WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

На правах рукописи

ГОДОВИКОВА ТАТЬЯНА СЕРГЕЕВНА

ХИМИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ФОТОАФФИННОЙ МОДИФИКАЦИИ БЕЛКОВ РЕАГЕНТАМИ НА ОСНОВЕ АРОМАТИЧЕСКИХ АЗИДОВ

02.00.10 – биоорганическая химия

Автореферат диссертации на соискание учёной степени доктора химических наук

Новосибирск - 2007 г.

Работа выполнена в Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Научный консультант:

д.х.н., академик РАН Кнорре Дмитрий Георгиевич

Официальные оппоненты:

д.х.н., профессор Лаврик Ольга Ивановна, Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН.

д.х.н., чл.-корр. РАН Донцова Ольга Анатольевна, Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова.

д.х.н. Василевский Сергей Францевич, Институт химической кинетики и горения СО РАН.

Ведущая организация:

Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Защита состоится «19» ____сентября_________2007 г. в_____ часов на заседании диссертационного совета Д 003.045.01 при Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН по адресу: 630090, Новосибирск-90, пр. Лаврентьева,

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН Автореферат разослан « ___ » ______________ 2007 г.

Учёный секретарь диссертационного совета д.х.н. Фёдорова О.С.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Репликация, транскрипция, биосинтез белка протекают с участием сложных надмолекулярных структур, состоящих, в первую очередь, из набора белков и нуклеиновых кислот. Структуру белково-нуклеиновых комплексов изучают как с помощью инструментальных методов, например, рентгеноструктурного анализа (РСА) и спектроскопии ядерного магнитного резонанса (ЯМР), так и методом ковалентного связывания белков с нуклеиновыми кислотами. Существует ряд задач, для решения которых химический метод представляется оптимальным. Так, он позволяет идентифицировать отдельные аминокислотные остатки в белке, сближенные с участком узнавания нуклеиновой кислоты на разных стадиях белково-нуклеинового взаимодействия.

На сегодняшний день существует большое число способов ковалентного присоединения белков к нуклеиновым кислотам. Для аффинной модификации белков используют аналоги нуклеиновых кислот, содержащие различные реакционноспособные группировки в гетероциклических основаниях или углеводном остатке, а также на концевой или межнуклеотидной фосфатных группах. Особое место в арсенале химических реагентов занимают фотоактивируемые аффинные реагенты на основе ароматических азидов. При облучении арилазидная группа, содержащаяся в одной из взаимодействующих молекул, превращается в высокореационноспособную частицу (нитрен), которая может атаковать соседние группы атомов с образованием ковалентной связи между контактирующими партнерами. Идентификация образованного продукта "фотосшивки" позволяет судить о структурной организации белково-нуклеинового комплекса, а также о динамике функционирования системы. В связи с этим, конструирование и синтез фотоактивируемых аффинных реагентов на основе ароматических азидов является одной из приоритетных задач биоорганической химии.

Несмотря на широкое использование арилазидных реагентов в молекулярнобиологических исследованиях, эксперименты по фотоаффинной модификации белков обычно заканчиваются получением данных одно- или двумерного гель-электрофореза с определением белков, по которым прошла модификация. Отсутствие информации о природе образующейся химической связи не всегда позволяет экспериментатору выбрать оптимальный путь и условия для выделения и анализа модифицированных белков. Это приводит к тому, что в случае лабильных связей утрачивается ценная информация об окружении реагентов в области связывания. Кроме того, из-за малой изученности природы продуктов модификации определенных аминокислотных остатков и механизмов их образования, подбор специфического реагента для каждого конкретного случая часто является недостаточно обоснованным. Фотохимические превращения арилазидных реагентов исследованы, как правило, для модельных соединений в неводных средах, т. е. в условиях, далеких от условий проведения фотоаффинной модификации белков и их комплексов. В связи с этим, полученные данные не могут объяснить ряд фактов, свидетельствующих о протекании в водных растворах реакций после прекращения облучения системы.

Таким образом, изучение механизмов фотовзаимодействия реагентов на основе ароматических азидов с функциональными группами белков представляет собой актуальную задачу, поскольку ее решение обеспечит развитие метода фотоаффинной модификации нуклеопротеидных комплексов - перспективного подхода не только для установления структуры и функции биополимеров и их комплексов, но и для направленного воздействия на них.

Цель настоящей работы - установление механизмов фотоиндуцированного взаимодействия арилазидных реагентов с функциональными группами белков и разработка новых подходов к получению фотоаффинных реагентов на основе ароматических азидов, перспективных для структурно-функциональных исследований надмолекулярных комплексов матричного биосинтеза.

Задачи, на решение которых было направлено настоящее исследование:

• изучение фотохимических превращений разного типа ароматических азидов в условиях проведения фотоаффинной модификации биополимеров для выявления возможных вторичных, т. е. «темновых», процессов с их участием;

• установление строения продуктов фотоиндуцированного взаимодействия ароматических азидов с функциональными группами белков;

• дизайн и синтез новых фотоактивируемых аффинных реагентов на основе ароматических азидов, перспективных для решения конкретных молекулярнобиологических задач.

Научная новизна и практическая ценность работы.

В результате настоящей работы оформилось новое научное направление исследования строения продуктов фотоаффинной модификации белков, основанное на получении физико-химических характеристик исследуемого объекта путем последовательного использования конкретных моделей, обеспечивающих пространственное сближение реагирующих группировок - остатка арилазида и бокового радикала аминокислоты.

Результаты, полученные при детальном исследовании процессов фотолиза ароматических азидов в водных растворах, и установление строения продуктов фотоиндуцированного взаимодействия арилазидных реагентов с функциональными группами белков не только проливают свет на механизмы фотоаффинной модификации белков такого типа реагентами, но и представляют несомненную практическую ценность. Они позволяют сформулировать на качественном уровне некоторые зависимости направления фотоиндуцированных реакций арилазидных реагентов от строения субстрата (аминокислотного остатка) и типа заместителей в арильном кольце азида. Это способствует осознанному выбору фотоактивируемой группы при конструировании фотоактивируемого реагента.

В рамках работы разработаны новые подходы к получению фотоаффинных реагентов на основе ароматических азидов для структурно-функциональных исследований надмолекулярных комплексов матричного биосинтеза. Для введения арилазидных группировок по терминальным фосфатам деблокированных олигодезоксирибонуклеотидов впервые использованы цвиттер-ионные производные олигонуклеотидов. С их применением получен ряд новых фотоактивируемых амидофосфатов олигодезоксирибонуклеотидов, несущих п-азидофениламиноалкильную группу, селективную в отношении функциональных групп белков.

Впервые осуществлен ферментативный синтез ДНК-дуплексов, содержащих арилазидные группы в С-5 положении дезоксиуридинов обеих цепей ДНК, благодаря использованию 5-[3-(E)-(4-азидо-2,3,5,6-тетрафторбензамидо)-пропенил-1]-2’дезоксиуридин-5’-трифосфата в качестве фотоактивируемого аналога элонгирующего субстрата в полимеразной цепной реакции с Taq-полимеразой. Это представляет практический интерес, например, для ферментативного синтеза фотоактивируемых ДНК-аптамеров, так как использование такого типа дезоксинуклеозид-5’-трифосфата позволяет исключить стадию пост-селекционной модификации аптамера. Предложено новое направление использования арилазидных ДНК-зондов в методе флуоресцентной гибридизации in situ для фотоиндуцированного маркирования как целой хромосомы, так и ее определенного участка.

Сконструированы новые аналоги инициирующего и элонгирующего субстратов для ферментов матричного синтеза РНК: -амидофосфаты АТР, несущие п-азидофениламиноалкильную группу, и производные UTP, содержащие остаток ароматического азида, присоединенный к С-5 положению гетероцикла через аминоаллильный спейсер. С использованием арилазидных аналогов UTP методом высокоселективного мечения исследован репликативный комплекс вируса клещевого энцефалита, и выявлены неструктурные белки (NS3 и NS5), выполняющие функцию репликаз на разных стадиях развития вирусной инфекции.

Публикации и апробация работы. По теме диссертации опубликовано 23 статьи и обзора. Отдельные части работы докладывались на международных конгрессах и конференциях: «Cytometry», Лейк-Плэйсид, США, 1994; «Nucleosides&Nucleotides», Ла Йолла, США, 1996; на 13 Международном круглом столе «Nucleosides, Nucleotides&Their Biological Applications», Монпелье, Франция, 1998; «Trends in Nucleic Acid Chemistry», Москва, Россия, 2000; Forum of Yong Scientists Protein StructureFunction, Trafficking and Signalling, satellite meeting of the 27th FEBS/PABMB, Ойерас, Португалия, 2001; 27th Meeting of the Federation of European Biochemical Societies, Лиссабон, Португалия, 2001; “RNA as Therapeutic And Genomics Target”, Новосибирск, Россия, 2001; V.I. Voevodsky Conference “Physics and Chemistry of Elementary Chemical Processes”. Новосибирск, Россия, 2002; «Chemical & Biological Problems of Proteomics», Новосибирск, Россия, 2004; Международный форум “Актуальные проблемы современной науки”, Самара, Россия, 2005; «Физико-химическая биология», Новосибирск, Россия, 2006.

Часть материалов диссертации вошла в цикл работ «Ген-направленные биологически-активные вещества - производные олигонуклеотидов: синтез и исследование взаимодействия с нуклеиновыми кислотами», который был удостоен Государственной премии им. Ленинского комсомола 1989 г. в области науки и техники.

Структура и объём работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, изложения результатов и их обсуждения, экспериментальной части, выводов и списка литературы. Работа изложена на 410 страницах, содержит 90 рисунков, 61 схему и таблиц. Библиография включает 505 литературных источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Результаты проведенных исследований изложены в двух разделах диссертационной работы. Порядок появления разделов не связан ни с хронологией, ни с относительной важностью раздела. В разделе 1 представлены результаты исследований по установлению механизмов фотоиндуцированного взаимодействия ряда арилазидных реагентов, в основном, из числа широко используемых для фотоаффинной модификации белков и их комплексов с нуклеиновыми кислотами, с боковыми радикалами аминокислот. Особое внимание уделено проблеме «темновых» процессов при фотоаффинной модификации белков. В разделе 2 описаны подходы к созданию высокоэффективных фотоаффинных реагентов - арилазидных производных нуклеиновых кислот, способных реагировать с определенными типами функциональных групп белков в составе надмолекулярных комплексов.

МЕХАНИЗМЫ ФОТОИНДУЦИРОВАННОГО ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ РЕАГЕНТОВ НА ОСНОВЕ АРОМАТИЧЕСКИХ АЗИДОВ С ФУНКЦИОНАЛЬНЫМИ ГРУППАМИ БЕЛКОВ Специфичность и эффективность модификации функциональных групп биополимеров арилазидными реагентами Сравнительный анализ реакционной способности ароматических азидов по отношению к функциональным группам белков проводили с использованием модельного дуплекса, в котором один из комплементарных олигонуклеотидов был реагентом, а другой - мишенью модификации. У реагента к 5’-концевому фосфату непосредственно или через спейсер была присоединена арилазидная группа. К 3’-концевому фосфату олигонуклеотида-мишени через спейсер был присоединен остаток, имитирующий боковой радикал аминокислоты (схема 1). Образование комплементарного комплекса позволяет сблизить фрагмент аминокислоты с арилазидным остатком на расстояние, сопоставимое с расстоянием между реагирующими центрами при фотоаффинной модификации белков.

о Фотохимические превращения в дуплексах (схема 1), осуществляли при 4 С, облучая реакционную смесь, содержащую производные олигонуклеотидов (10-5 М) в 0,16 М NaCl, 0,02 М Na2HPO4, рН 8,9, светом 300-350 нм. О внутрикомплексном характере всех описываемых ниже реакций свидетельствует то, что при температуре выше Тпл. (35 оС) никаких превращений мишени в процессе облучения не наблюдалось.

После облучения дуплексов (2,5-6 мин) реакционные смеси анализировали с помощью микроколоночной анионообменой хроматографии и/или гель-электрофореза.

Количественное распределение продуктов модификации мишени определяли по денситометрическим профилям дорожек радиоавтографа или путем просчета собранных фракций, соответствующих хроматографическим пикам продуктов внутрикомплексного фотовзаимодействия. Результаты анализа продуктов, образующихся при облучении дуплексов, представлены в табл. 1.

Схема 1.

(а) [32P]-d(GpGpTpApTpC)p МИШЕНИ (1-7) [32P]-d(GpGpTpApTpC)p-AA (8-14) 3' d(ApApCpCpApTpApG)p-ArN3 5' РЕАГЕНТЫ H N (CH2)3 NHO (1) H H N (CH2)3 N C NF H N (CH2)6 NH(8) (2) H NN (CH2)2S-S (CH2)2 NHO (3) H H N N (CH2)3 N C H N CH2 CHNH O2N (9) (4) O H H N (CH2)3 N C CH NHH (CH2)N NArN3 = (5) NHAA = O H (10) H H N (CH2)3 N C CH NHCHH H (6) N (CH2)n N NO H H n = 2 (11) N (CH2)3 N C CHn = 3 (12) n = 4 (13) n = 6 (14) (7) N H Из табл. 1 видно, что образование ковалентного аддукта - продукта сшивки олигонуклеотида-реагента с олигонуклеотидом-мишенью (а) - наблюдается только в случае реагента, несущего п-азидотетрафторбензоильный остаток (8). Ранее [Добриков М.И. и др., 1992], было обнаружено, что фотомодификация нуклеотидных остатков реагентами на основе 5-азидо-2-нитробензойной и 4-азидо-2,3,5,6-тетрафторбензойной кислот вызывает несколько типов повреждения мишени: образование ковалентных продуктов, как щелочестабильных, так и щелочелабильных, и скрытое повреждение мишени, проявляющееся при обработке пиперидином. Для выявления продуктов скрытой модификации мишеней в дуплексах олигонуклеотид-реагент•олигонуклеотидмишень (а) реакционные смеси анализировали после их обработки пиперидином. Как видно из данных табл. 1, фотомодификация мишени реагентом (9) приводит к большей скрытой модификации по сравнению с реагентом (8) (30 % и 5 % соответственно). В то же время, при облучении дуплексов олигонуклеотида (а) с реагентами на основе п-азидоанилина (соединения (10), (11), (13) и (14)) модификации функциональных групп олигонуклеотида-мишени (а) зарегистрировано не было.

