WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

На правах рукописи

ЖУКОВА Наталья Владимировна ЖИРНЫЕ КИСЛОТЫ МОРСКИХ ОРГАНИЗМОВ:

ТАКСОНОМИЧЕСКИЕ И ТРОФИЧЕСКИЕ МАРКЕРЫ 03.00.04 – биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Владивосток 2009

Работа выполнена в Институте биологии моря Дальневосточного отделения РАН

Официальные оппоненты: доктор биологических наук Калинин В.И.

доктор биологических наук Санина Н.М.

доктор биологических наук Розенцвет О.А.

Ведущая организация: Институт биофизики СО РАН

Защита состоится « » 2009 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 005.005.01 в Тихоокеанском институте биоорганической химии ДВО РАН по адресу:

690022, г. Владивосток, проспект 100 лет Владивостоку, 159, ТИБОХ ДВО РАН.

Факс: (4232)314050, e-mail: science@piboc.dvo.ru

С диссертацией можно ознакомиться в филиале Центральной научной библиотеки ДВО РАН (г. Владивосток, проспект 100 лет Владивостоку, 159, ТИБОХ ДВО РАН).

Автореферат разослан « » 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, д.х.н., с.н.с. С.А. Авилов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Изучение липидов является актуальным направлением современной биохимии. Липиды обеспечивают жизнедеятельность клеток любой организации живого: от прокариот до многоклеточных эукариотических организмов. Липиды играют жизненно важную роль как источник энергии и как структурные компоненты клеточных мембран (Bishop, 1976). Важной структурной и функциональной составляющей молекулы любого класса липидов являются ЖК1.

Особый интерес представляют ЖК морских организмов, многие из которых богаты ПНЖК, которые необходимы для поддержания жидкостности клеточных мембран, они участвуют в адаптации организма к окружающей среде, являются эссенциальными факторами пищи животных и человека, обладают разнообразной биологической активностью. Большинство беспозвоночных не способны синтезировать длинноцепочечные ПНЖК и получают их через диетарные источники, обеспечивая свои потребности в этих эссенциальных компонентах для поддержания нормальной биохимической и физиологической функции (Watanabe et al, 1983). С такими представителями ПНЖК n-3, как эйкозапентаеновая и докозогексаеновая кислоты, связывают высокую биологическую активность морских липидов и их благотворное влияние на здоровье человека (Dyerberg, 1986; Tapiero et al., 2002).

В результате многолетних исследований накоплен обширный материал по липидам и жирным кислотам морских беспозвоночных (Joseph, 1982; Ackman, 1983; Thiel et al., 2002).

Однако некоторые таксоны до сих пор слабо изучены, другие остаются без внимания. Работы по исследованию биосинтеза жирных кислот и путей их метаболизма в морских беспозвоночных единичны (Moreno et al., 1979; Morales Litchfield, 1977). Кроме этого, согласно современному методу идентификации бактерий, основанному на полифазной таксономии, оценка ФЛ и ЖК, отражающих филогенетические связи, как хемотаксономических характеристик является важной задачей. Поэтому изучение ЖК различных групп морских организмов до сих пор остается актуальной и важной проблемой. Это обусловлено тем, что достаточно полно понять закономерности распределения ЖК можно лишь, располагая обширной информацией и заполнив пробелы в знаниях по липидной биохимии отдельных групп, уделив особое внимание установлению структур молекул, путей биосинтеза и происхождения ЖК в морских организмах.

Сокращения, используемые в работе: ЖК – жирные кислоты, ФЛ – фосфолипиды, ГЛ – гликолипиды, СД – симбиотические динофлагелляты, ФАР – фотосинтетически-активная радиация, ТАГ – триацилглицерины, ПНЖК – полиненасыщенные ЖК, СДЖК – сверхдлинноцепочечные ЖК, НМР – неметиленразделенные ЖК, СЖК – свободные жирные кислоты, ФЛЖК – жирные кислоты фосфолипидов, МЭЖК – метиловые эфиры ЖК.

Развитие современных методов анализа ЖК, таких как капиллярная ГЖХ и ГЖХ в сочетании с масс-спектрометрией, дает широкие перспективы получения достоверной информации, что поможет выявить ряд особенностей распределения и структур этих компонентов, а также сравнить с известными в литературе данными.

Современное направление в биохимии липидов – использование ЖК как биохимических маркеров для решения важнейших вопросов трофической экологии, связанных с анализом источников и путей трансформации органического вещества в морских экосистемах (Sargent et al., 1987; Dalsgaard et al., 2003). Сложность трофических связей в морских экосистемах привела к поиску новых эффективных методов исследования. Для детального изучения пищевых взаимоотношений между организмами может служить метод биохимических маркеров, в качестве которых используются ЖК. Этот подход основан на специфичности состава ЖК микроорганизмов и водорослей, которые служат пищей для животных, и на ограниченной способности животных синтезировать ЖК, значительную часть которых животные получают из потребляемой пищи. Это позволяет рассматривать ЖК в качестве биохимических маркеров как весьма эффективный и перспективный инструмент для определения пищевого спектра и разнообразия источников пищи для морских организмов и для исследования пищевых цепей в морских экосистемах.

Для изучения трофических связей в морских экосистемах большое значение имеет знание особенностей состава ЖК микроводорослей и бактерий, которые являются первичными источниками пищи для морских беспозвоночных, а также выявление специфических компонентов, которые могут служить биомаркерами в таких исследованиях. Поскольку сведения о ЖК микроорганизмов доступны для ограниченного числа видов, информация для большего числа видов весьма желательна и полезна для установления характерных особенностей этих организмов.

Цель и задачи исследования. Цель работы – определение закономерностей распределения, химической структуры и путей биосинтеза жирных кислот в морских организмах, а также оценка роли жирных кислот как биомаркеров в трофических исследованиях.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

• Исследовать состав липидов и жирных кислот морских организмов из различных таксонов, включая бактерии, простейшие, водоросли и беспозвоночные, используя современные методы анализа.

• Определить влияние эндогенных и внешних факторов (среды) на состав и распределение липидов и жирных кислот в морских микроводорослях.

• Установить химическое строение ряда неидентифицированных и новых жирных кислот.

• Совершенствовать технику анализа меченных жирных кислот, которая позволит изучать пути их биосинтеза.

• Определить способности ряда морских организмов синтезировать ЖК из меченых предшественников.

• Охарактеризовать состав жирных кислот морских беспозвоночных, имеющих симбиотические микроорганизмы.

• Исследовать состав жирных кислот ряда брюхоногих и двустворчатых моллюсков, усоногих раков (баланусов) и полихет для определения их пищевых спектров и трофических взаимоотношений в отдельных сообществах.

• Определить пищевые источники в экосистеме мелководной гидротемы б. Кратерной (о.

Янкич, Курильские острова), используя потенциал жирных кислот как биомаркеров.

Положения, выносимые на защиту:

1. Распределение жирных кислот в морских микроорганизмах – бактериях и микроводорослях, отражает их систематическое положение. Жирные кислоты микроорганизмов имеют хемотаксономическое значение.

2. Гетеротрофные простейшие, составляющие первые звенья детритной пищевой цепи, способны продуцировать эссенциальные полиненасыщенные жирные кислоты и могут их источником в морских экосистемах.

3. Специфичность состава жирных кислот микроорганизмов позволяет оценить их вклад в симбиотические сообщества с морскими беспозвоночными.

4. Морские моллюски способны синтезировать неметиленразделенные жирные кислоты.

5. Состав жирных кислот морских беспозвоночных хотя и зависит от собственных биосинтетических способностей, но в значительной степени определяется характером потребленной пищи. Жирные кислоты беспозвоночных служат трофическими маркерами.

Научная новизна работы. Получены данные о распределение ЖК в липидах около 200 видов морских организмов, включая бактерии, простейшие, водоросли, а также представителей губок, кишечнополостных, моллюсков, иглокожих, ракообразных, полихет. Выявлены закономерности распределения ЖК в морских организмах.

Установлена связь состава жирных кислот с систематическим положением бактерий и микроводорослей. Получены новые данные по составу ФЛ и ЖК для ряда таксонов бактерий, которые были использованы для идентификации 4 новых родов и 39 новых видов морских протеобактерий. Эти хемотаксономические характеристики позволяют идентифицировать бактерии на уровне рода, а в некоторых случаях до вида. Найдено, что состав ФЛ и ЖК бактерий является отражением филогенетического положения исследованных организмов, а в ряде случаев и экофизиологического разнообразия штаммов. Выявлены таксономические различия в составе ЖК микроводорослей на уровне отделов. Редкие кислоты, группы обычных кислот или соотношение кислот могут служить полезными биохимическими индикаторами микроводорослей в экологических исследования.

Изучено влияние ряда факторов (жизненный цикл и интенсивность освещения) на липиды и ЖК микроводорослей. Установлено, что, несмотря на вариабельность состава липидных компонентов, черты, характерные для отдельных отделов, сохраняются.

На основе экспериментальных данных впервые показана способность простейших, составляющих первые звенья детритной пищевой цепи, продуцировать разнообразные эссенциальных ПНЖК, включая арахидоновую, ЭПК и ДГК. Таким образом, доказано, что Protozoa наряду с микроводорослями являются источником ПНЖК в морских экосистемах.

Установлена структура ряда ЖК из водорослей, губок и моллюсков. Впервые описана нечетная кислота 21:27,15 в голожаберных моллюсках. Впервые доказана способность моллюсков синтезировать НМР ЖК de novo, установлены пути биосинтеза этих компонентов.

Установлено, что по составу ЖК беспозвоночных можно определить присутствие симбиотических микроорганизмов в тканях животных. Определены специфические ЖК маркеры, позволяющие идентифицировать различные группы симбиотических микроорганизмов (хемоавтотрофные бактерии, симбиотические динофлагелляты – зооксантеллы, зеленые микроводоросли, цианобактерии) в клетках хозяина (моллюсков, кораллов и губок).

Экспериментально подтверждена способность ЖК передаваться по пищевым цепям и служить биомаркерами в трофических исследованиях. Определены пищевые источники для ряда морских бентосных беспозвоночных и трофические связи в сообществах и мелководной гидротермальной экосистеме.

Теоретическая и практическая значимость. Получены новые данные по распределению липидов и ЖК в различных видах бактерий, водорослей и беспозвоночных. Эти данные полезны для решения вопросов филогении, эволюции и экологии морских организмов. В виду сильного фенотипического сходства морских аэробных гетеротрофов, разработка перспективных хемотаксономических маркеров, полезна для быстрой и точной идентификации, по крайней мере, на уровне рода для изолятов из окружающей среды, особенно, в экологических исследованиях. Получены данные об эффективной продукции эссенциальных ЖК, таких как ЭПК и АК, микроводорослями, простейшими и некоторыми видами бактерий, что открывает перспективы использования этих микроорганизмов как источника биологически активных веществ.

Разработка метода биохимических маркеров – жирных кислот может внести вклад в решение ряда проблем трофической экологии и понимание трофических структур морских экосистем. Получена важная характеристика пищевого спектра промыслового и культивируемого моллюска приморского гребешка, обитающего на разных типах донных осадках.

Показано негативное влияние симбиотической полихеты на развитие моллюска. Эти данные могут быть полезны для марикультуры этого вида.

Разработанный метод анализа метиловых эфиров жирных кислот обеспечивает эффективное разделение, высокую чувствительность и недеструктивное обнаружение, что позволяет использовать метод для анализа меченых радиоактивными изотопами ЖК.

Апробация работы. Результаты работы были представлены автором на Всероссийском симпозиуме «Полиненасыщенные жирные кислоты n-6 и n-3 семейств: медикобиологические, биохимические и биотехнологические аспекты» (Владивосток, 1995), международных конференциях PICES (Владивосток, 1995, 1999, 2005гг.), международном совещании International Workshop on the Global Change Studies in the Far East (Владивосток, 2002), международной конференции «Мосты науки между Северной Америкой и ДВ России. Прошлое, настоящее и будущее» (Владивосток, 2004), международной конференции Mollusks of the Northeastern Asia and Northern Pacific: biodiversity, ecology, biogeography and faunal history (Владивосток, 2004), третьей международной научно-практической конференции «Морские прибрежные экосистемы. Водоросли, беспозвоночные и продукты их переработки» (Владивосток, 2008), международной конференции Marine biodiversity and bioresources of the NorthEastern Asia. (Чеджу, Ю. Корея, 2008).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 54 статьи в отечественных и международных журналах.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, пяти глав с изложением результатов работы и их обсуждения, описания материалов и методов исследования, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 358 источников. Диссертация изложена на 274 стр. машинописного текста, содержит рисунка и 44 таблицы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Жирные кислоты морских организмов. Обзор литературы В обзоре литературы, состоящем из пяти разделов, обобщены литературные сведения о разнообразии и специфичности распределения ЖК в различных группах морских организмов. Проанализированы имеющиеся в литературе данные. Обоснованы преимущества ЖК как биохимических маркеров в трофических исследованиях.

2. Материалы и методы исследования Бактерии содержатся в Коллекции морских микроорганизмов (КММ) в ТИБОХ ДВО РАН. Для анализа липидов штаммы выращивали при 28оС на морском агаре. После 48 часов роста клетки собирали для анализа. Микроводоросли содержатся в культуре в коллекции ИБМ ДВО РАН. Культуры для эксперимента выращивали при 20 ± 2оС в фильтрованной морской воде соленостью 32%о, обогащенной средой F (Guillard, Ryther, 1962) или средой Гольдберга. Животных собирали в заливах Петра Великого, у Курильских островов, у побережья Вьетнама, с окаймляющего рифа о. Окинава и в о. Байкал. Сбор проводили на литорали, водолазным способом, планктонной сетью и драгированием.

Липиды экстрагировали смесью хлороформ-метанол (Bligh, Dyer, 1959). Анализ липидов проводили методом высокоэффективной ТСХ (Беленький и др., 1984). Для разделения нейтральных липидов выполняли одномерную хроматографию, применяя смесь растворителей: гексан–диэтиловый эфир–уксусная кислота, 80:20:1. Для разделения индивидуальных ФЛ использовали системы растворителей (Vaskovsky, Terekhova, 1979). В первом направлении: хлороформ–метанол–бензол–28% NH4OH, 65:30:10:6, во втором направлении: хлороформ–метанол–уксусная кислота–ацетон–бензол–вода, 70:30:4:5:10:1. Для обнаружения и идентификации липидов использовали неспецифические и специфические реагенты (Kates, 1986). Количество ФЛ определяли по содержанию фосфора (Vaskovsky et al., 1975).

