WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

 

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В. ЛОМОНОСОВА

Химический факультет

На правах рукописи

СЕРГИЕВ Петр Владимирович

МОЛЕКУЛЯРНЫЕ АСПЕКТЫ ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ РИБОСОМНЫХ РНК

02.00.10 - биоорганическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора химических наук

Москва - 2008 г.

Работа выполнена на кафедре химии природных соединений Химического факультета Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова.

Официальные оппоненты:                        доктор химических наук,

профессор, чл-корр. РАН Цетлин В.И.

доктор химических наук,

профессор Лаврик О.И.

доктор биологических наук,

профессор Гарбер М. Б.

Ведущая организация:                        Институт Молекулярной Биологии

им. В.А. Энгельгардта РАН

Защита состоится 26 февраля 2008 г. в 16 часов на заседании совета Д 501.001.41 по химическим наукам при Московском Государственном Университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Воробьевы горы, МГУ, лабораторный корпус “А”, аудитория 501.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан 21 января 2008 г.

Ученый секретарь совета,

кандидат химических наук                                                        Смирнова И.Г.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Рибосома это молекулярное устройство, осуществляющее синтез белков из аминокислот, приносимых транспортной РНК (тРНК), согласно инструкциям, закодированным в последовательности нуклеотидов матричной РНК (мРНК). Рибосома состоит из большой (50S) и малой (30S) субчастиц и имеет три участка связывания тРНК – А, Р и Е. В ходе своей работы она взаимодействует с несколькими десятками различных лигандов и координирует работу своих функциональных центров, разнесенных в пространстве. Основную структурную и функциональную роль в рибосоме выполняет рибосомная РНК (рРНК). Основу 30S субчастицы составляет 16S рРНК, основу 50S субчастицы – 23S и 5S рРНК. Малая субчастица образует декодирующий центр, в котором происходит проверка соответствия (комплементарности) кодона мРНК и антикодона аминоацил-тРНК (аа-тРНК). Связывание аа-тРНК осуществляется при помощи комплекса фактора элонгации Tu и GTP (аа-тРНК*EF-Tu*GTP). После гидролиза GTP, который происходит в случае соответствия кодона мРНК и антикодона тРНК, аа-тРНК перемещается в А участок. При этом 3’-конец аа-тРНК, несущей аминокислоту проникает в пептидилтрансферазный центр (peptidyltransferase center, PTC) большой субчастицы рибосомы. В этом каталитическом центре происходит перенос синтезируемого рибосомой пептида с 3’-конца тРНК, связанной с Р участком рибосомы, на аминокислоту, связанную с тРНК, находящейся в А участке. После переноса пептида возникает необходимость переместить молекулы тРНК из А и Р участков в Р и Е участки, чтобы освободить А участок для связывания следующей аа-тРНК. Вместе с тем, необходимо переместить мРНК на три нуклеотида, чтобы можно было считать следующий кодон. Согласно гипотезе, сформулированной Спириным и Бретшером, а затем подтвержденной Моазедом и Ноллером, перемещение тРНК (транслокация) происходит сначала на большой субчастице, а затем на малой. Транслокация катализируется фактором элонгации G (EF-G) в комплексе с GTP, который в ходе транслокации гидролизуется.

В начале 21 века изучение рибосомы вышло на качественно новый уровень. С помощью рентгеноструктурного анализа были определены с высоким разрешением структуры рибосомных субчастиц, а затем и всей рибосомы. Появилась возможность формулировать вопросы и предположения о назначении тех или иных “деталей” рибосомы и подвергать их экспериментальной поверке. Методы изучения структуры рибосомы – рентгеноструктурный анализ и криоэлектронная микроскопия помогли выявить несколько изменений структуры рибосомы в ходе биосинтеза белка. Однако, функциональная роль этих изменений не может быть установлена исключительно с помощью определения строения рибосом. Направленное изменение тех или иных элементов пространственной структуры с помощью мутаций и анализ мутантных рибосом позволяет понять роль этих элементов в процессе трансляции. В настоящее время изучение взаимосвязи структуры и функции рибосомы - это чрезвычайно динамично развивающаяся область биоорганической химии и молекулярной биологии. Более того, без понимания механизмов работы таких молекулярных устройств, как рибосома, невозможно представить себе дальнейший прогресс в создании искусственных молекулярных машин нанометровых размеров.

Цель работы. Понять роль ряда элементов рибосомной РНК в функционировании рибосомы.

Задачи:

1. Найти неизвестные ранее гены ферментов, проводящих модификацию рРНК, и определить роль модификаций рРНК в клетке.

2. Определить функциональную роль элементов 16S рРНК, участвующих в формировании структуры декодирующего центра.

3. Установить функциональную роль формы желоба 50S субчастицы, по которому аа-тРНК поступает в А участок.

4.  Выяснить функциональную роль Е и Р/Е участков связывания тРНК в рибосоме.

5. Установить, какие элементы 23S рРНК обеспечивают аллостерическую связь Р/Е участка и участка связывания факторов элонгации. Определить, как происходит выбор между связыванием EF-G и EF-Tu при их конкуренции за общий участок связывания с рибосомой.

Научная новизна и практическая значимость. Все результаты работы получены впервые и не описаны ранее в научной литературе. В ходе выполнения работы впервые определены гены рРНК метилтрансфераз, модифицирующих основания G966 16S рРНК, A1618, G1835 и G2445 23S рРНК E. coli. Показано, что субстратом для метилтрансферазы YhhF, метилирующей NH2 группу нуклеотида G966 16S рРНК, служит 30S субчастица. На основе пространственных структур 30S субчастицы и белка YhhF построена модель их комплекса. Предположено, что метилтрансфераза связывается с малой субчастицей в том месте, где в ходе функционального цикла рибосомы расположена антикодоновая петля тРНК, находящейся в Р участке. Субстратом метилтрансфераз YgjO и YcbY, модифицирующих нуклеотиды G1835 и G2445 23S рРНК, служит, как было показано, депротеинизированная рРНК. Метилированные нуклеотиды m2G1835 и m2G2445 23S рРНК расположены в области контакта субчастиц и в пептидилтрансферазном центре. Метилтрансфераза YbiN проводит монометилирование нуклеотида А1618 23S рРНК. Субстратом для нее служит промежуточный комплекс сборки 50S субчастицы, сходный с рибонуклеопротеидом, образующимся при частичной депротеинизации 50S субчастицы. Хотя отсутствие любой из обнаруженных в работе метилтрансфераз приводит к замедлению роста клеток, оно не нарушает работу рибосомы in vivo.

       В работе разработана методология изучения функции рибосомной РНК с помощью мутагенеза. Впервые в мире разработан метод выделения рибосом, несущих аптамер в рРНК, с помощью аффинной хроматографии. В результате стало возможным выделять и изучать рибосомы, несущие летальные мутации. Собраны в одну систему методы изучения структуры рРНК и способы определения эффективности отдельных стадий трансляции.

Впервые получены мутации нуклеотидов 16S рРНК, участвующих в третичных взаимодействиях спирали 34 16S рРНК. Обнаружено, что мутации влияют на точность трансляции и предложено объяснение этого эффекта. Впервые доказано экспериментально, что нуклеотидные остатки U2492, C2556 и C2573 23S рРНК, образующие сужение на пути перемещения аа-тРНК в А участок не важны для скорости этого перемещения.        

        Детально изучен механизм аллостерической связи между Р/Е участком и участком связывания факторов элонгации. Впервые показано, что не отсутствие пептидной группы на тРНК, находящейся в Р участке, а способность этой тРНК перемещаться в Р/Е участок способствует связыванию EF-G и многократному не сопряженному с транслокацией гидролизу GTP. С помощью мутаций проверена возможность передачи аллостерического сигнала через спирали 38, 39, 89, 91, 95 (SRL) и 42 23S рРНК. Показано, что спираль 38 и петли спиралей 89 и 91 не участвуют в передаче сигнала. Мутации в спирали 39 способствовали стабилизации такой конформации 23S рРНК в составе рибосомы, при которой защищены от химической модификации нуклеотиды 23S рРНК, взаимодействующие с тРНК, связанной с Р участком. С помощью мутации в спирали 95 23S рРНК (SRL) было обнаружено, что гидролиз GTP не требует прочного взаимодействия EF-G с SRL. В тоже время, это взаимодействие необходимо для транслокации. Полученные результаты свидетельствуют в пользу того, что гидролиз GTP элонгационным фактором G предшествует транслокации. Движение спиралей 43-44 23S рРНК (GAC), наблюдаемое при связывании с рибосомой факторов элонгации, было вызвано нами искусственно, вне зависимости от присутствия лигандов рибосомы, с помощью мутации в спирали 42 23S рРНК. Впервые показано, что движение GAC в сторону SRL не мешает связыванию аа-тРНК*EF-Tu*GTP с рибосомой и декодированию, но препятствует связыванию EF-G*GTP и транслокации. С помощью химической модификации выявлена сеть третичных взаимодействий, связывающая пептидилтрансферазный центр с центром связывания факторов элонгации. Предложена модель селективного связывания факторов элонгации с рибосомой в зависимости от того, какое положение занимает в ней GAC.

       Результаты работы опубликованы в виде 10 статей в отечественных и 23 статей в зарубежных научных журналах, а также глав в 3 книгах и 2 методических разработках.

       Уникальные методы, разработанные в работе, такие, как метод детекции протонированных оснований в рРНК и метод аффинной хроматографии рибосом могут быть использованы в институтах, занимающихся исследованиями в области биоорганической химии и молекулярной биологии как в нашей стране, так и за рубежом. Разработанная нами система выделения рибосом с помощью аффинной хроматографии уже была успешно использована в Университете Брауна, США. Результаты, полученные в ходе выполнения работы, отвечают на многие вопросы о механизме функционирования сложных молекулярных машин и имеют фундаментальную научную ценность. Кроме того, выявленные в работе участки рРНК, необходимые для функционирования рибосомы, могут быть использованы как мишени для разработки новых видов антибиотиков.

       Работа была поддержана грантами: РФФИ, HHMI, Fogarty, CRDF.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на нескольких десятках международных конференций, в том числе на ключевых международных конференциях по функции РНК и трансляции:

-The Ribosome: Structure, Function, Antibiotics, and Cellular Interactions, June 13-17, 1999, Helsingor, Denmark

- RNA2001, 6th Annual meeting of the RNA society, May 29 –June 3, 2001, Banff, Canada

-Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology, The Ribosome, May 31- June 5, 2001, Cold Spring Harbor, USA

- The 5th International Engelhardt Conference on Molecular Biology, 21-26 июнь, 2001, Москва-Ярославль-Москва, Россия

-International conference in honour of Alexander Spirin, Protein synthesis, 27 августа – 1 сентября, 2001, Пущино, Россия

-The Dynamics of Ribosome Structure and Function, January 27 – February 1, 2002, Queenstown, New Zealand

- RNA2003, 8th Annual meeting of the RNA society, July 1–6, 2003, Vienna, Austria

- RNA2006, 11th Annual meeting of the RNA society, June 20-25, 2006, Seattle, USA

- The 8th International Engelhardt Conference on Molecular Biology "RNA – Protein Interactions", 19-24 августа, 2006, Московская обл., Россия

-Ribosomes: Form and Function, June 3-8, 2007, North. Falmouth, USA

Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 286 страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, результаты и их обсуждение, материалы и методы, выводы. Материал иллюстрирован 85 рисунками и 10 таблицами. Библиографический указатель включает 405 цитированных работ.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

В настоящее время определена структура комплексов рибосомы, находящейся на различных этапах ее функционального цикла, однако функциональная роль конформационных изменений рРНК в этих комплексах не очевидна. Целью работы было изучение функциональной роли потенциально важных элементов рРНК и их наблюдаемых или предполагаемых конформационных изменений в ходе работы рибосомы. Стратегия, выбранная нами для изучения рибосомы это сочетание направленного мутагенеза компонентов рибосомы и анализа функциональных последствий внесенных мутаций.

Поиск генов рРНК-метилтрансфераз, ответственных за метилирование нуклеотидов G966 16S рРНК, A1618, G1835 и G2445 23S рРНК

Рибосомные РНК E. coli содержат 36 модифицированных нуклеотидов. Модификацию этих остатков проводят 32 фермента, из которых 10 до сих пор неизвестны. Распределение модифицированных нуклеотидов в пространственной структуре рибосомы крайне неравномерно. Большинство из них находятся в функциональных центрах рибосомы - декодирующем, пептидилтрансферазном и в местах контакта субчастиц. Отдельная группа модифицированных оснований сближена с туннелем, проходящим через большую субчастицу. Распределение модифицированных нуклеотидов в пространственной структуре рибосомы еще более неравномерно относительно участков связывания лигандов. Большинство модифицированных нуклеотидов сближены с тРНК, находящимися в А и Р участках. Особенно богато минорными остатками окружение Р участка. Понять функциональную роль модификаций рРНК можно, только получив клетки и рибосомы, в которых та или иная модификация не происходит. Для этого необходимо определить гены, ответственные за модификацию нуклеотидов и инактивировать их.

В нуклеотидной последовательности генома E. coli нами был произведен поиск открытых рамок считывания, кодирующих белки, гомологичные известным РНК метилтрансферазам. Штаммы, в которых соответствующие участки ДНК были заменены на ген устойчивости к канамицину, были любезно предоставлены нам проф. Х. Мори (Япония). Из штаммов, в которых предполагаемые рРНК-метилтрансферазы были инактивированы, была выделена суммарная клеточная РНК, большинство из которой составляла рРНК. Для того, чтобы понять, привела ли инактивация генов к отсутствию той или иной модификации, мы использовали метод обратной транскрипции.

Нуклеотид m2G966 16S рРНК напрямую взаимодействует с  нуклеотидом 34 антикодоновой петли тРНК (Рис. 1а). Метилтрансфераза, проводящая модификацию этого нуклеотида была неизвестна. Обратная транскрипция рРНК, выделенной из клеток дикого типа, останавливалась за один нуклеотид до m2G966 (Рис. 1б, дорожка 1). Остановка обратной транскрипции не происходила, если использовалась рРНК, выделенная из клеток, в геноме которых ген yhhF был заменен на ген устойчивости к канамицину (Рис. 1б, дорожка 2). При инактивации генов других рРНК метилтрансфераз (Рис. 1б, дорожки 3, 4) остановка обратной транскрипции за один нуклеотид до G966 по-прежнему наблюдалась. Необходимо было доказать, что именно инактивация гена yhhF, а не изменение его окружения в геноме, послужила причиной отсутствия модификации. Мы трансформировали штамм, в котором ген yhhF на хромосоме был заменен на ген устойчивости к канамицину, плазмидой, в которой был закодирован ген yhhF. Экспрессия гена yhhF , содержавшегося на плазмиде,  компенсировала отсутствие гена yhhF в геноме (Рис. 1б, дорожка 5). Для того, чтобы показать, что белок YhhF без каких-либо дополнительных белков способен модифицировать G966, мы провели метилирование in vitro. Для этого нами были выделены 30S рибосомные субчастицы и 16S рРНК из штамма, в котором ген yhhF был инактивирован. Также, с помощью металлохелатной хроматографии на Ni-NTA агарозе был выделен рекомбинантный белок YhhF, содержащий гексагистидиновый “довесок”. Рекомбинантный YhhF метилировал G966 в составе 30S субчастиц (Рис. 1б, дорожка 6), но не был способен метилировать 16S рРНК (Рис. 1б, дорожка 8). Модификации не наблюдалось в отсутствии S-аденозил-L-метионина (SAM) (Рис. 1б, дорожки 7, 9), что позволяет отбросить маловероятную возможность того, что yhhF кодирует не метилтрансферазу, а специфическую рибонуклеазу.

Рисунок 1. Метилирование нуклеотида G966 16S рРНК и влияние этого метилирования на жизнеспособность E. coli. А. Расположение m2G966 в пространственной структуре малой субчастицы. Красная лента – тРНК, оранжевая мРНК. Зеленым показан нуклеотид m2G966 (на него указывает стрелка), синим –m5C967, фиолетовым –m2G1207 16S рРНК. Б. Модификация нуклеотида G966 16S рРНК с помощью обратной транскрипции. A, C, G, U -дорожки определения нуклеотидной последовательности. Цифры соответствуют 16S рРНК: (1) дикого типа; (2) штамма, в котором yhhF инактивирован; (3) штамма, в котором ygjO инактивирован; (4) штамма, в котором ycbY инактивирован; (5) штамма, в котором yhhF кодируется только плазмидой; (6) выделенной из 30S субчастиц обработанных YhhF и SAM in vitro.; (7) выделенной из 30S субчастиц обработанных YhhF in vitro; (8) обработанной белком YhhF и SAM in vitro; (9) обработанной YhhF in vitro; Нуклеотиды 16S рРНК подписаны слева. Использовали олигодезоксирибонуклеотид, комплементарный нуклеотидам 995-1011 16S рРНК. В. Скорость вытеснения клеток штамма без yhhF, клетками дикого типа. По оси ординат - доля клеток без yhhF. По оси абсцисс - количество циклов разведения культуры. Один цикл разведения соответствует примерно 10 удвоениям клеток.

Рисунок 2. Пространственная структура YhhF (А) и модель структуры комплекса YhhF с рибосомой (Б).