Присоединение к 3’-концу олигонуклеотида (а) остатка лизина (соединение (5)) или фрагмента, моделирующего его боковой радикал, – остатка 1,3-диаминопропана (соединение (1)), а также остатков ароматических аминокислот (соединения (6) и (7)), в большинстве случаев вызывает заметное увеличение эффективности модификации мишени (табл. 1). Исключением являются эксперименты по фотоаффинной модификации реагентами (8) и (9) производного олигонуклеотида, несущего остаток цистамина (соединение (3)), где выход ковалентных аддуктов не превышает 26 %.

Возможно, что конформация данных комплементарных комплексов не обеспечивает достаточного для протекания реакции сближения остатка цистина и образующегося в ходе фотолиза арилнитрена.

Таблица Результаты фотоиндуцированной модификации олигонуклеотида (а) и его производных в комплементарном комплексе с арилазидными реагентами Выход продуктов*, (%) реагент (8) (9) (10) (11) (13) (14) мишень А Б А Б А Б А А А (а) 23 0(5**) 0 0(30**) 0 0 (0**) 0 0 (1) 47 24 27 21 17(14***) 30(19***) 44 58 (2) 36 67 (3) 26 0 22 0 63 0 32 68 (4) 24 0 (5) 54 17 46 9 0 39(43***) 57 71 (6) 52 16 39 8 0 51(53***) 16 28 (7) 69 0 11 31 9 0 6 10 *А - ковалентные аддукты; Б - продукты с увеличенной электрофоретической подвижностью;

**степень модификации после обработки пиперидином.

***Эксперименты, в которых Р-меченую мишень добавляли к предварительно облученному п-азидоанилиду олигонуклеотида.

На исследованных модельных дуплексах (схема 1) выявлена некоторая избирательность арилазидных реагентов к различным мишеням. В случае реагента на основе 4-азидо-2,3,5,6-тетрафторбензойной кислоты (8), с достаточно высокой эффективностью модифицируются боковые радикалы ароматических аминокислот.

Существенное количество продуктов сшивки (69 %) наблюдается при облучении реагента (8) с мишенью, несущей индольную группу (7). Такая высокая эффективность модификации может объясняться тем, что в реакции синглетного перфторарилнитрена с индолом достигается максимальное абсолютное значение константы скорости бимолекулярной реакции [Marcinek A., 1994]. Следует отметить, что остаток триптофана является одной из основных мишеней в белках для разного типа арилазидных реагентов [Knorre D.G., Godovikova T.S., 1998].

Для реагентов на основе п-азидоанилина (10) и п-азидофениламиноалкиламина (соединения (11), (13), (14)) наиболее «уязвимыми» мишенями при модификации служат производные олигонуклеотидов, несущие алифатические аминогруппы.

Следует отметить, что основные продукты фотомодификации мишений (1), (5) и (6) реагентом (10) имеют большую электрофоретическую подвижность по сравнению с исходной мишенью, при этом электрофореграммы практически идентичны тем, которые наблюдались в случае, когда мишени добавлялись к предварительно облученному реагенту (10) (табл. 1). Это свидетельствует о том, что при облучении комплексов с реагентом (10) модификация осуществляется п-бензохинониминоимидом олигонуклеотида (15), который может вступать в реакцию с нуклеофилами с образованием продуктов как 1,2-присоединения (16), так и 1,4-присоединения (17) (схема 2, пути а и б, соответственно). При реализации пути а должно происходить отщепление олигонуклеотидного остатка реагента, что будет приводить к образованию продукта (16) с увеличенной электрофоретической подвижностью.

Схема 2.

h N3 NHX NH NX N(15) (10) NH2R' NH2R' (а) (б) NHX H2N NHX HN NHX NH NH NR' H2NX H NHR' R'HN R'HN O (16) (17) P O GATACCAA R' = X = *pGGTATCpNH(CH2)3NH-Lys (или Phe) O При облучении комплексов аминокислотных производных олигонуклеотида (5) и (6) с реагентом (10) было обнаружено, что основной продукт модификации имеет ту же электрофоретическую подвижность, что и соединение (1). Это может рассматриваться как указание на превращение аминокислотных производных олигонуклеотида в амидофосфат (1) в ходе фотомодификации, т. е. на отщепление аминокислотного фрагмента. Масс-спектрометрический анализ образующихся после облучения продуктов также свидетельствует об образовании соединения (1). На спектрах основных продуктов модификации соединений (5) и (6) регистрируется пик с массой 1943,75, что соответствует структуре олигонуклеотидного производного (1). Такое превращение может быть объяснено протеканием реакции модификации по -аминогруппе в олигонуклеотидных мишенях (5) и (6) с образованием производных типа (16) (схема 2, путь а). Последующая атака NHNH NHкислородом карбонильной H+ + H группы аминокислотного O O O O O O H H остатка электрофильного H N C C NH(CH2)3NHP R" N C C NH(CH2)3NHP R" N C C NH(CH2)3NHP R" + OOR' центра фрагмента (16) O- R' R' п-бензохинондиимина с NHNHH2O одновременным разрывом O амидной связи приведет к O + H2N(H2C)3HN P R" O накоплению соединения (1) O- O (1) HN HN NH(CH2)3NHP R" O (схема 3).

OOH R' R' = -CH2Ph, -(CH2)4-NH2 R'' = p*GGTATC R' Схема 3.

Отщепление нуклеотидного фрагмента в ходе модификации исключает возможность использования для радиохимической детекции ковалентных аддуктов радиоактивной метки Р в олигонуклеотидных реагентах и требует синтеза арилазидной группы, меченной 14С или 3Н.

Необходимо отметить, что при конструировании фотореагентов на основе (4-азидофенил)-N-алкиламина должна учитываться природа спейсера, соединяющего арилазидный остаток с олигонуклеотидом. Так, нами было обнаружено, что в ходе облучения реагента (12) возможно расщепление связи между олигонуклеотидом и спейсером, связывающим фотоактивируемую группу с олигонуклеотидом. Среди продуктов фотолиза соединения (12) основным является соединение, время удерживания которого на анионообменной смоле совпадает со временем удерживания исходного олигонуклеотида. Подтверждением разрушения фосфамидной связи при облучении олигонуклеотидных реагентов на основе N-(4-азидофенил)-1,3диаминопропана служат данные Р-ЯМР спектроскопии. После облучения фотореагента (12) интенсивность сигнала алифатического амидофосфата ( = 8,7 м.д.) в спектрах реакционной смеси уменьшается, и регистрируется новый сигнал при = 3,м.д., который соответствует концевой фосфатной группе олигонуклеотида.

Фотоиндуцированные реакции арилазидных реагентов в условиях проведения фотоаффинной модификации белков Серьезная проблема, с которой сталкиваются исследователи при интерпретации данных по фотоаффинной модификации белков реагентами на основе ароматических азидов, связана с наличием вторичных, «темновых», стадий. Ранее, в работе автора [Gall Т.S. (Godovikova), и др., 1983] было показано, что при облучении п-азидоанилина и его нуклеотидных производных в водных растворах накапливаются производные п-бензохинондиимина, которые, являясь электрофильными соединениями, могут взаимодействовать с нуклеофильными группами белков. В настоящей работе исследован процесс фотолиза в водных растворах различных по химической структуре ароматических азидов, и показано, что в ходе облучения некоторых из них образуются продукты, которые могут оказывать определенное воздействие на протекание реакции модификации биополимеров.

Фотоиндуцированные реакции в водном растворе реагентов на основе п-азидоанилина и его N-алкильных производных По данным электронной спектроскопии обнаружено, что в ходе облучения N-(4-азидофенил)-1,4-диаминобутана (18) в водных растворах (рН 9,6) накапливается продукт (19) с характерным h N3 NH (CH2)4 NH2 NH N (CH2)4 NHNспектром в УФ-области (max = (19) (18) H+ 271 нм). При добавлении к продукту фотолиза 1 н. HCl O O H3N (CH2)4 NH3+ образуется соединение, которое (20) Схема 4.

1 по данным электронной, ИК-, Н- и С-ЯМР-спектроскопии соответствует п-бензохинону (20).

Таким образом, данные настоящей работы и ранее полученные автором результаты указывают на то, что при использовании для фотоаффинной модификации белков реагентов на основе п-азидоанилина модифицирующей частицей может быть не только арилнитрен, но и продукты его дальнейшего превращения - соединения с хиноидной структурой. Для выявления участия п-бензохинониминиминиевого производного в процессе фотоаффинной модификации ферментов нами были поставлены эксперименты по модификации РНКазы А и ДНК-полимеразы I продуктами фотолитического разложения -(п-азидоанилида)АТР и -(п-азидоанилида)ТТР, соответственно.

Модификацию ферментов проводили двумя способами. Согласно первому, -(п-азидоанилиды)NТР облучали в присутствии ферментов. Во втором варианте, фотоактивируемые производные NTP предварительно облучали, после чего добавляли в реакционные смеси с ферментами. Как видно из данных, представленных в табл. 2, продукты фотолиза арилазидных производных NTP вызывают потерю ферментативной активности, аналогичную той, которая наблюдается при совместном облучении фермента с фотоактивируемым реагентом.

Таблица Изменение активности ферментов* при облучении их с -(п-азидоанилидом)NТР или при добавлении к ферментам предварительно облученных арилазидных реагентов Фермент Фотоаффинный реагент Активность, % Панкреатическая 10-3 М -(п-азидоанилид)АТР 75 ± рибонуклеаза А Предварительно облученный 70 ± 10-3 М -(п-азидоанилид)АТР 4 10-4 М -(п-азидоанилид)ТТР 78 ± ДНК-полимераза I Предварительно облученный 73 ± 4 10-4 М -(п-азидоанилид)ТТР *За 100 % активности ферментов принимали активность, измеренную в стандартной реакционной смеси в отсутствие реагента Совокупность полученных экспериментальных фактов свидетельствует о том, что при использовании реагентов на основе п-азидоанилина в модификации белков могут принимать участие частицы (п-бензохинондиимин и его производные), время жизни которых значительно превосходит время жизни первичных продуктов фотолиза (арилнитренов). Это, несомненно, необходимо учитывать при анализе данных по фотоаффинной модификации белков такого типа реагентами.

Фотолиз в водных растворах п-азидофенилфосфата (21) По данным Р-ЯМР, в процессе облучения соединения (21) (рН 5,1) сигнал, соответствующий п-азидофенилфосфату ( = –3,7 м. д.), исчезает, и появляется сигнал с химическим сдвигом = 0,27 м. д., характерный для иона фосфата. По данным УФ-спектроскопии, в ходе облучения образуется также соединение, электронный спектр поглощения которого соответствует спектру п-бензохинона (20). Для подтверждения строения продукт фотолиза экстрагировали хлороформом и исследовали с помощью инструментальных методов анализа (табл. 3).

Таблица Сравнительный анализ спектральных характеристик продукта фотолиза (21) (рН 5,1) с литературными данными для п-бензохинона (20) Литературные данные для Метод Экспериментальные данные бензохинона УФ-спектроскопия 246, 256 246 (4,30), 255 (4,23) (CDCl3, , , нм, (lg )) max infl ИК-спектроскопия 1656 1655 (C=O) (KBr, max, cm-1) Н-ЯМР (CDCl3, , ppm) 6,77 (с, H-2, H-3, H-5, H-6) 6,79 (с, H-2, H-3, H-5, H-6) 187,11 (с, C-1, C-4), 187,00 (с, C-1, C-4), С-ЯМР (CDCl3, , ppm) 136,45 (с, C-2, C-3, C-5, C-6) 136,40 (с, C-2, C-3, C-5, C-6) По данным УФ-спектроскопии, в ходе облучения соединения (21) в водном растворе с pH 9,6 наблюдается образование соединения с УФ-спектром, характерным для п-бензохинонмоноимина (22) (max = 254 и 261 нм). Соединение (22) экстрагировали хлороформом, регистрировали Н-ЯМР-спектр. Протону иминогруппы отвечает мультиплетный сигнал в слабом поле ( = 10,77 м. д.). Большое число линий указывает на то, что данный протон взаимодействует с соседними неэквивалентными протонами.

Кроме мультиплета, в спектре регистрируются четыре дублета [1H-ЯМР (CDCl3, , м.

д., J, Гц): 7,27 (д, H-3, 10,2), 6,76 (д, H-5, 9,4), 6,62 (д, H-2, 10,2), 6,46 (д, H-6, 9,4)], которые представляют спиновую систему AMXQ. Такая сложная спиновая система обусловлена ограничением во вращении Схема 5. вокруг N-C-связи. На основании данных Н-ЯМР спектроскопии можно сделать вывод, O O O что из двух возможных резонансных X M 6 структур, представленных на схеме 5, Q A 5 наибольший вклад вносит структура (22), а не N N N цвиттер-ион (22a).

H H H Для доказательства того, что продуктом цвиттер-ион анти- син(22) (22a) фотолиза соединения (21) в водном растворе является п-бензохинонмоноимин (22), был осуществлен встречный синтез данного соединения путем окисления п-аминофенола оксидом серебра в водном растворе.

Спектр Н-ЯМР продукта окисления п-аминофенола, зарегистрированный в хлороформе, соответствует спектру продукта фотолиза соединения (21) в буфере с pH 9,6.

Следует отметить, что в апротонном растворителе (CDCl3) при 25 С возможен медленный переход структуры (22) из син- в анти-конформацию. В случае син-конформации распределение сигналов в олефиновой области H-ЯМР спектра определяется дезэкранированием ядра H-3. Протон H-5 будет экранирован неподелённой электронной парой атома азота, а протоны H-2 и H-6 – неподелённой электронной парой атома кислорода. Спектральные параметры для структуры (22) были определены с помощью двойного гомоядерного резонанса на атомах водорода.

Облучение образца слабым радиочастотным полем на резонансной частоте ядра H-приводит к подавлению спин-спиновых взаимодействий ядра H-2 с ядром H-3, вследствие чего наблюдается исчезновение расщепления сигнала ядра H-2 (дублет превращался в синглет). Непрерывное облучение образца на резонансной частоте ядра H-3 приводит к тому, что происходит насыщение верхнего энергетического уровня этого ядра. В условиях медленного перехода соединения (22) из син- в анти-конформацию с константой скорости около 1 с-1 «насыщенное» ядро H-становится «насыщенным» ядром H-5, в результате чего сигнал от ядра H-5 исчезает из спектра. Подобные изменения в H-ЯМР спектре наблюдали при радиочастотном облучении образца на резонансных частотах протонов H-2, H-5 и H-6.

