WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

На правах рукописи

ГРАЙФЕР ДМИТРИЙ МАРАТОВИЧ

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ТОПОГРАФИЯ РИБОСОМ ЧЕЛОВЕКА ПО ДАННЫМ АФФИННОЙ МОДИФИКАЦИИ РЕАКЦИОННОСПОСОБНЫМИ ПРОИЗВОДНЫМИ ОЛИГОРИБОНУКЛЕОТИДОВ

02.00.10 – биоорганическая химия

Автореферат диссертации на соискание учёной степени доктора химических наук

Новосибирск – 2008

Работа выпо ии олнена в Институте химической биологи и фун ицины СО РАН ндаментальной меди Научный доктор химиче й консультант: еских наук, профессор Карпова Гали ина Георгиевна Официал еских наук, член-кор льные оппоненты: доктор химиче рреспондент РАН, профессор Габ Габибович бибов Александр Г доктор биолог фессор гических наук, проф Локтев Валер рий Борисович доктор биолог нт гических наук, доцен Бунева Вален нтина Николаевна

Ведущая организация: Московский го иверситет осударственный уни имени М.В.Ло кий факультет омоносова, химическ

Защита состоится 26 декабр 2008 г. в 10:00 ч на заседании диссертационного ря часов и совета Д 003.045.01 при Институте химической биологии и фундаментальной Д И медицины у: 630090, г. Новосиб ева, ы СО РАН по адресу бирск, пр. Лаврентье С диссерт ической биологии и тацией можно познакомиться в библиотеке Института хими фундамен нтальной медицины СО РАН Авторефе » ерат разослан « ___» ноября 2008 г.

Учёный с ионного совета секретарь диссертаци кандидат химических наук, доцент Коваль В. В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В клетках всех организмов – от бактерий до человека – реализация генетической информации происходит на рибосомах, где последовательности тринуклеотидов-кодонов мРНК, скопированные с ДНК, транслируются в аминокислотные последовательности синтезируемых белков.

Рибосома – это уникальный рибонуклеопротеид, обладающий сложнейшей четвертичной структурой и состоящий из большой и малой субчастиц, каждая из которых содержит рРНК и несколько десятков белков. Синтез белков на рибосомах является одним из ключевых процессов жизнедеятельности организмов, поэтому установление молекулярных механизмов, лежащих в его основе, и строения функциональных центров рибосомы является одной из важнейших проблем молекулярной биологии. Эта проблема особенно актуальна в случае рибосом млекопитающих, в частности, человека, поскольку природа многих болезней связана с нарушениями в механизмах регуляции функционирования белок-синтезирующей системы. Знание особенностей устройства функциональных центров эукариотической рибосомы является принципиально важным для понимания не только молекулярных механизмов трансляции у эукариот, но и природы тех регуляторных процессов, которые обеспечивают эффективность и точность белкового синтеза.

Рибосомы прокариот к настоящему времени детально изучены с применением различных методов, но наиболее впечатляющие успехи в расшифровке структуры рибосомы достигнуты на рубеже XX и XXI столетий благодаря рентгеноструктурному анализу (РСА), который позволил установить с высоким разрешением строение рибосом и выйти на новый уровень биохимических исследований, касающихся изучения молекулярных аспектов функционирования рибосомы. Однако метод РСА до сих пор неприменим для изучения эукариотических рибосом, поскольку кристаллы рибосом, пригодные для такого анализа, пока не получены. Метод крио-электронной микроскопии, интенсивно используемый для изучения эукариотических рибосом в последнее время, пока остается непригодным для определения структуры одного из важнейших функциональных центров рибосомы – мРНК-связывающего центра, поскольку разрешение, которое удается получить на эукариотических рибосомах, не позволяет “видеть” кодоны мРНК. Кроме того, с помощью этого метода не могут быть картированы рибосомные белки, не имеющие прокариотических гомологов. Наконец, методы, основанные на реконструкции рибосомных субчастиц из белков и рРНК (например, сайт-направленный мутагенез рРНК и сайт-направленное введение сшивающих групп в рРНК или белки), неприменимы для исследования рибосом высших эукариот, потому что до сих пор не найдено подходов к сборке активных субчастиц рибосом эукариот in vitro. Представлялось перспективным использовать для изучения мРНК-связывающего центра рибосом человека один из известных методов биоорганической химии – метод аффинной модификации (аффинного химического сшивания), который оказался очень продуктивным для изучения структурнофункциональной топографии прокариотических рибосом (Карпова, Кнорре, 1991;

Сергиев и др., 2001) и остается на сегодняшний день одним из наиболее приемлемых методов, способных давать детальную информацию о молекулярном окружении мРНК на эукариотической рибосоме.

Цель и задачи работы. Основной целью настоящей работы являлось установление структурной организации мРНК-связывающего центра рибосомы человека, а именно, выявление нуклеотидов рРНК и рибосомных белков, принимающих участие в формировании этого центра, с помощью аффинной модификации рибосом реакционноспособными аналогами мРНК. В качестве таких аналогов использован набор производных олигорибонуклеотидов, различающихся длиной, последовательностью и типом сшивающей группы, а также положением и природой нуклеотида, несущего эту группу. Одно из таких производных применено в качестве зонда для изучения структурно-функциональной топографии уникальной для рибосом эукариот 5.8S рРНК.

В ходе исследования решались следующие задачи:

• разработать методологию получения модельных комплексов аналогов мРНК с рибосомами, в которых расположение аналога мРНК можно было бы задавать с помощью тРНК, узнающей определенный кодон мРНК в отсутствие факторов трансляции;

• изучить фотоаффинную модификацию 80S рибосом человека аналогами мРНК длиной около 50 нт, несущими остатки 4-тиоуридина, и определить нуклеотиды 18S рРНК, сшивающиеся с этими аналогами;

• изучить аффинную модификацию 80S рибосом производными олигорибонуклеотидов, несущими алкилирующую или пазидотетрафторбензоильную группу, в составе комплексов, различающихся расположением модифицированного нуклеотида аналога мРНК относительно первого нуклеотида кодона в Р-участке;

• определить нуклеотиды рРНК и рибосомные белки, сшивающиеся с указанными аналогами мРНК, и тем самым получить информацию о структурных элементах 80S рибосомы, соседствующих с мРНК в области кодон-антикодоновых взаимодействий и в районах, прилегающих к кодонам в Е и А-участках;

• на основании полученных результатов охарактеризовать основные черты структурной организации мРНК-связывающего центра рибосомы человека и, сопоставив эти результаты с данными по структурно-функциональной топографии прокариотической рибосомы, выявить элементы сходства и различия в структурной организации этого центра у прокариот и млекопитающих;

• показать возможность использования реакционноспособных производных олигорибонуклеотидов в качестве зондов для изучения доступности и молекулярного окружения определенных последовательностей в рРНК на разных стадиях процесса трансляции.

Научная новизна и практическая значимость работы. Настоящая работа представляет собой первое комплексное исследование структурно-функциональной топографии рибосомы человека. В ней использован уникальный набор производных олигорибонуклеотидов, несущих сшивающую группу на определенном нуклеотидном остатке, в качестве аналогов мРНК и зондов для изучения топографии функционально значимых участков рРНК в рибосоме. Продемонстрирована результативность метода аффинной модификации применительно к рибосомам млекопитающих. Впервые получена информация о молекулярном окружении мРНК на 80S рибосоме на уровне нуклеотидов рРНК и рибосомных белков, а в случае одного из ключевых белков декодирующего центра, S15, – на уровне олигопептидной последовательности.

Выявлены общие черты в структурной организации мРНК-связывающего центра рибосом всех организмов и характерные особенности устройства этого центра в рибосоме млекопитающих. Показано, что нуклеотиды рРНК малых субчастиц, соседствующие с мРНК, составляют консервативный “кор” (сердцевину) рибосомы, структурно идентичную в рибосомах всех организмов. Установлено, что у млекопитающих белки играют большую роль в организации мРНК-связывающего центра рибосом, чем у прокариот, и обнаружены значительные различия в белковом окружении мРНК на рибосомах про- и эукариот. Эти различия касаются в основном окружения кодона в декодирующем центре и части мРНК с 5’-стороны от него, тогда как белковое окружение мРНК с 3’-стороны от этого кодона сходно в рибосомах всех царств. Получены данные о расположении центральной части 5.8S рРНК в 60S субчастице рибосомы и степени ее экспонированности на разных стадиях трансляции, позволившие понять, каким образом эта уникальная для эукариот рРНК может участвовать в процессе трансляции.

Результаты работы имеют фундаментальное значение для понимания принципов структурно-функциональной организации эукариотических рибосом, механизмов их функционирования и молекулярных основ взаимодействий, обеспечивающих регуляцию трансляции у высших организмов, и могут быть использованы для решения прикладных задач, связанных с созданием антибактериальных агентов, минимально затрагивающих белок-синтезирующую систему человека.

Публикации и апробация работы. Материалы диссертационной работы опубликованы в 32 статьях (включая 2 обзора) и представлены на следующих международных и российских конференциях: Второй съезд биохимического общества Российской академии наук (Москва, июнь 1997), Конференция, посвященная 30-летию журнала «Молекулярная биология» (Москва, ноябрь 1997 г.), 25th Silver Jubilee FEBS Meeting (Copenhagen, Denmark, July 1998), «RNA’99. The Fourth Annual Meeting of the RNA Society (Edinburgh, UK, June 1999), Конференция, посвященная памяти З.А.Шабаровой (Москва, ноябрь 2000 г), «Protein Synthesis. International Conference in Honour of Alexander Spirin» (Пущино, август 2001), International Conference “RNA as Therapeutic and Genomic Target” (Новосибирск, август 2001), III Съезд Биохимического общества (Санкт-Петербург, июль 2002), “Targeting RNA: Artificial Ribonucleases, Conformational Traps and RNA interference” (Новосибирск, июнь 2003), “Chemical & Biological problems of proteomics” (Новосибирск, июль 2004), International Conference on Chemical Biology (Новосибирск, июль 2005), International workshop “Biosphere Origin and Evolution” (Новосибирск, июнь 2005), Конференция по физико-химической биологии, посвященная 80-летию со дня рождения академика Д.Г.Кнорре (Новосибирск, 30 июля – 4 августа 2006), 8th International Engelhardt Conference on RNAprotein interactions (Московская обл., август 2006), Российско-французский симпозиум по супрамолекулярной химии в рамках XVIII Менделеевского съезда по общей и прикладной химии (Москва, сентябрь 2007), IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, май 2008 г.).

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 279 стр.

машинописного текста, состоит из введения, четырех глав, заключения, выводов, списка цитируемой литературы (223 ссылки) и содержит 74 рисунка и 31 таблицу.

Работа выполнена в период с 1990 по 2007 год. На разных этапах в ней принимали участие сотрудники и аспиранты Лаборатории структуры и функции рибосом НИБХ СО РАН (с 2003 г. ИХБФМ СО РАН) – М.А. Зенкова, А.А. Малыгин, К.Н. Булыгин, Н.А. Демешкина и М.В. Молотков, а также д-р П. Воллензиен (США), д-р И. Шталь (Германия д руководством авто А я) и работавшие под ора студенты НГУ. Автор приносит им искренню благодарность. Личный вклад авт заключался в непосредственном юю тора участии на всех этапах исследования – о постановки зад и проведения от дач экспериментов до обсуждени льтатов и их обобще ия полученных резул ения (кроме синтеза олигорибо п кционноспособной гр онуклеотидов и их производных с реак руппой на остатках уридина, полученных в лабо К ИХБФМ СО РАН оратории химии РНК Н под руководством к.х.н. А.Г торой автор также оч Г. Веньяминовой, кот чень благодарен).

Особую х.н. профессору Г.Г. Карповой, которая ю признательность автор выражает д.х была инициатором работы и уделяла ей первоочередное внимание на всех стадиях – от н постановк задач до предст результато в виде статей, тезисов докладов и ки тавления ов т настоящей диссертации. Авт также очень пр ику тор ризнателен академи Д.Г. Кнорре за постоянну терес к данной работ ую поддержку и инт те.

СОДЕРЖАНИЕ Р РАБОТЫ Исслед ывающего центра ри п дования мРНК-связы ибосомы E. coli с помощью аффинной модифика особными производн клеотидов показали, ации реакционноспо ными олигорибонук что резул модификаци зависят как от т комплекса (т.е от расположения льтаты ии типа е.

аналога мРНК на рибосоме и ее функционал состояния), так и от природы м е льного сшивающ у в настоящей работ лной и достоверной щей группы. Поэтому те для получения пол информац строении мРН ловека использован ции о НК-связывающего канала рибосомы чел широкий набор аналогов мРН ипами сшивающих (алкилирующих или НК с различными ти фотоактив п. уемое ое вируемых) групп Фотоактивиру производно одного из олигорибо льзовано к ия онуклеотидов испол также как зонд для изучени топографии 5.8S рРНК в ри ибосоме.

1. Методо модификации 80S р ология аффинной м рибосом Для изучения мРНК-свя ра века и язывающего центр рибосом челов использованы производн олигорибонукл от еотидных остатков, ные леотидов длиной о 6 до 12 нукле несущие алкилирующие или фотоактивируемые группы (рис. 1) и си а интетические мРНК длиной ок в с остатками 4-тиоу коло 50 нуклеотидов уридина (s4U) (табл. 1).

Рис. 1. Тип орибонуклеотидов с ал пы производных олиго лкилирующей группой на 5’-фосфате (а) или на 3’-конц рибозе (б) и с фотоактивируемой гру на 5’-фосфате (в), атоме С5 остатка цевой ф уппой ( урацила (г) а гуанина (д), использо работе.

), или атоме N7 остатка ованных в настоящей р Алкилирующие производные олигорибонуклеотидов и s4U-содержащие аналоги мРНК применяли ранее в опытах по сшивкам с 70S рибосомами E.coli; АТВ-производные использованы для аффинной модификации рибосом впервые. Для введения ATB группы в различные положения олигорибонуклеотида к выбранному нуклеотиду присоединяли спейсер с алифатической аминогруппой, по которой затем путем ее бензоилирования N-гидроксисукцинимидным эфиром п-азидотетрафторбензойной кислоты селективно вводили ATB группу. В случае 5’-фосфата (рис.1, в) проводили конденсацию олигорибонуклеотида с этилендиамином или пропилендиамином в присутствии трифенилфосфина и дипиридилдисульфида. Для присоединения спейсера к остатку гуанина (рис.1, д) олигорибонуклеотид с единственным остатком G алкилировали 4-[(N-2-хлорэтил-N-метиламино)]бензиламином, при этом происходило присоединение группировки, содержащей алифатическую аминогруппу, селективно по атому N7 остатка гуанина. Производные, несущие АТВ-группу на остатке уридина (рис. 1, г), получены с помощью подхода, основанного на использовании 5бромуридина вместо уридина при химическом синтезе олигорибонуклеотида на той стадии, где происходит включение соответствующего остатка в олигонуклеотидную цепь; по окончании синтеза атом брома замещали на остаток этилендиамина (Репкова и соавт., 1999). Синтетические мРНК с остатками s4U были получены с помощью Т7транскрипции.

Таблица 1. Нуклеотидные последовательности синтетических мРНК, содержащих s4U, использованных для аффинной модификации рибосом человека. Отмечены тринуклеотидыкодоны, направлявшиеся в Р-участок, а также остатки U, замещенные на s4U, и их положение на рибосоме при связывании отмеченного кодона (в случае двух отмеченных кодонов, первого из них) в Р-участке.

*Остатки U были замещены на s4U не полностью, а статистически. Содержание s4U составляло от 3,5 до 7 моль на моль мРНК.