Для оценки влияния модификации G966 на конкурентоспособность клеток, мы оценили эффективность вытеснения мутантного штамма из культуры клеток при совместной культивации с клетками дикого типа. Использовались различные среды и температуры культивации. Оказалось, что образование m2G966 дает клеткам небольшое преимущество при росте на богатой среде (Рис. 1в). Поскольку фенотип клеток, лишенных метилирования G966 был практически неотличим от дикого типа, мы сделали вывод о том, что маловероятна важная роль метильной группы, присоединенной к G966, в базовых стадиях трансляции. Возможно, метилирование G966 важно для регуляции работы рибосомы в каких-либо специфических, например, стрессовых условиях.

В нашей совместной работе с лабораторией проф. А. Йохимяка из Центра Структурной Геномики, США, была определена структура белка YhhF (Рис. 2а). Этот небольшой однодоменный белок имел пространственную укладку Россмана, сходную со структурами многих других метилтрансфераз. Интересно было сопоставить структуру этого фермента со структурой его субстрата, 30S субчастицы (Рис. 2б). Нуклеотидный остаток m2G966 расположен в углублении, образующем часть Р участка. В комплексе рибосомы с тРНК, m2G966 контактирует с наиболее далеко выступающим нуклеотидом антикодоновой петли тРНК и расположен практически в самом “глубоком” месте “щели”, в которой происходит связывание мРНК и антикодонов тРНК. Удивительно, как метилтрансфераза может контактировать со столь малодоступным нуклеотидным остатком. Возможно, именно этим обстоятельством объясняются малые размеры YhhF. Белок не содержит характерных для других ДНК и РНК метилтрансфераз дополнительных узнающих доменов. Напротив, сама форма YhhF способствует его связыванию с Р участком рибосомы, как это было показано при помощи созданной нами компьютерной модели (Рис. 2б). В отличие от большинства ферментов, в которых субстрат связывается во “впадине” активного центра белка, здесь фермент связывается в “активном центре” субстрата.

Рисунок 3. Метилирование нуклеотидов G1835 и G2445 23S рРНК и влияние этого метилирования на жизнеспособность E. coli. А. Модификация G1835 23S рРНК. A, C, G, U - дорожки определения нуклеотидной последовательности. Цифры соответствуют 23S рРНК: (1) штамма, в котором ygjO инактивирован; (2) дикого типа; (3) 50S субчастиц обработанных YgjO и SAM in vitro; (4) обработанная YgjO и SAM in vitro; (5) также, как (1); (6) штамма, в котором ygjO кодируется плазмидой; Полоса, соответствующая m2G1835, отмечена стрелкой справа. Использовали олигонуклеотид, комплементарный нуклеотидам 1874-1893 23S рРНК. Б. Модификация G2445 23S рРНК. Обозначения дорожек, как для панели А, только для выделения рРНК использовали штамм, в геноме которого был инактивирован ген ycbY. Этот же ген, закодированный на плазмиде использовали в опытах по комплементации. Использовали олигонуклеотид, комплементарный нуклеотидам 2480-2496 23S рРНК.  В. Скорость вытеснения клеток штамма без ygjO клетками дикого типа. Показана доля клеток без ygjO. По оси абсцисс - количество циклов последовательного разведения культуры. Один цикл разведения соответствует примерно 10 удвоениям клеток. Г. Тоже, что и на панели В, только использовали штамм без ycbY.

С помощью обратной транскрипции рРНК, выделенной из штаммов, в которых были инактивированы гены предполагаемых метилтрансфераз, были установлены гены, ответственные за модификацию нуклеотидов G1835 и G2445 23S рРНК. Ими оказались ygjO (Рис. 3а, дорожки 1 и 2) и ycbY (Рис. 3б, дорожки 1 и 2), соответственно. Экспрессия генов метилтрансфераз, закодированных на плазмиде (Рис. 3а,б, дорожки 6), компенсировала отсутствие функциональных генов в геноме. В отличие от метилтрансферазы YhhF, субстратом которой служила 30S субчастица, метилтрансферазы YgjO и YcbY использовали депротеинизированную 23S рРНК в качестве субстрата (Рис. 3а,б, дорожки 4). Отсутствие генов ygjO и ycbY  в геноме замедляло рост клеток и приводило к преимущественному размножению клеток дикого типа при совместном культивировании (Рис. 3в,г). Особенно выраженным преимуществом обладали клетки дикого типа при выращивании на минимальной среде.

Рисунок 4. Метилирование нуклеотида А1618 23S рРНК. А. Модификация нуклеотида А1618 23S рРНК. A, C, G, U - дорожки определения нуклеотидной последовательности. Цифры соответствуют 23S рРНК: (1) дикого типа; (2) штамма, в котором ybiN инактивирован; (3) штамма, в котором ybiN  кодируется на плазмиде; (4) обработанной YbiN и SAM in vitro; (5) обработанной YbiN in vitro; (6) из частиц, депротеинизированных LiCl и обработанных YbiN и SAM in vitro. (7) из частиц, депротеинизированных LiCl, и обработанных YbiN in vitro. (8) из частиц, депротеинизированных NH4Cl/EtOH, и обработанных YbiN и SAM in vitro. (9) из частиц, депротеинизированных NH4Cl/EtOH и обработанных YbiN in vitro. (10) из 50S субчастиц, обработанных YbiN и SAM in vitro. (11) из 50S субчастиц, обработанных YbiN in vitro. Нуклеотид m6А1618, отмечен стрелкой справа. Использовали олигонуклеотид, комплементарный нуклеотидам 1760-1780 23S рРНК.  Б. Проверка наличия модификации нуклеотида А1618 23S рРНК с помощью MALDI-MS продуктов гидролиза фрагмента 23S рРНК  с 1590 по 1620 нуклеотид РНКазой Т1. Нуклеотид А1618 входит в состав олигонуклеотида 1614ACACAG1619p. Спектры соответствуют: (ΔybiN) штамм без ybiN; (WT) дикий тип; (ΔybiN pYbiN) штамм, в котором ybiN закодирован только на плазмиде; Г. Скорость вытеснения клеток без ybiN клетками дикого типа. Показана пропорция клеток без ybiN. По оси абсцисс отложено количество циклов последовательного разведения культуры. Один цикл разведения соответствует примерно 10 удвоениям клеток. Условия культивирования (среда и температура), соответствующие представленным кривым, приведены справа.

Метилтрансфераза, осуществляющая модификацию нуклеотида m6A1618 23S рРНК, была выявлена с помощью обратной транскрипции (Рис. 4а) и масс-спектрометрии MALDI (Рис. 4б). Эта метилтрансфераза была закодирована в гене ybiN E. coli. Примечательно, что эта метилтрансфераза использовала в качестве субстрата не депротеинизированную рРНК (Рис. 4а, дорожка 4) и не 50S субчастицу (Рис. 4а, дорожка 10), а исключительно частично депротеинизированную 3.5М LiCl частицу (Рис. 4а, дорожка 6), сходную с рибонуклеопротеидными комплексами, служащими промежуточным звеном при сборке большой субчастицы. Особенностью YbiN было образование ковалентного соединения с рРНК в случае, когда субстрат подвергался обработке избытком фермента in vivo (Рис. 4а, дорожка 3) или in vitro (Рис. 4а, дорожка 6). Наличие ковалентного соединения было показано с помощью со-выделения YbiN с 23S рРНК в денатурирующих условиях.

Рисунок 5. Расположение m6А1618  в пространственной структуре большой субчастицы. Показан “срез” структуры большой субчастицы, как если бы на нее смотрели от пептидилтрансферазного центра через туннель и удалили ее верхнюю, ближайшую к наблюдателю часть. Участки связывания белков L7 и белок L9 обозначены. Зелеными лентами показаны белки L22 и L34 (подписаны). Нуклеотид m6А1618 показан красным.

Отсутствие гена ybiN в геноме E. coli приводит к потере конкурентоспособности по отношению к клеткам дикого типа при совместном культивировании (Рис. 4в), особенно при росте на богатой среде. Расположение нуклеотида m6A1618 в непосредственной близости от туннеля 50S субчастицы (Рис. 5) позволяет предположить, что метильная группа, переносимая YbiN, может быть необходимой для взаимодействия с туннелем регуляторных пептидов. Тем не менее, среди четырех изученных в работе рРНК метилтрансфераз, мы не выявили ни одной, функционирование которой было бы необходимо для трансляции. Идентификация генов рРНК метилтрансфераз служит непременным первым шагом на пути установления функции модифицированных оснований в рРНК. Скорее всего, эта функция связана с процессами регуляции трансляции или адаптации к стрессовым условиям.

Изучение функции элементов рРНК с помощью мутагенеза

       Изменение элементов рРНК, не связанное с нарушением метилирования, возможно с помощью направленного мутагенеза. Для того, чтобы изучить, как та или иная мутация нарушает работу рибосомы, необходимо иметь возможность выделять мутантные рибосомы в чистом виде. Получение мутантных рибосом в чистом виде возможно с помощью штаммов, лишенных рДНК оперонов в геноме, однако, таким образом можно изучать только рибосомы, сохраняющие функциональную активность.

Создание метода выделения рибосом, несущих летальные мутации

Изучение рибосом, несущих летальные мутации, таким способом невозможно. Мы создали метод выделения таких рибосом с помощью аффинной хроматографии. Основой метода служит введение в рРНК участка, с высокой аффинностью взаимодействующего со смолой-носителем. Подобный метод уже повсеместно используется для выделения белков, но только начинал применяться для выделения нескольких небольших РНК. О применении аффинной хроматографии для очистки объектов масштаба рибосомы от практически идентичных рибонуклеопротеидов, отличающихся лишь коротким фрагментом РНК, не сообщалось.

Мы выбрали спирали 9, 25, 45, 63 и 98 23S рРНК для вставки аптамеров, поскольку в различных организмах длины этих спиралей варьируются. В качестве аффинной вставки использовали участок связывания белка оболочки фага MS2, стрептомицин-связывающий аптамер и стрептавидин-связывающий аптамер. Для выделения рибосом с помощью участка связывания белка оболочки фага MS2 нам был нужен гибрид белка оболочки фага MS2 с доменом, который мог бы прочно связываться с каким-либо аффинным сорбентом. Была создана плазмида, кодирующая гибрид двух мономерных молекул белка оболочки и двух Z доменов белка А Staphylococcus aureus (Рис. 6а). Z домены белка А были нужны для связывания этого гибридного белка с IgG сефарозой. Участки связывания с РНК и с IgG сефарозой были разделены аминокислотной последовательностью, содержащей участок узнавания протеиназой TEV. К сожалению, одновременного связывания гибридного белка и с рибосомой и с IgG сефарозой не наблюдалось. Возможно, это объясняется слишком коротким участком аминокислотной последовательности, соединяющим две части белка, РНК-связывающую и IgG-связывающую.

Рисунок 6. Схема аффинного связывания 50S субчастиц, содержащих различные аффинные довески, с соответствующим сорбентом. А. Взаимодействие 50S субчастицы, несущей участок связывания белка оболочки фага MS2, с рекомбинантным белком и IgG сефарозой. Б. Взаимодействие 50S субчастицы, несущей участок связывания стрептомицина со стрептомицин-сефарозой. В. Взаимодействие 50S субчастицы, несущей участок связывания стрептавидина со стрептавидин - сефарозой.

Аптамер, связывающий стрептомицин, был присоединен к уже сделанной вставке в спираль 98 23S рРНК (Рис. 6б). Рибосомы, содержащие аптамер, связывали стрептомицин той областью 23S рРНК, которая содержала вставку. Об этом свидетельствовала защита нуклеотидов, входящих в состав аптамера, от химической модификации при связывании стрептомицина. Тем не менее, специфичного взаимодействия рибосом, несущих стрептомицин-связывающий аптамер со стрептомицином, иммобилизованном на агарозе, не удалось. Аминогруппы иммобилизованного стрептомицина превращали агарозу в анионообменную смолу, прочно и неспецифично взаимодействующую с рибосомами как содержащими аптамер, так и с рибосомами дикого типа.

Использование аптамера, взаимодействующего со стрептавидином (Рис. 6в), привело к желаемому результату. Для внедрения аптамера были выбраны спирали 9, 25 и 45 23S рРНК. Известно было, что вставки участка узнавания белка оболочки MS2 в эти спирали не сказывается на функциональной активности рибосом. Чтобы избежать проблем с отталкиванием такого крупного лиганда, как рибосома, от стрептавидин-сефарозы, была увеличена длина спирального участка, отделяющего аптамер от тех нуклеотидов 23S, где до вставки находились петли этих спиралей. Плазмиды pLK1192U, несущие вставки аптамеров в спирали 9, 25 и 45 могли служить единственным источником рРНК в клетках. Опыты показали, что чистые рибосомы дикого типа не связываются со стрептавидин-сефарозой. Рибосомы, несущие стрептавидин-связывающий аптамер, присоединенный к спиралям 25 и 45, связывались с аффинным сорбентом и элюировались биотином. Связывание с сорбентом рибосом, имеющих вставку аптамера в спираль 25, было на 30% лучше, чем связывание рибосом, содержащих вставку в спирали 45. Рибосомы, в которых стрептавидин-связывающая последовательность была введена в спираль 25 23S рРНК, были использованы для дальнейших опытов по аффинной очистке рибосом, содержащих летальные мутации 23S рРНК.

Изучение значимости для трансляции третичных взаимодействий спирали 34 16S рРНК

Спираль 34 это один из основных структурных элементов декодирующего центра рибосомы. Еще до определения структуры 30S субчастицы с помощью РСА функциональная важность спирали 34 в декодировании и терминации трансляции была выявлена с помощью мутагенеза. Опыты по фотоаффинному сшиванию, проведенные в нашей лаборатории, показали, что спираль 34 находится в контакте с частью мРНК, расположенной от 6 до 9 нуклеотидов к 3’-концу от кодона в Р участке. Взаимодействие спирали 34 с EF-G, было выявлено в ходе экспериментов по химической модификации, проведенных в лаборатории Винтермайера-Родниной.

Рисунок 7. Анализ влияния мутаций в спирали 34 на структуру и функционирование рибосомы. А. Влияние мутаций на ассоциацию рибосомных субчастиц. Представлена пропорция 30S/70S. Wt - дикий тип, мутантные субчастицы подписаны. Черные столбцы соответствуют [Mg2+] 7 мМ, серые – 14 мМ, белые – 21 мМ. Б. Влияние мутаций на частоту ошибок декодирования (черные столбцы) и сдвига рамки считывания -1 (белые столбцы) и +1 (серые столбцы). Высота столбцов соответствует частоте ошибок трансляции по сравнению с диким типом. В. Влияние мутаций на частоту ошибочного прочтения терминационных кодонов, как смысловых. Черные столбцы соответствуют ошибочному прочтению кодона UGA, серые – UAA, белые – UAG. Г. Анализ изменения структуры 16S рРНК, вызванного мутациями в спирали 34. A, C, G, U дорожки определения нуклеотидной последовательности. Wt - 16S рРНК дикого типа. DMS - обработка диметилсульфатом. Мутации подписаны. Для обратной транскрипции использовали олигодезоксирибонуклеотид, комплементарный нуклеотидам 995-1011 16S рРНК.

Спираль 34 связана со спиралью 31 16S рРНК помощью третичного взаимодействия нуклеотидов U961 – A974 – A1201. Положение спирали 34 в пространстве, по-видимому, определяется структурой узла спиралей 34/35/38 16S рРНК. По предсказанию Гутелла, основанном на сравнительном анализе последовательностей, нуклеотид С1109 находящийся в месте соединения спиралей 34/35/38 16S рРНК образует третичный контакт с парой оснований G933-C1384 16S рРНК. Это взаимодействие также может фиксировать положение узла спиралей. Мы сделали мутации U961A, A1201U, и двойную компенсаторную мутацию U961A/A1201U чтобы определить, какую роль играет взаимодействие этих нуклеотидов в цикле трансляции. Мутация C1109G должна была предотвратить взаимодействие нуклеотида в этом положении с парой оснований G933-C1384, если это взаимодействие действительно реализуется когда-либо в ходе трансляции. Замены A1191U, A1191C должны были ослаблять, а мутация A1191G разрушать структуру узла соединения спиралей 34/35/38.

Разрушение контакта U961 – A974 – A1201 как с помощью замены U961A, так и с помощью мутации A1201U приводило к нарушению ассоциации субчастиц рибосомы (Рис. 7а). Восстановление взаимодействия с помощью двойной мутации U961A/A1201U возобновляло способность субчастиц к ассоциации. Скорее всего, разрушение контакта U961 – A974 – A1201 влияло на положение “головы” субчастицы относительно ее “тела” и эффективность образования межсубчастичных мостиков В1 группы. Мутация U961A приводила к большей точности декодирования (Рис. 7б) и меньшей эффективности терминации (Рис. 7в). Уровень точности декодирования восстанавливался при компенсаторной мутации U961A/A1201U (Рис. 7б), а эффективность терминации нет (Рис. 7в). Скорее всего, это объясняется восстановлением при компенсаторной мутации лишь взаимодействия между нуклеотидами 961 и 1201, но не их взаимодействия с нуклеотидом 974. Об этом свидетельствует химическая модификация А974 диметилсульфатом (DMS) во всех трех мутантах (Рис. 7г). Измерение константы скорости транслокации, как однократной (перемещение тРНК), так и многократной (весь цикл работы EF-G) показало, что взаимодействие нуклеотидов U961 – A974 – A1201 для транслокации несущественно.