Таким образом, полученные результаты в совокупности свидетельствуют о том, что при облучении п-азидофенилфосфата (21) в водных растворах образуется п-бензохинонмоноимин (22), который в силу своей неустойчивости претерпевает дальнейшее превращение в п-бензохинон (20) (схема 6).

Схема 6.

N3 N NH O O h H2O 2H2O O P N2 NH4H2POO OH (24) O O O O (20) (22) O P O O P O O O (21) H2N CH COO (CH2)NHH2N CH COO OOC CH NH PO32(CH2)4 (CH2)HN PO32- NH(23a) (23) Фотопревращение п-азидофенилфосфата при его облучении в присутствии лизина По данным 31Р-ЯМР-спектроскопии, после облучения соединения (21) в 1 М растворе лизина (рН 9,6) был зарегистрирован сигнал с химическим сдвигом 9,37 м. д. Смещение сигнала исходного фосфомоноэфира ( = -3,7 м. д.) в слабое поле указывает на превращение его в алифатический амидофосфат. Зарегистрированный сигнал с химическим сдвигом = 9,37 м. д. может соответствовать - (23а) или -амидофосфату лизина (23) (см. схему 6). Поскольку арилнитрены не способны образовывать амидофосфаты, можно сделать вывод, что при фотолизе п-азидофенилфосфата образуется реакционноспособное фосфорилирующие соединение, которое модифицирует функциональную группу лизина. На роль этого соединения может претендовать метафосфат (24) (схема 6).

Одновременное образование фосфорилирующего соединения и п-бензохинонмоноимина при облучении реагентов на основе п-азидофенилфосфата выделяет эти фотоактивируемые производные из ряда других арилазидных реагентов.

С одной стороны, это фотовключаемые фосфорилирующие реагенты, которые могут обеспечить модификацию аминокислотных остатков, непосредственно контактирующих с фосфатной группой субстрата. С другой стороны, элиминирование реакционноспособного в отношении нуклеофильных центров п-бензохинонмоноимина позволяет рассматривать исследуемый арилазид как фотовключаемый бифункциональный реагент.

Фотоиндуцированные реакции п-нитрозамещенных арилазидов в водных растворах Облучение 3-аминопропиламида 5-азидо-2-нитробензойной кислоты (25) в водных растворах приводит к накоплению трех основных продуктов фотолиза:

N-(5-амино-2-нитробензоил)-1,3-диаминопропана (26), N-(2,5-динитробензоил)-1,3диаминопропана (27) и соединения (28), которое элюируется с обращенной фазы при более высокой концентрации ацетонитрила по сравнению с другими продуктами фотолиза. Было обнаружено, что при насыщении облучаемого раствора кислородом выход соединения (28) увеличивается. На основании данных 1Н-ЯМР (табл. 4), этому соединению может быть приписана структура N-(3-аминопропил)-5-{3-(3аминопропилкарбамоил)-4-[3-(3-амино-пропилкарбамоил)-4-нитрофенил-NNOазокси]фенил-ONN-азокси}-2-нитробенз-амида (28) (схема 7). Строение соединения (28) подтверждено данными С-ЯМР и MALDI-TOF-масс-спектрометрии. В MALDI масс-спектре продукта фотолиза (28) наблюдается пик с m/z 959,25, соответствующий иону этого соединения с дополнительно присоединенными двумя молекулами трифторацетата и ионом натрия, т. е. [M(28) + 2 CF3COO- + Na]+. Трифторацетат в составе соединения выявляется также F-ЯМР-спектроскопией. Появление его в качестве противоиона протонированного аминоспейсера обусловлено использованием раствора трифторуксусной кислоты в качестве элюента в процессе хроматографического разделения продуктов фотолиза арилазида (25).

Таблица Данные 1H-ЯМР для соединения (28) (DMSO-d6, , м. д., J, Гц) J, Гц д, 9,0 дд 9,0, 2,4 д, 2,4 М м м т, 6,0 т, 6,0 т, 6,(Н), 3 8,34 4 8,56 6 8,47 8, 8’ 9, 9’ 10, 10’ NH NH’ NH” 3’ 8,33 4’ 8,29 6’ 8,13 и 8” и 9” и 10” 9,04 8,99 8,, м.д.

3” 8,26 4” 8,22 6” 8,11 3,37 1,83 2,8 9 8" 9" 10" 8' 9' 10' До настоящего времени продукты CHCH2 CH2 NH3 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CHфотолиза (26) и (27) (схема 8) NH NH NH3 NH NH7"C O рассматривались как результат 7 C O 7' C O 6' 6" 1 1" 1' превращения триплетного O2N N N N N NO5' 2' 5" 2" 5 арилнитрена (схема 8, путь а).

O O 3 4' 3' 4" 3" Появление динитропроизводного (27) (28) Схема 7.

объясняли либо непосредственным взаимодействием триплетного нитрена с кислородом, либо через окисление образующегося предшественника - нитрозосоединения (29). Ниже, на схеме 8, суммированы все пути, по которым могут протекать в водных растворах фотоиндуцированные реакции реагентов на основе п-нитрозамещенных фенилазидов. На роль предшественника всех выявленных продуктов фотолиза нами впервые предлагается п-нитрозамещенный N-арилгидроксиламин (30) - продукт взаимодействия арилнитрена с молекулой воды (схема 8, путь б).

1 hv a R N3 R N R NH2 R N N R R N + - N(26) (32) Oa (27) H2O 2 R N O O б a OOOR N O R NOR NH OH б (29) (27) (30) R N диспропорб R N N R ционирование O (31) (26) + (29) O R = NO2 R' = C NH(CH2)3NH2 (25) R N N R R' = H (33) R' (32) Схема 8.

Ароматические N-замещенные гидроксиламины очень чувствительны к окислителям;

в водном растворе при действии кислорода воздуха они довольно быстро превращаются в азоксисоединения (31). Последние являются продуктами конденсации исходного N-арилгидроксиламина (30) с продуктом его окисления - нитрозосоединением (29). Другой, независимый от кислорода, путь образования нитрозосоединения - реакция диспропорционирования N-арилгидроксиламина. Из всех возможных химических процессов, протекающих с участием N-арилгидроксиламинов, именно окисление кислородом воздуха и диспропорционирование представляют наибольший интерес с точки зрения метода фотоаффинной модификации. В обоих случаях может образоваться реакционноспособное в отношении функциональных групп белков нитрозосоединение (29) (схема 8, путь б).

При облучении водного раствора п-нитрофенилазида (33) в присутствии 30 % метанола (рН 8) нам удалось зарегистрировать образование N-(п-нитрофенил)гидроксиламина (30) (R’ = H). В ходе фотолиза наблюдалось образование соединения, электронный спектр поглощения которого был аналогичен описанному в литературе для N-(п-нитрофенил)-гидроксиламина (max = 357 нм).

Выделение и идентификация N-арилгидроксиламинов затруднительны из-за неустойчивости соединений в водных растворах. Образование N-арилгидроксиламина (30) в ходе облучения 4-нитрофенилазида в водных растворах было подтверждено реакцией азоксисочетания продукта фотолиза с 1-нитрозо-4-нитробензолом (29) (R’ = H). Для того чтобы исключить влияние кислорода, фотолиз п-нитрофенилазида (33) в присутствии «ловушки» - 1-нитрозо-4-нитробензола - проводили в атмосфере аргона.

Предварительно было показано, что в условиях облучения нитрозосоединение устойчиво. Было обнаружено, что с увеличением дозы облучения, молярный коэффициент экстинции в области максимального поглощения 1-нитрозо-4-нитробензола (max = 282 нм) падает. Это указывает на вовлечение нитрозосоединения в реакцию. Образующееся при этом соединение было выделено и идентифицировано нами как 4,4'-динитроазоксибензол (31) (R’ = H).

Дополнительно мы исследовали взаимодействие 1-нитрозо-4-нитробензола с предоблучённым азидом (33) (табл. 5). Как видно из данных табл. 5, с повышением концентрации 1-нитрозо-4-нитробензола выход 4,4'-динитроазоксибензола увеличивается симбатно. Это еще раз свидетельствует о том, что при облучении п-нитрозамещённых арилазидов в водных растворах в качестве активного промежуточного соединения может образоваться N-арилгидроксиламин.

Таблица Зависимость выхода 4,4'-динитроазоксибензола (31) от соотношения п-нитрофенилазид (33)/1-нитрозо-4-нитробензол (29) Соотношение концентрации В отсутствие (29) 3,6 / 1 0,7 / соединений (33) / (29) *Выход соединения (31), % 15 31 * – Выход оценен как молярный эквивалент относительно исходного количества 1-нитрозо-4-нитробензола.

Характер конечных продуктов реакции диспропорционирования N-арилгидроксиламинов будет определяться рядом факторов. Известно, что диспропорционированию способствует формирование комплекса с переносом заряда.

Для N-арилгидроксиламинов с таким заместителем в пара-положении как нитрогруппа, характерно образование комплексов при рН ~ 10. В случае производного гидроксиламина (30) (R’ = -C(O)NH(CH2)3NH2) в молекуле присутствует аминоспейсер, рКа аминогруппы которого находится в области значения рКа для гидроксигруппы п-нитрозамещенного гидроксиламина (рКа = 10,2). Это может способствовать смещению равновесия в сторону образования цвиттер-иона гидроксиламина - соединения (30а) (схема 9).

Взаимодействие соединения (30а) с электронодефицитным нитрозосоединением (29) приведет к формированию комплекса с переносом заряда. В результате восстановления нитрогруппы в реакционной смеси будет появляться 2,5-динитрозопроизводное (34).

Как было отмечено выше, для нитрозосоединений характерно вступать в реакции с N-арилгидроксиламинами с образованием азоксисоединений. Вероятно, тример (28) является продуктом азоксисочетания динитрозопроизводного (34) с двумя молекулами N-арилгидроксиламина (30) (cхема 9). Появление среди основных продуктов фотолиза «тримера» (28) при практическом отсутствии димерного азоксисоединения (31) - продукта азоксисочетания нитрозосоединения (29) c гидроксиламином (30) - обусловлено, вероятно, тем, что динитрозопроизводное (34) обладает большей реакционной способностью в реакции азоксисочетания, чем мононитрозосоединение (29).

O O N O CO HN( CH2)3NH3+ NH OH O N N+ O HN NOO CO NH(CH2)3NH3+ CO NH(CH2)3NH3+ N O + H3N( CH2)3NH OC (29) NO(30a) H+ OH H + O N N O O N NO2 O N N O N NOO CO NH(CH2)3NH3+ CO NH(CH2)3NH3+ CO NH(CH2)3NH+ CO NH(CH2)3NH3+ (34) (30) Схема 9.

(28) Совокупность полученных нами результатов указывает на то, что при облучении фотоаффинных реагентов на основе п-нитрозамещенных арилазидов могут образоваться долгоживущие химически активные соединения - нитрозосоединения. В связи с высокой реакционной способностью данных продуктов фотолиза повышается вероятность протекания вторичных, т. е. «темновых» процессов. Исследования темновых процессов с возможным участием продуктов фотолиза п-нитрозамещенных арилазидов представлены в разделе «Продукты фотоиндуцированного взаимодействия функциональных групп белков с реагентами на основе ароматических азидов».

Фотохимическое превращение перфторированного ароматического азида в водном растворе Исследование фотопревращения перфтоарилазидных реагентов в водном растворе проводили на примере облучения раствора 4-азидо-2,3,5,6-тетрафторбензойной 3 кислоты (35). На основании данных O O h инструментальных методов анализа F N3 F H2N O- -NO- был сделан вывод, что основным 5 (36) (35) Схема 10.

продуктом, образующимся в ходе облучения перфторарилазида (35), является 4-амино-2,3,5,6-тетрафторбензойная кислота (36) (схема 10). Электронный спектр поглощения продукта фотолиза соответствует спектру п-аминоперфторбензойной кислоты (мах = 287 нм). В С-ЯМР спектре соединения (36), записанном в CD3CN, наблюдаются семь сигналов, характерных для 4-амино-2,3,5,6-тетрафторбензойной кислоты. Слабопольный сигнал при = 161,9 м. д.

соответствует сильно дезэкранированному атому углерода С-7 карбоксильной группы.

Далее последовательно располагаются в спектрах две группы пиков углеродов С-2, С-и С-3, С-5. Этим четырем атомам соответствует четыре сигнала: [13С-ЯМР (D2O, , м.

д.): 145,9 (С-2), 149,5 (С-6), 135,6 (С-3), 138,1 (С-5)]. В этой группе распределение сигналов подвергается влиянию заместителей в ароматической системе аналогично сигналам атомов углерода, непосредственно связанных с заместителями. Более сильное смещение в сторону слабого поля сигналов С-2 и С-6 объясняется вицинальным положением соответствующих атомов углерода относительно карбоксильной группы.

Сигнал при = 132,1 м. д. соответствует атому углерода С-1, а сигнал при = 98,7 м.д.

– углероду С-4.

Магнитная неэквивалентность атомов углерода в 2 и 6, 3 и 5 положениях соединения (36), вероятно, вызвана неэквивалентностью атомов фтора. В то время как 4-азидо-2,3,5,6-тетрафторбензоильный остаток, с точки зрения спин-спинового взаимодействия ядер фтора, представляет собой типичную AA’XX’ систему, в 19F-ЯМР спектре продукта фотолиза (36) регистрируются два мультиплетных сигнала - = 19,м. д. (м, 2F, F-2, F-6) и = -1,5 м. д. (м, 2F, F-3, F-5) с равной интенсивностью.

Магнитная неэквивалентность атомов углерода в 2 и 6, 3 и 5 положениях в 4-амино-2,3,5,6-тетрафторбензойной кислоте, очевидно, обусловлена наличием в кольце такого заместителя как аминогруппа. Возможно, присутствие в составе молекулы продукта фотолиза функциональной группы, способной к образованию водородной связи, и такого электроотрицательного атома как фтор будет способствовать образованию внутримолекулярной водородной связи. Это, в свою очередь, приведет к неэквивалентности углеродов в орто- и орто’-положениях в связи с тем, что один из них будет связан с фтором, принимающим участие в образовании водородной связи с аминогруппой.

