WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

 

На правах рукописи

ВОРОБЬЕВ  МИХАИЛ  МИХАЙЛОВИЧ

КИНЕТИКА ФЕРМЕНТАТИВНОГО ГИДРОЛИЗА ПОЛИПЕПТИДОВ И ГИДРОФОБНЫЕ ЭФФЕКТЫ

Специальность 02.00.04 – физическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук

                               

Москва-2009

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институт элементоорганических соединений  им. А.Н. Несмеянова РАН.

Официальные оппоненты:                                        член-корреспондент РАН,

доктор химических наук,

профессор

                                                               Варфоломеев Сергей Дмитриевич

                                                               доктор химических наук,

профессор

                                                               Ямсков Игорь Александрович

                                                               

доктор биологических наук,

профессор

                                                               Валуева Татьяна Александровна

                                                               

                                       

Ведущая организация: Химический  факультет МГУ им. М.В. Ломоносова

Защита состоится «____» ___________________2009 г. в _______ на заседании диссертационного совета Д 002.039.01 при Учреждении Российской академии наук Институт биохимической физики им. Н.Э. Эмануэля РАН по адресу: 118334, г. Москва, ул. Косыгина, д.4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Институт химической физики им. Н.Н. Семенова РАН.

Автореферат разослан «____» ___________________2009 г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета

Кандидат химических наук                                                                М.А. Смотряева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В настоящее время методы физической химии все шире применяются к комплексным объектам природного происхождения и сложным биохимическим процессам. Один из таких процессов - ферментативный гидролиз полимерных цепей полипептидов и белков (протеолиз) лежит в основе ряда биологических явлений, проявляющихся в широком диапазоне степени гидролиза пептидных связей от ограниченного протеолиза при активации ферментов до глубокого гидролиза при пищеварении. Протеолизу принадлежит важная роль в процессах модификации пищевых белков и производстве белковых гидролизатов в пищевой промышленности. Получение биологически-активных пептидов протеолизом из неактивных белковых предшественников является перспективным методом получения биопептидов. Создание общей физико-химической модели протеолиза, включающей кинетическое описание процессов межцепочечных взаимодействий, приводящих к маскированию/демаскированию пептидных связей, и количественному выражению фермент-субстратного узнавания (специфичности) в отношении полимерного субстрата, является, таким образом, важнейшей задачей.

Гидрофобные явления играют ключевую роль в живой природе и в модельных полимерных водных системах, определяя гидрофобный коллапс полипептидных цепей в белках и переходы клубок-глобула в синтетических белковоподобных полимерах. Актуальной задачей является разработка методов анализа многокомпонентных водных смесей пептидов – в первую очередь с точки зрения количественного выражения гидрофобности пептидов и их склонности к гидрофобным взаимодействиям. Представляется перспективным определять параметры гидрофобности по упорядочению воды в гидратных оболочках неполярных групп, определяемому по поглощению электромагнитного излучения в миллиметровой части спектра.

Описание кинетики превращений смесей пептидных фрагментов требует компьютерного моделирования, которое должно учесть весь объем информации и представить результаты в форме, удобной для экспериментальной проверки. Понимание физико-химических закономерностей сложных процессов, таких как протеолиз, невозможно без создания компьютерных программ и комплексного экспериментального и теоретического подхода.

       Все это делает исследование кинетики гидролиза полипептидов, компьютерное моделирование протеолиза  и количественное изучение гидратации весьма актуальным.

Целью работы является  изучение физико-химических закономерностей ферментативного гидролиза полимерных субстратов на примере протеолитических реакций, а также изучение гидратационных эффектов в водных аминокислотно-пептидных растворах и коллоидных системах.

       В рамках этого в диссертации решались следующие задачи:

1. Разработать аналитические методы и подходы, позволяющие определять константы скорости гидролиза пептидных субстратов протеолитическими ферментами в кинетических экспериментах, анализирующих как суммарную кинетику гидролиза пептидных связей, так и индивидуальную кинетику изменения концентраций пептидов по данным разделительных методов (обращеннофазная ЖХВД, количественный электрофорез, аминокислотный анализ).

2. Разработать пакет компьютерных программ, позволяющих предсказывать кинетику протеолиза для пептидных цепей, имеющих произвольную аминокислотную последовательность, с базой данных кинетических параметров для ряда протеолитических ферментов.

3. Разработать количественный метод определения гидратации методом миллиметровой (микроволновой) спектроскопии, позволяющий изучать состояние воды в гидратных оболочках пептидов в различных водных системах и процессах, включая водные растворы глобулярных белков, протеолиз, взаимодействие полипептидов с казеиновыми мицеллами. Показать перспективность количественного изучения гидратации для определения шкал гидрофобности аминокислот, оценки стабильности полипептидных мицелл, оценки конформаций синтетических белковоподобных сополимеров.

Научная новизна работы заключается в следующем:

1. Впервые предложена общая физико-химическая модель протеолиза, позволяющая анализировать кинетику во всем диапазоне изменения степени гидролиза пептидных связей с помощью одних и тех же уравнений. Показано, что кинетика протеолиза в общем случае соответствует двухстадийной схеме, где первая кинетически значимая стадия представляет демаскирование пептидных связей, а вторая - гидролиз.

2. С использованием ЖХВД на обращенной фазе получены экспериментальные данные по константам скоростей гидролиза различных пептидных связей β-казеина трипсином дикого типа и мутированными формами трипсина.

3. Впервые предложен механизм демаскирования гидрофобного С-концевого  участка при гидролизе β-казеина трипсином дикого типа и мутированными трипсинами.

4. Изучена суммарная кинетика гидролиза химотрипсином пептидных связей по поглощению N-тринитрофенильных производных образующихся аминогрупп. Впервые показано, что немонотонные участки нарастания аминного азота в ходе гидролиза связаны с маскированностью пептидных связей.

5. Изучена кинетика гидролиза панкреатином пептидов в реакторе открытого типа с удалением низкомолекулярных продуктов гидролиза. Экспериментально определены константы скорости выхода отдельных аминокислотных остатков в составе низкомолекулярных фракций.

6. Показано, что кинетика убывания исходной полипептидной цепи соответствует кинетике 1-го порядка. Получена оценка для отношения констант демаскирования и гидролиза глобулярных белков молока.

7. Впервые создана компьютерная программа PROTEOLYSIS, осуществляющая численное интегрирование дифференциальных уравнений, которые описывают демаскирование и гидролиз пептидных связей. Программа позволяет удовлетворительно предсказывать кинетику протеолиза с различными параметрами специфичности и маскированности, а также состав продуктов протеолиза (состав гидролизатов), полученных при различных кинетических условиях.

8.  Разработан метод определения параметров гидратации с использованием миллиметровой (микроволновой) спектроскопии. Метод имеет различную чувствительность к гидрофобной и гидрофильной типам гидратации, что впервые позволило использовать его для построения шкалы гидрофобности аминокислот и оценки количества неполярных групп, участвующих в гидрофобной гидратации или исключенных за счет гидрофобного взаимодействия. Метод позволяет определять кинетику развертывания белковой глобулы в ходе протеолиза.

9. Миллиметровая спектроскопия наряду с реологическими методами позволяет контролировать взаимодействие пептидов с казеиновыми мицеллами, в частности определять концентрации пептидов, при которых имеет место увеличение стабильности мицелл.

10. С помощью миллиметровой спектроскопии впервые показано, что гидрофобная модификация синтетических полимеров, не являющихся термочувствительными,  приводит к меньшему изменению гидратации по сравнению с переходом клубок глобула в термочувствительных полимерах.

Практическая значимость.

Кинетические параметры представлены в работе для таких практически важных протеаз как трипсин, химотрипсин, и пепсин при протеолизе белковых субстратов, выделенных из молока. Представленная общая методология анализа кинетики протеолиза дает возможность применить наработанные методы к другим белковым субстратам и протеазам, представляющим практический интерес. В работе  рассмотрено применение модельных представлений для анализа кинетики образования низкомолекулярных продуктов протеолиза в реакторе открытого типа, моделирующего in vitro панкреатическую стадию пищеварения. Эта часть работы имеет практическое значение для количественных оценок пищевой ценности белков.

Детальное изложение принципов построения программы PROTEOLYSIS может быть полезным при разработке других компьютерных программ, моделирующих сложные биохимические процессы. Применение компьютерного моделирования протеолиза может быть использовано для предсказания оптимальных кинетических условий получения белковых гидролизатов.

Использование метода количественного определения гидратации с помощью миллиметровой спектроскопии открывает новые аналитические возможности при исследовании различных амфифильных систем (белковых и полимерных). Количественные измерения гидратации позволяют контролировать гидролиз пищевых белков и образование казеиновых гелей, что может быть использовано в пищевой промышленности.

Защищаемые положения.

1. Расщепление пептидных связей в полипептидах происходит в две стадии: на первой осуществляется физический процесс конформационной перестройки пептидной цепи (демаскирование); на второй происходит собственно химический процесс – гидролиз пептидных связей.

2. Стадия демаскрования дает немонотонные участки увеличения аминного азота в ходе гидролиза и обеспечивает наличие кинетики накопления некоторых пептидов с лагом.

3. Отношение констант скоростей демаскирования и гидролиза является важным параметром при количественном описании протеолиза.

4. Компьютерное моделирование протеолиза дает возможность предсказывать состав (главные компоненты) гидролизатов для различных гипотетических механизмов протеолиза.

5.  Количество связанной воды растет с увеличением доступной для воды поверхности молекул, в частности, в начальной стадии протеолизе.

6. Метод миллиметровой (микроволновой) спектроскопии имеет различную чувствительность к гидрофобной и гидрофильной типам гидратации.

7. Взаимодействие пептидов в небольшой концентрации с казеиновыми мицеллами приводит к  увеличению стабильности мицелл, что определяется реологически и по изменению гидратации.

8. Гидратационные измерения позволяют дифференцировать конформационные состояния клубка и глобулы для синтетических белковоподобных полимеров.

Личный вклад автора. Автору принадлежит ведущая роль в формировании направления исследований, разработке зкспериментальных и теоретических подходов, проведении исследований и обобщении полученных результатов.

Апробация работы.

