WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


На правах рукописи

БАЖЕНОВА Тамара Александровна

БИОМИМЕТИЧЕСКИЕ МОДЕЛИ НИТРОГЕНАЗЫ С УЧАСТИЕМ ПРИРОДНОГО И СИНТЕТИЧЕСКИХ ГЕТЕРОПОЛИЯДЕРНЫХ КОМПЛЕКСОВ ЖЕЛЕЗА И МОЛИБДЕНА

02.00.15 – кинетика и катализ, химические наук

и А в т о р е ф е р а т диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук Черноголовка – 2012

Работа выполнена в Институте проблем химической физики Российской Академии Наук

Научный консультант: доктор химических наук, академик Шилов Александр Евгеньевич

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор Шур Владимир Борисович Институт элементоорганических соединений им. А.Н. Несмеянова Российской академии наук, г. Москва доктор химических наук, профессор Нефедов Сергей Евгеньевич Институт общей и неорганической химии им. Н.С. Курнакова Российской академии наук, г. Москва доктор химических наук, старший научный сотрудник Сырцова Лидия Александровна Институт проблем химической физики Российской академии наук, г. Черноголовка

Ведущая организация: Институт физиологически активных веществ Российской академии наук, г. Черноголовка

Защита состоится 16 мая 2012 г. в 10 час. 00 мин. на заседании диссертационного совета Д 002.082.02 при Институте проблем химической физики РАН по адресу:

142432, Московская область, г. Черноголовка, проспект академика Семенова, д.1, корпус общего назначения Института проблем химической физики РАН (КОН).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИПХФ РАН г. Черноголовка, проспект академика Н.Н. Семенова, 1.

Автореферат разослан ” ______ “_______________20____ г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор химических наук Т. С. Джабиев

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ



Актуальность темы. Фермент нитрогеназа, входящий в состав азотфиксирующих бактерий, катализирует в природе восстановление N2 до NH3, который, в отличие от атмосферного азота, может использоваться живыми организмами для синтеза белков, нуклеиновых кислот и других важных биомолекул. Не будет преувеличением сказать, что жизнь на Земле зависит от биологической фиксации азота – процесса восстановления атмосферного азота до аммиака.

Несмотря на большие успехи в исследовании нитрогеназы, достигнутые в последние годы, механизм функционирования фермента на молекулярном уровне остается неясным.

Второй главный источник связанного азота на Земле, индустриальный процесс синтеза аммиака по методу Габера-Боша, является очень энергозатратным, поэтому химики не оставляют попыток создания альтернативы с использованием гомогенного катализа. Для этого необходимо понимание того, каким образом природа в мягких условиях активирует самую прочную межатомную связь, тройную связь молекулы азота.

Нитрогеназа очень сложный фермент, многосубъединичный и многосубстратный. Чтобы разобраться в различных аспектах механизма, необходимо использовать разного типа биомиметические модели, некие упрощения, которые позволяют адекватно исследовать какие-то стороны функционирования фермента.

В активный центр фермента входит железо-молибденовый кофактор (FeMoco).

Это восьмиядерный кластер состава [(С)MoFe7S9 гомоцитрат], на котором, как сейчас доказано, осуществляется координация и восстановление различных субстратов – малых молекул с кратными связями, главной из которых является молекула N2.

Молекулярный механизм процессов на FeMoco не известен. Изучение фермента в целом дает мало информации о реакциях превращения субстрата в активном центре, так как эти реакции не являются скорость определяющими и не проявляются в ферментативной кинетике.

Общая особенность и биологического и промышленного путей синтеза аммиака – использование соединений железа в качестве активных центров – катализаторов реакции. В связи с этим развитие координационной химии диазотных комплексов железа, особенно полиядерных, и исследование восстановления азота в гомогенных апротонных азотфиксирующих системах на основе соединений железа является актуальным направлением исследований, позволяющим описать химизм постадийного превращения N2 в природном полиядерном железо-содержащем центре.

Исследование другого типа моделей, протонных азотфиксирующих систем с полиядерными активными центрами, позволяет понять общие принципиальные закономерности кластерного катализа восстановления азота, каким, по сути, является и природный процесс.

Мы решили ввести в круг изучаемых катализаторов и сам железо-молибденовый кофактор нитрогеназы, экстрагированный из фермента. Задача введения выделенного из белка FeMoco в реакции с субстратами нитрогеназы и изучения его как катализатора этих реакций к началу наших исследований решена не была. Исследование поведения металлокластера FeMoco вне белковой матрицы позволяет преодолеть кинетические ограничения, существующие в белковой нитрогеназной системе, которые препятствуют расшифровке детального механизма превращения субстратов в активном центре фермента. Такой подход позволяет также прояснить роль белкового окружения активного центра нитрогеназы в осуществлении ферментом его функции. А сравнение каталитических характеристик природного и моделирующих его действие синтетических комплексов, действующих в протонных азотфиксирующих системах, в одинаковых небелковых условиях позволяет понять, насколько они адекватны как модели.

Цель работы – получение новых знаний о механизме действия фермента нитрогеназы посредством разработки и изучения новых типов небелковых биомиметических систем, моделирующих различные стороны действия фермента, а также применения новых экспериментальных подходов к изучению нитрогеназной белковой системы in vitro.

Работа включала следующие задачи:

1. Изучение механизма восстановления молекулярного азота системами на основе соединений железа с литийорганическими восстановителями.

Для этого необходимо было изучить кинетические закономерности реакции восстановления хлорного железа литийорганическим соединением без азота и в присутствии азота выяснить состав и строение низковалентных производных железа, образующихся в этих системах и способных давать комплексы с азотом и другими субстратами нитрогеназы; выделить и исследовать состав, строение и свойства промежуточных диазотных комплексов, образующихся в этих системах; исследовать реакции низковалентных производных железа с рядом других малых молекул, определить их молекулярные структуры определить роль лития в активации малых молекул этими комплексами 2. Выделение из молибден-железного белка нитрогеназы входящего в его активный центр железо-молибденового кофактора - кластера FeMoco и изучение его реакционной способности в чисто химических условиях Для этого необходимо было найти условия, в которых выделенный из белка FeMoco способен катализировать реакции восстановления субстратов нитрогеназы изучить кинетические закономерности этих реакций, а также реакций FeMoco с ингибиторами нитрогеназы, с целью сравнения каталитического поведения FeMoco вне белка и в составе фермента изучить возможности восстановления на отделенном от белка FeMoco основного субстрата нитрогеназы – молекулярного азота изучить механизм каталитического действия выделенного из фермента кластера в реакциях восстановления субстратов нитрогеназы в чисто химических условиях, в частности, определить природу скорость определяющей стадии и механизм протонирования субстрата при катализе FeMoco; определить характерные свойства и особенности FeMoco как катализатора реакций восстановления субстратов нитрогеназы 3. Определение сходства и различий в механизмах катализа восстановления субстратов нитрогеназы кластерами природного и искусственного происхождения с целью выяснения, в какой мере синтетические полиядерные катализаторы моделируют активный центр фермента Для этого необходимо было изучить кинетические закономерности восстановления ацетилена, катализируемого полиядерным молибден-магниевым комплексом (Mg2Mo8), и ингибирования этой реакции молекулярным азотом и оксидом углерода (II) в тех же самых условиях и с участием тех же восстановителей, что были использованы при изучении каталитической реакционной способности выделенного из фермента FeMoco 4. Исследование особенностей протекания нитрогеназной реакции in vitro в сильных магнитных полях в разных условиях проведения эксперимента Для этого необходимо было разработать экспериментальные условия проведения реакции в шахте магнита исследовать кинетику реакции при различных соотношениях белковых компонентов реакции, разных температурах, разных значениях напряженности магнитного поля, в присутствии различных реагентов, оказывающих влияние на протекание нитрогеназной реакции in vitro Научная новизна. Найдены и подробно исследованы азотфиксирующие системы на основе железа и литийорганических восстановителей. Сочетание детального кинетического исследования и синтетического подхода, направленного на выделение и идентификацию промежуточных комплексов, позволило впервые убедительно обосновать механизм восстановления азота в этих системах. Показано, в частности, что определяющей скорость стадией восстановления азота в системе FeCl3-LiPh является реакция образования комплекса нуль-валентного железа, активного к молекулярному азоту.

Впервые экспериментально показано, что содействие соединений лития восстановлению азота комплексами железа связано с тем, что он образует смешанные комплексы переходного и непереходного металла, в которых литий равным образом принимает участие в активации N2 за счет множественной координации молекулы азота.

Впервые получены рентгеноструктурные характеристики бинарных железоорганических производных двухвалентного железа, а также ряда неописанных ранее железо-литиевых комплексов с субстратами и ингибиторами нитрогеназы.

Показано, что моноядерные комплексы железа образуют диазотные комплексы, содержащие реакционно-способную молекулу азота, только если состояние окисления железа в комплексе равно 0.

Впервые экспериментально показано, что достаточная активация молекулы N2 к дальнейшим реакциям по азоту возможна и в комплексах двухвалентного железа, только если эти комплексы полиядерные.

Впервые предложено и реализовано оригинальное исследование каталитической реакционной способности отделенного от белковой матрицы кластера FeMoсо в реакциях восстановления субстратов нитрогеназы в небелковой среде.

Впервые установлено, что FeMoсо и вне белкового окружения способен эффективно координировать молекулярный азот.

Проведено изучение кинетических закономерностей реакций, катализируемых FeMoсо вне белка; изучено взаимное влияние субстратов и ингибиторов, что позволило установить, что на восстановленном вне белка кофакторе активны к субстратам и ингибиторам несколько взаимозависимых активных центров с разными параметрами связывания.

Впервые проведенный сравнительный анализ каталитического поведения выделенного FeMoсо в реакциях восстановления ацетилена и ингибирования этого процесса оксидом углерода (II) и молекулярным азотом с таковым для ферментативной системы, показал значительное сходство основных закономерностей этих реакций (вплоть до количественного совпадения констант) для фермента и химических систем с участием кофактора. Сделан вывод, что наблюдаемые особенности связаны в первую очередь с составом и структурой FeMoсо, и проявляются им независимо от природы восстановителя и среды реакции.

Впервые найдены экспериментальные подтверждения механизма опосредованного протонирования субстрата при катализе FeMoсо вне белка, предсказанного ранее теоретическими расчетными методами.

На основе данных о каталитическом восстановлении ацетона на отделенном от белка FeMoсо найден новый субстрат нитрогеназы: показано, что нитрогеназа in vitro, как и FeMoсо вне белка, способна восстанавливать ацетон с образованием метана.

В работе впервые проведено сравнительное экспериментальное исследование в одинаковых условиях каталитических свойств магний-молибденового комплекса, входящего в активный центр самой эффективной на сегодняшний день модельной азотфиксирующей системы, и системы с участием FeMoсо вне белка. Показано значительное сходство в поведении и механизмах катализа реакций восстановления С2Н2 и ингибирования их оксидом углерода (II) системами с участием данных кластеров.

Впервые из исследования температурных зависимостей скоростей каталитических реакций в присутствии FeMoco и Mg-Mo-кластера найдено, что оба типа кластеров как катализаторы благоприятствуют осуществлению многоэлектронных окислительновосстановительных каталитических процессов: энергии активации образования продуктов 4-х электронного восстановления субстрата заметно меньше, чем продуктов 2-х электронного восстановления.

Впервые изучено влияние магнитного поля на нитрогеназную реакцию in vitro, что позволило выявить следующие особенности нитрогеназного катализа: а) различные кинетические события могут лимитировать общую скорость каталитического цикла в разных условиях проведения реакции; б) в лимитирующую стадию процесса восстановления субстрата при физиологических температурах включен дистанционный межкластерный электронный перенос; в) излом на температурной зависимости нитрогеназной реакции связан с изменением скорость определяющей стадии при температуре 20оС.

Практическая значимость работы заключается в формулировке механизма активации молекулярного азота металлоорганическими соединениями железа, что может быть использовано для последующего развития этого направления гомогенного катализа. Определенный практический интерес представляет разработка конкретных методик синтеза устойчивых железоорганических соединений.

Предложенный и реализованный в работе подход – исследование каталитической активности FeMoсо вне белка - является полезным и информативным для изучения механизма превращения субстратов нитрогеназой. Практический интерес представляет нахождение и разработка новых систем для изучения каталитической активности выделенного из белка FeMoсо, а также разработка модифицированного хроматографического метода получения препаративных количеств FeMoсо с использованием техники Шленка.

Понимание химического механизма функционирования одного из самых сложных ферментов – нитрогеназы – представляет интерес для фундаментальной науки, а в дальнейшем может стать научной основой создания новых экологически чистых катализаторов и каталитических процессов с использованием принципов, реализуемых в живой природе.

Личный вклад автора. В диссертации представлены результаты исследований, выполненных самим автором или под его непосредственным руководством. Личный вклад автора состоит в постановке задач, разработке и осуществлении экспериментальных исследований, в том числе, модифицированных методик выделения FeMoco, всего спектра кинетических исследований, методов обработки экспериментальных данных, а также анализе, интерпретации и обобщении полученных результатов.

