WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

На правах рукописи

Игнатьева Наталия Юрьевна ТЕРМИЧЕСКАЯ СТАБИЛЬНОСТЬ КОЛЛАГЕНА В СОЕДИНИТЕЛЬНЫХ ТКАНЯХ

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук

по специальности 02.00.04–физическая химия Москва, 2011г.

Работа выполнена на кафедре физической химии Государственного учебнонаучного учреждения Химический факультет Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова.

профессор, доктор физико-математических

Научный консультант:

наук, Баграташвили Виктор Николаевич

Официальные оппоненты: профессор, доктор химических наук, Мельников Михаил Яковлевич (Химический факультет МГУ имени М.В.

Ломоносова) профессор, доктор химических наук, Ищенко Анатолий Александрович (МГА Тонкой Химической технологии) профессор, доктор физико-математических наук Гончуков Сергей Александрович (Национальный исследовательский ядерный университет “МИФИ»)

Ведущая организация: Институт химической физики им. Н. Н.

Семёнова РАН

Защита диссертации состоится 21 октября 2011 г. в 15 часов 00 минут на заседании диссертационного совета Д 501.001.90 по химическим наукам при МГУ имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 3, аудитория 446.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова.

Отзывы на автореферат высылать по адресу: Москва ГСП-1, 119991, Ленинские горы, дом 1, строение 3, Ученому секретарю диссертационного совета Д 501.001.90 Бобылевой М.С.

Автореферат разослан «___»_________2011 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета Д 501.001.90, Кандидат химических наук М.С. Бобылева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Коллаген является основным структурным белком в организмах млекопитающих и составляет каркас матрикса соединительных тканей. Важнейшей функцией соединительных тканей является механическая, во всем своем многообразии: опора, сочленение, объединение, передача нагрузки, защита и другие. Каждой разновидности механической функции соответствует своя структура каркаса матрикса, которая определяется способом укладки коллагена и его взаимодействием с другими макромолекулами внеклеточного матрикса ткани. Даже незначительные нарушения структуры могут приводить к существенному отклонению в функционировании органа. Поэтому существует проблема определения структурных изменений в ткани и подходов к коррекции обнаруженных нарушений и функций.

Выявление взаимосвязи структуры и функции материала является общей естественнонаучной проблемой. При этом стабильность объекта, являясь, с одной стороны, характеристикой структуры, с другой - напрямую определяется его функцией. В физической химии особую роль играет термическая стабильность, которая позволяет для сложных, многокомпонентных, многофазных объектов оценить самые общие термодинамические свойства и дает возможность анализа структурнофункциональных связей в данном объекте. Для выделенного коллагена (в растворе и волокнах) уже установлены количественные термодинамические характеристики перехода из нативной упорядоченной конформации в форму случайного клубка: температура Тд и энтальпия его H д денатурации. Информация об этом явлении для коллагена, находящегося в составе реальной ткани, крайне скудна и не систематизирована, хотя преимущества использования Тд и Hд кажутся очевидными, как в качестве первого шага структурного исследования ткани и ее заменителей, так и для диагностики патологических структурных изменений в ткани.

Значительное место в современных медицинских технологиях занимает метод локальной (в том числе – лазерной) гипертермии, когда в основе структурных изменений лежит денатурация коллагена, либо целевые структурные изменения протекают при температурах, равных или несколько превышающих Тд. При осуществлении локального ИК лазерного нагрева соединительных тканей условия обработки (такие, как время и температура нагрева) зачастую оказываются далеко не оптимальными, а результаты - плохо предсказуемыми, так как в экспериментальных исследований редко принимается во внимание специфическая архитектоника конкретных тканей. Таким образом, актуальной задачей является научное обоснование применения метода локального нагрева для модификации соединительных тканей в клинической практике.

Настоящая работа, направленная на исследование стабильности коллагена в соединительных тканях различного типа, состоит из двух частей. В первой части обосновывается использование термической стабильности, как структурной и функциональной характеристики матрикса соединительных тканей различного типа, а во второй - исследуется устойчивость этих тканей в условиях неоднородного лазерного нагрева.

Работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ Химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова, тема «Химические реакции в разрядах и при фотохимическом и лазерном инициировании», № гос. регистрации 01.200.115171. В течение 10 лет исследования осуществлялись при финансовой поддержке РФФИ (99-02-16855-а, 00-0216263-а, 01-02-17743-а, 02-02-16246-а, 04-02-16743-а, 05-02-16902-а, 06-0800950-а, 07-02-12080-офи, 07-08-00448-а, 08-02-00583-а, 09-02-00714-а), в том числе проектом № 07-02-00749-а, руководителем которого автор диссертации непосредственно являлся. Работа поддерживалась также грантами АФГИР (RUP2-2660-MO-05) и МНТЦ (3360).

Цели работы 1. Охарактеризовать состояние коллагена в соединительных тканях и установить взаимосвязь между структурными и термодинамическими параметрами стабильности коллагена в этих тканях с применением современных физико-химических методов.

2. Определить особенности действия локального лазерного нагрева на матрикс соединительных тканей и выявить факторы, определяющие стабильность коллагена в этих условиях.

Научная новизна - Впервые проведено систематическое исследование термической стабильности коллагена в тканях с разной архитектоникой и химическим составом матрикса. Выявлена взаимосвязь между термодинамическими параметрами денатурации коллагена и свойствами матрикса. Установлено, что иммобилизация фибрилл и волокон коллагена за счет взаимодействия с сеткой протеогликановых агрегатов или внедрения их в более плотную ткань является важнейшим фактором стабильности коллагена в ткани.

Нарушение целостности единой структуры органа приводит к значительному уменьшению термической стабильности коллагена.

- Впервые показано, что использование термодинамических характеристик денатурации коллагена в соединительных тканях совместно с химическим анализом и данными оптических методов визуализации, позволяет определять состояние коллагена в тканях и его изменения в результате патологических процессов или целевой модификации. Разработанный в диссертации подход является достаточно эффективным и информативным методом определения структурных и функциональных особенностей матрикса соединительных тканей, а также их изменений при различных воздействиях на ткань.

- Впервые выявлено принципиальное различие в поведения коллагеновой сети в тканях с волокнистой структурой при осуществлении гидротермального и ИК лазерного нагрева умеренной интенсивности. Это различие обусловлено развитием механической дезорганизации упаковки коллагена в условиях нестационарного и неоднородного в пространстве температурного поля при ИК лазерном воздействии (фототермомеханический эффект). Показано, что при ИК лазерном нагреве денатурация коллагена в тканях возможна при температурах более низких, чем температура денатурации коллагена в калориметрической ячейке.

Предложена схема модификации волокнистых структур ИК лазерным излучением умеренной интенсивности.

- Впервые показано, что характер изменений матрикса и его коллагеновой подсистемы зависит от состава и надмолекулярной организации матрикса ткани. В частности, в гиалиновом хряще носовой перегородки дезорганизацию претерпевает главным образом протеогликановая подсистема, а в жировой ткани – подсистема триацилглицеридов.

Практическая значимость - Разработанная методология комплексного физико-химического анализа соединительных тканей, включающая термический и химический анализы, а также методики оптической диагностики, однозначно характеризует состояние коллагена в тканях, что дает молекулярную основу для разработки новых методов коррекции функции тканей.

- Обнаруженный фототермомеханический эффект воздействия ИК лазерного излучения умеренной интенсивности на соединительные коллагенсодержащие ткани, приводящий к дезорганизации матрикса ткани, необходимо учитывать при разработке клинических методов модификации ткани с использованием лазерных технологий. Выявленная корреляция между составом и архитектоникой ткани и ее откликом на неоднородный нагрев дает важный вклад в разработку научных основ метода локальной гипертермии коллагенсодержащих тканей с патологическими изменениями.

- Полученные в работе данные позволяют предсказать степень деградации соединительной ткани при термическом и ИК лазерном воздействии и дают научную основу выбора режимов ИК лазерного воздействия, обеспечивающего желаемый терапевтический эффект.

Личный вклад автора В диссертации представлены результаты исследований, выполненных лично автором, при его решающем участии или под его руководством в период с 1998 по 2010 г. на кафедре физической химии химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова в рамках дипломных работ студентов и кандидатских диссертаций С.В. Аверкиева и Н.А. Данилова, руководителем и со-руководителем которых являлся автор. Личный вклад автора в настоящую работу состоит: в формулировке ее концепции, основных положений и выводов; в разработке экспериментальных методик и проведении экспериментов; обработке, анализе и обобщении результатов.

Морфологический анализ выполнен д.м.н., проф. Шехтером А.Б. (МГМУ им. И.М. Сеченова). Часть работы выполнена в соавторстве с сотрудниками Института проблем лазерных и информационных технологий РАН. Большое влияние на работу оказали академик РАН, д.х.н., проф. В.В.Лунин и научный консультант д.ф.-м.н., проф. Баграташвили В.Н.

Апробация работы Основные результаты работы доложены на ряде российских и международных конференций, в их числе:

V международная конференция по лазерной физике (2001, Москва), IX, X, XI и XIV международные конференции «Новые информационные технологии в медицине и экологии» (Гурзуф, Украина, 2001, 2002, 2003 и 2007 гг.), международная конференции «Лазеры: применение и технологии» (Москва, 2002 г.), XIII международная конференции по биологической калориметрии (Вюрцбург, Германия, 2003 г.), 4-я всероссийская Каргинская конференция “Наука о полимерах 21-му веку” (Москва, 2007 г.), международная конференция “Применение лазеров в науках о жизни” (Москва, 2007 г.), 15 и 16 международные конференция по современным лазерным технологиям (Леви, Финляндия, 2007 г., Шиофок, Венгрия, 2008г.), XVI и XVII международной конференции по химической термодинамике в России (Суздаль, 2007 г., Казань 2009 г.), конференция «Биомеханика глаза» (Москва, 2007 и 2009 гг.), III конференция «Медицинская физика и инновации в медицине» (Троицк, 2008 г.), 16-й конгресс Европейского общества по биомеханике, (Люцерн, Швейцария, 2008 г.), 12-я и 13-я международные конференции по миопии (Сидней, Австралия, 2008 г., Тьюбинген, Бельгия, 2010 г.), конгресс европейского общества офтальмологов, (Амстердам, Голландия, 2009 г.), II международный симпозиум «Актуальные проблемы биофотоники» (Нижний Новгород, 2009 г.), III евразийский конгресс по медицинской физике и инженерии (Москва, 2010 г.), и другие престижные российские и международные форумы, конференции и семинары.

Публикации По материалам диссертации опубликованы 39 статей в рецензируемых российских и международных изданиях и более 30 тезисов докладов на российских и международных конференциях.

Структура диссертации Работа состоит из введения, 4 глав и общих выводов. Работа изложена на 307 страницах машинописного текста и включает 25 таблиц, 1рисунков и список литературы из 640 наименований.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Первая глава посвящена описанию физико-химических свойств основных компонентов внеклеточного матрикса соединительных тканей – коллагена и протеогликанов, а также надмолекулярной организации матрикса.

Макромолекула фибриллярного коллагена представляет собой три полипептидных цепи, закрученных в тройную спираль. Во внеклеточном матриксе эти макромолекулы укладываются в фибриллы, располагаясь параллельно со сдвигом на молекулы ( D-период). Данные по дифракции рентгеновских лучей, электронной и атомно-силовой микроскопии указывают на существование в соединительных тканях упорядоченной укладки коллагеновых макромолекул, фибрилл и волокон в квазикристаллическую структуру. Ко- и пост-трансляционная модификации приводят к образованию специфичных для коллагена гидроксипролина (Hyp) и гидроксилизина (Hyl) и ферментативному окислению лизина до альлизина, после чего протекает их конденсации с NH2 группами боковых цепей и формирование термолабильных внутри- и межмолекулярных ковалентных поперечных связей, превращающихся в термостабильные сшивки. Второй путь образования сшивок связан с накоплением конечных продуктов гликации (КПГ) за счет конденсации азотсодержащих групп остатков лизина, аргинина с альдегидными группами простых сахаров. С возрастом сшивки накапливаются, что приводит к изменению физикохимических свойств тканей. Общая схема образования коллагеновой подсистемы в ткани представлена на рисунке 1.

ПГА размер до 1 мкм, масса до 107 Д Рисунок 1. Схема образования коллагеновой подсистемы в матриксе соединительных тканей (слева) и строение протеогликанового агрегата (ПГА, справа).

Протеогликаны (ПГ) состоят из полисахаридных цепей гликозаминогликанов (ГАГ), связанных со стержневым белком Огликозидными связями, а макромолекулы ПГ могут образовывать протеогликановые агрегаты (ПГА) с другой полисахаридной молекулой – гиалуроновой кислотой. В тканях ПГ, взаимодействуя с поверхностью фибрилл коллагена, задают толщину фибрилл и ориентируют их, формируя специфическую организацию матрикса, которая обеспечивает оптимальные механические свойства и функционирование ткани.

Рассмотрены физико-химические основы тепловой денатурации коллагена на базе теории плавления полимеров в рамках модели фазового перехода I рода; такой подход объясняет восстановление структуры коллагена при охлаждении, влияние концентрации растворителя и степени поперечной связанности макромолекул на измеряемую температуру Тд.

Вторая глава посвящена рассмотрению методов исследования свойств матрикса. Химический анализ дает содержание ГАГ и коллагена. Оценка типового состава коллагена основана на разнице мольных соотношений r = Hyp/Hyl (rI = 15±1 для коллагена I и rII = 4.5±0.5 для коллагена II) и Gly/Ala (2.97 для коллагена I и 3.42 1для коллагена III). Особое место занимает определение устойчивости к трипсину. Этот фермент, катализирует протеолиз всех белков, кроме макромолекул коллагена в конформации тройной спирали, и доля деградированного коллагена T равна доле Hyp, вымытого трипсином в супернатант m(Hyp)S от общего количества коллагена m(Hyp)T: T = m(Hyp)T / (m(Hyp)S + m(Hyp)T )100%.

