WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

 

  На правах рукописи

ЗАСЛАВСКАЯ МАЙЯ ИСААКОВНА

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ  CANDIDA  ALBICANS

С НЕЙТРОФИЛАМИ  И ЭПИТЕЛИОЦИТАМИ

В ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ СИСТЕМАХ

03.00.07 микробиология

14.00.36 аллергология и иммунология

  А в т о р е ф е р а т

диссертации на соискание ученой степени

  доктора биологических наук

                       

  Москва 2009

Работа выполнена на кафедре микробиологии и иммунологии государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Нижегородская государственная медицинская академия Федерального  агенства по здравоохранению и социальному развитию РФ»

Научный консультант:

Доктор медицинских наук, Маянский Андрей Николаевич

профессор

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, Шендеров Борис Аркадьевич

профессор

Доктор медицинских наук, Бондаренко Виктор Михайлович

профессор

Доктор медицинских наук, Пинегин  Борис Владимирович

профессор

Ведущая организация:

Научно-исследовательский  институт  медицинской  микологии  им. П. Н. Кашкина Санкт-Петербургской медицинской академии последипломного образования

Защита состоится «____ »_____________ 2009  года в___ часов на заседании диссертационного совета Д 208.046.01 при Федеральном Государственном учреждении науки «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека» по адресу: 125212, Москва, ул. Адмирала Макарова, 10. 

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского

Автореферат разослан «____»______________2009  г.

Ученый секретарь

диссертационного совета, д.б.н.  Комбарова С. Ю.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ДИССЕРТАЦИИ

Актуальность проблемы

В настоящее время наблюдается рост грибковых оппортунистических инфекций, среди которых значительную часть составляет кандидоз (Рахманова А.Г. и соавт., 2000; Елинов Н. П., 2001; Сергеев А. Ю., Сергеев Ю.В., 2001, Лебедева Т.Н., 2004; Лесовой В.С., Липницкий А.В. 2008), вызываемый, преимущественно, Candida albicans (Бурова С.А., Воинова Г.В., 1997; Сергеев А. Ю., Сергеев Ю.В., 2001, Лесовой  В.С. и соавт., 2003; Cannon R.D.et al., 1995).  Развитие инфекции зависит от вирулентности кандид, состояния колонизируемой ткани и выраженности иммунных реакций (Cannon R.D.et al., 1995). В то же время, остается открытым вопрос о пусковых механизмах  кандидоза и взаимодействии различных звеньев иммунитета в ходе заболевания.

Достаточно хорошо изучен спектр факторов патогенности, которые  обеспечивают адгезию и инвазию C.albicans (Сергеев А. Ю., Сергеев Ю.В., 2001, Tronchin G. et al., 1991; Chaffin W.Z. et al., 1998; Cannon R.D., Chaffin W.L., 1999).

Недавно представлены данные о формировании возбудителем биопленки – резистентной ассоциации C.albicans, состоящей из гифальных (мицелиальных) и дрожжевых элементов,  а также  об устойчивости  клинических изолятов кандид к антагонистическому действию лактосодержащих пробиотиков (Рыбальченко О.В., Бондаренко В.М., Добрица В.П., 2008). Более патогенной принято считать мицелиальную форму гриба (Odds F.S.,1988), однако не вполне ясно, что способствует ее большей вирулентности  по сравнению с  дрожжевой формой.

       Первую линию защиты при кандидозной инвазии обеспечивают факторы слизистых оболочек и опсонофагоцитарные реакции (Махрова Т.В. и соавт., 2003; Гасанова Ф.М., Караев З.О., 2008; Challacombe S. J., 1994; Cannon R.D. et al.,  1995; Vazquez-Torres, A. et al., 1997; Kozel, T. R., 1999; Peltroche-Llacsahuanga H. et al., 2000; Romani L.,2000;). Однако, несмотря на значительное число работ,  посвященных адгезии и колонизации  кандид на слизистых оболочках, недостаточно изучены механизмы регуляции адгезивной фазы инфекционного процесса и роль отдельных  факторов слизистых оболочек. Существуют противоречивые данные о влиянии микрофлоры  (Falleiros de Pdua R.A. et al., 2008;  Elahi S. et al., 2005; Diebel L.N. et al. , 1999; Nair R.G., Samaranayake L.P., 1996; Holmes A.R., 1995;  Bagg J., Silverwood R.,1986; Kennedy M.J., Volz P.A., 1985) и действии эффекторов воспаления (Симбарская М.Л. и др., 2008) на адгезивные реакции кандид. Необходимо также упомянуть и о биологически активных продуктах нейтрофилов (миелопероксидаза, катионные белки, кислые гидролазы, щелочная фосфатаза, простагландины, лизоцим, низкомолекулярные пептиды и др.), входящих в состав мукозальных секретов (Долгушин И.И., Бухарин О.В., 2001; Witko-Sarsat V. et al.,2000; Murav'ev R.A. et al., 2003),  и потенциально способных оказывать влияние на прикрепление кандид к эпителию слизистых оболочек.

Кандиды, подобно другим микроорганизмам, способны стимулировать клетки макроорганизма, вызывая синтез цитокинов (Steele C., Fidel P.L.,2002; Schaller M. et al., 2004). Цитокины играют существенную роль при инфекциях, обеспечивая кооперацию между эффекторами клеточного и гуморального иммунитета (Ярилин А.А.,1999, Маянский А.Н., 2003). Несмотря на многочисленные публикации, характеризующие цитокиновую сеть при кандидозной инфекции, мало внимания уделяется цитокинам, которые продуцируются нейтрофилами. В то же время показано, что данные регуляторные молекулы важны для взаимодействия различных звеньев иммунитета на начальном этапе развития инфекции (Долгушин И.И., Бухарин О.В., 2001; Witko-Sarsat V., 2000).

Немаловажную роль в элиминации С. albicans играет биоцидность нейтрофилов, которая усиливается после прямых и опсонин-опосредованных взаимодействий фагоцитов с кандидами, в частности, с участием опсонинов альтернативного пути активации комплемента (АПАК) (Ройт А. и соавт., 2000). Отсюда представляется важным  изучение эффективности АПАК-зависимой опсонизации С. albicans и ее функциональных последствий в системе с нейтрофилами. 

В настоящее время акцент в изучении патогенеза кандидоза сместился на исследование механизмов регуляции иммунного ответа при инфекции. Особый интерес представляют внутриклеточные сигнальные пути, такие как система нуклеарного фактора kB и группа митоген-активированных киназ. Они играют важную роль в регуляции активности генов, отвечающих за адаптивные реакции клеток человека,  и вовлечены в продукцию иммунорегуляторных и биоцидных факторов  (Маянский А.Н. и соавт., 2007; Tian W. et al.,2000; Tak P.P., Firestein G.S.,2001; Tato C. M., Hunter C. A.,2002; Tang N. et al., 2004).

Таким образом, исследование механизмов и факторов, влияющих на взаимоотношение С.albicans с эффекторами первого уровня защиты (мукозальные эпителиоциты, нейтрофилы, система комплемента) позволит расширить представления о причинах развития кандидозной инфекции и возможных путях ее регуляции.

Широкое распространение штаммов C. albicans, обладающих резистентностью к антибиотикам  (Выборнова И.В., и др., 2008; Анкирская А.С., и др., 2006;  Арзуманян В.Г., Семенов Б.Ф., 2001; Cualco L. et al., 2007;  Baddly J.W., Moser S.A., 2004), выдвигает еще одну задачу:  поиск  фунгицидных (биоцидных) средств, позволяющих преодолеть лекарственную устойчивость кандид.

Цель настоящего исследования

Определить условия и факторы, влияющие на взаимодействие  С.albicans с эпителиоцитами слизистых оболочек, нейтрофилами и комплементом, и изучить  механизмы их действия.

Задачи исследования

  1. Сравнить нейтрофил - стимулирующую активность дрожжевой и мицелиальной  форм C.albicans.
  2. Оценить активность С.albicans в системе альтернативного пути активации  комплемента.
  3. Изучить функциональные последствия внутрисосудистой дестабилизации крови, индуцированной C. albicans, в системе нейтрофильного фагоцитоза.
  4. Охарактеризовать набор факторов и условий, влияющих на адгезию C. albicans к эпителиоцитам слизистых оболочек.
  5. Определить значимость активации внутриклеточных сигнальных путей, сопряженных с нуклеарным фактором kB и системой митогенактивированных киназ для нейтрофилов и буккальных эпителиоцитов при взаимодействии с  C. albicans.
  6. Оценить эффект некогерентного импульсного излучения на C.albicans в экспериментальных системах in vitro и  in vivo.

Научная новизна

Получены новые сведения о патогенности кандид, реализуемой в системах с нейтрофилами, комплементом и мукозальными эпителиоцитами.

Впервые показано, что мицелиальная форма C. albicans обладает большей вирулентостью, чем дрожжевая,  реализуемой в системах с нейтрофилами.  Мицелиальная форма слабее индуцирует биоцидность фагоцитов и активнее способствует продукции нейтрофилами молекул, дестабилизирующих гомеостаз.

Установлена антиопсоническая активность С.albicans в системе  альтернативного  пути  активации  комплемента  и  определены  функциональные последствия данного эффекта при опсонин-опосредованных взаимодействиях кандид  с нейтрофилами.

       Выявлен и впервые исследован феномен «острой мобилизационной  блокады»  нейтрофилов, проявляющийся в снижении миграции полиморфноядерных лейкоцитов (ПМЛ) в зону воспаления в условиях,  имитирующих состояние кандидемии (внутрисосудистая дестабилизация крови).

Установлено, что адгезия C. albicans на эпителиоцитах зависит от интенсивности метаболизма, синтеза белка и реактивности цитоскелета буккальных клеток. Показано, что эффективность адгезии C. albicans на эпителиоцитах зависит от интенсивности синтеза белка клетками кандид. Определен вклад различных компонентов мукозальных секретов и эффекторов воспалительного процесса  в реализацию адгезии  C. albicans на клетках эпителия слизистых оболочек. Показано ингибирующее влияние секреторных метаболитов Staphylococcus aureus на адгезивность C. albicans. 

        Определен вклад внутриклеточных сигнальных путей, связанных с нуклеарным фактором kB и  митогенактивированными киназами (ERK1/2 и р38), в реализацию функционального потенциала нейтрофилов и эпителиоцитов в системах с C.albicans.

        Впервые выявлен фунгицидный эффект некогерентного импульсного излучения в отношении C.albicans. Определены основные факторы и механизмы биоцидного эффекта некогерентного импульсного излучения.

Практическая значимость

       Оптимизирована экспериментальная тест-система для изучения адгезии C. albicans на эпителиальных клетках. Определены факторы, влияющие на адгезию в системе «C. albicans – буккальные эпителиоциты». Снижение адгезивной активности кандид под действием ингибирующих факторов позволит вносить коррективы в комплексное лечение кандидозов.

       Создана экспериментальная модель для изучения функционального потенциала экссудативных нейтрофилов на фоне внутрисосудистой дестабилизации крови. Определено влияние внутрисосудистой  циркуляции C. albicans на кислород-зависимую биоцидность нейтрофилов в очаге острого воспаления.

