WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


 

На правах рукописи

СИБИРЦЕВ Владимир Станиславович

НОВЫЕ МЕТОДЫ БИОТЕСТИРОВАНИЯ

И АНАЛИЗА ДНК С ПОМОЩЬЮ ФЛУОРОФОРОВ

Специальности:

03.01.06 биотехнология  (в том числе бионанотехнологии)

02.00.10 биоорганическая химия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

доктора химических наук

Санкт–Петербург

2011 г.

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального  образования  «Санкт–Петербургский  государственный

технологический институт  (технический университет)»

Научный консультант:

доктор химических наук, профессор  Гарабаджиу Александр Васильевич

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор, академик РАМН  Швец Виталий Иванович

доктор химических наук, профессор  Шугалей Ирина Владимировна

доктор химических наук, профессор  Москвин Андрей Вадимович

Ведущая организация:

ФГУП государственный научно–исследовательский институт

особо чистых биопрепаратов ФМБА России

Защита состоится  ____________________________________ в  _____ часов 

на заседании  совета  по  защите  докторских  и  кандидатских  диссертаций

Д 212.230.04 при Санкт–Петербургском государственном технологическом

институте по адресу: 190013, Санкт–Петербург, Московский пр., д.26.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Замечания и отзывы, заверенные печатью, просим направлять по адресу:

190013, Санкт–Петербург, Московский пр., д.26, Санкт–Петербургский

государственный технологический институт, Ученый совет (тел.: 494-93-75,

факс: 712-77-91, e-mail: dissovet@lti-gti.ru или dissovet@technolog.edu.ru).

Автореферат разослан  _____________________________________________

Ученый секретарь

диссертационного совета,

к.т.н., доцент  М. М. Шамцян

Актуальность работы

В последнее время, в связи со все большими объемами производства и потребления различных фармакологических субстанций и биотехнологической продукции, а также увеличением общего уровня антропогенной нагрузки на окружающую среду – все более актуальной становится проблема быстрого выявления негативных свойств новых, а также генетически или иным способом модифицированных пищевых продуктов, биологически активных веществ, лекарственных и иных препаратов… причем не только при изолированном их действии на живой организм, но и в сочетании с другими продуктами, препаратами и факторами окружающей среды, специфическими для того или иного региона. 

Кроме того, нередко важна и сама по себе проблема достаточно быстрой и комплексной оценки степени экологического неблагополучия того или иного региона… причем даже в том случае, когда «стандартными» методами там не фиксируется превышение установленных норм ни по одному из возможных угнетающих факторов – однако в сочетанном виде они способны оказывать значимое повреждающее действие на людей и другие живые организмы.

Решение вышеупомянутых проблем может быть осуществлено разными способами. Но наиболее приемлемым и адекватным представляется использование для этой цели «стандартных» тестовых биосистем (таких например, как крысы) – достаточно адекватно моделирующих человеческий организм, но при том дешевых, доступных и имеющих сравнительно короткий жизненный цикл (что позволяет формировать на их основе статистически значимые выборки… и притом, осуществлять достаточно экспрессное моделирование даже хронического воздействия на живые организмы тех или иных факторов).

Одним же из важнейших параметров, характеризующих состояние организма, являются изменения в структуре его генома (в отношении «степени суперспирализации ДНК», например, наблюдающиеся даже вследствие обычных суточных изменений физиологического и психологического состояния человека) – которые весьма просто и экспрессно могут быть выявлены, в частности, с помощью синтетических низкомолекулярных флуорофоров, чувствительных даже к достаточно небольшим изменениям как в составе, так и в структуре внутриклеточной ДНК.

Кроме того, экспрессный анализ генома живых организмов с помощью специфических флуорофоров может быть весьма важен и для решения целого ряда иных проблем – диагностических, мониторинговых, исследовательских и т.п. А помимо этого, и сами синтетические нуклеотид–специфичные соединения могут быть использованы в качестве лекарственных препаратов, радиопротекторов и т.п.

Но для всех вышеозначенных целей желательно использование соединений, как можно более специфичных и чувствительных в отношении изменения своих флуоресцентных свойств при связывании с ДНК. И осуществлять их подбор при этом хотелось бы не эмпирически… а на основании единой обобщенной модели – позволяющей теоретически предсказывать изменения флуоресцентных и комплексообразующих свойств таких соединений в зависимости от их химической структуры, характера взаимодействия с субстратом, свойств среды измерения и т.д.

Цель и задачи исследования

Основной целью настоящей работы стала разработка научно–методических основ простой и быстрой оценки качества и безопасности использования различных пищевых, лекарственных и иных продуктов и препаратов (как по отдельности, так и в сочетании друг с другом),  а также оценки степени общего экологического неблагополучия того или иного региона – при помощи биотестирования, с использованием для характеристики состояния «стандартных» биосистем нескольких синтетических низкомолекулярных ДНК–специфичных флуорофоров со взаимодополняющими свойствами. Для этого были поставлены следующие задачи.

1. Провести оценку и систематизацию на основе универсального структурно–химического подхода свойств возможно большего числа флуорофоров на ДНК – с тем, чтобы исходя из этого, сформулировать основные положения единой обобщенной модели, адекватно объясняющей изменения флуоресцентных свойств подобных соединений в зависимости от их химической структуры, особенностей взаимодействия с субстратом, свойств среды измерения и т.д.;  и затем, предложить рекомендации по конструированию новых флуорофоров на ДНК с требуемыми свойствами – поскольку малоперспективно ориентироваться при разработке методов анализа клеточного генома только на уже известные флуорофоры или подбирать новые исключительно эмпирически.

2. С помощью нескольких ДНК–специфичных флуорофоров со взаимодополняющими свойствами разработать метод оценки не только общего содержания нуклеиновых кислот в пробе (как это делалось ранее), но и изменений в структуре генома клетки.

3. С помощью вышеупомянутой схемы анализа генома «стандартных» биосистем разработать метод для быстрого выявления генотоксического воздействия на человеческий и другие живые организмы различных угнетающих факторов окружающей среды, продуктов питания, лекарственных и иных препаратов – в том числе при сочетанном действии на эти организмы других продуктов, препаратов и факторов окружающей среды, специфических для того или иного региона.

4. Разработать другие возможные методы диагностики и мониторинга, основанные на количественном и качественном анализе генетического материала клеток с помощью ДНК–специфичных флуорофоров.

Научная новизна и научнопрактическая значимость исследования

1. Получено и систематизировано на основе универсального структурно–химического подхода значительное количество новых данных по свойствам более 30 синтетических ДНК–специфичных флуорофоров: фенилиндольного, фенилбензазольного, бисбензимидазольного, псораленового, ангелицинового, тетрагидрокарбазольного, оксофеноксазольного и др. рядов – что существенно расширяет уже имеющуюся базу данных свойств подобных соединений, а также уточняет представления о закономерностях, связывающих вышеупомянутые свойства флуорофоров с их структурой.

2. Даны рекомендации по конструированию новых эффективных ДНК–специфичных флуорофоров;  а также сформулированы основные положения единой обобщенной модели, позволяющей адекватно объяснить изменения флуоресцентных свойств таких соединений в зависимости от их химической структуры, характера взаимодействия с субстратом, свойств среды измерения и т.д.

3. С использованием системы из двух флуорофоров со взаимодополняющими свойствами предложена новая схема анализа нуклеиновых кислот (НК), позволяющая проводить оценку не только общего содержания ДНК в пробе, но и степени изменения структуры клеточного генома.

4. С помощью вышеупомянутой схемы анализа генома «стандартных» биосистем разработаны новые методы для быстрого выявления возможного генотоксического воздействия на человеческий и другие живые организмы различных угнетающих факторов окружающей среды, продуктов питания, лекарственных и иных препаратов (в том числе при сочетанном действии на эти организмы других продуктов, препаратов и факторов окружающей среды, специфических для того или иного региона) – что является весьма актуальным в связи со все большими объемами производства и потребления различных фармакологических субстанций, генетически модифицированной продукции, иных продуктов биотехнологии… а также, в частности, может позволить проводить комплексную оценку степени экологического неблагополучия того или иного региона даже в том случае, когда «стандартными» методами не фиксируется превышение предельно допустимых норм ни по одному из вышеуказанных факторов, однако в сочетанном виде они способны оказывать значимое повреждающее действие на людей и другие живые организмы.

5. С использованием ДНК–специфичных флуорофоров разработан новый метод экспрессной оценки микробной обсемененности различных жидких сред непосредственно на месте отбора проб (что может позволить оценивать санитарно–гигиеническое состояние водоемов, проводить мониторинг процесса очистки воды, а также иных биотехнологических производств в течение нескольких минут, а не суток, как ранее), а также новый метод оценки индивидуальной радиочувствительности человека и других живых организмов (что может позволить, в частности, выбирать оптимальную дозу облучения больных при лучевой терапии, определять время, которое тот или иной человек может находиться без значимого ущерба для своего здоровья в зоне с повышенным радиационным фоном и т.д.).

Апробация работы.  По теме диссертации автором получен патент на изобретение, а также опубликовано 50 работ (в том числе: одна монография; 16 статей в таких признаваемых ВАК ведущих периодических изданиях РФ, как: Журнал органической химии, Биоорганическая химия, Биохимия, Вопросы онкологии, Клиническая геронтология, Биотехносфера; 8 статей в зарубежных сборниках и периодических изданиях; а также 28 тезисов докладов на международных, всероссийских и российских конференциях, форумах, съездах и т.д.).

Объем и структура работы.  Диссертация изложена на 184 страницах машинописного текста, включает 60 рисунков, 11 таблиц и состоит из введения, 5-и глав, заключения и библиографического указателя, включающего 403 работы.