Метиловые эфиры жирных кислот получали по методу Carreau, Dubacq (1978). МЭЖК бактерий обычно получали кислотным метанолизом (5%HCl/MeOH, 80о 3 ч). Перед анализом очистку метиловых эфиров проводили ТСХ в бензоле. МЭЖК анализировали ГЖХ на набивных колонках (фазы DEGS, FFAP и Silar 5CP на Chromaton N, длина 2-5 м) и капиллярных кварцевых колонках с иммобилизованными фазами Carbowax 20M, OV-101, а также на готовых колонках Supelcowax 10 и SPB-5 длина 25-30 м, внутренний диаметр 0.25 мм, температура 200-220оС. В работе использовали хроматографы Shimadzu-GC5A, Shimadzu-GC9A и Shimadzu-GC14A. ЖК идентифицировали сравнением времен удерживания со стандартами и по рассчитанным значениям эквивалентной длине цепи. Дополнительно для идентификации ЖК проводили разделение МЭЖК по степени ненасыщенности на ТСХ, пропитанных AgNO3, и каталитическое гидрирование над PtO2. Физико-химические исследовании проводили на оборудовании ТИБОХ РАН. Для доказательства структуры ЖК использовали химические методы (озонолиз, частичное восстановление двойных связей гидразином) и ГЖХМС анализ МЭЖК или их пирролидиновых производных. ГЖХ-МС анализ проводили на приборе Shimadzu QP-5050A, снабженном капиллярной кварцевой колонкой (0.25 мм 30 м) с фазой MDN-5S или Supelcowax 10. Газ-носитель – гелий. Энергия ионизации 70 eV.

Величины среднего квадратического отклонения (SD) использовали как показатель вариации величин средней. Для обнаружения различий между средними использовали критерий Стьюдента (t-test) или дисперсионный анализ (ANOVA). Различия считали статистически значимыми при Р 0.05. Для оценки степени сопряженности (связи) между признаками (величинами) использовали корреляционный анализ.

3. РАЗРАБОТКА МЕТОДА АНАЛИЗА МЕЧЕНЫХ МЕТИЛОВЫХ ЭФИРОВ ЖИРНЫХ КИСЛОТ ДВУМЕРНОЙ ТОНКОСЛОЙНОЙ ХРОМАТОГРАФИЕЙ При изучении метаболизма жирных кислот морских беспозвоночных встала задача – анализировать индивидуальные ЖК с низкой радиоактивностью. Обычно это делают с помощью ГЖХ с последующим сцинтилляционным счетом собранных фракций, или используя специальные радиоактивные детекторы. Оба метода не лишены недостатков.

Основываясь на методе высокоэффективной ТСХ с прочно закрепленным слоем сорбента (Беленький и др., 1984), нами была предложена техника анализа меченых ЖК, которая представляет собой двумерную ТСХ на силикагеле, импрегнированном нитратом серебра в первом направлении и обратно-фазовую хроматографию во втором направлении. Использование пластинок с прочно закрепленным слоем сорбента позволяет погружать пластинки в различные водные реагенты без разрушения слоя. Это свойство позволило отмывать их раствором тиосульфата натрия после ТСХ на силикагеле, пропитанном AgNO3, для того, чтобы удалить нитрат серебра, который мешал бы последующей процедуре разделения МЭЖК по длине цепи обратно-фазовой хроматографией во втором направлении. Декан, которым пропитывались пластинки для обратно-фазовой хроматографии, легко удалялся с пластинки струей теплого воздуха, что позволяло исследовать разделенные вещества любыми физикохимическими методами. В ряде экспериментов было показано, что степень пропитки нитратом серебра при используемых условиях составляла 8%, а деканом – 10-12%.

На рис. 1 показаны результаты разделения МЭЖХ из общих липидов печени крысы ТСХ и ГЖХ. Число пятен на тонкослойной хроматограмме соответствует числу пиков на газовой хроматограмме. Это доказывает высокую эффективность разделения смеси разработанным методом двумерной ТСХ.

Таблица 1. Действие времени отмывки тонкослойных пластинок на сохранение меченых метиловых эфиров жирных кислот на ТСХ Время отмывки (мин) Радиоактивность (cpm) Сохранность (%) Тиосульфатом Водой Нанесено на ТСХ После процедуры 0.5 3 15 737 15 637 99.1.0 5 77 055 70 058 90.2.0 10 19 517 16 774 85.Эксперименты с индивидуальными мечеными МЭЖК (16:0, 18:0 и 18:1) и смесью, полученной после введения 1-14С-ацетата в эмбрионы морского ежа, показали, что сохраняется более 90% радиоактивности (табл. 1). Разработанная нами процедура отличается высокой чувствительностью (для анализа требуется 50-100 мкг смеси МЭЖК), она позволяет недеструктивное обнаружение, а также относительно проста и дешева. При этом разрешающая способность ТСХ близка к разрешению при ГЖХ на набивных колонках.

Б А Рис. 1. (А.) Двумерная ТСХ МЭЖК липидов печени крысы (100 мкг): первое направление – хроматография на силикагеле, пропитанном AgNO3, второе направление – обратнофазовая хроматография. Обнаружение 10% H2SO4 в метаноле с последующим нагреванием 180оС. (Б.) ГЖХ МЭЖК липидов печени крысы. Обозначения 1 – 16:0, 2 – 16:1, 3 – 18:0, 4 – 18:1, 5 – 18:2n-6, 6 – 18:3n-3, 7 – 20:3n-6, 8 – 20:4n-6, 9 – 22:4n-6, 10 – 22:5n-6, 11 – 22:5n-3, – 22:6n-3.

4. ЖИРНЫЕ КИСЛОТЫ МОРСКИХ ОРГАНИЗМОВ В настоящей главе представлены результаты многолетних исследований по изучению состава ЖК в липидах около 200 видов морских организмов, включая бактерии, простейшие, водоросли (микро- и макро-), а также представителей губок, кишечнополостных, моллюсков, иглокожих, ракообразных, полихет.

4.1. Фосфолипиды и жирные кислоты бактерий В этой главе приведены результаты исследования ФЛ и ЖК морских бактерий как важных хемотаксономических показателей, являющихся составной частью полифазной таксономии бактерий. Эти работы выполнены мною в ходе совместных исследований по идентификации новых таксонов бактерий с сотрудниками Лаборатории микробиологии ТИБОХ ДВО РАН Е.П. Ивановой, О.И. Недашковской и Л.И. Романенко.

Поскольку описание новых организмов вместе с филогенетическим доказательством обязательно должна подтверждаться рядом фенотипических свойств, необходимых для дифференциации видов и родов, оценка хемотаксономических характеристик, отражающих филогенетические связи, является важной задачей. Разработка перспективных хемотаксономических маркеров полезна для быстрой и точной идентификации морских бактерий, по крайней мере, на уровне рода для изолятов из окружающей среды, особенно, в экологических исследованиях.

4.1.1 Alteromonas-подобные бактерии Для того чтобы оценить значение ЖК и ФЛ для дифференциации группы бактерий, родственных Alteromonas, был проанализирован состав ЖК и ФЛ всех видов родов Alteromonas, Pseudoalteromonas Marinomonas, Glaciecola и Idiomarina, выделенных из морской воды, водорослей, морских беспозвоночных в Лаборатории микробиологии ТИБОХ ФЛ составляли от 55до 85% от общих липидов. ТСХ анализ показал, что ФЭ и ФГ были главными ФЛ всех культур этой группы. Соотношение классов ФЛ имело характерное для родов распределение (рис. 2).

Pseudoalteromonas Alteromonas macleodii Glaciecola mesophila haloplanktotis 71,69,37,60,23,23,2,2,8 2,3,7 3,ФЭ ФГ бис-ФК ЛФЭ ФЭ ФГ бис-ФК ЛФЭ ФЭ ФГ бис-ФК ДФГ Рис. 2. Состав фосфолипидов различных видов альтеромонад Доминирующими кислотами этой группы бактерий были 16:1n-7, 16:0, 17:1n-8 и 18:1n-7, тогда как 14:0, 15:0, 15:1n-8 и 17:0 относились к минорным компонентам. Основываясь на полученных результатах, установлено, что для Idiomarina характерен высокий уровень iso-15:0, для Glaciecola – 16:1n-7, для Marinomonas – 18:1n-7. Эти компоненты могут Рис. 3. Дендрограмма сходства жирных кислот Alteromonas-подобных видов.

считаться специфическим маркерами для этих родов. Продолжая оценку ЖК как таксономических показателей, мы оценили состав описанных видов Alteromonas и Pseudoalteromonas.

Хотя профили ЖК представителей этих родов показали высокую степень сходства, соотношения некоторых компонентов вполне различались для каждого рода, что позволило разделить штаммы каждого рода в отдельные кластеры (рис. 3.). Таким образом, для дифференциации бактерий родственных Alteromonas (Pseudoalteromonas, Alteromonas, Marinomonas, Glaciecola и Idiomarina) успешно использован состав ЖК и ФЛ бактерий. Полученные данные подтверждают, что ЖК являются ценными хемотаксономическими маркерами для дифференциации филогенетически сходных родов, которые нельзя разделить на основании фенотипических данных.

4.1.2. Бактерий рода Shewanella Род Shewanella включает группу грамотрицательных, аэробных и факультативно анаэробных, гаммапротеобактерий, адаптированных как к умеренным, так и низким температурам, высокому давлению и глубоководной среде. Существуют определенные трудности при идентификации штаммов Shewanella, выделяемых из природной среды, что связано с высокой степенью сходства фенотипических признаков с другими морскими гаммапротеобактеТаблица 2. Состав главных клеточных жирных кислот бактерий видов Shewanella (в % от суммы кислот). n – число проанализированных штаммов.

S. colwelliana S. japonica S. waksmanii S. fidelis S. pacifica S. affinis n=4 n=7 n=2 n=2 n=6 n=12:0 1.9 1.7 2.0 1.iso-13:0 6.7 8.1 10.0 10.7 9.3 6.14:0 1.3 3.1 1.7 2.iso-15:0 25.0 33.0 32.5 22.3 34.0 20.aiso-15:0 0.5 1.9 0.15:0 6.8 3.7 5.3 8.7 6.15:1n-6 2.3 0.2 1.16:0 7.9 8.8 6.2 12.9 8.9 6.16:1n-7 21.5 14.5 9.8 20.0 14.8 21.iso-17:0 1.9 1.9 0.17:0 2.8 0.7 1.17:1n-8 14.7 5.0 - 6.3 14.18:0 0.3 0.5 0.3 0.18:1n-7 2.5 3.2 2.0 5.20:5n-3 1.1 4.9 6.7 – 5.3 2.риями. Для выявления надежных хемотаксономических показателей этого рода был определен состав ЖК различных штаммов Shewanella, выделенных из ряда видов беспозвоночных (офиуры, сипункулиды, голотурий), а также морской воды и донных осадков Северозападной Пацифики (Японское море и Курильские острова).

Главные характерные черты ЖК профилей проанализированных штаммов (табл. 2) сходны с тем, что известно для других видов Shewanella (Russel, Nichols, 1999). Во всех изученных штаммах кислоты iso-13:0, iso-15:0, 15:0, 16:0, 16:1n-7 и 17:1n-8 были главными компонентами, и уровень разветвленных ЖК достигал 54% от суммы кислот. ЭПК 20:5n-3 идентифицирована во всех изолятах, за исключением S. fidelis, и составляла от 1.1 до 6.7% от суммы. Несмотря на вариабельность состава ЖК между исследованными видами Shewanella, специфические особенности рода сохраняются. Показано, что кластерный анализ, основанный на составе клеточных ЖК, может быть полезным дополнительным инструментом для дифференциации родов. Однако, этот метод неэффективен для разделения видов родов как Shewanella так и Pseudoalteromonas.

4.1.3. Бактерии типа Cytophaga-Flavobacterium-Bacteroides Бактерии типа Cytophaga-Flavobacterium-Bacteroides (CFB), являющиеся одним из доминирующих компонентов микробных сообществ морских экосистем и освоившие разнообразные экологические ниши, часто перекрываются фенотипически с членами других типов. В результате исследования разнообразных штаммов флавобактерий нами оценена важность хемотаксономической информации, полученной в результате анализа ФЛ и ЖК. Получены новые данные, часть из которых легла в основу описания хемотаксономических харакТаблица 3. Состав жирных кислот новых описанных видов флавобактерий Жирные Mesonia Formosa Salegentibacter Algibacter кислоты lectus algae mobilis algae agariphila flavus holothuriorum i-15:1 36.7 38.3 9.9 6.5 5.4 18.2 13.ai-15:0 11.4 4.0 4.7 3.4 11.1 7.i-15:0 9.8 9.7 17.1 12.7 5.4 26.3 12.15:0 6.0 7.6 15.5 8.7 8.6 9.6 13.15:1n-6 2.9 2.3 8.5 6.0 2.9 10.i-16:0 3.4 1.0 1.1 2.1 7.ai-16:1 1.0 0.6 2.5 3.16:0 0.9 2.2 1.1 1.6 5.16:1n-7 3.6 8.1 3.3 4.0 7.5 10.i-17:1 6.5 6.2 1.3 1.4 1.8 8.17:1n-6 2.9 3.6 4.7 3.2 4.i-15:0 2OH 2.9 8.3 3.0 11.8 3.6 7.ai-15:0 2OH 3.i-15:0 3OH 6.7 7.7 1.0 9.i-16:0 2OH 1.0 0.7 4.i-16:0 3OH 1.4 0.5 4.0 8.9 6.i-17:0 3OH 3.7 2.3 9.6 8.5 3.2 9.ai-17:0 3OH 1.0 4.15:0 2OH 1.5 1.15:0 3OH 2.3 2.16:0 3OH 2.17:0 2OH 1.теристик трех новых родов: Mesonia (Nedashkovskaya et al., 2003), Formosa (Ivanova et al., 2004) и Algibacter (Nedashkovskaya et al., 2004), а также семи новых видов.

Профили ЖК новых описанных видов имеют специфические черты семейства Flavobacteriacea, т.е. комбинацию разветвленных (iso- и anteiso-) кислот, составляющих 5070% от суммы кислот, а также значительную концентрацию разнообразных гидрокси 2ОН и 3ОН жирных кислот (табл. 3). Обнаружены существенные различия в распределении отдельных компонентов между родами. Наличие единственного фосфолипида ФЭ специфично для флавобактерий. Таким образом, новые изоляты содержали высокие пропорции разветвленных насыщенных и моноеновых клеточных ЖК, которые, как и наличие гидрокси кислот, аминосодержащих липидов и единственного среди фосфолипидов ФЭ, специфичны для флавобактерий и отличались гетерогенностью состава ЖК между родами.

4.1.4. Вибрионы, аэромонады Состав ФЛ и клеточных ЖК как хемотаксономических маркеров был использован для выявления различий между родами и видами вибрионов Aeromonas и Vibrio, выделеных из водохранилища. Состав ФЛ изученных бактерий обоих родов был сходен, среди них главными были ФЭ, ФГ, ДФГ. Хотя не существовало дифференциации по составу ФЛ между родами, этот анализ полезен в качестве дополнительной хемотаксономической характеристики.

Анализ клеточных ЖК видов Aeromonas и Vibrio изолятов позволил дифференцировать роды и виды. Некоторая видоспецифичность наблюдалась, как по соотношению этих главных компонентов – 16:0, 16:1n-7 и 18:1n-7, так и по распределению минорных кислот. В результате кластерного анализа данных по ЖК в изученных штаммах Aeromonas и Vibrio сформировалось несколько кластеров на Эвклидовом расстоянии 10-15, что доказывает их связь на уровне родов и видов (Sasser, 1997). Таким образом, ФЛ и профили ЖК представляют полезную информацию, эффективную для таксономии этих бактерий, а также для экологического мониторинга Aeromonas и Vibrio.