Таким образом, нами обнаружено, что в отличие от всех остальных исследованных в рамках настоящей работы ароматических азидов, фотохимические превращения перфторарилазида в водной среде сходны с описанными реакциями в органических растворителях. Отличительным свойством перфторированных ароматических азидов является их способность с высокой эффективностью образовывать ковалентные аддукты с углеводородными и ароматическими молекулами при облучении в апротонной среде. В экспериментах на модельном дуплексе нами была продемонстрирована высокая эффективность фотомодификации боковых радикалов ароматических аминокислот такого типа реагентами (см. данные табл. 1). В связи с этим, можно полагать, что использование перфторарилазидов в качестве функциональных групп фотоаффинных реагентов обеспечит высокую эффективность образования фотосшивок, по крайней мере, к гидрофобным участкам белков и гетероциклическим основаниям нуклеиновых кислот.

Продукты фотоиндуцированного взаимодействия функциональных групп белков с реагентами на основе ароматических азидов Для установления строения продуктов фотомодификации аминокислотных остатков нами предложен общий методический подход, в котором такая ключевая черта фотоаффинной модификации как протекание реакции в условиях сближения реакционных центров воспроизведена на простых модельных системах, а именно:

1) аффинный комплекс - стрептавидин•фотоактивируемый аналог биотина;

2) соединения, в которых аминокислотный остаток сближен при помощи линкера с арилазидной группой на расстояние, сопоставимое с расстоянием между реагирующими группами при фотоаффинной модификации белка.

Общая стратегия определения структуры продуктов фотомодификации функциональных групп белков представлена на схеме 11.

Схема 11.

O HN NH Фотобиотин CH2 CH2 CHCHS -C O (K =10 M) d Комплекс ArN3 NH (CH2)n NH стрептавидинфотобиотин h 1.

Структура продукта 2.

Протеиназа фотомодификации Модифицированный Гидролизат пептид ЯМР-, ИК-, УФ-, MALDIмасс-спектроскопия h УФ-, MALDI-масс- Анализ последовательности Спейсер спектроскопия методом Эдмана Аминокислотный ArNостаток Модельное Модифицированный соединение аминокислотный остаток Выбор для фотоаффинной модификации стрептавидина в качестве белковой мишени обусловлен тем, что этот белок характеризуется экстремально высоким сродством к биотину (Ка = 1014 М-1). Прочное связывание реагента (производное биотина, содержащее остаток арилазида) с объектом модификации (стрептавидин) позволяет ограничить область модификации функциональных групп белка в пределах участка связывания лиганда. Сочетание «селективного» фотоаффинного мечения белка в составе модели стрептавидин•фотоаналог биотина с использованием высокочувствительных методов структурного анализа пептидов позволяет решить вопрос о природе модифицированной аминокислоты и получить минимальный набор спектральных данных для модифицированного пептида (УФ, MALDI-TOF МS).

Задачей следующего этапа является создание с помощью методов синтетической органической химии «миниатюрной» модели, в которой увеличивается вероятность возникновения благоприятной взаимной ориентации реагирующих групп.

Низкомолекулярная модель лишена макромолекулярного пептидного остова. В то же время, она состоит из сближенных при помощи линкера ароматического азида и аминокислотного остатка, аналогичного тому, который подвергается модификации в белке. Данная модель должна обеспечить получение продуктов фотовзаимодействия ароматического азида с аминокислотным остатком в количествах, достаточных для их анализа с помощью стандартного набора инструментальных методов исследования (УФ, ЯМР, MS).

Разработка общего методического подхода к изучению продуктов фотоаффинной модификации белков и демонстрация первых результатов по использованию предложенных моделей для установления строения продуктов фотовзаимодействия арилазидных реагентов с функциональными группами белков были проведены нами на примере реагентов на основе 5-азидо-2-нитробензойной кислоты. Выбор такого типа арилазида в качестве объекта исследования обусловлен тем, что присутствие в молекуле реагента такой хромофорной группы как -NO2 облегчает детекцию модифицированного белка и пептидов при их выделении с целью последующего анализа.

Фотовзаимодействие и "темновые" реакции фотоактивируемых аналогов биотина с активным центром стрептавидина Возможность участия в модификации белков долгоживущих интермедиатов, генерируемых при облучении реагентов, несущих 5-азидо-2-нитробензоильную группу, исследовалась нами на примере фотоиндуцируемой аффинной модификации стрептавидина фотоактивируемыми аналогами биотина (37), (38) и (39) (схема 12).

Схема 12.

O 3" HN NH O2N 4" 2" O 1 1"a 1"e CH2 CH2 NH C R NH C CH2 CH2 CH2 CH2 5" S R= N10" 9" 7" 6" 2' 1' 8" O 6" (37) O2N 4 O2N 1 1 CH2 CH2 CH2 NH C N3 CH2 CH2 CH2 CH2 NH C N3' 2' 1' O ' 2' 1' 3' 4 O (38) (39) В экспериментах мольное отношение лиганд/белок составляло 4:1. В табл. приведены данные хроматографического разделения протеиназного гидролизата стрептавидина, модифицированного фотобиотином (37) при различных условиях проведения реакции. Видно, что как в случае реакционной смеси с облучённым комплексом стрептавидин•фотобиотин (37) (реакционная смесь I), так и при модификации стрептавидина продуктами фотолитического разложения (37) (реакционная смесь II) образуются модифицированные пептиды, время удерживания которых на смоле с обращенной фазой практически совпадает (фракция 3).

Таблица Данные хроматографического разделения протеиназного гидролизата стрептавидина, модифицированного фотобиотином (37) при различных условиях проведения реакции № реакц. Облучение Облучение Хроматографические данные ** смеси. фотобиотина реакц. смеси (время удерживания, мин) I — 40 с 6,97 (1), 11,72 (3) II 40 с — 6,74 (1), 9,42 (2), 11,69 (3) Контрольный эксперимент* 6,83 (1), 9,42 (2) * — облучённый фотоаналог биотина, ** — детекция при = 360 нм В ходе аналогичных экспериментов, проведенных с использованием в качестве лиганда фотоаналогов биотина (38) и (39), получается более сложный набор модифицированных пептидов (данные не приведены), но анализ соответствующих хроматографических данных также свидетельствует о протекании «темновой» стадии модификации.

Представленные выше результаты указывают на то, что при использовании реагентов на основе 5-азидо-2-нитробензойной кислоты частицей, модифицирующей белок, может быть не арилнитрен, как считали ранее, а продукт его дальнейшего превращения, например, нитрозосоединение. Его предшественником, как было описано выше, может быть N-арилгидроксиламин, который образуется в качестве промежуточного активного соединения при облучении п-нитрозамещённого арилазида в водном растворе (схема 8). Однако представленные ниже данные электронной спектроскопии указывают на то, что судьба арилнитрена, генерируемого в ходе облучения фотоактивируемых аналогов биотина, будет определяться размером спейсера, связывающего биотиновый остаток с арилазидной группой. Так, характер изменений в спектрах поглощения при фотолизе соединения (37) (рис. 1, а) аналогичен изменениям в спектрах поглощения, наблюдаемых при облучении фотобиотина (39) (данные не представлены). В то же время, при регистрации спектров продуктов фотолиза фотобиотина (38) наблюдаются отличительные особенности (рис. 1, сравни а и б).

1,0 1,б a 0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,200 300 400 500 600 7200 300 400 500 600 7, нм.

, нм Рис. 1. Изменения электронных спектров поглощения 0,5 мM водно-спиртовых растворов (% MeOH) фотоаналогов биотина (37) (а) и (38) (б), при облучении в течение 0 с (+ + +), 8 с ( ), 16 с (- - -), 24 с ( ), 35 с (- -), 55 с (- - - - -), 75 с (---), 95 с (----), = 313 и 3нм, 0,1 см кварцевая кювета.

Одним из путей превращения арилнитрена, образующегося при фотолизе соединения (37), может быть его внутримолекулярное взаимодействие с биотиновым остатком с образованием, согласно данным 1H-ЯМР (табл. 7), циклического иминосульфурана (40) (схема 13). На преимущественное протекание внутримолекулярной реакции арилнитрена с биотиновым фрагментом также указывает возрастание процентного содержания основного продукта фотолиза (40) при понижении концентрации исходного арилазида (37) в облучаемом водном растворе.

Поглощение, о.е.

Поглощение, о.е.

Таблица Данные 1H-ЯМР для соединений (40) и (41) (CD3CN, , м. д. и J, Гц) (Н) 3, д, 4, дд, 6, д 1е”, дд 1a”, дд 2”, ддд 4”, дд 5”, ддд 8,07 7,19 7,24 4,10 3,96 4,9 4,78 4, (40) J 9,0 9,0, 2,5 2,5 13,2, 6,0 13,2, 3,0 8,0, 6,0, 8,0, 5,5 10,5, 3,0 5,5, 4,7,97 6,70 6,64 2,83 3,24 4,77 4,64 2, (41) J 9,0 9,0, 2,5 2,5 15,0, 6,5 15,0, 1,5 8,5, 6,5, 8,5, 6,0 10,0, 1,5 5,0, 6,Соединение (40) оказалось неустойчивым. Время полупревращения 2,5 мМ водного раствора соединения (40) в единственный продукт - N-(5-амино-2-нитробензоил)-N’-(d(S-оксо)биотинил)-1,2-диаминоэтан (41) - при комнатной температуре составляло 8,суток (схема 13). Строение соединения (41) подтверждено спектральными данными (1Н-ЯМР (табл. 7), С-ЯМР, ИК, МS). В ИК-спектре аминопроизводного (41) наблюдается сильная полоса поглощения при значении волнового числа 1097,9 см-1, что может быть вызвано валентными колебаниями связи S=O. В масс-спектре этого соединения регистрируется сигнал с m/z 437,2, соответствующий иону [M – NO + H]+.

O O O HN NH HN NH HN NH O O O (CH2)S C (CH2)4 (CH2)S C S C h N NH N3 NH N NH -NCHCH2 CHNH CHC NH CH2 NH CHC C NO2 O NO2 O NO2 O (37) O O O 3" 3" HN NH HN NH HN NH 2" 4" 2" 4" 1"a 5" 10" O 7" 8" 9" 1"a 7" 8" 9" 5" O (CH2)1"e S CH2CH2CH2CH2C S C 1"e S S CH2CH2CH2CH6" 6" O NH NH 6" N N C O N 10" 6" NH2 2'CH2 H2O 5 CH6 NH 4 7 1' NH CHC NH CH2 CHC NH CH2 3 C 2' 1' NO2 O 2 O O NONO(40) (41) Схема 13.

При фотолизе соединения (37) не было обнаружено продуктов, характерных для реакций триплетных нитренов. В то же время известно, что диалкилсульфиды часто используются в качестве ловушек синглетных нитренов. Таким образом, можно предполагать, что синглетный арилнитрен, образующийся при фотолизе соединения (37), не претерпевает интеркомбинационного перехода в триплетное состояние, а при создавшихся благоприятных условиях (близко расположенный нуклеофильный центр на биотиновом остатке) взаимодействует с нуклеофильным атомом серы. Однако возможность образования соединения (37) через взаимодействие триплетного нитрена с атомом серы биотинового остатка также нельзя упускать из рассмотрения. Такое взаимодействие может протекать легко за счёт того, что электроноакцепторная нитрогруппа будет способствовать восстановлению нитрена с образованием сульфинимина (40).

Образование продуктов сульфиминовой природы при фотоаффинной модификации белков может привести к снижению выхода ковалентных аддуктов между фотореагентом и белком по трем причинам: 1) за счёт реакции нитрена с компонентами буфера (тиолсодержащими соединениями); 2) за счёт гидролиза ковалентных аддуктов с сульфиминовой связью, образующихся в случае модификации серусодержащих аминокислотных остатков; 3) в связи с возможным образованием ковалентно соединённых между собой участков внутри модифицированного белка за счет реакции активного сульфинимина с нуклеофильным боковым радикалом соседнего аминокислотного остатка.

Анализ модифицированных пептидов. Установление первичной структуры модифицированных пептидов проводилось нами с использованием стрептавидина, модифицированного реагентом (38) или фотобиотином (39). Что касается модификации стрептавидина фотоактивируемым аналогом биотина (37), в этом случае наблюдалось образование ковалентных аддуктов с неустойчивой ковалентной связью. По этой причине данные модифицированные пептиды в рамках настоящей работы не подвергались сиквенс-анализу. В случае реагента (38), для секвенирования по Эдману использовали модифицированный пептид, который, с одной стороны, образуется непосредственно при облучении комплекса стрептавидин•фотоаналог биотина (38), а с другой стороны, является продуктом реакции стрептавидина с долгоживущим интермедиатом, генерируемом при фотолитическом разложении соединения (38).

Индивидуальные пептиды, модифицированные реагентом (38) или (39), были получены в количествах (20-40 нмолей), достаточных как для секвенирования, так и для исследования их с помощью электронной спектроскопии. Смещение максимумов кривой поглощения модифицированных пептидов в длинноволновую часть спектра указывает на присутствие в составе продуктов хромофорной группы реагента (max ~ 385 нм).

Последовательность аминокислотных остатков пептида, выделенного из гидролизата стрептавидина, модифицированного фотоаналогом биотина (38), была определена как Gly(74)Trp*ThrValAlaTrp*LysAsn(81), где Trp* - модифицированный остаток триптофана. В MALDI-масс-спектре продукта регистрируется сигнал с m/z = 1455,1, соответствующий массе иона, образованного пептидным фрагментом с дополнительно присоединенным остатком арилнитрена и двух атомов кислорода. Последовательность аминокислотных остатков пептида, модифицированного фотоактивируемым аналогом биотина (39), была определена как Ser(52)ArgTyr*ValLeu(56), где Tyr* - модифицированный остаток тирозина.

Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что реагенты на основе 5-азидо-2-нитробензойной кислоты проявляют некоторую избирательность по отношению к боковым радикалам ароматических аминокислот. В связи с этим, на следующем этапе нами были сконструированы низкомолекулярные модели, в которых остатки ароматических кислот и 5-азидо-2-нитробензоильная группа были объединены в одной молекуле спейсером определенного размера. Роль последнего заключалась в обеспечении необходимого пространственного сближения двух ароматических фрагментов для реализации атаки арилнитрена по боковому радикалу тирозина или индольному остатку триптофана.