В работе принимали участие сотрудники ИПХФ РАН: кхн Н.В. Ковалева, кхн Г.Н.

Петрова, д.х.н. А.Ф. Шестаков, кхн А.К. Шилова. Особая благодарность - д.х.н. К.А.

Лысенко и д.х.н. М.Ю. Антипину (ИНЭОС РАН), выполнивших большую часть РСА полученных автором монокристаллов комплексов.

Апробация работы. Основные результаты работы докладывались и обсуждались на следующих симпозиумах и конференциях: II Международная летняя школа по металлоорганическому катализу, Нойбранденбург, ГДР, 1984 год; IV Европейская конференция по металлоорганической химии, Рига, 1985 год; 11 Международный конгресс по фиксации азота, Париж, Франция, 1997 год; 3 Европейская конференция по фиксации азота, Лунтерен, Голландия, 1998 год; Всероссийское совещание по высокоорганизованным каталитическим системам, Черноголовка, 1998 год; Международный конгресс по фиксации азота, Фос-до Игуасу, Парана. Бразилия, 19год; 4 Европейская конференция по фиксации азота, Севилья, Испания, 2000 год; II Всероссийское научное совещание «Высокоорганизованные каталитические системы» 2000г., МГУ, Москва; 13 Международный конгресс по фиксации азота, Гамильтон, Онтарио, Канада 2001 год; 1 Международная конференция по высокоорганизованным каталитическим системам (Highly Organized Catalytic Systems, HOCS2002) Черноголовка 2002 год; Международная конференция «Modern trends in organometallic and catalytic chemistry» памяти М.Е. Вольпина, г. Москва, 2003 год; XV Всероссийский симпозиум «Современная химическая физика», г. Туапсе, 2003 год; 6 Европейская конференция по фиксации азота, Тулуза, Франция, 2004 год; Третий международный симпозиум «Молекулярный дизайн и синтез супрамолекулярных архитектур», Казань, Россия, 2004 год; 9 Международный симпозиум по спиновым и магнитным эффектам в химии и других областях, Оксфорд, Великобритания, 2005 год; VII Всероссийская конференция «Механизмы каталитических реакций» (с международным участием) г.

Санкт-Петербург, Россия, 2006 год; 38-й Международная конференция по координационной химии ICCC38, г. Иерусалим, Израиль, 2008 год; XXI Симпозиум «Современная химическая физика», Туапсе, 2009 год; 39 Международная конференция по координационной химии ICCC39, г. Аделаида, Австралия, 2010 год.

Публикации. Основное содержание работы

опубликовано в 37 статьях в отечественных и зарубежных журналах (список приводится в конце данного реферата) и более чем 30 тезисах докладов на международных и российских конференциях и конгрессах.

Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на 333 страницах машинописного текста и включает 10 таблиц и 91 рисунок. Диссертация состоит из введения, шести глав, списка литературы из 307 наименований.

Работа выполнена при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (гранты 96-03-33627, 98-03-32291, 01-03-33278, 04-03-32635, 08-03-00674) и Совета по грантам Президента Российской федерации (программа по государственной поддержке ведущих научных школ РФ, гранты № НШ-2065.2003.3, № НШ-4525.2006.3, № НШ-4167.2008.3, № НШ-3198.2010.3).

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении дана общая характеристика области исследований, обоснована актуальность темы, сформулированы цели и задачи работы, описаны основные результаты, их научная новизна и практическая значимость.

В первой главе приведен обзор литературы по теме диссертации, а именно, по составу, свойствам, структуре и механизму действия фермента нитрогеназы;

рассмотрены известные к настоящему времени литературные данные о составе и свойствах железо-молибденового кофактора нитрогеназы в белке и вне белка; по восстановлению азота в апротонных средах; по диазотным комплексам железа и молибдена, особенно тем, которые содержат реакционно-способный азот.

Во второй главе описаны экспериментальные методики и аналитические методы, использованные в работе.

В третьей главе приведены результаты изучения апротонных азотфиксирующих систем состава FeCl3 + LiAr.

В качестве восстановителей хлорного железа в эфире для получения гомогенных апротонных азотфиксирующих систем исследован ряд ароматических и алифатических литийорганических соединений, а именно, фениллитий, о-, m-, p-толиллитий, мезитиллитий, -нафтиллитий и н-пропиллитий. На примере системы FeCl3 + LiPh проведено подробное кинетическое исследование процессов восстановления хлорного железа фениллитием а также кинетики реакции восстановления молекулярного азота в этой системе. Изучено влияние характера радикала R литийорганического соединения на строение, свойства и реакционную способность образующихся железо-органических комплексов. Исследованы реакции этих комплексов с рядом малых молекул, в частности, с N2, H2, CO, C2H4, PhCCPh, PhN=NPh; для большинства соединений получены монокристаллы и определены их молекулярные структуры.

Кинетические закономерности и механизм восстановления азота в системе хлорное железо – литийфенил.

В одной из наших ранних работ1 было показано, что при смешивании эфирных растворов хлорного железа и фениллития образуются гомогенные системы, способные восстанавливать молекулярный азот до гидразина и аммиака. Затем А.К. Шилова, А.Е.

М.О. Бройтман, Т.А. Воронцова, А.Е. Шилов, Восстановление молекулярного азота в системе FeCl3 + LiPh + N2, Кинетика и катализ, 1972, т. 13, №1, с. 61-Шилов и Б. Чубар2 показали, что присутствие галоидных солей лития (LiBr, LiI) в реакционном растворе значительно увеличивает скорость накопления продуктов восстановления азота. Интересно было понять, какова природа ускоряющего действия солей, способствуют ли они облегчению восстановления азота в комплексах, как это ранее предполагали2, или же они влияют на скорость накопления активной к азоту формы железа. Для решения этой задачи мы, наряду с исследованием кинетики накопления азотсодержащих продуктов, изучили кинетическое поведение системы без азота и сделали вывод о механизме восстановления хлорного железа фениллитием и действия солей на эту реакцию.

Кинетика и механизм реакции восстановления хлорного железа фениллитием Изменения спектров поглощения систем FeCl+ LiPh в атмосфере аргона в присутствии и в отсутствие бромистого лития качественно аналогичны: по мере накопления комплекса восстановленного железа в спектре поглощения появляется полоса с максимумом 500 нм.

Оптическая плотность при 500 нм растет во времени и достигает постоянного значения.

Кривые имеют автокаталитический характер, причем с Рис.1. Кинетические кривые накопления восстановленного увеличением комплекса железа в системе FeCl3 + LiPh в аргоне для концентрации различных концентраций LiBr: 1 – без LiBr, 2 – 0.1 М LiBr, бромистого лития 3 – 0.2 М LiBr, 4 – 0.4 М LiBr, [FeCl3] = 0.7 10-2 M уменьшается период индукции и увеличивается скорость процесса, Рис. 1.

Было обнаружено, что предельное значение оптической плотности при 500 нм пропорционально исходной концентрации хлорного железа и не зависит от концентрации бромистого лития. При этом начальные скорости накопления окрашенного комплекса и максимальные скорости пропорциональны исходным концентрациям, как бромистого лития, так и хлорного железа. Если в начальный момент времени к реакционной смеси FeCl3 + LiPh добавить раствор конечного продукта, то индукционный период снимается и наблюдается максимальная скорость с Чубар Б., Шилов А.Е., Шилова А.К. Каталитический эффект литиевых солей при восстановлении азота в системе FeCl3-LiPh-N2, Кинетика и катализ, 1975, т.16, №4, с. 1097-10самого начала процесса. Конечным продуктом, накапливающимся в системе при комнатной температуре и ответственным за автокатализ, является комплекс нульвалентного железа. В пользу этого свидетельствуют следующие экспериментальные данные: во-первых, по данным магнитного взвешивания конечный продукт диамагнитен, во-вторых, при действии HСl на продукты реакции выделяется водород, в-третьих, его образование из комплекса Fe(II), образующегося при сливании хлорного железа с фениллитием, сопровождается выделением дифенила.

Автокаталитический характер реакции можно объяснить тем, что накапливающийся в системе комплекс Fe(0) вступает во взаимодействие с низкотемпературным комплексом Fe(II), ускоряя его восстановление. Для объяснения совокупности экспериментальных данных был предложен следующий механизм. В первой стадии (Схема 1, уравнение 1) взаимодействие хлорного железа с фениллитием при низкой температуре приводит к образованию комплекса двухвалентного железа. Этот комплекс при комнатной температуре восстанавливается до соединения нуль-валентного железа посредством отщепления молекулы дифенила.

Схема 1.

LiPh c LiBr Fe(II)PhLn FeCl3 -20oC kFe(II)Ph2 Ln Fe(0) Ln + LiBr + Phk2 Ln Fe(0) + PhFe(II)Ph2 Ln Fe(0) Ln + где L – лиганды, например PhLi, LiBr, эфир; n – число лигандов, которое, возможно, является переменным.

Процесс восстановления ускоряется бромистым литием (уравнение 2). Третье уравнение учитывает, что накопление комплекса нуль-валентного железа ускоряется самим конечным продуктом.

Из этой схемы следует, что накопление комплекса нульвалентного железа происходит по закону Интегрируя это дифференциальное уравнение, находим, что Теоретические кривые, изображенные на Рис. 1 сплошными линиями, рассчитывали по этой формуле. Параметры k1, [Fe(II)]0, и k2 определяли из экспериментальных значений [Fe(0)], t, соответствующих случаю [LiBr]=1х10-1М (Рис.





1, кривая 2). Остальные теоретические кривые строили, исходя из тех же значений k1, k2 и [Fe(II)]0. Величину k1[LiBr] меняли в соответствии с экспериментальными значениями концентрации бромистого лития. Было найдено: k2 = 0.7ч-1 D-1, Dmax = 1.11, k1[LiBr] (кривая 2) = 0.07ч-1. Видно, что при значительных изменениях концентраций соли и железа экспериментальные данные достаточно хорошо укладывается на теоретические кривые, что говорит о правильности предлагаемого механизма.

По нашему мнению механизм ускоряющего действия бромистого лития в процессе восстановительного распада железоорганических комплексов связан с вхождением аниона в координационную сферу металла, что приводит к ослаблению связи железоуглерод и облегчению отщепления дифенила. В этом смысле действие Br- аналогично действию других оснований, например, ТГФ, PPh3, алкенов, которые, как известно, ускоряют распад металлоорганических соединений. Таким же образом можно объяснить каталитическое действие комплекса нуль-валентного железа на восстановительный распад соединения двухвалентного железа, поскольку по отношению к соединению Fe(II) комплекс Fe(0) является донором.

Кинетика восстановления молекулярного азота в системе FeCl3 + LiPh Если реакцию взаимодействия хлорного железа с фениллитием проводить в присутствии молекулярного азота, то образующийся на стадии 2 (см. Схему 1 на стр.

10) комплекс нуль-валентного железа реагирует с N2 с образованием комплекса, имеющего линию поглощения в видимой области с максимумом 476 нм. Под 1действием протонсодержащих реагентов 90 азот из комплекса выделяется в виде гидразина (до 25% на железо в 3 комплексе), N2 (около 75%) и аммиака (14%). Сумма азотсодержащих продуктов, образующихся при разложении, равна моль на моль железа. На Рис. 2 приведены 1 кинетические кривые накопления диазотного комплекса для различных исходных концентраций хлорного железа при постоянной концентрации LiBr. Из рисунка видно, что начальная скорость 0 0 100 200 300 400 500 6накопления комплекса с азотом время, мин пропорциональна исходной концентрации хлорного железа. Константа скорости не зависит от концентрации хлорного железа Рис. 2 Кинетические кривые в интервале (0.3-1.4)х10-2М при накопления азотного комплекса в постоянной концентрации бромистого системе FeCl3-LiPh-N2 для различных лития. Кроме этого было показано, что концентраций FeCl3:1 – 0.4х10-2 М, 2 - начальная скорость накопления гидразина 0.5, 3 – 0.7, 4 – 1.1 х10-2 М;

изменяется пропорционально [LiBr]=0.3M; 5 – спрямление кривых концентрации LiBr и не зависит от и 2 в координатах ln D/D-D – t концентрации фениллития при соотношении PhLi/FeCl3 >10 и давления азота при PN2 >200мм.рт.ст. Если вначале провести реакцию FeCl3+LiPh в атмосфере аргона до достижения максимальной оптическая плотность оптической плотности при 500 нм, а затем в систему ввести азот, то в спектре уменьшается поглощение при 500 нм и увеличивается при 476 нм, причем постепенно спектр становится идентичным конечному спектру раствора, в котором реакция с самого начала проводилась под азотом.

Полученные кинетические данные показывают, что активной частицей, реагирующей с молекулярным азотом, является комплекс нульвалентного железа, так как система, выдержанная в аргоне в течение длительного времени и содержащая только Fe(0), продолжает оставаться активной к азоту. Кинетическое уравнение включает концентрацию железа в первой степени, что соответствует активной моноядерной форме железа, то-есть, при рассмотрении реакции хлорного железа с фениллитием в азоте приведенную выше Схему 1 реакции в аргоне необходимо дополнить реакцией взаимодействия комплекса LnFe(0) с азотом.

