WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

 

На правах рукописи

Ревельский Александр Игоревич

МЕТОДОЛОГИЯ АНАЛИЗА ОБЪЕКТОВ РАЗЛИЧНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ МЕТОДАМИ ГАЗОВОЙ ХРОМАТОГРАФИИ-МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ И ЭЛЕМЕНТНОГО АНАЛИЗА НА СОДЕРЖАНИЕ СЛЕДОВ СРЕДНЕЛЕТУЧИХ ОРГАНИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ

02.00.02 – Аналитическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени

доктора химических наук

Москва - 2012

Работа выполнена на кафедре аналитической химии химического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор

  Рыбальченко Игорь Владимирович

доктор химических наук, профессор

Буряк Алексей Константинович

доктор химических наук

Бродский Ефим Соломонович

Ведущая организация: научно-технический центр «Хроматография»

Защита состоится « » марта 2012 г. в 15 час. 00 мин. в аудитории 446 на заседании диссертационного совета Д 501.001.88 по химическим наукам при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу:

119992, Москва, Ленинские горы, МГУ, Химический факультет

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова

С авторефератом можно ознакомиться на сайте ВАК России: http//vak.ed.gov.ru

Автореферат разослан « » января 2012 г.

Учёный секретарь диссертационного совета,

Кандидат химических наук

Торочешникова И.И.

Общая характеристика работы

Актуальность темы

В настоящее время актуальной задачей является обнаружение следов среднелетучих органических соединений (СЛОС) и количественное определение в различных средах. К СЛОС относятся стойкие органические загрязнители (СОЗ), контролю содержания которых в объектах окружающей среды, продуктах питания и биосредах в настоящее время уделяется особое внимание (хлорорганические пестициды (ХОП), полициклические ароматические углеводороды (ПАУ), полихлорированные бифенилы (ПХБ), полихлорированные дибензодиоксины (ПХДД), производные фенолов, фталаты и др.).

ПДК этих соединений составляют 10-12 – 10-7 % - в зависимости от класса соединений. Большую группу СЛОС составляют опасные соединения, в состав молекул которых входят такие элементы, как F, Cl, Br, S и Р. ПДК для них находятся в том же диапазоне, что и для большинства СОЗ.

Существует необходимость обнаружения и определения следовых содержаний среднелетучих производных (дериватов) нелетучих физиологически активных соединений таких, как аминокислоты, жирные, дикарбоновые кислоты, сахара, стероиды, фармацевтические субстанции и др. в биосредах и водных растворах. Важным объектом анализа являются фармацевтические препараты и присутствующие в них примеси.

Увеличение достоверности диагностики ряда заболеваний требует обнаружения как числа неизвестных СЛОС, так и их идентификации на следовом уровне в биосредах.

Для решения рассмотренных задач в большинстве случаев требуется предварительное выделение аналитов из матрицы и их концентрирование.

Наибольшее распространение, как при анализе вод, так и продуктов питания, почв, донных отложений, биосред на содержание СЛОС получил метод их выделения и концентрирования, основанный на жидкостной экстракции. Этот метод, в отличие от других известных методов, применим к широкому кругу матриц и лишён ряда ограничений при определении ультрамалых концентраций аналитов, в частности СОЗ. При извлечении СЛОС отбирают большие пробы образца (в случае воды 0.5 – 10 л) и используют большие объёмы органического растворителя (десятки и сотни мл). Полученный экстракт упаривают. Упаренный объём экстракта обычно составляет около 1 мл, а объём анализируемой пробы – 1 мкл (в большинстве случаев). Из-за анализа столь малой части экстракта на стадии перехода от пробоподготовки к анализу имеет место увеличение пределов обнаружения от 1000 до 500 раз.

Для увеличения объёма пробы, анализируемой методом КГХ, используется два основных способа концентрирования примесей из больших проб органических растворов (экстрактов).  Первый из них – это ввод больших проб в капиллярную колонку, свободную от НФ (Large volume cold on column injection), второй - это ввод больших проб на сорбент, помещённый в кварцевый лайнер инжектора, нагреваемого по определённой температурной программе (PTV инжектор – Programmed Temperature Vaporizing Injector). Объём пробы, обычно, не более 0.1 мл. При вводе пробы раствора в PTV инжектор с контролируемой скоростью объём пробы может быть увеличен.

Выделение примесей из раствора проводится внутри газового хроматографа (внутри аналитической системы) при вводе всего объёма пробы в капиллярную колонку свободную от неподвижной фазы или лайнер инжектора с сорбентом. После завершения концентрирования (удаления основной массы паров растворителя) концентрат аналитов переносится в разделительную колонку (при нагревании капилляра или инжектора). Большинство этих работ выполнено для растворов, в которых содержание аналитов в пробе составляло 10-9 - 10-8 г, с использованием капиллярной газовой хроматографии. Извлечение примесей из больших проб (до 0.5 мл) органических и водных растворов с нанесением всей пробы в пустую колонку, либо колонку, заполненную инертным носителем, проводилось методом термической и изотермической хромадистилляции (предложен и развит Жуховицким А.А. и Яновским С.М. с сотрудниками). Концентрат с остатками растворителя переводился в хроматограф (количества определяемых веществ 10-9 - 10-8 г).

Имеется ряд ограничений при концентрировании ультрамалых количеств аналитов различной полярности и летучести этими методами и их определении методом ГХ/МС. Среди этих ограничений: попадание части паров растворителя в разделительную колонку и масс-спектрометр, загрязнение хроматографической системы нелетучими компонентами пробы, изменение аналитического сигнала (форма хроматографических пиков, воспроизводимость масс-спектров), потери следов определяемых веществ или искажение состава пробы. В связи с этим, эти способы нашли ограниченное применение в сочетании с ГХ-МС (обычно концентрирование из проб объёмом до 20 мкл).

Во всех работах, посвящённых рассматриваемым способам, не изучали степень извлечения широкого круга среднелетучих органических соединений различной полярности и летучести из больших проб органических растворов, и особенно важно, их следовых количеств (10-13 - 10-9  г), внутри аналитической системы, в частности ГХ/МС, которая получила широкое распространение в анализе следов аналитов. Не было известно работ по концентрированию  следов СЛОС из больших проб органических растворов (экстрактов) вне аналитической системы (вне термостата колонок или инжектора хроматографа), переводу сконцентрированных определяемых веществ в аналитический прибор посредством термодесорбции и анализу всего концентрата как методом ГХ/МС, так и другими методами. Такое концентрирование позволило бы устранить недостатки известных способов.

В связи с этим актуальным является исследование концентрирования ультрамалых количеств (10-13 - 10-10 г) СЛОС из органических растворов (экстрактов) и анализа всего концентрата методом ГХ/МС с целью снижения концентрационных пределов обнаружения, особенно при анализе экстрактов из малых проб образцов различных матриц, из которых извлечение аналитов производится жидкостной экстракцией. Актуальным является также снижение пределов обнаружения производных нелетучих физиологически активных органических соединений (аминокислот, жирных кислот, нуклеозидов, стероидов, сахаров и др.) с целью обнаружения следов таких веществ в различных матрицах. Большой практический интерес представляет разработка подходов к определению состава компонентов смесей заданных и неизвестных соединений на уровне следов для решения различных задач в экологии, медицине, антидопинговом контроле, контроле качества фармацевтических веществ и препаратов.

Актуальной является также разработка подхода к эколого-аналитическому контролю, основанного на быстром скрининге проб органических экстрактов на суммарное содержание следов Hal-, P- и S- органических соединений в пересчёте на элемент (обобщённый показатель).

Цели работы

Развитие направления обнаружения СЛОС различной летучести и полярности на уровне следов в сложных по составу матрицах, основанного на извлечении обнаруживаемых веществ из образца органическим растворителем, концентрировании полученных растворов и анализе всего концентрата аналитов методами ГХ/МС и элементного анализа.

Разработка подходов к обнаружению следов заданных и неизвестных СЛОС в образцах различного происхождения, позволяющих по новому решить задачи экологического контроля, диагностики заболеваний, антидопингового контроля, контроля качества высокочистых веществ (фармсубстанций).

Для достижения поставленных целей необходимо было решить следующие задачи:

  1. Разработать метод анализа следов СЛОС различной полярности и летучести, основанный на их извлечении из органических растворов в процессе непрерывной микрохромадистилляции и анализе всего концентрата методами  ГХ-МС, ГХ-АЭД и элементного анализа.
  2. Выбрать условия хромато-масс-спектрометрического обнаружения ультрамалых количеств широкого круга органических соединений различной полярности и летучести и производных нелетучих органических соединений (в том числе дикарбоновые, гидрокси, окси-, жирные и аминокислоты спирты, сахара, стеролы, нуклеозиды, моносахариды, стероиды, ряда фармацевтических веществ).
  3. Расширить возможности метода ГХ/МС для обнаружения следов малолетучих и нелетучих органических соединений в виде их производных, основанного на их выделении из образца, дериватизации, замене реагента на легколетучий инертный растворитель, концентрировании полученных растворов в процессе НМХД и анализе всего концентрата производных методом ГХ/МС.
  4. Для метода ГХ/АЭД изучить зависимость сигналов атомно-эмиссионного детектора (АЭД) по углероду и водороду от структуры молекул органических соединений, содержащих такие элементы как C, H, N, O, P, S, F, Cl и Br и разработать условия минимизирующие такую зависимость. Разработать способ определения %-ного содержания углерода в молекулах компонентов смесей углеводородов и количественного состава без градуировки по каждому компоненту.
  5. Разработать способ быстрого скрининга органических и водных растворов на суммарное содержание следов среднелетучих F-, Cl-, Br-, S- и P- органических соединений в пересчёте на элемент (обобщённый показатель).
  6. Разработать способ определения состава неизвестных СЛОС в конденсате выдыхаемого воздуха человека, основанный на жидкостной экстракции, концентрировании аналитов с удалением растворителя в процессе НМХД и ГХ/МС (ЭИ, ХИ) анализе всего концентрата. На основании полученных данных рассмотреть возможность увеличения достоверности диагностики таких лёгочных заболеваний, как бронхиальная астма и хроническая обструктивная болезнь лёгких (ХОБЛ).
  7. Предложить подход к селективному обнаружению состава неизвестных среднелетучих примесей в фармацевтических субстанциях на уровне следов, основанный на жидкостной экстракции органическим растворителем, мало-растворяющим основной компонент, концентрировании аналитов с удалением растворителя из этого экстракта вне аналитической системы и ГХ/МС анализе всего концентрата аналитов.

Научная новизна

  1. На примере следовых количеств ПХДД, ПХБ и ХОП показана принципиальная возможность обнаружения следов СЛОС в органических растворах на уровне 10-12 – 10-10 % и в модельных водных растворах (после микрожидкостной экстракции) на уровне 10-13 – 10-11 % благодаря сочетанию концентрирования органических растворов в предколонке без неподвижной фазы, соединённой с разделительной колонкой и линией сброса паров растворителя и анализа всего концентрата определяемых веществ методом ГХ/МС (ХИ) с регистрацией отрицательных ионов.
  2. Предложена методология анализа образцов различного происхождения на содержание следов СЛОС, основанная на их извлечении органическим растворителем, концентрировании полученных растворов в условиях непрерывной микрохромадистилляции и анализе всего концентрата методом ГХ/МС и элементного анализа.
  3. Разработан метод концентрирования органических растворов следов (10-12 - 10-9 г) СЛОС в условиях НМХД в присутствии сорбента и анализа всего концентрата свободного от растворителя методом ГХ/МС. Он позволяет на 2-3 порядка снизить пределы обнаружения методов ГХ/МС, ГХ/АЭД и метода элементного анализа, включающего окислительную конверсию аналитов с последующей регистрацией продуктов конверсии, соответствующих определяемым элементам, методом ионной хроматографии. Он явился основой при разработке подходов и способов определения СЛОС в различных средах на уровне следов, которые позволили решить различные задачи в экологии, медицине, антидопинговом контроле, идентификации, контроле качества лекарственных средств на новом уровне.
  4. Предложено описание процесса концентрирования органических растворов следов СЛОС основанное на теории хромадистилляции предложенной А.А. Жуховицким. Процесс концентрирования происходит в условиях, названных непрерывной микрохромадистилляцией и в присутствии сорбента.
  5. Выбраны условия дериватизации для следовых количеств (10-11 - 10-9 г) широкого круга нелетучих или малолетучих биологически активных соединений (аминокислоты, жирные, дикарбоновые, гидрокси, оксикислоты, нуклеозиды, сахара, стероиды и др.) при использовании реакции силилирования и этерификации/ацилирования (для амино и жирных кислот).
  6. Предложена новая методология обнаружения следов изученных кислот, спиртов, сахаров и стеролов при их совместном присутствии в водном растворе. Она основана на высушивании одной части образца и последующем триметилсилилировании смесью БСТФА с пиридином, и дериватизации другой части смесью ИБХФ с гептафторбутанолом в водно-органическом растворе с последующим ГХ/МС анализом соответствующих производных в выбранных в результате исследований условиях эксперимента; при использовании разработанной методологии впервые изучен состав жирных, дикарбоновых и аминокислот в лиофилизатах клеток аденокарциномы прямой кишки человека и фибробластов с использованием ГХ/МС анализа производных определяемых соединений и впервые показана возможность увеличения достоверности установления отличия этих клеток друг от друга на основании различия в составе аминокислот.
  7. Разработан метод обнаружения нелетучих физиологически активных веществ, основанный на их дериватизации, замене реагента после дериватизации на легколетучий инертный растворитель, концентрировании полученных растворов в условиях НМХД и анализе всего концентрата свободного и от реагента и от растворителя методом ГХ/МС.  Метод позволил снизить пределы обнаружения производных таких соединений более чем на 2 порядка.
  8. Предложен подход к обнаружению C-, H-, N-, O-, F-, Cl-, Br-, P- и S- содержащих органических соединений методом ГХ/АЭД, позволивший минимизировать зависимость сигналов этого детектора по С и Н от структуры и элементного состава аналитов при использовании гелиевой плазмы, обогащённой кислородом. Это позволило осуществить определение отношений nc/nh для различных веществ c минимальной погрешностью. Позволило предложить способ определения процентного содержания углерода в молекулах компонентов смесей углеводородов с высокой точностью и определения их количественного содержания без градуировки АЭД по каждому компоненту. Способ не требует образцов сравнения для каждого компонента смеси.

Практическая значимость

  1. Предложенный подход к обнаружению ПХДД, ПХБ и ХОП в органических и водных растворах при их совместном присутствии в смеси на уровне 10-12 - 10-10 % показывает принципиальные возможности сочетания предложенного подхода к концентрированию органических растворов и анализа всего концентрата методом ГХ/МС. В случае отсутствия (или снижения) влияния мешающих компонентов матрицы способ позволяет проводить быстрый скрининг проб экстрактов на наличие хлорсодержащих токсикантов.
  2. Модификации разработанного метода концентрирования органических растворов следов СЛОС в условиях НМХД и в присутствии сорбента (размеры камеры концентрирования, вид сорбента, его количество либо отсутствие, условия перевода в разделительную капиллярную колонку, условия хромато-масс-спектрометрического анализа) позволили разработать ряд способов и подходов к обнаружению компонентов различных сложных смесей при из содержании на ультрамикроуровне, и решить ряд важных задач в эколого-аналитическом контроле, медицинской диагностике, антидопинговом контроле и идентификации компонентов сложных смесей.
  3. Разработанный способ определения аминокислот в водных растворах, основанный на получении ИБОК-ГФБ производных в воде, их жидкостной экстракции, концентрировании растворов аналитов в условиях НМХД и ГХ/МС анализе всего концентрата аналитов, позволяет снизить пределы обнаружения аминокислот более, чем на 2 порядка, благодаря чему существенно расширены возможности решения различных задач, связанных с определением состава аминокислот. Показанная возможность увеличения достоверности установления отличия клеток аденокарциномы прямой кишки человека и фибробластов между собой на основании различия в составе аминокислот может увеличить достоверность гистологической диагностики онкозаболеваний.
  4. Разработанные способы определения следовых содержаний производных ряда нуклеозидов, 2-деокси-2-фтор-d-глюкозы, ряда сахаров,  позволяют снизить пределы обнаружения более чем на 2 порядка, и решить соответствующие задачи на новом уровне, недостижимом при общепринятом подходе.
  5. Существенно расширены возможности антидопингового контроля благодаря разработанному способу анализа стероидов в водных растворах и моче. Способ позволяет зарегистрировать в моче больше соединений со стероидной структурой и снизить предел обнаружения более чем в 100 раз по сравнению с общепринятым подходом.
  6. Разработанный подход, позволяющий минимизировать зависимость сигналов по С и Н атомно-эмиссионного детектора (АЭД) от структуры аналитов, и определять отношения nс/nh с низкой погрешностью расширяет возможности ГХ/АЭД с точки зрения определения как качественного, так и количественного состава компонентов смесей, особенно компонентов смесей углеводородов. Показана возможность определения элементного состава компонентов и их содержания для различных смесей без проведения градуировки АЭД по каждому компоненту, что очень важно при анализе многокомпонентных смесей. Благодаря этому возможна градуировка других детекторов (например, ПИД) при отсутствии стандартных образцов аналитов.
  7. Предложенные подходы к обнаружению следов аналитов в органических растворах основанные на концентрировании этих растворов в условиях НМХД и последующем анализе всего концентрата методами ГХ/АЭД и ГХ/МС, позволившие снизить пределы обнаружения методов ГХ/АЭД и ГХ/МС более чем на 2 порядка, существенно расширили возможности как обнаружения заданных соединений, так и идентификации компонентов смесей на уровне следов при совместном использовании данных, полученных этими методами.
  8. Предложен способ дифференциации здоровых людей и больных астмой и ХОБЛ, при использовании разработанного подхода к определению состава неизвестных СЛОС на уровне следов (10-8 - 10-7 %) в водном конденсате выдыхаемого воздуха, что очень важно для проведения правильной терапии больных рассмотренными заболеваниями.
  9. Новые возможности в эколого-аналитическом контроле открываются при использовании предложенных способов определения суммарного содержания Hal-, P- и S- содержащих органических соединений на уровне (10-10 - 10-8 %) в водных и органических растворах. Эти способы позволяют создать новую методологию действенного эколого-аналитического контроля за всеми наиболее опасными нормируемыми и ненормируемыми токсикантами, основанную на быстром скрининге проб на суммарное содержание соответствующих соединений (элементов).
  10. Предложенный новый подход к определению состава неизвестных среднелетучих примесей в фармацевтических субстанциях, основанный на жидкостной экстракции и ГХ/МС (ЭИ, ХИ) анализе всего концентрата открывает новые возможности для сопоставления качества оригинальных (патентованных) субстанций (и препаратов на их основе) и дженериков (копий). Это удаётся благодаря возможности сравнения многомерных профилей примесей (времён удерживания, масс-спектров электронной и химической ионизации и интенсивностей соответствующих сигналов для зарегистрированных соединений).