Сходные хемотаксономические особенности были обнаружены у нового описанного рода и вида Oceanisphaera litoralis, выделенного из донных песчаных осадков (Romanenko et al, 2003). ФЛ представлены ФЭ и ФГ. Главные ЖК – 16:0, 16:1n-7 и 18:1n-7 (в сумме почти 90%). Филогенетический анализ показал высокую степень сходства с членами семейств Vibrionaceae и Aeromonadaceae.

Полученные данные значительно расширили знания о биохимическом разнообразии бактерий и подтвердили представление, о том, что ЖК отражают внутривидовое сходство и являются ценными таксономическими маркерами для дифференциации филогенетически сходных родов.

4.2. Липиды и жирные кислоты микроводорослей 4.2.1. Планктонные микроводоросли Микроводоросли являются главным поставщиком органического вещества и энергии в морских экосистемах, источником эссенциальных ПНЖК и пищей для морских животных, определяя их функционирование и жизнеспособность. В результате детального исследования состава ЖК 15 видов планктонных микроводорослей (рис. 4), культивированных в одинаковых условиях, относящихся к отделам Chlorophyceae (виды 1-4), Prasinophyceae (5, 6), Bacillariophyceae (7-10), Prymnesiophyceae (11), Dinophyceae (12), Eustigmatophyceae (13), Cryptophyceae (14) и Rhodophyceae (15), культивированных в одинаковых условиях было найдено, что каждый отдел микроводорослей характеризовался специфическим профилем ЖК. Показано, что необычные или некоторые обычные ЖК или соотношение кислот являются полезными хемотаксономическими маркерами отделов микроводорослей.

C16ПНЖК n-3, n-30 14:C16ПНЖК n-4, n-25 20:5n-5 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 C18 ПНЖК 20:4n-16:1n-22:6n-1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Виды микроводорослей Виды микроводорослей Рис. 4. Распределение маркерных жирных кислот в различных отделах микроводорослей (в % от суммы всех кислот).

Характерной чертой Chlorophyceae являлась высокая концентрация С16 ПНЖК, 16:2n-6, 16:3n-3 и 16:4n-3, а также С18 ПНЖК, 18:2n-6 и 18:3n-3. Ни один вид не содержал 22:6n-3, а 20:5n-3 найдена в следовых количествах. В представителях Prasinophyceae главны% от суммы жирных кислот % от суммы жирных кислот % от суммы жирных кислот % от суммы жирных кислот ми были 16:4n-3, 18:3n-3 и 18:4n-3. Кислота 20:5n-3 присутствовала в заметных количествах.

Кроме того, зеленые водоросли характеризовались повышенной концентрацией 16:1n-trans, специфичной для липидов, участвующих в фотосинтезе. Индикаторами диатомовых водорослей Bacillariophyceae служит высокая концентрация 16:1n-7 и превалирование 16:1n7 над 16:0, высокий уровень 20:5n-3 и 14:0, а также незначительная концентрация С18 кислот и 22:6n-3. К дополнительным маркерам диатомей относятся 16:2n-4, 16:3n-4 и 16:4n-1, доля которых очень велика по сравнению с другими водорослями. Prymnesiophyceae подобно диатомовым, содержат 14:0, 16:0, 16:1n-7 и 20:5n-3, как главные компоненты, но отличительной чертой является высокое содержание 18:4n-3 и присутствие 22:6n-3. Главными индикаторами фотосинтетичеких динофлагеллят Dinophyceae служит необычная 18:5n-3, высокое содержание 22:6n-3, редкой среди микроводорослей, а также С18 ПНЖК. Высокая концентрация 16:0, 16:1n-7 и 20:5n-3 при незначительном вкладе других компонентов могут считаться хемотаксономическими индикаторами отдела Eustigmatophyceae. Cryptophyceae богаты 16:0, C18 ПНЖК и 20:5n-3, при этом содержат едва заметные количества 18:0 и C16 ПНЖК.

Rhodophyceae имели характерный профиль ЖК, с доминирующими 16:0, 20:4n-6 и 20:5n-3. К их отличительной особенности относится высокое содержание 20:4n-6.

В заключении, выявлены таксономические различия в составе ЖК отделов микроводорослей. Редкие кислоты или группы обычных кислот могут служить полезными биохимическими индикаторами отдельных отделов.

4.2.2. Биохимический подход к оценке разнообразия симбиотических динофлагеллят В герматипных кораллах с окаймляющего рифа о. Сесоко (Окинава, Япония) были обнаружены три типа симбиотических динофлагеллят (СД), названных L, B и G, различающихся по своим морфологическим и физиологическим характеристикам (Titlyanov et al., 2001). Колонии гидрокоралла Millepora intricata содержали симбионтов типа L, склерактиниевые кораллы содержали тип B в Pocillopora damicornis, тип G в Seriatopora caliendrum и Seriatopora hystrix, а в Stylophora pistillata были обнаружены оба типа B и G. Различные типы СД различаются размерами клеток, формой и структурными элементами, максимальными скоростями клеточного деления и деградации клеток, первичной продукцией, по фотосинтетическим способностям и способностям аккумулировать пигменты. Учитывая связь ЖК состава микроводорослей с их систематическим положением, мы предположили, что анализ этих компонентов может прояснить вопрос о таксономической принадлежности типов СД.

Исследованные типы СД в целом обнаруживают черты, специфические для фотосинтетических динофлагеллят: присутствие высоких концентраций 18:4n-3, 18:5n-3, 22:6n-3 и 20:5n-3, причем 18:5n-3 и 22:6n-3 – кислоты редкие для других отделов микроводорослей. В тоже время распределение ЖК среди исследованных типов СД достаточно различается, чтобы отличить один тип от другого.

Главная особенность состава ЖК полярных липидов СД из M. intricata – практически полное отсутствие кислот 20:4n-6 и 20:5n-3, которые являются доминирующими в других типах СД. Принципиальным отличием СД типа L от других типов является высокая концентрация 18:5n-3 в полярных липидах, а также 22:5n-6 (10% от суммы кислот), которая отсутствует в других типах СД. Таким образом, сочетание высоких пропорций 18:4n-3, 18:5n-3, 22:5n-6 и 22:6n-3 со следовыми количествами 20:4n-6 и 20:5n-3 в СД типа L из M. intricata является уникальным. Профили жирных кислот СД типов B и G довольно сходны, главное различие состоит в уровне 18:4n-3 и 22:6n-3. Тип B имеет высокое содержание 18:4n-3 и низкое 22:6n-3. Тип G имеет обратную пропорцию этих кислот.

Анализ ЖК показал принципиальные различия между типом L, выделенным из M. intricata и типами B и G, найденными в склерактиниевых кораллах. Существенные различия были также обнаружены между типами B и G. Более того, эти различия были найдены как в полярных липидах, структурных компонентах клеточных мембран, так и запасных липидах клетки – ТАГ. Известно, что вариации состава ЖК микроводорослей определяет геном организма. Можно предположить, что различия в ЖК составе между морфофизиологическими типами СД являются отражением генетических различий этих типов. Анализ ЖК служит полезным инструментом для определения таксономических различий между симбиотическими динофлагеллятами беспозвоночных.

4.2.3. Влияние условий среды на липиды и жирные кислоты микроводорослей Состав липидов фототрофных организмов может меняться под влиянием факторов окружающей среды и в зависимости от физиологических характеристик, таких как стадии жизненного цикла.

4.2.3.1. Изменение состава липидов и жирных кислот в течение жизненного цикла диатомовых водорослей Некоторые диатомовые водоросли в неблагоприятные периоды оседают на дно, образуя покоящиеся клетки и споры. Считается, что образование покоящихся стадий является стратегией выживания микроводорослей при неблагоприятных условиях окружающей среды и, следовательно, для поддержания популяции диатомовых в морских экосистемах. Молекулярные механизмы происходящих адаптационных процессов практически не исследованы. В связи с этим, исследованы вегетативные клетки и клетки в покоящейся стадии диатомовых Chaetoceros salsugineus и Thalassiosira pseudonana. с целью определения роли липидов в экологии и физиологии этих организмов.

Результаты исследования показали, что в течение жизненного цикла диатомей происходят заметные биохимические изменения. Соотношение классов липидов и их ЖК профили меняются в зависимости от жизненных форм. Количество полярных липидов, включающих ФЛ и ГЛ, являющихся структурными компонентами клеточных мембран и мембран тилакоидов, быстро увеличивается в период образования покоящихся клеток (рис. 5).

Рис. 5. Изменение состава липидов Рис. 6. Изменение относительного содерThalassiosira pseudonana в течение жиз- жания жирных кислот в полярных липидах ненного цикла. 1 – полярные липиды, 2 – Thalassiosira pseudonana в течение жизтриацилглицерины, 3 – стерины, 4 – сво- ненного цикла. 1 – 20:5n-3, 2 – 16:3n-4, 3 – бодные жирные кислоты, 5 – углеводоро- 16:0, 4 – сумма 18:0 и 18:1n-9.

ды.

В полярных липидах главными были ПНЖК 16:3n-4 и 20:5n-3, составляющие до 59% от суммы ЖК и достигающие максимума в период образования покоящихся клеток (рис. 6).

Таким образом, изменения, наблюдаемые в липидном составе микроводорослей, являются результатом активных биохимических процессов, происходящих при формировании покоящихся клеток. В клетках покоящихся стадий аккумулируются структурные компоненты фотосинтетических и клеточных мембран, что, вероятно, обеспечивается быстрый рост клеток и массовое развитие вида при возникновении благоприятных условий в природной среде.

4.2.3.2. Влияние света на состав жирных кислот симбиотических динофлагеллят Свет является наиболее важным фактором в жизненных процессах фототрофных организмов. Биосинтез органического вещества симбиотическими динофлагеллятами (СД) является жизненно важным процессом в кораллах, а свет – наиболее важным фактором в экологии коралловых рифов, поскольку липиды, синтезированные и аккумулированные фотоавтотрофными симбионтами, служат важнейшим источником энергии и клеточного материала для животного-хозяина.

Рис. 7. Содержание главных полиненасыщенных жирных кислот и хлорофилла a в симбиотических динофлагеллятах при различном уровне освещения (% от ФАР). Средние значения ± стандартное отклонение, n=3.

Впервые исследован состав ЖК симбиотических динофлагеллят из склерактиниевых кораллов Pocillopora damicornis, Seriatopora caliendrum, Seriatopora hystrix, Stylophora pistillata, Echinopora lamellosa, и из гидрокоралла Millepora intricata, адаптированных к различному уровню света: 95%, 30%, 8% и 2% ФАР. Полярные липиды и ТАГ существенно различались по составу ЖК. Полярные липиды были богаты ПНЖК, а ТАГ – насыщенными ЖК. Свет оказывал существенное влияние на состав ЖК как полярных липидов, так и ТАГ.

Повышение уровня света вызывало увеличение содержания 16:0 в обеих группах липидов и 16:1n-7 – в ТАГ. Очевидно, на ярком свету происходит активный синтез 16:0 de novo, обеспечивая утилизацию излишков энергии для энергетически затратных процессов. При уменьшении интенсивности света в полярных липидах уровень 22:6n-3 и 20:4n-6 снижался, тогда как происходило увеличение концентрации 18:4n-3 и 20:5n-3, которое сопровождалось повышением содержания хлорофилла a в клетках зооксантелл, (рис. 7). Хотя относительное содержание индивидуальных ЖК существенно варьировало при изменении света, в целом баланс между насыщенными и ПНЖК менялся незначительно. Это доказывает, что роль фотоадаптации не сводится к изменению жидкостности клеточных мембран. Вызванные светом изменения в составе жирных кислот отражают взаимосвязь фотосинтетических процессов и биосинтеза ЖК.

В целом, обнаружено, что, не смотря на заметные изменения в составе ЖК микроводорослей, характерные черты исследованных таксонов, сохраняются.

4.3. Биосинтез жирных кислот в простейших В морских экосистемах первичными продуцентами ПНЖК n-3 и n-6 серий являются микро- и макроводоросли, эти эссенциальные компоненты передаются далее по пищевой цепи животным. Таким образом, морские животные, неспособные синтезировать эти компоненты, получают эссенциальные ЖК необходимые для их нормальной жизнедеятельности.

Альтернативой пастбищной пищевой цепи в морских экосистемах является детритная пищевая цепь, когда органическое вещество включается в пищевую цепь только после превращения ее в бактериальную биомассу. Отсутствие ПНЖК в бактериях приводит к потере этих важных компонентов в первых звеньях этой пищевой цепи. Следующие за бактериями звенья составляют морские простейшие – бесцветные жгутиконосцы и инфузории. Существовала неопределенность относительно судьбы этих эссенциальных компонентов в детритной пищевой цепи, поскольку данные о содержании ПНЖК в морских простейших отсутствовали. Мы предположили, что представители Protista способны синтезировать ПНЖК. Для проверки этой гипотезы были исследованы ЖК простейших, выращенных на питательных средах (рис или крахмал) и включение меченого ацетата (рис.8). Состав ЖК жгутиконосцев Bodo sp. и инфузорий Euplotes crassus варьировал в зависимости от субстрата, но во всех экспериментах они содержали ПНЖК. Главными ЖК в инфузориях E. crassus, кормленB A 120 Euplotes Euplotes Bodo Bodo PL FFA TAG SE Рис. 8. Распределение радиоактивности из 1-14С ацетата по классам липидов (А) и (В) 3 C жирным кислотам простейших, культивированных на рисе. Общая радиоактивность равна 100%. (С) Удельная радиоактивность жирных кислот простейших. Обозначения: PL полярные липиды, FFA свободные жирные кислоты, TAG триацилгEuplotes лицериды, ES эфиры стеринов.

Bodo % от общей радиоактивности % от общей радиоактивности sat 14:16:18:20:18:20:22:Удельная радиоактивность sat 14:16:18:20:18:20:22:ных бактериями, выращенными на рисе, были насыщенные и моноеновые кислоты, доля ПНЖК составляла 17.4%, среди них найдены 20:4n-6 (4.8%) и 20:5n-3 (2.3%). Продукция ПНЖК в жгутиконосцах Bodo sp.на рисовой культуре составляла в сумме 5.9%, а на крахмале была выше (10.7%) за счет вклада 22:6n-3 (5.8%).

Опыты по включению 1-14C показали, что меченый ацетат наиболее активно включался в ФЛ обоих простейших (рис. 8А). Они были способны синтезировать ПНЖК (рис. 8B), и особенно высокой была скорость синтеза 22:6n-3 в Bodo sp. (рис. 8C). Несмотря на то, что скорость синтеза ПНЖК в инфузориях была ниже, чем в жгутиконосцах, присутствие эссенциальных ЖК в инфузориях значительной степени обогащает биохимический состав детритной пищевой цепи. Таким образом, установлено, что бесцветные жгутиконосцы и инфузории, составляющие первые звенья детритной пищевой цепи следом за бактериями, содержат ПНЖК и обладают способностью синтезировать эти эссенциальные компоненты. Это доказывает, что простейшие могут быть источником эссециальных ПНЖК в морских экосистемах.

4.4. Жирные кислоты макрофитов. Особенности состава жирных кислот бурой водоросли Sargassum pallidum Наиболее заметной особенностью состава ЖК S. pallidum является присутствие компонента, который был предварительно идентифицирован как дигомо--линоленовая кислота.