Схема 2.

LiPh c LiBr Fe(II)PhLn FeCl3 -20oC kFe(II)Ph2 Ln Fe(0) Ln + LiBr + Phk2 Ln Fe(0) + PhFe(II)Ph2 Ln Fe(0) Ln + k[L Fe(0)N2] Ln Fe(0) + Nn Предположим, что образующийся в реакции 2 комплекс LnFe(0) быстрее реагирует с азотом, чем расходуется по реакции 3, т.е. k3>>k2[Fe(II)]0. Из этой схемы скорость накопления азотного комплекса равна, а так как exp{-, находим а [FeN2] exp{-.

Теоретические кривые, построенные по этому уравнению, приведены на Рис. сплошными линиями. Видно, что экспериментальные точки достаточно хорошо укладываются на теоретические кривые. В координатах ln D/D-D – t экспериментальные точки с хорошей точностью описываются линейной зависимостью (прямая 5, рис. 2). Это позволило определить величину k1 – константы скорости восстановительного распада железоорганического соединения Fe(II) k’ =0.6 D-1ч-1, которая оказалась близкой по значению к величине k1 (k1=0.7 D-1ч-1), найденной из автокаталитических кривых накопления активного к азоту комплекса нуль-валентного железа.

Таким образом, мы установили, что в изучаемой системе азот реагирует с комплексом нуль-валентного железа, который образуется по автокаталитическому закону из комплекса двухвалентного железа. Процесс восстановления ускоряется в присутствии бромистого лития. С ускоренной наработкой активного к азоту комплекса железа (0) связано и наблюдавшееся ускорение восстановления N2 в присутствии солей лития.

Строение бинарных железоорганических соединений Для расширения класса гомогенных азотфиксирующих систем на основе железа исследован, помимо фениллития, ряд ароматических и алифатических литийорганических соединений, а именно, о-, m-, p-толиллитий, мезитиллитий, нафтиллитий и н-пропиллитий. Мы нашли, что отолилитий и мезитиллитий не взаимодействуют с хлорным железом, по-видимому, из-за стерических затруднений. Мета- и p-толиллитий реагируют с хлорным железом аналогично фениллитию с образованием анионных -арильных комплексов железа (0), но с меньшими скоростями. Все эти комплексы нуль-валентного железа активны в восстановлении азота.

Взаимодействие хлорного железа с нафтиллитием заканчивается образованием парамагнитного дилитийтетранафтилферрата(II), стабильного как к дальнейшему восстановлению Рис. 3.Молекулярная нафтиллитием, так и к реакции с азотом. Это структура подтверждается обнаружением динафтила в [LiO(C2H5)2]2[Fe(C10H7)4]:

продуктах реакции, а также результатами изучения вверху – проекция состава и строения образующегося комплекса структуры в направлении двухвалентного железа.

минимального Отметим, что комплекс содержит только перекрывания атомов; внизу связанные арильные лиганды и является первым – вдоль С(1) – Fe связи примером такого типа соединений двухвалентного железа.

-30oC + NpLi [LiOEt2]2[FeNp4] FeCl3 5 + 3 LiCl + 1/2Npэфир Дополнительное восстановление этого соединения, например, н-пропиллитием, приводит к диамагнитному комплексу нуль-валентного железа, который, в отличие от исходного литийтетранафтилферрата, реагирует с молекулярным азотом с образованием диазотного комплекса, способного к протонированию по азоту.

Железо-литиевые комплексы с молекулярным водородом Железо-органические производные нуль-валентного железа (с R=Ph p-Tol, m-Tol), активные к молекулярному азоту, 515 nm 515 nm реагируют в очень мягких условиях (20оС, D D D давление Н2 менее 100 мм рт. ст.) с 500 nm 500 nm молекулярным водородом. Фенильные комплексы железа реагируют с водородом очень быстро: уже через 2 минуты после напуска водорода из раствора выпадают блестящие черные кристаллы; реакция мета-толильного производного с Нзаканчивается лишь через сутки, паратолильного - за несколько часов. За реакцией с водородом удобно следить по спектрам (Рис. 4). Молекулярные структуры определены для фенильного и 28 24 20 28 24 20 , 1000 cm-, 1000 cm-пара-толильного дигидридов.

Было найдено, что комплексы двухвалентного железа [(Н)2FеPh4]Li4Еt20 (1) и [(Н)2Fе(p-Tol)4]Li4 4Еt20 (2) имеют сходное строение с фактически одинаковой геометрией центрального октаэдрического узла [Ph4FeH2] и транс расположением двух гидридных атомов Н при атоме металла. Расстояния Fe-Н равны 1,64(3) и 1,69(2) и характерны для известных гидридных комплексов железа. В ИК-спектре 1 колебанию связи железо-гидрид отвечает очень интенсивная широкая полоса при 12см-1, понижающая частоту до 898 см-1 при замене в 1 H2 на D2 (соответственно для (FeН) составляет 1223 cм-1 и (FeD) - 9Рис. 4. Вверху: Изменение спектра см-1).

поглощения системы FeCl3 + LiPh при После выпадения из эфирного комн. To в аргоне и в присутствии H2:

раствора кристаллы 1 и 2 в эфире уже не 1–спектр фенильного производного двухвалентного железа; 2 - спектр растворяются. Но они прекрасно комплекса нуль-валентного железа; 3– растворяются в 2,5спектр дигидрида Li4[Fe(H)2Ph4]4Et2O диметилтетрагидрофуране и стабильны в (продукта реакции комплекса нульэтом растворителе в течение длительного валентного железа с молекулярным времени. Растворяются они и в водородом;

тетрагидрофуране: уже при температуре Внизу: молекулярная структура плавления ТГФ (-66оС) раствор дигидрида Li4[Fe(H)2Ph4]4Et2O интенсивно окрашен в ярко-малиновый цвет с линией поглощения той же, что в эфире. При повышении температуры до комнатной цвет ТГФ раствора дигидрида медленно меняет окраску с ярко-малиновой на красно-коричневую (max = 465 нм), тоесть, ТГФ не является нейтральным растворителем для этих комплексов. Проведенный РСА показал, что 1 при растворении в абсолютном ТГФ превращается в железолитиевый гидридный комплекс [FePh3(µ2-H)3FePh3]Li5·5THF (3). Его молекулярная структура приведена на Рис. 5.

Рис. 5 Молекулярная структура железо-литиевого гидридного кластера [Ph3Fe(µ2-H)3FePh3]Li5·5THF (3).

Пара-толильный транс-дигидрид претерпевает аналогичное, но гораздо более медленное превращение уже в среде абсолютного диэтилового эфира, в котором он, в отличие от 1, хорошо растворим. Молекулярная структура образующегося комплекса также определена методом РСА. Механизм превращения специально не изучался, показано лишь, что все уходящие фенильные группы находятся в реакционной смеси в виде дифенила.

Оба изученных комплекса 3 и 4 имеют сходное строение центрального фрагмента с двумя концевыми и тремя мостиковыми атомами лития между двумя атомами железа, связанными в комплексах связью металл-металл длиной 2,389(1) и 2,379(1) в 3 и 2,378(2) в 4. Такие длины связей отвечают прочному взаимодействию металл-металл.

Концевые атомы лития расположены фактически на продолжении линии связи Fe-Fe с образованием почти строго линейных цепочек Li-Fe-Fe-Li. Симметрия расположения мостиковых атомов лития близка к тройной (см. рис 5).

Транс-дигидридные комплексы двухвалентного железа не реагируют с молекулярным азотом. Образующиеся из них под действием ТГФ железо-литиевые полиядерные комплексы реагируют с ненасыщенными соединениями, образуя аддукты с частичным восстановлением субстратов при обработке HCl. Так, например, этилен образует с 3 комплекс, дающий при разложении HCl этан (выход 70%) и этилен (30%).

Монооксид углерода (II) дает карбонильный комплекс (1 CO на 1 Fe), высвобождающий СО под действием HCl. Аддукт с молекулярным азотом дает гидразин (25-30% на железо) и N2 (70-75%).

ИК спектры продукта взаимодействия комплекса 3 с N2, содержащие изотопы (14) (15) 7 N2, N2, а также Li и Li, показывают, что ионы лития участвуют во взаимодействии 3 с N2, образуя Li-N связи.

Анализ имеющейся к настоящему времени литературы по диазотным комплексам железа показал, что только моноядерные комплексы Fe(0), с очень высокой электронной плотностью на железе, причем, анионные, с дополнительной координацией на азоте калия или магния, показывают образование небольшого количества гидразина при протолизе3. В литературе нет ни одного примера диазотного комплекса Fe(II), содержащего реакционно-способный азот, кроме комплекса, образующегося при взаимодействии 3 с азотом, описанного в данной работе. Обращает на себя внимание тот факт, что фактически комплекс является полиядерным, где возможна множественная координация молекулы азота, за счет которой достигается необходимая для дальнейших реакций активация NN связи даже таким не слишком восстановленным состоянием железа, как Fe(II), которое, по-видимому, только и возможно в активном центре природных азотфиксирующих систем.

Реакция азобензола с железо-литиевыми соединениями; молекулярная структура и свойства образующихся комплексов Рис. 6. Молекулярная структура Fe(N2Ph2)3(Li(OEt2))3 (6).

A и B показывают различные проекции структуры; контакты Fe...Li показаны пунктиром Чтобы получить информацию о возможных способах координации NN кратных связей с железо-литиевыми комплексами, мы исследовали их взаимодействие с азобензолом (дифенилдиазеном) и реакции образующихся комплексов с протонирующими агентами, а именно, с водой или сухим HCl. Отметим здесь, что диметилдиазен, как было показано, является субстратом нитрогеназы.

В реакцию с азобензолом вводили железо-литиевые комплексы, показавшие активность к молекулярному азоту, комплекс нуль-валентного железа предположительного состава Ph4FeLi4(OEt2)4, образующийся по реакции FeCl3 + LiPh (5) и гидридный комплекс Fe(II) [FePh3(µ2-H)3FePh3]Li5·5THF (3).

Согласно данным рентгеноструктурного анализа при взаимодействии комплекса с азобензолом получается соединение Fe(N2Ph2)3Li3(OEt)3 6, а комплекса 3 – соединения Fe(N2Ph2)3Li2(THF)2 7 и Fe(N2Ph2)3Li2(OEt)2 8. Найденные молекулярные структуры соединений 6, 7 и 8 приведены на Рис. 6, 7, соответственно.

J.L. Crossland, D.R. Tyler, Iron-dinitrogen chemistry: Dinitrogen activation and reactivity, Coord. Chem. Rev. 254, 2010, 1883-18Рис. 7. Молекулярная структура комплексов: Слева Fe(N2Ph2)3(Li(THF))2 7 Справа - Fe(N2Ph2)3(Li(OEt2))2 8. A и B показывают различные проекции структуры; контакты Fe...Li показаны пунктиром Соединение 6 имеет кристаллографическую ось третьего порядка, C3, проходящую через атом железа, который координирован тремя азобензольными лигандами и имеет слегка искаженную плоскую геометрию. Атомы азота азобензольных N2Ph2 лигандов, помимо связей Fe-N, образуют дополнительные связи с LiOEt2 группировками. Таким образом, в соединении 6 атом железа оказывается в центре девятичленного «складчатого» цикла Li3(N2)3 (Рис.. 6, В), с фенильными кольцами азобензольных лигандов, расположенными выше и ниже плоскости цикла (Рис.. 7, А). Расположение ионов лития в соединении 7 вызывает укорочение расстояния Fe...Li до 2.689(3).

Примечательно, что расстояния Li-Fe в комплексе (FePh3(2-H)3FePh3)Li5 5THF значительно короче (2.45-2.53(1) ).

Соединения 7 и 8 изоструктурны, длины связей и углы в этих комплексах очень похожи. Кристаллические структуры соединений имеют кристаллографические оси второго порядка C2, проходящие через атомы железа и середины N(1)-N(2) связей.

Кроме этого, также как и в соединении 6, металлические центры в обеих структурах имеют координационное число 6 и слегка искаженную плоскую геометрию. Интересно, что в структурах 7 и 8 только по два иона лития в виде групп (Li(THF) в 7 и Li(OEt2) в образуют связи с азобензольными лигандами, с той же самой ориентацией Ph колец по отношению к Fe(N2Ph2)3 фрагменту (Рис. 7) как и в соединении 6.

При протолизе комплексов образуются азобензол, гидразобензол и анилин, то есть продукты двух и четырехэлектронного восстановления азобензола. Взаимное соотношение их зависит от условий протолиза.

Реакция железо-литиевых соединений с тройной СС связью Чтобы исследовать строение аддуктов 3 с непредельными соединениями, мы провели его реакцию с толаном. Реакцию проводили в тех же условиях, что и реакцию с азотом.