Продукты фотоиндуцированного взаимодействия 5-азидо-2-нитробензоильных реагентов с боковыми радикалами ароматических аминокислот Учитывая результаты компьютерного моделирования, выполненного для нескольких модельных соединений, для решения задачи по установлению строения продуктов фотоиндуцированной модификации функциональных групп тирозина и триптофана мы синтезировали N-{2-[2-амино-3-(4-гидроксифенил)-пропиониламино]-этил}-5-азидо-2нитробензамид (42) и N-{3-[2-амино-3-(Н-индол-3-ил)-пропионил-амино]-пропил}-5азидо-2-нитробензамид (43) (схема 14). Именно в данных модельных соединениях реализуется благоприятная взаимная ориентация реагирующих групп.

NOHO 4" 3" 11" H2 H2 H2 H H 2" 5" C N C C C C C NH3+ 1" 1' 2' 3' O O NO2 6" CH2 10" 5" CH7" N 4"3" O O 6" H2 HH C N C C C NH3+ C 2" H 1' 2' 7" N 9" 8" H 1" 8" N(42) (43) Схема 14.

При анализе методом микроколоночной обращено-фазовой ВЭЖХ реакционных смесей, полученных при облучении соединения (42) в разных условиях, было обнаружено, что присутствие кислорода существенно влияет на набор продуктов фотолитического разложения соединения (42) (табл. 8).

Таблица Распределение продуктов фотолиза соединения (42) в зависимости от условий облучения [(42)], мМ Продукты фотолиза и их относительное содержание*, % (44) (45) (46) (47) (48) (49) (50) 0,062а (н. у.) 12 14 7 13 10 4,5 0,062б (н. у.) 28 13,8 16 10,8 0,062а (О2) 28,6 18,8 2,5 11,7 15,0,062б (О2) 39,6 8,3 29,0,062а и б (Ar) 23,3 15 9,7 32,Примечание. Здесь * - Количество продукта, оцененное интегрированием соответствующего а хроматографического пика. Детекция на = 220 нм. Хроматографические профили получены б сразу после облучения соединения (42). Хроматографические профили получены после выдерживания облученной реакционной смеси в темноте в течение 20 ч при 20 С. Н. у. - нормальные условия.

Электронный спектр поглощения одного из неустойчивых продуктов (соединение (50)), образующихся в присутствии кислорода, (max = 278 нм) близок к электронному спектру поглощения 1-нитро-4-нитрозобензойной кислоты (max = 282 нм).

Устойчивые продукты фотопревращения соединения (42) были получены в количествах, достаточных для их анализа с помощью Н-ЯМР, электронной спектроскопии и MALDI-TOF-масс спектрометрии. Среди продуктов фотолиза были обнаружены соединения (46)-(49), которые, по данным спектроскопии ЯМР на ядрах Н (табл. 9), содержат остаток тирозина, структурно аналогичный остатку тирозина в исходном соединении (42). Это указывает на отсутствие модификации по боковому радикалу аминокислоты. На основании данных инструментальных методов анализа, продуктам фотолиза соединения (42) могут быть приписаны следующие структуры:

амино-(46), нитро-(47), азокси-(48) и азосоединения (49) (схема 15).

Схема 15.

3 O2N NH O2N NH 1 6 OH C O C 4'' O 3'' HN O HN 5'' (42) + H2C 1' 2'' H2C 1'' 2' 6'' H2C H 8'' H2C C CHH HN C CH2 C HN NH3+ 7'' C NH3+ O O (45) (44) (нестабильное) O NAr другие продукты ArNH2 ArNO2 Ar N+ N Ar Ar N N Ar + + + + + (нестабильное) (46) (47) (49) (48) O (50) 8" 6" 5" 5 O 1' 2' O 7" Ar = H C NHCH2CH2NH C C CH2 OH 4" 1 1" NH3+ 3 3" 2" NOПри анализе данных по фотолизу соединения (42) в атмосфере аргона интригующим моментом является образование азоксисоединения (48) (табл. 8). Этот результат не укладывается в рамки предлагаемой до настоящего исследования концепции механизма фотолиза арилазидов. До сих пор образование азоксисоединений при фотолизе арилазидов рассматривалось как результат взаимодействия триплетного нитрена с нитрозосоединением, который, в свою очередь, может быть продуктом реакции арилнитрена с кислородом (см. схему 8, путь а). Учитывая, что при облучении в водных растворах пара-нитрозамещенных арилазидов может образоваться, как было описано выше, N-замещенный арилгидроксиламин (см. схему 8, путь б), мы впервые предлагаем его на роль предшественника ароматических амино- (46), азокси- (48), азо- (49) и нитрозосоединений (50).

Структура соединения (45) формально соответствует продукту внедрения высокореакционноспособного арилнитрена по связи С-Н бокового радикала тирозина, находящейся в орто-положении по отношению к гидроксильной группе. На это 1 указывают данные Н-ЯМР спектроскопии. В ароматической части Н-ЯМР-спектра остатка тирозина наблюдаются существенные изменения (табл. 9):

1) не регистрируется сигнал Н-3’’, и изменяются химические сдвиги протонов Н-2’’, Н-5’’ и Н-6’’;

2) Н-7’’ - протоны метиленовой группы становятся неэквивалентными, а из-за конформационных изменений в алифатическом фрагменте изменяются константы их спин-спинового взаимодействия с Н-8’’ протоном.

Таблица Данные 1H-ЯМР спектроскопии для соединения (42) и продуктов его фотолиза в воде; (, ррm; J, Hz) Соеди- Н-2’’, Н-3’’, Н-7’’ Н-8’’ Н-1’ Н-3 H-4 H-нение Н-6’’ Н-5’’ Н-2’ (42) 7,0, д. 6,74, д. 3,07, д. 4,11, т. 8,21, д. 7,31, дд. 7,10, д.

3,3-3,6, J = 8,0 J = 8,0 J = 7,0 J = 7,0 J = 8,8 J = 8,8, J = 2,м.

J = 2,(45) 7.41, д. 7,01, д. 3,25, дд. 4,23, 8,15, д. 7,07, дд. 7,23, д.

3,3-3,6, Н2’’ Н5’’ J = 14,0, дд. J = 9,2 J = 9,2, J = 2,м.

J = 1,8 J = 8,0 J = 2,0 J = J = 2,6,93, дд. 3,18, дд. 14,0, Н6’’ J = 14,0, J = 2,J = 8,0, J = 7,J = 1,(46) 7,14, д. 6,79, д. 4,15, т. 8,07, д. 6,81, дд. 6,60, д.

3,0-3,2, 3,3-3,6, J = 8,0 J = 8,0 J = 7,0 J = 9,2 J = 9,2, J = 2,м. м.

J = 2,(47) 7,14, д. 6,77, д. 4,16, т. 8,38, д. 8,55, дд. 8,41, д.

3,0-3,02, 3,3-3,6, J = 8,0 J = 8,0 J = 7,0 J = 9,0 J = 9,0, J = 2,м. м.

J = 2,(48) 7,10, д. 6,72, д. 3,11, д. 4,16, т. 8,34, д. 8.14, дд. 8.11, д.

3,3-3,6, J = 8,0 J = 8,0 J = 7,0 J = 7,0 J = 8,8 J = 8.8, J = 2.м.

8,39 д. J = 2.5 8.40 д.

J = 8,8 8.53 дд. J = 2.J = 8.8, J = 2.(49) 7,09, д. 6,71, д. 3,1, д. 4,16, т. 8,39, д. 8,16, дд. 7,95, д.

3,3-3,6, J = 8,0 J = 8,0 J = 7,0 J = 7,0 J = 8,8 J = 8,8, J = 2,м J = 2,Кроме этого, сигналы Н-2’’ и Н-6 ароматических протонов существенно сдвинуты в более слабое поле по отношению к их рассчитанным значениям с учетом влияния заместителя. Вероятно, это связано с анизотропным эффектом близко расположенных ароматических колец. Внедрение нитрена в Н-3’’ положение может быть дополнительно подтверждено значением константы спин-спинового взаимодействия (J2’’,6’’ = 1,8 ± 0,3 Hz). В случае внедрения арилнитрена в Н-2’’ положение, значение константы спин-спинового взаимодействия (J3’’,5’’) должно быть больше, чем 2,5 Hz.

Следует отметить, что строение соединения (45) не может соответствовать какой-либо хиноидной структуре, т. к. значение константы спин-спинового взаимодействия (J5'',6’’) для таких соединений должно быть более 10 Hz. В пользу структуры (45) указывают также данные MALDI-TOF масс-спектрометрии. Наиболее интенсивный пик m/z 355,соответствует рассчитанной массе молекулярного иона [M - NO]+. Кроме этого, зарегистрированы пик с m/z = 408,2, соответствующий рассчитанной массе молекулярного иона [M + Na]+, пики с m/z = 392,2 [M + Na - O]+ и m/z = 378,2 [M + Na + NO]+.

На то, что соединение (45) является продуктом внутримолекулярной реакции, указывают также данные по исследованию фотолиза соединения (42) при разных концентрациях. Так, при концентрациях 6,2 10-5 М, 0,36 10-3 М и 1,12 10-3 М доля соединения (45) составляет, по данным хроматографического анализа, 28 %, 1 % и 0,6 %, соответственно.

Нами предлагается несколько возможных путей, приводящих к образованию (14-амино-19-гидрокси-6-нитро-2,9,12-триазотрицикло-[14.3.1.13,7]генэйкоза1(20),3,5,7(21),16,18-гексаен-8,13-диона - продукта внутримолекулярной циклизации (45) (схема 16). При поглощении кванта света азидогруппа из основного состояния (S0) переходит в возбужденное (S1) (42*S). После этого происходит стабилизация возбужденного состояния путем отщепления молекулы азота с образованием синглетного нитрена (51) (схема 16).

Схема 16.

O2N NH O2N NH O2N NH OH + OH OH (52) (42) (45) -комплекс a h H = -20,ккал/моль..

..

O2N NH O2N NH O2N N3* (S1) O2N N (S0)..

б H O OH O OH N(56) (42*S) (51) (44) ИКК H = -48 ккал/моль (O2)..

....

O2N NH O2N N. (T0) O2N NH.

..

O2N N3* (T1) в.

.

O OH O:

..

OH 2NO (42*T) (53) (54) (55) Синглетный арилнитрен (51) может внутримолекулярно взаимодействовать с ароматической системой тирозина по пути а (схема 16). Однако выход продукта фотолиза (45), образующегося по пути а, не может превышать 14 %, т. е. того количества, которое образуется в ходе облучения (табл. 8). Из данных табл. 8 видно, что образование соединения (45) происходит также в результате темновых превращений соединения (44). На роль соединения (44) можно предложить циклический О-замещенный N-арилгидроксиламин, который может образоваться в результате прямого внедрения арилнитрена в О-Н-связь (схема 16, путь б). Соединение (44) образуется с более высокими выходами при облучении раствора арилазида, насыщенного кислородом. Это указывает на то, что в водных растворах возможен еще и другой, кислород-зависимый, путь его образования, вероятно, через генерирование триплетного нитрена (53) с последующим превращением его в бирадикальное производное (54) (схема 16, путь в).

Фотоиндуцированное взаимодействие 5-азидо-2-нитробензоильной группы с боковым радикалом триптофана Среди продуктов фотолиза соединения (43) наряду с устойчивыми соединениями (58) и (59) (см. схему 17) было выделено соединение (57), которое с течением времени распадалось с образованием трех основных продуктов: неустойчивого соединения (60) и двух устойчивых соединений (59) и (61). На основании сходства химического поведения и электронных спектров поглощения продукта (57) (max = 358 нм) и п-нитрофенилгидроксиламина (max = 356 нм), соединение (57) было отнесено нами к производному N-замещенного арилгидроксиламина (схема 17). Согласно данным H-ЯМР и электронной спектроскопии, а также MALDI-масс-спектрометрии, соединению (58) может быть приписана структура азоксисоединения, а соединению (59) - структура аминосоединения (схема 17).

При сравнении электронных спектров поглощения триптофана и соединения (61) выявляются изменения в области поглощения, соответствующей поглощению индольного кольца. Кроме того, в спектре соединения (61) наблюдается полоса поглощения (max = 382 нм), свидетельствующая о наличии 5-амино-2-нитробензоильного остатка (max = 383 нм).

O O O R C 5 N3 R C R C ON N (60) h O2N H2O O2N 3(43) O2N O R= NH R C NHOH 1' CH2 O диспропорционирование 2' CH2 O2N C R OO2N 3' CH(57) R C R C N O NH NH12" O O C O N O H2N O2N O2N N CH 11" (60) (59) 2"3" 1" CH2 10" O NH2O O HN 5" 6" 4" C CH2 CH C NH CH2CH2CH2NH C 1 5 NH9" 4" 3" 3' O2N C R 10" 11" 12" 2' 1' 5" 8" 9" O 7" (58)(61) O2N 7" 6" NH2 1" 8" Схема 17.

Согласно данным 1Н-ЯМР, соединению (61) может соответствовать структура N-{3[2-амино-4-(2-аминофенил)-4-оксобутириламино]-пропил}-5-амино-2-нитробензамина (табл. 10, нумерация атомов для соединения (61) приведена на схеме 17 и аналогична нумерации для соединения (43)). Данные MALDI-TOF-масс спектрометрии подтверждают образование производного кинуренина (61). В масс-спектре соединения (61) регистрируются сигналы с m/z 427 [M + H]+, m/z 397 [M – NO]+, m/z 381 [M – NO – O]+.

Таблица Данные 1H-ЯМР для соединения (61) (D2O, , м. д. и J, Гц) (H) 3 4 6 2” 5” 6” 7” 8” 10” 11” 8,04 6,77 6,65 7,84 7,45 6,82 6,91 3,78 4, J д, дд д, д, т, т, д, д, т, 9,0 9,0, 2,4 2,5 8,0 8,0 8,0 8,0 6,0 6,Образование предшественника соединения (61) является кислород-зависимым процессом. Среди стадий процесса фотопревращения арилазида (43) кислородзависимой стадией может быть окисление N-арилгидроксиламина (57), приводящее к образованию нитрозосоединения (60), которое, кроме того, может образоваться за счёт диспропорционирования соединения (57) (см. схему 17). Продуктом конденсации исходного N-арилгидроксиламина с нитрозосоединением будет азоксисоединение (58).