**Сохранены обозначения, использованные ранее для этих же аналогов мРНК в работе (Bhangu & Wollenzien, 1992).

1.1. Моде ами мРНК ельные комплексы рибосом с аналога Сшивк ли в модельных ком ых ки аналогов мРНК с рибосомами изучал мплексах, полученны при 20oC неэнзиматически, т.е. без участия факт б торов трансляции в буфере с 13 мМ Mg2+ (в отдель эксперимента – в буфере с 4 мМ Mg2+, соде ьных ах ержащем спермин и спермиди Для проверки функциональной корректности комплексов рибосо ин). и й к ом he использов U)6 в качестве анало oli вали поли(U) или (pU огов мРНК и тРНКPh человека или E. co в форме [14C]Phe-тРНКPhe или N-Ac[14C]Phe-тР а также де и РНКPhe, еацилированную [5’32 P P]тРНКPhe дрожжей. При ни х N-Ac[14C]Phe-тРНКPhe, когда степень ее изких концентрациях К е связывани ль тРНК на моль акт олее 80% связанных с ия была менее 1 мол тивных рибосом, бо рибосомо остатков N-Ac[14C]Phe было способн реагировать с пу ае ой C но уромицином в случа тРНК чел то свидетельствовал -участке. Связывани ловека или E. сoli, чт ло о связывании в Р- ие Phe-тРНКPhe и N-AcPhe-тРНКPhe с 80S рибосома практически по о К К ами олностью зависело от присутств матрицы, при этом активные рибосомы связывали до двух молекул тРН вия НК (одну в А-, а другую – в Р-у Сопоставл ывания Phe-тРНКPhe и А участке). ление уровней связы синтеза (Phe)2 позволило зак что больш часть Phe-тРНКPhe, связанной с 80S ключить, шая К рибосома способна участ в транспепт Таким обр образующиес ами, твовать тидации. разом, ся комплексы были функцион корректным Количественны и качественны нально ми. ые ые характери связывания тРНКPhe человека и E. coli с 80S рибосомами человек истики р ка оказались почти одинаковы поэтому для п ных ь ыми, получения модельн комплексов 80S рибосом человека с аналогам узнающими определе их ч ми мРНК и тРНК, у енные кодоны в эти аналогах, использовали намного более доступные индивидуальные т тРНК E. coli.

Связыв логов мРНК - олиго й от 6 до 13 звеньев с вание коротких анал оуридилатов длиной 80S рибо ски висело ствия ри осомами практичес полностью зав от присутс тРНКPhe; пр насыщающей концентрации т олее одной молекул тРНКPhe рибосома могла связывать не бо лы аналога м дство олигоуридилат астало с увеличение мРНК (рис. 2), а срод тов к рибосоме возра ем их длины. Триуридилат, соде ный кодон UUU, так ержащий единственн кже мог связываться с 80S рибос о для достижения ур я, сомами в присутствии тРНКPhe. Однако ровня его связывания близкого к 1 молю на моль рибосом, требовалис р сь высокие ко ога К.

онцентрации анало мРНК и тРНК Связывание олигоуридилатов с 80S рибосомам е ми мало зависе от того, была ли аминоацилирован ело л на тРНКPhe.

Рис. 2. Свя [5’-32P](pU)n с 80S рибосомами.

язывание Реакционные смеси содержали в 20 мкл буфера 3 пмол е 2 ль рибосом, 20 пмоль Phe- тРНКPhe и меченый аналог мРНК К.

Светлые зна – связывание в отсутствие тРНК. , ачки в степень связы (моль/моль 80S рибосом, активных в ывания связывании P Phe-тРНК).

Таким образом, в отсутст факторов тран можно пол комплексы, в твие нсляции лучать которых (pU)n фиксирован на рибосоме кодон-а имодействием либо в ( н антикодоновым взаи Р-участке дновременно в А- и Р-участках. Очевид ая е (при n<6), либо од дно, что однозначна фиксация м омах происходит тол я данных аналогов мРНК на 80S рибосо лько при n = 3 или 6.

При n = 3 екула тРНКPhe распол ке, а при n = 6 – как в 3 кодон UUU и моле лагаются в Р-участк Р, так и в А-участке. В случае других олигоуридилатов может происходит и В ть неоднозна посадка в участке декодиров в результат чего получаетс ачная вания, те ся гетероген смесь комплек Поскольку тРН связывается в первую очередь в Рнная ксов. НК п Р участке, для получения ком с однознач расположение аналогов мРНК в д мплексов чным ем настоящей работе использов олигорибонукл несущие разные кодоны, чт вали леотиды, то позволяло фазировать их на 80S рибосоме с по тРНК, узна единственны о омощью ающей ый кодон, направляемый в Р-уча асток.

Введ реакционносп в отид ве дение пособной группы в олигорибонуклео в большинств случаев не приводило к суще нию его сродства к рибосомам, а кривы н ественному изменен ые связывани гетерогенных ол ов, дон нь ия лигорибонуклеотидо содержащих код Phe, были очен схожи с кривыми связыва олигоуридилат соответствующ длины (рис. 2).

ания тов щей Исключен являлись лиш производные с модифицированными остатками U во нием шь в втором или третьем поло кодона UU направляемого в Р-участок (эт и ожении UU, о ти производн связывались с 80S рибосомами гораздо хуже, че соответствующи ные с ем ие немодифи рибонуклеотиды).

ицированные олигор Таки образом, реак им кционноспособные производные олигорибонуклеотидов, использов й работе, в целом удо ринятым требования ванные в настоящей овлетворяли общепр ям к аффин реагентам дл получения адек информаци о молекулярно нным ля кватной ии ом окружени мРНК на рибос Типы модел комплексов с аналогами мРН ии соме. льных НК приведены х случаях контролем е комплексы аналого ы на рис. 3. Во всех м служили бинарные ов мРНК с 80S рибосомами.

Рис. 3 Примеры компле 80S рибосом с 3. ексов произв олигорибонук ми водными клеотидов, состоящим из д различных кодонов. Выделен двух ны нуклео остатки, несущие сшивающу отидные н ую группу указаны положени модифицированны у, ия ых нуклео относительно первого нуклеотид отидов да кодона в Р-участке. А, Р, Е – участки связывани а Е ия тРНК.

1.2. Аф ффинная модификация рибосом и анали ибосомных из модификации ри субчас стиц Для аффинной модифи использовал я икации ли аналог же, ги мРНК, меченные 32Р по 5’- или, реж по 3 шивки 3’-концу. Для сш рибосом с алкили налогами мРН ирующими ан НК соотве лексы ли етствующие компл выдерживал при 20-25оС в течение времени и, соотве ам етствующего 3-5 периода полупревращения алкили ирующей группы в активн интермедиат – этилениммониевы ный – ый катион тивируемых аналого н. В случае фотоакт ов мРНК соответствующие ком облучали м УФ-светом (>290 нм в случа мплексы мягким ае АТВ-прои ервале от 320<<3изводных или в инте 5 нм в случае s4U-содержащих мРНК).

Распре мными ами ли еделение сшивки между рибосом субчастица анализировал центрифу диенте сахарозы в условия диссоциации 80S угированием в град плотности с ях рибосом на субчастицы (3 мМ Mg2+, 300-500 м KCl в отсутстви полиаминов). Дл м мМ ие ля анализа распределения сши между 18S рРНК и белками модифицированны ивки ые субчастиц денатурировали с помощью SDS и ЭДTA, после чего рРНК и белк цы и ч ки разделяли е плотности сахароз ым и либо центрифугированием в градиенте зы, либо одномерны гель-элект утствии SDS.

трофорезом в прису 1.3. Определение участков сшивки аналогов мРНК с 18S рРНК В первых работах (с алкилирующими производными олигоуридилатов) участки 18S рРНК, содержащие сшитый меченый аналог мРНК, определяли с помощью блотгибридизации модифицированной 18S рРНК с фрагментами рестрикции соответствующей рДНК, иммобилизованными на капроновой мембране. В последующих работах модифицированную рРНК гидролизовали рибонуклеазой Н в присутствии дезоксирибоолигонуклеотидов, комплементарных различным последовательностям 18S рРНК (кДНК), продукты гидролиза разделяли электрофоретически с последующим окрашиванием и радиоавтографированием гелей. Сопоставление результатов, полученных с помощью различных кДНК, позволяло определить фрагмент длиной несколько десятков нуклеотидов, содержащий участок сшивки с аналогом мРНК.

Нуклеотиды 18S рРНК, с которыми сшивались аналоги мРНК, определяли с помощью обратной транскрипции, используя модифицированную 18S рРНК в качестве матрицы.

Праймеры выбирали с учетом данных по определению районов 18S рРНК, содержащих участки сшивки. Поскольку удлинение меченого праймера на рРНК как на матрице прерывается/замедляется при достижении растущей цепью ДНК модифицированного нуклеотида рРНК, сшитым считали обычно нуклеотид рРНК, расположенный с 5’стороны после основания, на котором произошла остановка обратной транскрипции.

1.4. Определение рибосомных белков, сшивающихся с аналогами мРНК Белки, сшитые с мечеными аналогами мРНК, разделяли с помощью одномерного гельэлектрофореза в присутствии SDS и двумерного электрофореза в различных системах, для которых известно положение пятен рибосомных белков млекопитающих на электрофореграммах. В большинстве случаев для двумерного разделения использовали систему I, в которой в первом направлении разделение происходит при рН 8.3, а во втором – при рН 6.75 в присутствии SDS. В тех случаях, когда разделение в этой системе не позволяло определить модифицированные белки, проводили дополнительный анализ в системе II (разделение в первом направлении при рН 8.3, а во втором – при рН 4.0) или в системе в системе III (разделение первом направлении – pH 5.5, во втором – pH 4.5). Для идентификации модифицированных белков радиоавтограф накладывали на соответствующий окрашенный гель и определяли положения радиоактивных полос или пятен относительно полос или пятен, соответствующих немодифицированным белкам.

При сопоставлении радиоавтографов и окрашенных гелей принимали во внимание, что остаток аналога мРНК, сшитый с белком, меняет его электрофоретическую подвижность.

Если гидролиз сшитого аналога мРНК не приводил к потере метки Р в модифицированном белке, его гидролизовали РНКазой А для уменьшения его влияния на электрофоретическую подвижность белка. В отдельных случаях идентификацию подтверждали с помощью иммуноблотинга или иммунопреципитации с использованием специфических антител против определенных рибосомных белков человека или крысы.

1.5. Определение фрагментов рибосомного белка, сшитых с аналогами мРНК Для определения участков рибосомного белка S15, содержащих сшитый меченый аналог мРНК, использован подход, основанный на специфическом расщеплении полипептидной цепи белка по определенным аминокислотным остаткам с последующим разделением образовавшихся продуктов гель-электрофорезом. В качестве протеолитических агентов использовали бромциан, расщепляющий полипептидную цепь после остатков метионина, и гидроксиламин, гидролизующий пептидную связь между остатками Asn и Gly. Модифицированные олигопептиды определяли, сравнивая молекулярные массы фрагментов, несущих сшитый остаток меченого аналога мРНК, с величинами, рассчитанными для всех фрагментов, которые могли образоваться при расщеплении белка данным протеолитическим агентом.

2. Аффинная модификация 80S рибосом алкилирующими производными олигорибонуклеотидов Для определения рибосомных белков и нуклеотидов рРНК, соседствующих с мРНК в рибосоме человека, использовали олигоуридилаты разной длины, несущие алкилирующую группу на 5’- или 3’-конце, ClRp(U)n (n=3, 4, 6 или 12) и (Up)nC-R’Cl (n = 3, 6 или 12), а также ClRpGUGUUU (рис. 1, а, б). В присутствии тРНКPhe степень связывания аналогов мРНК составляла около 0.7 моль на моль 80S рибосом (примерно моль аналога мРНК на моль активных рибосом).

2.1. Аффинная модификация 80S рибосом производными (pU)n Модификации во всех случаях подвергались практически только 40S субчастицы;

сшивки происходили в составе соответствующих специфических комплексов, поскольку их практически не наблюдали в отсутствие тРНК и в комплексах, полученных в присутствии избытка соответствующего немодифицированного олигоуридилата (табл. 2).

В случае 5’-алкилирующих производных доля модификации 18S рРНК резко снижалась с увеличением длины олигоуридилатной части реагента и, соответственно, увеличивалась доля модификации белков 40S субчастицы (табл. 3). Основной «скачок» в изменении окружения 5’-конца аналога мРНК происходил при переходе от производных тетра- к производным гексауридилата, т.е., при изменении типа комплекса аналога мРНК с 80S рибосомами (см. раздел 1.1). Это указывало на изменения в окружении 5’-концевого нуклеотида кодона, связанного в Р-участке, индуцируемые кодоном в А-участке, что неудивительно, поскольку известно, что в прокариотических рибосомах соседние кодоны мРНК в А и Р-участках образуют угол. В случае (Up)nC-R’Cl распределение сшивки между 18S рРНК и белками мало зависело от n, и во всех случаях на долю рРНК приходилось 60-70% сшитого аналога мРНК.

Эксперименты по блот-гибридизации показали, что участки сшивки 5’-производных три- и тетрауридилатов локализованы во фрагментах 975-1061 и 1058-1172, гексауридилата – во фрагменте 975-1061, а производного додекауридилата – в трех фрагментах 975-1172, 593-674 и 1748-1869. Большее число фрагментов рРНК, модифицированных производным (pU)12, по-видимому, связано с его неоднозначной посадкой на рибосоме. Для всех 3’-алкилирующих аналогов мРНК получены практически одинаковые результаты - сшивки во фрагментах 1610-1748 и 1749-1869.

Из данных, приведенных на рис. 4, можно заключить, что 5’-производные олиго(U) сшивались с нуклеотидами U1022, U1025, C1057 и A1058, а 3’-производные – с G1702.

Однако ароматические иприты, использованные в настоящей работе, неспособны алкилировать остатки уридина при значениях pH, близких к нейтральным (Ross, 1962).

Поэтому можно предположить, что остановки на А1023 и С1026 вызваны не сшивками с U1022 и U1025, а расщеплением рРНК по А1023 и С1026 вследствие алкилирования межнуклеотидных фосфатов с образованием лабильных фосфотриэфиров (см. Карпова и соавт., 1981). Большее число точек модификации 18S рРНК 5’-производными (pU)n (n = или 4) по сравнению с производным (pU)6, возможно, связано с большей подвижностью 5’-концевого фосфата в случае производных, фиксированных на рибосоме кодонантикодоновым взаимодействием только в Р-участке.

Таблица 2. Аффинная модификация 80S рибосом алкилирующими пр U).

м роизводными олиго(U Ошибка эк ла примерно 10%; конц а (pU)n были на порядо ксперимента составлял центрации ингибитора ок выше конц ющих алкилирующих производных.

центраций соответствую Степень сшивки, моль остатков Аналог мРНК тРНКPhe (pU)n ) реагент та/ моль 40S ClR[32P](pU)3 + - 0.C ClR[32P](pU)3 - - 0.C ClR[32P](pU)3 + + 0.C ClR[32P](pU)4 + - 0.C ClR[32P](pU)4 + + 0.C ClR[32P](pU)4 - - 0.C ClR[32P](pU)6 + - 0.C ClR[32P](pU)6 - - 0.C ClR[32P](pU)6 + + 0.C ClR[32P](pU)12 + - 0.C ClR[32P](pU)12 - - 0.C ClR[32P](pU)12 + + 0.C (Up + - 0.p)2U[32P]pC-R’Cl (Up + - 0.p)5U[32P]pC-R’Cl (Up - - 0.p)5U[32P]pC-R’Cl (Up + + 0.p)5U[32P]pC-R’Cl (Up)11U[32P]pC-R’Cl + - 0.) Таблица 3. Распределение сши 5’-алкилирующих производных олигоуридилатов между 18S 3 ивки х рРНК и бел цах. Ошибка экспериме рно 10%.

лками в 40S субчастиц ента составляла пример Аналог мРНК Распределение сшивки между рР РНК и белками, % рРНК белки ClR[32P](pU)3 96 ClR[32P](pU)4 93 ClR[32P](pU)6 24 ClR[32P](pU)12 4 Рис. 4. Рад ывающие положение о линении 5’-32Р-меченог диоавтограммы, показы остановок/пауз при удл го праймера, комплементарного по 81-1200 н оследовательности 118 (а), 1081-1100 (б) и 1812-1831 (в), на матрице 18S рРНК. U, G, C и A - продукты секвенир образованные в присутствии ddATP, 8 A рования, е ddCTP, dd и dTTP соответ Дорожки 3, 4 и 6 на панелях (а) и (б) - 18S рРНК dGTP тственно., К, модифицир ClRp(U)3, Cl и ClRp(U)6, со S и рованная lRp(U)4 оответственно. К - 18S рРНК, выделенная из немодифиц выдержанных в услови цированных рибосом, в иях алкилирования.