Рис.1. Структурные формулы исследованных соединений.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Из потенциальных ДНК–специфичных флуорофоров в качестве объекта исследования было взято более 30 соединений 1,2,3,4-тетрагидрокарбазольного I–III, 4,8,4'-триметилпсораленового IV–VI, 4,4'-диметилангелицинового VII–IX, 2-фенилиндольного X–XI, 2-фенилбензазольного XII–XIX, бисбензимидазольного XX–XXIV, 2-амино-3Н-3-оксофеноксазинового XXV–XXX и др. рядов (см. рис.1).

Именно эти соединения были выбраны с тем чтобы, во-первых, отразить по-возможности полно всё многообразие известных на настоящий день синтетических флуоресцентных нуклеотид–специфичных красителей. Во-вторых, нужно было иметь возможность для адекватного сравнения исследуемых соединений по их химической структуре (для чего выбиралось по нескольку представителей каждого ряда, отличающихся лишь характером какого-либо из своих «внешних» заместителей).

А кроме того, для исследования выбирались представители тех рядов, которые уже имеют на настоящий день достаточно важное и широкое практическое применение. В частности, для карбазолов в литературе была отмечена весьма значительная антимикробная и противоопухолевая активность; псоралены и ангелицины в последнее время достаточно активно используют в фотохемотерапии (в частности, псориаза), для обеззараживания крови, для сайт направленной модификации РНК и иных целей;  ряд представителей фенилиндолов и бисбензимидазолов служат коммерческими флуоресцентными красителями на ДНК; а феноксазиновый фрагмент является хромофором известного антибиотика актиномицина D.

И наконец, учитывая реалии настоящего времени в нашей стране, в ряде случаев приходилось просто исходить из возможностей практического осуществления синтеза того или иного соединения.

При этом коммерческие флуорофоры X, XI, XX, XXII и XXXI были получены от фирмы «Serva» (Германия), а остальные соединения синтезированы сотрудниками Российского химико-технологического университета и Санкт-Петербург-ского государственного технологического института (причем, в значительной части впервые). Чистота синтезируемых соединений оценивалась по спектрам ЯМР 1Н (которые записывались на спектрометре «Bruker АС-200» с рабочей частотой 200 МГц в дейтерохлороформе с ТМС, в качестве внутреннего стандарта, и диметилсульфоксиде) и масс-спектрам (которые записывались на приборе «SSQ-710 Finnigan-MAT» при энергии ионизирующего излучения 70 эВ);  протекание реакций контролировалось с помощью ТСХ на пластинах «Silufol UV-254» (элюент – хлороформ);  а хроматографическое разделение проводили на силикагеле (элюент – хлороформ). Характер взаимодействия исследуемых красителей с ДНК (интеркаляционный либо неинтеркаляционный) удостоверялся на основании данных по вискозиметрии и оптической анизотропии ДНК в связанном и несвязанном с флуорофором состоянии. 

В качестве стандартного (St-) субстрата использовалась ДНК тимуса теленка (обрабатываемая после растворения ультразвуком так, чтобы средняя масса одного полинуклеотидного фрагмента составляла 35000 Да);  в качестве стандартного буфера – водный раствор, содержащий 0,01М NaCl + 0,01M Na2EDTA  +  0,01M Tris (pH 7,4);  а в качестве лизирующей смеси (применяемой для того, чтобы нарушить целостность клеточных стенок, а также внешних клеточных и ядерных мембран и таким образом обеспечить доступ красителя из «внешнеклеточного» раствора к внутриклеточной ДНК) – водный раствор, содержащий 2М NaCl + 0,1M Na2EDTA + 0,01M Tris + 0,5% (по объему) Triton Х-100 (pH 8,0). При этом вышуказанные реактивы в основном были также получены от фирмы «Serva»… либо использовались с маркой «Х.Ч.».

Спектры поглощения и флуоресценции регистрировались на приборах «Beckman-35» (Австрия) и «Hitachi-850» (Япония). При этом спектры флуоресценции регистрировались при длинах волн, соответствующих наибольшим максимумам возбуждения и эмиссии соединения при каждом конкретном измерении. Квантовые выходы флуоресценции  (φ – выражающие отношение числа квантов света, испущенных при флуоресценции всеми молекулами красителя в рассматриваемой системе, к числу квантов света, поглощенных теми же молекулами непосредственно перед этим) определялись относительным методом с использованием в качестве стандарта раствора сульфата хинина в 1 М серной кислоте (φ=0,55) по формуле: φ2/φ1=(I2A1)/(I1A2), где в качестве A и I брались максимальные, регистрируемые на сравниваемых спектрах поглощательная способность и интенсивность флуоресценции, соответственно.

Параметры комплексообразования красителей с St-ДНК: константа адсорбции K (имеющая величину, обратную концентрации свободного лиганда в системе, когда им занята на субстрате половина потенциальных мест связывания) и «коэффициент специфичности» n (имеющий величину максимально возможного числа молекул лиганда, которое может быть связано одной молекулой НК, деленного на общее число пар нуклеотидов в последней) – рассчитывались по модели Скэтчарда на основании данных флуориметрического титрования в St-буфере при соотношениях молярных концентраций субстрата (ДНК) и лиганда CS/CL>>1 – чтобы исключить влияние на эти данные неспецифического типа связывания красителя с ДНК, а также «статистического» и «кооперативного» эффектов, учитываемых более «продвинутыми» теоретически по сравнению с моделью Скэтчарда, но и значительно более критичными к качеству экспериментальных данных моделями адсорбции mcGhee–vanHippel, Crothers, Заседателева–Гурского и др. (см. рис.16).

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Спектральные и комплексообразующие с НК свойства

синтетических потенциально флуоресцентно-активных

и нуклеотид-специфичных соединений

Как уже отмечалось, в последнее время в отраслях науки и практики, так или иначе связанных с молекулярной биологией, биотехнологией и т.п. соединениям, способным специфически связываться с определенными последовательностями нуклеотидов в геноме, уделяется все большее внимание. Связано это в первую очередь с тем, что такие соединения могут быть (и используются) при лечении различных онкологических, инфекционных, генетически обусловленных заболеваний, в качестве радиопротекторов, в качестве антисептических препаратов (например, в системах обеззараживания крови), в исследовательских целях (например, для блокировки различных участков нуклеиновых кислот) и т.д. Но если рассматриваемые соединения помимо высокого сродства и избирательности к определенным участкам НК обладают также удобными для регистрации свойствами, то сфера их применения еще более расширяется.

Рис.2. Схема первичной структуры молекулы ДНК. Условные обозначения:

и – первая и вторая цепи ДНК; ВС – водородные связи.

Рис.3. Пример третичной структуры молекулы ДНК прокариота.

Рис.4. Схема взаимодействия с ДНК типичных интеркалятора ЕБ  и неинтеркалятора Хт


Таблица 1. Свойства

1,2,3,4-тетрагидрокарбазолов

Примечания. ε1см1) – молярный коэффициент поглощения (определялся при длине волны, соответствующей максима-льному пику в спектре поглощения); φ – квантовый выход флуоресценции; K1) и n – константа адсорбции и коэффициент "специфичности", рассчитанные по модели Скэтчарда для комплекса красителя с St-ДНК в St-буфере (см. "Материалы и методы"); индексами обозначены: 2-пропанол (Р), а также St-буфер в отсутствие St-ДНК (W) и в присутствии насыщающего краситель ее количества (D). 

Таблица 2. Свойства 4,8,4'-триметилпсораленов IV–VI

и 4,4'-диметилангелицинов VII–IX

Соед.

IV

V

VI

VII

VIII

IX

εw330 ×104

0,83

0,91

0,75

0,93

0,98

0,85

φw

  0,096

  0,13

  0,19

  0,069

  0,10

  0,13

φР

  0,29

  0,29

  0,30

  0,25

  0,25

  0,26

φР/φw

3,0

2,6

1,5

4,1

3,1

2,2

φD

0,24

0,24

0,25

0,21

0,21

0,22

φD/φw

2,4

2,1

1,3

3,0

2,4

1,7

K1 ×106

0,035

0,031

0,017

0,067

0,064

0,044

n1 ×103

120

110

99

210

240

260

K2 ×106

0,0045

0,0039

0,0021

0,0088

0,0081

0,0055

n2 ×103

39

37

35

75

83

90

K3 ×106

0,019

0,018

0,0093

0,037

0,035

0,024

n3 ×103

28

27

24

53

58

63

Примечания.  Индексами (1)–(3) обозначены параметры, рассчитанные по модели Скэтчарда для типов связывания рассматриваемых лигандов с St-ДНК, превалирующих в St-буфере при соотношениях молярных концентраций ДНК и красителя (CS/СL): 3–20 (1), 20–65 (2) и 65–100 (3), соответственно. Остальные обозначения – как в табл.1.

+

Рис.5. Спектры поглощения (аb), а также возбуждения флуоресценции (ex) и эмиссии (em) соединений I и IV в St-буфере в присутствии St-ДНК.  Условные обозначения: CS/СL – отношения молярных концентраций ДНК/лиганд, соответствующие указанному типу кривых; λи – изобестические точки.  Концентрация соединений: 4106 М.  В тех же условиях спектры тетрагидрокарбазолов II–III по своему характеру сходны со спектрами, приведенными для соединения I;  а спектры триметилпсораленов V–VI и диметилангелицинов VII–IX – со спектрами соединения IV.

Таблица 3. Свойства 2-фенилиндолов X–XI и 2-фенилбензимидазолов XII–XIV

Соед.

X

XI

XII

XIII

XIV

λwab

340

355

330

330

330

λdab

350

365

330

340

340

λwem

455

465

450

455

455

λdem

455

450

450

455

455

εw ×104

2,0

1,7

3,1

1,6

0,52

φw

0,0063

0,0078

0,23

0,0047

0,0038

φd

0,20

0,22

0,13

0,10

0,09

φd/φw

24

32

0,55

24

23

K ×106

4,9

8,4

14

7,8

  7,9

n ×103

26

6,9

4,1

  6,5

  6,6

Примечания.  λab и λEM (нм) – обозначают длины волн максимумов в спектрах поглощения и флуоресцентной эмиссии соединения, соответственно. Остальные обозначения – как в табл.1. Кроме отмеченных в таблице, у указанных соединений в водных средах имеются также меньшие по интенсивности пики в спектрах поглощения (и соответственно, возбуждения флуоресценции) с максимумами в диапазоне длин волн 265–275 нм.