Взаимодействие арилнитрозогруппы с индольным кольцом триптофана, вероятно, приводит к образованию продукта (61). При реакции диспропорционирования N-арилгидроксиламина (57) наряду с нитрозосоединением будет также накапливаться аминосоединение (59) (схема 17).

С учетом того, что для нитрозосоединений с нитрогруппой в пара-положении бензольного кольца возможно образование комплексов с переносом заряда, можно предложить следующий путь взаимодействия нитрозосоединения (60) с функциональной группой триптофана, в результате которого будет накапливаться соединение (61) (схема 18).

NHNHNHCH2 CH C O CH2 CH C O CH2 CH C O NH перенос 1 е NH NH NH H N H CH2 O N H O N CH2 O HN N H CHO O O CHCHCHC NH CHC NH CH2 C NH CH(60) N+O NONH2 NON NH2 O NHNHO H NH2 CH2 CH C NH C CH2 CH C NH C O O O CH C NH O O CHCH2 H3O+ C CHH3O+ HN O O H2N CHCHO CH2 -CO2 HN O CH2 (59) (57) C NH CHO C NH CHC NH CH(61) NONONOСхема 18.

В свете полученных результатов по фотовзаимодействию 5-азидо-2-нитробензоильных реагентов с остатками ароматических аминокислот, можно сделать вывод, что мишенями при фотоаффинной модификации белков могут быть боковые радикалы таких ароматических аминокислот как тирозин и триптофан.

Однако в случае триптофана могут образоваться продукты «скрытой» модификации типа (61). Отсутствие ковалентных аддуктов реагента с белковой мишенью будет создавать большие затруднения при выделении модифицированного белка с целью последующего установления точки модификации.

Фотовзаимодействие 4-азидо-2,3,5,6-тетрафторбензоильной группы с боковым радикалом тирозина Результаты, полученные нами при исследовании фотоиндуцированной модификации аминокислотных производных олигонуклеотидов в комплементарном комплексе (табл.

1), свидетельствуют о том, что реагенты на основе 4-азидо-2,3,5,6-тетрафторбензойной кислоты с высокой эффективностью модифицируют боковые радикалы ароматических аминокислот. Для установления строения продуктов фотомодификации функциональных групп тирозина и триптофана нами были сконструированы низкомолекулярные модели, в которых остатки ароматических кислот и арилазидная группа были объединены в одной молекуле спейсером определенного размера, обеспечивающим благоприятную взаимную ориентации реагирующих групп.

При фотолизе реагента на основе 4-азидо-2,3,5,6-тетрафторбензойной кислоты (62) в водных растворах наблюдалось, по данным ОФХ, образование двух основных 1 продуктов фотореакции, которые, на основании данных H-, F-ЯМР (табл. 11), электронной спектроскопии и масс-спектрометрии, соответствуют аминосоединению (63) и продукту внутримолекулярной модификации по остатку тирозина – 4-амино14,15,16,17-тетрафтор-3-(4-гидроксифенил)-2,6,11-триаза-бицикло[11.2.2]гептадека1(16),13(17),14-триен-5,12-диону (64) (схема 19).

Таблица Данные ЯМР-спектроскопии для соединения (62) и продуктов его фотопревращения (63) и (64); (, м. д., J, Гц) Тип ядра и его Соединение и тип растворителя положение (62) (ДМСО-d6) (63) (CD3CN/D2O (64) (CD3CN/D2O (1:1, v/v)) (1:1, v/v)) H-3, H-6 3,00 – 3,12 (м) 3,00 – 3,12 (м) 2,86 – 3,36 (м) H-4, H-5 1,40 – 1,44 (м) 1,38 – 1,42 (м) 1,24 – 1,36 (м) H-9 3,36 (дд) 3,39 – 3,44 (м) 2,86 – 3,36 (м) J = 7,8, J = 5,H-2’’, H-6’’ 6,98 (д), J = 8,4 6,98 (д), J = 8,4 6,98 – 7,03 (м) H-3’’, H-5’’ 6,70 (д), J = 8,4 6,67 (д), J = 8,4 6,69 – 6,76 (м) H-7’’ 2,86 – 3,36 (м) 2,80 Н7’’ (дд) 2,82 Н7’’ (дд) J = 13,5, J = 5,5, J = 13,5, J = 5,5, 2,55 Н7’’ (дд) 2,58 Н7’’ (дд) J = 13,5, J = 7,8 J = 13,5, J = 7,F-2’, F-6’ 27,9 (дд) 24,0 (д) 21,9 – 22,0 (м) J = 21,7, J = 9,1 J = 17,8 21,1 – 21,2 (м) F-3’, F-5’ 19,5 (дд) 7,9 (д) 14,9 – 15,1 (м) J = 21,7, J = 9,1 J = 17,8 12,6 – 12,7 (м) В пользу предложенной для соединения (64) структуры свидетельствуют данные F-ЯМР. В исходном азиде (62) и его аминопроизводном (63) атомы F-2’ и F-6’, а также F-3’ и F-5’ являются попарно магнитно-эквивалентными, поэтому в спектрах F-ЯМР они представлены двумя сигналами (табл. 11). В то же время, в спектре соединения (64) присутствуют все четыре сигнала от анизохронных атомов фтора, поскольку в циклической молекуле затруднено вращение вокруг связи C-4’-N.

В спектре Н-ЯМР интегральная интенсивность сигналов от атома водорода H-7’’ уменьшается на один протон, что указывает на его замещение. В пользу предложенной структуры (64) говорят также данные MALDI-масс-спектрометрии. Зарегистрирован пик с m/z = 441,1, соответствующий молекулярному иону [M + H]+ (рассчитано для С20H21F4N4O3+ 441,155).

Схема 19.

F F O O H OH N3 C NHCH2CH2CH2CH2NH C C C HNHF F hv -N(62) H H 4 O O N N 5 5 C C 10 3 7 NH2 NHF F F F CH CH 2' 3'' 2'' 2' 3'' 2'' 2 2 9 + HN 3' HN 3' 1 1' 4'' 1' 4'' 1'' 1'' C N C OH C NH2 H2C OH 4' H 4' 7'' H 6' 6' 7'' O O 5'' 6'' 5'' 6'' 5' 5' F F F F (63) (64) Для наглядного представления данных по Н-ЯМР-спектроскопии атомы в соединении пронумерованы в соответствии с нумерацией исходного соединения, а не в соответствии с названием по номенклатуре IUPAC.

Фотовзаимодействие 4-азидо-2,3,5,6-тетрафторбензоильной группы с боковым радикалом триптофана При облучении модельного соединения (65), в молекуле которого два ароматических фрагмента пространственно сближены для реализации атаки нитрена по индольному остатку триптофана, наблюдалось образование двух основных продуктов фотолиза:

аминосоединения (66) и макроциклического соединения (67) – 8-амино-17,18,24,25тетрафтор-4,10,14,20-тетрааза-тетрацикло-[14.4.3.03,23.217,20]пентакоза-1,3(23),5, 16(24),17,19(25),21-гептаен-9,15-диона (схема 20).

Соединение (66), согласно данным Н-ЯМР, содержит остаток триптофана, структурно аналогичный остатку триптофана в исходном соединении (65), что указывает на отсутствие модификации по боковому радикалу аминокислоты. При анализе спектра F-ЯМР (табл. 12) видно, что в положении С-4’ появляется функциональная группа, которая вызывает изменения химических сдвигов 19F в орто- и орто’-положениях в сторону сильного поля. Увеличение электронной плотности обусловлено анизотропным эффектом аминогруппы, которая может появиться в ходе фотопревращения триплетного арилнитрена. Превращение соединения (65) в аминопроизводное (66) (схема 20) подтверждается также данными MALDI-TOF-масс анализа. В масс-спектре продукта фотолиза наблюдается ион с m/z 451,9, cоответствующий по массе иону, образованному из п-аминоперфторбензоильного производного (66) путем присоединения протона.

Схема 20.

6'' 7'' F F 5'' 8'' OO 3' 2' 4'' 9'' 2 3 4 5 6 8 10'' 1 N3 4' 1' C NH CH2 CH2 CH2 NH C CH CH2 3'' NH 1'' 5' 6' 2'' (65) NHF F h - N2 6'' 7'' F F 5'' 8'' OO 3' 2' 9'' 4'' 2 3 4 5 6 8 10'' 1 NH2 4' 1' C NH CH2 CH2 CH2 NH C CH CH2 3'' NH 1'' 5' 6' 2'' NHF F (66) O 4 5 6 8 CH2 CH2 CH2 NH C CH NH10'' CH5'' 3'' NH 4'' 2' 3' 6'' 1 2'' 1' 4' 7'' C F N 1'' 9'' N 8'' O H 6' 5' H (67) На протекание реакции электрофильного замещения в ароматическом гетероцикле указывает изменение в спектре Н-ЯМР интегральной интенсивности ароматических протонов. Ароматическая система индола в соединении (67) содержит четыре протона вместо пяти протонов исходного соединения (65). Данные 1Н-ЯМР для соединения (67) свидетельствуют об отсутствии структурных изменений в пиррольном кольце:

положение сигнала, соответствующего протону при С-2’’, практически не изменяется относительно исходного соединения (табл. 12). Следовательно, реакция протекает по бензольному кольцу индола. Анализируя характер расщепления сигналов ароматической системы, можно исключить положения С-5” и С-8” в качестве центров для атаки арилнитреном, потому что в противном случае наблюдалось бы наличие триплета (табл. 12). Следовательно, остаются два возможных центра для протекания реакции электрофильного замещения: С-6 и С-7. Принимая во внимание расчетные параметры суперделокализации для индола [Millie P., et al. 1968], можно предполагать, что положение С-7” является оптимальным для реализации атаки нитрена по бензольному кольцу индола с образованием макроцикла. По данным 19F-ЯМР, в спектре соединения (67) наблюдается анизохронность всех атомов фтора в составе арилазидного остатка. В отличие от двух мультиплетов, регистрируемых в спектре F-ЯМР исходного перфторарилазида (65), в спектре F-ЯМР соединения (67) присутствуют четыре сигнала (табл. 12). В пользу структуры продукта (67) свидетельствует изменение характера спектра 1Н-ЯМР метиленовых групп (табл. 12). Как видно из данных табл. 12, наблюдается анизохронность протонов при одной СН2-группе (т. е. каждый из протонов при С-3 и С-4 представлен отдельным сигналом в спектре Н-ЯМР). Кроме того, наблюдается смещение сигналов протонов алифатических групп в сильное поле по сравнению с сигналами метиленовых групп в исходном соединении (65). В пользу структуры (67) говорят также данные MALDI-TOF-масс спектрометрии.

Зарегистрирован пик с m/z = 450,0, соответствующий молекулярному иону [M + H]+, (рассчитано для С21H20F4N5O2+ 450,155).

Таблица Данные ЯМР-спектроскопии для соединения (65) и продуктов его фотопревращения (66) и (67); (, м. д., J, Гц) Тип ядра и его Соединение и тип растворителя положение (65) (D2O) (66) (D2O) (67) (СD3OD) H-5’’ 7,67 (д), J = 8,1 7,68 (д), J = 8,1 6,98 (д), J = 8,H-8’’ 7,58 (д), J = 8,1 7,57 (д), J = 8,1 7,66 – 7,72 (м) H-2’’ 7,39 (c) 7,39 (c) 7,42 (c) H-7’’ 7,33 (т), J = 8,1 7,30 (т), J = 8,1 – H-6’’ 7,23 (т), J = 8,1 7,23 (т), J = 8,1 7,5 (д), J = 8,H-8 4,27 (т), J = 5,9 4,26 (т), J = 5,9 3,34–3,44 (м) 2,83–2,91 H10’’ (м) H-10’’ 3,47 (м) 3,45 (м) 2,21–2,29 H10’’ (м) 3,28 Н5 (м) 3,26 Н5 (м) 3,36 Н5 (м) H-3,07 Н5 (м) 3,05 Н5 (м) 3,73 Н5 (м) 3,09 Н3 (м) H-3 3,02 (т), J = 7,0 3,00 (т), J = 7,2,99 Н3 (м) 1,44 Н4 (м) H-4 1,49 (м) 1,47 (м) 0,49 Н4 (м) 21,6 – 21,9 (м) F-2’, F-6’ 22,9 (м) 25,4 (м) 19,2 – 19,4 (м) 17,6 – 17,9 (м) F-3’, F-5’ 14,2 (м) 8,9 (м) 13,1 – 13,5 (м) Таким образом, совокупность полученных в настоящей работе данных указывает на то, что при использовании реагентов на основе 4-азидо-2,3,5,6-тетрафторбензойной кислоты следует ожидать образования устойчивых продуктов ковалентного присоединения реагентов к боковым радикалам ароматических аминокислот белковой молекулы.