Из раствора были выделены черные, хорошо ограненные кристаллы, как показал РСА монокристалла, 1,4-дилитийтетрафенилбутадиена (9). Интересно, что ранее было описано образование такого соединения в реакции толана с металлическим литием4, но структура этого соединения не была известна.

Общий вид комплекса 9 показан на Рис. 8 Он соответствует димеру димеров с осью симметрии лития [Li4(THF)4(C4Ph4)2] второго порядка. Атомы лития образуют сильно искаженный тетраэдр, и каждый атом лития координирован одной молекулой ТГФ (длины связей Li-O равны 1.944(2) и 1.967(5)), а также углеродными атомами бутадиеновой цепи C(1)-C(4) дианионов [PhC1 C2 (Ph) C3(Ph) C4(Ph)]2.

Механизм образования соединения можно представить как рекомбинацию двух Li-C(Ph)-C(Ph) фрагментов, образованных в координационной сфере одного или двух атомов железа после переноса атомов лития к С атомам толанового лиганда, хотя в Рис 8. Общий вид молекулярной отсутствие кинетических данных нельзя структуры 1,4-дилитийбутадиенисключать и образование таких частиц вне THF комплекса.

координационной сферы железа.

Таким образом, мы показали, что взаимодействие ароматических литийорганических соединений с безводным хлорным железом в апротонных растворителях приводит к образованию железо-литиевых комплексов разной ядерности и состава в зависимости от характера радикала и полярности и координирующей способности растворителя. Поскольку в этих соединениях все расстояния между атомами металлов находятся в области валентных взаимодействий, их следует рассматривать как гетерометаллические кластеры.

Согласно расчетам состояние атомов лития в этих смешанных комплексах является промежуточным между Li(0) и Li(+1) и литию принадлежит равноправная роль в активации молекулы азота. Экспериментальное исследование ИК-спектров ряда изотопозамещенных (с изотопами лития, азота и водорода) образующихся из этих соединений азотных комплексов показало, во-первых, многосвязанность молекулы N2 в этих комплексах, а во-вторых, существенную роль лития при координации азота за счет образования связей азот-литий. Существенная роль лития в координирующей способности этих кластеров подтверждается также результатами, полученными при исследовании их взаимодействия с дифенилацетиленом и азобензолом как модельными молекулами.

В четвертой главе приведены и обсуждены результаты изучения каталитической активности железо-молибденового кофактора нитрогеназы вне белка в сравнении с поведением М-центра – кофактора внутри белковой матрицы.

E.H. Braye, W. Hbel and I. Caplier, J. Amer. Chem. Soc., 83 (1961) 44Наличие всего лишь двух связей кофактора с белком (Рис. 9) позволяет при соблюдении определенных условий5 отделить этот кластер от белковой глобулы без его разрушения и работать с ним как с обычным химическим соединением. Из рентгеноструктурного анализа монокристалла МоFe белка известно, что FeMoco погружен примерно на 10 внутрь белковой глобулы, что объясняет его устойчивость к действию воды в протеинсвязанном состоянии. Разрушение защитного Рис. 9. Молекулярная структура железомолибденового кофактора нитрогеназы окружения при отделении FeMoco от (FeMoco) с аминокислотами, посредством белка приводит к тому, что он легко которых он связан с белковой матрицей (гидролизуется водой или спиртами.

442His и -275Cys), а также важными Поэтому мы предложили создавать аминокислотами, определяющими «выдачу» каталитические системы с участием протонов (-195His) и предельный размер FeMoco в апротонных средах разной субстратов (-70Val) полярности, а в качестве источников протонов, необходимых для получения продуктов восстановления из координированных на катализаторе молекул субстрата, использовать специально добавляемые вещества, с рК, достаточными для протонирования, но не разрушающими кластерную структуру активного центра.

FeMoco выделяли из МоFe белка нитрогеназы Azotobacter vinelandii с использованием хроматографического метода, внеся некоторые модификации в методику: вместо проведения процедуры выделения в аргоновом «боксе» пользовались техникой Шленка для работы в инертной атмосфере, сконструировав для этой цели специальную хроматографическую установку.

Базовая система, для которой были получены основные результаты работы, выглядела следующим образом: FeМосо нитрогеназы Azotobacter vinelandii (катализатор), амальгама цинка или европия (восстановитель), диметилформамид (ДМФА) (растворитель), тиофенол (донор протонов) и ацетилен (субстрат).

С целью подбора амальгам, имеющих восстановительный потенциал, достаточный для перевода FeMoco в восстановленное (субстратсвязывающее, FeMoco(red)) состояние, было проведено исследование электрохимического поведения FeMoco в ДМФА методом циклической вольтамперометрии. Найдено, что формальный редокс потенциал перехода FeMoco из так называемого полувосстановленного (дитионит-восстановленного, FeMoco(s-r)) состояния*, в восстановленное состояние, равен 0.73 В (отн. н.в.э.). Таким образом, потенциалы амальгам цинка (Е = 0.84 В отн. н.в.э.) и европия (Е = 1.4 В отн. н.в.э) (потенциалы получены прямыми измерениями в среде ДМФА/тиофенол) достаточны для восстановления FeMoco.

Shah V. K. and Brill W. J. // Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 1977. V. 74. P. 32* Редокс состояние FeMoco в присутствии восстановителя дитионита Целостность кластерного скелета FeMoco и наличие гомоцитрата в его составе после выделения кофактора из белка и после участия его в каталитической реакции вне белка проверяли с помощью теста на «биологическую активность», который заключается во встраивании экстрагированного FeMoco в дефектный по кофактору MoFe белок с последующей проверкой активности холофермента по отношению к восстановлению ацетилена в полной нитрогеназной системе. Этот тест является единственным критерием для идентификации и оценки состава и строения выделенного из белка FeMoco. В наших опытах специфическая активность экстрагированного FeMoco после встраивания его в дефектный MoFe белок нитрогеназы Klebsiella pneumoniae Kp 5058 составляла 18020 нмоль С2Н4 в мин на нмоль Мо. Активность нитрогеназной системы к восстановлению ацетилена после реконструкции MoFe белка образцами FeMoco «до» и «после» участия его в каталитических реакциях (с использованием амальгам цинка и европия в качестве восстановителей, а также тиофенола с концентрацией до 0.2 М) оказалась практически одинаковой. Этот факт доказывает, что FeMoco является истинным катализатором изучаемых реакций, так как после участия в реакциях кофактор сохраняет свою целостность и активность.

Кинетические закономерности восстановления ацетилена, катализируемого FeMoco вне белка При изучении каталитической активности FeMoco вне белка было найдено, что при использовании амальгам цинка и европия как доноров электронов (в апротонных растворителях с тиофенолом в качестве источника протонов) FeMoco является эффективным катализатором восстановления субстрата нитрогеназы ацетилена, причем выход продуктов и скорость реакции растут при переходе от Zn(Hg) к Eu(Hg), увеличиваясь с ростом катодного (отрицательного) потенциала восстановителя.

В системе с амальгамой европия проведено сравнительное изучение каталитического поведения кофакторов, выделенных из MoFe белков нитрогеназ различных микроорганизмов - Azotobacter vinelandii и Klebsiella pneumoniae. Мы нашли, что в одинаковых реакционных условиях эти катализаторы ведут себя практически идентично (Рис. 10). Специфическая активность в «биотесте» для данных образцов также оказалась одинакова.

Были установлены следующие факты: катализатор необратимо разрушается под действием кислорода; как в отсутствие FeMoco, так и в присутствии FeMoco, разрушенного кислородом воздуха, не наблюдается образования продуктов восстановления ацетилена (этилена и этана) амальгамами Zn или Eu в ДМФА в присутствии тиофенола; при повышении температуры реакции выше 40 С скорости восстановления ацетилена обеими амальгамами значительно падают, видимо, за счет термического разрушения FeMoco. Этилен является плохим субстратом в этих системах: наблюдается всего лишь стехиометрическое восстановление этилена в этан.

Кроме потенциала восстановителя, на скорость накопления продуктов каталитических реакций оказывают влияние интенсивность перемешивания амальгамы, фактически, размер площади поверхности «электрода», что указывает на поверхностный характер реакций.

343C2HC2H232Eu(Hg) 21C2H1C2HC2HZn(Hg) 1C2H0 100 200 300 400 50 600 1200 1800 2400 3000 3600 42время, с время, сек Рис. 10. Кинетика восстановления ацетилена амальгамами цинка или европия, катализатор FeMoco (слева); справа - Сравнение каталитического поведения кофакторов нитрогеназ из разных бактериальных источников: —•—FeMoco из нитрогеназы Klebsiella pneumoniae [Mo] = 0.610-5 M, ——FeMoco из нитрогеназы Azotobacter vinelandii [Mo] = 0.5310-5 M Условия реакции: [Mo] = 0.5310-5M; растворитель - ДМФА (4 мл); Eu(Hg) 0.5 мл.;

Zn(Hg) 0.7 мл.; [PhSH] = 0.012 M, давление С2Н2 - 180 мм Hg, температура 21оС Система с Eu/Hg в качестве восстановителя Протекающая в системе реакция в общем виде может быть представлена следующим уравнением:

FeMoco C2H+ Eu/Hg + PhSH C2H4 + C2H6 + Eu2+ PhS- + H+ ДМФА 21oC Фактически происходит восстановление С2Н2 до этилена и этана с использованием электронов амальгамы европия и протонов тиофенола. Накопление продуктов восстановления С2Н2, этилена и этана, в данной системе происходит параллельно (см.

Рис. 10).

В системе изучены зависимости скоростей образования этилена и этана от концентраций катализатора, субстрата, протонирующего агента, концентрации амальгамы, а также методом ИК-Фурье спектроскопии исследована стереоспецифичность реакции.

продукты, моль x продукты, моль x Зависимость начальной скорости* образования этилена от давления субстрата при катализируемом FeMoco восстановлении ацетилена амальгамой европия приведена на Рис. 11.

w, моль этилена/мин х Мо w 1,30 1,Б 1,20 А 1,1,log W = 2.8 + 1.6 * log P 0,0,00 0,02 0,04 0,-1,3 -1,2 -1,1 -1,0 -0,9 -0,8 -0,7 -0,C2H2, атм lg P C2H0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,C2H2, атм Рис. 11. Зависимость скорости образования этилена в реакции восстановления С2Намальгамой Eu, катализируемой FeMoco, от давления субстрата; вставка А - участок зависимости для Р (С2Н2) = 00.06 атм; вставка Б – преобразование S-образной части кривой (Р (С2Н2) = 0.060.3 атм) в координатах Хилла; Условия: [FeMoco] = 0.5510M; Eu(Hg) (1.1 М) 0.5 мл; [PhSH] = 0.012 M; растворитель - ДМФА (4.3 мл); С2Н2;

21оС Видно, что зависимость скорости накопления этилена (и этана, не приведено на Рис.) от концентрации субстрата имеет сложный характер, что объяснено наличием на восстановленном кластере FeMoco как минимум двух взаимозависимых центров координации и восстановления ацетилена: один центр действует при давлениях 0 0.атм С2Н2 и описывается с помощью гиперболической функции (Кm = 0.006 атм С2Н2 как для С2Н4, так и для С2Н6). Насыщение этого центра субстратом индуцирует активность еще как минимум одного центра, и при давлениях 0.06 0.3 атм С2Н2 активны несколько центров (коэффициент Хилла составляет 1.6) с эффективной Кm = 0.08 атм.

Поскольку образование FeMoco(red) происходит на поверхности амальгамы, а превращение субстрата в продукты, по-видимому, осуществляются без выхода катализатор-субстратного комплекса [FeMocored(H)(PhS)(C2H2)] в объем раствора, скорость реакции с участием восстановленного кофактора должна быть * Под начальной скоростью (w) подразумевается количество продукта реакции, образовавшегося в единицу времени в расчете на один моль Мо, на начальном линейном участке кинетической кривой образования продукта реакции lg w пропорциональна площади поверхности амальгамы и поверхностной концентрации FeMoco: w kS[FeMoco]s, где S – площадь соприкосновения данного количества амальгамы с раствором, а [FeMoco]s –поверхностная концентрация кофактора**.

В таком случае зависимость скоростей образования этилена и этана от концентрации FeMoco должна описываться уравнением, [ FeMoco] k ads v [ FeMoco] = s [ 1 + FeMoc o] k ads v, сходным с изотермой адсорбции, отражающей изменение поверхностной концентрации катализатора при увеличении его объемной концентрации, что и было найдено экспериментально. На Рис. 12 приведены полученные зависимости скоростей накопления С2Н4 и С2Н6 от концентрации FeMoco.

Скорость накопления этилена описывается уравнением [ FeMoco]v 8.2 [ FeMoco] v = а этана - WC2H= WC2H, [ FeMoco] [ 0.FeMoco] + 0.+ v v (сплошные линии на Рис. 12).

Величины kads, входящие в выражения w, моль продукта х 10 7/ мин зависимости скоростей образования и этилена, и этана от концентрации катализатора, равны, что говорит о том, что оба продукта образуются с C2Hучастием одной и той же частицы [FeMocored(H)(PhS)(C2H2)], адсорбированной на поверхности амальгамы.

