WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


На правах рукописи

КИРЕЕВ ИГОРЬ ИГОРЕВИЧ

ВЫСШИЕ УРОВНИ ОРГАНИЗАЦИИ ГЕНЕТИЧЕСКОГО АППАРАТА ЭУКАРИОТ И РЕГУЛЯЦИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ГЕНОМА

03.03.04 – Клеточная биология, цитология, гистология А в т о р е ф е р а т диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва – 2011

Работа выполнена в Отделе электронной микроскопии Института физикохимической биологии им. А.Н. Белозерского (директор – академик РАН, профессор В.П. Скулачёв) Московского Государственного Университета им.

М.В. Ломоносова.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Онищенко Галина Евгеньевна, доктор биологических наук, профессор Коломиец Оксана Леонидовна, доктор биологических наук, профессор Зеленин Александр Владимирович.

Ведущая организация: Институт биологии развития РАН

Защита диссертации состоится « » ___________ 2011 г. в ____ часов на заседании диссертационного совета Д 501.001.52 при Московском Государственном Университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские горы, МГУ, Биологический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан « » ___________ 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного Совета кандидат биологических наук Калистратова Е.Н.

1. ВВЕДЕНИЕ Значительное увеличение размеров и сложности генома в процессе эволюции повысило важность решения проблемы упорядоченной пространственной организации генетического материала и его аккуратной сегрегации в ходе деления клетки у высших эукариот. Это достигается многоуровневой упаковкой ДНК в сложный нуклеопротеидный комплекс — хроматин. Вершиной такой упаковки являются митотические хромосомы, степень компактизации ДНК в которых на стадии метафазы достигает 104. Важную роль в упорядоченной укладке ДНК в составе хроматина играют как гистоны, так и негистоновые белки, причем до недавнего времени считалось, что гистоны выполняют исключительно структурную роль, обеспечивая упаковку ДНК на низших уровнях компактизации - в составе нуклеосом и 30-нм фибрилл хроматина. Дальнейший способ упаковки 30-нм фибриллы и формирование т.н. высших уровней организации хроматина до сих пор остаются предметом дискуссий. Неполнота и противоречивость сведений о пространственной организации хроматина существенно осложняют адекватную интерпретацию биохимических и генетических данных о молекулярных механизмах, лежащих в основе процессов компактизации/декомпактизации хроматина. Например, прогресс в исследовании функциональной роли «архитектурных» негистоновых хромосомных белков, таких как топоизомераза II и белки конденсинового комплекса, существенно тормозится из-за того, что изучение характера их взаимодействия с хромосомами проводили преимущественно в системах in vitro, а также в условиях искусственной деконденсации хромосом (Earnshaw, Heck, 1983; Hirano, Mitchison, 1994; Maeshima et al, 2005). Поскольку данные об ультраструктурной локализации этих важнейших структурных компонентов хромосом в контексте нативного хроматина практически отсутствуют, многие аспекты структурно-функциональной организации и динамики хромосом в митозе остаются непонятными.



Следует отметить, что сложности в исследовании структуры хромосом обусловлены не в последнюю очередь особенностями их организации. Так, высокая плотность упаковки хроматина не позволяет непосредственно проследить характер укладки хроматиновых фибрилл разного уровня в составе компактизованных метафазных хромосом. Это обстоятельство и является главной причиной популярности экспериментальных подходов, использующих различные методы декомпактизации хроматина (Paulson, Laemmli, 1977; Brinkley et al, 1980;

