WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


МОСКОВСКИЙ ОРДЕНОВ ЛЕНИНА, ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В. ЛОМОНОСОВА Химический факультет

На правах рукописи

СЕНИН ИВАН ИВАНОВИЧ

Са2+/РЕКОВЕРИН-ЗАВИСИМАЯ РЕГУЛЯЦИИ ФОТОТРАНСДУКЦИИ

02.00.10 – биоорганическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени доктора химических наук

Москва – 2008

Работа выполнена в отделе сигнальных систем клетки научно-исследовательского института физико-химической биологии имени А.Н.Белозерского МГУ имени М.В.Ломоносова.

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, академик РАН, профессор Мирошников Анатолий Иванович доктор химических наук, профессор Громова Елизавета Сергеевна доктор биологических наук, профессор Чернов Николай Николаевич

Ведущая организация: Институт молекулярной биологии имени В.А.Энгельгардта РАН

Защита диссертации состоится 3 июня 2008 г. в 16 часов на заседании совета Д501.001.по химическим наукам при Московском государственном университете имени М.В.

Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, МГУ, НИИ физико-химической биологии имени А.Н.Белозерского МГУ, аудитория 501.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан 2 мая 2008 г.

Ученый секретарь совета, кандидат химических наук Смирнова И.Г.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ



Актуальность проблемы. Ионы кальция и процессы фосфорилирования/ дефосфорилирования белков используются клетками всех типов для передачи и регуляции самых разнообразных внешних и внутриклеточных сигналов, управляющих такими фундаментальными биологическими функциями, как клеточная пролиферация и дифференцировка, иммунитет, транспорт. Благодаря методическому удобству работы с фоторецепторными клетками (исключительно высокое содержание сигнальных белков, возможность "запуска" передачи сигнала светом), зрительный пигмент родопсин, принадлежащий к семейству сопряженных с G-белками мембранных рецепторов, и зрительный каскад родопсин - трансдуцин - cGMP-фосфодиэстераза послужили прототипами для огромного числа работ по системам рецептор - G-белок - эффекторный белок, функционирующим в клетках других типов.

Многие эффекты Са2+ на системы клеточной сигнализации опосредованы Са2+связывающими белками, мишенями для которых очень часто служат протеинкиназы и протеинфосфатазы. Са2+-связывающим белкам и механизмам регуляции ими процессов фосфорилирования/дефосфорилирования посвящено огромное число работ;

фоторецепторная клетка в этом отношении - была исключение. К моменту начала настоящей работы были ясны общая картина и многие детали зрительной трансдукции у позвоночных животных, в частности, доказана важность фосфорилирования родопсина для аттенюации сигнала в зрительном каскаде и для световой адаптации фоторецепторной клетки. Однако систематическое и интенсивное исследование роли Са2+-связывающих белков в регуляции фототрансдукции у позвоночных животных, в том числе - в регуляции фосфорилирования зрительного рецептора (родопсина) и соответствующей протеинкиназы (родопсинкиназы), было начато благодаря обнаружению в 1991 году Са2+-связывающего белка рековерина, функция которого к моменту начала настоящей работы не была установлена.

Рековерин – родоначальник белков семейства нейрональных Са2+-сенсоров, как и остальные представители этого семейства, содержит на N-конце миристоильный остаток. В свободном от Са2+ состоянии миристоильный остаток рековерина погружен в гидрофобный “карман” белка, вследствие чего рековерин находится в растворимой фазе. В присутствии Са2+, благодаря экспонированию миристоильного остатка из гидрофобного “кармана”, рековерин транслоцируется из раствора на мембрану. Этот механизм, получивший название Са2+-миристоильного переключателя, впервые описан для рековерина и позднее – также для других нейрональных Са2+-сенсоров.

Актуальность данной работы обусловлена тем, что к моменту начала работы отсутствовала информация о (i) функции рековерина в фоторецепторных клетках и (ii) механизме Са2+-миристоильного переключателя рековерина и других представителей семейства нейрональных Са2+-сенсоров и о роли каждого Са2+-связывающего центра белка в работе этого механизма.

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы – изучение рековерина из фоторецепторных клеток быка. В соответствии с этой целью в работе решались следующие задачи:

1. Идентификация клеточной мишени (или мишеней) рековерина и установления его функции в фоторецепторной клетке 2. Исследование механизма Са2+-миристоильного переключателя рековерина Научная новизна. В настоящей работе продемонстрирована и детально исследована Са2+зависимая регуляция фосфорилирования родопсина в наружных сегментах палочки (НСП) сетчатки быка и доказано, что ингибирующий эффект ионов кальция на фосфорилирование родопсина опосредован рековерином. Установлено, что клеточной мишенью для рековерина служит родопсинкиназа; эти данные говорят о том, что рековерин in vivo выполняет функцию «кальциевого сенсора» для родопсинкиназы. Показано, что эффективность рековерина как Са2+-зависимого ингибитора значительно выше в реакции фосфорилирования «темнового», чем фотоактивированного родопсина; высказана оригинальная гипотеза, предполагающая, что одна из функций рековерина в фоторецепторной клетке – предотвращение нежелательной реакции фосфорилирования «темнового» родопсна и тем самым создание благоприятных условий для выполнения родопсинкиназой ее основной функции – фосфорилирование фотовозбужденного рековерина. Показано, что N-концевое миристоилирование рековерина увеличивает его ингибирующую эффективность в реакции фосфорилирования родопсина родопсинкиназой.

Наши данные также показывают, что холестерин, входящий в состав фоторецепторных мембран, способствует связыванию рековерина с мембранами и усиливает ингибирование родопсинкиназы посредством сдвига полумаксимального эффекта ингибирования родопсинкиназа в сторону низких значений концентраций свободного кальция и рековерина.

Установлена специфическая роль каждого из двух функционирующих в рековерине Са2+-связывающих центров (EF2 и EF3) в механизме его Са2+-миристоильного переключателя. Получены прямые экспериментальные доказательства последовательного заполнения Са2+-связывающих центров рековерина ионами кальция. Обнаружено, что для функционирования механизма последовательного заполнения Са2+-связывающих центров рековерин должен быть миристоилирован. Определены кинетические параметры, характеризующие взаимодействие рековерина с искусственными липидными мембранами.

Впервые продемонстрировано, что Са2+-связывающий центр EF2 рековерина непосредственно контролирует экспонирование гидрофобного “кармана” и миристоильного остатка, а также Са2+-зависимое ингибирование родопсинкиназы рековерином. Методом ренгрено-структурного анализа охарактеризована пространственная структура мутанта рековерина с выключенным EF2, что позволило выявить последовательность структурных перестроек в молекуле белка, сопутствующие процессу экспонирования миристоильного остатка при последовательном заполнении кальцием Са2+-связывающих центров рековерина.

Выявлена роль функционального четвертого Са2+-связывающего центра рековерина.

Установлена функция реконструированного Са2+-связывающего центра EF4 в процессе связывания рековерина с фоторецепторной мембраной и в процессе ингибирования фосфорилирования родопсина, катализируемого родопсинкиназой. Получены прямые экспериментальные доказательства того, что активный Са2+-связывающий центр EF4 в молекуле рековерина может функционально компенсировать отсутствие связывания ионов кальция в третьем, но не во втором Са2+-связывающем центре. Получено независимое доказательство гипотезы о том, что второй Са2+-связывающий центр молекулы рековерина контролирует время нахождения белка на мембране, а следовательно и Са2+-зависимое ингибирование родопсинкиназы рековерином.

Показано, что нарушение регуляции рековерином фосфорилирования родопсина, катализируемого родопсинкиназой может лежать в основе молекулярных механизмов патогенеза таких заболеваний сетчатки, как пигментный ретинит и паранеопластическая ретинопатия.

Практическая значимость работы Установление клеточных мишеней и механизма функционирования рековерина в фоторецепторной клетке необходимы для понимания механизмов зрительной трансдукции и выяснения молекулярных основ зрения. Полученные результаты важны и в более широком плане, поскольку фоторецепторная клетка служит удобной моделью для понимания устройства других сигнальных систем с участием сопряженных с G-белками рецепторов, нарушение функционирования которых служит причиной разнообразных патологических состояний клетки.

Апробация работы. Результаты работы были доложены на семинарах НИИ физикохимической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ (НИИФХБ МГУ) и отдела сигнальных систем клетки НИИФХБ МГУ, а также на конференции ФЕБО по биологическим мембранам (Хельсинки, 1994), 1-ом Российско-Турецком симпозиуме по биотехнологии (Анкара, 1995), Международной конференции, посвященной 90-летию А.Н.Белозерского (Москва, 1995), на Международной конференции «Retinal proteins» (Япония, 1998), на II съезде биофизиков России (Москва, 1999), XIII и XIV зимних международных молодежных научных школах “Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии” (Москва, 2001 и 2002), на III съезде Всероссийского биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002), на 6-ой Международной конференции по молекулярной биологии памяти В.А. Энгельгардта (Санкт-Петербург – Москва, 2003), 8-м Европейском симпозиуме по Са2+-связывающим белкам в норме и при патологии (Великобритания, 2004), Публикации. По материалам диссертации опубликована 31 статья в рецензируемых журналах.

Структура и объём работы. Диссертация изложена на 239 страницах машинописного текста, содержит 81 рисунок и 8 таблиц. Диссертация состоит следующие разделы:

введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и их обсуждение, выводы и список цитируемой литературы. Библиографический указатель включает 317 цитированных работ.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Действие рековерина в реакции фосфорилирования световозбужденного родопсина, катализируемой родопсинкиназой Первоначально предполагалось, что функция рековерина в фоторецепторной клетке состоит в Са2+-зависимой активации гуанилатциклазы (Dizhoor et al., 1991; Lambrecht, Koch, 1991). Однако к моменту начала настоящей работы было установлено, что эта точка зрения ошибочна (Hurley et al., 1993; Gorodovikova and Philippov, 1993). Предварительные данные, полученные в нашей лаборатории, указывали на то, что возможной мишенью для рековерина в НСП является родопсинкиназа (Gorodovikova and Philippov, 1993); об этом же говорили результаты японских авторов (Kawamura, 1993), которые исследовали функцию гомолога рековерина, S-модулина, в фоторецепторах лягушки. Поэтому наша работа была начата с выяснения вопроса, влияет ли рековерин на фосфорилирование родопсина, катализируемое родопсинкиназой.

1.1. Изучение влияния рековерина на фосфорилирование фотовозбужденного родопсина в суспензии НСП Установлено, что уровень фосфорилирования светоактивированного родопсина (Rho*) в суспензии НСП зависит от концентрации свободных ионов кальция ([Са2+]f): он понижается при возрастании [Са2+]f от 0.1 до 100 мкМ (рис. 1), при этом полумаксимальный эффект приходился на [Са2+]f = 1.5 - 2 мкМ.

Влияние Са2+ на включения фосфата в Rho* в суспензии НСП практически полностью подавляется в результате преинкубации реакционной смеси в присутствии антител (АТ) против рековерина, при этом фракция иммуноглобулинов, полученных от неиммунизированного животного, влияния не оказывает (таблица 1).

Отсюда можно сделать вывод, что наблюдаемый эффект Са2+ на фосфорилирование Rho* в суспензии НСП (рис. 1) опосредован присутствующим в суспензии "эндогенным" 110,001 0,01 0,1 1 10 100 10[Са2+]f, мкM Рис.1. Зависимость относительной активности родопсинкиназы от [Ca2+]f в суспензии НСП.

Относительный уровень фосфорилирования,% Таблица 1. Влияние антител против рековерина на фосфорилирований родопсина в суспензии НСП.