Рисунок 8. Предполагаемое влияние мутаций на конформацию головы малой субчастицы. Нуклеотиды, которые были мутированы показаны красным. А. Мутация U961A может сдвигать спираль 34 16S рРНК (синяя) вниз. Б. Мутации A1191C и A1191U могут приводить к движению головы к большой субчастице. Мутация A1191G может приводить к движению головы от большой субчастицы.

Мы объясняем эффект разрушения триады оснований U961 – A974 – A1201 на трансляцию механически. Из-за оппозиции двух аденозинов (961 и 1201) на 1-3 увеличивается расстояние между спиралью 34 и верхней частью головы 30S субчастицы (Рис. 8а). В свободных 30S субчастицах это приводит к сдвигу белка S13, вместе со всей верхней частью головы, и препятствует взаимодействию S13 с ASF и L5 большой субчастицы, т.е. образованию мостиков группы В1. В рибосомах, стабилизированных тРНК, связанной с Р участком, образование мостиков происходит, но спираль 34 вынуждена “опуститься” на 1-3   “глубже” в декодирующий центр (Рис. 8а). Это приводит к более “тесному” окружению антикодона тРНК в А участке, меньшему сродству тРНК к А участку и большей точности декодирования. То же изменение структуры декодирующего центра препятствует проникновению в декодирующий центр доменов II/IV факторов терминации. Фенотип мутаций A1191C и A1191U отличался от фенотипа мутации A1191G. Мутации A1191C и A1191U повышали частоту +1 сдвига рамки считывания и препятствовали терминации, в то время как A1191G – повышала частоту -1 сдвига рамки и не препятствовала терминации (Рис. 7б). Пиримидиновые основания, меньшее объемные, чем аденин, могли вызывать компактизацию узла соединения спиралей 34/35/38. Гуанин, напротив, “раздвигал” укладку этого узла. В результате могло меняться положение всей спирали 34. В случае компактизации узла соединения спиралей 34/35/38, спираль 34 сдвигалась по направлению к большой субчастице, а в случае увеличения размеров этого узла, от большой субчастицы. Вероятность -1 и +1 сдвига рамки считывания увеличивалась из-за того, что спираль 34 определяет 3’-границу А участка. При перемещении в сторону большой субчастицы, эта спираль будет стремиться сдвинуть антикодон тРНК на один нуклеотид в сторону 5’-конца мРНК. При возможности образования кодон-антикодоновых взаимодействий в -1 рамке считывания это приведет к сдвигу рамки. Отклонение спирали 34 от большой субчастицы будет позволять антикодону тРНК, если это позволяет нуклеотидная последовательность мРНК, образовать кодон-антикодоновый дуплекс в +1 рамке. Таким образом, положение спирали 34, фиксированное с помощью ее третичных взаимодействий, определяет размер декодирующего центра и, таким способом, минимизирует вероятность ошибок декодирования и сдвига рамки считывания.

Определение функциональной роли “желоба”, по которому аа-тРНК попадает в А участок.

На поверхности 50S субчастицы, между пептидилтрансферазным центром и участком связывания трансляционных факторов GTPаз проходит желоб, образованный спиралями SRL, 91, 90 и 89 23S рРНК “сверху” и L14 и спиралью 92 23S рРНК “снизу”. По этому “желобу” движется аминоацилированный конец аа-тРНК, когда она перемещается от EF-Tu*GDP к PTC. Перемещение аа-тРНК из А/Т в А/А участок было подвергнуто компьютерному моделированию Санбонматсу и коллегами. Согласно компьютерной модели, аминоацилированный конец тРНК движется неравномерно. Временная остановка перемещения аа-тРНК происходит перед сужением, образованном нуклеотидными остатками U2492, C2556 и C2573 спиралей 89, 91 и 90 23S рРНК, соответственно (Рис. 9а,б). На основе компьютерной модели возникла гипотеза, что задержка перемещения аа-тРНК в А участок, вызванная этими “воротами”, необходима для повышения точности трансляции, поскольку при замедлении перехода аа-тРНК из А/Т в А/А участок аа-тРНК, несоответствующая кодону мРНК, будет иметь дополнительное время для ухода из рибосомы.

Мы сконструировали плазмиды, в которых в ген 23S рРНК были внесены замены С2573 на A, G и U, а также проведена делеция этого нуклеотида и соседнего нуклеотида А2572. Предположительно, замена цитидина на более объемные пуриновые основания должна “сужать” коридор, через который проходит аа-тРНК. Мутации нуклеотида U2492 и его окружения планировались так, чтобы изменить вторичную структуру спирали 89, которой принадлежит этот остаток. Для этой спирали можно предложить два варианта вторичной структуры (Рис. 9в). Тот вариант, который был определен методом РСА (Рис. 9в, слева), содержит  три неспаренных основания. Альтернативный, гипотетический  вариант (Рис. 9в, справа) содержит лишь одно неспаренное основание. Мы внесли в спираль 89 23S рРНК ряд мутаций, UUU2491-3UC, A2459G, U2491C, U2491C/A2459G, G2458C, U2491C/G2458C, каждая из которых влияла на предполагаемый переход между двумя альтернативными структурами.

Рисунок 9. “Ворота”, через которые происходит перемещение аа-тРНК из А/Т в А/А участок. А. Расположение “ворот” (показаны красным) в структуре 50S субчастицы. Б. Нуклеотиды U2492, C2556 и C2573 во фрагменте вторичной структуры 23S рРНК. В. Варианты вторичной структуры спирали 89 23S рРНК. Слева - вариант вторичной структуры, определенный с помощью РСА. Слева -, предсказанный на основе ковариационного анализа. Г. Предполагаемое влияние мутаций в спирали 89 на ее вторичную структуру. Нуклеотиды, измененные с помощью мутагенеза, показаны красным. Светло-серым показан тот вариант структуры, который, предположительно, дестабилизируется мутацией; черным – вариант структуры, который стабилизируется.

Среди введенных в 23S рРНК мутаций летальными оказались делеции нуклеотидов C2573 и А2572, а также замена UUU последовательности 2491-2493 на UC. Остальные мутации в разной степени замедляли рост клеток, но не были летальными, даже если все рибосомы в клетке содержали мутацию. Измерение скоростей роста клеток позволило заключить, что мутации, дестабилизирующие “альтернативную” вторичную структуру не влияют на процесс трансляции. Напротив, мутации, дестабилизирующие вторичную структуру, наблюдаемую при помощи РСА, приводили к замедлению роста клеток. Мутация UUU2491-3UC, полностью исключающая образование вторичной структуры, наблюдаемой при помощи РСА, была летальна. На основании этих наблюдений можно сделать вывод о том, что “альтернативная” вторичная структура не реализуется в ходе трансляции.

В чем причина летальности, вызываемой мутацией UUU2491-3UC? Проверка эффективности связывания fMet-тРНКfMet с Р участком и Phe-тРНКPhe с А участком показала, что мутация UUC2491-3UC приводит к снижению степени связывания тРНК на 20% с Р-участком и на 50% с А участком. Эффективность переноса пептида, катализируемого мутантными рибосомами, была проверена с помощью гидролиза пептидил-тРНК, выделенной из комплекса с рибосомами, содержащими мутацию UUC2491-3UC и разделения продуктов гидролиза с помощью ВЭЖХ. Оказалось (Рис. 10а), что эта мутация полностью ингибирует пептидилтрансферазную реакцию. Полученный результат уникален, поскольку ни одна из изученных до сих пор мутаций не приводила к полному ингибированию переноса пептида на аминоацил-тРНК. В литературе описаны лишь мутации, предотвращающие перенос пептида на пуромицин. Поддержание вторичной структуры спирали 89 23S рРНК оказалась важным для пептидилтрансферазной реакции.

Рисунок 10. Влияние мутаций в элементах вторичной структуры, образующих “ворота”, через которые происходит перемещение аа-тРНК из А/Т в А/А участок, на функционирование рибосомы. А. Влияние мутации UUC2491-3UC в спирали 89 23S рРНК на пептидилтрансферазную реакцию. Доля тРНК, вступившей в реакцию транспептидации. Синие столбики - fMet-тРНКfMet, зеленые столбики - Phe-тРНКPhe. В. Зависимость доли Phe-тРНКPhe переместившейся в А участок рибосомы от времени. Нумерация кривых соответствует рибосомам дикого типа (1) и рибосомам, несущим мутации A2572U (2), C2573A (3), 2573 (4) и 2572 (5).

Можно было предположить, что мутации нуклеотидов С2572 и А2573 будут влиять на размер “ворот”, через которые проходит аа-тРНК. В сотрудничестве с лабораторией Винтермайера-Родниной мы измерили константы скорости перемещения аа-тРНК в А участок рибосом, содержащих мутации A2572U, C2573A, 2573 и 2572. Мы ожидали, что в соответствии с моделью Санбонматсу, мутация C2573A будет уменьшать, а 2573 увеличивать скорость перемещения аа-тРНК в А участок. Для измерения констант скоростей перемещения аа-тРНК в А участок использовали взаимодействие комплекса рибосом, содержащего fMet-тРНКfMet в Р участке с комплексом Phe-тРНКPhe*EF-Tu*GTP. Скорость перемещения аа-тРНК в А участок оценивали по образованию дипептида, поскольку скорость пептидилтрансферазной реакции на 2 порядка превышает скорость перемещения аа-тРНК. Кинетические кривые, описывающие процесс перемещения Phe-тРНКPhe в А участок рибосом и соответствующие константы скорости представлены на рисунке 10б. Оказалось, что константы скорости перемещения аа-тРНК в А участок рибосом изменяются несущественно в результате мутаций A2572U, C2573A, 2573 и 2572 в 23S рРНК. Это значит, что гипотеза Санбонматсу о важности размера “ворот”, образованных нуклеотидами С2573, U2492 и С2556, как фактора, определяющего скорость перемещения аа-тРНК не подтверждается.

Изучение роли Е участка в работе рибосомы с помощью мутации С2394G, препятствующей связыванию тРНК с Р и Р/Е участками

После переноса пептида с пептидил-тРНК, связанной с Р участком, на аминоацильный остаток тРНК, находящийся в А участке, комплекс рибосомы с мРНК и двумя тРНК должен претерпеть самую значительную конформационную перестройку в функциональном цикле рибосомы, транслокацию, катализируемую EF-G*GTP. Первой стадией транслокации, не требующей гидролиза GTP, служит переход тРНК в гибридные участки. Пептидил-тРНК переходит из А/А участка в А/Р участок, а деацилированная тРНК из Р/Р в Р/Е участок. Присутствие деацилированной тРНК, связанной с Р участком способствует связыванию EF-G и увеличивает скорость цикла его работы, измеренную по скорости не сопряженного с транслокацией гидролиза GTP. Оставалось неясным, что же служит сигналом для стимуляции связывания EF-G - отсутствие пептида, присоединенного к ССА концу тРНК, находящейся в Р участке или возможность перехода тРНК в гибридный Р/Е участок?

Кроме функциональной роли гибридного Р/Е участка оставалась неясной и роль самого Е участка. Согласно представлениям группы Витермайера-Родниной, роль Е участка сводится к понижению энергетического барьера транслокации. Согласно аллостерической модели рибосомы, предложенной Ниерхаусом, роль Е участка состоит также в поддержании рамки считывания  и снижении числа ошибок декодирования. Кроме того, считается, что связывание тРНК с Е участком прочное и разрушается только при взаимодействии с А участком следующей аа-тРНК в комплексе с EF-Tu*GTP.

Рисунок 12. Взаимодействие нуклеотидов А76 тРНК и С2394 23S рРНК и его влияние на связывание тРНК с рибосомой. А. Пространственное окружение нуклеотида A76 тРНК. Б. Зависимость степени связывания тРНКPhe с рибосомами от соотношения тРНК/рибосома. Обозначение кривых указано справа. WT соответствует рибосомам дикого типа, G соответствует рибосомам, несущим мутацию C2394G. Присутствие или отсутствие полиуридиловой кислоты обозначено. тРНК, лишенные 3’-концевого остатка адениловой кислоты обозначены, как tRNA Δ3’-A. В. Оценка эффективности отдельных стадий элонгационного цикла.  Дорожки соответствуют: (1) рибосома, мРНК, кодирующая MFK пептид, fMet-тРНКfMet. Комплекс (2) образован из (1) добавлением Phe-тРНКPhe*EF-Tu*GTP+EF-Ts. Комплекс (3) образован из (2) с помощью добавления EF-G*GTP. Комплекс (4) образован из (3) с помощью добавления Lys-тРНКLys*EF-Tu*GTP+EF-Ts. Цифры соответствуют расстоянию  места остановки обратной транскрипции от А в инициаторном AUG кодоне. Использовали олигонуклеотид, комплементарный нуклеотидам 50-76 от инициаторного кодона. Рибосомы дикого типа - WT, несущие мутацию – C2394G.

Реакционная способность нуклеотида С2394 по отношению к DMS снижается при связывании тРНК с Е участком. С другой стороны, модификация этого нуклеотида DMS приводит к ингибирования связывания тРНК с Е участком. Недавно взаимодействие нуклеотида С2394 с 3’-концевым аденозином тРНК было прямо показано с помощью РСА (Рис. 12а). Известно, этот остаток аденозина необходим для связывания тРНК с Е участком.

Плазмида, несущая мутацию C2394G в гене 23S рРНК могла служить единственным источником рРНК в клетках. Время удвоения числа клеток получившегося штамма при росте на богатой среде при 37оС было 103±2 минуты. Штамм, трансформированный плазмидой, не несущей мутации С2394G, имел время удвоения 85±2 минуты. Мы решили проверить, действительно ли замена С2394G нарушает связывание тРНК с Е участком рибосомы? Мы определили число молекул деацилированной тРНК способное связаться с мутантными рибосомами (Рис. 12б). Связывание транспортной РНК как с рибосомами дикого типа, так и с мутантными рибосомами в отсутствии мРНК ограничивается Р участком. В присутствии полиуридиловой кислоты (polyU) в качестве мРНК две молекулы тРНКPhe, лишенной 3’-концевого аденозина, связывалась с рибосомами дикого типа и рибосомами, несущими мутацию С2394G. Значит, связывание тРНК с А и Р участками мутантных рибосом проходило нормально. Полноразмерная деацилированная тРНКPhe в присутствии polyU связывалась с А, Р и Е участками рибосом дикого типа. Мутантные рибосомы могли связать только две молекулы тРНК, что свидетельствовало о нарушении связывания с Е участком.

Для прямого связывания тРНК с Е участком мы использовали комплекс рибосом с мРНК, кодирующей дипептид fMet-Phe (MF). Связывание AcPhe-тРНКPhe с Р участком рибосомы, запрограммированной MF-мРНК (Табл. 1), приводило к тому, что AUG кодон, кодирующий метионин, оказывался в Е участке. Прямое связывание тРНКfMet могло проходить только с Е участком. Деацилированная тРНК хорошо связывалась с Е участком рибосом дикого типа. Е участок мутантных рибосом связывал в 4 раза меньше деацилированной тРНК (Табл. 1).

Таблица 1. Связывание деацилированной тРНКfMet с Е участком рибосом, запрограммированных мРНК, кодирующей MF пептид

Порядок добавления тРНК

Степень связывания тРНК (на рибосому)

Рибосомы дикого типа

Рибосомы, несущие мутацию C2394G

AcPhe-tRNAPhe

(P-участок)

tRNAfMet

(E-участок)

AcPhe-tRNAPhe

(P-участок)

tRNAfMet

(E-участок)

AcPhe-tRNAPhe

0.77 ± 0.04

0.95 ± 0.06

AcPhe-tRNAPhe,

tRNAfMet

0.76 ± 0.03

0.44 ± 0.05

0.91 ± 0.06

0.11 ± 0.03

Чтобы проверить, насколько прочно тРНК связывается с Е участком мутантных рибосом после транслокации мы провели пошаговую трансляцию модельной мРНК, кодирующей пептид fMet-Phe-Lys (MFK). Эффективность прохождения отдельных шагов трансляции мы оценивали с помощью тоупринтинга (Рис. 12в). Количество деацилированной 5’-[32P]-тРНКfMet, находящейся в комплексе с рибосомами, измеряли с помощью связывания рибосом с нитроцеллюлозными фильтрами. Связывание деацилированной тРНКfMet с Р участком (Рис. 12в, дорожки 1; Табл. 2) и AcPhe-тРНКPhe с А участком (Рис. 12в, дорожки 2) проходило одинаково эффективно для рибосом дикого типа и мутантных рибосом. Транслокация (Рис. 12в, дорожки 3) не приводила к уходу деацилированной тРНК из комплекса с рибосомами дикого типа, которая оставалась связанной с Е участком. Транслокация деацилированной тРНК в Е участок мутантных рибосом приводила к диссоциации комплекса тРНК и рибосомы (Табл. 2). Только связывание Lys-тРНКLys*EF-Tu*GTP с А участком рибосом дикого типа (Рис. 12в, дорожки 4) приводило к диссоциации комплекса деацилированной тРНК с Е участком рибосомы (Табл. 2). Таким образом, мутантные рибосомы не были способны удерживать деацилированную тРНК в Е участке.