Результаты работы докладывались и обсуждались на Международном симпозиуме по компьютерным вычислениям в химических исследованиях (Москва, Россия, 1996 г.); на V Симпозиуме по пищевым белкам (Потсдам, Германия, 1997 г.); на XIII Конференции Европейского коллоидного и поверхностного общества (Дублин, Ирландия, 1999 г.); на IX Симпозиуме по пищевым коллоидным системам, биополимерам и материалам (Вагенинген, Голландия, 2002 г.); на VIII (Хельсинки, Финляндия, 1998 г.), IX (Зихрон Яков, Израиль, 2000 г.) Международных симпозиумах по свойствам воды; на Европейском полимерном конгрессе (Москва, Россия, 2005); на XII Европейской конференции по спектроскопии биологических молекул (Бобини, Франция, 2007 г.); на XXIX Европейском конгрессе по спектроскопии молекул (Опатия, Хорватия, 2008 г.); на семинаре в научно-исследовательском центре фирмы «Нестле» (Лозанна, Швейцария, 1996 г.), на семинаре в Немецком федеральном центре по исследованиям в молочной промышленности (Киль, Германия, 1994 г.); на семинарах в Университете Лаваля (Квебек, Канада, 1992), Университетского колледжа Дублина (Дублин, Ирландия, 2002);  на семинарах лаборатории физической химии полимеров ИНЭОС РАН.

Работа была выполнена при поддержке ряда проектов РФФИ, в том числе под руководством диссертанта: 98-03-32230 (Количественное изучение гидратации амфифильных молекул) и 07-03-00131 (Количественное изучение гидратации ферментоподобных сополимеров с цвиттерионными группировками).

Публикации. Материалы диссертации изложены в 24 статьях, а также в 7 тезисах указанных выше конференций.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 5 глав, заключения и выводов, а также списка цитируемой литературы из 291 наименования. Объем диссертации 273 страницы, включая 62 рисунка и 27 таблиц.

КРАТКОЕ СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

Во введении обоснована актуальность темы диссертации, сформулированы цель и задачи работы, приведены основные положения, выносимые на защиту, обсуждены научная новизна и практическая значимость работы.

В первой главе рассмотрены литературные данные по кинетике ферментативного гидролиза полипептидов и белков, а также по экспериментальным методам определения гидратации и количественного выражения гидрофобных эффектов. Анализируются физико-химические предпосылки количественного описания гидролиза полипептидов с использованием методов химической кинетики. 

Обосновано приближение, согласно которому эффективную константу скорости расщепления j-ой связи  (индекс j обозначает различный тип гидролизуемых пептидных связей, СО группа которых входят в аминокислотный остаток –NHCH(Rj)CO–) можно представить в виде:

,                                                                                        (1)

где  kj - константа гидролиза демаскированной связи j, определяемая аминокислотными остатками, расположенными около гидролизуемой связи и взаимодействующими с активным центром фермента, Pdj –вероятность того, что j-я связь демаскирована, т.е. доступна действию фермента. Pdj - определяется гидролизом других связей (не j –ой).

       Проанализированы публикации по экспериментальному определению параметров гидрофобности (или в более широком смысле - гидратации) для аминокислот, пептидов и белков. Рассмотрены предпосылки разработки метода определения гидратации с помощью миллиметровой спектроскопии. Рассмотрены гидрофобные эффекты с участием пептидов, в частности гидрофобный коллапс небольших белков и пептидов, который имеет значение для протеолиза.

Во второй главе описываются  наши экспериментальные результаты по кинетике гидролиза различных полимерных пептидных субстратов различными протеолитическими ферментами в закрытых и открытых реакторах при изучении суммарной кинетики гидролиза пептидных связей и индивидуальной кинетики для отдельных компонентов.

Ферментативный гидролиз пептидных связей R1-CONH-R2 + H2O → R1COOH  + NH2R2 был рассмотрен на примере ряда субстратов с различными аминокислотными последовательностями. Субстратами являлись природные полипептиды и белки, состоящие из  природных аминокислотных остатков (таблица 1). Нас интересовали такие общие кинетические закономерности, которые бы не зависели от конкретного расположения аминокислотных остатков в последовательности, а были бы справедливы для любого полипептидного субстрата. В таблице 1 приведены значения гидрофобности аминокислот, полученные методом миллиметровой спектроскопии. Особенное внимание к гидрофобности обусловлено тем, что кластеры гидрофобных аминокислотных остатков могут обеспечивать маскирование пептидных связей, и таким образом замедлять протеолиз.

В разделе 2.1 приводятся экспериментальные данные по кинетике гидролиза β–казеина трипсином дикого типа и мутированными трипсинами. Интерес к продуктам протеолиза β–казеина, например, пептидам, образующимся из гидрофобного С-конца цепи, обусловлен их физиологической активностью, в частности, способностью ингибировать ангиотензин-превращающий  фермент (АПФ).        

β-Казеин (вариант А1) в соответствующем буфере (pH от 7 до 10) был подвергнут гидролизу трипсином дикого типа или мутированными ферментами K188H, K188F, K188Y, K188W или K188D/D189K при 37оС. Отношения фермент/субстрат были 0.005, 0.005, 0.01, 0.02, 0.02  и 0.01 (в/в) для трипсина дикого типа и мутированных ферментов K188H, K188F, K188Y, K188W, K188D/D189K, соответственно. Пробы отбирались через 30 мин, 1, 2, 4, 8, 24 и 48 ч после начала реакции, затем закислялись чтобы остановить реакцию. Образующиеся в ходе протеолиза пептиды анализировались ЖХВД на обращенной фазе. Были обнаружены кинетические кривые двух сортов: при гидролизе доступных пептидных связей получаются кривые, описываемые простыми экспоненциальными функциями. Для маскированных пептидных связей получаются кривые другого вида, - наблюдается кинетика с временной задержкой.

Таблица 1. Боковые радикалы и числа гидратации α-аминокислот (H3N+CHRCOO-).

Аминокислота

Боковой радикал R

Gly

H

-1.3

Ala

Me

1.9

Val

CH(Me)2

6.2

Leu

CH2CH(Me)2

7.4

Ile

CH(Me)Et

8.2

Asp

CH2COOH

1.4

Ser

CH2OH

0.8

Trp

7.1

Phe

CH2Ph

6.5

Asn

CH2CONH2

0.8

Arg

(CH2)3NHC(=NH)NH2

2.5

His

1.9

Gln

CH2CH2CONH2

1.9

Glu

CH2CH2COOH

1.4

Lys

(CH2)4NH2

3.4

Met

CH2CH2SMe

3.9

Proб

2.2

Thr

CH(OH)CH3

2.2

Tyr

CH2C6H4OH-p

5.4

a Числа гидратации цвиттерионов аминокислот определены методом миллиметровой спектроскопии.

б Приведена формула для всей аминокислоты.

Пример хроматограммы трипсинового гидролизата β-казеина представлен на рис. 1. В финальных гидролизатах были найдены следующие 12 моноблочных пептидов: A (Arg1-Arg25), B (Ile26-Lys28), C (Lys29-Lys32), D (Phe33-Lys48),  E (Ile49-Lys97), F (Glu100-Lys105), H (Glu108-Lys113), I (Tyr114-Lys169), J (Val 170-Lys176), K (Ala177-Arg183), L (Asp184-Arg202), N (Gly203-Val209); четырех диблочных пептида: D-E (Phe33-Lys97), G-H (His106-Lys113), Val-Lys-F (Val98-Lys105), L-N (Asp184-Val209) и один триблочный пептид G-H-I (His106-Lys169). Образование пептидов A и L-N определяется гидролизом связей Arg-X (Arg25-Ile26 и Arg183-Asp184). Образование пептидов D, E, H, C, F, I, J определяется гидролизом связей Lys-X.

                                                                       Время (мин)

1 A

H.Arg-Glu-Leu-Glu-Glu-Leu-Asn-Val-Pro-Gly-Glu-Ile-Val-Glu-SerP-Leu-SerP-SerP-SerP-Glu-Glu-Ser-Ile-Thr-

25  B C  D

Arg--Ile-Asn-Lys-- Lys--Ile-Glu-Lys--Phe-Gln-SerP-Glu-Glu-Gln-Gln-Gln-Thr-Glu-Asp-Glu-Leu-Gln-Asp-

48 E

Lys--Ile-His-Pro-Phe-Ala-Gln-Thr-Gln-Ser-Leu-Val-Tyr-Pro-Phe-Pro-Gly-Pro-Ile-His-Asn-Ser-Leu-Pro-Gln-

73

Asn-Ile-Pro-Pro-Leu-Thr-Gln-Thr-Pro-Val-Val-Val-Pro-Pro-Phe-Leu-Gln-Pro-Glu-Val-Met-Gly-Val-Ser-Lys--

98 F  G  H

Val-Lys--Glu-Ala-Met-Ala-Pro-Lys--His-Lys--Glu-Met-Pro-Phe-Pro-Lys--Tyr-Pro-Val-Glu-Pro-Phe-Thr-

121  I

Glu-Ser-Gln-Ser-Leu-Thr-Leu-Thr-Asp-Val-Glu-Asn-Leu-His-Leu-Pro-Leu-Pro-Leu-Leu-Gln-Ser-Trp-Met-His-

146

Gln-Pro-His-Gln-Pro-Leu-Pro-Pro-Thr-Val-Met-Phe-Pro-Pro-Gln-Ser-Val-Leu-Ser-Leu-Ser-Gln-Ser-Lys--Val-

171  J K  L

Leu-Pro-Val-Pro-Gln-Lys--Ala-Val-Pro-Tyr-Pro-Gln-Arg--Asp-Met-Pro-Ile-Gln-Ala-Phe-Leu-Leu-Tyr-Gln-

195 N 209

Glu-Pro-Val-Leu-Gly-Pro-Val-Arg--Gly-Pro-Phe-Pro-Ile-Ile-Val.OH

Рис. 1. Обращеннофазная ЖХВД трипсинового гидролизата β-казеина. Расположение образующихся пептидов в аминокислотной последовательности β-казеина показано латинскими буквами. Пептиды были разделены на колонке Nucleosil C18 (4.6 mm  x 25 cm, SFCC, France) c линейным градиентом растворителя А (0.11% трифторуксусной кислоты ) к 100% растворителя B (60% ацетонитрил, 40%  H2O, 0.09% трифторуксусной кислоты) за 62.5 мин.

       При мутациях 188 остаток лизина, находящийся вне активного центра трипсина, менялся на другой остаток (например, Phe в мутированном ферменте K188F). Поэтому первичная специфичность трипсина сохранялась, – гидролизовались связи, образованные аргинином и лизином. Отношение констант скоростей гидролиза второго порядка для субстратов, содержащих  остатки Arg и Lys в позиции P1, отражают первичную специфичность фермента. Эти отношения представлены в таблице 2 для гидролиза доступных связей β-казеина в сравнении с синтетическими амидными субстратами.