№ Добавки Включение 32Р(срм) в присутствии Эффект кальция(а) [Ca2+]f:

1 нМ 5,6 мкМ % 1 ----- 2115±80 1080±110 1035 100(в) 2 Контрольная 2050±60 1170±60 880 сыворотка 3 АТ к рековерину 2170±40 1980±70 190 Перед проведением реакции аликвоты суспензии НСП инкубировали в реакционной смеси для определения родопсинкиназной активности в темноте в течение 10 мин при 00С в присутствии 0.05 мг АТ к рековерину или контрольной сыворотки (фракция иммуноглобулинов, полученная от неиммунизированных животных), затем еще 2 мин при 250С; реакцию начинали световой вспышкой (100% обесцвечивания родопсина) и добавлением АТФ.

а) Разница () между уровнями включения Р в родопсин в присутствии 1 нМ и 5.6 мкМ [Са2+]f обозначена как "эффект кальция";

б) за 100% принято значения кальциевого эффекта в отсутствии добавок.

рековерином. Заметим, что в отсутствие Са2+ добавленный извне рековерин не оказывал влияния на реакцию фосфорилирования, тогда как в присутствии Са2+ "экзогенный" рековерин значительно уменьшал уровень фосфорилирования Rho*: в среднем в присутствии 5 мкМ рековерина величина включения фосфата в Rho* снижалась в 2 раза (данные не приведены).

Таким образом, результаты экспериментов, приведенных на рис. 1 и в табл. 1, говорят о том, что Са2+ ингибирует фосфорилирование родопсина, катализируемое родопсинкиназой в суспензии НСП и этот эффект опосредован рековерином.

1.2. Изучение влияния рековерина на фосфорилирование родопсина в реконструированной системе Результаты, полученные в предыдущем разделе, свидетельствуют в пользу того, что рековерин способен Са2+-зависимым образом ингибировать фосфорилирование родопсина в суспензии НСП. Однако этот факт не исключал той возможности, что для проявления эффекта рековерина необходим дополнительный фактор (или факторы), присутствующий в суспензии. Для того, чтобы подтвердить или опровергнуть эту возможность, мы изучили способность рековерина ингибировать фосфорилирование родопсина в реконструированной системе, состоящей из фоторецепторных мембран, содержащих родопсин, и очищенных препаратов родопсинкиназы и рековерина.

Оказалось, что в реконструированной системе, как и в суспензии НСП, фосфорилирование Rho* чувствительно к [Са2+]f: уровень включения Р в Rho* уменьшался в 5 раз с увеличением [Са2+]f от 0.1 до 200 мкМ; полумаксимальный эффект проявлялся при [Са2+]f, равной 2 мкМ (рис. 2А).

Рис. 2Б демонстрирует зависимость фосфорилирования Rho* родопсинкиназой от количества присутствующего в реконструированной системе рековерина. Видно, что (1) в отсутствие рековерина уровень фосфорилирования Rho* не зависит от концентрации Са2+;

(2) в отсутствие Са2+ уровень фосфорилирования Rho* максимален и не зависит от концентрации рековерина; (3) в присутствии Са2+ степень ингибирования фосфорилирования Rho* возрастает по мере повышения концентрации рековерина с полумаксимальным эффектом при концентрации рековерина, равной 6 мкМ.

Поскольку в отсутствие рековерина уровень фосфорилирования родопсина был максимален, а с увеличением концентрации рековерина наблюдалось прогрессивное ингибирование реакции, можно сделать вывод, что (1) в реконструированной системе, как и в суспензии НСП, рековерин обладает способностью Са2+-зависимым образом 1А Б 110,001 0,01 0,1 1 10 100 100 10 20 30 40 [Ca2+]f, мкМ [Рековерин], мкМ Рис. 2. Зависимость относительной активности родопсинкиназы от (А) [Са2+]f в реконструированной системе, содержащей отмытые в мочевине мембраны НСП (10 мкМ родопсин) и родопсинкиназу (70 нМ), в присутствии (•) или в отсутствие () 20 мкМ рековерина; (Б) концентрации рековерина в реконструированной системе, содержащей отмытые в мочевине мембраны НСП (10 мкМ родопсин), родопсинкиназу (70 нМ), рековерин, а также < 1 нМ () или 5.6 мкМ (•) [Ca2+]f.

О тн о си тел ь н а я а к ти в н ость р о до п си н к и н а зы,% О тн оси тель ная ак ти вн ость родоп си н к ин азы, % ингибировать фосфорилирование Rho* и (2) что для проявления ингибирующего эффекта рековерина не требуется каких-либо дополнительных факторов.

Следует, однако, иметь в виду, что даже при использовании реконструированной системы взаимодействие рековерина и родопсинкиназы происходит в присутствии фоторецепторной мембраны, которая представляет собой липидный матрикс с включенными в него белками, представленными на 95% родопсином (Ovchinnikov, 1982).

Существуют основания полагать (Kuhn, 1980), что большинство, а возможно и все процессы, имеющие прямое отношение к фототрансдукции и ее регуляции, происходят непосредственно на мембране, образно говоря, в "двумерном пространстве", а не в цитоплазме. Поэтому в основе обнаруженной нами способности рековерина ингибировать родопсинкиназную активность может лежать как прямое взаимодействие рековерина с родопсинкиназой, так и более сложные механизмы, вовлекающие фоторецепторную мембрану; в свою очередь фоторецепторная мембрана может участвовать в этих механизмах либо только своим липидным матриксом, либо только родопсином, либо обоими этими компонентами. Приводимые ниже эксперименты указывают на то, что рековерин способен взаимодействовать одновременно как с родопсинкиназой, так и с фоторецепторными мембранами.

1.3. Влияние N-концевого миристоилирования рековерина на его эффективность как ингибитора родопсинкиназы Известно, что для связывания рековерина с фоторецепторными мембранами необходимо присутствие N-концевого миристоилирования, удаление которого сопровождается потерей способности рековерина взаимодействовать с мембраной Са2+зависимым образом (Dizhoor, 1993). Поэтому мы провели исследование влияния Nконцевого миристоилирования рековерина на его эффективность как ингибитора родопсинкиназы.

Нами была разработана схема экспрессии гена рековерина в клетках E.coli. В результате удалось получить рекомбинантные формы немиристоилированного и миристоилированного рековерина с чистотой более чем 99% и выходом более 5 мг/мл культуральной среды. Рекомбинантный миристоилированный рековерин по ряду своих функциональных характеристик был близок к природному белку; в частности, в реакции фосфорилирования Rho* были получены близкие величины К50 по отношению к Са2+ (мкМ в обоих случаях) и по концентрации рековерина (6 и 5.4 мкМ для природного и рекомбинантного препаратов, соответственно) (данные не представлены).

Как следует из рис. 3А, кривые зависимости относительной активности родопсинкиназы от [Са2+]f дают одну и ту же величину К50, равную 2 мкМ, для миристоилированного и немиристоилированного препаратов рековерина. В случае миристоилированного белка наблюдалась кооперативность по Са2+ (коэффициент Хилла равен 1.7), которая отсутствовала в случае немиристоилированного белка (n=0.9). Однако, как следует из рис. 3Б, миристоилированный рековерин обладает большей ингибирующей эффективностью по сравнению с немиристоилированным белком: величины К50 по рековерину составляли 5.4 и 19 мкМ, соответственно.

Таким образом, результаты экспериментов, представленных в настоящей главе, говорят о том, что N-концевое миристоилирование рековерина придает ему кооперативное поведение по отношению к ионам Са2+ и увеличивает его эффективность как ингибитора родопсинкиназы.

По литературным данным (Dizhoor, 1993), N-концевое миристоилирование рековерина необходимо для его Са2+-зависимого связывания с фоторецепторной 11Б 100 A 0,01 0,1 1 10 10,01 0,1 1 10 100 10[Рековерин], мкМ [Ca2+]f, мкМ Рис. 3. Зависимость относительной активности родопсинкиназы от (А) [Са2+]f в реконструированной системе, содержащей отмытые в мочевине мембраны НСП (10 мкМ родопсин) и родопсинкиназу (70 нМ), в присутствии (•) или в отсутствие () 10 мкМ рековерина; (Б) концентрации рековерина в реконструированной системе, содержащей отмытые в мочевине мембраны НСП (10 мкМ родопсин), родопсинкиназу (50 нМ), рековерин, а также < 1 нМ () или 5.6 мкМ (•) [Ca2+]f.

Относительная активность родрпсинкиназы, % О тносительная активность родопсинкиназы, % мембраной. В тоже время, как мы указывали выше, присутствие N-миристоильного остатка не есть необходимое условие для взаимодействия рековерина с родопсинкиназой.

Сопоставление этих двух фактов в свете обнаруженного нами усиления ингибирующей способности рековерина в результате его N-ацилирования позволяет предполагать, что фоторецепторная мембрана, с которой рековерин предпочтительно взаимодействует с помощью своего ацилированного N-конца, важна для функционирования системы, состоящей из родопсина (субстрата), родопсинкиназы (фермента, регулирующего активность фотовозбужденного родопсина и, соответственно, передачу сигнала в каскаде Rho*--->трансдуцин--->ФДЭ) и рековерина (кальциевого сенсора родопсинкиназы).

1.4. Влияние содержания холестерина фоторецепторных мембран на взаимодействие рековерина с мембранами и регуляцию фосфорилирования родопсина Мембрана фоторецепторных дисков, содержащихся в наружных сегментах палочки, имеет следующий фосфолипидный состав: фосфатидилэтаноламин (40%), фосфатидилсерин (14%), фосфатидилхолин (40%) и фосфатидилинозит (2,5%) (Fliesler and Anderson, 1983).

Кроме того, обнаружена пространственная гетерогенность содержания холестерина в мембранах дисков НСП. Так, на новообразованные диски у основания НСП (базальные диски) приходится подавляющая часть массы холестерина, что составляет приблизительно 30% от общего количества липидов, в то время как на диски у окончания НСП (апикальные диски) – всего лишь 5% (Boesze-Battaglia et al., 1990). Изменение содержания холестерина в составе фоторецепторных мембран оказывает существенное влияние на кинетику передачи светового сигнала в фосфодиэстеразном каскаде: увеличение содержания холестерина ингибирует активность cGMP-фосфодиэстеразы и препятствует образованию фотовозбужденного родопсина (Boesze-Battaglia et al., 1990). Эти данные указывают на пространственную неоднородность процессов передачи сигнала в НСП. Так, автором работы (Schnapf, 1983) обнаружено, что ответ на единичный фотон, регистрируемый на конце НСП, имеет меньшую амплитуду, нежели ответ, регистрируемый у его основания.





Можно предположить, что эти различия кинетики фотоответа обусловлены составом фоторецепторной мембраны и, в частности, различным содержанием холестерина. Однако какие-либо экспериментальные данные о возможном влиянии содержания холестерина на процесс выключения зрительного каскада, а именно фосфорилирование светоактивированного родопсина родопсинкиназой и Са2+-зависимую регуляцию этого процесса рековерином, к моменту начала данной работы в литературе отсутствовали.

Для изучения влияния холестерина на регуляцию фосфорилирования Rho* были получены фоторецепторные мембраны с различным содержанием холестерина: от 4,1 до 29,6%, при том, что нативные мембраны НСП содержат в среднем 14% холестерина.

Установлено, что с увеличением содержания холестерина от 4,1% до 29,6% количество миристоилированного рековерина, связанного с мембранами НСП, повышалось в 3-4 раза (рис. 4).

Мы также исследовали зависимость ингибирования активности родопсинкиназы от концентрации миристоилированного рековерина при различных концентрациях холестерина в мембранах НСП в условиях постоянной концентрации Са2+.

Полумаксимальная величина ингибирования (IC50) родопсинкиназы составляла 6,6 мкМ рековерина в присутствии необработанных мембранах НСП (14% холестерина). Положение IC50 сдвигалась в сторону более высоких значений при понижении содержания холестерина в мембранах НСП (рис. 5А).