Положения, выносимые на защиту

  1. Подход к обнаружению ПХДД, ПХБ и ХОП в органических растворах на уровне 10-12 - 10-10 %. Подход основан на концентрировании органических растворов следов этих веществ в предколонке без неподвижной фазы, соединённой с разделительной колонкой и линией сброса паров растворителя и анализе всего концентрата методом ГХ/МС (ХИ) с регистрацией отрицательных ионов.
  2. Подход к обнаружению ПХДД, ПХБ и ХОП в водных растворах на уровне ПДК и ниже, основанный на микрожидкостной экстракции аналитов, концентрировании экстракта в условиях НМХД и анализе всего концентрата методом ГХ/МС (ХИ) с регистрацией отрицательных ионов.
  3. Метод концентрирования органических растворов (экстрактов) следовых количеств среднелетучих органических соединений в условиях НМХД, переводе концентрата термодесорбцией в аналитический прибор и анализе всего концентрата методами ГХ/МС и элементного анализа.
  4. Способ определения аминокислот в водном растворе на уровне следов основанный на получении их ИБОК-ГФБ производных, жидкостной экстракции, концентрировании экстрактов в условиях НМХД и ГХ/МС анализе всего концентрата аналитов, позволяющий снизить предел обнаружения более чем на 2 прядка.
  5. Способ дифференциации клеток аденокарциномы и фибробластов, основанный на определении состава аминокислот (их ИБОК-ГФБ производных) методом реакционной ГХ/МС в этих клетках.
  6. Метод обнаружения нелетучих органических соединений (или соединений, аналитический сигнал производных которых более информативен), основанный на дериватизации, замене реагента после проведения дериватизации на летучий растворитель, концентрировании полученных растворов производных в условиях НМХД и ГХ/МС анализе всего концентрата аналитов. Способ обнаружения стероидов в водных растворах и моче, основанный на разработанном методе, позволивший снизить более чем на 2 порядка пределы обнаружения и регистрировать в моче большее число соединений со стероидной структурой.
  7. Подход к минимизации зависимости сигналов АЭД по С и Н от структуры молекул аналитов, и определения отношения nс/nh с высокой точностью, основанный на использовании гелиевой плазмы, обогащённой кислородом. Способ определения элементного состава компонентов смесей углеводородов с высокой точностью и их количественного содержания без градуировки АЭД по каждому компоненту с использованием разработанных условий определения.
  8. Подходы к обнаружению органических соединений на уровне следов в органических растворах (экстрактах) методами ГХ/АЭД и ГХ/МС, позволяющие снизить пределы обнаружения этими методами более, чем на 2 порядка.
  9. Способ одновременного определения общего содержания Hal-, P- и S- содержащих органических соединений в водных растворах, основанный на высаливании, жидкостной экстракции, концентрировании экстракта в условиях НМХД, переводе всего концентрата аналитов в реактор термодесорбцией и анализе всего абсорбата продуктов высокотемпературной окислительной конверсии методом ионной хроматографии (предел обнаружения по элементу на уровне 10-10 %).
  10. Способ определения состава неизвестных СЛОС на уровне 10-8 - 10-7 % в водном конденсате выдыхаемого воздуха, основанный на жидкостной экстракции с высаливанием, концентрировании аналитов из полученного органического экстракта с удалением растворителя вне аналитической системы и анализе всего концентрата методом ГХ/МС. Способ дифференциации здоровых людей и больных ХОБЛ и бронхиальной астмой с высокой достоверностью на основании данных, полученных в результате анализа соответствующих конденсатов.
  11. Новый подход к определению состава неизвестных среднелетучих примесей в фармацевтических субстанциях и фармпрепаратах на их основе. Подход основан на жидкостной экстракции растворителем, не растворяющим основной компонент, концентрировании аналитов из полученного экстракта вне аналитической системы и ГХ/МС (ЭИ, ХИ) анализе всего концентрата аналитов и позволяет зарегистрировать большее число примесей, по сравнению с существующим подходом.

Апробация работы и публикации

Результаты исследований докладывались на следующих научных конференциях:

16-th International Symposium on Capillary Chromatography (Riva-del-Garda, Italy, 1994); Международный Симпозиум «Хроматография и масс-спектрометрия в анализе объектов окружающей среды» (Ст.-Петербург, Россия, 1994); Всероссийская конференция по анализу объектов окружающей среды «Экоаналитика-94» (Краснодар, Россия, 1994); InCom’95 International Symposium on Instrumentalized Analytical Chemistry and Computer Technology (Dusserldorf, Germany, 1995); PIITCON (McCormick Place, Chicago, Illinois, 1996); InCom’96 International Symposium on Instrumentalized Analytical Chemistry and Computer Technology (Dusserldorf, Germany, 1996); VII Всероссийский симпозиум по молекулярной жидкостной хроматографии (Москва, Россия, 1996); 18-th International Symposium on Capillary Chromatography (Riva-del-Garda, Italy, 1996); ISCSE’96, Chromatography and spectroscopy in environmental analysis and toxicology (St.-Petersburg, Russia,1996); IFPAC’97, Eleventh international forum process analytical chemistry (Seattle (Blaine), WA, USA, 1997); InCom’97 International Symposium on Instrumentalized Analytical Chemistry and Computer Technology (Dusserldorf, Germany, 1997); PITTCON (Atlanta, Georgia, USA,1997); Nineteenth international symposium on capillary chromatography and electrophoresis (Wintergreen, Virginia, USA, 1997); International congress on Analytical chemistry (Moscow, Russia, 1997); Balaton symposium’97 on high-performance separation methods (Siofok, Hungary, 1997); InCom’98 International Symposium on Instrumentalized Analytical Chemistry and Computer Technology (Dusserldorf, Germany, 1998); PITTCON (New Orleans, Louisiana, USA, 1998); 20th International Symposium on Capillary Gas Chromatography (Riva del Garda, Italy, 1998); Balaton symposium’99 on high-performance separation methods (Siofok, Hungary, 1999); PITTCON (New Orleans, Louisiana, USA, 2000); 23rd International Symposium on Capillary Gas Chromatography (Riva del Garda, Italy, 2000); 10-th Russian-Japan Joint Symposium on Analytical Chemistry (Moscow and Saint Petersburg, Russia, 2000); VIII Всероссийский симпозиум по молекулярной жидкостной хроматографии и капиллярному электрофорезу (Москва, Россия, 2001); Seventh International Symposium on Hyphenated Techniques in Chromatography and Hyphenated Chromatographic Analyzers (Brugge, Belgium, 2002); Всероссийский симпозиум « Современные проблемы хрматографии» (Москва, Россия, 2002); 25th International Symposium on Capillary Gas Chromatography (Riva del Garda, Italy, 2002); 3rd International Symposium on Separations in BioSciences (100 Years of Chromatography) (Moscow, Russia, 2003); 8th International Symposium on Hyphenated Techniques in Chromatography (Brugge, Belgium, 2002); Всероссийский симпозиум «Хроматография и хроматографические приборы» (Москва, Россия, 2004); 27th International Symposium on Capillary Gas Chromatography  (Riva del Garda, Italy, 2004); European Conference on Analytical Chemistry (Salamanca, Spain,2004); Всероссийская конференция «Теория и практика хроматографии. Применение в нефтехимии» (Самара, Россия, 2005); Второй съезд ВМСО, Всероссийская конференция с международным участием «Масс-спектрометрия и ее прикладные проблемы» (Москва, Россия, 2005); II Международный симпозиум «Разделение и концентрирование в аналитической химии и радиохимии» (Краснодар, Россия, 2005); 1st BBBB Conference on Pharmaceutical science (Siofok, Budapest, Hungary, 2005); International Conference Instrumental Methods of Analysis «IMA’05» (Iraklion, Grete, Greece, 2005); 28th International Symposium on Capillary Chromatography and Electrophoresis  (Las Vegas, USA, 2005); 40th IUPAC Congress «Innovation in Chemistry» (Beijing, China, 2005); Ninth International symposium on hyphenated techniques in chromatography and hyphenated chromatographic analyzers (York, 2006); 29th International Symposium on Capillary Gas Chromatography (Riva del Garda, Italy, 2006); International Congress on Analytical Sciences ICAS-2006 (Moscow, Russia, 2006); Всероссийский симпозиум «Хроматография в химическом анализе и физико-химических исследованиях» (Москва - Клязьма, Россия, 2007); Третий съезд ВМСО II Всероссийская конференция с международным участием «Масс-спектрометрия и ее прикладные проблемы» (Москва, Россия, 2007); II Всероссийская конференция по аналитической химии с международным участием «Аналитика России» (Краснодар, Россия, 2007); Всероссийский симпозиум «Хроматография и хромато-масс-спектрометрия» (Москва, Клязьма, Россия, 2008); Всероссийская конференция «Химический анализ» (32-я годичная сессия научного совета РАН по аналитической химии) (Москва, Клязьма, Россия, 2008); The 32th International Symposium on Capillary Gas Chromatography (Riva del Garda, Italy, 2008); II Международный форум «Аналитика и Аналитики» (Воронеж, Россия, 2008); The 68th FIP World Congress of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences (Basel, Switzerland, 2008); Четвертый съезд ВМСО III Всероссийская конференция с международным участием «Масс-спектрометрия и ее прикладные проблемы» (Москва, Россия, 2009); VII Всероссийская конференция по анализу окружающей среды «Экоаналитика-2009» (Йошкар-Ола, Россия, 2009); Всероссийская конференция «Теория и практика хроматографии. Хроматография и нанотехнологии» (Самара, Россия, 2009); V Международная научно-практическая конференция «Сверхкритические флюиды: фундаментальные основы, технологии, инновации» (Суздаль, Россия, 2009); III Всероссийская конференция с международным участием «Аналитика России» (Краснодар, Россия, 2009); III Российская конференция «Актуальные проблемы нефтехимии» (Звенигород, Россия, 2009); I Всероссийская конференция «Современные методы химико-аналитического контроля фармацевтической продукции» (Москва, Россия, 2009); Съезд аналитиков России 2010 «Аналитическая химия – новые методы и возможности» (Москва, Россия 2010); 34th International Symposium on Capillary Chromatography and 7th GCGC Symposium (Riva del Garda, Italy 2010); Четвертая Всероссийская конференция-школа «Фундаментальные вопросы масс-спектрометрии и ее аналитические применения» (Звенигород, Россия 2010); Четвертая Международная конференция «Экстракция органических соединений» (Воронеж, Россия. 2010); Пятый съезд ВМСО, 4 Всероссийская конференция с международным участием «Масс-спектрометрия и её прикладные проблемы» (Москва, Россия, 2011); Третий Всероссийский симпозиум с международным участием «Разделение и концентрирование в аналитической химии и радиохимии» (Краснодар, Россия, 2011).

Вклад автора

Вклад автора в работы, выполненные в соавторстве и включённые в диссертацию, состоит в общей постановке задач, непосредственном участии в экспериментальных исследованиях, творческом участии на всех этапах исследований, обсуждении и оформлении полученных результатов и обобщении результатов исследований.

Публикации результатов

Материалы диссертации опубликованы в 29 статьях и в более чем 80 тезисах докладов и патенте.

Структура и объём работы

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 5-ти глав с обсуждением полученных результатов, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на  280 страницах текста, содержит 76 таблиц и 40 рисунков.

Основное содержание работы

Во введении обоснована актуальность работы, сформулированы её цели и задачи, решение которых необходимо для достижения поставленных целей.

Обоснована необходимость развития направления работ по выделению следовых количеств СЛОС из больших проб органических растворов с удалением растворителя и анализом всего концентрата. Развитие этих работ актуально как для снижения пределов обнаружения заданных соединений методами ГХ-МС и элементного анализа, так и установления числа неизвестных соединений и их идентификации на следовом уровне в объектах различного происхождения.

Первая глава посвящена краткому обзору основных способов выделения следовых количеств СЛОС из органических растворов (экстрактов), полученных в результате пробоподготовки (в основном, жидкостной экстракции) и последующего анализа концентратов методами КГХ, ГХ-МС, ГХ-АЭД, определения суммарного содержания элемент-органических соединений. Рассмотрены возможности и ограничения известных методов.

В этой же главе приведен обзор литературных данных по анализу методом газовой хроматографии и хромато-масс-спектрометрии производных таких малолетучих либо нелетучих физиологически активных соединений, как жирные, дикарбоновые, гидрокси-, окси- и аминокислоты, сахара, спирты, стеролы, нуклеозиды, стероиды. Особое внимание уделено возможности определения следов большей части из них при их совместном присутствии в водных растворах и биосредах.

Проведен также обзор литературы по возможности применения газовой хроматографии с атомно-эмиссионным детектором (ГХ/АЭД) для определения качественного и количественного состава компонентов смесей.

Рассмотрена литература по определению суммарного содержания галоид-, фосфор- и сераорганических соединений в органических и водных растворах и зависимости сигналов АЭД по элементам от структуры аналитов. Приведен обзор литературы по определению следов органических соединений в выдыхаемом воздухе. Особое внимание уделено среднелетучим соединениям.

Во второй главе обсуждаются результаты исследования масс-спектров химической ионизации с регистрацией отрицательных ионов для ПХДД, ПХБ и ХОП, условий селективного их определения в растворе на уровне следов методом ГХ-МС. Обсуждаются разработанные подходы к обнаружению этих соединений в органических и водных растворах на уровне (10-12-10-10) % и (10-13-10-11) %, соответственно. Подходы основаны на выделении 10-13-10-12 г аналитов из больших проб органических растворов (или экстрактов из водных растворов) в предколонке без неподвижной фазы, соединённой с разделительной колонкой и линией сброса паров растворителя, с последующим разделением выделенных веществ и масс-спектральным детектированием в режиме химической ионизации с регистрацией отрицательных ионов.

В этой же главе обсуждается новый метод анализа органических растворов, содержащих следы СЛОС различной полярности и летучести (хлорфенолы, ПАУ, ПХБ, ХОП), основанный на концентрировании этих растворов (метод непрерывной микрохромадистилляции), и анализе всего концентрата. Метод основан на выделении следовых количеств аналитов из больших проб органических растворов в процессе непрерывного ввода пробы раствора (с одновременным удалением растворителя) и потока инертного газа в камеру концентрирования (кварцевый капилляр или кварцевая трубка малого диаметра) и переносе всего концентрата в аналитическую систему термодесорбцией в потоке газа-носителя. Процесс концентрирования осуществляется вне прибора, с помощью которого после термодесорбции проводится регистрация выделенных веществ. 

Третья глава посвящена разработке подходов к обнаружению следовых количеств различных нелетучих и малолетучих биологически активных органических соединений в органических, водных растворах и биосредах методом ГХ/МС после  извлечения веществ из образцов и получения их термостабильных и летучих производных. Рассмотрена возможность обнаружения следов дериватов таких соединений, как органические кислоты и аминокислоты, сахара, стероиды, с использованием метода ГХ-МС (ЭИ, ХИ). Приведены результаты определения состава жирных, дикарбоновых и аминокислот в культурах клеток аденокарциномы прямой кишки человека и фибробластов и показана возможность увеличения достоверности дифференциации этих клеток на основании полученных данных по составу аминокислот. В этой же главе рассмотрен новый способ определения следовых концентраций аминокислот в водных растворах, позволяющий снизить пределы обнаружения более чем на 2 прядка. Кроме того, изучена возможность дериватизации ряда фармацевтических субстанций, с использованием различных способов дериватизации и показано, что наибольшее число из изученных соединений может быть продериватизировано с использованием реакции силилирования.