       Разработана методика изучения нейтрофилов крови с помощью атомной силовой микроскопии. 

Результаты проведенных исследований позволили обосновать применение высокоэнергетических импульсных воздействий как средство для дезинфекции и антисептики, которое обладает фунгицидным действием и не влияет на базовые показатели гомеостаза макроорганизма. Получено положительное решение о выдаче патента «Способ дезинфекции биологических субстратов и эпителиальных покровов» от 28.03.2008;  № заявки  2007118899/15 (020587). 

Результаты испытаний, проведенных совместно с инженерами РФЯЦ ВНИИЭФ (г. Саров),  легли в основу устройства для генерации некогерентного импульсного излучения «БРИГ», разработанного в 2004 году.

 

Внедрение результатов работы

Разработанные методы и экспериментальные тест-системы  используются при проведении научных исследований, а также в лабораторно-клинической практике ФГУ «Нижегородский научно-исследовательский кожно-венерологический институт Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию».

Устройство для генерации некогерентного импульсного излучения «БРИГ», применяют в медико-биологических и электрохимических исследований в РФЯЦ ВНИИЭФ (г. Саров), НИИ им. Скобельцина при МГУ (г.Москва), а также ЦНИЛ ГОУ ВПО НижГМА Росздрава  (г. Нижний Новгород).

Результаты исследования используются при обучении студентов на кафедре микробиологии и иммунологии и в процессе преподавания на циклах повышения квалификации  на кафедре профилактической медицины ЦПК и ППС ГОУ ВПО НижГМА Росздрава (г. Нижний Новгород).

Положения, выносимые на защиту

  1. Дрожжевая и мицелиальная форма C. albicans обладают различной способностью активировать нейтрофилы. Мицелиальная форма слабее, чем дрожжевая, индуцирует кислород-зависимую биоцидность нейтрофильных гранулоцитов и вызывает более выраженную продукцию нейтрофилами провоспалительных медиаторов (ИЛ-8, ИЛ-6) и иммунорегуляторов (sHLA-I), дестабилизирующих гомеостаз.
  2. C.albicans обладают антиопсонической активностью в системе альтернативного пути активации комплемента, которая детерминируется термолабильными компонентами клеточной стенки грибов. Присутствие кандид в кровяном русле приводит к торможению направленной миграции нейтрофилов в очаги воспаления.
  3. C. albicans и эпителиоциты слизистых оболочек активно взаимодействуют друг с другом на этапе адгезии кандид. Контакт C. albicans с буккальными клетками зависит от белок-синтезирующей активности кандид, а также усиливается при различных видах метаболической и цитоскелетной активности эпителиоцитов. Существенный вклад в антиадгезивный эффект ротовой жидкости и сыворотки крови вносят антитела, а также температурозависимые факторы, вызывающие необратимые изменения адгезинов C. albicans.
  4. Активация в нейтрофилах внутриклеточных сигнальных путей, связанных с нуклеарным фактором kB и митогенактивированными киназами (ERK1/2 и р38), опосредуется специфическими контактами с C.albicans и ведет к увеличению продукции активных форм кислорода фагоцитами. Кандида-индуцированная активация нуклеарного фактора kB в эпителиоцитах усиливает их адгезивность в отношении C.albicans.
  5. Высокоэнергетические импульсные искровые разряды миллисекундной длительности, генерирующие некогерентное излучение (НКИ), вызывают дестабилизирующий эффект, приводящий к гибели C.albicans. Деструктивный эффект НКИ селективен: он более выражен в отношении кандид, чем в отношении клеток макрорганизма.

Апробация материалов диссертации

Диссертация апробировалась на расширенном заседании кафедры микробиологии  и  иммунологии  ГОУ ВПО НижГМА Росздрава (г. Нижний Новгород)  6 ноября 2008г.; протокол № 3.

Основные  результаты  диссертации  докладывались  и  обсуждались  на:

IV  всесоюзном  совещания  «Люминесцентный анализ  в  медицине  и  биологии и его аппаратурное обеспечение» (Москва, 1992), 5-й Пущинской конференции молодых ученых (Пущино, 2001), международной конференции “Proceeding of the Scanning Probe Microscopy-2001 Workshop” (Нижний Новгород, 2001), 1-м, 2-м, 3-м и 4-м Всероссийских конгрессах по медицинской микологии (Москва, 2003; 2004; 2005; 2006), III конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (Москва, 2004); 3-м съезде биофизиков России (Воронеж, 2004), научной конференции молодых ученых «Актуальные вопросы инфекционной патологии человека, клинической и прикладной иммунологии» (Уфа, 2004), международном научном семинаре «Высокоинтенсивные физические факторы в биологии, медицине, сельском хозяйстве и экологии» (Саров, 2004), VI  Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Озон в биологии и медицине» (Нижний Новгород, 2005), симпозиуме национального альянса дерматологов и косметологов (Санкт-Петербург, 2007),VI, VII, VIII, IX и XI научно-практической конференции по медицинской микологии (Кашкинские чтения) (Санкт-Петербург, 2003; 2004; 2005; 2006; 2008), Первом и Втором съездах Микологов России «Современная микология в России» (Москва, 2002; 2008).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 55 печатных работ, в том числе 19 – в изданиях, рекомендованных ВАК Минобразования и науки, в материалах съездов, конгрессов, симпозиумов,  Всероссийских, международных и региональных  конференций и совещаний. Издано 3 учебно-методических пособия для студентов медицинских ВУЗов, рекомендованных УМО. Одна работа выполнена на уровне изобретения (получено положительное решение о выдаче патента РФ).

Объем и структура диссертации

       Диссертация изложена на 253 страницах машинописного текста и состоит из введения,  обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 6 глав собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы. Диссертация иллюстрирована 39 таблицами и 40 рисунками. Библиографический указатель включает 432 источника литературы, в том числе 106 отечественных и 326 зарубежных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

Материалы и методы исследования

Использовали живые культуры Candida аlbicans – штаммы 441,  67/846, 201, 258, 290, 601, 852,  Candida kefyr 17 и Candida guillermondii 6530-2055, Staphylococcus aureus (штаммы 86М,  66М, 7Н, 1971) и Staphylococcus epidermidis (51-1, 310-2, 178, ССМ 885), Escherichia coli штамм 18М  (из коллекций кафедры микробиологии и иммунологии ГОУ ВПО НижГМА Росздрава, НИИ гигиены и профпатологии МЗ РФ (г. Нижний Новгород) и Всесоюзного центра глубоких микозов (г. С.-Петербург)). Свежевыделенные клинические изоляты (19 штаммов) получали  из бактериологических лабораторий НИИ детской гастоэнтерологии МЗ РФ (г. Нижний Новгород) и Нижегородской областной клинической больницы.

       Эксперименты выполнены на 593 белых беспородных крысах, самках и самцах, массой 230 ± 30 г и  на 104 самках линии Wistar массой 200 ± 10 г, полученных из питомника «Моховая» (Московская обл.). Животные содержались в стационарных условиях вивария на стандартном рационе. Все манипуляции с животными проводили с применением эфирного наркоза.

       В работе  были исследованы нейтрофилы 523 крыс и 81 человека, а также эпителиоциты слизистых оболочек 254 человек. Секрет ротовой полости/слюну  и сыворотку крови получали от здоровых доноров-добровольцев 18-25 лет (415 человек). Проведено свыше 3000 анализов с использованием различных методов (табл.1)

Культуру C. albicans получали в дрожжевой фазе на агаре Сабуро (24 часа, 37С) (ННПЦ ГИП, г. Оболенск). Посевы смывали, дважды отмывали (1000g, 15 мин) десятикратным объемом забуференного (рН 7,2-7,4) физиологического раствора (ЗФР), удаляли клеточные агрегаты центрифугированием (40 g, 2 мин) и ресуспендировали в ЗФР в концентрации 107 – 109 клеток/мл (в зависимости от эксперимента). Концентрацию кандид определяли спектрофотометрически.

Мицелиальную форму кандид  получали по методу Заславской М.И и соавт. (2006)  (рис. 1а).  Гифальные элементы кандид использовали в концентрации, эквивалентной по сухому весу дрожжевой фазе.

Таблица 1.

Методы оценки реактивности / функциональной активности  клеток,

использованные при выполнении диссертационной  работы

Метод

Автор / техника исследования

Объем

исследований

1

2

3

Оценка люминол-зависимой хемилюминесценции нейтрофилов крови  или  экссудата

Tono-Oka T. et al.; 1983;

Маянский А. Н., Пикуза О.И.,1993; Заславская М.И., Маянский А.Н, 2006

56 серий

исследований

Определение концентрации интерлейкинов (ИЛ-8, ИЛ-6) методом ИФА 

Маянский Н.А. и соавт., 2000;

Заславская М.И. и соавт. 2006

Набор реагентов для ИФА (НПО «Цитокин»,

г. С.-Петербург)

9 серий

исследований

Определение растворимых молекул HLA-I  методом ИФА

Заславская М.И. и соавт. 2006

Новиков В.В., 1996

Набор реагентов для ИФА

(ННИЭМ, Нижний Новгород)

7 серий

исследований

Определение рецепторзависимой (C3b/ iC3b-, IgG-) и неспецифической адгезии нейтрофилов на гранулах искусственных сорбентов  (рис. 1б)

Чеботарь И.В. и соавт., 1991

325 экспериментов

Оценка активности кандид в системе альтернативного пути активации комплемента

Заславская М.И. и соавт., 2004

16 серий

исследований

Оценка интраплантарного  воспаления у крыс

Заславская М.И., Маянский А.Н.; 2006

3 серии

исследований

Оценка спонтанной миграции  нейтрофилов

David J.R. et al.; 1964

20 экспери-

ментов

1

2

3

Определение индекса естественной колонизации буккальных  эпителиоцитов

Маянский А.Н. и соавт., 1999

273 препарата

Определение искусственной колонизация кандид на эпителиоцитах

Cox F., 1983; Darwazeh A.M. et al.; 1991; Маянский А.Н.

и соавт.,2002

1548

препаратов

Оценка прочности адгезии кандид на эпителиоцитах

Маянский А.Н. и соавт.; 2003

11 экспериментов

       Выделение чистой фракции нейтрофилов крови проводили по методу Подосинникова И.С. и соавт. (1981).

        Первичную 18-часовую чистую культуру нейтрофилов крови получали при культивировании в среде ДМЭМ  ранее описанным способом ( Маянский Н.А., Заславская М.И.,  Маянский А.Н, 2000).        

а                                                  б

Рис.1.  а – мицелиальная форма C. albicans штамм 601. Окраска азуром А.

  Увеличение 600.

  б - адгезия нейтрофилов на гранулах С3b-сефадекса. Увеличение ×80.

       Опсонизацию кандид и зимозана проводили цельной сывороткой, а также в режиме сорбции C3b/iC3b- и IgG-молекул (Маянский А.Н. и соавт., 1989; Заславская М.И., Маянский А.Н.; 2006 )

Топографию нейтрофилов исследовали с помощью сканирующего зондового микроскопа TopoMetrix SPMLab (США) в НИОЦ СЗМ (Н.Новгород).  Работа на сканирующем зондовом микроскопе выполнена совместно с научным сотрудником центра - Гущиной Ю.Ю.