C2H0,0 0,5 1,0 1,5 2,[FeMoco], M x 10 -Рис. 12. Зависимость скоростей образования этилена и этана от объемной концентрации FeMoco; Условия: FeMoco;

Eu(Hg) (1.1 М) 0.5 мл; [PhSH] = 0.012 M;

Р С2Н2 0.2 атм; ДМФА (4 мл); 21оС ** kads – коэффициент адсорбции FeMoco на Eu(Hg), аналогичный коэффициенту в уравнении изотермы адсорбции Лэнгмюра. Формула используется с теми же допущениями, что и при выводе изотермы адсорбции, в частности, с приближением об однородном характере поверхности (центры адсорбции имеют одинаковые адсорбционные свойства) w, моль продукта/мин х Мо Из зависимости скоростей образования этилена и этана от концентрации тиофенола (Рис. 13), имеющих резко экстремальный характер (максимум при концентрации PhSH в ДМФА 10-2 М), сделано заключение о сложном характере C2Hпротонирования координированного ацетилена: первичная атака протона осуществляется по одному из атомов кластера, и лишь затем в результате C2Hвнутримолекулярного переноса протон попадает на субстрат.

Подобную ситуацию 0 1 2 3 предполагают и в нитрогеназе in vitro, - lg ([PhSH], M) где протоны, доставленные к кофактору по сети водородных связей, Рис. 13. Зависимость скоростей вероятно, первоначально связываются образования этилена и этана от либо с мостиковыми атомами серы, концентрации тиофенола;

либо с атомами железа.

полулогарифмические координаты С целью изучения характера Условия: [FeMoco] = 0.5510-5 M; Eu(Hg) связывания С2Н2 с кластером и (0.35 М) 0.5 мл; растворитель - ДМФА (механизма протонирования мл); р С2Н2 0.2 атм; PhSH; 21оС координированного ацетилена была исследована стереоспецифичность реакции образования этилена из C2D2 при протонировании его «легким» PhSH методом ИК-Фурье спектроскопии.

1Рис. 14. ИК-спектр продуктов C2H3D 1восстановления C2D2 в 988 см-диапазоне 1000 800 см Trans-1,2-C2H2D2 943 см-–, катализатор FeMoco (1); газовая фаза %T аналогичной реакции без FeMoco (2) Условия: ИК- 843 см-спектрометр FTIR-16Cis-1,2-C2H2DPerkin Elmer, –разрешение 2 см, 1000 950 900 850 8cm-вакуумируемая кювета Волновое число со стеклами из KBr Найдено, что основным продуктом восстановления C2D2 является цис-1,2дидейтероэтилен (транс-1,2-C2H2D2 образуется 11%, а C2H3D – 13%). Видно (Рис. 15), что амальгама европия без катализатора не дает никаких продуктов восстановления ацетилена; аналогичный результат показывает хроматографический анализ газовой фазы реакции без FeMoco.

Данные о стереоселективности реакции (Рис. 14), также как и результаты исследования скорости реакции от концентрации тиофенола, подтверждают опосредованный характер протонирования координированного на FeMoco ацетилена.

Система с Zn/Hg в качестве восстановителя Зависимость начальной скорости образования этилена от концентрации субстрата описывается гиперболической функцией, Кm = 0.045 атм С2Н2. Количество этана в продуктах реакции восстановления С2Н2 зависит от давления субстрата: в области низких давлений С2Н2 0.0090.06 атм (от 7 до 45 мм рт. ст.) образуется значительное количество этана (до 17 % от общего количества продуктов), причем с ростом давления субстрата наблюдается линейное падение доли этана в продуктах реакции.

При изучении стереоспецифичности реакции восстановления C2D2 методом ИКФурье-спектроскопии было найдено, что единственным продуктом восстановления C2D2 в этой системе является цис-1,2-дидейтероэтилен. Транс-продукта, в отличие от системы с амальгамой европия, не наблюдается совсем. Таким образом, стереоспецифичность реакции превращения ацетилена в системе с Zn/Hg практически совпадает с ситуацией в классической нитрогеназе: единственным продуктом является цис-1,2-C2D2H2, H-D обмена координированного C2D2 с Н+ из среды реакции не происходит.

Наиболее интересной 4реакцией, наблюдаемой в системе с Zn/Hg, была обнаруженная нами 3реакция каталитического 3восстановления ацетона (Рис. 15) с 2образованием метана и этанола. СО 2и ацетилен ингибируют эту реакцию, 1причем ацетон и ацетилен являются 1конкурирующими субстратами и, соответственно, взаимно ингибируют восстановление друг 0 500 1000 1500 2000 2500 30друга. В системе c Eu/Hg Время, с восстановления ацетона не происходит, что объяснено слишком высоким уровнем восстановления кластера FeMoco, который Рис. 15. Образование метана при восстановлении обеспечивает амальгама европия, не ацетона амальгамой цинка, катализатор FeMoco.

способствующим координации Условия реакции: [FeMoco] = 0.510-5 M; Zn(Hg) электрон-донорного субстрата (4.27М) 0.7 мл; [PhSH] = 0.012 M; растворитель - ДМФА (4 мл); [(CH3)2CO] = 0.2 М; 21о ацетона на кофакторе.

До наших исследований не было никаких данных о том, является ли Метан, моль х ацетон субстратом фермента нитрогеназы. Мы провели качественную нитрогеназную реакцию с участием ацетона в качестве субстрата (в атмосфере аргона) и показали, что нитрогеназа, как и выделенный FeMoco, способна восстанавливать ацетон с образованием метана. Этот результат важен не только потому, что он обнаруживает новый субстрат нитрогеназы, но и потому, что он подтверждает плодотворность используемого нами подхода – изучения закономерностей нитрогеназного катализа на отделенном от белка кофакторе – для понимания механизма восстановления субстратов в активном центре фермента.

Ингибирование каталитического восстановления ацетилена оксидом углерода (II) Изучение "взаимоотношений" различных субстратов и ингибиторов на отделенном от белка FeMoco дает важную дополнительную информацию о химии активного центра нитрогеназы, о его редокс состояниях, о свойствах координирующих центров кластера.

С этой точки зрения очень интересно изучение ингибирующего действия СО, который, будучи изоэлектронным основному субстрату нитрогеназы азоту, не восстанавливается ферментом, но является ингибитором восстановления практически всех субстратов нитрогеназы. Мы нашли, что СО взаимодействует с выделенным из фермента FeMoco, восстановленным амальгамами цинка или европия. Найдено, что в системе с Zn/Hg СО обратимо ингибирует реакцию восстановления ацетилена до этилена с Ki = 0.05 атм СО.

0,0,0,С2Н0,С2Н6 - Ki C H0,0,0,00 0,01 0,02 0,03 0,-0,01 0,00 0,01 0,02 0,03 0,СО, атм СО, атм Рис. 16. Зависимость начальных скоростей образования этилена и этана от давления СО.

(слева); Справа - ингибирование образования этилена (координаты Диксона):

Квадратики - р С2Н2 0.07 атм; - р С2Н2 0.2 атм. Условия реакции: [FeMoco] = 0.610-5 M; Eu(Hg) (0.35М) 0.5 мл; [PhSH] = 0.012 M; ДМФА (4 мл); давление С2Н2 0.07 атм; CO; 21оС В системе с Eu/Hg ингибирование СО образования двух продуктов восстановления С2Н2 различно: ингибирование образования этилена смешанного или конкурентного типа, Ki = 0.003 атм СО, тогда как в случае образования этана можно говорить о неполном конкурентном ингибировании, Ki = 0.006 атм СО. Это означает, что присоединение к FeMoco молекулы (или молекул) СО оказывает негативное влияние как на связывание ацетилена с кластером, так и на распад катализатор-субстратного комплекса. Константы и тип ингибирования были определены путем обработки экспериментальных данных в координатах Диксона и координатах «обратное ---w, моль продукта (моль Мо) мин 1/w, мин (моль Мо) (моль этилена) парциальное ингибирование / обратное давление СО». Более сильное ингибирующее влияние СО на образование С2Н4 приводит к тому, что при давлении СО 0.05 атм доля С2Н6 в продуктах реакции составляет более 50% (Рис. 16).

Изменение продуктспецифичности центров восстановления ацетилена под действием СО объяснено некоторой стабилизацией промежуточного комплекса (FeMocoС2Н2) при одновременной координации СО на каталитическом кластере, в результате чего доля продукта многоэлектронного восстановления – этана – растет.

Полученные результаты дополнительно указывают на то, что на восстановленном амальгамой европия кластере FeMoco одновременно могут быть заняты субстратами и (или) ингибиторами несколько активных центров.

Продуктов восстановления СО, метана и метанола, найдено не было; повидимому, FeMoco вне белка не катализирует восстановление СО. Также, как и в Мосодержащей нитрогеназе, СО является лишь ингибитором, но не субстратом.

Ингибирование каталитического 1,восстановления ацетилена молекулярным азотом 0,Сравнение описанных выше кинетических зависимостей реакции 0,восстановления С2Н2, катализируемой FeMoco вне белка, с 0,аналогичными данными для нитрогеназной системы in vitro 0,показывает, что наблюдаемые скорости реакции, состав продуктов, 0,общие закономерности очень 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,похожи для столь различных систем N2, атм с участием FeMoco в качестве катализатора. То есть, способность FeMoco катализировать Рис. 17. Ингибирование молекулярным азотом восстановление С2Н2 практически восстановления C2H2 до этилена в различных сохраняется при отделении его от системах с участием FeMoco белковой матрицы.

- система (II) с участием FeMoco вне белка;

Была проведена работа по - нитрогеназа A. vinelandii, данные [84];

поиску продуктов восстановления о - нитрогеназа A. vinelandii, данные [58];

азота, аммиака или гидразина, в * - мутант -Gln-195 A. vinelandii, данные [58] системе с Eu/Hg с использованием w(N2) - скорость реакции восстановления C2Hв системе {N2 + C2H2 + Ar} изотопа N. В результате w(Ar) – то же в отсутствие азота (в системе тщательных экспериментов было {C2H2 + Ar}) показано, что восстановления азота, Условия реакции: [FeMoco] = 0.710-5 M;

катализируемого FeMoco вне белка, ДМФА (4 мл); Eu(Hg) (0.35 М) 0.5 мл; [PhSH] = даже стехиометрического, не 0.012 M; давление С2Н2 0.0145 атм (во всех происходит в тех условиях, где сравниваемых системах) активно восстанавливается С2Н2.

Хотя образование аммиака из w(N ) / w(Ar) молекулярного азота - процесс сложный и многостадийный, но начинаться он обязательно должен с восстановления FeMoco и координации молекулы N2 на восстановленном кофакторе. Чтобы определить, способен ли отделенный от белка FeMoco хотя бы обратимо координировать N2, мы исследовали влияние азота на кинетику катализируемого FeMoco восстановления ацетилена. Было найдено, что молекулярный азот является ингибитором каталитического восстановления ацетилена в системе с Eu/Hg.

Полученные результаты приведены на Рис. 17 вместе с данными по ингибированию азотом восстановления ацетилена различными нитрогеназами. Видно, что количественный эффект замедления реакции восстановления С2Н2 в присутствии Nпрактически одинаков для всех приведенных систем, как белковой, так и небелковой природы.

С помощью обработки экспериментальных данных в координатах Диксона (Рис.

18) было показано, что ингибирование молекулярным азотом образования как этана, так и этилена носит конкурентный характер, Ki = 0.5 атм N2 для обоих продуктов. То есть, N2 и С2Н2 как лиганды конкурируют за связывание на одном и том же координационном месте на восстановленном кластере FeMoco. Как и в нитрогеназных системах in vitro, наблюдается снятие ингибирования азотом при больших давлениях субстрата.

Факт наблюдения ингибирующего действия азота очень важен, так как он впервые определенно показывает возможность взаимодействия молекулярного азота с кофактором, выделенным из белковой матрицы и восстановленным обычным химическим восстановителем.

0,0,0,0,р С2Н2 = 0.0033 атм 0,0,(2.5 мм рт.ст.) 0,6 р С2Н2 = 0.0033 атм 0, (2.5 мм рт. ст.) 0,0,Ki = 0.5 атм N0,0,р С2Н2 = 0.0145 атм 0,3 (11 мм рт.ст.) Ki = 0.49 атм N0,р С2Н2 = 0.0146 атм 0,0, (11 мм рт. ст.) 0,1 0,0,0,-1,00 -0,75 -0,50 -0,25 0,00 0,25 0,50 0,75 1,-0,6 -0,4 -0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,N2, атм N2, атм Рис. 18 Ингибирование молекулярным азотом катализируемого FeMoco восстановления ацетилена амальгамой европия (координаты Диксона): слева – ингибирование образования этилена, справа - этана Влияние рКа и химической природы реагента на скорость восстановления ацетилена, катализируемого FeMoco вне белка --1/w, мин (моль Мо) (моль С Н ) 1/w, мин (моль Мо) (моль С Н ) Нами было установлено, что FeMoсо и вне белкового окружения способен эффективно координировать молекулярный азот. При этом продуктов восстановления азота в условиях реакции найдено не было. Причиной этого могла быть либо недостаточная основность координированной молекулы N2, либо неподходящий по кислотности и(или) химической природе протонирующий агент. Таким образом, пытаясь найти ответ на один из важных вопросов, а именно, может ли отделенный от белка кластер FeMoco катализировать восстановление азота в чисто химической системе, а также для получения информации о механизме протонирования субстрата по ходу восстановления, мы провели изучение влияния характера протонирующего агента на реакцию восстановления ацетилена с участием FeMoco вне белка.