Zatsepina et al., 1983). В то же время, значительные структурные перестройки хроматина, происходящие даже в достаточно узком диапазоне изменений состава окружающей среды, могут не отражать истинной природы хромосом, а сами эти подходы могут служить потенциальным источником артефактов. Это особенно актуально для высших уровней организации хроматина, демонстрирующих высокую лабильность в системах in vivo и in vitro. В связи с этим, особое значение приобретает разработка методических подходов, направленных на исследование организации хроматина в его нативном состоянии. Дополнительные сложности в решении данной задачи связаны с тем, что структурная организация хроматина не монотонна: различные участки генома различаются по характеру упаковки ДНК, и эти различия связаны с функциональным состоянием генных локусов. Классическим примером может служить подразделение интерфазного хроматина на слабо компактизованный, транскрипционно активный эухроматин и плотно упакованный, инертный в отношение экспрессии генетической информации гетерохроматин. Различия в структурном состоянии эу- и гетерохроматина становятся менее очевидными при переходе от интерфазы к митозу, однако фундаментальные особенности структуры этих фракций генома по-видимому, сохраняются. В связи с этим особенно важно иметь возможность исследовать особенности структурной организации индивидуальных хромосомных локусов в составе нативного хроматина. Для решения такой задачи требуются новые методические подходы, поскольку используемые в настоящее время методы гибридизации in situ не позволяют в должной степени сохранить интактной тонкую структуру хромосом. Одним из таких подходов является конструирование искусственных хромосомных локусов, визуализуемых при помощи системы lac-опреатор/lac-репрессор как in situ, так и in vivo (Robinett et al, 1996).

Однако биологическое значение высших уровней организации хромосом эукариот не ограничивается необходимостью компактизации длинных молекул ДНК для аккуратной трансмиссии генетической информации в процессе клеточного деления. Сложно организованный и плотно упакованный хроматин неизбежно создает топологические проблемы при репликации ДНК, что требует точной координации процесса синтеза ДНК со структурными преобразованиями реплицирующегося хроматина. Отсутствие детальной информации об организации хроматиновых структур высшего порядка ограничивает выработку единой точки зрения на пространственно-временную организацию процесса синтеза ДНК и механизмы пострепликативной сегрегации сестринских хроматид.

Cтруктурное состояние хроматина также является важным элементом системы эпигенетической регуляции экспрессии генов. Роль упаковки хроматина проявляется как на уровне контроля доступности ДНК для связывания трансфакторов за счет ограничения диффузии (John et al, 2011), так и на уровне модуляции их взаимодействий с хроматиновой матрицей через посттрансляционные модификации гистонов (Allis et al, 2007). В последнее время становится все более очевидным, что и высшие уровни компактизации хроматина, и даже позиционирование хромосомных локусов или целых хромосом в трехмерном пространстве интерфазного ядра представляют собой дополнительные уровни эпигенетического контроля, однако механизмы реализации такого рода регуляции, и способы поддержания эпигенетических состояний, связанных с пространственной организацией интерфазного хроматина, в ряду клеточных делений или остаются гораздо менее исследованными. Очевидно, что ответы на эти вопросы не могут быть даны без полного понимания принципов структурной организации хроматина на этих надмолекулярных уровнях.

1.2. Цель и задачи работы.

Целью настоящей работы было исследование формирования высших уровней организации хроматина в процессе митотической компактизации хромосом и роли «архитектурных» белков хромосом в этом процессе, а также изучение взаимосвязи структурной организации хроматина и его функционального состояния, в первую очередь, в отношение транскрипционной и репликативной активности.

Конкретные задачи работы состояли в следующем:

- 1) провести сравнительный ультраструктурный анализ и исследовать особенности высших уровней компактизации ДНК в хроматиновых доменах с различным генетическим статусом (эухроматин, факультативный и конститутивный гетерохроматин), используя инактивированную Х-хромосому и прицентромерный гетерохроматин (хромоцентры) в качестве модели.

2) исследовать динамику высших уровней организации хроматина в процессе репликации ДНК и характер пострепликативных структурных преобразований хроматина.

3) изучить топологию рано реплицирующегося, транскрипционно активного эухроматина и поздно реплицирующегося, молчащего гетерохроматина в митотических хромосомах 4) исследовать на ультраструктурном уровне структурные преобразования хроматина при активации транскрипции, используя в качестве модели искусственные генные локусы, визуализуемые in vivo.

5) изучить динамику митотической компактизации хроматина на ультраструктурном уровне и процесс формирования высших уровней организации хроматина в ходе естественной компактизации.

