WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


 

На правах рукописи

КОЗИНА

Людмила Семеновна

АНТИОКСИДАНТНОЕ ДЕЙСТИЕ
ГЕРОПРОТЕКТОРНЫХ ПЕПТИДНЫХ БИОРЕГУЛЯТОРОВ

14.00.53 - геронтология и гериатрия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Санкт-Петербург - 2008

Работа выполнена в лаборатории биохимии
Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии
Северо-Западного отделения РАМН

Научный консультант:

член-корреспондент РАМН

доктор медицинских наук, профессор

Хавинсон Владимир Хацкелевич

Официальные оппоненты:

академик РАН, доктор биологических наук,

профессор Ноздрачев Александр Данилович

доктор медицинских наук, профессор

Малинин Владимир Викторович

доктор биологических наук, профессор

Розенгарт Евгений Викторович

Ведущая организация:

ГУ «Российский научно-исследовательский институт геронтологии»

Минздравсоцразвития РФ

Защита состоится «____»__________________2008 г. в ____ часов на заседании диссертационного Совета Д601.001.01 при Санкт-Петербургском  институте биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН по адресу: 197110 Санкт-Петербург, пр. Динамо, д .3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Санкт-Петербургского

института биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН (197110 Санкт-Петербург, пр. Динамо, д. 3).

Автореферат разослан _________________________________2008 г.

Ученый секретарь

диссертационного Совета

доктор медицинских наук, профессор Рыжак Г.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ



Актуальность проблемы

Свободнорадикальная теория старения, предложенная в 50-е г.г. прошлого столетия
Д. Харманом и получившая дальнейшее развитие в многочисленных работах зарубежных и отечественных исследователей, к которым относятся в первую очередь Н.М. Эммануэль и его школа, до настоящего времени считается одной из самых перспективных теорий, объясняющих механизмы старения и связанных с ним патологических процессов.

Известно, что процессы старения организма и формирования возрастной патологии обусловлены ростом молекулярных повреждений, вызываемых свободными радикалами, а также нарушением функции системы антиоксидантной защиты организма. При этом наблюдается дисбаланс показателей антиоксидантной и прооксидантной систем, определяющий интенсивность патологических процессов. Оксидативные реакции приводят к нарушению регуляции клеточного гомеостаза, что способствует развитию заболеваний или индуцирует процесс преждевременного старения [Хавинсон В.Х. и соавт., 2003; Зенков Н.К. и соавт.,2001; Дубинина Е.Е., 2006]. В основе этих нарушений лежат процессы перекисного окисления липидов (ПОЛ), которые носят каскадный характер, окислительной модификации белков и ДНК.

Наряду с этим, установлено, что одной из наиболее важных регуляторных функций эндогенных пептидов (глутатион, карнозин и его производные, некоторые нейропептиды) является ограничение чрезмерной активации свободнорадикальных процессов, прежде всего ПОЛ, и поддержание способности системы антиоксидантной защиты противодействовать окислительному стрессу, развивающемуся в организме при патологических процессах, действии неблагоприятных факторов внешней среды и старении [Болдырев А.А., 1998; Хавинсон В.Х. и соавт., 2003; Лысенко и соавт., 2005]. Принимая во внимание разнообразие физиологических эффектов регуляторных пептидов, легко представить, что уменьшение их продукции может привести к нарушению механизмов пептидной регуляции и постепенному угасанию функций в стареющем организме.

В Санкт-Петербургском Институте биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН выделено из тканей животных большое количество геропротекторных полипептидных препаратов, представляющих собой низкомолекулярные соединения пара- и аутокринной природы, выполняющие функции внутри- и межклеточных мессенджеров. Они, как и многие синтезированные на основе изучения их аминокислотного состава короткие пептиды, принимают участие в переносе информации между группами клеток, регулируют их активность и обладают поли­функциональным действием в организме. Широкий спектр фармакологической активности этих соединений связан с их влиянием на ряд наибо­лее общих механизмов, лежащих в основе разнообразных патологичес­ких процессов. Установлено, что они способствуют увеличению продолжительности жизни, тормозят развитие опухолей, обладают иммуномодулирующим действием и т.д. [Анисимов В.Н., 2003]. Существует представление о том, что соединения пептидной природы могут осуществлять свои функции на уровне межклеточного взаимодействия между геномом и структурно-функциональными элементами нейро-иммунно-эндокринной регуляции [Хавинсон В.Х., Кветной И.М. и соавт., 2003, Пальцев М.М., Кветной И.М., 2008]. По-видимому, пептиды, обладающие антиоксидантной активностью, способны корректировать нарушения подобного взаимодействия в условиях окислительного стресса, возникающего при старении вследствие развития различных патологических процессов (сердечно-сосудистые заболевания, нарушение мозгового кровообращения, злокачественный рост, нейродегенеративные болезни и т.д.).

Механизмы действия регуляторных пептидов до настоящего времени объясняют с позиций существования пептидного каскада, сформулированных в гипотезе о функциональном континууме пептидов [Ашмарин И.П., Каменская М.А., 1988; Ашмарин И.П., 1996; Ашмарин И.П., Королева С.В, 2003]. Каждый пептид имеет спектр биологической активности, определяемый, во-первых, его непосредственным действием и, во-вторых, его способностью индуцировать выход эндогенных регуляторов, в том числе и других регуляторных пептидов. В свою очередь, каждые из них также могут служить индукторами выхода следующей группы пептидов и т.д., благодаря чему формируется сложный каскадный процесс. Гипотеза о существовании такой системы регуляции позволяет преодолеть серьезные противоречия, возникающие при попытках объяснения относительно длительных физиологических эффектов короткоживущих пептидов. Другим механизмом действия регуляторных пептидов считается их процессинг, в результате которого становится возможным в короткие сроки путем активации определенных протеолитических ферментов образовывать в нужном месте необходимое количество требуемых пептидов [Яковлев и соавт., 1992; Гомазков О.А., 1995]. Образующиеся короткие фрагменты из 3-4 аминокислотных остатков, полностью лишенные гормональной активности, могут оказаться значительно более эффективными, чем исходные соединения.

Известно, что любая клетка наделена системой защиты от АФК и продуктов пе­рекисного окисления, которые способны нанести ей непоправимый вред. Значительная часть этой защитной системы локализована в митохондриях и микросомах и представлена такими ферментами, как супероксиддисмутаза, каталаза и глутатионпероксидаза. Ингибирование избыточного свободнорадикального окисления (СРО) играет особо важную роль в функционировании митохондрий, мембрана которых несет на своей поверхности комплексы ферментов, осуществляющих транспорт электронов, цикл трикарбоновых кислот и процессы фосфорилирования.

Нормальная деятельность ферментных систем митохондрий выполняет важную роль в осуществлении физиологических функций клетки, работа которой во многом определяется состоянием проницаемости, пассивного и активного транспорта, а также стабильностью митохондриальных мембран [Скулачев В.П., 1997; Skulachev V.P., 2002]. Отсюда правомочно заключить, что даже незначительные структурные и функциональные сдвиги в митохондриальных мембранах, возникшие вследствие усиления процессов перекисного окисления, могут существенно нарушать функции клетки. Вместе с тем регуляторные пептиды, ингибируя кислородозависимые процессы в мембране, способствуют сохранению ее целостности и обеспечивают нормальное функционирование клетки. В этой связи перспективной представляется гипотеза о вызываемой пептидными регуляторами длительной модификации характера экспрессии генов, кодирующих белки митохондриальных мембран [Khavinson V. et al., 2002, 2007].

Пептидный компонент регуляции проявляется на всех уровнях функционирования организма [Гомазков О.А., 1995; Шерстнев В.В. и соавт, 1999]. Одним из наиболее важных механизмов реализации разнообразных эффектов биологически активных пептидов является их нормализующее влияние на интенсивность свободнорадикального окисления в органах и тканях, что, как правило, сопровождается усилением  клеточного и гуморального иммунитета, улучшением коагулогических показателей, повышением нейрональной активности, оптимизацией когнитивных функций и т.д. [Лысенко А.В. и соавт., 2005]. Особое значение приобретает пептидная регуляция при коррекции нарушений, вызванных воздействием на организм стрессорных факторов, способствующих ускоренному старению. В связи с этим можно рассматривать пептидные биорегуляторы как перспективные фармакологические средства, способствующие замедлению возрастных и стресс-индуцированных изменений в организме.

Исходя из вышеизложенного, весьма актуальным представляется проведение экспериментального изучения влияния коротких пептидов как антиоксидантов на интенсивность свободнорадикальных процессов на клеточном уровне, а также в различных органах при воздействии стресса и при старении. Это позволит выявить и оценить антиоксидантные эффекты коротких пептидов и возможные механизмы их реализации, что представляет значительный научно-практический интерес.

Цель и задачи исследования

Целью исследования являлось изучение влияния на свободнорадикальные процессы ряда геропротекторных пептидных препаратов, разработанных в Санкт-Петербургском Институте биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН (эпиталон, вилон, пинеалон и др.) и возможных механизмов их антиоксидантного действия.

В рамках указанной цели были поставлены следующие задачи:

  1. Изучить возрастную динамику основных показателей СРО и системы антиоксидантной защиты в крови, мозгу и печени крыс;
  2. Исследовать влияние геропротекторных пептидных препаратов на показатели свободнорадикального окисления и антиоксидантной системы в сыворотке крови и тканях крыс.
  3. Изучить влияние геропротекторных пептидных препаратов на показатели свободнорадикального окисления и антиоксидантной системы в условиях действия экстремальных факторов (гипоксия, гипокинезия);
  4. Оценить антиоксидантную активность и мембранопротекторные свойства коротких пептидов в модельных экспериментах:
    • Исследовать прямую антиоксидантную активность коротких пептидов
    • Исследовать влияние коротких пептидов на Fe2+-индуцированное окисление липопротеинов крови и скорость осмотического гемолиза эритроцитов
    • Изучить действие коротких пептидов на нейрональные клетки мозжечка
  1. Изучить механизмы защитного действия пептидных биорегуляторов при гипоксии:
  • Исследовать влияние коротких пептидов на устойчивость крыс к воздействию гипобарической гипоксии
  • Исследовать влияние коротких пептидов (пинеалон) на состояние потомства крыс, подвергнутых воздействию гипобарической гипоксии
  • Исследовать влияние пинеалона на поведенческие реакции крысят, перенесших пренатальную гипоксию
  • Исследовать влияние пинеалона на нейрональные клетки мозжечка потомства крыс, подвергнутых воздействию гипобарической гипоксии
  • Исследовать влияние коротких пептидов на клетки нейробластомы человека при гипоксическом воздействии

Научная новизна работы

       Установлено, что в печени и сыворотке крови крыс при старении снижается уровень генерации активных форм кислорода (АФК), что сопровождается значительным подавлением активности системы антиоксидантной защиты. При этом выявлено заметное повышение уровня содержания в белках карбонилпроизодных аминокислот, что свидетельствует об использовании АФК в реакциях окислительной модификации белков. Возрастная динамика СРО в гомогенатах мозга аналогичных изменений не претерпевает, однако впервые выявлена интенсификация свободнорадикальных процессов в митохондриях, выделенных из ткани коры больших полушарий и гипоталамуса старых крыс (24 мес.) по сравнению с молодыми животными (3 мес.). Обобщены данные, полученные в отношении действия коротких пептидов (эпиталон и его структурные аналоги, вилон и кортаген) на свободнорадикальные процессы и основные системы антиоксидантной защиты в крови, печени и мозге лабораторных животных (белые крысы линий ЛИО и Wistar, мыши линии CBA). Впервые показано, что исследуемые пептидные препараты особенно эффективны как антиоксиданты при старении животных. Наиболее выраженные антиоксидантные свойства были выявлены у эпиталона. На примере эпиталона показано, что эффективность антиоксидантного действия пептидных биорегуляторов еще более возрастает при воздействии на организм экстремальных факторов (гипоксия, гипокинезия).

Впервые проведено изучение антиоксидантной активности и мембранопротекторных свойств эпиталона, вилона и других коротких пептидов (везуген, пинеалон) в модельных экспериментах in vitro. Установлено, что исследуемые пептиды не обладают прямой антиоксидантной активностью, но способны защищать липопротеиновые комплексы плазмы крови от Fe2+-–индуцированного окисления и подавлять осмотический гидролиз эритроцитов.

Приоритетными являются исследования, проведенные в области изучения антигипоксических свойств коротких пептидов. Выявлена способность пинеалона и других вышеперечисленных пептидных препаратов защищать нейроны мозжечка потомства крыс, подвергнутых гипоксическому воздействию, от окислительного стресса, индуцируемого перекисью водорода или лигандом NMDA-рецепторов глутамата N-метил-D-аспартатом. Нейропротекторное действие коротких пептидов показано также
в экспериментах с использованием клеток нейробластомы человека, культивируемых в условиях гипоксии. Установлено, что эпиталон и, отчасти, вилон проявляют антигипоксический эффект, препятствуя подавлению экспрессии металлопептидаз (неприлизина и инсулин-деградирущего фермента), участвующих в катаболизме -амилоидного пептида, играющего исключительно важную роль в патогенезе весьма распространенной в пожилом и старческом возрасте болезни Альцгеймера.

Практическая ценность работы

Выявление антиоксидантной активности ряда коротких пептидов (эпиталон, вилон, кортаген, пинеалон и везуген) дает основание полагать, что она играет важную роль в механизмах геропротекторного действия этих биорегуляторов, поскольку ослабление мощности антиоксидантных систем организма является одной из ведущих причин развития возрастной патологии и преждевременного старения.