Поскольку из экспериментов по зависимости величины восстановительного потенциала электрода на каталитическую реакцию восстановления С2Н2 в присутствии FeMoco (см. ниже) мы нашли, что чем меньше по абсолютной величине восстановительный потенциал электрода, тем относительно важнее кислотность протонирующего агента, систематические опыты по влиянию рКа на реакцию проводили с амальгамой цинка в качестве восстановителя, ожидая, что эффект влияния кислотности реагента будет в этом случае более значительным.

В качестве потенциальных доноров протонов для образования С2Н4 или С2Н6 из С2Н2, были изучены 12 соединений. Их строение и величины рКа в Н2О и ДМФА, приведены в Таблице 1. Необходимыми требованиями при выборе являлись растворимость в ДМФА и значения рКа в ДМФА 5 (в более кислой среде кофактор необратимо разрушается).

Таблица 1. Значения рКа протонирующих агентов в растворителях соединение рКа рКа № молекулярная в название в H2OДМФАформула SH 1 тиофенол 6.6 10.F F SH 2 пентафтортиофенол 2.7 6.F F F OH 3 фенол 9.95 15.N H N 4 имидазол 14.5 18. March J. Advanced Organic Chemistry, 3rd ed., New York.: John Wiley & Sons, 1985, P. 1087-1136.

Izutsu K. Acid-base dissociation constants in dipolar aprotic solvents. Oxford.: Blackwell Scientific, 1990.

N 2SH 5 ~8 ~меркаптобензимидазол N H COOH CH3.13 10.HO C COOH 6 лимонная кислота 4.76 13.CH6.40 15.COOH COOH 1.2 8.7 щавелевая кислота 4.2 16.COOH OH 8 пирокатехин 9.2 ~OH 9 C18H38COOH стеариновая кислота 4.9 ~COOH 10 бензойная кислота 4.2 12.2.1 ~11 H3PO4 ортофосфорная кислота 7.2 ~12.3 ~12 H2O вода 15.7 ~Выбор химической природы соединений определялся строением лигандного окружения кофактора в белке при протекании реакции in vivo и in vitro (тиофенол, имидазол и их аналоги, вода) и необходимостью «охватить» в исследовании различные классы соединений.

Для каждого из приведенных соединений [H+A-] изучены скорости накопления С2Н4 и С2Н6 в системе {FeMoco + Zn/Hg + C2H2 + [H+A-]} в ДМФА. В данных условиях вода, ортофосфорная и монокарбоновые кислоты (бензойная и стеариновая), а также фенол оказались неактивными. Остальные 7 соединений в системе активны, причем, значительное изменение кислотности (от 8 до 19) и различная химическая природа (при условии соблюдения возможности образования координационной связи) применяемых соединений слабо влияют на скорости накопления продуктов реакции.

Для объяснения этого факта мы привлекли результаты всех работ, проведенных на выделенном из белка кофакторе, литературные данные по изучению влияния рН среды на нитрогеназную реакцию in vitro, а также, теоретические расчеты механизма протонирования в белке. Совокупность экспериментальных данных, полученных для FeMoco вне белка, указывает на сложный характер протонирования субстрата. Повидимому, для осуществления реакции восстановления субстратов на FeMoco необходимо, чтобы источник протонов имел некоторое пороговое значение кислотности, при котором происходит протонирование мостикового атома серы с дальнейшим переносом водорода на субстрат. Интересно, что в области значений рКа соединений от 8 до 19 независимость от кислостности протонирующего агента можно объяснить и тем, что для кофактора, как выделенного из белка, так и в составе фермента, стадия переноса протона не является лимитирующей. При переходе же к более «кислому» соединению – пентафтортиофенолу – наблюдается смена лимитирующей стадии (см. ниже).

Влияние потенциала внешнего донора электронов на закономерности катализа восстановления С2Н2 в присутствии активного центра нитрогеназы (FeMoco), выделенного из фермента Для определения лимитирующей стадии процесса было исследовано влияние изменения потенциала внешнего донора электронов на параметры каталитического восстановления С2Н2 до этилена и этана в присутствии в качестве доноров протонов тиофенола, рКа (Н2О) 6.6, и пентафтортиофенола, рКа (Н2О) 2.7.

Протонирующие агенты - тиофенол или вода На рис.19 представлена 0,14 1,экспериментально 1,полученная зависимость 0,1,E = a + b lg w скорости восстановления b 0,ацетилена до этилена от 1,0,потенциала катода из 0,амальгамы цинка. Видно, что -2,8 -2,4 -2,0 -1,6 -1,2 -0,0,lg W(C2H4) с увеличением отрицательного потенциала 0,рабочего электрода наблюдается резкое 0,возрастание скорости образования этилена; при 0,этом в широком диапазоне значений потенциалов 0,скорость реакции 1,05 1,20 1,35 1,50 1,65 1,80 1,экспоненциально зависит от -E / В отн. Ag/AgCl, KClнас потенциала катода.

-E / V vs. Ag/AgCl, KCls Зависимость спрямляется в полулогарифмических координатах (рис. 19, вставка), то есть, подчиняется Рис. 19. Зависимость скорости накопления C2H4 от уравнению Тафеля, заданного потенциала рабочего электрода; на врезке – связывающему скорость преобразование зависимости в координатах Тафеля;

электрохимической реакции с Условия реакции: электрохимическая ячейка:

[FeMoco]=1.2·10–5 M; [PhSH]=1.2·10–2 M; электрод потенциалом электрода.

Zn/Hg (2 мас.%), 2 мл; площадь поверхности катода Такая зависимость скорости 3.1 см2; электрод сравнения Ag/AgCl/KCl(нас.); объем реакции от потенциала катода католита 6.5 мл; 20 °С; PC2H2 100 Торр говорит о том, что замедленной стадией последовательности реакций -s нас -E / V vs. Ag/AgCl, KCl -E / В отн Ag/AgCl, KCl C H ·10 / моль·мин ) ( является электрохимическая стадия, т.е. перенос электронов через границу раздела фаз от катода на кластер FeMoco. Аналогичные экспоненциальные зависимости скорости реакции образования С2Н4 от потенциала рабочего электрода получены и при катодной поляризации электрода из чистой ртути, в присутствии и тиофенола, и Н2О.

Помимо величины катодного потенциала, материал электрода также оказывает заметное влияние на скорость и механизм реакции. На катодах из разных материалов (чистая ртуть, Zn/Hg или Eu/Hg) при одинаковом значении задаваемого потенциала, равного, например, потенциалу амальгамы европия (-1.4 В отн. н.в.э.), и одном и том же протонирующем агенте – тиофеноле, абсолютные значения скорости накопления этилена на амальгаме европия примерно в 20 раз выше (а накопления этана даже в раз выше), чем на катоде из чистой ртути с тем же потенциалом, и в 10 раз – чем на катоде из амальгамы цинка при том же значении заданного потенциала.

Зависимость скорости реакции восстановления С2Н2 от температуры снимали в потенциостатическом режиме при заданном потенциале рабочего электрода (Zn/Hg) Е = 1.7 В. Мы нашли, что скорость накопления и этилена, и этана возрастает экспоненциально с увеличением температуры в интервале от 13 до 30оС. Выше температуру не поднимали, так как ранее мы установили, что FeMoco обладает ограниченной термической устойчивостью, и при температуре 40оС в значительной степени разрушается. Рассчитанная по уравнению Аррениуса эффективная энергия активации восстановления ацетилена с образованием этилена составляет 18.3 (1.5) ккал/моль, а до этана – примерно в полтора раза меньше, 12.8 (2) ккал/моль. В связи с этим относительный выход этана заметно падает с повышением температуры.

Использование пентафтортиофенола вместо тиофенола приводит не только к увеличению примерно в пять раз скорости реакции по этану и в три раза по этилену, но и к изменению кинетических зависимостей. Вначале при увеличении потенциала катода от Е = – 1.07 В до Е = – 1.2 В скорость увеличивается с ростом потенциала. Затем, начиная с этого значения, и вплоть до Е = –1.75 В, скорость реакции перестает зависеть от потенциала. После выключения тока стационарный потенциал реакционного раствора составляет Е = – 1.15 В. По-видимому, это потенциал редокс пары FeMoco(s/FeMoco(red). При этом значении потенциала происходит восстановление катализатора r) до субстратсвязывающего состояния. При напуске воздуха в систему, т.е. при необратимом окислении FeMoco, потенциал раствора падает до Е = –1.07 В. Интересно, что в этом случае скорости накопления, как этана, так и этилена, практически не зависят от материала катода: поляризация чистой ртути и амальгамы цинка дает практически одинаковые скорости при одинаковых значениях потенциала.

Независимость скорости восстановления от величины катодного потенциала и материала электрода говорит о том, что перенос электрона от катода не является лимитирующей стадией в этом случае. Скорость реакции растет с повышением температуры от 15 до 30оС. Температурная зависимость подчиняется уравнению Аррениуса. Эффективная энергия активации для этой системы, измеренная при заданном потенциале катода Е = – 1.3 В составляет 32 (4) ккал/моль для обоих продуктов.

Таким образом, мы показали, что в зависимости от кислотности применяемого донора протонов, катализируемое FeMoco восстановление тройной связи может лимитироваться как переносом электрона от внешнего донора, так и внутримолекулярными перегруппировками в координационной сфере металлокомплекса с субстратом и донором водорода.

Проведенное исследование показало, что существует целый ряд сходных черт между процессами превращения ацетилена разнообразными нитрогеназами и химическими системами с участием отделенного от белка FeMoco. Сходны особенности координации субстратов, подачи на субстрат электронов от внешнего восстановителя и протонов от донора Н+, механизм распада комплекса катализаторсубстрат с образованием продуктов, стереоспецифичность реакции восстановления C2D2, наличие в обоих случаях нескольких одновременно работающих взаимозависимых активных центров на восстановленном FeMoco, и некоторые другие особенности.

Проведено сравнение количественных параметров (Km, активностей, доли этана в продуктах) реакции восстановления ацетилена с участием FeMoco в качестве катализатора вне белка и в составе разнообразных белковых систем. Также проведено количественное сравнение каталитического поведения FeMoco вне белка и в составе фермента по отношению к восстановлению С2Н2 в присутствии N2 и СО. Сделан вывод, что по ряду показателей (закономерности восстановления ацетилена, характер ингибирования СО, выделение водорода и т.д.) каталитическое действие кофактора в небелковых условиях аналогично его действию в составе фермента. То есть, каталитический кластер FeMoco проявляет высокую степень самодостаточности и способен успешно вести реакции восстановления некоторых субстратов нитрогеназы (С2Н2, Н+), находясь вне белка.

На основании полученных в работе результатов сделаны следующие заключения:

извлечение FeMoco из белковой матрицы приводит к потере им способности катализировать восстановление азота, оставляя почти неизменной возможность и особенности восстановления ацетилена и протонов и способность координировать молекулу азота. На восстановленном амальгамой европия кластере FeMoco в ДМФА активны к субстратам и ингибиторам (С2Н2, N2, CO) три центра. На одном из них, самом активном, может координироваться и восстанавливается С2Н2 с Km = 0.006 атм, а также координироваться без восстановления N2 и (или) CO. Центры 2 и 3 гораздо менее активны (Km по ацетилену более чем на порядок превышает Km для центра 1), и могут связывать С2Н2 и (или) СО. Данные по ингибированию молекулярным азотом восстановления ацетилена, катализируемого выделенным из фермента FeMoco в ДМФА, причем практически с теми же количественными параметрами, что и в ферментных системах (и в нативной нитрогеназе, и в мутантах), позволяют заключить, что кластер FeMoco с обязательностью является сорбционным участком активного центра фермента (отвечает за комплексообразование субстрата с ферментом;

определяет специфичность действия катализатора). Каталитическим же участком, где происходит перераспределение электронных плотностей и перенос групп в химическом акте катализа, или, иначе говоря, активным центром фермента следует считать кластер FeMoco с окружающими его аминокислотными остатками, стабилизирующими интермедиаты каталитического цикла и участвующими в передаче протонов нужной (оптимальной) кислотности на координированный азот.

В пятой главе приведены результаты кинетического исследования восстановления С2Н2 при катализе MgMo комплексом и влияния СО и N2 на этот процесс в сравнении с аналогичными данными, полученными для системы с участием FeMoco вне белка.