Результат анализа белков, сшивающиеся с 5’- роизводными (pU)6 и ты -алкилирующими пр (pU)12, по гидролиза сши с белками оста олиго(U) РНК А и щелочно осле итых атков Казой ой фосфатазо ис. 5.

ой, приведены на ри а б Рис. 5. Анализ белков 40S субчастиц, сшиты ых с 5'-32Р- меченым ClR двумерным гельRp(U)6, электрофорезом в си II (см. разде истеме ел 3.1.5). (а), электрофо го ореграмма окрашенног геля; (б) радиоавтогра ом аф геля. На окрашенно геле выделены белк соседствующие с ки, радиоактивным пятном (отмечен но пунктиром). Радиоавтограф геля в случа ае производного ClRp(U практически тако U)12 ой же (не приведен).

Единственное ради н иоактивное пятно на электрофореграмма соответствует по ах п положению модифи ку ицированному белк S26. Для окончательной идентификаци ии модифицированного белка проводил о ли иммунопреципитацию с использовани антител кролик ием ка против рибосомн белка S26 крысы. Белки ного 6 и, экстрагированные из осадков и соответствующи и их супернатантов, ана мощью го ализировали с пом одномерног гель-электрофореза (рис. 6). Видно, что как в случа ае ClRp(U)6, так и в случае ClRp(U)12 более 90% метки P б находится в пол соответствую белку S26.

лосе, ющей Следовательно, сре белков практич единственны еди чески ым продуктом модифик кации рибосом был белок S26.

Рис. 6. Анализ рибосо х с ClRp(U)6 и омных белков, сшитых ClRp(U)12, с помощью иммунопреципитации и последу ореза. Радиоавтограф ующего гель-электрофо нитроцеллю геля рибосомных белко юлозной мембраны после переноса на нее с г ов, осажденных иммуносор м к рибосомному белку 26-p(U)6 и PAS-S26рбентом, специфичным у S26 (дорожки PAS-Sp(U)12), и б пернатантов (дорожки S белков, выделенных из соответствующих суп SUP-p(U)6 и SUPp(U)12).

Рибосомные б сшивающиеся с 3’-производным белки, ми олигоуридила анализировали вначале с помощью атов, ю одномерного э электрофореза (рис. 7).

Рис. 7. Анализ м елков одномерным гельмодифицированных бе электрофорезом а – окрашенный ге б – радиоавтогра м: ель; аф геля. Дорожки 1, 2 и 3 – белк модифицированны и ки, ые (Up)2U[32P]pC-R Cl и (Up)11U[32P]pC-R’C R’Cl, (Up)5U[32P]pC-R’C Cl соответственно. Указаны положен полос некоторы. ния ых немодифициров ванных белков.

Поскольку электрофоретичес подвижност ская ть модифицирова белка тем меньше, чем больш анного м ше масса при можно ть, ии исоединенного к нему аналога мРНК, м предположит что модификаци во всех случаях подвергались две одинаковые группы белков. Верхняя полоса в геле соответствует белкам S2/S3/S3a/S4/S6, а нижняя – белкам S12/S15a/S20/S26/S27a.

Аналоги мРНК (Up)6C-R’Cl и (Up)12C-R’Cl модифицировали преимущественно белки, соответствующие верхней полосе, а (Up)3C-R’Cl - нижней полосе. В случае (Up)6C-R’Cl и (Up)12C-R’Cl окончательную идентификацию модифицированных белков проводили с помощью иммунопреципитации с использованием антител против рибосомных белков S3, S3a и S26, которые являлись наиболее вероятными мишенями модификации (рис. 8).

Рис. 8. Анализ рибосомных белков, сшитых с (Up)6C-R’Cl (1) или с (Up)12C-R’Cl (2), с помощью иммунопреципитации и последующего гель-электрофореза. Радиоавтограф нитроцеллюлозной мембраны после переноса на нее с геля рибосомных белков, осажденных иммуносорбентом, специфичным к белкам S3 и S26 (а) или к белку S3a (б).

Положения модифицированных белков S3, S3a и Sуказаны стрелками.

В контрольных экспериментах, выполненных с каждым из аналогов мРНК, к суммарному рибосомному белку, выделенному из модифицированных 40S субчастиц, добавляли иммуносорбент, содержащий антитела против белков S3, S3a и S26 одновременно. При этом практически вся радиоактивная метка оказывалась связанной с иммуносорбентом (т.е. супернатант не содержал радиоактивности), поэтому сделано заключение, что никакие другие рибосомные белки (кроме белков S3, S3a и S26) не сшивались с аналогами мРНК. В эксперименте с производным (Up)3C с помощью иммунопреципитации было показано, что нижняя полоса соответствует белку S(соответствующий радиоавтограф не приведен). Данные по аффинной модификации 80S рибосом человека алкилирующими производными олигоуридилатов суммированы в табл. 4.

2.2. Аффинная модификация 80S рибосом 5’-алкилирующим производным pGUGU Модификацию рибосом с помощью ClR[5’-32P]pGUGUUU, содержащим валиновый кодон GUG и фенилаланиновый кодон UUU, проводили либо в комплексе с кодонантикодоновым взаимодействием в Р-участке, образованном с участием тРНКVal или тРНКPhe, либо в комплексе с двумя кодон-антикодоновыми взаимодействиями. Обе тРНК существенно стимулировали связывание и сшивку ClR[5’-32P]pGUGU3 с 80S рибосомами (табл. 5), что свидетельствовало о способности кодонов GUG и UUU аналога мРНК участвовать в кодон-антикодоновом взаимодействии с соответствующими тРНК. Во всех случаях, кроме комплекса с тРНКVal в Р-участке, сшивка происходила практически только с рибосомными белками (табл. 5). Анализ модифицированных белков одно- и двумерным гель-электрофорезом показал, что в комплексах с одной тРНКPhe и с двумя тРНК модифицировался преимущественно белок с подвижностью, лучше всего соответствующей модифицированному S26, а в комплексе с тРНКVal – модифицированному S6. Для подтверждения сшивки с белком S26 использовали иммуноблоттинг. Как видно из результатов анализа, представленных на рис. 9, антисыворотка против белка S26 проявляла интенсивную полосу (дорожка 2), соответствующую немодифицированному белку S26 (дорожка 1), и более слабую полосу (дорожка 2), положение которой совпадало с положением радиоактивной полосы на дорожке 3. Очевидно, что слабая полоса соответствует модифицированному белку S26.

Таблица 4. Результаты аффинной ирующими й модификации 80S рибосом человека алкили производны.

ыми олигоуридилатов.

Аналог Положение Сшивк ка с 40S субчастицами мРНК сшивающей 18S рРНК Белки группы на От вные Относи Сшитые тноситель- Основ итель- 80S ная ная доля мо- белки* я доля мо- сайты рибосоме ди ки дифик ификации, % сшивк кации, % ClRp(U)3 +1 96 A1023 4 H.o.** 3, C106, C1057, A10ClRp(U)4 +1/-1 93 A1023 3, C1026, C1057, A10ClRp(U)6 +1 24 C1057 76 SClRp(U)12 Неоднозначно 4 593-74, 975-1172, 96 S(от –6 до +1) 1749-18р(U)3C-R’C +3/+4*** 80 G1702 20 S26, Cl S3, S3a р(U)6C-R’C +6/+7*** 70 G1702 30 S3, S3a, Cl Sр(U)12C-R’Cl Неоднозначно 65 G1702 35 S3, S3a, (от +6 до +13) S* Выделены шивки среди белков.

ы основные мишени сш **Не опред делено.

***Неодно ы аналога мРНК на риб означность положения алкилирующей группы босоме связана с возможнос онов UUU, так и с помо стью фиксации матрицы как с помощью кодо ощью кодона UUC.

Таблица 5 ация 80S рибосом в сос лексов с 5. Аффинная модифика ставе модельных компл ClR[5’-32P] ]pGUGU3.

тРНК Связывание, Ковалентно Относительная степень моль аналог присоединенны модификации, % га ый % мРНК на мол аналог, моль/мо ль оль 80S рибосом 40S субчастиц Белки м ц 18S рРНК Без тР 0.12 0.16 90 РНК тРНКVal 0.52 0.33 55 К тРНКPhe 0.65 0.58 97 К тРНКVal +тРНКPhe 0.65 0.56 96 Рис 9. Идентификация модифицированного белка S26 с помощь с. ью имм в муноблотинга после разделения белков одномерным гельэлек дующего ую ктрофорезом и послед переноса их на нитроцеллюлозну мем зультаты анализа белк ых мбрану. Приведены рез ков, модифицированны ClR мплексе налогичные результат R[5’-32P]pGUGU3 в ком с тРНКPhe. Ан ты пол для комплекса рибосом с двумя тРН (не приведены). 1 – лучены НК мем окрашенная а роявление мбрана, амидо-черным; 2 – пр белка S26 с пом соответствую антисыворотки 3 –радиоавтогра мощью ющей и; аф мем Указаны по ых мбраны. оложения некоторых немодифицированны белк ков.

Обращает на себя внимание то, что результаты аффинной модификации 80S рибосом производным pGUGU3 в комплексе с тРНКVal и в комплексе с двумя тРНК значительно различаются, несмотря на одинаковое положение (+1) нуклеотида со сшивающей группой на рибосоме. Напротив, в комплексах с тРНКPhe и с двумя тРНК, различающихся по расположению на рибосоме нуклеотида, несущего алкилирующую группу (соответственно, -3 и +1), получены практически одинаковые результаты. Это можно объяснить тем, что вместо комплекса с двумя молекулами тРНК происходило образование комплекса, где тРНКPhe и кодон UUU находились в Р-участке, тогда как Аучасток оставался свободным. Очевидно, это было вызвано тем, что тРНКPhe имеет большее сродство к Р-участку 80S рибосомы по сравнению с тРНКVal. Из-за этого не все активные рибосомы находились в комплексе с аналогом мРНК в присутствии тРНКVal, и имело место равновесие между связанным и свободным аналогом. При добавлении тРНКPhe равновесие смещалось в сторону образования более стабильного комплекса, содержащего кодон UUU и тРНКPhe в Р-участке.

Результаты по сшивкам производного pGUGU3 в присутствии тРНКPhe позволили получить однозначную информацию о белковом окружении на рибосоме модифицированного нуклеотида в положении -3, которую невозможно было получить помощью производных олиго(U). Практически единственной мишенью модификации 80S рибосом в составе этого комплекса был белок S26, что хорошо согласуется с аналогичными данными для 5’-производного (pU)12, алкилирующая группа которого могла находиться с 5’-стороны от кодона в Р-участке в положениях от +1 до -6.

Суммируя результаты, полученные с помощью алкилирующих производных олигорибонуклеотидов, можно отметить, что они позволили впервые установить нуклеотиды рРНК, соседствующие с кодонами мРНК в 80S рибосоме, определить положения нуклеотидов в мРНК, сближенных с белками S3, S3a и S26, найденными ранее в мРНК-связывающем центре рибосом из печени крысы (Stahl and Kobetz, 1981;

1984; Stahl and Karpova, 1985) и выявить новые белки S2 и S6 в области мРНКсвязывающего центра. Однако, информация, которую могут дать алкилирующие аналоги мРНК, ограничена окружением 5’- и 3’-концов рибозо-фосфатного остова мРНК.

Поэтому в дальнейшем для исследования мРНК-связывающего центра рибосом человека использовали фотоактивируемые аналоги мРНК, несущие остатки s4U, и производные олигорибонуклеотидов с АТВ-группой на остатках гетероциклических оснований.

3. Сшивки рибосом с синтетическими аналогами мРНК, несущими остатки 4тиоуридина (s4U) Синтетические аналоги мРНК длиной от 30 до 50 нт, несущие остатки s4U, нашли широкое применение в исследованиях мРНК-связывающего центра рибосом E.coli, наиболее активно проводившихся в 90-х годах XX века в группах Р. Бримакомба в Германии, А.Богданова и О.Донцовой в России и П.Воллензиена в США. С помощью таких аналогов были определены нуклеотиды рРНК, контактирующие с мРНК на протяжении практически всего ее «пути» через рибосому, начиная от участка ее входа до самого участка выхода (Bhangu and Wollenzien, 1992; Rinke-Appel et al., 1993;

Baranov et al., 1999). В настоящей работе для аффинной модификации 80S рибосом человека использовали тот же набор аналогов мРНК (табл. 1) и ту же методологию анализа их сшивок с рРНК, что и в группе П.Воллензиена при изучении мРНКсвязывающего центра 70S рибосом. Это дало возможность провести корректное сопоставление данных об устройстве мРНК-связывающего центра 70S и 80S рибосом.

Продук ов мРНК с рРНК, вы ченных комплексов, кты сшивок аналого ыделенные из облуч, анализиро электрофоре в агарозе. Контролями служи необлученные овали езом или е комплексы и комплексы с аналогами мРНК, в которых вместо s4U были остатки и уридина. Результаты анализ для мРНК 1с и 7 с остатками s4U, статистически за и распредел вдоль всей цепи РНК, приве в качестве примера на рис. ленными едены п (сходные результаты получен РНК).

ны для остальных мР Рис. 10. Ан гель-электрофо в агарозе РН нализ орезом НК, выделенной из облученных комп 80S рибосом с плексов м мРНК 1с и 7 (радиоавтограф высуш ено шенного геля). Отмече наличие в мР у РНК остатков s4U или уридина (U). Комплексы 80S рибосом с аналогами мРНК получали в присутств м п вии (+) или в отсу ющих кодон Phe в мРН утствие (-) тРНК, узнаю НК 1с или кодо Trp в мРНК 7. Ко С он онтрольная дорожка Ссоответствует РНК, выделенно из необлученно т ой ого комплекса 80 рибосом с мРНК 1с и тРНКPhe. Положен 0S ние полос 18S р 28S рРНК и мРНК (указано справ рРНК, м ва) определено п флуоресценции соответствующих полос в по с геле, окрашен ием.

нном бромистым этиди Видно, чт мРНК с рРНК полностью зависит от нали то сшивка аналогов м ичия в них остатков s4U и УФ ексов; авной шивки Ф-облучения компле из рРНК гла мишенью сш являлась 18S рРНК, сте сшивки с кот мало менялась в присутствии тРН но зависела от епень торой ь НК, последова ательности мРНК.

При опр н НК с помощью обра ределении сшитых нуклеотидов 18S рРН атной транскрипции использов набор праймер позволяющий п анализ бол части рРНК вали ров, провести льшей (последов мера иведены вательности 392-1810). В качестве прим на рис. 11 при результаты анализа сш НК в районе U630; вс ированы в табл. 6.

шивки аналогов мРН се результаты сумми Видно, что аналоги мРНК и 7 с остатками статистическ распределенными К 1с и s4U, ки и практичес вдоль всей цепи РНК, сшивались г образом с нуклеотидом U-6ски и главным 18S рРНК как и мРНК 8 и 9e’ с остатками s4U расположенными на расстоянии 16 и К, 9 U, и более ну - ы одон-антикодоновых уклеотидов с 3’- или 5’-стороны от области ко х взаимодей Нуклеотид U630 соответству U534 16S рРН E.coli, который йствий. ует НК й находится аимодействующим с вым дуплексом в Ая рядом с G530, вза с кодон-антикодонов участке 30S субчастицы. В случае мРНК 1с наблюдали также слабые сшивки с 3 В с нуклеотидами A1060,, U104 и U966. Первые 46 е два находятся в в консе и ервативной спирали 24, апикальная часть ь котор рой Рис. 11. Анализ сшивки анало огов мРНК в районе U630 в составе комплексов, образованных в прису утствии (+) или отсутс ствие (-) тРНК. Р остановок/пауз обратно Радиоавтографы, показывающие положение о ой транскрипции при удлинении мера, комплементарног и 655-674, на матрице и 5’-32Р-меченого прайм го последовательности 18S рРНК. A, G, C и U - продукты в присутствии ddATP, ы секвенирования 18S рРНК, образованные в ddCTP, ddG венно. Результаты, при Б, свидетельствуют об GTP и dTTP соответств иведенные на панели Б отсутстви учае мРНК 10b и 10c.