       Изучение  активности кандид  и зимозана  в системе альтернативного пути активации комплемента (АПАК) проводили с сывороткой, где был возможен только альтернативный путь активации (Kozel T. R, et al., 1987).

Искусственную колонизацию кандид на эпителиоцитах осуществляли способом, описанным ранее (Маянский А.Н. и соавт.,2002).  Определяли индекс адгезии, т.е. среднее количество кандид в пересчете на один эпителиоцит (канд/эп) после просмотра 100 эпителиальных клеток. Эксперименты по  оценке адгезивных реакций в системе «Candida albicans –  эпителиоциты»  выполнены совместно с сотрудниками ГОУ ВПО НижГМА Росздрава (г.Нижний Новгород): асс. Махровой Т.В., доц.  Салиной Е.В., асс. Луковой О.А. (каф. микробиологии и иммунологии) и асс. каф. госпитальной педиатрии Абаджиди М.А. при  непосредственном участии автора.

Оценку влияния различных факторов на адгезию в системе «C.albicans- буккальные эпителиоциты» определяли после предварительной обработки клеток соответствующими реактивами с последующей отмывкой ЗФР. Нековаленто связанные компоненты удаляли с поверхности клеток раствором  0,1% додецилсульфата натрия (ДДС) (Kozel T.R. et al., 1987).

Экстракт нейтрофилов, стандартизованный по миелопероксидазе, получали, используя обработку клеток  0,1% тритоном Х-100 (Suzuki K. et al., 1983) .        

Сыворотку и слюну, истощенные по антителам к кандидам получали способом, описанным ранее (Махрова Т.В. и соавт.; 2005). Полноту истощения субстрата (слюны, сыворотки) по антителам к кандидам оценивали в реакции энзим-меченых антител по методу Астафьева Д.Г. (1987).

       Оценку естественной колонизации проводили путем подсчёта бактериальных клеток, адгезированных на эпителиоцитах. Для этого из суспензии эпителиоцитов готовили мазки, фиксировали метанолом (10 мин) и окрашивали 0,25% водным раствором азура А (“Sigma”, США). Индекс естественной колонизации оценивали по числу бактериальных клеток в пересчёте на один эпителиоцит (бакт/эп). Учитывали средний результат после подсчета 100 эпителиоцитов.

               Блокаду нуклеарного фактора kB и внутриклеточных митоген-активированных киназ ERK1/2 и p38  в нейтрофилах и эпителиоцитах проводили путем инкубации клеток с  соответствующими ингибиторами (Заславская М.И., 2005; Заславская М.И., Маянский А.Н., 2007).

       Моделирование орального  кандидоза у крыс осуществляли по методу Samaranayake Y.H. et al. (2001).

       Некогерентное импульсное излучение (НКИ) инфракрасного, видимого и ультрафиолетового диапазона получали с помощью генератора высокоэнергетических импульсов (ВНИИЭФ, г. Саров) (Спиров Г.М., и соавт., 2005). Напряженность электромагнитного поля между электродами достигала 100 кВ/м, ток в канале искрового разряда - 1 кА. Источник генерации искровых разрядов работал с заданным распределением импульсов во времени в режиме  с частотой  1 Гц (1 имп/сек). Длительность каждого разряда составляла 5-20 мсек, энергия - 5Дж в одном разряде. Объекты помещали в зоне излучения на расстоянии 2,0-2,5 см от электродов генератора НКИ. В экспериментах in vitro (16 серий экспериментов) использовали суспензию кандид (5·104 кл/мл) или  эпителиоцитов  в ЗФР. Толщина слоя клеточной суспензии при обработке НКИ составляла 2-3 мм. Жизнеспособность клеток после воздействия НКИ определяли по трипановому тесту, а также сравнивая количество КОЕ кандид, выросших  при  посеве из опытных и контрольных образцов.        Для оценки эффекта НКИ in vivo были проведены испытания (5 серий исследований) на лабораторных крысах линии Wistar.

       Подсчет лейкоцитарной формулы крови осуществляли по общепринятой методике (Меньшиков В.В.; 1987).

Уровень сиаловых кислот в суспензии клеток определяли с помощью набора реагентов «Сиалотест-100» (НПО Экосервис, С.-Петербург) согласно рекомедациям фирмы-производителя.

Уровень перекисного окисления липидов (ПОЛ) мембран клеток C. albicans эритроцитов и плазмы крови человека определяли методом хемилюминесценции (Кузьмина Е.И.,1983).

Статистическую обработку данных проводили по общепринятой методике (Реброва О.Ю., 2003). Рассчитывали среднюю арифметическую и ее стандартную ошибку (М ± m). Достоверность различий оценивали при помощи критериев Стьюдента (t)  или Вилкоксона-Манна-Уитни.  Различия расценивали как статистически значимые при р<0,05. Взаимосвязь параметров оценивалась методом корреляционного анализа, определяя коэффициент ранговой корреляции Спирмена (rs). Результаты исследования обрабатывались с использованием прикладных программ EXEL и «STADIA  4..51». 

Результаты исследования и их обсуждение

Нейтрофил-стимулирующая активность дрожжевой и мицелиальной

форм Candida albicans

       Сравнивали способность дрожжевой и мицелиальной форм C.albicans стимулировать продукцию нейтрофилами активных форм кислорода, цитокинов (ИЛ-8, ИЛ-6) и образование растворимых форм мембранных антигенов HLA-I класса.

Все тест-культуры C.albicans (штаммы №№ 258, 290, 852, 601) в дрожжевой фазе вызывали более сильную люминол-зависимую хемилюминесценцию (ХЛ) нейтрофилов по сравнению с мицелиальными элементами  (табл.1).

Таблица 1

Показатели кандида-индуцированной ХЛ нейтрофилов в системах

с  дрожжевой  и мицелиальной формами Candida  albicans, M ±m

Штаммы

C. albicans

ХЛ в системах 

с дрожжевой  формой  (ХЛ-ДФ)

(103 имп/мин)

ХЛ в системах

с мицелиальной формой  (ХЛ-МФ)

(103 имп/мин)

Отношение

ХЛ-МФ/  ХЛ-ДФ

(количество раз)

258

179,5 ± 12,8

153,2  ±  8,9

1,17 ± 0,03

290

247,8 ± 96,8

116,4  ±  42,6 *

1,91  ± 0,13

601

156,8  ± 18,4

124,9 ± 11,8

1,76  ± 0,23

852

126,1 ± 10,3

97,6  ± 4,6

1,69  ± 0,17

* - достоверные отличия относительно дрожжевой формы (p <0,05)

Так как уровень индуцированной ХЛ нейтрофилов коррелирует со способностью фагоцитов вступать в адгезивные реакции (Bellavite P. et. al., 1994),  была исследована вовлеченность специфических и неспецифических адгезинов разных морфологических форм в стимуляцию кислород-зависимых реакций нейтрофилов. После термической обработки (70°С, 40 мин) дрожжевые элементы тест-культуры C.albicans штамм 601 значительно слабее, чем мицелиальные, индуцировали ХЛ нейтрофилов (0,6 ± 0,2·103 имп/мин  против 9,6 ± 3,2·103 имп/мин; р<0,05). Это указывало на то, что C. albicans в дрожжевой фазе обладают более широким набором термолабильных адгезинов (предположительно, белковой природы), обеспечивающих контакт с нейтрофилами. После обработки кандид трипсином (1мг/мл, 1ч, 37°С; “Spopha”,Чехия) наблюдалось снижение нейтрофил-стимулирующей активности дрожжевой формы в 1,3 ± 0,1 раза (p <0,05); такая же обработка не влияла на стимулирующую активность псевдомицелия.

Формирование нейтрофилами псевдоподий после контакта с кандидами исследовали с помощью атомного силового микроскопа TopoMetrix SPMLab (США) в НИОЦ СЗМ (Н.Новгород). Было показано, что образование псевдоподий нейтрофилами наступало через 5 мин после контакта с C. albicans, и не зависело от морфологической формы кандид. 

Ингибирование активности микротрубочек нейтрофилов колхицином (1мкг/мл, 30 мин, 37°С;  “Sigma”, США) приводило к достоверному (p<0,05) снижению нейтрофил-стимулирующей активности C. albicans – в 1,71 ± 0,03 для дрожжевой формы и в 1,44 ± 0,04 раз  для псевдомицелия. Подавление активности микрофиламентов цитохалазином В (1мкг/мл, 30 мин, 37°С;  “Sigma”, США)  не меняло реактивности нейтрофилов в системе с кандидами.

Сравнивали способность нейтрофилов активироваться опсонизированными дрожжевыми и гифальными элементами кандид. Дрожжевую или мицелиальную форму C. albicans штамм 601 обрабатывали цельной сывороткой, а также в режиме сорбции C3b/iC3b-компонента комплемента или молекул IgG (Заславская М.И., Маянский А.Н.,2006). После обработки цельной сывороткой или ее субкомпонентами (iC3b/C3b-, IgG-) мицелиальная и дрожжевая формы индуцировали сходную ХЛ нейтрофилов (p>0,05).

Была исследована способность дрожжевых элементов и псевдомицелия  C. albicans вызывать продукцию провоспалительных цитокинов ИЛ-8 и ИЛ-6 нейтрофилами in vitro (Заславская М.И., Маянский А.Н., 2006). Отмечен более высокий  синтез ИЛ-8 и ИЛ-6 в системах с мицелиальной формой C. albicans штамм 601 (p<0,05) (табл.2). 

Инактивация кандид (70оС, 40 мин) не влияла на лидирующие позиции гифальных элементов по синтезу ИЛ-8, но нивелировала их различие в способности индуцировать ИЛ-6. Можно предположить, что более интенсивная продукция

Таблица 2
Продукция нейтрофилами ИЛ-8, ИЛ-6 и sHLA- I  в системах  с дрожжевыми (ДФ) или мицелиальными (МФ) формами Candida  albicans  штамм  601, M ± m

Кандиды в системе

ИЛ-8 (пкг/мл)

ИЛ-6 (пкг/мл)

sHLA-I

(усл.ед./мл)

Контроль (без кандид)

208,8  ±  23,2

  66,9 ± 12,2

43,2 ± 4,1

живые  ДФ

505,0 ± 113,4 *

165,3 ± 17,8*

111,6 ± 34,5 *

живые МФ

934,0 ± 127,8*/ **

221,3 ± 28,4*/**

219,7 ± 47,8*/ **

инактивированные ДФ

392,9 ± 68,8 *

141,3 ± 32,6 *

81,5 ± 9,5  *

инактивированные МФ

643,1 ± 102,1*/***

148,2 ± 19,4*

191,1 ± 20,3*/***

* -  достоверные отличия относительно контроля (p <0,05)

** -  достоверные отличия относительно системы с живыми  ДФ (p <0,05)

*** - достоверные отличия относительно инакивированных  ДФ (p <0,05)

нейтрофилами провоспалительных цитокинов в присутствии псевдомицелия может служить дополнительным механизмом сдерживания инвазии и диссеминации кандид.