Показана возможность использования эпиталона и вилона в качестве стресспротекторных соединений при воздействии на организм таких сопутствующих старению неблагоприятных экологических факторов как гипоксия и гипокинезия.

Результаты проведенных исследований свидетельствуют о том, что ряд исследуемых коротких пептидов (пинеалон, везуген, эпиталон и вилон) обладают выраженными нейропротекторными свойствами, что проявляется в защите нервных клеток от окислительного стресса, развивающегося в результате гипоксического воздействия.  Детальное изучение нейропротекторной роли указанных соединений создает предпосылки их применения для профилактики и терапии различных нейродегенеративных заболеваний, ассоциированных с возрастом. Особенно перспективны в этом отношении трипептиды пинеалон и везуген, которые могут быть использованы как биологические добавки к пище, способствующие улучшению качества жизни и активного долголетия человека.

Основные положения, выносимые на защиту

  1. Короткие пептиды (эпиталон, кортаген, вилон, пинеалон и везуген) обладают антиоксидантными свойствами в экспериментах in vivo и in vitro.
  2. Антиоксидантные эффекты коротких пептидов (эпиталон, вилон) особенно наглядно проявляются при старении и в условиях действия на животных экстремальных факторов (гипокинезия, гипоксия).
  3. Короткие пептиды (эпиталон, вилон, везуген и, особенно, пинеалон) обладают антигипоксическим действием, что выражается в повышении устойчивости животных к гипобарической гипоксии.
  4. Пинеалон повышает активность антиоксидантных ферментов в мозгу и печени беременных самок крыс, подвергнутых воздействию гипобарической гипоксии, и обеспечивает защиту потомства от ее последствий.
  5. Короткие пептиды (пинеалон, эпиталон и вилон) при гипоксическом воздействии оказывают протекторное влияние на нейроны мозжечка крыс и клетки нейробластомы человека.

Апробация работы

Материалы исследования доложены и обсуждены на международной конференции “Free radicals and antioxidants in the development and functions of the central nervous system: from fetus to aging» (Saint-Petersburg, 2001), международной научно-практической конференции «Медико-психологическая реабилитация: современное состояние и перспективы развития» (Санкт-Петербург, 2004), международном симпозиуме «Молекулярные механизмы регуляции функции клетки» (Тюмень, 2005), Всероссийской конференции «Перспективы фундаментальной геронтологии» (Санкт-Петербург, 2005, 2006), IV национальном конгрессе геронтологов и гериатров Украины «Проблемы старения и долголетия» (Киев, 2005), 4-й, 5-й и 6-й  национальных научно-практические конференциях с международным участием «Активные формы кислорода, оксид азота» (Смоленск, 2005, 2006, 2007),  II и III Российском симпозиуме по химии и биологии пептидов (Санкт-Петербург, 2005, 2006), I Съезде физиологов СНГ (Сочи, Дагомыс, 2005), 4-й Российской конференции с международным участием «Гипоксия, механизмы, адаптация, коррекция» (Москва, 2005), научной конференции с международным участием «Нейрохимия: фундаментальные и прикладные аспекты» (Москва, 2005), региональных научных конференциях «Геронтология: от кардиологии к социально-экономическим аспектам» (Сыктывкар, 2005, 2006), Всероссийской научной конференции «Перспективные направления использования лабораторных приматов в медико-биологических целях» (Сочи–Адлер, 2006), международной научной конференции «Свободные радикалы, антиоксиданты и старение» (Астрахань, 2006), VII Всероссийской конференции с международным участием «Биоантиоксидант» (Москва, 2006), VII Международном симпозиуме «Биологические механизмы старения» (Харьков, Украина. 2006, 2007), научно-практической конференции, посвященной 20-летию первой в России кафедры гериатрии («Актуальные проблемы геронтологии и гериатрии», Санкт-Петербург, 2006), III и IV Всероссийских научно-практических конференциях "Общество, государство и медицина для пожилых и инвалидов" (Москва, 2006, 2007), Научно-практической конференции «Пожилой больной» (Москва, 2006), международной конференции 4th Bologna International Meeting “Affective, behavioral and cognitive disorders in the elderly-ABCDE”(Bologna, Italy, 2006), международной конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии» (Ялта-Гурзуф, Крым, Украина, 2007), II Международном конгрессе "Социальная адаптация, поддержка и здоровье пожилых людей в современном мире" (Санкт-Петербург, 2007), XIV Российском национальном Конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2007),  III, IV научно-практических[ геронтологических конференциях с международным участием, посвященной памяти Э.С. Пушковой, "Пушковские чтения" (Санкт-Петербург, 2007, 2008), XII Международном симпозиуме «Эколого-физиологические проблемы адаптации» (Москва, 2007), Межрегиональной научно-практической конференции «Медицинские проблемы пожилых» (Йошкар-Ола), III Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Пущино, 2007), II Международном конгрессе "Социальная адаптация, поддержка и здоровье пожилых людей  в современном мире" (Санкт-Петербург, 2007), II-м Санкт-Петербургском  международном экологическом форуме (Санкт-Петербург, 2008), конференции с международным участием «Нейрохимические механизмы формирования адаптивных и патологических состояний мозга» (Санкт-Петербург-Колтуши,2008), Конгрессе «Экотоксины и здоровье» (Санкт-Петербург, 2008), а  также международных форумах: International conference “Free radicals and antioxidants in the development and functions of the central nervous system: from fetus to aging» (Saint-Petersburg, 2001), 18th World Congress of Gerontology (Rio de Janeiro, Brazil, 2005), International Symposium «Interaction of the nervous and immune systems in health and disease» (Saint-Petersburg, 2007), 21st Biennial Meeting of International Society for Neurochemistry and the 38th Annual Meeting of the American Society for Neurochemistry (Cancun, Mexico, 2007), 4th International Peptide Symposium, 7th  Australian Peptide Symposium, 2nd Asia-Pacific International Peptide Symposium “Discovery to Drugs: The Peptide Pipeline” (Cairns, Queensland, Australia), VI European Congress International association of gerontology and geriatrics (Saint-Petersburg, 2007).

Реализация результатов исследования

Результаты исследований используются в научной и практической деятельности Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН, Научного центра неврологии РАМН (Москва), ГУН «НИИ онкологии им. проф. Н.Н. Петрова» ФАЗСР РФ, ГУ «НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта» РАМН, Южно-Федерального Университета, (Ростов-на Дону), Института молекулярной и клеточной биологии Университета (Лидс, Великобритания).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 72 работы, 19 статей в журналах и в сборниках научных трудов (из них 9 в журналах, включенных в перечень ВАК Минобрнауки РФ), 1 монография,  52 тезиса докладов.

Связь с научно-исследовательской работой Института

Диссертационная работа является научной темой, выполняемой по основному плану НИР Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН.

Структура  и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, 2 глав обзора литературы, главы описания материалов и методов исследования, 3 глав результатов собственных исследований, главы обсуждения результатов, заключения, выводов, практических рекомендаций и указателя литературы. Текст диссертации изложен на 252 страницах, содержит 21 таблицу и иллюстрирован 36 рисунками. Указатель литературы содержит 360 источника, из которых отечественных - 113, зарубежных -247.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Экспериментальные животные и исследуемые препараты

Исследование процессов СРО и антиоксидантной активности пептидных биорегуляторов проводилось в экспериментах in vivo и in vitro.  Эксперименты были поставлены на молодых (3мес) и старых (24 мес) крысах линии ЛИО, а также половозрелых крысах линий Wistar (6 мес) и мышах линии CBA (18 мес). Животных содержали в пластмассовых клетках, они получали стандартный в условиях вивария корм и воду без ограничений.

В качестве пептидных препаратов были использованы синтетические короткие пептиды эпиталон (Ala-Glu-Asp-Gly), кортаген (Ala-Glu-Asp-Pro), вилон (Lys-Glu), везуген (Lys-Glu-Asp) и пинеалон (Glu-Asp-Arg). В экспериментах in vivo пептидные препараты вводили в течение 5 дней внутрибрюшинно в дозе 2,5 – 10 мкг/кг массы (эпиталон, вилон, кортаген, везуген и пинеалон). Дозы и интервалы времени применения препаратов соответствовали тем, что были отработаны ранее [Малинин В.В., 2001].

Экспериментальные модели стрессовых воздействий

В качестве экспериментальных моделей стресса были выбраны гипокинезия и гипобарическая гипоксия:

1. Гипокинезию у крыс модулировали путем помещения их в тесные пластиковые пеналы из оргстекла, добиваясь резкого ограничения движения животных [Федоров И.В., 1987; Лысенко А.В. и соавт., 2001].

2. Модель острой гипобарической гипоксии вызывали, помещая крыс в барокамеру проточно-вытяжного типа при атмосферном давлении 0,029 МПа, что соответствует подъему на высоту 9000 м над уровнем моря [Вальдман А.В. и соавт., 1989]. В барокамеру были вмонтированы поглотители углекислоты и влаги. Животные находились в ней в условиях свободного наблюдения в течение 3 ч. под постоянным наблюдением. Затем крыс декапитировали, брали кровь, извлекали мозг и выделяли на льду кору головного мозга.
В отдельных сериях экспериментов использовали модель острой сублетальной гипобарической гипоксии, модулируя ее в барокамере с регулируемым протоком воздуха для предотвращения развития гиперкапнии [Boldyrev A.A. et al., 1997]. С помощью вакуумного насоса давление в барокамере снижали за 1 мин. до конечного значения 0,125 атм.; в таких условиях животных выдерживали до остановки дыхания, после чего возвращали в условия нормального давления, постепенно подавая в камеру атмосферный воздух. Эта же модель использовалась нами для исследования потомства беременных самок крыс, подвергнутых гипоксическому воздействию пренатальной гипоксии (пренатальная гипоксия). В этих опытах крысы были подвергнуты гипобарической гипоксии на 10- й день беременности – в срок, при котором у потомства происходит закладка нервной системы [Федорова Т.Н. и др., 2006].

Физиологические методы исследования.

Разделение экспериментальных животных на группы устойчивых и чувствительных к гипоксии проводили в условиях стандартной методики открытого поля [Буреш Л. и соавт., 1991; Вербицкий Е.В., 2003]. Регистрировали частоту вертикальных и горизонтальных локомоций, груминга, болюсов, выходов в центр открытого поля, что отражало физиологическую активность подопытных животных.

При оценке гипоксического воздействия регистрировали следующие параметры:

  1. время потери дыхания "на высоте" (сек);
  2. время восстановления позы (сек), то есть период времени от остановки дыхания до момента, когда  животное после "спуска с высоты" и восстановления дыхания в условиях нормобарии принимало нормальную позу;
  3. время реституции (сек), которое составляло общую продолжительность периода восстановления физиологической активности после гипоксического воздействия.

Для определения эффективности защитного действия исследуемых пептидов использовали такие параметры, как смертность, необходимость применения процедуры искусственного дыхания, «коэффициент реституции», выражающий отношение продолжительности времени реституции к времени до остановки дыхания в барокамере.

Биофизические и биохимические методы исследования.

Интенсивность ПОЛ оценивали по количеству малонового диацетальдегида – МДА (ТБК-активных продуктов), диеновых конъюгатов (ДК) и шиффовых оснований (ШО), а также показателям Н2О2-индуцируемой люминолзависимой или Fe2+- индуцируемой хемилюминесценции (ХЛ), которую измеряли на хемилюминометрах Emilitte -1105 (Россия) и LKB-1251 (Швеция). В хемилюминометрических исследованиях регистрировали светосумму и высоту вспышки ХЛ, величина которых определяет интенсивность свободнорадикальных реакций и расходования свободных радикалов вследствие их взаимодействия с природными антиоксидантами, содержащимися в биосубстрате [Арутюнян А.В и соавт., 2000]. МДА определяли спектрофотометрически по интенсивности окраски образующегося в реакции с тиобарбитуровой кислотой триметинового комплекса с максимумом поглощения при 535 нм [Гаврилов В.Б. и соавт., 1987]. Для экстракции ДК из сыворотки крови использовали смесь изопропилового спирта и гептана (1:1), содержащую бутилированный гидрокситолуол (0,5 г в 100 мл смеси), концентрацию ДК определяли спектрофотометрически при 232 нм в гептановой фазе [Dillard C.J., Tappel A.L., 1989]. ШО определяли по флюоресценции с максимумом возбуждения при 370 нм и максимумом излучения при 450 нм [Арутюнян А.В и соавт., 2000].





Уровень окислительной модификации белков оценивали по содержанию карбонильных производных аминокислот в белках. В основе метода лежит взаимодействие белков, полученных после осаждения трихлоруксусной кислотой и обработки осадка смесью этилового спирта и этилацетата (1:1) с 2,4 – дифенилгидразином. Карбонильные производные после растворения белкового осадка в 8 М мочевине при 37о С.определяли при 363 нм, используя коэффициент молярной экстинкции 22х103 М-1см [Levine R.L. at al., 1981; Арутюнян А.В. и др., 2000].

Активность системы антиоксидантной защиты оценивали, определяя уровень общей антиокислительной активности (ОАА) и активность антиоксидантных ферментов супероксиддисмутазы (СОД) и глутатионпероксидазы (ГП). Для определения ОАА использовали хемилюминесцентную реакцию рибофлавина с перекисью водорода в присутствии двухвалентного железа, измеряя светосумму в течение 2 мин. при 37о С. [Арутюнян А.В. и др., 2000]. ОАА выражали в условных единицах на мг белка, рассчитывая ее по формуле:

ОАА= (1-ССоп./ССк.) /А, где ССоп. – величина светосуммы опытного образца; ССк  - величина светосуммы конторольной пробы; А – содержание белка в реакционной смеси, который определяли методом [Lowry O.H. et al., 1951]. Активность Cu,Zn – супероксиддисмутазы определяли с использованием системы, обеспечивающей восстановление нитросинего тетразолия, а активность глутатионпероксидазы с использованием гидроперекиси третичного бутила и восстановленного глутатиона [Арутюнян А.В. и др., 2000]. Определение содержания церулоплазмина основано на его оксидазной активности в реакции окисления пара-фенилендиамина [Камышников В.С., 2000].