ии сшивки с U630 в слу Таблица 6. Результаты экспериментов по сшивкам аналогов мРНК, содержащих остатки s4U, с 18S рРНК в составе комплексов 80S рибосом.

Аналог мРНК Ожидаемое положение s4U Сшитый нуклеотид 18S рРНК* мРНК 8’ +20….+26 U6мРНК 9e’ -20… -16 U6мРНК 10 -3, -1, +4 +6 U630, U1111/A11мРНК 10c -3, -1 U1111/A11мРНК 10b +4, +6 Не определен мРНК 1c Распределены статистически U630, A1060, U1046, U9мРНК 7 Распределены статистически U6*Выделены основные сшивки.

(«790 loop») в 30S субчастице находится в непосредственной близости от кодона в Ручастке (Carter et al., 2000; Yusupova et al., 2001; Selmer et al., 2006). Нуклеотид U9находится в апикальной петле “690-loop” в спирали 23, которая в 30S субчастице соседствует с кодоном мРНК в Е-участке (Yusupova et al., 2001). Нуклеотиды U1111/A1112 18S рРНК, которые сшивались с мРНК 10 и 10с, лежат вне консервативного кора рРНК малых субчастиц (в 16S рРНК E.coli им примерно соответствуют нуклеотиды 838/839, не имеющие отношения к декодирующему центру). Для мРНК 10b не удалось определить участков сшивки с 18S рРНК, скорее всего, из-за того, что они находились в 3’-концевом фрагменте 1812-1869 18S рРНК и поэтому не могли быть определены с помощью использованного набора праймеров.

Полученные результаты существенно отличаются от данных по сшивкам тех же аналогов мРНК с 16S рРНК в комплексах с 70S рибосомами E.coli (Bhangu and Wollenzien, 1992; Bhangu et al., 1994). Хотя в обоих случаях сшивки происходили преимущественно с рРНК малой субчастицы и почти не зависели от присутствия тРНК, модификация 18S рРНК протекала более избирательно, чем 16S рРНК. Так, в случае рибосом E.coli было выявлено 12 основных точек контакта 16S рРНК с мРНК, несущими остатки s4U, статистически распределенные вдоль всей цепи РНК (Bhangu and Wollenzien, 1992), а в комплексах с рибосомами человека те же аналоги мРНК сшивались только с нуклеотидом U630 18S рРНК (табл. 6). Аналогично, мРНК, несущие остатки s4U в определенных положениях, сшивались с 1-2 нуклеотидами 18S рРНК в комплексах с 80S рибосомами (табл. 6) и с 3-6 нуклеотидами 16S рРНК в комплексах с 70S рибосомами (Bhangu et al., 1994). Эти различия обусловлены, скорее всего, тем, что в рибосомах млекопитающих большая часть мРНК контактирует не с рРНК, а с белками (см. раздел 4.1).

Таким образом, использование синтетических аналогов мРНК с остатками s4U позволило впервые получить информацию о том, что взаимодействие матрицы с рибосомой млекопитающих осуществляется за счет меньшего числа контактов с рРНК, чем с бактериальной рибосомой.

4. Сшивки рибосом с производными олигорибонуклеотидов, несущими ATBгруппы Для аффинной модификации рибосом человека использовали производные олигорибонуклеотидов длиной 6-12 нуклеотидных остатков с ATB-группами либо на 5’-концевом фосфате, либо на гетероциклическом основании - атоме С5 остатка уридина или N7 остатка гуанозина (рис. 1, в-д).

4.1. Аффинная модификация рибосом производными с ATB-группой на 5’концевом фосфате Для изучения окружения на 80S рибосоме 5’-концевого нуклеотида мРНК в положении +1 или –3 использовали производные pGUGUUU, pUUUGUU и pUUCUAAA, в которых АТВ-группа была присоединена к 5’-фосфату через этилендиаминовый спейсер (рис. 1, в).

Аффинную модификацию 80S рибосом проводили в составе 6 типов модельных комплексов (рис. 12). Контролями для каждого из комплексов служили бинарные комплексы соответствующих аналогов мРНК с 80S рибосомами. тРНКPhe использовали в аминоацилированной форме для того, чтобы при получении комплексов 4 и 5 исключить ее связывание в Е-участке и обеспечить заполнение этого участка деацилированной тРНКVal в комплексе 4.

Рис. 12. Типы модельных комплексов, в которых изучали сшивку с 80S рибосомами человека фотоактивируемых аналогов мРНК с АТВ-группой (N3R’’) на 5’-концевом фосфате.

Ни один из аналогов практически не связывался с рибосомами и не образовывал сшивок в присутствии избытка соответствующего немодифицированного олигомера или в отсутствие тРНК (табл. 7). Это свидетельствовало о том, что связывание и сшивки происходили в составе специфических комплексов этих аналогов мРНК с 80S рибосомами и тРНК. Как и в опытах с алкилирующими производными олигорибонуклеотидов, модификации подвергались практически только 40S субчастицы. Более низкий уровень связывания и сшивки в комплексе 1, образованном с участием с тРНКVal, по сравнению с аналогичными комплексами 5 и 6, полученными в присутствии тРНКPhe, очевидно, обусловлен тем, что тРНКVal имеет меньшее сродство к Р-участку 80S рибосом, чем тРНКPhe (см. раздел 2.2).

Данные по распределению сшивок между рРНК и белками (за исключением данных для комплекса 2), хорошо согласуются с результатами, полученными с помощью алкилирующих аналогов мРНК (см. раздел 2). Так, ATB-группа в положении –сшивалась в основном с белками, а в положении +1 – с рРНК и белками в сопоставимой степени. Что касается комплекса 2, где ATB-группа должна была находиться в положении +1, то данные, полученные для этого комплекса, резко отличались от результатов для комплекса 1 с тем же расположением модифицированного нуклеотида, но были очень схожими с данными для комплексов 3 и 4, где ATB-группа находилась в положении -3. По-видимому, при получении комплекса 2 фактически происходило образование комплекса 3 вследствие того, что тРНКVal имеет меньшее сродство к Ручастку 80S рибосом, чем тРНКPhe (см. раздел 2.2). В результате сшивающая группа оказывалась в положении -3, а не +1.

Таблица 7 ация 80S рибосом прои нуклеотидов с ATB7. Аффинная модифика изводными олигорибон группой на та была в пределах 10% а 5’-концевом фосфате. Ошибка эксперимент %.

Тип комп ывание аналога Ковалентно Относительная плекса (см. Связы рис. 12), в скобках мРНК, моль/моль 80S пр тепень модификации, рисоединённый ст указано п рибосом реа % положение р агент, моль/моль нуклео 40S отида со сшивающе ей группой 18S рРНК Рибосомные белки 1а* 0.03 <0.01 – – 1 (+1) 0.20 0.12 70 2 (+ 0.78 0.50 12 +1)** 3 (-3) 0.74 0.52 8 3 (-3) в при <0.05 <0.01 - исутствии избытка не емодифици- рованного pGUGU4 (-3) 0.80 0.47 6 5а* 0.08 0.07 – – 5 (+1) 0.60 0.45 50 6а* 0.08 0.06 – – 6 (+1) 0.68 0.55 40 *Данные для бинарных комплекс аналогов мРНК с 80S р сов соответствующих а рибосомами **Указано ожидаемое положение е Эксп еплению модифицир Казой Н показали, чт перименты по расще рованной рРНК РНК то во всех ко налогов мРНК с 18S а внутри района 12омплексах сшивка ан S рРНК происходила 01222 (на рис. 13 в качестве примера представлены результаты, полученные в случа е п ае производн pGUGUUU). На основании этого в качестве прайме для определени ного Н о ера ия модифици тидов атной ии ированных нуклеот 18S рРНК с помощью обра транскрипци использов дезокси-олигомер, комплементар нуклеотидной последовательност вали рный ти 1222 Во всех типах комплексов, 2-1241.

обра ием ка азованных с участи тРНК, остановк обра транскрипци происходила на атной ии н нукл рРНК. Следовательно леотиде А1208 18S р о, моди лся ификации подвергал нуклеотид G1(рис. 14). В отдель эксперимент. ьном те пока что G1207 был единственно азано, ой мишенью для сшивки аналогов мРНК с 18S а рРНК поскольку проду гидролиза 18S К, укты рРНК РНКазой Н в присутстви К ии дезок го ксирибо-олигомера, комплементарног посл ли ледовательности 1197-1216, не содержал метк Р, т.е. ковалент присоединенног ки тно го аналога мРНК.

Рис. 13. Анализ продуктов гидролиза модифицирован нной 18S рРНК РНКазой Н в присутствии 20звенных кДНК, комплементарн последовательност 1548-1567, 1222-1241, 1181-1200, 1081к ных тям 1100, 950-9 и 821-840 18S рРНК (дорожки 1-6 соот форезом » 969 тветственно), электроф в ПААГ. «к» - модифицир « нная РНКазой Н в отсу ль, рованная 18S рРНК, «к’» она же, обработан утствие кДНК; а – гел окрашенны «Stains all», б – радиоавтограф. Стрелк указаны ожидаем длины фрагменто ый ками мые ов РНК. В экс али 18S рРНК, модифи е комплекса 1.

сперименте использова ицированную в составе Рис. 14. Анализ продуктов обратной транскрипции модифицированной 18S рРНК в присутствии 5’-32Р-меченого праймера, комплементарного последовательности 1222-1241.

Радиоавтограф геля. Номер дорожки соответствует номеру комплекса, комплексы 1а, 5а и 6а соответствуют комплексам 1, 5 и 6, полученным в отсутствие тРНК. Дорожка «к» – 18S рРНК, выделенная из 80S рибосом, выдержанных в тех же условиях, что и комплексы.

U, G, C, A – продукты секвенирования, образованные в присутствии ddATP, ddCTP, ddGTP и dTTP соответственно. Положение остановки (паузы) обратной транскрипции, вызванной сшивкой 18S рРНК с аналогом мРНК, обозначено стрелкой.

Видно, что сшивка с G1207 не зависит от природы кодона в А-участке (смысловой или стоп-кодон) и нуклеотида в вобблположении кодона в Р-участке. Можно полагать, что G1207 находится ближе к нуклеотиду мРНК в положении +1, чем в положении -3, поскольку эффективность сшивки с рРНК ATB-группы на нуклеотиде в положении +1 гораздо выше, чем в положении –3 (табл. 7). Нуклеотид G1207 во вторичной структуре рРНК малых рибосомных субчастиц соответствует G926 в 16S рРНК E.coli, который в 30S субчастице контактирует с кодоном в Р-участке и расположен на расстоянии всего нескольких ангстрем от нуклеотидов 789-790, соответствующих нуклеотидам 1057-1058 18S рРНК, сшивающимся с 5’-алкилирующими производными олиго(U) (раздел 2.1).

Результаты анализа рибосомных белков, сшитых с 5’-АТВ-производным pGUGUUU, представлены в табл. 8. Видно, что результаты, полученные помощью 5'фотоактивируемого производного pGUGU3, существенно отличаются от результатов, полученных с помощью 5'-алкилирующего производного этого же гексамера в составе идентичных комплексов с рибосомами (см. разделы 4.1 и 2.2). Иными словами, алкилирующее и фотоактивируемое производные имели разные мишени для модификации в 18S рРНК и среди рибосомных белков. Это, очевидно, связано с разной природой образующихся активных промежуточных частиц, которые могут иметь разную химическую и/или стереохимическую селективность к нуклеотидам 18S рРНК или аминокислотным остаткам белков, находящимся в радиусе их действия. Следовательно, результаты, полученные с помощью алкилирующих и фотоактивируемых аналогов мРНК, являются взаимно дополняющими.

Интересно сравнить результаты модификации 80S рибосом в комплексах 3 и 4, где кодон pGUG с модифицирующей группой на 5'-концевом фосфате находился в Еучастке. В комплексе 4, в отличие от комплекса 3, не наблюдали сшивки с белком S2, что легко можно объяснить экранирующим эффектом тРНК в Е-участке. Напротив, сшивка с белком S30 происходила только в комплексе 4, указывая на то, что тРНК в Е-участке влияла на белковое окружение 5’-концевого фосфата кодона в этом участке. Таким образом, применение 5’-фотоактивируемых производных олигорибонуклеотидов позволило существенно расширить представление о молекулярном окружении кодонов мРНК в Р и Е-участках 80S рибосомы, полученное с помощью алкилирующих аналогов мРНК. С использованием АТВ-производных выявлены новые структурные элементы мРНК-свя а 1207 и 0, язывающего центра - нуклеотид G1 18S рРНК и белки S2 и Sсоседству в ах, и получены первы ии ующие с кодонами в Р- и/или Е-участка ые данные о влияни тРНК в Е- е окружение нуклео 3.

-участке на белковое отида в положении -Таблица 8 одным pGUGUUU в со 8. Белки, модифицированные 5’-АТВ-произво оставе различных комплексов с 80S рибосомами.

Тип Положение Модифици ированные белки комплекс нуклеотида с АТ са ТВгруппой на S2 S6 S26 Sрибосоме 1 +1 ++ - - 2 +1* +++ ++ + 3 -3 +++ ++ ++ 4 -3 - +++ ++ + + *Указано о ожидаемое положение 4.2. Аффи ия рибосом произво несущими ATBинная модификаци одными UUUGUU, н группы в и на остатке G, и производным UUAG в триплете UUU или GUAUUUAUU с ATB-груп ппой на остатке G Модиф роизводными рUUU ой, присоединенной к фикацию рибосом пр UGUU с ATB-группо первому, второму или третьему остатку U либо к остатку G (аналоги I-IV U, у соответст ным рUUAGUAUUU ой группой на остатк твенно), и производн UAUU с аналогично ке G (аналог V) проводили в составе комплексов, где нуклеотид со сшивающей группо г с, ой находился в положениях от –3 до +4 (рис. 15 Модельные комп 1-8 (рис. я т 5). плексы 5) получали инкубацией рибосо К и тРНК в буфере с 13 мМ Mg2+ (буфе ом с аналогами мРНК ер А), испол о спериментах по сши льзованном во всех описанных выше экс ивкам, или в буфере Б с 4 мМ Mg2+, содержащем по кс 7 получали инкуб M олиамины. Комплек бацией комплекса 6 с тРНКVal, узнающей кодон GUA в Е-участке, а комплекс 8 с кодон-неспецифично G к ой т тРНКAsp в Е-участке - инкубацие ей к комплекса 6 с т тРНКAsp.

Р S Рис. 15. Комплексы 80S р рибосом с п производными о олигорибонуклеотидов р рUUUGUU и р рUUAGUAUUUAUU.

Ц Цифрами указаны п в положения нуклеотидов м мРНК, несущих сшивающую группу, о относительно первого н нуклеотида кодона в Ру участке; - остаток а аминокислоты;

ф ) фенилаланиновый (Phe) и и валиновый (Val) к кодоны в п последовательностях а аналогов мРНК п подчеркнуты.

Уровень связывания аналого ами в присутствии тРНК сильно зависе с ов мРНК с рибосома т ел от типа комплекса. В случа аналогов I, IV и V стимулирующее влияние тРНКVal на к ае н связывани кодона GUA/GU в Р-участке 80S рибосом было в 3-4 раза меньше, че ие UU ем влияние тРНКPhe на связыван о подтверждает сдел 2.

т ние кодона UUU, что ланный в разделе 2.вывод о более низком срод тРНКVal к Р-у 80S рибосо по сравнению со дстве участку ом с сродством м тРНКPhe.

Интере екта не наблюдали в в буфере Б. Это дает есно, что этого эффе в случае аналога V в т основания ользование буфера Б олиаминами вместо я полагать, что испо Б с 4 мМ Mg2+ и по о буфера А позволило в случ аналога V получ комплекс 5, где в Р-участке 80S А чае чить г S рибосом находился кодон GUA и тРНКVal, а в А-участке – кодон UUU и тРНКPhe. В G В случае ан мРНК II и III степень связывания в комплексах 1 и 2 была намного налогов I 1 о ниже, чем в аналогичных ко ом.