На рис.5Б. представлен график зависимости активности родопсинкиназы от концентрации Са2+ при различном содержании холестерина в мембранах, из которого следует, что при увеличении концентрации холестерина от 4,1% до 29,6% величина ICсдвигается в область более низких значений Ca2+, а именно уменьшается от 4,31 мкМ до 0,82 мкМ.

29,6% холестерина 14% холестерина 4,1% холестерина 0 20 40 60 80 1[Родопсин], мкM Рис. 4. Связывание миристоилированного рековерина с фоторецепторными мембранами, содержащими различное количество холестерина.

Связанный с мембранами рековерин, % Наши результаты предполагают, что высокая концентрация холестерина способствует связыванию рековерина с мембранами. В одной из последних работ (Strissel, 2005) обнаружены факты, указывающие на наличие градиента рековерина в НСП, причем большая его часть находится в базальной части этой структуры. Таким образом, градиент рековерина соответствует градиенту холестерина в НСП, что подтверждает наши результаты о влиянии холестерина на способность рековерина взаимодействовать с мембранами. Кроме того, повышение концентрации холестерина усиливает ингибирующую способность рековерина в отношении родопсинкиназы. Это происходит в результате сдвига полумаксимального эффекта ингибирования родопсинкиназы в сторону низких концентраций свободного Са2+ и рековерина.

В настоящее время в литературе широко обсуждается явление светозависимой транслокации сигнальных белков в мембранах дисков НСП (Sokolov et al., 2002).

Возможность транслокации связывают с существованием особых мембранных доменов, нерастворимых в детергенте, или, так называемых, рафт-структур. Рафт-структуры, обнаруженные в НСП, характеризуются высоким содержанием холестерина, сфинголипидов и фосфолипидов с длинными ненасыщенными жирнокислотными остатками (Martin et al., 2005). Светозависимая транслокация в рафт-структуры была продемонстрирована для трансдуцина (Seno et al., 2001), cGMP-фосфодиэстеразы (Liu et al., Б 11А 129,6% холестерина 14% холестерина 4,1% холестерина 4,1% холестерина 14% холестерина 29,6% холестерина 0 0,1 1 10 0,01 0,1 1 10 100 10[рековерин], мкM [Са2+]f, мкM Рис. 5. Зависимость относительной активности родопсинкиназы от концентрации миристоилированного рековерина (А) и от концентрации Са2+ (Б) при различном содержании холестерина в мембранах.

Относительная активность родопсинкиназы, % Относительная активность родопсинкиназы, % 2003) и сплайс-варианта аррестина р44 (Nair et al., 2002). Наши данные указывают на возможность нахождения рековерина и родопсинкиназы в составе рафт-структур.

В соответствии с хорошо описанным градиентом холестерина в НСП (для базальных дисков до 30%, для апикальных – до 5%) регуляция родопсинкиназной активности посредством рековерина также является гетерогенным процессом, а именно, в базальной части НСП эффективность ингибирующего действия рековерина выше. Полученные нами результаты in vitro объясняют опубликованные ранее (Schnapf, 1983) наблюдения in vivo о том, что выключение передачи светового сигнала в базальной части НСП является более длительным процессом по сравнению с таковым в их апикальной части.

2. Сравнение влияния рековерина на фосфорилирование "темнового" и фотовозбужденного родопсина Исследование фосфорилирования родопсина при низких (<0.01%) уровнях обесцвечивания родопсина в максимально нативных НСП лягушки выявило, что стехиометрия включения фосфата на одну молекулу Rho* может достигать 1000 - 1500, что во много раз превосходит количество остатков серина и треонина в молекуле родопсина (Binder et al., 1990). Этот феномен, получивший название "фосфорилирование с высоким выходом", объясняется именно тем, что наряду с фосфорилированием фотовозбужденного родопсина, происходит также фосфорилирование "темнового" родопсина.

Мы показали, что в присутствии Са2+ рековерин ингибирует фосфорилирование Rho*. В настоящем разделе мы исследовали влияние рековерина на фосфорилирование "темнового" родопсина и сравнили эффективность рековерина как Са2+-зависимого ингибитора родопсинкиназы в реакциях фосфорилирования "темнового" и фотовозбужденного родопсина.

2.1. Определение соотношения фосфородопсин/фосфоопсин при различных уровнях обесцвечивания родопсина Рис. 6 демонстрирует, что в реконструированной системе, содержащей отмытые мочевиной мембраны НСП и родопсинкиназу, общее включение 32Р в родопсин падает при уменьшении количества обесцвеченного родопсина, при этом относительное включение фосфата (Pi/Rho*) минимально и равно 2 при 100%-ном обесцвечивании; максимальная стехиометрия (Pi/Rho*=90) наблюдается при 0.005%-ном обесцвечивании родопсина. Мы провели также прямое определение соотношения количества фосфорилированного Rho* 110,001 0,01 0,1 1 10 1Уровень обесцвечивания родопсина, % Рис. 6. Зависимость относительного включения Р в родопсин от уровня обесцвечивания родопсина в реконструированной системе, содержащей отмытые мочевиной мембраны НСП (мкМ родопсин) и родопсинкиназу (100 нМ).

(фосфоопсина) и "темнового" родопсина (фосфородопсина) в реконструированной системе при различных уровнях обесцвечивания родопсина, используя способность фосфоопсина более прочно взаимодействовать с гидроксиапатитом по сравнению с фосфоопсином, и показали, что соотношение фосфородопсин : фосфоопсин возрастает более чем в 10 раз при понижении уровня обесцвечивания пигмента от 15 до 1% (данные не представлены).

Таким образом, понижение уровня обесцвечивания родопсина в реакционной смеси приводит к предпочтительному фосфорилированию "темнового" родопсина по сравнению с фотовозбужденным пигментом.

2.2. Сравнение ингибирующей эффективности рековерина в реакции фосфорилирования "темнового" и фотовозбужденного родопсина в реконструированной системе Рис. 7 демонстрирует, что в реакции фосфорилирования родопсина величина Кингибирующего эффекта рековерина уменьшается с понижением уровня обесцвечивания Стехиометирия включение Р в родопсин, моль / моль родопсина, причем максимальное значение К50 принимает при 100%-ном обесцвечивании и соответствует 5 мкМ концентрации рековерина; минимальное значение К50 имеет место при 0.03%-ном обесцвечивании пигмента и составляет 0.8-1.0 мкМ. Т.е. в условиях низкого обесцвечивания родопсина, когда фосфорилирование "темнового" родопсина преобладает над фосфорилированием Rho*, эффективность рековерина как ингибитора активности родопсинкиназы возрастает в 5-6 раз.

Прямое определение количеств фосфоопсина и фосфородопсина (рис. 8), образовавшихся в процессе реакции в отсутствие или в присутствии рековерина, показало, что рековерин ингибирует фосфорилирование Rho* на 45%, тогда как уровень фосфорилирования "темнового" родопсина падает на 90%; т.е. и здесь рековерин более эффективно ингибирует родопсинкиназу в реакции фосфорилирования "темнового" родопсина по сравнению с фосфорилированием Rho*.

Итак, в реконструированной системе рековерин более эффективно ингибирует фосфорилирование "темнового", чем фотовозбужденного родопсина. Далее аналогичное сравнение было проведено с использованием суспензии НСП.

Мы нашли, что максимальное "фосфорилирование с высоким выходом", равное 35 Pi/Rho*, наблюдается при 0.2% обесцвечивании родопсина, тогда как минимальный уровень фосфорилирования, равный 1.4 Pi/Rho*, обнаруживается при полном обесцвечивании пигмента (данные не приведены). Поскольку максимальное количество участков, которые могут быть модифицированы родопсинкиназой в Rho* равно 9, то, очевидно, что при 0.2% обесцвечивании по крайней мере 26 фосфатных остатков включается в "темновой" родопсин. Следовательно, в суспензии НСП, как и в реконструированной системе, при низком уровне освещения происходит фосфорилирование не только Rho*, но и "темнового" родопсина.

В присутствии Са2+ величина К50 ингибирующего эффекта рековерина на активность родопсинкиназы понижается от 7 мкМ (в случае полного обесцвечивания родопсина) до 2.5 мкМ (при 0.2%-ном обесцвечивании); как и в реконструированной системе, эффект рековерина более ярко выражен при низком, чем при высоком обесцвечивании родопсина(данные не приведены).

Таким образом, можно заключить, что в суспензии НСП, как и в реконструированной системе, рековерин с большей эффективностью ингибирует фосфорилирование «темнового» родопсина, чем фосфорилирование Rho*. На этом 0,01 0,1 1 10 1Уровень обесцвечивания родопсина, % Рис. 7. Зависимость К50 для эффекта рековерина в реакции фосфорилирования родопсина при различных уровнях обесцвечивания пигмента в реконструированной системе.

1 2 3 Фосфоопсин Фосфородопсин Рис. 8. Влияние рековерина на образование фосфородопмина и фосфоопсина в реакции фосфорилирования родопсина в условиях 3%-ного обесцвечивания пигмента в реконструированной системе. Столбцы 1 и 3 – образование фосфоопсина и фосфородопсина, соответственно, в отсутствие рековерина; столбцы 2 и 4 - образование фосфоопсина и фосфородопсина, соответственно, в присутствии 4,4 мкМ рековерина.

К для рековерина, мкМ Включение Pi, нмоль основании мы высказали гипотезу о том, что указанный феномен может использоваться в условиях in vivo для предотвращения нежелательного фосфорилирования необесцвеченного родопсина родопсинкиназой, находящейся в активированном состоянии в комплексе с фотовозбужденным родопсином.

3. Изучение механизма Са2+-миристоильного переключателя на примере рековерина Молекула рековерина содержит 4 потенциальных Са2+-связывающих центра типа EF-hand, из которых только два, а именно второй и третий (EF2 и EF3), способны связывать ионы кальция. N-конец рековерина ацилирован (преимущественно миристоилирован) в результате посттрансляционной модификации. Связывания ионов кальция с рековерином приводит к экспонированию его N-концевого миристоильного остатка из так называемого гидрофобного “кармана” белка в раствор, в результате чего рековерин становится способным взаимодействовать с фоторецепторными мембранами (Zozulya and Stryer, 1991). Этот механизм получил название Са2+-миристоильного переключателя (calcium-myristoyl switch).

Нами были получены две мутантные формы рековерина, у которых не функционировал один из работающих в рековерине Са2+-связывающих центров. Это – мутант RcE85Q (EF-2), у которого не функционирует EF2 вследствие замены остатка глутаминовой кислоты в 85-м положении на остаток глутамина, и мутант RcE121Q (EF-3), у которого не функционирует EF3 из-за аналогичной замены в 121-м положении. Мы использовали эти мутанты для исследования механизма Са2+-миристоильного переключателя рековерина.

3.1. Исследование механизма связывания ионов кальция с рековерином Для характеристики Са2+-связывающих свойств рековерина и его мутантов RcE85Q и RcE121Q мы использовали радиоактивный изотоп кальция – 45Са2+; свободную концентрацию ионов кальция ([Са2+]f) варьировали в диапазоне от 20 нМ до 500 мкМ. Измерения были выполнены как для миристоилированных, так и немиристоилированных форм рековерина и его мутантов.

Как видно из рис. 9А и таблицы 2, немиристоилированная форма рековерина связывает 2 иона кальция, и что характерно – некооперативно. Величины KD для двух его Са2+- связывающих центров при этом составляют 0,21 мкМ и 6,2 мкМ. Поскольку не было известно, какому именно Са2+-связывающему центру – EF2 или EF3 – соответствует высокоаффинная константа, а какому – низкоаффинная, мы попытались ответить на этот вопрос, используя немиристоилированные мутанты рековерина по второму (мутант EF-2) и третьему (мутант EF-3) Са2+- связывающим центрам.