Рассмотрен новый подход к развитию высокочувствительного обнаружения следов производных нелетучих органических соединений методом хромато-масс-спектрометрии. Этот подход основан на удалении избытка дериватизирующего реагента из реакционной смеси после проведения реакции дериватизации, его замене на легколетучий инертный растворитель, концентрировании дериватов из всего объёма пробы полученного раствора с помощью разработанного метода, основанного на НМХД и ГХ-МС анализе всего концентрата. Подход существенно расширяет возможности метода ГХ/МС благодаря снижению пределов обнаружения производных и увеличению стабильности характеристик метода во времени. С использованием этого подхода выбраны условия обнаружения следов биологически активных соединений (нуклеозиды, сахара, стероиды) рассмотренные в этой главе.

В четвёртой главе рассмотрены результаты исследования зависимости сигналов атомно-эмиссионного детектора (АЭД) для С и Н от структуры аналита и присутствия в его молекуле таких элементов, как N, O, F, Cl, Br, I, P и S. Предложен подход, сочетающий преимущества разработанного метода концентрирования основанного на НМХД и метода ГХ/АЭД для обнаружения  следовых количеств среднелетучих соединений. Подход позволил снизить пределы обнаружения метода ГХ/АЭД более чем на 2 порядка. В этой же главе приведены результаты исследования по определению элементного состава компонентов смесей углеводоров и их количественного состава без градуировки по каждому компоненту при использовании усовершенствованного метода ГХ-АЭД, позволяющего минимизировать зависимость сигнала АЭД по каналам С и Н от структуры и элементного состава молекул. Рассмотрен новый подход к идентификации компонентов смесей на следовом уровне, основанный на выделении компонентов из органического раствора (экстракта) в процессе НМХД, анализе всего концентрата методами ГХ/МС (ХИ, ЭИ) и ГХ/АЭД и совместном использовании полученных данных о молекулярной массе компонента, присутствующих в молекуле элементах и масс-спектре электронной ионизации.

Пятая глава посвящена разработке способа быстрого скрининга проб органических и водных растворов на суммарное содержание галоген-, фосфор- и сера- органических соединений на уровне следов и новых подходов к эколого-аналитическому контролю и обнаружению опасных органических соединений в различных матрицах.

В шестой главе приведены результаты исследования состава неизвестных среднелетучих органических соединений на уровне следов в конденсате выдыхаемого воздуха человека, полученные при использовании разработанного метода концентрирования в процессе НМХД и анализа всего концентрата методом, ГХ-МС (ЭИ, ХИ). Проведено сопоставление результатов анализа образцов конденсата выдыхаемого воздуха по обнаруженным соединениям, собранных у групп здоровых людей и больных бронхиальной астмой и ХОБЛ. Показано, что такое сопоставление позволило существенно увеличить достоверность дифференциации здоровых и больных этими заболеваниями по сравнению с существующим в медицине подходом. В этой главе представлен новый подход к определению состава неизвестных среднелетучих примесей в фармацевтических субстанциях и фармпрепаратах на их основе. Подход основан на жидкостной экстракции растворителем, не растворяющим основной компонент, концентрировании полученного экстракта в процессе НМХД и ГХ/МС (ЭИ, ХИ) анализе всего концентрата аналитов. Подход позволяет зарегистрировать большее число примесей, по сравнению с существующим подходом, основанным на растворении субстанции в растворители хорошо растворяющим основной компонент.

1. Концентрирование органических растворов ультрамалых количеств среднелетучих органических соединений различной полярности и летучести и ГХ-МС анализ всего концентрата.

1.1. Разработка подхода к обнаружению ПХДД, ПХБ и ХОП в водных и органических растворах при их совместном присутствии в смесях на уровне ультраследовых количеств

Определение СЛОС на уровне ниже 10-5% в воде,  и органических растворах (экстрактах) требует предварительного выделения и концентрирования. В большинстве случаев для извлечения таких соединений из вод и других сред используется жидкостная экстракция с последующим упариванием. Объектом исследования является органический раствор (экстракт) объём которого составляет до 1 мл; при этом анализу подлежит лишь 0.001-0.01 часть конечного объёма экстракта. Актуальной задачей является разработка способов концентрирования следов СЛОС из больших проб органических растворов (экстрактов) и ГХ-МС анализа всего концентрата аналитов.

В этой главе с использованием большого числа модельных соединений (больше 130) таких, как ПХДД, ПХБ и ХОП на основании изучения масс-спектров их химической ионизации с регистрацией отрицательных ионов и выбора условий газо-хроматографического разделения разработан подход к их обнаружению при совместном присутствии в растворе на уровне 10-13 – 10-12 г в пробе методом ГХ-МС с химической ионизацией и регистрацией отрицательных ионов (Cl-, М-).

1.2. Разработка подхода к концентрированию органических растворов, содержащих следовые количества ПХДД, ПХБ и ХОП в предколонке без неподвижной фазы, соединённой с разделительной колонкой и линией сброса паров растворителя в термостате хроматографа и ГХ-МС анализу всего концентрата аналитов с регистрацией отрицательных ионов

Показано, что общепринятый вариант концентрирования в газовом хроматографе  не применим при непрерывной подачи пробы раствора в ГХ с масс-спектральным детектором в связи с попаданием большой доли паров растворителя в разделительную колонку и масс-спектрометр.

Разработан подход к  концентрированию больших проб органических растворов (экстрактов), содержащих следовые количества (10-13 - 10-12 г) органических соединений. Подход основан на удалении основной массы паров растворителя при непрерывной подаче пробы раствора в зону концентрирования (предколонку без неподвижной фазы, соединённую с разделительной колонкой и линией сброса паров растворителя) до разделительной колонки и анализе сконцентрированных веществ при увеличении температуры термостата по оптимизированной температурной программе. С целью минимизации потока паров растворителя в разделительную  колонку и масс-спектрометр на выходе из предколонки включён форвакуумный насос (подключён к линии сброса паров растворителя).

При использовании предложенного подхода к концентрированию больших проб органических растворов следов ПХДД, ПХБ и ХОП внутри термостата хромато-масс-спектрометра и предложенного подхода к обнаружению этих веществ при совместном присутствии на уровне  10-13 - 10-12 г, была показана принципиальная возможность быстрого скрининга органических растворов на содержание ПХДД, ПХБ и ХОП на уровне 10-12 - 10-10 %, при условии отсутствия (или устранения) мешающих компонентов матрицы.

Соответствующие данные по пределам обнаружения, полученные для различных ПХДД, приведены в Таблице 1.

Таблица 1. Пределы обнаружения различных ПХДД при концентрировании проб гексанового раствора объёмом 10 и 400 мкл внутри термостата хроматографа и ГХ/МС (ХИ) анализе всего концентрата аналитов с регистрацией отрицательных ионов (35Сl-)

Название

Предел обнаружения, ×10-15, г

Предел обнаружения, ×10-10, %

Объём пробы, мкл

Объём пробы, мкл

10

400

10

400

1

Тетра ХДД

50

40

7.1

0.14

2

Пента ХДД

20

10

2.9

0.04

3

Гекса ХДД

20

10

2.9

0.04

4

Гепта ХДД

30

20

4.3

0.07

5

Окта ХДД

600

500

86.0

1.80

Подход к обнаружению ультраследовых содержаний ПХДД, ПХБ и ХОП при их совместном присутствии в органических растворах позволил приступить к исследованию по обнаружению этих соединений на ультраследовом уровне и в водных растворах. Была изучена степень извлечения рассматриваемых соединений при использовании микрожидкостной экстракции (соотношение водный раствор/гексан, равное 100:1). Объём водного раствора был равен 40 мл. Вода предварительно была тщательно очищена от фонового содержания хлорорганики.

В результате проведенных исследований был предложен быстрый скрининг проб водных растворов (свободных от мешающих компонентов матрицы) на содержание ПХДД, ПХБ и ХОП, основанный на микрожидкостной экстракции, концентрировании экстрактов и ГХ/МС анализе в режиме химической ионизации с регистрацией отрицательных ионов всего концентрата аналитов. Пределы обнаружения, полученные для ряда ХОП, приведены в Таблице 2.

Таблица 2. Пределы обнаружения нормированных в воде ХОП по концентрации, полученные при анализе предложенным способом

Название соединения

Концентрация, созданная в воде, 10-13%

Предел обнаружения,

10-13% (S/N=10:1)

1

1,2,3,4-тетрахлорбензол

240

21

2

-хлорциклогексан

210

15

3

гексахлорбензол

240

45

4

-гексахлорциклогексан

250

6

5

-гексахлорциклогексан

200

6

6

гептахлор

210

3

7

альдрин

240

3

8

гептахлорэпоксид

320

3

9

кельтан

350

3

10

ДДД

230

6

11

ДДТ

170

3

Пределы обнаружения для ПХДД и ПХБ составили 2.510-13 – 1.310-11%, и 10-13 - 10-12%, соответственно. Время одного определения не превышало 30 мин.

Концентрирование больших проб органических растворов следов СЛОС внутри термостата газового хромато-масс-спектрометра и анализ всего концентрата методом ГХ/МС позволили предложить подходы к быстрому скринингу органических и водных растворов на содержание наиболее опасных ксенобиотиков на уровне ПДК и ниже, при совместном присутствии в смеси (при условии отсутствия влияния мешающих компонентов матрицы). На примере хлорированных токсикантов была показана принципиальная возможность достижения столь низких пределов обнаружения органических соединений в водных и органических растворах при применении разработанного подхода.

Разработка обеспечила возможность снижения пределов обнаружения других СЛОС на 2-3 порядка, по сравнению со стандартными методами.

Однако этому подходу присущи определённые ограничения:

- он применим только для анализа очищенных экстрактов с малым содержанием малолетучих и нелетучих неопределяемых примесей;

- объединение стадии концентрирования аналитов в процессе удаления растворителя внутри системы ГХ/МС и стадии анализа снижает производительность анализов; концентрирование проводится только в данном приборе, концентрат не может быть проанализирован другим методом или на другом ГХ/МС приборе;

- попадание части (хотя и небольшой) паров растворителя в разделительную колонку и масс-спектрометр.

1.3. Разработка метода анализа органических растворов следовых количеств СЛОС, основанного на концентрировании растворов в процессе непрерывной микрохромадистилляции и анализе всего концентрата аналитов методом ГХ-МС после перевода концентрата в прибор термодесорбцией

В связи с этим было проведено следующее исследование возможности концентрирования следов СЛОС из больших проб органических растворов и анализа всего концентрата. Следовые количества аналитов из органических растворов выделяли в процессе непрерывной подачи с постоянной скоростью пробы раствора (с одновременным удалением паров растворителя) и потока инертного газа в камеру концентрирования (кварцевый капилляр или кварцевая трубка малого диаметра). После завершения концентрирования пробы раствора (объём пробы до 500 мкл) весь концентрат, свободный от растворителя, переносили из камеры концентрирования в инжектор хроматографа или непосредственно в капиллярную колонку термодесорбцией в потоке газа-носителя и анализировали методом ГХ/МС. Процесс концентрирования осуществляли вне прибора, с помощью которого после термодесорбции проводили обнаружение выделенных веществ.  Внутри камеры концентрирования осуществлялось распыление органического раствора с образованием капель на стенках камеры и паров в газовой фазе. В случае выделения из раствора в камере концентрирования более летучих СЛОС, на выходе из неё, помещали небольшое количество сорбента (миллиграммы).

Исследование проводили при использовании растворов в гексане таких модельных соединений, как ПАУ, ПХБ, ПХДД, ХОП, алкил-фенолы, хлорфенолы, нитрофенол, хлоранилин и др., содержание которых в пробе составляло 10-10 – 10-8 г.

Необходимым условием концентрирования, как показал эксперимент, было наличие жидкой фазы раствора внутри камеры концентрирования (на её стенках) и отсутствие таковой на выходе из неё.

Камеру испарения и концентрирования помещали в металлический контейнер (картридж) цилиндрической формы. Картридж обеспечивал возможность подачи потоков инертного газа и органического раствора в камеру при концентрировании определяемых веществ. Он же соединялся с инжектором газового хроматографа через иглу, либо непосредственно с разделительной капиллярной колонкой для проведения термодесорбции концентрата аналитов в потоке газа-носителя (гелия).

Исследование концентрирования определяемых веществ из органических растворов включало следующие этапы:

- выбор сорбента (и его количества), который бы обладал минимальной остаточной сорбцией аналитов, и, в то же время, позволял выделять из потока парогазовой смеси их следовые количества;

- изучение степени термодесорбции с сорбента следовых количеств всех соединений, выбранных в качестве модельных;

- изучение зависимости степени переноса аналитов из пробы органического раствора в ГХ/МС, от объёма пробы раствора, подаваемого в камеру концентрирования, от скорости потока инертного газа, от скорости подачи раствора в камеру концентрирования; выбор оптимальных скоростей раствора и инертного газа;

- уменьшение размеров камеры концентрирования с оптимизацией всех вышеперечисленных параметров.

Изучены такие сорбенты, как кварцевые шарики с 1% НФ, Хромосорб G с 3% НФ, сверхтонкое кварцевое волокно (СКВ), обработанное диметилдихлорсиланом. В роли камеры концентрирования выступали кварцевые трубки различного внутреннего диаметра (от 5 до 1 мм), длинной от 30 до 100 мм. Слой сорбента составлял до длины трубки.

В результате проведенных исследований в качестве сорбента было выбрано СКВ. Изучение условий термодесорбции ПАУ, ПХБ, ПХДД, ХОП и СЛОС различной полярности (для 10-8 - 10-9 г) показало, что степень термодесорбции для всех изученных СЛОС (36 соединений) составила в большинстве случаев около 100%. Результаты представлены в таблицах 3 и 4.

Таблица 3. Степень термодесорбции ряда ПАУ, ПХБ, ХОП, ПХДД с СКВ (Р=0.95, n=6)

Название соединения

Степень термодесорбции, %

Количество вещества

n10-9г

n10-8г

бифенил

94±5

95±6

Бенз()пирен

96±7

98±7

2-хлорбифенил

97±6

99±6

2,2',3,3',4,5',6,6'-октахлорбифенил

97±6

96±7

1,2,3,4-тетрахлорбензол

96±6

98±6

ДДТ

97±6

96±7

1,3,7,8-тетраХДД

98±5

97±6

Окта-ХДД

98±7

97±6

Таблица 4. Степень термодесорбции модельной смеси среднелетучих нормируемых соединений разной полярности  с СКВ (Р=0.95, n=6)

Название соединения

Степень термодесорбции, %

Количество вещества

n10-9г

n10-8г

фенол

78±5

80±6

2-метилфенол

76±5

84±5

3-метилфенол

85±5

89±6

4-метилфенол

85±6

89±5

Бензойная кислота

95±5

97±5

4-хлорфенол

97±6

96±6

4-хлранилин

96±6

98±5

4-нитрофенол

99±7

101±6

пентахлрфенол

98±7

100±6

Ди-н-бутилфталат

99±6

99±7

В качестве модельных веществ отбирали аналиты, температуры кипения которых охватывали весь диапазон для СЛОС. Степень извлечения изученных аналитов из пробы органического раствора объёмом 100 мкл (с учётом степени термодесорбции), как показал эксперимент, практически не зависела от скорости потока инертного газа (100 – 480 см3/мин) и для большинства изученных СЛОС составила около 100 %. Результаты представлены в таблице 5.

Таблица 5. Зависимость степени переноса ПХБ в ГХ/МС при концентрировании раствора объёмом 100 мкл от скорости потока инертного газа (Р=0.95, n=3)

Название соединения

Степень переноса, %

Скорость потока инертного газа, см3/мин

480

340

200

100

2-хлорбифенил

22±5

38±5

60±5

96±5

2,3-дихлорбифенил

65±7

87±6

95±5

102±4

2,4,5-трихлорбифенил

93±6

95±6

96±5

95±5

2,2',3,4,6-тетрахлорбифенил

96±4

97±5

98±4

93±6

2,2',4,4'-пентахлорбифенил

97±5

98±5

99±6

99±7

2,2',4,4',5,6'-гексахлорбифенил

98±5

100±6

100±5

101±5

2,2',3,3',4,4',6-гептахлорбифенил

97±5

99±6

98±6

102±6

2,2',3,3',4,5',6,6'-октахлорбифенил

98±5

98±6

101±5

103±6

Оптимальной скоростью подачи инертного газа была выбрана скорость, равная 100 см3/мин, а оптимальной скоростью потока органического раствора - 100 мкл/мин.

При оптимальных скоростях потоков органического раствора и инертного газа, подаваемых в камеру концентрирования, была изучена зависимость степени переноса из пробы органического раствора в ГХ/МС от объёма концентрируемой пробы ряда ПАУ, ПХБ, ХОП и ПХДД. Полученные данные (количество каждого из веществ - около 10-9 г) приведены в Таблице 6.

Таблица 6. Зависимость степени переноса ряда ПАУ, ПХБ, ХОП и ПХДД из пробы органического раствора в ГХ/МС (при оптимальных скоростях потоков органического раствора и инертного газа при концентрировании) от объёма анализируемой пробы

Название соединения

Степень переноса, %

Объём анализируемой пробы, мкл

100

200

300

Бифенил

93±7

91±7

93±6

Бенз()пирен

101±6

102±6

98±7

2-хлорбифенил

98±7

96±6

95±6

2,2',3,3',4,5',6,6'-октахлорбифенил

101±6

103±6

102±7

1,2,3,4-тетрахлорбензол

96±6

95±6

96±6

ДДТ

96±6

99±6

97±6

1,3,7,8-тетраХДД

98±6

99±6

97±6

октаХДД

98±6

97±7

95±6

В результате проведенных исследований с использованием большого числа модельных СЛОС, отличающихся по летучести и полярности, разработан метод анализа больших проб органических растворов содержащих следы таких соединений. Метод основан на выделении всего количества искомых соединений из органических растворов, на переводе свободных от растворителя аналитов термодесорбцией из камеры концентрирования в газовый хроматограф и на их анализе методом газовой хромато-масс-спектрометрии. Извлечение следов веществ из растворов проводили вне приборов.