О состоянии эритроцитарных и лейкоцитарных мембран судили по количеству внеэритроцитарного гемоглобина [Меньшиков В.В. и соавт., 1987], который определяли с помощью тест-набора производства «Olvex Diagnosticum» (Санкт-Петербург) и суммарной пероксидазной активности [Внуков В.В., 1979]. Мембрано-стабилизирующее действие пептидных соединений в опытах in vitro исследовали на модели осмотического гемолиза эритроцитов крови крыс или здоровых доноров [Pribush A. еt al., 2002].

В отдельной серии экспериментов оценивали прямую антиоксидантную активность исследуемых пептидных биорегуляторов по их  способности восстанавливать стабильный радикал 1,1-дифенил-2-пикрилгидразил (ДФПГ), измеряя скорость убыли ДФПГ – радикалов спектрофотометрически при 519 нм [Brasnod-Williams W. еt al., 1995; Schlesier K. еt al., 2002].

Выделение субклеточных фракций проводили методом дифференциального центрифугирования в градиенте плотности сахарозы [de Robertis E., 1971] на рефрижераторной центрифуге К-24.

Молекулярно-биологические методы исследования.

1. Культура клеток мозжечка крыс.

Действие пептидных препаратов на образование активных форм кислорода (АФК) гранулярными клетками мозжечка крыс исследовали методом проточной цитометрии [Boldyrev A.A. et al., 1997; Болдырев А.А., 2000]. Использовали первичную культуру нейронов, выделенную из мозжечка 9-дневных крыс линии Wistar. Клетки получали путем обработки измельченного мозжечка в растворе Тироде с 0,2% диспазой –коллагеназой  для разрушения межклеточных контактов (30 мин при 33С) с последующим отмыванием кусочков ткани, их взмучиванием и фильтрованием полученной суспензии через тефлоновый фильтр с размером пор 50 мкм. Полученная суспензия содержала около 2 млн клеток в 1 мл. Цитометрический анализ проводили на приборе FacStar (“Becton Dickinson”, США), исследуя популяцию NMDA-чувствительных клеток, которую выделяли гейтом, соответствующим размеру гранулярных клеток (около 10 мк). Полученные результаты анализировали с помощью компьютерной программы WinMDI 2.7.

Исходные вещества (эпиталон, вилон, везуген и пинеалон) в концентрации 10 мМ были растворены в буфере  HEPES (10 мМ, рН 7,4), карнозин и N-ацетилцистеин (NАС) растворяли в воде и доводили рН до 7,4. Все вещества использовали в конечной концентрации 1 мM, добавляя их к клеткам непосредственно после выделения. После 120 мин. преинкубации клетки нагружали в течение 40 мин при 37С флуоресцентным красителем DCFH2DA в конечной концентрации 0,1 мМ для определения АФК. Затем клетки стимулировали H2O2  (10 мМ) в течение 30 мин. при 37С. За 1 мин до измерения флуоресценции к суспензии клеток добавляли пропидий иодид в конечной концентрации 10 мкг/мл для оценки доли нежизнеспособных

2. Клетки нейробластомы человека.

Клетки нейробластомы NB7 культивировали в стандартной среде RPMI-1640 (Sigma, Англия), содержавшей 10% эмбриональной сыворотки телят, 5% пенициллина/стрептомицина и 5% L-глутамина. Клетки выращивали в 30 мл среды во флаконах с площадью 175 см2 при 370C в 5% (по объему) СО2 до достижения ими 70% конфлюэнтности, после чего культуральную среду заменяли на среду, не содержащую сыворотку, в которую добавляли тестируемые компоненты (вилон и эпиталон добавляли до конечной концентрации 50 нМ, или антиоксидант экстракта зеленого чая эпигаллокатехин-3-галлат – до концентрации 50 мкг/мл). К контрольным образцам добавляли такое же количество фосфатного буфера (20 мМ, рН 7.4). После добавления среды клетки содержали или в стандартных условиях, как описано выше, или при пониженном содержании кислорода. Для создания гипоксии использовали О2/СО2 инкубатор  (MC0-175M, Sanyo, Япония), в котором содержание кислорода поддерживалось на уровне 1% при помощи замещения его азотом. Содержание СО2, влажность  и температура в инкубаторе, поддерживались на стандартном уровне - 370C,  5% (по объему) СО2.

Выделение РНК из культивируемых клеток с использованием набора реагентов (Mini-prep RNeasy purification kit, Qiagen Sussex, Англия) и полимеразную цепную реакцию полученных препаратов РНК  с применением набора TITANIUM (One-Step RT-PCR Kit, BD Biosciences, Англия) проводили согласно протоколу производителя

Все эксперименты с клетками повторялись 3 раза, а анализ мРНК осуществлялся
3-5 раз в зависимости от воспроизводимости результатов. Все количественные параметры стандартизировали по мРНК актина.

Полученные в экспериментах результаты подвергали статистической обработке с помощью компьютерной программы STATISTICA 5.0 (Statsoft). Использовали методы параметрической и непараметрической статистики: t- критерий Стьюдента, U-критерий Манна-Уитни, корреляционный тест Спирмена и регрессионный анализ. Статистическую обработку проводили, используя пакет программ ”BIOSTAT” (Гланц С., 1999).

Лабораторная база для проведения исследований была предоставлена кафедрой биохимии МГУ им. М. В. Ломоносова, Научным центром неврологии РАМН, НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта РАМН и лабораторией протеолиза Института молекулярной и клеточной биологии Университета г. Лидс, Великобритания.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Возрастная динамика ряда показателей свободнорадикального окисления

и антиоксидантной системы

Литературные данные о динамике процесса генерации АФК при старении носят противоречивый характер. Многие авторы считают твердо установленным фактом, что продукция АФК при старении возрастает, и связывают это с окислительным повреждением митохондриальных мембран и нарушением функционирования электрон-транспортной цепи митохондрий [Скулачев В.П., 1997; Ozawa T.,1997; Allen R.G., Nresini M., 2000]. При старении усиливается образование промежуточного продукта восстановления коэнзима Q (убихинона), способного неферментативным путем передавать (сбрасывать) электроны на молекулярный кислород с образованием супероксидного радикала. По мнению других авторов, при старении образование АФК уменьшается вследствие общего снижения интенсивности окислительно-восстановительных процессов (окислительного метаболизма). Одновременно наблюдается снижение активности СОД и других компонентов антиоксидантной защиты, по крайней мере при отсутствии выраженной возрастной патологии [Кольтовер В.К., 1998; 2000, 2005, 2007].

В ряде работ описано снижение общей антиокислительной активности у мышей при старении, причем оно происходит с неодинаковой интенсивностью у животных разных линий [Эммануэль Н..М, 1982]. Показано также, что старые крысы и черви нематоды утрачивают способность к индукции СОД и других антиоксидантных ферментов при гипероксии и становятся более чувствительными к токсическому действию кислорода [Darr D., Fridovich I., 1995; Гусев В.А., Панченко Л.Ф.,1997].

Представление о снижении уровня генерации АФК и активности антиоксидантой системы в процессе старения нашло подтверждение в наших исследованиях. Согласно полученным нами данным, уровень АФК снижается в сыворотке старых крыс по сравнению с молодыми почти на 50%, а в печени более чем в 5 раз. При этом не наблюдается заметных изменений в уровне содержания продуктов ПОЛ, однако достоверно (р<0,05) возрастает уровень содержания белковых карбонилов (1, 86 мкмоль и 5 мкмоль/мг белка в сыворотке крови и 1,53 и 2,39 мкмоль/мг белка в сыворотке крови и печени молодых и старых крыс соответственно). Полученные нами результаты полностью соответствуют литературным данным о большей чувствительности белковых молекул к окислительному повреждению, по сравнению с липидами при старении [Pacifici R.E., Davies K.J,A., 1991; Хавинсон и соавт., 2003; Дубинина Е.Е., 2006]. В наших экспериментах было установлено, что снижение уровня генерации АФК у старых крыс сопровождается  подавлением активности СОД, что наиболее наглядно проявляется в печени, отличающейся наиболее высоким содержанием этого фермента [Tian L. et al.,1998]. Активность СОД в печени молодых крыс составляла 116,0 ±8,5отн.ед., тогда как у старых 48,3 ±6,4 отн. ед.(р<0,001). В мозгу исследуемые показатели не претерпевают заметных возрастных изменений, за исключением СОД, активность которой у старых животных несколько понижается. Эти данные также согласуются с литературными сведениями о сопряженном и однонаправленном характере изменений уровня генерации АФК и показателей системы антиоксидантной защиты при старении [Кольтовер В.К., 1998; 2000, 2005, 2007].

Влияние геропротекторных пептидных препаратов на показатели свободнорадикального окисления и антиоксидантной системы.

       Многочисленные исследования, проведенные в 70-е – 90-е годы прошлого столетия, показали, что комплексный препарат эпифиза эпиталамин обладает выраженным геропротекторным действием и стимулирует функциональную активность репродуктивной, иммунной и эндокринной систем организма [Анисимов В.Н., 1973; Anisimov V. et al., 1982, 1994; Лабунец И.Ф., Бутенко Г.М.,1992; Кузник Б.И. и др..,1998; Хавинсон В.Х. и др., 1998]. Вместе с этим было установлено, что эпиталамин проявляет антиоксидантные свойства в экспериментах in vivo и in vitro [Анисимов В.Н и др. 1995, 1996, 1997; Дятлов Р.В. и др., 1997; Мыльников С.В. и др., 2000].

       Выполненные нами эксперименты посвящены изучению антиоксидантного действия тетрапептида эпиталона, сконструированного на основе исследования аминокислотного состава эпиталамина, а также некоторых других коротких пептидов, оказывающих сходные с эпиталоном биологические эффекты (кортаген, вилон) и играющих важную роль в пептидергической регуляции гомеостаза.

Было проведено сравнительное изучение влияния эпиталона и кортагена на процессы свободнорадикального окисления (СРО) в сыворотке крови и мозге половозрелых крыс (Wistar). Характерно, что в мозге эпиталон оказывал более выраженное по сравнению с кортагеном ингибирующее действие на процесс ПОЛ, вызывая достоверные изменения в содержании как начальных (ДК) и так и конечных (ШО) продуктов ПОЛ. Под влиянием кортагена статистически достоверно снижалось содержание ДК, тогда как в отношении ШО наблюдалась лишь тенденция к их снижению. В сыворотке крови отмечается избирательное влияние обоих пептидов на начальные этапы ПОЛ, что выражалось в статистически достоверном снижении уровня ДК и некоторой тенденцией к уменьшению содержания ШО. Полученные данные свидетельствуют также о том, что исследуемые пептиды ингибируют наряду с ПОЛ также и процесс окислительной модификации белков (ОМБ), причем наиболее наглядно это проявляется в ткани мозга. В сыворотке крови некоторое снижение интенсивности ОМБ (около 15%) наблюдалось только под влиянием кортагена. Можно полагать, что в этих условиях ШО образуются не только путем последующего превращения ДК, но и при взаимодействии бифункциональных продуктов ПОЛ типа малонового диацетальдегида с различными соединениями, содержащими свободные аминогруппы, прежде всего аминокислотными остатками белков, что приводит к их окислительной модификации с образованием карбонильных групп [Дубинина Е.Е., 2006].

При изучении влияния исследуемых пептидов на антиоксидантную активность было установлено, что кортаген вызывал подавление ОАА в сыворотке крови, а эпиталон как в сыворотке крови, так и в головном мозге. Снижение ОАА сопровождалось ингибированием активности антиоксидантных ферментов: под влиянием эпиталона и кортагена подавлялась активность глутатионпероксидазы мозга, а введение животным кортагена вызывало статистически достоверное понижение активности СОД в сыворотке крови; активность фермента в мозгу, так же как и под влиянием эпиталона при этом не изменялась. Структурное сходство эпиталона и кортагена обуславливает их аналогичные эффекты в отношении большинства изученных нами показателей свободнорадикального окисления.

Полученные данные позволяют полагать, что действие эпиталона и кортагена может быть связано с подавлением образования продуктов ПОЛ и ОМБ и компенсаторным снижением антиокислительной активности. Ранее было установлено, что антиоксидантное действие полипептидного препарата эпифиза эпиталамина проявляется в повышении активности антиоксидантных ферментов [Arutjunyan A.V. et al., 2001; Козина Л.С., Арутюнян А.В., 2007]. Приведенные выше результаты об отсутствии изменений в активности ферментативного звена антиоксидантной защиты под влиянием исследуемых пептидов свидетельствуют об отличии механизмов антиоксидантного действия эпиталона и кортагена от эпиталамина.

Антиоксидантное действие эпиталона особенно наглядно проявлялось в экспериментах на старых животных (крысы, мыши). Эпиталон в сыворотке крови старых крыс оказывал выраженное ингибирующее влияние на ПОЛ, заметно снижая уровень ДК, и вызывал при этом некоторое подавление процесса ОМБ. При этом у них отсутствовали сдвиги в активности антиоксидантных ферментов и антиокислительной активности в целом.
В головном мозгу старых крыс под влиянием эпиталона также наблюдалось подавление образования продуктов ПОЛ и уровня ОМБ. Вместе с тем, при отсутствии изменений в активности ГП при введении эпиталона отмечалось отчетливое повышение активности СОД (43,5±7,6 по сравнению с 24,8±2,8 отн.ед./мг белка в контроле).