Мы установили, что немиристоилированный мутант EF-2, у которого не функционирует Са2+-связывающиий центр EF2, связывает только 1 ион кальция с KD, равной 0,26 мкМ (рис. 9Б и таблица 2). Поскольку этот мутант содержит модифицированный EF2 и нативный EF3, очевидно, это связывание происходит именно за счёт EF3 и, следовательно, Са2+-связывающиий центр EF3 в этом мутанте связывает ионы кальция с KD = 0,26 мкМ. Эта константа практически совпадает со значением KD = 0,мкМ, которое мы получили для высокоаффинного центра в немиристоилированном рековерине. Следовательно, можно сделать вывод, что высокоаффинным центром связывания Са2+ в немиристоилированном рековерине является EF3.

Немиристоилированный мутант рековерина EF-3, у которого модифицирован Са2+связывающий центр EF3, способен связывать один ион Са2+ на молекулу рековерина с KD = 8,2 мкМ (рис. 9В и таблица 2). Поскольку KD = 8,2 мкМ практически совпадает с KD = 6,2 мкМ, определенной нами для низкоаффинного центра в немиристоилированном рековерине, можно заключить, что EF2 в немиристоилированном рековерине представляет собой низкоаффинный центр связывания ионов кальция.

Таким образом, наши результаты, полученные при исследовании связывания ионов кальция с немиристоилированными формами рековерина, позволяют сделать вывод о том, что в немиристоилированном рековерине Са2+-связывающий центр EF3 является высокоаффинным (KD = 0,21 мкМ), а EF2 – низкоаффинным (KD = 6,2 мкМ).

Таким образом, наши результаты, полученные при исследовании связывания ионов кальция с немиристоилированными формами рековерина, позволяют сделать вывод о том, что в немиристоилированном рековерине Са2+-связывающий центр EF3 является высокоаффинным (KD = 0,21 мкМ), а EF2 – низкоаффинным (KD = 6,2 мкМ).

Результаты исследования Са2+-связывающих свойств миристоилированных форм рековерина представлены на рис. 9 и в таблице 2. Видно, что миристоилированный рековерин так же, как и его немиристоилированная форма, связывает 2 иона кальция.

Однако в случае миристоилированного рековерина связывание Са2+ происходит кооперативно с коэффициентом Хилла 1,9 и KD, равной 17,6 мкМ. Следовательно, миристоилирование понижает аффинность рековерина к ионам кальция и придаёт процессу связывания катиона кооперативный характер.

2,2,1,1,1,1,nRc nEF-mRc 0,mEF-0,0,0,0,001 0,01 0,1 1 10 100 1000 0,001 0,01 0,1 1 10 100 10[Ca2+]f, мкМ [Ca2+]f, мкМ 2,1,1,0,nEF-mEF-0,0,001 0,01 0,1 1 10 100 10 [Ca2+]f, мкM Рис. 9. Связывание 45Са2+ с миристоилированными формами рековерина и мутантов EF-2 ( RcE85Q) и EF-3 (RcE121Q). ( – немиристоилированная форма, – миристоилированная форма).

Таблица 2. Стехиометрия связывания и константы диссоциации Са2+ для рековерина и его мутантных форм.

№ Форма рековерина Стехиометрия KD1, мкМ KD2, мкМ Коэффициент связывания Са2+, моль Хилла на моль белка 1 nRc* 2 nEF-2 3 nEF-3 4 mRc 5 mEF-2 6 mEF-3 - *Сокращения: nRc – немиристоилированный рековерин дикого типа; nEF-2 - немиристоилированная форма рековерина RcE85Q; nEF-3 - немиристоилированная форма рековерина RcE121Q; mRc – миристоилированный рековерин дикого типа; mEF-2 - миристоилированная форма рековерина RcE85Q; mEF-3 - миристоилированная форма рековерина RcE121Q.

2+ 2+ Связанный Ca, моль / моль белка Связанный Ca, моль / моль белка 2+ Связанный Ca, моль / моль белка Из рис. 9Б и таблицы 2 также следует, что миристоилированный мутант EF-2, в котором присутствует единственный нативный Са2+-связывающий центр EF3, координирует 1 ион кальция с KD = 34,6 мкМ. Однако миристоилированный мутант EF-3, в котором нативен Са2+-связывающий центр EF2, лишён способности координировать ионы кальция (рис. 9В). Следовательно, модификация EF3 в миристоилированном рековерине блокирует связывание Са2+ с нативным EF2. В то же время нарушение Са2+-связывающих свойств EF2 в миристоилированном белке не препятствует связыванию Са2+ с нативным EF3. Эти результаты позволяют сделать вывод о том, что связывание катиона с миристоилированным рековерином происходит последовательно: сначала ионы кальция заполняют Са2+-связывающий центр EF3 и только затем – EF2; при этом заполнение центра EF3 ионами кальция является необходимым условием для последующего связывания катиона в центре EF2.

Сравнение Са2+-связывающих свойств немиристоилированных и миристоилированных мутантов EF-2 и EF-3 позволяет сделать еще один важный вывод о роли N-концевого миристоилирования рековерина. Мы показали, что миристоилированный рековерин не способен связывать ионы кальция за счет Са2+-связывающего центра EF2, когда EF3 в нем не функционален (миристоилированный мутант EF-3), т.е. в миристоилированном рековерине работает механизм последовательного заполнения его Са2+-связывающих центров катионом. Однако в немиристоилированном рековерине Са2+связывающий центр EF2 способен координировать ионы кальция, несмотря на то, что EF3 в нем мутирован, и его Са2+-связывающая способность нарушена (немиристоилированный мутант EF-3). Таким образом, необходимым условием для функционирования механизма последовательного заполнения Са2+-связывающих центров рековерина ионами кальция является присутствие в его молекуле миристоильного остатка.

3.2.Изучение роли Са2+-связывающих центров рековерина в функционировании его Са2+-миристоильного переключателя.

К моменту начала настоящей работы оставалось неизвестным, какую роль играет каждый из двух Са2+-связывающих центров рековерина в раскрытии гидрофобного “кармана”, за счет которого рековерин взаимодействует со своей внутриклеточной мишенью родопсинкиназой, и в экспонировании миристоильного остатка, с помощью которого рековерин связывается с фоторецепторной мембраной. В этой связи следующим этапом настоящей работы было исследование роли Са2+-связывающих центров EF2 и EF3 в указанных процессах.

3.2.1. Кальцийзависимое экспонирование гидрофобного “кармана” рековерина Показателем экспонирования гидрофобного “кармана” рековерина может служить его способность взаимодействовать с гидрофобным носителем фенилсефарозой (Polans et al., 1991). Мы использовали это свойство рековерина для выяснения роли его Са2+связывающих центров EF2 и EF3 в экспонировании гидрофобного “кармана” белка.

Исследуемые формы рековерина инкубировали в присутствии фенилсефарозы в диапазоне [Са2+]f от 10 нМ до 100 µМ и степень связывания рековерина с носителем определяли по количеству белка, оставшегося в растворе после осаждения фенилсефарозы. С помощью этого метода было исследовано связывание с фенилсефарозой миристоилированных и немиристоилированных форм рековерина как дикого типа, так и мутантов EF-2 и EF-3.

Из рис. 10А видно, что миристоилированный рековерин Са2+-зависимым образом взаимодействует с фенилсефарозой; величина K50, характеризующая это взаимодействие, составляет 1,22 мкМ. Миристоилированные мутанты EF-2 и EF-3, у которых, соответственно, не функционируют Са2+-связывающие центры EF2 и EF3, способностью Са2+-зависимым образом взаимодействовать с фенилсефарозой не обладают. Этот результат был ожидаем для мутанта EF-3, который, как было показано нами выше, вообще не способен связывать ионы кальция. Миристоилированный мутант EF-2 хотя и связывает Са2+ за счет нативного EF3, но с фенилсефарозой не взаимодействует. Следовательно, заполнение ионами кальция Са2+-связывающего центра EF3 не приводит к экспонированию гидрофобного “кармана”, и можно предположить, что оно зависит от связывания катиона с Са2+-связывающим центром EF2. Описанные ниже эксперименты, которые были выполнены нами на немиристоилированных мутантах EF-2 и EF-3, подтвердили это предположение.

Из рис. 10Б видно, что немиристоилированный рековерин способен, подобно миристоилированной форме белка, Са2+-зависимым образом взаимодействовать с фенилсефарозой. Немиристоилированный мутант EF-3 взаимодействует с фенилсефарозой аналогично рековерину, при этом взаимодействие этого мутанта с носителем происходит в том же диапазоне [Са2+]f, при котором происходит заполнение катионом нативного Са2+связывающего центра EF2. В отличие от мутанта EF-3, немиристоилированный EF-2, несмотря на то, что он связывает ионы кальция за счет нативного EF3, с фенилсефарозой не взаимодействует. Таким образом, заполнение ионами кальция центра EF2, а не EF3, определяет способность рековерина взаимодействовать с фенилсефарозой, и, следовательно, координация ионов кальция именно в Са2+-связывающем центре EFнеобходима для экспонирования гидрофобного “кармана” рековерина.

3.2.2. Кальцийзависимое ингибирование родопсинкиназы рековерином Как видно из рис. 11А, миристоилированный рековерин ингибирует активность родопсинкиназы Ca2+-зависимым образом с полумаксимальным эффектом, равным 2,3 µМ.

Миристоилированный мутант EF-3 не влияет на активность родопсинкиназы, что может быть объяснено неспособностью этого мутанта связывать ионы кальция.

Миристоилированный мутант EF-2 также не действует на активность родопсинкиназы, хотя он и связывает один катион за счёт нативного EF3. Следовательно, способность рековерина ингибировать родопсинкиназу не зависит от заполнения EF3 ионами кальция. Отсюда можно предположить, что способность рековерина ингибировать родопсинкиназу зависит от связывания катиона с EF2. Для проверки этого предположения мы использовали немиристоилированные формы рековерина, которые, подобно его миристоилированным формам, ингибируют родопсинкиназу Са2+-зависимым образом [Calvert et al., 1995].

Из рис. 11Б следует, что немиристоилированный рековерин, аналогично миристоилированному рековерину, ингибирует родопсинкиназу Са2+-зависимым образом.

Такое же действие на фермент оказывает и немиристоилированный мутант EF-3, причём ингибирование наблюдается в том же диапазоне Са2+, в котором этот мутант связывает ионы кальция за счет EF2. В отличие от немиристоилированного мутанта EF-3, немиристоилированный EF-2, хотя и координирует Са2+ в EF3, на активность родопсинкиназы не действует. Следовательно, способность рековерина ингибировать родопсинкиназу зависит от связывания ионов кальция с центром EF2, но никак не коррелирует с заполнением катионом центра EF3.

3.2.3. Кальцийзависимое экспонирование миристоильного остатка рековерина Ещё одной важной составляющей механизма Са2+-миристоильного переключателя рековерина является его способность взаимодействовать с мембранами в результате Са2+- зависимого экспонирования ковалентно связанного с белком миристоильного остатка. На следующем этапе работы мы провели изучение способности миристоилированных форм рековерина и мутантов EF-2 и EF-3 связываться с фоторецепторными мембранами как характеристики экспонирования миристоильного остатка. Исследование немиристоилированных форм не 11А Б 0,001 0,01 0,1 1 10 10,001 0,01 0,1 1 10 1[Ca2+]f, мкМ [Ca2+]f, мкМ Рис. 10. Са2+-зависимое связывание миристоилированных (А) и немиристоилированных (Б) форм wt-рековерина и мутантов EF-2 и EF-3 с фенилсефарозой. За 100% принято общее количество рековерина в пробе. ( – wt-рековерин, – мутант EF-2, – мутант EF-3).

11А Б 0,001 0,01 0,1 1 10 11 10 1[Ca2+]f, мкМ [Ca2+]f, мкМ Рис.11. Са2+-зависимое ингибирование активности родопсинкиназы миристоилированными (А) и немиристоилированными (Б) формами рековерина и мутантов EF-2 и EF-3. За 100% принята активность родопсинкиназы в отсутствие рековерина. ( – wt-рековерин, – мутант EF-2, – мутант EF-3).