м омплексах с аналого I, но выше, чем в отсутствие тРНК.

Это свиде м, что модифицирую о етельствовало о том ющая группа на атоме С5 остатка U во втором и третьем (но не в первом) положе кодона сущес затрудняла и ении ственно а (вероятно н-антикодоновое вза НКPhe в Р-участке, но о, стерически) кодон аимодействие с тРН о не препятствовала ему пол В отсутст тРНК (компле 9) связывания лностью. твие ексы я производн гексарибонук UU и е ных клеотида рUUUGU с рибосомами практически не наблюдал производное дод а и ли; декарибонуклеотида (аналог мРНК V) в заметной степени связывало с рибосомами и в отсутствие тРНК и кодон-неспеци тРНКAsp не ось и К, ифичная е стимулир ие.

ровала его связывани Во всех случаях сшивка ан сходила практически налогов мРНК проис и только с 40S субчастиц фикации которых хо цами, степень модиф орошо коррелировала с уровнем связывани рибосомами в соотве ия аналога мРНК с р етствующем комплексе. Результаты модифика ависели от состава б котором получали ации 18S рРНК не за буфера (А или Б), в к комплексы (рис. 16, 17 и табл л. 9).

Рис. 16. Удлинени ие меченого праймер ра, комплементарного о последовательност ти 1222-1241 (а, в) ил ли 1081-1100 (б), на матрице 18S рРНК К.

Дорожки U, G, C и и A - продукты секвенирования.

Удлинение праймера на 18S рРНК из рибосом, модифицированны ых аналогом I (а, б) и и III (в) в составе комплексов 1-3 и (дорожки 1-3 и соответственно), а а также на ко ом (дорожки К) (в случ ы онтрольной 18S рРНК из облученных рибосо чае аналога II получены результаты трелками обозначены ы, аналогичные тем, которые представлены на панелях (а) и (б)). Ст положения атной транскрипции, вы я остановок (пауз) обра ызванных сшивками 18S рРНК с аналогами мРНК. Вни указаны положения мод леотида аналога мРНК изу панелей в рамках у дифицированного нукл К на рибосоме.

Таки образом, резуль аффинной м р ми им ьтаты модификации 80S рибосом различным аналогами п твительными к соста А и мРНК оказались практически не чувст аву буфера (буфер А с 13 мМ Mg2+ или буфер Б с 4 м нами), использованн g мМ Mg2+ и полиамин ного для а б в Рис. 17. Уд аймера, комплементарн сти 1835-1849 (а), 18длинение меченого пра ного последовательнос 21831 (б) ил трице 18S рРНК, выдел одифицированных ли 1222-1241 (в), на мат ленной из рибосом, мо аналогом IV в составе комплексо V в составе комплексов е ов 1-3 (а, б), аналогом V в 4, 6-8 (в), и этими же аналогами в бинарных комплекса соответствуют номерам и – ах 9 (номера дорожек с м комплексов). Детали см. подпис сь к рис. 16.

комплексообразования анало мами. Поэтому данн м огов мРНК с рибосом ные о молекулярном окружени мРНК на рибосоме, полученные в б А с концент Mg2+ более ии буфере трацией е высокой, чем его концентрац ским, можно считать ция в условиях, близких к физиологичес ь вполне ко орректными.

Таблица 9 тиды 18S рРНК, сшива мРНК I-V.

9. Фрагменты и нуклеот ающиеся с аналогами м Тип ко Участок сшивки в 18S рРНК омплекса рода и положение Аналог (в скобках - прир Фрагмент Нуклеотид о сшивающую группу) мРНК нуклеотида, несущего ) I 1 ( 1197-1216 G12(U+1) I 2 ( 1197-1216 G12(U+1) I 3 ( 840-1081 G9(U-3) II 1 ( 1197-1216 G12(U+2) II 2 ( 1197-1216 G12(U+2) II 3 ( 674-1081 G9(U-2) III 1 ( 1100-1222 G12(U+3) III 2 ( 1100-1222 G12(U+3) III 3 ( 1100-1222 G12(U-1) IV 1 ( 1812-1831 А1823-А18(G+4) IV 2 ( 1812-1831 А1823-А18(G+4) IV 3 ( 1641-1869 G17(G+1) V 4 ( 1641-1869 н.о.

(G+1) V 5 (G+1)** 1197-1216(*) G12( V 6 ( 1197-1222(*) G12(G-3) V 7 ( 1197-1222(*) G12(G-3) V 8 ( 1197-1222(*) G12(G-3) * Указан основной участок модификации 18S рРНК.

** Приведе ченные в буфере А, где фактически имело ены результаты, получ е вместо комплекса 5 ф место обра азование комплекса 6.

Резуль роизводных UUUGU асположение кодона ьтаты по сшивкам пр UU показали, что ра а мРНК в Р-участке и первого нуклеотида кодона в А-участке относ 18S рРНК Р о сительно К практичес не зависит от наличия молекулы тРНК в А-участ 80S рибосомы, ски ы тке, исключая частичное экранир оснований А1823-А1825 от сшивки с аналогом я рование с м мРНК IV в случае, когда моди аналога находился в положении +4 (рис.

ифицированный G а.

17, а). Да приведенные в табл. 9, свидете то анные, е ельствуют о том, чт нуклеотид G12соседству м х от -3 до +3, G961 – и ует с нуклеотидами мРНК в положениях – в положениях -3 и -2, G1702 в положении +1, а участок A1823-A сближен с ну в 2 – A1825 уклеотидом мРНК в положени еотид G1207 18S рР рактически со всеми ии +4. То, что нукле РНК соседствует пр и нуклеотид и вает на наличие изги т дами кодонов в Р- и Е-участках, указыв иба, который делает матрица на рибосоме межд этими кодонами, благодаря чему нуклеотид G12ду у оказывает аждым нуклеотидом частках.

тся сближенным с ка м кодонов в Р- и Е-уч Резуль убчастиц, сшитых с аналогами мРНК I, I м ьтаты анализа 40S су II и III, одномерным гель-элект сутствии едены е трофорезом в прис SDS приве на рис. 18. Все радиоактивные полосы, кроме самой верхней м белкам, поскольку к й, соответствовали модифицированным у они исчез субчастиц протеиназ о сохранялись после зали при обработке с зой К (рис. 18, а), но е обработки РНКазой А (рис. 18, д). Сшивка с б соответствующими полосам в и белками, в центральн и нижней частя геля, сильно зави от присутстви тРНК. Напротив, ной ях исела ия, модифика белков, соответствующих двум и и ацию интенсивным полосам в верхней части геля, наб во всех случаях, в том чи и в бинарных комплексах. Эта блюдали с исле х а модифика была специф поскольку поли(U) полность блокировала ее ация фичной, ью е (дорожка К). Достаточно вы уровень сши с белками в ла х ысокий ивок абильных бинарных комплексах коротких аналог мРНК с 80S р димому, н гов рибосомами, по-вид обусловлен быстрым обменом между свя ым аналогом мРНК во время облучения.

язанным и свободны в.

В связи с этим нельзя исклю ексах, где степень связывания аналогов с ючить, что в компле в мРНК бы к ами II и III и компл, ыла невысокой (все комплексы с аналога лекс 3 с аналогом I), сшивка с белками, соответ ним а с тствующими верхн полосам (рис. 18), происходила полностью оставе бинарных ком ю или частично в со мплексов.

Рис 18. Анализ 40S с. S субч выделенных частиц, х из облученных х ком 80S рибосом мплексов м с ан мРНК III (а, налогами, б), II (в) и I (г, д),, элек Г ктрофорезом в ПААГ в присутствии SDS.

.

Ради е иоавтограф. В случае (а) 40S субчастицы перед 4 д анал были лизом и обработаны протеиназой й К, а в случае (д) – – РНК А. Номера Казой а дорожек соответствуют т ном комплексов.

мерам.

Дор К – анализ 40S рожка S субч выделенных частиц, х из комплекса 80S S рибосом с аналогом I,, образованного в в при.

исутствии поли(U).

Дор е - типичный рожка й окра ашенный гель.

Результат полученные с аналогом мРНК I хорошо согласуют с данными по ты, тся о сшивкам 80S рибосом с аналогами мРН несущими ал и с НК, лкилирующую или фотоактив а 5’-фосфате. Так, в комплексах 1 и 2 с м м вируемую группу на модифицированным U в полож роисходила в больше НК, а в комплексе жении +1 сшивка пр ей степени с 18S рРН с модифицированным U в пол ущественно с белкам ложении -3 - преиму ми.

Сопост радиоавтог окрашенным гелем (панель е) в случае тавление графа (панель д) с о е аналога I позволило отнести две верхние радиоа м м активные полосы к модифицированным белкам S2/S3a и S3, полосу в средней части гел к S5/S7, а две нижние полосы – к 2 ля – к S14/S23/S и S16/S19/S2 Результаты ана сшивок анал I с белками S15a 26. ализа лога и двумерны шитого с белком ост К ым электрофорезом после гидролиза сш татка аналога мРНК РНКазой А приведены на рис. 19 и в табл. 10 Для аналогов II и III полагали, что р 0. о радиоакти адающие с полосами га I при одномерном ивные полосы, совпа и белков для аналог м разделени НКазой А (рис. 18), соответствуют тем же белкам, что и в ии без обработки РН в случае ан налога I.

В случ из модифицированны и без гидролиза чае аналога IV анали ых белков проводили остатка ге а, сшитого с белками из приводил бы к ексарибонуклеотида и, поскольку гидроли потере ме надежной идентифик енные из етки 32Р; для более н кации белки, выделе модифици частиц, анализировал трофорезом в двух ированных 40S субч ли двумерным элект системах (I и II). Результаты о в, модифицированны определения белков ых аналогами I-IV, суммиров ваны в табл. 10.

Рис. 19. Анализ белков, сшиты с аналогом мРНК I с помощью двумер электрофореза в А ых I, рного в системе I. (а) – радиоавтографы гелей после разделения белков, выделенн из 40S субчастиц, ы ных, обозначены модифицированные белки. (б) – типичн электрофореграмм окрашенного геля;

ы е ная ма ;

положения радиоактивных пят соответствующих модифицированным белкам, отмечены я тен, м ы пунктиром Номера комплексов указаны в правых вер углах радиоавт а положение м. рхних тографов, е модифицир осоме дано в рамках в л рованного нуклеотида аналога мРНК на рибо левых углах.

Таблица 1 фицирующей группой на нуклеотидах 10. Рибосомные белки, сшивающиеся с модиф аналогов м сновные мишени моди мРНК в положениях от –3 до +4 (выделены ос ификации).

Полу ы ученные результаты Тип комплекс Модифиц са цируемые Аналог (в скобках полож ыделены хорошо согласуются с жение белки (вы о с мРНК модифицирован основ нного вные данным по аффинной ми й нуклеотида на риб укты) босоме) проду модифи м икации 80S рибосом аналога мРНК с 5’ами I 1 (+1) S3, S26, S2, S14, Sконцевы сшивающими ыми и I 2 (+1) S3, S26, S2, S14, SI 3 (-3) S3, S26, S2 ми (см. разделы 2 и 2, S14, группам и S5/S4.1), од е днако использование IV 1 (+4) S15, S2, Sаналого мРНК с АТВов IV 2 (+4) Sгруппам на остатках ми х гетероциклических х IV 3 (+1) S15, S2, Sоснован позволило ний о выявить ряд новых белков. Полученные данные показывают, что белковое окружение р П е б е кодона мРНК в Р и Е-участках в значительной степени сходно. Различия в окружении кодонов в Р- и Е-участках проявлялись в том, что сшивка с белком S14 была сильнее при расположении модифицированного нуклеотида в Е-участке, сшивку с белками S5/Sнаблюдали только в Е-участке, а с белком S23 – только в Р-участке. Можно полагать, что белки S5/S7 и S14 относятся к непосредственному окружению кодона в Е-участке, а белок S23 соседствует только с кодоном в Р-участке. При расположении модифицированного U в Е-участке доля сшивки с белками была значительно выше, чем в Р-участке. По-видимому, кодон в Е-участке 80S рибосомы соседствует преимущественно с белками, а в Р-участке – с белками и 18S рРНК.

4.3. Сшивка рибосом с модифицированными остатками U или G c 5'-стороны от кодона в Е-участке Для изучения окружения мРНК с 5’-стороны от кодона в Е-участке 80S рибосом использовали набор аналогов мРНК, несущих фенилаланиновый кодон UUU на 3’конце и остаток U или G с ATB-группой с 5’-стороны от этого кодона (табл. 11). При связывании кодона UUU в Р-участке в присутствии тРНКPhe модифицированные нуклеотиды аналогов мРНК оказывались в положениях -4, -6 или -9 относительно первого нуклеотида этого кодона.

Таблица 11. Аналоги мРНК, использованные для изучения окружения мРНК с 5’-стороны от кодона в Е-участке. Серым цветом выделен кодон UUU, направляемый в Р-участок. Обозначение аналога мРНК отражает его длину (в скобках), а также природу и положение модифицированного нуклеотида относительно первого нуклеотида кодона, направляемого в Р-участок.

Аналог мРНК Последовательность Во всех комплексах, где нуклеотид аналога аналога мРНК мРНК, несущий фотоактивируемую группу, -4U(9) UCU*GUGUUU находился с 5’-стороны от кодона в Е-участке (в -6U(9) U*CUGUGUUU положениях от -4 до -9), относительные степени -9U(12) U*CUCUCGUGUUU модификации рРНК были очень низкими – -4G(9) CUG*UCAUUU -6G(9) G*UAUCAUUU сшивка происходила практически только с -9G(12) G*UAUCUCUCUUU белками независимо от природы нуклеотида, несущего сшивающую группу. Следовательно, можно полагать, что мРНК с 5’-стороны от кодона в Е-участке соседствует в основном с белками. Наборы белков, сшитых с аналогами мРНК, также мало зависели от природы и положения модифицированного нуклеотида в области от -4 до -9. Основной мишенью для сшивки во всех случаях был белок S26 (идентификация основана на данных одно- и двумерного гель-электрофореза после гидролиза сшитого с белками аналога мРНК с помощью РНКазы А и подтверждена иммуноблотингом (рис. 20)).

Рис. 20. Определение модифицированного белка S26 с помощью иммуноблотинга после разделения белков одномерным электрофорезом в присутствии SDS и последующего переноса на нитроцеллюлозную мембрану. Приведены результаты анализа белков, сшитых с аналогами мРНК -4U(9), -6U(9) и -9U(12) в составе тройных комплексов с 80S рибосомами и тРНКPhe (дорожки 1-соответственно), и контрольного опыта с белками, выделенными из немодифицированных рибосом (дорожка К). Радиоавтограф (а);

проявление белка S26 c помощью специфических антител (б).

Принимая во внимание данные разделов 2 и 4.1, можно сделать вывод, что нуклеотиды в положении от –9 до +1 сближены с белком S26, причем этот белок вносит определяющий вклад в формирование участка связывания мРНК с 5’-стороны от кодона в Е-участке.

4.4. Аффинная модификация 80S рибосом в области декодирующего центра Для изучения молекулярного окружения кодона мРНК в декодирующем центре 80S рибосомы использовали три аналога мРНК, позволяющие направлять остаток U с ATBгруппой в положения от +4 до +6 (см. табл. 12).

Аналог Нуклеотидная последовательность Таблица 12. Аналоги мРНК, мРНК аналога мРНК использованные для сшивок +4U(7) UUCU*CAA модифицированных нуклеотидов в составе +5U(6) UUUGU*U кодона в А-участке. Комментарии – см.

+6U(6) UUUGUU* табл. 12.

В тройных комплексах 80S рибосом с аналогами мРНК и тРНК Phe около 30% сшивок приходилось на долю 18S рРНК, которая модифицировалась только в присутствии тРНКPhe, а 70% - на долю белков. Аналоги +4U(7), +5U(6) и +6U(6) сшивались с теми же нуклеотидами А1823-А1825 18S рРНК, что и аналог IV при локализации модифицированного остатка G в положении +4 (см. раздел 4.2), что свидетельствует об ключевой роли этих нуклеотидов в формировании декодирующего центра.