Дифференциальная сканирующая калориметрия (ДСК) дает две основные термодинамические характеристики денатурации коллагена в тканях: температура (Тд) и энтальпия ( ) денатурации. Степень Н д денатурации коллагена ДСК можно определить, зная тепловой эффект денатурации Н: ДСК = (1-Н/Нд)100%, где Нд - энтальпия денатурации коллагена в интактных тканях. Информация о степени сшивания и совершенстве фибриллярной упаковки коллагена может быть получена на основе Тд.

Фибриллы и волокна детектируются с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ). Поскольку несимметричные макромолекулы коллагена имеют отличную от нуля нелинейную поляризуемость, они способны к генерации второй гармоники (ГВГ) лазерного излучения; сигнал ГВГ усиливается при параллельной упаковке молекул. Укладка фибрилл и волокон охарактеризована с помощью многофотонной микроскопии. Анизотропные свойства и общая архитектоника ткани характеризуются методом кросс-поляризационной оптической когерентной томографии (КПОКТ). Этот метод дает информацию об изменении состояния поляризации обратно рассеянного зондирующего излучения в среде и количественную характеристику анизотропии образца - двулучепреломление n, которое может быть рассчитано по периоду модуляции интенсивности интерференционного сигнала zb: n = /2zb, где – длина волны зондирующего излучения.

На рис. 2 представлена схема, соотносящая метод исследования с уровнем структурной иерархии коллагена в ткани на примере связки надколенника.

Рисунок 2.

Соотнесение метода исследования с уровнем структурной иерархии коллагена на примере ткани связки.

Часть качественной информации о ткани получена из данных об изменениях сорбционных свойств ткани, ИК спектроскопии и световой микроскопии. Выбор методов исследования диктуется надмолекулярной организацией ткани.

Третья глава посвящена физико-химическому анализу коллагена в различных соединительных тканях. В каждом разделе главы термическая стабильность коллагена в определенной ткани обсуждается в связи с химическим составом, надмолекулярной организацией и механической функцией ткани.

В разделе 3.1 в качестве модельной системы рассматривается ткань связки надколенника, которая подвергается преимущественно одноосному натяжению. Коллаген составляет 86±2% и представлен коллагеном типа I (Hyp/Hyl=14.5±0.5 и Gly/Ala=2.77±0.4), массовая доля ГАГ- 1.3± 0.2%.

а б в Рисунок 3. Характеристика квазикристаллической структуры коллагена в Tonset Tпик г -1,интактной ткани связки: фибриллы на ПЭМ микрофотографии (а), волокна на ГВГ -1,HД изображении (б), интерференционная картина Hi -1,на КПОКТ томограмме (в) и переход спиральклубок (денатурация коллагена) на ДСК -1,термограмме (г).

-1,40 50 60 70 80 температура, 0C Ткань связки характеризуется упорядоченной одноосной укладкой макромолекул, фибрилл и волокон, что проявляется на ПЭМ микрофотографиях, где видна характерная D-периодичность фибрилл, и ГВГ изображениях, где идентифицируются параллельные волокна и пучки с тепловой поток, мВт волнообразными складчатостями (кримпами) (рис. 3а, б). Параллельная укладка волокон в пучки обеспечивает анизотропные свойства ткани, обуславливая интерференционную картину на КПОКТ томограммах (n = (6,8±0,2)10-3) (рис. 3в). Конформационный переход спираль-клубок (денатурация коллагена) регистрируется на ДСК термограммах связки как эндотермический пик с характеристиками: HД = 60±3 Дж/г коллагена, Tonset, = 63±1.5°С, Tпик = 67±1°С (соответствует температуре плавления фибрилл коллагена Тд) и (рис. 3г). На эндотермах плавления коллагена в ткани всегда наблюдается высокотемпературное плечо.

Денатурация коллагена при гидротермальной обработке связки протекала, начиная с 65°С, и регистрировалась, как уменьшение (вплоть до полного исчезновения) эффекта на ДСК термограммах, искажение волокнистой структуры на ГВГ изображениях и исчезновение двулучепреломления на КПОКТ томограммах. Процесс деградации при однородном нагреве носит пороговый характер и характеризуется одновременным нарушением упорядоченности на всех уровнях структурной иерархии ткани.

Приложение растягивающей силы, направленной вдоль главной оси связки, приводило к существенному увеличению стабильности коллагена.

При 82°С лишь через 2 мин а часть макромолекул теряла б нативную структуру (ДСК = 18±3%), при этом укладка волокон и анизотропия ткани сохранялись, хотя и в искаженном виде (рис. 4).

Описание денатурации коллагена как фазового Рисунок 4. Сохранение волокнистых структур перехода первого рода коллагена на ГВГ микрофотографии (а), и анизотропии связки на КПОКТ изображении (б) позволяет использовать после гидротермального прогрева с нагрузкой уравнения ТД= Н / SД для Д Ньютонов (82°С, 2 мин).

анализа состояния коллагена в тканях. Учитывая постоянство НД – энергии, необходимой для разрушения системы водородных связей, стабилизирующих тройную спираль, изменение ТД следует связывать только с SД. Предполагая неизменность энтропии коллагена в нативном состоянии, определяемой числом возможных конформаций тройной спирали, изменение Тд будет указывать на изменение энтропии коллагена в состоянии случайного клубка и отражать топологические ограничения, накладываемые на коллагеновую сеть ( S TД ) или увеличение свободного объема за счет разрыхления Д квазикристаллической упаковки фибрилл ( SД TД ). Увеличение в коллагеновой сети концентрации поперечных сшивок (с возрастом, за счет образования конечных продуктов гликации) приводит к уменьшению числа конформаций в состоянии случайного клубка, появлению фракции коллагена с повышенной Тд и, как следствие, наличию высокотемпературного плеча на эндотерме плавления коллагена в ткани. Повышение термической стабильности коллагена в связке при натяжении также обусловлено уменьшением числа допустимых конформаций полипептидных цепей в состоянии случайного клубка (уменьшение SД).

В разделе 3.2. представлены результаты исследования тканей глаза - склеры (кролика) и Теноновой капсулы (человека), в которых выявляются возможности использования данных о термическом поведении коллагена для характеристики состояния ткани.

Показательным оказалось сравнительное изучение физико-химических свойств склеры и соединительной ткани капсул, образованных вокруг склероукрепляющих трансплантатов глаз. Трансплантаты содержали стимулирующий препарат панаксел (OD) или были без него (OS) [1].

Таблица 1. Физико-химические характеристики соединительнотканных капсул.

Показатели Склера (n=15) Капсула OS (n=7) Капсула OD (n=7) Orn*,**** 0.4±0.07 0.8±0.1 0.8±0.Gly/Ala*** 2.95±0,05 2, 91±0.11 2,87±0.Hyp/Hyl*** 15±1,5 16±2 17±Коллаген** 67±2 83±7 76±ГАГ **,**** 1,3±0,2 1,8±0,1 1,9±0,Hд, Дж/г 58,4±1,5 59,6±1,5 59±1,Тд,°С **** 67,5±1,04 63.9±0.2 64.8±0.* ** на 1000 аминокислотных остатков, % от сухой массы ткани,*** различие между группами статистически незначимо (p>0.05),****различие между группами статистически значимо (p<0.05).

Химический состав препаратов капсулы оказался близок к составу склеры, хотя содержание коллагена I и ГАГ в капсулах оказалось повышенным (табл. 1). Форма эндотерм плавления была различна для трех групп образцов (рис. 5). В капсулах высокотемпературное плечо денатурации Рисунок 5. ДСК термограммы склеры и Рисунок 6.ДСК термограмма капсулы OD соединительнотканных капсул вокруг после восстановления ткани NaBH4.

трансплантата.

коллагена оказалось значительно менее выражено, а Тд основной фракции ниже, чем в склере; это указывает на меньшую концентрацию термостабильных сшивок и отсутствие КПГ в ткани капсулы, незрелой, по сравнению со склерой. На эндотерме денатурации коллагена в капсуле OD появлялся низкотемпературный пик (Тп = 60.7±0.2°С), который исчезал после обработки капсул NaBH4 (рис. 6). Это указывало на связь низкотемпературного пика с плавлением фракции коллагена с большим содержанием «незрелых» альдиминовых сшивок, которые после восстановления превращаются в термостабильные связи -C-N-. Наличие альдиминовых сшивок характерно для эмбрионов и незрелых особей. Это в совокупности с повышенной концентрацией ГАГ, коллагена и орнитина (Orn) свидетельствует о высокой синтетической активности клеток в капсулах. Определение особенностей состояния коллагена в новообразованной соединительной ткани оказалось весьма перспективным для поиска материалов нового поколения, стимулирующих фибрилогенез в тканях глаза.

Эффективным оказалось и использование сшивающего агента глицеринового альдегида (ГА) для стабилизации ткани склеры. По мере протекания гликации возрастали до предельных значений интенсивность флуоресценции (ex/em =370/435 нм), модуль Юнга, температура денатурации, устойчивость к смеси протеолитических ферментов «Морикраза» (рис. 7).

Рисунок 7. Изменения характеристик образцов склеры кролика в ходе сшивания глицериновым альдегидом.

На ранних стадиях реакции отмечены локальный минимум протеолитической устойчивости и образование фракции коллагена с Тд ~ 60-62°C, что ниже, чем в исходных образцах (рис. 8). Эти явления, по-видимому, связаны с наличием фракции коллагена, содержащего продукты первичного присоединения ГА к одной NHгруппе (т.н. эффект маскирования).

Рисунок 8. Примеры ДСК термограмм В результате маскирования образцов склеры на ранних временах имеют место:

обработки глицеральдегидом -увеличение энтропии случайного клубка в расплаве за счет появления вращений вокруг новых одинарных связей;

-появление дополнительных объемных групп на концах боковых цепей, нарушающих целостность тройной спирали и, как следствие, кристаллическую молекулярную упаковку в фибриллах;

- изменение зарядового профиля молекулы и сетки водородных связей.

Различия Тд для интактной, маскированной и сшитой фракций коллагена можно объяснить изменением энтропии этих фракций, определяемой числом конформационных состояний случайного клубка в предположении незначительного изменения при маскировании и сшивании: скорость ферментной деградации коллагеновых материалов определяется доступностью гидролизуемых полипептидных связей. Наличие локального минимума протеолитической стабильности хорошо согласуется с маскированием аминогрупп. После модификации некоторой части NH2 групп устойчивость к протеазам незначительно возрастает; при дальнейшем увеличении числа объемных групп боковых цепей нарушается упорядоченность трехспиральной структуры, доступ фермента облегчается, и стабильность падает.

В дальнейшем влияние эффекта маскирования компенсируется влиянием эффекта сшивания, так как значительная доля продуктов одиночного присоединения превращается в сшивки. Это вызывает значительный рост и сшитый термической (за счет уменьшения Sклубок ) и протеолитической (за счет изменения центров связывания ферментов и стерических затруднений образования фермент-субстратного комплекса) стабильности.

Общее возрастание структурной стабильности коллагена склеры при сшивании обосновывает перспективность клинического использования метода гликации для укрепления склеры при прогрессирующей миопии; при этом следует иметь в виду возможность частичной дезорганизации фибриллярной структуры на ранних стадиях гликации.

Изменение состояния коллагена в тканях при патологиях показано на примере Теноновой капсулы пациентов с прогрессирующей близорукостью по сравнению с группой контроля. Результаты химического, термического, флуоресцентного и морфологического (ПЭМ) анализа образцов Теноновой капсулы суммированы в табл. 2. Более низкое значение уровня флуоресценции для миопической группы связано с низкой долей продуктов гликации в коллагене и более ускоренным его обновлением.

Таблица 2. Изменение физико-химических характеристик Теноновой капсулы человека при прогрессирующей миопии Параметр Контроль Миопия Мольное отношение Gly/Ala** 2.61±0.01 (n=3) 2.62±0.20 (n=3) Мольное отношение Hyp/Hyl** 25.20±0.99 (n=3) 22.73±2.57 (n=3) Коллаген, % от сухой массы** 47.0±2.4 (n=8) 51.0±5.7 (n=8) ГАГ, % от сухой массы** 0.149±0.035 (n=6), 0.144±0.020 (n=6) Интенсивность флуоресценции* 0.614±0.354 (n=6) 0.540±0.250 (n=6) (ex/em=370/438 нм) Тд,°С * 65.6±1.0 (n=10) 61.6±1.0 °С (n=5) Hд, Дж/г коллагена 45±3 (n=10) 49±3 (n=10) Диаметр фибрилл, нм 89.5±13.2 75.7±7 нм * ** различие между группами статистически значимо (p<0.05), различие между группами статистически незначимо (p>0.05) Фибриллы коллагена в Теноновых капсулах группы контроля имеют одномодальное распределение по диаметру и плотно упакованы в волокна, ориентированные в различных направлениях, образуя трехмерную сеть (рис.

9а). Такая структура оптимальна для того, чтобы ткань выдерживала разнонаправленные нагрузки. Для образцов миопической группы характерны: дезорганизация волокон и фибрилл в волокнах; лизис фибрилл;

уменьшение их диаметра и наличие областей с отсутствием фибрилл, заполненных избытком ПГ (рис. 9б). Кроме того, средний диаметр фибрилл уменьшен по сравнению с контрольной группой, причем распределение фибрилл по диаметрам более однородно за счет уменьшения доли фибрилл самых малых диаметров. Это коррелирует с общей деградацией ткани, так как в отсутствие нормального связывания между коллагеном и протеогликанами фибриллы малого диаметра деградируют в первую очередь.

Дезорганизация ткани отражается на термическом поведении образцов.