Таблица 2. Количество деацилированной тРНКfMet , связанной с рибосомой, на различных стадиях трансляции мРНК, кодирующей MFК пептид

Стадия трансляции in vitro

Степень связывания тРНКfMet (на рибосому)

Рибосомы дикого типа

Рибосомы, несущие мутацию C2394G

Связывание tRNAfMet с P-участком

0.82 ± 0.01

0.83 ± 0.10

Связывание AcPhe-tRNAPhe с A-участком

0.76 ± 0.03

0.69 ± 0.05

Транслокация, катализируемая EF-G*GTP

0.70 ± 0.10

0.45 ± 0.08

Связывание Lys-tRNALys*EF-Tu*GTP с A-участком

0.45 ± 0.05

0.40 ± 0.04

Используя метод тоупринтинга для того, чтобы оценить эффективность отдельных шагов трансляции мы обратили внимание на то, что транслокация AcPhe-Lys-тРНКLys из А в Р участок мутантных рибосом происходит менее эффективно, чем транслокация AcPhe-Lys-тРНКLys из А в Р участок рибосом дикого типа (Рис. 12в, дорожки 4). Среди продуктов транслокации мутантных рибосом виден комплекс, сигнал тоупринтинга которого свидетельствует о произошедшем сдвиге рамки считывания (+22 нуклеотид от AUG кодона). Очевидно, что неспособность тРНК связываться с Е участком приводит к понижению эффективности транслокации и повышению вероятности сдвига рамки считывания.

Таблица 3. Частота ошибок трансляции в клетках дикого типа и клетках, несущих мутацию C2394G в 23S рРНК.

Плазмида, кодирующая ген-репортер

Тип ошибки трансляции, компенсирующей мутацию в гене lacZ

Клетки дикого типа

Клетки, несущие мутацию C2394G

pSG 853

Прочтение UAA, как смыслового

2.2 ± 0.6

7.3 ± 0.6

pSG 12-6

Прочтение UAG, как смыслового

7 ± 0.4

12 ± 0.5

pSG

Прочтение UGA, как смыслового

43 ± 2

64 ± 3

pSG lac7

Сдвиг рамки считывания +1

41 ± 2

74 ± 4

pSG 12DP

Сдвиг рамки считывания -1

44 ± 2

84 ± 5

f’CSH 103

Встраивание глютаминовой кислоты вместо глютамина

0.6 ± 0.1

0.6 ± 0.1

pSG25

Эффективность трансляции без ошибок

4280 ± 70

5990 ± 80

Приведены значения активности β-галактозидазы в единицах Миллера. Чем выше активность, тем выше частота ошибок трансляции.

Наблюдается ли повышенная частота сдвига рамки считывания в клетках, экспрессирующих rrnB оперон, несущий мутацию C2394G? Для оценки частоты сдвига рамки считывания в клетках мы воспользовались набором плазмид, каждая из которых несла ген lacZ с мутацией. Получение ферментативно активной β-галактозидазы могло произойти только если при трансляции происходила ошибка, компенсирующая мутацию в мРНК. Как показали результаты опыта (Табл. 3), мутация C2394G приводила к умеренному, примерно в 2 раза, повышению частоты как +1, так и -1 сдвига рамки считывания и не приводила к изменению частоты ошибок декодирования.

За счет чего рибосомы, несущие мутацию C2394G, оказались менее эффективны в реакции транслокации тРНК и мРНК, чем рибосомы дикого типа? Мы сравнили эффективность взаимодействия EF-G с рибосомами, имеющими мутацию C2394G, и рибосомами дикого типа. Связывание EF-G с рибосомами и их функциональными комплексами детектировали по защитам нуклеотидов А1067 (Рис. 13а) и А2661 23S рРНК от модификации DMS. Эффективность связывания EF-G с рибосомой падает в результате мутации C2394G. Влияние мутации C2394G на связывание EF-G можно объяснить только аллостерическим эффектом, поскольку  расстояние между нуклеотидом 2394 23S рРНК и участком связывания EF-G равно примерно 100.

Рисунок 13. Оценка влияния мутации C2394G 23S рРНК на связывание и функционирование EF-G. А. Влияние мутации С2394G 23S рРНК на взаимодействие EF-G с GAC. A, C, G, U дорожки определения нуклеотидной последовательности. К - немодифицированная 23S рРНК. WT - дикий тип, C2394 – рибосомы, несущие мутацию. Цифрами обозначены модифицированные DMS комплексы рибосомы: (1) без лигандов; (2) с мРНК, fMet-тРНКfMet, Phe-tRNAPhe*EF-Tu*GTP, EF-G*GMPPNP; (3) с мРНК, fMet-tRNAfMet, Phe-tRNAPhe*EF-Tu*GTP, EF-G*GTP и фусидовой кислотой; (4) с EF-G*GMPPNP; (5) с EF-G*GTP и фусидовой кислотой. Нуклеотид А1067 отмечен стрелкой справа. Для обратной транскрипции использовали олигонуклеотид, комплементарный нуклеотидам 1121-1140 23S рРНК. Б. Зависимость степени не сопряженного с транслокацией гидролиза GTP EF-G от времени. Гидролиз стимулировали рибосомами дикого типа (серые круги), рибосомами, несущими мутацию C2394G (серые треугольники), комплексами  рибосом дикого типа с polyU и тРНКPhe (черные круги) и комплексами  рибосом, несущими мутацию C2394G, с polyU и тРНКPhe (черные треугольники).

Чтобы оценить влияние мутации C2394G 23S рРНК на суммарную скорость цикла работы EF-G, мы измерили скорость не сопряженному с транслокацией гидролиза GTP. В этом модельном опыте рибосомы или их комплекс с мРНК и деацилированной тРНК смешиваются с EF-G и с избытком GTP. Скорость обмена GDP на GTP для EF-G велика по сравнению со скоростью цепочки превращений, происходящих с EF-G при связывании с рибосомой. Поэтому, скорость гидролиза GTP в выбранной экспериментальной системе отражает только суммарную скорость связывания рибосомы с EF-G, гидролиза GTP, конформационных превращений комплекса рибосомы с EF-G*GDP*Pi, выхода фосфат-иона, конформационных превращений комплекса рибосомы с EF-G*GDP и диссоциации этого комплекса. Таким методом не удается определить ту стадию функционального цикла EF-G, на которую влияет мутация C2394G 23S рРНК, но удается оценить влияние мутации на общую эффективность взаимодействия рибосомы с EF-G. Когда в Р участке рибосом находится деацилированная тРНК, суммарная скорость функционального цикла EF-G значительно возрастает. В претранслокационном комплексе, который служит естественным субстратом EF-G, в Р участке как раз находится деацилированная тРНК, в то время, как А участок занят пептидил-тРНК. Как это ни удивительно, для функционирования EF-G оказывается важным, что деацилированная тРНК занимает Р участок, даже если А участок свободен. Подобный вывод подтверждается также тем, что EF-G может катализировать транслокацию, только когда в Р участке находится полноразмерная тРНК. При этом достаточно, что в А участке находится только антикодоновая петля тРНК.

В соответствии с данными литературы, мы обнаружили, что деацилированная тРНК, связанная с Р участком рибосом дикого типа, оказывает стимулирующее влияние на скорость не сопряженного с транслокацией гидролиза GTP EF-G (Рис. 13б). Рибосомы, несущие мутацию C2394G в 23S рРНК, слабо стимулировали не сопряженную с транслокацией GTPазную активность EF-G вне зависимости от того, была тРНК связана с Р участком или нет (Рис. 13в). Таким образом, нарушение связывания тРНК с Е участком нарушает взаимодействие EF-G с модельным комплексом, имитирующим претранслокационное состояние рибосомы.

Как мутация, ингибирующая связывание тРНК с Е участком, может препятствовать формированию комплекса рибосомы с деацилированной тРНК в Р участке, узнаваемому EF-G? Известно, что если с Р участком рибосомы связана деацилированная тРНК, ее акцепторный конец может перемещаться в Е участок большой субчастицы. Такая тРНК оказывается связанной с гибридным Р/Е участком. Для того, чтобы определить, с каким участком мутантных рибосом связана деацилированная тРНК, мы использовали метод химической модификации. В первую очередь подтверждено, что рибосомы, несущие мутацию C2394G в 23S рРНК не могут связывать тРНК в Е участок. На радиоавтографах, интенсивность полос, соответствующих модификации нуклеотидов G2112 и G2116 кетоксалем, практически не изменялась при связывании тРНК с Е участком мутантных рибосом (Рис. 14а, дорожки 1 и 4). Для рибосом дикого типа защита нуклеотидов G2112 и G2116 от модификации кетоксалем наблюдалась уже при связывании деацилированной тРНК с Р участком (Рис. 14а, дорожка 2). Взаимодействие тРНК с Е участком 50S субчастицы дикого типа сохранялось и при связывании двух тРНК (деацилированной тРНКfMet в Р участок и AcPhe-тРНКPhe в А участок) (Рис. 14а, дорожка 3) и при последующей транслокации (Рис. 14а, дорожка 4). Защита нуклеотида U2585 23S рРНК дикого типа от модификации СМСТ возникала при связывании с рибосомой двух тРНК (деацилированной тРНКfMet в Р участок и AcPhe-тРНКPhe в А участок) (Рис. 14б, дорожка 3). После транслокации, когда в Р участке рибосом оказывалась не деацилированная, а AcPhe-тРНКPhe пониженный уровень модификации U2585 сохранялся (Рис. 14б, дорожка 4). Наши опыты свидетельствовали о связывании деацилированной тРНК в гибридный Р/Е участок как в комплексе рибосом дикого типа с одной тРНК, так и в претранслокационном комплексе рибосом дикого типа.  Напротив, рибосомы, несущие мутацию C2394G в 23S рРНК, связывали деацилированную тРНК в “классический” Р/Р участок. Защита нуклеотидных остатков G2112 и G2116 от модификации кетоксалем, характеризующая взаимодействие с Е участком при связывании деацилированной тРНК, не наблюдалась (Рис. 14а, дорожка 2). Нуклеотид U2585 23S рРНК мутантных рибосом оказывался защищенным от модификации 1-циклогексил-3-(2-морфолинил-4-этил)карбодиимидметил-п-толуолсульфонатом (CMCT) при связывании деацилированной тРНК (Рис. 14б, дорожка 2), что свидетельствовало о взаимодействии ССА конца тРНК с Р участком 50S субчастицы.

Связывание деацилированной тРНК происходит с Р участком рибосом, несущих мутацию C2394G в 23S рРНК, а не с Р/Е участком, как это наблюдается для рибосом дикого типа. Нарушение связывания тРНК с гибридным участком, вызванное мутацией,  коррелирует с отсутствием стимуляции не сопряженной с транслокацией GTPазной активности EF-G связыванием деацилированной тРНК. Теперь мы можем утверждать, что не само отсутствие пептидной группы, а именно способность деацилированной тРНК перемещаться в гибридный Р/Е участок важно для функциональной активности EF-G в комплексе с рибосомами.

Рисунок 14. Оценка влияния мутации C2394G 23S рРНК на связывание тРНК с Е (А) и Р (Б) участками. A, C, G, U - дорожки определения нуклеотидной последовательности. К - немодифицированная 23S рРНК. WT - 23S рРНК дикого типа, C2394 - 23S рРНК, несущая мутацию. Цифры соответствуют  комплексам рибосомы: (1) без лигандов; (2) с мРНК и тРНКfMet; (3) с мРНК, тРНКfMet и AcPhe-tRNAPhe; (4) с мРНК, тРНКfMet, AcPhe-tRNAPhe и EF-G*GTP. Нуклеотиды G2112, G2116 и U2585 отмечены стрелками. Использовали модификацию кетоксалем (А) и СМСТ (Б) и олигонуклеотиды, комплементарные нуклеотидам 2281-2301 23S рРНК (А) и 2649-2667 23S рРНК (Б).

Гибридный Р/Е участок находится на расстоянии около 100 от места связывания EF-G (Рис. 15). Как информация о переходе тРНК в Р/Е участок может влиять на EF-G? Между Р/Е участком и EF-G расположен пептидилтрансферазный центр, D петля 5S рРНК, спирали 80, 39, 42, 89, 91 23S рРНК и сам участок связывания EF-G, состоящий из GAC и SRL. Аллостерическая связь между Р/Е участком и EF-G должна осуществляться с помощью изменения конформации одного или нескольких из этих элементов структуры 50S субчастицы. Внося мутации в эти элементы, мы искали путь передачи аллостерического сигнала исходя их нескольких соображений.

Рисунок 15. Возможные участники конформационных перегруппировок, аллостерически связывающих Р/Е участок и участок связывания факторов элонгации. Разными цветами показаны и обозначены стрелками элементы 50S субчастицы, расположенные между Р/Е участком и участком связывания факторов элонгации. Расстояние от Е участка на большой субчастице до участка связывания факторов элонгации показано зеленой стрелкой.

Во-первых, структура 50S субчастицы, определенная с помощью РСА, выглядит монолитной (за исключением L1 пальца и GAC) и не позволяет точно идентифицировать подвижные элементы. Мы предполагаем существование нескольких конформаций элементов 50S субчастицы между Р/Е участком и участком связывания EF-G. Вносимые в 23S рРНК мутации могут влиять на конформационное равновесие и делать более стабильной ту конформацию, которая реализуется в процессе передачи аллостерического сигнала при функционировании EF-G, транслокации. В пользу такой интерпретации говорит сходный характер изменений структуры 23S рРНК, вызываемых мутациями в различных, удаленных друг от друга участках рРНК.

Во-вторых, мы ожидаем, что внося мутации в 23S рРНК на пути передачи аллостерического сигнала, мы нарушим эту передачу. Это значит, что EF-G перестанет различать, находится ли тРНК в Р/Е участке или нет. Теоретически, возможно создание мутаций 23S рРНК, вследствие которых EF-G будет либо все время взаимодействовать с рибосомой так, как если бы она содержала тРНК в Р/Е участке, либо наоборот, даже если тРНК и находится в Р/Е участке, EF-G слабо взаимодействует с таким комплексом, как будто тРНК в Р/Е участке нет. Дальнейшие разделы работы посвящены изучению с помощью мутагенеза функциональной роли элементов 23S рРНК между PTC и участком связывания EF-G.

Изучение функциональной значимости межсубчастичного мостика В1а: укорочение ASF

Спираль 38 23S рРНК (Рис. 16а) образует длинный выступ большой субчастицы, так называемый “палец А участка” (ASF). Этот выступ достигает “головы” малой субчастицы и образует контакт с С-концевым доменом белка S13. При связывании EF-G*GDPNP, согласно литературным данным, субчастицы рибосомы поворачиваются друг относительно друга и ASF, вместо белка S13, начинает взаимодействовать с белком S19. Заманчиво было предположить, что разрыв В1а мостика будет способствовать спонтанной и ускорять EF-G зависимую транслокацию.

Для изучения функциональной роли мостика В1а мы провели делецию нуклеотидов 872-905 23S рРНК, составляющих оконечность ASF, взаимодействующую с 30S субчастицей. Мутация не была летальной. Клетки, все рибосомы которых были лишены В1а мостика, росли со скоростью одно удвоение в 116±8 мин, в то время как клетки того же штамма, не содержащие мутации, удваивались каждые 87±8 мин. Измерение точности трансляции с помощью тестовых плазмид, кодирующих ген lacZ с мутациями, показало, что разрушение мостика В1а практически не влияет ни на прочтение стоп-кодонов как смысловых, ни не сдвиг рамки считывания, ни на ошибки декодирования.

Поскольку мы разрушили межсубчастичный мостик, сначала логично было проверить, влияет ли такая мутация на ассоциацию субчастиц? Оказалось, что рибосомные 50S субчастицы с делецией части спирали 38 требуют более высоких концентраций ионов магния, чтобы ассоциировать с малыми субчастицами. При концентрации Mg2+ 5мМ 70% 50S субчастиц дикого типа и 95% мутантных субчастиц не образовывали 70S рибосом. При концентрации Mg2+ 14мМ 85% 50S субчастиц дикого типа, но лишь 50% мутантных субчастиц  находились в составе 70S рибосом. Даже при концентрации Mg2+ 21мМ, когда 90% субчастиц дикого типа ассоциировали с 30S субчастицами, лишь 60% субчастиц с укороченной спиралью 38 23S рРНК ассоциировали с малыми субчастицами. Таким образом, мы показали, что разрушение В1а мостика нарушает ассоциацию субчастиц.

Известно, что структура В1а мостика меняется при взаимодействии с EF-G. Скажется ли разрушение этого мостика на эффективность работы EF-G? С помощью тоупринтинга мы проверили, влияет ли укорочение спирали 38 23S рРНК на эффективность отдельных стадий цикла элонгации (Рис. 16в). Оказалось, что связывание fMet-тРНКfMet с Р участком рибосом (Рис. 16в дорожки 1), Phe-тРНКPhe*EF-Tu*GTP с А участком рибосом (Рис. 16в дорожки 2) и транслокация, катализируемая EF-G*GTP (Рис. 16в дорожки 3,4) происходили с одинаковой эффективностью в случае рибосом дикого типа и рибосом с делецией нуклеотидов 872-905 23S рРНК. Можно сделать вывод о том, что все стадии элонгационного цикла рибосомы с нарушенным В1а мостиком выполняют с той же эффективностью, что и рибосомы дикого типа.