О т н о с и т е л ь н а я а к т и в н о ст ь р о д о п си н к и н а зы, % О тн оси тел ь н а я ак т и в н ость р од оп си н к и н а зы, % К оличество связанного рековерина, % К ол и ч ест в о св я зан н ого р ек ов ер и н а, % проводилось, т.к. они с фоторецепторными мембранами не взаимодействуют (Zozulya and Stryer, 1991).

Как видно из рис. 12, миристоилированные рековерин и мутант EF-2 связываются с фоторецепторными мембранами Са2+-зависимым образом. Тогда как количество мутанта EF-3, присутствующего на мембранах, было низким и от концентрации кальция не зависело.

Очевидно, причиной того, что мутант EF-3 не взаимодействует с фоторецепторными мембранами Са2+-зависимым образом служит его неспособность связывать ионы кальция.

Взаимодействие с мембранами миристоилированного мутанта EF-2 происходит в два этапа. В микромолярном диапазоне концентраций кальция, в котором у мутанта EF-заполняется катионом нативный центр EF3, наблюдается частичное связывание этого мутанта с мембранами. Следовательно, в этих условиях миристоильный остаток рековерина экспонируется лишь частично. При дальнейшем повышении концентрации кальция связывание мутанта EF-2 с фоторецепторными мембранами достигает максимума, аналогичного тому, что имеет место для рековерина. Видимо, в милимолярном диапазоне 0,1 1,0 10,0 100,0 1000,0 10000,0 100000,[Ca2+]f, мкМ Рис. 12. Са2+-зависимое связывание миристоилированных форм рековерина и мутантов RcE85Q и RcE121Q с фоторецепторными мембранами. Исследуемые формы рековерина инкубировали в присутствии отмытых мочевиной фоторецепторных мембран при различных значениях [Са2+]f. За 100% принято общее количество рековерина в пробе. ( – wt-рековерин, – мутант EF-2, – мутант EF-3).

Связанный с мембраной рековерин, % концентраций ионов кальция происходит связывание ионов кальция с мутированным центром EF2, что и приводит к полному экспонированию миристоильного остатка.

Таким образом, наиболее значительные структурные перестройки молекулы рековерина, связанные с функционированием его Са2+-миристоильного переключателя, происходят после заполнения ионами кальция Са2+-связывающего центра EF2.

3.3. Исследование взаимодействия рековерина дикого типа и его мутантов по кальцийсвязывающим центрам с иммобилизованным липидным бислоем методом спектроскопии поверхностного плазмонового резонанса (SPR-spectroscopy).

Для исследования Са2+-миристоильного переключателя рековерина методом спектроскопии поверхностного плазмонового резонанса мы разработали систему рековерин - искусственная фосфолипидная мембрана, которая моделирует связывание рековерина с фоторецепторной мембраной. Компоненты модельной системы находились в двух различных фазах. Искусственный липидный бислой, идентичный по составу липидам фоторецепторных мембран, образовывал однородную поверхность на чипе и находился в неподвижной фазе в течение хода эксперимента. Рековерин присутствовал в составе растворимой фазы, подвижной относительно иммобилизованного на чипе липидного бислоя.

Сенсограммы, соответствующие связыванию миристоилированной формы wtрековерина с чипом, показывают, что эта форма способна взаимодействовать с липидным бислоем как в присутствии, так и в отсутствие ионов кальция (данные не представлены).

Однако амплитуда связывания (определяется как величина сигнала связывания в течение равновесной фазы) значительно меньше в отсутствие Са2+, чем в его присутствии. Иная картина наблюдается при связывании с липидным бислоем немиристоилированной формы рековерина. В этом случае амплитуды связывания в присутствии и отсутствие ионов кальция почти одинаковы и равны амплитуде для миристоилированного рековерина в отсутствие Са2+. Следовательно, с липидным бислоем, иммобилизованным на чипе, Са2+зависимым образом связывается только миристоилированный рековерин. В то же время немиристоилированный рековерин с иммобилизованным липидным бислоем практически не взаимодействует, и эффект Са2+ в этом случае выражен слабо.

На рис. 13 приведены сенсограммы, отражающие взаимодействие миристоилированных форм рековерина и мутанта EF-2 с липидным бислоем, иммобилизованным на чипе. (Исследование связывания мутанта EF-3 с иммобилизованным липидным бислоем не проводили, поскольку его взаимодействие с липидным бислоем очень слабое и от присутствия ионов кальция не зависит). Измерения проводили при двух значениях [Ca2+]f: 1 и 400 мкМ. Из рис. 13 видно, что при концентрации ионов кальция, равной 400 мкМ, миристоилированный мутант EF-2 диссоциирует из комплекса с липидами заметно быстрее, чем рековерин. Это означает, что модификация Са2+-связывающего центра EF2 в молекуле рековерина уменьшает время его нахождения на поверхности липидного бислоя.

При концентрации ионов кальция, равной 1 мкМ, этот эффект не выявляется: обе миристоилированные формы диссоциируют из комплекса с липидами примерно с равными скоростями. На основании сенсограмм (см. рис.13) были рассчитаны константы скорости диссоциации (kd), характеризующие процесс диссоциации миристоилированных форм рековерина и мутанта EF-2 из комплекса с липидным бислоем. В присутствии [Ca2+]f, 6400 µM Ca2+ 5432рековерин 1EF-21 µM Ca2+ рековерин EF-0 200 400 600 8Время, сек Рис.13. SPR-сенсограммы, отражающие взаимодействие миристоилированных форм рековерина и мутанта EF-2 с иммобилизованным липидным бислоем. Измерения выполнены при двух значениях [Са2+]f: 1 и 400 µМ. Полоса над сенсограммами обозначает период времени, в течение которого в подвижной фазе отсутстствует (не закрашено) и присутствует (закрашено черным) рековерин.

Величина сигнала, RU равной 1 мкМ, величина kd для миристоилированного рековерина оценивается как kd 0,c-1, а при 400 мкМ [Ca2+]f – kd 0,01 с-1. Хотя определение констант скоростей диссоциации миристоилированных форм рековерина из комплекса с липидами носит оценочный характер, различие указанных величин kd составляет как минимум один порядок.

Следовательно, можно заключить, что время нахождения миристоилированного рековерина на поверхности липидного бислоя зависит от концентрации ионов кальция. В случае миристоилированного мутанта EF-2 различия в скоростях его диссоциации из комплекса с липидами в зависимости от Ca2+ выявлены не были и соответствующие kd оценены как 0,c-1.

В совокупности результаты, представленные на рис. 19, позволяют сделать вывод о том, что время нахождения рековерина на поверхности липидного бислоя зависит от заполнения ионами кальция Са2+-связывающего центра EF2.

Можно предположить, что в физиологических условиях замедление диссоциации рековерина с поверхности мембран при высоких концентрациях кальция, т.е. тогда, когда рековерин должен ингибировать родопсинкиназу, может увеличивать эффективность этого ингибирования, поскольку родопсинкиназа в условиях in vivo преимущественно (или даже полностью) ассоциирована с поверхностью фоторецепторных мембран.

4. Структурные предпосылки механизма Са2+-миристоильного переключателя.

Сравнение пространственных структур миристоилированных апоформы (Ames et al., 1995) и Са2+-содержащей формы (Ames et al., 1997) рековерина методом ядерного магнитного резонанса позволило выявить основные структурные перестройки в молекуле белка, сопутствующие процессу экспонирования гидрофобного “кармана” и миристоильного остатка при заполнении ионами кальция Ca2+-связывающих центров рековерина. В свободном от кальция состоянии миристоильный остаток рековерина погружен в глубокий гидрофобный “карман” в N-концевом домене белка. Связывание двух ионов кальция вызывает относительный поворот на 45о N- и С-концевого доменов рековерина вокруг Gly96 и последующий поворот вокруг Gly42 (расположенному в Са2+связывающей петле центра EF1), что в конечном счете приводит к экспонированию гидрофобного “кармана” и высвобождению миристоильного остатка. Экспонирование гидрофобного “кармана” рековерина делает доступным растворителю значительное количество его гидрофобных остатков, которые становятся способными взаимодействовать с родопсинкиназой – внутриклеточной мишенью рековерина. Важно, что структурные перестройки молекулы рековерина, сопровождающие экспонирование гидрофобного “кармана” и миристоильного остатка, затрагивают N-концевой домен рековерина в гораздо большей степени, чем С-концевой, т. е. основные структурные изменения происходят в окружении центра EF2, который локализован в N-концевом домене рековерина.

Каковы структурные предпосылки последовательного механизма связывания ионов кальция с миристоилированным? Для ответа на поставленный вопрос нами методом рентгеноструктурного анализа была охарактеризована мутантная форма рековерина EF-2, с которой связан один ион кальция за счёт нативного EF3, тогда как EF2 катионом не заполнялся (рис. 14Б).

Оказалось, что при этом образуется стабильный интермедиат, который по своей структуре отличался как от миристоилированной апоформы рековерина (рис. 14А), так и от миристоилированного wt-рековерина, содержащего два иона кальция (рис. 14В). Структура интермидиата (рис. 14Б) представляет собой переходное состояние от апоформы рековерина к его форме, полностью насыщенной ионами кальция. При этом структура Nконцевого домена интермедиата, содержащего центры EF1 и EF2, больше напоминает бескальциевую структуру рековерина, тогда как cтруктура C-концевого домена (содержит EF3 и EF4) сходна с таковой у белка, содержащего 2 иона кальция. Этот факт объясняется, видимо, тем, что в интермедиате катион связан именно в C-концевом домене (за счёт центра EF3). Кроме того, было показано, что заполнение центра EF3 катионом, кроме изменений в структуре C-концевого домена рековерина, приводит к повороту на 45° N- и Сконцевых доменов белка друг относительно друга вокруг остатка Gly96. Хотя при этом поворота вокруг Gly42, ответственного за экспонирование гидрофобного “кармана” и миристоильного остатка, не происходит, все же наблюдается частичное экспонирование миристоильного остатка (см. рис. 14Б). Упомянутый поворот вокруг Gly42, очевидно, происходит после заполнения катионом центра EF2.

Суммируя результаты наших экспериментов, работу Ca2+-миристоильного переключателя рековерина можно представить следующим образом. Связывание ионов кальция с рековерином происходит сначала за счёт Са2+-связывающего центра EF3, при этом конформация белка изменяется таким образом, что Са2+-связывающий центр EFтакже становится доступным для связывания катиона. Рековерин с заполненным Са2+ центром EF3, но свободным от катиона центром EF2, образует стабильное переходное состояние с частично экспонированным миристоильным остатком; при этом гидрофобный “карман” интермедиата остаётся неэкспонированным, что и определяет неспособность этой формы ингибировать родопсинкиназу. Рековерин полностью экспонирует миристоильный родопсинкиназу экспонирует остаток после заполнения катионом Са2+-связывающего центра EF2, т.е. когда оба Са2+заполнения катионом 2, т связывающих центра рековерина заполнены ионами кальция. Заполнение катионом центра рековерина Заполнение EF2 является также необходимым условием для экспонирования гидрофобного “кармана” необходимым гидрофобного рековерина и, соответственно, для появления у него способности ингибировать соответственно способности родопсинкиназу Са2+-зависимым зависимым образом.

Рис. 14. Структуры бескальциевой (А) (Ames et al., 1995) и содержащей 1 (Б) (Weiergraber at al., бескальциевой содержащей 1 ( 2003) и 2 (В) (Ames et al., 1997) иона кальция форм рековерина.

Заметим, что аналогичная роль центра EF2 была продемонстрирована для нейрокальцина – гомолога рековерина из мозга быка (Kumar and Kumar, 1999).

Следовательно, весьма вероятно, что выявленный нами механизм экспонирования миристоильного остатка может быть универсальным для нейрональных кальциевых сенсоров, в которых функционирует Ca2+-миристоильный переключатель.