Для контрольной группы эндотерма денатурации коллагена представлена четким эндотермическим пиком и высокотемпературным плечом, связанным а б Рисунок 9. ПЭМ микрофотографии образцов Теноновой капсулы из контрольной (а) и миопической (б) групп.

с наличием фракции коллагена, сшитой формирующимися во время старения поперечными связями (гликация), причем это плечо очень слабо выражено у пациентов моложе 15 лет. Кривые ДСК миопических образцов характеризовались переходом спираль клубок при температурах ниже Тд в контрольных образцах, наблюдались и мультипиковые эндотермы (рис.

10б).

а б Рисунок 10. Примеры ДСК термограмм образцов Теноновой капсулы контрольной (а) и миопической (б) групп.

Понижение Тд коллагена в Теноновых капсулах миопической группы связано с наличием фракции незрелого коллагена с термолабильными, альдиминовыми поперечными связями. Структурная дезорганизация фибриллярной упаковки и отделение ПГ от фибрилл также способны понижать Тд: чем более рыхлая упаковка макромолекул и больше энтропия случайного клубка, тем ниже Тд.

Объединенные данные ДСК, ПЭМ и флуоресцентного анализа позволили установить отклонения в структуре коллагена Теноновой капсулы при прогрессирующей миопии. Изменения связаны с понижением уровня поперечного сшивания и ускорением деградации ткани Теноновой капсулы при развитии прогрессирующей миопии. В результате происходит ухудшение биомеханических характеристик и развитие необратимых деформаций даже в диапазоне физиологических нагрузок.

Раздел 3.3 посвящен исследованию термической стабильности коллагена в тканях межпозвонкового диска, состоящего из пульпозного ядра и окружающих его фиброзного кольца и замыкательных пластин (рис. 11).

Все они считаются хрящевыми, но отличаются химическим составом и архитектоникой, а также выполняют разные функции. В работе исследованы диски поясничного отдела кролика и хвоста теленка.

Рисунок 11. Схематичное изображение межпозвонкового диска в комплексе позвонок (ТП)-диск -позвонок (ТП). Диск включает внешнее фиброзное кольцо (ФК) с ламеллярной структурой, внутреннее пульпозное ядро (ПЯ) и примыкающую к кости позвонка замыкательную пластину (ЗП). Внизу изображена схема ламеллярного строения фиброзного кольца.

В матриксе фиброзного кольца (ФК) плотно упакованные параллельные волокна образуют ламеллы, угол между направлением волокон в соседних ламеллах составляет 67±2° (рис. 11). Архитектоника ФК идеальна для обеспечения устойчивости к силам натяжения и сдвига. Данные по химическому составу исследуемых объектов приведены в табл. 3.

Таблица 3. Физико-химические характеристики фиброзного кольца и его препаратов после модификации.

Химический состав* Образец Нд, Дж/г Тд, °С n коллаген ГАГ I 55.6±5.5 70-15.5± 5.1 55.0±0.5# ФК кролика 65.5±0.(n=7) (n=7) (n=15) (5.3±0.3)10-49±6.5 10,3±2,5 72-75 (n=25) 57.5±0.3# ФК теленка 65.3±0.(n=5) (n=7) (n=7) ФК кролика после 63.4±2.5 4.7±2.1 20.0±2.0+ (4.5±0.3)·10-66.0±1.гиалуронидазы (n=3) (n=5) (n=4) (n=15) 74±2 5.2±1.8 68-71 (3.2±0.2)·10-14±2+ ФК кролика после трипсина 65.0±1.(n=5) (n=5) (n=25) (n=5) ФК кролика после 25.0±2.0+ (4.1±0.2)·10-74.5±1.глицеральдегида (n=3) (n=15) * # % от сухой массы ткани, нормировано на содержание коллагена,+ нормировано на сухую массу.

Коллаген является основным компонентом матрикса и представлен двумя типами – I и II. Для оценки доли коллагена I в образцах (I) был разработан простой алгоритм, приводящий к выражению I= rI(rII -rs)/rs(rII -rI), где rs и rI,rII - мольные отношения Hyp/Hyl в образце (s) и коллагенах I и II.

Высокоупорядоченная на всех уровнях иерархии, ламеллярная, анизотропная структура коллагена ФК проявляется на КПОКТ томограммах и ГВГ изображениях (рис. 12). Переход спираль-клубок регистрируется на ДСК термограммах ФК как эндотермический пик при ~ 65.5°С (рис. 13). Для коллагена этой ткани Тд и Hд (табл. 3) близки к таковым для ткани связки, то есть при нагреве секвестрированных фрагментов ФК в них происходит полная денатурация коллагена.

а б Рисунок 12. КПОКТ томограмма (а) и Рисунок 13. ДСК термограммы ФК:

ГВГ изображение (б) фиброзного интактного (1-кролика, 2–теленка) и после кольца. гидротермального прогрева диска в комплексе с позвонками (3).

Для изучения влияния состава и структуры матрикса соединительной ткани на состояние коллагеновой компоненты проведены модифицирующие обработки фиброзного кольца кролика гиалуронидазой (распад ПГА и ГАГ), трипсином (разрушение связующих и стержневых белков ПГ и отщепление терминальных доменов макромолекул коллагена) и глицеральдегидом.

Химическая модификация матрикса приводила к разупорядоченности укладки коллагена в ткани, причем степень дезорганизации, выраженная как изменение n, Тд и Hд (табл. 3), определяется природой модифицирующего агента. Разрушение ГАГ давало минимальные изменения, а образование избытка поперечных сшивок приводило (помимо незначительного искажения анизотропной укладки) к существенной стабилизации матрикса (рост Tд).

Полное разрушение ПГ подсистемы трипсином вызывало значительную дезорганизацию коллагеновой подсистемы: деградацию макромолекул коллагена и искажение анизотропной укладки волокон (значения Нд и n значительно уменьшались, табл. 3). Таким образом, сеть ПГ и телопептидные домены коллагена оказывают значительное влияние на состояние матрикса.

Длительный гидротермальный прогрев диска в гибридной структуре позвонок-диск-позвонок (П-Д-П) при температуре 85°С (>Тд секвестрированных фрагментов!) не приводила к денатурации коллагена;

макромолекулы удерживали конформацию тройной спирали (эндотермический пик денатурации оставался на термограммах, рис. 14, кривая 3, Тд=67±2оС и Нд = 51.2±0.5 Дж/г коллагена), сохранялась волокнистая структура и анизотропные свойства ткани (рис. 14, n=(4.2±0.3)10-3). Аналогичный результат получен для образцов после химической модификации: их гидротермальная обработка не приводила к изменению термодинамических (Тд и Нд) и структурных ( n) параметров.

Это указывает на то, что ПГ и телопептиды не являются факторами, определяющими повышенную термическую стабильность коллагена ФК в целостной системе П-Д-П.

Мы полагаем, что закрепление а коллагеновых волокон в костной ткани позвонка, обеспечивающее их одноосную направленность от одного позвонка к другому, создает естественное, внутреннее натяжение и б стабилизирует коллаген фиброзного кольца. Таким образом, сама архитектоника фиброзного кольца в костном комплексе предопределяет его Рисунок 14. КПОКТ томограмма (а) и устойчивость по отношению к внешним ГВГ изображение (б) ФК после воздействиям. Повышение Тд коллагена прогрева диска в комплексе.

ФК в костном комплексе, как и в случае натянутой связки, объясняется уменьшением числа возможных конформаций случайного клубка макромолекулы, а, следовательно, и Sд.

В отличие от волокнистого фиброзного кольца, пульпозное ядро (ПЯ) характеризуется рыхлой и нерегулярной сетью коллагена и имеет гелеобразную консистенцию. Содержание в матриксе ПЯ коллагена, представленного типом II, удивительно низкое, а ГАГ - очень высокое (табл.

4), при этом ПГ почти не образуют аггрегатов [2]. Макромолекулы коллагена в ткани ПЯ полностью переходят из конформации тройной спирали в случайный клубок при прогреве, а ферментативные обработки, хотя и приводят к уменьшению содержания ГАГ, практически не влияют на Таблица 4. Физико-химические характеристики пульпозного ядра и его препаратов после модификации.

4.5± 2.2 35,5±2 9.2±3.8 67.5±7.8 13.9±6.4 53.2±7.Коллаген* (n=7) (n=3) (n=3) (n=3) (n=3) (n=3) 4.5±0.7 5.3±0.Hyp/Hyl - - - - (n=5) (n=3) ГАГ* 12.5±3.3 8.3±0.3 9.2±1. 9 8.1±0.29±8 40±Нд, 55,1±4,0 62.4±1.2 58.5±2.5 60.5±3.5 52.6±4.5 53.6±3.Дж/г (n=12) (n=5) (n=3) (n=3) (n=3) (n=3) коллагена Тд, °С 65.5±1.5 67±1 65.5±3.2 66.3±2.2 64.0±2.0 65.1±2.* % от сухой массы ткани термическую стабильность коллагена (табл. 4). Мы полагаем, что отсутствие сетки ПГА и высокоупорядоченной структуры коллагена, предопределяет Образец ПЯ от кролика интактный от теленка интактный от кролика, обработка ABC хондро итиназой от теленка, обработка ABC хондро итиназой от кролика, обработка трипсином от теленка, обработка трипсином отсутствие стерических ограничений на число конформаций молекул коллагена в состоянии случайного клубка.

Замыкательная пластина (ЗП) относится к гиалиновым хрящам, и ее основными компонентами являются коллаген II и ГАГ (табл. 5).

Таблица 5. Физико-химические характеристики замыкательной пластины и ее препаратов после модификации.

После После Выдержанный Образец ЗП Интактый ABC трипсина в 1,5M NaCl хондроитиназы Коллаген* 44±2 (n=5) 47-50 (n=2) 4.9±0.Hyp/Hyl 4,( n=3) 17±3 (n=5) ГАГ* 23±2 (n=5) 4±2 (n=4) Нд, 8,5±2,5 (n=5) 12,5±1 (n=3) 42±5 (n=5) 12±3 (n=3) Дж/г коллагена Тд, °С 65-82 68-84 66±2 65-80С * % от сухой массы ткани Теплота регистрируемого на ДСК термограммах (рис. 15) перехода коллагена в интактной ЗП в 5-8 раз меньше Н коллагена II в ПЯ (табл. 5).

д После обработки прогретых образцов трипсином в супернатант выходило 12±2% исходного Hyp, а при повторном прогреве остатков на термограммах вновь наблюдался эндотермический эффект с температурой пика 60оС и H = 35±5 Дж/г сухого остатка (n=3) (рис. 16). Эти данные указывают, что при первом прогреве ЗП денатурация коллагена в этой ткани не происходит полностью (ДСК =15%, T =12 2%).

Рисунок 16. Повторный ДСК скан трипсинизированного препарата ЗП, Рисунок 15. ДСК термограммы ЗП: интактной полученного после первого прогрева (1), обработанный АВС хондроитиназой (2) и ЗП.

трипсином (3).

Тепловой эффект денатурации возрастал после деполимеризации и уменьшения концентрации ГАГ под действием АВС хондроитиназы, оставаясь, однако, меньше Нд. Лишь после полного разрушения трипсином сети ПГ нагрев препаратов ЗП приводил к полной денатурации коллагена (табл. 5, рис. 16), Отметим, что аналогичные результаты были получены для гиалинового хряща сустава.

Очевидно, что ПГ определяют термическую стабильность коллагена II в гиалиновом хряще ЗП, однако, их роль не связана ни с осмотическим давлением, ни с электростатическими взаимодействиями. Действительно, доля сульфатированных ГАГ в ПЯ выше, чем в ЗП, но коллаген II полностью денатурирует в ткани ПЯ при ее нагреве. Кроме того, увеличение ионной силы в 10 раз практически не изменяет термического поведения коллагена в ткани (табл. 5).

Мы полагаем, что принципиальное значение для термической стабильности коллагенового волокна имеет сетка ПГА, которая находятся в теснейшем механическом переплетении с коллагеновой сетью.

Протеогликановые агрегаты иммобилизуют коллагеновые фибриллы, создавая стерические ограничения для движения полипептидных цепей коллагена. В ткани гиалинового хряща число допустимых конформаций для этих цепей в состоянии случайного клубка будет ограничено топологическими препятствиями, следствием чего является уменьшение Sд и увеличение Тд. В препаратах тканей с поврежденной сетью ПГА коллаген II денатурирует лишь частично, а с разрушенной сеткой - полностью.

Поскольку в матриксе замыкательной пластины существуют локальные неоднородности, то возможен процесс локальной денатурации коллагена в зонах деградации ПГА. Схема такого процесса представлена на рисунке 17.

Составляющие межпозвонкового диска отличаются по составу, морфологии и, как показано в настоящей работе, термической стабильностью коллагена. Можно считать, что термическая стабильность коллагена отражает морфологию матрикса ткани и, следовательно, ее функцию.

Рисунок.17. Схема иммобилизации фибрилл коллагена (КФ), агрегатами ПГ (ПГА), ограничивающими свободный объем для денатурирующих молекул. Разрушение ПГ трипсином снимает ограничения.

Волокна коллагена в фиброзном кольце, которое выдерживает двустороннее растяжение-сжатие и сдвиги, закреплены в теле позвонка, что и обеспечивает повышенную стабильность коллагена в целостной системе.

Пульпозное ядро, окруженное ФК и ЗП, выдерживает высокие компрессионные нагрузки, которые компенсируются осмотическим давлением за счет высокой концентрации ГАГ; для перераспределения нагрузки ПЯ должно легко поддаваться сдвигу, и коллаген в этой ткани не иммобилизован (сеть ПГА отсутствует). В результате коллаген в ПЯ не отличается повышенной термической стабильностью. Замыкательная пластина работает на компрессионное сжатие и сдвиговые деформации, для чего необходима как высокая концентрация ГАГ, так и иммобилизации коллагеновой сети сетью ПГА. Стабильность коллагена в секвестрированных образцах этой ткани самая высокая из всех тканей диска.