Таблица 4. Свойства 2-фенилбензоксазолов XV–XVI

и  2-фенилбензтиазолов XVII–XIX

Соед.

XV

XVI

XVII

XVIII

XIX

λab

325

340

350

340

370

λem

390

510

520

445

465

εw ×104

1,5

0,60

1,7

1,3

2,6

φw

0,87

0,13

0,07

0,55

0,66

φd

0,074

0,072

0,053

0,055

0,056

φd/φw

0,085

0,55

0,76

0,10

0,085

Примечания.  Условные обозначения – как в табл.1,3. У соединения XVI имеется дополнительный пик при λem=400 нм, а λab при связывании с ДНК сдвигается до 345 нм. У соединения XVII имеются дополнительные пики при λab=315 нм и λem=430 нм, а λab=350 нм при связывании с ДНК сдвигается до 355 нм.  Кроме того, у указанных соединений в водных средах имеются также меньшие по интенсивности пики в спектрах поглощения (и соответственно, возбуждения флуоресценции) с максимумами в диапазоне длин волн 260–280 нм.

Рис.6. Спектры поглощения (аb), возбуждения флуоресценции (ex) и эмиссии (em) 2-фенилиндола X и 2-фенилбензимидазола XII в St-буфере в присутствии St-ДНК. Условные обозначения – как на рис.8. Концентрация красителей: 6,4107 М. Спектры соединений XI, XIII, XIV по своему характеру сходны со спектрами, приведенными для соединения X.

Рис.7. Спектры поглощения (аb) и флуоресцентной эмиссии (em) 2-фенилбенз-оксазолов XV–XVI и 2-фенилбензтиазолов XVII–XIX в St-буфере в отсутствие St-ДНК (CSL=0) и в присутствии насыщающего краситель ее количества (CSL=200). Концентрация соединений: 105 М. Пики в спектрах возбуждения флуоресценции соединений XV–XIX совпадают с пиками в спектрах их поглощения.

Таблица 5. Свойства бисбензимидазолов

Соед.

XX

XXI

XXII

XXIII

XXIV

λwab

345

350

345

360

330

λdab

355

355

350

370

350

λwem

500

500

495

555

400

λdem

455

455

455

500

400

εw ×104

2,7

3,6

2,4

1,7

1,3

φw

0,011

0,0091

0,013

0,0086

0,051

φd

0,49

0,48

0,50

0,40

0,42

φd/φw

44

53

40

46

10

φс/φw

7,0

6,8

7,1

10

2,0

K ×106

  4,6

  4,6

  4,6

4,2

7,2

n ×103

  8,9

  9,0

11

16

8,4

Примечания. Индексом (С) обозначены параметры, определявшиеся в 50% (по массе) растворе сахарозы в St-буфере. Остальные обозначения – как в табл.1,3.  Помимо отмеченных в таблице, у указанных соединений имеются также меньшие по интенсивности пики в спектрах поглощения (и соответственно, возбуждения флуоресценции) с максимумами в диапазоне длин волн 260–280 нм. Кроме того, у соединения (XXIV) в спектрах флуоресцентной эмиссии имеются дополнительные максимумы при длинах волн: 380, 420 и 450 нм;  а при соотношении молярных концентраций ДНК и красителя CS/СL>160 имеет место дополнительный тип связывания с субстратом, сопровождающийся уменьшением интенсивности и квантового выхода флуоресценции при дальнейшем увеличении CS/СL в системе.

Таблица 6.  Свойства 2-амино-3Н-3-оксофеноксазинов

Соед.

XXV

XXVI

XXVII

XXVIII

XXIX

XXX

εw ×104

0,68

0,59

0,71

0,76

0,69

0,72

φw

  0,0093

0,0081 

0,0067 

0,013

0,0085

0,041

φd

0,11

0,11

0,10

0,12

0,11

0,13

φd/φw

12

14

15

9,2

13

3,3

φР/φw

  1,2

0,32

0,10

0,13

0,83

0,21

Примечания.  Индексами обозначены 2-пропанол (Р) и St-буфер с рН=8,0 в отсутствие St-ДНК (W) и в присутствии насыщающего краситель ее количества (D).  Остальные обозначения – как в табл.1,3.  В водных средах у указанных соединений имеются в спектрах поглощения пики с максимумами при длинах волн: 270, 330 (у соединения XXVI – 315) и 440 (у соединений XXIX и XXX – 450, а у соединения XXVI – 430 и 450) нм  –  наиболее длинноволновый из которых в спектрах возбуждения флуоресценции не дублируется,  а остальным в спектрах флуоресцентной эмиссии соответствуют пики с максимумами при длинах волн: 400 (у соединений XXVII и XXVIII – отсутствует) и 470 (у соединений XXVII и XXVIII – 450) нм.

Рис.8. Спектры поглощения (аb), возбуждения флуоресценции (ex) и эмиссии (em) бисбензимидазолов XXIII и XXIV в St-буфере в присутствии St-ДНК. Условные  обозначения  –  как на рис.5. Концентрация красителей: 6,4107 М. Спектры соединений XX–XXII по своему характеру сходны со спектрами, приведенными для соединения XXIII.

Рис.9. Спектры поглощения (аb), возбуждения флуоресценции (ex) и эмиссии (em) соединения XXV в несвязанном с ДНК состоянии в St-буфере с различными значениями рН.  Концентрация красителя: 7,6105 М. При взаимодействии с ДНК спектральные свойства соединения XXV изменялись также, как и при увеличении pH. Сходным было и поведение соединений XXVI–XXIX. Соединение же XXX хотя и взаимодействовало с ДНК аналогичным образом, при изменении рН свои спектральные свойства меняло незначительно (вследствие, очевидно, отсутствия у его молекулы возможности образовывать S2-форму, аналогичную показанной на рис.12).

Рис.10. Спектры флуоресцентной эмиссии соединений XXV–XXVII в несвязанном с ДНК состоянии в St-буфере с рН 8,0. Спектры флуоресцентной эмиссии: у соединения XXVIII сходны со спектрами соединения XXVII, а у соединений XXIX–XX – со спектрами соединения XXV. Спектры же поглощения и возбуждения флуоресценции соединений XXVI–XXX в несвязанном с ДНК состоянии сходны с аналогичными спектрами, показанными на рис.8 для соединения XXV.

Рис.11. Спектры флуоресцентной эмиссии соединения XXVIII в несвязанном с ДНК состоянии в St-буфере с  рН 7,0 (W) и в 2-пропаноле (Р). Спектры флуоресцентной эмиссии соединений XXV–XXX в 2-пропаноле аналогичны показанным для соединения XXVIII. А спектры пог-лощения соединений XXV–XXX в 2-пропаноле мало отличаются от аналогичных спектров для этих соединений в несвязанном с ДНК состоянии в St-буфере с рН 7,0.

Рис.12. Вероятные структуры равновесных форм, в которых актиноцины XXV–XXIX на-ходятся в водной среде с нейтральным рН, и схема взаимопереходов между ними.  Пунктиром обозначены возможные водородные связи.

Рис.13. Зависимость величины коэффициента флуоресцентной чувствительности (η – отражающего приращение интенсивности флуоресценции красителя при увеличении концентрации ДНК в растворе на 1 M) от соотношения молярных концентраций субстрат/лиганд в системе (CS/CL) в St-буфере для 10 соединений X–XIV и XX–XXIV (демонстрировавших среди исследованных в настоящей работе красителей наибольшее относительное изменение квантового выхода флуоресценции при связывании с полинуклеотидом).

Рис.14.  Зависимости между комплексообразующими и спектральными свойствами соединений X–XIV и XX–XXIV в St-буфере в присутствии St-ДНК.  Точками показаны данные, вычисленные непосредственно на основании эксперимента, для соответствующих соединений. Кривыми 16 показаны зависимости вида:

1К=4,72106+139,6/n2  (r=0,850, α<0,01 – где r – коэффициент корреляции,  α – уровень достоверности)  для бензазолов X–XIV и XX–XXIV,

2К=5,29104/n  (r=0,815, α<0,01)  для «бензазолов» X–XIV и XX–XXIV,

4η10=–5,38106+4,831013/K (r=0,994, α<0,01) для «монобензазолов» X и XII–XIV,

5η10=6,311060,30K (r=–0,815, α<0,05) для бисбензимидазолов XX–XXIV,

6η100=7,311055,80109K2 (r=–0,911, α<0,05) для «монобензазолов» X–XIV.

Остальными кривыми показаны зависимости, полученные после «сглаживания» данных для  бисбензимидазолов XX–XXIV (8); а также «бензазолов» X–XIV и XX–XXIV (9), соответственно. Прочие обозначения – как в табл.1 и на рис.13.

Рис.15. Ряд «внешних» заместителей, построенный в порядке убывания их электроноакцепторной (и возрастания затем электронодонорной) активности по отношению к хромофорной системе красителя.

Рис.16. Пример расчета параметров комплексообразования соединения VI с St-ДНК в St-буфере по модели Скэтчарда (ri/mi=Kn–Kri). Точками обозначены экспериментальные данные; прямыми 13  – расчетные зависимости  для соответствующих типов комплексов краситель–ДНК;  ri=СbL,i/СS,imi=СLСbL,iСS,i и СL – общие молярные концентрации ДНК и лиганда в системе, СbL,i=СL(IiI0)/(ImI0) – концентрация связанного с ДНК лиганда,  Im,1, Im,2 и Im,3 – значения максимально возможных интенсивностей флуоресценции для соответствующих типов комплексов краситель–ДНК; I0,3 – «нулевая» интенсивность флуоресценции для 3-го типа комплекса красителя с ДНК.