6) исследовать роль Ca++ в формировании высших уровней компактизации хроматина в живых клетках 7) исследовать топологию основных архитектурных белковых компонентов хромосом - конденсинового комплекса и топоизомеразы II в ход митотической компактизации хроматина и установить их связь с формирование высших уровней компактизации хромосом.

8) исследовать динамику конденсинового комплекса при искусственно индуцированных изменениях характера компактизации хромосом в живых клетках 9) исследовать топологию конденсинового комплекса в мейотических хромосомах.

1.3. Научная новизна работы.

В работе было впервые проведено детальное ультраструктурное исследование динамики формирования высших уровней компактизации хромосом млекопитающих в профазе митоза. Обнаружено, что митотическая компактизация происходит с образованием как минимум двух промежуточных уровней — хроматиновых фибрилл диаметром 200-250 нм и 400 нм.

Впервые исследована трехмерная организация доменов факультативного гетерохроматина, соответствующих неактивной Х-хромосоме человека. Показано, что инактивация сопровождается упаковкой хроматина в фибриллы диаметром 200-400 нм, при сохранении доступности внутренних областей Xi для транс-факторов.

Показано, что репликативные кластеры в поздно-реплицирующемся гетерохроматине соответствуют хроматиновым доменам диаметром 250-300 нм.

Репликация не требует глобальной деконденсации плотно упакованных доменов, и репликативные комплексы распределены равномерно в объеме реплицирующегося домена, не формируя репликативные фабрики.

Исследована динамика основных архитектурных белков хроматина топоизомеразы II и конденсинов в процессе профазной компактизации хромосом, а также в экспериментальных условиях, вызывающих изменение степени компактизации хромосом in vivo. На основании полученных данных предложена новая модель структурной организации митотических хромосом.

Впервые продемонстрирована локализация субъединиц конденсина в тельцах Кахаля, а также явление независимой локализации индивидуальных субъединиц конденсинового комплекса в различных структурно-функциональных доменах ядра.

Разработан новый метод in vivo иммуномечения клеточных белков наночастицами золота, и с помощью данного метода впервые удалось визуализовать на ультраструктурном уровне характер упаковки индивидуальных хромосомных локусов в виде хроматиновых фибрилл высшего порядка в интактных клетках.

Разработан метод индукции линейной и поперечной дифференциации митотических хромосом и впервые продемонстрированы различия в организации рано- и поздно реплицирующихся хроматиновых доменов относительно хромосомной оси.

Впервые в интактных клетках показано, что индукция транскрипции эухроматиновых генов сопровождается частичной деконденсацией высших уровней организации хроматина. В то же время, транскрипция может осуществляться на плотно упакованной хроматиновой матрице.

Впервые прижизненно прослежена динамика ассоциации генов с кластерами интерхроматиновых гранул при активации транскрипции, а также продемонстрирована высокая локальная мобильность транскрибирующихся хромосомных локусов. На основании полученных данных предложена новая модель организации процесса транскрипции в контексте нативного хроматина.

1.4. Научно-практическая ценность работы.

Настоящая работа является фундаментальным научным исследованием. В ходе ее выполнения получены новые данные об организации генетического аппарата высших эукариот и о структурных перестройках высших уровней упаковки ДНК в хромосомах, сопровождающих протекание фундаментальных биологических процессов, связанных с экспрессией, репликацией и сегрегацией генетического материала клетки. Эти данные позволяют расширить наши представления о структурно-функциональной организации генома, а также в перспективе использовать полученные сведения для разработки подходов для коррекции различных патологических процессов, связанных с нарушениями структурного состояния хроматина.

Разработанные автором методы фотостабилизации хроматина, in vivo-иммуномечения могут быть использованы и уже успешно применяются в различных цитологических исследованиях (Kanazawa et al, 2011) Результаты работы включены в учебные курсы для студентов Биологического факультета, факультета биоинформатики и биоинженерии, химического факультета МГУ, для слушателей научно-образовательного центра по нанотехнологиям МГУ, Биологического факультета Университета штата Иллиноис (Урбана-Шампейн, США).