Представленные в разделе 3.4 результаты исследования устойчивости к нагреву коллагена формообразующих хрящей (носовой перегородки и щитовидного хряща гортани коровы и свиньи) обсуждаются в связи с архитектоникой этих тканей. Их характерной морфологической особенностью является окружение плотным соединительнотканным слоем – надхрящницей гиалиновой основы хряща. Отличие химического состава матрикса двух подсистем заключается в большем содержании ГАГ и меньшей доли коллагена в гиалиновой составляющей; кроме того коллаген в ней представлен только коллагеном II (табл. 6).

Таблица 6. Физико-химические характеристики формообразующих хрящей.

Щитовидный хрящ гортани Хрящ носовой перегородки Образцы гиалиновая гиалиновая надхрящница надхрящница составляющая составляющая Коллаген* 46±5 (n=5) 25±5 (n=7) 52±4 (n=5) 35±5 (n=15) 70 (n=3) 0 (n=5) 80% (n=3) 0 (n=9) ГАГ* 18±7 (n=5) 49±8 (n=12) 22±5 (n=5) 47±9 (n=23) n (4,7±0,2)10-3 (5,1±0,3)10-Нд, Дж/г коллагена 64±2 (n=5) Денатурации 65±1 (n=5) Денатурации Тд, °С 62±1 нет, n=7 63±3 нет, n=* % от сухой массы Организация коллагена различна в подсистемах, что следует из результатов исследования ГВГ, представленных на рис.18 а, б. Волокна коллагена в надхрящнице уложены в пучки, ориентированные под разными а в б г Рисунок 18. Разные способы укладки коллагена в надхрящнице (Н) и гиалиновой составляющей (Х) носовой перегородки (а, в) и щитовидного хряща (б, г) на ГВГ (а, б) и КПОКТ (в,г) изображениях.

углами, но параллельно поверхности, что и вызывает эффект двулучепреломления, проявляющийся на КПОКТ томограммах. В глубокой зоне хряща фибриллы создают подобие слоев, лежащих перпендикулярно поверхности хряща, и материал выглядит изотропным (рис. 18в, г). Группы фибрилл в переходной зоне отклоняются в слоях к горизонтали и конденсируются, а волокна коллагена надхрящницы начинают расщепляться.

Здесь происходит взаимопроникновение коллагеновых сетей хряща и надхрящницы, в результате чего и образуется единая коллагеновая система органа (рис. 19).

Рисунок 19. ГВГ изображения переходной зоны хряща носовой перегородки.

.

Термическое поведение коллагена в гиалиновом хряще и надхрящнице кардинально различается. При прогреве в калориметре ткани надхрящницы все макромолекулы коллагена претерпевают переход спираль – клубок, на термограммах интактной ткани гиалиновой составляющей хрящей эндотермические эффекты, соответствующие денатурации, отсутствовали (рис.20). Прогретые в калориметрической ячейке образцы не растворялись в а б Рисунок 20. Термограммы интактной ткани отделенной надхрящницы (1) и гиалиновой составляющей (2) щитовидного хряща (а) и хряща носовой перегородки (б). Вставка:

повторный нагреве образца гиалинового хряща, подвергшегося обработке трипсином после первого прогрева.

трипсине (T ~ 6% ), а при повторном прогреве после трипсина на термограммах гиалиновой составляющей проявлялся пик денатурации коллагена с тепловым эффектом НД=38±2 (n=3) Дж/г сухого остатка (рис.

20, врезка). Видимых изменений коллагеновой сети на ГВГ изображениях гиалиновой составляющей прогретых образцов не отмечалось (рис.21). Таким образом, денатурация коллагена типа II в интактных образцах тканей гиалиновой составляющей формообразующих хрящей невозможна.

а б Рисунок 21. ГВГ изображения гиалиновой части после прогрева:

хрящ носовой перегородки (а) и щитовидный хрящ гортани (б).

Данные термического анализа образцов гиалиновой составляющей формообразующих хрящей после модификационных обработок (табл. 7) подтверждают, что коллаген, как и в случае замыкательной пластины, имеет возможность полностью денатурировать при нагреве лишь после дезагрегации всей сетки ПГА матрикса гиалинового хряща трипсином (и химотрипсином). При этом ни электростатические взаимодействия (избыток NaCl не влияет на переход), ни сами ГАГ не играют решающей роли;

впрочем, деполимеризация цепей ГАГ в присутствии АВС хондроитиназы давала возможность частичной денатурации коллагена.

Таблица 7. Термодинамические характеристики денатурации коллагена в препаратах ткани гиалинового хряща* после модифицирующих обработок.

Вид обработки Hд, Дж/г сухой массы Тд, С -химотрипсин (n=5) 59±1*** 61±Трипсин (n=12) 40±5 59±Трипсин**(n=3) 42 ±3 60±АВС хондроитиназа (n=3) 65-5±1,5 M NaCl (n=3) 70-1±* все данные относятся к препаратам хряща носовой перегородки, за исключением помеченных**, которые относятся к препаратам щитовидного хряща; ***Дж/г коллагена.

Если часть коллагена в гиалиновом хряще ЗП претерпевает переход при нагреве, то в формообразующих хрящах такой фракции нет. Это можно объяснить трехкратным превышением степени агрегации ПГ в хрящах носа и гортани по сравнению с суставными хрящами [3]. Именно жесткая сетка ПГА в формообразующих хрящах оказывает необходимое сопротивление движению коллагеновой сетки при сдвиге, обеспечивая устойчивость к сдвиговым деформациям и сохранение формы органа. Очевидно, что чем жестче сетка ПГА, тем больше ограничений наложено на число конформаций для молекул коллагена в состоянии клубка, тем меньше S и выше Тд (рис.

д 17). Можно сделать заключение, что по мере роста устойчивости ткани к сдвиговым нагрузкам и уменьшения компрессионной нагрузки в ряду «пульпозное ядро – замыкательная пластина – формообразующие хрящи» термостабильность коллагена II в тканях возрастает вследствие агрегации протеогликанов.

Денатурация коллагена надхрящницы в целостной системе протекает при более высоких температурах, чем в отделенной надхрящнице. В случае щитовидного хряща Тд достигает 81-83°С (n=7), для хряща носовой перегородки Тд находится в диапазоне 70-75°С (n = 5) (рис. 22). Эффект уменьшения термической стабильности коллагена Рисунок 22. Примеры термограмм хряща с надхрящницей: носовая надхрящницы при нарушении перегородка (1) и щитовидный хрящ (2).

целостности системы надхрящницахрящ ярко проявлялся при гидротермальной обработке. Например, при 65°С в отделенной надхрящнице за 90 с протекал переход спираль-клубок (аморфизация матрикса и усадка ткани), а матрикс целостной системы оставался неизменным. Даже при 90°С в целостной системе в значительной степени сохранялись и нативные трехспиральные макромолекулы, и волокнистая структура, и анизотропные свойства ткани (рис. 23).

Благодаря взаимному переплетению коллагеновых сетей гиалиновой Гидротермальная обработка 90°С, 60 с Гидротермальная обработка 85°С, 10 мин Система с отделенной Целостная система надхрящницей Целостная система Рисунок 23. Влияние гидротермальной обработки на структуру коллагена в целостной и отделенной системе хрящ-надхрящница.

зоны и надхрящницы возникает целостная система формообразующего хряща. Эта система выдерживает высокие сдвиговые деформации (за счет гиалиновой составляющей) и способна к торсионным движениям (за счет надхрящницы). Стабилизация коллагеновой подсистемы надхрящницы осуществляется за счет интегрирования фибрилл коллагена в гиалиновую часть.

Раздел 3.5. посвящен исследованию термической стабильности коллагена в менисках, выполняющих ряд функций, важнейшей из которых является перераспределение компрессионной нагрузки, так, что значительная ее часть (до 70%) переходит в давление на окружную периферию мениска.

Матрикс мениска состоит из коллагена (59-66%), который представлен типами I и II (Hyp/Hyl=8-9.8, I ~ 66%); содержание ГАГ незначительно (2.2±0.3%). Анизотропные свойства мениска проявляются на КПОКТ томограммах, полученных при сканировании поверхности и продольных -срезов n~2.510, рис. 24б). Действительно на ГВГ изображениях ( поверхности визуализуются преимущественно параллельно лежащие волокна, а на продольных срезах более глубоких слоев - круговые пучки волокон с характерными складчатыми структурами - кримпами (рис. 24в, г).

На поперечных срезах проявляются поперечные стяжки, выходящие из приповерхностных слоев и оплетающие круговые пучки (рис. 24д).

Рисунок 24. Визуализация структуры матрикса мениска на разных срезах (а) с помощью КПОКТ (б) и многофотонной микроскопии (в-д).

На ДСК термограммах образцов из центральной части мениска (рис.

25) наблюдался переход с температурой пика 71± 3°С и H = 18.7± 4.8 Дж/г коллагена (n=18). Образцы не растворяются в трипсине, но в супернатант ). При повторном прогреве в переходит около 1/3 от всего Hyp (T = 34 ± 3% ячейке калориметра остатка в диапазоне 40-80°С происходит денатурация коллагена с H1=25±4 коллагена (n=3). В совокупности эти результаты показывают, что коллаген в мениске претерпевает лишь частичную денатурацию при первом нагреве.

После трипсинизации мениска на ГВГ изображениях наблюдалось разрыхление и появление складчатостей в поверхностном слое и поперечных стяжках при сохранении тонкой волокнистой структуры круговых пучков (рис. 26). Известно, что именно вокруг поперечных стяжек ПГ образуют сеть ПГА [4], которая разрушалась в присутствии трипсина, что и приводило к ослаблению внутренних напряжений и нарушению интактной организации этих структур. Денатурация коллагена при нагреве трипсинизированных образцов мениска в ячейке калориметра протекала полностью (Тд = 69± 0.5°С, Hд = 50± 5 Дж/г коллагена (рис. 25, кривая 2).

Рисунок 25. ДСК термограммы образцов центральной части мениска интактного (1) и подвергнутого обработке трипсином (2). На врезке – повторный прогрев образца после обработки трипсином.

Рисунок 26. Влияние трипсина на структуру мениска. ГВГ изображения поперечных (а, б) и продольных (в) срезов.

Для определения особенностей неполной денатурации коллагена в мениске было выполнено исследование образцов мениска, подвергнутых гидротермальной обработке (83°С и 73°С, 3 мин). После прогрева тонкая волокнистая структура от поверхности и поперечных стяжек сохранялась, но коллаген круговых пучков явно претерпел изменения (рис. 27). На ГВГ изображениях продольных срезов пучки стали малоразличимы, а на продольных срезах в них наблюдалось исчезновение кримпов и появление локальных аморфных областей. Деградация структур, обеспечивающих двулучепреломление среды, подтвердило и уменьшение n до 1-1.510-3 (на основе данных КПОКТ).

Рисунок 27. Влияние гидротермальной обработки (83°С, 3 мин) на структуру мениска.

ГВГ изображения поверхности (а) поперечного (б) и продольных (в) срезов.

Обработка трипсином прогретых образцов дает три фракции:

супернатант, дисперсию и остаток. Результаты аминокислотного и термического анализа фракций (табл. 8) подтвердили сохранение трехспиральной конформации значительной части макромолекул после прогрева. На термограммах остатка и дисперсии наблюдался эндотермический переход денатурации, и T составляла не более 41%.

Супернатант оказался обогащенным коллагеном I, а остаток и дисперсия - коллагеном II. Поскольку коллаген I концентрируется в круговых пучках, а коллаген II – в поперечных стяжках [5], то данные химических анализов подтвердили повышенную стабильность поперечных стяжек и меньшую – круговых пучков.

Таблица 8. Результаты анализа фракций мениска, полученных в результате трипсинизации прогретых образцов.

Мениск после гидротермальнй Мениск после гидротермальной Тип обработки при 73°С (n=4) обработки при 83°С (n=4) образцов Супернатант Дисперсия Остаток Супернатант Дисперсия Остаток T, % 28.5±2.5 14.5±0.5 57±2 41±1 20±2 40±Hyp/Hyl 10.9±0.8 8.5±0.2 8.6±0.2 10.1±0.2 8.2±0.1 8.4±0.** 92-80 76-70 76-70 84-79 72-67.5 71.5-I,% I***,% 32 14 54 45 19 II****,% 17 17 66 28 24 69±1 69.5±1.5 67.5±0.5 70±0.Тд, °С Hд, Дж/г 28±2 26.5±1.5 22.5±0.5 23.5±0.коллагена * доля коллагена в каждой фракции от общего количества;

** доля коллагена типа I в данной фракции по отношению к общему содержанию коллагена в данной фракции *** доля коллагена типа I во фракции от всего коллагена типа I в исходных образцах **** доля коллагена типа II во фракции от всего коллагена типа II в исходных образцах В случае мениска повышение термической стабильности коллагена поперечных стяжек связано с энтропийными затруднениями образования случайных клубков макромолекул. Ограничения обусловлены наличием вокруг этой подсистемы сетки ПГА [4], в свою очередь поперечные стяжки переплетают круговые пучки, ограничивая их свободный объем.

Дополнительные ограничения на величину S вносит натяжение фибрилл в д неповрежденных областях, связанное с усадкой волокон в зонах аморфизации. Исчезновение складчатостей в круговых пучках подтверждает их натяжение. Принцип стабилизации коллагена в приповерхностной зоне основан на внедрении проходящих волокон и фибрилл в более жесткую матрицу поперечных стяжек (аналогично системе «хрящ-надхрящница»).

Необычное термическое поведение подсистем каркаса матрикса мениска можно связать с их функциями. Круговые пучки, характеризующиеся меньшей устойчивостью к термическому воздействию, противостоят растягивающим силам. Термическая стабильность коллагена на поверхности является отражением его способности нести компрессионную нагрузку. Это же можно сказать о поперечных стяжках, по которым компрессионная нагрузка диссипирует в радиальном направлении.