       В экспериментах, поставленных на. мышах линии СВА, проведено сравнительное изучение влияния эпиталона и вилона на свободнорадикальные процессы. Наиболее отчетливое антиоксидантное действие было выявлено у эпиталона; на фоне повышенного уровня образования АФК в сыворотке крови оно было сопоставимо по величине с ингибирующим действием мелатонина, являющимся эффективным природным антиоксидантом, вырабатываемым эпифизом. Наряду с этим, под влиянием эпиталона и мелатонина наблюдалось заметное повышение ОАА. Эпиталон, также как и мелатонин, проявлял тенденцию к уменьшению образования АФК в головном мозгу и при этом значительно повышал ОАА. Вилон не действовал на уровень образования АФК в сыворотке крови, печени и ткани головного мозга. Эпиталон не оказывал заметного влияния на образование АФК и уровень ОАА в печени, не влиял на интенсивность ПОЛ в сыворотке крови, но был эффективен качестве ингибитора ПОЛ в головном мозгу и печени мышей. Применение вилона ни в одном случаев не вызывало статистически достоверных изменений в уровне содержания продуктов ПОЛ и показателей антиоксидантной системы. Мелатонин же всегда вызывал ингибирование процесса ПОЛ. Под влиянием исследуемых пептидов, а также мелатонина не было выявлено каких-либо изменений в активности СОД, хотя при определении ОАА наблюдалось ее повышение в сыворотке крови и головном мозгу при хроническом воздействии на мышей эпиталона и мелатонина.

       Таким образом, введение эпиталона, в отличие от вилона, приводит к заметному снижению интенсивности свободнорадикальных процессов в крови и тканях мышей CBA. Преимущественное влияние эпиталона на начальные этапы ПОЛ (уровень ДК) в печени и сыворотке крови и, напротив, его терминальную стадию (уровень ШО)  в головном мозгу может быть обусловлено влиянием тетрапептида на процесс взаимодействия образующихся из ДК бифункциональных продуктов ПОЛ типа малонового диацетальдегида с низко- или высокомолекулярными соединениями, содержащими свободные аминогруппы (фосфатидилсерин и фосфатидилэтаноламин, нуклеотиды и прежде всего аминокислоты, пептиды и белки).

Влияние геропротекторных пептидных препаратов

на показатели свободнорадикального окисления и антиоксидантной системы
в условиях действия экстремальных факторов (гипокинезия, гипоксия).

Гипокинезия вследствие ограничения общей двигательной активности является фактором, способствующим преждевременному старению и одним из основных симптомов ассоциированных с возрастом нейродегенеративных заболеваний, в частности паркинсонизма [Charlton C., Crowell B., 1995].

Результаты проведенных нами исследований показали, что 24-часовая гипокинезия вызывала у крыс прирост светосуммы ХЛ плазмы крови с одновременным достоверным увеличением суммарной пероксидазной активности крови, что указывает на начальные стадии активации ПОЛ. В коре головного мозга при этом показатели ХЛ снижались, что, вероятно, свидетельствует о достаточной мощности антиоксидантных систем мозга на данном этапе этого довольно сильного стрессорного воздействия. Вместе с тем, гипокинезия приводила к интенсификации ПОЛ мозгу, о чем можно судить по увеличению содержания малонового диацетальдегида (МДА).

Предварительное введение крысам перед началом сеанса гипокинезии эпиталона, приводило к достоверному снижению показателей ХЛ и суммарной пероксидазной активности (СПА) в плазме крови. При этом наблюдалось некоторое снижение уровня внеэритроцитарного гемоглобина и заметное повышение содержания церулоплазмина, а также активности СОД в гемолизате эритроцитов. Наряду с этим, при введении эпиталона наблюдалось снижение СПА, уровня содержания МДА, показателей ХЛ и повышение  активности СОД в растворимой фракции коры головного мозга, по сравнению с показателями при стрессе.

       Церулоплазмин является одним из важнейших компонентов антиоксидантной системы крови, который, помимо окисления Fe2+,обладает супероксиддисмутазной активностью и способностью нейтрализовать наиболее реакционноспособные гидроксильные радикалы [Погосян Г.Г., Налбандян Р.М., 1983; Бобырев В.Н. и соавт., 1994; Atanasiu et al., 1998].

Предварительное введение крысам вилона приводило к сходным по направленности действия, но гораздо менее выраженным по сравнению с эпиталоном, изменениям в регуляции свободнорадикальных процессов при гипокинезии. Он был менее эффективен в отношении показателей ХЛ в плазме крови и коре мозга, несколько повышал уровень внеэритроцитарного гемоглобина, почти не влиял на активность СОД в гемолизате эритроцитов и коре головного мозга. При этом он также как эпиталон снижал уровень СПА и МДА в коре головного мозга и повышал активность церулоплазмина в плазме крови.

В следующей серии экспериментов нами было исследовано влияние гипоксии на интенсивность свободнорадикальных процессов крови и коре мозга половозрелых крыс. Гипоксия включает в себя весь комплекс процессов в организме, обусловленных кислородной недостаточностью. Она является неотъемлемым элементом стрессорного действия гипокинезии, физического перенапряжения и служит одной из важных причин развития возрастной патологии (атеросклероз, ишемические поражения сердца и мозга, болезнь Альцгеймера и т.д.) [Лысенко А.В. и соавт., 2005].

Проведенными нами исследованиями установлено, что в условиях гипоксии в плазме крови и коре головного мозга показатели ХЛ, за исключением величины светосуммы ХЛ в мозгу, заметно возрастали, при этом уровень содержания МДА в мозгу почти не изменялся. Не претерпевал также достоверных изменений уровень СПА в плазме крови и мозгу при гипоксии. Введение эпиталона перед сеансом гипоксии способствовало нормализации показателей ХЛ в плазме крови и коре мозга и несколько снижало уровень содержания МДА в мозгу, что было статистически достоверно по отношению к интактным животным. Под влиянием эпиталона происходило также снижение уровня СПА как в плазме крови, так и коре мозга крыс, подвергнутых воздействию гипоксии.

Предварительное введение вилона подопытным животным вызывало аналогичные, но менее наглядные, по сравнению с эпиталоном, изменения исследуемых показателей свободнорадикального окисления.

Таким образом, представленные результаты свидетельствуют о том, что антиоксидантные и мембраностабилизирующие свойства вилона при воздействии гипокинезии и гипоксии проявлялись гораздо слабее, чем у эпиталона. Известно, что при воздействии стрессорных факторов на организм происходит активация функции эпифиза, что можно отнести к защитным антистрессовым механизмам, поскольку вырабатываемый им мелатонин, будучи мощным эндогенным антиоксидантом, обладает разнообразными нейропротекторными свойствами [Хавинсон В.Х. и соавт., 2003]. В связи с этим полученные нами данные об антиоксидантных эффектах эпиталона представляют значительный интерес, поскольку предполагают, что при острой гипоксии в антистрессовой защите нервной системы и всего организма участвуют также пептиды эпифиза [Заморский Н.И., Пишак В.П., 2000].

Оценка антиоксидантной активности и мембранопротекторных свойств коротких пептидов в модельных экспериментах in vitro.

Исследование прямой антиоксидантной активности коротких пептидов

       Результаты анализа антирадикальной активности исследуемых коротких пептидов (эпиталон, вилон, везуген и пинеалон) показали, что ни одно из исследуемых, соединений в диапазоне концентраций 0,5 – 1 мМ, за исключением эпиталона, не обладает способностью взаимодействовать с ДФПГ-радикалом. Между тем N – ацетилцистеин (NАС) уменьшает оптическую плотность проб, содержащих ДФПГ, проявляя сильное антиоксидантное действие уже в концентрации 0,25 мМ. Карнозин в этой системе выступает как слабый антиоксидант. Действие эпиталона проявляется еще слабее, по сравнению с карнозином. Везуген и пинеалон даже несколько увеличивают оптическую плотность проб, что может служить косвенным указанием на возможность их взаимодействия с ДФПГ с образованием промежуточных продуктов. Условно эта способность, наиболее заметная в случае везугена, может быть названа «прооксидантной», природа которой остается неизвестной.

Действие коротких пептидов на Fe2+-индуцированное окисление липопротеинов крови и скорость осмотического гемолиза эритроцитов

Внесение FeSO4 в кювету, содержащую фракцию липопротеинов, инициирует быструю вспышку хемилюминесценции (ХЛ), пропорциональную количеству предобразованных гидроперекисей липидов (h), ее величина уменьшается в присутствии антиоксидантов, способных взаимодействовать с гидроперекисями (Рис. 1). Последующая лаг-фаза (τ) характеризует собственный антиоксидантный потенциал системы (АОП), который исчерпывается по мере превращения двухвалентного железа в трехвалентное. После истощения собственного АОП вспыхивает волна хемилюминесценции, и скорость этого процесса отражает скорость окисления липидного материала [Vladimirov Yu., 1991]. Величина латентного периода τ тем больше, чем выше АОП системы. При этом, как правило, более высокий АОП коррелирует с более низкой скоростью окисления [Федорова Т.Н. и др., 1996].

Рис. 1. Кинетическая кривая, характеризующая Fe2+-индуцированную хемилюминесценцию липопротеинов сыворотки крови

Как было определено нами в специальных экспериментах, сами исследуемые вещества не подвергаются окислению в данных условиях, так что изменения, наблюдаемые в их присутствии, отражают их прямое действие на окисление липидного материала. Из приведенных в табл. 1 данных видно, что исследуемые соединения в разной степени влияют на окисляемость липопротеинов.

Таблица 1.

Влияние исследуемых соединений на параметры Fe2+-индуцированной хемилюминесценции липопротеинов сыворотки крови здоровых доноров

(в процентах по отношению к контролю)

Название

вещества

Концентрация

вещества

в пробе

Параметры Fe2+-индуцированной ХЛ

h, %

, %

Н, %

Скорость

окисления, %

Карнозин

0,5 мМ

53±6

133±8

94±6

75±10

1 мМ

40±5

189±9

88±8

66±8

Вилон

0,5 мМ

66±6

93±10

92±7

86±6

1 мМ

43±4

120±11

87±6

78±6

Эпиталон

0,5 мМ

69±6

116±9

94±6

83±7

1 мМ

49±4

120±10

97±8

77±5

Везуген

0,5 мМ

54±4

100±8

94±5

92±6

1 мМ

50±6

100±8

104±11

75±5

Пинеалон

0,5 мМ

54±4

105±10

94±9

81±5

1 мМ

50±6

111±12,0

88±8,5

75±7

Эффект вилона и эпиталона несколько слабее эффекта карнозина, а везуген лишь незначительно снижает скорость окисления, практически не влияя на величину τ. В то же время, все исследованные соединения способны эффективно связывать гидроперекиси липидов дозо-зависимым способом, что отражается в снижении величины h. Полученные результаты указывают на способность исследуемых соединений препятствовать окислительному повреждению липидов. С учетом того, что исследуемые соединения не проявляют способности нейтрализовать радикальные молекулы, их эффект можно объяснить стабилизирующим влиянием на структуру липопротеинов. Эти данные указывают на то, что короткие пептиды способны осуществлять защиту надмолекулярных комплексов не по принципу антиоксидантного действия, а за счет их структурных перестроек.

Таблица 2.

Сравнение действия исследуемых соединений

на уровень АФК в нейронах крыс

Используемое соединение

Флуоресценция DCFH2DA, отн. ед.

Флуоресценция DCFH2DA, % по отношению

к контролю

Количество мертвых клеток, %

-H2O2

+H2O2

-H2O2

+H2O2

-H2O2

+Н2O2

Контроль

(без добавок)

21,6±2,0

158,7±14,6

100

100

9,6

15,0

Карнозин,

1 мМ

23,2±1,9

105,3±8,9*

108

66

4,3

6,5

NAC,

1 мМ

21,9±3,1

127,6±5,1

101

80

5,5

15,2

Вилон,

1 мМ

34,9±3,0*

134,5±9,1

161

84

6,4

10,2

Эпиталон,

1 мМ

144,0±9,8**

131,1±12,5

666

83

10,9

5,5

Везуген,

1 мМ

41,5±4,1*

221,7±12,5*

192

140

6,0

2,4

Пинеалон,

1 мМ

54,2±3,9*

108,6±3,0

250

68

6,5

3,1

Примечание:  *р<0,005; **р<0,001 по сравнению с контролем.

Исследуемые соединения по-разному влияли на течение осмотического гемолиза эритроцитов крыс. NAC не оказывал влияния на осмотический гемолиз, что закономерно, поскольку в развитие осмотической неустойчивости мембран свободнорадикальные процессы не вовлекаются. Карнозин понижал скорость гемолиза на 35-40% уже в концентрации 0,4 мМ, что объясняется его мембранопротекторными свойствами. Все исследованные короткие пептиды проявляли двойной эффект: при концентрациях 1–2 мМ они несколько увеличивали скорость гемолиза эритроцитов крысы, а при повышении концентрации стимулирующий эффект сменялся подавлением процесса гемолиза. Сходные эффекты исследуемых соединений наблюдались и на эритроцитах человека – при концентрации, равной 3,0 мМ, исследуемые соединения повышали скорость гемолиза (особенно выраженным - в 2,5 раза по сравнению с контролем - было действие эпиталона), тогда как повышение концентрации до 5,0 мМ вызывало противоположное действие - возрастание устойчивости эритроцитов к осмотическому гемолизу. Полученные результаты указывают на проявление исследуемыми соединениями мембранопротекторных свойств, не связанных с прямой антиоксидантной активностью.