Рисунок 16. Делеция “пальца А участка” (ASF) и ее влияние на функционирование рибосом. А. Фрагмент вторичной структуры 23S рРНК. В черный прямоугольник обведены нуклеотиды 872-905, удаленные с помощью мутагенеза. Б. Расположение мостиков В1а (образованный ASF), В1b и B1c  в пространственной структуре большой субчастицы рибосом. В. Пошаговая трансляция in vitro.  Дорожки соответствуют функциональным комплексам рибосомы: (1) с мРНК и fMet-тРНКfMet. Комплекс (2) образован из (1) добавлением Phe-тРНКPhe*EF-Tu*GTP+EF-Ts. Комплекс (3) образован из (2) с помощью добавления EF-G*GTP. Комплекс (4) образован из (3) с помощью добавления Lys-тРНКLys*EF-Tu*GTP+EF-Ts. Цифры соответствуют расстоянию от А в инициаторном AUG кодоне. Использовали олигонуклеотид, комплементарный нуклеотидам 50-76 мРНК считая от инициаторного кодона. WT - дикий тип, Δ872-905-мутантные рибосомы. Г. Зависимость от концентрации EF-G скорости не сопряженного с транслокацией гидролиза GTP, стимулированного рибосомами дикого типа (черные квадраты), рибосомами, лишенными ASF (серые квадраты), комплексами  рибосом дикого типа с polyU и тРНКPhe (черные круги) и комплексами  рибосом, лишенными ASF с polyU и тРНКPhe (серые круги).

Рисунок 17. Влияние делеции ASF на структуру 23S и 5S рРНК. A, C, G, U -дорожки определения нуклеотидной последовательности. Wt - дикий тип, Δ - рибосомы, несущие делецию ASF Модификация проводилась DMS, котоксалем (Ket) и CMCT. Un – без модификации. Нуклеотиды, меняющие реакционную способность, показаны стрелками. Использовали олигонуклеотиды, комплементарные нуклеотидам 1104-1120 (А), 2281-2301 (Б), 2591-2611 (В), 2886-2903 (Г) 23S рРНК и 102-120 (Д) 5S рРНК.

Для того, чтобы определить влияние делеции нуклеотидов спирали 38 23S рРНК на скорость функционирования EF-G, мы измерили скорость не сопряженного с транслокацией гидролиза GTP элонгационным фактором G, стимулированным рибосомами дикого типа и мутантными рибосомами (Рис. 16г), а также комплексами рибосом с polyU и деацилированной тРНКPhe. За исключением несколько меньшей скорости гидролиза GTP, стимулированной комплексом мутантных рибосом с polyU и деацилированной тРНКPhe, по сравнению с тем же комплексом рибосом дикого типа, никаких существенных отличий найдено не было. Этот результат свидетельствует против того, что В1а мостик и его изменения в ходе транслокации существенны для работы EF-G.

Для нас было интересным оценить, как отсутствие мостика В1а сказывается на структуре рибосомы. Мы повели химическую модификацию рибосом, у которых спираль 38 содержала делецию нуклеотидов 872-905 DMS, кетоксалем и CMCT (Рис. 17). Спираль 38 взаимодействует с Е петлей 5S рРНК и спиралью 81 23S рРНК. Спираль 81, в свою очередь, связана со спиралью 80, т.н. Р петлей 23S рРНК. Между спиралями 80 и D-петлей 5S рРНК расположена спираль 39 23S рРНК. Весь этот узел третичной структуры 23S рРНК оказался измененным под влиянием делеции конца спирали 38 23S рРНК. Нуклеотиды U2249, G2250 и G2255 Р петли (спирали 80), U89 D петли 5S рРНК и G956 спирали 39 23S рРНК стали более реакционноспособными по отношению к химическим реагентам (Рис. 17 а,б,д). Некоторые из этих нуклеотидных остатков вовлечены в третичные взаимодействия сами, некоторые соседствуют с нуклеотидами, вовлеченными в третичные взаимодействия с нуклеотидами спиралей 42 и 89. Две последние спирали расположены между PTC и центром связывания трансляционных факторов GTPаз, состоящим из GAC и SRL (Рис. 15). Очевидно, что эти спирали несколько изменили свое положение в пространстве как единое целое. Этим можно объяснить влияние делеции нуклеотидов 872-905 на реакционную способность нуклеотидов G2529 и G2751, участвующих в третичных взаимодействиях со спиралями 89 и 42, соответственно.

Изучение роли взаимодействия между спиралями 39 23S рРНК и D петлей 5S рРНК в формировании структуры PTC и участка предполагаемой передачи аллостерического сигнала

Петля спирали 39 расположена между Р петлей 23S рРНК, взаимодействующей с ССА концом тРНК, находящейся в Р участке, и D петлей 5S рРНК (Рис. 15). Спираль 39 расположена таким образом, что может участвовать в передаче аллостерического сигнала от Р/Е участка к месту взаимодействия с EF-G. Делеция части ASF привела к усилению степени модификации нуклеотида G956 петли спирали 39 кетоксалем (Рис. 17в). Спираль 39 привлекла наше внимание еще до определения пространственной структуры 50S субчастицы рибосомы. В нашей лаборатории, с помощью фотоаффинного сшивания, было обнаружено, что D петля 5S рРНК соединяет спирали 39, 42 и 89 23S рРНК. Эти спирали сближены с GAC и PTC во вторичной структуре 23S рРНК. Именно тогда, еще до определения структуры большой субчастицы рибосомы с атомарным разрешением, в нашей лаборатории была сформулирована гипотеза о передаче аллостерического сигнала между PTC и участком связывания EF-G.

Замены нуклеотида А960 на G, C и U оказались не летальными. Рибосомы, несущие эти мутации могли поддерживать жизнь клеток, в которых не было рибосом дикого типа. Замены A960G и А960U практически не меняли времени удвоения клеток, составляющему 119±1 минута для клеток дикого типа, 107±8 минут для клеток, несущих мутацию А960G в 23S рРНК и 125±3 минуты для мутанта А960U. Замена нуклеотида А960 на цитидин (А960С) замедляла рост клеток (время удвоения 175±4 минуты).

Мы использовали химическую модификацию рибосом DMS, кетоксалем и CMCT для определения нуклеотидных остатков 23S и 5S рРНК, изменяющих свою конформацию в результате мутаций нуклеотида А960. Как и ожидалось, мутации изменяли структуру петли спирали 39 и D петли 5S рРНК (Рис. 18 а,б). Степень изменения реакционной способности коррелировала со степенью влияния мутаций на скорость роста клеток.

Рисунок 18. Влияние мутаций нуклеотида А960 на структуру 23S. A, C, G, U - дорожки определения нуклеотидной последовательности. Нуклеотид 960 23S рРНК обозначен над дорожками. RNA – депротеинизированная рРНК дикого типа. Обработка проводилась DMS, кетоксалем (Kethoxal) и CMCT. Un –без обработки. Нуклеотиды, изменяющие реакционную способность,  показаны стрелками. Использовали олигонуклеотиды, комплементарные нуклеотидам 2591-2611 (А, Б), 1049-1059 (В), 2886-2903 (Г), 2281-2301 (Д) 2730-2749 (Ж) 23S рРНК.

       

Наибольшее отличие от дикого типа имели рибосомы, несущие мутацию А960С. Кроме нуклеотидов, непосредственно взаимодействующих со спиралью 39, мы обнаружили еще несколько нуклеотидов 23S рРНК, которые меняли свою реакционную способность по отношению к DMS, кетоксалю или CMCT при мутациях А960 (Рис. 18 в-ж). Эти нуклеотиды были расположены вблизи, либо входили в состав PTC. Наиболее удивительным было то, что нуклеотиды G2251, G2252, U2506, U2585, защищаемые от химической модификации при связывании тРНК с Р участком рибосом, также оказывались защищены в рибосомах, несущих мутации А960 (Рис. 18 г,е,ж). Особенно сильным было изменение реакционной способности нуклеотидов PTC при замене А960С. Нарушение структуры спирали 39 23S рРНК приводит к конформационному изменению ПТЦ, делающему недоступными для химической модификации нуклеотиды, взаимодействующие с тРНК в Р участке.

Рисунок 19. Расположение нуклеотидов, степень модификации которых уменьшалась (синие) или увеличивалась (красные) при мутациях нуклеотида А960 23S рРНК. Зеленым показана спираль 89 23S рРНК.

Можно было предположить, что подобное изменение структуры, также делает эти нуклеотиды недоступными для взаимодействия с тРНК. В таком случае мы можем иметь дело со стабилизацией конформации 50S субчастицы, при которой нарушено взаимодействие тРНК с Р участком большой субчастицы. Эта конформация может реализовываться в ходе транслокации, при перемещении тРНК в участки А/А + Р/Е. Пространственное расположение нуклеотидов, которые меняют конформацию в результате мутации А960С представлено на рисунке 19. Эти нуклеотиды образуют третичные взаимодействия между спиралями 39, 89, 91, 92 23S рРНК и D петлей 5S рРНК. Изучение рибосом, несущих мутации нуклеотида А960, подтвердило, что 50S субчастица имеет участки конформационной подвижности между PTC и местом связывания EF-G. Необходимо было определить, какой из элементов большой субчастицы, расположенных между двумя ее функциональными центрами, необходим для передачи аллостерического сигнала.

Изучение роли взаимодействия между спиралями 89 и 91 23S рРНК в функционировании факторов трансляции - GTPаз

Петли спиралей 89 и 91 23S рРНК находятся между GAC и SRL, двумя участками связывания факторов трансляции, имеющих GTPазную активность (Рис. 15). Хотя реакционная способность нуклеотидов спиралей 89 и 91 по отношению к химическим модифицирующим реагентам не меняется при связывании EF-G с рибосомой, IF2 защищает нуклеотиды A2476 и A2478 спирали 89 23S рРНК от модификации DMS. Участок 23S рРНК, изменяющий свою реакционную способность по отношению к DMS при связывании фактора, участвует в третичных взаимодействиях со спиралью 91 23S рРНК. Эти две спирали связывает неканоническая, так называемая обращенная Уотсон-Криковская пара C2475 – G2529. Для изучения функциональной важности этих взаимодействий в 23S рРНК были введены мутации: C2475G, двойная мутация C2475G/G2529C и делеция пары A2471 - U2479. Мутация C2475G, не разрушала взаимодействие спирали 89 с петлей спирали 91. Псевдокомпенсаторная мутация C2475G/G2529C наоборот, приводила к разобщению спиралей 89 и 91. Делеция A2471/U2479 приводила к тому, что петля спирали 89 смещалась от участка взаимодействия с трансляционными факторами GTPазами к PTC. Взаимодействие со спиралью 91 также нарушалось. Все мутации оказались не летальными, и соответствующие мутантные рибосомы могли осуществлять трансляцию в клетках, в которых отсутствовали рибосомы дикого типа. Скорость роста клеток штамма, в котором все рибосомы имели мутацию C2475G (время удвоения 87±8 мин) не отличалась от скорости роста штамма, в котором функционировали только рибосомы дикого типа (время удвоения 85±8 мин). Мутация C2475G/G2529C приводила к увеличению времени удвоения клеток до 134±10 мин. Укорочение спирали 89 (ΔA2471/U2479) приводило к самому сильному замедлению роста (время удвоения 220±16 мин).

Для оценки роли взаимодействия петель спиралей 89 и 91 в поддержании точности трансляции мы использовали систему плазмид, в которых был закодирован ген lacZ. Мутации, внесенные в этот ген, могли быть компенсированы ошибками при трансляции считанной с него мРНК. Оказалось, что взаимодействие петель спиралей 89 и 91 не важно для поддержания точности декодирования.

Эффективность отдельных стадий трансляции, осуществляемой мутантными рибосомами, мы оценивали с помощью метода тоупринтов. Для этих опытов использовали мРНК, кодирующую пептид MFK. Связывание fMet-тРНКfMet с Р участком, связывание Phe-тРНКPhe*EF-Tu*GTP с А участком и транслокация проходили одинаково эффективно с рибосомами дикого типа и мутантными рибосомами. Кроме того, все типы мутантных рибосом были способны стимулировать не сопряженный с транслокацией гидролиз GTP элонгационным фактором G в той же степени, что и рибосомы дикого типа. Получив подобные результаты, мы пришли к заключению, что взаимодействие спиралей 89 и 91 не важно для функционирования ни EF-Tu, ни EF-G и вообще для элонгации трансляции.

       Согласно литературным данным, петля спирали 89 взаимодействует с инициаторным фактором 2. Этот фактор, как EF-Tu и EF-G, связывает GTP, однако, катализирует другой процесс – отбор fMet-тРНКfMet и ассоциацию субчастиц при инициации. Связывание IF2*GDPNP с рибосомами мы детектировали, наблюдая за защитой оснований 23S рРНК от химической модификации (Рис. 20а). Поскольку было известно, что IF2 E. coli связывается с рибосомой слабо и не способен защищать нуклеотиды 23S рРНК от химической модификации, мы использовали IF2 T. thermophilus. Как было известно, взаимодействие IF2 с рибосомой приводит к уменьшению реакционной способности нуклеотида А2665 и повышению реакционной способности нуклеотида А2660 23S рРНК по отношению к DMS. Все мутантные рибосомы были способны связывать IF2*GDPNP, однако степень связывания отличалась у рибосом, несущих мутации. Оценка степени связывания IF2*GDPNP проводилась с помощью сравнения реакционной способности нуклеотидов А2660 и А2665 по отношению к DMS. Мы использовали такой своеобразный “внутренний контроль”, чтобы небольшие отличия в интенсивности дорожек радиоавтографа соответствующего полиакриламидного геля, в котором разделяли продукты обратной транскрипции, минимально влияли на результаты нашей оценки. Мутация ΔA2471/U2479 не влияла на связывание с рибосомой IF2*GDPNP (Рис. 20а). Одиночная замена C2475G немного (примерно на 20%) ухудшала взаимодействие IF2 с рибосомой (Рис. 20а). Двойная мутация C2475G/G2529C приводила к снижению эффективности изменения реакционной способности нуклеотидов А2660 и А2665 23S рРНК на 60% (Рис. 20а). Ни одна из изученных мутаций не приводила к полному ингибированию связывания IF2 с рибосомой, что вполне согласуется с тем, что мутации не были летальными.

Рисунок 20. Влияние мутаций в участке контакта спиралей 89 и 91 23S рРНК на инициацию трансляции. А. Оценка взаимодействия IF2 с SRL и влияние на нее мутаций в участке контакта спиралей 89 и 91 23S рРНК. A, C, G и U -дорожки определения нуклеотидной последовательности. Для модификации использовали DMS. Un- 23S рРНК без модификации. WT-дикий тип, 89 –мутация C2475G, 89/91 - мутации C2475G/G2529C, Δ - делеция A2471/U2479. Дорожки, находящиеся справа в отделенных вертикальными лилиями столбцах соответствуют рибосомам без лигандов; Дорожки, находящиеся слева в отделенных вертикальными лилиями столбцах соответствуют комплексам рибосом и IF2*GDPNP. Нуклеотиды А2660 и А2665 отмечены стрелкой справа. Использовали олигонуклеотид, комплементарный нуклеотидам 2730-2749 23S рРНК. Б. Зависимость от концентрации рибосом скорости не сопряженного с транслокацией гидролиза GTP инициаторным фактором 2, стимулированного рибосомами дикого типа (квадраты), рибосомами, несущими мутацию C2475G (ромбы), рибосомами, несущими мутацию C2475G/G2529C (треугольники) и рибосомами, несущими делецию пары нуклеотидов A2471/U2479 (круги). В. Оценка с помощью тоупринтинга влияния IF2 на образование инициаторного комплекса. Дорожки соответствуют: (К) мРНК; (-) комплексам рибосомы, мРНК, fMet-тРНКfMet, IF1 и IF3; (+) комплексам рибосомы, мРНК, fMet-тРНКfMet, IF1, IF2 и IF3. Полоса, соответствующая инициаторному комплексу, отмечена цифрой +16. Использовали олигонуклеотид, комплементарный нуклеотидам 50-76 мРНК считая от инициаторного кодона. Подписи дорожек - как на панели (А).

Рисунок 21. Влияние мутаций в участке контакта спиралей 89 и 91 23S рРНК на структуру 23S. A, C, G, U - дорожки определения нуклеотидной последовательности. Модификацию проводили  DMS, кетоксалем (Ket) и CMCT. Un – без модификации. Подписи дорожек, как для рис. 20. Нуклеотиды, степень модификации которых зависела от мутаций, показаны стрелками. Для обратной транскрипции использовали олигодезоксирибонуклеотиды, комплементарные нуклеотидам 2591-2611 (А, Б), 1049-1059 (В), 2886-2903 (Г) и 2281-2301 (Д) 23S рРНК.