Таблица 2. Преимущество скоростей гидролиза субстратов, содержащих остаток Arg, над субстратами, содержащими остаток Lys.

Фермент

pH

  Субстрат

п-нитроанилид тетрапептидаа

пептиды из β-казеинаб

kcat/KM(Arg)

-----

kcat/KM(Lys)

kArg(Arg25-Ile26)

--------

kLys(max)

трипсин

7

22

7.4

дикого

8

7.0

8.0

типа

9

4.2

5.1

10

4.3

3.7

K188H

7

-

1.3

8

8.7

1.5

9

-

1.4

10

-

3.8

K188F

7

8.7

1.1

8

8.2

1.2

9

6.3

1.2

10

6.0

0.7

K188Y

7

10

7.3

8

5.2

14

9

7.7

11

10

8.8

10

K188W

7

8.8

4.3

8

10

13

9

15

11

10

-

-

K188D/D189K

7

-

12

8

22.5

13

9

-

11

10

-

6.6

a Субстрат: Suc-Ala-Ala-Pro-X-pNA (X=Arg, Lys).

бkLys(max) является средней константой скорости гидролиза связей Lys28-Lys29, Lys32-Phe33, Lys99-Glu100, Lys105-His106, Lys113-Tyr114, Lys169-Val170, Lys176-Ala177.

В случае синтетических субстратов для всех изученных мутированных трипсинов было найдено существенное преимущество гидролиза субстратов, содержащих  остаток Arg, над субстратами, содержащими остаток Lys. Для β-казеина такого преимущества не было найдено для ферментов K188H и  K188F. По-видимому, изменение аминокислотного остатка вне активного центра может приводить к изменениям специфичности в рамках первичной специфичности за счет дополнительного связывания фермента с длинными пептидными субстратами.

Накопление пептида Gly203-Val209 (пептид N) при гидролизе связи Arg202-Gly203, происходит с временной задержкой (кинетика с лагом). Существенно, что это наблюдается для всех мутированных ферментов и трипсина дикого типа. Таким образом, мы приходим к необходимости привлечения понятия маскированности, определяющейся строением субстрата вне зависимости от специфичности фермента. 

Рис. 2 показывает принципиально различную кинетику накопления N-, C-концевых пептидов, образующихся соответственно из гидрофильного и гидрофобного конца полипептидной цепи β-казеина. Согласно данным миллиметровой спектроскопии средняя гидрофобность участков цепи β-казеина составляет 2.96 (участок 1-46), 3.53 (участок 44-92), 3.13 (участок 93-135), 3.61 (участок 136-178), 3.06 (участок 179-189) и 4.20 (участок 190-209). Приведены средние числа гидратации для смесей аминокислот, эквивалентных по аминокислотному составу соответствующим участкам цепи. Гидрофобные участки 44-92, 136-178 и 190-209 могут взаимодействовать, образуя гидрофобный кластер. Гидролиз связи Lys-X (например, Lys105-His106) или связи Arg183-Asp184 может приводить к разрыву полипептидной цепи, связывающей один из этих гидрофобных участков с остальными. В результате следует ожидать увеличения конформационной подвижности и запуска механизма демаскирования пептидной связи Arg202-Gly203.

Образование С-концевого пептида было описано нами двухстадийной схемой. На первой стадии изначально недоступные для ферментативной атаки маскированные пептидные связи Bm превращаются в демаскированные связи Bd. На второй стадии эти связи гидролизуются в соответствии со специфичностью, определяемой аминокислотной последовательностью: 

                                                                               (Схема 1)

где kd - константа скорости демаскирования, kh – константа скорости гидролиза демаскированных связей, N – аминный азот.

Согласно схеме 1, время задержки τ при гидролизе связи Arg202 равно:

                                            (2)

где  kd и kh - константы скоростей демаскирования и гидролиза связи Arg202.

Рис.2. Гидрофобный кластер, маскирующий С-концевой фрагмент  полипептидной цепи β-казеина. Образование доступного для фермента N–концевого пептида описывается простым уравнением  A(t)=A0(1-e-kt). Образование С-концевого пептида Gly203-Val209 (пептид N) происходит по схеме 1, где пептидная связь Arg202-Gly203 является изначально недоступной (маскированной).

Эта формула была использована для  вычисления констант скорости демаскирования по измеренным временам τ для трипсина дикого типа и мутированных ферментов. 

Нами предложено использовать отношение констант скоростей гидролиза и демаскирования для выявления той пептидной связи в  расщепляемой полипептидной цепи, гидролиз которой запускает  демаскирование (таблица 3).  Для такой связи константа скорости гидролиза должна быть близка к константе демаскирования. Как показывает таблица 3, гидролиз одной из связей Lys-X может запустить процесс демаскирования для всех ферментов кроме K188F. Для K188F лимитирующей стадией может быть гидролиз связи Arg183-Asp184.

Из приведенных в разделе 2.1 кинетических данных следуют следующие отношения констант скоростей демаскирования и гидролиза (kd/kh) для пептидной связи Gly203-Val209: 11.5 (трипсин дикого типа); 20.5 (K188H); 3.8 (K188F); 9.5 (K188Y) и 10.5 (K188D/D189K). То есть, для  гидрофобного C конца β-казеина параметр демаскирования в среднем равен 10, в то время как для демаскированных пептидных связей kd/kh>>1.

Таблица 3. Отношение константы скорости гидролиза  к константе скорости демаскирования kd.

Фермент

pH

Константа скорости / константа демаскирования

k(Arg25-Ile26)/kd

kLys-X/kd

k(Arg183-Asp184)/kd

трипсин

7

6.2

0.8

2.7

дикого

8

7.5

1.0

2.0

типа

9

5.0

1.0

2.0

10

2.7

0.7

0.7

K188H

7

1.0

-

1.9

8

1.4

0.9

4.6

9

1.4

1.0

2.2

K188F

10

3.6

1.0

3.0

7

1.8

1.7

0.4

8

4.2

3.6

0.8

9

3.6

3.0

0.5

10

1.8

2.6

0.4

K188Y

7

1.0

1.3

1.1

8

8.9

0.7

2.1

9

11.0

1.0

2.3

10

11.6

1.2

2.6

K188D/D189K

7

9.5

0.7

3.1

8

10.7

0.8

2.9

9

10.1

0.9

3.6

10

5.9

0.9

-

В разделе 2.2 описываются протеолитические эксперименты с описанием  кинетики по изменению концентрации суммы аминогрупп, образующихся при гидролизе пептидных связей. Определение суммарной кинетики проводили по поглощению N-тринитрофенильных производных всех продуктов гидролиза H2NR, получаемых с использованием тринитробензосульфокислоты:

Накопление аминного азота N при протеолизе суммарного казеина химотрипсином представляет немонотонную функцию (рис.3).

Рис. 3. Кинетические кривые N(t) для протеолиза суммарного казеина химотрипсином. Концентрация субстрата 0.05 г/л () и 0.2 г/л ().

Для объяснения причин возникновения немонотонных зависимостей N(t) (локальных максимумов скорости dN/dt) был использован оригинальный подход. Константу скорости второго порядка <kcat/KM> и обратную величину эффективной константы Михаэлиса <1/KM>  считали функциями степени гидролиза d=N/S0 (<…> - знак усреднения по всем разновидностям пептидных связей). Тогда выражение для скорости гидролиза пептидных связей принимает вид:

,                                               (3)

где N – концентрация аминного азота, B - концентрация пептидных связей, S0=B+N -  общая концентрация всех аминокислотных остатков, - E0 – общая концентрация фермента, P(S0) - вероятность демаскирования субстрата (межмолекулярный процесс). <k> - усредненная величина по всей совокупности индивидуальных констант :

,                                                                               (4)

где Bj – концентрация пептидных связей сорта j во всей совокупности пептидных связей, Pj - вероятность демаскирования пептидных связей сорта j (внутримолекулярный процесс). Член <k>, представляющий сумму произведений индивидуальных констант гидролиза на долю демаскированных связей,  определяет изменение в ходе протеолиза вклада демаскирования в суммарную скорость процесса. По форме уравнение (3) имеет вид уравнения Михаэлиса-Ментен, но вместо постоянных величин  (константы второго порядка и константы Михаэлиса), в него входят функции. Например, константа второго порядка является усредненной величиной по ансамблю демаскированных пептидных связей (уравнение 4). Описание протеолиза сводится, таким образом, к определению функциональных зависимостей усредненных величин.

Зависимость <k> от DH (DH=d100%), измеренная по экспериментально определенной зависимости скорости V(DH), представлена на рис. 4 для протеолиза суммарного казеина химотрипсином при концентрациях субстрата 0.4, 0.2, 0.1 г/л. Функция <k>, зависящая от индивидуальных констант гидролиза и процесса демаскирования, имеет локальный максимум в области 2-4% степени гидролиза. Таким образом, показано, что наблюдаемые немонотонные особенности суммарных кинетических кривых (рис. 3) связаны с демаскированием.

Примеры изменения в ходе протеолиза V(DH) для индивидуальных  казеинов представлены на Рис. 5, показывающем различные зависимости для α и β казеинов. Для α-казеина имеет место убывающая монотонная зависимость, а для β-казеина зависимость V(DH) имеет локальный максимум. По зависимостям скорости гидролиза от степени гидролиза в экспериментах, выполненных при низких концентрациях субстрата (<0.01%), можно качественно определить уровень маскирования при гидролизе данного субстрата.  Сравнение зависимостей для α- и β-казеинов показывает, что пептидные связи в β-казеине маскированы больше.

Рис. 4. Зависимость <k> от DH для протеолиза суммарного казеина химотрипсином при концентрациях субстрата 0.4, 0.2, и 0.1 г/л. E0=6.6·10-8M.

В разделах 2.3 и 2.4 рассмотрены другие количественные методы определения кинетических параметров протеолиза, связанные с использованием электрофореза в ацетатцеллюлозных пленках и аминокислотного анализа низкомолекулярных фракций гидролизатов.

В разделе 2.3 показано, что логарифм концентрации исходного полипептида (белка) убывает линейно со временем протеолиза, т.е. формально наблюдается кинетика 1-го порядка.

Из таблицы 4 видно, что для обеих температур константы второго порядка  скоростей гидролиза для казеинов больше, чем для глобулярных белков примерно на два-три порядка. В глобулярных белках, гидролиз лимитируется маскированием пептидных связей, связанным с упаковкой полипептидной цепи в белковой глобуле.