НОВЫЕ ПОДХОДЫ К СИНТЕЗУ ФОТОАФФИННЫХ РЕАГЕНТОВ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ БЕЛКОВО-НУКЛЕИНОВЫХ КОМПЛЕКСОВ Фосфорилирующие производные олигонуклеотидов с цвиттер-ионной концевой группой как промежуточные соединения при синтезе фотоаффинных реагентов Модифицированные олигонуклеотиды широко используются в качестве прецизионных инструментов для исследования тонких биологических процессов, связанных с реализацией генетической информации. Одним из перспективных методов введения группировок с заданными свойствами в состав олигонуклеотидов, не приводящих к существенному изменению комплементационных свойств, может быть селективная модификация их 5’- или 3’-терминального моноэтерифицированного остатка фосфорной кислоты. Наибольшие успехи в селективной активации моноэтерифицированных фосфатов олиго- и полинуклеотидов к моменту начала настоящей работы были достигнуты с применением окислительно-восстановительного конденсирующего реагента Ph3P/(PyS)2 [Самуков и др., 1979]. Нами выявлено участие растворителя в процессе активации данными реагентами фосфатных групп олигодезоксирибонуклеотидов. Так, в случае проведения реакции в DMF образуется фосфорилирующее производное олигонуклеотидов с цвиттер-ионной О-фосфорилметилендиметилимино-группой (68) ( 2 м. д.) (схема 21). В то же время, при активации олигодезоксирибонуклеотидов смесью Ph3P/(PyS)2 в DMF/DMSO/H2O в спектрах Р-ЯМР образующегося соединения (69) отсутствует сигнал, соответствующий концевой фосфатной группе ( -1,5 м. д.), и регистрируется сигнал в области, характерной для пирофосфатов ( -16 м. д.). Это указывает на протекание реакции внутримолекулярного пирофосфорилирования. Такое направление процесса ставит под сомнение применимость к олигорибонуклеотидам способа активации их в водно-органической среде с помощью Ph3P/(PyS)2 в отсутствие нуклеофила. При проведении активации в присутствии нуклеофилов (N,N-диметиламинопиридин, N-оксид N,N-диметиламинопиридина, N-метилимидазол) независимо от типа растворителя в спектрах 31Р-ЯМР наблюдается смещение сигнала фосфатной группы в сильное поле (табл. 13), что свидетельствует об образовании соответствующих амидофосфатов олигонуклеотидов с цвиттер-ионной группой (70), (72) и соединения (71) (схема 21). Процесс завершается в течение 2-4 мин.

Схема 21.

MeIm O + H3C N N P O O- O B O O O P O + (72) O- O B Ph3P/(PyS)2 Ph3P O P O B R1 RO- O H3C DMAP O + R1 RN N P O R1 RO- O B H3C (71) R1 RDMF : DMSO : H2O 10 : 9 : 1 DMAPO H3C O + N N O P O O O- O B - H3C O P O B (70) O O R1 RR1 = остаток олигонуклеотида P R2 = -H H3C O RO O + H N C O P O (69) олигонуклеотид O- O B H3C DMF (68) R1 RДостаточная стабильность соединений с цвиттер-ионной группой (табл. 13) обеспечивает возможность выделения их из реакционной среды путем осаждения в раствор LiClO4 в ацетоне с целью последующего использования для фосфорилирования алифатических аминов в водных растворах. Нами обнаружено, что реакции соединений типа (68), (70), (71) и (72) (10-3 М) с алифатическими аминами (5-10-кратный избыток) протекают практически количественно при комнатной температуре и заканчиваются в течение нескольких минут.

Таблица Кинетические характеристики реакций производных рТ(Ас) с водой (4,2 М) при 38 0С в DMF и данные 31Р-ЯМР-спектроскопии Соединение Р-ЯМР, . м. д. k, мин-1 t1/2, мин 9,(72) -11,13 (7,2 ± 0,4) 10-(71) -7,11 (1,5 ± 0,2) 10-7(70) -0,55 (9,7 ± 0,8) 10-Разнесение во времени стадий активации олигонуклеотидов и фосфорилирования образующимися цвиттер-ионными производными олигонуклеотидов нуклеофильных групп обеспечивает возможность получения производных олигонуклеотидов, несущих остатки ароматических азидов, так как исключается опасность восстановления азидогруппы в присутствии трифенилфосфина. С использованием соединений (68), (70), (71) и (72) нами были получены различные амидофосфаты олигонуклеотидов, в том числе и аффинные реагенты на основе ароматических азидов, структуры которых представлены на схеме 1.

Производные олигонуклеотида, несущие остаток п-азидоанилина, присоединенный к концевому фосфату олигонуклеотида через линкеры разного размера (N3C6H4NH(CH2)nNH-d(pApC)6), были апробированы нами совместно с группой к.х.н.

Н.Д. Кобец для фотоаффинной модификации белков хроматина, локализованных в области TG-повторов [Кнорре Д.Г. и др., 2000].

Рис. 2. Результаты гель-электрофоретического анализа белков хроматина, модифицированных фотоактивируемыми производными pd(AC)6, несущими остаток пара-N3C6H4NH(CH2)nNH-. Дорожки: 1 - n = 2, соединение (73); 2 - n = 4, соединение (74); 3 - n = 6, соединение (75).

Черточки слева указывают на положение маркерных белков (молекулярные массы представлены в Да).

Из данных, представленных на рис. 2, видно, что интенсивность модификации белков в составе хроматина существенно зависит от длины линкерной группы, связывающей фотоактивируемую группу и остаток олигонуклеотида. Наиболее эффективно модифицирует белки производное олигонуклеотида, несущее остаток п-азидоанилина, присоединенный к 5’-концевому фосфату через диаминотетраметиленовый спейсер (74) (дор. 2). В то же время, при увеличении длины линкера (соединение (75), n = 6) специфической модификации каких-либо дополнительных белков не наблюдалось, а эффективность модификации при этом несколько снижется (дор. 3 по сравнению с дор.

2). Полученные данные по эффективности модификации белков хроматина коррелируют с результатами исследований на специально сконструированной нами модельной системе - дуплексе (схема 1). Как было описано выше, именно производное олигонуклеотида, несущее остаток 4-азидофениламинобутана на 5’-концевом фосфате, с наибольшей эффективностью модифицирует в составе комплементарного комплекса функциональные группы белков, присоединенные к 3’-концевому фосфату комплементарного олигонуклеотида (табл. 1).

Нами было обнаружено, что интенсивность модификации белков в составе хроматина зависит от строения ароматического азида. Так, эффективность модификации белков в случае использования реагентов на основе п-азидоанилина - N3C6H4NH(CH2)nNH-d(pТ)16) значительно выше, чем в случае олигонуклеотидных производных, несущих 5-азидо-2-нитробензоильный фрагмент (данные не представлены).

Совокупность данных, полученных на модельном дуплексе и при фотоаффинной модификации белков хроматина, позволяет сделать вывод, что фотоактивируемые производные олигонуклеотидов, несущие остаток п-азидоанилина, присоединенный к 5’-концевому фосфату через диаминотетраметиленовый спейсер, являются перспективными реагентами для проведения структурно-функционального анализа белково-нуклеиновых комплексов.

Арилазидные производные нуклеозид-5’-трифосфатов для ферментативного синтеза фотоактивируемых ДНК-зондов и фотоаффинных ДНК- и РНК-реагентов В последние годы достигнуты значительные успехи в получении фотоактивируемых аналогов ДНК и РНК, несущих остаток ароматического азида в гетероциклическом основании, в процессе матричного биосинтеза с использования арилазидных производных dNTP и NTP в качестве элонгирующих субстратов ДНК- и РНК-полимераз соответственно. Вместе с тем, нельзя не отметить, что во всех известных случаях фотоактивируемые группы энзиматически вводились только в одну из цепей в ДНК. В настоящей работе найдено решение задачи по химикоферментативному синтезу фотоактивируемых ДНК-дуплексов с реакционноспособными группами в обеих цепях ДНК.

Нами был осуществлен синтез ряда производных (d)UTP (76d), (77d), (78d), (79d), которые различались либо природой арилазидного остатка, либо строением спейсера, соединяющего фотоактивируемую группу с С-5 положением пиримидинового гетероцикла (схема 22).

Среди четырех синтезированных производных dUTP было выявлено единственное соединение (78d) - 5-[3-(E)-(4-азидо-2,3,5,6-тетрафтор-бензамидо)-пропенил-1]-2’дезоксиуридин-5’-трифосфат, которое заменило в полимеразной цепной реакции природный субстрат dTTP. Фотоактивируемое производное dUTP (78d) оказалось эффективным элонгирующим субстратом Taq-полимеразы. Более того, встраивание его в ДНК не нарушало ее способности служить матрицей на следующих этапах для получения комплементарной цепи. При гель-электрофоретическом анализе продукта, образующегося при синтезе ДНК в присутствии фотоаналога (78d), было обнаружено, что его подвижность в геле уменьшается по сравнению с подвижностью продукта синтеза ДНК в системе с природными субстратами. Уменьшение электрофоретической подвижности свидетельствует о введении в ДНК-продукт модифицированных нуклеотидов с объемным заместителем. Данные ИК-спектроскопии указывают на наличие в продукте ПЦР интенсивной полосы поглощения при 2100 см-1, характерной для азидогруппы. Было показано, что комплементарные цепи фотоактивируемой ДНК могут сшиваться между собой при облучении реакционной смеси продуктов ПЦР светом в области 313-345 нм.

Схема 22.

O O O HN N N R H H O2N O N O O O R = F N-O P O P O P O O O- O- ONOH (76d) (77d) O O CH2=CH-CH2NH C R HN O N O O O -O P O P O P O O O- O- OOH H (OH) NO H N NR = F NN H O2N (78d), (78r) (80r) (79d), (79r) В целях развития технологии флуоресцентной гибридизации in situ мы также исследовали соединение (78d) на предмет перспективы использования его для получения in situ фотоактивируемых ДНК-зондов (совместно с группой д.ф.-м.н.

А.И. Полетаева). Элонгирование ДНК-зонда, гибридизованного in situ с хромосомами, с помощью фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I в присутствии соединения (78d) и последующее облучение вызывало фотоиндуцированное присоединение зонда к ДНК в области его локализации. Это обеспечило возможность избирательного закрепления на метафазной хромосоме интересующего зонда с целью маркировки как целой хромосомы, так и ее определенного участка. Незакрепленные зонды были удалены в процессе денатурирующих отмывок. Способность зондов, ковалентно присоединенных к ДНК, оставаться на препарате после денатурирующих отмывок может быть использована в одноцветной гибридизации, что проиллюстрировано ниже на примере экспериментов с фотоактивируемым зондом рBR13/21, гибридизующимся с центромерным районом хромосом 13 и 21 (рис. 3).

Проба рBR13/21 была использована нами для «несмываемого» маркирования хромосомы 13. Это избавило от необходимости проводить дифференциальное окрашивание хромосом, которое возможно не для всех препаратов и вариантов гибридизации. В ходе второй гибридизации на хромосоме 13 были локализованы космидные зонды (рис. 3, а и б). Последовательное проведение гибридизации с «маркированными» на первом этапе хромосомами позволяет локализовать каждый зонд с использованием одного и того же препарата хромосом и даже одного флуорохрома.

Рис. 3. Двухступенчатая гибридизация с космидами. Зонд pBR13/21, меченный биотином, был гибридизован, удлинен в присутствии фотоактивируемого дезоксиуридин-5’-трифосфата (78d) и закреплен на хромосомах при облучении светом в области 313-345 нм. После денатурирующей отмывки была проведена повторная гибридизация на том же препарате с космидами из библиотеки фрагментов хромосомы 13. Зонд pBR13/21, остающийся на хромосоме после денатурирующей отмывки, служит маркером хромосомы 13 (яркий зеленый сигнал в центромерном районе хромосомы 13). Более слабые парные зеленые сигналы указывают на локализацию космидных клонов в районах 13q14 (а) и 13q34 (б).

Нами было обнаружено, что арилазидные производные UTP (см. структуры на схеме 21) способны заменить природный UTP при репликации РНК. Фотоактивируемые производные UTP - соединения (78r), (79r) и (80r)) - были исследованы нами совместно с д.б.н. Морозовой О.В. на предмет перспективы их применения как аффинных реагентов для идентификации белков, ответственных за элонгацию при репликации РНК вируса клещевого энцефалита (ВКЭ). С их использованием методом высокоселективного мечения был исследован репликативный комплекс ВКЭ, и выявлены неструктурные белки (NS3 и NS5), играющие роль репликаз на разных стадиях развития вирусной инфекции.

Рис. 4. Авторадиограмма геля после электрофоретического разделения в SDS-ПААГ (10 %-ный) продуктов фотоаффинного мечения белков репликативного комплекса ВКЭ (ядерная фракция через 48 ч после инфицирования), инкубированного с различными фотоактивируемыми производными UTP (дор. 2-4), и иммуноблотинг с МКА против белков NS5 и NS3 ВКЭ (дор. 1, использован реагент (80r)). Дорожки: 2 - соединение (80r), 3 - соединение (79r), 4 - соединение (78r).

Перевиваемая монослойная культура клеток почки эмбриона свиньи (СПЭВ) была инфицирована вирусом клещевого энцефалита (штамм Софьин). Ядерная фракция зараженных клеток была выделена через 16 ч и 48 ч после заражения и добавлена к реакционной смеси, которая наряду с природными NTP содержала одно из фотоактивируемых производных UTP. Синтез РНК ВКЭ в ядерной фракции проводили в присутствии актиномицина Д. Наличие актиномицина Д в реакционных смесях ингибировало ДНК-зависимый синтез клеточных РНК и не влияло на РНК-зависимую репликацию вирусного генома. После инкубации в течение 15 мин реакционную смесь облучали ультрафиолетовым светом ( > 313 нм), затем добавляли [-32P]NTP.

Продукты фотоаффинной модификации анализировали методом гель-электрофореза в денатурирующих условиях.

Из результатов анализа, представленных на рис. 4, видно, что с точки зрения перспективы использования реагентов для фотоаффинной модификации белков, лучшими являются фотоактивируемые производные UTP, несущие перфторазидоарильную (78r) и п-азидофениламиноалкильную (80r) группы.

ВЫВОДЫ I. Установлены механизмы фотоиндуцированного взаимодействия реагентов на основе ароматических азидов с функциональными группами белков:

1). Обнаружено, что природа частиц, образующихся в ходе облучения арилазидных реагентов в водных растворах и принимающих участие в «темновых» стадиях фотоаффинной модификации биополимеров, зависит от типа заместителей в бензольном кольце.

• При наличии в пара-положении к азидогруппе заместителей с положительным мезомерным эффектом (п-азидоанилин, п-азидофениламиноалкиламин, п-азидофенилфосфат) продуктами фотолиза являются соединения с хиноидной структурой, обладающие реакционной способностью по отношению к нуклеофильным группам белков. Обнаружено, что при облучении п-азидофенилфосфата наряду с п-бензохинонмоноимином образуется фосфорилирующее производное, что позволяет рассматривать данный арилазид как фотовключаемый бифункциональный реагент.

• Арилнитрены, генерируемые при облучении ароматических азидов, у которых в пара-положении находится заместитель с отрицательным мезомерным эффектом (4-нитрофенилазид и амиды 5-азидо-2-нитробензойной кислоты), взаимодействуют с водой с образованием N-арилгидроксиламинов. Диспропорционирование последних или окисление их кислородом воздуха приводит к накоплению ароматических нитрозосоединений, ответственных за протекание «темновых» стадий при фотоаффинной модификации белков.