Опыты по изучению связывания IF2 с рибосомой были дополнены измерением GTPазной активности IF2, индуцируемой рибосомами (Рис. 20б). Рибосомы, несущие укороченную спираль 89 (ΔA2471/U2479) хуже, чем рибосомы дикого типа, способствовали гидролизу GTP инициаторным фактором 2. Рибосомы, несущие мутации C2475G и C2475G/G2529C, были более эффективны в стимуляции GTPазной активности IF2. Кажущееся противоречие между результатами измерения связывания с рибосомами и GTPазной активности IF2 можно объяснить. Сходный феномен наблюдался в лаборатории Далберга при изучении связывания и не сопряженной с транслокацией GTPазной активности EF-G. Объяснение подобных результатов состоит в том, что фактор трансляции может связаться с рибосомой, гидролизовать GTP, и покинуть рибосому, не выполнив свою функцию – то или иное изменение конформации функционального комплекса рибосомы. Прочное связывание, необходимое для выполнения функции, препятствует “холостому” гидролизу GTP.

       Как же мутации в спиралях 89 и 91 влияют на выполнение фактором IF2 своей функции – сборке комплекса рибосом с мРНК, содержащего fMet-тРНКfMet в Р участке? Для ответа на этот вопрос мы использовали метод тоупринтов. Для определения влияния IF2 на сборку инициаторных комплексов сравнивали интенсивности сигналов тоупринтинга, соответствующих инициаторным комплексам, собранным в присутствии всех трех инициаторных факторов и в присутствии только IF1 и IF3 (Рис. 20в). Все мутантные рибосомы были способны образовывать инициаторный комплекс, и для всех мутантных рибосом присутствие IF2 способствовало сборке этого комплекса. Количественные оценки показали, что для мутации ΔA2471/U2479 23S рРНК, активность IF2 в сборке инициаторного комплекса снижена на 30%. Мутации C2475G и C2475G/G2529C  23S рРНК снижали эффективность работы IF2 вдвое. Эти результаты хорошо согласуются с интерпретацией результатов оценки связывания IF2 с рибосомой и измерения GTPазной активности IF2, стимулируемой рибосомами. Мутации C2475G и C2475G/G2529C  23S рРНК приводят к тому, что возрастает вероятность диссоциации комплекса IF2*GDP с рибосомой без образования инциаторного комплекса. Такое “холостое” связывание приводит к перерасходу GTP и снижению эффективности инициации трансляции. Слишком прочное связывание IF2, характерное для рибосом, несущих делецию пары оснований в спирали 89, также замедляет инициацию, препятствуя уходу IF2.

Рисунок 22. Расположение нуклеотидных остатков 23S рРНК, реакционная способность которых зависит от мутаций в участке контакта спиралей 89 и 91 23S рРНК во вторичной (А) и пространственной (Б) структуре 50S субчастицы. Черные линии соединяют те нуклеотиды, которые участвуют в третичных взаимодействиях. Красными треугольниками (А) и черными сферами (Б) отмечены нуклеотиды, реакционная способность которых повышается при мутациях в участке контакта спиралей 89 и 91 23S рРНК. Черные прямоугольники – места мутаций. 

Петли спиралей 89 и 91 находятся на предполагаемом пути передачи аллостерического сигнала от Р/Е участка большой субчастицы к EF-G (Рис. 15). Хотя мутации, нарушающие взаимодействие этих петель, не сказываются на функционировании EF-G, нам показалось интересным выяснить, какие изменения они вызывают в конформации 23S рРНК? Возможно, не прервав цепь передачи аллостерического сигнала полностью, мутации могли сместить равновесие конформеров 23S рРНК. Обнаружение нуклеотидов 23S рРНК, которые изменили свою реакционную способность в результате мутаций в спиралях 89 и 91, позволило бы выявить подвижные элементы 23S рРНК, расположенные между PTC и участком, взаимодействующим с факторами элонгации.

       Химическая модификация рибосом, несущих мутации C2475G, C2475G/G2529C и ΔA2471/U2479 23S рРНК, проводилась с помощью DMS, кетоксаля и CMCT. Степень модификации тех или иных оснований 23S рРНК определялась с помощью обратной транскрипции. Были обнаружены несколько нуклеотидных остатков 23S рРНК, реакционная способность которых по отношению к используемым реагентам менялась в результате мутаций (Рис.21). Степень изменения конформации рРНК, вызванная мутациями, коррелировала с замедлением скорости роста клеток. Замена C2475G 23S рРНК практически не вызывала изменений реакционной способности нуклеотидов 23S рРНК (Рис. 21). Двойная мутация C2475G/G2529C привела к изменению реакционной способности нуклеотидов G2472, G2475(место мутации), A2476, U2477, C2529(место мутации), A2534 23S рРНК в спиралях 89 и 91 (Рис. 21 а,б). Очевидно, что двойная мутация привела к нарушению взаимодействия между спиралями 89 и 91. Кроме нуклеотидов, сближенных с местом мутации, изменили конформацию несколько нуклеотидов 23S рРНК, расположенных на расстоянии. Так, стали более доступны для реакции с кетоксалем нуклеотиды G956 (Рис. 21в) и G2751 (Рис. 21г), принадлежащие петлям спиралей 39 и 97 23S рРНК. Обе эти петли участвуют в третичных взаимодействиях с удаленными во вторичной структуре 23S рРНК участками (Рис. 22 а).

Возможно, что эти третичные взаимодействия могут нарушаться в ходе передачи аллостерического сигнала от Р/Е участка к EF-G. Нуклеотид G956 расположен в непосредственной близости от PTC (Рис. 22 а,б), а нуклеотид G2751 образует третичный контакт со спиралью 42 23S рРНК (Рис. 22 а,б), соединяющей GAC с оставшейся частью 23S рРНК. Делеция нуклеотидов A2471/U2479 23S рРНК приводит к изменению реакционной способности тех же нуклеотидов 23S рРНК, что и мутация C2475G/G2529C, но дополнительно изменяет конформацию еще нескольких нуклеотидов (Рис. 21). В спирали 89 оказываются реакционноспособными по отношению к кетоксалю нуклеотиды G2470 и G2481 (Рис. 21 а). Это наблюдение свидетельствует о разрушении части вторичной структуры спирали 89. Неожиданным было обнаружить, что мутация ΔA2471/U2479 23S рРНК приводит к усилению модификации нуклеотида А2225 23S рРНК DMS (Рис. 21 д). Нуклеотид А2225 расположен в основании L1 пальца большой субчастицы, с противоположной стороны от GAC и спиралей 89 и 91. Хотя петлю спирали 89 и нуклеотид А2225 разделяет значительное расстояние (Рис. 22 б), они связаны двумя длинными спиралями 89 и 75, симметрично расположенными относительно PTC (Рис. 22 а,б). Можно предположить, что участок связывания факторов элонгации и L1 палец аллостерически связаны спиралями 89 и 75. К этому выводу можно также прийти, в результате анализа структуры комплекса рибосомы с EF-G*GDPNP, определенной методом криоЭМ. Два самых подвижных элемента большой субчастицы, GAC и L1 палец, подвержены в этом комплексе скоординированному перемещению в сторону центрального протуберанца большой субчастицы.

       

Изучение роли нуклеотида G2655 SRL 23S рРНК в связывании EF-G и транслокации

Элонгационный фактор G взаимодействует с двумя элементами 23S рРНК – SRL и GAC. Сарцин-рициновая петля абсолютно необходима для взаимодействия рибосомы с элонгационными факторами. Апуринизация А2660 рицином и разрезание связи между нуклеотидами G2661 и А2662 сарцином приводит к инактивации рибосом. Нуклеотидный остаток G2655 защищается от модификации кетоксалем при связывании с рибосомой факторов элонгации. Мутации этого нуклеотида G2655C и G2655U были описаны как летальные. Применение криоЭМ позволило определить, что SRL взаимодействует с участком связывания GTP элонгационными факторами. Можно было предположить, что это взаимодействие необходимо для гидролиза GTP.

Мы провели замены нуклеотида G2655 23S рРНК на A, C и U. Мутация G2655U, в отличие от ранее опубликованных данных, оказалась не летальной, замена G2655А не влияла на функционирование рибосом. Однако, мутация G2655C была летальной, и мы использовали рибосомы, несущие эту мутацию в дальнейших опытах.

Рисунок 23. Оценка влияния мутации G2655С 23S рРНК на связывание и функционирование EF-G. А. Оценка взаимодействия EF-G с GAC и влияние на нее мутации G2655С 23S рРНК. A, G -дорожки определения нуклеотидной последовательности. Модификацию проводили DMS, Unmod -немодифицированная 23S рРНК WT - дикий тип, G2655С – рибосомы, несущие мутацию. Дорожки: (-EF-G) рибосомы без лигандов; (EF-G) комплекс рибосом и EF-G*GTP; (EF-G+Fus) комплекс рибосом, EF-G*GTP и фусидовой кислоты. Нуклеотид А1067 отмечен стрелкой. Использовали олигонуклеотид, комплементарный нуклеотидам 1121-1140 23S рРНК. Б. Оценка взаимодействия EF-G с SRL и влияние на нее мутации G2655С 23S рРНК. Обозначения соответствуют таковым для панели A. Нуклеотиды А2660 и G/С2655 отмечены стрелкой. Использовали олигонуклеотид, комплементарный нуклеотидам 2730-2749 23S рРНК. В. Зависимость степени не сопряженного с транслокацией гидролиза GTP EF-G от времени. Гидролиз стимулировали рибосомами дикого типа (черные квадраты), рибосомами, несущими мутацию G2655С (черные треугольники), рибосомами дикого типа в присутствии фусидовой кислоты (серые квадраты) и рибосомами, несущими мутацию G2655С в присутствии фусидовой кислоты (серые треугольники). Г. Изучение влияния мутации G2655С 23S рРНК на эффективность транслокации. Белые столбцы соответствуют функциональным комплексам рибосом дикого типа, черные – комплексам рибосом, несущих мутацию G2655С 23S рРНК. (1) рибосомы, polyU и AcPhe-тРНКPhe; (2) комплекс (1) + AcPhe-тРНКPhe; (3) комплекс (2) + EF-G*GTP.

Мы оценивали связывание EF-G с рибосомами по степени модификации нуклеотидов А1067 (Рис. 23а) и А2660 DMS (Рис. 23б). Основание А1067 принадлежит GAC, а А2660 – SRL. Оценивая степень модификации этих нуклеотидов, можно было получить ответ на вопрпос, взаимодействует ли EF-G с GAC и взаимодействует ли он с SRL. Оказалось, что связывание EF-G с GAC не было подвержено влиянию мутации G2655C (Рис. 23а). В то же время, заимодействие EF-G с SRL в результате этой мутации было значительно ослаблено (Рис. 23б).

Было известно, что SRL взаимодействует именно с той частью EF-G, которая связана с GTP. Влияет ли мутация G2655C 23S рРНК на стимуляцию GTPазной активности EF-G рибосомами? Мы использовали не сопряженный с транслокацией гидролиз GTP, для оценки способности EF-G взаимодействовать с рибосомами и осуществлять гидролиз гуанозин - 5’- трифосфата (Рис. 23в). Оказалось, что рибосомы, несущие мутацию G2655C 23S рРНК, стимулируют не сопряженный с транслокацией гидролиз GTP, осуществляемый EF-G, в той же степени, что и рибосомы дикого типа (Рис. 23в). Может быть, эта мутация вообще не влияет на функционирование EF-G?

Для оценки эффективности транслокации, катализируемой EF-G, мы использовали пуромициновую реакцию (Рис. 23г). Способность мутантных рибосом к транслокации была значительно, примерно в 3 раза, снижена. В этом опыте мы не измеряли скорость транслокации, а лишь выход этой реакции за 10 минут. Такой низкий уровень транслокации в течении длительного для элонгационного цикла рибосомы времени свидетельствовал о том, что в клетке рибосомы, несущие мутацию G2655C должны быть практически неактивны в трансляции, что и объясняет летальность мутации. За те же 10 минут мутантные рибосомы стимулировали количественный гидролиз 100-кратного избытка GTP, осуществляемого EF-G. Значит, рибосомы, имеющие мутацию G2655C 23S рРНК, связывают EF-G*GTP и стимулируют гидролиз трифосфата, после чего комплекс рибосомы с EF-G*GDP диссоциирует без прохождения конформационных изменений, необходимых для транслокации.

Сходное явление было описано в литературе для EF-G, в котором домены I и V были сшиты дисульфидной связью. Такой, “конформационно-ограниченный” EF-G взаимодействовал с GAC 50S субчастицы дикого типа и не взаимодействовал с SRL. Отсутствие взаимодействия с SRL не препятствовало гидролитической активности EF-G, но делало транслокацию невозможной. Мы наблюдали практически такой же эффект, нарушая взаимодействие EF-G с SRL с помощь мутации G2655C. Основываясь на результатах этих опытов, можно предложить, в какой последовательности происходят конформационные превращения комплекса EF-G с рибосомой. Взаимодействие EF-G с GAC (или GAC-связывающими белками L11 и L7/L12) первично. Для него не требуется “разгибания” субдоменов I-III и IV-V. Взаимодействие EF-G с GAC приводит к гидролизу GTP. Затем, для катализа транслокации, необходимо изменить взаиморасположение субдоменов EF-G. Это изменение конформации EF-G требует стабилизации, достигаемой дополнительно возникающим взаимодействием EF-G с SRL. GAC и SRL оказываются не просто двумя частями участка связывания EF-G, но и элементами, активно участвующими в изменении конформации EF-G, и в транслокации.

Изучение движения GAC как основного конформационного изменения, необходимого для связывания EF-G. Роль GAC в связывании EF-G и EF-Tu.

       Факторы элонгации EF-G и EF-Tu взаимодействуют с двумя участками 50S субчастицы – GAC и SRL. По данным криоэлектронной микроскопии, в комплексе рибосомы с EF-G*GDPNP GAC сдвинут в сторону центрального протуберанца. Затем, после гидролиза GTP, рибосома принимает ту конформацию, которую она имела до связывания EF-G. В структуре комплекса рибосомы с аа-тРНК*EF-Tu*GDPNP, GAC немного смещается в сторону спирали 89 23S рРНК, принимая “полузакрытую” конформацию, которая затем, после гидролиза GTP, превращается в “закрытую”. Изменение положения GAC можно наблюдать также, сравнивая пространственные структуры 50S субчастиц H. marismortui  и D. radiodurans. Очевидно, что GAC это подвижная структура и ее положение относительно других компонентов 50S субчастицы зависит от функционального состояния рибосомы.

Рисунок 24. Расположение нуклеотидных остатков 23S рРНК, реакционная способность которых зависит от перемещений GAC.  А. Фрагмент вторичной структуры 23S рРНК. Стрелками показаны нуклеотиды 23S рРНК, реакционная способность которых изменяется при вставке в спираль 42 23S рРНК. Нуклеотид G2655 становится менее доступным для модификации кетоксалем. Все остальные нуклеотиды, отмеченные стрелками увеличивают свою реакционную. Прямоугольник- вставка пары нуклеотидов.  Б. Расположение нуклеотидных остатков 23S рРНК, реакционная способность которых зависит от перемещений GAC 23S рРНК в пространственной структуре 50S. Красным показаны нуклеотиды, которые увеличивают свою реакционную при вставке пары нуклеотидов в спираль 42 23S рРНК. Синим показан нуклеотид G2655, который уменьшат свою реакционную способность при вставке пары нуклеотидов в спираль 42 23S рРНК. В. Элементы вторичной структуры 23S рРНК, которые меняют конформацию при вставке пары нуклеотидов в спираль 42 23S рРНК. Обозначения те же, что и для панели А. Элементы вторичной структуры 23S рРНК подписаны. Зеленой стрелкой показано направление движения.

Почему GAC может перемещаться относительно других элементов большой субчастицы? Дело в том, что GAC представляет собой разветвленную шпильку, соединенную с оставшейся частью 23S рРНК одной спиралью 42. Эта спираль взаимодействует со спиралью 89 в своем начале и имеет изгиб, образованный т.н. К-поворотом. Мы решили проверить, насколько важен поворот спирали 42 23S рРНК, ведущий к “закрытой” конформации GAC для связывания и функционирования факторов трансляции. Было интересно также выяснить, сопровождается ли переход в эту конформацию другими изменениями структуры 50S субчастицы. Для того, чтобы зафиксировать GAC в “закрытой” конформации вне зависимости от функционального состояния рибосомы, мы ввели в спираль 42 вставку С-G пары после пары оснований C1030-G1124 23S рРНК (Рис. 24а). Вставка пары оснований в спираль РНК приводит к удлинению спирали на 3-3.5 и повороту нуклеотидов спирали, следующих за вставкой на 30-36о. В случае спирали 42, имеющей изогнутую Г-образную форму, вставка пары оснований будет приводить к смещению GAC в стороны спирали 89 и образованию “закрытой” конформации (Рис. 24в).