Действие коротких пептидов на нейрональные клетки мозжечка

Использование метода проточной цитометрии позволило оценить влияние исследуемых соединений на состояние гранулярных клеток мозжечка крыс и генерацию ими активных форм кислорода в условиях окислительного стресса, вызываемого перекисью водорода. Действие коротких пептидов в условиях индукции АФК проявляется различным образом (табл. 2).  Прединкубация клеток с 10 мМ H2O2 в течение 190 мин вызывала увеличение внутриклеточного уровня АФК в 7 раз. В присутствии карнозина увеличение уровня АФК происходило гораздо слабее (только в 4 раза), что указывает на то, что карнозин выступает как антиоксидант прямого действия, препятствуя накоплению АФК. NAC в этой же концентрации был гораздо менее эффективен, чем карнозин. Вилон сам по себе вызывал увеличение внутриклеточного уровня АФК (в 1,6 раз по сравнению с контролем). На этом фоне, тем не менее, наблюдалось некоторое ограничение роста АФК под действием H2O2 (на 16%). Эпиталон вызывал наиболее значительное увеличение внутриклеточного уровня АФК, сравнимое с тем, что достигается перекисью водорода (в 6,6 раз по сравнению с контролем), но при этом не влиял на гибель нейронов (Рис.2). Добавление 10 мМ H2O2 на этом фоне не приводило к дополнительному росту АФК. Везуген увеличивал исходный уровень АФК в 2 раза, и на его фоне происходило дальнейшее увеличение уровня АФК в ответ на преинкубацию с 10 мМ H2O2 (в 1,4 раза). Пинеалон увеличивал исходный уровень АФК в 2,5 раза, на его фоне происходило дальнейшее увеличение уровня АФК в ответ на преинкубацию с 10 мМ H2O2 (в 2 раза), однако достигаемое значение было ниже контрольного (на 32%).

Таким образом, исследуемые короткие пептиды увеличивали продукцию АФК
в клетках. На этом фоне эффективность индукции АФК перекисью водорода снижалась пинеалоном на 32%, вилоном и эпиталоном - на 20%. Везуген увеличивал индуцированный перекисью водорода уровень АФК на 40%. Приведенные данные согласуются с описанными нами ранее результатами экспериментов с ДФПГ о наличии «прооксидантной составляющей» в механизме действия исследуемых пептидов на нейрональные клетки.

               

       Контроль

       

        Вилон                                                Эпиталон

       

       Везуген                                                Пинеалон

Рис.2 Влияние коротких пептидов на гибель нейронов мозжечка крыс

Примечание: живые клетки располагаются в нижнем левом квадранте,
мертвые – в  верхнем левом квадранте.

Действие перекиси водорода на фоне вилона, везугена и пинеалона сопровождалось уменьшением количества нейронов в анализируемом гейте на 40-50%, причем доля мертвых клеток в исследуемой популяции снижалась (Рис. 2). Полученные результаты позволяют предположить, что регуляторные пептиды способны вовлекаться в механизм регуляции процессов апоптоза/некроза нейронов головного мозга в условиях индуцированного перекисного окисления липидов. При этом можно ожидать, что в условиях in vivo их эффективные концентрации при направленном действии на мозг могут быть значительно ниже, чем в модельных экспериментах.

Антигипоксические свойства коротких регуляторных пептидов

Влияние коротких пептидов на устойчивость крыс
к воздействию гипоксии и состояние их потомства

При воздействии на крыс острой сублетальной гипобарической гипоксии дольше всего дыхательную активность в барокамере сохраняли крысы, получавшие инъекции пинеалона. Удовлетворительные результаты были получены также при применении вилона и эпиталона. Для животных, которым вводили пинеалон и эпиталон, были характерны наименьшие значения коэффициента реституции, что свидетельствует о их лучшей адаптированности к гипоксическому воздействию. Исходя из приведенных результатов, пинеалон был выбран в качестве наиболее перспективного протектора от гипоксии, в связи с чем в следующей серии экспериментов его антигипоксические эффекты были исследованы на модели пренатальной гипобарической гипоксии. Беременные крысы по чувствительности к гипоксии были разделены на 2 группы. Крысы 1-ой группы характеризовались высокой чувствительностью к гипоксии, что проявлялось в остановке дыхания через 61-285 сек. после достижения заданного остаточного давления в барокамере. 2-я группа животных была представлена устойчивыми к гипоксии животными, сохранявшими дыхательную активность в барокамере на протяжении всего периода гипоксического воздействия. У чувствительных к гипоксии животных (группа 1) наблюдалась также потеря позы продолжительностью 140 – 340 сек. В ходе сеанса гипоксии у животных, устойчивых к гипоксии (2-я группа), потери позы не наблюдалось.

Заметный интерес представляют данные о влиянии пинеалона на активность антиоксидантных ферментов в мозге и печени устойчивых и чувствительных к гипоксии крыс. Оказалось, что в ткани мозга устойчивых к гипоксии крыс активность супероксиддисмутазы (СОД) и глутатионпероксидазы (ГП) в 2 раза выше, чем у животных, чувствительных к гипоксии (рис.3,4а). В печени же подопытных животных подобной разницы в активности антиоксидантных ферментов между двумя группами не отмечалось (Рис. 3,4б), что соответствует представлениям о том, что мозг наиболее подвержен гипоксическому воздействию. Вместе с тем, полученные нами данные отчетливо показали, что введение чувствительным к гипоксии животным пинеалона приводит к значительному повышению активности СОД в тканях мозга и печени (рис. 3а,б). Причем, в мозговой ткани он достигает уровня, сопоставимого с таковым у животных, устойчивых к гипоксии. Активность ГП под влиянием пинеалона возрастает только у крыс, чувствительных к гипоксии (рис. 4а,б). Характерно, что пинеалон не вызывает достоверных изменений в активности антиоксидантных ферментов в мозге и печени крыс, устойчивых к гипоксии. Полученные данные свидетельствуют о том, что у устойчивых к гипоксии крыс высокая активность наиболее значимых антиоксидантных ферментов СОД и ГП обеспечивает защиту от гипоксического воздействия и не нуждается в дополнительной стимуляции со стороны пинеалона и, возможно, других коротких регуляторных пептидов.

 

Рис. 3 а. Влияние пинеалона на активность супероксиддисмутазы
в мозге чувствительных  и устойчивых  к гипоксии крыс.

* - отличия между  животными  чувствительными к гипоксии и животными, чувствительными к гипоксии, получавшими пинеалон (p<0,01);
** - отличия между чувствительными и устойчивыми к гипоксии животными (p<0,001)

 

Рис. 3 б. Влияние пинеалона на активность супероксиддиммутазы
в печени  чувствительных  и устойчивых  к гипоксии крыс.

* - отличия между  животными  чувствительными к гипоксии

и животными чувствительными к гипоксии,  получавшими пинеалон (p<0,05).

 

Рис.4 а. Влияние пинеалона на активность глутатиопероксидазы в мозге  чувствительных  и устойчивых  к гипоксии крыс.

Примечание: * - отличия между  животными  чувствительными к гипоксии и животными чувствительными к гипоксии,  получавшими пинеалон (p<0,05);
** - отличия между чувствительными и устойчивыми к гипоксии животными (p<0,01)

 

Рис. 4 б. Влияние пинеалона на активность глутатиопероксидазы в печени  чувствительных  и устойчивых  к гипоксии крыс.

Численность потомства от животных, перенесших гипоксию, составляла 9±3 особи,
а в группе, получавшей пинеалон - 14±2 (p<0,05), что приближалось к нормальному физиологическому уровню, типичному для интактных животных. На 12-й день часть подросших животных была декапитирована, и их мозжечок был использован для цитометрического анализа. Оставшихся животных в возрасте 4 недель использовали для оценки поведения в тесте «открытое поле». При этом в течение 3 мин поминутно регистрировали горизонтальную активность животных (ГА) – количество пересеченных квадратов, вертикальную активность (ВА)  - количество стоек, количество обследованных норок, характеризующее исследовательскую активность животных, число эпизодов груминга, выход в центр поля, количество болюсов, характеризующие тревожность и эмоциональную активность животных. Потомство животных, разделенное по реакции их матерей на гипобарическую гипоксию в период беременности на 2 разные группы – чувствительную
к гипоксии и устойчивую к ней анализировали по отдельности. Данные представлены в таблице 3. У потомства, как чувствительных, так и устойчивых к гипоксии крыс, получавших пинеалон, и ГА, и ВА были достоверно выше, чем у потомства крыс подвергшихся гипоксии и не получавших этого пептида. При этом у  потомства, полученного от устойчивых к гипоксии крыс, ГА была несколько выше, чем от чувствительных к гипоксии крыс, поэтому эффект пинеалона проявлялся более выражено в группе чувствительных к гипоксии животных. На исследовательскую активность (обследование норок) достоверного влияния пинеалон не оказывал. 

Таблица 3

Физиологические параметры, характеризующие поведение животных в тесте «открытое поле»

Параметр

Чувствительные к гипоксии

(n=6)

Чувствительные к гипоксии + пинеалон (n=11)

Устойчивые к гипоксии (n=9)

Устойчивые к гипоксии + пинеалон (n=12)

ГА

36±6,9

53±5,1*

45±3,3

57±3,3*

ВА

2±0,8

5±0,8*

2±0.6

6±1,1*

Норковая активность

1,5±0,5

1,5±0,6

2,7±0,7

3±0,5

Число эпизодов груминга

1,5±0,8

3,5±1,2

8,7±2,9

10±2,4

Кол-во болюсов

2,7±0,4

1,8±0,6

2,0±0,7

4,1±0,8

Число выходов в центр поля

0,01±0,1

0,27±0,1

0,17±0,1

0,13±0,1

Примечание:* р<0,05 -  характеризует достоверность по отношению к группе гипоксических животных, не леченых пинеалоном.

У потомства чувствительных к гипоксии крыс пинеалон заметно увеличивал частоту груминга и количество выходов в центр открытого поля, хотя это увеличение так же как изменение количества болюсов (актов дефекации) было недостоверным вследствие разброса показателей индивидуальной реакции животных. В противоположность этому, его действие на потомство устойчивых к гипоксии животных не проявлялось.

Действие пинеалона на нейрональные клетки мозжечка потомства крыс,

подвергнутых воздействию гипобарической гипоксии

       Инкубация  нейронов с перекисью водорода (20 мМ в течение 20 мин) или с NMDA (1 мМ в течение 40 мин) вызывала резкое возрастание гибели нейрональных клеток (Рис. 5). При этом в суспензии нейронов крысят, рожденных от самок, подвергнутых гипоксии, но не леченых пинеалоном, наблюдалось двукратное увеличение гибели клеток, вызываемое перекисью водорода, в то время как для нейронов, выделенных из мозжечка потомства самок, получавших пинеалон, эта величина не превышала 40%. Исходный уровень мертвых нейронов в первичной культуре также был почти вдвое ниже в случае нейронов, выделенных из мозжечка животных, выделенных из мозжечка леченых пинеалоном крыс.  Менее выраженные, но аналогичные изменения наблюдались при инкубации нейронов мозжечка с NMDA. Таким образом, клетки, выделенные из мозжечка животных, рожденных от крыс, получавших пинеалон, демонстрируют большую устойчивость к окислительному стрессу.

Рис. 5. Доля мертвых клеток в первичной культуре нейронов мозжечка крыс
при инкубации с перекисью водорода (слева) или с NMDA (справа).

Инкубация  с 20 мМ перекиси водорода – 20 мин, с 1 мМ NMDA – 40 мин

Рис. 6. Уровень активных форм кислорода в первичной культуре нейронов
при инкубации с перекисью водорода (слева) или NMDA (справа).
Обозначения те же, что на Рис.5.

Исследование уровня АФК в тестируемых клетках обнаружило, что гипоксия приводит к резкому (почти в 3 раза) увеличению исходного (стационарного) уровня АФК. На этом фоне индукция окислительного стресса у нейронов с помощью неспецифического фактора (перекиси водорода) вызывает прирост свободных радикалов, который мало отличается в обеих группах гипоксических животных (получавших и не получавших пинеалон).

В то же время, по реакции на NMDA нейроны этих животных существенно различались. На фоне высокого стационарного уровня АФК NMDA не вызывал дополнительного роста свободных радикалов в нейронах потомства гипоксических крыс, как это наблюдается в случае интактных нейронов, а в нейронах потомства гипоксических крыс, леченных пинеалоном, даже понижал его (Рис. 6). Этот факт свидетельствует о том, что пинеалон защищает нейрональные клетки от экзайтотоксического действия NMDA.

Влияние коротких пептидов
на клетки нейробластомы человека  при гипоксии

В данном исследовании при инкубации клеток нейробластомы в условиях гипоксии было обнаружено снижение уровня мРНК неприлизина (НЕП) и инсулиндеградирующего фермента (ИДФ), участвующих в деградации -амилоидного пептида, на 25-30% и 30-35%, соответственно (Рис. 7, 8)

Рис. 7. Уровень содержания мРНК металлопептидазы НЕП в клетках нейробластомы человека NB7, культивируемых в нормоксических или гипоксических условиях.

Примечание: Здесь и на Рис.8 по оси ординат - % от контроля. Содержание мРНК в контрольных клетках принято за 100%. Нормоксия: 1 – контроль (без введения агентов), 2 эпиталон 50 нМ, 3 – вилон 50 нМ. Гипоксия:  4 – контроль (без введения агентов),  5 – эпиталон 50 нМ, 6 – вилон 50 нМ, 7 - ЭГКГ 25 мкг/мл. * - p < 0.05 по сравнению с контролем;

# - p < 0.05 по сравнению с гипоксией.

Рис. 8. Уровень содержания мРНК ИДФ в клетках нейробластомы человека NB7, культивируемых в нормоксических или гипоксических условиях.