Разделение МЭЖК S. pallidum по ненасыщенности ТСХ, импрегнированной AgNO3, показало, что эта кислота концентрируется в зоне триеновых МЭЖК. Каталитическое гидрирование дало n-эйкозеновую кислоту (20:0). Масс-спектрометрия МЭЖК показала [М]+ m/z 320, который соответствует метилэйкозатриеноату. УФ спектр исключил присутствие конъюгированных связей, и на ИК спектре отсутствовали полосы поглощения, характерные для transэтиленной (960-980 см-1) и ацетиленной (2150 см-1) связей. Положения двойных связей, ближайших к эфирной связи и к метильному концу, были определены окислительным озонолизом с последующей ГЖХ продуктов, которые показали два пика на ГЖХ – ДМС8 и ММС6.

Доказательство структуры получено из результатов масс спектрометрии пирролидиновых производных. Структура кислоты, выделенной из Sargassum pallidum, была 20:38,11,14.

Образцы S. pallidum, собранные в разные сезоны в течение трех лет в различных бухтах залива Петра Великого Японского моря, имели сходный состав ЖК. Содержание 20:3n-в образцах варьировало от 12.8 до 17.7% от суммы кислот, и не было связано ни с сезоном, ни с местом сбора. Еще одна особенность этой водоросли состояла в доминировании n-6 над кислотами n-3 серии. Можно предположить, что высокое содержание 20:3n-6 является хемотаксономическим маркером S. pallidum. Эта кислота привлекает внимание как биологически активное вещество, поэтому высокое содержание этого компонента в распространенной морской водоросли может представлять как научный, так и практический интерес.

4.5. Жирные кислоты губок Жирные кислоты губок привлекают пристальное внимание биохимиков с точки зрения уникальности компонентов, многообразия их структур, биогенеза и роли в организме. Из трех классов типа Porifera класс Hexactinellida (Стеклянные губки) мало изучен. Исследованный вид глубоководной морской стеклянной губки Pheronema raphanus проявил черты, характерные для класса Hexactinellida. К ним можно отнести высокую пропорцию СДЖК, среди которых главные изомеры 30:35,9,21 и 30:35,9,23 (более 55% от суммы ЖК), низкую концентрацию разветвленных ЖК (2.8%) и отсутствие типичных морских кислот n-3 серии – как ЭПК и ДГК, результат отсутствия планктонных микроводорослей в пище этого глубоководного вида. Присутствие в СДЖК специфичной группировки двойных связей 5,9 указывает на сходство механизмов биосинтеза этих кислот в разных классах губок. Низкая доля разветвленных кислот в P. raphanus, как и в других стеклянных губках может служить показателем ассоциированных микроорганизмов, отличных от бактерий, ассоциированных с видами класса Demospongiae.

4.6. Жирные кислоты моллюсков Моллюски представляют второй по числу видов тип животных, большинство из которых являются морскими видами. Пионерские исследования ЖК моллюсков, выполнены в начале 70-х. Биохимия липидов многих моллюсков хорошо изучена, но остаются еще нерешенные вопросы. Целью проделанной работы было восполнить пробел в знаниях по липидной биохимии моллюсков.

4.6.1. Распределение неметиленразделенных жирных кислот К таким явным пробелам относились вопросы, связанные с НМР ЖК. Первым шагом на пути исследования НМР кислот было установление их структуры. Колоночная хроматография на силикагеле, импрегнированном AgNO3 обеспечила эффективное разделение метилового эфира 22:2 из двустворчатого моллюска Scapharca broughtoni. Чистота фракций, соответствующих 22:2, была 99.7%. 1Н-ЯМР спектр метилового эфира имел следующие сигналы (м.д.): 0.88 (т. СН3), 1.30 (м. СН2), 1.62 (м. Н3СО-СО-СН2-СН2), 2.03 (м. НС=СН-СН2), 2.32(т. СН3-О-СО-СН2), 367 (с. Н3С-О-СО), 5.34 (м. СН=СН). На 13С-ЯМР спектре были следующие сигналы химических сдвигов (м.д.): 14.2 (СН3), 22.7, 25.0, 28.9, 29.8, 32.0, 34.2 (СН2), 51.5 (СН3-О), 129.6, 130.1 (СН=СН), 174.3 (СО-О). Спектры показали присутствие двух двойных связей cis-конфигурации, отделенных от карбоксильной группы и друг от друга несколькими метиленовыми связями. Масс-спектрометрия метилового эфира 22:2 показала молекулярный ион равный 350, который соответствовал метилдокозадиеноату. Каталитическое гидрирование дало метиловый эфир бегеновой кислоты 22:0.

Заключение о структуре изомеров 22:2 НМР ЖК было сделано на основании результатов масс-спектрометрии пирролидиновых производных и ГЖХ анализа продуктов окислительного озонолиза метиловых эфиров. Пирролидиды 22:2 МЭЖК из S. broughtonii дали серию пиков с m/e 70, 98, 113, 126, 140, 154, 168, 180, 194, 208, 222, 236, 250, 262, 264, 276, 278, 290, 304, 318, 332, 346, 360, 374 и молекулярный ион m/e 389. Масс-спектр имел фрагменты, соответствующие полярной части молекулы (m/e 70 и m/e 98), и основной пик m/e 113. Нерегулярный интервал в 12 массовых единиц существует между максимумами пиков m/e 168 и 180, что указывает на двойную связь в положении 7, интервал между m/e 250 и m/e 262 – на двойную связь в положении 13, и интервал между m/e 278 и m/e 290 показывает существование двойной связи в положении 15. Характерные пики m/e 264 и m/e 276 доказывают, что двойные связи в положении 13 и 15 принадлежат разным изомерам 22:2 НМР ЖК.

Рис. 9. (А) ГЖХ продуктов окислительного озонолиза 22:2 НМР кислоты из Scapharca broughtoni. Пики соответствуют 1 – ММС5, 2 – ММС6, 3 – ММС7, 4 – ММС9, 5 – ММС11+ДДС5, 6 – ДДС6, 7 – ДДС7, 8 – ДДС8. (Б) Смеси стандартов. Пики соответствуют – ММС7, 2 – ММС9, 3 – ДДС6, 4 – ДДС7, 5 – ДДС8.

Для строго доказательства структуры изомеров 22:2 НМР ЖК провели окислительный озонолиз в среде BF3–метанол. В результате окислительного расщепления двойных связей и этерификации фрагментов получается два типа продуктов: диметиловые эфиры дикарбоновых кислот (ДДС) и метиловые эфиры монокарбоновых кислот (ММС) (Sebedio, Ackman, 1978). Сравнение ГЖХ анализа продуктов озонолиза 22:2 НМР со стандартами (рис. 9) позволило определить, что пики 3 и 4 соответствуют ММС7 и ММС9, а пики 6, 7, 8 – ДДС6, ДДС7 и ДДС8, соответственно. Причем площадь пика ДДС7 соответствует сумме площадей пиков ДДС6 и ДДС8, указывая, что оба изомера 22:2 кислоты имеют первую связь в 7 положении. Наличие кислот ММС9 и ДДС6 показывает, что один изомер имеет структуру 22:27,13, а кислоты ММС7 и ДДС8 указывают на строение второго изомера – 22:27,15. На основании определения площадей пиков установили соотношение изомеров 22:27,15 – 61.± 1.9% и 22:27,13 – 39.0 ± 1.9%.

Исследован состав ЖК семи видов двустворчатых и брюхоногих моллюсков. Наиболее интересной особенностью было присутствие 22:2 НМР ЖК, количество которых варьировало от вида к виду (от 0.7 до 20.7%). Особый интерес вызывал высокий уровень 22:2 в липидах двустворки S. broughtoni сем Arcidae, который достигал 20.7%, Анализируя результаты, было замечено, что самые древние семейства Bivalvia превосходят другие по содержанию НМР ЖК, тогда как в эволюционно продвинутых видах эти компоненты находятся в следовых количествах или отсутствуют. Кроме того, в наших видах найдены большие количества ПНЖК n-3 кислот: 37.5% 20:5n-3 и 22:6n-3 в сумме. Количество 20:5n-3 варьировало от 10.2 до 27.1%, тогда как уровень 22:6n-3 оставался почти постоянным в разных видах двустворок. Профиль ЖК Acmea pallida и Callisela dorsuosa типичен для гастропод, он отражает особенности их водорослевой диеты. Высокие концентрации 16:0,18:1, 20:4n-6 и 20:5n-3 при практически полном отсутствии 22:6n-3 типичны для растительноядных моллюсков.

4.6.2. Биосинтез 22:2 неметиленразделенных жирных кислот Не смотря на возрастающий интерес к НМР ЖК, вопрос об их происхождении оставался открытым. Чтобы определить способность морских беспозвоночных синтезировать С20 и С22 НМР ЖК и выяснить пути их биосинтеза, были проведены прямые эксперименты по включению С-ацетата в ЖК морских двустворчатых моллюсков. В качестве моделей, богатых этими кислотами, взяты Scapharca broughtoni, Callista brevisiphonata и Mytilus edulis.

Главное включение 14С-ацетата было в ФЛ и в меньшей степени в ТАГ. Результаты распределения радиоактивности в ЖК S. broughtoni показали, что 22:2 метилась значительно во все периоды исследования, достигая 20.1% от суммарной активности в жабрах и 18.4% в мантии. Чтобы оценить возможность биосинтеза НМР ЖК de novo была определена удельная радиоактивность возможных предшественников 22:2, найденных в S. broughtoni (табл. 4.).

Практически все из них имели высокий уровень радиоактивности.

Чтобы получить прямое доказательство биосинтеза НМР ЖК de novo, был выполнен озонолиз меченой 22:27, 13 и 22:27,15, чтобы оценить распределения метки по цепи ЖК.

Все фрагменты, как с карбоксильного конца, так и с метильного и внутренние фрагменты имели 14С активность, что указывало на биосинтез 22:2 НМР ЖК из 14С-ацетата de novo. Таким образом, было доказано, что моллюск Scapharca broughtoni имеет активные системы десатурации и элонгации, позволяющие ситезировать 22:2 НМР ЖК de novo.

Таблица 4. Биосинтез жирных кислот из 14С-ацетата в Scapharca broughtoni Жирные Удельная радиоактивность Ткани кислоты 3 час 6 час 12 час 24 час Жабры насыщенные 2.04 1.96 1.77 1.16:1 1.65 1.94 4.53 6.18:1 2.53 2.60 3.37 4.20:1 0.51 0.53 0.25 0.22:2НМР 0.29 0.30 0.33 0.Мантия насыщенные 1.76 1.71 1.5 1.16:1 3.25 3.81 3.69 4.18:1 1.07 1.14 1.20 1.20:1 0.42 0.35 0.47 0.22:2НМР 0.38 0.38 0.48 0.Следующим шагом на пути исследования биосинтеза НМР ЖК было определение способности моллюсков продуцировать 20:25,11 и 20:25,13, интенсивности биосинтеза и установению их биогенетической связи с 22:2 НМР ЖК. С этой целью изучено включение 14Сацетата в ЖК Mytilus edulis. 20:2 интенсивно метились во все периоды инкубации, достигая 18.1% при 12 час экспозиции. Радиоактивности в ПНЖК найдено не было, что указывает на эссенциальность этих кислот для моллюсков. Следовательно, НМР являются единственными ПНЖК, которые моллюски могут продуцировать. Уменьшение удельной радиоактивности в ряду: насыщенные, 16:1, 18:1, 20:1 и 20:2 НМР означает, что 20:2 НМР образуется de novo из насыщенных и моноеновых кислот, синтезированных из ацетата, а не являются результатом элонгации запасенных ЖК. Закономерная и последовательная связь удельной активности подтверждает предположение об элонгации 20:2 НМР, синтезированной из ацетата de novo до 22:2 НМР ЖК и показывает высокую скорость этого процесса. В заключении, результаты по включению 14С-ацетата в ЖК двустворчатых моллюсков, оценка их удельной активности и распределение 14С метки по цепи 22:27,13 и 22:27,15 позволили определить пути биосинтеза С20 и С22 НМР ЖК в моллюсках:

16:1n-718:1n-720:1n-720:25,1322:27,5десат 9десат 16:5десат 9десат 18:018:1n-920:1n-920:25,1122:27,Таким образом, доказано, что моллюски имеют активные системы десатурации и элонгации, позволяющие синтезировать С20 и С22 диеновые НМР кислоты de novo.

4.6.3. Липиды и жирные кислоты голожаберных моллюсков Тип Mollusca является одним из хорошо изученных в плане липидов, однако до сих пор остаются не исследованными отдельные группы, в том числе Nudibranchia, которые привлекают огромное внимание как источник разнообразных биологически активных веществ.

Для того чтобы восполнить пробел в знаниях по липидной биохимии моллюсков, исследован состав липидов и ЖК голожаберных моллюсков, собранных в тропических водах северозападной Пацифики. Найдено, что пропорции классов липидов различались между видами за счет различного вклада нейтральных липидов. Это объясняется различиями в диете и биохимии видов, поскольку запасные липиды имеют диетарное происхождение. Определено отсутствие видоспецифичности в распределении классов ФЛ, что является доказательством сходства природы биологических мембран морских организмов.

НЖК Chromodoris sp.

Phyllidia coelestis 26,МЖК 27,27,16,ПНЖК n-ПНЖК n-26,15,15,СД ЖК 34,4 2,2,12,0 6,12,7,1 НМР ЖК Рис. 10. Распределение жирных кислот в голожаберных моллюсках.

Обнаружено огромное разнообразие ЖК в видах Nudibranchia (рис. 10). Уникальной особенностью ЖК Chromodoris sp. и Phyllidia coelestis, отличающей их от других гастропод и других классов моллюсков, является присутствие значительных количеств СДЖК, специфичных для губок. Разнообразные СДЖК с прямой цепью и разветвленные (iso-), насыщенные и диеновые с 5,9 группировкой были идентифицированы в обоих видах (12.0 и 9.4% от суммы кислот), основываясь на масс-спектрометрии МЭЖК и их пирролидиновых производных. К другой уникальной особенности этой группы моллюсков относится доминирование разнообразных нечетных iso- и anteiso- разветвленных «бактериальных» ЖК (15.7 и 34.4% от суммы кислот). Главными среди них были 15:0 и 17:0. Тогда как обычные ЖК, характерные для морских организмов практически отсутствовали. ПНЖК n-3 были минорными компонентами (1.6 и 2.1% в сумме). Количество ПНЖК n-6 в исследованных видах (26.0 и 25.3% от суммы кислот) было на порядок выше, чем доля ПНЖК n-3. Содержание компонентов уменьшалось в порядке 22:4n-6, 20:4n-6 и 18:2n-6. Таким образом, профили ЖК голожаберников во многих отношениях отличались от того, что известно для других гастропод и моллюсков в целом.

Определена структура 12 новых для моллюсков ЖК. Среди моноенов идентифицирована новая кислота 21:17(около 6% от суммы кислот), масс-спектрометрией определена ее структура. МЭЖК показала молекулярный ион m/z 338 и главный ион m/z 306, указывая на присутствие 21:1. Молекулярный ион пирролидидов соответствовал m/z 377. Двойная связь при С7 идентифицирована по присутствию нерегулярного интервала m/z 12 между С6 m/z 168 и С7 m/z 180. Эти фрагменты послужили доказательством структуры кислоты 21:17.