С нашей точки зрения процесс отделения следовых количеств (пг – нг) СЛОС от органического растворителя в разработанном методе может быть описан в виде  непрерывной микрохромадистилляции (НМХД). Дискретный вариант изотермической хромадистилляции был описан А.А. Жуковицким (ДИХД). В отличие от ДИХД, в рассматриваемом случае проба раствора подается непрерывно в камеру концентрирования вместе с потоком инертного газа, в которой происходит распыление раствора с образованием парогазовой смеси в присутствии жидкой фазы раствора, попавшей на стенки камеры, и небольшого количества инертного сорбента на выходе из камеры. Выбираются такие потоки органического раствора и инертного газа, чтобы на выход из камеры концентрирования поступала только парогазовая смесь, а примеси определяемых веществ концентрировались внутри камеры. Кроме того, размеры камеры концентрирования и, соответственно, площадь на которой распределяется жидкая фаза раствора в случае НМХД как минимум на два порядка меньше (по этой причине в названии появилось слово микро).

Выделение примесей из раствора происходит при комнатной температуре и ниже как благодаря процессу изотермической хромадистилляции (тяжёлые примеси выделяются в основном в начале камеры испарения на инертной поверхности кварца), так и процессу ограничительной хромадистилляции и неэффективной хроматографии на инертном сорбенте (помещённом на выходе из камеры). Этот сорбент должен обеспечивать возможность селективного отделения от растворителя следовых количеств (пг – нг) СЛОС различной полярности и летучести во время удаления из камеры концентрирования остатков растворителя и должен обеспечивать возможность извлечения из него этих веществ во время их перевода в аналитическую систему термодесорбцией.

При дискретной изотермической хромадистилляции, проба раствора наносится дискретно на инерный носитель (либо капиллярную колонку большой длины (порядка десяти метров), свободную от неподвижной фазы) с последующей продувкой инертным газом до удаления большей части растворителя из нанесённой пробы раствора. В этом случае, согласно А. А. Жуховицкому, может быть записано уравнение баланса для растворителя (концентрация которого в растворе >> концентрации примесей:

Qр = CiрVt  (1)

Где Qp – количество органического раствора (растворителя), г, нанесённого на инертный носитель;

Ci -  концентрация паров растворителя в газовом потоке, г/см3

V – объёмная скорость инертного газа, см3/мин, подаваемого в колонку;

t – время, в течение которого производится испарение растворителя.

Полное удаление растворителя в процессе концентрирования этим методом не производится.

При выделении следовых количеств СЛОС (температура кипения которых много больше температуры кипения растворителя) и концентрация которых в растворе на многие порядки меньше концентрации растворителя, количество испаряемого растворителя примерно соответствует количеству раствора.

В предлагаемом нами методе удаление растворителя осуществляется в большой степени в результате процесса непрерывной изотермической микрохромадистилляции (НИТМХД) в  коротком инертном кварцевом капилляре, при непрерывной подаче в него потоков пробы раствора (экстракта) и инертного газа.

Этот процесс может быть описан следующим неравенством:

Qр/tопт CipVопт  (2)

где Qр/tопт – количество органического раствора (растворителя), поступающего в камеру концентрирования, г/мин;

Vопт – скорость газа-носителя, при которой при выбранной скорости подачи раствора, на выход из камеры концентрирования поступает только парогазовая смесь;

tопт – выбранное оптимальное время концентрирования (подачи пробы раствора и удаления растворителя).

При заданном количестве раствора, выбираются оптимальные значения tопт и Vопт, при которых отсутствует проскок жидкой фазы на выходе из камеры концентрирования. т.е. на выходе - только парогазовая смесь.

Необходимые условия осуществления этого процесса в режиме НИТМХД:

  • отсутствие жидкости на выходе из камеры концентрирования (только паро-газовая смесь);
  • наличие небольшого количества жидкости в этой камере в процессе концентрирования  (для обеспечения процесса НИТМХД), которая испаряется потоком инертного газа при окончании подачи органического раствора в камеру;
  • отсутствие потерь выделяемых примесей в процессе концентрирования;
  • инертность поверхности кварца по отношению к следовым количествам аналитов.

Эти условия реализуются на практике при выборе соответствующего растворителя (экстрагента) и потоков органического раствора и инертного газа в камеру концентрирования в случае большого различия в упругости пара растворителя и примесей, инертности поверхности кварца по отношению к аналитам и отсутствии влияния растворителя на процесс отделения примесей от растворителя методом НИТМХД.

В последнем случае имеется в виду отсутствие размывания зоны растворителя в процессе  испарения и отделения примесей от него (и разделения их между собой благодаря процессу газовой хроматографии с подвижной/неподвижной фазой, роль которой играет растворитель, и вызванного этим процессом дополнительного размывания зон примесей). Этот процесс, в нашем случае, минимизирован благодаря большой скорости потока инертного газа, подаваемого в камеру концентрирования.

В качестве растворителя-экстрагента выбирается один из общепринятых растворителей, применяемых при жидкостной экстракции – наиболее летучий и наиболее чистый. Этим требованиям при решении различных задач отвечали спектроскопически чистые гексан, хлороформ, пентан, дихлорметан, метилтретбутиловый эфир.

При выбранных параметрах образования парогазовой смеси, обеспечивающих удаление растворителя из раствора в режиме НИТМХД за оптимальное время, выбранные скорости потоков инертного газа и органического раствора соответствуют Vопт и Qр/tопт.

Допустим, что количество примеси в пробе органического раствора, поступающего на концентрирование, равно qi.

Скорость переноса испаряемого количества примеси qiпр/tопт парогазовой смесью при выбранных для растворителя скорости потоков инертного газа Vопт и органического раствора Qр/tопт и давлении насыщенного пара примеси Сiпр будет описываться таким же уравнением баланса, как и в случае растворителя:

qiпр/tопт = qiпр(пар)/tопт = СiпрVопт (3)

где qiпр – количество примеси,  г, переносимое в парогазовой смеси в процессе удаления растворителя в режиме НИТМХД;

tопт – выбранное оптимальное время подачи раствора с удалением растворителя в виде парогазовой смеси, мин.

Сiпр – концентрация паров примеси в газовой фазе, соответствующая давлению насыщенного пара примеси;

Vопт – выбранная оптимальная скорость потока инертного газа, см3/мин в парогазовой смеси, сформированной в основном растворителем.

Так как tопт и Vопт в случае растворителя и примеси одни и те же, то

qiпр/Qp = Ciпр/Cip = Pxпр/ Pxр (4)

или

qiпр = Pxпр/ Pxр Qp  (5)

где Pxр и Pxпр – давления насыщенного пара растворителя и примеси, соответственно.

Т.е. количество примеси, уносимое с парами растворителя в парогазовой смеси тем меньше, чем меньше Pxпр (при Pxр=const).

При qiпрqi почти вся примесь переводится в паровую фазу и уносится парогазовой смесью (в режиме НИТМХД).

При qi>>qiпр примесь сконцентрируется в начальной части камеры концентрирования за счёт процесса (НИТМХД).

Время концентрирования в режиме НИТМХД определяется объёмом органического раствора (экстракта), временем его подачи и удаления растворителя потоком инертного газа. Последнее несколько превышает время подачи раствора и испарения растворителя, рассчитанное из уравнения (2) в связи с тем, что для полного удаления растворителя необходимо небольшое время после испарения основной его массы. Это время определялось исходя из необходимости минимизации потерь наиболее летучего СЛОС, присутствующего в смеси, и компонентов, концентрация которых в смеси наименьшая.

Предел обнаружения по массе при прямом определении СЛОС методом ГХ/МС в органических растворах составляет в общем случае при регистрации суммарного ионного тока около 10-10 г (при объёме пробы – 1 мкл). Для достижения более низких пределов обнаружения по концентрации необходимо концентрирование растворов определяемых веществ. При пробе объёмом 0.1 – 1мл и анализе всего концентрата предел обнаружения должен составлять 10-7 - 10-8 %, соответственно, при количественном выделении определяемых веществ. При этом количество аналита в объёме анализируемой пробы составляет те же 10-10 г. При регистрации в режиме селективного ионного детектирования предел обнаружения может достигать 10-11 - 10-12 г/мкл и ниже для заданных соединений.

Необходимым условием концентрирования следов примесей из органического раствора в соответствии с методом НИТМХД является не только большое различие в упругостях пара растворителя и примеси, но и присутствие примеси в пробе раствора в количествах qi, не испаряемых за время удаления растворителя в процессе концентрирования.

При количественном извлечении примесей методом НИТХД достаточно, чтобы qiпр0.01qi. Для qi = 10-10 г испаряемое количество примеси qiпр должно быть 10-12 г. Для Qp = 0.1 г и qiпр = 10-12 г; Pxпр/ Pxр  10-11.

Такому значению, соответствует случай, как показывают расчёты, когда растворителем является гексан, а примесью – н-алкан С23 с Ткип = 382С, проба раствора – 0.1 г и расходы органического раствора и инертного газа равны при этом 0.02 г/мин и 100 см3/мин, соответственно.

Рассмотрим на примере ряда н-алканов, для которых известны либо могут быть рассчитаны давления насыщенного пара при разных температурах, зависимость количества примеси, уносимого парогазовой смесью за время удаления растворителя, в процессе НИТХД вместе с растворителем (гексан), от Ткип примеси и её упругости пара (Pxпр). Примем величину пробы раствора, подаваемого на концентрирование, равной 0.1 г (около 100 мкл), Vопт = 100 см3/мин; время подачи пробы раствора  - около 5 мин; количество примеси в растворе qi = 10-9-10-12 г. Соответствующие данные приведены в таблице 7.

Таблица 7. Отношение испаряемого количества примеси к его количеству в растворе, qiпр/ qi  для ряда н-алканов, растворённых в гексане

Число атомом углерода в молекуле

Ткип, С

Давление насыщенного пара, (при комнатной температуре)

Px,мм.рт.ст

Ciпр/Cip = Pxпр/ P

Количество примеси, qiпр, испаряемое в процессе концен-

трирования, г

Отношение испаряемого количества примеси к его количеству в растворе, qiпр/ qi

qi=10-9 г

qi=10-10 г

qi=10-11 г

qi=10-12 г

С6

68.7

121

С13

235

2.110-2

1.7510-4

1.7510-5

1.75104

С16

287

3.4510-4

2.8510-6

2.8510-7

285

С18

317

1.9410-5

1.610-7

1.610-8

16

С19

331

4.0210-6

3.4710-8

3.4710-9

3.47

34.7

С20

345

7.910-7

6.5310-9

6.5310-10

6.5310-1

6.53

65.3

6.53102

С23

382

3.4910-9

2.8810-11

2.8810-12

2.8810-3

2.8810-2

2.8810-1

2.88

С25

405

5.410-11

4.4610-13

4.4610-14

4.4610-5

4.4610-4

4.4610-3

4.4610-2

С27

427

4.8410-13

4.010-15

4.010-16

4.010-7

4.010-6

4.010-5

4.010-4

Изучение зависимости количества примеси, уносимого парогазовой смесью за время удаления растворителя (гексан) в процессе НИТМХД вместе с растворителем от Ткип примеси и её упругости пара (Pxпр), проведенное нами для н-алканов, для которых известны либо могут быть рассчитаны Px, при разных температурах показало, что количественное выделение следов СЛОС из органического раствора при использовании только метода НИТМХД в случае qi=10-9 г возможно для веществ с Ткип345С, а в случае qi=10-11 - 10-12 г – для веществ с Ткип405С (проба раствора – 100 мг, Vопт=100 см3/мин, и время подачи раствора – около 5 мин).

При концентрировании высококипящих соединений, (которые могут быть проанализированы методом ГХ) содержащих в молекуле полярные -ОН, -NH2, -COOH, -SH и другие фукциональные группы с подвижными атомами водорода, для обеспечения количественной термодесорбции следовых количеств таких веществ внутренняя поверхность кварцевого капилляра дезактивируется (силанизируется). Кроме того, в случае следов как малолетучих, так и особенно нелетучих соединений, содержащих в молекуле такие функциональные группы, проводится их превращение (дериватизация) в менее полярные и более летучие и термостабильные соединения с использованием соответствующих реагентов и условий проведения реакций.

Существенное достоинство способа концентрирования, основанного только на НИТМХД – возможность выделения и переноса в аналитическую систему следовых (пг – нг) количеств заданных высококипящих СЛОС без использования сорбента.

В то же время, наряду с достоинством, этому способу присуще существенное ограничение при концентрировании следов СЛОС, кипящих в широком диапазоне температур, особенно когда состав примесей неизвестен.

В связи с этим предлагаемый метод включает концентрирование, основанное, как на НИТМХД, так и на ограничительной хромадистилляции и неэффективной хроматографии (НХ) в присутствии сорбента. Стадия ограничительной хромадистилляции появляется в случае присутствия сорбента, когда образующаяся на сорбенте в результате динамической конденсации насыщенных паров органического растворителя его жидкая фаза играет роль ограничителя и способствует дополнительному отделению аналитов от растворителя.

Для большинства изученных нами СЛОС различной летучести в качестве сорбента использовали СКВ (сверхтонкое кварцевое волокно). В этом случае, как было показано экспериментально, количественное извлечение и перенос термодесорбцией был возможен для веществ с Ткип250С. В ряде случаев, когда необходимо было выделение следов более летучих СЛОС в качестве сорбента использовали полимерный сорбент Tenax (в сочетании с СКВ). Сочетание НИТМХД, ОХД и НХ позволяет расширить диапазон концентрируемых СЛОС в сторону более легколетучих.

При осуществлении концентрирования в соответствии с предложенным методом, основанным на сочетании НИТМХД, ОХД и НХ, уравнение баланса для растворителя аналогично уравнению (2). Это связано с тем, что на выходе из слоя сорбента так же парогазовая смесь, сформированная в процессе НИТМХД из паров растворителя и инертного газа, но в этой смеси отсутствуют пары примесей, выделившиеся из неё благодаря ОХД и НХ.

В этом случае количество примеси, переведённое в пар (qiпр), равно этому же количеству, выделенному на сорбенте (qiпр.с); т.е.

qiпр = qiпр.с  (6)

Потери СЛОС, связанные с процессом испарения и уносом парогазовой смесью при НИТМХД, в этом случае отсутствуют. Сорбент позволяет, что особенно важно, расширить диапазон не только Ткип, но и следовых количеств СЛОС, выделяемых из органических растворов, в сторону пикограммовых количеств (что для многих СЛОС невозможно при их выделении только методом НИТМХД). В этом случае испаряемые количества следов аналитов выделяются на сорбенте в широком диапазоне количеств и не уносятся парогазовой смесью.

Важным этапом предложенного метода концентрирования следовых количеств СЛОС из органических растворов является их перевод термодесорбцией в аналитическую систему в потоке газа-носителя;

  • в случае хромато-масс-спектрометра и хроматографа с атомно-эмиссионным детектором – в инжектор хроматографа либо непосредственно в разделительную капиллярную колонку при оптимальной скорости газа-носителя через неё;
  • в случае элементного анализатора – потоком гелия, поступающим в поток кислорода (в этом случае скорость Не значительно больше чем в случае  десорбции в хроматограф);

Температура термодесорбции должна обеспечивать быстрый перевод аналитов, выделенных из органического раствора, в аналитическую систему при оптимальной скорости газа-носителя.

Главный критерий выбора условий выделения следов СЛОС предлагаемым методом из органического раствора – степень извлечения аналита из органического раствора и его переноса в аналитическую систему термодесорбцией в потоке газа-носителя.

Ri =Si2/Si1100  (7)

Где Ri – степень выделения i-того аналита из органического раствора и его переноса в аналитическую систему, Si1 и Si2, – площади пиков, зарегистрированные при прямом вводе пробы органического раствора объёмом 1 мкл в инжектор хроматографа и при переводе концентрата аналита из большой пробы этого раствора, содержащей то же количество аналита, что и в 1 мкл, соответсвенно.

При количественном выделении аналита из органического раствора и его переносе в аналитическую систему эти площади должны быть примерно равны между собой и Ri должна быть около 100%.

В данном исследовании применяли широкий круг модельных СЛОС различной полярности и летучести. В связи с этим было выдвинуто предположение о том, что разработанный метод анализа применим как для изученных, так и других СЛОС, которые могут быть обнаружены методом газовой хроматографии-масс-спектрометрии.

При извлечении заданных компонентов из органического раствора конкретные условия концентрирования (наличие либо отсутствие сорбента, его тип, его количество, объём пробы, скорости потоков раствора и инертного газа, условия перевода концентрата в аналитическую систему) выбираются исходя:

  • из Ткип растворителя и заданных аналитов (их упругостей пара при комнатной температуре);
  • предполагаемых концентраций аналитов в пробе и пределов их детектирования;
  • из обеспечения условий, исключающих появление жидкости на выходе из камеры концентрирования;
  • из условий, обеспечивающих удаление растворителя в процессе концентрирования и количественный перенос следов аналитов из пробы в аналитическую систему.