1.5. Апробация работы.

Материалы диссертации были представлены на Европейском совещании по структуре и функции ядра памяти В.Бернара (1989, 1999, 2003); Конгрессе Европейского общества по фотобиологии (Кембридж, Великобритания, 1995);

Съезде Британского общества клеточных биологов (Кентербери, 1995); Совещании EMBO по структуре и функции клеточного ядра (Прага, Чехия, 1999).

Европейского конгресса по клеточной биологии (Прага, Чехия, 1994); Конференциях Американского общества клеточных биологов (2001, 2002, 2008); Симпозиуме Европейского общества гистохимии (Прага, Чехия, 2010), 17 Международной хромосомной конференции (Бун, США, 2009), 3 Конференции памяти Марии Кюри по архитектуре генома в связи с патологией (Эдинбург, 2009), Всесоюзных (всероссийских) симпозиумах ”Структура и функция клеточного ядра” и «Биология клетки в культуре» (1990, 1997, 2010), 1-ом Съезде Российского общества клеточных биологов (С-Петербург, 2003), а также на семинарах Московского общества клеточных биологов, НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ, Биологического факультета Университета Ренна (Франция), Департамента клеточной биологии и биологии развития Университета Палермо (Италия), кафедры цитологии и гистологии Биологического факультета МГУ.

2. КРАТКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ОБЪЕКТОВ И МЕТОДОВ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Принятые сокращения: АТ – антитела; ИФ – иммунофлуоресценция; ЭМ – электронная микроскопия; BrdU – бромдезоксиуридин; EdU - этинилдезоксиуридин; FISH – флуоресцентная гибридизация in situ, PBS – физиологический фосфатный буферный раствор, GFP – зеленый флуоресцирующий белок.

В работе были использованы несколько типов клеточных культур, включая клетки человека (HeLa, WI-38), свиньи (СПЭВ), шпорцевой лягушки (XL2), мыши (эмбриональные фибробласты), китайского хомячка (CHO K1, CHO DG44). Также были получены субклоны линии CHO, несущие интегрированные в геном трансгенные конструкции, содержащие тандемные повторы lac-оператора. Визуализация трансгенных локусов in vivo осуществлялась при помощи экспрессии в этих клетках GFP-Lac-репрессора (Robinett et al., 1996). Культивирование клеток и процедуры сихронизации клеточных популяций осуществлялись по описанным ранее методам (Li et al., 1998, Uzbekov et al., 1998). Получение препаратов распластанных зародышевых пузырьков ооцитов Xenopus laevis и иммунофлуоресцентный анализ хромосом типа «ламповые щетки» проводили по стандартной методике (Beenders et al, 2003).

Приготовление препаратов для иммунофлуоресцентной микроскопии и FISH, а также методы флуоресцентной 3D-микроскопии описано в нескольких публикациях (Uzbekov et al, 2003; Kireeva et al, 2004; Rego et al, 2008; Hu et al, 2009). Электронномикроскопический анализ проводили на ультратонких срезах по стандартной методике, а также с использованием микроинъекции первичных антител, коньюгированных с наночастицами золота. Микроинъекцию осуществляли с помощью микроинъектора IM300 (Nikon, Япония) и микроманипулятора MO-202U (Narishige, Япония), смонтированного на инвертированом флуоресцентном микроскопе IMT-2 (Olympus, Япония). Электронно микроскопические исследования проводили на микроскопах HU-11B, HU-12 и H-700 (Hitachi, Япония). Анализ 3D-организации хроматина проводили методами реконструкции по серийным ультратонким срезам (регистрация и препроцессинг изображений и создание трехмерных моделей проводились при помощи ImageJ и Matlab) или по угловым проекциям полутонких (500-нм) срезов при 200кВ в микроскопе Philips CM200 (FEI, Нидерланды), оборудованном гониометром с большими углами наклона (Gatan, США) и CCD-камерой TemCam-F224 (TVIPS, Германия).