Поперечные стяжки, ограничивая круговые пучки, препятствуют их выталкиванию из рабочей зоны и обеспечивают целостность мениска, препятствуя сдвиговым деформациям.

На основе изложенных в третьей главе данных можно сделать заключение о том, что величина Тд коллагена в тканях всегда коррелирует с морфологией и составом матрикса. Наличие ограничений на движение макромолекул в фибрилле и случайном клубке, связанных либо с взаимодействием с другими компонентами, либо с иммобилизацией проходящих фибрилл в матриксе более жесткой ткани, неизбежно приводит к увеличению Тд, вплоть до полной невозможности денатурации в ячейке калориметра. Изменение вида эндотермы и температуры денатурации коллагена в тканях с патологическими изменениями позволяет, во-первых, детектировать наличие дефектов в коллагеновой подсистеме, а, во-вторых, позволяет ограничить направление поиска причин заболевания на молекулярном уровне. Второй, на наш взгляд более фундаментальный, аспект изменения характеристик стабильности коллагена в ткани, связан с ее функцией. Обобщая наши результаты, можно утверждать: в ряду тканей, работающих на растяжение, компрессию, сдвиг, величина Тд возрастает. Повидимому, это возрастание отражает общее увеличение стабильности матрикса, связанное с вариациями архитектоники и состава, обеспечивающими комплексное функционирование ткани.

Четвертая глава посвящена анализу устойчивость матрикса в условиях лазерного нагрева. В разделе 4.1 описаны принципы взаимодействия лазерного излучения с биологическими тканями. В настоящей работе воздействие на ткани осуществляли с помощью излучения эрбиевого волоконного лазера (длина волны =1.56 мкм), все более широко используемого в современной лазерной медицине. В экспериментах варьировались мощность (0.25-5 Вт), режимы (импульсный или непрерывный) и способ (контактное или дистанционное) облучения. Нагрев вызван поглощением фотонов внутритканевой водой в области первого обертона валентного колебания OH (коэффициент поглощения µa = 9,65 см-1).

Эффективная глубина проникновения излучения в ткань ( ) определяется eff эффективным коэффициентом ослабления , eff=1/eff. В свою очередь eff eff зависит от, а также коэффициента и анизотропии рассеяния ( и g):

а s µeff = 3µa (µa + µs (1- g)) Для лазерного излучения с =1,56 мкм и коллагенсодержащих тканей µs=60 см-1, g=0,97 получаем µeff 13 см-1 и eff 0,8 мм [6].

В разделе 4.2 кратко даны основы ИК радиометрии, как современного и удобного метода определения пространственно-временных температурных полей. В разделе 4.3 приведены результаты исследования изменений, происходящих в матриксе соединительных тканей при неоднородном нагреве.

Для определения специфики лазеро-индуцированных превращений коллагеновой системы использовали модельную ткань связки надколенника (раздел 4.3.1). Нагрев осуществляли дистанционно в присутствии растягивающей силы вдоль главной оси связки и без нагрузки; достигаемые температуры в центре облучаемой зоны Тмакс соответствовали Тд коллагена в ткани связки, а также были и ниже, и выше. Данные об условиях облучения сведены в таблице 9. Временные и пространственные профили температур приведены на рис. 28.

Таблица 9. Условия ИК лазерной обработки образцов связок и термодинамические параметры денатурации коллагена в этих образцах.

Характеристики облучения, % Образцы* (мощность, Вт/ длительность Тмакс, °С** ДСК облучения, с/ пауза, с Л1 (17/7) 0.5 /4/0 - режим 1, без нагрузки 59±1 Л2 (15/6) 1/2/0 - режим 2, без нагрузки 65±1 57±Л3 (7/4) 2/0.5/0.5- режим 3,, без нагрузки 70±2 <ЛТ1 (11/5/) 0,5 /4/0 - режим 1, нагрузка 5 Н 59±1 27±ЛТ2 (9/5) 1/2/0 - режим 2, нагрузка 5 Н 65±1 62±ЛТ3 (5/4) 2/0.5/0.5 - режим 3, нагрузка 5 Н 70±2 46±* общее число облученных образцов / число образцов, для которых выполнен ДСК анализ ** максимальная температура в центре облучаемой зоны *** на сухую массу препарата а б Рисунок 28. Динамика приповерхностной температуры ткани в центре облучаемой области при лазерном нагреве в режимах 1-3 (а) и изменение радиального температурного поля во времени в режиме 1 (б).

Анализ полученных КПОКТ и ГВГ изображений, на которых четко визуализуется зона облучения, а также данных термического анализа (табл.9) позволил определить особенности лазеро-индуцированных изменений волокнистых структур матрикса ткани связки:

- несимметричная форма области изменений, которая оказалась вытянутой поперек основной оси связки (рис. 29);

- появление складчатостей (кримпов) в областях, граничащих с зоной непосредственного воздействия лазерного излучения, где температуры не превышают 30°С (рис. 30, 32);

- специфическая модификация ткани в области облучения, происходящая до денатурации коллагена (рис. 29а, 31);

- увеличение степени деградации коллагена на всех уровнях структурной иерархии в присутствии одноосного натяжения (табл. 9, рис. 32).

в а б г направление главной оси связки Рисунок 29. Примеры ГВГ (а, б) и КПОКТ (в, г) изображений ткани связок после лазерного воздействия (а – режим 1; б – режим 2; в, г – режим 3, сканирование вдоль (в) и поперек (г) основной оси связки.

Рисунок 30. Модификация коллагена Рисунок 31. ДСК термограммы образцов в образцах Л1 на ГВГ изображениях. после лазерной обработки.

Специфическая модификация надмолекулярной организации без денатурации (ДСК = 0) заключалась в дезорганизации упаковки коллагена - расщепление пучков на волокна и волокон на фибриллы, хаотичные направления хода волокон в пучках (рис. 30), что приводило к нарушению анизотропной структуры и уменьшению двулучепреломления (Л1:

n=2.5±1.010-3, Л3: n=3.9±0.510-3, рис. 29, 32). Подобные изменения выглядят как механические повреждения под действием разнонаправленных сил и не наблюдались при гидротермальной обработке. Термическое поведение модифицированной системы менялось по сравнению с интактной тканью: Tonset уменьшалась на 4-5°C, а для образцов Л1 и Л3, в дополнение к главному, наблюдался низкотемпературный пик денатурации Тп= 61±1 °C (рис. 31). Разрыхление плотной упаковки волокон приводит к увеличению свободного объема, конформационной энтропии денатурирующих цепей коллагена и, как следствие, к падению Тд.

Денатурация коллагена происходила в тех случаях, когда и Тмакс превышала Тд, и время воздействия является достаточным для раскручивания тройных спиралей макромолекул, переплетения полипептидных цепей случайным образом и аморфизации матрикса. Эти условия соблюдались в режиме 2; в результате центр зоны облучения образцов Л2 выглядел изотропным на ГВГ и КПОКТ изображениях (рис. 29б, 32), ДСК=43±3%.

Облучение в присутствие растягивающей силы вдоль главной оси связки приводило к денатурации во всех режимах облучения, а в режиме 2 к росту ДСК (табл. 9, рис. 32). Эти результаты противоположны полученному увеличению устойчивости к деградации коллагена в растянутых связках при гидротермальной обработке (рис. 5).

Рисунок 32. Влияние натяжения на изменение структуры связки при лазерном нагреве. Слева – на КПОКТ томограммах образцов ЛТ в зоне воздействия выявляются изотропные области; справа – ГВГ изображение образца ЛТпоказывает наличие обширной зоны с отсутствием волокнистой структуры (ср. с рис. 29 и 30).

Наблюдаемое различие результатов гидротермального и лазерного нагревов, очевидно, связано с неравновесным характером последнего. В условиях неоднородного в пространстве и времени температурного поля развиваются градиенты давлений, которые инициируют потоки тепла и воды, а также деформацию коллагеновых фибрилл, которой способствует распад термолабильных сшивок. Для тканей с одноосной упаковкой коллагена гидравлическая проницаемость очень мала, причем в продольном направлении ее величина составляет ~10-15м4Н-1с-1, а в поперечном почти в 50 раз меньше [7]. В результате в ткани развиваются механические напряжения, которые и способствуют расщеплению структуры на разных иерархических уровнях вплоть до разрывов. Поскольку сопротивление потоку в поперечном направлении больше, чем в продольном, и градиенты давлений в этом направлении значительнее, то, в результате повреждения в направлении, перпендикулярном направлению волокон, носят более серьезный характер. Если условия высокой температуры и механического воздействия сохраняются в течение некоторого времени, то локальная денатурация и разрывы фибрилл продолжаются, повреждения происходят на более высоком уровне иерархической организации коллагена (волокна, пучки), и денатурация может носить каскадный характер, приобретая черты объемного плавления. На макромолекулы в поврежденных волокнах уже не накладывается условие ограничения числа возможных конформаций в состоянии случайного клубка, и денатурация может протекать и при более низкой температуре. После охлаждения происходит релаксация напряжений;

в результате появляются кримпы, образование которых всегда имеет место при релаксации коллагенового волокна. Так проявляется фототермомеханический эффект неабляционного воздействия лазерного излучения умеренной интенсивности.

На основании полученных результатов нами предложена феноменологическая модель взаимодействия «лазерное излучение – волокнистый матрикс соединительной ткани». Модель основана на предположении, что денатурация коллагена вторична по отношению к термомеханическим повреждениям. Блок-схема процессов представлена на рис. 33. Каждая стадия схемы обусловлена фототермическим или фототермомеханическим эффектом лазерного воздействия, либо их совместным влиянием.

Рисунок 33. Блок-схема лазеро-индуцироанных превращений коллагена в соединительных тканях с волокнистой структурой.

Результаты экспериментального исследования лазеро-индуцированных изменений структуры матрикса склеры кролика представлены в разделе 4.3.2.

Контактное облучение длительностью 200 мс проводили при мощности 1,Вт, Тмакс достигала 75°С. В центре облученной области происходила денатурация коллагена, которая проявляется на КПОКТ томограммах как исчезновение двулучепреломления (рис. 34б). После растворения деградированного коллагена в присутствие трипсина в зоне воздействия образовывалась полость (T = 100%, рис. 34в). Тем не менее, на КПОКТ изображениях наблюдались локальные зоны, обладающие двулучепреломляющими свойствами, а на микрофотографиях полостей – пучки волокон, направленные к центру (рис. 34). Существование таких пучков связано с возникающими в результате денатурации силами натяжения, которые смещают неповрежденные части в зону деструкции.

Рис. 34. КПОКТ изображения интактной склеры (а) и после ИК лазерного облучения (б).

Стрелками указано наличие в зоне воздействия двулучепреломляющих структур.

Микрофотография облученной зоны склеры после обработки трипсином (в).

Лазеро-индуцированная деградация коллагена в тканях межпозвонкового диска обсуждается в разделе 4.3.3. Изменения коллагена фиброзного кольца и пульпозго ядра были определены в комплексе «позвонок-дискпозвонок» при контактном непрерывном и импульсном лазерном воздействии (табл. 10).

Таблица 10. Характеристики режимов лазерной обработки фиброзного кольца.

Режим Образец* мощность, Вт имп, мс** tвозд, сек** Тмакс, оС , % ДСК А ФКА(10/3) 0.25 - 20 56±2 1 ФК1 (10/5) 0.5 - 5 64±63±1 0.5 - 5 64±2 ФК1P (5/3) 2 ФК2 (4/2) 0.5 - 15 75±80±2 0.5 - 15 75±30±ФК2P (4/2) 3 ФК3(8/5) 1 - 5 85±92±3 1 - 5 85±52±ФК3P (4/2) 4 ФК4(10/3) 5 10 100 37±2 ~5 ФК5 (10/4) 5 50 20 76±2 60±* общее число облученных образцов / число образцов, для которых выполнен ДСК анализ.

Образцы с подрезанными внешними волокнами отмечены знаком P.

** имп - время импульса при частоте 1 Гц, tвозд - общее время воздействия.

Анализ КПОКТ и ГВГ изображений (рис. 35, 36) и данных термического анализа (табл. 10) выявил особенности изменения волокнистых структур коллагена при лазерной обработке ФК в комплексе П-Д-П:

- дезорганизация упаковки и переход спираль-клубок при ТмаксТд (режим 1);

- появление зон аморфизации матрикса в глубине ткани, где температура существенно ниже Тд (рис. 35);

- возрастание устойчивости коллагена ФК к лазерному нагреву после нарушения закрепления волокон внешней трети ФК в костной ткани;

- зависимость от скорости нагрева специфического характера модификации матрикса при Тмакс Тд (рис. 36).

Внутреннее натяжение и закрепление волокон в костной ткани позвонка уменьшают стабильность структуры при ИК лазерном воздействии. В отличие от гидротермального нагрева, после облучения ФК в комплексе П-Д-П в режиме (Тмакс<85°C) коллаген денатурирует ( ~65%), зоны ДСК аморфизации на КПОКТ томограммах). После Рисунок 35. КПОКТ изображения фиброзного нарушения целостности кольца (интактного и с подрезанными внешними волокнистой структуры ее волокнами P) после лазерного воздействия.

устойчивость к лазерному нагреву возрастала и оказалась сравнимой с термической стабильностью секвестрированных образцов. Переход спираль-клубок протекал лишь при Тмакс > Тд (режимы 2 и 3, рис. 35). Отсюда следует, что на развитие повреждений коллагена ФК, инициируемых ИК лазерным излучением умеренной интенсивности, оказывают значительное влияние механические процессы, связанные с потоками внутритканевой воды и деформацией сетки коллагена. Таким образом, предложенная схема лазеро-индуцироанных превращений коллагена в соединительных тканях с волокнистой структурой (рис. 33) применима и к ткани фиброзного кольца.