В случае смесей неизвестного качественного и количественного состава, о которых имеется лишь какая-либо предположительная информация, процесс концентрирования оптимизируется с использованием смесей модельных соединений, отличающихся по полярности и летучести, предполагаемых в пробе, содержание которых в пробе составляет  10-12 - 10-9 г/мкл.

При отсутствии какой-либо предварительной информации о составе выделяемых аналитов, концентрирование проводится и при НИТМХД, и при сочетании НИТМХД, ОХД и НХ.

При выделении примесей СЛОС из воды использовали жидкостную экстракцию (с высаливанием). Предпочтение отдавали, когда это возможно, микрожидкостной экстракции в связи с возможностью анализа всего объёма микроэкстракта с применением предлагаемого метода анализа без предварительного упаривания, которое может приводить к искажению состава пробы.

При выделении следов аналитов из твёрдой матрицы, в частности из фармпрепаратов, использовали, когда это было возможно, растворитель, минимально растворяющий основной компонент – с целью увеличения селективности выделения примесей аналитов, увеличения числа регистрируемых примесей и снижения их пределов обнаружения.

Все эти условия определялись летучестью и полярностью аналитов, составом анализируемой смеси, и количествами аналитов. Во многих случаях компоненты смеси были неизвестны.

Достоинства разработанного метода концентрирования следов СЛОС из больших проб органических растворов вне аналитической системы:

- метод позволяет проводить концентрирование органических растворов среднелетучих органических соединений, кипящих в широком диапазоне температур и отличающихся по полярности и летучести, и переводить весь концентрат в аналитическую систему термодесорбцией в потоке газа-носителя;

- в результате концентрирования выделяется смесь аналитов, практически свободная от растворителя, благодаря чему обеспечиваются условия определения, позволяющие достичь минимальных пределов обнаружения по концентрации;

- минимизируется загрязнение разделительной колонки и инжектора малолетучими или нелетучими примесями за счёт их удерживания в камере концентрирования;

- метод может быть использован для анализа всего концентрата аналитов не только методом ГХ/МС, но и другими (например, методами определения состава элементов);

- метод может быть использован для анализа всего концентрата методом ВЭТСХ (для термостабильных и летучих СЛОС), благодаря чему предел обнаружения метода по концентрации может быть уменьшен на 2-3 порядка и исключено мешающее влияние растворителя;

- метод может быть использован для быстрого скрининга проб вод (но не сточных) на содержание заданных соединений при проведении микрожидкостной экстракции и ГХ/МС анализе всего концентрата аналитов;

- метод позволяет зарегистрировать большее число известных и неизвестных примесей в объектах исследования благодаря анализу всего концентрата из соответствующего экстракта и снизить предел обнаружения по концентрации на 2-3 порядка, по сравнению с существующими способами;

- метод позволяет снизить пределы обнаружения при использовании масс-спектрометров с ионной ловушкой за счёт ионизации только аналитов (в отсутствие паров растворителя) и уменьшить искажение масс-спектров, свойственное этому анализатору (по сравнению с квадрупольным анализатором).

Для реализации разработанного метода концентрирования органических растворов различных СЛОС были разработаны и использованы следующие способы выделения аналитов из органических растворов и перевода всего концентрата в аналитическую систему и соответствующие устройства:

- концентрирование аналитов из органического раствора в кварцевой трубке (лайнере) с сорбентом вне аналитической системы сорбцией из потока сформированной парогазовой смеси с последующим его переносом в инжектор хроматографа;

- концентрирование аналитов вне аналитической системы из потока сформированной парогазовой смеси в кварцевой трубке с сорбентом, помещённом в специальный металлический картридж (либо в окварцованном картридже с сорбентом), перевод концентрата аналитов из которого осуществляется в потоке газа-носителя после его подсоединения иглой к инжектору хроматографа либо непосредственно к разделительной колонке.

С использованием разработанного метода концентрирования органических растворов следов СЛОС разработан ряд новых способов концентрирования следов малолетучих и нелетучих органических соединений и их анализа, позволивших решить ряд актуальных задач по обнаружению следов заданных и неизвестных соединений в различных матрицах, рассмотренных ниже.

Эти способы отличались условиями выделения аналитов, применяемым сорбентом, его количеством (либо сорбцией на внутренней поверхности кварцевой трубки), условиями перевода в аналитическую систему термодесорбцией в потоке газа-носителя и условиями соответствующего метода анализа.

2. Разработка подходов к обнаружению следовых концентраций ряда малолетучих и нелетучих органических соединений в органических и водных растворах и биосредах методом ГХ/МС

2.1. Обнаружение следовых концентраций различных органических и аминокислот, сахаров и спиртов в водных растворах методом ГХ/МС

При исследовании состава смесей соединений, образующихся в процессе роста бактерий требуется установление состава таких соединений, как жирные, дикарбоновые, оксо- и аминокислоты, сахара, стеролы на следовом уровне. Установление состава смесей ряда из рассмотренных соединений на уровне следов (в частности, аминокислот) требуется и при изучении жизнедеятельности клеток.

К началу настоящего исследования работы по установлению состава смесей  рассмотренных соединений при их совместном присутствии на уровне 10-12 - 10-9 г в анализируемой пробе не были известны.

Изучены условия получения силильных производных для следовых количеств около 60-ти малолетучих и нелетучих различных жирных, дикарбоновых, гидрокси-, оксо- и аминокислот, сахаров, спиртов и стиролов в органических растворах при использовании различных силлилирующих реагентов (БСТФА, МТБСТФА) и растворителей. Выбраны оптимальные условия дериватизации рассмотренных соединений при их совместном присутствии в смеси, выявлены возможности и ограничения.

Показано, что только при использовании МТБСТФА возможно получение  стабильных во времени летучих производных всех изученных (17) аминокислот.

Изучены условия дериватизации следов жирных, дикарбоновых и аминокислот в водно-органических растворах с использованием изобутил-хлорформиата (ИБХФ) в смеси с изобутанолом либо гептафторбутанолом (ГФБ) и выбраны оптимальные  условия дериватизации и жидкостной экстракции полученных производных.

Изучены масс-спектры электронной и химической ионизации для следовых количеств всех полученных производных определяемых соединений; определены пределы детектирования в режиме регистрации суммарного ионного тока и селективного ионного детектирования, которые составили 10-12 - 10-9 г (в зависимости от соединения, способа ионизации и регистрации ионов).

Предложен новый подход к определению следовых содержаний жирных, дикарбоновых, гидрокси-, оксо- и аминокислот, сахаров, спиртов и стиролов при их одновременном присутствии в водном растворе. Он основан на получении для одной части исследуемого образца ТМС-производных после взаимодействия со смесью БСТФА с пиридином (после высушивания водной пробы), а для другой –ИБОК-ГФБ-эфиров всех аминокислот (кроме аргинина), и ГФБ-эфиров и диГФБ-эфиров для всех жирных и дикарбоновых кислот в водно-органическом растворе после дериватизации смесью ИБХФ и ГФБ. Растворы полученных производных анализировали методом ГХ/МС.

С использованием разработанных условий дериватизации изучен состав жирных, дикарбоновых и аминокислот в культурах клеток аденокарциномы прямой кишки человека и фибробластов. Показано, что содержание большинства аминокислот в клетках фибробластов превышало более чем в 10 раз их содержание в онкоклетках.

Данные определения состава аминокислот в клетках аденокарциномы и фибробластов приведены в Таблице 8.

Таблица 8. Результаты анализа лиофилизатов клеток аденокарциномы и фибробластов (sr ≤ 0.20) на содержание аминокислот

Аминокислота

Оценка содержания, %

К

Клетки аденокарциномы ac +

Клетки фибробластов

fb +

Аланин, ИБОК-ГФБ

3.2×10-3

1.6×10-2

5.0

Глицин, ИБОК-ГФБ

7.6×10-3

4.8×10-3

0.7

Валин, ИБОК-ГФБ

7.2×10-4

1.2×10-2

16.9

Лейцин, ИБОК-ГФБ

1.2×10-3

2.7×10-2

23.2

Изолейцин, ИБОК-ГФБ

4.6×10-4

1.5×10-2

31.9

Пролин, ИБОК-ГФБ

5.2×10-3

1.7×10-2

3.3

Аспарагин, ИБОК-ГФБ

3.2×10-4

4.0×10-3

12.7

Метионин, ИБОК-ГФБ

3.4×10-4

1.1×10-2

31.8

Треонин, 2ИБОК-ГФБ

1.3×10-3

1.3×10-2

10.3

Фенилаланин, ИБОК-ГФБ

7.5×10-4

2.1×10-2

27.9

Серин, 2ИБОК-ГФБ

1.8×10-3

1.3×10-2

7.5

Лизин, 2ИБОК-ГФБ

1.3×10-3

1.5×10-2

11.8

Гистидин, 2ИБОК-ГФБ

1.6×10-4

4.2×10-3

25.4

Триптофан, ИБОК-ГФБ

1.7×10-4

6.5×10-3

38.1

Тирозин, 2ИБОК-ГФБ

8.2×10-4

2.1×10-2

25.7

Цистин, 2ИБОК-2ГФБ

9.7×10-5

1.2×10-3

12.8

* В таблице приведены данные для ИБОК-ГФБ производных соответствующих аминокислот.

Предложен способ обнаружения следовых концентраций аминокислот в водных растворах, основанный на их дериватизации изобутилхлорформиатом в смеси с гептафторбутанолом, жидкостной экстракции производных, концентрировании полученных растворов в процессе НМХД и ГХ/МС анализе всего концентрата аналитов. Способ позволяет снизить предел обнаружения не менее чем на 2 порядка.

Степени переноса аналитов из органического раствора в систему ГХ/МС составляли для проб растворов объёмом 1 и 100 мкл от 80 до 105 %, в зависимости от соединения. Концентрации вещества в пробе составляли n10-10 г/мкл и n10-12 г/мкл, соответственно.

2.2. Развитие направления исследований по обнаружению следов ряда физиологически активных соединений в водных растворах и биосредах методом ГХ/МС

2.2.1. Обнаружение следовых концентраций ряда нуклеозидов и сахаров в виде их производных в органических растворах

Определение указанных веществ в водных матрицах методом ГХ/МС предполагает селективное их выделение с помощью аффинной хроматографии, ВЭЖХ очистки и фракционирования, твёрдофазной экстракции на обращённой фазе, высушивание (лиофилизирование) выбранной очищенной фракции, её дериватизация (в случае ГХ/МС) и анализ аликвоты реакционной смеси. В данном исследовании акцент делали на стадиях дериватизации и анализа полученных производных.

Обнаружение сахаров на низком уровне (10-9 г в пробе и ниже) необходимо для определения из содержания в клеточных структурах. Особый интерес представляет определение 2-деокси-2-фтор-d-глюкозы как потенциального маркера онкологических заболеваний. Актуальным является определение на следовом уровне и ряда модифицированных нуклеозидов, которые, так же как и сахара, могут отражать особенности биологических процессов (в том числе и патологических) в живых организмах. Стандартный подход (в том случае, когда применяется метод ГХ/МС) основан на получении летучих производных этих соединений и ГХ/МС анализе полученной реакционной смеси. В этом случае объём анализируемой пробы реакционной смеси составляет около 1 мкл, в связи с чем, предел обнаружения составляет не ниже 10-5%. Прямой анализ реакционной смеси приводит к ухудшению разделительной способности капиллярной колонки, искажению состава масс-спектра электронной ионизации полученных производных и снижению чувствительности масс-спектрометра. Метод ГХ/МС применяют по причине его высокой селективности и чувствительности, а так же уникальной, на сегодняшний день, воспроизводимости масс-спектров электронной ионизации.

В результате проведенных исследований предложен новый подход к обнаружению следовых количеств ТМС производных ряда нелетучих органических соединений в органических растворах. Моносахариды (D-фруктозы, D-галактозы, 1-октил--D-глюкопиранозида) дериватизировали с помощью БСТФА в присутствии пиридина в ультразвуковом поле. После завершения реакции дериватизации удаляли реагенты из реакционной смеси с заменой на летучий инертный растворитель (МТБЭ). Полученные растворы анализировали методом ГХ/МС. Показано, что в выбранных условиях органические растворы ТМС-производных моносахаридов (в метилтретбутиловом эфире) с содержанием (n10-10 г/мкл - n10-8 г/мкл) стабильны при хранении. Изучены условия дериватизации ряда нуклеозидов (уридин, 5-метилуридин (тимиди), 2-деоксиуридин) и 2-деокси-2-фтор-d-глюкозы при использовании БСТФА и пиридином и последующей замены избытка реагента на инертный растворитель (МТБЭ). Показано, что производные аналитов стабильны в полученном растворе в течении как минимум одной недели при содержании (n10-10 г/мкл - n10-8 г/мкл).

Концентрируя полученные растворы в процессе НМХД с последующим анализом всего концентрата, свободного от растворителя снижали предел обнаружения более чем в 100 раз. Существенным достоинством предложенного подхода наряду со снижением пределов обнаружения силильных производных нелетучих веществ является стабильность характеристик разделительной колонки и чувствительности масс-спектрометра во времени благодаря исключению возможности попадания реагента в колонку. Подход к анализу нелетучих органических веществ методом ГХ/МС, основанный на дериватизации, замене реагента на легколетучий и инертный растворитель и анализе всей пробы (до 500 мкл) полученного раствора ранее, по нашим данным, в литературе не встречался.

2.2.2. Разработка способа определения следовых концентраций ряда стероидов в водных растворах и моче, расширяющего возможности антидопингового контроля

Существующий подход – выделение стероидов из мочи, их триметилсилирование с помощью МСТФА, ГХ/МС анализ 1/500 части объёма реакционной смеси в режиме селективной регистрации трёх ионов (СИД). Помимо повышения предела обнаружения в связи с анализом малой части смеси наблюдается загрязнение разделительной колонки и источника ионов реагентом и изменение их характеристик во времени.

Актуальным являлось: снижение пределов обнаружения стероидов, минимизация возможности загрязнения прибора и ухудшения его характеристик во времени, увеличение достоверности обнаружения стероидов на уровне следов благодаря увеличению объёма анализируемой пробы и обеспечению возможности регистрации полных масс-спектров.  Кроме того, актуальным являлось увеличение числа регистрируемых стероидов и подобных им по структуре соединений (для более достоверного установления паспорта спортсмена, для увеличения достоверности обнаружения новых дизайнерских стероидов, не входящих в обязательный перечень определяемых веществ).

В результате проведенных исследований предложенный подход к обнаружению следовых количеств ТМС производных нелетучих органических соединений был применён для обнаружения стероидов и выбраны условия обнаружения их следов в водных растворах и моче. Стероиды дериватизировали с использованием БСТФА в смеси с пиридином, заменяли реагент на легколетучий инертный растворитель (МТБЭ), концентрировали полученные растворы в режиме НМХД и анализировали весь свободный от растворителя концентрат методом ГХ/МС в режиме полного ионного тока. Объём пробы органического раствора в случае анализа водного раствора составлял 100 мкл, а в случае мочи – 10 мкл. Было показано, что ТМС-производные ряда изученных стероидов были стабильны в растворе МТБЭ не менее двух недель.

Пределы обнаружения при пробе раствора, равной 100 мкл, составили от 510-13 г/мкл до 210-12 г/мкл, в зависимости от соединения, т.е. были более чем на 2 порядка ниже, чем при пробе, равной 1 мкл.

В результате проведенного исследования разработан способ высокочувствительного определения стероидов в водных растворах, основанный на получении растворов триметилсильных производных стероидов в лёгколетучем инертном растворителе, на концентрировании этих растворов и анализе всего концентрата методом капиллярной газовой хроматографии-времяпролётной масс-спектрометрии (ВПМС).

Применение ГХ/МС с времяпролётным масс-анализатором с большой скоростью сканирования масс-спектров обеспечило возможность регистрации полного масс-спектра для следовых количеств каждого компонента смеси.

Применение предложенного способа к анализу мочи (объём пробы органического раствора в МТБЭ – 10 мкл) позволил зарегистрировать в 2 раза больше соединений стероидной структуры, чем при пробе того же раствора, равной 1 мкл (40 соединений вместо 20).

Этот способ может быть использован для проведения рутинных анализов (пробоподготовка осуществляется вне прибора) и обнаружения новых ранее неизвестных допинговых соединений стероидной структуры (так называемых дизайнерских стероидов) в связи с регистрацией полных масс-спектров  (а не 3-х характеристичных ионов). Предложенный способ может быть использован для более достоверного подтверждения результатов допингового контроля, полученных на предварительной стадии (скрининга) с использованием стандартного метода, благодаря возможности регистрации полных масс-спектров для следовых количеств аналитов в пробе и обнаружению их на более низком уровне, чем требует ВАДА (Всемирное антидопинговое агентство). Он существенно расширяет возможности антидопингового контроля.

2.2.3. Исследование возможности определения ряда фармацевтических субстанций методом реакционной ГХ/МС

К физиологически активным веществам относятся и фармацевтические субстанции.

Целевое и побочное их действие на организм человека ограничивается не только действующим веществом, но и примесями, содержащимися в субстанциях.