Метод спектроскопии поверхностного плазмонового резонанса позволил нам обнаружить еще один эффект, который проявляется при заполнении Са2+-связывающего центра EF2 ионами кальция. Оказалось, что при высоких концентрациях ионов кальция wtрековерин диссоциирует с поверхности липидного бислоя, иммобилизованного на чипе, медленнее по меньшей мере на порядок по сравнению с мутантом EF-2, в котором модифицирован центр EF2. Это различие было Са2+-зависимым: при низких концентрациях Са2+ рековерин и мутант EF-2 диссоциировали с поверхности липидного бислоя одинаково быстро. Можно предположить, что в физиологических условиях замедление диссоциации рековерина с поверхности мембран при высоких концентрациях кальция, т.е. тогда, когда рековерин должен ингибировать родопсинкиназу, может увеличивать эффективность этого ингибирования, поскольку родопсинкиназа в условиях in vivo преимущественно (или даже полностью) ассоциирована с поверхностью фоторецепторных мембран.

5. Исследование функциональных свойств рековерина, содержащего реконструированный Са2+-связывающий центр EFДля нормального функционирования многих представителей семейства NCS необходимо наличие активного Са2+-связывающего центра EF4 в структуре молекулы белка, однако, в информация об участии четвертого Са2+-связывающего центра в функционировании механизма Са2+-миристоильного переключателя в семействе NCS и, в частности, рековерина отсутствовала. Для «восстановления» Са2+-связывающей способности центра EF4, потребовалось введение пяти точечных мутаций (G160D, K161E, K162N, D165G и K166Q). Также были получены мутанты рековерина EF-2+4 и EF-3+4, у которых в дополнение к реконструкции центра EF4, была нарушена способность координировать катионы центром EF2 (E85Q) и EF3 (E121Q) соответственно. Мы использовали описанные мутанты для изучения влияния реконструированного Са2+связывающего центра EF4 на функциональные свойства рековерина.

5.1. Связывание ионов кальция мутантами рековерина, модифицированными по четвертому Са2+-связывающему центру.

Как видно из таблицы 3, немиристоилированный мутант EF+4 связывает 3 иона кальция в отличие от рековерина дикого типа, который координирует 2 катиона. Из таблицы 3 также видно, что мутант EF+4, как и рековерин дикого типа, связывает ионы кальция некооперативно. Величины констант диссоциации (KD), относящиеся к центрам EF3, EF2 и EF4 соответственно, составляют: KD1 = 0,21 мкМ, KD2 = 6,4 мкМ и KD3 = 1,1 мкМ.

Сравнение констант диссоциации для Са2+-связывающих центов EF3 и EF2 у немиристоилированного мутанта EF+4 показало, что они идентичны соответствующим значениям для немиристоилированной формы рековерина дикого типа (0,21 мкМ и 6,мкМ). В то же время наблюдается дополнительное связывание катиона четвертым Са2+связывающим центром рековерина с KD3 = 1,1 мкМ.

Миристоилированный мутант EF+4, так же как и его немиристоилированная форма, связывает 3 иона кальция (табл. 3). Однако связывание катионов, в отличие от немиристоилированного мутанта EF+4, в случае его миристоилированной формы происходит кооперативно с коэффициентом Хилла 1,6 и KD = 12,4 мкМ. Сравнение изученных нами Са2+-связывающих свойств миристоилированного мутанта EF+4 с Таблица 3. Стехиометрия связывания и константы диссоциации Са2+ для мутантных форм рековерина с восстановленным EF4.

№ Форма рековерина Стехиометрия KD1, мкМ KD2, мкМ KD3, мкМ связывания Са2+, моль (EF3) (EF2) (EF4) на моль белка 1 nRc+4* 3 0,21 6,4 1,2 nEF-2,+4 2 0,21 - 0,3 nEF-3,+4 2 - 5,7 0,4 mRc+4 3 12,4 1,5 mEF-2,+4 2 - 13,0 0,6 mEF-3,+4 2 198,0 - 2,*Сокращения: nRc+4 – немиристоилированная мутантная форма рековерина с восстановленным EF4 (RcG160D,K161E,K162N,D165G,K166Q); nEF-2,+4 - немиристоилированная мутантная форма рековерина RcE85Q,G160D,K161E,K162N,D165G,K166Q; nEF-3,+4 - немиристоилированная мутантная форма рековерина RcE121Q,G160D,K161E,K162N,D165G,K166Q;

mRc+4 – миристоилированная мутантная форма рековерина с восстановленным EF(RcG160D,K161E,K162N,D165G,K166Q); mEF-2,+4 - миристоилированная мутантная форма рековерина RcE85Q,G160D,K161E,K162N,D165G,K166Q; mEF-3,+4 - миристоилированная мутантная форма рековерина RcE121Q,G160D,K161E,K162N,D165G,K166Q.

таковыми рековерина дикого типа (координирует 2 катиона и это взаимодействие носит кооперативный характер с коэффициентом Хилла 1,9 и KD = 17 мкМ) демонстрирует, что в обоих случаях миристоилирование понижает аффинность центров EF2 и EF3 к катиону и придаёт процессу связывания кооперативный характер. В то же время, в молекуле этого мутанта не наблюдается кооперативного взаимодействия «восстановленного» центра EF(KD3 = 1 мкМ) с Са2+-связывающими центрами EF2 и EF3.

Результаты исследования Са2+-связывающих свойств как немиристоилированного, так и миристоилированного мутанта EF-2+4 представлены в табл. 3. Видно, что немиристоилированный мутант EF-2+4 связывает два иона кальция с KD1 = 0,21 мкМ и KD3=0,7 мкМ. Величина KD1, относящаяся к высокоаффинному Са2+-связывающему центру EF3 в этой мутантной форме, соответствует ранее определенному значению для немиристоилированного мутанта EF-2, который координирует один катион за счет центра EF3 с KD = 0,26 мкM. Величина KD3 практически совпадает со значением KD = 1,1 мкМ, которое мы определили для центра EF4 в немиристоилированном мутанте EF+4.

Исследование связывания ионов кальция с миристоилированным мутантом рековерина EF-2+4 показало, что этот мутант так же, как и его немиристоилированная форма, координирует 2 катиона с константами диссоциации 13 мкМ и 0,9 мкМ (табл. 3).

Поскольку миристоилированный мутант рековерина EF-2 координирует 1 катион за счет нативного центра EF3 с KD = 34,6 мкМ, сопоставление величин констант диссоциации для Са2+-связывающих центров миристоилированных мутантов EF-2+4 и EF-2, позволяет нам говорить о том, что в мутанте EF-2+4 величина 13 мкМ относиться к центру связывания EF3, тогда как значение 0,9 мкМ соответствует KD3 для Са2+-связывающего центра EF4.

Таким образом, миристоилирование мутанта EF-2+4 значительно увеличивает константу связывания для центра EF3, при этом практически не изменяя константу связывания для центра EF4. Следовательно, функциональный центр EF4 в миристоилированном мутанте EF-2+4 не влияет на Са2+-связывающие свойства третьего Са2+-связывающего центра молекулы рековерина (EF3). Принимая во внимание рассчитанные нами константы связывания с ионами кальция для центров EF3 и EF4 в миристоилированном мутанте EF2+4, можно заключить, что при функционировании дополнительного Са2+-связывающего центра (EF4) в С-концевом домене рековерина не наблюдается кооперативного взаимодействия между центрами EF3 и EF4.

Из табл. 3 следует, что немиристоилированный мутант EF-3+4, у которого не функционирует центр EF3, связывает 2 иона кальция. Величины констант диссоциации для его Са2+-связывающих центров EF2 и EF4 составляют 5,7 мкМ и 0,9 мкМ соответственно.

Величины полученных констант свидетельствуют о том, что аффинность у центра EF2 к ионам кальция в немиристоилированном мутанте EF-3+4 такая же, как у рековерина дикого типа (KD2 = 5,7 мкМ), а константа связывания катиона с центром EF4 совпадает со значением KD3 = 1,1 мкМ, рассчитанным нами для четвертого Са2+-связывающего центра в немиристоилированном мутанте EF+4.

Миристоилированный мутант EF-3+4 так же, как и его немиристоилированная форма, связывает 2 катиона (табл. 3). Мы рассчитали константы диссоциации для двух независимых центров связывания ионов кальция в этом мутанте. Полученные значения равны 198 мкМ и 2,9 мкМ. Величина KD = 2,9 мкМ может быть отнесена к четвертому Са2+связывающему центру, поскольку она близка соответствующему значению, определенному нами для центра EF4 в миристоилированном мутанте EF+4 (KD3 = 1 мкМ). Следовательно, KD = 198 мкМ должна быть отнесена к центру EF2 в этой мутантной форме. Эти результаты существенно отличаются от данных по Са2+-связывающей способности миристоилированного мутанта EF-3, у которого мутирован высокоаффинный центр EF3.

Мутант EF-3 не способен связывать катионы даже при высокой концентрации Са2+ из-за того, что в миристоилированном рековерине работает механизм последовательного заполнения его Са2+-связывающих центров ионами кальция. Таким образом можно заключить, что в мутантной форме рековерина EF-3+4 становится делает возможным связывание ионов кальция с центром EF2.

Каковы же структурные предпосылки феномена связывания ионов кальция миристоилированным мутантом EF-3+4 при том, что у миристоилированного мутанта EF-отсутствует такая способность? Как показано в работе (Yap et al., 1999), структура миристоилированного рековерина является очень компактной. При этом Са2+-связывающий центр EF2 располагается глубоко внутри глобулы, а центры EF3 и EF4 находятся на ее поверхности, что, по-видимому, и служит причиной того, что С-концевой домен, а следовательно центры EF3 и EF4, более доступны ионам кальция по сравнению с центром EF2. После связывания катиона с центром EF3 происходит перестройка структуры миристоилированного рековерина, что делает центр EF2 также доступным ионам кальция.

В то же время, четвертый Са2+-связывающий центр молекулы рековерина претерпевает структурные изменения, подобные тем, что происходят в центре EF3. Следовательно, можно говорить о том, что реконструированный Са2+-связывающий центр EF4 в рековерине, в котором из-за модификации 3-й Са2+-связывающий центр не способен связывать ионы кальция, функционально компенсирует отсутствие Са2+-связывающей способности центра EF3.

5.2. Са2+-зависимое взаимодействие мутантов рековерина, модифицированных по четвертому Са2+-связывающему центру, с фоторецепторными мембранами.

Модификация Са2+-связывающего центра EF4 в молекуле рековерина мало влияет на его способность взаимодействовать с фоторецепторными мембранами (данные не приведены). Величина K50, характеризующая взаимодействие мутанта EF+4 с фоторецепторными мембранами, составляет 4 мкМ, как и в случае рековерина дикого типа.

По всей видимости, это связано с тем, что Са2+-связывающие свойства центров EF2 и EF3 в данной мутантной форме не изменяются при «восстановлении» четвертого Са2+связывающего центра.

Взаимодействие миристоилированного мутанта EF-2+4, как и мутанта EF-2, с фоторецепторными мембранами происходит в два этапа (рис. 15А). В микромолярном диапазоне концентраций ионов кальция у мутанта EF-2 происходит заполнение третьего Са2+-связывающего центра, что приводит к частичному экспонированию миристоильного остатка белка. Поскольку введение дополнительного центра EF4 не влияет на заполнение ионами кальция третьего Са2+-связывающего центра молекулы, то, можно утверждать, что часть кривой, соответствующая микромолярному диапазону концентраций ионов кальция, отражает заполнение катионами центра EF3 и, соответственно, частичное экспонирование миристоильного остатка у мутанта EF-2+4. Дополнительное связывание мутанта EF-2+4 с фоторецепторными мембранами, наблюдаемое в миллимолярном диапазоне концентраций ионов кальция, можно объяснить только лишь заполнением катионами мутированного второго Са2+-связывающего центра.