При добавлении в инкубационную среду 50 нМ эпиталона он препятствовал снижению уровня экспрессии ИДФ и НЕП, вызванному гипоксией, а в случае НЕП приводил даже к увеличению его экспрессии на 30%. В аналогичных условиях эксперимента вилон не оказывал влияния на уровень экспрессии ИДФ при гипоксии, но предотвращал подавление экспрессии НЕП. Изучение влияния вилона и эпиталона на уровень экспресии НЕП и ИДФ в клетках нейробластомы человека NB7 при нормоксии не выявило статистически достоверных изменений в уровне содержания их мРНК, хотя в случае мРНК ИДФ наблюдалось незначительное (10-15%) его повышение (Рис. 7).

Для сравнения нами было исследовано действие антиоксиданта экстракта зеленого чая, эпигаллокатехин-3 галлата (ЭГКГ) на уровень экспрессии мРНК  НЕП и ИДФ в клетках нейробластомы NB7 в условиях гипоксии. Известно что, ЭГКГ вызывает увеличение экспрессии НЕП на уровне белкового продукта в клетках нейробластомы SH-SY5Y [Yasojima K. еt al., 2005]. Оказалось, что ЭГКГ также способен предотвращать снижение уровня экспрессии НЕП в нашем эксперименте, однако он был менее эффективен в отношении ИДФ (Рис.7, 8). В нормоксических условиях эффект ЭГКГ на содержание мРНК ИДФ был также слабо выраженным (117±9%).

Анализируя полученные нами данные, можно заключить, что из всех исследуемых препаратов является оптимальным по величине антигипоксического эффекта в отношении уровня экспрессии НЕП и ИДФ, а вилон, не влияя на экспрессию НЕП, несколько уступает ЭГКГ в стимулировании уровня экспрессии ИДФ.

Заключение.

Экспериментами, проведенными in vivo установлено, что короткие пептиды (эпиталон, кортаген и вилон) при введении животным (крысы линий ЛИО, Wistar  мыши линии СВА) оказывают антиоксидантное действие, которое выражается в снижении интенсивности свободнорадикальных процессов (перекисного окисления липидов и окислительной модификации белков). Антиоксидантные свойства коротких пептидов проявляются в экспериментах как на интактных половозрелых животных, так и особенно наглядно при старении или действии экстремальных факторов внешней среды (гипоксия, гипокинезия). Наиболее сильным антиоксидантом является эпиталон, слабее всего антиоксидантные свойства выражены у вилона.

Модельные эксперименты in vitro показали, что, наряду с эпиталоном и вилоном, антиоксидантным действием обладают относящиеся к категории биологических добавок пинеалон и везуген. Они также как эпиталон и вилон при применении в концентрациях до
5 мМ не взаимодействуют со стабильным радикалом ДФПГ, т.е. не относятся к группе антиоксидантов прямого действия, таких как аскорбиновая кислота и тиоловые соединения. Вместе с тем, исследуемые пептиды, особенно эпиталон и вилон, оказывали мембраностабилизирующее действие, подавляя в той или иной степени окисляемость липопротеиновых комлексов плазмы крови и препятствуя осмотическому гидролизу эритроцитов. Мембранопротекторные свойства коротких пептидов были выявлены также и в экспериментах in vivo при воздействии на животных гипокинезии и гипобарической гипокинезии, что выражалось в снижении под влиянием эпиталона и вилона уровня содержания внеэритроцитарного гемоглобина и суммарной пероксидазной активности в плазме крови. Установлено также стимулирующее влияние исследуемых пептидных препаратов на стационарный уровень активных форм кислорода в изолированных гранулярных клетках мозжечка, наряду со снижением доли погибших клеток в популяции нейронов.

Изучение в тесте «открытое поле» поведенческой активности и характеристики когнитивных функций у потомства самок крыс, подвергшихся во втором триместре беременности воздействию острой сублетальной гипобарической гипоксии, выявило защитное влияние пинеалона на исследуемые физиологические показатели. Известно, что одной из значимых причин развития хронической внутриутробной гипоксии плода и фетоплацентарной недостаточности на поздних сроках беременности является гипергомоцистеинемия. При этом наблюдается картина генерализованной микроангиопатии, проявляющейся в виде позднего токсикоза (гестоза), следствием которого является тяжелая нефропатия и развитие аутоиммунных процессов у матери и снижение функциональных резервов всех жизнеобеспечивающих систем новорожденного [Vollset S.E., 2000, Wotherspoon F., Laight D., 2003]. Проведенные нами исследования показали, что ряд коротких пептидов (пинеалон, карнозин) способны осуществлять защиту потомства от токсического действия гипергомоцистеинемии (неопубликованные данные). Обнаружено, что при введении этих пептидов беременным самкам наблюдается увеличение среднего веса потомства, выращенного в условиях пренатальной гипергомоцистеинемии до контрольного уровня (22 – 25 г.). Оценка пространственной ориентации крысят, т.е. способности к обучению в тесте Морриса (поиск платформы при передвижении в бассейне) выявила некоторое улучшение под влиянием исследуемых пептидов возможностей их обучения и запоминания, нарушенных в результате перенесенной пренатальной гипергомоцистеинемии.

В экспериментах с нейронами, выделенными из мозжечка животных, рожденных от крыс, получавших пинеалон, установлены нейропротекторные свойства коротких пептидов, обуславливающие устойчивость клеток к окислительному стрессу, индуцируемому перекисью водорода или лигандом глутаматных рецепторов N-метил-D-аспартатом. Поскольку не было обнаружено аналогии между уровнем смертности нейронов и ростом АФК при индукции окислительного стресса, можно заключить, что защита клеток от гибели осуществляется пинеалоном не путем прямого ограничения продукции АФК. Возможно, это обусловлено механизмом, связанным с повышением устойчивости мембран, как это наблюдалось нами ранее в модельных экспериментах с осмотическим гемолизом эритроцитов, индуцируемым в присутствии пинеалона. Нельзя исключить, что эффект пинеалона реализуется через увеличение устойчивости системы антиоксидантных ферментов, как это установлено нами для самок беременных крыс.

Полученные нами данные позволяют предположить, что синтетические пептиды эпиталон, и в меньшей степени вилон, обладают нейропротекторыми антигипоксическими свойствами в отношении уровня экспрессии таких металлопептидаз, как НЕП и ИДФ. Известно, что при старении и ишемии мозга также наблюдается снижение уровня экспрессии НЕП и ИДФ в коре и гиппокампе [Caccamo A. et al., 2005]. В связи с этим, можно полагать, что эпиталон и вилон способны оказывать защитный нейропротекторный эффект на нервные клетки этих структур путем стабилизации активности этих ферментов, играющих важную роль в катаболизме амилоидного пептида, и препятствовать его накоплению в токсических для клеток концентрациях.

Приведенные в работе результаты исследований об антиоксидантном действии исследуемых пептидных препаратов, которое проявляется на различных уровнях, начиная от клеток до организма в целом, в зрелом возрасте и при старении, в условиях действия экстремальных факторов внешней среды, свидетельствуют о важной роли коротких пептидов в механизмах регуляции гомеостаза при старении.

ВЫВОДЫ

  1. В сыворотке крови и печени старых крыс (24 мес.) уровень генерации АФК по сравнению с молодыми животными (3 мес.) снижается, что сопровождается интенсификацией процесса окислительной модификации белков, некоторым увеличением образования продуктов ПОЛ и значительным ингибированием активности СОД. В мозгу не выявлено существенных возрастных изменений показателей свободнорадикального окисления.
  2. Введение  половозрелым крысам эпиталона и кортагена (2,5 – 10 мкг/кг массы) приводит к снижению уровня содержания продуктов ПОЛ и окислительной модификации белков в сыворотке крови  и коре головного мозга, которому сопутствует подавление общей антиокислительной активности. Антиоксидантное действие эпиталона особенно наглядно проявляется в экспериментах на старых (24 мес.) животных, у которых при его введении почти вдвое повышается активность СОД коры головного мозга.
  3. Сравнительное исследование влияния эпиталона и вилона на свободнорадикальные процессы у 18 –мес. мышей линии СВА показало, что введение эпиталона, в отличие от вилона, приводит к заметному снижению интенсивности свободнорадикальных процессов в крови и тканях мышей CBA; при этом он оказывает преимущественное влияние на начальные этапы ПОЛ (уровень ДК) в печени и сыворотке крови и, напротив, его терминальную стадию (уровень ШО) в головном мозгу. Эффекты эпиталона в большинстве случаев сопоставимы с действием мелатонина.
  4. Предварительное введение крысам эпиталона и вилона (2,5 – 10 мкг/кг массы) перед началом сеанса гипокинезии или гипоксии способствует нормализации свободнорадикальных процессов в плазме крови и коре мозга крыс благодаря антиоксидантным и мембраностабилизирующим свойствам коротких пептидов, которые у вилона выражены гораздо слабее, по сравнению с эпиталоном.
  5. При определении прямой антиоксидантной активности тестируемых соединений вилон и эпиталон не проявляют способности к взаимодействию со стабильным свободным радикалом 1,1‘-дифенилпикрилгидразилом, что позволяет классифицировать их как соединения, не обладающие прямой антиоксидантной активностью.
  6. Исследование индуцированного окисления липопротеинов плазмы крови человека показало, что короткие пептиды способны защищать липопротеиновые комплексы от Fe-индуцированного окисления, причем вилон и эпиталон обеспечивают заметное увеличение резистентности к окислению, а везуген и пинеалон существенно снижают скорость окислительного процесса.
  7. Вилон, везуген, эпиталон и пинеалон примерно в равной степени оказывают мембраностабилизирущее влияние, подавляя осмотический гемолиз эритроцитов крысы и человека, хотя этот защитный эффект проявляется лишь при высоких
    (5 мМ) концентрациях пептидных препаратов, протекторная активность которых была приблизительно равноценной.
  8. Вилон, везуген и пинеалон повышают стационарный уровень активных форм кислорода в изолированных гранулярных клетках мозжечка на 61-155%, на этом фоне перекись водорода не только не вызывает роста внутриклеточного уровня АФК, но и приводит к понижению уровня радикалов в нейронах. При этом эти вещества, подобно карнозину, вызывают уменьшение доли мертвых клеток в популяции исследуемых нейронов. Эпиталон вызывал наибольшее увеличение уровня АФК в нейронах (до 666%), хотя не влиял на гибель нейронов.
  9. Введение вилона, везугена, эпиталона, и пинеалона в дозе 10 мкг/кг массы самкам крыс перед созданием гипобарической гипоксии, оказывает антигипоксическое действие на животных. Среди исследуемых пептидов наиболее эффективным является пинеалон, введение которого повышает устойчивость животных к гипоксии и обеспечивает частичную защиту от вызываемого ею окислительного стресса. Это проявляется в повышении активности антиоксидантных ферментов (СОД и глутатионпероксидазы) в мозгу и печени чувствительных к гипоксии крыс.
  10. Введение пинеалона в дозе 10 мкг/кг массы беременным крысам после сеанса гипобарической гипоксии способствует увеличению численности потомства и обеспечивает его защиту от последствий гипоксической атаки развивающегося мозга. Защитный эффект пинеалона выражается в улучшении показателей поведения крысят в тесте «открытое поле», а также в увеличении устойчивости выделенных из их мозжечка нейронов к окислительному стрессу, индуцируемому перекисью водорода или N-метил-D-аспартатом.
  11. Эпиталон и в меньшей степени вилон оказывают нейропротекторное действие, препятствуя снижению уровня экспрессии металлопептидаз неприлизина инсулиндеградирующего фермента в клетках нейробластомы человека NB7 в условиях гипоксии. Это позволяет рассматривать исследуемые короткие пептиды в качестве перспективных нейропротекторных соединений, препятствующих накоплению -амилоида в нервных клетках.

Практические рекомендации

  1. Принимая во внимание экспериментальные данные об антиоксидантных свойствах эпиталона и других коротких пептидов, целесообразно провести клинические испытания их в качестве антиоксидантных геропротекторных препаратов.
  1. Исходя из полученных результатов об антигипоксическом и нейропротекторном действии пинеалона и везугена, целесообразно использовать их в качестве биорегуляторов, способствующих профилактике развития возрастной патологии и ускоренного старения.