Таблица 4. Константы скоростей деградации полипептидных субстратов под действием химотрипсина.

Субстрат

T,oC

Eo, мкг/мл

kI, мин-110-2

kII=kI/Eo,М-1с-1

β-казеин

35

0.2

9.2

2.9105

α-казеин

35

0.2

16.8

5.3105

β-ЛГ

35

100

25

1.6103

БСА

35

12

2.3

1.2103

α-ЛА

35

12

0.44

0.23103

β-казеин

25

0.6

3.6

0.38105

α-казеин

25

0.6

7.4

0.78105

β-ЛГ

25

95

3.3

2.2102

БСА

25

7.5

0.21

1.75102

α-ЛА

25

7.5

0.036

0.3102

В качестве верхней оценки отношения константы скорости демаскирования глобулы  к средней константе скорости гидролиза одной доступной пептидной связи получаем kd/kh kII(сыв.)/kII(каз.)n = 0.003510 = 0.035 0.04 (где n=10 – оценка числа доступных  специфичных пептидных связей в казеинах, гидролизуемых без временной задержки). Оценку n мы смогли выполнить только приближенно. Например, для гидролиза β-казеина трипсином, рассмотренного в разделе 2.1, такими связями являются Arg25-Ile26, Arg183-Asp184, Lys28-Lys29, Lys32-Phe33, Lys99-Glu100, Lys105-His106, Lys113-Tyr114, Lys169-Val170, Lys176-Ala177 (n=9). 

Отдельная группа экспериментов (раздел 2.4) посвящена гидролизу в реакторе открытого типа, моделирующем in vitro панкреатическую стадию пищеварения. В диализном мешке в качестве субстрата находилась смесь пептидов, полученная пепсиновым гидролизом пищевого белка, и панкреатин. Экспериментальная установка по гидролизу панкреатическими ферментами была предложена Савуа и Гаутье (Университет Лаваля, Квебек, Канада)1. Отобранные пробы представляли собой продукты гидролиза с молекулярной массой меньше 1000, вымытые из диализного мешка потоком буфера в разные моменты времени. После полного кислотного гидролиза проводили аминокислотный  анализ отобранных проб. Накопление каждой аминокислоты i (1i<16, число анализируемых аминокислот) в составе низкомолекулярной фракции продуктов гидролиза определялось по нарастанию величины Di=(содержание i -ой аминокислоты в диализате) / (содержание  той же аминокислоты в белке). Показано, что выход из реактора специфичных для трипсина и химотрипсина аргининовых, лизиновых, тирозиновых и фенилаланиновых остатков опережал выход других аминокислотных остатков. Относительная константа скорости ki, характеризующая обогащение низкомолекулярной фракции аминокислотными остатками i, определялась с помощью выражения:

,                                                                                        (5)

где D=Diwi, а wi –молярная доля аминокислотных остатков i в белковом субстрате. 

Сравнительный анализ проводился для пепсиновых гидролизатов суммарного казеина (СК) и относительно более маскированного изолята белков рапса (ИБР). Статистический анализ был применен ко всему массиву экспериментальных данных, полученных с различными отношениями E/S и временами отбора проб.

Для более маскированного субстрата наблюдалось более узкое распределение функции распределения вероятности для констант ki (Рис.6). Для демаскированного субстрата СК специфичные связи гидролизуются с максимально возможной скоростью, отсюда и широкое распределение P(ki) для казеинового субстрата.  С этим согласуются данные по разности констант обогащения низкомолекулярных фракций специфичными (Arg, Lys, Tyr, Phe) и неспецифичными аминокислотными остатками.

Кроме субстратов СК и ИБР анализ кинетики протеолиза панкреатином в реакторе открытого типа был выполнен для пепсиновых гидролизатов нативного β-лактоглобулина, препарата сывороточных белков молока и препарата термически обработанных сывороточных белков молока. 

Таким образом, в главе 2 предложена общая физико-химическая модель протеолиза, позволяющая анализировать кинетику во всем диапазоне изменения степени гидролиза пептидных связей с помощью одних и тех же уравнений для произвольных фермент-субстратных пар. Показано, что кинетика протеолиза в случае суммарной кинетики и кинетики образования индивидуальных продуктов соответствует двухстадийной схеме, где первая кинетически значимая стадия представляет демаскирование пептидной связи, а вторя стадия соответствует гидролизу. Таким образом, перспективной представляется модель согласно которой имеется «резервуар» пептидных связей, которые демаскируются в ходе протеолиза и поступают в сферу реакции. Эта модель оказалась подходящей для описания протеолиза как глобулярных белков, так и относительно подвижных казеиновых полипептидных цепей.

Глава 3 посвящена описанию принципов компьютерного моделирования, заложенных нами при разработке пакета компьютерных программ, а также описанию результатов моделирования конкретных примеров протеолиза, описанных в главе 2.

В разделе 3.1 описывается пакет компьютерных программ, и демонстрируются его возможности.

Уравнения, описывающие гидролиз пептидных связей, имеют вид:

                                                                                                       (6)

Здесь N(i, j) – концентрация фрагментов (i, j), имеющих i-ый номер N-конца (N – конец фрагмента образован гидролизом i-ой пептидной связи) и длиной j аминокислотных остатков (i изменяется от 0 до N-1, j изменяется от 1, причем i+jN), k0(i, j, l) – обозначает константу скорости второго порядка гидролиза пептидной связи, имеющей номер l,  в фрагменте (i, j), E – концентрация свободного фермента, N – число аминокислотных остатков в исходной полипептидной цепи.

Матрица констант скоростей была представлена в виде:

,                                                                        (7)

где kh(i,l,s) – константа, вычисляемая по инкрементам специфичности f(Rj-4, Rj-3, Rj-2, Rj-1, Rj, Rj+1, Rj+2, Rj+3, Rj+4, Rj+5)=f(Rj-4) f(Rj-3) f(Rj-2) f(Rj-1) f(Rj) f(Rj+1) f(Rj+2) f(Rj+3) f(Rj+4) f(Rj+5), Pd(s) - вероятность того, что  атакуемая пептидная связь является демаскированной, L(i,j,s) – концевая функция, уменьшающая константу скорости для пептидных связей, находящихся близко к концам цепи, i -  номер пептидной связи, гидролиз которой образовал N-конец фрагмента длиной l, s – номер атакуемой пептидной связи.

Уравнение, описывающее демаскирование, имеет вид:

,                                                                                        (8)

где Bm – концентрация маскированных пептидных связей (связей во всей цепи или части цепи), kd - константа скорости демаскирования.

       Уравнениями материального баланса являются (небольшие концентрации субстрата):

Субстрат:        ,                                                                         (9)

Фермент:        ,                                                                (10)

где Ео – общая концентрация фермента, KM(d) - константа Михаэлиса, которая  представляется в виде функциональной зависимости степени гидролиза пептидных связей;  So - общая концентрация субстрата (суммарная концентрация всех аминокислотных остатков во всех компонентах гидролизата).

       Алгоритм вычисления кинетических констант гидролиза пептидных связей в пептиде с произвольной последовательностью аминокислотных остатков по соответствующим инкрементам для аминокислотных остатков был задан по аналогии с подходом, разработанным В.К. Антоновым, А.А. Зинченко и Л.Д. Румшем для пепсина2,3. Специфичность фермента по отношению к атакованной пептидной связи является аддитивной функцией вкладов аминокислотных остатков (максимум 10 остатков), взаимодействующих с сайтами фермента.

(1)

Входные данные:                 (5)

Ео, So, t                Представление результатов

                 в графической форме:

                                                               DH(t), N(i,j)

(2)

Фермент: (4)

{kh},  KM(DH) Вычисления

               (6)

  Cписок основных пептидов - 

продуктов протеолиза

(3) 

Субстрат:

аминокислотная

последователь-

ность,

kd/kh

Рис.7. Блок-схема компьютерной программы PROTEOLYSIS.

База данных, включающая инкременты  для наиболее изученных протеолитических ферментов, входит в программу PROTEOLYSIS. Когда учитывается весь массив информации, константа гидролиза kh вычисляется по 10 переменным:

,                                        (11)

где f( ) – функциональная зависимость, определенная по экспериментальным данным  гидролиза относительно коротких пептидов. Гипотетическое уменьшение размера активного центра фермента было промоделировано путем уменьшения размерности массива данных (например, с 10 до 5).

Главное меню программы PROTEOLYSIS включает следующие опции: HELP, PROTEIN, ENZYME, KINETIC CONDITIONS, SIMULATION, RESULTS, QUIT. На рис. 7 показана блок-схема компьютерной программы PROTEOLYSIS. Пользователь задает фермент из списка, предлагаемого программой, и субстрат (определяет аминокислотную последовательность с помощью специальной процедуры, рис. 7, пункты 2 и 3). Кроме того, пользователь задает начальные концентрации субстрата и фермента, а также время протеолиза (пункт 1). Поскольку параметр демаскирования не определяется автоматически, пользователь должен выбрать то приближение, в котором проводится компьютерное моделирование.

Рис. 8. Главное меню и процедура вычислений при помощи программы PROTEOLYSIS (пункт  меню SIMULATION/RUN).

На рис. 8 показана процедура вычислений (пункт  меню SIMULATION), следующая после определения условий протеолиза (пункт  меню KINETIC CONDITIONS). Перед началом счета необходимо определить приближение, в рамках которого представляется специфичность фермента (первичная или вторичная специфичность, пункт меню SIMULATION / SPECIFICITY). При моделировании в рамках первичной специфичности учитываются только аминокислотные остатки, находящиеся в позиции Р+1.  Этот режим компьютерного моделирования, требующий наименьшего времени вычислений, применяется для грубой оценки результатов протеолиза. В приближении вторичной специфичности учитывается массив данных специфичности согласно уравнению (11).

После численного интегрирования дифференциальных уравнений (6) - (8) с использованием процедуры Рунге - Кутта (рис. 7, пункт 4, SIMULATION / RUN),  программа представляет выходные данные в графической форме (рис. 7, пункт 5, RESULTS). Программа также осуществляет поиск главных компонент гидролизатов в любой момент времени и выводит их список (рис. 7, пункт 6, RESULTS). Предусмотрена возможность файлового способа хранения результатов вычислений  и создание библиотеки данных компьютерного моделирования протеолиза. Программа PROTEOLYSIS написана нами на языке С.