Особый интерес представляла находка новой НМР кислоты, идентифицированной как 21:27,13 (рис. 11).

113 1300250200115031002211140 12502250 2233318 33150 200 250 300 3Рис. 11. Масс спектр пирролидиновых производных 21:27,13.

Данные масс-спектра:

7,13-метиловый эфир хенэйкозадиеновой кислоты. MS m/z (относительная интенсивность, %): 336 (M+, 13), 318 (0.1), 305 (3), 287 (3), 276 (0.5), 262 (1), 252 (0.6), 238 (2), 224 (6), 210 (4), 194 (10), 178 (11), 164 (8), 150 (16), 135 (14), 123 (21), 109 (35), 95 (75), 81 (96), (91), 55 (100).

7,13-пирролидиды хенэйкозадиеновой кислоты. MS m/z (относительная интенсивность, %): 375 (M+, 9.8), 363 (0.3), 346 (1), 332 (1.7), 318 (1), 304 (2), 290 (3.2), 276 (3), 2(2.5), 250 (2.7), 236 (8), 222 (4.5), 208 (7.4), 194 (6), 180 (13.5), 168 (6.8), 154 (6.7), 140 (6), 1(53), 113 (100).

Описан путь биосинтеза 21:27,13 в моллюске из предшественников бактериального происхождения: 9-17:1 11-19:1 5десатураза 5,11-19:2 7,13-21:2.

Специфичность состава липидов доказывает хищничество на губках и возможность присутствия симбиотических бактерий в моллюсках.

5. ЖИРНЫЕ КИСЛОТЫ – ПОТЕНЦИАЛ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ СИМБИОТИЧЕСКИХ МИКРООРГАНИЗМОВ В МОРСКИХ БЕСПОЗВОНОЧНЫХ Характер пищи, в частности, ее ЖК компонентов, находит свое отражение в составе ЖК животных (Sargent 1987; Dalsgaard et al., 2003). Симбиотрофия – способ получения органического вещества беспозвоночными за счет фото- или хемосинтеза внутриклеточными микроорганизмами. Поскольку различные группы микроорганизмов имеют характерные особенности ЖК, мы предположили и доказали, что по профилю ЖК беспозвоночных можно определить присутствие в его тканях симбиотических организмов.

5.1. Симбиоз моллюсков с хемоавтотрофными бактериями В результате скринингового исследования ЖК ряда беспозвоночных из бухты Кратерной, испытывающей влияние подводного вулканизма, был обнаружен двустворчатый моллюск Axinopsida orbiculata, который по составу ЖК принципиально отличался от других животных сообщества, а также от других моллюсков. Он характеризовался высокой концентрацией типичной бактериальной кислоты 18:1n-7 и некоторым увеличением разветвленных кислот, а также существенным уменьшением количества n-3 ПНЖК 20:5n-3 и 22:6n-3, обычно главных в моллюсках-фильтраторах. Такие особенности A. orbiculata, по нашему мнению, указывают на отличительный способ питания моллюска за счет хемоавтотрофных симбиотических бактерий. На основании микроскопического анализа структур клеток предполагается наличие у A. orbiculata симбиоза с нитрифицирующими бактериями.

Чтобы показана эффективность ЖК в качестве биохимических маркеров для обнаружения симбиотической ассоциации беспозвоночных с хемоавтотрофными бактериями, проведен сравнительный анализ состава ЖК ряда видов морских двустворчатых моллюсков из залива Восток Японского моря. Среди них представители семейства Lucinidae, Pillucina pisidium, содержащая сульфат-окисляющие эндосимбиотические бактерии, Axinopsida orbiculata subquadrata из семейства Thyasiridae, многие виды которого содержат хемоавтотрофные бактерии в клетках жабр, а также моллюски-фильтраторы Raeta pulchella из семейства Mactridae и Theora lubrica из семейства Semelidae. Между видами найдены существенные различия (рис. 12) 35 Pillucina Axinopsida Reata 15 Theora Рис. 12. Распределение некоторых жирных кислот в моллюсках (% от суммы кислот).

Это указывает на то, что присутствие в клетках жабр моллюсков хемоавтотрофных бактерий приводит к изменению состава ЖК хозяина-моллюска. Состав ЖК такой симбио% от суммы кислот е ы n n н :

:

н е л + в т е n в з :

а Р тической ассоциации отличается высокой концентрацией типичных бактериальных кислот 18:1n-7 и некоторым увеличением разветвленных кислот, а также существенным уменьшением количества n-3 ПНЖК 20:5n-3 и 22:6n-3. Необходимо подчеркнуть, что именно комплекс названных особенностей может служить надежным биохимическим доказательством существования симбиоза животного с хемоавтотрофными бактериями, поскольку в некоторых случаях отдельные ЖК, предложенные как маркеры, могут варьировать значительно.

5.2. Губки – вклад симбиотических организмов в пул жирных кислот губок Многие губки содержат различные симбиотические микроорганизмы, которые включают как автотрофов, таких как цианобактерии и микроводоросли, так и гетеротрофов, таких как дрожжи и бактерии. Эти микроорганизмы существенно различаются по составу ЖК, что дало основание предполагать, что анализ ЖК губки позволит определить вклад симбионтов в общий пул ЖК животного.

5.2.1. Жирные кислоты как биомаркеры симбионтов в губках из озера Байкал Анализ ЖК шести видов пресноводных губок из о. Байкал и двух морф (зеленой и серой) Baicalospongia intermedia показал, что разветвленные ЖК, типичные для бактерий, составляли от 1.9 до 6.2%. в существенных концентрациях обнаружены С16 и С18 ПНЖК:

16:3n-3, 16:4n-3, 18:2n-6, 18:3n-3, 18:4n-3 (10.7-24.3% от всех кислот), которые служат маркерами зеленых водорослей. НМР 26:3, представленная изомерами 26:35cis,9cis,19cis и 26:35cis,9cis,19trans (Vysotsky et al., 1990), варьировала от вида к виду от 4.6 до 28.5%.

Для определения участия симбионтов в биосинтезе липидов и ЖК губок была проведена серия опытов по включению 14С-ацетата и 14С-бикарбоната в липиды губки Lubomirskia baicalensis. Распределение радиоактивности из этих двух предшественников по классам липидов губки существенно различалось. Метка из 14С-ацетата почти полностью включалась в основном в ФЛ, и только незначительно в ТАГ, тогда как метка из 14С-бикарбоната распределялась почти по всем классам липидов, доминируя в ФЛ и ТАГ. Примечательно, что 14С из С-бикарбоната включался в гликолипиды, что подтверждает участие фотоавтотрофных микроорганизмов в биосинтетических процессах. Увеличение удельной радиоактивности ФЛ с увеличением времени экспозиции свидетельствует об интенсивном биосинтезе липидов. Из меченого ацетата образовывались, главным образом, насыщенные и моноеновые ЖК. Интенсивный синтез из 14С-бикарбоната кислот 16:2n-6, 18:2n-6, 16:3n-3 и 18:3n-3, типичных для зеленых водорослей, и включение меченых ЖК в ГЛ – моногалактозилдиацилглицерин МГДГ и дигалактозилдиацилглицерин ДГДГ (18.5 и 12.3 % от суммарной радиоактивности липидов), которые являются главными структурными компонентами мембран хлоропластов, предполагает активное участие симбиотических зеленых микроводорослей в биосинтезе липидов губки. Таким образом, показано, что микроводоросли в большей степени и бактерии в меньшей степени вносят свой вклад в формирование общего пула ЖК пресноводных губок.

5.2.1. Жирные кислоты как биомаркеры цианобактерий в глубоководной стеклянной губке Pheronema raphanus Глубоководные стеклянные губки (Hexactinellida) в настоящее время являются предметом интенсивного научного изучения, что связано с особенностями организации их кремнийорганических спикул. Проведенное комплексное изучение тропической глубоководной губки Pheronema raphanus (Дроздов и др., 2008) включало исследование морфологии спикул, спектров флуоресценции и поглощения; автором изучен состав ЖК этого вида.

Обнаружено, что состав ЖК губки P. raphanus типичен для представителей класса Hexactinellida, характерной особенностью которого является высокое содержание ЖК от Сдо С30 атомов углерода в цепи (Thiel et al., 2002). Главная ЖК этого вида идентифицирована как 30:35,9,23 (более 55% от суммы кислот). Чтобы оценить возможный вклад цианобактерий в общий состав ЖК губки, особое внимание было уделено компонентам от С14 до С18, которые характерны для этих микроорганизмов. Особый интерес представляет наличие СПНЖК в липидах исследованной губки, поскольку именно по их присутствию классифицируют цианобактерий (Cohen et al., 1995; Romano et al., 2000).

Рис. 13 Распределение жирных кислот, характерных для цианобактерий, в губке Pheronema raphanus.

В липидах исследованной губки кислоты 18:3n-3 и 18:4n-3 обнаружены в следовых количествах, тогда как 18:2n-6 найдена в заметных концентрациях, составляя 4.5% от суммы С14-С18 ЖК (рис. 13). Таким образом, полученные результаты анализа ЖК не противоречат предположению об ассоциации этого вида стеклянной губки с цианобактериями.

На основании изучения морфологии спикул, спектров поглощения и флюоресценции, а также состава ЖК, можно утверждать, что симбионтами у стеклянной губки P. raphanus являются фотосинтезирующие цианобактерии.

5.3. Вклад симбиотических динофлагеллят в состав жирных кислот кораллов Мягкие кораллы Octocorallia: Alcyonaceae – самый богатый видами порядок восьмилучевых кораллов представляет важную группу сессильных морских беспозвоночных в тропических и умеренных водах. В некоторых районах их обилие и плотность поселения может даже превышать обилие твердых рифообразующих кораллов.

Сравнение состава ЖК видов альционарий, не имеющих зооксантелл, с видами, содержащими эти фототрофные симбионты показало, что отличительной особенностью восьмилучевых кораллов является присутствие 24:5n-6 (7.2-12.9% суммы кислот) и 24:6n-3 (0.5-4.7%).

Содержание маркерных ЖК динофлагеллят 18:4n-3 и 22:6n-3 колебалось значительно от вида к виду. В двух видах Dendronephthya, не имеющих зооксантелл, концентрация 18:4n-3 не превышала следовых количеств (0.1-0.3%), тогда как в видах, содержащих зооксантеллы – Sarcophyton acutum и Lobophytum pusillum, уровень 18:4n-3 достигал 8.9 и 4.1%, соответственно. Доля 22:6n-3 у симбионт-содержащих видов составляла 5.1 и 2.5%,что в несколько раз выше, чем у кораллов без симбионтов (1.3 и 0.9%). Сочетание высоких пропорций 18:4n3 и 22:6n-3, специфичных для динофлагеллят, может служить показателем присутствия зооксантелл в клетках альционарий.

Таким образом, эти исследования доказывают эффективность ЖК в качестве биохимических маркеров для обнаружения симбиотических ассоциаций беспозвоночных с микроорганизмами.

6. ОЦЕНКА СТРУКТУРЫ МИКРОБНОГО СООБЩЕСТВА ДОННЫХ ОСАДКОВ НА ОСНОВАНИИ АНАЛИЗА ЖИРНЫХ КИСЛОТ ФОСФОЛИПИДОВ Специфические особенности ЖК микроорганизмов имеют огромный потенциал и находят применение для решения различных проблем, в том числе и для анализа структур микробных сообществ.

Для исследования микробного сообщества донных осадков загрязненных нефтепродуктами районов в сравнении с чистыми районами был использован современный и доступный метод анализа жирных кислот фосфолипидов (ФЛЖК), как индикаторов микробных групп.

3-0. 8-0.0. 0. 0- 3-0. 3-0.0.0 10 20 30 40 50 60 70 Общая микробная биомасса, мкг/г сухой массы осадка Рис. 14. Общая микробная биомасса в донных осадках с указанием районов исследования и глубины осадка.

Станции, горизонт ( см ) Определена общая микробная биомасса, пространственные вариации микробных сообществ и воздействие промышленного загрязнения на микробные сообщества донных осадков.

Донные осадки различались как по содержанию общей микробной массы, так и по структуре микробных сообществ. Микробная масса, оцениваемая по абсолютному содержанию ФЛЖК, колебалась от 9 до 78 мкг/г сухой массы осадка и зависела от разных факторов (рис. 14). Величина микробной биомассы уменьшалась с глубиной грунта (горизонтом) и была значительно выше на илистых грунтах, чем на песчаных. Районы промышленного загрязнения отличались от чистых районов более высокими значениями микробной биомассы.

Анализ ФЛЖК осадков позволил определить присутствие микроэукариот, аэробных, анаэробных и сульфатредуцирующих бактерий. Выявлены особенности изменения структуры микробных сообществ в зависимости от степени загрязнения районов, глубины осадка и гранулометрического состава грунта (рис. 15).

Наилок (0.3 см) Грунт на глубине 3-10 см 1 25 20 15 15 3 10 5 I II III IV I II III IV Микробные группы Микробные группы 7 I микроэукариоты (микроводоросли и микрозообентос) II аэробные прокариоты и эукариоты III анаэробные бактерии IV сульфат-редуцирующие и другие анаэробные бактерии Рис. 15. Абсолютное содержание функциональных групп микроорганизмов (мкг ФЛЖК на г сухой массы осадка) в донных осадках исследованных районов (станции 1-8).

В структуре сообществ донных осадков во всех районах доминировали прокариоты, среди них существенную долю составляли аэробные бактерии. Следующей по вкладу в ЖК донных осадков являлась группа анаэробных бактерий, доля которых была больше в загрязненных районах, и их концентрация повышалась с глубиной осадка. Наибольшие пропорции биомаркеров сульфатредуцирующих бактерий – показателя органического загрязнения, определены в кутовой части загрязненных бухт. ЖК эукариот, находились в большей концентрации в поверхностных слоях осадков, чем в более глубоких слоях грунта. Среди них доминировали кислоты – маркеры диатомовых водорослей. Довольно высокое содержание бактерий в донных осадках загрязненных районов, существенный вклад анаэробных и сульфатреБиомаркеры дуцирующих бактерий, небольшая доля микроэукариот являются показателем существования развитого микробного сообщества, испытывающего влияние органического загрязнения.

Однако отсутствие принципиальных отличий в структуре микробных сообществ между чистыми и загрязненными районами свидетельствует о том, что микробное сообщество не испытывает угнетающего воздействия.

7. ЖИРНЫЕ КИСЛОТЫ – МАРКЕРЫ В ТРОФИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ Сложность трофических связей в морских экосистемах привела к поиску новых эффективных методов исследования. Для детального изучения пищевых взаимоотношений между организмами может служить метод биохимических маркеров, в качестве которых используются ЖК (Sargent et al., 1987; Dalsgaard et al., 2003). Этот подход основан на специфичности состава ЖК микроорганизмов и водорослей, которые служат пищей для животных, и на ограниченной способности животных синтезировать ЖК, значительную часть которых они получают из потребляемой пищи.