Рис.17. Спектры флуоресцентной эмиссии системы «Хт+ЕБ», регистрируемые при длине волны возбуждения λex=350 нм в St-буфере (а) и в растворе, содержащем 19 частей (по объему) St-буфера на 1 часть лизирующей смеси (б), в присутствии различных количеств St-ДНК. Сплошной кривой на рис.б показан спектр, снятый для Хт в отсутствие как ДНК, так и ЕБ (на рис.а аналогичный вид имел бы спектр, регистрируемый для Хт в присутствии ДНК, но в отсутствие ЕБ).  Условные обозначения: CS/СL – отношения молярных концентраций ДНК/лиганд, соответствующие указанному типу кривых.  Концентрации: Хт – 106 М, ЕБ – 8106 М.

Тут и различные системы диагностики, включающие количественный и качественный анализ НК тех или иных клеток организма в сопоставлении с различными его состояниями, и научные исследования (в том числе с применением меток на НК, не нарушающих жизнедеятельность организма, позволяющих следить за состоянием объекта в динамике,  в обычных для него условиях), и экологический мониторинг и многое другое.

При этом если характер собственно взаимодействия с субстратом синтетических ДНК-специфичных соединений изучен к настоящему времени уже достаточно хорошо; то механизмы изменения свойств, пригодных для регистрации вышеупомянутого взаимодействия низкомолекулярных лигандов с ДНК, исследованы в значительно меньшей степени... И не только потому, что сами эти свойства могут быть весьма различны... Наибольшее в данной области количество работ посвящено в последнее время красителям, способным резко изменять интенсивность своего свечения при специфическом взаимодействии с полинуклеотидом, которые выгодно отличает от прочих сочетание простоты регистрации с достаточно высокой её чувствительностью и избирательностью... Однако, даже тут достаточно разработанной теоретической базы, позволяющей заранее предсказывать свойства и особенности поведения того или иного красителя, и соответственно, конструировать, а не подбирать эмпирически новые лиганды с требуемыми свойствами, пока ещё не существует. Решению этой проблемы и посвящена первая часть настоящей работы.

1.1. Комплексообразующие с НК свойства синтетических красителей

Всё многообразие известных в настоящее время соединений, специфически и в тоже время обратимо–нековалентно связывающихся с двухцепочечными участками НК, по типу взаимодействия с субстратом подразделяется в основном на два больших класса: интеркаляторы и так называемые «внешнесвязывающиеся» с НК соединения.  При этом интеркаляторы (к которым из исследовавшихся в настоящей работе относятся флуорофоры I–IX и XXV–XXXI, основные спектральные и комплексообразующие с ДНК свойства которых приведены в табл.1,2,6 и на рис.5,9-12) встраиваются внутрь двойной спирали полинуклеотида (что приводит к локальному раскручиванию вышеупомянутой спирали и её удлинению), специфичны в основном ко вторичному и более высоким порядкам организации структуры НК и занимают при связывании на субстрате по две комплементарных пары оснований на один связывающийся с НК фрагмент молекулы лиганда.  В то время как «внешнесвязывающиеся» соединения (к которым из исследовавшихся в настоящей работе относятся флуорофоры X–XXIV, основные спектральные и комплексообразующие с ДНК свойства которых приведены в табл.3-5 и на рис.6-8) присоединяются к молекуле полинуклеотида «снаружи», не нарушая целостности структуры субстрата (хотя при этом и происходит некоторое сжатие, а также локальное изменение аллостерической конформации двойной спирали ДНК в области связывания с ней), занимают на нём как правило три и более комплементарных пар оснований на одну молекулу лиганда и специфичны в наибольшей степени к первичному и вторичному порядкам организации структуры НК…  Однако, следует помнить, что вышеупомянутое деление по типу взаимодействия в значительной степени условно.

Во-первых, потому что связывание лиганда с субстратом происходит, как правило, в несколько этапов…  Так, в частности, соединения псораленового и ангелицинового рядов (к которым из исследовавшихся в настоящей работе относятся флуорофоры IV–IX) первоначально достаточно «слабо и малоспецифично» взаимодействуют с одной из цепей НК. Этот тип взаимодействия характерен для большинства НК-связывающихся соединений (которые занимают при этом, как правило, на субстрате одну или даже менее комплементарных пар оснований на одну молекулу лиганда) и обуславливается в основном образованием как ван-дер-вальсовых, так и иных электростатических связей между молекулой красителя и отрицательно заряженным фосфатным остовом полинуклеотида (сопровождающимся, как правило, уменьшением интенсивности как поглощения, так и флуоресценции связанного с ДНК красителя относительно несвязанного)...  Затем, вышеуказанные соединения обратимо интеркалируют между двумя комплементарными друг другу цепями НК (при этом, как правило, псоралены более предпочтительно связываются с АТ-богатыми областями, а ангелицины – неспецифичны к первичной структуре НК). При этом стабилизация данного типа комплексов происходит как за счёт межплоскостных (стэкинг) взаимодействий молекулы лиганда с нуклеотидами, между которыми он интеркалируется, так и за счёт

уже описанных электростатических сил (вызывающих, однако, образование уже не только ионных, как в ранее упомянутом случае «малоспецифического» взаимодействия, но и водородных связей между наиболее электроноизбыточными атомами азота или кислорода лиганда и соответствующими гетероатомами азотистых оснований полинуклеотида)…  И наконец, после достаточно длительного (до 1 ч) облучения в области длин волн 250–370 нм, рассматриваемые соединения могут связываться с НК также необратимо–ковалентно.

Во-вторых, в растворе достаточно часто одновременно наличествуют нес-колько типов комплексов «одних и тех же» лиганда и субстрата (причем, в зависимости от соотношения молярных концентраций лиганда и субстрата, а также состава раствора, его вязкости, температуры, рН, ионной силы и т.д. – количественное соотношение вышеназванных комплексов в системе может изменяться в весьма широких пределах). Так, в частности, для уже упоминавшихся выше соединений IV–IX, исследовавшихся в настоящей работе, было отмечено, как минимум, по три «тонких» типа обратимого интеркаляционного специфического взаимодействия с полинуклеотидом, превалирующих при различных соотношениях концентраций ДНК и красителя (см. табл.2)… причем триметилпсоралены IV–VI при связывании с ДНК демонстрировали сродство к субстрату (определяемое величинами Ki из табл.2) примерно в 2 раза меньшее и специфичность по отношению к полинуклеотиду (определяемую величиной 1/ni из табл.2) примерно в 2 раза большую, чем аналогичные им диметилангелицины VII–IX.

И в третьих, НК-связывающийся лиганд может иметь не один, а несколько непосредственно взаимодействующих с субстратом фрагментов. Причем фрагменты эти могут быть как в достаточной степени «однородны» (как в случае например исследовавшихся в настоящей работе бисбензимидазолов XX–XXIV), так и весьма различны по своим комплексообразующим и спектральным свойствам (как в случае например исследовавшегося в настоящей работе соединения XXXII).

1.2. Общий механизм изменения флуоресцентных свойств

НКспецифичных соединений

Если систематизировать на основе универсального структурно–химического подхода, принятого в целом для органических красителей, новые данные, полученные в ходе настоящей работы для более 30 синтетических флуорофоров на ДНК, а также значительное количество имеющихся на данный момент для подобных соединений наработок других авторов – то общий механизм изменения флуоресцентных свойств низкомолекулярных нуклеотид–специфичных красителей заключается, по-видимому, в следующем.

Во-первых, активно светиться способны, как правило, только структуры с развитой сопряженной электронной системой, включающей в себя как π-электроны кратных связей, так и неподеленные n-электроны гетероатомов (которые собственно и имеют карбазольная, псораленовая, ангелициновая, индольная, бензазольная, феноксазиновая и т.д. хромофорные группы всех исследованных в настоящей работе соединений).

Во-вторых, такое сопряжение достигается обычно лишь, когда вышеуказанная электронная система имеет достаточно жесткую копланарную структуру. Если же это условие «непосредственно» не соблюдается (как в случае например исследованных в настоящей работе бисбензимидазолов XX–XXIV), необходимо наличие дополнительных факторов, обеспечивающих стабилизацию плоскостной структуры молекулы (что уменьшает безизлучательные потери энергии, поглощенной молекулой красителя, за счет взаиморотации друг относительно друга отдельных составляющих ее фрагментов и увеличивает соответственно вероятность радиационных переходов электронов из возбужденного состояния в основное).  При этом в качестве основных таких факторов можно назвать:  специфическое взаимодействие красителя с субстратом;  значительную вязкость среды, в которой находится молекула красителя (как например в случае 50% водного раствора сахарозы);  наличие у молекулы красителя определенных «внешних» заместителей (таких например как карбамоильные) и т.п.

В-третьих, если даже хромофорная система молекулы обладает достаточно развитой и жесткой сопряженной электронной структурой – квантовый выход флуоресценции (φ) такой молекулы в несвязанном состоянии, в полярном растворителе может быть уменьшен введением «внешних» заместителей, электроноакцепторных по отношению к хромофору (т.е. оттягивающих на себя часть электронной плотности хромофорной системы красителя), либо соответственно увеличен, если вводимый заместитель будет проявлять электронодонорный по отношению к хромофору характер. При специфическом же взаимодействии с полинуклеотидом (либо в средах с низкой диэлектрической проницаемостью – таких например, как 2-пропанол) вышеописанное влияние «внешних» заместителей на хромофорную систему лиганда в значительной мере ослабляется – и в результате, наблюдаемый общий φ красителя становится ближе по величине к φ его хромофорной системы в отсутствие каких-либо заместителей.

И наконец, нередко (как в случае например исследованных в настоящей работе фенилмонобензазолов XV–XIX и оксофеноксазинов XXV–XXX) одно и тоже соединение может присутствовать в растворе одновременно в нескольких равновесных формах, различающихся степенью ионизации хромофорной системы и ее заместителей, количеством внутри- либо межмолекулярных водородных связей и т.д. Причем соотношение концентраций этих форм способно меняться в зависимости от величины рН раствора, характера растворителя и т.д. Вследствие этого, общая картина получается еще более сложной.