СПИСОК  РАБОТ,  ОПУБЛИКОВАННЫХ  ПО  ТЕМЕ ДИССЕРЦИИ

Статьи в журнале по перечню ВАК

Министерства образования и науки Российской Федерации:

  1. Влияние пептидов вилон и эпиталон на уровень экспрессии неприлизина и инсулин-деградирующего фермента в клетках нейробластомы человека в норме и при гипоксии / Л.С. Козина, Е.Г. Кочкина,  Н.Н. Наливаева, Н.Д. Беляев,
    Э. Тернер, А.В. Арутюнян// Нейрохимия. – 2008. - Т.25, № 1 – 2. – С. 82 – 85.
  2. Влияние пептидных препаратов эпифиза на пролиферативные процессы в органотипической культуре преоптической области гипоталамуса / Ю.П. Милютина, Л.С. Козина, А.В. Арутюнян, Н.И Чалисова., В.В.  Лесняк // Успехи геронтологии, 2007. – Т. 20. – № 4. – С. 61 – 63.
  3. Изучение антиоксидантных и мембранопротекторных свойств коротких пептидов в модельных экспериментах/ Л.С. Козина, С.Л. Стволинский, Т.Н. Федорова, Е.Р. Булыгина, Е.С. Арзуманян, А.В. Арутюнян,  В.Х. Хавинсон//Вопр. биол., мед. и фармацевт. химии. – 2008, -№ 2. – С.
  4. Козина Л.С. Исследование антигипоксических свойств коротких пептидов/Л.С. Козина//Успехи геронтологии. - 2008. – Т.21. - , № 1. – С. 61 – 67.
  5. Козина Л.С. Антиоксидантное действие пептидных препаратов эпифиза и мелатонина/ Л.С. Козина// Вест.  Санкт-Петербургской государственной медицинской академии им. И.И. Мечникова.- 2007.- Т. 8, №1 – С. 140 – 143.
  6. Козина Л.С. Влияние биологически активных тетрапептидов на свободнорадикальные процессы/ Л.С. Козина//Бюлл. эксперим. биологии  и медицины. – 2007. – Т. 143, № 6. – С. 690 – 692.
  7. Оценка  биологической активности регуляторных пептидов в модельных экспериментах in vitro// Л.С. Козина, А.В. Арутюнян, С.Л. Стволинский, В.Х. Хавинсон//Успехи геронтологии. - 2008. – Т.21, № 1. – С. 68 – 73.
  8. Пренатальная гипергомоцистеинемия как модель окислительного стресса мозга/А.В. Махро, А.П. Машкина, О.А. Соленая, О.А. Трунова, Л.С. Козина, А.В. Арутюнян, Е.Р. Булыгина//Бюлл. эксперим. биологии и медицины.– 2008.- Т.146  , № 7 . –  С. 37 – 39.
  9. Регуляторные пептиды защищают нейроны мозга от гипоксии в экспериментах in vivo/ Л.С. Козина, А.В. Арутюнян,  С.Л. Стволинский, М.С. Степанова,  В.Х. Хавинсон// Докл. акад. наук, 2008, - т. 418,  №3, – с.419 – 422.

Монографии

  1. Пептидная регуляция адаптации организма к стрессорным воздействиям/ А.В. Лысенко, А.В. Арутюнян, Л.С. Козина. – СПб : ВМедА, 2005. -207 с.

Статьи

  1. Антиоксидантные механизмы стресс- и геропротекторных эффектов дельта-сон индуцирующего пептида и его аналогов у крыс разного возраста /А.В. Лысенко, Л.С. Козина, Р.Г. Шейхова, А.А. Алиев//Новые лекарственные препараты.  - 2007.- Т. 34, № 3. – С. 44 -56.
  2. Арутюнян А.В. Антиоксидантное действие коротких пептидов при старении и экстремальных воздействиях/А.В. Арутюнян, Л.С. Козина// Матер. докл. Международной конф. «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии» Украина, Крым, Ялта-Гурзуф, 31 мая – 9 июня 2007 г.
    – С. 409-411.
  3. Арутюнян А. В. Модулирующее влияние геропротекторных пептидов эпифиза, обладающих антиоксидантными свойствами, на репродуктивную систему/
    А.В. Арутюнян, Л.С. Козина, Хавинсон В.Х.// Международный симпозиум
    « Молекулярные механизмы регуляции функции клетки» 12-16 сентября 2005г., Тюмень, 2005. – С. 209 - 211.
  4. Арутюнян А.В. Хронобиология регуляции репродуктивной функции при старении / А.В. Арутюнян, Л.С. Козина, Ю.П. Милютина//Перспективные направления использования лабораторных приматов в медико-биологических целях: Матер. Всеросс. научн. конф. - Сочи–Адлер, 2006. - С. 276 -281.
  5. Влияние эпиталона на возрастные изменения эндокринной функции пинеальной железы и активность ферментов антиоксидантной защиты у самок макак резусов/ А. В. Шмалий, Н. Д. Гончарова, Л.С. Козина, А.А. Венгерин// Перспективные направления использования лабораторных приматов в медико-биологических целях: Матер. Всеросс. научн. конф. - Сочи–Адлер, 2006. - С. 293 -298.
  6. Козина Л.С. Влияние интенсивности окислительных процессов в организме на продолжительность жизни/ Л.С. Козина, А.В. Арутюнян//«Актуальные проблемы геронтологии и гериатрии» Сб. трудов юбилейной научно-практической конференции «ХХ лет первой в России кафедре гериатрии» (под ред. проф. А.Л. Арьева) СПб МАПО, 27-28 апреля 2006 г., СПб.­–2006­– С. 272-278.
  7. Козина Л.С. Исследование антиоксидантных свойств коротких пептидов в модельных экспериментах in vitro/ Л.С. Козина, А. В. Арутюнян, Е.Л. Стволинский // Матер. 5-ой национальной научно-практической конференции с международным участием «Активные формы кислорода, оксида азота, антиоксиданты и здоровье человека», 18-22 сентября, 2007, Смоленск, 2007. С. 334-337.
  8. Козина Л.С. Роль пептидов в регуляции свободнорадикальных процессов при старении/ Л.С. Козина, А.В. Арутюнян, В.Х. Хавинсон //Матер. Международной научной конференции «Свободные радикалы, антиоксиданты и старение», 2-3 ноября 2006 г., Астрахань. – 2006. – С. 15-20.
  9. Kozina  L.S. Antioxidant properties of geroprotective of  the pineal gland/ L.S.Kozina, A.V. Arutjunyan,  V.Kh. Khavinson// Arch. Gerontol. Geriatr. Suppl. 1. – 2007. - P. 213-216.
  1. The effects of vilon and epithalon peptides on the expression of neprilysin and insulin – degrading enzyme in human neuroblastoma NB7 cells under normal and hypoxic conditions /L.S. Kozina, E.G. Kochkina, N.N. Nalivaeva, N.D. Belyaev, A. J. Turner, A.V. Arutjunyan // Neurochemical. Journal.-2008. - Vol.2. No.1-2. P. 82 – 85.