В работе А.Е. Шилова с соавторами8 была открыта азотвосстанавливающая система на основе полиядерных комплексов молибдена. На данный момент эта система является единственной неферментативной системой, способной каталитически, со скоростями, сравнимыми с нитрогеназой, восстанавливать N2 при атмосферном давлении и комнатной температуре. Реакция осуществляется в среде метилового спирта с небольшими добавками воды, которая, по-видимому служит донором водорода при образовании аммиака и(или) гидразина. Восстановителем может служить амальгама натрия, амальгама европия или катод с заданным потенциалом, равным потенциалу Na/Hg.

Мы показали9, что данные системы на основе полиядерных комплексов молибдена могут катализировать и восстановление С2Н2, причем, гораздо более слабыми, чем амальгама натрия восстановителями, например, амальгамой цинка, правда, в присутствии более кислого донора водорода, тиофенола. В данной главе приведены результаты изучения закономерностей этой реакции с целью проведения сравнения механизма одной и той же реакции в одинаковых условиях с участием синтетических азотфиксирующих кластеров и природного кластера FeMoco.

Были изучены, в частности, зависимости скоростей накопления этилена и этана от концентраций катализатора и субстрата, параметры ингибирования данной реакции монооксидом углерода и молекулярным азотом, а также исследовано влияние потенциала внешнего донора электронов на закономерности данной реакции в присутствии доноров протонов различной кислотности. Изучены температурные зависимости скорости этих реакций.

Показано, что на полиядерном Mg-Mo комплексе, как и на восстановленном амальгамой европия FeMoco, активны к субстратам и ингибиторам несколько взаимозависимых координирующих центров. СО заметно менее эффективно, чем при катализе FeMoco ингибирует реакцию восстановления ацетилена, хотя, как мы нашли, тип ингибирования в обеих системах – смешанный: СО координируется на нескольких центрах кластера и влияет как на стадию комплексообразования С2Н2 с восстановленным кластером, так и на стадию разложения катализатор-субстратного комплекса с образованием продуктов.

Исследование температурных зависимостей скоростей каталитических реакций в присутствии Mg-Mo-кластера показало, что как и FeMoco, этот кластер как катализатор благоприятствует осуществлению многоэлектронных окислительно-восстановительных каталитических процессов: энергии активации образования продуктов 4-х электронного восстановления субстрата заметно меньше, чем продуктов 2-х электронного восстановления, что крайне важно для восстановления азота в мягких условиях.

Mg-Mo кластер, в отличие от FeMoco, эффективно катализирует восстановление молекулярного азота. Ацетилен является очень мощным ингибитором этой реакции: Ki ~ 0.009 атм С2Н2 при использовании амальгамы натрия в качестве восстановителя. При этом мы не наблюдали ингибирования восстановления ацетилена азотом, что было Shilov A. E., Pure & Appl. Chem., 1992, v. 64, p. 1 Т. А. Баженова, М. А. Баженова, Г. Н. Петрова, А. К. Шилова, А. Е. Шилов, Изв. АН. Сер. хим., 1998, 8найдено для системы с участием природного кластера в качестве катализатора.

Причиной этого, по-видимому, является то, что система с участием Mg-Mo кластера намного более активна по отношению к ацетилену, чем к азоту (для Na/Hg в качестве восстановителя различие в константах Михаэлиса Кm составляет четыре порядка).

Ингибирование ацетиленом восстановления азота в системе с участием MgMo комплекса Высокие скорости образования N2H4 и NH3 наблюдаются в так называемой «полной» системе, когда в качестве восстановителя используется амальгама натрия, и присутствуют сокатализаторы - фосфатидилхолин и трибутилфосфин. В этих условиях ацетилен является очень хорошим субстратом с константой Михаэлиса Km около 310-атм С2Н2. Запределивание же скорости реакции по концентрации азота наблюдается при давлениях N2 в несколько десятков атмосфер, а рассчитанное значение Кm для азота из данных по ингибированию восстановления азота ацетиленом составило порядка 25 атм.

Не удивительно, что ацетилен эффективно ингибирует восстановление азота в этих условиях.

На рис. 20 приведены 2,зависимости скорости восстановления азота (при двух 2,разных значениях давления N2) от концентрации ацетилена в газовой 1,фазе. Прямые пересекаются на оси абсцисс «давление ингибитора» в 1,области отрицательных значений, что свидетельствует о протекании 0,ингибирования реакции по -Ki неконкурентному типу. Найденное 0,-8 -4 0 4 8 значение константы ингибирования С2Н2, Торр (Ki) составило 0.009 атм С2Н2.

Сравнение с аналогичными данными для нитрогеназной Рис. 20. Ингибирование восстановления Nсистемы in vitro показывает, что в ацетиленом в «полной» системе при pN2 = 4природной системе и лучшей ее (1), 760 Торр (2); данные в координатах функциональной модели сродство Диксона Условия реакции:[MgMo] = 8.3·10–6M; каталитического кластера к [фосфатидилхолин] = 3·10–4 M; [Bu3P] = 5·10–ацетилену больше, чем к азоту на M; [NaOMe] = 6·10–3 M; [Bu4NBr] = 0.1 M;

несколько порядков, при этом С2НMeOH; Na/Hg (1.07 M); C2H2; 21 °С неконкурентно ингибирует восстановление N2 с близкими значениями констант ингибирования (Ki = 0.008 атм С2Нв случае нитрогеназной системы in vitro10).

Rivera-Ortiz J. M., R. H. Burris. Interactions among substrates and inhibitors of nitrogenase. J. Bacteriol., 1975, V.123, № 2, p.537-545.

N H ----W · 10, моль / мин В шестой главе описаны результаты исследования влияния сильного магнитного поля на нитрогеназную реакцию in vitro, позволившие определить лимитирующие оборот стадии реакции и предложить объяснение излома на аррениусовской зависимости нитрогеназной реакции.

(Работа выполнена совместно с Факультетом физики и астрономии Университета г.

Ноттингема, Великобритания) Изучая кинетические особенности моделирующих действие фермента нитрогеназы систем, как на основе выделенного из белка кластера FeMoco, так и синтетических каталитических кластеров молибдена, мы нашли, что лимитирующей стадией процесса восстановления субстрата является перенос электрона от внешнего донора на каталитический кластер. Что же касается самой нитрогеназной системы, как in vitro, так и in vivo, то к настоящему времени нет единого мнения о природе скорость определяющей стадии этого природного процесса. Доминирующая в литературе точка зрения, что лимитирует процесс реакция диссоциации белкового комплекса на компоненты после каждого акта межбелкового переноса электрона, не кажется нам верной, так как в последнее время появилось много новых данных по стационарной кинетике нитрогеназной реакции, противоречащих такому утверждению.

15 oC 121,0,110,0,20.3 oC 110,0 2 4 6 8 10 12 14 16 10Magnetic field, T 1090 2 4 6 8 10 12 14 16 Магнитное поле, T Рис. 21. Влияние магнитного поля на стационарную скорость восстановления C2Hнитрогеназой in vitro; вставка показывает скорость накопления продукта в магнитном поле (В) (W(B)) относительно скорости без наложенного магнитного поля (В=0) (W(0)) при различных температурах Мы высказали предположение, что исследование влияния сильных магнитных полей на нитрогеназную реакцию могло бы дать новую информацию относительно механизма функционирования фермента. Поскольку движущей силой процесса является серия дистанционных, сопряженных с гидролизом АТФ, электронных W(B)/W(0) Специфическая активность (nmole C H /min mg MoFe protein) переносов между кластерами металлов, мы полагаем, что скоростьопределяющая стадия оборота нитрогеназы связана, скорее всего, с одной из стадий гидролиза АТФ или со стадией сопряженного с гидролизом межкластерного переноса электрона. Если электронный перенос определяет общую скорость процесса, сильное магнитное поле может повлиять на реакцию11. Если же, либо стадия диссоциации нитрогеназных белков, либо какая-то из стадий гидролиза АТФ лимитирует скорость оборота нитрогеназы, мы не увидим влияния магнитного поля на этот процесс.

Измерения проводили на сверхпроводящем магните OXFORD Instrument на Факультете физики и астрономии Университета г. Ноттингема в Великобритании. В данном магните генерируются поля от 0 до 17.5 Тесла и возможно поддержание температур от очень низких до комнатной и выше.

Рис. 21 показывает 7,эффект влияния 7,магнитного поля на 7,нитрогеназную активность по восстановлению 6,E = 15 kcal/mol act ацетилена in vitro:

6,скорость реакции монотонно уменьшается с 6,увеличением поля. Мы 6,нашли, что эффект 5,является температурноE = 30 kcal/mol act зависимым. Магнитное 5,поле ингибирует накопление продукта 3,36 3,39 3,42 3,45 3,48 3,51 3,восстановления при 1/T x 10температурах 20оС и выше. Когда реакция осуществляется при 15оС Рис. 22. Зависимость специфической активности или более низких нитрогеназной реакции от температуры (координаты температурах при прочих Аррениуса) в магнитном поле 10 Т и без поля, 0 Т равных условиях приложенное магнитное поле не оказывает влияния на нитрогеназную активность (Рис. 21, вставка).

Эффективные энергии активации (Еакт) для этих реакций были рассчитаны из зависимостей скорости от температуры (см. Рис. 22) согласно уравнению Аррениуса.

Зависимость показывает резкое изменение в энергии активации реакции: было найдено, что Еакт составляет около 15 ккал моль-1 и 30 ккал моль-1 для температур выше 20оС и ниже 15оС соответственно. Величина Еакт не зависит от приложенного магнитного поля в обоих температурных интервалах (Рис. 22).

Из всех многочисленных реакций, осуществляющихся в системе до образования продукта, только перенос электрона включает изменение спинового состояния Ferraudi, G., Magnetokinetic effect in outer-sphere electron-transfer reactions: on the role of spin-orbit and hyperfine coupling Molecular Physics, 1997, 91, N2, с. 273-2ln W подсистем донора и акцептора и, таким образом, приводит к изменению магнитных характеристик компонентов системы.

Это значит, что магниточувствительной стадией, которую мы наблюдаем при температурах выше 20оС, является стадия дистанционного электронного переноса, чувствительного к сильному магнитному полю; это или межбелковый перенос от Fe белка на MoFe белок (в условиях low electron flux) или внутрибелковый перенос от Р кластера на кофактор (в условиях high electron flux). При температурах ниже 15оС белковая динамика, а именно, конформационные изменения, вызванные связыванием и гидролизом АТФ, контролируют скорость оборота нитрогеназы. Эффект объяснен влиянием магнитного поля на скорость интерконверсии различных спиновых состояний восстановленного железо-серного кластера Fe-белка, которые имеют различную активность в переносе электрона с Fe белка на MoFe белок нитрогеназы.

Проведенное изучение влияния магнитного поля на нитрогеназную реакцию in vitro позволило выявить следующие особенности нитрогеназного катализа: а) различные кинетические события могут лимитировать общую скорость каталитического цикла в разных условиях проведения реакции; б) один из двух дистанционных межкластерных электронных переносов включен в лимитирующую стадию процесса восстановления субстрата при физиологических температурах (выше 20оС); в) излом в температурной зависимости нитрогеназной реакции связан с изменением скорость определяющей стадии при этой температуре.

ВЫВОДЫ 1. На основании кинетических исследований предложен механизм восстановления азота системами на основе соединений железа с литийорганическими восстановителями. Показано, что лимитирующей стадией реакции является накопление соединения нульвалентного железа, реагирующего с азотом с образованием диазотного комплекса, содержащего реакционно способную молекулу азота 2. Впервые получены и охарактеризованы рентгеноструктурным анализом стабильные бинарные железоорганические комплексы двухвалентного железа и ряд неописанных ранее железо-литиевых комплексов с субстратами и ингибиторами нитрогеназы.

3. Экспериментально показано, что содействие соединений лития восстановлению азота комплексами железа связано с тем, что он образует смешанные комплексы переходного и непереходного металла, в которых литий равным образом принимает участие в активации N2 за счет множественной координации молекулы азота 4. Впервые найдены условия и показана принципиальная возможность вовлечения железо-молибденового кофактора нитрогеназы (FeMoсо), отделенного от белковой матрицы, в реакции с субстратами нитрогеназы в чисто химических условиях.

5. Показано значительное сходство основных закономерностей реакций каталитического восстановления С2Н2 и ингибирования этого процесса оксидом углерода (II) и молекулярным азотом для нитрогеназы in vitro и химических систем с участием выделенного из белка FeMoсо. Найдено, что наблюдаемые особенности поведения FeMoсо в изучаемых реакциях определяются его составом и структурой, и проявляются им независимо от природы (белковой или небелковой) восстановителя и среды реакции; установлено, что восстановленный FeMoсо и вне белкового окружения способен обратимо координировать молекулярный азот 6. На основе данных о каталитическом восстановлении ацетона на отделенном от белка FeMoсо найден новый субстрат нитрогеназы: показано, что нитрогеназа in vitro, как и FeMoсо вне белка, способна восстанавливать ацетон с образованием метана 7. Показано, что в зависимости от кислотности протонирующего агента, лимитирующей стадией каталитического восстановления С2Н2 на выделенном из белка FeMoco может быть как перенос электрона от катода на каталитический кластер, так и стадия переноса протона в катализатор-субстратном комплексе.

