С.351.
  10. Тюренков, И.Н. Оценка эндотелиальной дисфункции методом высокочастотной допплерографии для профилактики послеоперационных нарушений микроциркуляции и тромбоэмболических осложнений / И.Н. Тюренков, А.В. Воронков, А.А. Воробьев, С.В. Поройский // Бюллетень НЦССХ им.А.Н, Бакулева РАМН. Сердечно сосудистые заболевания-2007.-Т.8.-№6.-С.348.
  11. Тюренков, И.Н. Влияние овариэктомии на мнестические и когнетивные процессы животных с оценкой эндотелиальной функции церебральных сосудов кастрированных крыс / И.Н. Тюренков, А.В. Воронков, А.И. Робертус, Д.В. Куркин, С.А. Воскресенский, А.А. Слиецанс // Научные труды VIII международного конгресса «Здоровье и образование в XXI веке; концепции болезней цивилизации», РУДН.-Москва.-2007.-С.639-640.
  12. Тюренков, И.Н. Фармакологическая коррекция эндотелиальной дисфункции, вызванной гормональной недостаточностью / И.Н. Тюренков, А.В. Воронков, А.И. Робертус // Психофармакология и биологическая наркология: материалы  III съезда фармакологов России, Фармакология- практическому здравоохранению.-Санкт-Петербург.-2007.-Т.7.-Спец.вып., часть 2.-С.2-1983.
  13. Тюренков, И.Н. Морфологическая оценка эндотелия сосудов почек после ампутации матки с придатками / И.Н. Тюренков, А.А. Воробьев, А.В. Воронков, С.В. Поройский, В.Б Барканов // Международная конференция «Структурные преобразования органов и тканей на этапах онтогенеза в норме и при воздействии антропогенных факторов. Экология и здоровье человека» Астрахань.-2007.-№2.-С.-187-188.
  14. Тюренков, И.Н. Изучение влияния биофлавоноидов на печеночную микроциркуляцию в условиях нормы и модификации синтеза эндогенного оксида азота (NO) / И.Н. Тюренков, А.В. Воронков, А.И. Робертус // Сборник материалов и тезисов: VI Международная конференция «Гемореология и микроциркуляция» (от молекулярных мишеней к органным и системным изменениям).-Ярославль.-2007.-С.193.
  15. Тюренков, И.Н. Влияние нового производного ГАМК на эндотелиальную дисфункцию при ишемии головного мозга / И.Н. Тюренков, А.В. Воронков, А.И. Робертус, С.А. Воскресенский, Д.В. Куркин, А.А. Слиецанс // Материалы 14-ого Российского национального конгресса «Человек и лекарство». 18-22 апреля 2007.-Москва.-2007.-С.632.
  16. Тюренков, И.Н. Влияние гесперидина на церебральный кровоток животных, подвергшихся овариоэктомии на фоне модификации синтеза эндогенного оксида азота / И.Н. Тюренков, А.В. Воронков, Е.Г. Доркина // Материалы II международная научная конференция «Химия, технология и медицинские аспекты природных соединений».-Алматы.-Казахстан.-2007.-С.107-108.
  17. Воробьев, А.А. Изменения микроциркуляции брюшины в динамике экспериментальной операционной травмы / А.А. Воробьев, С.В. Поройский, И.Н. Тюренков, А.В. Воронков, В.Б. Барканов // Международная дистанционная научно-практическая конференция, посвященная памяти выдающегося ученого и хирурга профессора Василия Николаевича Парина. Внедрение инновационных технологий в хирургическую практику (фундаментальные и прикладные аспекты).-Пермь.-2008.-70-72.
  18. Тюренков, И.Н. Изучение скорости кровотока у животных с экспериментальным сахарным диабетом в условиях тромбообразования и модификации синтеза эндогенного NO / И.Н. Тюренков, Воронков А.В., Заитениди И.К., Робертус А.И., Воскресенский С.А., Слиецанс А.А. // IX Международный конгресс молодых ученых «Науки о человеке»: материалы…- Томск, 2008. - С.108-109.
  19. Тюренков, И.Н. Морфологические изменения эндотелиоцитов мозга крыс с экспериментально вызванной недостаточностью половых гормонов / И.Н. Тюренков, А.В. Воронков, А.И. Робертус, А.А. Воробьев, С.В. Поройский, А.В. Поройская // Человек и лекарство: тезисы докладов 15-го Российского национального конгресса. – Москва, 2008. – С. 421.
  20. Тюренков, И.Н. Диагностика эндотелиальной функции в эксперименте / И.Н. Тюренков, А.В. Воронков, А.И. Робертус, И.К. Заитениди, С.А. Воскресенский // Ангиология и сосудистая хирургия.-2008.-Т.14.-№3.-Приложение.-С.155-156.
  21. Тюренков, И.Н. Основные методические приемы изучения эндотелиальной функции в эксперименте / И.Н. Тюренков, А.В. Воронков, А.И. Робертус, А.А. Воробьев, С.В. Поройский // Бюллетень НЦССХ им. А.Н. Бакулева РАМН сердечно-сосудистых заболеваний. Приложение №1: тезисы докладов и сообщений XIV Всероссийского съезда сердечно-сосудистых хирургов.-Москва.-2008.-Т.9.-№6.-С.156.
  22. Воробьев, А.А. Состояние микроциркуляции сосудов брюшины в динамике операционной травмы / А.А. Воробьев, И.Н. Тюренков, С.В. Поройский, А.В. Воронков /// Бюллетень ВМЦ РАМН.-2008.-№1.-С.50-53.
  23. Тюренков, И.Н. Основные методические приемы изучения эндотелиальной функции в эксперименте / И.Н. Тюренков, А.В. Воронков, А.И. Робертус, А.А. Воробьев, С.В. Поройский // Четвертая всероссийская конференция «Клиническая гемостезиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии» (с международным участием).-Москва.-2009.-С.188-189.
  24. Воронков, А.В. Определение десквамированных эндотелиоцитов в крови крыс с недостаточностью половых гормонов / А.В. Воронков, И.Н. Тюренков, А.И. Робертус, А.А. Слиецанс, Д.В. Куркин // Человек и лекарство: тезисы докладов 16-го Российского национал. конгресса 2009г. – Москва, 2009. – С.635.
  25. Тюренков, И.Н. Недостаточность половых гормонов, эндотелиальная дисфункция и коррекция ее ГАМК-ергическими средствами / И.Н. Тюренков, А.В. Воронков, А.И. Робертус, Е.В. Петрова // Материалы VIII Съезда кардиологов ЮФО.- Ростов-на-Дону.- 2009.-С.201-202.