  Для подтверждения вышесказанного можно привести в частности следующие факты, имевшие место для исследовавшихся в настоящей работе флуорофоров на ДНК…  Значения φ красителей I–III в 2-пропаноле и в водной среде в связанном с ДНК состоянии больше и ближе друг к другу по величине, чем аналогичные значения для тех же соединений в водной среде в несвязанном с полинуклеотидом состоянии… а последние увеличиваются с уменьшением электроноакцепторного характера модифицируемого заместителя по отношению к полициклической тетрагидрокарбазольной хромофорной системе красителя (см. табл.1 и рис.5).

У соединений IV–IX значения квантовых выходов флуоресценции соединений IV–IX в St-буфере в несвязанном (φW), а также в связанном с ДНК состоянии(φD) по отношению к несвязанному увеличиваются с уменьшением электроноакцепторного характера «внешних» заместителей по отношению к полициклической хромофорной системе красителя, а также в зависимости от характера самого хромофора (4,8,4'-триметилпсоралены IV–VI имеют несколько большие величины φW, чем аналогичные им 4,4'-диметилангелицины VII–IX) (см. табл.2 и рис.5)…  При этом наибольшая среди соединений IV–IX «электроотрицательность» по отношению к хромофорной системе красителя именно гидроксимино–группы определяется очевидно как усилением электроноакцепторных свойств атома азота за счет дополнительной гидроксильной группы, так и возможностью образования внутримолекулярной водородной связи между этой группой и атомом кислорода фурокумаринового кольца. Оксо–группа в большей степени, чем гидроксильная, оттягивает на себя электронную плотность фурокумаринового «ядра» за счет большей кратности своей с ним связи. А  метокси–группа проявляет электроноакцепторные свойства в наименьшей степени  вследствие того, что входящий в ее состав «электроотрицательный» (по отношению к углероду) атом кислорода имеет возможность заимствовать электронную плотность не только от фурокумаринового «ядра», но и от метильной группы.

2-фенилиндол X – амидиновые терминальные заместители которого являются более сильными акцепторами электронной плотности, чем имидазолиновые группы 2-фенилиндола XI – имеет и меньшую по сравнению с последним величину φW. При этом для тех же соединений (X и XI) значения φD весьма близки друг к другу и, в тоже время, примерно в 2 раза больше, чем у 2-фенилбензимидазолов XII–XIV – потому очевидно, что π-избыточный индольный фрагмент, входящий в состав хромофорной системы соединений X и XI, обладает более сильными и устойчивыми флуоресцентными свойствами, чем аналогичный бензимидазольный фрагмент соединений XII–XIV, проявляющий π-амфотерные свойства (см. табл.3 и рис.6)…  Кроме того, соединение XII имеет среди исследовавшихся в настоящей работе 2-фенилбензимидазольных производных наиболее высокое значение φW=0,23 и уменьшает интенсивность и квантовый выход флуоресценции при связывании с ДНК – вследствие очевидно, наличия двух «внешних» амино–групп, проявляющих по отношению к связанной с ними фенилбензимидазольной хромофорной системе электронодонорные свойства. В тоже время, соединение XIII, отличающееся от вышеупомянутого соединения XII только наличием у бензимида зольного конца своей молекулы вместо амино–группы – амидинового заместителя (проявляющего по отношению к полициклической хромофорной системе этого соединения электроноакцепторные свойства), имеет уже значительно меньшую величину φW=0,0047. Однако, при специфическом взаимодействии соединения XIII с полинуклеотидом величина его квантового выхода флуоресценции в водной среде увеличивается почти до той же величины (φD=0,1), которая наблюдается у связанного с ДНК красителя XII. Аналогично ведет себя и соединение XIV, у которого и вторая «терминальная» амино–группа (у фенильного конца молекулы) заменена на нитрогруппу (проявляющую по отношению к связанной с ней хромофорной системе красителя электроноакцепторные свойства). При этом его φW=0,0038 – наименьший по величине среди рассматриваемых здесь 2-фенилбензимидазольных производных.

У бисбензимидазолов XX–XXIII (см. табл.5 и рис.8) и фенильный, и оба бензимидазольных фрагмента, способных к активной флуоресценции, имеют возможность для активной взаиморотации – вследствие чего эти соединения несмотря на очевидно электронодонорный характер своих «терминальных» групп по отношению к связанной с ними фенилбисбензимидазольной хромофорной системе имеют весьма малые величины квантовых выходов флуоресценции в водном буфере в несвязанном с ДНК состоянии (φw)… восстанавливая их до значений, значительно превышающих аналогичные величины для фенилмонобензимидазолов XII–XIV лишь при специфическом связывании с ДНК…  либо например при добавлении в раствор сахарозы (увеличивающей вязкость среды и, вследствие того, стабилизирующей планарную структуру фенилбисбензимидазольной хромофорной системы). В тоже время, у соединения XXIV длинные, разветвленные, гидрофильные диметиламинопропилкарбамоильные «терминальные» группы, взаимодействуя с молекулами воды, стабилизируют планарную структуру фенилбисбензимидазольной хромофорной системы – вследствие чего очевидно, квантовый выход флуоресценции в водном буфере в несвязанном с ДНК состоянии (φw) у соединения XXIV примерно в 5 раз больше, чем у остальных исследованных в настоящей работе бисбензимидазолов… но тем не менее в 10 раз меньше, чем в связанном с ДНК состоянии соединения XXIV (φd) – поскольку вышеупомянутые карбамоильные группы имеют все же очевидно электроноакцепторный характер по отношению к связанной с ними фенилбисбензимидазольной хромофорной системе. Подтверждает вышесказанное и то, что отношение квантовых выходов флуоресценции в несвязанном с ДНК состоянии в водном буфере с добавлением сахарозы и без нее (φс/φw) для соединения XXIV было значительно меньшим, чем для остальных исследованных бисбензимидазолов.

Если сравнить свойства бензоксазолов XV–XVI и бензтиазолов XVII–XIX (см. табл.4 и рис.7), то можно видеть, что у всех этих соединений имеет место уменьшение как интенсивности, так и квантового выхода флуоресценции при специфическом взаимодействии с полинуклеотидом в водной среде;  φD у бензоксазолов XV и XVI больше по величине, чем у бензтиазолов XVII–XIX и меньше, чем у бензимидазолов XII–XIV;  а кроме того, у бензоксазола ХVI φW=0,13 существенно меньше, чем у бензоксазола ХV (φW=0,87) – что может быть объяснено тем, что модифицируемая амино–группа соединения ХVI находится в растворе, по-видимому, предпочтительно в протонированной H3N(+) форме, проявляющей по отношению связанному с ней фенилбензоксазольному фрагменту электроноакцепторные свойства… в то время как вторая, немодифицируемая «внешняя» амино-группа бензоксазолов (ХV) и (ХVI) находится в растворе предпочтительно в неионизированной форме, проявляющей по отношению к хромофорной системе этих соединений электронодонорные свойства.  Аналогично, факт, что при замене амино–группы соединения XVII на карбоксильную у соединения XVIII φW существенно увеличивается (от 0,07 до 0,55), может быть объяснен тем, что хотя карбокси–группа в неионизированном состоянии должна проявлять по отношению к связанному с ней фенилбензтиазольному фрагменту электроноакцепторные свойства, в депротонированной ()ООС форме характер влияния данной группы на хромофорную систему красителя становится электронодонорным.  И наконец, для случая красителей XVIII (φW=0,55) и XIX (φW=0,66) определяющим фактором оказалось очевидно то, что «внешняя» диметиламино–группа последнего в ионизированной форме является более слабым акцептором, а в неионизированной форме – более сильным донором электронной плотности фенилбензтиазольного «ядра», чем аналогичная амино–группа соединения XVIII в соответствующих формах.

И наконец, у всех рассматривавшихся в настоящей работе 2-амино-3Н-3-оксофеноксазинов (соединения XXV–XXX; см. табл.6 и на рис.9-12), кроме последнего («терминальные» диметиламино–группы которого не способны к образованию водородных связей), в St-буфере, в несвязанном с ДНК состоянии с увеличением рН раствора от 6 до 9:  во-первых, значительно увеличивается интенсивность флуоресценции (так что с помощью вышеозначенных соединений,при желании, можно было бы даже измерять рН растворов… хотя величины квантовых выходов у флуорофоров XXV–XXIX с изменением рН и оставались постоянными);  а во-вторых, столь же значительно изменяется и спектр поглощения (причем не  только по амплитудам, но и по длинам волн максимумов пиков – что приводит к заметному даже «невооруженным глазом» изменению цвета раствора) (см. рис.9)… что может быть объяснено тем, что большинство из рассматриваемых здесь феноксазинов присутствуют в водной среде одновременно в нескольких равновесных формах – одни из которых (S1) превалируют при щелочных значениях рН, поглощают свет в диапазоне длин волн от 250 до 350 нм и способны к сравнительно активной флуоресценции;  в то время как другие (S2 – с бо'льшим количеством внутримолекулярных водородных связей, приводящим к снижению электрононасыщенности феноксазинового «ядра» молекулы) превалируют при кислотных значениях рН, поглощают свет в диапазоне преимущественно от 400 до 500 нм и способностью к флуоресценции не обладают…  А кроме того, для рассматриваемых феноксазинов следует отметить неоднозначный характер изменения φW с уменьшением электроноакцепторной способности «терминальных» заместителей по отношению к  хромофорной системе их молекулы. В частности, с увеличением числа атомов углерода в модифицируемом «терминальном» заместителе у соединений XXV–XXVII происходит уменьшение величины φW, а у соединения XXVIII – наоборот, увеличение.  Это вызвано вероятно тем, что вышеупомянутое увеличение в ряду соединений XXV–XXVIII «терминального» углеводородного фрагмента, связанного посредством промежуточной карбамоильной группы (RNHCO) с фенокcазиновым «ядром»  –  хотя, с одной стороны, и способствует ослаблению электроноакцепторных свойств карбамоильной группы в наиболее активно флуоресцирующем S1.a состоянии молекул красителя… с другой стороны, повышает для атомов азота и кислорода NHCOгруппы возможность образования водородных связей, что ведет к увеличению в растворе доли менее активно флуоресцирующих S1.b и S1.c субформ молекул красителя (см. рис.12).