• При облучении 4-азидо-2,3,5,6-тетрафторбензойной кислоты в водных растворах основным продуктом фотолиза является 4-амино-2,3,5,6-тетрафторбензойная кислота.

2). Разработан комплексный подход для изучения специфичности и эффективности фотовзаимодействия арилазидных реагентов с функциональными группами белков и установления строения образующихся продуктов. Подход основан на использовании трех типов моделей, в которых боковой радикал аминокислотного остатка и арилазидная группа сближены на расстояние, сопоставимое с расстоянием между реагирующими центрами при фотоаффинной модификации белков.

• С использованием модельного дуплекса, состоящего из производных двух комплементарных олигонуклеотидов, к 5’-концевому фосфату одного из которых непосредственно или через спейсер присоединена арилазидная группа, а к 3’-концевому фосфату другого - боковой радикал аминокислоты, выявлена избирательность арилазидных реагентов к различным функциональным группам биополимеров. Обнаружено, что в отличие от реагентов на основе 5-азидо-2-нитробензойной и 4-азидо-2,3,5,6-тетрафторбензойной кислот, реагенты на основе п-азидоанилина, реагирующие при облучении через промежуточное образование высокоэлектрофильного производного п-бензохинондиимина, селективны по отношении к функциональным группам белков.

• С использованием модельного дуплекса или модельного комплекса стрептавидин•фотоактивируемый аналог биотина показано, что реагенты на основе 5-азидо-2-нитробензойной и 4-азидо-2,3,5,6-тетрафторбензойной кислот с высокой эффективностью модифицируют боковые радикалы ароматических аминокислот.

Для реагентов на основе п-азидоанилина и п-азидофениламиноалкиламина основными мишенями модификации являются алифатические аминогруппы аминокислотных остатков. При модификации -аминогруппы N-концевой аминокислоты возможно расщепление амидной связи после модифицированного остатка аминокислоты.

• С использованием модели, в которой арилазидная группа и остаток аминокислоты объединены в одну молекулу через спейсер определенного размера, установлено строение продуктов фотовзаимодействия двух ароматических азидов с остатками ароматических аминокислот. Обнаружено, что фотоиндуцированное взаимодействие 4-азидо-2,3,5,6-тетрафторбензоильной группы с боковым радикалом тирозина протекает по С–Н связи бензильного атома углерода, в то время как 5-азидо-2-нитробензоильный реагент реагирует по орто-положению бензольного кольца. При фотовзаимодействии перфторазидоарильной группы с остатком триптофана образуется продукт модификации по бензольному ядру индольной группы триптофана. В то же время, взаимодействие реагента на основе 5-азидо-2-нитробензойной кислоты с остатком триптофана приводит к образованию производного кинуренина - продукта «скрытой» модификации по пиррольному кольцу.

• Показано, что в условиях сближения реагирующих центров фотовзаимодействие 5-азидо-2-нитробензоильного остатка с группировкой, имитирующей боковой радикал метионина, приводит к образованию нестабильного ковалентного аддукта сульфиминовой природы, который гидролизуется с образованием производного сульфоксида.

II. Разработаны новые подходы к получению фотоаффинных реагентов на основе ароматических азидов для структурно-функциональных исследований надмолекулярных комплексов матричного биосинтеза.

• Впервые получено новое фосфорилирующее производное олигодезоксирибонуклеотидов с цвиттер-ионной О-фосфорилметилендиметилимино-группой. Показано, что такого типа соединение достаточно стабильно в водных условиях. В то же время наличие положительного заряда в структуре активирующей группировки обеспечивает ему высокую реакционную способность по отношению к различным нуклеофилам в широком диапазоне значений рН. С использованием цвиттер-ионных производных олигодезоксирибонуклеотидов разработан эффективный и простой в исполнении метод введения арилазидных группировок по терминальным фосфатам деблокированных нуклеиновых кислот. С его применением получен ряд новых фотоактивируемых амидофосфатов олигонуклеотидов - реагентов на основе п-азидофениламиноалкиламина, перспективность которых как фотоаффинных модификаторов белков была продемонстрирована при исследовании белкового окружения ДНК в составе хроматина.

• Впервые осуществлен ферментативный синтез и амплификация фотоактивируемых дуплексов с арилазидными группами в С-5 положении дезоксиуридинов обеих цепей ДНК путем включения высокоэффективного аналога элонгирующего субстрата Taq-полимеразы - 5-[3-(E)-(4-азидо-2,3,5,6тетрафторбензамидо)-пропенил-1]-2’-дезоксиуридин-5’-трифосфата – в продукт полимеразной цепной реакции. Показана перспективность применения арилазидных ДНК-зондов в методе флуоресцентной гибридизации in situ для фотоиндуцированного маркирования как целой хромосомы, так и ее определенного участка.

• С использованием фотоаналогов UTP, несущих остаток ароматического азида в С-5 положении гетероцикла, продемонстрирована возможность введения фотоактивируемых групп в РНК вируса клещевого энцефалита в составе ядерной фракции. С помощью синтезированной in situ фотоактивируемой РНК, методом высокоселективного мечения, исследован репликативный комплекс вируса клещевого энцефалита, и выявлены неструктурные белки (NS3 и NS5), играющие роль репликаз на разных стадиях развития вирусной инфекции.

Основные результаты работы изложены в следующих публикациях:

1. Годовикова Т.С., Зарытова В.Ф., Халимская Л.М. Реакционноспособные фосфамиды моно- и олигонуклеотидов // Биоорган. химия. 1986. Т. 12. С. 475-481.

2. Годовикова Т.С., Зарытова В.Ф., Райт В.К., Лебедев А.В., Самуков В.В. Некоторые аспекты амидирования моноэтерифицированного фосфата нуклеотидов и динуклеотидов при действии трифенилфосфина и 2,2’-дипиридилдисульфида // Изв. Сиб. Отд. АН СССР. Сер. хим. наук. 1986.

Вып. 2. С. 110-115.

3. Zarytova V.F., Godovikova T.S., Kutyavin I.V., Khalimskaya L.M. Reactive oligonucleotide derivatives as affinity reagents and probes in molecular biology // In: Biophosphates and Their Analogues – Synthesis, Structure, Metabolism and Activity / Eds. Bruzik K.S., Stec W.J. Elsevier Sci. Publ.. Amsterdam, 1987.

P. 149-164.

4. Годовикова Т.С., Зарытова В.Ф., Мальцева Т.В., Халимская Л.М. Активные производные олигонуклеотидов с цвиттер-ионной концевой фосфатной группой для конструирования аффинных реагентов и зондов // Биоорган. химия. 1989. Т. 15. С. 1246-1253.

5. Кудряшова Н.В., Шаманина М.Ю., Годовикова Т.С., Ананько Е.А., Ахмадиева Ф.Ф., Ромащенко А.Г. Особенности взаимодействия ДНК-полимеразы I Е. coli и ее большого фрагмента с -пазидоанилидом dTTP // Биохимия. 1993. Т. 58. С. 224-233.

6. Knorre D.G., Godovikova T.S., Nevinsky G.A. Oligonucleotide and their derivatives as a tool to study protein-nucleic acids interaction // In: Evolutionary biochemistry and related areas of physicochemical biology / Eds. B. Poglazov et al.. Bach Institute of Biochemistry and ANKO. Moscow, 1995. P. 297-313.

7. Годовикова Т.С., Березовский М.В., Кнорре Д.Г. Фотоаффинная модификация аминокислотных производных олигонуклеотидов в комплементарном комплексе // Биоорган. химия. 1995. Т. 21. С.

858-867.

8. Godovikova T.S., Knorre V.D., Maksakova G.A., Sil’nikov V.N. Synthesis of azidoaniline derivatives of oligonucleotides and investigaion of their photochemical behavior // Bioconjugate Chem. 1996. P.

343-348.

9. Кобец Н.Д., Горожанкин А.В., Годовикова Т.С., Сильников В.Н., Кнорре Д.Г. Аффинная модификация хроматина фотореакционноспособными производными олиготимидилата // Докл.

АН. 1996. Т. 349. С. 822-825.

10. Годовикова Т.С. Алексеев П.В., Кнорре Д.Г. Новое фосфорилирующее производное олигодезоксирибонуклеотидов // Докл. АН. 1997. Т. 357. C. 259–262.

11. Godovikova T.S., Kolpashchikov D.M., Orlova T.N., Richter V.A. New photoreactive deoxynucleoside-5’triphosphates substitutes for thymidine-5’-triphosphate in the polymerase chain reaction // FASEB J.

1997. V. 11. P. 1367.

12. Кнорре Д.Г., Биченкова Е.В., Коваль В.В., Алексеев П.В., Кнорре В.Д., Нордхоф Э., Годовикова Т.С.

Новый подход к изучению взаимодействия аминокислот по их боковым радикалам с арилазидами // Биоорган. химия. 1998. Т. 24. С. 663-669.

13. Knorre D.G., Alekseyev P.V., Gerassimova Yu.V., Sil’nikov V.N., Maksakova G.A., Godovikova T.S.

Intraduplex photocross-linking of p-azidoaniline residue and amino acid side chains linked to the complementary oligonucleotides via a new phosphorylating intermediate formed in the Mukayama system // Nucleosides&Nucleotides. 1998 V. 17. P. 397-410.

14. Knorre D.G., Godovikova T.S. Photoaffinity labeling as an approach to study nucleoprotein complexes (обзор) // FEBS Lett. 1998. V. 433. P. 9-14.

15. Наседкина Т.В., Мальков Р.Б., Федорова Л.И., Годовикова Т.С., Колпащиков Д.М., Полетаев А.И.

Использование фотопришиваемых ДНК-зондов для флуоресцентной гибридизации in situ // Цитология. 1998. Т. 40. С. 763-767.

16. Mishchenko E.L., Reinbolt J., Markushin Yu.Ya., Ehresman B. And Godovikova T.S. Tyrosin 54 and tryptophan 108 of N’-(d-biotinyl)-1,4-diaminobutane streptavidin are photolabelled by N-(2-nitro-5azidobenzoyl)-N’-(d-biotinyl)-1,4-diaminobutane and (N-4-azidophenyl)-N’-(d-biotinyl)-1,4diaminobutane, respectively. Isolation, spectrophotometric characterization and sequence analysis of photolabelled peptides // J. Photochem. Photobiol. B:Biol.. 1998. V. 45. P. 9-18.

17. Кнорре Д.Г., Годовикова Т.С. Химические подходы к исследованию нуклеопротеидных структур (обзор) // Изв. АН. Сер. хим. 1999. С. 1225-1231.

18. Godovikova T.S., Kolpashchikov D.M., Orlova T.N., Richter V.A., Ivanova T.M., Grochovsky S.L., Nasedkina T.V., Victorova L.S., Poletaev A.I. 5-[3-(E)-(4-Azido-2,3,5,6-tetrafluorobenzamido)propenyl1]-2’-deoxyuridine-5’-triphosphate substitutes for thymidine-5’-triphosphate in the polymerase chain reaction // Bioconjugate Chem. 1999. V. 10. P. 529-537.

19. Morozova O.V., Kolpashchikov D.M., Ivanova T.M., Godovikova T.S. Synthesis of a new photocrosslinking 5-C-base-substituted UTP analogs and their application in highly selective affinity labeling of the tick-borne encephalitis virus RNA replicase proteins // Nucleosides&Nucleotides. 1999. V. 18. P.

1513-1514.

20. Туницкая В.Л., Кочетков С.В., Годовикова Т.С., Кочетков С.Н. Взаимодействие РНК-полимеразы бактериофага Т7 с аффинными модификаторами - аналогами нуклеозидтрифосфатов // Молекуляр.

биология. 2000. Т. 34. С. 60-66.

21. Mishchenko E.L., Kozhanova L.A., Denisov A.Yu, Gritsan N.P., Markushin Yu.Ya, Serebriakova M.V., Godovikova T.S. Study of the chemical structures of photo-cross-linking products between Tyr and the 5azido-2-nitrobenzoyl residue // J. Photochem. Photobiol. B: Biol. 2000. V. 54. P. 16-25.

22. Alekseyev P.V., Romanova I.V., Shakirov M.M., Godovikova T.S. p-Azidophenyl phosphate is a photoactivatable phosphorylating reagent and p-benzoquinone monoimine precursor // J. Photochem.

Photobiol. B:Biol.. 2001. V. 65. P. 39-46.

23. Popova T.V., Denisov A.Yu., Shakirov M.M., Komarova N.I., Alekseyev P.V., Serebriakova M.V., Godovikova T.S. // Long-lived reactive intermediate photogenerated from N-(5-azido-2-nitrobenzoyl)-N'(d-biotinyl)-1,2-diaminoethane as an affinity reagent to streptavidin // J. Photochem. Photobiol. B: Biol.

2001. V. 61. P. 68-77.

24. Popova T.V., Mal’shakova V.S., Alekseyev P.V., Kudryashova N.V., Shakirov M.M, Savinkova L.L., Drachkova I.A., Godovikova T.S. Photoanalogues of the initiation substrates of the RNA polymerase II, 5azido-2-nitrobenzoyl derivatives of the ATP -amidophosphate: the possible photoinduced degradation of the functional group to an N-arylhydroxylamine // Nucleosides, Nucleotides&Nucleic Acids. 2004. V. 23.

P. 921–925.

25. Кнорре Д.Г., Кудряшова Н.В., Попова Т.В., Шакиров М.М., Мальшакова В.С., Шпенев О.Е., Савинкова Л.К., Серебрякова М.В., Годовикова Т.С. Фотоактивируемые аналоги инициирующего субстрата РНК-полимеразы II на основе производных -амидофосфатов NTP: синтез, химические и фотохимические реакции функциональных групп // Биоорган. химия. 2005. Т. 34. С. 332-343.

Изд. лиц. ИД № 04060 от 20.02.2001.

Подписано в печать 24.05.20Формат бумаги 6084 1/16. Бумага № 1. Гарнитура “Times New Roman”.

Печать офсетная. Печ. л. 2,5. Уч.-изд. л. 2,8. Тираж 150. Заказ № 1Институт неорганической химии им. А.В. Николаева СО РАН.

Просп. Акад. Лаврентьева, 3, Новосибирск, 6300




© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.