7.1. Экспериментальное доказательство полезности жирных кислот как биомаркеров в изучении трофологии морских организмов Для получения доказательств влияния диеты на состав ЖК животных, нами выполнен ряд экспериментов по кормлению науплей Artemia salina различными видами микроводорослей и дрожжами, которые принципиально отличались по составу липидов и ЖК. Установлено, что Artemia способна включать и избирательно концентрировать некоторые липиды диеты.

Запасные липиды были более чувствительны к изменению состава липидов диеты, чем главные структурные липиды – ПЛ и стерины. Состав ЖК животного варьировал с диетой. КонA 20:5n-3 18:B 20 16:18:20:5n-18:18:16:2 16:18:0 0 5 10 15 0 5 10 15 Сутки Сутки Рис. 16. Изменение состава жирных кислот общих липидов (% от суммы) Artemia salina в течение кормления микроводорослями и дрожжами.

A - Phaeodactylum tricornutum, B - Isochrysis galbana.

центрация насыщенных ЖК, по-видимому, поддерживалась в науплиях биосинтезом этих компонентов de novo. Тогда как кислота 16:1n-7 происходила из диеты и зависела от ее уровня в микроводорослях (рис. 16). Концентрация ПНЖК n-3 варьировала в зависимости от ее уровня в диете. Эти находки поддерживают мнение о ЖК как пищевых маркерах.

м % от сум ы 7.2. Жирные кислоты двух видов баланусов как индикаторы источников пищи Особый интерес в изучении спектров питания представляют массовые виды бентосных беспозвоночных. Среди них усоногие раки, которые в изобилии встречаются в зонах литорали и сублиторали. Анализ ЖК баланусов Hesperibalanus hesperius и Balanus rostratus из эпибиоза морского двустворчатого моллюска Patinopecten (Mizuchopecten) yessoensis, собранных на различных участках Японского моря, был выполнен, чтобы оценить спектр и разнообразие их пищевых источников, а также трофические связи с хозяином-гребешком, используя ЖК маркеры (табл. 5). Наблюдаемые различия в составе ЖК разных размерных (возрастных) групп можно объяснить как результат увеличения разнообразия источников пищи, потребляемой баланусами. Распределение ЖК в молоди обоих видов (2-6 мм) характеризовалось доминированием насыщенных и моноеновых ЖК и небольшим количеством ПНЖК, что является отражением потребления детрита. Кроме того, высокая концентрация 18:1n-9 (до 18.4%) и ее многократное превышение над долей 18:1n-7 (в 4.6 и 3.5 раз для обоих видов) в молоди обоих видов указывает на то, что они являются мусорщиками (некрофагами). С увеличением размера мелкого вида H. hesperis пропорция ЖК, характерных для диатомовых заметно возрастает. Высокий уровень 20:5n-3, доминирование 16:1n-7 над 16:и, кроме того, присутствие 16:2n-4, 16:3n-4 и 16:4n-1 являются специфическими маркерами диатомей (гл. 4.2). Таким образом, анализ ЖК маркеров подтверждает мнение, основанное на анализе соТаблица 5. Состав жирных кислот (% от суммы) различных размерных групп балянусов Hesperibalanus hesperius и Balanus rostratus из эпибиоза с моллюском Patinopecten (Mizuchopecten) yessoensis из разных мест обитания. Средние значения, n=3.

Hesperibalanus hesperius Balanus rostratus P. yessoensis Жирные б. Алексеева п.Старка пролив Старка б.Алексеева п.Старка кислоты 2-3 mm 4-6 mm 11 mm 4-6 mm 6 mm 50 mm 14:0 3.9 4.8 4.9 5.5 5.5 8.6 3.0 3.16:0 21.3 19.7 15.2 22.7 22.3 12.1 13.8 12.16:1n-7 2.8 5.8 9.3 5.8 3.5 17.9 12.5 15.18:0 16.6 7.6 6.3 9.7 8.0 1.4 4.2 2.18:1n-9 14.8 12.0 10.6 15.2 18.4 4.2 3.3 2.20:5n-3 8.3 16.0 20.2 8.4 7.4 27.2 19.8 29.22:6n-3 4.3 6.5 7.6 3.7 3.3 4.1 12.6 8.Нечетные* 2.1 2.6 1.2 2.5 2.3 0.5 1.1 0.iso, anteiso** 1.8 1.5 1.6 1.7 2.3 1.6 1.3 0.16:1n-7/16:0 0.1 0.3 0.6 0.3 0.2 1.5 0.9 1.18:1n-9/n-7 3.5 2.1 1.6 3.6 4.6 0.7 0.5 0.С 16 ПНЖК 1.5 1.9 3.1 1.9 2.4 5.6 1.2 2.* ЖК с нечентым числом атомов углерода в цепи (С15 и С17).

** Разветвленные: iso и anteiso ЖК.

держимого желудка циприд, что баланусы относятся к всеядным животным. Взрослые особи B. rostratus содержали большие количества ЖК, типичных для диатомовых, что обеспечивает веское доказательство питания их диатомовыми. Сходство профилей ЖК особей сходных размеров видов H. hesperius и B. crenatus из одного и того же местообитания является результатом сходства потребленной пищи. Различия в составе ЖК H. hesperius, собранных из разных мест, происходят из различий в источниках пищи этих животных. Следовательно, пищевой спектр баланусов зависит также от доступности пищи. Что касается состава ЖК хозяина – двустворчатого моллюска P. yessoensis, на котором живут баланусы, он является отражением планктона. Профиль его ЖК включает как маркеры диатомовых (высокий уровень 16:1n-7 и 20:5n-3), так и маркеры динофлагеллят (18:4n-3 и 22:6n-3). Различия в составе ЖК баланусов и их хозяина гребешка указывает на отсутствие пищевой конкуренции между этими видами.

7.3. Питание приморского гребешка Patinopecten yessoensis на различных типах донных осадков: доказательство на основании анализа жирных кислот Состав донных осадков – один из главных факторов, который определяет трофический потенциал для бентосных организмов. Подвижный бентосный приморский гребешок Patinopecten (=Mizuhopecten) yessoensis широко распространен в прибрежной зоне северозападной Пацифики и часто доминирует в бентосных сообществах. Для определения источников пищи гребешка анализировали ЖК пищеварительной железы и мягких тканей моллюска и его потенциальных источников пищи: планктона, сестона из придонного слоя воды и донных осадков (рис. 17). Главную долю ЖК моллюска составляли 14:0, 16:0, 16:1n-7 и 20:5n-3, которые являются маркерами диатомей, а также 18:2n-6, 18:3n-3, 18:4n-3, 20:4n-6 и 22:6n-3, происходящие из флагеллят и простейших, а также зоопланктона.

Таким образом, распределение маркерных ЖК в липидах гребешка отражало потребление в пищу диатомей, флагеллят и личинок беспозвоночных. ЖК, ассоциированные с бентосными бактериями и детритом, были идентифицированы во всех образцах, но в основном в следовых количествах, что указывало на их незначительное потребление моллюском независимо от места обитания. Гораздо выше доля этих компонентов в органическом веществе придонного слоя - наилка. (рис. 17). Таким образом, данные биохимического анализа, позволяющего определить, что именно было усвоено животным, не подтверждают мнение о важности детрита в питании гребешка, как считалось ранее на основании данных по содержимому пищевого комка, в котором детрит составляет 30-70% (Микулич, Цихон-Луканина, 1981). По нашим данным, с увеличением обилия бентосных диатомей в наилке заиленного участка, их пропорция заметно увеличивалась в пище гребешка. У особей с песчаного ВОВ придонного слоя Patinopecten yessoensis OBFA 18:2(n-6) 18:4(n-3) 20:4(n-6) 20:5(n-3) 22:6(n-3) OBFA 18:2(n-6) 18:4(n-3) 20:4(n-6) 20:5(n-3) 22:6(n-3) Sandy site 1 Muddy site Рис. 17. Содержание маркерных жирных Планктон кислот (в % от суммы всех кислот) в пищеварительной железе Patinopecten yessoensis и потенциальных источниках пищи на участках с различным типом донных осадков (песчаный участок 1 и илистый участок 2).

OBFA: сумма нечетных и разветвленных жирных кислот (iso- и anteiso-). Данные OBFA 18:2(n-6) 18:4(n-3) 20:4(n-6) 20:5(n-3) 22:6(n-3) представлены как средние ±SD.

участка, были выше показатели ЖК, происходящие из флагеллят и личинок беспозвоночных.

Вклад бактерий в питание моллюска был несколько повышен у особей, обитающих на заиленном участке. Таким образом, различия в составе ЖК гребешков, собранных на участках с различным типом донных осадков, отражали пространственную вариабельность пищевых компонентов, прежде всего, состав и обилие пищи в придонном слое.

7.4. Трофические взаимоотношения в симбиотическом сообществе морского двустворчатого моллюска Patinopecten yessoensis и полихеты Polydora brevipalpa: доказательство на основании анализа жирных кислот В шельфовой зоне моря двустворчатые моллюски-сестонофаги часто доминируют в бентосе. Обычно их раковины служат субстратом для бентосных организмов. Поверхность раковин заселяется животными и растительными организмами, а в раковины всверливаются эндолитические организмы. Немногочисленны данные о взаимоотношениях видов в таких сообществах, главными среди которых считаются, трофическими взаимодействия.

Для определения характера трофических взаимоотношений в сообществе приморского гребешка-хозяина P. yessoensis и его симбионта - полихеты Polydora brevipalpa и установления главных источников пищи этих животных, исследован состав их ЖК (рис.18). Анализ состава ЖК гребешка и полихеты показал доминирование 20:5n-3, соотношение 16:1n-7 к 16:0 близкое к 1 при высокой концентрации этих ЖК, а также присутствие 14:0 и С16 ПНЖК в существенных концентрациях. Такое распределение характерно для диатомей (гл. 4.2).

% от суммы ЖК % от суммы Ж К % от суммы ЖК Рис. 18. Содержание маркерных жирных кислот в пищеварительной железе P. yessoensis P. brevipalpa гребешка Patinopecten yessoensis и ТАГ полихеты Polydora brevipalpa Сходное соотношение маркеров этой группы микроводорослей найдено у полихеты (рис. 19). Таким образом, диатомовые были главной составляющей пищи этих животных. В тоже время обнаружены некоторые различия составов ЖК этих видов. Липиды моллюска отличало высокое содержание 22:6n-3 и 18:1n-9, что типично для плотоядных консументов, и является показателем потребления гребешком мелких беспозвоночных из планктона. Заметную долю в составе ЖК гребешка составляли кислоты 18:2n-6, 18:3n-3, 18:4n-3 и 20:4n-6, происходящие из флагеллят и простейших (гл. 4.3), что свидетельствует о вкладе этих микроорганизмов в пищу моллюска. ЖК с нечетным числом атомов углерода в цепи, а также разветвленные кислоты типичны для бактерий и служат для оценки содержания этих орга1,Рис. 19. Факторный анализ содержания B2B3B0,8 POMPOM маркерных жирных кислот в животных и POM 0,потенциальных источниках пищи. B1, B2 и Plankton 0,Plancton B3 – образцы донных осадков. POM1, Plankton 0,POM2 и POM3 – образцы ВОВ придонного 0,слоя воды. Plankton 1, Plankton 2 и Plankton -0,3 – образцы планктона. S1, S2, S3, S4 и SS4SPSPSPPSPP-0,4 – образцы гребешка. P1, P2, P3, P4, P5 и P-0,6 – образца полихеты.

-1 -0,9 -0,8 -0,7 -0,6 -0,5 -0,Factor низмов в пищевом рационе животных. Заметная доля этих бактериальных ЖК, а также превалирование 18:0 обнаружены в липидах полихеты, что является показателем вклада бактерий и детрита в пищу этого животного. Содержание этих компонентов в ТАГ полихеты значительно выше, чем в пищеварительной железе гребешка. Таким образом, установлено, что основу усвоенной пищи приморского гребешка составляют диатомовые водоросли, флагелляты и мелкие беспозвоночные. Полихета P. brevipalpa усваивает главным образом диатомовые и в меньшей степени детрит. Это свидетельствует о возможной пищевой конкуренции между этими видами в симбиотической ассоциации.

% от суммы жирных кислот Factor ) ) ) ) К :

:

Ж n n n n.

( ( ( ( р :

:

:

:

е т к а Б 7.5. Трофология голожаберных моллюсков: доказательство на основании маркерных жирных кислот Nudibranchia являются важной составляющей бентосных сообществ тропических морей. Хотя эти моллюски не образуют популяций большой плотности, они широко распространены и отличаются огромным видовым разнообразием, которое можно наблюдать на ограниченных участках. Для определения пищевого спектра этих животных и решения вопроса о пищевой конкуренции между видами Nudibranchia использовали метод биомаркеров – ЖК.

Дендрограмма сходства профилей ЖК 15 видов голожаберников, собранных у побережья Вьетнама, выявила два кластера (рис. 20). Кластер 1 объединяет виды доридин. Кластер 2 состоит из двух видами аеолидин. Между видами подпорядков Doridina и Aeolidina обнаруживается наименьший уровень сходства. Источником пищи доридин являются губки, тогда как аеолидии питаются одиночными полипами. Исследованные виды принципиально различаются по составу ЖК. Представители подотряда Doridina, который объединяет виды хромодорисов, доридид и филидий (кластер 1), содержат разнообразные СДЖК, которые происходят из их главной пищи – губок. Среди СДЖК, идентифицированных в голожаберниках, обнаружены кислоты с длиной цепи – от 24 до 26, среди них диеновые и триеновые, с прямой цепью и разветвленные (iso и anteiso), имеющие 5,9 группировку двойных связей, характерных для губок. Распределение этих компонентов заметно различается от вида к виду.

Tree Diagram for 15 Cases Unweighted pair-group average Euclidean distances C. sp.1 (33) C. sp.2 (02) C. michaelliC. geometricaC. tinctoriaGlosssodorisRisbeciaPlatydorisP. ocellataP. varicosaP. spPhyllidiellaP. coelestisFlabellinaPteraelidia5 10 15 20 25 30 Linkage Distance Рис. 20. Дендрограмма сходства жирных кислот Nudibranchia, собранных у побережья Вьетнама.

Специфичность распределение разнообразных СДЖК дает основание полагать, что эти виды моллюсков питаются различными видами губок или их разными частями. Питание из различных источников обеспечивает отсутствие пищевой конкуренции между видами на одном биотопе и является биологической основой для видового разнообразия голожаберных моллюсков на ограниченных участках.

Оба вида подотряда Aeolidina (кластер 2) – хищники, жертвами которых являются разные виды одиночных полипов. Эти трофические особенности находят свое отражение в составе ЖК моллюсков, которые характеризуются высокой пропорцией 22:6n-3, 16:0 и 18:1n9 и отсутствием СДЖК. Кроме этого, присутствие в Pteraeolidia ianthina в заметных концентрациях 18:4n-3 и 18:5n-3 – компонентов, специфичных для симбиотических динофлагеллят, подтверждает, что дополнительным источником органического вещества для этого вида служат зооксантеллы, ассоциированные с моллюском.

Таким образом, голожаберные моллюски обнаружили уникальный состав ЖК и проявили высокую видовую вариабельность. Обнаруженные особенности состава являются результатом необычной диеты моллюсков и отражают их трофические особенности.