Из рис. 15Б видно, что мутант EF-3+4, в отличие от мутанта EF-3, оказывается способным взаимодействовать с фоторецепторными мембранами Са2+-зависимым образом, несмотря на то, что в нем отсутствует функционирующий третий Са2+-связывающий центр. Мутант EF-с мембранами практически не взаимодействует и лишь в миллимолярном диапазоне концентраций ионов кальция наблюдается его незначительное связывание. Отсутствие у мутанта EF-3 способности взаимодействовать с мембранами обусловлено тем, что в нем нарушен процесс последовательного заполнения катионами его Са2+-связывающих центров, который предполагает, что в миристоилированном рековерине центр EF2 может координировать катионы только при условии заполнения ионами кальция центра EF3.

Способность мутанта EF-3+4 взаимодействовать с фоторецепторной мембраной может быть объяснена данными, полученными нами при исследовании связывания ионов кальция с этим мутантом. Следует подчеркнуть, что в микромолярном диапазоне концентраций ионов кальция наблюдается частичное связывание мутанта EF-3+4 с фоторецепторными мембранами когда, как было сказано выше, заполняются ионами кальция Са2+связывающие центры EF4 и EF2. Однако при высоких (миллимолярных) концентрациях ионов кальция наблюдается досвязывание мутанта с мембранами, что можно объяснить заполнением катионом мутированного центра EF3, который также вносит свой вклад в экспонирование миристоильного остатка.

5.3. Изучение взаимодействия мутантов рековерина по четвертому Са2+связывающему центру с иммобилизованным липидным бислоем методом спектроскопии поверхностного плазмонового резонанса.

Исследование мутанта EF+4 показало, что варьирование концентраций ионов кальция и белка вызывает изменение амплитуды сигнала связывания, но не оказывает заметного влияния на кинетику ассоциации мутантов рековерина с иммобилизованным липидным бислоем. Однако кинетика диссоциации мутанта EF+4 из комплекса с липидным бислоем варьирует в зависимости от концентрации катиона. Поскольку нас прежде всего интересовал механизм Са2+-зависимого взаимодействия мутантов рековерина по EF-2+4 EF-3+EF-2+4 EF-3+EF-2+4 EF-3+15 15 EF-EF-EF-10 10 EF-EF-5 5 0,1 1 10 100 1000 10000 10000,1 1 10 100 1000 10000 10000,1 1 10 100 1000 10000 10000,1 1 10 100 1000 10000 1000[Ca2+]f, µM [Ca2+]f, µM [Ca2+]f, µM [Ca2+]f, µM Рис. 15. Са2+-зависимое связывание с фоторецепторными мембранами мутантов EF-2+4, EF-2 (A) и мутантов EF-3+4, EF-3 (Б).

Количество связанного рековерина, % Количество связанного рековерина, % Количество связанного рековерина, % Количество связанного рековерина, % четвертому Са2+-связывающему центру с искусственным липидным бислоем, далее мы более детально исследовали влияние ионов кальция на этот процесс.

Измерения проводили при двух значениях [Ca2+]f: 1 мкМ и 400 мкМ. Из рисунка видно, что при концентрации ионов кальция, равной 400 мкМ, мутант EF+4 диссоциирует из комплекса с иммобилизованным липидным бислоем значительно медленнее, чем при [Ca2+]f, равной 1 мкМ. На основании полученных сенсограмм нами были рассчитаны константы скорости диссоциации (kd), характеризующие процесс диссоциации мутанта EF+4 из комплекса с липидным бислоем при двух указанных значениях [Ca2+]f (константы носят оценочный характер, поскольку точные значения не могли быть рассчитаны из-за ограничений метода). Величина константы скорости диссоциации при низкой концентрации ионов кальция (1 мкМ), оцененная как kd 0,1 c-1, характеризует быструю фазу диссоциации мутанта из комплекса с липидным бислоем. При высокой концентрации катиона (400 мкМ) значение kd оценено как kd 0,01 c-1, что соответствует медленной фазе вышеуказанного процесса. Сопоставляя полученные значения kd,, можно заключить, что различие указанных величин составляет как минимум один порядок. Это означает, что время нахождения миристоилированного мутанта EF+4 на поверхности иммобилизованного липидного бислоя зависит от концентрации катиона. Следует добавить, что рассчитанные константы описывают 2-х фазный процесс диссоциации мутанта EF+4 из комплекса с липидным бислоем в зависимости от концентрации ионов кальция и совпадают с соответствующими константами, определенными нами для рековерина дикого типа.

На рис. 16 приведены сенсограммы, отражающие связывание мутантов EF-2+4 и EF3+4 с липидным бислоем, иммобилизованным на чипе (в этом случае измерения проводили только при [Ca2+]f = 400 мкМ поскольку при концентрации катиона, равной 1 мкМ, эффект взаимодействия этих мутантов с липидным бислоем не выявляется). Из приведенных на рисунке сенсограмм видно, что мутант EF-2+4 диссоциирует из комплекса с липидным бислоем заметно быстрее, чем мутант EF-3+4. Это означает, что модификация Са2+связывающего центра EF2 в молекуле рековерина уменьшает время его нахождения на поверхности иммобилизованного липидного бислоя. На основании сенсограмм нами были рассчитаны константы скорости диссоциации мутантов EF-2+4 и EF-3+4 из комплекса с липидным бислоем. В случае мутанта EF-2+4 определена одна константа, соответствующее значение которой оценено как 0,1 c-1. Следовательно, кинетика диссоциации мутанта EF-3+EF-3+22EF-2+EF-2+110 200 400 600 80 200 400 600 8Время, сек Время, сек Рис. 16. SPR-сенсограммы, отражающие взаимодействие миристоилированных мутантных форм рековерина EF-2+4 и EF-3+4 с иммобилизованным липидным бислоем. Измерения выполнены при [Са2+]free = 400 мкМ. Концентрация белка составляла 15 мкМ. Полоса над сенсограммами обозначает период времени, в течение которого в подвижной фазе отсутствует (не закрашено) и присутствует (закрашено черным) мутантная форма рековерина.

EF-2+4 характеризуется только быстрой кинетической составляющей.

Миристоилированный мутант EF-3+4 диссоциирует из комплекса с липидным бислоем с бифазной кинетикой.

Константы скорости диссоциации (kd) в случае мутанта EF-3+4 оценены как: kd 0,c-1 и kd 0,01 с-1. Таким образом, кинетика скорости диссоциации мутанта EF-3+4 из комплекса с иммобилизованным липидным бислоем характеризуется быстрой (kd 0,1 c-1) и медленной (kd 0,01 c-1) компонентами. Из этого следует, что при высоких концентрациях ионов кальция происходит замедление процесса диссоциации мутанта EF-3+4 из комплекса с липидным бислоем.

На основании полученных результатов можно заключить, что: а) время нахождения рековерина на поверхности липидного бислоя зависит от его способности связывать ионы норм норм Величина сигнала, RU Величина сигнала, RU кальция вторым Са2+-связывающим центром и б) реконструкция четвертого Са2+связывающего центра рековерина в мутанте EF-3+4, у которого отсутствует способность координировать катионы за счет центра EF3, позволяют этому мутанту диссоциировать с поверхности липидного бислоя подобно рековерину дикого типа.

Результаты, представленные в настоящей работе, позволяют сделать вывод о том, что функциональный четвертый Са2+-связывающий центр молекулы рековерина в значительной степени способен компенсировать нарушение Са2+-связывающей способности в третьем, но не во втором Са2+-связывающем центре. Также нами было получено независимое доказательство гипотезы о том, что среднее время нахождения рековерина на мембране определяется функционированием его второго Са2+-связывающего центра. Этот шаг важен для понимания механизма ингибирования родопсинкиназы рековерином при высоких концентрациях ионов кальция. Нами было непосредственно продемонстрировано, что миристоилированный мутант EF-3+4 ингибирует родопсинкиназу (данные не приведены), в то время как мутант EF-3 не оказывает влияние на активность фермента. Проведенные нами исследования имеют большое значение для изучения процесса функционирования Са2+-связывающих белков, которые опосредуют эффект ионов кальция на протеинкиназы G-белок-сопряженных рецепторов, поскольку они регулируют активность ферментов Са2+-зависимым образом.

6. Са2+/рековерин-зависимая регуляция фототрансдукции и патологии зрения.

Под термином “пигментный ретинит” (ПР) объединяют группу дегенеративных заболеваний сетчатки глаза, вызванных мутациями во многих генах, при этом мутации в гене зрительного рецептора родопсина являются наиболее частой причиной болезни. На сегодняшний день обнаружено более чем 150 мутаций в гене родопсина, ассоциированных с ПР. Столь значительное количество патогенных мутаций рецептора указывает на критическую важность правильной трехмерной структуры родопсина для его функционирования, и говорит об оптимальности дизайна молекулы рецептора достигнутой в процессе эволюции.

К настоящему моменту некоторое количество мутантов родопсина, ассоциированных с ПР, было получено и охарактеризовано, однако многие мутанты, ассоциированные с ПР до сих пор находились вне поля зрения исследователей. Один из аминокислотных остатков, замены которого достаточно часто встречаются у пациентов с пигментным ретинитом – R135, локализованный в цитоплазматическом окончании третьей трансмембранной -спирали родопсина. На сегодняшний день выявлено три мутации в этом положении (R135L, R135G и R135W), ассоциированные с ПР. Мутации R135 связаны с наиболее серьезной формой ПР. Так, клинический фенотип заболевания, вызванного заменой R135L, отличался более тяжелым течением, чем ПР, вызванный, например, мутацией P23H в трансмембранной части молекулы или мутацией С-концевого цитоплазматического P347.

Нами был получен и охарактеризован мутант родопсина R135L, ассоциированный с ПР. Как видно из рис. 17 гиперфосфорилирование в случае мутанта родопсина R135L менее эффективно ингибируется Ca2 +/рековерином, чем в случае родопсина дикого типа. Это указывает на участие Ca2+/рековерина в молекулярном механизме, в соответствии с которым, мутация родопсина R135L оказывает патогенный эффект, являясь причиной дегенерации фоторецепторной клетки. Полученный результат вносит существенные дополнения к существующим молекулярным механизмам пигментного ретинита, впервые указывая на важность правильного и своевременного выключения родопсина, регулируемого Ca2+/рековерином. Предложенный нами механизм может являться дополнением к результатам недавнего исследования, где деградация фоторецепторной клетки, вызванная мутацией R135L, объяснялась ослаблением эндоцитозной активности в отношении мутированного белка. Отметим, что до настоящей работы, непосредственное участие рековерина в развитии ПР не выявлялось.

2111110,0 0,1 1,0 10,0 100,[Рековерин], мкМ Рис. 17. Зависимость фосфорилирования родопсина (•) и его мутантной формы R135L () от концентрации рековерина в реконструированной системе.

Относительное фосфорилирование,% ВЫВОДЫ 1. Функциональной мишенью для рековерина в фоторецепторных клетках служит родопсинкиназа.

2. Рековерин Са2+-зависимым образом ингибирует фосфорилирование родопсина, катализируемое родопсинкиназой.

3. N-концевое миристоилирование рековерина увеличивает его эффективность как ингибитора родопсинкиназы.

4. Холестерин выступает в роли фактора, оказывающего влияние на функциональные свойства рековерина: высокая концентрация холестерина повышает сродство рековерина к фоторецепторным мембранам и усиливает ингибирование родопсинкиназы рековерином.

5. Рековерин более эффективно ингибирует родопсинкиназу в реакции фосфорилирования «темнового» родопсина, чем в реакции фосфорилирования фотовозбужденного пигмента; высказана гипотеза о том, что одной из функций рековерина в фоторецепторной клетке является предотвращение нежелательного фосфорилирования «темнового» родопсина родопсинкиназой, находящейся в активированном состоянии.