Инкубация  нейтрофилов  с  различными морфологическими вариантами С.albicans in vitro вызывала увеличение концентрации растворимых форм мембранных антигенов HLA I класса (sHLA-I) (p<0,05). При этом как нативные, так и инактивированные гифы сильнее стимулировали поступление sHLA-I в инкубационную среду, чем дрожжевые элементы (p<0,05) (см. табл.2). Это может указывать на более сильный дестабилизирующий эффект псевдомицелия  гриба на Т-зависимые реакции макроорганизма.

Таким образом, мицелиальная форма C. albicans слабее стимулирует кислород-зависимую биоцидность фагоцитов  и, одновременно, активнее индуцирует синтез нейтрофилами молекул, дестабилизирующих гомеостаз.  Это означает, что мицелиальная форма C. albicans, по сравнению с дрожжевой, обладает большей вирулентостью, реализуемой в системах с нейтрофилами. 

Активность C. albicans в системе альтернативного пути активации комплемента

Оценивали вклад альтернативного пути активации комплемента (АПАК) в опсонин-зависимые взаимодействия  нейтрофилов с  C.albicans. Использовали кандиды в дрожжевой фазе – нативные или опсонизированные в системе  АПАК (Заславская М.И., и соавт., 2004). Для сравнения использовали зимозан (“Sigma”, CША),  представляющий собой полисахарид клеточных стенок Saccharomyces cerevisiae, сходный с углеводными компонентами клеточных стенок кандид (Vazquez-Torres A., Balish E., 1997; Cannon R.D., Chaffin W.L.,1999) и известный как классический активатор АПАК (Pillemer L. et al., 1956). Зимозан использовали в концентрации,  эквивалентной сухому весу C. albicans.

Нативные  C. albicans  сильнее  стимулировали  ХЛ нейтрофилов, чем зимозан (табл. 3).  Для разных штаммов C.albicans показатели варьировали от 8,7 ± 1,4 ·104 имп/мин  (штамм 441) до 30,8 ± 4,1· 104  имп/мин (штамм 67/846).  Нейтрофил

стимулирующая активность C. kefyr и C. guillermondii была соответственно 11,3 ±  4,3 · 104 имп/мин и  6,6 ± 3,0 · 104  имп/мин. В системе с  неопсонизированным зимозаном ХЛ нейтрофилов была самой слабой – 5,5 ± 0,7 · 104 имп/мин.

Таблица 3 

Опсоническая активность кандид и зимозана в системе АПАК, M ± m

Субстраты

Кратность усиления ХЛ нейтрофилов в системах с субстратами после опсонизации в системе  АПАК (количество раз)

Зимозан

18,8 ± 6,9

Кандиды ( виды/штаммы):

Живая (нативная)

культура

Убитая (гретая)

культура

C.albicans 601

1,2  ± 0,4*

12,0 ± 1,8**

C.albicans 67/846

0,9  ± 0,3*

-

C.albicans 44 1

3,1  ± 0,6*

20,5 ± 2,4**

C.albicans 201

1,3  ± 0,4*

-

C. kefyr 17

2,4  ± 1,0*

-

C. guillermondii  6530-2055

4,9  ± 1,6*

22,0 ± 5,0**

* - достоверность различий относительно зимозана (р<0,05)

**   - достоверность различий между живыми и убитыми кандидами (р<0,05)

После опсонизации в системе АПАК живые кандиды имели более низкую (р<0,05) нейтрофил-стимулирующей активность  по сравнению с зимозаном, опсонизированным в том же режиме. Это не было связано с различием в поглощении C.albicans и зимозана нейтрофилами, разрушением опсонических молекул комплемента экзоферментами кандид или различной способностью исследуемых субстратов запускать  АПАК (р>0,05) .

Опсонизация гретых (убитых) культур С. albicans, приводила к значительному усилению активности нейтрофилов (см. табл. 3). Это указывало на то, что термолабильные компоненты клеточной стенки кандид ответственны за низкую  эффективность АПАК-зависимой опсонизации и могут блокировать сорбцию опсонических молекул на поверхности кандид или вызывать деградацию опсонинов системы комплемента.

Острая воспалительная реакция на фоне дестабилизации внутрисосудистого гомеостаза, индуцированного Candida albicans

       Процесс нарушения  внутрисосудистого гомеостаза был смоделирован внутривенным введением белым беспородным крысам зимозана (10 мг/мл; “Sigma”, США) или живых C.albicans штамм 601 (5·108 кл/мл) в 0,2 мл ЗФР (Заславская М.И., Маянский А.Н., 2004; 2006). Спустя 0,5-1-4-24 ч у крыс вызывали асептическое воспаление путем введения в брюшную полость 5 мл стерильного изотонического 10% раствора пептона. Через 4 часа  после внутрибрюшинной инъекции (время максимального накопления нейтрофилов в экссудате) животных декапитировали, промывали брюшную полость 20 мл ЗФР, отбирали перитонеальное содержимое и оценивали гистологические показатели.

       Обнаружен феномен, который был обозначен как  «острая мобилизационная блокада» нейтрофилов. Он проявлялся в резком сокращении количества нейтрофилов, эмигрировавших в брюшную полость спустя 30-60 мин после внутривенного введения  зимозана или C.albicans по сравнению с контролем ( инъекция ЗФР) (р<0,05). Феномен не зависел от природы индуктора местного воспаления: он был также воспроизведен при введении в брюшную полость лиофилизированных клеточных стенок Staphylococcus aureus, штамм ССМ 885 (5мг/мл) в 5 мл ЗФР (р<0,05).

       Для проверки системности реакции была изучена миграционная активность нейтрофилов на модели острой воспалительной реакции, в подушечках лап у крыс. В качестве раздражителя использовали агрегированный (63°С, 30мин) иммуноглобулин человека. Наблюдали снижение интенсивности острой интраплантарной воспалительной реакции в 1,5 раза в на фоне внутрисосудистой дестабилизации крови (р>0,05 ).

Феномен «мобилизационной блокады» нейтрофилов не было связан с сокращением внутрисосудитстого пула циркулирующих нейтрофилов (р>0,05). Кроме того, нейтрофилы сохраняли способность прикрепляться к объектам, несущим специфические (C3b/iС3b-, IgG-) и неспецифические лиганды, а также  способность к спонтанной миграции in vitro (р>0,05 ).

       Изучено функциональное состояние очага острого воспаления на фоне нарушения внутрисосудистого гомеостаза, индуцированного C.albicans. Сокращение притока нейтрофилов в очаг воспаления не сопровождалось изменением общего уровня  спонтанной и латекс-индуцированной ХЛ (иХЛ) перитонеального экссудата. В то же время спонтанная ХЛ (сХЛ) отдельных нейтрофилов в экссудате резко усиливалась: 11,1 ± 4,9 ·103  имп/мин у экспериментальных крыс и 2,9 ± 0,1 ·103  имп/мин  в контрольной группе животных (р<0,05). Уровень удельной иХЛ эксудативных нейтрофилов также повышался и составлял 36,9 ± 13,2 ·103  имп/мин в контроле и 151,9 ± 69,8 ·103 имп/мин в опыте (р<0,05). Повышение иХЛ отдельных фагоцитов говорило о том, что внутрисосудистая циркуляция кандид оказывает стимулирующий эффект на нейтрофилы, усиливая их реактивность (кислород-зависимую биоцидность).

Адгезивные реакции в системе «Candida albicans  эпителиоциты» 

На предварительном этапе была разработана экспериментальная тест-система для изучения адгезии C. albicans на эителиоцитах. Эксперименты показали отсутствие достоверных различий адгезивных реакций с буккальными эпителиоцитами человека между музейными культурами C. albicans и штаммами, выделенными из разных источников (язык, кишечник, влагалище). Для проведения дальнейших исследований был выбран штамм C. albicans 601, который отличался средними, но наиболее постоянными показателями адгезии (рис.2). Была определена оптимальная экспозиция кандид с эпителиоцитами (37°С, 30 мин), при которой результаты эксперимента не зависели от жизнеспособности C. albicans, не давали ко-адгезии  кандид и обеспечивали прочность связывания по фиколл-верографиновому тесту  60,8 ± 9,0 %.

Значение метаболической активности клеток для реализации адгезии в системе  «Candida  albicans-буккальные эпителиоциты». Опыты проводили с подавлением метаболизма буккальных клеток (4°С), блокадой гликолиза (фторид натрия;  200мМ, 15 мин, 37°С) , ингибированием синтеза белка (циклогексимид, “Sigma”,США; 16 мкг/мл, 30 мин, 37°С),  при выключении реакций цитоскелета (микротрубочек или микрофиламентов) колхицином и цитохалазином В (“Sigma”,США; 1 мг/мл, 30 мин, 37°С). Эсперименты выявили снижение адгезивности эпителиоцитов на холоду, при торможении гликолиза, подавлении синтеза

белка и реакций цитоскелета, что говорило об активной роли эпителиальных кле-

ток при взаимодействии с кандидами (табл.4).

Рис. 2.  Искусственная колонизация  C.albicans штамм 601 на буккальном эпите-

лиоците. Окраска азуром А.  Увеличение × 1350.

Таблица  4

Уровень адгезии C.albicans штамм 601кандид  на эпителиоцитах при различных вариантах метаболической активности клеток, М ± m

Функции  эпителиоцитов,  подвергавшиеся  ингибированию

Кандиды

в системе

Контроль:

адгезия кандид на интактных

эпителиоцитах

(канд/эп)

Адгезия кандид на фоне  блокады функции  эпителиоцитов

абсолютное значение

(канд/эп)

% адгезии

относитель-но контроля

Общая метаболи-ческая активность

живые

12,2 ± 1,3

6,2  ± 0,4*

52,2 ± 1,7*

убитые

10,9 ± 1,3

5,7  ± 0,7*

52,0 ± 2,9*

Гликолиз

живые

10,1 ± 0,7

4,7 ± 0,3 *

52,2 ± 2,4*

Синтез белка

живые

10,2  ± 0,6

3,7 ± 0,1 *

36,6 ± 1,9*

Активность  микротрубочек

живые

9,5  ± 0,6

5,7 ± 1,0 *

60,3 ± 2,2*

убитые

9,6  ± 1,1

8,3 ± 1,2 **

85,8 ± 2,8**

Активность  микрофиламентов

живые

9,7  ± 2,0

5,6 ± 1,5 *

57,9 ± 2,9*

убитые

9,4 ± 0,8

8,6 ± 1,7 **

90,7 ± 4,5**

*  – достоверность различий относительно контроля (интактные эпителиоциты) (р<0,05) 

** – достоверность различий относительно эксперимента с  живыми кандидами (р<0,05)

       Установлено, что адгезия кандид на буккальных клетках складывается из двух механизмов. Один из них не зависит от уровня метаболической и цитоскелетной активности эпителиоцитов. Взаимодействие между эпителиальными клетками и кандидами, в этом случае носящее пассивный характер, не связано с рецепторами кандид, а определяется неспецифическим механизмами, такими как: гидрофобные, вандерваальсовы и электростатические  взаимодействия. Второй механизм является результатом взаимодействия метаболически активных клеток и лучше всего проявляется в физиологичных условиях (37°С).