В разделе 3.2 приводятся результаты моделирования гидролиза пепсином - протеолитическим ферментом с хорошо выраженной вторичной специфичностью.  Примеры результатов моделирования представлены на рис. 9 и 10 для пепсинолиза частично демаскированной цепи β-ЛГ. Увеличение степени гидролиза по ходу протеолиза (рис.9) представлено при двух значениях отношения константы скорости демаскирования к константе скорости гидролиза.

Степень гидролиза  d(t)

       Время протеолиза (мин)

Концентрация N(i,j)

       Время протеолиза (мин)

В таблице 5 проведено сравнение сайтов расщепления, определенных экспериментально и предсказанных компьютерным моделированием. Восемь экспериментально определенных сайтов представляют собой сайты, которые были определены в экспериментах по гидролизу пепсином β-лактоглобулина, демаскированного высоким давлением и действием этанола. Эффективность предсказания 50% (четыре из восьми) существенно превышала вероятность угадывания (20/161х100%=12%).

Таблица 5. Влияние размерности активного центра пепсина на результат компьютерного моделирования расщепления пептидных связей β-лактоглобулина.

Сайты расщепления*

Вторичная структура

Результаты компьютерного предсказания при размерности активного центра 3, 5, 10 аминокислотных остатков

3

5

10

Asp(11)-Ile(12)

+

Trp(19)-Tyr(20)

Leu(31)-Leu(32)

+

+

+

Leu(54)-Glu(55)

β

Phe(82)-Lys(83)

β

+

+

Ala(132)-Leu(133)

α

+

+

Leu(147)-Ser(148)

β

Leu(156)-Glu(157)

+

+

* Совпадающие сайты, найденные в экспериментах по пепсиновому гидролизу, частично денатурированного высоким давлением и действием этанола.

В разделе 3.3 приведены данные по компьютерному моделированию протеолиза трипсином и химотрипсином, т.е. ферментами, обладающими в основном первичной специфичностью. Компьютерная программа PROTEOLYSIS была использована для предсказания гидролиза β-казеина трипсином дикого типа при различных предположениях относительно его субстратной специфичности. Было исследовано образование 17 основных пептидов в зависимости от степени гидролиза пептидных связей (таблица 6). Наборы кинетических констант менялись в зависимости от принятых предположений, относительно специфичности фермента. Данные таблицы 6 позволяют проследить, как увеличивается эффективность предсказания при учете более полной информации о специфичности (неспецифичный гидролиз только первичная специфичность первичная + вторичная специфичность демаскирование + первичная + вторичная специфичность).

Таблица 6. Предсказание основных продуктов протеолиза  -казеина трипсином с помощью программы PROTEOLYSIS при различных моделях протекания протеолиза.

DH  DM                       Продукты гидролиза                                         EP

(%)        (%)        моноблочные                        диблочные                 высшие продукты  (%)

                               неспецифичный протеолиз (kArg = kLys)

3.3        41        A, D, E, I, K, L, N        BC, JK, CD, DE, IJ, EF, LN                IJK, BCD, HIJK 20

                               только первичная специфичность (kArg = 6. kLys)

3.4        41        A, D, E, I, K, L, N        BC, CD, DE, EF, HI, JK, LN        BCD, IJK, HIJK  20

4.7        71        A, B, D, E, H, I, K, L, N        CD, DE, EF, HI, IJ, JK        DEF, IJK         13

6.1        65        A, B, D, E, F, H, I, J, K, L, N       CD, DE, EF, HI, IJ                IJK                 17

                               первичная специфичность+вторичная специфичность*

4.2        29        A, D, E, F, I        CD, IJ, DE, KL, LN       BCD, CDE, GHI, HIJ, KLN, GHIJ  25

5.0        35        A, D, E, F, I, J       CD, IJ, DE, HI, KL, LN        CDE, GHI, HIJ, KLN, GHIJ  27

6.1        53        A, D, E, F, I, J, K, L, N        IJ, HI, KL, LN        KLN, GHI, HIJ, GHIJ  25

6.4        65        A, B, C, D, E, F, I, J, K, L, N       IJ, HI, KL, LN                GHI, HIJ         33

       первичная специфичность+вторичная специфичность * + маскирование**

6.3        65        A, B, C, D, E, F, I, J, K, L, N       DE, GH, HI, LN, EF                GHI         67

*Использованы константы скоростей для вторичной специфичности из базы данных программы  PROTEOLYSIS.

**Вероятность демаскирования считалась обратно пропорциональной средней гидрофобности 6 аминокислотных остатков, ближайших к расщепляемой связи.

Число основных компонентов - 17. Моноблочные продукты (A, B, C, F, D, J, E, H, K, N, I, L), диблочные продукты (L-N, D-E, G-H, E-F) и триблочный продукт G-H-I были определены экспериментально (выделены жирным шрифтом, рис.1).

DH - степень гидролиза (число гидролизованных связей / число аминокислотных остатков ·100%) .

DM -процент моноблочных пептидов в гидролизате.

EP - эффективность предсказания (отношение суммы правильно предсказанных диблочных и высших продуктов к общему количеству предсказанных диблочных и высших продуктов.

Из содержания таблицы 6 можно сделать вывод, что набор главных компонентов меняется в ходе протеолиза (от степени гидролиза пептидных связей). Наибольшее количество  предсказанных продуктов протеолиза было когда учитывалась вторичная специфичность и эффект демаскирования пептидных связей. Эффективность предсказания увеличивалась до 67% от уровня 20%.

В аналитическом виде была рассмотрена кинетика демаскирования маскированных пептидных связей и кинетика гидролиза демаскированных связей (индекс j обозначает различный тип пептидных связей, СО группа которых входит в аминокислотный остаток –NHCH(Rj)CO–):

,                                                                                (12)

где kj – константа скорости гидролиза пептидных связей типа j, kd - константа скорости демаскирования, которая считается одинаковой для всех пептидных связей. Зависимость только от одного типа бокового радикала Rj (1j20) показывает, что наше рассмотрение применимо к протеазам, обладающим первичной специфичностью.

Несколько характерных случаев гидролиза химотрипсином были рассмотрены и результаты представлены в виде зависимостей <k> от d (Рис. 11 и 12). В расчетах учтены кинетически значимые различия связей, образованных специфичными остатками  Trp, Tyr, Phe и менее специфичными Leu, Met, Asn и Gln. Для прочих связей считалось, что kj=0. Варьировались параметр m, выражающий начальную степень маскирования, индивидуальные константы и константа демаскирования kd. Величина kd выбиралась с таким расчетом, чтобы параметр демаскирования kd/<kh> был порядка 10, что соответствует экспериментально найденному значению этого параметра для демаскирования гидрофобного С-конца β-казеина при протеолизе трипсином.

Протеолиз α-казеина (рис. 5) близок к случаю, когда большинство пептидных связей изначально демаскировано (рис.11). Протеолиз суммарного казеина (рис. 4) близок к случаю, изображенному на рис. 12, когда начальные концентрации маскированных и демаскированных  связей были соизмеримы (m=0.6). При этом наблюдается заметное замедление, а затем увеличение скорости (вплоть до образования экстремумов) в районе d=2-4%, что было подтверждено экспериментально (рис.4).

Таким образом, в третьей главе описаны принципы компьютерного моделирования протеолиза. Описана программа PROTEOLYSIS, осуществляющая численное интегрирование дифференциальных уравнений, описывающих демаскирование и гидролиз пептидных связей с учетом материального баланса по субстрату и ферменту. Программа позволяет предсказывать кинетику гидролиза с различными параметрами специфичности и маскированности, что позволяет проверять механизмы протеолиза. Программа удовлетворительно предсказывает места  расщепления цепи (сайты) и состав гидролизатов.

Рис. 11. Зависимость усредненной константы скорости гидролиза от d для m=0.05 и  kd=1.1. Отношение kd/kh=32.5(), 23.8(), 13.1 ().

Рис. 12. Зависимость усредненной константы скорости гидролиза от d для m=0.6 и набора индивидуальных констант kTrp=10, kTyr=0.5, kPhe=0.5, kLeu,Met,Asn,Gln=0.003. Отношение kd/kh=3.3(♦), 6.6(), 12.1(),  22(), 55 ().

В четвертой главе описываются наши эксперименты по определению гидратации водных растворов аминокислот, белковых гидролизатов, казеиновых мицелл и синтетических белковоподобных полимеров с помощью метода миллиметровой спектроскопии. Метод миллиметровой спектроскопии сравнивается с методом дифференциальной сканирующей калориметрии, позволяющей оценивать гидратацию по теплоемкостям гидратации.

В разделе 4.1 рассмотрен вариант метода миллиметровой (микроволновой) спектроскопии, основанный на резонансном эффекте. При помощи миллиметровой спектроскопии возможно определить фракцию свободной воды - фракцию молекул H2O, обладающих вращательной подвижностью в соответствии с моделью «ожиданий и перескакиваний». Вращательные движения возможны из-за понижения активационного барьера вращений благодаря взаимодействию молекулы воды с дополнительной молекулой воды, т.е. с  пятой соседней молекулой H2O в тетраэдрической сетке водородных связей. Параметры гидратации были определены по дефициту поглощения (в терминологии Ю.И. Хургина)4, т. е. разнице в поглощении невозмущенной воды и воды в растворе.  Этот дефицит приписывался уменьшению подвижности воды вследствие присутствия растворенной молекулы. Число гидратации N, число связанных молекул воды, было вычислено согласно следующей формуле:

,                                                                               (13)

где С1 - молярная концентрация водной компоненты, C1f  - молярная концентрация свободной воды по данным поглощения миллиметрового излучения, С2 - молярная концентрация растворенного вещества.

Числа гидратации природных α-аминокислот (кроме цистеина), находящихся в форме цвиттерионов  H3N+CHRCOO-, были определены методом миллиметровой спектроскопии при частоте излучения 31ГГц и малой мощности излучения (1мВт), обеспечивающей нетепловой режим измерений (рис. 13). Для аминокислот, известных как гидрофобные (Leu, Ile, Trp, Phe), получаются относительно большие величины N. Это согласуется с фактом, что гидрофобная гидратация сопровождается стабилизацией сетки Н-связей воды в первом гидратном слое гидрофобных групп. Таким образом, микроволновой метод позволял количественно выражать гидрофобность аминокислот, и были все основания полагать, что он мог быть эффективным для регистрации процессов, происходящих при изменении количества неполярных групп, экспонированных в сторону водного окружения.