Влияние фототермического и фототермомеханического эффектов на модификацию матрикса зависит от соотношения между длительностью воздействия tвозд и характерным временем температурной релаксации тр=L2/4, которое составляло 0.1-1 c с учетом значений коэффициента температуропроводности ~1.310-7м2 с-1 [8] и линейных размеров L нагретой зоны с радиусом ~ 0.2 мм и глубиной ~ 0.8 мм. Для режима А в системе устанавливается температурное поле, близкое к стационарному (tвозд> ). Неравновесные явления, а следовательно, и фототермо тр механический эффект минимальны: модификация волокнистых структур выглядит как плавные искажения пучков в ламеллах и волокон в пучках (рис.

36), а поскольку Тмакс < Тд, переходы спираль-клубок не детектируются (ДСК =0).

Рисунок 36. КПОКТ и ГВГ изображения фиброзного кольца после лазерного воздействия в режимах А, 4 и 5.

В режиме 4 нагрев приближается к адиабатическому ( <<р ), и при имп облучении происходит распространение волн расширения-сжатия из зоны облучения в окружающую ткань. Потокам воды из зоны нагрева препятствует плотная упаковка коллагена, развиваются локальные перенапряжения и деформация сетки коллагена с последующей дезорганизацией: разволокнения фиброзных структур, прерывание и искажение хода волокон и ламелл. Все изменения вызваны фототермомеханическим эффектом воздействия, так как проявление фототермического эффекта практически исключено (Тмакс ~37°C, ДСК =0%).

В полном объеме оба эффекта взаимодействия ИК лазерного излучения с тканью проявлялись при увеличении до 50 мс (режим 5). Температура в имп центральной части пятна превышала Тд, и денатурация коллагена в сетке, деформированной и ослабленной за счет фототермомеханического действия лазерного излучения, носила объемный характер.

Лазеро-индуцированные изменения матрикса ФК после модификаций гиалуронидазой, трипсином и глицериновым альдегидом, моделирующих патологические и возрастные изменения, несколько отличались от превращений в интактных образцах (табл. 11, рис. 37).

После деструкции гликозаминогликанов гиалуронидазой деградация коллагена в образцах ФК1H оказалась меньше, чем в интактных образцах, что связано с пятикратным увеличением гидравлической проницаемости [9], более свободным движением воды и ослаблением фототермомеханического эффекта лазерного воздействия. Образцы группы ФК1G являются примером, Таблица 11. Характеристика модифицированных образцов фиброзного кольца после лазерного воздействия.

Химическая , % Группа Режим лазерной обработки ДСК обработка Гиалуронидаза 1 (0.5Вт, 5с; Тмакс= 65 C) ~10 (n=3) ФК1H Гиалуронидаза 3 (1Вт, 5с; Тмакс= 85 C) ~20 (n=3) ФК3H Трипсин 0.5Вт, 5с; Тмакс= 65 C 55±5/50±5*(n=3) ФК1T Трипсин 1Вт, 5с; Тмакс= 85 C ~100(n=3) ФК3T Глицеральдегид 0.5Вт, 5с; Тмакс= 65 C 25±2(n=3) ФК1G Глицеральдегид 1Вт, 5с; Тмакс= 85 C 64±4(n=3) ФК3G * значения вычислено относительно Hд коллагена в интактной/трипсинизированной ткани фиброзного кольца (табл. 3).

Рисунок 37. КПОКТ томограммы модифицированной ткани ФК после лазерного воздействия.

когда фототермомеханический эффект лазерного воздействия оказывается решающим для деградации коллагеновой сетки, так как термическая денатурация макромолекул невозможна вплоть до 75°С. После обработки сшивающими агентами эластичность ткани ФК уменьшается, и частота механических повреждений в материалах возрастает [10]. Действительно ДСК достигала 25%, и на КПОКТ томограммах детектировались нарушения в анизотропной укладке. Очевидно, что переходы спираль-клубок протекали в механически поврежденных фибриллах и волокнах. При повышении температуры обработки до 85 C денатурация в образцах ФК3G протекала достаточно активно (ДСК=64%), однако, без полной потери двулучепреломления и образования аморфных областей. Это объясняется уменьшением подвижности полипептидных цепей после сшивки и сохранением макромолекулой своего положения в фибриллах.

Максимальные повреждения (высокое значение и обширные ДСК изотропные области) отмечались у образцов, предварительно обработанных трипсином. Этот фермент не только полностью разрушает ПГ подсистему, но и ослабляет коллагеновую сеть за счет разрушения телопептидных доменов коллагена и уменьшения взаимодействия коллагена с ПГ; в результате в образцах ФКT при лазерном воздействии интенсивно наблюдались как повреждения коллагеновой сети, так и последующая денатурация макромолекул.

Достигаемая при ИК лазерном воздействии температура не является решающим фактором, определяющим полноту деградации коллагена в пульпозном ядре при его облучении через пункционный прокол в фиброзном кольце (табл. 12). Окружение облучаемой области тканями ФК и замыкательной пластины препятствует движению внутритканевой воды и испарению воды с поверхности образца и способствует развитию напряжений. Весьма вероятно, что именно эти отличительные особенности материальных свойств ПЯ имеют решающее значение для механических повреждений фибрилл коллагеновой сети. Самые высокие значения характерны для режимов первой группы, где изменения температуры не превышали 10°С, но благодаря высокой скорости нагрева при значительной мощности излучения, фототермомеханический эффект проявлялся наиболее ярко. Значения оказались существенно ниже при более низкой скорости нагрева во второй группе. Денатурация коллагена в образцах третьей группы является результатом воздействия, главным образом, фототермомеханического эффекта (Тмакс>Тд).

Таблица 12. Режимы облучения пульпозного ядра в комплексе позвонок-диск-позвонок и данные о деградации коллагена в образцах.

3 группа 1 группа 2 группа Группа режимов имп = имп = 10 мс имп = 100 мс 1000 мс Мощность излучения, Вт 3 5 5 1.5 1.5 1.5 0.Время облучения/интервал 20 20 40 10/10 40 5/10 20/между цугами импульсов, с Число цугов импульсов 1 1 1 3 1 4 Частота, Гц 1 1 1 1 0,5 2 0,Тмакс, оС 29±1 32±2 33±1 56±1 51±1 47±2 70±70±3 74±4 94±4 25±5 20±5 27±3 92±,% ДСК (n=5) (n=5) (n=5) (n=3) (n=3) (n=3) (n=3) Инициируемая лазерным нагревом модификация матрикса гиалиновой составляющей хряща носовой перегородки (данные представлены в разделе 4.3.4) отличается по своему характеру от термомеханической деградации коллагеновой подсистемы волокнистых тканей. Установлено, что денатурация коллагена в гиалиновом хряще незначительна. Если Тмакс не превышала 55-60С, то при временах облучения tвозд до 1 минуты степень деградации коллагена Т, определенная по количеству коллагена, подверженного действию трипсина, составляла 2-5%, что соответствует Т в интактных образцах. При достижении Тмакс70С и выше, Т возрастала с увеличением tвозд, но не превышала 15–16% (рис. 38а). Доказательством сохранения интактных макромолекул коллагена стали данные ДСК анализа облученных и затем подвергнутых обработке трипсином образцов, на термограммах которых проявлялся эндотермический эффект денатурации коллагена (рис. 38б). Сохранение в облученных образцах коллагеновой сетки, хотя и измененной, со слипшимися фибриллами, подтвердилось морфологическими исследованиями, (рис. 38в).

а б Рисунок 38. Сохранение структуры коллагена в в гиалиновом хряще носовой перегородки после ИК лазерного воздействия: устойчивость к действию трипсина облученных образцов (а); эффект денатурации на ДСК термограммах (б) и волокнистые структуры коллагена на микрофотографии (в, окраска пикрофуксином, 40) облученных и за тем трипсинизированных образцов.

Незначительная степень деградации коллагена в гиалиновом хряще б при ИК лазерном воздействии связана, с тем, что фототермомеханический эффект в этой ткани не столь существенен. Иммобилизация фибрилл коллагена ПГ агрегатами предотвращает их механическую деформацию, а сопротивление потокам воды меньше, чем в волокнистых тканях (из-за более высокого значения гидравлической проницаемости ~3.0·10-14м4Н-1с-[9]). В результате механические повреждения фибрилл оказываются менее значительными.

Определенная дезорганизация матрикса гиалинового хряща при лазерном нагреве, тем не менее, происходила. Ее проявления регистрировались на облученных препаратах и сводились к следующему:

- уменьшение метахромазии анионных красителей (рис. 39);

- увеличение скорости вымывания ГАГ из хрящевой ткани в буферный раствор (табл. 13);

- изменение спектров КР (рис. 40);

- уменьшение в облученных препаратах хряща сорбционной емкости монослоя Xm, полученной из изотерм сорбции воды, обработанных в рамках модели БЭТ и ГАБ1 (табл. 13).

Все эти данные указывают на изменение подсистемы протеогликанов.

Уменьшение метохромазии обусловлено уменьшением степени связывания анионного красителя (толуидинового синего) и указывает на дезагрегацию протеогликановых агрегатов. Это коррелирует с эффективным вымыванием ГАГ из облученных препаратов в буферный раствор.

Важная информация об а б изменениях компонентов матрикса гиалинового хряща получена с помощью анализа КР спектров. Все основные характеристические частоты Рисунок 39. Уменьшение метахромазии сохраняли свои значения, в том анионного красителя в облученных образцах числе и дублет 1245-1263 см-1, хряща носовой перегородки (б) по сравнению связанный со сложным с контролем (а) (окраска толуидиновым синим, 40).

колебательным движением в плоскости пептидной связи (Амид III) и характеризующий трехспиральную конформацию коллагена. Изменения отмечены в широкой полосе 1000-1200 см-1, однозначно связанной с колебаниями пиранозного кольца SOи групп ГАГ. В облученных образцах меняется соотношение интенсивностей пиков 1063 см-1 и 1046 см-1, весьма чувствительных к конформации полисахаридной Рисунок 40. Спектры КР гиалинового хряща цепи и взаимодействиям ГАГ- носовой перегородки после облучения Тмакс= вода [10]. Эти изменения, в 70°С, tвозд = 10 c (1) и Тмакс= 80°С, tвозд = совокупности с уменьшением Xm, c (2).

характеризующей количество доступных для молекул воды полярных групп, позволяют сделать предположение о нарушении в облученных образцах взаимодействия Изотерма ГАБ – изотерма Гуггенгейма, Андерсона и де Бора, при выводе которой учитывает разность химических потенциалов адсорбата в толще воды и не только в первом (как в БЭТ), но и последующих адсорбционных слоях.

полярных групп биополимеров с водой, вызванного конформационными изменениями ГАГ.

Таблица 13. Изменение свойств гиалинового хряща носовой перегородки после ИК лазерного нагрева.

сорбционная емкость монослоя Содержание ГАГ в Образец буферном растворе*, XmБЭТ XmГАБ мг/г Контроль 0,070±0,01 0,083±0.01 20,8±2.После лазерного воздействия, 0.058±0,026** 0,058±0.016** 53,5±7.5**,*** Тмакс=70С, tвозд = 40 c После лазерного воздействия, 0.060±0,012** 0,064±0.01**,*** 34,9±8.4**,*** Тмакс=50С, tвозд = 30c * вымывание из сухих препаратов, анализ через 26 часов после выдерживания в растворе;

** статистически значимое различие от группы контроля (p<0.05);

*** статистически значимое различие между группами облученных образцов (p<0.05).

Высокая концентрация гликозаминогликанов, наличие ПГА, низкая доля коллагена, не образующего волокон, и более высокая гидравлическая проницаемость предопределяют гораздо меньший уровень повреждений в коллагеновой сети при лазерном нагреве гиалинового хряща, чем в случае тканей с волокнистой структурой. Однако, препятствуя потокам воды из зоны нагрева (а в тканях гиалинового хряща именно ПГА выполняет эту роль), протеогликановая подсистема претерпевает модификацию. Очевидно, что эта модификация приводит к нарушению взаимодействия протеогликановой и коллагеновой подсистем, после чего коллаген становится способен к частичной денатурации. При этом, поскольку после дезорганизации сети ПГА гидравлическая проницаемость, как правило, возрастает, то и фототермомеханический эффект ослабевает; в результате развития повреждения коллагеновой сети гиалинового хряща при умеренном лазерном нагреве не происходит. При дальнейшем повышении мощности излучения деградация коллагена носит значительно более серьезный характер.

В разделе 4.3.5 обсуждаются превращения, инициируемые ИК лазерным нагревом в жировой ткани. Основным по массе компонентом этой ткани являются жиры - триацилглицериды (ТГ), которые существуют в виде огромных капель в клетках; клетки организованы в группы – дольки, разделенные перегородками из волокон коллагена и аморфного эластина.

Из-за повышенного содержания в ТГ остатков ненасыщенных кислот фазовое состояние жира человека (ЖЧ) является расплавом при температуре 20°С, в отличие от жиров запаса свиньи (ЖС) или коровы, которые представлены аморфной и не менее чем одной кристаллической фазами. При лазерном нагреве тканей поглощенная энергия расходовалась на плавление ТГ, а ткани ЖС нагревались медленнее, чем ЖЧ, и на радиометрических кривых лазерного нагрева этих жировых тканей появлялись особенности, включая изотермическое плато (рис. 41).

Рисунок 42. Влияние лазерной обработки на Рисунок 41. Сравнение динамики термическое поведение ЖЧ: (1-3) – температуры поверхности при ИК охлаждение; (4-6) – нагрев; интактные лазерном нагреве (1.5 Вт) жира образцы (1, 4), после лазерной обработки: Тмакс человека (1) и свиньи (2). = 50°С, tвозд =90 с (2,5), Тмакс=70°С, tвозд=90 с (3,6).