  26. Робертус, А.И. Оценка взаимосвязи между уровнем фибриногена и скоростью тромбообразования у животных с недостаточностью половых гормонов на фоне введения производного ГАМК РГПУ-189 / А.И. Робертус, А.В. Воронков // Сборник трудов межвузовской научной конференции, посвященной памяти профессора Владислава Васильевича Пичугина и 75-летию КГМУ. «Актуальные вопросы фармакологии и фармации» 400с .-Курск.-2009.-С.308-309.
  27. Тюренков, И.Н. Эндотелиопротективное действие структурных аналогов ГАМК / И.Н. Тюренков, А.В. Воронков, А.И. Робертус, А.А. Слиецанс, Е.В. Петрова, Д.В. Куркин // Сборник научных трудов (под редакцией академика РАМН В.И.Петрова) 56-ой региональной научно-практической конференции профессорско-преподавательского коллектива ВолГМУ: Инновационные достижения фундаментальных и прикладных мед.исследований в развитии здравоохранения Волгоградской обл.-Издательство ВолГМУ.-Волгоград.-2009.- С.289-291.
  28. Слиецанс, А.А. Изучение антитромботической активности флавицина у животных с экспериментальным сахарным диабетом / А.А. Слиецанс, И.Н. Тюренков, А.В. Воронков, Е.В. Петрова // Научная конференция “Актуальные вопросы фармакологии и фармации”: сб.науч.тр. - Курск, 2009. – С. 322-323.
  29. Слиецанс, А.А. Влияние дибикора на уровень липопротеидов высокой плотности и общий холестерин у крыс при экспериментальном сахарном диабете / А.А. Слиецанс, А.В. Воронков, Е.В. Петрова // X Международный конгресс “Здоровье и образование в XXI веке РУДН ”: сб.науч.тр. -  Москва, 2009. - С. 845.
  30. Тюренков, И.Н. Эндотелиальная дисфункция при экспериментальном сахарном диабете и возможность ее коррекции флавоноидами / И.Н. Тюренков, А.В. Воронков, А.А. Слиецанс, Е.Г. Доркина // VIII съезд кардиологов Южного Федерального округа «Совершенствование оказания медицинской помощи больным с сердечно-сосудистыми заболеваниями – новые подходы и перспективы»: материалы… - Ростов-на-Дону, 2009. - С. 199-200.
  31. Тюренков, И.Н. Изучение влияния гесперидина на эндотелиальную функцию животных с экспериментально вызванным сахарным диабетом / И.Н. Тюренков, А.В. Воронков, Е.Г. Доркина, А.А. Слиецанс // Бюллетень Волгоградского научного центра РАМН. – 2009. -  №1. - С. 19-21.
  32. Тюренков, И.Н. Влияние мексидола на эндотелиальную функцию церебральных сосудов у животных с экспериментальным сахарным диабетом / И.Н. Тюренков, А.В.Воронков, А.А. Слиецанс, Е.В.Петрова // X Международный конгресс “Здоровье и образование в XXI веке РУДН ”: сб.науч.тр. - Москва, 2009. - С. 797-798.
  33. Тюренков, И.Н. Оценка функционального состояния эндотелия по изменению сосудистой вазодилатации и показателям свертываемости крови у животных с экспериментальным сахарным диабетом / И.Н. Тюренков, А.В. Воронков, Е.В. Петрова, А.А. Слиецанс // Научная конференция “Актуальные вопросы фармакологии и фармации”: сб.науч.тр. - Курск, 2009. – С.336-338.
  34. Поройский, С.В. Послеоперационные микроциркуляторные нарушения брюшины и способы их фармакологической коррекции / С.В. Поройский, А.А. Воробьев, И.Н. Тюренков, А.В. Воронков // Четвертая всероссийская конференция «Клиническая гемостезиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии» (с международным участием).-Москва.-2009.-С.160-161.
  35. Тюренков, И.Н. Вещества с эндотелиопротективными свойствами новое направление в создании сердечно-сосудистых средств / И.Н. Тюренков, А.В. Воронков // Материалы 8 съезда кардиологов Южного Федерального округа «Совершенствование оказания медицинской помощи больным с сердечно-сосудистыми заболеваниями – новые подходы и перспективы».-Ростов-на-Дону.-2009.-С.198-199.
  36. Слиецанс, А.А. Изучение антитромботической активности диосмина как компонента его эндотелиопротективного действия у животных с экспериментальным сахарным диабетом / А.А. Слиецанс, Е.В. Петрова, А.В. Воронков, А.И. Робертус // II Всероссийский научно-практический семинар для молодых ученых “Методологические аспекты экспериментальной и клинической фармакологии”: материалы… – Волгоград, 2010. - С. 108-109.
  37. Слиецанс, А.А. Изучение влияния гесперидина на вазодилатирующую функцию церебральных сосудов у животных с эндотелиальной дисфункцией на фоне экспериментального сахарного диабета / А.А. Слиецанс, А.В. Воронков, Е.В. Петрова // V Международная (XIV Всероссийская) Пироговская научная медицинская конференция студентов и молодых ученых: материалы... - Москва, 2010 г.- С. 552.
  38. Тюренков, И.Н. Морфологическая оценка эндотелиальной дисфункции, в сосудах почек крыс обоего пола, с экспериментально вызванной недостаточностью половых гормонов / И.Н. Тюренков, А.В. Воронков, Г.Л. Снигур, С.В. Поройский, А.В. Поройская, А.И. Робертус, А.А. Слиецанс, Е.В. Петрова // Сборник трудов научно-практической конференции «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической морфологии» посвященной памяти член корр. РАМН, з.д.н. РФ, д.м.н., проф. В.Б.Писарева.- Волгоград.-2010.-С.145-149.
  39. Робертус, А.И. Изучение антитромботической активности производного ГАМК РГПУ-189 в условиях эндотелиальной дисфункции при экспериментально вызванной недостаточностью половых гормонов / А.И. Робертус, А.В. Воронков // Вестник РГМУ. Периодический медицинский журнал. – М.: ГОУ ВПОРГМУ Росздрава. – 2010, Специальный выпуск № 2. –С.542.