8. Изучена кинетика восстановления C2H2 и ингибирование этого процесса N2 и CO при катализе синтетическим MgMo комплексом в условиях, аналогичных для системы на основе экстрагированного из фермента активного центра нитрогеназы (FeMoco). Сравнение основных параметров реакций показало значительное сходство механизмов каталитического восстановления субстратов в присутствии природного и синтетического кластеров.

9. Исследованы температурные зависимости скоростей реакций, катализируемых FeMoco вне белка и MgMo комплексом. Показано, что оба типа кластеров как катализаторы благоприятствуют осуществлению многоэлектронных окислительно-восстановительных каталитических процессов: энергии активации образования продуктов 4-х электронного восстановления субстрата заметно меньше, чем продуктов 2-х электронного восстановления, что крайне важно для восстановления азота в мягких условиях 10. Впервые предложенное и реализованное изучение влияния магнитного поля на нитрогеназную реакцию in vitro позволило выявить следующие особенности нитрогеназного катализа: а) различные кинетические события могут лимитировать общую скорость каталитического цикла в разных условиях проведения реакции; б) в лимитирующую стадию процесса восстановления субстрата при физиологических температурах (выше 20оС) включен дистанционный межкластерный электронный перенос; в) излом на температурной зависимости нитрогеназной реакции связан с изменением скорость определяющей стадии при этой температуре Основное содержание диссертации опубликовано в статьях, приведенных ниже.

1. A.E. Shilov, A.K. Shilova, E.F. Kvashina, T.A. Vorontsova, Isolation of a Binuclear complex intermediate in the reaction of molecular nitrogen with titanium compounds // J. Chem. Soc., Chem. Сommuns. 1971, p. 152. М.О. Бройтман, Т.А. Воронцова, А.Е. Шилов, Восстановление молекулярного азота в системе FeCl3 + LiPh + N2 // Кинетика и катализ, 1972, т. 13, №1, с. 613. Т.А. Воронцова, А.Е. Шилов, О механизме действия аденозинтрифосфорной кислоты (АТФ) в биологической фиксации азота и в модельных системах // Кинетика и катализ, 1973, т. 14, №5, с. 1226-124. A.P. Khrushch, T.A. Vorontsova, A.E. Shilov, Role of acids in reduction of acetylene catalyzed by molybdenum-thiol complexes // J. Amer. Chem. Soc., 1974, v. 96, N15, p. 4987-495. A.E. Shilov, A.K. Shilova, T.A. Vorontsova, Molybdenum complexes as catalysts for the reduction of molecular nitrogen in protic media // React. Kinet. Catal. Lett.

1975, v.3, N2, p. 143-16. А.П. Хрущ, Т.А. Воронцова, А.Е. Шилов, О механизме образования этана при восстановлении ацетилена в присутствии молибден-тиольных катализаторов // Кинетика и катализ, 1975, т. 16, №6, с. 1618-167. Т.А. Баженова, М.С. Иоффе, Л.М. Качапина, Р.М. Лобковская, Р.П. Шибаева, А.Е. Шилов, А.К. Шилова, Строение молибден-карбонильных комплексов, образующихся в системе Ti(OH)3 + MoOCl3 + CO // Журнал структурной химии, 1978, т. 19, №6, с. 1047-1062.

8. Л.М. Качапина, Г.А. Кичигина, Т.А. Баженова, Резонансное комбинационное рассеяние комплексов молекулярного азота с дициклопентадиенильными соединениями трехвалентного титана // Оптика и спектроскопия, 1980, т. 48, №2, с. 250-29. Т.А. Баженова, М. Грюзель, Ж. Лени, А.Е. Шилов, А.К. Шилова, Кинетика и механизм восстановления азота в системе FeCl3 + LiPh в присутствии галогенидов лития // Кинетика и катализ, 1981, т. 23, №6, с. 1457-1410. T.A. Bazhenova, A.K. Shilova, E. Deschamps, M. Gruselle, G. Leny, B Tchoubar, Obtention d’un complexe de fer(II) ne comportant que des ligands , le bis-lithium tetranaphtylferrate, et sa transformation par action de C3H7Li en un complexe reducteur de N2 // Journal of Organom. Chem., 222 (1981) pp. С1-С11. Т.А. Баженова, Р.Н. Лобковская, Р.П. Шибаева, А.Е. Шилов, А.К. Шилова, М.

Грюзель, Ж. Лени, Б. Чубар, Строение промежуточного активного комплекса в азотфиксирующей системе FeCl3 + LiPh // Кинетика и катализ, 1982, т. 24, №1, с. 246-212. T.A. Bazhenova, R.M. Lobkovskaya, R.P. Shibaeva, A.K. Shilova, A.E. Shilov, Structure of the naphthyl iron(II) complex formed in the reaction of FeCl3 and C10H7Li // Journal of Organometallic Chemistry, 244 (1983) p. 375-313. T.A. Bazhenova, R.M. Lobkovskaya, R.P. Shibaeva, A.K. Shilova, A.E. Shilov, Structure of the intermediate iron(0) complex isolated from the nitrogen fixing system LiPh + FeCl3 // Journal of Organometallic Chemistry, 244 (1983) p. 265-214. T.A. Bazhenova, I.N. Ivleva, L.M. Kachapina, A.K. Shilova, A.E. Shilov, Isolation and investigation of the complex Li3[FeNp3N2]nEt2O – the product of the interaction of molecular nitrogen with a naphthyl derivative of zero-valent iron // Journal of Organometallic Chemistry, 296 (1985) p. 95-115. T.A. Bazhenova, R.M. Lobkovskaya, R.P. Shibaeva, A.K. Shilova, A.E. Shilov, Crystal and molecular structures of hexameric lithium dimethylnaphthylsilanolate, [LiOSiNPMe2]6 // Journal of Organometallic Chemistry, 330 N1-2 (1987) p. 9-16. T.A. Bazhenova, L.M. Kachapina, A.E. Shilov, M.Yu. Antipin, Yu.T. Struchkov, Mono- and binuclear -aryl iron-lithium hydrides; synthesis and molecular structure // Journal of Organometallic Chemistry, 428 (1992) pp. 107-117. Bazhenova T. A., Shilov A. E., Nitrogen Fixation in Solution // Coord. Chem. Rev., 1995, V. 114, P. 69.

18. T. A. Bazhenova, A. F. Shestakov, A. E. Shilov, M. Yu. Antipin, Yu. T. Struchkov, K. A. Lyssenko, Reaction of an Iron-lithium complex with tolane and the structure of dilithiumtetraphenylbutadiene formed // J. Organomet. Chem., 1995, 490, 71-73.

19. T. A. Bazhenova, A. V. Kulikov, A. F. Shestakov, A. E. Shilov,. M. Yu. Antipin, K.

A. Lyssenko, Structure of [Li2Cl 6THF][Cp2ZrPPh2] and Its Implications for the Nature of Dilithium Dinitrogen Complex // J. Amer. Chem. Soc., 1995, 117, р.

12176-12120. Т. А. Баженова, А. Е. Шилов, Фиксация молекулярного азота в растворах // ЖВХО им. Менделеева, 1995, т.39, с. 50.

21. Т. А. Баженова, И.Н. Ивлева, А.В. Куликов, А.Ф. Шестаков, А. Е. Шилов, М.Ю. Антипин, К.А. Лысенко, Ю.Т. Стручков, Молекулярное строение литийциркониевой комплексной соли [Li2Cl 6THF][Cp2ZrPPh2]. Вывод о природе дилитиевого комплекса с молекулярным азотом // Коорд. Химия, 1995, 21, 9, с.

704.

22. Баженова Т. А., Баженова М. А., Петрова Г. Н., Шилов А. Е., Железомолибденовый кофактор нитрогеназы как катализатор восстановления ацетилена амальгамой цинка // Кинетика и катализ, 1997, Т. 38, С. 323. Баженова Т. А., Баженова М. А., Петрова Г. Н., Шилова А.К., Шувалова Н.И., Шилов А. Е. Роль тиофенола в каталитическом восстановлении ацетилена амальгамой цинка. Развитие химических моделей нитрогеназы // Доклады академии наук, 1997, том 354, №1, с. 51-24. Bazhenova T. A., Bazhenova M. A., Mironova S. A., Petrova G. N., Shilova A. K., Shuvalova N. I., Shilov A. E., Catalytic reduction of acetylene in presence of molybdenum and iron clusters, including FeMo-cofactor of nitrogenase // Inorg.

Chim. Acta, 1998, 270, р. 221-225. Баженова Т. А., Баженова М. А., Петрова Г. Н., Шилова А.К., Шилов А. Е., Каталитическое восстановление ацетилена и азота с участием железомолибденового кофактора нитрогеназы и синтетических полиядерных комплексов молибдена (III) // Известия академии наук, серия химическая, 1998, №5, с. 890-826. T. A. Bazhenova, N. S. Emelyanova, A. F. Shestakov, A. E. Shilov, M. Yu.

Antipin, K. A. Lyssenko, Molecular Structure and Reactions of Azobenzene Complexes with Iron-Lithium Compounds // Inorg. Chim. Acta, 280, 1998, 288-227. T. A. Bazhenova, M. A. Bazhenova, G. N. Petrova, A.E. Shilov “Catalitic reduction of acetylene with participation of isolated FeMo-co from Azotobacter vinelandii in non-enzymatic conditions”, in Biological Nitrogen fixationfor the 21st century,A.

Kondorosi, W. Newton (eds.) 1998, Kluwer Academic Publishers, p. 28. Баженова Т. А., Баженова М. А., Петрова Г. Н., Шилов А. Е., Ингибирование молекулярным азотом восстановления ацетилена, катализируемого выделенным из белка FeMo-кофактором нитрогеназы // Кинетика и катализ, 1999, Т. 40, С. 942-929. Баженова Т. А., Баженова М. А., Петрова Г. Н., Миронова С. А., Стрелец В.

В., Каталитическое поведение в неэнзиматических условиях выделенного из фермента железо-молибденового кофактора нитрогеназы в реакции восстановления С2Н2, // Кинетика и катализ, 2000, Т. 41, №4, с. 550-563.

30. T. A. Bazhenova, M. A. Bazhenova, G. N. Petrova, A. E. Shilov, “Catalytic behavior of isolated FeMo-cofactor of nitrogenase in non-protein surroundings”, in Nitrogen fixation: from molecules to crop productivity, F.O. Pedrosa, M. Hungria, G. Yates, W. Newton (eds.) 2000, Kluwer Academic Publishers, p. 49-31. Т. А. Баженова, М. А. Баженова, Г. Н. Петрова, С. А. Миронова, Кинетика и механизм реакции восстановления ацетилена амальгамой европия, катализируемой активным центром нитрогеназы, выделенным из фермента // Кинетика и катализ, 2002, т. 43, N 3, с. 382-332. М. А. Баженова, Т. А. Баженова, Г. Н. Петрова, С. А. Миронова, Взаимное влияние субстратов и ингибиторов в реакциях, катализируемых железомолибденовым кофактором нитрогеназы вне белка // Кинетика и катализ, 2002, т. 43, N 2, с. 219-233. T. A. Bazhenova, M. A. Bazhenova, G. N. Petrova, “Isolated FeMo-co catalytic reactivity in non-protein surroundings: substrate and inhibitor interactions (C2H2, N2, CO)”, in Nitrogen fixation:global perspectives, T. Finan, M. O’Brian, D.

Layzell, K. Vessey, W. Newton (eds.) 2002, CAB International, p. 334. Т. А. Баженова, Н. В. Бардина, Г. Н. Петрова, М. А. Боровинская, Влияние потенциала внешнего донора электронов на закономерности катализа восстановления ацетилена в присутствии активного центра нитрогеназы (FeMoco), выделенного из фермента // Известия АН, Серия химическая, 2004, №8, с. 1583-1535. Т.А. Баженова, Н.В. Бардина, Г.Н. Петрова, А.К. Шилова, А.Е. Шилов, Сравнительное изучение каталитического поведения полиядерного Mg-Mo комплекса и активного центра нитрогеназы, выделенного из фермента, в реакциях с С2Н2, N2 и СО // Известия АН, Серия химическая, 2006, №5, с. 766736. N. V. Bardina, T. A. Bazhenova, K. A. Lissenko, M.Yu. Antipin, Yu.M. Shulga, T.

A. Filina, A. F. Shestakov, Unusual binuclear alkoxomolybdenum(V) complex free of oxo groups: synthesis, structure and IR spectra // Mendeleev Commun., v. 16, 2006, 307-337. Savinykh T. A., Shestakov A. F., Bardina N. V., Bazhenova T. A., Shulga Yu. M., Density functional theoretical study of electron structure and IR spectra of polynuclear Mo8Mg2 complex, which is precursor of clusters with high nitrogen fixing ability // Mendeleev Commun. 2008, 18, 128-1






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.