       Эксперименты позволили установить, что блокада цитоскелета эпителиоцитов не меняла уровень адгезии убитых кандид  на буккальных клетках, но, в то же время,  вызывала существенное снижение адгезии живых кандид в системе (см. табл.4). Это позволило думать о том, что сам процесс закрепления живых кандид способен усиливать  адгезивность  эпителиоцитов через изменение реактивности элементов цитоскелета буккальных клеток. 

Значение метаболической активности кандид для реализации адгезии в системе  «Candida  albicans-буккальные эпителиоциты». Исследовали значение метаболической активности самих кандид для реализации их  адгезии на эпителиоцитах. В отличие от клеток человека, адгезивная активность кандид снижалась только при ингибировании синтеза белка. В этом случае предварительная обработка живых кандид циклогексимидом уменьшала показатель адгезии почти наполовину (42,1 ± 5,2% от уровня эксперимента с нативными кандидами). Это указывало на то, что адгезивные реакции C.albicans могут определяться как механизмами, не зависящими от метаболизма клеток, так и связанными с  белок-синтезирующей активностью самих кандид.

Влияние факторов слюны  на адгезивные реакции в системе «Candida  albicans-буккальные эпителиоциты». Цельная слюна вызывала снижение адгезии кандид на буккальных клетках в 2,8 раза (р<0,05) (табл.5). Это показывало, что адгезия кандид включает два компонента, один из которых блокируется слюной, а другой не подвержен ее влиянию.

После обработки кандид в обычном режиме (37°С) слюной, истощенной по антикандидозным антителам, наблюдали ослабление антиадгезивного эффекта  (р<0,05). Следовательно, антитела слюны вносят существенный вклад во взаимоотношения кандид с буккальными клетками, обеспечивая 62% от общего антиадгезивного эффекта ротовой жидкости.

       При обработке кандид истощенной по антителам слюной при 4°С антиадге-

зивный эффект слюны был меньше, чем при 37°С (р< 0,05) (см. табл.5). Обработка кандид 0,1% раствором ДДС не приводила к восстановлению исходного уровня адгезии. Таким образом, в слюне имеются  факторы, отличные от антител,  действие которых на кандиды проявляется, во-первых, только при 37°С и, во-вторых, не экранируется нековалентно связанными молекулами. Показано, что температурозависимые антиадгезины слюны не имеют отношения к муцину (р>0,05). Предположительно, речь идет о факторах ферментной природы, которые способны вызывать структурные изменения  поверхностных компонентов кандид.

Таблица  5

Влияние цельной и истощенной по антителам к кандидам слюны /сыворотки  на адгезию  C.albicans штамм 601 к  буккальным эпителиоитам, М ± m

Субстрат

для обработки кандид

Режим 

инкубации

кандид

с субстратом

% адгезии

относительно контроля

Антиадгезив-ный эффект

субстрата

(%)

Контроль (нативные кандиды)

37С

Цельная слюна

37С

36,0 ± 3,1*

64,0 ± 8,4*

45,4 ± 3,6*

55,5 ± 3,9*

Истощенная (по антителам) слюна

37С

75,7 ± 11,5

24,3 ± 9,4

  90,9 ± 0,9 **

  9,1 ± 0,1**

Цельная сыворотка

37С

26,5 ± 1,6 *

73,5 ± 1,4*

45,4 ±2,3*/**

54,6 ± 2,7 */**

Истощенная (по антителам) сыворотка

37С

44,2 ± 4,2 *

55,8 ± 2,2 *

  87,7 ± 1,6 **

12,3 ± 1,4**

* –  достоверность отличий относительно контроля  (р<0,05) 

** – достоверность различий относительно эксперимента при 37С (р <  0,05)

       

Влияние эффекторов воспалениия на адгезивные реакции в системе «Candida  albicans-буккальные эпителиоциты». Обработка кандид (30 мин, 37°) экстрактом нейтрофилов (концентрация 30·106 кл/мл) вызывала незначительное повышение уровня адгезии C. albicans на эпителиальных клетках – 136,5 ± 8,0%  (р=0,05). Тот же экстракт при обработке С3b-сефадекса G50, Fine (Pharmacia, Швеция), вызывал почти полное снижение С3b-зависимой адгезии нейтрофилов на гранулах сефадекса, что указывало на его выраженную протеолитическую активность.

Экссудат, принимающий участие в воспалении, включает антитела, комплемент и другие элементы, способствующие или препятствующие воспалительной реакции. Это определило круг задач, связанных с изучением сывороточных факторов на адгезивные реакции кандид.

Пул сыворотки вызывал снижение адгезии кандид на буккальных эпителиоцитах в 3,6±0,2 раз (р<0,05). После обработки C. albicans сывороткой, истощенной кандидами на холоду (4°С,30 мин; удаление антител без активации комплемента) адгезивный эффект снижался  в 2,0 ± 0,1 раз (р<0,05). Это говорит о том, что антитела вносят существенный вклад во взаимоотношения кандид с эпителиальными клетками, отвечая примерно за 24% общего антиадгезивного эффекта сыворотки.

Для изучения природы антиадгезивных факторов, не связанных с антителами, проводили обработку C. albicans при 37С или 4С сывороткой, истощенной по антителам к кандидам. При 4°С антиадгезивный эффект сыворотки был значительно ниже, чем при 37°С (р<0,05) (см.табл.5). Обработка 0,1 % ДДС  не устраняла  антиадгезивного  эффекта истощенной  сыворотки. Следовательно, в сыворотке содержатся факторы, действие которых на кандиды проявляется, во-первых, только при 37°С и, во-вторых, не экранировано нековалентно связанными молекулами. Установлено, что данные факторы не относятся к системе комплемента, поскольку при полной блокаде комплемента (Kozel T. R, et al., 1987) не менялась антиадгезивная активность сыворотки (р>0,05). Можно предположить, что температурозависимое антиадгезивное действие сыворотки связано с другими факторами (возможно, ферментами), структурно модифицирующими адгезины кандид.

Влияние бактериальных факторов на адгезивные реакции в системе «Candida  albicans-буккальные эпителиоциты». Кандидоз может протекать как смешанная инфекция, в связи с этим нами изучено влияние на взаимоотношения кандид с буккальными клетками метаболитов золотистого и эпидермального стафилококка, которые могут подключаться к воспалительному процессу на этапах мукозального и кожного кандидозов.

Метаболиты S. aureus (штаммы 86М, 66М, 7Н, 1971), но не S. epidermidis (штаммы 51-1, 310-2, 178) снижали адгезию кандид на буккальных эпителиоцитах. При инкубации (60 мин, 37°С) кандид с супернатантами суточных культур золотистого стафилококка (выращенных на жидкой среде ДМЕМ; ГУП ИПВЭ, г.Москва) таким действием обладали все четыре штамма стафилококка. Максимальное снижение адгезии (в 2,6 ± 0,1 раз) наблюдалось под действием метаболитов штамма 86М.  Эффект был необратимым (обработка 0,1%  раствором ДДС не возвращала исходной адгезивной активности C. albicans) и предположительно объяснялся ферментативным действием  секреторных продуктов золотистого стафилококка на адгезины кандид. Об этом косвенно свидетельствовало ослабление адгезивной активности кандид при их обработке проназой (комплекс бактериальных протеаз) (“Fluka”, Швейцария; 1мг/мл; 1 ч ,37°С).

В отличие от экспериментов с C. albicans, обработка буккальных клеток метаболитами золотистого стафилококка не влияла на  жизнеспособность и адгезивность эпителиоцитов.

Адгезивные реакции C. albicans и эпителиоцитов, полученных от доноров разного возраста и из различных источников. Уровень искусственной колонизации C. albicans буккальных эпителиоцитов у взрослых (11,2 ± 2,6) не отличался существенно от показателей у детей 6-8 лет (16,0 ± 5,1). В то же время естественная колонизация нормальной микрофлорой того же эпителия была почти в три раза выше в детском возрасте (14,3 ± 6,9 у взрослых и 40,6 ±19,0 у детей (р>0,05)). Это показывает, что возрастные различия в естественной колонизации буккальных клеток не затрагивают их чувствительности к искусственному заселению факультативной микрофлорой, в частности кандидами.

Эксперименты показали наличие сходной адгезивности мукозальных клеток, взятых из разных биотопов – буккального и вагинального эпителия (р>0,05). Наличие прямой корреляции между  показателями искусственной колонизации  C. albicans у обоих типов эпителиальных клеток говорит о сходстве их рецепторного аппарата, взаимодействующего с кандидам.

Функциональный и морфологический статус эпителиоцитов способен меняться на фоне патологических состояний (Рыжавский Б.Я., Холодок Г.Н., 1995; Хусаинова И.С. и соавт. ,1997; Маянский А.Н. и соавт.,1999;  Цепов Л.М. и соавт., 1999). Мы исследовали изменение адгезивных реакций эпителиоцитов слизистых оболочек при поверхностном кандидозе (кандидный онихомикоз, вагинальный кандидоз) и хронической некандидозной патологии (бронхиальная астма). Уровень естественной колонизации буккальных эпителиоцитов в группе детей (6-12 лет) с кандидозным онихомикозом (17 человек, проходящие лечение в ФГУ «Нижегородский кожно-венерологический научно-исследовательский институт Росздрава») был выше, чем у здоровых (25 человек): 83,6 ± 23,5  бакт/эп и 40,7 ± 16,2 бакт/эп соответственно (р>0,05). Показатели искусственной колонизации  были сходными у здоровых детей (14,0 ± 5,1 бакт/эп )  и у детей с кандидозными поражениями (11,6 ± 4,3 бакт/эп ) (р>0,05).

Под наблюдением находилось также 19 детей в возрасте 4-12  лет в периоде обострения бронхиальной астмы (проходившие лечение в стационаре ГУ «Нижегородская областная детская клиническая больница»). Контрольную группу составили 36 практически здоровых детей 5-12 лет. Было обнаружено увеличение адгезивности эпителиоцитов по отношению к C. albicans у детей с бронхиальной астмой. Так, у 30 из 36 здоровых детей показатели адгезии C. albicans на буккальных эпителиоцитах были ниже 10 и в среднем составили  6,8 ±  0,9 канд/эп. Иная картина наблюдалась в группе детей с бронхиальной астмой: лишь в одном из 19 случаев результат оказался ниже 10 при среднем показателе 15,3 ± 2,8 канд/эп (р < 0,05).

Изучение естественной и искусственной колонизации вагинальных эпителиоцитов у здоровых небеременных женщин (15 человек), здоровых беременных женщин (17 человек) и беременных с кандидозом (13 человек),  получавших консультации  на кафедре акушерства и гинекологии ГУ ВПО «НижГМА Росздрава» (на базе МЛПУ ГКБ №40, Н.Новгород), дало следующие результаты.