В ходе работы получен: Патент Российской Федерации на изобретение №2374699. зарегистрирован в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 27 ноября 2009 года.

Список сокращений

ЭД - эндотелиальная дисфункция

ЭСД экспериментальный сахарный диабет

НПГ недостаточность половых гормонов

ЭЗВД - эндотелиозависимая вазодилатация

ЭНЗВД - эндотелионезависимая вазодилатация

АЦХ – ацетилхолин

НТГ - нитроглицерин

АЧТВ активированное частичное тромбопластиновое время

ПВ протромбиновое время

ТВ тромбиновое время

СРБ – С-реактивный белок

ОС-оксидативный стресс

СК-скорость мозгового кровотока

ЭНДОТЕЛИАЛЬНАЯ ДИСФУНКЦИЯ И ПУТИ ЕЕ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЙ КОРРЕКЦИИ

Воронков Андрей Владиславович

А В Т О Р Е Ф Е Р А Т

диссертации на соискание ученой

степени доктора медицинских наук

Подписано к печати «_____»____________2011 г. Формат бумаги 60x84 1/16

Бумага кн.-журнальная. Печать ротапринтная.

Волгоградский государственный медицинский университет

Усл. печ. л. 1,0. Тираж 200 экз. Заказ №_____

Государственное общеобразовательное учреждение высшего профессионального образования «Волгоградский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения и социального развития Российской федерации», 400131, г. Волгоград, Пл. Павших Борцов, 1.


1 Выражаем искреннюю благодарность зав.кафедрой органической химии РГПУ им.А.И..Герцена , з.д.н., д.х.н., проф. Берестовицкой В.М., к.х.н., доц. Васильевой О.С. и всем сотрудникам кафедры за предоставленные для исследования  вещества






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.