Среди рибосомных белков одной из основных мишеней модификации в тройном комплексе рибосом с аналогами мРНК +4U(7), +5U(6) и +6U(6) и тРНКPhe был белок S15 (в качестве примера см. рис.21), степень сшивки с которым уменьшалась при переходе от аналога +4U(7) к аналогу +6U(6). Принимая во внимание данные о том, что белок S15 являлся одной из основных мишеней для сшивки с 80S рибосомами аналогов мРНК, несущих остаток s4U в составе кодона в А-участке (Bulygin et al., 2005), можно сделать вывод о том, что белок S15 играет ключевую роль в формировании декодирующего центра 80S рибосом млекопитающих. Кроме белка Sмодифицированные нуклеотиды в составе кодона в А-участке сшивались с белком S3 и, в некоторых случаях, с белком S2. Эти белки модифицировались также при расположении нуклеотида со сшивающей группой в Р- или Е-участке (см. разделы 2, 4.и 4.2) и в отсутствие тРНК. Следовательно, белки S3 и S2, в отличие от белка S15, сближены с мРНК в различных участках мРНК-связывающего центра 80S рибосом (в том числе в участках, удаленных от декодирующего центра).

4.5. Сшивка рибосом с модифицированными остатками U или G c 3'-стороны от кодона в A-участке Для изучения окружения мРНК с 3’-стороны от кодона в А-участке 80S рибосом использовали набор аналогов мРНК, несущих на 5’-конце фенилаланиновый кодон UUU/UUC, который направляли в Р-участок, и остаток U или G с ATB-группой в положении +7, +9 или +12 относительно первого нуклеотида этого кодона (табл. 13).

Все аналоги мРНК сшивались преимущественно с белками, причем при перемещении модифицированного нуклеотида аналога мРНК в 3’-сторону от кодона в А-участке доля сшивки с 18S рРНК уменьшалась (с 20% до 2% в случае U* и с 7% до 2% в случае G*), а с белками – соответственно возрастала.

Рис. 21. Ан указаны на панелях), с помощью двумерного нализ белков, сшитых с аналогами мРНК (у о электрофор ах I (а) и II (б). Типичн мы окрашенных гелей в реза в ПААГ в система ные электрофореграмм в электрофор казаны лков х ретических системах I и II, на которых ук положения бел и радиоактивных пятен (пун приведены справа. Разделение в системе I позволило определить основной нктиром), й продукт сш как S10*/S15*, а разделение в систем ть его более точно как шивки ме II идентифицироват к S15*.

Таблица 13. Аналоги мРНК, использованные для я Аналог Нуклеотидная изучения окру мРНК с 3’-сто от кодона в Аужения ороны мРНК последовательност ть участке. Комментарии – см. табл. 10.

.

аналога мРНК +7U(12) UUUAACU*CUCCU U Как и во все предыдущих случ сшивки с 18S ех чаях, S +9U(12) UUUAACUCU*CCU U рРНК наблю только в со комплексов, юдали оставе, +12U(12) UUUAACUCUCCU* образованных в присутствии тР Все аналоги х РНКPhe. и +7G(9) UUCUCAG*AA мРНК в этих комплексах сшивал и лись с нуклеотидами +9G(12) UUUAACCUG*UCU U А1823-А1825 м 605-630, в котором 5, С1698 и участком м +12G(12) UUUAACUCUCUG G* с помощью обратной транскр не удалось рипции ь +7U(7) UUUAACU* определить модифицированны нуклеотид. В ый В +9U(9) UUUAACUCU* +7G(7) UUCUAAG* разделах 4.1 и 4.2 показано, что нуклеотиды А1823+9G(9) UUUAACCUG* А1825 и G входящий в участок 605-630, G626,, соседству участке. Поэтому мо т уют с кодоном в А-у ожно предположить, что матрица делает резкий изгиб между кодоно в А-участке и примыкающим к нему с 3’-стороны ом ы кодоном, благодаря чему оба кодона оказывают сближенными с одними и теми же тся с е рибосомн компонентами При этом трипл расположенный с 3’-стороны от ными и. лет, т кодона в А-участке, соседст также с нукле С1698 и по ю твует еотидом оследовательностью 605-630 18S рРНК.

Среди белков основн мишенью с мо ы ной сшивки независим от природы модифици тида в аналоге и его положения с 3’-стор ированного нуклеот роны от кодона в Аучастке был белок S3; в небо дифицировались так и б ольшой степени мод кже белки S2, S15 и S30, при эффективность сшивки с белко S15 резко пад при удалении ичем ом дала и модифици тида участке е ированного нуклеот в 3’-сторону от кодона в А-у (в качестве примера с см. рис. 22).

Рис. 22. Анализ белков, сшитых с с аналогами мРНК (указаны на панелях), с помощью ю двумерного электроф фореза в ПААГ в системе I II. Типичная электроф фореграмма окрашенн ного геля, на которой указаны п положения белков и радиоакт тивных пятен (пунктиром), приведена внизу справа.

Можно полагать, что белок к S3 играе в ет ключевую роль в формиро а овании участка связыван мРНК с 3’ния стороны от кодона в ы в декодир, рующем центре, однако часть белка а соседству также с кодонам в А-, Р- и Е-уч рибосомы (см. разделы 2.4.1 и ует ми частках с и 2.4.2). В определенной степен вод можно сделать также относительно о ни аналогичный выв т о белка S2 ( (см. рис. 22).

Резуль налогов мРНК с 80S рибосомами суммир ьтаты по сшивкам ан рованы в табл. 14.

4.6. Фраг содержащие участк гами мРНК гменты белка S15, с ки сшивки с аналог На приме евого структурного компонента декодир S ере белка S15, ключе рующего центра 80S рибосомы впервые сделана попытка выйти на о овень и ы, олигопептидный уро при изучении белкового иот. Для определени а о окружения мРНК на рибосоме эукари ия фрагментов белка S15, сшив ыми К, ход, а вающихся с мечены аналогами мРНК использован подх основанный на специфич расщеплении белков, сшитых с мечеными аналогам мРНК в составе ческом и ми е комплексо с рибосомами с последующим определением модифицированных ов и, м х олигопепт В качестве селективных про нтов ы тидов. отеолитических аген использованы гидроксил Полипептидная цепь S15 содержит т ламин и бромциан. П ь белка т единственный сайт расщепления гидроксиламино х ом, расщепление по которому приводит к образованию двух фрагментов (1-98 и 99-145), и 7 сайтов расщеплен с. 23).

ния бромцианом (рис Анал показал, что во всех случаях в результате расще получается лиз в в епления я практичес единственный фрагмент, несущ радиоактивную метку, причем ски щий ю м электрофо ижность этого фр е оретическая подви рагмента тем меньше, чем больше молекуляр масса сшитог с ним аналога мРНК (рис. 23). Модифицированные рная го М е олигопепт идентифицировали, сравнивая м фрагментов, несущих сшитый тиды массы, й остаток меченого аналога мР рными х м РНК (рис. 23), с расчетными молекуляр массами всех фрагментов, которые мог образовыватьс при расщепл белка Sгут ся лении гидроксил ианом. При расщепл ном оказалось, что ламином или бромци лении гидроксиламин Рис. 23. Анализ модифицированн бразующихся при расщ ных олигопептидов, об щеплении белка S15, сшитого с м мРНК, бромцианом (лев иламином (правая мечеными аналогами м вая панель) и гидрокси панель). (а) ированных олигопепти зом (радиоавтограф).

) Разделение модифици идов гель-электрофорез Положения указаны слева и справа от панелей (Mr – я пептидных маркеров молекулярной массы у молекулярн расщепления рибосомно S15 человека ная масса). (б) Схема р ого белка а гидроксиламином (правая пан евая панель), сверху ук нель) и бромцианом (ле казаны рассчитаные молекулярные массы образующи у которых происходит ихся фрагментов, снизу – номера аминокислотных остатков, после к расщепление полипептидной цепи белка S15. Отмечен С белка S15, масса С-концевой фрагмент б которого наиболее точно соответс сперимента.

ствует результатам экс радиоакти метка во всех случаях содержитс во фрагменте с массой примерно 5.ивная х ся м кДа (посл К), который соответ у ле вычета массы сшитого аналога мРНК тствует С-концевому фрагменту равая панель). При р ианом метка во всех у 99-145 (рис. 23, пр расщеплении бромци х случаях б ньше 4 кДа, который с учетом данных по была во фрагменте с массой немного мен о расщеплению гидроксиламин мог соответство только фрагм 111-145 белка ном овать менту а S15 (рис. 23, левая панель).

Таким образом, нуклеоти мРНК в полож от +4 до +12 сближены с Сиды жениях + концевым фрагментом 111-145 белка S15. По сшивка с белком S15 была м оскольку с а наиболее эффективна в случа ированные нуклеоти К аях, когда модифици иды аналогов мРНК находились в А-участке (см. разделы 4.2, 4.4 и 4.5), можно полага что С-концевой. ать, й фрагмент едственно соседству частке.

т этого белка непосре ует с кодоном в А-уч 5. Распол по данным сшивок с аналогами ложение мРНК на рибосоме человека п мРНК Резуль по сшивкам аналогов мРНК с 8 рибосомами (табл. 14) позволили ьтаты 80S т и впервые в ые особенности устро вающего центра 80S выявить характерны ойства мРНК-связыв S рибосомы к ски представлены на, ы, основные черты которого схематичес а рис. 24. Оказалось, что мРНК с 3’-стороны от кодона в А-участке и c 5’-стороны от кодона в Е-участке К к е окружена и Е-участках сближены как белками, так а в основном белками, а кодоны в А, Р и к и 18S рРН ке соседствует в бол ками, чем с рРНК).

НК (кодон в Е-участк льшей степени с белк Сопоставл результатов по аффинной модификации 80S ри человека с ление ибосом с данными по устройству мРН ентра 70S рибосомы свидетельствует о НК-связывающего це ы о Таблица 14. Результаты аффинной модификации 80S рибосом человека аналогами мРНК – реакционноспособными производными олигорибонуклеотидов.

Положение Место Распределение Мишени для сшивки аналогов мРНК в Модифици- присоединения и сшивки между 80S рибосоме (выделены основные) рованного природа 18S рРНК и нуклеотида сшивающей рибосомными аналога группы белками, % мРНК на 18S Белки Нуклеотиды 18S рРНК (в Белки 40S рибосоме рРНК скобках – нумерация субчастицы по 16S рРНК E.coli) -9 U (ATB) <2 >98 - S-9 G (ATB) <2 >98 - S26, S-6 U (ATB) <3 >97 - S-6 G (ATB) <3 >97 - S26, S-4 U, G (ATB) <3 >97 - S26, S-3 5’p (RCl) 3 97 - S26, S-3 5’p (ATB) 6-8 92-94 G1207 (G926) S2, S6, S26, S-3 U (ATB) 7 93 G961 (G693) S3, S26, S2, S5/S7, S-3 G (ATB) Н.о. * Н.о. G1207 Н.о.

-2 U (ATB) Н.о. Н.о. G961 Н.о.

-1 U (ATB) Н.о. Н.о. G1207 Н.о.

+1 5’p (RCl, pGUGU3) 45 55 S5’p (RCl, pU6) 24 76 С1057 (U789) S+1 5’p (ATB) 40-70 30-60 G1207 S+1 U (ATB) 50 50 G1207 S3, S26, S2, S14, S+1 G (ATB) 30 70 G1702 (G1401) S15, S2, S+2 U (ATB) Н.о. Н.о. G1207 Н.о.

+3 U (ATB) Н.о. Н.о. G1207 Н.о.

+3/+4 3’OH (RCl) 80 20 G1702 S26, S3, S3a +4 G (ATB) 70 30 A1823-1825 (1491-1493) S15, S2, S+4 U (ATB) Н.о. Н.о. A1823-1825 S15, S+5 U (ATB) 32 68 A1823-1825 S15, S+5 G (ATB) Н.о. Н.о. A1823-1825, G626 (G530) Н.о.

+6 U (ATB) 29 71 A1823-A1825 S15, S+6 G (ATB) Н.о. Н.о. A1823-A1825, G626 Н.о.

G (ATB) 20 80 A1823-A1825, район 605-630 S3, S15, +7 U (ATB) 8 92 (509-534), С1698 (C1397) S2, S G (ATB) 10 90 A1823-A1825, район 605- S3, S2, +9 U (ATB) 7 93 630, С1698 S15, S G (ATB) 2 98 A1823-A1825, район 605- S3, S+12 U (ATB) 2 98 630, С16*Н.о. – не определено или результат не однозначен.

Рис. 24. Схема расположения мРНК относительно компонентов 80S рибосомы человека по данным сшивок с аналогами мРНК. Большие овалы – рибосомные белки, кружочки – нуклеотиды 18S рРНК.

сходстве в расположении кодонов мРНК в А, Р и Е-участках и с 3’-стороны от кодона в А-участке относительно рРНК малой субчастицы у прокариот и эукариот. Все нуклеотиды 18S рРНК, которые соседствуют с мРНК в 80S рибосоме, расположены в наиболее консервативных районах рРНК малых субчастиц: либо точно в тех же положениях вторичной структуры рРНК, что и нуклеотиды 16S рРНК, непосредственно контактирующие с мРНК в рибосомах прокариот (G626, G961, G1207, C1698, G1702, A1824/1825), либо в положениях, непосредственно примыкающих к ним (А1823, C1057) (рис.

25). Следовательно, можно заключить, что все нуклеотиды 18S рРНК, соседствующие с мРНК, составляют консервативный “кор” (сердцевину) рибосомы, структурно идентичную в рибосомах всех организмов.

Наиболее характерными компонентами белкового окружения мРНК на 80S рибосоме являются белки S3, S15 и S26. Белок S15 гомологичен белку S19p эубактерий, который находится на голове 30S субчастицы вдали от мРНК-связывающего центра.

Лишь его неструктурированная С-концевая часть («хвост») вытянута в сторону Аучастка (рис. 25), приближаясь к нему на расстояние до 35 . Согласно данным РСА, неструктурированный С-концевой хвост белка S19р Th. thermophilus включает в себя а.о. Выравнивание аминокислотных последовательностей белков S15 человека и S19р Th.

Thermophilus показало, что наиболее консервативной является их центральная часть, которая в белке S19p высокоструктурирована. Последним структурированным фрагментом в первичной структуре белка S19р является пентапептид LGEFA в положениях 71-75, которым заканчивается наиболее консервативная часть белка. В белке S15 за консервативным тетрапептидом LGEF (в положениях 115-119) следует Сконцевой фрагмент 120-145, который соответствует неструктурированной части белка S19p. Это дает основания полагать, что фрагмент 120-145 белка S15 также неструктурирован. Длина этого фрагмента составляет 26 а.о., что примерно в 1.5 раза больше, чем длина соответствующего «хвоста» белка S19p, благодаря чему С-концевой фрагмент белка S15 может достигать декодирующего центра рибосомы и контактировать с мРНК. Анализ последовательностей белка S15 различных эукариот показал, что их Сконцевой фрагмент весьма консервативен. Поэтому можно полагать, что он вносит существенный вклад в эффективность работы эукариотической рибосомы. Возможно, этот фрагмент стабилизирует кодон мРНК в декодирующем центре 80S рибосомы в дополнение к взаимодействиям этого кодона с нуклеотидами рРНК малой субчастицы, тем самым обеспечивая более высокую точность трансляции и меньшую вероятность сдвига рамки.

С 3’-стороны от кодона в А-участке мРНК соседствует в основном с белком S3, а также с белком S2. Рибосомные белки S3 и S2 человека гомологичны прокариотическим белкам S3p и S5p, которые являются структурными компонентами«участка входа» мРНК Рис. 25. Модель комплекса 30S субчастицы с мРНК и тРНК, полученная на основании данных РСА (Yusupova et al., 2006; код доступа в PDB 2HGR). На модели отмечены белки и нуклеотиды 16S рРНК, гомологичные белкам 40S субчастицы и нуклеотидам 18S рРНК, сшивающимся с аналогами мРНК по данным настоящей работы (приведены в скобках). Нуклеотиды 16S рРНК отмечены желтыми кружками, положения нуклеотидов мРНК указаны стрелками на цепи мРНК (сиреневого цвета). Вид со стороны поверхности межсубъединичного контакта.