Общепринятый подход к определению примесей в фармацевтических препаратах основан на растворении навески образца в растворителе (или экстракции из навески) и анализе полученного раствора (экстракта) методом ВЭЖХ (УФ) либо ВЭЖХ/МС (МС). Этот подход имеет широкое применение как в методиках, внесённых в фармакопеи разных стран, так и в исследовательских работах,  т.к. большинство фармацевтических субстанций часто является нелетучими соединениями. Метод ГХ/МС с электронной и химической ионизацией обычно применяется для определения остатков органических растворителей в образцах фармпрепаратов. Нами проведено исследование возможности определения ряда фармацевтических субстанций и соответствующих экстрактов из фармпрепаратов и показано, что целый ряд фармацевтических субстанций, обычно анализируемых методом ВЭЖХ, может быть напрямую проанализирован методом ГХ/МС. Этот метод превосходит метод ВЭЖХ по эффективности разделения, информативности (благодаря сочетанию с масс-спектрометрией электронной ионизации) и чувствительности. Представляло интерес также изучение возможности анализа ряда нелетучих фармацевтических субстанций, содержащих в молекулах различные функциональные группы, методом ГХ/МС.

Изучение условий дериватизации низкомолекулярных фармацевтических веществ и примесей в них для использования преимуществ метода ГХ/МС (высокая эффективность разделения, самый воспроизводимый на сегодняшний день масс-спектр (электронной ионизации), определение молекулярной массы, низкий предел обнаружения) представляет несомненный научный и практический интерес.

Исследовали возможность получения производных ряда фармацевтических субстанций, отличающихся по структуре и содержащих различные функциональные группы, в качестве модельных соединений (метоклопрамид, сотолол, каптоприл, гидрохлортиазол, налидиксовую кислоту и ставудин). Функциональные группы, по которым могли пройти реакции дериватизации в этих веществах следующие: гидроксо-группа, карбоксильная группа, кето-группа и амино-группа. Дериватизацию изучали с использованием пяти известных дериватизирующих агентов (БСТФА, МТБСТФА, BzTMAH, ИБХФ, ПФББ) с целью изучения реакций силлирования, ацилирования и алкилирования. Продукты реакции анализировали методом ГХ/МС. Изучены соответствующие масс-спектры и выбраны характеристичные ионы, отражающие особенности структуры производных и используемые при регистрации масс-хроматограмм следовых количеств этих веществ.

В результате исследования показано, что ни один из изученных дериватизирующих агентов не является универсальным при определении данных веществ (а, следовательно, подобных неизвестных веществ – примесей) и в общем случае для увеличения вероятности регистрации максимального числа термостабильных неизвестных примесей в лекарственных средствах методом реакционной ГХ/МС целесообразно использование различных реагентов.

Показана возможность высокоселективной дериватизации малолетучих и нелетучих веществ, молекулы которых содержат карбоксильную группу, при использовании в качестве реагента изобутилхлорформиата (ИБХФ) и проведении реакции в водной среде (с последующей экстракцией и анализом экстракта методом ГХ/МС). Наиболее эффективными оказались БСТФА и МТБСТФА – при использовании каждого из них производные были получены для четырёх из шести изученных фармацевтических субстанций.

На основании результатов проведенного исследования предложен новый подход к сравнению качества фармацевтических препаратов (субстанций), основанный на сопоставлении многомерных профилей неизвестных примесей, зарегистрированных при прямом ГХ/МС (ЭИ, ХИ) анализе соответствующих экстрактов и при анализе реакционной смеси (регистрация производных примесей).

Этот подход был использован при сопоставлении качества ряда оригинальных фармпрепаратов и соответствующих дженериков.

В таблице 9 приведены в качестве примера результаты, полученные при сопоставлении оригинального фармпрепарата и двух дженериков. Наибольшее число примесей при прямом анализе было зарегистрировано в случае использования МТБЭ как экстрагента.

Таблица 9. Число примесей, зарегистрированных в образцах оригинального фармпрепарата и двух его дженериков при анализе экстракта из этих препаратов и реакционной смеси методом ГХ/МС. Объём пробы – 1 мкл

Образец

Число зарегистрированных среднелетучих примесей

Анализ МТБЭ экстракта

Анализ реакционной смеси

Оригинал фармпрепарата

11

28

Дженерик 1

16

35

Дженерик 2

11

15

По общему числу зарегистрированных примесей исследованные образцы фармпрепаратов можно расположить в следующий ряд: дженерик 2 < оригинал < дженерик 1.

Проведение такого сопоставления важно не только для сравнения качества фармсубстанций и фармпрепаратов, но и для выявления факта заимствования технологии получения субстанций.

Таким образом, в результате проведенных исследований развито направление высокочувствительной  газовой хромато-масс-спектрометрии при обнаружении следов нелетучих (и соединений, летучие производные которых имеют более информативный аналитический сигнал) физиологически активных соединений в водных растворах и биосредах.

3. Минимизация зависимости сигналов атомно-эмиссионного детектора (АЭД) по углероду и водороду от структуры молекул аналитов, снижение пределов обнаружения при использовании газовой хроматографии с атомно-эмиссионным детектором

3.1. Исследование зависимости сигналов АЭД по элементам от структуры молекул компонентов

Актуальной задачей является идентификация компонентов смесей на уровне следов, возможности которой существенно расширяются при совместном использовании данных АЭД по составу элементов в молекулах компонентов и их молекулярных массах, которые могут быть получены при использовании ГХ/МС.

Достоверность идентификации может быть существенно увеличена, если определены величины отношений чисел атомов углерода и водорода (nc/nh) в молекулах компонентов.

К началу наших исследований в литературе существовали противоречивые данные о возможности определения состава элементов и количественного состава компонентов смесей при использовании АЭД в общепринятых условиях его работы.

В результате проведенных нами исследований для большого числа C-, H-, N-, O-, F-, Cl-, Br-, P-, S- содержащих органических соединений показано, что в общепринятых условиях соответствующие сигналы АЭД по С и Н зависят от структуры и элементного состава аналитов.

Разработаны условия, позволяющие минимизировать эту зависимость, и предложен способ определения nc/nh (где nc  и  nh – числа атомов углерода и водорода в молекуле) с погрешностью, составляющей в среднем около 4% отн. (при использовании гелиевой плазмы, обогащённой кислородом). Такая возможность была показана для углеводородов и соединений, содержащих в молекуле такие элементы, как фтор, хлор, бром, фосфор, серу, азот и кислород.

Изучение зависимости соответствующих отношений чисел атомов углерода к числу атомов таких элементов, как Cl, Br, S, P, N в молекулах компонентов смесей от их структуры и элементного состава показало, что точное определение величин таких отношений при использовании ГХ/АЭД в общем случае невозможно ни в стандартных условиях, ни в предложенных нами.

Предложен способ определения элементного состава компонентов смесей углеводородов и их количественного содержания без градуировки по каждому компоненту смеси с использованием разработанных условий АЭ детектирования с гелиевой плазмой, обогащённой кислородом.

Таблица 10. Результаты определения процентного содержания углерода в молекулах компонентов смеси «неизвестных» углеводородов и их содержания без градуировки при использовании экспериментальных значений nC/nH и wC,% (n=3)

Соеди­не­ние

wC,%

Концентрация на компонент, г/мкл

истин­ное значение

расчетное значение

sr

, %

истин­ное значение

расчетное значение

sr

, %

C11H24

84.61

84.67

0.0005

0.1

3.32×10-8

3.23×10-8

0.002

-3

C12H26

84.72

стандарт

2.75×10-8

стандарт

C13H28

84.77

85.14

0.0007

0.4

1.03×10-7

9.89×10-8

0.005

-4

C14H30

84.86

85.27

0.0003

0.5

1.57×10-7

1.46×10-7

0.002

-7

C16H34

84.97

85.17

0.0007

0.2

9.40×10-8

9.04×10-8

0.005

-4

Расчёт процентного содержания углерода в молекуле, Wc, % проводили по формуле:

Wc, % = 12/ 12+( nc/nh)100%,

где nc/nh – отношение чисел атомов углерода и водорода в молекуле углеводорода, рассчитанное на основании экспериментальных данных, полученных для этих элементов с АЭД,

12 – атомная масса углерода.

Из формулы видно, что погрешность определения Wc, %, практически мало зависит от погрешности определения nc/nh;

Расчёт отношений nc/nh проводили по формуле:

nc/nh =  Scx/ShxShст/Scстnc,ст/nh,ст,

где nc,ст/nh,ст – отношение чисел атомов углерода и водорода в молекуле вещества стандарта,

Sc,x/Sh,x, Sh,cт/Sc,ст – отношение площадей пиков, зарегистрированных по каналам углерода и водорода для анализа и вещества-стандарта, соответственно.

Содержание углеводорода в смеси без градуировки (Cx) может быть рассчитано, как было нами показано, по формуле:

Cx = (Scx / Scст)Wcx,%/ Wcст,%Сcт,

где Сx и Сст – концентрации определяемого количества (х) и вещества-стандарта (ст), соответственно;

Wcx,%/ Wcст,% - процентное содержание углерода в молекуле аналита и вещества – стандарта, соответственно;

Scx и Scст – площади пиков аналитов и вещества-стандарта, соответственно, зарегистрированные по каналу углерода.

Погрешность определения процентного содержания углерода в молекулах компонентов смеси углеводородов составила около 0.3 % абс., т.е. соответствовала погрешности определения этого элемента в молекулах индивидуальных органических соединений, специфицируемой для элементных анализаторов.

В случае определения количественного состава компонентов смеси углеводородов без градуировки (соответственно, без стандартных образцов аналитов), погрешность составляла около 4 % отн., т.е. была не выше погрешности определения при проведении анализа с градуировкой. Применение предложенного способа особенно перспективно при анализе многокомпонентных смесей углеводородов, состав которых полностью неизвестен, когда градуировка практически неосуществима в связи, как со сложностью смеси, и отсутствием большого числа стандартных образцов, так и неизвестностью качественного состава. Способ может быть использован и для анализа смесей без градуировки других соединений известного качественного состава, когда отсутствуют стандартные образцы аналитов.

Пределы детектирования по углероду и водороду в разработанных условиях АЭ детектирования составляют около 10-10 г и 10-11 г, соответственно.

3.2. Снижение пределов обнаружения метода ГХ/АЭД

Актуальным являлось снижение пределов обнаружения ГХ/АЭД по концентрации как для самостоятельного использования ГХ/АЭД, так и при идентификации компонентов смесей на уровне следов. Эта идентификация основана на совместном использовании данных, полученных с ГХ/АЭД по составу элементов и ГХ/МС (молекулярная масса, масс-спектр электронной ионизации), предел детектирования которого в режиме регистрации суммарного ионного тока при электронной ионизации несколько ниже, чем в случае АЭД по углероду, а в случае химической ионизации – примерно такой же.

В качестве модельных соединений были выбраны триэтилфосфат, дибутилбутилфосфонат и трибутилфосфат, которые являлись имитаторами таких ФОВ, как зарин, зоман и Vx, обнаружение и идентификация которых в различных средах является актуальной задачей.

Была исследована возможность концентрирования органических растворов этих соединений (сорбент – сверхтонкое кварцевое волокно, объём пробы – 500 мкл) с использованием метода концентрирования органических растворов в процессе НМХД и анализа всего концентрата после его перевода термодесорбцией в ГХ/АЭД.

Аналогичное исследование для смеси таких же модельных соединений было проведено для снижения концентрационного предела обнаружения методом ГХ/МС.

Данные по степени переноса модельных среднелетучих соединений (имитаторов ФОВ (Ткип от 215 до 289С)) в ГХ/АЭД, полученные в результате концентрирования из проб органических растворов объёмом 1 мкл и 500 мкл (концентрации n10-8 г/мкл - n10-10 г/мкл, соответственно) приведены в  Таблице 11.

Таблица 11. Степени переноса n10-8 г ряда среднелетучих
органических соединений из разных по объему проб органических растворов
в ГХ-АЭД (n=3, sr  0.15)

Соединение

Степень переноса, %

1 мкл

500 мкл

триэтилфосфат

70

40

дибутилбутилфосфонат

95

100

трибутилфосфат

105

110

Таким образом, нами был предложен способ определения среднелетучих органических соединений (имитаторов ФОВ), основанный на сорбционном концентрировании с удалением растворителя вне аналитического прибора и анализе всего концентрата методом ГХ/АЭД. Способ позволяет снизить пределы обнаружения ГХ/АЭД более, чем на 2 порядка. Он позволяет существенно расширить возможности ГХ/АЭД при идентификации и определении следов компонентов СЛОС.

Возможность снижения концентрационного предела обнаружения методов ГХ/МС и ГХ/АЭД показана также при анализе растворов ряда малолетучих фармацевтических субстанций. Данное исследование проводилось с целью расширения возможностей применения этих методов для регистрации и идентификации следов термостабильных примесей в фармацевтических препаратах. Использование преимуществ данных методов для определения термостабильных и малолетучих веществ вместе с чаще используемыми методами (ВЭЖХ/УФ и, реже, ВЭЖХ/МС) необходимо для более полного сравнения качества фампрепаратов, содержащих одно и то же активное вещество, выявления фальсификатов, фактов заимствования технологий получения субстанций, обнаружения примесей, которые даже в следовых количествах отвечают за побочное действие лекарств.

В качестве модельных соединений использовали термостабильные и малолетучие фармсубстанции ряда фармпрепаратов, содержащие гетероэлементы. Анализировали растворы метронидазола, каптоприла, ифосфамида, пентоксифилина, метаклопромида, феназепама, рофекоксиба и холоксана.

Разработанный метод концентрирования органических растворов СЛОС в процессе НМХД позволил и для этих полярных малолетучих веществ понизить концентрационный предел обнаружения более чем на 2 порядка (при объёме пробы – 500 мкл). При этом количественный перенос концентрата аналитов удалось обеспечить только при присоединении термодесорбера, (в котором находилась камера концентрирования - кварцевая трубка) непосредственно к аналитической колонке, минуя инжектор.

При вводе пробы раствора смеси модельных фармацевтических препаратов  посредством термодесорбера непосредственно в колонку, наблюдались минимальные потери определяемых веществ. По-видимому, в инжекторе хроматографа происходила сорбция следов определяемых веществ, и в следствии этого, дискриминация состава пробы.

В результате исследования был предложен подход к обнаружению следов термостабильных фармацевтических веществ различной полярности и летучести, основанный на концентрировании содержащих их органических растворов в процессе НМХД и анализе всего концентрата методами ГХ/МС и ГХ/АЭД. Подход к регистрации следов модельных веществ этими двумя методами был распространён на сравнение оригинальных препаратов и дженериков по составу термостабильных примесей. Он вошёл в состав методологии контроля качества фармпрепаратов, являющейся основой соглашения о сотрудничестве химического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова и Росздравнадзора.

3.3. Новый подход к идентификации компонентов смесей среднелетучих органических соединений на уровне следов, основанный на концентрировании больших проб органических растворов (экстрактов) в процессе НМХД и анализе всего концентрата методами ГХ-АЭД и ГХ/МС (ХИ, ЭИ)

В настоящее время идентификация компонентов смесей проводится в подавляющем большинстве случаев по экспериментальным масс-спектрам ЭИ с использованием электронной базы данных масс-спектров NIST; проба составляет 0.001-0.01 части органического экстракта.

Примерно для 26% изученных соединений, приведенных в базе данных NIST (2008) масс-спектры не содержат пика молекулярного иона – самого важного иона масс-спектра, либо его интенсивность очень мала (1%). Для 39% соединений, приведённых в базе данных, интенсивность пика в масс-спектрах 5%. Достоверность идентификации на основании масс-спектров ЭИ уменьшается для следовых количеств аналитов даже при использовании базы данных NIST. Состав масс-спектров, и следовательно, степень совпадения с библиотечным масс-спектром, зависит от масс-анализатора, температуры источника ионов, количества аналита, его концентрации в газе носителе, фона прибора. Процесс идентификации усложняется, если экспериментальный масс-спектр аналита отсутствует в базе масс-спектров NIST.

Достоверность идентификации возрастает, если известна молекулярная масса аналита и элементы, входящие в состав молекулы аналита.

Разработанный нами метод концентрирования СЛОС из органических растворов в процессе НМХД и разработанный способ определения nc/nh (где nc  и  nh – числа атомов углерода и водорода в молекуле) методом ГХ/АЭД при использовании гелиевой плазмы, обогащённой кислородом, позволили предложить новый подход к идентификации компонентов сложных смесей СЛОС (или летучих производных нелетучих органических веществ) на уровне следов, который включает:

  • анализ всего концентрата методом ГХ/МС (ХИ) и определение молекулярных масс компонентов;
  • анализ всего концентрата методом ГХ/МС (ЭИ) и регистрацию масс-спектров ЭИ;
  • анализ всего концентрата методом ГХ/АЭД и регистрацию всех элементов (C, H, N, O, F, Cl, Br, J, P, S), которые могут входить в состав определяемых веществ;
  • анализ всего концентрата методом ГХ/АЭД при использовании гелиевой плазмы обогащённой кислородом, и определение соотношения nc/nh для интересующих компонентов анализируемых смесей органических веществ.

Отличие предлагаемого подхода – возможность снижения пределов обнаружения при определении молекулярной массы компонентов, регистрации воспроизводимого масс-спектра электронной ионизации и регистрации элементов, присутствующих в их молекулах, более чем на 2 порядка по сравнению с известными подходами.