6. В немиристоилированном рековерине Са2+-связывающий центр EF3 является высокоаффинным (KD1=0,21 мкM), EF2 –низкоаффинным (KD2=6,2 мкM).

7. В миристоилированном рековерине заполнение Са2+-связывающих участков ионами кальция происходит последовательно: сначала заполняется 3-й участок, и лишь затем 2-й, при этом заполнение ионами кальция центра EFявляется необходимым условием для последующего связывания катиона в центре EF2. Миристоильный остаток является важной деталью последовательного механизма заполнения Са2+-связывающих участков в молекуле рековерина, поскольку он блокирует связывание кальция с EF2 до того, как произойдёт заполнение кальцием с EF3.

8. Заполнение ионами кальция Са2+-связывающего центра EF3 сопровождается частичным экспонированием миристоильного остатка рековерина; полное экспонирование последнего происходит в результате последующего связывания ионов кальция с EF2.

9. Экспонирование гидрофобного «кармана» рековерина и, соответственно, его способность Са2+-зависимым образом взаимодействовать с фосфолипидными мембранами, и ингибировать родопсинкиназу непосредственно зависит от заполнения ионами кальция Са2+-связывающего центра EF2.

10. Скорость диссоциации рековерина с поверхности фосфолипидных мембран зависит от заполнения ионами кальция его Са2+-связывающего центра EF2.

11. Реконструкция 4-го Ca2+-связывающего центра в рековерине, в котором 3-й Са2+-связывающий центр EF3 модифицирован и не способен связывать ионы кальция, функционально компенсирует отсутствие связывания ионов кальция в Са2+-связывающем центре EF3.

12. Нарушение регуляции рековерином фосфорилирования родопсина, катализируемого родопсинкиназой может лежать в основе молекулярного механизма патогенеза такого заболевания сетчатки, как пигментный ретинит.

Список публикаций по теме диссертации 1. Gorodovikova E.N., Gimelbrant A.A., Senin I.I., Philippov P.P. Recoverin mediates the calcium effect upon rhodopsin phosphorylation and cGMP hydrolysis in bovine rerina rod cells.// FEBS Lett., 1994, v. 349, p. 187-190.

2. Gorodovikova E.N., Senin I.I., Philippov P.P. Calcium-sensitive control of rhodopsin phosphorylation in the reconstituted system consisting of photoreceptor membranes, rhodopsin kinase and recoverin. // FEBS Lett., 1994, v. 353, p. 171-172.

3. Senin I.I., Zargarov A.A., Alekseev A.M., Gorodovikova E.N., Lipkin V.M., Philippov P.P. NMyristoylation of recoverin enhances its efficiency as an inhibitor of rhodopsin kinase. // FEBS Lett., 1995, v. 376, p. 87-90.

4. Заргаров А.А., Сенин И.И., Алексеев А.М., Шульга-Морской С.В., Филиппов П.П., Липкин В.М. Получение миристоилированной и немиристоилированной форм рекомбинантного рековерина в клетках E.coli и сравнение их функциональной активности.

// Биоорган. Химия, 1996, т. 22, № 7, с. 483-488.

5. Senin I.I., Dean K.R., Zargarov A.A., Akhtar M., Philippov P.P. Recoverin inhibits the phosphorylation of dark-adapted rhodopsin more than it does that of bleached rhodopsin: A possible mechanism through which rhodopsin kinase is prevented from participation in a sidereaction. // Biochem. J., 1997, v. 321, p. 551-555.

6. Senin I.I., Zargarov A.A., Akhtar M., Philippov P.P. (1997) Rhodopsin phosphorylation in bovine rod outer segments is more sensitive to the inhibitory action of recoverin at the low rhodopsin bleaching than it is at the high bleaching. // FEBS Lett., 1997, v. 408, p. 251-254.

7. Alekseev A.M., Shulga-Morskoy S.V., Zinchenko D.V., Shulga-Morskaya S.A., Suchkov D.V., Vaganova S.A., Senin I.I., Zargarov A.A., Lipkin V.M., Akhtar M., Philippov P.P. Obtaining and characterization of EF-hand mutants of recoverin. // FEBS Lett., 1998, v. 440, p. 116-118.

8. Пермяков С.Е., Сенин И.И., Уверский В.Н., Черская А.М., Шульга-Морской С.В., Зинченко Д.В., Алексеев А.М., Заргаров А.А., Липкин В.М., Филиппов П.П., Пермяков Е.А.

Точечные аминокислотные замены в Са2+-связывющих центров рековерина. I. Механизм последовательного заполнения Са2+-связывающих центров. // Биоорган. химия, 1999, т.25, ;№, с.742-746.

9. Уверский В.Н., Пермяков С.Е., Сенин И.И., Черская А.М., Шульга-Морской С.В., Зинченко Д.В., Алексеев А.М., Заргаров А.А., Липкин В.М., Филиппов П.П., Пермяков Е.А.

Точечные аминокислотные замены в Са2+-связывющих центров рековерина. II. Необычное поведение белка при взаимодействии с ионами кальция. // Биоорган. химия, 2000, т.26, ;№, с.173-178.

10. Пермяков С.Е., Уверский В.Н., Черская А.М., Шульга-Морской С.В., Зинченко Д.В., Алексеев А.М., Зерний Е.Ю., Заргаров А.А., Сенин И.И., Липкин В.М., Филиппов П.П., Пермяков Е.А. Точечные аминокислотные замены в Са2+-связывющих центров рековерина.

III. Мутант с четвертым реконструированным Са2+-связывающим центром. // Биоорган.

химия, 2000, т.26, ;№, с. 275-283.

11. Permyakov S.E., Cherskaya A.M., Senin I.I., Zargarov A.A., Shulga-Morskoy S.V., Alekseev A.M., Zinchenko D.V., Lipkin V.M., Philippov P.P., Uversky V.N., Permyakov E.A. (2000) Effects of mutations in the calcium-binding sites of recoverin on its calcium affinity: evidence for successive filling of the сalcium binding sites. // Protein Eng., 2000, v.13, p. 783-790.

12. Bazhin A.V., Shifrina O.N., Savchenko M.S., Tikhomirova N.K., Goncharskayj M.A., Gorbunova V.A., Senin I.I., Chuhalin A.G., Philippov P.P. Low titre autoantibodies against recoverin in sera of patients with small cell lung cancer but without a loss of vision. // Lung cancer, 2001, v.34, p.99-104.

13. Комолов К.Е., Сенин И.И., Филиппов П.П. Влияние протеолитического отщепления Сконцевого фрагмента родопсина на его способность активировать зрительный каскад. // Биоорган. химия, 2002, т. 28, №, с. 16-22.

14. Senin I.I., Koch K.-W., Akhtar M., Philippov P.P. Ca2+-Dependent Control of Rhodopsin Phosphorylation: Recoverin and Rhodopsin Kinase. // Adv. Exp. Med. Biol., 2002, v. 514, p.6999.

15. Fisher T., Senin I.I., Philippov P.P., Koch K.-W. Application of different lipid surfaces to monitor protein-membrane interaction by surface plasmon resonance spectroscopy. // Spectroscopy, 2002, v.16, p. 271 – 279.

16. Senin I.I., Fisher T., Komolov K.E., Zinchenko D.V., Philippov P.P., Koch K.-W. Ca2+myristoyl switch in the neuronal calcium sensor recoverin requires different functions of Ca2+binding sites. // J. Biol. Chem., 2002, v. 277, № 52, p.50365-50372.

17. Зериний Е.Ю., Тихомирова Н.К., Филиппов П.П., Сенин И.И. Обнаружение аннексина IV в палочках сетчатки быка. // Биохимия, 2003, т. 68, № 1, с. 154-160.

18. Permyakov S.E., Cherskaya A.M., Wasserman L.A., Khokhlova T.I., Senin I.I., Zargarov A.A., Zinchenko D.V., Zernii E.Yu., Lipkin V.M., Philippov P.P., Uversky V.N, Permyakov E.A.

Recoverin Is a Zinc-Binding Protein // J. Proteome Res., 2003, v.2, № 1, p.51-57.

19. Weiergraber O.H., Senin I.I., Philippov P.P., Granzin J., Koch K-W. Impact of N-terminal myristoylation on the Ca2+-dependent conformational transition in recoverin. // J. Biol. Chem., 2003, v. 278, № 25, p.22972-22979.

20. Senin I.I., Vaganova S.A., Weiergraber O.H., Ergorov N.S., Philippov P.P., Koch K-W.

Functional restoration of the Ca2+-myrisсчссс ьт0447кччкчякщкукщщзк3зщщ03к2я32toyl switch in a recoverin mutant. // J. Mol. Biol., 2003, v. 330, № 2, p.409-418.

21. Комолов К.Е., Сенин И.И., Филиппов П.П. Зрительная трансдукция и кальций. // Биофизика, 2004, т. 49, №2, с. 265-77.

22. Zernii E.Yu., Tikhomirova N.K., Hellman U., Philippov P.P. and Senin I.I. Annexins in bovine photoreceptors. // Annexins, 2004, v.1, № 1, p.63-69.

23. Senin I.I., Hoeppner-Heitmann D., Polkovnikova O.O., Churumova V.A., Tikhomirova N.K., Philippov P.P., and Koch K.W. Recoverin and rhodopsin kinase activity in detergent-resistant membrane rafts from rod outer segments. // J. Biol. Chem., 2004, v.279, № 47, p. 48647-48653.

24. Тихомирова Н.К., Гончарская М.А., Сенин И.И. Получение и характеристика Са2+зависимых моноклональных антител против рековерина. // Биохимия, 2004, т. 69, № 12, с.

1360-1364.

25. Komolov K.E., Zinchenko D.V., Churumova V.A., Vaganova S.A., Weiergraber O.H., Senin I.I., Philippov P.P., and Koch K.W. One of the Ca2+ binding sites of recoverin exclusively controls interaction with rhodopsin kinase. // Biol. Chem., 2005, v.386, № 3, p. 285-289.

26. Komolov K.E., Senin I.I., Philippov P.P., and Koch K.W. Surface plasmon resonance study of G-protein/receptor coupling in a lipid bilayer-free system. // Anal. Chem., 2006, v. 78, № 4, p.

1228-1234.

27. Senin I.I., Bosch L., Ramon E., Zernii E.Yu., Manyosa J., Philippov P.P., and Garriga P.

Ca2+/recoverin dependent regulation of phosphorylation of the rhodopsin mutant R135L associated with retinitis pigmentosa. // Biochem. Biophys. Res. Commun., 2006, v. 349, № 1, p. 345-352.

28. Weiergrber O.H., Senin I.I., Zernii E.Yu. Churumova V.A., Kovaleva N.A., Nazipova A.A., Permyakov S.E., Permyakov E.A., Philippov P.P., Granzin J., and Koch K.W. Tuning of a Neuronal Calcium Sensor. // J.Biol.Chem., 2006, v. 281, №, p. 37594 – 37602.

29. Gensch T., Komolov K.E., Senin I.I., Philippov P.P., and Koch K.W. Ca2+-dependent conformational changes in the neuronal Ca2+-sensor recoverin probed by the fluorescent dye Alexa647. // Proteins, 2007, v. 66, № 2, p. 492-499.

30. Ramon E., Cordom A., Bosch L., Zernii E.Yu., Senin I.I., Manyosa J., Philippov P.P., Prez J.J., and Garriga P. Critical Role of Electrostatic Interactions of Amino Acids at the Cytoplasmic Region of Helices 3 and 6 in Rhodopsin Conformational Properties and Activation. // J.Biol.Chem., 2007; v. 282, №, p. 14272 - 14282.

31. Senin I.I., Churumova V.A., Philippov P.P., Koch K.W. Membrane binding of neuronal calcium sensor recoverin – modulatory role of the charged carboxy-terminus. // BMC Biochem., 2008, v.8, p.24-29.






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.