в рибосому. Выравнивание аминокислотных последовательностей белков SThermus thermophilus и человека показало, что три из четырех аминокислотных остатков белка S3 Thermus thermophilus, контактирующих с мРНК по данным РСА, находятся в консервативных участках белка. Это дает основание полагать, что эволюционно консервативные аминокислотные остатки белков S3 эубактерий и человека вовлечены в формирование участка связывания мРНК с 3’-стороны от кодона в декодирующем центре. Таким образом, белковое окружение мРНК с 3’-стороны от кодона в декодирующем центре, по-видимому, сходно в рибосомах всех царств. С другой стороны, в белковом окружении кодонов мРНК в Р- и Е-участках 70S и 80S рибосомы имеются значительные различия. В частности, в наборе белков, соседствующих c нуклеотидами мРНК в положениях от -3 до +3 в 80S рибосоме, есть белки, не имеющие прокариотических гомологов, а именно, S6 и S26. То, что белок Sбыл одной из главных мишеней сшивки для большинства аналогов мРНК, когда модифицированный нуклеотид аналога находился в Р- или Е-участке, может свидетельствовать о непосредственных контактах белка S26 с кодонами мРНК в этих участках. Наконец, эукариот-специфичный белок S26 является основным компонентом молекулярного окружения мРНК с 5’-стороны от кодона в Е-участке. Это свидетельствуют о принципиальных различиях в строении участка связывания мРНК с 5’-стороны от кодона в Е-участке на рибосомах про- и эукариот. Взаимодействие 5’концевой части мРНК с белком S26 в 40S субчастице, по-видимому, заменяет те взаимодействия в 30S субчастице, в которых участвуют белок S18p, не имеющий эукариотических гомологов, и фрагменты 16S рРНК, которые связываются с районом последовательности Шайна-Дальгарно, отсутствующей у эукариот.

6. Изучение структурно-функциональной топографии 5.8S рРНК в 60S субчастице с помощью фотоактивируемых производных олигорибонуклеотидов Метод олигонуклеотидного пробинга, основанный на изучении доступности определенных участков рРНК в составе рибосом для связывания комплементарных олигонуклеотидов (зондов), используют уже более двух десятилетий для выявления экспонированных участков РНК и для изучения участия различных. Однако при низкой степени последовательностей рРНК в функционировании рибосомы связывания олигонуклеотида-зонда с рибосомой (что бывает часто) трудно судить о специфичности связывания зонда с выбранной последовательностью рРНК и о его влиянии на функционирование рибосомы. Использование вместо олигонуклеотидов их реакционноспособных производных позволяет изучать функциональную топографию рРНК в рибосоме даже в тех случаях, когда олигомер образует с рРНК труднодетектируемые лабильные комплексы, поскольку к овалентное присоединение производного олигомера к рРНК приводит к фиксации таких комплексов. Это дает возможность исследовать изменение доступности комплементарной олигомеру последовательности рРНК в зависимости от функционального состояния рибосомы путем определения степени модификации рРНК производным данного олигомера.

Преимуществом использования реакционноспособных производных коротких олигорибонуклеотидов по сравнению с немодифицированными олигомерами является то, что, определив сшивающийся нуклеотид рРНК-мишени, можно судить о селективности связывания зонда с выбранной последовательностью рРНК.

В экспериментах по сшивкам 80S рибосом с производными нонарибонуклеотида UCUGUGUUU, несущего ATB-группу на остатке уридина в первом или третьем положении (аналоги -6U(9) и -4U(9), табл. 11) было обнаружено, что наряду со значительной модификацией 40S субчастиц, зависимой от присутствия тРНКPhe, происходит относительно слабая независимая от тРНК модификация 60S субчастиц.

Анализ рРНК, выделенной из облученных комплексов, показал наличие единственного радиоактивного продукта с электрофоретической подвижностью, соответствующей подвижности 5.8S рРНК, сшитой с нонамером (рис. 26). Выход этого продукта был намного выше в случае аналога -6U(9). Поли(U) не блокировала, а напротив, усиливала сшивку обоих производных с 5.8S рРНК, что указывало на то, что она происходила вне мРНК-связывающего центра. Сшивка с 5.8S рРНК была сиквенс-специфичной - ее не наблюдали ни для одного из производных других олигорибонуклеотидов, использованных в качестве аналогов мРНК, при этом степень связывания аналогов -6U(9) и -4U(9) с рибосомами в отсутствие тРНК была близкой к фоновым значением.

Рис. 26. Анализ сшивки меченых производных -6U(9) (дорожки 1 и 2) и -4U(9) (дорожки 3 и 4) с 5.8S рРНК электрофорезом в 5%-ном ПААГ. РНК выделяли из комплексов 80S рибосом, полученных в отсутствие (дорожки 1 и 3) или в присутствии (дорожки 2 и 4) поли(U).

Положения маркеров длины РНК, определенных с помощью окрашивания геля ‘Stains All’, указаны справа.

Можно было полагать, что в 5.8S рРНК есть последовательность, комплементарная нонамеру, благодаря чему сшивки могли происходить в составе лабильных комплементарных комплексов, не детектируемых методом фильтрации на нитроцеллюлозных фильтрах. Компьютерный анализ выявил единственную относительно длинную последовательность ACACA в положениях 82-86 5.8S рРНК человека, которая полностью комплементарна последовательности UGUGU в составе производных нонамера UCUGUGUUU. Анализ нуклеотидов 5.8S рРНК, сшивающихся с аналогом -6U(9), с помощью обратной транскрипции показал, что сшивка происходила с G89, ра лизи ти о асположенным вбл 3’-стороны последовательност ACACA. Это свидетель икации в нтарного, ьствовало о модифи 5.8S рРНК в составе комплемен комплекса, образован ьностью ACACA и пр бонуклеотида.

нного последователь роизводным нонариб Извест две альтернатив вторичных стр 5.8S рРНК млекопитающих в тны вных руктуры К в составе ее РНК (рис. 27 A и Б). В структуре A посл е комплекса с 28S рР ледовательность 8286 находи в односпиральн участке, а в стр Б – в двусп.

ится ном руктуре пиральном (рис. 27).

Дуплекс, образован этой нный й последоват гментом в тельностью и фраг UGUGU в составе производных но н онамера, должен дополнител стабилизи я льно ироваться двумя терминальн неканоническ парами GiU ными кими U (Zenkova and Karpova, 1993). Очевидно, что о структура А более пред я дпочтительна для связывания я производных нонамера.

Рис. 27. Вт структура це S торичная ентральной части 5.8S рРНК челов в ее комплексе с 28S рРНК согласно века о (www.rna.icm N.

mb.utexas.edu) (A) и Nazar et al., (1975) (Б).

На структу А приведена схема комплементарного уре о спаривания производных нонарибонуклеотида а UCUGUGUU, UU с последовательностью 80-86 5.8S рРНК, приводящег к сшивке с G89 на структуре (Б) го 9; ) последовате на жирной линией.

ельность 80-86 отмечен Эффек РНК рно я ктивность сшивки -6U(9) с 5.8S рР была пример одинакова для изолирова ц (рис. 28, дорожка 1 плексов 80S рибосом анных 60S субчастиц 1) и всех типов комп м (дорожки 3-6), но значительн ае вакантных 80S ри.

но ниже, чем в случа ибосом (дорожка 2).

Различия в эффективности сш ого нонарибонуклео в шивания производно отида с 5.8S рРНК в составе 60S субчастиц и вак 80S рибос сохранялись в широком диапазоне 6 кантных сом ш е концентра аций производного.

Рис. 28. Анали сшивки меченого аналога –6U(9) с 5.8S из а S рРНК электрофо таве 60S субчастиц (1), орезом в ПААГ в сост, в составе вакан 80S рибосом (2), в комплексе 80S нтных S рибосом с поли( 0S рибосом с поли(U) и (U) (3), в комплексе 80 и Phe-тРНКPhe (4), осом с аналогом мРНК, в комплексе 80S рибо К UCUCUCGUGU астке (5) и в комплексе UUU и тРНКPhe в P уча е 80S рибосом с UCUCUCGUGUUU, тРНКPhe в P участке и т и тРНКVal в E E участке (6).

Таким образом, доступность последовательн 82-86 5.8S рРНК для связывания ности я комплеме ибосомах, полученн реассоциацией ентарного зонда в вакантных 80S ри ных й субчастиц е, чем в изолированн ах или в комплексах ц, значительно ниже ных 60S субчастица х 80S рибосом с мРНК и тРН (иными словами в «программирова рибосомах).

НК и анных».

Резкие различия в доступности центральной части 5.8S рРН в вакантных и р й НК и «программированных» 80S рибосомах могут быть вызваны конформационными т к и изменениями, сопровождаю переход рибосом из «пр » ющими рограммированного» состояния оцессе белкового син о после терминации я в вакантное в про нтеза. Известно, что и трансляци все лиганды покидают рибосому после чего она диссоциирует на ии п у, а а субчастиц под действием факторов инициац eIF-3 и eIF-6, а образовавшиеся цы ции я свободны 40S субчастицы могут принять уча в инициации трансляции новой ые астие и й мРНК. Можно предположит что диссоциаци лигандов из по й М ть, ия ост-терминационной рибосомы вызывает конформ д, язывание, ы мационный переход облегчающий свя факторов, что делает центральную часть 5.8S рРНК менее экспонированной. Такой переход может происходить либо вследствие изменений в молекулярном окружении центральной части 5.8S рРНК, либо из-за изменений во вторичной структуре рРНК, в результате которых последовательность 82-86 оказывается в двуспиральном участке, недоступном для связывания комплементарных олигонуклеотидов. Из-за наличия двух альтернативных структур 5.8S рРНК в ее комплексе с 28S рРНК (рис. 27) более привлекательным кажется второй вариант. Вероятно, в изолированных 60S субчастицах и в «программированных» 80S рибосомах 5.8S рРНК имеет структуру A, а в вакантных 80S рибосомах – структуру Б, которая может стимулировать связывание факторов, диссоциирующих рибосому, что приводит к образованию свободных субчастиц, способных начать трансляцию новой мРНК. Есть основания полагать, что конформационный переход в центральной части 5.8S рРНК специфичен для рибосом эукариот.

Аналог -6U(9) оказался также удобным инструментом для определения белков 60S субчастицы, соседствующих с последовательностью 82-86 5.8SS рРНК в составе 60S субчастицы. Сшивка с белками, как и с 5.8S рРНК, была специфична для -6U(9), поскольку ее не наблюдали в случае использования АТВ-производных других олигорибонуклеотидов. Модификации подвергались белки L6 и L8, которые могли быть однозначно идентифицированы с помощью одномерного гель-электрофореза благодаря большому расстоянию между полосами индивидуальных белков в самой верхней части электрофореграммы. Один из этих белков, L8, был картирован на крио-ЭМ изображении 60S субчастицы дрожжей у основания L1-выступа с внешней стороны субчастицы (Spahn et al., 2001). Белок L6 не имеет прокариотических гомологов, поэтому его не удалось картировать на 60S субчастице с помощью крио-ЭМ.

Результаты настоящей работы свидетельствуют о том, что в 60S субчастице белок Lсоседствует с центральной частью 5.8S рРНК. На крио-ЭМ модели 60S субчастицы дрожжей сегмент экспансии ES4, куда входит 3’-конец 5.8S рРНК, картирован у основания L1-выступа очень близко к белку L8. Следовательно, можно полагать, что центральная часть 5.8S рРНК, содержащая последовательность 82-86, и белки L6 и Lрасположены по соседству друг с другом у основания L1-выступа с внешней стороны 60S субчастицы рибосомы человека.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ Применение метода афинной модификации рибосом с использованием производных олигорибонуклеотидов, несущих реакционноспособную группу в заданном положении, позволило получить уникальную информацию о структурно-функциональной организации рибосом млекопитающих, которую до сих пор не могут дать другие методы и подходы. В настоящей работе впервые получено экспериментальное подтверждение распространенного представления о том, что нуклеотиды рРНК, принимающие участие в формировании мРНК-связывающего центра, включая участок декодирования, составляют консервативный “кор” (сердцевину) рибосомы, структурно идентичную в рибосомах всех организмов. Это согласуется с представлением о «мире РНК», согласно которому проторибосома, возникшая на заре эволюции, состояла только из рРНК, а белки появились в составе рибосомы позже. Возможно, первоначальная роль белков состояла в поддержании пространственной структуры рРНК, оптимальной для функционирования рибосомы, но в процессе дальнейшей эволюции роль белков возросла и они стали принимать участие в формировании некоторых функциональных центров рибосом. Полученные в настоящей работе данные свидетельствуют о том, что у эукариот рибосомные белки вносят больший вклад в формирование мРНК-связывающего центра, чем у прокариот. Более того, молекулярное окружение мРНК на рибосоме млекопитающих в значительной степени состоит из эукариот-специфичных рибосомных белков, а также белков, которые хоть и имеют прокариотические гомологи, но соседствуют с мРНК своими эукариот-специфичными последовательностями. Эти данные несомненно должны поставить под сомнение широко распространенную точку зрения, что эукариотическая рибосома представляет собой просто усложненную копию прокариотической рибосомы, в которой все функциональные центры устроены в общем так же, как и в прокариотической рибосоме, а эукариот-специфичные белки расположены на периферии, вдали от функциональных центров, и нужны главным образом для поддержания «правильной» пространственной структуры фрагментов рРНК, отсутствующих у прокариот.

Можно предположить, что вовлечение в формирование мРНК-связывающего центра 80S рибосом специфичных для эукариот олигопептидных последовательностей или белков связано с их способностью взаимодействовать с различными факторами (шаперонами, модифицирующими ферментами и пр.), влияющими на эффективность и точность трансляции, или служить мишенями для этих факторов. Это, в свою очередь, может обеспечивать более сложную и многостадийную систему регуляции белкового синтеза у эукариот по сравнению с прокариотами. Высказанная гипотеза базируется на том, что различия в молекулярном окружении мРНК на рибосомах прокариот и эукариот касаются в наибольшей степени окружения той части мРНК, которая находится с 5’стороны от кодона в Е-участке; именно те компоненты рибосомы, которые формируют это окружение, отвечают за ее взаимодействие с 5’-нетранслируемой областью мРНК, которая может участвовать в различных регуляторных процессах.

Недавно результаты настоящей работы были полностью подтверждены данными по сшивкам мРНК, несущих остатки s4U, с рибосомами кролика в составе 48S предынициаторного и 80S инициаторного комплексов (Pisarev et al., 2006; 2008).

Оказалось, что в составе этих комплексов мРНК соседствует с теми же нуклеотидами рРНК и рибосомными белками, что и в комплексах рибосом человека, изученных в настоящей работе, а нуклеотиды мРНК в положениях от -8 до -17 контактируют со специфичным для эукариот фактором инициации eIF3, что согласуется с высказанной выше гипотезой.

Фотоактивируемые производные олигорибонуклеотидов оказались полезными для изучения не только структурной организации мРНК-связывающего центра рибосомы человека, но и в качестве комплементарно-адресованных зондов (которые имеют ряд преимуществ по сравнению с обычными антисмысловыми олигонуклеотидами) для изучения изменений, которые могут происходить в определенных участках структуры рРНК при переходе рибосомы из одного функционального состояния в другое. В частности, в настоящей работе с использованием такого зонда удалось обнаружить зависимость доступности последовательности в центральной части 5.8S рРНК от состояния рибосомы, благодаря чему стала более понятной роль 5.8S рРНК в процессе трансляции.

Нет сомнений, что использование метода аффинной модификации для изучения структурно-функциональной топографии эукариотической рибосомы дает уникальную возможность получать всестороннюю информацию об особенностях устройства ее функциональных центров, что является принципиально важным для понимания как молекулярных механизмов трансляции у эукариот, так и тех регуляторных процессов, которые обеспечивают эффективность и точность белкового синтеза.

ВЫВОДЫ Настоящая работа представляет собой первое комплексное исследование структурнофункциональной топографии рибосомы человека. Это исследование позволило получить уникальную информацию о молекулярном окружении мРНК на 80S рибосоме на уровне нуклеотидов рРНК и рибосомных белков, в случае одного из них – на уровне олигопептидной последовательности, а также о расположении центральной части 5.8S рРНК в 60S субчастице рибосомы и степени ее экспонированности на разных стадиях трансляции.