1.3. Общие рекомендации по эффективному конструированию

и использованию новых флуорофоров на ДНК

Исходя из вышеизложенного, при конструировании эффективного флуорофора на ДНК необходимо, очевидно, сначала выбрать для него структуру потенциально флуоресцентно активной хромофорной системы, которая должна содержать один или несколько фрагментов, обладающих развитой системой сопряженных связей и включающих в себя, желательно, один или несколько 5- или 6-членных ароматических цикла (обязательно конденсированных, если конструируется интеркалятор) и хотя бы один гетероатом (желательно, эндоциклический азот или кислород), который помимо прочего послужит центром специфического связывания конструируемого красителя с полинуклеотидом.

Такого рода хромофорные системы в обязательном порядке имеются практически у всех известных к настоящему времени флуорофоров, специфических к ДНК. Но кроме того, в составе молекулы будущего красителя должны присутствовать и один или несколько «внешних» заместителей, подобрать оптимальные структуру, количество и расположение которых, как правило, существенно сложней, т.к. они должны:

- не создавать стерических затруднений взаимодействию конструируемого лиганда с субстратом (как в случае, например, трет-бутильных или им подобных структур);

- желательно, обладать гидрофильными свойствами (иначе конструируемый флуорофор будет плохо растворим в водных средах);

- включать в себя функциональные группы, содержащие гетероатомы азота или кислорода (которые смогут служить дополнительными центрами специфического связывания флуорофора с полинуклеотидом);

- и проявлять по отношению к хромофорной системе конструируемого красителя в условиях, при которых будет предположительно происходить его связывание с ДНК, электроноакцепторные свойства, уменьшающие интенсивность флуоресценции красителя в водных средах, в несвязанном с субстратом состоянии в достаточной мере… но не слишком сильно (иначе может например иметь место случай, когда увеличение флуоресценции красителя при специфическом связывании его с субстратом хотя и будет достаточно значительным в относительном выражении, однако слишком мало в абсолютном выражении для достоверной практической регистрации – как в случае исследованных в настоящей работе 2-фенилбензимидазолов XIII и XIV…а кроме того, как показало настоящее исследование, даже при сходном характере «внешних» заместителей имеет место ослабление флуоресцентных свойств в частности в следующем ряду хромофорных групп: «индол < бензимидазол < бензоксазол < бензтиазол»).

Для удобства подбора такие заместители можно например организовать по их относительной электроноакцепторной активности в ряд, подобный тому, который показан на рис.15.  Кроме того, при выборе оптимальной структуры флуорофора на НК следует учитывать насколько спектральные и комплексообразующие свойства рассматриваемого соединения будут чувствительны к изменению условий измерения (температуры, рН, вязкости и т.д.) и присутствию в растворе различных примесей (изменяющих диэлектрическую проницаемость среды, конкурирующих с основным лигандом за места связывания на субстрате, либо наоборот конкурентно связывающимися с лигандом и т.п.);  а также насколько соединение, предполагаемое к широкому использованию в качестве флуорофора на НК, доступно в плане технологии его получения или закупки, хорошо растворимо и устойчиво в растворе (не образует агрегатов, не сорбируется на стенках сосудов) и т.д.

И наконец, исходя из личного опыта, хочется заметить, что для практического использования того или иного соединения в качестве флуорофора на НК важна не столько максимальная величина отношения квантовых выходов флуоресценции рассматриваемого красителя в присутствии и в отсутствие ДНК (φd/φw), сколько к примеру такая величина, как коэффициент флуоресцентной чувствительности (η – отражающий величину приращения интенсивности флуоресценции лиганда при увеличении концентрации субстрата на 1 моль/л при заданном соотношении концентраций субстрата и лиганда) – значение которого не столь сильно зависит от φd/φw, сколько от константы адсорбции красителя на ДНК (K) (см. рис.14)… а главное, от величины соотношения молярных концентраций субстрата и лиганда в системе (CS/CL)... причем максимальную величину, как правило, имеет при малых значениях CS/CL (см. рис.13).

2. Новые методы применения флуоресцентных

нуклеотидспецифичных красителей

2.1. Метод экспрессной оценки  микробной обсемененности жидких сред

Общая микробная обсемененность является одним из важных показателей при оценке санитарно–гигиенического состояния водоемов, мониторинге процесса очистки воды а также иных биотехнологических производств и т.д. Стандартные методы, применяющиеся для этого в настоящее время и включающие в себя: высевание анализируемого материала на питательную среду, инкубирование его затем при постоянной температуре, в стерильных условиях в течение от одних до нескольких суток и последующий подсчет числа образовавшихся колоний микроорганизмов – требуют для своего проведения значительного времени и специализированных стационарных условий.

Разработанный же нами метод оценки общего содержания микроорганизмов в различных жидких средах позволяет проводить анализ практически в «реальном» режиме времени, непосредственно на месте отбора проб… и заключается в следующем. Сначала, к отобранной во флуориметрическую кювету пробе (достаточно 1 мл) добавляем лизирующую смесь (состав см. «Материалы и методы») и определяем фоновую интенсивность флуоресценции образца IФ1 – также, как описано выше для «чистых» красителей и полинуклеотида. Затем, туда же добавляем раствор ДНК–специфичного флуорофора (такого например как коммерческий краситель DAPI – соединение Х на рис.1 – фоновая интенсивность флуоресценции которого IФ2 определяется заранее) и измеряем интенсивность флуоресценции IД, определяемую в наибольшей своей части взаимодействием добавленного к пробе красителя с содержащейся в ней ДНК (ставшей доступной для красителя вследствие добавления к пробе вышеупомянутой лизирующей смеси), а также в некоторой степени другими компонентами микробных клеток. Далее, в качестве «внутреннего стандарта», добавляем  туда же раствор с известной концентрацией St-ДНК в St-буфере (состав см. «Материалы и методы») и определяем получившуюся интенсивность флуоресценции Iсд, изменившуюся относительно IД вследствие взаимодействия содержащегося в пробе флуорофора помимо микробной ДНК также с известным добавленным количеством St-ДНК. После чего, вычисляем общее количество микроорганизмов в пробе как: 

Cm = а0 + а1Х,        где Х=(IДIФ1IФ2)/(IСДIД),

или в более широком диапазоне значений Cm как:       CmаiХi,         i=0÷N,

где коэффициенты а0÷аN определяются по данным калибровки, предварительно проводимой с использованием стандартных образцов с уже известным содержанием в них микроорганизмов (определяемым например по «стандартной высевной» методике), например по методу наименьших квадратов.

Рис.18. Схема флуоресцентного резонансного переноса энергии (FRET) между молекулами Хехста-33258 (Хт) и этидия бромида (ЕБ). Условные обозначения: I – интенсивность флуоресценции; hv1 и hv2  – кванты света, поглощаемый Хт и испускаемый ЕБ, соответственно.

С использованием переносного микрофлуориметра ТКО-100 (фирмы «Serva») данная методика позволила определять общее количество микроорганизмов в пробе начиная с 20 кл/мл, с погрешностью не более 30%, затрачивая не более 10 мин на одно измерение. При этом с 95% вероятностью подтвердилась гипотеза о том, что данные получаемые по нашей методике принадлежат к той же генеральной совокупности, что и данные, получаемые для тех же образцов по стандартной методике, описанной в ГОСТ 18963.  На вышеописанную методику нами был получен патент, а дальнейшая ее разработка осуществлялась при финансовой поддержке гранта PD03-1.3-40 правительства Санкт-Петербурга. 

Так, в частности, если вместо лизирующей смеси при обработке клеток использовать какой-либо антибиотик, образующий канал только во  внешних стенке и мембране клетки, то ДНК–специфичный флуорофор будет окрашивать лишь клетки прокариотов (присутствие которых нежелательно к примеру при производстве пива). Если же вычесть полученные таким образом данные из общего количества микроорганизмов в пробе, определенного с помощью флуорофора на ДНК и лизирующей смеси, как описано выше, то можно будет оценить и количество содержащихся в анализируемом образце эукариотов (присутствие которых нежелательно к примеру при производстве кисломолочных продуктов). Кроме того, на производствах, осуществляемых в стационарных условиях (как например, очистка воды для населения и технических нужд, производство пива и т.д.), для регистрации окрашивания ДНК флуорофором можно использовать не переносной прибор, а например стационарный проточный цитофлуориметр – что позволит не только проводить оценку микробной обсемененности действительно в реальном режиме времени, но и существенно повысить чувствительность такой оценки.

2.2. Анализ ДНК с помощью системы из двух красителей

с согласованными свойствами

Для проверки предположения о том, что при совместном использовании нескольких флуоресцентных, нуклеотид–специфичных красителей с согласованными спектральными и комплексообразующими свойствами можно существенно повысить информативность анализа генома, по сравнению со случаем, когда те же соединения используются по отдельности – была выбрана система из двух таких широко распространенных, коммерческих, флуоресцентных, нуклеотид–специфичных красителей, как этидий бромид (ЕБ) и Хехст-33258 (Хт) (соединения XXXI и XX на рис.1). Первый из которых (ЕБ), как известно, является интеркалятором, прослаивающимся между двумя парами оснований двойной спирали полинуклеотида с некоторым предпочтением к его гуанин–цитозин (GC) богатым участкам, но в основном специфичным ко вторичному и более высоким порядкам организации молекулы ДНК. Тогда как второй (Хт) присоединяется к молекуле ДНК «снаружи» и предпочтительно специфичен к участкам двойной спирали полинуклеотида, содержащим три последовательно расположенных аденино–тиминовых (АТ) и одну GC пары оснований. Кроме того, поскольку в связанном с ДНК состоянии в видимой области спектра длины волн максимумов возбуждения флуоресценции и эмиссии для Хт составляют 350 и 455 нм, а для ЕБ – 520 и 605 нм, соответственно; то между молекулами этих красителей при совместной сорбции их на полинуклеотиде может происходить флуоресцентный резонансный перенос энергии – явление, когда при возбуждении флуоресценции молекул донора энергии (в нашем случае, Хт) светиться начинают не только они, но и молекулы акцептора энергии (в нашем случае, ЕБ), область  длин  волн  возбуждения флуоресценции которого в значительной мере пересекается с областью длин волн флуоресцентной эмиссии донора (см. рис.17-18). При этом эффективность такого переноса энергии (Е) будет зависеть от расстояния между молекулами донора и акцептора энергии (f) как:

Е=f0l/(f0l+fl)

(где f0=const – Форстеровский критический радиус,  а  l  = 2, 4 или 6 – в зависимости от вида диполь-дипольного взаимодействия между молекулами донора и акцептора энергии).