Таблица 14. Изменение термических характеристик жировой ткани после лазерной обработки Нагрев –30°90°С, 10К/мин Охлаждение , 25°-30°С, ДСК Экзотермический , Тmax Эндотермический переход % 5К/мин переход (белок) Q, Ткр °С Qm, Дж/г Т, °C Tm,°C Дж/г Жировая ткань человека (ЖЧ) Интактная -7.5±1.5 Отсутствует 106±8 3,2±0, 30 с, 50°С, -8,5±0,5 -20,3±0,2 -0,6±0,3 95±10 90 с, 50°С, -10.9 -20,3 4,7 -1 100 270 с, 50°С, -14.2 -20,3 4,4 -1,8 86 4,8±1, -3,30 с, 70°С -16±1 -20,3±0,1 68±8 Жировая ткань свиньи (ЖС) -2,2±0,8;

Интактная нет 0±0,7; 29,4±0,5 95±10 -13,5±30 с, 70°С -2,8; -14,5 нет 3±0,2; 30±0,5 93±10 ИК лазерное воздействие мощностью 3 и 3,5 Вт и временах до 270 с приводило к достижению максимального значения Тmax (50 или 70°С) за 2025 с, после чего температура не менялась, так как скорости отвода и выделения тепла были равны. Анализ ИК спектров облученных образцов показал, что разрывы и образования ковалентных связей при этом не происходили. Термическое поведение ЖC после облучения не менялось, а термограммы облученных образцов ЖЧ отличались от исходных (рис. 42).

С увеличением Тмакс или tвозд температура кристаллизации Ткр снижалась при охлаждении в первом периоде цикла термического анализа (нагрев – охлаждение), а при нагреве второго периода цикла температура и теплота плавления (Tпл и Qпл) монотонно уменьшались (табл. 14). Кроме того, на кривых плавления облученных образцов ЖЧ непосредственно перед плавлением проявлялся экзотермический переход.

В общем случае при одинаковых параметрах лазерного воздействия, ТГ в жировой ткани человека претерпевали более сильный перегрев над температурой плавления по сравнению с ЖС. Такой перегрев приводил к разрушению остатков кристаллической структуры и молекулярных ассоциатов, служащих зародышами при кристаллизации. В ЖС кристаллическая фаза в соответствии с данными ДСК сохраняется до 45°С, а кратковременный локальный лазерный нагрев до 70°С не приводит к разрушению ассоциатов ТГ и остатков кристаллической структуры. В результате образующаяся при охлаждении кристаллическая модификация соответствовала исходной форме (). Лазерная обработка ЖЧ до 50-70°С приводила к значительному перегреву расплава ТГ по сравнению с Тпл и, как следствие, к уменьшению размеров и разрушению ассоциатов. Заметное понижение Ткр с увеличением tвозд и Тмакс свидетельствовало о возрастающих затруднениях в образовании зародышей кристаллической фазы. При быстром охлаждении жидкого жира образовалась метастабильная кристаллическая модификация ТГ, которая при последующем нагреве переходила в более устойчивую модификацию. Уменьшение Тпл и Qпл с ростом tвозд и Тмакс свидетельствовало об уменьшении стабильности кристаллической фазы, полученной при охлаждении жировой ткани, подвергнутой лазерной обработке; это связано с увеличением доли ТГ, остающихся в жидком состоянии при переохлаждении.

Лазеро-индуцированную модификацию белков жировой ткани человека и свиньи исследовали после ее обезжиривания, обезвоживания и выделения протеиновой фракции, основным компонентов которой является коллаген. Удаление пластификаторов приводило к уменьшению сегментальной подвижности полипептидных цепей и к увеличению наблюдаемой Тд до 124°C. После лазерной обработки Hд коллагена в протеиновой фракции уменьшалась (рис. 43), а ДСК возрастала (табл. 14).

Важной особенностью ДСК кривых протеиновой компоненты облученных образцов оказалось наличие аномалии в виде скачка теплоемкости при 106°С, соответствующего расстеклованию аморфных полимеров. В случае интактных (квазикристаллических) сухих белков расстеклование не проявлялось.

Рисунок 43. ДСК термограммы полипептидной фракции ЖЧ. 1 – из интактного образца, 2 -4– из образцов после лазерного нагрева: 2 - 50° С, 90 с; – 50° С, 270 с; 4 – 70 °С, 30с.

После лазерного облучения длительностью свыше 60 с в режиме интенсивного воздействия (мощность свыше 4 Вт, Тмакс ~ 100-130°С) происходила перестройка углеводородного скелета компонентов жировой ткани. В ИК спектре образцов отмечалось уменьшение относительной интенсивности максимума пика 3006 см-1, относящегося к валентному колебанию =CH, и появление новых пиков с максимумами 1070 см-1 и 883см-1, относящихся, наиболее вероятно, к колебаниям эфирной и эпоксигрупп соответственно (рис. 44). Интенсивный лазерный нагрев открытых участков жировой ткани, по-видимому, приводил к окислению двойной связи кислородом воздуха. Резкое уменьшение интенсивности полосы 1655 см-1 (Амид I) указывает на значительную деградацию белковой компоненты.

Рисунок 44. Спектр ИК поглощения жировой ткани человека (1 – интактный и после лазерной обработки до температуры 700С; 2 – после лазерной обработки до 1200С).

В заключение следует отметить, что характер лазероиндуцированных превращений матрикса в значительной степени зависит от состава и архитектоники ткани. Для получения целевого эффекта лазерной обработки, следует учитывать не только термические, но и термомеханические эффекты, возникающие даже при умеренном лазерном нагреве.

Выводы:

1. Предложен подход определения состояния коллагена в соединительных тканях на всех уровнях структурной иерархии, включающий в себя:

- определение содержания основных компонентов матрикса, а именно, коллагена с оценкой его типового состав и гликозаминогликанов;

- определение конформации (тройная спираль, случайный клубок) макромолекул коллагена (методы дифференциальной сканирующей калориметрии, спектроскопии комбинационного рассеяния, устойчивость к неспецифическим протеолитическим ферментам);

- определение упаковки макромолекул в фибриллы и фибрилл в волокна (метод электронной микроскопии);

- определение укладки фибрилл в волокна и волокон в пучки и/или ламеллы (методы многофотонной микроскопии с регистрацией генерации второй гармоники, световой микроскопии);

- определение общей анизотропии ткани (методом кроссполяризационной оптической когерентной томографии);

- определение температуры перехода Тд (температура денатурации) макромолекул коллагена из конформации тройной спирали в случайный клубок (метод дифференциальной сканирующей калориметрии).

2. На примерах тканей глаза (склера, Тенонова капсула) показана связь между отклонениями физико-химических характеристик матрикса соединительных тканей от контроля и направлением патологических изменений коллагенового каркаса ткани. Предложен и охарактеризован метод стабилизации матрикса за счет действия сшивающих агентов на коллагеновую сеть.

3. Установлено, что температура денатурации является характеристикой состояния коллагена, а ее отклонение от Тд выделенного фибриллярного коллагена определяется архитектоникой ткани, а именно:

- иммобилизацией (полной или частичной) фибрилл коллагена сеткой протеогликановых агрегатов в ткани гиалинового хряща;

- закреплением волокон коллагена фиброзного кольца в костной ткани;

- закреплением волокон коллагена надхрящницы формообразующих хрящей в зонах гиалинового хряща.

Факторы закрепления и иммобилизации влияют на энтропию случайного клубка полипептидных цепей коллагена, определяя температуру денатурации Tд=Hд/Sд.

4. Установлена закономерность последовательного увеличения термической стабильности коллагена в тканях, работающих преимущественно на растяжение, сжатие и сдвиг. В матриксе мениска обнаружено две подсистемы коллагена с разной термической стабильностью - круговые пучки и поперечные стяжки. Согласно установленной закономерности для этих подсистем выполнено отнесение функций: круговые пучки противостоят растяжению, а поперечные стяжки – сдвиговым деформациям.

5. Показано, что неоднородный нагрев волокнистых тканей под действием ИК лазерного излучения приводит к повреждениям термомеханического характера. При этом деградация коллагеновой сети на всех уровнях структурной иерархии происходит при температурах, существенно более низких, чем при гидротермальном нагреве. Фактор натяжения волокон, стабилизирующий коллаген при гидротермальном нагреве, оказывает противоположное дестабилизирующее действие.

6. Предложена схема модификации коллагена в соединительной ткани с волокнистой структурой в условиях нагрева ткани ИК лазерным излучением умеренной интенсивности. Эта схема включает последовательно следующие стадии:

- локальные конформационные переходы макромолекул коллагена из тройной спирали в случайный клубок;

- локальная деформация и разрывы в фибриллярной структуре;

- перераспределение натяжения по соседним макромолекулам и разрыв ослабленных фибрилл и волокон;

- объемное плавление коллагена.

Каждая стадия предложенной схемы обусловлена фототермическим или фототермомеханическим эффектом лазерного воздействия, либо их совместным влиянием.

7. Показано, что лазеро-индуцированные превращения матрикса соединительной ткани зависят от химического состава, морфологии и материальных свойств (в том числе гидравлической проницаемости) матрикса. Наименее стабильная подсистема подвергается деградации в первую очередь и определяет непосредственный отклик матрикса. В волокнистых тканях (связка, фиброзное кольцо) дезорганизация начинается с механической деструкции коллагеновой сети, в ткани гиалинового хряща- с разрушения протеогликановой подсистемы, в жировой ткани - с плавления, разрушения ассоциатов и окисления липидов. Химические (возрастные и патологические) изменения компонентов и состава матрикса приводят к изменению механических свойств ткани, тем самым специфически влияя на первичный отклик ткани к неоднородному лазерному нагреву. Найденные закономерности дают научную основу выбора оптимального режима ИК лазерного воздействия на соединительные ткань разных типов с целью получения желаемого терапевтического эффекта.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ ИЗЛОЖЕНЫ В СЛЕДУЮЩИХ ПУБЛИКАЦИЯХ:

1. Ignatieva N.Yu., Lunin V.V., Majorova A.F., Mudretsova S.N.,, Bagratashvili V.N., Sobol E.N., Sviridov A.P. Thermoanalytical study of cartilaginous tissue // Mendeleev Communication. 2000. N 4. P. 223-224.

2. Bagratashvili N.V., Ignatieva N.Yu, Kharlanov A.N., Lunin V.V. FTIR spectroscopy of main components of cartilage // Proceedings of SPIE. 2000. V.

4241. P. 268-271.

3. Баграташвили Н.В., Игнатьева Н.Ю., Лунин В.В., Свиридов А.П., Харланов А.Н. Исследование системы хондроитинсульфат - вода методом ИК-Фурье-спектроскопии // Вестник Московского Университета. Сер. 2, Химия. 2001. Т. 42. № 6. С. 373-375.

4. Игнатьева Н.Ю., Гроховская Т.Е., Лунин В.В., Баграташвили В.Н., Свиридов А.П., Махмутова Г.Ш. Лазерно-индуцированные структурные и химические изменения жировой ткани // Журнал физической химии.

2002. Т. 76. № 8. С. 1357-1364.

5. Соболь Э.Н., Большунов А.В., Воробьева Н.Н., Омельченко А.И., Захаркина О.Л., Игнатьева Н.Ю., Гроховская Т.Е., Лунин В.В.

Коррекция рефракции глаза путем неабляционного лазерного воздействия на термомеханические свойства роговицы и склеры // Квантовая электроника. 2002. Т. 32. № 10. С. 909-912.

6. Баграташвили В.Н., Баграташвили Н.В., Игнатьева Н.Ю., Лунин В.В., Гроховская Т.Е., Аверкиев С.В., Свиридов А.П., Шах Г.Ш. Структурные изменения в соединительных тканях при умеренном лазерном нагреве // Квантовая электроника. 2002. Т. 32. № 10. С. 913-916.

7. Ignatyeva N.Yu., Sobol E.N., Lunin V.V., Averkiev S.V., Bagratashvili V.N., Sviridov A.P., Korobov M.V. Modification of Collagen-Containing Tissues by IR Laser Radiation // Laser Physics. 2003. V. 13. N 1. P. 1-6.

8. Аверкиев С.В., Игнатьева Н.Ю., Лунин В.В., Соболь Э.Н. Влияние лазерного излучения на адсорбцию воды сухими препаратами хрящевой ткани и коллагена // Биофизика. 2003. Т. 48. № 3. С. 505-510.

9. Шах Г.Ш., Свиридов А.П., Шехтер А.Б., Косминкова И.Н., Игнатьева Н.Ю., Баграташвили В.Н. Разработка методики лазерного лифтинга поверхостно-мышечной фасциальной системы // Анналы пластической, реконструктивной и эстетической хирургии. 2003. № 3. С. 25-35.

10. Игнатьева Н.Ю., Соболь Э.Н., Аверкиев С.В., Лунин В.В., Гроховская Т.Е., Баграташвили В.Н., Янцен Е.С. Термическая стабильность коллагена II в хряще // Доклады Академии Наук. 2004. Т. 395. № 5. С.

696-698.

11. Ignatieva N.Yu., Lunin V.V., Averkiev S.V., Maiorova A.F., Bagratashvili V.N., Sobol E.N. DSC investigation of connective tissues treated by IR-laser radiation // Thermochimica Acta. 2004. V. 422. N 1-2. P. 43-48.

12. Аверкиев С.В., Игнатьева Н.Ю., Соболь Э.Н., Лунин В.В., Баграташвили В.Н. Диагностика состояния соединительных тканей при ИК лазерном воздействии с помощью спектроскопии комбинационного рассеяния // Вестник Московского Университета. Сер. 2, Химия. 2005. Т. 46. № 1. С.

24-28.