Перемещение GAC в сторону спирали 89 23S рРНК и образование контакта с этой спиралью должно было сопровождаться изменением реакционной способности нуклеотидов спирали 89 и, возможно, тех элементов структуры 50S субчастицы, которые образовывали третичные взаимодействия с этой спиралью. Для проверки этого предположения мы провели химическую модификацию мутантных рибосом DMS, кетоксалем и CMCT. Степень модификации нуклеотидов 23S рРНК определяли с помощью обратной транскрипции (Рис. 25). Множество нуклеотидов 23S рРНК в результате мутации InsC1030/G1124 изменяли свою реакционную способность по отношению к модифицирующим реагентам (Рис. 25). Эти нуклеотиды была рассеяны во вторичной структуре 23S рРНК (Рис. 24а), но оказались сгруппированы в пространственной структуре 50S субчастицы (Рис. 24б,в). Большинство оснований, степень модификации которых химическими реагентами зависела от присутствия мутации InsC1030/G1124, сгруппированы вокруг спирали 89 23S рРНК. Одни нуклеотиды этой группы напрямую участвуют в образовании третичных взаимодействий с этой спиралью, другие участвуют в третичных взаимодействиях со спиралями 23S рРНК, в свою очередь, находящихся в контакте со спиралью 89 23S рРНК (Рис. 24б,в). Область изменения конформации рРНК, вызванная переходом GAC в “закрытое” состояние находится между PTC и участком взаимодействия с факторами элонгации (Рис. 24б,в). Интересно, что изменение положения GAC вызвало, в свою очередь, изменение конформации SRL (Рис. 24, 25).

Рисунок 25. Влияние вставки пары нуклеотидов в спираль 42 23S рРНК на структуру 23S. A, C, G, U - дорожки определения нуклеотидной последовательности. wt - дикий тип; I - вставка пары нуклеотидов в спираль 42 23S рРНК. Модификацию проводили DMS, кетоксалем (Kethoxal) и CMCT. Unm – без модификации. Нуклеотиды, степень модификации которых зависела от мутации, показаны стрелками. Для обратной транскрипции использовали олигонуклеотиды, комплементарные нуклеотидам 1104-1120 (А, Б), 1190-1210 (В), 2081-2100 (Г), 2281-2301 (Д), 2591-2611 (Е, Ж), 2730-2749 (З, И), 2886-2903 (К, Л) 23S рРНК.

Несколько нуклеотидных остатков, чья реакционная способность по отношению к химическим реагентам изменилась в результате мутации InsC1030/G1124 были расположены на значительном удалении от места мутации, GAC и спирали 89 23S рРНК (Рис. 24б,в). Эта группа нуклеотидов либо входила в состав петли спирали 96, либо участвовала в третичных взаимодействиях со спиралью 96 (Рис. 24, 25). Как могла измениться конформация этих нуклеотидов 23S рРНК? Мы обратили внимание на то, что спирали 96 и 97 образуют монолитный спиральный элемент, скрепленный коаксиальным стекинг-взаимодействием (Рис. 24в). Верхняя часть этого спирального элемента находится под “сгибом” спирали 42, образованном К-поворотом. Со стороны спирали 97, во взаимодействии со спиралью 42 участвует нуклеотид G2751. Его реакционная способность по отношению к кетоксалю меняется у нескольких типов мутантных рибосом. Видимо, при образовании “закрытой” конформации GAC спираль 42 “давит” на спиральный элемент, образованный спиралями 97 и 96 23S рРНК. При этом разрываются контакты петли спирали 96 с ее окружением. Спирали 97 и 96 служат своеобразным “ограничителем” и “амортизатором” движения GAC. Заметим, что SRL (спираль 95) присоединена к этому спиральному элементу. Таким образом, конформация SRL оказывается зависимой от положения GAC, что мы можем наблюдать при помощи химической модификации (Рис. 24, 25).

Рисунок 26. Оценка эффективности отдельных стадий элонгационного цикла с помощью пошаговой трансляции in vitro.  Компоненты, участвующие в образовании функционального комплекса подписаны сверху от авторадиограммы. WT - дикий тип, Ins - вставка в спираль 42 23S рРНК. Цифры соответствуют расстоянию (в нуклеотидах) места остановки обратной транскрипции от А в инициаторном AUG кодоне. Использовали олигонуклеотид, комплементарный нуклеотидам 50-76 мРНК считая от инициаторного кодона.

Рисунок 27. Оценка влияния вставки пары нуклеотидов в спираль 42 23S рРНК на связывание и функционирование EF-Tu. А. Зависимость от времени степени гидролиза GTP фактором элонгации Tu. Черные значки соответствуют комплексам рибосом дикого типа, а серые – комплексам рибосом, со вставкой в спирали 42 23S рРНК. Использовали комплексы Phe-тРНКPhe*EF-Tu*GTP (круги), соответствующие, и Lys-тРНКLys*EF-Tu*GTP (квадраты), не соответствующие кодону мРНК в А участке. Б. Оценка взаимодействия EF-Tu с SRL и влияние на нее вставки в спираль 42 23S рРНК. A, C, G, U - дорожки определения нуклеотидной последовательности. Модификацию проводили DMS, К – без модификации. Компоненты, функциональных комплексов, подписаны сверху от авторадиограммы. WT - дикий тип, Ins - вставка в спираль 42 23S рРНК. Нуклеотиды А2660 и А2665 отмечены стрелками. Использовали олигонуклеотид, комплементарный нуклеотидам 2730-2749 23S рРНК.

Влияет ли перемещение GAC к спирали 89 23S рРНК на активность факторов элонгации и передачу аллостерического сигнала от Р/Е участка к GAC и SRL? Мы использовали метод тоупринтинга для того, чтобы найти ту стадию цикла элонгации, на которую оказывает влияние летальная мутация InsC1030/G1124 23S рРНК (Рис. 26). В опыте, результаты которого показаны на рисунке 26, мы связывали тРНКfMet с Р участком рибосомы, затем связывали AcPhe-тРНКPhe с А участком. Добавление EF-G*GTP вызвало транслокацию в случае рибосом дикого типа.  Эффективность транслокации была снижена для мутантных рибосом (Рис. 26). Последующее добавление Lys-тРНКLys*EF-Tu*GTP приводило к образованию AcPheLys-тРНКLys в А участке рибосом дикого типа и ее транслокации. Рибосомы, содержащие вставку пары оснований в спирали 42 23S рРНК оставались в претранслокационном состоянии (Рис. 26). Для рибосом, несущих мутацию, после 10 минут инкубации, вообще не видно продукта, содержащего в Р участке AcPheLys-тРНКLys . Из результатов приведенных опытов мы сделали вывод, что образование “закрытой” конформации GAC препятствует транслокации.

Рисунок 28. Оценка влияния вставки пары нуклеотидов в спираль 42 23S рРНК на связывание и функционирование EF-G. А. Оценка взаимодействия EF-G с SRL. A, C, G, U - дорожки определения нуклеотидной последовательности. Модификацию проводили DMS, К – без модификации. Компоненты функциональных комплексов, подписаны сверху. WT - дикий тип, Ins - вставка в спираль 42 23S рРНК. Нуклеотид А2660 отмечен стрелкой. Использовали олигонуклеотид, комплементарный нуклеотидам 2730-2749 23S рРНК. Б. Оценка взаимодействия EF-G с GAC и влияние на нее вставки пары нуклеотидов в спираль 42 23S рРНК. Обозначения те же, что и для панели А. Нуклеотид А1067 отмечена стрелкой. Использовали олигонуклеотид, комплементарный нуклеотидам 1121-1140 23S рРНК. В. Зависимость от концентрации EF-G скорости не сопряженного с транслокацией гидролиза GTP, стимулированного рибосомами дикого типа (черные квадраты), рибосомами, несущими вставку пары нуклеотидов в спираль 42 23S рРНК (серые квадраты), комплексами  рибосом дикого типа с polyU и тРНКPhe (черные круги) и комплексами  рибосом, несущими вставку пары нуклеотидов в спираль 42 23S рРНК, с polyU и тРНКPhe (серые круги).

Поскольку при проведении реакции in vitro, связывание аа-тРНК с А участком рибосомы возможно и без посредства EF-Tu, необходимо было удостовериться, что EF-Tu может способствовать связыванию аа-тРНК с А участком мутантных рибосом. Мы образовали комплекс рибосомы с мРНК, кодирующей пептид MFK и fMet-тРНКfMet, так же, как мы делали это в опытах, описанных в предыдущем разделе. В декодирующем центре малой субчастицы оказывался кодон UUC, кодирующий фенилаланин. Далее, мы проводили связывание Phe-тРНКPhe*EF-Tu*GTP или Lys-тРНКLys*EF-Tu*GTP с А участком и измеряли уровень гидролиза GTP (Рис. 27а). Как рибосомы дикого типа, так и рибосомы, несущие мутацию InsC1030/G1124 23S рРНК, способствовали кодон-зависимому гидролизу GTP элонгационным фактором Tu. Для того, чтобы оценить, не изменилось ли сродство EF-Tu к рибосоме в результате мутации InsC1030/G1124 23S рРНК, мы использовали метод защиты нуклеотидов 23S рРНК от химической модификации.

Связывание комплекса Phe-тРНКPhe*EF-Tu*GDPNP с рибосомами, содержащими мРНК, кодирующую пептид MFK, и fMet-тРНКfMet снижало реакционную способность нуклеотидов А2660 и А2665 по отношению к DMS (Рис. 27б). При этом не было обнаружено никакого различия между рибосомами дикого типа и рибосомами, несущими мутацию InsC1030/G1124 23S рРНК, в степени связывания Phe-тРНКPhe*EF-Tu*GDPNP. Мы пришли к выводу о том, что образование “закрытого” состояния GAC никак не влияет на функционирование EF-Tu.

Поскольку применение тоупринтинга показало, что мутация InsC1030/G1124 23S рРНК нарушает процесс транслокации, мы изучили взаимодействие EF-G с мутантными рибосомами (Рис. 28). Эффективность связывания EF-G с рибосомами оценивалась с помощью защиты нуклеотидов 23S рРНК от химической модификации при образовании комплекса рибосомы с EF-G (Рис. 28а,б). Реакционная способность нуклеотидов А2660 (Рис. 28а) и А1067 (Рис. 28б) при взаимодействии рибосомы с EF-G снижается. Оказалось, что смещение GAC к спирали 89 сильно ингибирует связывание EF-G с рибосомой. Мы также изучили влияние мутации InsC1030/G1124 23S рРНК на эффективность передачи аллостерического сигнала от Р/Е участка к EF-G. Для этого измеряли то, как связывание деацилированной тРНК с Р/Е участком рибосомы стимулирует не сопряженную с транслокацией GTPазную активность EF-G (Рис. 28в). Оказалось, что вставка пары оснований в спираль 42 23S рРНК полностью подавляет передачу аллостерического сигнала. Даже когда деацилированная тРНК связана с Р/Е участком рибосомы, несущей мутацию, EF-G этого “не видит”.

Мы показали, что если GAC находится в “закрытом” состоянии, это не препятствует связыванию и функционированию EF-Tu, но препятствует связыванию и функционированию EF-G. На основании этого результата мы сделали вывод, что положение GAC определяет, какой из факторов элонгации может связаться с рибосомой. “Закрытое” состояние GAC способствует связыванию тройного комплекса аа-тРНК*EF-Tu*GTP, а “открытое” – связыванию EF-G*GTP.

Как перемещение GAC (Рис. 29а) может регулировать выбор EF-Tu или EF-G? Эти белки имеют весьма сходное строение. Сходство структур аа-тРНК*EF-Tu*GTP (Рис. 29б) и EF-G*GDP (Рис. 29в) легло в основу гипотезы молекулярной мимикрии. Структура G-доменов обоих факторов очень похожа. Участок связывания GTP/GDP имеет консервативную структуру и взаимодействует, согласно результатам, полученным с помощью криоЭМ, с SRL. В отличие от GAC, SRL не меняет своего положения в пространственной структуре 50S субчастицы (Рис. 29а). В строении комплексов аа-тРНК*EF-Tu*GTP  (Рис. 29б) и EF-G*GDP (Рис. 29в) можно увидеть важные различия. Так, EF-G содержит дополнительный минидомен – G’. Именно с G’-доменом перед гидролизом GTP взаимодействует С-домен L7/L12 и N-домен L11, образуя “арку”, существование которой было показано с помощью криоЭМ. Белки L7/L12 связаны со спиралью 42 посредством белка L10, а белок L11 напрямую связан с GAC. Переход GAC в “закрытое” состояние может быть необходим для изменения положения С-домена L7/L12 и N-домена L11. У белка EF-Tu нет G’-домена и взаимодействие с С-доменом L7/L12 осуществляется спиралью D G-домена EF-Tu. Спираль А G’- домена EF-G расположена практически параллельно спирали D EF-Tu при выравнивании структур факторов элонгации в пространстве (Рис. 29б,г).

Рисунок 29. Модель селективного связывания факторов элонгации в зависимости от конформации GAC рибосомы. А. Фрагменты структуры 23S рРНК H. marismortui  (GAC показан оранжевым) и D. radiodurans  (GAC показан желтым). Зеленый кружок обозначает приблизительное место контакта нуклеотид-связывающего кармана факторов элонгации с рРНК. Красный кружок показывает приблизительное место взаимодействия тройного комплекса EF-Tu с GAC, синий  -  место взаимодействия EF-G с GAC. Б. Структура тройного комплекса аа-тРНК*EF-Tu*GTP. Зеленым показан GTP, красным - спираль D G-домена EF-Tu, взаимодействующая с белком  L7/L12, прикрепленным к месту соединения спирали 42 и GAC. В. Структура комплекса EF-G*GDP. Зеленым показан GDP, синим - спираль А G’-домена EF-G, взаимодействующая с белком  L7/L12, прикрепленным к месту соединения спирали 42 и GAC. Г. Модель взаимодействия факторов элонгации с рибосомой. Крупная полусфера - большая, маленькая – малая субчастицы. “Рука” обозначает GAC и присоединенные к нему белки L11 и L7/L12. Закрытая и открытая конформации GAC показаны в виде “длинной” и ”короткой” “руки”. А, Р и Е – тРНК, связанные с соответствующими участками. EF-Tu и EF-G подписаны. Обозначены претранслокационное (PRE) и посттранслокационное (POST) состояния рибосомы.

Модель селекции факторов элонгации при прохождении рибосомой по циклу элонгации представлена на рисунке 29г. Согласно модели, движение GAC изменяет взаиморасположение двух участков связывания факторов элонгации – GAC и SRL (Рис. 29а). Большее расстояние между GAC и SRL необходимо для связывания и функциональной активности EF-G. Этот фактор взаимодействует с белками, ассоциированными с GAC, A спиралью G’-домена при “закрытой” конформации GAC и, после перемещения GAC в “открытую” конформацию может взаимодействовать с SRL участком связывания нуклеотида (Рис. 29). Такой переход невозможен для рибосом, несущих мутацию InsC1030/G1124 23S рРНК. Напротив, EF-Tu связывается при “открытой” конформации GAC, с помощью D спирали G-домена. Для дальнейших шагов в функционировании EF-Tu необходим переход GAC в “закрытую” конформацию. При этом SRL вступает в контакт с участком связывания нуклеотида EF-Tu. По-видимому, комплекс аа-тРНК*EF-Tu*GTP может связываться напрямую с рибосомами, у которых GAC находится в “закрытой” конформации из-за мутации InsC1030/G1124 23S рРНК. При таком взаимодействии и GAC и SRL образуют контакты с аа-тРНК*EF-Tu*GTP одновременно.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В работе удалось разработать комплекс методов, позволяющий определять функциональную роль элементов рРНК в трансляции. Сейчас, после определения пространственной структуры рибосомы, появилась возможность рационально планировать направленный мутагенез рРНК. Если раньше мутагенезу подвергали нуклеотиды, взаимодействие которых с лигандами рибосомы было показано с помощью пришивок и химической модификации, то сейчас стало возможным направленно изменять третичные контакты, поддерживающие архитектуру функциональных центров и осуществляющие их взаимодействие.

Разработан метод выделения рибосом, несущих летальные мутации. Дополняя использование штаммов, в которых рРНК кодируется только на плазмиде, этот метод позволяет выделять рибосомы, несущие любые мутации. Метод тоупринтинга позволяет выявить стадию трансляции, на которую влияет мутация. При этом, взаимодействие факторов элонгации с рибосомой может быть изучено с помощью тестирования GTPазной активности и с помощью химической модификации комплекса фактора и рибосомы. Тот же метод химической модификации позволяет оценить изменения структуры рРНК, вызванные мутацией.

Нам удалось доказать, а в ряде случаев опровергнуть, гипотезы о функциональной роли элементов рРНК. Мы получили ответы на вопросы о поддержании структуры декодирующего центра, о роли желоба, по которому аа-тРНК поступает в А участок, о роли Е и Р/Е участков связывания тРНК и о передаче аллостерического сигнала к участку связывания факторов элонгации. Собранный нами набор методов может быть использован и в будущем, для изучения тех молекулярных механизмов работы рибосомы, которые еще не были изучены.