У здоровых беременных женщин уровень естественной колонизации (16,6±8,1 бакт/эп) был несколько ниже, чем аналогичные показатели у здоровых небеременных женщин (23,2±10,5 бакт/эп) (р>0,05). Наличие кандида-зависимого воспалительного процесса во влагалище у беременных ассоциировалось с еще более низкими показателями естественной колонизации вагинального эпителия (13,8±6,2 бакт/эп) (р>0,05). Показатели кандида-индуцированной искусственной колонизации у здоровых беременных (7,6±1,3 канд/эп) и больных кандидозом (6,3 ± 1,6 канд/эп) не отличались от показателей у здоровых небеременных женщин (8,4 ± 2,5 канд/эп) (р>0,05).

Причиной такого «расщепления» адгезивных реакций эпителиоцитов у пациентов разных групп может быть изменение морфологии или интенсивности  экспрессии рецепторов под влиянием медиаторных (например, цитокиновых) воздействий или ферментов мукозальных секретов на фоне перестройки системного гомеостаза и/или на уровне слизистых оболочек (Weinmeister R.D., Dal Nogare A.R.,1994).

Участие внутриклеточных сигнальных путей во взаимодействии

нейтрофилов и эпителиоцитов  с Candida albicans

Изменение реактивности клеток человека  в ответ на внеклеточные стимулы опосредуется через внутриклеточные сигнальные пути, осуществляющие передачу активирующего сигнала с поверхности на их генетический аппарат.  Показано, что основную транслирующую функцию в клетках выполняют внутриклеточные регуляторы генной транскрипции,  такие как нуклеарный (транскрипционный) фактор-B (NF-B) (Barnes P.J., Karin M.,1997; Jobin Ch., Sartor R.B.,2000; Baldwin A.S.,2001) и митоген-активированные протеинкиназы (MAP-киназы) (Tian W. et  al.,2000; Zarubin T., Han J.,2005).

               Для определения значения нуклеарного фактора kB (NF-kB) проводили исследования в режиме его подавления путем инкубации (90 мин, 370С, 100 μM)  нейтрофилов с протеасомным ингибитором – ALLN (“Sigma”,США) (Dahan S. et al.,2002; Carlson D.L. et al., 2003). Контролем служили интактные клетки.

               Блокада NF-kB приводила к снижению уровня  адгезии C. albicans штамм 601  на буккальных эпителиоцитах в 1,7 ± 0,6 раза (p<0,05), что указывало на участие NF-kB в регуляции процессов, обеспечивающих контакт между эпителиоцитами и кандидами. На фоне блокады NF-kB было отмечено снижение уровня индуцированной ХЛ (иХЛ)  нейтрофилов после контакта с нативными кандидами в 1,7 ± 0,4 раза по сравнению с контролем  (p< 0,05).  Разрушение белковых составляющих рецепторного аппарата грибов (прогревание 70°С, 40 мин) не изменяло уровня иХЛ фагоцитов при ингибировании NF-kB. Показатели несколько увеличивались на фоне блокады нуклеарного фактора при инкубации фагоцитов с  кандидами, опсонизированными цельной сывороткой или IgG(p>0,05). В то же время, контакт нейтрофилов с кандидами, опосредованных через C3b/iC3b-молекулы, приводил к снижению иХЛ в 1,2 ± 0,3 раза (p< 0,05).

               Мы предположили, что подобный эффект связан с тем, что C. albicans используют уникальный механизм связывания СЗb/iC3b-молекул, после чего последние утрачивают способность к взаимодействию с СR1 и  CR3 рецепторами  на нейтрофилах (Gilmore B.J. et al., 1988). В пользу этого свидетельствовали эксперименты с  другим объектом, опсонизированным в режиме АПАК: блокада NF-B  снижала способность СЗb/iC3b-опсонизированного зимозана стимулировать нейтрофилы (p< 0,05). На фоне блокады NF-kB отмечено увеличение уровня спонтанной хемилюминесценции  нейтрофилов в 4,6 ± 2,1 раза (p< 0,05). Это указывало на сопряженность NF-kB с базовым уровнем окислительного метаболизма клеток.

Для определения роли внутриклеточных MAP- киназ (ERK1/2 и p38) проводили исследования в режиме их блокады в нейтрофилах и эпителиоцитах путем прединкубации клеток (60 мин,370С, 20μM) со специфическими ингибиторами U0126 (“Sigma”, США) (Tian W. et al.,2000) и SB203580 (“Sigma”, США) (Jiang Y. et al., 1996; Terada L. S. et al., 1999). В контроле использовали интактные клетки.

Блокада p38 и ERK1/2  существенно не меняла уровня адгезии C.albicans на буккальных эпителиоцитах и спонтанной ХЛ нейтрофилов (р>0,05), но приводила к снижению кандида-индуцированной ХЛ (иХЛ) нейтрофилов. Снижение уровня иХЛ наблюдалось при инкубации нейтрофилов с нативными кандидами (p<0,05), а в экспериментах с блокадой ERK1/2-киназы – также и с C.albicans, опсонизированными цельной сывороткой, iC3b- или IgG- молекулами (p<0,05). Разрушение термолабильных протеиновых компонентов рецепторного аппарата C.albicans (прогревание 70°С, 40 мин) не меняло уровня иХЛ фагоцитов в системах с ингибиторами MAP-киназ (р>0,05).

Фунгицидный эффект некогерентного импульсного излучения  в системах с Candida albicans

В связи с появлением  штаммов C. albicans, обладающих устойчивостью к антибиотикам (Анкирская А.С. и соавт 2006; Выборнова И.В. и соавт., 2008; Baddly J.W., Moser S.A.,2004; Cualco L. et al., 2007) несомненный интерес представляет поиск агентов и факторов, обладающих выраженной фунгицидной активностью и не приводящих к формированию  резистентных  клонов.

Действие некогерентного импульсного излучения на  Candida albicans и буккальные клетки in vitro. При воздействии НКИ (1Гц) миллисекундной длительности диапазона 180-800 нм (режим 300 секунд) на посевы кандид на агар Сабуро (в чашках Петри) нами был обнаружен биоцидный эффект в отношении тест-культур C. albicans (штаммы 601, К101/99,  441) и C. kefyr штамм 17 (рис.3). Биоцидный эффект НКИ был неспецифичен и наблюдался также в отношении бактериальных тест-культур:  S. epidermidis штамм 51-1  и  E. coli штамм 18М.

 

Рис. 3. Фунгицидный эффект НКИ (300 секунд воздействия) при облучении 

посевов культур C. albicans  штамм 601 и C. kefyr штамм 17.

Эксперименты с суспензией C. albicans показали, что биоцидный эффект отмечался, начиная с минимальных доз облучения (25 секунд) и был сильно выражен в режимах от 200 cекунд и более (р <0,05). 

Установлено, что действующим фактором НКИ, обеспечивающим фунгицидный эффект, является УФ-излучение  (около 59,6 %). Кроме того, 40,4%

активности НКИ зависит от иных факторов,  не связанных с тепловым воздей-ствием, предположительно, свободных радикалов и активных форм кислорода, образующихся в зоне газового разряда (Базелян Э.М., Ражанский И.М.,1988; Буранов С.Н. и соавт. 1995; Иванова И.П. и соавт., 2004). 

Изучено влияние некогерентного импульсного излучения на C. albicans и изолированные клетки организма человека – буккальные эпителиоциты. Эксперименты показали, что НКИ в режиме 300 секунд снижает более чем в 2 раза адгезию кандид на эпителиоцитах (р<0,05)  при обработке обоих компонентов системы. При раздельном действии  НКИ на отдельные компоненты системы  более сильное  снижение  адгезии наблюдалось  при  обработке  C. albicans, чем при воздействии на эпителиоциты (р>0,05).

       НКИ влияло не только на функционирование, но и на структуру рецепторного аппарата изучаемых клеток. Так, при действии НКИ на культуру C.albicans штамм 601 или на буккальные эпителиоциты оба типа клеток сбрасывали в среду сиалированные компоненты рецепторов. Динамика накопления  свободных сиаловых кислот в суспензии кандид значительно опережала аналогичный процесс у эпителиоцитов. Сравнительная оценка выживаемости C.albicans и буккальных эпителиоцитов после экспозиции с НКИ (в диапазоне 150-600 секунд) показала, что процент жизнеспособных (не окрашенных трипановым синим) клеток в эксперименте всегда был более низким у кандид, чем у  эпителиоцитов.

Действие  некогерентного  импульсного  излучения  при  экспериментальном  оральном  кандидозе крыс. Облучение ротовой полости НКИ (в режимах 100 или 300 секунд) у инфицированных кандидами животных проводили через 60 мин после инокуляции кандид на слизистую зева, а затем через каждые 24 ч в течение 6 суток после заражения. Контролем служили интактные (не зараженные кандидами) животные, а также крысы с оральным кандидозом, без воздействия НКИ. Каждая группа животных состояла из 14-16 особей. Выявляли наличие и количество кандид на 1-й и 7-й день после заражения.

       После воздействия НКИ количество кандид в ротовой полости инфицированных животных снижалось до  130,3 ± 72,8 КОЕ (режим 100 секунд) и 143,3 ± 97,3 КОЕ  (режим 300 секунд) по сравнению с контрольной группой (427,8 ± 228,6 КОЕ).  Показатели спонтанной и латекс-индуцированной ХЛ нейтрофилов крыс, подвергавшихся воздействию НКИ существенно не менялись у интактных (незараженных) животных (р>0,05). В то же время, облучение ротовой полости крыс с оральным кандидозом приводило к снижению изначально высоких показателей сХЛ (р<0,05), что могло быть связано со снижением интенсивности воспалительного процесса, вызванного присутствием C. albicans  в организме животных.

Результаты показали отсутствие существенных изменений в функциональной активности фагоцитов крови, уровне ПОЛ плазмы и лейкоцитарной формулы у крыс после их облучения НКИ (режим 300 секунд). Сохранение этих базовых параметров гомеостаза указывало на то, что воздействие искровым разрядом миллисекундной длительности (в исследуемом нами интервале времени воздействия) не оказывает заметного влияния на структурно-функциональное состояние внутренних органов и систем организма животных.