Регистрация масс-хроматограмм, отвечающих молекулярным либо квазимолекулярным ионам, позволяет получить достоверную информацию о молекулярных массах компонентов, их числе в смеси, решить задачу обнаружения коэлюируемых пиков на хроматограмме, увеличить достоверность идентификации при использовании масс-спектров электронной ионизации. Обнаружение коэлюируемых пиков позволяет оптимизировать условия разделения компонентов смеси, увеличить достоверность установления состава сложных смесей, определения отношения nc/nh для интересующих компонентов анализируемых смесей.

Определение молекулярной массы позволяет провести первичную выборку брутто-формул при содержании аналитов на уровне следов.

Регистрация всех элементов, входящих в состав молекул этих аналитов, позволяет на том же уровне содержаний, что и при определении молекулярных масс, провести существенное сокращение первой выборки вероятных брутто-формул.

Определение отношений nc/nh и значения nc позволяет дополнительно минимизировать число вероятных брутто-формул (однако, для количеств, больших на порядок, чем при регистрации элементов).

Регистрация масс-спектров ЭИ компонентов позволяет на том же уровне содержаний аналитов, что и при определении молекулярных масс, регистрации элементов, входящих в молекулу, и определении величин nc/nh, уточнить строение выбранных соединений. Информация о молекулярной массе и составе элементов в молекуле обеспечивает увеличение достоверности идентификации компонентов смесей на уровне следов и при библиотечном поиске, если масс-спектр аналита есть  в библиотеке. При его отсутствии в библиотеке полученная во всей совокупности информация позволит в ряде случаев провести идентификацию компонентов на следовом уровне при наличии баз данных только по брутто-формулам и молекулярным массам. Использование молекулярных масс (молекулярных, протонированных или депротонированных ионов) для идентификации компонентов в таких случаях может быть иногда более продуктивным чем масс-спектров ЭИ, в которых пик молекулярного иона отсутствует либо малоинтенсивен, т.к. предел обнаружения определяется фактически одним, но самым информативным ионом масс-спектра (интенсивность соответствующего иона в масс-спектре ХИ максимальна).

4.0. Разработка способа быстрого скрининга проб органических и водных растворов на суммарное содержание галоид-, фосфор-, сераорганических соединений на уровне следов в пересчёте на элемент (обобщённый показатель)

В соответствии со стандартными методами эколого-аналитического контроля только небольшая часть соединений, для которых были установлены ПДК, подлежит определению. В случае анализа вод эта часть составляет около 10% даже при использовании методов ЕРА. Общепринятая методология эколого-аналитического контроля (для СЛОС) в большинстве случаев основана на требующей больших затрат времени пробоподготовке с использованием жидкостной экстракции и покомпонентном ГХ/МС анализе малой (0.001-0.01) части конечного объёма экстракта. Такой подход не обеспечивает контроля за всеми опасными токсикантами, малопроизводителен и экономически малоэффективен. Большинство опасных органических соединений – известных и неизвестных – к которым относятся Hal-, P-, S-органические соединения, не подлежит контролю. Поэтому эколого-аналитический контроль сегодня позволяет решать только малую часть проблем, которые должны решаться для защиты окружающей среды, но не могут быть решены при использовании существующего подхода к такому контролю.

Новые возможности в эколого-аналитическом контроле открываются, если проводить определение суммарного содержания Hal-, P-, S-органических соединений на уровне следов в водных и органических растворах. В этом случае возможно получение информации о большинсте (заданных и незаданных) опасных СЛОС.

В результате проведенного исследования разработан способ одновременного определения суммарного содержания Hal-, P-, S-содержащих СЛОС в пересчёте на элемент в органических растворах на уровне 510-9 – 2.510-8 % по элементу (объём пробы раствора 500 мкл).

Способ основан на предложенном методе концентрирования органических растворов СЛОС в процессе НМХД, переводе всего концентрата аналитов в реактор термодесорбцией в потоке гелия, их высокотемпературной окислительной конверсии, абсорбции продуктов конверсии из потока кислорода и анализа всего абсорбата методом ионной хроматографии на содержание фторида, хлорида, бромида, фосфата и сульфата, которые соответствуют определяемым элементам. Метод определения суммарного содержания Hal-, P-, S-органических соединений в органических растворах на уровне 10-4 – 10-3 % разработан в нашей лаборатории ранее.

Разработан также способ определения суммарного содержания F-, Cl-, Br-, P-, S- содержащих СЛОС в воде, основанный на высаливании, жидкостной экстракции, концентрирования экстрактов и определении аналитов в концентрате с использованием предложенного метода определения суммарного содержания таких соединений в органических растворах. При объёме пробы воды, равном 10 мл, предел обнаружения способа составляет 110-10 – 510-10 % по элементу (в зависимости от элемента). При использовании разработанного способа было проведено определение суммарного содержания рассматриваемых соединений в образцах различных вод. Полученные данные приведены в Таблице 12.

Таблица 12. Результаты определения суммарного содержания F-, Cl-, Br-, P-, S- содержащих СЛОС в образцах различных вод.

Наименование образца

Суммарное содержание определяемого элемента, %

F

Cl

Br

P

S

Деионизованная вода

<1.110-10

0.810-6

<4.910-10

<5.110-10

1.310-6

Водопроводная вода (Хим. фак. МГУ)

6.910-8

2.410-6

6.110-8

<5.110-10

4.910-6

Водопроводная вода (г. Подольск)

9.210-8

1.810-6

2.510-8

<5.110-10

4.110-6

Питьевая вода «Bonaqua»

6.710-8

1.210-6

3.110-8

<5.110-10

2.210-6

Питьевая вода «Святой источник»

5.110-8

1.610-6

0.510-8

<5.110-10

2.710-6

Время одного определения вместе с концентрированием в случае вод не превышает 30 мин.

Изучение распределения органических соединений, нормируемых по ПДК в воде показало, что для около 96% этих соединений ПДК составляли от 10-4 до 10-6%, для около 3% - от 10-6 до 10-8% и для менее чем 1% - менее 10-9%.

Для надёжного и экономически высокоэффективного эколого-аналитического контроля вод мы предлагаем новую методологию. Она основана на случайном выборе проб из большой выборки отобранных образцов, быстром скрининге этих проб на суммарное содержание Hal-, P-  и S-содержащих органических соединений. Скрининг осуществляется на уровне 10-10 – 10-9 % для бром-, фтор- и фосфор- содержащих органических веществ и на уровне выше – 10-6 % для хлор и  серу содержащих органических веществ (в воде, т.к. в этой матрице уровень фонового сигнала по этим элементам находится на уровне 10-6 %). Если фоновый уровень по хлору и сере позволяет (особо чистая вода, экстракты из матриц, в которых фоновый уровень по хлору и сере низкий) то скрининг по этим элементам может быть осуществлён на уровне 10-10 – 10-9 %.

5. Разработка подхода к определению состава неизвестных среднелетучих органических соединений на уровне следов в конденсате выдыхаемого воздуха человека и увеличения  достоверности диагностики астмы и ХОБЛ. Разработка способа регистрации неизвестных среднелетучих примесей в образцах фармацевтических препаратов после растворения последних в растворителях мало их растворяющих.

К началу наших исследований применяемые в медицине методы диагностики таких лёгочных заболеваний, как хроническое обструктивное заболевание лёгких (ХОБЛ) и астма не обеспечивали высокой степени достоверности дифференциации таких больных на ранних стадиях заболеваний, что приводило к неправильному лечению. Увеличение достоверности диагностики таких заболеваний является очень актуальным, особенно с учётом того, что число людей, ежегодно заболевающих этими болезнями, очень велико.

Подавляющее число работ по анализу выдыхаемого воздуха посвящено определению газообразных и легколетучих соединений, которые неадекватно отражают состав смеси выдыхаемых эндогенных соединений. Состав СЛОС в конденсате выдыхаемого воздуха (КВВ) был практически неизвестен, и их содержание оценивалось на уровне ниже 10-7%.

Целью работы являлось изучение состава неизвестных СЛОС на уровне следов в КВВ здоровых и больных ХОБЛ и астмой людей и изучение возможности увеличения достоверности диагностики эти заболеваний на основании полученных результатов исследования. Исследование проводили при использовании смесей модельных соединений (более 20) таких, как спирты, жирные кислоты, н-алканы, ароматические углеводороды, кетоны и альдегиды, отличающиеся по полярности и летучести, которые, согласно литературным данным, могли присутствовать в выдыхаемом воздухе. Были изучены масс-спектры ЭИ и ХИ модельных соединений, оптимизированы условия газо-хроматографического разделения и определения методом масс-спектрометрии.

В результате проведенного исследования концентрирования органических растворов ультраследовых количеств модельных СЛОС выбраны условия обнаружения таких соединений. Были выбраны условия концентрирования растворов в режиме НМХД и анализа всего концентрата аналитов методом ГХ/МС (ЭИ, ХИ). При концентрировании в качестве сорбента использовали Теnax и СКВ. Пределы обнаружения способа составили 10-8 - 10-6%, в зависимости от соединения.

Выбраны условия обнаружения СЛОС  различной полярности в водных растворах на следовом уровне. Условия включали высаливание, жидкостную экстракцию, концентрирование экстрактов в условиях НМХД и анализ всего концентрата аналитов методом ГХ/МС (ЭИ). Варьируя выбранные условия для обнаружения СЛОС в воде, оптимизировали условия их обнаружения в образцах конденсата выдыхаемого воздуха. При объёме пробы органического экстракта из КВВ, равной 100 мкл, пределы обнаружения составили 510-9 – 510-7 %, в зависимости от аналита.

С использованием оптимизированных условий анализа образцов КВВ изучен состав среднелетучих органических соединений в 70 таких образцах здоровых людей и больных ХОБЛ и астмой. Зарегистрировано более 100 соединений на уровне 10-8 – 10-7 % и ниже, из которых 33 были идентифицированы с использованием библиотеки масс-спектров NIST (часть из них совпали с модельными веществами, которые были взяты для разработки способа). Для 11 отсутствующих в библиотеке веществ (которые также были взяты для сравненения образцов здоровых и больных людей) были зарегистрированы масс-спектры ЭИ и времена удерживания. Молекулярные массы большинства из зарегистрированных соединений подтверждены с помощью метода ГХ/МС(ХИ). Ранее, согласно литературным данным, в образцах КВВ СЛОС не обнаруживали, объясняя это их низким содержанием.

Математическая обработка полученных нами данных проведена с использованием теории распознавания образов сотрудниками кафедры математической теории интеллектуальных систем механико-математического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова под руководством академика Кудрявцева В.Б. В результате математической обработки полученных данных, показана возможность различить с высокой надёжностью (достоверность более 80%) здоровых людей и больных ХОБЛ, здоровых и больных бронхиальной астмой, больных ХОБЛ и бронхиальной астмой между собой.

Выявлена группа веществ, которые могут рассматриваться как потенциальные биомаркеры астмы и ХОБЛ.

Для увеличения селективности выделения примесей из фармацевтических веществ нами предложен подход к обнаружению неизвестных среднелетучих примесей в фармацевтических субстанциях, основанный на их выделении из образца органическим растворителем, концентрировании полученных растворов, в условиях НМХД и ГХ/МС анализе всего концентрата. Выделение примесей осуществляется с помощью жидкостной экстракции растворителем, малорастворяющем действующее вещество, либо не растворяющим его совсем. Мы предположили, что примеси, концентрации которых много меньше концентрации основного компонента (на порядки), должны растворяться в таком растворителе.

При использовании предложенного подхода был изучен состав неизвестных примесей в образцах двух фармсубстанций – метранидазола и дротаверина. Исследование показало, что метронидазол не растворим в пентане, а дротаверин – в МТБЭ. В то же время МТБЭ хорошо растворял первый, а метанол – второй препарат. Объём экстрагента – 1мл. Проба анализируемого раствора в растворителе, хорошо растворяющем основной компонент субстанции, составляла 1 мкл (концентрация основного компонента – 10-6 г/мкл), плохо растворяющем – 500 мкл. В случае метронидазола в пентановом экстракте были зарегистрированы 4 примеси и соответствующие им масс-спектры ЭИ. В МТБЭ растворе не было зарегистрировано ни одной примеси.

В случае МТБЭ экстракта из дротаверина было обнаружено 13 примесей, а экстракта метанолом – 3 примеси.

Таким образом, использование растворителя, не растворяющего основной компонент субстанции, и применение разработанного метода концентрирования органических растворов в условиях НМХД позволяет селективно выделять примеси из образца субстанции и селективно их обнаруживать методом ГХ/МС, что расширяет возможности контроля качества лекарственных средств.

Заключение

В результате проведенных исследований развито новое направление в обнаружении известных и неизвестных СЛОС на уровне следов в различных матрицах – водах, биосредах, фармпрепаратах. Направление основано на использовании предложенного нового метода анализа объектов различного происхождения. Метод основан на выделении СЛОС из образца органическим растворителем, концентрировании полученных растворов в условиях НМХД, переводе всего концентрата в аналитический прибор термодесорбцией и анализе методами ГХ/МС и элементного анализа, включающего ГХ/АЭД и определение суммарного содержания СЛОС содержащих в молекуле F, Cl, Br, P и S.

Концентрирование органических растворов следов СЛОС внутри термостата газового хромато-масс-спектрометра и анализ всего концентрата методом ГХ/МС с химической ионизацией и регистрацией отрицательных ионов позволили на примере хлорированных токсикантов (ПХДД, ПХБ и ХОП) показать принципиальную возможность достижения ультранизких пределов обнаружения (10-13 – 10-12 %) органических соединений в водных и органических растворах.

Разработка и развитие метода концентрирования органических растворов в процессе НМХД и анализа всего концентрата аналитов применительно к решению конкретных задач установления состава смесей различных соединений позволило снизить пределы обнаружения таких методов, как ГХ/МС (ЭИ, ХИ), ГХ/АЭД и метод определения суммарного содержания Hal-, P-, S-органических соединений, более чем на 2 порядка по сравнению с существующими способами.

Показана возможность обнаружения методом ГХ/МС следов малолетучих и нелетучих органических соединений, таких как гидрокси, оксо-б дикарбоновые, жирные и амино-кислоты при их совместном присутствии в водных растворах и биосредах. Выбраны соответствующие условия дериватизации, экстракции, анализа.

Благодаря полученным результатам проведено исследование состава аминокислот в лиофилизатах раковых клеток прямой кишки и фибробластов и  выявлено значимое различие состава таких кислот, что позволило увеличит достоверность дифференциации раковых клеток и фибробластов.

Развито направление высокочувствительной ГХ/МС следов малолетучих и нелетучих физиологически активных органических соединений. Оно базируется на разработанном методе анализа, включающем дериватизацию обнаруживаемых соединений с использованием БСТФА в смеси с пиридином, замену, после дериватизации, избытка реагента на летучий инертный растворитель, концентрирование полученных растворов в условиях НМХД и анализ всего концентрата методом ГХ/МС. Такой подход позволяет не только снизить пределы обнаружения более чем на 2 порядка, но и существенно улучшить стабильность свойств колонки и чувствительности масс-спектрометра во времени. Он существенно расширил возможности антидопингового контроля как с точки зрения пределов обнаружения заданных стероидов (что очень актуально), так и увеличения числа регистрируемых соединений стероидной структуры, что важно для решения задач паспортизации спортсменов и обнаружения дизайнерских (новых, неизвестных) стероидов.

Наряду с разработкой способов обнаружения следовых содержаний заданных СЛОС и малолетучих и нелетучих органических соединений в водных и органических растворах (экстрактах) и биосредах в работе развито направление по обнаружению в этих средах числа и природы неизвестных среднелетучих и нелетучих органических соединений.

Разработан способ обнаружения состава неизвестных среднелетучих примесей различной полярности и летучести в конденсате выдыхаемого воздуха человека. Он основан на жидкостной экстракции, концентрировании экстрактов в условиях НМХД и ГХ/МС (ЭИ, ХИ) анализе всего концентрата аналитов.

Сопоставление состава примесей,  обнаруженных в конденсате выдыхаемого воздуха здоровых людей и больных ХОБЛ и бронхиальной астмой позволило с достоверностью более 80% дифференцировать эти группы людей. Достоверность диагностики в этом случае существенно выше общепринятой в медицине.

Сочетание предложенного метода концентрирования органических растворов СЛОС в условиях НМХД с методом определения суммарного содержания Hal-, P-  и S-органических соединений позволило разработать способ быстрого скрининга проб на суммарное содержание таких соединений на уровне следов. Предложена новая методология эколого-аналитического контроля, основанная на случайном выборе проб на анализ из большой выборки отобранных образцов и быстром скрининге анализируемых проб на суммарное содержание наиболее опасных Hal-, P- и S-содержащих токсикантов в пересчёте на элемент.  Методология открывает новые возможности в осуществлении надёжного высокоселективного, экономически эффективного и действенного эколого-аналитического контроля.

В отличие от общепринятого подхода к определению известных и неизвестных примесей в фармсубстанциях и фармпрепаратах, основанного на анализе малой части экстракта методом ВЭЖХ (УФ) и реже – ВЭЖХ (МС), изучена возможность анализа растворов целого ряда малолетучих фармсубстанций, отличающихся по структуре и составу функциональных групп, методом ГХ/МС. Показано, что метод ГХ/МС имеет целый ряд преимуществ при обнаружении таких веществ по сравнению с другими методами (селективность, чувствительность, воспроизводимость масс-спектров). Анализ всего экстракта не только позволил снизить пределы обнаружения, но и (при термодесорбции аналитов непосредственно в колонку, минуя инжектор) значительно уменьшить часто описываемую в литературе дискриминацию состава пробы таких веществ при вводе пробы растворов.