Тезисы

  1. Антигипоксическое действие коротких регуляторных пептидов/Л.С. Козина, А.В. Арутюнян, С.Л. Стволинский, В.А. Арутюнов, М.С. Степанова// Матер. III научно-практической геронтологической конференции с международным участием, посвященная памяти Э.С. Пушковой (Пушковские чтения), 8-9 ноября 2007 г., С-Петербург. – 2007. – С. 176.
  2. Антиоксидантные и мембранопротекторные свойства коротких пептидов в экспериментах in vitro /Л.С. Козина, А.В. Арутюнян, С.Л. Стволинский, В.Х. Хавинсон// Матер. III научно-практической геронтологической конференции с международным участием, посвященная памяти Э.С. Пушковой (Пушковские чтения), 8-9 ноября 2007 г., С-Петербург. – 2007. – С. 177.
  3. Антиоксидантные свойства геропротекторных пептидов эпифиза/ А.В. Арутюнян, Л.С. Козина, Т.В. Харитонова, Ю.П. Милютина // 4-й Национальный конгресс геронтологов и гериатров Украины «Проблемы старения и долголетия», Киев. - 2005. - Т. 14. – С. 71–72.
  4. Антиоксидантные свойства эпиталона и его структурных аналогов / Козина Л.С., А.В. Арутюнян, В.М. Прокопенко, Т.И. Опарина, Ю.П.  Милютина// Тез. докл. VII Всероссийской конференции с международным участием «Биоантиоксидант», 25-26 ноября 2006 г., Москва. –  2006, С. 47 – 48.
  5. Арутюнян А.В. Антиоксидантные свойства геропротекторных пептидных препаратов эпифиза и вилочковой железы /А.В. Арутюнян, Л.С. Козина// Всероссийской конференции «Перспективы фундаментальной геронтологии» 25-26 ноября 2006 г., Санкт-Петербург. – 2006. –  С. 11–12.
  6. Арутюнян А.В. Влияние геропротекторных пептидов на свободнорадикальные процессы/А.В. Арутюнян, Л.С. Козина// Тез. докл. 4-ой Крымской конференции «Окислительный стресс и свободнорадикальные патологии» Судак, Крым, Украина, 2008. –  С. 7– 8.
  7. Арутюнян А.В. Нейропротекторное действие пептидных биорегуляторов при гипоксии/А.В. Арутюнян, Л.С. Козина, В.А. Арутюнов// Конференция с международным участием «Нейрохимические механизмы формирования адаптивных и патологических состояний мозга» Санкт-Петербург-Колтуши, 10-12 сентября 2008 г., Тез. докл. СПб.
    - С. 11-12.
  8. Арутюнян А.В. Окислительная модификация белков и старение/ А.В. Арутюнян, Л.С. Козина, В.В. Лесняк//Сб. тез. конф/«Проблемы геронтологии  и гериатрии», 20-22 апреля. 2006г., Сыктывкар. 2006. С. 68.
  9. Арутюнян А.В. Полифункциональное антиоксидантное действие мелатонина/ Арутюнян Л.С., Козина Л.С. //Тез. докл. Всерос. научно-практической конференция
    «50 лет мелатонину: Итоги и перспективы исследований» - Санкт-Петербург, 24-25 апреля 2008. – С. 4 – 5.
  10. Влияние пептидов на адаптационные возможности организма и уровень тревожности/ А.В. Лысенко, Е.В. Моргуль, Р.Г. Шейхова, Л.С. Козина, А.В. Арутюнян//Тез. докл. ХХ съезда физиологического общества им. И.П. Павлова, 4-8 июня 2007 г., Москва. – 2007. – С. 315.
  11. Возрастные аспекты стресспротекторной эффективности коротких пептидов при гипоксии /А.В. Лысенко, Козина Л.С., Руденко Т.Н.. Арутюнян А.В.// Матер. 4-й Российской конференции «Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция» (с международным участием), 12-14 октября 2005 г., Москва. – 2005. – С. 70-71.
  12. Возрастные особенности показателей стрессоустойчивости у работников железнодорожного транспорта с различным уровнем тревожности/Т.А. Финоченко, А.В. Лысенко, В.А. Мамченко, Л.С. Козина// Матер. Межрегиональной научно-практической конференции «Медицинские проблемы пожилых»,  20 ноября 2007 г., Йошкар-Ола, - 2007. – С. 58–60.
  13. Гипоталамическая регуляция репродуктивной функции и ее нарушение  под влиянием нейротоксических ксенобиотиков/ А.В. Арутюнян, М.Г. Степанов, А.В. Кореневский, Л.С. Козина//Сб. научных трудов I съезда физиологов СНГ, Сочи, Дагомыс, 19-23 сентября 2005. - Москва.- 2005. – Т.1. – С.116.
  14. Защитная роль мелатонина и пептидных препаратов эпифиза при воздействии экотоксикантов на репродуктивную функцию/А.В. Арутюнян, Ю.П. Милютина,  А.В. Кореневский, М.Г. Степанов, Л.С. Козина, В.Х. Хавинсон// Матер. Конгресса «Экотоксины и здоровье», 1-4 июля 2008, Санкт-Петербург. Вестник Российской Военно-медицинской академии, 2008, № 3 (23) Приложение 2.Часть I. – С. 65.
  15. Захарченко И.В. Адаптивное значение возрастных изменений углеводного обмена в печени при иммобилизационном стрессе/ И.В.Захарченко,  Л.С. Козина//Матер. конф. «Забота, помощь, милосердие», 21-24 марта 2007г., С-Петербург, 2007. С. 66-67.
  16. Кириченко И.М. Зависимость результатов ангиографии коронарных артерий у лиц пожилого и старческого возраста от показателей липидного обмена и внутрисосудистой активации тромбоцитов / И.М. Кириченко, Л.С. Козина// Всероссийской конференции «Перспективы фундаментальной геронтологии» 25-26 ноября 2006 г., Санкт-Петербург. – 2006. –  С. 53–54.
  17. Кириченко И.М. Зависимость результатов ангиографии коронарных артерий от наличия инфаркта миокарда в анамнезе у пациентов пожилого и старческого возраста /И.М. Кириченко, Л.С. Козина //Матер. IV научно-практической конференции «Общество, государство и медицина для пожилых и инвалидов», 21-22 мая 2007г., Москва, 2007. С. 51.
  18. Кириченко И.М. Зависимость результатов ангиографии коронарных артерий от индекса массы тела у пациентов пожилого и старческого возраста/ И.М. Кириченко, Л.С. Козина, К.Л. Козлов //Матер. конф. «Забота, помощь, милосердие», 21-24 марта 2007г., С-Петербург, 2007. С. 66-67.
  19. Козина Л.С. «Антигипоксические эффекты коротких пептидов»/ Л.С. Козина, А.В. Лысенко// Матер. XII Международного симпозиума «Эколого-физиологические проблемы адаптации», 30-31 января 2007 г., Москва. – 2007. – С. 235–236.
  20. Козина Л.С. Влияние вилона и эпиталона на процессы свободнорадикального окисления при старении у мышей линии CBA /Л. С. Козина, А.В. Арутюнян//Матер. III Всесоюзной научно-практической конф. «Общество, государство и медицина для пожилых», 25-26 мая 2006г., Москва. – 2006. - С. 53.
  21. Козина Л.С.  Возрастная динамика показателей свободно-радикальных процессов и антиоксидантной системы / Л.С. Козина, В.В. Лесняк //«Актуальные проблемы геронтологии и гериатрии» Сб. трудов юбилейной научно-практической конференции «ХХ лет первой в России кафедре гериатрии» (под ред. проф. А.Л. Арьева) СПб МАПО, 27-28 апреля 2006 г., СПб.­–2006– С.  288-289.
  22. Козина Л.С.  Возрастные изменения в интенсивности биорадикальных процессов при развитии сердечно-сосудистой патологии/Л.С. Козина, Т.В. Харитонова//Матер. III научно-практической геронтологической конференции с международным участием, посвященная памяти Э.С. Пушковой (Пушковские чтения), 8-9 ноября 2007 г.,
    С-Петербург.– 2007. – С. 101–102.
  23. Козина Л. С. Возрастные изменения перекисного окисления белков  эритроцитов и плазмы крови/Л. С. Козина, А.В. Арутюнян// Матер. научно-практической конф. «Пожилой больной» Москва, 2004. – ж. Клиническая геронтология. – Т.10, № 9. – С. 76.
    (нет ксерокса).
  24. Козина Л.С. Возрастные особенности процессов свободнорадикального окисления в печени крыс при иммобилизационном стрессе/Л.С Козина, И.В. Захарченко //Матер. конф. «Забота, помощь, милосердие», 21-24 марта 2007г., С-Петербург, 2007. С. 67.
  25. Козина Л.С.  Изучение возрастных изменений в интенсивности биорадикальных процессов при развитии сердечно-сосудистой патологии/ Л.С. Козина, Т.В. Харитонова// 4-я национальная научно-практическая конференция с международным участием. «Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека» Смоленск, Россия,  26-30 сентября 2005 г., Смоленск, – 2005. – С. 394–395.
  26. Козина Л.С. Изучение прямого антиоксидантного действия коротких пептидов / Л.С. Козина, С.Л. Стволинский, А.В. Арутюнян// Тез. докл III Российского симпозиума «Белки и пептиды», 16 – 21 сентября 2007 г., Пущино. 2007. – С. 121-122.
  27. Козина Л.С. Исследование антиоксидантных свойств коротких пептидов в модельных экспериментах in vitro/Л.С. Козина, А.В. Арутюнян, С.Л. Стволинский//5-я национальная научно-практическая конференция с международным участием. «Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека» Смоленск, Россия,  18-22 сентября 2007 г., Смоленск. – 2007. – С. 334–335.
  28. Козина Л.С. Регуляция свободнорадикальных процессов пептидными препаратами эпифиза при старении/ Л.С. Козина, А.В. Арутюнян //Сб. докл.VII Международный симпозиум «Биологические механизмы старения», 24-27 мая 2006 г., Харьков, Украина. 2006. – С. 30 – 31.
  29. Козина Л.С. Роль возрастных изменений функциональной активности митохондрий в развитии сердечно-сосудистой патологии /Л.С. Козина, Т.В. Харитонова, И.М. Кириченко// Всероссийской конференции «Перспективы фундаментальной геронтологии» 25-26 ноября 2006 г., Санкт-Петербург. – 2006. –  С. 59–60.
  30. Козина Л.С. Роль свободнорадикальных процессов в развитии атеросклероза/ Л.С. Козина, Т.В. Харитонова, А.В. Арутюнян//Сб. научных трудов «Актуальные вопросы внутренних болезней» СПб государственная медицинская акад. им. И.И. Мечникова, Санкт-Петербург, 2006. – С. 60 - 61.
  31. Козина Л. С. Роль пептидов эпифиза в регуляции свободнорадикальных процессов при старении/Л. С. Козина, А.В. Арутюнян// Матер. научно-практической конф. «Пожилой больной» Москва, 2004. – ж. Клиническая геронтология. – Т.10, № 9. – С. 78.
  32. Козина Л.С. Экспериментальное изучение влияния геропротекторных пептидов эпифиза на антиоксидантную систему /Л. С. Козина, А.В. Арутюнян// Матер. научно-практической конф. «Пожилой больной» Москва, 2006. – ж. Клиническая геронтология. – Т.12, № 9. – С. 88.
  33. Козина Л.С. Ингибирование активности холинэстераз в клетках нейробластомы человека SH-SY5Y под влиянием вилона и эпиталона /Л.С. Козина, Н.З. Макова, Н.Н. Наливаева,Е.Г Кочкина., В.А. Арутюнов,  А. Тернер, И.А. Журавин, А.В. Арутюнян// Сб. докл.VIII Международный симпозиум «Биологические механизмы старения», 21-24 мая 2008 г., Харьков, Украина. 2008. – С. 65 – 66.
  34. Козина Л.С. Эффект геропротекторных пептидов на активность холинэстераз в клетках нейробластомы человека SH-SY5Y/Л.С. Козина, Н.З. Макова, Н.Н. Наливаева,
    Е.Г Кочкина., В.А. Арутюнов,  А. Тернер, И.А. Журавин, А.В. Арутюнян// Матер. V Всероссийской научно-практической конф. «Общество, государство и медицина для пожилых», 3-4 июня 2008г., Москва. – 2008. - С. 35.
  35. Лысенко А.В. Применение эпиталона для коррекции метаболических и функциональных нарушений при физической нагрузке у спортсменов/А.В. Лысенко, Л.С. Козина//Тез. докл. «XIV Российский национальный Конгресс «Человек и лекарство», 16-20 апреля 2007 г., Москва, 2007. С. 400.
  36. Оценка безопасности использования нанопрепаратов пептидной природы/ А.В. Лысенко, Т.А. Финоченко, Р.Г. Шейхова, Л.С. Козина, А.В. Арутюнян//Матер. II-го Санкт-Петербургского международного экологического форума, 1-4 июля 2008, Санкт-Петербург. Вестник Российской Военно-медицинской академии, 2008, № 3 (23) Приложение 2.Часть II. – С. 486
  37. Сравнительное изучение антиоксидантных свойств тетрапептидов/Л.С. Козина, А.В. Арутюнян, В.М. Прокопенко, Т.И. Опарина, Т.В. Харитонова//Тез. докл. «2-й Российский симпозиум по химии и биологии пептидов», 25-27 мая 2005 г., Санкт-Петербург. – 2005. - С. 66.
  38. Участие биогенных аминов гипоталамуса в регуляции репродуктивной системы женского организма/ А.В. Арутюнян, М.Г. Степанов, А.В. Кореневский, Г.О. Керкешко, Л.С. Козина //Сб. тез. докл. «Нейрохимия: фундаментальные и прикладные аспекты». Научн. конф. 14-16 марта 2005 г., Москва.-2005. – С. 77.
  39. Харитонова Т.В. Характеристика показателей про- и антиоксидантных систем крови при старении / Т.В. Харитонова, Л.С. Козина // Тез. докл. «Геронтология: от кардиологии к социально-экономическим аспектам», Сыктывкар, 2005. – С. 75.
  40. Харитонова Т.В. Показатели  про- и антиоксидантных систем крови при старении/Т.В. Харитонова, Л.С. Козина// Матер. III научно-практической геронтологической конференции с международным участием, посвященная памяти Э.С. Пушковой (Пушковские чтения), 8-9 ноября 2007 г., С-Петербург. – 2007. – С. 135-136.
  41. Arutjunyan A.V. In vivo protection of the organism from oxidative stress by small natural regulatory peptides/A.V. Arutjunyan, A.A. Boldyrev, L.S. Kozina//Abstr. VI European Congress «Healthy and active ageing for all Europeans» International association of gerontology and geriatrics, 5-8 July, 2007. Adv. in Gerontology. 2007. – Vol. 20, № 3 – P. 17.
  42. Arutjunyan A.V. Geroprotective peptides of the pineal gland and antioxidative defence system/A.V. Arutjunyan, L.S. Kozina, V.Kh. Khavinson// 4th Bologna International Meeting “Affective, behavioral and cognitive disorders in the elderly-ABCDE”. Bologna, Italy, 2006.-P.68.
  43. Chalisova N.I. Modulatory effect of amino acids on the liver tissue culture of young and old rats/ N. I. Chalisova, L.S. Kozina, V.V. Lesnyak// Abstr. VI European Congress «Healthy and active ageing for all Europeans» International association of gerontology and geriatrics, 5-8 July, 2007. Adv. in Gerontology. 2007. – Vol. 20, № 3 – P. 25.
  44. Effect of synthetic regulatory peptides on expression of neprilysin in human neuroblastoma NB7 cells/N.N. Nalivaeva, , E.G. Kochkina, N. Makova, N.D. Belyaev, A.J. Terner L.S. Kozina,V.A. Arutyonov, A.V. Arutjunyan // Abstr. VI European Congress «Healthy and active ageing for all Europeans» International association of gerontology and geriatrics, 5-8 July, 2007. Adv. in Gerontology. 2007. – Vol. 20, № 3 – P. 59.
  45. Khavinson V.Kh.Geroprotective peptides of the pineal gland and antioxidative protection system/ V.Kh. Khavinson, A.V. Arutjunyan, L.S. Kozina//Abstr. 18th World Congress of Gerontology, Rio de Janeiro, Brazil, June 26-30, 2005. – J. Gerontology. –  P. 106.
  46. Kozina L.S. Age dependent changes in lipid metabolism and thrombocytes intravascular aggregation in cardiovascular pathology development/L.S Kozina, T.V. Kharitonova, I.M. Kirichenko// Abstr. VI European Congress «Healthy and active ageing for all Europeans» International association of gerontology and geriatrics, 5-8 July, 2007. Adv. in Gerontology. 2007. – Vol. 20, № 3. – P. 46.
  47. Kozina L.S. The influence of geroprotective peptides on the phagocytic activity of leucocytes in hypokinesia/L.S. Kozina, A.V. Lysenko, A.V. Arutjunyan//Abstr. International Symposium “Interactuion of the nervous and immune systems in health and disease, May 31 – June 2, 2007. Saint-Petersburg. 2007. – P. 38 – 39.
  48. Kozina L.S. The role of pineal gland peptides in regulation of free radical rocesses in aging/ L.S.Kozina, V.Kh. Khavinson, A.V. Arutjunyan  //Abstr.  of  the 8th ECNP regional Meeting Moscow, Russia, April 14-16, 2005//European Neuropsychopharmacology – 2005.– Vol. 15. Supplement 2 –2005. - S. 208–209.
  49. Protective effect of the peptides vilon and epitalon against hypoxia incluced changes in amiloid-degrading enzymes/ N.N. Nalivaeva, N. Makova, E.G. Kochkina, D. John, N.D. Belyaev, L.S. Kozina, A.V. Arutjunyan, A.J. Terner //Abstr. 21st Biennial Meeting of International Society for Neurochemistry and the 38th Annual Meeting of the American Society for Neurochemistry/ Cancun, Mexico, 19-24 August, 2007. J. Neurochemistry. – Vol. 102. Supplement 1. – 2007. – P. 134.
  50. Study of the effects of regulatory peptides on expression of amyloid-degrading enzymes/ N.N. Nalivaeva, N.Z. Makova, L.R. Fisk, E.G. Kochkina,  N.D. Belyaev, I.A. Zhuravin, L.S. Kozina, A.V. Arutjunyan, A.J. Terner// Abstr.4th International Peptide Symposium, 7th  Australian Peptide Symposium, 2nd Asia-Pacific International Peptide Symposium “Discovery to Drugs: The Peptide Pipeline”, 21-25 October,2007, Cairns, Queensland, Australia.
  51. The disturbance of free radical processes in rat brain during toluene and dioxane chronic inhalation/ Burmistrov S.O., Kerkesyko G.O., Stepanov M.G., Kozina L.S., Korenevsky A.V.// Abstr. International conference “Free radicals and antioxidants in the development and functions of the central nervous system: from fetus to aging». April 18-20, 2001. Saint-Petersburg, Russia. Adv. in Gerontology, 2001. – Vol. 6. – P. 45.
  52. The effect of regulatory peptides on aging intensity  in rats with different anxiety level/A.V. Lysenko, E.V. Morgul, R.G. Sheykhova, T.A. Finochenko, L.S. Kozina//Abstr. VI European Congress «Healthy and active ageing for all Europeans» International association of gerontology and geriatrics, 5-8 July, 2007. Adv. in Gerontology. 2007. – Vol. 20, № 3 – P. 53.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ, ИСПОЛЬЗУЕМЫХ В АВТОРЕФЕРАТЕ

ОАА общая антиокислительная активность

АОП – антиоксидантный потенциал системы

АФК – активные формы кислорода

ГП – глутатионпероксидаза

ДК – диеновые конъюгаты

ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота

ДФПГ – 1,1 дифенил -2 - пикрилгидразил

ИДФ – инсулиндеградирующий фермент

МДА – малоновый диальдегид

мРНК – матричная рибонуклеиновая кислота

НЕП – неприлизин

ОМБ – окислительная модификация белков

ПОЛ – перекисное окисление липидов

СОД - супероксиддисмутаза

СПА – суммарная пероксидазная активность

СРО – свободнорадикальное окисление

ТБК – тиобарбитуровая кислота

ТБК-АП  – ТБК-активные продукты, то есть реагирующие с ТБК

ШО – шиффовы основания

ХЛ – хемилюминисцесценция

ЭГКГ – эпигаллокатехин-3 галлат

H2O2 –  перекись водорода

NАС – N-ацетилцистеин

NMDA – N-метил-D-аспартат

Козина Л.С. АНТИОКСИДАНТНОЕ ДЕЙСТИЕ ГЕРОПРОТЕКТОРНЫХ ПЕПТИДНЫХ БИОРЕГУЛЯТОРОВ// Автореф. дис. … докт. биол. наук: 14.00.53. – СПб., 2008. 46 с.

Подписано в печать «___»  _________ 2008. Формат 60*84 1/16.

Бумага офсетная. Печать офсетная. Печ. л. 2,0

Тираж 150 экз.  Заказ __.

Отпечатано с готового оригинал-мактета

В типографии Издательства СПбГЭТУ «ЛЭТИ»

Издательство  СПбГЭТУ «ЛЭТИ»

197376, Санкт-Петербург, ул. проф. Попова, дом 5






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.