7.6. Жирные кислоты как маркеры источников пищи в экосистеме мелководной гидротермы (б. Кратерная, о. Янкич, Курильские острова) Сложность трофических связей в морских экосистемах привела к поиску и использованию новых методов их исследования. Для определения вклада различных источников пищи в трофическую структуру мелководной гидротермальной экосистемы бухты Кратерной (Курильские острова) и для установления трофических связей в сообществах бухты были использованы ЖК в качестве биомаркеров.

Исследован состав ЖК морских организмов, собранных в б. Кратерная: массовых видов зообентоса, фитопланктона, бентосных микро- и макроводорослей, донных осадков, альгобактериальных матов и бактерий. Вклад различных источников пищи в трофическую цепь мелководной гидротермальной экосистемы был оценен, используя ЖК как биомаркеры.

Анализ ЖК главных источников пищи в б. Кратерной позволил идентифицировать маркерные ЖК: (1) соотношение 16:0/16:1n-7; (2) сумма разветвленных ЖК; (3) концентрация 16:1n-7; (4) сумма С18 и С20 ПНЖК – 18:2n-6, 18:3n-3, 18:3n-3, 18:4n-3, 20:2n-6 и 20:4n-6; (5) концентрация 20:5n-3; (6) концентрация 22:6n-3. Эти маркеры были использованы для определения главных источников пищи макробентоса в этой мелководной гидротермальной экосистеме (табл. 6). Соотношение 16:0/16:1n-7 служило маркером диатомей и бактерий. Соотношение меньше 1 было в планктонных диатомовых, микробных матах и донных осадках;

оно равно 2 в сестоне и варьировало в макроводорослях от 1.7 до 8.3. Присутствие в пище больших количеств бактерий приводило к высокой концентрации 18:1n-7 или нечетных и разветвленных ЖК. Липиды микробных матов и донных осадков были богаты бактериальными ЖК. Присутствие в пище значительных количеств бурых водорослей объясняло высокие концентрации С18 и С20 ПНЖК: 18:2n-6, 18:3n-3, 18:3n-3, 18:4n-3, 20:2n-6 и 20:4n-6. Бурые водоросли содержали до 57% этих кислот. ЭПК 20:5n-3 найдена в высоких концентрациях в планктонных диатомовых (10.4 и 24.1% от всех кислот), а также в бурых и красных водорослях (от 9 до 19.6%, соответственно). Концентрация 20:5n-3 в микробных матах и донных осадках была низкой. Концентрация 22:6n-3 была низкой во всех потенциальных источниках пищи и не превышала 3.1%.

Установлено, что большинство животных имело маркеры, характерные для диатомей, что указывает на то, что двустворчатые моллюски, полихеты, голотурии и морской еж питаются, главным образом, диатомовыми водорослями (табл. 5). Биомасса этих видов составляет 58-94% от биомассы макробентоса в сублиторальных сообществах бухты. Жирные кислоты – индикаторы бурых водорослей идентифицированы только в брюхоногих моллюсках.

Высокие концентрации бактериальных ЖК (разветвленных и нечетных) определены в полихетах, голотуриях и двустворчатом моллюске Axinopsida orbiculata, что свидетельствует о значительном вкладе бактерий в пищу этих видов. Высокий уровень 22:6n-3 свидетельствовал о плотоядности одиночного шестилучевого коралла и полихет Myxicola infundibulum и Chone sp. Основываясь на специфичности состава ЖК, выявлено существование симбиоза A.

orbiculata с хемоавтотрофными бактериями (гл. 5.1).

Таблица. 6. Маркерные жирные кислоты (% от суммы) в животных из б. Кратерная Животные 16:0/ iso, 18:1n-7 20:5n-3 C18, C20 22:6n-16:1n-7 anteiso ПНЖК Ceriantus lloydii одиночный полип 4.0 2.4 2.2 14.4 3.2 27.Amphitrite cerrata полихета 1.0 4.7 4.5 22.5 2.7 5.Chone sp. полихета 0.8 4.6 4.6 14.5 6.2 14.Myxicola infundibulum полихета 3.0 2.4 2.7 20.0 6.6 22.Pectinaria hyperborea полихета 2.0 13.4 6.3 11.9 5.3 3.Balanus crenatus усоногий рак 1.7 0.1 2.6 31.4 5.6 9.Littorina kurila гастропода 3.1 0.6 1.2 22.6 18.3 0.Nucella freycinettii гастропода 6.6 0.9 1.0 22.4 10.0 2.Axinopsida orbiculata двустворка 0.8 2.2 24.0 4.3 7.0 3.Hiatella arctica двустворка 2.1 3.2 2.4 20.7 5.4 7.Macoma calcarea двустворка 0.6 3.6 1.6 26.8 5.6 3.Macoma lukini двустворка 1.3 2.7 1.8 24.3 6.1 8.Mya uzenensis двустворка 3.7 2.3 2.2 22.6 6.8 13.Strongilocentrotus 1.7 2.0 4.7 14.8 8.8 0.droebachiensis морской еж Eupentacta 0.3 24.9 2.8 24.8 3.9 2.pseudoquinquesemita голотурия Psolus fabricii голотурия 0.9 20.1 1.5 34.2 5.7 1.Установлено, что главным источником пищи для макробентоса в б Кратерной, подобно прибрежным экосистемам, являются фотосинтезирующие организмы, диатомовые водоросли. Трофическая структура мелководной гидротермальной экосистемы отличается от глубоководных, основанных на хемосинтезирующих симбиотических бактериях.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ Использование современных методов изучения жирных кислот, таких как капиллярная ГЖХ и ГЖХ-масс-спектрометрия в сочетании с химическими методами, позволили получить достоверную информацию о составе жирных кислот морских организмов из различных таксонов и выявить ряд особенностей распределения и структур этих компонентов.

Показано, что жирные кислоты являются ценными таксономическими маркерами для дифференциации филогенетически сходных родов бактерий и могут быть использованы для экологического мониторинга. Установлена связь состава фосфолипидов и жирных кислот с систематическим положением бактерий. Эти хемотаксономические характеристики позволяют идентифицировать бактерии на уровне рода.

В результате исследования жирных кислот микроводорослей из 8 отделов были выявлены таксономические различия на уровне отделов. Показано, что необычные или некоторые обычные жирные кислоты или соотношение кислот служат таксономическими маркерами микроводорослей, которые могут быть полезны как биоиндикаторы в экологических и трофических исследованиях.

Показано влияние экзогенных и эндогенных факторов на липидные компоненты микроводорослей. Обнаруженные изменения отражают взаимосвязь физиологических и биохимических процессов. Однако, не смотря на заметные изменения в составе жирных кислот микроводорослей, черты, характерные для отделов микроводорослей, сохраняются.

Доказано, что простейшие обладают способность продуцировать ПНЖК и могут являться источником эссециальных ПНЖК в морских экосистемах.

Значительное внимание в работе было уделено изучению ЖК морских беспозвоночных. Решен ряд задач, связанных с липидной биохимией моллюсков. В том числе и вопросы, связанные с НМР ЖК. Структура НМР кислот установлена как 22:27,13 и 22:27,15, а также 20:25,11 и 20:25,13. Доказано, что моллюски имеют активные системы десатурации и элонгации, позволяющие синтезировать С20 и С22 диеновые НМР ЖК de novo. Особый интерес представляла находка новой НМР нечетной кислоты в липидах голожаберных моллюсков Nudibranchia, идентифицированной как хенэйкозадиеновая 21:27,13. Описан путь ее биосинтеза в моллюсках из предшественников бактериального происхождения.

На основании специфичности состава жирных кислот микроорганизмов – бактерий микроводорослей и простейших определены компоненты, которые могут быть использованы как хемотаксономические маркеры и биомаркеры в экологических и трофических исследованиях. Специфические особенности жирных кислот различных групп микроорганизмов имеют огромный потенциал и находят применение для решения разнообразных проблем.

Современный и доступный метод анализа жирных кислот фосфолипидов, как индикаторов микробных групп позволил определять микробную биомассу, а также исследовать структуру и динамику микробных сообществ донных осадков.

По профилю ЖК беспозвоночных определено присутствие различных групп симбиотических микроорганизмов в клетки животного-хозяина (моллюсков, кораллов и губок). Установлено, что высокий уровень 18:1n-7 при низкой концентрации 20:5n-3 и 22:6n-3 является надежным показателем существования хемоавтотрофных бактерий. Сочетание высоких пропорций 18:4n-3 и 22:6n-3 указывает на присутствие симбиотических динофлагеллят (зооксантелл). Вклад зеленых микроводорослей определяется по присутствию 16:3n-3 и 18:3n-3.

Доказательством присутствия цианобактерий служат разнообразные С18 ПНЖК.

На специфичности состава жирных кислот микроорганизмов, которые служат пищей для животных, и на ограниченной способности животных синтезировать эти компоненты основан метод биохимических маркеров – жирных кислот. В экспериментах нами получены доказательства влияния диеты на состав жирных животных, а затем изучены спектры питания ряда массовых видав бентосных беспозвоночных. Присутствие СДЖК, специфичных для губок, в липидах голожаберных моллюсков является результатом потребления губок. В составе жирных кислот моллюсков, баланусов и полихет доминируют компоненты 20:5n-3, 16:1n-7 и С16 полиненасыщенные жирные кислоты, характерные для диатомовых, что указывает на потребление этими животными диатомовых водорослей. Установлено, что состав жирных кислот животных является отражением потребляемой диеты и определяется, главным образом, доступностью и характером потребленной пищи.

Для определения вклада различных источников пищи в трофическую структуру мелководной гидротермальной экосистемы б. Кратерной (Курильские острова) и для установления трофических связей в сообществах бухты были использованы жирные кислоты в качестве биомаркеров. Установлено, что главным источником пищи для макробентоса в б Кратерной, подобно прибрежным экосистемам, являются фотосинтезирующие организмы – диатомовые водоросли. Трофическая структура мелководной гидротермальной экосистемы отличается от глубоководных, основанных на хемосинтезирующих симбиотических бактериях.

Таким образом, распределение жирных кислот в морских микроорганизмах – бактериях и микроводорослях, отражает их систематическое положение. Состав жирных кислот морских беспозвоночных хотя и зависит от собственных биосинтетических способностей, но в значительной степени определяется характером потребленной пищи.

ВЫВОДЫ 1. Получены данные о распределение жирных кислот в липидах около 200 видов морских организмов, включая бактерии, простейшие, водоросли, а также представителей губок, кишечнополостных, моллюсков, иглокожих, ракообразных, полихет. Выявлены закономерности распределения жирных кислот в морских организмах.

2. Установлена связь состава фосфолипидов и жирных кислот с систематическим положением бактерий. Эти хемотаксономические характеристики позволяют идентифицировать бактерии на уровне рода. Полученные данные по составу фосфолипидов и жирных кислот были использованы для идентификации 4 новых родов и 39 новых видов морских протеобактерий.

3. Выявлены таксономические различия в составе жирных кислот микроводорослей на уровне отделов. Характерной особенностью диатомовых Bacillariophyceae является высокий уровень 20:5n-3 и превалирование 16:1n-7 над 16:0. К дополнительным маркерам диатомовых относятся 16:2n-4, 16:3n-4 и 16:4n-1. Динофлагелляты Dinophyceae отличается высоким содержанием 18:4n-3, 18:5n-3 и 22:6n-3. Отличительной чертой зеленых Chlorophyceae является высокий уровень С16 и С18 полиненасыщенных кислот n-3 и n6. Несмотря на вариабельность состава липидов под влиянием ряда факторов (освещение и жизненный цикл), черты, характерные для отделов водорослей, сохраняются.

4. Впервые исследовано влияние света на липиды симбиотических динофлагеллят. Установлено, что интенсивность освещения влияет на состав жирных кислот, как полярных липидов, так и триацилглицеридов. Повышение уровня света вызывало увеличение содержания 16:0 в обеих группах липидов за счет синтеза de novo. При уменьшении освещения в полярных липидах происходило увеличение уровня 18:4n-3 и 20:5n-3, которое сопровождалось увеличением содержания хлорофилла a в клетках. Вызванные светом изменения в составе жирных кислот отражают взаимосвязь фотосинтетических процессов и биосинтеза жирных кислот.

5. Обнаружено, что в течение жизненного цикла диатомовых водорослей происходят заметные изменения состав липидных компонентов. В период образования покоящихся клеток увеличивается доля полярных липидов и полиненасыщенных кислот 20:5n-3 и 16:3n-4. Аккумуляция этих структурных компонентов в покоящихся клетках может обеспечивать быстрый рост клеток и массовое развитие вида при возникновении благоприятных условий в природной среде.

6. На основе экспериментальных данных впервые показана способность морских простейших – инфузорий и бесцветных жгутиконосцев, составляющих первые звенья детритной пищевой цепи, синтезировать разнообразные полиненасыщенные жирные кислоты, такие как арахидоновая, эйкозапентаеновая и докозагексаеновая кислоты. Доказано, что простейшие могут являться источником эссенциальных ПНЖК в морских экосистемах.

7. Установлена структура ряда жирных кислот из водорослей, губок и моллюсков. Впервые описана нечетная кислота 21:27,15 в голожаберных моллюсках Nudibranchia. Разработанный метод анализа меченных жирных кислот позволил изучить биосинтез этих компонентов. Доказана способность моллюсков синтезировать диеновые НМР жирные кислоты de novo, определены пути биосинтеза этих компонентов.

8. Предложено использование метода маркерных жирных кислот для оценки вклада различных групп симбиотических микроорганизмов в клетки хозяина (моллюсков, кораллов и губок). Установлено, что высокий уровень 18:1n-7 при низкой концентрации 20:5n-3 и 22:6n-3 является надежным показателем существования хемоавтотрофных бактерий. Сочетание высоких пропорций 18:4n-3 и 22:6n-3 указывает на присутствие симбиотических динофлагеллят (зооксантелл). Вклад зеленых микроводорослей определяется по присутствию 16:3n-3 и 18:3n-3. Доказательством присутствия цианобактерий служат разнообразные С18 полиненасыщенных жирных кислот.

9. Показана эффективность использования жирных кислот как маркеров для определения пищевых спектров ряда массовых видов бентосных беспозвоночных и трофических взаимоотношений животных в сообществах. Установлено, что состав жирных кислот животных является отражением потребляемой диеты и определяется, главным образом, доступностью и характером потребленной пищи, а также собственными биосинтетическими способностями. Присутствие сверхдлинноцепочечных жирных кислот, специфичных для губок, в липидах голожаберных моллюсков является результатом потребления ими губок. В составе жирных кислот ряда моллюсков, баланусов и полихет доминируют компоненты 20:5n-3, 16:1n-7 и С16 полиненасыщенные жирные кислоты, характерные для диатомовых, что указывает на потребление диатомовых водорослей.

10. Впервые изучена структура пищевых цепей в мелководной гидротермальной экосистеме б. Кратерная (о. Янкич, Курильские острова), используя потенциал жирных кислот как биомаркеров. Установлено, что диатомовые водоросли являются главным источником пищи макрозообентоса в б. Кратерной. Это приводит к заключению, что трофическая структура мелководной гидротермальной экосистемы отличается от глубоководных экосистем.

Список основных публикаций по теме диссертации:

1. Svetashev V.I., Zhukova N.V. Analysis of labelled fatty acid methyl esters by argentation and reversed-phase two-dimensional thin-layer chromatography // J. Chromatogr. 1985. V. 330. P.