Рис. 13. Зависимость чисел гидратации N от площади доступной поверхности неполярных групп (2) для цвиттерионов природных α-аминокислот.

Шкала гидрофобности аминокислот по данным миллиметровой спектроскопии устанавливает следующий порядок уменьшения гидрофобности: Ile(8.2),  Leu(7.4), Trp(7.1), Phe(6.5), Val(6.2), Tyr(5.4), Met(3.9), Lys(3.4), Arg(2.5), Thr(2.2), Pro(2.2), Ala(1.9), Gln(1.9), His(1.9), Asp(1.4), Glu(1.4), Ser(0.8), Asn(0.8), Gly(-1.3).

Теплоемкость гидратации ΔCp,h= Cp,2 - Cpg, представляющая собой разность между парциальной мольной теплоемкостью вещества в водном растворе (Сp,2) и мольной теплоемкостью в газовой фазе (Cpg), представлена для цвиттерионов α-аминокислот в таблице 7. Для глицина получено отрицательное значение ΔCp,h (наименьшее среди всех аминокислот), что соответствует данным миллиметровой спектроскопии. Вычисления инкрементов функциональных групп были проведены из данных для цвиттерионов аминокислот (таблица 7), а не модельных незаряженных органических соединений.

Таблица 7. Теплоемкости гидратации (ΔСp,h) цвиттерионов α-аминокислот при 298К.

Амино-кислотаa

R

Сp,2

Дж·моль-1·К-1

ΔСp,h

Дж·моль-1·К-1

Gly

H

35.9

-56.0

Ala

Me

138.3

25.7

Abu

CH2Me

225.9

90.2

Val

CHMe2

303.3

145.7

Leu

CH2CHMe2

387.1

206.5

Ile

CHMeCH2Me

395.6

215.0

Ser

CH2OH

106.1

-19.6

Thr

CHOHMe

205.5

54.6

Asn

CH2CONH2

128.3

-27.9

Gln

CH2CH2CONH2

181.6

2.4

Вклады в гидратацию неполярных и полярных групп, полученные миллиметровой спектроскопией, сравнены с термодинамическими данными, полученными нами для цвиттерионов аминокислот (таблица 8). Оба метода имеют близкую чувствительность по отношению к разным типам гидратации. Установлено, что вклады в гидратацию полярных групп на порядок меньше, чем вклад метиленовой группы. Вклад цвиттерионного фрагмента отрицателен, и по относительной величине сопоставим для обоих методов.

Таблица 8. Вклады в гидратацию различных групп по данным двух методов.

Тип гидратации

Группа

Вклад в гидратацию

Миллиметровая спектроскопия

ДСК

ΔN

ΔN/ΔN (CH2)

ΔCp,h

Дж·моль-1 К-1

ΔCp,h/ΔCp,h (CH2)

Гидрофобная гидратация

CH2

2.6±0.2

1

75±4

1

Гидрофильная гидратация (не ионная)

OH  CONH2

COOH

0.05±0.4

0.02±0.2

-6.5±12

-.09±.1

Гидрофильная гидратация  (ионная)

CH(N+H3)COO-

-3.4±1.2

-1.3±0.5

-119±11

-1.6±.2

Коэффициенты корреляции индексов гидрофобности для шкал гидрофобности, предложенных к настоящему времени,  невелики (порядка 0.5-0.6). Наша шкала, построенная по данным миллиметровой спектроскопии (шкала 1, таблица 9), и шкала, построенная по теплоемкостям гидратации аминокислот (шкала 2), коррелируют с гораздо более высоким коэффициентом (0.973). Объяснение заключается в том, что обе представленные шкалы гидрофобности основаны на измерениях динамических свойств воды, хотя и на различных уровнях – микроскопическом и макроскопическом.

Таблица 9. Коэффициенты корреляция шкал гидрофобности аминокислот.

 

 

Вращательная подвижность воды по данным миллиметровой спектроскопии

Теплоемкость гидратации по данным ДСК

Растворимость в водно-органических системах (Тэнфорд)

Доступная поверхность аминокислотных остатков в белках  (Чотиа)

1

2

3

4

1

1

0.973

0.69

0.57

2

0.973

1

0.62

0.63

3

0.69

0.62

1

0.42

4

0.57

0.63

0.42

1

В разделе 4.2 на примере циклодекстринов и ароматических аминокислот рассмотрена гидратация ассоциирующих молекул, образующих обратимые комплексы. При конечных концентрациях, используемых в определениях гидратации с помощью миллиметровой спектроскопии (2-100 г/л), перекрывание гидратных оболочек для ассоциирующих растворенных веществ или даже вытеснение воды из области взаимодействия функциональных групп является существенным фактором, изменяющим гидратационные параметры по сравнению с не ассоциирующими растворенными веществами.

Из гидратационных данных (таблица 10) следует, что α-циклодекстрин связывается с Tyr и Phe, поскольку удельное число гидратации n3' существенно меньше чем n3. Доля связанного α-циклодекстрина оказывается равной 0.17 для тирозина и 0.19 для фенилаланина. Эти значения согласуются с величинами, вычисленными из типичной величины константы связывания α-циклодекстрина с ароматическими группами аминокислот. Таким образом, при увеличении концентрации растворенных веществ, склонных к ассоциации, измеренное число гидратации уменьшается.

Таблица 10. Удельные числа гидратации лигандов в системе аминокислота + лиганд и доли связанного лиганда.

Лиганд/аминокислота

Гидратация лиганда в

отсутствие аминокислоты (X2=0), n3, г-1

Гидратация лиганда

в присутствие

аминокислоты (X2=0.107), n3' = n3 - ΔnCM-L/CL0, г-1

Доля связанного лиганда

CM-L/CL0

Глюкоза/ фенилаланин

0.0195

0.0194

0

α-циклодекстрин/ тирозин

0.017

0.0112

0.17

α-циклодекстрин/ фенилаланин

0.017

0.0105

0.19

В разделе 4.3 приведены данные по гидратации белков и  изменению гидратации при ферментативном гидролизе. Зависимость N от площади доступной для воды поверхности глобулярных белков можно считать пропорциональной (рис. 14). Количество связанной воды, выраженной в г связанной воды на г белка, в среднем для изученных глобулярных белков можно оценить как 0.3.

Сопоставление экспериментальных и теоретических значений N для рибонуклеазы и лизоцима, вычисленных по представленным в таблице 8 вкладам в N неполярной группы СН2 (2.6), усредненной полярной группы (около 0) и заряженной пары (-3.4), приведено в таблице 11. Как можно видеть, имеется неплохое согласие вычисленных и экспериментально полученных значений N.

Таблица 11. Вклад в гидратацию глобулярных белков функциональных групп, расположенных на поверхности белков.

Функциональные группы

Вклад данной группы в N

Рибонуклеаза

Лизоцим

Неполярные группы (CH2)

327 (126)а

296 (114)

Полярные группы

0 (97)

0 (103)

Пары заряженных групп

-48 (14)

-31 (9)

Суммарное значение N

Вычисленное значение N

279

  265

Экспериментальное значение N

220

  236

аВ скобках приведены числа функциональных групп на поверхности белков.

Рис. 14.  Зависимость чисел гидратации глобулярных белков от площади доступной поверхности (2). Бычий сывороточный альбумин (1), яичный альбумин (2), пепсин (3),  химотрипсиноген (4), α-химотрипсин (5), трипсин (6), соевый ингибитор трипсина (7), β-лактоглобулин (димер) (8), α-лактальбумин (9), лизоцим (10), рибонуклеаза А (11).

Пример изменения гидратации при протеолизе представлен на рис. 15 для гидролиза трех субстратов трипсином. В начале процесса гидролиза как глобулярных белков (β-лактоглобулина и БСА), так и β-казеина происходит заметное увеличение гидратации. При гидролизе трипсином БСА, β-лактоглобулина и β-казеина максимальное увеличение удельной гидратации составляет 36, 17 и 37% соответственно. При протеолизе глобулярных белков после гидролиза хотя бы одной пептидной связи происходит развертывание глобулы, внутренние пептидные связи становятся доступны воде, что и регистрируется при увеличении гидратации. Явление заметного увеличения гидратации при гидролизе β-казеина согласуется с ролью демаскирования при протеолизе β-казеина, которая была определена нами по кинетике образования продуктов гидролиза (раздел 2.1).

Рис. 15. Изменение удельных чисел гидратации (число гидратации на единицу массы растворенного вещества) при гидролизе трипсином БСА (), β-лактоглобулина () и β-казеина ().

Как известно, при гидролизе всего одной пептидной связи Phe(105)-Met(106) в κ-казеине ренином казеиновая мицелла теряет стабильность, и происходит коагуляция. Однако, это слишком сложная система для одновременного количественного описания протеолиза и изменения гидратации. Для моделирования закономерностей гидратации при агрегации казеиновых мицелл мы использовали агрегацию мицелл, индуцированную медленным закислением глюконовой кислотой (раздел 4.4). Использовались казеиновые мицеллы, восстановленные из обезжиренного молока. Изучали две разновидности мицелл: немодифицированные мицеллы с изоэлектрической точкой около 4.9 и модифицированные мицелы с имобилизованными белками на поверхности. Они  дают значение изоэлектрической точки порядка 5.2.  При уменьшении pH ниже значения 4.8-4.9 (изоэлектрическая точка казеиновых фосфопептидов находится в интервале 4.3-4.2) казеиновые мицеллы в таких растворах агрегируют за счет гидрофобных взаимодействий, что приводит к образованию мягких вязкоупругих гелей. Медленное уменьшение рН вызывалось самопроизвольным гидролизом δ-глюконолактона с образованием D-глюконовой кислоты (рКа =3.56):

                                                       белковая частица  (1 мкм)

казеиновая мицелла (0.05мкм)

 

       

На рис. 16 представлены зависимости динамического модуля упругости и связанной воды от времени гелеобразования для процессов, протекающих при различных скоростях уменьшения рН (различных концентрациях δ-глюконолактона). Чем больше концентрация δ-глюконолактона, тем раньше наступает начало гелеобразования. Взаимосвязано с G'  ведет себя параметр гидратации, увеличиваясь в ходе гелеобразования.

Рис. 16. Зависимости модуля упругости G (Па) и связанной воды (г Н2О/г  препарата·100%) от времени гелеобразования немодифицированных казеиновых мицелл (16%) для процессов, протекающих при различных скоростях уменьшения рН (различных концентрациях δ-глюконолактона). Концентрации δ-глюконолактона: 3.4% (, ); 3% (, ); 2.7% (, ). Температура 43оС. Частота измерений =1 рад с-1.