Кроме того, предложен новый способ селективного определения среднелетучих и малолетучих примесей в лекарственных средствах, основанный на экстракции примесей растворителем, не растворяющим основной компонент, сорбционном концентрировании из этого раствора и ГХ/МС анализе всего концентрата.

Показано, что при использовании этого способа регистрируется больше (в несколько раз) примесей, чем при анализе раствора в растворителе, растворяющем основной компонент.

Новые возможности идентификации компонентов смесей на уровне следов открываются при использовании предложенной методологии, основанной на выделении веществ из образца органическим растворителем, концентрировании полученных растворов в условиях НМХД и анализе всего концентрата методами ГХ/МС (ХИ) и ГХ/АЭД. Совместное использование данных для следов СЛОС о составе масс-спектра электронной ионизации, молекулярной массе аналитов и присутствующих в молекуле элементов позволяет сузить круг веществ-претендентов.

Таким образом, результаты, полученные в настоящем исследовании, открывают новые возможности в обнаружении состава смесей известных и неизвестных среднелетучих, малолетучих и нелетучих соединений в образцах различного происхождения на уровне следов и решении различных задач, имеющих важное практическое значение в медицине, биотехнологии, эколого-аналитическом контроле, антидопинговом контроле, определении состава примесей в высокочистых органических веществах, в частности фармацевтических.

Перспективным является развитие сочетания предложенного метода концентрирования в условиях НМХД и ВЭЖХ, КЭФ и ТСХ.

Выводы

  1. В результате проведенных исследований развито новое направление в обнаружении известных и неизвестных СЛОС и производных нелетучих органических соединений на уровне следов в различных матрицах – водах, органических растворах (экстрактах), биосредах, фармацевтических субстанциях. Оно основано на извлечении обнаруживаемых веществ в органический растворитель, концентрировании полученных растворов в процессе непрерывной микрохромадистилляции (НМХД) и анализе всего концентрата методами ГХ/МС и элементного анализа.
  2. На примере следовых количеств ПХДД, ПХБ и ХОП показана принципиальная возможность обнаружения следов СЛОС в органических растворах на уровне 10-12 – 10-10 % и в модельных водных растворах (после микрожидкостной экстракции) на уровне 10-13 – 10-11 % благодаря сочетанию предложенного подхода к концентрированию органических растворов и анализа всего концентрата определяемых веществ методом ГХ/МС (ХИ) с регистрацией отрицательных ионов. Что, в случае устранения или отсутствия мешающих компонентов матрицы, позволяет осуществлять быстрый скрининг проб растворов на наличие хлорсодержащих токсикантов на уровне 10-12 – 10-10 %.
  3. Разработан новый метод анализа органических растворов содержащих следы СЛОС различной полярности и летучести, основанный на концентрировании этих растворов благодаря процессу непрерывной микрохромадистилляции (НМХД) в присутствии сорбента, и вводе всего концентрата аналитов в ГХ/МС термодесорбцией.
  4. Предложены подходы к обнаружению следовых количеств различных жирных кислот, аминокислот, дикарбоновых, гидрокси и оксокислот, сахаров и спиртов в водных растворах и биосредах, при их совместном присутствии в смеси,  основанные на дериватизации и ГХ/МС анализе соответствующих производных. Снижены пределы обнаружения аминокислот в водных растворах более чем на 2 порядка, при использовании концентрирования органического экстракта и ГХ/МС анализа всего концентрата в соответствии с предложенным методом.
  5. Показана возможность увеличения достоверности дифференциации онкоклеток и фибробластов, основанная на установлении различия в составе аминокислот разработанным способом их определения.
  6. Расширены возможности метода ГХ/МС для обнаружения следов малолетучих и нелетучих органических соединений и предложено направление, основанное на их выделении из образца, дериватизации соответствующим реагентом, замене реагента на инертный легколетучий растворитель, концентрировании полученных  растворов с удалением растворителя в режиме НМХД и анализе всего концентрата производных методом ГХ/МС. Пределы обнаружения снижены более чем на 2 порядка.
  7. В соответствии с этим направлением предложен подход к  обнаружению следов стероидов в водных растворах и моче, существенно расширяющий возможности антидопингового контроля благодаря снижению пределов обнаружения стероидов более чем на 2 порядка, и регистрации большего числа соединений стероидной структуры, по сравнению с общепринятым подходом.
  8. Предложен подход к минимизации зависимости сигналов АЭД по углероду и водороду от структуры молекул аналитов, основанный на использовании гелиевой плазмы, обогащённой кислородом. Способ позволяет определять отношения чисел атомов углерода и водорода (nc/nh) с высокой точностью.
  9. Предложен новый способ определения элементного состава компонентов углеводородных смесей с высокой точностью, основанный на использовании отношений nc/nh и определения количественного содержания без градуировки по каждому компоненту смеси.
  10. Предложен новый подход к идентификации компонентов смесей СЛОС на уровне следов, основанный на их концентрировании из органических растворов в режиме НМХД, анализе всего концентрата аналитов методами ГХ/МС(ХИ) и ГХ/АЭД и совместном использовании данных о молекулярной массе и присутствующих в молекулах элементов.
  11. Предложен подход к определению суммарного содержания среднелетучих Hal-, P-, S- органических соединений в водных и органических растворах на уровне 10-10 – 10-9 %  и 10-9 – 10-8 % (по элементу) соответственно, позволяющий осуществлять быстрый скрининг проб таких растворов, и проведён анализ образцов различных вод. Способ основан на разработанном методе концентрирования органических растворов в режиме НМХД и переводе всего концентрата в окислительный реактор в потоке гелия с последующей регистрацией продуктов конверсии, соответствующих определяемым элементам, методом ионной хроматографии.
  12. Предложена новая методология экологоаналитического контроля, основанная на случайном выборе проб на анализ из большой выборки отобранных проб, быстром скрининге этих проб на суммарное содержание Hal-, P-  и S-содержащих органических соединений (в том числе токсикантов). Скрининг осуществляется на уровне 10-10 – 10-9 % для бром-, фтор- и фосфор- содержащих органических веществ и на уровне выше – 10-6 % для хлор и  серу содержащих органических веществ (в воде, т.к. в этой матрице уровень фонового сигнала по этим элементам находится на уровне 10-6 %). Если фоновый уровень по хлору и сере позволяет (особо чистая вода, экстракты из матриц, в которых фоновый уровень по хлору и сере низкий) то скрининг по этим элементам может быть осуществлён на уровне 10-10 – 10-9 %.
  13. Разработан подход к определению среднелетучих соединений различной полярности и летучести (спирты, жирные кислоты, н-алканы, ароматические углеводороды, альдегиды и кетоны) в органических и водных растворах на уровне 10-8 – 10-6 %  и 10-9 – 10-7 %, соответственно. Он основан на предложенном методе концентрирования органических растворов (экстрактов) в условиях НМХД и ГХ/МС (ЭИ, ХИ) анализе всего концентрата. С использованием данного подхода изучен состав конденсата выдыхаемого воздуха здоровых людей и больных бронхиальной астмой и ХОБЛ. Зарегистрировано более 100 органических соединений на уровне 10-8 – 10-7 %. В результате математической обработки данных (масс-спектров, времён удерживания и интенсивностей хроматографических пиков зарегистрированных веществ) показана возможность увеличения достоверности диагностики больных бронхиальной астмой и ХОБЛ (до 80%), по сравнению с существующими методами.
  14. Предложен новый подход к обнаружению неизвестных среднелетучих примесей в фармацевтических субстанциях, основанный на их выделении экстракцией растворителем, не растворяющим активное вещество, концентрировании аналитов из всего объёма экстракта предложенным нами методом вне аналитической системы и анализе всего концентрата методом ГХ/МС. Показана возможность увеличения числа обнаруживаемых неизвестных примесей по сравнению с общепринятым подходом и снижению их пределов обнаружения.

Публикации по теме работы

  1. Revelsky I.A., Golovko I.V., Yashin Yu.S., Efimov I.P., Zirko B.I., Glazkov  I.N., Revelsky A.I., Vulikh P.P., Zolotov Yu.A. On the methodology of trace organic determination in water. // Analytical Methods and Instrumentation. 1995. 2 (4). 163-169.
  2. Ревельский И.А., Головко И.В., Ефимов И.П., Яшин Ю.С., Зирко Б.И., Глазков И.Н., Ревельский А.И., Вулых П.П., Золотов Ю.А. О методологии определения органических примесей в воде. // Вестник Московского Университета. 1995. 36 (5). 395-408.
  3. Ревельский А.И., Яшин Ю.С., Ларионов О.Г., Ревельский И.А., Ефимов И.П. Быстрый метод скрининга хлорсодержащих пестицидов в воде на уровне следовых концентраций (10-10 – 10-13%). // Вестник Московского Университета. 1996. 37 (4). 376-380.
  4. Ревельский А.И., Яшин Ю.С., Митрошков А.В., Ларионов О.Г., Ревельский И.А., Лазутин М.Г. Быстрый скрининг проб водных и органических растворов на наличие полихлордибензодиоксинов в присутствии хлорорганических пестицидов и полихлорбифенилов на уровне следов. // Заводская лаборатория. Диагностика материалов. 1997. Т. 63 (12). 3-7.
  5. Ревельский А.И., Мочалов Т.Г., Ревельский И.А., Яшин Ю.С., Зирко Б.И., Пасекова Н.А. Изучение возможности газохроматографического анализа больших по объему проб органических растворов. // Вестник Московского Университета. 1998. 39 (3). 181-183.
  6. Ревельский А.И., Ларионов О.Г., Глазков И.Н.,  Ревельский И.А. Способ ввода в хромато-масс-спектрометр больших по объему проб органических растворов с удалением растворителя вне аналитической системы. // Заводская Лаборатория. Диагностика материалов. 2002. Т. 68. № 10. С11-15.
  7. T.G. Sobolevsky, A.I. Revelsky, I.A. Revelsky, B. Miller, V. Oriedo Electron ionization mass spectra of N(O,S)-isobutoxycarbonyl isobutyl esters of amino acids. // European Journal of Mass Spectrometry. 2002. vol. 8. pp. 447-449
  8. T.G. Sobolevsky, E.S. Chernetsova, A.I. Revelsky, I.A. Revelsky, A.B. Starostin, B. Miller, V. Oriedo Electron ionization mass spectra and their reproducibility for trialkylsilylated derivatives of organic acids, sugars and alcohols. // European Journal of Mass Spectrometry. 2003. vol. 9. pp. 487-495.
  9. I.A. Revelsky, Y.S. Yashin, T.G. Sobolevsky, A.I. Revelsky, B. Miller, V. Oriedo Electron ionization and atmospheric pressure photochemical ionization in gas chromatography-mass spectrometry analysis of amino acids. // European Journal of Mass Spectrometry. 2003. vol. 9. pp. 497-507.
  10. Ревельский И.А., Караваева В.Г., Яшин Ю.С., Аавик Х.Э., Белов Б.Н., Иоонсон В.А., Милли В.Э., Жуховицкий А.А., Мулярский Я.В., Бородулина Р.И., Зирко Б.И., Капинус Е.Н., Вирюс Э.Д., Глазков И.Н., Полухин Д.Ю., Вулых П.П., Напалкова О.В., Ревельский А.И. Идентификация компонентов сложных смесей, количественный анализ без градуировки, новые подходы к контролю качества химической продукции и эколого-аналитическому контролю. 100 лет хроматографии/отв. ред. Б.А. Руденко. М.: Наука, 2003. (529-545) 739 с.
  11. T.G. Sobolevsky, A.I. Revelsky, B. Miller, V. Oriedo, E.S. Chernetsova, I.A. Revelsky Comparison of silylation and esterification/acylation procedures in GC-MS analysis of amino acids. // Journal of Separation Science. 2003. vol. 26. n. 17, p. 1474-1478
  12. T.G. Sobolevsky, A.I. Revelsky, I.A. Revelsky, B. Miller, V. Oriedo Simultaneous determination of fatty, dicarboxylic and amino acids based on derivatization with isobutyl chloroformate followed by gas chromatography-positive ion chemical ionization mass spectrometry. // Journal of Chromatography B. 800 (2004). p. 101-107
  13. Чернецова Е.С., Ревельский А.И., Дёрст Д., Ревельский И.А. Определение элементного состава компонентов смесей углеводородов при использовании газового хроматографа с атомно-эмиссионным детектором: увеличение точности. // Журнал аналитической химии. 2005. Т. 60. № 9. С. 963-968.
  14. Чернецова Е.С., Ревельский А.И., Дёрст Д., Ревельский И.А. Определение отношений nC/nH в молекулах летучих Cl- и Br-содержащих углеводородов при использовании газового хроматографа с атомно-эмиссионным детектором. // Заводская лаборатория. Диагностика материалов. 2005. Т. 71. № 8. С. 12-14.
  15. E.S. Chernetsova, A.I. Revelsky, D. Durst, T.G. Sobolevsky, I.A. Revelsky. Increasing the accuracy of determination of nC/nH ratios by GC-AED. // J. of Chromatography A, 1071(2005) 55-58
  16. Chernetsova E.S., Revelsky A.I., Sobolevsky T.G., Revelsky I.A., Durst D. Improving the Accuracy of Carbon-to-Hydrogen Ratio Determination for P, N, S, O, Cl and Brcontaining Organic Compounds Using Atomic Emission Detector. // Analytical and Bioanalytical Chemistry. 2005. 382. 448 – 451
  17. Чернецова Е.С., Ревельский А.И., Дёрст Д., Ревельский И.А Изучение возможности определения отношений чисел элементов при использовании газовой хроматографии с атомно-эмиссионным детектором. // Заводская лаборатория. № 2. 2006. стр. 8-13
  18. Ревельский А.И., Ревельский И.А. Применение метода хромато-масс-спектрометрии и способа ввода больших по объему проб для определения среднелетучих органических соединений в различных средах. // Хроматография на благо России. Издательская группа «Граница». 2007. Москва. Стр. 249-272
  19. Родионов А.А., Долгорукова А.В., Ревельский А.И. Прямое определение кетонов и альдегидов методом хромато-масс-спектрометрии с химической ионизацией и регистрацией положительных ионов. // Сорбционные и хроматографические процессы. 2007. Т.7. В.5. С. 726-732.
  20. А.А. Родионов, А.И. Ревельский, И.А. Ревельский, Т.Н. Анохина, Э.Х. Анаев Хроматомасс-спектрометрическое определение среднелетучих органических веществ в конденсате выдыхаемого воздуха. // Масс-спектрометрия. 2007. Т.4. № 2. С. 143-148.
  21. Revelsky I.A., Chernetsova E.S., Revelsky A.I. Gas chromatography with atomic emission detection: a method for the determination of hydrocarbon mixture components. // Mendeleev Communications. 2009. 19 (4). 233 – 234.
  22. Ревельский А.И., Андриянов А.В., Ревельский И.А. Снижение пределов обнаружения стероидов благодаря сочетанию способа ввода больших проб органических растворов (экстрактов) и метода ГХ/МС. // Масс-спектрометрия. 2009. 6(1). стр. 77 – 78.
  23. Гуляев И.В., Ревельский А.И. Анализ фармацевтических субстанций методом реакционной газовой хроматографии в сочетании с масс-спектрометрией // Масс-спектрометрия. 2009. 6(3). стр. 199-204
  24. Ревельский А.И., Леднева А.В., Андриянов А.В., Ревельский И.А. Определение моносахаридов методом реакционной газовой хроматографии/масс-спектрометрии с удалением реагента из реакционной смеси // Масс-спектрометрия. 2009. 6(3). стр. 221-225.
  25. Ревельский И.А., Капинус Е.Н., Федосеева М.В., Ревельский А.И. Одновременное определение общего содержания галоген-, фосфор- и серосодержащих среднелетучих органических соединений в органических растворах (экстрактах) на ультрамикроуровне. Заводская лаборатория. Диагностика материалов. 2010. 76(4). С. 15-18.
  26. Ревельский И.А., Капинус Е.Н., Федосеева М.В., Ревельский А.И. Определение общего содержания галоген-, фосфор- и серосодержащих среднелетучих органических соединений в воде на уровне 10-10 – 10-9% // Заводская лаборатория. Диагностика материалов. 2010. 76(5). С. 10-15.
  27. Chernetsova E.S., Revelsky A.I., Revelsky I.A., Zolotov Yu.A. Gas chromatography of organic mixtures using an atomic emission detector. // Journal of Analytical Chemistry. 2010. 65(8). P. 788-802.
  28. Ревельский А.И., Чернецова Е.С., Ревельский И.А. Газовая хроматография с атомно-эмиссионным детектированием, предварительным концентрированием и переводом всего концентрата в хроматограф. // Заводская лаборатория. Диагностика материалов. 2010. 76(6). С. 19-21.
  29. И.А. Ревельский, Е.Н. Капинус, А.И. Ревельский. Способ одновременного определения суммарного содержания F-, Cl-, Br-, J-, S- и P-органических соединений в воде и водных растворах. Патент. 2395804. Бюл. №21. 27.07.2010.
  30. А.I. Revelsky, A. S. Samokhin, E. D. Virus, G. M. Rodchenkov and I. A. Revelsky High sensitive analysis of steroids in doping control using gas chromatography/time-of-flight mass-spectrometry (pages 263–267). // Drug Testing and Analysis. Volume 3. Issue 4. pages 263–267. April 2011.





© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.