Таким образом очевидно, что при совместном использовании Хт и ЕБ можно оценивать не только общее количество, но и степень изменения структуры ДНК в пробе. При этом в качестве практического примера одной из возможных схем анализа генетического материала с помощью вышеупомянутой системы «Хт+ЕБ» можно предложить следующее.

1) К 0,1 мл пробы (в качестве которой может быть использована например цельная кровь) добавляем 1 мл лизирующей смеси (состав см. «Материалы и методы»), перемешиваем, выдерживаем 5 мин… после чего к 0,1 мл полученного раствора добавляем 2 мл St-буфера. В результате, получаем раствор 1, для которого определяем значения фоновой интенсивности флуоресценции: Iфx,1 (при длинах волн возбуждения и эмиссии 350 и 455 нм) и  IфЕ,1 (при длинах волн возбуждения и эмиссии 520 и 605 нм).

2) Добавляя к 1,05 мл 1-го раствора 0,05 мл раствора, содержащего 10 мкг/мл Хт в St-буфере (интенсивность флуоресценции Iфx,2 для которого определяем заранее – при добавлении 0,05 мл данного раствора к раствору, содержащему 4,33 об.% лизирующей смеси в St-буфере, и длинах волн возбуждения и эмиссии 350 и 455 нм), получаем раствор 2, для которого при тех же длинах волн, что и для Iфx,1, определяем интенсивность флуоресценции Ix (возросшую по сравнению с Iфx=Iфx,1+Iфx,2 вследствие специфического взаимодействия флуорофора Хт с ДНК, содержавшейся в исходной пробе и ставшей доступной для красителя вследствие обработки исходной пробы лизирующей смесью). Далее, добавлением к 1,1 мл 2-го раствора 0,02 мл раствора, содержащего 60 мкг/мл St-ДНК в St-буфере, получаем раствор 3, интенсивность флуоресценции которого (Iдx – возросшую по сравнению с Ix вследствие взаимодействия Хт не только с исходной ДНК, но и с добавленной к пробе St-ДНК) определяем также, как Ix. После чего вычисляем собственно концентрацию ДНК в пробе:

Cдx=gCсд(IxIфx)/(IдxIx)

(здесь g=246 – разбавление ДНК в растворе 3, по сравнению с отобранной цельной кровью;  а Cсд=3,3×10–6 М – концентрация St-ДНК в растворе 3).

3) Добавляя к 1,05 мл 1-го раствора 0,05 мл раствора, содержащего 200 мкг/мл ЕБ в St-буфере (интенсивность флуоресценции IфЕ,2 для которого определяем заранее – при добавлении 0,05 мл данного раствора к раствору, содержащему 4,33 об.% лизирующей смеси в St-буфере, и длинах волн возбуждения и эмиссии 520 и 605 нм), получаем раствор 4, для которого при тех же длинах волн, что и для IфЕ,1, определяем интенсивность флуоресценции Iе (возросшую по сравнению с IфЕ=IфЕ,1+IфЕ,2 вследствие специфического взаимодействия флуорофора ЕБ с ДНК, содержавшейся в исходной пробе). Далее, добавлением к 1,1 мл 4-го раствора 0,02 мл раствора, содержащего 60 мкг/мл St-ДНК в St-буфере, получаем раствор 5, интенсивность флуоресценции которого (Iде – возросшую по сравнению с IЕ вследствие взаимодействия ЕБ не только с исходной ДНК, но и с добавленной к пробе St-ДНК) определяем также, как IЕ. После чего вычисляем «коэффициент структуризации»:

Ks=Cде/Cдх         (где Cде=gCсд[IеIфе]/[IдеIе]),

изменение величины которого должно отражать изменения в характере третичного и более высоких порядков организации структуры генома пробы (поскольку ЕБ, как уже отмечалось, к ним существенно более специфичен, чем Хт).

4) При длинах волн возбуждения и эмиссии 350 и 605 нм определяем значение интенсивности флуоресценции 2-го раствора IфxЕ. Затем, добавлением к 1,12 мл 2-го раствора 0,02 мл раствора, содержащего 200 мкг/мл ЕБ в St-буфере, получаем раствор 6, интенсивность флуоресценции которого (Iхе – определяемую резонансным переносом энергии от первично возбужденных молекул Хт к адсорбированным на ДНК вблизи них молекулам ЕБ) определяем также, как IфxЕ. После чего вычисляем «коэффициент эффективности  переноса энергии»:

Ke=(IIфxЕ)/Cдх

(уменьшение величины которого должно, по нашему мнению, как показано на рис.18, в частности, в определенной мере, отражать уменьшение длины теломерных участков генома – которые для позвоночных животных и человека представляют собой многократно повторяющиеся на концах молекул ДНК фрагменты вида «TTAGGG» – число которых уменьшается при каждом делении клетки, вследствие неполной репликации ее ДНК, и соответственно, является максимальным  ограничителем возраста живого организма... выполняя, впрочем, и некоторые другие, в частности, регуляторные функции).

Вышеописанная схема анализа ДНК была опробована нами, в частности, на двух группах крыс (по 30 особей в каждой) со средним возрастом 2 месяца и 1,5 года. В результате, были получены достоверно (с веpоятностью 99%) различающиеся величины усредненных по этим группам параметров Ks и Ke – что вполне соответствовало нашим исходным предположениям, поскольку с возрастом (а процессы «старения» у крыс протекают, в целом, примерно в 20 раз быстрее, чем у человека) состояние генетического материала в клетках эукариотов и должно ухудшаться, в частности, за счет уменьшения длины теломерных участков генома (которое составило для вышеуказанных групп при определении «классическим» методом с ПЦР-амплификацией 6300 пар нуклеотидов, в среднем, на один конец хромосомы) и других изменений в структуре хромосомального нуклеопротеидного комплекса…  Кроме того, вышеприведенная схема анализа ДНК использовалась в методах оценки возможных генотоксических эффектов различных продуктов питания, лекарственных препаратов и угнетающих факторов окружающей среды на живые организмы; а также оценки индивидуальной радиочувствительности клеток крови человека и животных – адекватность которых удостоверялась как описано ниже.

2.3.  Метод выявления генотоксических эффектов

Также был разработан метод для быстрого выявления возможного генотоксического воздействия на человеческий и другие живые организмы различных продуктов питания, лекарственных препаратов, а также радиационных, химических и иных угнетающих факторов окружающей среды – в том числе в низких дозах и при сочетанном их действии на живые организмы. Этот метод основан на том, что группе животных (например крыс, жизненный цикл которых, как уже отмечалось, протекает примерно в 20 раз быстрее, чем у человека) единовременно или несколько раз в течение определенного времени (при моделировании хронического воздействия) вводят тем или иным способом  (с водой, с пищей, внутривенно, внутримышечно и т.д.) анализируемый продукт или препарат (или подвергают оную группу воздействию того или иного угнетающего фактора); в сочетании (при необходимости) с другими продуктами, препаратами и факторами окружающей среды. При этом у животных регулярно отбирают пробы крови, которые обрабатывают лизирующей смесью.  После чего оценивают общее содержание и структуру генетического материала в пробе (например по вышеописанной схеме с помощью системы из таких специально подобранных ДНК–специфичных флуорофоров со взаимодополняющими свойствами, как этидий бромид и Хехст-33258); нормируют их на количество лейкоцитов (поскольку эритроциты в нормальном состоянии в крови млекопитающих ДНК не содержат); и на основании сравнения с аналогичными величинами, определяемыми для контрольной группы животных (содержащихся в аналогичных с испытуемой группой условиях – но не подвергавшихся никакому из анализируемых воздействий), а также для всех животных, участвующих в анализе, до начала его проведения – делают вывод о наличии или отсутствии у анализируемой группы каких-либо достоверных изменений в структуре генома.

Вышеописанный метод был апробирован нами, в частности: при оценке лечебного и профилактического действия циклоферона (индуктора интерферона) при лучевой терапии фибросаркомы; при прогнозировании развития лейкопении вследствие применения различных видов лучевой терапии; при анализе действия на живые организмы в условиях Петербурга и Ленинградской области различных минеральных вод (по договорам с предприятиями, их производящими); а также при оценке экологического состояния ряда водоемов Ленинградской области. И полученные при этом результаты достоверно коррелировали, в частности, с наблюдаемым в дальнейшем снижением продолжительности жизни испытуемых животных;  а также  с результатами,  полученными для тех же образцов методом учета нестабильных хромосомных аберраций в культивируемых лимфоцитах и другими цитологическими методами.