       С начала гидролиза глюконолактона рН снижается от значения 5.5, поэтому сначала образуются тяжи из модифицированных мицелл. В промежуточной области рН может происходить разрыв геля, образованного модифицированными мицеллами, и замещение его гелем, образованным немодифицированными мицеллами. Поэтому имели место  наблюдаемые нами немонотонные зависимости на графиках увеличения модуля накопления при гелеобразовании.

Эффект стабилизации казеиновых мицелл при добавлении смеси полипептидов был продемонстрирован с помощью описанной выше гелеобразующей системы, включающей агрегацию казеиновых мицелл при гидролизе δ-глюконолактона. Увеличение стабильности системы определялось по увеличению времени, требуемого до достижения точки гелеобразования при неизменной скорости уменьшения рН (рис. 17) или по величинам модуля упругости  G и коэффициента вязкости  , полученных при анализе частотных зависимостей динамических модулей G'(ω) и G''(ω) в рамках модели Максвелла.

Рис. 17. Кинетика гелеобразования при добавлении к казеиновым мицеллам смеси полипептидов. Массовая доля полипептидов: 0 (), 3.6% (), 7.8% () и 10.4% (). Концентрация  δ-глюконолактона 3%, температура 43оС.

Представленные на рис. 18 зависимости показывают, что гидратационные и реологические параметры изменяются согласованно, а их минимумы достигаются в одной и той же концентрационной области. Таким образом, максимум эффекта стабилизации казеиновых мицелл приходится на концентрацию добавленных пептидов порядка 6%.



Рис. 18. Зависимости реологических параметров 10-2·G () и 10-3· (), а также зависимость количества связанной воды в конце выбранного временного интервала гелеобразования () от концентрации добавленных полипептидов (вес полипептидов/вес сухих веществ·100%).

В разделе 4.5 приведены данные по гидратации синтетических полимеров. Величины N, приходящиеся на мономерное звено, представлены на рис. 19 для полиакриламида (ПАМ), полэтиленгликоля (ПЭГ) и термочувствительного поли-N-изопропилакриламида (ПНИПАА):

       ПАМ:                                ПЭГ:                                ПНИПАА:

                                                       

Числа гидратации были интерпретированы как величины, зависящие только от числа неполярных групп и их доступности для воды. Измерения были сделаны при температурах ниже (30оС) и выше (43оС) температуры перехода клубок-глобула для макромолекулы ПНИПАА (около 32оС). Было найдено, что гидратация ПНИПАА различна в чистой воде и в воде с додецилсульфатом натрия (ДСН, 0.375 г/л), что согласуется с данными о чувствительности перехода клубок-глобула к присутствию в растворе ионных детергентов. Выше температуры перехода клубок-глобула, величина N для ПНИПАА в присутствии ДСН была выше, чем для ПНИПАА в чистой воде (рис. 19).

Рис. 19. Зависимость числа гидратации от количества атомов углерода в неполярных группах (на звено) для ПЭГ (), ПАМ(♦), ПНИПАА в воде (  30oC, 43oC), и ПНИПАА с ДСН (  30oC, 43oC). Прямая линия соответствует алифатическим спиртам. Стрелки соответствуют переходу клубок глобула.

Другим примером применения миллиметровой спектроскопии к анализу конформационного состояния полимеров явилось изучение гидратации гидрофобно-модифицированных полиакриламидов и хитозанов, содержащих гидрофобные кластеры, но не способных образовывать глобулы.

Следующие гидрофобно-модифицированные полимеры были использованы в сравнительном анализе:

1. Гидрофобно-модифицированный хитозан (ГМХ)5

2. Сополимер акриламида и додецилметакрилата (АМ/ДДМК)

[-CH2-C(CONH2)H-]x-[-CH2-C(CH3)(COOC12H25]y;6

3. Сополимер акриламида и нонилметакрилата (АМ/НМК)

[-CH2-C(CONH2)H-]x-[-CH2-C(CH3)(COOC9H19]y.

Для различных классов растворенных веществ с различными молекулярными массами и различной степенью доступности их неполярных групп для воды имеет смысл сравнивать удельные величины параметров гидратации n=N'/cнп, где N'=N/ΔN(CH2), ΔN(CH2) – вклад в гидратацию метиленовой группы, cнп - число атомов углерода в неполярных группах.

Изменение n при вариации содержания гидрофобов обнаружено нами в следующих пределах (рис. 20): 0.29-0.21=0.08 (гидрофобно-модифицированные хитозаны), 0.72-0.53=0.19 (сополимеры АМ/НМК), 0.72-0.50=0.22 (сополимеры АМ/ДДМК). Для перехода клубок глобула для ПНИПАА (стрелка на рис. 20) получаем больший диапазон изменения n (0.73-0.29=0.4). Для процесса экспонирования в водное окружение неполярных групп, содержащихся в БСА, получается еще большее значение n0.7 (стрелка на рис. 20). Таким образом, методом миллиметровой спектроскопии показано, что гидрофобная модификация полиакриламидов и хитозанов приводит к меньшей вариации параметра удельной гидратации, чем кооперативные переходы связанные с денатурацией белков  и переходом клубок-глобула для термочувствительного ПНИПАА.

Рис. 20. Зависимость относительного числа гидратации N от числа атомов углерода в неполярных группах в расчете на одно звено. ПАМ и гидрофобно-модифицированный ПАМ: АМ/НМК - , АМ/ДДМК - ; БСА - ; хитозан и гидрофобно-модифицированный хитозан - ; ПНИПАА (клубок) - ; ПНИПАА (глобула) - . Прямая линия соответствует алифатическим спиртам ().

Миллиметровая спектроскопия позволила дифференцировать также различные конформационные состояния сополимеров N-винилкапролактама и N-винилимидазола, полученные при сополимеризации в водной среде при температуре выше точки фазового расслоения полимерной системы.

Таким образом, в четвертой главе описан метод определения параметров гидратации различных соединений с использованием миллиметровой (микроволновой) спектроскопии по эффекту упорядочения структуры воды в гидратной оболочке растворенной молекулы. При протеолизе зарегистрировано увеличение удельной величины связанной воды, что логично, поскольку происходит разворачивание белковой глобулы и увеличение поверхности контакта функциональных групп с водой. Миллиметровая спектроскопия была применена для анализа слипания казеиновых мицелл и образования гелей при медленном самопроизвольном гидролизе δ-глюконолактона, приводящем к снижению рН. Показано, что реологические параметры и  гидратационные параметры ведут себя согласованным образом. Показано, что миллиметровая спектроскопия позволяет контролировать конформацию термочувствительных синтетических полимеров и белковоподобных сополимеров. Таким образом, измерение гидратации является перспективным методом, способствующим пониманию физико-химических закономерностей процессов, протекающих с участием гидрофобных эффектов.

В пятой главе описаны детали оригинальных методик, которые были предложены и использованы специально для решения поставленных в диссертационной работе задач. Среди них: методика определения общей кинетики протеолиза по накоплению аминного азота, определяемого фотометрированием N-тринитрофенильных производных продуктов протеолиза; методика приготовления казеиновых гелей при одновременном определении динамических реологических модулей; методика определения параметров гидратации с помощью миллиметровой резонансной установки, работающей в диапазоне частот 26-37 ГГц.  В разделе 5.2 в качестве примера приведены две подпрограммы, входящие в пакет программы PROTEOLYSIS.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ

1. Впервые предложена общая физико-химическая модель протеолиза, позволяющая анализировать кинетику во всем диапазоне изменения степени гидролиза пептидных связей с помощью одних и тех же уравнений. Показано, что кинетика протеолиза в общем случае соответствует двухстадийной схеме, где первая кинетически значимая стадия представляет демаскирование пептидных связей, а вторая стадия соответствует собственно гидролизу пептидных связей.

2. С использованием ЖХВД на обращенной фазе определены кинетические кривые для отдельных пептидов, образованных гидролизом пептидных связей трипсином. Получены экспериментальные данные по константам скоростей гидролиза доступных и изначально маскированных пептидных связей β-казеина трипсином дикого типа и мутированными формами трипсина.

3. Впервые детально исследовано демаскирование гидрофобного С-концевого  участка при гидролизе β-казеина трипсином дикого типа и мутированными трипсинами. Показано, что наличие кинетики накопления пептидов с лагом связаны с маскированностью пептидных связей. Предложен механизм демаскирования пептидных связей в кластере, образованном гидрофобными участками полипептидной цепи β-казеина.

4. Изучена суммарная кинетика гидролиза всех пептидных связей по поглощению N-тринитрофенильных производных образующихся аминогрупп при гидролизе казеиновых полипептидов химотрипсином. Впервые показано, что немонотонные участки зависимости нарастания аминного азота от степени гидролиза связаны с демаскированием пептидных связей. Экспериментально и  теоретически определены области степени гидролиза, где находятся локальные максимумы скорости.

5. Изучена кинетика гидролиза пептидов в реакторе открытого типа с непрерывным удалением низкомолекулярных продуктов гидролиза. Экспериментально определены константы скорости выхода отдельных аминокислотных остатков в составе низкомолекулярной фракции продуктов гидролиза. Распределение констант скорости было шире для более демаскированного субстрата, и уже - для более маскированного пептидного субстрата.

6. Количественным электрофорезом показано, что кинетика убывания исходной полипептидной цепи соответствует кинетике 1-го порядка по субстрату. Получена оценка для отношения констант скоростей демаскирования и гидролиза пептидных связей глобулярных белков молока.

7. Впервые создана компьютерная программа, осуществляющая численное интегрирование дифференциальных уравнений, описывающих демаскирование и гидролиз пептидных связей с учетом материального баланса по субстрату и ферменту.

8.  Программа PPOTEOLYSIS  удовлетворительно предсказывает места  расщепления цепи (сайты) для протеолитических ферментов. Достоверность предсказания продуктов протеолиза увеличивается при учете сначала вторичной специфичности, а затем и маскирования связей.

9. Разработан метод определения параметров гидратации различных соединений с использованием миллиметровой (микроволновой) спектроскопии по эффекту упорядочения структуры воды в гидратной оболочке растворенной молекулы. Измеряемой величиной  было число гидратации, которое показывает количество молекул воды, потерявших вращательную подвижность из-за взаимодействия с растворенной молекулой.