1. Для изучения молекулярного окружения мРНК на 80S рибосоме человека предложен набор фотоактивируемых аналогов мРНК – производных олигорибонуклеотидов длиной от 3 до 12 нт, различающихся природой и положением нуклеотида, несущего сшивающую группу, который использован для аффинной модификации рибосом наряду с алкилирующими производными олигорибонуклеотидов.

• Установлено, что в отсутствие факторов трансляции короткие аналоги мРНК, могут быть с высокой степенью точности фазированы на рибосоме с помощью прокариотических тРНК, узнающих кодон, направляемый в Р-участок, в отличие от аналогов мРНК длиной около 50 нт.

• Показано, что при облучении мягким УФ-светом комплексов 80S рибосом с тРНК и аналогами мРНК, несущими алкилирующую группу на 3’- или 5’-конце или пазидотетрафторбензоильную группу на остатке уридина, гуанозина или 5’концевом фосфате, происходят сшивки аналогов с рибосомами; для всех аналогов основной мишенью сшивки являлась 40S субчастица.

2. Определены рибосомные белки и нуклеотиды 18S рРНК, сшивающиеся с аналогами мРНК. Обнаружено, что результаты аффинной модификации (наборы сшивающихся белков, положение сшитого нуклеотида в 18S рРНК и выход каждого из продуктов сшивки) зависят не только от положения модифицированного нуклеотида аналога мРНК на рибосоме, но и от его природы и типа сшивающей группы.

3. Показано, что нуклеотиды рРНК малых субчастиц, соседствующие с мРНК, составляют консервативный “кор” (сердцевину) рибосомы, структурно идентичную в рибосомах всех организмов.

• Установлено, что 18S рРНК сближена с довольно протяженным фрагментом мРНК – с нуклеотидами в положениях от -3 до +9 относительно первого нуклеотида кодона в Р-участке.

• Показано, что все нуклеотиды 18S рРНК, сшивающиеся с аналогами мРНК, находятся в консервативных районах рРНК малых рибосомных субчастиц и по положению во вторичной структуре точно соответствуют нуклеотидам 16S рРНК, контактирующим с мРНК по данным рентгеноструктурного анализа рибосом прокариот.

4. Установлено, что у млекопитающих рибосомные белки играют большую роль в организации мРНК-связывающего центра рибосом, чем у прокариот, и обнаружены значительные различия в белковом окружении мРНК на рибосомах про- и эукариот.

• Показано, что белки сближены со всеми нуклеотидами мРНК в положениях от -до +12, а нуклеотиды в положениях от -4 до -9 и от +9 до +12 соседствуют в основном с белками.

• Установлено, что на 80S рибосоме нуклеотиды мРНК в положениях от +1 до -соседствуют с белками S6 и S26, не имеющими прокариотических гомологов, а в положениях от -4 до -9 – в основном с белком S26. Нуклеотиды в декодирующем центре (в положениях от +4 до +6) и в положении +7 сближены преимущественно с белком S15, чей прокариотический гомолог S19 удален от декодирующего центра на расстояние более 35 .

• Обнаружено, что нуклеотиды мРНК в положениях от +4 до +7 соседствуют на 80S рибосоме с С-концевым фрагментом 111-145 белка S15, что указывает на участие этого фрагмента в формировании декодирующего центра эукариотической рибосомы.

• Выявлено сходство в белковом окружении мРНК на рибосоме с 3’-стороны от кодона в декодирующем центре у про- и эукариот. Показано, что эта часть мРНК соседствует в основном с белком S3, прокариотический гомолог которого контактирует с мРНК с 3’-стороны от кодона в А-участке.

5. С использованием производного нонарибонуклеотида, содержащего последовательность, комплементарную фрагменту 82-86 в центральном районе 5.8S рРНК, и перфторфенилазидогруппу на первом остатке уридина, впервые изучено расположение этого района 5.8S рРНК в рибосоме млекопитающих, а также его доступность для комплементарно-адресованной модификации этим производным в разных функциональных состояниях рибосомы.

• Установлено, что белки L6 и L8 окружают последовательность 82-86 5.8S рРНК в составе 60S субчастиц. Сопоставление этих результатов с данными по криоэлектронной микроскопии эукариотических 60S субчастиц показало, что центральная часть 5.8S рРНК и белки L6 и L8 расположены у основания L1стержня в 60S субчастице.

• Показано, что доступность фрагмента 82-86 5.8S рРНК для комплементарноадресованной модификации производным нонарибонуклеотида в свободных 80S рибосомах намного ниже, чем в 60S субчастицах и программированных 80S рибосомах. На основании этих данных выдвинута гипотеза о конформационном переходе в центральной части 5.8S рРНК, сопровождающем диссоциацию 80S рибосом на субчастицы после терминации трансляции.

Основные результаты диссертации изложены в следующих работах:

Обзоры 1. Грайфер Д.М., Карпова Г.Г., Кнорре Д.Г. Расположение матрицы на рибосоме человека по данным аффинной модификации реакционноспособными аналогами мРНК // Биохимия. - 2001.

- Т. 66. - С. 725-744.

2. Грайфер Д.М., Карпова Г.Г. Структурно-функциональная топография рибосом человека по данным сшивок с аналогами мРНК – производными олигорибонуклеотидов // Молек. биология.

- 2001. - Т. 35. - С. 584-596.

Статьи в научных журналах 1. Грайфер Д.М., Зенкова М.А., Карпова Г.Г., Малыгин А.А., Матасова Н.Б. Особенности неэнзиматического связывания олигорибонуклеотидов - аналогов мРНК и Phe-тРНКPhe с 80S рибосомами из плаценты человека. // Молекуляр. биология. - 1990. - Т. 24. - С. 1076-1082.

2. Булыгин К.Н., Грайфер Д.М., Зенкова М.А., Малыгин А.А., Ямковой В.И., Карпова Г.Г.

Аффинная модификация 80S рибосом из плаценты человека аналогами мРНК-производными олигоуридилатов с алкилирующей группой на 3'-конце // Молекуляр. биология. - 1992. - Т. 26. - С. 821-828.

3. Малыгин А.А., Грайфер Д.М., Зенкова М.А., Мамаев С.В., Карпова Г.Г. Аффинная модификация 80S рибосом из плаценты человека производными три- и гексауридилатов в качестве аналогов мРНК // Молекуляр. биология. - 1992. - Т. 26. - С. 369-378.

4. Graifer D.M., Nekhai S.Yu., Mundus D.A., Fedorova O.S., Karpova G.G. Interaction of human and Escherichia coli tRNAPhe with human 80S ribosomes in the presence of oligo- and polyuridylate template. // Biochim. Biophys. Acta. - 1992. - Vol. 1171. - P. 56-64.

5. Malygin A.A., Graifer D.M., Bulygin K.N., Zenkova M.A., Yamkovoy V.I., Stahl J., Karpova G.G.

Arrangement of mRNA at the decoding site of human ribosomes. 18S rRNA nucleotides and ribosomal proteins cross-linked to oligouridylate derivatives with alkylating groups at either the 3' or the 5' termini // Eur. J. Biochem. - 1994. - Vol. 226. - P. 715-723.

6. Graifer D.M., Juzumiene D.I., Karpova G.G., Wollenzien P. mRNA binding track in the human 80S ribosome for mRNA analogues randomly substituted with 4-thiouridine residues. // Biochemistry. - 1994. - Vol. 33. - P. 6201-6206.

7. Graifer D.M., Juzumiene D.I., Wollenzien P., Karpova G.G. Cross-linking of mRNA analogues containing 4-thiouridine residues on the 3'- or 5'-side of the coding triplet to the mRNA binding center of the human ribosome. // Biochemistry. - 1994. - Vol. 33. - P. 3878-3884.

8. Булыгин К.Н., Матасова Н.Б., Грайфер Д.М., Веньяминова А.Г., Ямковой В.И., Шталь И., Карпова Г.Г. Белковое окружение матрицы в декодирующей области 80S рибосом из плаценты человека по данным аффинной модификации аналогами мРНК - производными олигонуклеотидов // Молекуляр. биология. - 1996. - Т. 30. - С. 400-409.

9. Смоленская И.А., Грайфер Д.М., Иванов А.В., Владимиров С.Н., Веньяминова А.Г., Репкова М.Н., Шталь И., Карпова Г.Г. Белковое окружение матрицы в области декодирования по данным аффинной модификации рибосом из плаценты человека алкилирующим производным олигорибонуклеотида pGUGU3 // Молекуляр. биология. - 1997. - Т. 31. - С. 144-151.

10. Bulygin K.N., Graifer D.M., Repkova M.N., Smolenskaya I.A., Veniyaminova A.G., Karpova G.G.

Nucleotide G-1207 of 18S rRNA is an essential component of the human 80S ribosomal decoding center // RNA. - 1997. - Vol. 3. - P. 1480-1485.

11. Bulygin K.N., Matasova N.B., Graifer D.M., Veniyaminova A.G., Yamkovoy V.I., Stahl J., Karpova G.G. Protein environment of mRNA at the decoding site of 80S ribosomes from human placenta as revealed from affinity labeling with mRNA analogs - derivatives of oligoribonucleotides // Biochim.Biophys.Acta. - 1997. - Vol. 1351. - P. 325-332.

12. Смоленская И.А., Булыгин К.Н., Грайфер Д.М., Иванов А.В., Веньяминова А.Г., Репкова М.Н., Карпова Г.Г. Расположение матрицы в области декодирования по данным аффинной модификации рибосом человека фотоактивируемым производным олигорибонуклеотида pGUGUUU. // Молекуляр. биология. - 1998. - Т. 32. - С. 233-241.

13. Грайфер Д.М., Ляхович А.В., Демешкина Н.А., Иванов А.В., Репкова М.Н., Веньяминова А.Г., Карпова Г.Г. Фотоаффинная модификация 80S рибосом человека аналогом мРНК - производным гексарибонуклеотида pUUUGUU, несущим арилазидогруппу на остатке гуанина // Молекуляр. Биология. - 1999. - Т. 33. - С. 174-182.

14. Грайфер Д.М., Демешкина Н.А., Булыгин К.Н., Репкова М.Н., Веньяминова А.Г., Карпова Г.Г. Окружение 5’-концевого нуклеотида кодона мРНК в Р- и Е-сайтах рибосомы человека:

сшивки с производными рUUUGUU, несущими фотоактивируемую группу на остатке урацила или на 5’-фосфате // Молекуляр. биология. - 2000. - Т. 34. - С. 270-276.

15. Демешкина Н.А., Репкова М.Н., Веньяминова А.Г., Грайфер Д.М., Карпова Г.Г. Аналог мРНК – производное рUUUGUU с арилазидогруппой на остатке гуанозина сшивается с нуклеотидами А1823 и А1824 18S рРНК в составе 80S рибосом человека // Молекуляр.

биология. - 2000. - Т.34. - С. 894-898.

16. Demeshkina N., Repkova M., Ven’yaminova A., Graifer D., Karpova G. Nucleotides of 18S rRNA surrounding mRNA codons at the human ribosomal A, P and E sites, respectively: a cross-linking study with mRNA analogues carrying aryl azide group at either the uracil or the guanine residue. // RNA. - 2000. - Vol. 6. - P. 1727-1736.

17. Демешкина Н.А., Репкова М.Н., Веньяминова А.Г., Грайфер Д.М. Карпова Г.Г. Сшивки аналога мРНК, производного pUUAGUAUUUAUU с фотоактивируемой группой на остатке гуанозина, с 80S рибосомами человека // Молекуляр. биология. - 2002. - Т. 36. - С. 114-122.

18. Демешкина Н.А., Лалетина Е.С., Мещанинова М.И., Репкова М.Н., Веньяминова А.Г., Грайфер Д.М., Карпова Г.Г. Окружение кодонов мРНК в Р и Е-сайтах рибосом человека по данным фотосшивок с производными рUUUGUU // Молекуляр. биология. - 2003. - Т. 37. - С.

147-155.

19. Demeshkina N., Laletina E., Meschaninova M., Ven’yaminova A., Graifer D., Karpova G.

Positioning of mRNA codons with respect to 18S rRNA at the P and E sites of human ribosome // Biochim. Biophys. Acta. - 2003. - Vol. 1627. - P. 39-46.

20. Стяжкина В.А., Молотков М.В., Демешкина Н.А., Булыгин К.Н., Грайфер Д.М., Мещанинова М.И., Репкова М.Н., Веньяминова А.Г., Карпова Г.Г. Расположение смыслового и терминирующего кодонов матрицы в А-участке рибосом человека по данным фотосшивок с производными олигорибонуклеотидов // Молекуляр. биология. - 2003. - Т. 37. - С. 1019-1026.

21. Демешкина Н.А., Репкова М.Н., Веньяминова А.Г., Грайфер Д.М., Карпова Г.Г. Первый нуклеотид кодона в Р-участке 80S рибосом cближен с нуклеотидом G1702 18S рРНК - по данным сшивок с производным pUUUGUU, несущим перфторфенилазидогруппу на остатке гуанина // Молекуляр. биология. - 2004. - Т. 38. - С. 501-506.

22. Молотков М.В., Грайфер Д.М., Мещанинова М.И., Репкова М.Н., Веньяминова А.Г., Карпова Г.Г. Белковое окружение смыслового кодона матрицы в А-участке рибосом человека по данным фотосшивок с производными олигорибонуклеотидов // Молекуляр. биология. - 2004.

- Т. 38. - С. 493-500.

23. Молотков М.В., Грайфер Д.М., Еремина А.В., Иванов А.В., Лалетина Е.С., Репкова М.Н., Веньяминова А.Г., Карпова Г.Г. Часть матрицы с 5’-стороны от кодона в Е-участке сближена с белком S26 на 80S рибосоме человека // Молекуляр. биология. - 2004. - Т. 38. - С. 1033-1040.

24. Graifer, D., Molotkov, M., Styazhkina, V., Demeshkina, N., Bulygin, K., Eremina, A., Ivanov, A., Laletina, E., Ven’yaminova, A., and Karpova, G. Variable and conserved elements of human ribosomes surrounding the mRNA at the decoding and upstream sites // Nucleic Acids Res. - 2004. - Vol. 32. - P. 3282-3293.

25. Graifer D., Molotkov M., Eremina A., Ven’yaminova A., Repkova M. and Karpova G. The central part of the 5.8S rRNA is differently arranged in programmed and free human ribosomes // Biochem.

J. - 2005. - Vol. 387. - P. 139-145.

26. Molotkov M., Graifer D., Demeshkina N., Repkova M., Ven’yaminova A., Karpova G.

Arrangement of mRNA 3’ of the A site codon on the human 80S ribosome // RNA Biology. - 2005.

- Vol. 2. - P. 63-69.

27. Молотков М.В., Грайфер Д.М., Демешкина Н.А., Репкова М.Н., Веньяминова А.Г., Карпова Г.Г. Расположение матрицы с 3’-стороны от кодона в А-участке на 80S рибосоме человека // Молекуляр. биология. - 2005. - Т. 39. - С. 999-1007.

28. Molotkov M.V., Graifer D.M., Popugaeva E.A., Bulygin K.N., Meschaninova M.I., Ven’yaminova A.G. and Karpova G.G. mRNA 3’ of the A site bound codon is located close to protein S3 on the human 80S ribosome // RNA Biology. - 2006. - Vol. 3. - P. 122-129.

29. Молотков М.В., Грайфер Д.М., Попугаева Е.А., Булыгин К.Н., Мещанинова М.И., Веньяминова А.Г., Карпова Г.Г. Белок S3 в 80S рибосоме человека соседствует с мРНК с 3’стороны от кодона в А-участке // Биоорган. химия. - 2007. - Т. 33. - С. 431-441.

30. Хайрулина Ю.С., Молотков М.В, Булыгин К.Н., Грайфер Д.М., Веньяминова А.Г., Карпова Г.Г. С-концевой фрагмент рибосомного белка S15 расположен в декодирующем центре рибосомы человека // Молекуляр. биология. - 2008. - Т. 42. - С. 306-313.




© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.