396-399.

2. Zhukova N.V., Svetashev V.I. Non-methylene-interrupted dienoic fatty acids in mollusks from the Sea of Japan // Comp. Biochem. Physiol. 1986. V. 83B. No. 3. P. 643-646.

3. Zhukova N.V. Biosynthesis of non-methylene-interrupted dienoic fatty acids from 14C acetate in mollusks // Biochim. Biophys. Acta 1986. V. 878. P. 131-133.

4. Zhukova N.V. The pathway of the biosynthesis of nonmethylene-interrupted dienoic fatty acids in mollusks // Comp. Biochem. Physiol. 1991. V. 100B. P. 801-804.

5. Жукова Н.В., Харламенко В.И., Гебрук А.В. Жирные кислоты двустворчатого моллюска Axinopsida orbiculata – потенциал для выявления симбиоза с хемоавтотрофными бактериями // Мелководные газогидротермы и экосистема бухты Кратерной (вулкан Ушишир, Курильские острова). Кн. 1. Функциональные характеристики. Ч. 2. - Владивосток: ДВО АН СССР, 1991. C. 63-78.

6. Жукова Н.В. Неметиленразделенные жирные кислоты морских двустворчатых моллюсков: распределение по тканям и классам липидов // Ж. эволюц., биохим. и физиол. 1992.

Т. 28. С. 434-440.

7. Zhukova N.V., Kharlamenko V.I., Svetashev V.I., Rodionov I.A. Fatty acids as markers of bacterial symbionts of marine bivalve mollusks // J. Exp. Mar. Biol. and Ecol. 1992. V. 16. P.

253-263.

8. Latyshev N.A., Zhukova N.V., Efremova S.M., Imbs A.B., Glysina O.I. Effect of habitat on participation of symbionts in formation of the fatty acid pool of fresh-water sponges of Lake Baikal // Comp. Biochem. Physiol. 1992. V. 102B. P. 961-965.

9. Zhukova N.V., Aizdaicher N.A. Fatty acid composition of 15 species of marine microalgae // Phytochemistry. 1995. V. 39. P. 351-356.

10. Kharlamenko V.I., Zhukova N.V., Khotimchenko S.V., Svetashev V.I., Kamenev G.M. Fatty acids as markers of food sources in a shallow water hydrothermal ecosystem (Kraternaya Bight, Yankich Island, Kurile Islands) // Mar. Ecol. Progr. Ser. 1995. V. 120. P. 231-241.

11. Жукова Н.В., Орлова Т.Ю., Айздайчер Н.А. Жирнокислотный состав как показатель физиологического состояния диатомовой водоросли Pseudonitzschia pungens в природной среде и в культуре // Биол. моря. 1998. Т. 24. С. 44-48.

12. Zhukova N.V., Imbs A.B., Liu Fa Yi. Diet-induced changes in lipid and fatty acid compositions of Artemia salina // Comp. Biochem. Physiol. 1998. V. 120B. P. 499-506.

13. Zhukova N.V., Kharlamenko V.I. Sources of essential fatty acids in the marine microbial loop // Aquat. Microbiol. Ecol. 1999. V. 16. P. 153-157.

14. Zhukova N.V., Svetashev V.I. A high level of dihomogammalinolenic acid in brown alga Sargassum pallidum (Turn.) // Phytochemistry. 1999. V. 50. P. 1209-1211.

15. Zhukova N.V. Fatty acid components of two species of barnacles, Hesperibalanus hesperius and Balanus rostratus (Cirripedia), as indicators of food sources // Crustaceana. 2000. V. 73. P.

513-518.

16. Ivanova E.P., Zhukova N.V., Svetashev V.I., Gorshkova N.M., Kurilenko V.V., Frolova G.M., Mikhailov V.V. Evaluation of phospholipid and fatty acid compositions as chemotaxonomic markers of Alteromonas-like Proteobacteria // Curr. Microbiol. 2000. V. 41. P. 341-345.

17. Zhukova N.V., Aizdaicher N.A. Lipid and fatty acid composition during vegetative and resting stages of the marine diatom Chaetoceros salsugineus // Bot. Marina. 2001. V. 44. P. 287-293.

18. Ivanova E.P., Zhukova N.V., Gorshkova N.M., Chaikina E.L. Characterization of Aemonas and Vibrio species isolated from a drinking water reservoir // J. Appl. Microbiol. 2001. V. 90. P.

919-927.

19. Zhukova N.V., Tarasov V.G. Microbial community structure in sediments of Vostok and Nakhodka Bays (Sea of Japan) // Abstracts of the International Workshop on the Global Change Studies in the Far East. October 2-3, 2002, Vladivostok, Dalnauka, P.136-139.

20. Romanenko L. A., Zhukova N.V., Rohde M., Lysenko A.M., Mikhailov V.V., Stackebrandt E.

Pseudoalteromonas agarivorans sp. nov., a novel marine agarolytic bacterium // Int. J. Syst Evol. Microbiol. 2003. V. 53. P. 125-131.

21. Zhukova N.V., Titlyanov E.A. Fatty acid variations in symbiotic dinoflagellates from Okinawan corals // Phytochemistry 2003. V. 62. P. 191-195.

22. Ivanova E.P., Sawabe T., Hayashi K., Gorshkova N.M., Zhukova N.V., Nedashkovskaya O.I., Mikhailov V.V., Nicolau D.V., Christen R. Shewanella fidelis sp. nov., isolated from sediments and sea water // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2003. V. 53. P. 577-582.

23. Romanenko L. A., Zhukova N.V., Rohde M., Lysenko A.M., Mikhailov V.V., Stackebrandt E.

Glaciecola mesophila sp. nov., a novel marine agar-digesting bacterium // Int. J. Syst Evol.

Microbiol. 2003. V. 53. P. 647-651.

24. Беленева И.А., Жукова Н.В., Масленникова Э.Ф. Сравнительное изучение структуры микробных сообществ мидии Mytilus trossulus из культивируемой и природной популяции залива Петра Великого // Микробиология 2003. Т. 72. С. 1-7.

25. Жукова Н.В. Биохимический подход к оценке разнообразия симбиотических динофлагеллят // Биол. моря 2003. Т. 29. С. 363-367.

26. Ivanova E.P., Sawabe T., Zhukova N.V., Gorshkova N.M., Nedashkovskaya O.I., Hayashi K., Frolova G.M., Sergeev A.F., Pavel K.G., Mikhailov V.V., Nicolau D.V. Occurrence and diversity of mesophilic Shewanella strains isolated from the North-West Pacific ocean // System.

Appl. Microbiol. 2003. V. 26. P. 293-301.

27. Romanenko L. A., Schumann P., Zhukova N.V., Rohde M., Mikhailov V.V., Stackebrandt E.

Oceanisphaera litoralis gen.nov., sp. nov., a novel halophilic bacterium from marine bottom sediments // Int. J. Syst Evol. Microbiol. 2003. V. 53. P. 1885-1888.

28. Romanenko L.A., Zhukova N.V., Lysenko A.M., Mikhailov V.V., Stackebrandt E. Assignment of "Alteromonas marinoglutinosa" NCIMB 1770 to Pseudoalteromonas mariniglutinosa sp.

nov., nom. rev., comb. nov. // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2003. V. 53. P. 1105-1109.

29. Romanenko L.A., Uchino M., Mikhailov V.V., Zhukova N.V., Uchimura T. Marinomonas primoryensis sp. nov., a novel psychrophile isolated from coastal sea-ice in the Sea of Japan // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2003. V. 53. P. 829-832.

30. Ivanova E.P., Nedashkovskaya O.I., Zhukova N.V., Nicolau D.V., Christen R., Mikhailov V.V.

Shewanella waksmanii sp. nov., isolated from a sipuncula (Phascolosoma japonicum) // Intern.

J. Syst. Evol. Microbiol. 2003. V. 53. P. 1471-1477.

31. Nedashkovskaya O.I., Kim S.B., Han S.K., Lysenko A.M., Rohde M., Zhukova N.V., Fasen E., Frolova G.M., Mikhailov V.V., Bae K.S. Mesonia algae gen. nov., sp. Nov., a novel marine bacterium of the family Flavobacteriaceae isolated from the green alga Acrosiphonia sonderi (Kutz) Kornm. // Int. J. Syst Evol. Microbiol. 2003. V. 53. P. 1967-1971.

32. Жукова Н. В. Изменение липидного состава Thalassiosira pseudonana в течение жизненного цикла // Физиология растений 2004. Т. 51. С. 1-6.

33. Ivanova E.P., Alexeeva Y.A., Zhukova N.V., Gorshkova N.M., Buljan V., Nicolau D.V., Mikhailov V.V., Christen R. Bacillus algicola sp. nov., a novel filamentous organism isolated from brown alga Fucus evanescens // System. Appl. Microbiol. 2004. V. 27. P. 301-307.

34. Ivanova E.P., Gorshkova N.M., Zhukova N.V., Lysenko A.M., Zelepuga E.A., Prokofeva N.G., Mikhailov V.V., Nicolau D.V., Christen R. Characterization of Pseudoalteromonas distinctalike sea-water isolates and description of Pseudoalteromonas aliena sp. nov. // Int. J. Syst.

Evol. Microbiol. 2004. V. 54. P. 1431-1437.

35. Nedashkovskaya O.I., Suzuki M., Vancanneyt M., Cleenwerck I., Zhukova N.V., Vysotskii M.V., Mikhailov V.V., Swings J. Salegentibacter holothuriorum sp. nov., isolated from the edible holothurian Apostichopus japonicas // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2004. V. 54. P. 11071110.

36. Nedashkovskaya O.I., Kim S.B., Han S.K., Rhee M.-S., Lysenko A.M., Rohde M., Zhukova N.V., Frolova G.M., Mikhailov V.V., Bae K.S. Algibacter lectus gen. nov., sp. nov., a novel member of the family Flavobacteriaceae isolated from green algae // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2004. V. 54. P. 1257-1261.

37. Ivanova E.P., Alexeeva Y.A., Flavier S., Wright J.P., Zhukova N.V., Gorshkova N.M., Mikhailov V.V., Nicolau D.V., Christen R. Formosa algae gen. nov., sp. nov., a novel member of the family Flavobacteriacea // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2004. V. 54. P. 705-711.

38. Zhukova N.V. Variation in microbial biomass and community structure in sediments of Peter the Great Bay (Sea of Japan/East Sea), as estimated from fatty acid biomarkers // Ocean Science Journal 2005. V. 40. P. 145-153.

39. Ivanova E.P., Bowman J.P., Lysenko A.M., Zhukova N.V., Gorshkova N.M., Kuznetsova T.A., Kalinovskaya N.I., Shevchenko L.S., Mikhailov V.V. Erythrobacter vulgaris sp. nov., a novel organism isolated from the marine invertebrates // Syst. Appl. Microbiol. 2005. Vol. 28. P. 123130.

40. Ivanova E.P., Zhukova N.V., Lysenko A.M., Gorshkova N.M., Sergeev A.F., Mikhailov V.V., Bowman J.P. Loktanella agnita sp. nov. and Loktanella rosea sp. nov., from the north-west Pacific Ocean // Int. J. Syst Evol. Microbiol. 2005. V. 55. P. 2203-2207.

41. Ivanova E.P., Onyschenko O.M., Christen R., Lysenko A.M., Zhukova N.V., Shevchenko L.S., KiprianovaE. A. Marinomonas pontica sp. Nov., isolated from the Black Sea // Int. J. Syst.

Evol. Microbiol. 2005. V. 55. P. 275-279.

42. Ivanova E.P., Bowman J.P., Lysenko A.M., Zhukova N.V., Gorshkova N.M., Sergeev A.F., Mikhailov V.V. Alteromonas addita sp. nov. // // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2005. V. 55. P.

1065-1068.

43. Беленева И.А., Даутова Т.И., Жукова Н.В. Характеристика сообществ гетеротрофных бактерий, ассоциированных со здоровыми и пораженными кораллами залива Нячанг (Вьетнам) // Микробиология. 2005. T. 74. С. 579-587.

44. Zhukova N.V., Titlyanov E.A. Effect of light intensity on the fatty acid composition of dinoflagellates symbiotic with hermatypic corals // Botan. Marina. 2006. V. 49. P. 339-346.

45. Беленева И.А. Жукова Н.В. Бактериальные сообщества некоторых бурых и красных водорослей залива Петра Великого, Японское море // Микробиология. 2006. T. 75. С. 1-10.

46. Nedashkovskaya O.I., Kim S.B., Zhukova N.V., Kwak J.,Mikhailov V.V., Bae K.S. Mesonia mobilis sp. nov., isolated from sea water, and emended description of the genus Mesonia // Int.

J. Syst Evol. Microbiol. 2006. V. 56. P. 2433-2436.

47. Ivanova E.P., Bowman J.P., Christen R., Zhukova N.V., Lysenko A.M., Gorshkova N.M., Mitik-Dineva N., Sergeev A.F., Mikhailov V.V. Salegentibacter flavus sp. nov. // Int. J. Syst.

Evol. Microbiol. 2006. V. 56. P. 583-586.

48. Силина А.В., Жукова Н.В. Питание и рост приморского гребешка на различных типах донных oсадков // Известия РАН. Сер. Биол. 2007. № 1. С. 68-74.

49. Жукова Н.В. Изменение состава жирных кислот симбиотических динофлагеллят из герматипного коралла Echinopora lamellosa при адаптации к различному уровню освещения // Физиология растений 2007. Т. 54. С. 856-863.

50. Zhukova N.V. Lipid classes and fatty acid composition of the tropical nudibranch mollusks Chromodoris sp. and Phyllidia coelestis // Lipids 2007. V. 42. P. 1169-1175.

51. Imbs A.B., Latyshev N.A., Zhukova N.V., Dautova T.N. Comparison of fatty acid compositions of azooxanthellate Dendronephthya and zooxanthellate soft coral species // Comp.

Biochem. Physiol. 2007. V. 148B. P. 314-321.

52. Беленева И.А., Жукова Н.В., Ле Лан Х., Нгуен Тран Д.Х. Таксономический состав микрофлоры, ассоциированной с культивируемыми моллюсками Crassostrea lugubris и Perna viridis и водой в лагуне залива Нячанг, Вьетнам // Микробиология 2007. Т. 76 С. 253-262.

53. Силина А.В., Жукова Н.В. Трофические взаимоотношения в сообществе морского двустворчатого моллюска и полихеты-сверильщика // Океанология 2008. Т. 48. С. 889-894.

54. Дроздов А.Л., Букин О.А., Вознесенский С.С., Галкина А.Н., Голик С.С., Жукова Н.В., Кульчин Ю.Н., Нагорный И.Г., Чербаджи И.И. Симбионтные цианобактерии в шестилучевых губках (Hexactinellida) Докл. Акад. Наук 2008. Т. 420. С. 565-567.

Соискатель Н.В. Жукова Наталья Владимировна ЖУКОВА ЖИРНЫЕ КИСЛОТЫ МОРСКИХ ОРГАНИЗМОВ:

ТАКСОНОМИЧЕСКИЕ И ТРОФИЧЕСКИЕ МАРКЕРЫ Автореферат






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.