10. Поскольку метод миллиметровой спектроскопии имеет различную чувствительность к гидрофобной и гидрофильной типам гидратации, нами впервые построена шкала гидрофобности природных α-аминокислот в цвиттерионной форме, т.е. аминокислоты ранжированы в порядке увеличения гидрофобности. Для чисел гидратации и теплоемкостей гидратации было проведено сравнение вкладов в гидратацию, соответствующих гидрофобной гидратации, гидрофильной неионной и гидрофильной ионной типов гидратации. При гидролизе полипептидов и белков зарегистрировано увеличение удельной величины связанной воды.

11. Показано, что для ассоциирующих молекул по данным миллиметровой спектроскопии функциональные группы контактируют, а гидратные оболочки перекрываются с исключением молекул воды. Количественные соотношения для связанной воды рассмотрены в работе на примере ассоциации циклодекстринов с  ароматическими аминокислотами. Миллиметровая спектроскопия была применена для анализа слипания казеиновых мицелл и образования гелей при медленном самопроизвольном гидролизе δ-глюконолактона, приводящем к снижению рН. Показано, что реологические параметры в рамках модели Максвелла и  гидратационные параметры ведут себя согласованным образом. При добавлении в небольших концентрациях полипептидов мицеллы становятся более стабильными. В этом же диапазоне концентраций добавленных полипептидов наблюдается уменьшение концентрации связанной воды.

12. Впервые показано, что миллиметровая спектроскопия позволяет контролировать конформацию термочувствительных синтетических полимеров и белковоподобных сополимеров. Гидратационные изменения при переходах клубок-глобула сравнивали с изменением гидратации при введении гидрофобных групп в гидрофобно-модифицированные полимеры (гидрофобно-модифицированные хитозаны и полиакриламиды). Введение гидрофобных групп в эти полимеры приводит к меньшему изменению связанной воды по сравнению с изменением гидратации при денатурации глобулярных белков (БСА) и переходе клубок-глобула термочувствительного поли-N-изопропилакриламида.

Основное содержание диссертации опубликовано в следующих работах:

  1. Vitt S.V., Vorob'ev M.M., Paskonova E.A., Saporovskaya M.B. HPLC separation and determination of N-trinitrophenil derivatives of amino acids and peptides // J. High Resolution Chromatog. & Chrom. Com. - 1983. - V.6, N3. -  P. 158-159.
  2. Витт С.В., Воробьев М.М., Пасконова Е.А., Сапоровская М.Б., Беликов В.М. Определение N-тринитрофенильных производных аминокислот и пептидов методом ЖХВД // Ж. Аналит. Химии. - 1983. - Т. 38, №8. - С. 1537-1540.
  3. Пасконова Е.А., Воробьев М.М., Витт С.В., Беликов В.М. Установление аминокислотного состава N-тринитрофенильных производных пептидов // Ж. Аналит. Химии. - 1986. - Т. 41, №10. - С. 1895-1897.
  4. Воробьев М.М., Пасконова Е.А., Витт С.В, Беликов В.М. Зависимость свойств хроматографических фракций протосубтилиновых гидролизатов казеина от условий протеолиза // Биотехнология. - 1986. - №4. С. 40-45.
  5. Belikov V.M., Kudinova E.G., Vorob'ev M.M. Kinetic description of proteolysis. Part1. Peptic hydrolysis of proteins from chicken heart: Optimization in terms of time and substrate concentration // Nahrung. - 1986. - V. 30, N5. - P. 501-506.
  6. Vorob'ev M.M., Paskonova E.A., Vitt S.V., Belikov V.M. Kinetic description of proteolysis. Part 2. Substrate regulation of peptide bond demasking and hydrolysis. Liquid chromatography of  hydrolyzates // Nahrung. - 1986. - V. 30, N10. - P. 995-1001.
  7. Vorob'ev M.M., Vitt S.V., Belikov V.M. Kinetic description of proteolysis. Part 3. Total kinetics of peptide bond hydrolysis in peptide mixtures // Nahrung. - 1987. - V. 31, N4. -  P. 331-340.
  8. Vorob'ev M.M., Slobodyanikova L.S., Vitt S.V., Latov V.K., Belikov V.M. Kinetic description of proteolysis. Part 4. Hydrolysis kinetics of partial protein hydrolyzates // Nahrung. - 1987. -  V. 31, N8, - P. 777-782.
  9. Воробьев М.М., Федорова Е.Б., Черноглазова Н.И., Витт С.В., Беликов В.М. Регулирование функциональных свойств белковых гидролизатов // Тезисы докладов всесоюзной конференции «Химия пищевых добавок». 25-27 апреля 1989 г. – Черновцы, 1989. -  С.54.
  10. Хургин Ю.И., Баранов А.А., Воробьев М.М. Гидрофобная гидратация алифатических аминокислот // Изв. АН. Сер. хим. - 1994. - №11. - С. 2031-2033.
  11. Хургин Ю.И., Лебедев О.В., Максарева Е.Ю., Завизион В.А., Кудряшова В.А., Воробьев М.М., Орехова Г.А., Даниленко А.Н. Межмолекулярные взаимодействия в водных растворах мебикара // Изв. АН, Сер. хим. - 1995. - №6. - С. 1178-1179.
  12. Воробьев М.М., Баранов А.А., Беликов В.М., Хургин Ю.И. Исследование гидратации α-аминокислот методом абсорбционной миллиметровой спектроскопии // Изв. АН, Сер. хим., - 1996. - №3. - С. 618-622.
  13. Vorob’ev Computer simulation of hydrolysis kinetics of polymer degradation // International symposium Computer assistance to chemical research, 17-18 December 1996. – Moscow, 1996. - P. 82.
  14. Воробьев М.М., Даниленко А.Н. Оценка гидратации полярных групп α-аминокислот методом дифференциальной сканирующей калориметрии // Изв. АН, Сер. хим. - 1996. - №9. - С. 2237-2242.
  15. Воробьев М.М., Левичева И.Ю., Беликов В.М. Исследование начальной кинетики гидролиза белков молока химотрипсином // Прикл. биохим.  микробиол. – 1996. – Т. 32, №2. - С. 237-241.
  16. Vorob’ev M.M., Parent G., Savoie L. Quantitative comparison of casein and rapeseed proteolysis by pancreatin // Nahrung. - 1996. - V.40, N5. - P. 248-255.
  17. Vorob’ev M.M. The hydrophobicity scale of amino acids as determined by absorption millimeter spectroscopy: Correlation with heat capacities of aqueous solutions // Z. Naturforschung. -  1997. - V. 52c. - P. 227-234.
  18. Vorob’ev M.M. General kinetic model of proteolysis // Nahrung. - 1998. - V. 42, N3/4. - P. 173.
  19. Vorob’ev M.M, Goncharov D.V. Quantitative study of different states of bound water molecules in the hydration shells of peptides and proteins // Nahrung. – 1998. - V.42, N3/4. - P. 177-178.
  20. Vorob’ev M.M., Goncharova I.A. Computer simulation of proteolysis. Peptic hydrolysis of partially demasked β-Lactoglobulin // Nahrung. – 1998. - V. 42, N2. - P. 60-66.
  21. Vorob’ev M.M., Buckin V., Waghorne E. Evaluation of hydrophobicity of milk proteins by absorption millimeter spectroscopy // 13th Conference of the European colloid and interface society, 12-17 September 1999. - Dublin, Ireland, 1999.  - P.91.
  22. Vorob’ev M.M., Dalgalarrondo M., Chobert J.-M., Haertle T. Kinetics of β-casein hydrolysis by wild-type and engineered trypsin // Biopolymers. – 2000. - V. 54. - P. 355-364.
  23. Vorob’ev M.M. Bound water measurements in aqueous systems // 9th Symposium on Food colloids, biopolymers and materials, 14-17 April, 2002. - Wageningen, Netherlands, 2002. - P.37.
  24. Vorob’ev M.M. Water mobility around kosmotropic and chaotropic solutes: Absorption spectroscopy in the millimeter range // Water science for food, health, agriculture and environment.  Z .Berk, R.B. Leslie, P.J. Lillford, & S. Mizrahi (Eds.) Lancaster & Basel: Technomic Publishing, 2001. - P. 59-72.
  25. Vorob’ev M.  Bound water measurements for aqueous protein solutions and food gels // Colloids and Surfaces B. - 2003. - V. 31. - P. 133-140.
  26. Vorob’ev M.M., Faleev N.G. Water ordering measurements in the aqueous polymer systems by waveguide dielectric resonance method // Mendeleev Commun. – 2005. - N6. - P. 259-261.
  27. M.M.Vorob’ev. Free water/bound water measurements in aqueous polymer systems // European polymer congress, 27 June – 1 July 2005. - Moscow, Russia, 2005. - P.99.
  28. Vorob’ev M.M. Monitoring of water ordering in aqueous protein systems // Food Hydrocolloids. – 2007. - V. 21. - P. 309-312.
  29. Vorob’ev M.M. Quantitative comparison of the hydration of proteins with protein-like synthetic polymers by millimeter-wave spectroscopy // 12th European conference on the spectroscopy of biological molecules, 1-6 September, 2007. - Bobigny, France, 2007. - P. 139.
  30. Vorob’ev M., Churochkina N., Khokhlov A., Stepnova E. Hydration characterization of hydrophobically modified polymers by dielectric measurements in the millimeter range // Macromol. Bioscience. – 2007. - V.7. - P. 475-481.
  31. Vorob’ev M.M. Microwave hydration measurements in aqueous systems of proteins and synthetic polymers // XXIX European congress on molecular spectroscopy, 31 August- 5 September, 2008. - Opatija, Croatia, 2008. – P. 187.

1 Savoie L., Gauthier S.F. // J. Food Sci. – 1986. – V.51. – P. 494.

2 Зинченко А.А., Румш Л.Д., Антонов В.К. // Биоорган. химия. - 1997.-Т.3, №12. - С.1663. 

3 Зинченко А.А., Румш Л.Д., Антонов В.К. // Биоорган. химия. -1976.- Т.2, №6. - С. 803.

4 Khurgin Y.I., Kudryashova V.A., Zavizion V.A., Betski O.V. // Advances in Chemical Physics Series, W. Coffey (Ed.). – V. 87. – New York: Wiley, 1994. – P. 483.

5 Babak V.G., Desbrieres J., Tikhonov V.E. // Colloids Surf. A. – 2005. –V.255. – P. 119.

6 Shashkina Y.A., Zaroslov Y.D., Smirnov V.A., Philipova O.E., Khokhlov A.R., Pryakhina T.A., Churochkina N.A. // Polymer. - 2003. – V.44. – P.2289.




© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.