В Ы В О Д Ы

  1. Дрожжевая форма Candida albicans в большей мере, чем мицелиальная, взаимодействует с нейтрофилами через термолабильные рецепторы, индуцирует перестройку элементов цитоскелета (микротрубочек) и стимулирует продукцию фагоцитами активных форм кислорода. Мицелиальная и дрожжевая форма C. albicans обладают сходной способностью сорбировать на себе различные опсонические молекулы.
  2. Мицелиальная форма C. albicans, по сравнению с дрожжевой, активнее стимулирует нейтрофилы к синтезу  ИЛ-8, ИЛ-6  и продукции растворимых HLA-I. Термолабильные контакты между кандидами и нейтрофилами вносят дополнительный вклад в образование цитокинов и высвобождение молекул главного комплекса гистосовместимости.
  3. Установлена антиопсоническая активность C.albicans в системе альтернативного пути активации комплемента, которая определяется термолабильными структурами клеточной стенки грибов.  Данные структуры не препятствуют активации АПАК кандидами, но снижают эффективность опсонизации при взаимодействии с нейтрофилами.
  4. Внутрисосудистая  дестабилизация крови, индуцированная  C. albicans, вызывает острое снижение направленной миграции нейтрофилов в очаг воспаления, и, в то же время, усиливает кислород-зависимую реактивность дискретных нейтрофилов экссудата. Феномен «мобилизационной блокады» нейтрофилов не зависит от природы раздражителя, индуцирующего воспалительную реакцию, и  носит системный характер. Снижение притока нейтрофилов в очаг воспаления не связано с уменьшением их числа в крови, ослаблением общей миграционной активности и адгезивных реакций (С3b-, IgG-зависимых и неспецифических) полиморфноядерных лейкоцитов циркулирующего пула.
  5. Адгезия C. albicans на буккальных клетках зависит от уровня метаболической, белок-синтезирующей и цитоскелетной активности эпителиоцитов. Необходимым условием для реализации адгезивных контактов в системе «C. albicans – эпителиоциты» является активность белок-синтезирующего аппарата кандид. Адгезия C. albicans на буккальных эпителиоцитах находится под негативным контролем секреторных продуктов Staphylococcus aureus.
  6. Антитела слюны являются основным фактором, препятствующим адгезии кандид на буккальном эпителии. Дополнительный эффект обеспечивают температурозависимые факторы слюны, обладающие ферментативной активностью, а также прочие компоненты. Антиадгезивный эффект сыворотки в большей степени обеспечивается неспецифическими температурозависимыми факторами, не связанными с системой комплемента, и в меньшей степени – антикандидозными  антителами.
  7. Установлено отсутствие существенных различий между адгезией кандид на эпителиальных клетках взрослых и детей, а также у эпителиоцитов из разных биотопов (буккальные, вагинальные). Отсутствует корреляция между уровнем естественной обсемененности и искусственной колонизации C. albicans эпителиальных клеток. Наличие местной кандидозной инфекции (кандидомикоз, вагинальный кандидоз) не сопровождается изменением адгезивности мукозальных эпителиоцитов для C. albicans, но может  меняться в отношении бактерий нормальной микрофлоры. Выявлено усиление адгезивности эпителиоцитов к C. albicans при бронхиальной астме у детей. 
  8. Контакты с C.albicans определяют активацию в нейтрофилах внутриклеточных сигнальных путей, связанных с нуклеарным фактором kB и  митогенактивированными киназами (ERK1/2 и р38). Это ведет к образованию нейтрофилами активных форм кислорода. Адгезивность эпителиоцитов в системах с C.albicans усиливается после индуцированной кандидами активации нуклеарного фактора kB,  но не меняется при активации митогенактивированных киназ.
  9. Некогерентное  импульсное излучение миллисекундной длительности обладает доза-зависимым фунгицидным эффектом в отношении C.albicans. Деструктивный эффект НКИ селективен: он более выражен в отношении кандид, чем в отношении клеток макрорганизма.
ПРАКТИЧЕСКИЕ  РЕКОМЕНДАЦИИ

Буккальные и вагинальные эпителиоциты можно взаимозаменяемо применять при изучении естественной и искусственной колонизации клеток слизистых оболочек. Показатель искусственной колонизации C.albicans на эпителиоцитах может быть использован в качестве одного из индикаторов гомеостаза при соматических патологиях.

Рекомендуется применение некогерентного импульсного излучения миллисекундной длительности в течение 5-10 минут  (частота 1 Гц) с целью локальной дезинфекции рабочих поверхностей, биологических субстратов и эпителиальных покровов.

Экспериментальная тест-система «искусственная колонизация C.albicans на буккальных эпителиоцитах» может применяться для оценки антиадгезивного эффекта, биоцидности, селективной токсичности физических факторов и дезинфектантов в отношении клеток грибов и человека.

Список  работ, опубликованных по теме диссертации:

        1. Чеботарь И.В,  Заславская М.И., Конышкина Т.М., Маянский А.Н.  IgG- и C3b- зависимая адгезия нейтрофилов в системах с аллогенными и ксеногенными лигандами // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 1991. – № 10. – С. 403-404.
        2. Маянский А.Н., Заславская М.И., Невмятуллин А.Л., Конышкина Т.М. Люминолзависимая  хемилюминесценция в оценке эволюции  и эффекторных возможностей воспалительного процесса // Люминесцентный анализ  в  медицине  и  биологии и его аппаратурное обеспечение: сборник тезисов докладов IV  всесоюзного  совещания. – М., 1992. – Вып. 4. – С. 74-75.
        3. Маянский Н.А., Заславская М.И, Маянский А.Н. Апоптоз экссудативных  нейтрофилов человека // Иммунология. – 2000. – № 2. – С. 11-13.
        4. Заславская М.И., Зеленова Е.Г. Иммунопатогенетические аспекты кандидоза новорожденных и детей раннего возраста // Состояние здоровья и организация медицинского обслуживания детей, подростков, учащейся и рабочей  молодежи: сборник научных трудов Нижегородской медицинской академии / Под ред. Н.А. Камаева. – Нижний Новгород, 2001. – С. 240-245.
        5. Заславская М.И., Плескова С.Н., Миронов А.А., Гущина Ю.Ю. Определение структурно-функционального состояния цитоплазматической мембраны клеток крови человека методом сканирующей зондовой микроскопии  в системах in vitro // Биология-наука-XXI века: сборник тезисов докладов 5-й  Пущинской конференции молодых ученых, 16-20 апреля 2001. – Пущино, 2001. – С. 129.
        6. Pleskova S.N., Zaslavskaja M.I., Guschina Yu.Yu., Koksharov I.A., Erastova Yu.G.  Morphological investigation of human blood neutrophil phagocytosis in vitro by AFM // Physics of Low-Dimentional Structures. – 2001. – № 3/4. – Р. 229-236. – ISSN 0204-3467.
        7. Зеленова Е.Г., Заславская М.И., Махрова Т.В. Кандиды: экология, морфо-функциональные особенности и факторы патогенности // Нижегородский  медицинский журнал.  – 2002. – № 1. – С. 73-84. – ISSN 0869-0936.
        8. Махрова Т.В., Заславская М.И. Штаммовая харатеристика Candida albicans в адгезивных реакциях с буккальными эпителиоцитами // Современная  микология в России: тезисы докладов первого съезда микологов России. ­– М., 2002. ­– С. 368.
        9. Маянский А.Н., Заславская М.И., Салина Е.В., Абаджиди М.А., Ашкинази В.И., Махрова Т.В. Феномен избирательного ослабления колонизационной (адгезивной ) резистентности в системе «Candida  albicans – буккальные  эпителиоциты» // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. – 2002. – №  4. – С. 17-20.
        10. Маянский А.Н., Салина Е.В., Абаджиди М.А., Ашкинази В.И., Заславская М.И. Адгезивные реакции буккальных эпителиоцитов на Candida albicans у детей с бронхиальной астмой и гастродуоденитом // Педиатрия. – 2002. – №  3. – С. 41-43.
        11. Абаджиди М.А., Махрова Т.В., Маянская И.В., Заславская М.И., Маянский А.Н. Буккальные эпителиоциты как инструмент клинико-лабораторных  исследований // Нижегородский медицинский журнал. – 2003. – N. 3-4. ­–­ С. 105-110. – ISSN 0869-0936.
        12. Заславская М.И.,  Махрова Т.В., Салина Е.В., Маянский А.Н. Адгезивные реакции Candida albicans в условиях кондиционирования метаболической  активности эпителиоцитов // Успехи медицинской микологии: материалы  первого всероссийского конгресса по медицинской микологии. – М., 2003. –  Т. 1. – С. 358.
        13. Махрова Т.В., Заславская М.И., Маянский А.Н. Антиадгезивный эффект  слюны в системе «Candida albicans -  буккальные (щечные) эпителиоциты» // Проблемы медицинской микологии: тезисы докладов VI научно-практической конференции по медицинской микологии. – 2003. – Т. 5. – №  2. – С. 44-45.
        14. Маянский А.Н., Салина Е.В., Заславская М.И. Способ оценки прочности адгезии Candida albicans на эпителиоцитах // Клиническая лабораторная диагностика. – 2003.­ – №  2. – С. 53-54. – ISSN 0869-2084.
        15. Заславская М.И., Иванова И.П., Спиров Г.М. Влияние некогерентного импульсного излучения на реактивность нейтрофилов и перикисное окисление липидов крови крыс с оральным кандидозом // Актуальные проблемы  биологии: сборник научных работ Сибирского государственного  университета. – Томск, 2004. ­– Т. 3. – №  1. – С. 78-79.
        16. Заславская М.И.,  Иванова И.П., Спиров Г.М. Фунгицидный эффект  некогерентного импульсного излучения видимого диапазона света в системах с  Candida albicans // Вестник Санкт-петербургской медицинской академии им. И.И. Мечникова – 2004. – №  3. – Вып. 5. – С. 54-56. – ISSN 0371-9367.
        17. Заславская М.И.,  Махрова Т.В., Маянский А.Н. Механизм антиадгезивного эффекта сыворотки крови в системе «кандиды-буккальные эпителиоциты» // Естествознание и гуманизм: сборник научных работ Сибирского  государственного университета. – Томск, 2004. – Т. 4. – № 1. – С. 68.
        18. Заславская М.И.,  Махрова T.В., Маянский А.Н. Реактивность Candida albicans в системе альтернативного пути активации комплемента // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. – 2004. – № 5. – С. 80-84.
        19. Заславская М.И., Маянский А.Н.  Мобилизационная  блокада  нейтрофилов на  фоне  внутрисосудистой  дестабилизации  крови,  индуцированной Candida albicans // Успехи медицинской микологии: материалы второго всероссийского конгресса по медицинской микологии. – М., 2004 – Т. 4. – С. 83-84.
        20. Заславская М.И., Маянский А.Н. Нейтрофилзависимая воспалительная реакция на фоне внутрисосудистой дестабилизации крови, индуцированной Candida albicans // Проблемы медицинской микологии. – 2004. – T. 6. – №  4. – С. 24-25.
        21. Заславская  М.И.,  Маянский А.Н.  Элиминационные ресурсы очага воспаления на фоне внутрисосудистой дестабилизации крови, индуцированной Candida albicans // Проблемы медицинской микологии: тезисы докладов VII научно-практической конференции по медицинской микологии. – 2004. – Т. 6. – № 2. – С. 80.
        22. Заславская М.И., Строгова Ю.Ю., Поляшова А.С., Махрова Е.В. Естественная и Candida-зависимая колонизация буккального эпителия взрослых  в системах in vitro // Проблемы медицинской микологии: тезисы докладов VII научно-практической конференции по медицинской микологии. – 2004. – Т. 6. – №  2. – С. 80-81.
        23. Заславская М.И. Функциональный резерв очага острого воспаления на фоне внутрисосудистой дестабилизации крови  // Актуальные проблемы биологии, медицины и экологии: сборник научных работ Сибирского государственного университета. – Томск, 2004. – Т. 4. – №  1. – С. 106.
        24. Зеленова Е.Г., Заславская М.И., Салина Е.В., Рассанов С.П. Микрофлора  полости рта: норма и патология: Учебное пособие. Лекции для студентов стоматологического факультета // Нижний Новгород : НГМА, 2004. – 158 с. Утверждено: УМО-248 от 24.04.03.
        25. Иванова И.П.,  Заславская М.И., Зуймач Е.А. Влияние некогерентного  импульсного излучения на активность фагоцитоза и ПОЛ крови крыс с оральным кандидозом // Материалы 3-го съезда биофизиков России, 24-29  июня 2004. – Воронеж, 2004. – С. 650-651.
        26. Иванова И.П.,  Заславская М.И. Оральный кандидоз крыс на фоне некогерентного импульсного излучения // Проблемы медицинской микологии: тезисы докладов VII научно-практической конференции по медицинской микологии. – 2004. – Т. 6. – № 2. – С. 82-83.
        27. Махрова T.В.,  Заславская М.И., Маянский А.Н. Влияние метаболитов стафилококка на адгезивные реакции в системе «Candida albicans -  буккальные  эпителиоциты» // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. – 2004. – №  5. – С. 4-7.
        28. Махрова Т.В.,  Заславская М.И., Маянский А.Н. Участие цитоскелета  буккальных эпителиоцитов в адгезивных реакциях с Candida albicans //  Проблемы медицинской микологии: тезисы докладов VII научно-практической конференции по медицинской микологии. – 2004. – Т. 6. – №  2. – С. 100.
        29. Махрова Т.В., Маянский А.Н., Шмелева Е.А., Заславская М.И. Влияние TLR-рецепторов на адгезивные реакции в системе «Candida albicans -  буккальные эпителиоциты» // Актуальные вопросы инфекционной патологии человека, клинической и прикладной иммунологии: материалы научной конференции молодых ученых. – Уфа, 2004. – С. 252-253.
        30. Маянский Н.А., Абаджиди М.А., Маянская И.В., Заславская М.И., Махрова Т.В. Реактивность буккальных эпителиоцитов: индикация местных и общих нарушений гомеостаза // Клиническая лабораторная диагностика. – 2004. – № 8. – С. 31-34. – ISSN 0869-2084.
        31. Строгова Ю.Ю., Махрова Е.В., Поляшова А.С., Заславская М.И. Влияние нормальной  микрофлоры буккального эпителия взрослых и детей на адгезивные реакции Candida albicans в системах in vitro // Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины: материалы III конференции  молодых ученых России с международным участием, 20-24 января 2004. – М., 2004. – С. 167-168.
        32. Заславская М.И.,  Иванова И.П. Фунгицидный эффект  некогерентного импульсного излучения при экспериментальном оральном кандидозе крыс // Проблемы медицинской микологии: тезисы докладов VIII научно-практической конференции по медицинской микологии. – 2005. – Т. 6. – № 2. – С. 285.
        33. Заславская М.И. Роль  митоген-активированных киназ в адгезивных взаимодействиях  нейтрофилов и буккальных эпителиоцитов человека  с  Candida albicans (Robin) Berkhout // Проблемы медицинской микологии. – 2005. – Т. 7. –  № 3. – С. 30-33.
        34. Иванова И.П.,  Заславская М.И. Кандидацидный эффект некогерентного импульсного света // Успехи медицинской микологии: материалы третьего всероссийского конгресса по медицинской микологии. – М., 2005. – Т.5. – С.298-300. 
        35. Иванова И.П.,  Заславская М.И. Механизм фунгицидного эффекта высокоэнергетического импульсного излучения // Проблемы медицинской микологии: тезисы докладов VIII научно-практической конференции по  медицинской микологии. – 2005. – Т. 6. – №  2. – С. 286.
        36. Иванова И.П.,  Заславская М.И. Озон и активные формы кислорода  высокоэнергетических импульсных разрядов  // Нижегородский медицинский журнал. Приложение. Озонотерапия. – 2005. – С. 30. – ISSN 0869-0936.
        37. Иванова И.П.,  Заславская М.И. Озон и ультрафиолетовое излучение как  биоцидные факторы высокоэнергетического импульсного некогерентного излучения // Нижегородский медицинский журнал. Приложение. Озонотерапия. – 2005. – С. 29. – ISSN 0869-0936.
        38. Иванова И.П., Заславская М.И., Спиров Г.М., Шлепкин С.И. Бактерицидные свойства высокоэнергетических импульсных разрядов // Высокоинтенсивные физические факторы в биологии, медицине, сельском хозяйстве и экологии: труды международной конференции,  26-28 апреля 2004. – Саров: РФЯЦ-ВНИИЭФ., 2005. – С. 144-148.
        39. Махрова T.В.,  Маянский А.Н., Заславская М.И. Некоторые механизмы  антиадгезивного эффекта секрета ротовой полости в системе «Candida  albicans – буккальные эпителиоциты» // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. – 2005. – №  2. – С.11-14.
        40. Маянский А.Н., Заславская М.И., Зеленова Е.Г., Салина Е.В., Строгова Ю.Ю., Рассанов С.П., Малышева Э.Ф. Адгезивные реакции буккальных  эпителиоцитов в индикации нарушений местного и общего гомеостаза // Нижегородский медицинский журнал. – 2005. – № 1. – С. 158-161. – ISSN 0869-0936.
        41. Zaslavskaya M.I. Applied microbiology and immunology. Textbook for the international English speaking medical students – Nizhny Novgorod: NSMA, 2005. – 60 p. Утверждено: УМО-49 от 21.06.06.
        42. Заславская М.И.,  Воронова Н.Ю. Нейтрофил-зависимая продукция ИЛ-8, индуцированная дрожжевой и гифальной формами Candida albicans // Проблемы медицинской микологии: тезисы докладов IX научно-практической конференции по медицинской микологии. – 2006. – Т. 8. – № 2. – С. 41-42.
        43. Заславская М.И., Каткова Н.Ю. Адгезивные реакции эпителиоцитов у беременных женщин с вагинальным кандидозом  // Успехи медицинской микологии: материалы четвертого всероссийского конгресса по медицинской микологии. – М., 2006. – Т. 7. – С. 46-47.
        44. Заславская М.И., Крыжанова М.А., Новиков В.В. Уровень растворимых молекул гистосовместимости I класса при взаимодействии нейтрофилов крови человека с дрожжевой и гифальной формами  Candida albicans // Успехи медицинской микологии : материалы  четвертого всероссийского конгресса по медицинской микологии. – М., 2006. – Т. 7. – С. 48-49.
        45. Заславская М.И., Махрова Т.В., Зеленова Е.Г., Салина Е.В. Прикладная  микробиология и иммунология: руководство к практическим занятиям для студентов высшего сестринского образования. – Нижний Новгород : НГМА, 2006. – 112 с. Утверждено: УМО-411 от 21.06.06.
        46. Заславская М.И.,  Маянский А.Н. Нейтрофилзависимое воспаление на фоне дестабилизации внутрисосудистого гомеостаза // Цитокины и воспаление. – 2006. – Т. 5. – №  1. – С. 50-52.
        47. Заславская М.И.,  Маянский А.Н. Нейтрофил-стимулирующая активность дрожжевой и гифальной форм Candida albicans (Robin) Berkhout // Проблемы медицинской микологии. – 2006. – Т. 8. – № 3. – С. 40-44.
        48. Заславская М.И.,  Новиков В.В. Продукция нейтрофилами растворимых HLA-I при взаимодействии с дрожжевой  и гифальной формами  Candida albicans // Проблемы медицинской микологии: тезисы докладов IX научно-практической конференции по медицинской микологии. – 2006. – Т. 8. – № 2. – С. 42.
        49. Иванова И.П.,  Заславская М.И. Действие некогерентного импульсного излучения на сиаловые кислоты и адгезивные свойства в системе «Candida  albicans - буккальные эпителиоциты» // Проблемы медицинской микологии: тезисы докладов IX научно-практической конференции по медицинской микологии. – 2006. – Т. 8. – № 2. – С. 43-44.
        50. Заславская М.И.,  Маянский А.Н. Роль нуклеарного фактора-κВ в обеспечении взаимодействий нейтрофилов и клеток эпителия слизистой полости рта человека с Candida albicans // Журнал микробиологии, эпидемиологии и  иммунобиологии. – 2007. – № 5. – С. 61-65.
        51. Заславская М.И., Мишина Ю.В. Адгезивные реакции буккальных эпителиоцитов у пациентов с кандидозным онихомикозом // Материалы  научных трудов симпозиума национального альянса дерматологов и  косметологов, 21-23 ноября 2007. – СПб., 2007. – С. 66-67.
        52. Маянский А.Н., Маянский Н.А., Заславская М.И. Нуклеарный фактор-κВ и воспаление // Цитокины и воспаление. – 2007. – Т.6. – №  2. – С. 61-65.
        53. Заславская М.И., Лукова О.А. Роль нуклеарного фактора-κВ в обеспечении контакта  эпителиоцитов с Candida albicans // Проблемы медицинской  микологии: тезисы докладов XI научно-практической конференции по  медицинской микологии. – 2008. – Т. 10. – №  2. – С. 44.
        54. Заславская М.И., Мишина Ю.В., Лукова О.А. Адгезивные реакции буккальных эпителиоцитов у пациентов детского возраста с онихопатиями // Современная микология в России: материалы второго съезда микологов России.- М., 2008. - С. 429.
        55. Иванова И.П., Заславская М.И., Спиров Г.М. Способ дезинфекции биологических субстратов и эпителиальных покровов // Положительное решение о выдаче патента: от 28.03.2008, № заявки 2007118899/15 (020587).

Благодарности

Автор выражает глубокую благодарность научному консультанту проф. Маянскому  А.Н. за ценные советы на различных этапах выполнения работы.

Автор  признателен сотрудникам Российского Федерального ядерного центра (РФЯЦ ВНИИЭФ, г. Саров)  нач. отд. Спирову Г.М. и ведущему инженеру Шлепкину С.И., а также зав. научной проблемной группой НИИ ПФМ при ГОУ ВПО НижГМА Ивановой И.П. за помощь в организации проведения экспериментов с источником некогерентного импульсного излучения.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АПАК

альтернативный путь активации комплемента

ДДС

додецилсульфат натрия

ЗФР

забуференный  физиологический раствор

ИЛ

интерлейкин

ИФА

иммуноферментный анализ

КОЕ

колониеобразующая единица

НКИ

некогерентное импульсное излучение

ПМЛ        

полиморфноядерный лейкоцит (нейтрофил)

ПОЛ

перекисное окисление липидов

РЭМА

реакция энзиммеченных антител

УФ

ультрафиолетовое излучение

ХЛ

Хемилюминесценция

иХЛ

индуцированная хемилюминесценция

сХЛ

спонтанная хемилюминесценция

CR

cell receptor – клеточный рецептор

MAP

митогенактивированные протеинкиназы

NF-kB

нуклеарный фактор kB

sHLA-I

растворимые (внеклеточные) молекулы главного комплекса

гистосовместимости человека I класса






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.