13. Игнатьева Н.Ю., Аверкиев С.В., Соболь Э.Н., Лунин В.В. Денатурация коллагена II в хрящевой ткани при термическом и лазерном нагреве // Журнал физической химии. 2005. Т. 79. № 8. С. 1505–1513.

14. Игнатьева Н.Ю. Коллаген – основной белок соединительной ткани (обзор). // Эстетическая медицина. 2005. Т. VI. № 3. С. 247-256.

15. Yansen E.S., Ignatieva N.Yu., Averkiev S.V., Shekhter A.B., Lunin V.V., and Sobol E.N. Changes in proteoglycan subsystem of cartilage as a result of infrared-laser treatment // Laser Physics. 2005. V. 15. N 12. P. 1660–1663.

16. Sobol’ E.N., Baum O.I., Bol’shunov A.V., Siplivy V.I., Ignat’eva N.Y., Zakharkina O.L., Lunin V.V., Omelchenko A.I., Kamensky V.A., and Mjakov A.V. Eye tissue structure and refraction variations upon nondestructive laser action // Laser Physics. 2006. V. 16, N 5. P. 1–6.

17. Zimnyakov D.A., Sviridov A.P., Kuznetsova L.V., Baranov S.A., Ignatieva N.Y. Monitoring of tissue thermal modification with a bundle-based full-field speckle analyzer // Applied Optics. 2006. V. 45. N 18. P. 4480-4490.

18. Игнатьева Н.Ю., Аверкиев С.В., Лунин В.В., Гроховская Т.Е., Обрезкова М.В. Влияние надмолекулярной организации хрящевой ткани на термическую стабильность коллагена // Журнал физической химии.

2006. Т. 80. № 8. С. 1336–1341.

19. Аверкиев С.В., Игнатьева Н.Ю., Соболь Э.Н., Шехтер А.Б., Баранов С.А., Обрезкова М.В., Лунин В.В. Модификация коллагеновых волокон при лазерной обработке хрящевой ткани // Вестник Московского Университета. Сер. 2, Химия. 2006. Т. 47. № 5. С. 367-373.

20. Игнатьева Н.Ю., Данилов Н.А., Аверкиев С.В., Обрезкова М.В., Лунин В.В., Соболь Э.Н. Определение гидроксипролина в тканях и оценка содержания в них коллагена // Журнал аналитической химии. 2007. Т. 62.

№ 1. C. 51–57.

21. Игнатьева Н.Ю., Аверкиев С.В., Иомдина Е.Н., Иващенко Ж.Н., Баратова Л.А., Лукашина Е.В., Лунин В.В. Изменение физикохимических характеристик склеры в результате склероукрепляющего вмешательства // Биофизика. 2007. Т. 52. № 2. С. 324-331.

22. Андреева И.В., Игнатьева Н.Ю., Аверкиев С.В., Лунин В.В., Захаркина О.Л., Обрезкова М.В. Термическая стабильность коллагена в тканях межпозвонкового диска // Вестник Московского Университета. Сер. 2, Химия. 2007. Т. 48. № 1 С. 3-8.

23. Игнатьева Н.Ю., Данилов Н.А., Лунин В.В., Обрезкова М.В., Аверкиев С.В., Чайковский Т.И. Изменение термодинамических характеристик денатурации коллагена тканей глаз в результате неферментативной гликации // Вестник Московского Университета. Сер. 2, Химия. 2007. Т.

48. № 2. С. 75-79.

24. Зимняков Д.А., Свиридов А.П., Кузнецова Л.В., Баранов С.А., Игнатьева Н.Ю., Лунин В.В. Спекл-коррелометрический анализ кинетики термической модификации биотканей // Журнал физической химии.

2007. Т. 81. № 4. С. 626-631.

25. Игнатьева Н.Ю., Захаркина О.Л., Соболь Э.Н., Лунин В.В., Каменский В.А., Андреева И.В., Аверкиев С.В., Мяков А.В. Изменение структуры коллагена фиброзного кольца при термическом и ИК лазерном воздействии. Доклады Академии Наук // 2007. Т. 413. № 6. С. 845–847.

26. Sobol E.N., Milner T.E., Shekhter A.B., Baum O.I., Guller A.E., Ignatieva N.Y., Omelchenko A.I., and Zakharkina O.L. Laser reshaping and regeneration of cartilage // Laser Physics Letters. 2007. V. 4. N 7. P. 488–502.

27. Ignatieva N.Yu., Zakharkina O.L., Andreeva I.V., Sobol E.N., Kamensky V.A., Myakov A.V., Averkiev S.V., and Lunin V.V. IR laser and heatinduced changes in annulus fibrosus collagen structure // Photochemistry and Photobiology. 2007. V. 83. P. 675–685.

28. Ignatieva N., Zakharkina O., Leroy G., Sobol E., Vorobieva N., and Mordon S. Molecular processes and structural alterations in laser reshaping of cartilage // Laser Physics Letters. 2007. V. 4. N 10. P. 749–753.

29. Логунова М.А., Шахова М.А., Андреева И.В., Игнатьева Н.Ю., Каменский В.А., Баграташвили В.Н. Эффект уменьшения термостабильности коллагена при нарушении целостности ткани щитовидного хряща гортани // Биофизика. 2008, Т. 53. № 5. С. 202-210.

30. Андреева И.В., Захаркина О.Л., Игнатьева Н.Ю., Каменский В.А.

Эффект взаимодействия лазерного излучения с биотканями межпозвонкового диска // Альманах клинической медицины. 2008. Т.

XVII. Часть 1. С. 5-8.

31. Danilov N.A., Ignatieva N.Yu., Iomdina E.N., Semenova S.A., Rudenskaya G.N., Grokhovskaya T.E., Lunin V.V. Stabilization of scleral collagen by glycerol aldehyde cross-linking // Biochimica et Biophysica Acta. 2008. V.

1780. N 5. P. 764–772.

32. Ignatieva N., Zakharkina O., Andreeva I., Sobol E., Kamensky V., and Lunin V. Effects of laser irradiation on collagen organization in chemically induced degenerative annulus fibrosus of lumbar intervertebral disc // Lasers in Surgery and Medicine. 2008. V. 40. P. 422–432.

33. Ignatieva N., Zakharkina O. The role of in situ tissue constraint in collagen stability under non- and homogeneous heating // Journal of Biomechanics.

2008. V. 41. Suppl. 1. P. 505.

34. Иомдина Е.Н., Тарутта Е.П., Игнатьева Н.Ю., Костанян И.А., Минкевич Н.И., Шехтер А.Б., Данилов Н.А., Кваацхелия Н.Г., Чернышева С.Г.

Современные достижения фундаментальных исследований патогенеза прогрессирующей миопии // Российский офтальмологический журнал.

2008. Т. 1. № 3. С. 7-12.

35. Захаркина О.Л., Игнатьева Н.Ю., Иксанов Р.P., Каменский В.А., Соболь Э.Н., Лунин В.В. Влияние одноосного натяжение на стабильность коллагеновых волокон в условиях неоднородного лазерного нагрева // Журнал физической химии. 2009. Т. 83. № 2. С. 383-390.

36. Андреева И.В., Игнатьева Н.Ю., Захаркина О.Л., Лунин В.В.

Лазероиндуцированная модификация коллагена в геле пульпозного ядра // Журнал физической химии. 2009. Т. 83. № 3. С. 590–592.

37. Голубятников Г.Ю., Шахова М.А., Снопова Л.Б., Терентьева А.Б., Игнатьева Н.Ю., Каменский В.А. Сравнительные исследования инфракрасного лазерного и высокочастотного воздействия на биоткани in vitro методом поляризационно-чувстительной оптической когерентной томографии // Известия высших учебных заведений. Радиофизика. 2010.

Т. 53. № 1. С. 41-50.

38. Данилов Н.А., Игнатьева Н.Ю. Стабилизация склеры при гликации // Вестник Казанского технологического университета. 2010. № 2. С. 11-17.

39. Данилов Н.А., Игнатьева Н.Ю., Иомдина Е.Н., Гроховская Т.Е., Обрезкова М.В., Руденская Г.Н., Лунин В.В. Увеличение стабильность склерального коллагена в ходе гликодимирования треозой in vitro // Журнал физической химии. 2010. Т. 84. № 1. С. 131-137.

40. Ignatieva N.Y., Guller A.E., Zakharkina O.L., Sandnes B., Shekhter A.B., Kamensky V.A., Zvyagin A.V. Laser-induced modification of the patellar ligament tissue: comparative study of structural and optical changes // Lasers in Medical Science. 2011. V. 26. N 3. P. 401-413.

Благодарности Автор выражает глубокую признательность Лунину В.В. за выбор направления исследований, Баграташвили В.Н. за помощь и поддержку на всех стадиях работы, и Захаркиной О.Л. за помощь и поддержку на ключевых стадиях работы.

Автор выражает благодарность Иомдиной Е.Н. за помощь в постановке и решении проблемы структурных изменений тканей глаза и Соболю Э.Н. за полезные консультации. За помощь в проведении термического анализа автор благодарит Гроховскую Т.Е, аминокислотного анализа - Баратову Л.А., морфологического анализа - Шехтера А.Б., и спеклкоррелометрического анализа - Зимнякова Д.А.

Автор благодарит сотрудников ИПФ РАН Каменского В.А., Голубятникова Г.Ю., Сергееву Е.С. и Балалаеву И.В. за помощь в исследованиях методами оптической когерентной томографии и многофотонной микроскопии.

Автор благодарит соавторов своих публикаций, в том числе Аверкиева С.В., Данилова Н.А., Свиридова А.П. и Логунову М.А.

Автор выражает глубокую благодарность своим первым наставникам в научной работе Егоровой Г.В., Житневу Ю.Н. и Тимофееву В.В. и всем сотрудникам лаборатории КГЭ кафедры физической химии химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова.

Список цитированной литературы 1. Иомдина Е.Н., Тарутта Е.П., Андреева Л.Д., Иващенко Ж.Н., Маркосян Г.А., Шкуренко С.И. // Рефракционная хирургия и офтальмология. 2005.

№ 4. с. 19-23.

2. Buckwalter J.A. Aging and degeneration of the human intervertebral disc.

Review // Spine. 1995. V. 20. N 11. P. 1307-1314.

3. Buckwalter J.A., Roughley P.I., Rosenberg L.C. Age-related changes in cartilage proteoglycans: quantitative electron microscopic studies // Microscopy Res. Techn. 1994. V. 28. P. 398-408.

4. Valiyaveettil M., Mort J.S., McDevitt C.A. The concentration, gene expression, and spatial distribution of aggrecan in canine articular cartilage, meniscus, and anterior and posterior cruciate ligaments // Connective Tissue Res. 2005. V. 46. P. 83–91.

5. Kambic H.E., McDevitt C.A. Spatial organization of types I and II collagen in the canine meniscus // J. Orthop. Res. 2005. V. 23. P. 142–149.

6. Лазерная инженерия хрящей. / Под ред. В.Н. Баграташвили, Э.Н. Соболя, А.Б. Шехтера. М.: ФИЗМАТЛИТ, 2006. С. 37. Weiss J.A., Maakestad B.J. Permeability of human medial collateral ligament in compression transverse to the collagen fiber direction // J. Biomech. 2006.

V. 39. P. 276-283.

8. Jacques S.L. Laser-tissue interactions. Photochemical, photothermal, and photomechanical // Surg. Clin. North. Am. 1992. V. 72. P. 531-558.

9. Perie D.S., Maclean J.J., Owen J.P., Iatridis J.C. Correlating material properties with tissue composition in enzymatically digested bovine annulus fibrosus and nucleus pulposus tissue // Ann. Biomed. Eng. 2006. V. 34. P.

769-777.

10. Iatridis J.C. and ap Gwynn I. Mechanisms for mechanical damage in the intervertebral disc annulus fibrosus // J. Biomech. 2004. V. 37. P. 1165-1175.

11. Rotter N., Tobias G., Lebl M. Age-related changes in the composition and mechanical properties of human nasal cartilage // Arch. Biochem. Biophys.

2002. V. 403. P. 132-140.

12. Servaty R., Schiller J., Binder H., Arnold K. Hydration of polymeric components of cartilage - an infrared spectroscopic study on hyaluronic acid and chondroitin sulfate // Int. J. Biol. Macromol. 2001. V. 28. P. 121-127.

Список сокращений Химические соединения:

Hyl – гидроксипролин, специфичная для коллагена аминокислота;

Hyp – гидроксипролин, специфичная для коллагена аминокислота;

Gly – глицин, аминокислота;

Ala – аланин, аминокислота;

ГА – глицериновый альдегид;

КПГ – конечные продукты гликации. Гликация начинается с реакции между альдегидными группами простых сахаров и их метаболитов и аминогруппами боковых цепей белка и, в конечном итоге, приводит к образованию поперечных сшивок между макромолекулами белка;

ГАГ – гликозаминогликаны, сульфатированные и карбоксилированные полисахариды, содержащие N – ацетильную группу в каждом втором мономерном звене;

ПГ – протеогликаны, состоящие из белкового стержня и присоединенных к нему гликозидными связями гликозаминогликанов;

ПГА – протеогликановые агрегаты, в которых протеогликаны присоединены нековалентными связями к стержню гиалуроновой кислоты с помощью связующего белка.

Методы:

ГВГ – генерация второй гармоники;

КПОКТ – кросс-поляризационная оптическая когерентная томография;

ПЭМ – просвечивающая электронная микроскопия;

ДСК – дифференциальная сканирующая калориметрия.

Ткани:

ФК – фиброзное кольцо межпозвонкового диска;

ПЯ – пульпозное ядро межпозвонкового диска;

ЗП – замыкательная пластина межпозвонкового диска;

П-Д-П – позвонок-диск-позвонок, комплекс, включающий два костных тела позвонков и межпозвонковый диск;

ЖЧ – жировая ткань человека;

ЖС – жировая ткань свиньи.




© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.