ВЫВОДЫ

  1. Гены yhhF, ybiN, ygjO и ycbY кодируют ферменты, метилирующие нуклеотиды G966 16S рРНК, A1618, G1835 и G2445 23S рРНК Escherichia coli. Субстратом для YhhF служит 30S субчастица, для YbiN – рибонуклеопротеид, промежуточный в процессе сборки 50S субчастиц, и депротеинизированная 23S рРНК для YgjO и YcbY. Делеции генов yhhF, ybiN, ygjO и ycbY приводят к замедлению роста клеток, но не летальны.
  2. Третичные взаимодействия нуклеотидов A1201 и А1191 спирали 34 16S рРНК, способствуют ассоциации субчастиц и обеспечения точности трансляции.
  3. Сужение, образованное нуклеотидами U2492, C2556 и C2573 23S рРНК на пути перемещения аминоацил-тРНК в А участок не влияет на скорость этого перемещения.
  4. Перемещение деацилированной тРНК из Р в Р/Е участок способствует взаимодействию EF-G*GTP с рибосомой, повышает эффективность и точность транслокации.
  5. Межсубчастичный мостик В1а не важен для транслокации, но способствует формированию структуры 50S субчастицы.
  6. Мутации нуклеотида А960 23S рРНК стабилизируют конформацию рибосомы, в которой нуклеотиды, образующие Р участок 50S субчастицы защищены от действия модифицирующих реагентов.
  7. Взаимодействие петель спиралей 89 и 91 23S рРНК не важно для элонгации трансляции, но способствует функционированию фактора инициации 2.
  8. Прочное взаимодействие EF-G с SRL не важно для GTPазной активности EF-G, но необходимо для транслокации.
  9. Вставка пары нуклеотидов в спираль 42 23S рРНК, предположительно сближающая  GAC и SRL, нарушает аллостерическое взаимодействие между Р/Е участком связывания тРНК и участком связывания факторов элонгации, благоприятно для связывания и функциональной активности EF-Tu и ингибирует связывание и функциональную активность EF-G.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в научных журналах

1. Bogdanov A., Dontsova O., Rinke-Appel J., Dokudovskaya S., Lavrik I., Alekseeva K., Spanchenko O., Sergiev P., Baranov P., Shirokova E., Nierhaus K., and Brimacombe R. Thio-substituted derivatives of RNA: application in protein biosynthesis studies. // Nucl. Acids Symp. Ser. - 1994 - v. 31. - p. 273-274.

2. Sergiev P.V., Lavrik I.N., Wlasoff V.A., Dokudovskaya S.S., Dontsova O.A., Bogdanov A.A. and Brimacombe R. The path of mRNA through the bacterial ribosome: A site-directed cross-linking study using new photoreactive derivatives of guanosine and uridine. // RNA. - 1997-v. 3. - p. 464-475.

3. Sergiev P.V., Dokudovskaya S.S., Topin A., Petrov A., Shpanchenko O.V., Dontsova O.A., Brimacombe R. and Bogdanov A.A. The environment of 5S rRNA in the Escherichia coli ribosome: a cross-linking study.// Nucl. Acids Symp. Ser. - 1997 - v. 36. - p. 181-183.

4. Baranov P.V., Sergiev P.V., Dontsova O.A., Bogdanov A.A. and Brimacombe R. The Database of Ribosomal Cross links (DRC). // Nucl. Acids Res. - 1998- v. 26. - p. 187-189.

5. Sergiev P., Dokudovskaya S., Romanova E., Topin A., Bogdanov A., Brimacombe R. and Dontsova O. The environment of 5S rRNA in the ribosome: cross-links to the GTPase-associated area of 23S rRNA. // Nucl. Acids Res. - 1998 - v. 26. - p. 2519-2525.

6. Сергиев П.В., Лаврик И.Н., Докудовская С.С., Донцова О.А. и Богданов А.А. Структура декодирующего центра рибосомы. // Биохимия – 1998 – т.63 – вып. 8. – с. 1129-1143.

7. Леонов А.А., Сергиев П.В., Донцова О.А. и Богданов А.A. Направленное введение фотоаффинных реагентов во внутренние участки РНК. // Молекулярная биология – 1999 – т.33 – с. 1063-1073. 

8. Bogdanov A.A., Sergiev P.V., Lavrik I.N., Spanchenko O.V., Leonov A.A., and Dontsova O.A. Modern Site-Directed Cross-Linking Approaches: Implications for Ribosome Structure and Functions. //In The Ribosome; Structure, Function, Antibiotics, and Cellular Interactions/ Eds: Garrett R.A., Douthwaite S.R., Liljas A., Matheson A.T., Moore P.B., and Noller H.F.- 2000 – ASM Press. Washington D.C. – pp.245-255.

9. Sergiev P.V., Bogdanov A.A., Dahlberg A.E., Dontsova O. Mutations at position A960 of E. coli 23 S ribosomal RNA influence the structure of 5 S ribosomal RNA and the peptidyltransferase region of 23S ribosomal RNA. // J. Mol. Biol. – 2000 - v.299. – p.379-389.

10. Matadeen R, Sergiev P, Leonov A, Pape T, van der Sluis E, Mueller F, Osswald M, von Knoblauch K, Brimacombe R, Bogdanov A, van Heel M, Dontsova O. Direct Localization by Cryo-electron Microscopy of Secondary Structural Elements in Escherichia coli 23 S rRNA which Differ from the Corresponding Regions in Haloarcula marismortui. // J. Mol. Biol. - 2001 –v.307. – p.1341-1349.

11. Сергиев П.В., Донцова О.А., Богданов А.А. Изучение структуры прокариотической рибосомы биохимическими методами: Судный день. // Молекулярная биология – 2001 – т.35 – с. 559-583. 

12. Kubarenko A.V., Sergiev P.V., Bogdanov A.A., Brimacombe R. and Dontsova O.A. A protonated base pair participating in rRNA tertiary structural interactions. // Nucleic Acids Res. – 2001 – v. 29. – p. 5067-5070.

13. Smith M.W., Meskauskas A., Wang P., Sergiev P., and Dinman J.D. Saturation mutagenesis of 5S rRNA in Saccharomyces cerevisiae. // Mol Cell Biol. – 2001 – v. 21. – p. 8264-8275.

14. Avdeeva O.N., Myasnikov A.G., Sergiev P.V., Bogdanov A.A., Brimacombe R. and Dontsova O.A. The construction of the “minimal” SRP interacting with the translating ribosome but not with specific membrane receptor in E. coli. // FEBS Lett. – 2002 - v. 514. – p. 70-73.

15. Rinke-Appel J., Osswald M., von Knoblauch K., Mueller F., Brimacombe R., Sergiev P., Avdeeva O., Bogdanov A., and Dontsova O. Crosslinking of 4.5S RNA to the Escherichia coli ribosome in the presence or absence of the protein Ffh. // RNA - 2002 – v. 8. – p. 612-625.

16. Sergiev P., Leonov A., Dokudovskaya S., Shpanchenko O., Dontsova O., Bogdanov A., Rinke-Appel J., Mueller F., Osswald M., von Knoblauch K., and Brimacombe R. Correlating the X-ray structures for halo- and thermophylic ribosomal subunits with biochemical data for the Escherichia coli ribosome. // Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology, v. LXVI – The Ribosome, CSH Laboratory Press – 2001 – p.87-100.

17. Leonov A.A., Sergiev P.V., Bogdanov A.A., Brimacombe R., Dontsova O.A. Affinity purification of ribosomes with a lethal G2655C mutation in 23 S rRNA that affects the translocation. // J. Biol. Chem. - 2003 - v. 278 - p. 25664-25670.

18. Кубаренко А.В., Лаврик И.Н., Сергиев П.В., Хойпль М., Роднина М., Винтермаер В., Богданов А.А., Донцова О.А. Метод фотоаффинного химического сшивания как способ выявления контактов фактора элонгации G с малой субчастицей рибосомы. // Доклады Академии Наук - 2003 - т.393 - вып.1 - с.124-127.

19. Лаврик И.Н., Сергиев П.В., Богданов А.А., Zimmermann R.A., и Донцова О.А. Рибосома Escherichia coli как модель для апробации новых фотоаффинных аналогов тРНК, содержащих остатки 6-тиогуанозина. //  Молекулярная биология – 2004 – т.38 – вып. 5. – с. 937-944.

20. Кубаренко А.В., Сергиев П.В., Роднина М.В. GTPазы аппарата трансляции. //  Молекулярная биология – 2005 – т.39 – вып. 5. – с. 746-751.

21. Kiparisov S, Petrov A, Meskauskas A, Sergiev P.V., Dontsova O.A., Dinman J.D. Structural and functional analysis of 5S rRNA in Saccharomyces cerevisiae. // Mol Genet Genomics. - 2005 - v. 274 - pp.235-247.

22. Sergiev P.V., Lesnyak D.V., Burakovsky D.E., Kiparisov S.V., Leonov A.A., Bogdanov A.A., Brimacombe R., Dontsova O.A. Alteration in location of a conserved GTPase-associated center of the ribosome induced by mutagenesis influences the structure of peptidyltransferase center and activity of elongation factor G. // J. Biol. Chem. - 2005 - v. 280 - pp.31882-31889.

23. Sergiev P.V., Kiparisov S.V., Burakovsky D.E., Lesnyak D.V., Leonov A.A, Bogdanov A.A., Dontsova O.A. The conserved A-site finger of the 23 S rRNA: just one of the intersubunit bridges or a part of the allosteric communication pathway? // J. Mol. Biol. - 2005 – v. 353 - pp.116-123.

24. Sergiev P.V., Bogdanov A.A., Dontsova O.A. How can elongation factors EF-G and EF-Tu discriminate the functional state of the ribosome using the same binding site? // FEBS Lett. - 2005 - v. 579 - pp.5439-5442.

25. Sergiev P.V., Lesnyak D.V., Kiparisov S.V., Burakovsky D.E., Leonov A.A, Bogdanov A.A., Brimacombe R., Dontsova O.A.

Function of the ribosomal E-site: a mutagenesis study. // Nucleic Acids Res. - 2005 - v. 33 - pp.6048-6056.

26. Kovalskaya O.N., Sergiev P.V., Bogdanov A.A., Dontsova O.A. //  Does a deficiency of the signal recognition particle (SRP)-pathway affect the biosynthesis of its components in Saccharomyces cerevisiae and Escherichia coli? Biochemistry (Mosc). - 2006 - v. 71 - pp.723-729.

27. Кипарисов С.В., Сергиев П.В., Богданов А.А., Донцова О.А. // Конформационные изменения рибосомы в процессе элогнационного цикла. Молекулярная биология – 2006 – т.40 – вып. 4. – с. 1-14.

28. Kubarenko A., Sergiev P., Wintermeyer W., Dontsova O., Rodnina M.V. // Involvement of helix 34 of 16S rRNA in decoding and translocation on the ribosome. J. Biol. Chem. - 2006 - v. 281 - pp. 35235-35244.

29. Lesnyak D.V., Sergiev P.V., Bogdanov A.A., Dontsova O.A. // Identification of Escherichia coli m(2)G methyltransferases: I. The ycbY gene encodes a methyltransferase specific for G2445 of the 23S rRNA. J. Mol. Biol. - 2006 - v. 364 - pp. 20-25.

30. Sergiev P.V., Lesnyak D.V., Bogdanov A.A., Dontsova O.A. // Identification of Escherichia coli m(2)G methyltransferases: II. The ygjO gene encodes a methyltransferase specific for G1835 of the 23S rRNA. J. Mol. Biol. - 2006 - v. 364 - pp.26-31.

31. Sergiev P.V., Bogdanov A.A., Dontsova O.A. // Ribosomal RNA guanine-(N2)-methyltransferases and their targets. Nucleic Acids Res. - 2007 – v. 35 – pp. 2295-2301.

32. Lesnyak D.V., Osipiuk J., Skarina T., Sergiev P.V., Bogdanov A.A., Edwards A., Savchenko A., Joachimiak A., Dontsova O.A. // Methyltransferase that modifies guanine 966 of the 16 S rRNA: functional identification and tertiary structure. J. Biol. Chem. - 2007 - v. 282 - pp. 5880-5887.

33. Ковальская, О.Н., Сергиев, П.В., Богданов, А.А., Донцова, О.А. // Структурно-функциональная анатомия сигнал-узнающей частицы: от бактерий до млекопитающих. Успехи. Биол. Химии.  – 2007 – т. 47 – с. 129-188.

34. Бураковский Д. Е., Смирнова А. С., Лесняк Д. В., Кипарисов С. В., Леонов А. А., Сергиев П. В., Богданов А. А., Донцова О. А. // Взаимодействие спиралей 89 и 91 23S рибосомной РНК Escherichia coli способствует функционированию IF2, но не важно для работы факторов элонгации. – 2007 - Молекулярная биология – т. 41 – вып. 6 - с. 1031-1041.

35. Sergiev, P.V., Serebryakova, M.V., Bogdanov, A.A., Dontsova, O.A. // The ybiN gene of E. coli encodes adenine-N6 methyltransferase specific for modification of A1618 of 23S ribosomal RNA, a methylated residue located close to the ribosomal exit tunnel.  J. Mol. Biol., принято к печати

Избранные тезисы конференций

36. A.A. Bogdanov, P.V. Sergiev, A.A. Leonov, R. Brimacombe, A. Dahlberg, and O.A. Dontsova. Interaction between functional centers of the ribosome. LXVI Cold Spring Harbor Symposium on Quantitative Biology. The Ribosome. Cold Spring Harbor, 2001. Abstracts of papers presented. p. 11.

37. P.V. Sergiev, R. Matadeen, A.A. Leonov, T. Pape, E. van der Sluis, F.Mueller, M. Osswald, K. von Knoblauch, R. Brimacombe, A. Bogdanov, M. van Heel, O. Donstova. Cryo-electron microscopy localization of artificially extended helical elements of the 23S rRNA. RNA2001. 6th Annual Meeting of the RNA Society. 2001. Abstract book. p. 482.

38. P.V. Sergiev, O.N. Avdeeva, A.A. Bogdanov, R. Brimacombe. Study of the interaction of Escherichia coli signal recognition particle with the ribosome. Meeting of International Research Scholars. Vancouver. Canada. 2001. Program and Abstract. p. 37.

39. O.A. Dontsova, P.V. Sergiev, O.N. Avdeeva, O.V. Shpanchenko, M.I. Zvereva, P. V. Ivanov, N.I. Topilina, G. Aglyamova, A.A. Bogdanov, M. Kalkum, Y. Teraoka, K.H. Nierhaus and R. Brimacombe. Interaction of RNP with the E.coli ribosome. International conference in honour of Alexander Spirin. Protein synthesis. Pushchino.Russia.2001. Abstract book. p.12.

40. P.Sergiev, R.Matadeen, A.Leonov, T. Pape, E. van der Sluis, F.Mueller, M. Osswald, K. von Knoblauch, R. Brimacombe, A. Bogdanov, M. van. Heel, O. Donstova. Localization of helical elements of E.coli 23S rRNA that differ from the H marismortui. 23S rRNA. International conference in honour of Alexander Spirin. Protein synthesis. Pushchino.Russia. 2001. Abstract book. p. 85.

41. O.A.Dontsova, P.V.Sergiev, A.A.Leonov, R.Brimacombe, A.Dahlberg, A.A.Bogdanov. Interaction between functional centers of the ribosome. The Dynamics of Ribosome Structure and Function. Queenstown, New Zealand. 27th January-1st February 2002. Abstracts.Programme. p.43.

42. P.V. Sergiev, O.N. Avdeeva, R. Brimacombe, A.A. Bogdanov, O.A. Dontsova. Interaction of SRP with the E.coli ribosome. Interaction between functional centers of the ribosome. The Dynamics of Ribosome Structure and Function. Queenstown, New Zealand. 27th January-1st February 2002. Abstracts.Programme. p.45.

43. P.V. Sergiev, A.A. Leonov, A.A. Bogdanov, R. Brimacombe, O.A. Dontsova. Isolation of ribosomes with a lethal G2655C mutation in 23S rRNA that affects the translocation. 8th Annual Meeting of the RNA Society “RNA 2003”. July 1-July 6, 2003. Vienna, Austria. p.707.

44. P. Sergiev, D. Lesnyak, D. Burakovsky, S. Kiparisov, A. Leonov, A. Bogdanov, and O. Dontsova. Communication Between the Ribosomal P- and E-sites and Elongation Factor Binding Sites. - Eleventh Annual Meeting of the RNA Society "RNA 2006", Seattle, Washington, June 20-25, 2006, p. 274.

45. P.V. Sergiev, D.V. Lesnyak, D.E. Burakovsky, S.V. Kiparisov, A.A. Leonov, A.A. Bogdanov, and O.A. Dontsova. Communication between the functional centers of the ribosome. - The 8th International Engelhardt Conference on Molecular Biology "RNA – Protein Interactions", Buran Conference Center, Moscow, August 19-24, 2006, p. 23.

46. P. Sergiev, D. Lesnyak, D. Burakovsky, A. Smirnova, A. Bogdanov, O. Dontsova. Conformation signals that determine the activity of translational factors: site-directed mutagenesis and biochemical studies. “Ribosome: form & function”, North Falmouth, USA, 3-8 June, 2007, Abstract book, p. 22.

47. P. Sergiev, D. Lesnyak, A. Bogdanov, O. Dontsova. Escherichia coli m2G methyltransferases. Identification of the new enzymes and mystery of their functional role. “Ribosome: form & function”, North Falmouth, USA, 3-8 June, 2007, Abstract book, p. 171.




© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.