2.4. Метод оценки индивидуальной радиочувствительности

Кроме того, был разработан метод предварительной оценки индивидуальной радиочувствительности живых организмов – основанный на том, что у пациента до начала лучевой терапии например отбирают пробу крови (достаточно 1 мл), разбавляют St-буфером и делят на две равные части… одну из которых затем облучают, а другую (контрольную) – нет.  После чего каждый из вышеупомянутых образцов инкубируют в течение 3ч при 370С (для репарации первичных повреждений ДНК) и обрабатывают лизирующей смесью. Затем, с помощью специального красителя (либо системы из нескольких красителей) и флуориметра оценивают общее содержание и структуру генетического материала в пробе… нормируют их на количество лейкоцитов… и, сравнивая полученные величины между собой, делают вывод о степени повреждающего воздействия, которое окажет вероятно лучевая терапия в выбранной дозе на конкретного пациента.  Описанный метод был достаточно успешно апробирован нами на более чем 50 пациентах Центрального научно–исследовательского рентгено–радиологического института – показав достоверную 95% корреляцию с результатами, полученными для тех же людей в тех же условиях методом учета нестабильных хромосомных аберраций в культивируемых лимфоцитах (одним из общепринятых для ранней идентификации облучения человека... но при этом существенно более материалоемком, трудоемком и продолжительном – 7 суток вместо 4 часов – чем предлагаемый нами метод). 

ВЫВОДЫ

Таким образом, в представляемой диссертационной работе решена крупная, имеющая важное народохозяйственное значение проблема, заключающаяся в научном обосновании и методико–техническом обеспечении простых и быстрых методов оценки качества и безопасности использования различных пищевых, лекарственных и иных продуктов и препаратов, а также степени общего экологического неблагополучия того или иного региона – при помощи биотестирования с использованием для характеристики состояния «стандартных» биосистем новой оригинальной схемы, основывающейся на совместном применении для анализа клеточного генома нескольких синтетических низкомолекулярных ДНК–специфичных флуорофоров со взаимодополняющими свойствами. В ходе чего были получены следующие конкретные результаты.

1. Получено и систематизировано на основе универсального структурно–химического подхода значительное количество новых данных по свойствам более 30 синтетических ДНК–специфичных флуорофоров фенилиндольного, фенилбензазольного, бисбензимидазольного, псораленового, ангелицинового, тетрагидрокарбазольного, оксофеноксазольного и др. рядов.

2. Даны рекомендации по конструированию новых эффективных флуорофоров на ДНК;  а также сформулированы основные положения единой обобщенной модели, позволяющей адекватно объяснить изменения флуоресцентных свойств таких соединений в зависимости от их химической структуры, характера взаимодействия с субстратом, свойств среды измерения и т.д.

3. С использованием системы из двух флуорофоров со взаимодополняющими свойствами предложена новая схема анализа НК, позволяющая проводить оценку не только общего содержания ДНК в пробе, но и степени изменения структуры генома в клетках.

4. С помощью вышеупомянутой схемы анализа генома «стандартных» биосистем разработаны новые методы для быстрого выявления возможного генотоксического воздействия на человеческий и другие живые организмы различных угнетающих факторов окружающей среды, продуктов питания, лекарственных и иных препаратов – в том числе при сочетанном действии на эти организмы других продуктов, препаратов и факторов окружающей среды, специфических для того или иного региона.

5. С использованием ДНК–специфичных флуорофоров разработан новый метод экспрессной оценки микробной обсемененности различных жидких сред непосредственно на месте отбора проб, а также новый метод оценки индивидуальной радиочувствительности человека и других живых организмов.

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ,

ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Сибирцев В.С., Гарабаджиу А.В., Иванов С.Д. Механизмы взаимодействия красителей фенилбензимидазольного и фенилиндольного ряда с ДНК. // Биоорган. химия. -1994. -Т.20,  №6. -C.650–668.

2. Сибирцев В.С., Гарабаджиу А.В., Иванов С.Д. Механизмы изменения флуоресцентных свойств бисбензимидазольных красителей. // Биоорган. химия. -1995. Т.21,  №9. -С.731–736.

3. Ivanov S.D., Sibirtsev V.S. Mechanisms of fluorescent interactions of the phenylbenzoimidazole and phenylindole dyes with DNA. // FASEB J. -1995. -V.9,  №6. -P.A1255.

4. Иванов С.Д., Сибирцев В.С. Способ определения микробиологической загрязненности воды: Патент №2079138, зарег. в гос. реестре изобрет. 10.05.1997, бюлл. №13; приоритет от 30.01.1996; заявка №96101131/14.

5. Сибирцев В.С., Гарабаджиу А.В., Иванов С.Д. Спектральные свойства красителей бисбензимидазольного ряда при взаимодействии с ДНК. // Биоорган. химия. -1997. Т.23,  №12. -С.969–978.

6. Сибирцев В.С., Гарабаджиу А.В. Влияние природы гетероатома в бензазолах на их спектральные свойства. // Журн. Орг. Хим. -1997. -Т.33,  №12. -С.1840–1843.

7. Ivanov S.D., Korytova L.I., Yamshanov V.A., Ilyn N.V., Sibirtsev V.S. Leukopenia prognosis by radiation therapy of patients with Hodgkin's disease. // J. Exp. Clin. Cancer Res. -1997. -V.16,  №2. -P.183–188.

8. Иванов С.Д., Ямшанов В.А., Акимов А.А., Шуст В.Ф., Ильин Н.В., Сибирцев В.С. Особенности возрастных и половых изменений в крови больных лимфогранулематозом. // Клиническая геронтология. -1998. -Т.2. -С.28–33.

9. Иванов С.Д., Коваленко А.Л., Кованько Е.Г., Ямшанов В.А., Акимов А.А., Забежинский М.А., Сибирцев В.С. Применение циклоферона при экспериментальной лучевой терапии опухолей. // Вопросы онкологии. -1999. -Т.45, №.3. -С.292–297.

10. Сибирцев В.С., Тындык М.Л., Иванов С.Д.  Особенности индивидуальных реакций дезактивации  бенз(а)пирена у крыс в зависимости от режима поступления канцерогена в организм.  // Вопросы онкологии. -2000. -Т.46, №5. -С.594–599.

11. Сибирцев В.С., Глибин  Е.Н., Иванов С.Д. Изменения спектральных свойств производных актиноцина, обусловленные превращением равновесных форм. // Журн. Орг. Хим. -2000. -Т.36, №12. -С.1865–1872.

12. Сибирцев В.С., Гарабаджиу А.В., Иванов С.Д. Сравнительное исследование свойств ДНК-специфичных красителей индольного и бензимидазольного ряда. // Биоорган. химия. -2001. -Т.27, №.1 -С.64–73.

13. Сибирцев В.С., Толмачев А.Ю., Суслов В.В., Гарабаджиу А.В., Травень В.Ф. Зависимость флуоресцентных свойств соединений псораленового, ангелицинового и карбазольного рядов от характера их терминальных заместителей. // Журн. Орг. Хим. -2003. -Т.39,  №6. -С.930–938.

14. Sibirtsev V.S., Garabadzhiu A.V.  Express-method of valuation general microbiological pollution of water by the fluorescent DNA-specific dyes. // Digest «Biotechnology and the environment including biogeotechnology». New York, «Nova science publishers» Inc., 2004. -P.49-50.

15. Sibirtsev V.S., Garabadzhiu A.V.  Qualitative and quantitative analysis of nucleic acids by the system from two fluorescent dyes. // Digest «Biotechnology and the environment including biogeotechnology». New York, «Nova science publishers» Inc., 2004. -P.51–57.

16. Sibirtsev V.S., Tyndyk M.L., Garabadzhiu A.V. Evaluation of organism individual sensitivity to carcinogenes action. // Digest «Biotechnology and the environment including biogeotechnology». New York, «Nova science publishers» Inc., 2004. -P.41–48.

17. Сибирцев В.С. Изучение возможностей применения к анализу ДНК бифункциональной системы: бромид этидия + Хехст-33258. // Биохимия. -2005. -Т.70, №4. -С.545–555.

18. Сибирцев В.С., Толмачев А.Ю., Ковалева М.В., Гарабаджиу А.В., Травень В.Ф. Спектральное исследование взаимодействия с ДНК 4,8,4'-триметилпсораленов и 4,4'-диметилангелицинов. // Биохимия. -2005. -Т.70, №7. -С.995–1007.

19. Сибирцев В.С. Анализ механизмов дезактивации бенз(а)пирена у крыс. // Биохимия. -2006. -T.71, №1. -С.111–120.

20. Sibirtsev V.S., Garabadzhiu A.V. The general technique for the establishment of dependence between various bioobjects parameters. //  Digest «New Research on biotechnology in biology and medicine». New York, «Nova science publishers» Inc., Editors: A.M.Egorov and Gennady Zaikov (Russian Academy of Sciences, Russia), 2006. -P.51–71.

21. Сибирцев В.С., Гарабаджиу А.В. Флуоресцентные ДНК-зонды: введение в теорию и практику использования. -С.Пб.: НОУ «Экспресс», 2006. -188 с., ил.

22. Сибирцев В.С. Флуоресцентные ДНК–зонды: исследование механизмов изменения спектральных свойств и особенностей практического применения. // Биохимия. -2007. -T.72, №8. -С.1090–1106.

23. Сибирцев В.С., Гарабаджиу А.В. Спектральное исследование взаимодействия с ДНК бензтиазолил-бенз--хромена. // Биохимия. -2007. -T.72, №8. -С.1107–1116.

24. Sibirtsev V.S., Garabadzhiu A.V. New Method of Diagnostics of Possible Genetoxic Effects of Food Products and Medicinal Preparations. //  Digest «Research Progress in Biotechnology». New York, «Nova science publishers» Inc., 2008. -P.109-115.

25. Sibirtsev V.S., Garabadzhiu A.V.  Revealing possible genetoxic effects on human and other live organisms of various food products as well as medicinal and other preparations. //  Digest «Biotechnology, Biodegradation, Water and Foodstuffs». New York, «Nova science publishers» Inc., 2009. -P.119–125.

26. Сибирцев В.С., Гарабаджиу А.В.  Новые методы биотестирования и анализа ДНК с помошью флуорофоров.  // Биотехносфера. -2011. -Т.13, №1. -С.10–15.







© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.