Прижизненные наблюдения проводились в проточной камере FCS(Bioptechs, США) на автоматизарованном инвертированном микроскопе Axiovert 100M (Zeiss, Германия) под контролем программы ISee (Innovision) (Carpenter et al, 2004).

3. РЕЗУЛЬТАТЫ.

3.1. Структурные мотивы высшего порядка в организации факультативного гетерохроматина Неактивная Х-хромосома (Хi), являющаюся классическим примером факультативного гетерохроматина, в интерфазном ядре представлена в виде гетеропикнического тельца Барра. В первичных человеческих фибробластах WI-38 (XX) доля клеток с тельцами Барра, детектируемого как единственная компактная ядерная структура, ярко окрашиваемая красителем ДАПИ или антителами против H3-3mK27. Доля клеток с четко выявляемым тельцем Барра была максимальной в конфлюэнтной культуре через 10 дней после пересева и достигала 85% (95% при применении алгоритмов деконволюции). Размеры Xi в таких клетках составляли 2.7 мкм2 против 3.4 мкм2 в клетках, находившихся в логрифмической фазе роста. Для оптимизации протоколов пробоподготовки для иммуноэлектронной микроскопии с целью максимальной сохранности нативной структуры Xi и получения удовлетворитель-ного контраста хроматина, хроматин в клетках WI-38 метили при помощи экспрессии GFP-H2B и сравнивали конформацию Xi in vivo и после пермеабилизации и фиксации клеток Б в различных условиях.

Флуоресцентная микроскопия высокого разрешения с применением деконволюции показала, что в живых клетках тельце Барра имеет фибриллярную структуру с толщиной фибрилл от 200 до 4нм. Сравнительный анализ показал, что Рис. 1: Оптический срез живой клетки, наибольшей сохранности экспрессирующей гистон H2B-GFP, после этих структурных элемендеконволюции. В составе тельца Барра тов можно достичь при выявляются субструктуры размеров 200-400 нм.

пермеабилизации в буфере А с дополнительной фотостабилизацией с использованием в качестве сенсибилизатора бромистого этидия. Ультраструктурный анализ клеток, фиксированных 2% глутаральдегидом, и клеток, пермеабилизованных после фотостабилизации, показал наличие в ядрах четко различимых компактных хроматиновых доменов, по размерам, структуре и содержанию H3-3mK27 соответствующих тельцам Барра (рис.2).

Анализ серийных срезов показал, что факультативный гетерохроматин Xi не является сплошной массой хроматина, а представляет собой аггломерат плотно упакованных хроматиновых фибрилл высшего порядка, отличающихся существенно большим диаметром в сравнении А Б с фибриллами хроматина в других районах ядра. В составе Xi выявлялись пространственно обособленные хроматиновые фириллы толщиной от 30 до 400 нм, с 50-400 нм промежутками между ними (рис.2).

Прямое сравнение организации факультативного и В конститутивного хроматина мы провели на модели эмбриональных фибробластов мыши (МЭФ XX). которые содержат крупные легко идентифицируемые хромоцентры, образованные слиянием прицентромерного хроматина нескольких хромосом. Тельца Барра в МЭФ идентифицировали по иммуноокрашиванию H3-3mK27. Анализ полных серий ультраРис. 2. А) Ультраструктура тельца Барра после тонких срезов ядер фотостабилизации и пермеабилизации в показал, что полиаминовом буфере. Б) Идентификация Xi ультраструктура телец (стрелка) при помощи иммуноэлектронной Барра в МЭФ очень помикроскопии с антителами против H3-3mK27, В) хожа на таковую Компьютерная модель тельца Барра, построенная клеток человека. В них на основе серийных ультратонких срезов.

выявлялись относительно рыхло упакованные гетерохроматиновые фибриллярные домены, что резко отличало Xi от хромоцентров, обладающих более плотной и гомогенной текстурой. Мы не выявили видимых хроматиновых субструктур высшего порядка в составе хромоцентров, что можно объяснить либо чрезвычайно высокой плотностью упаковки хроматина в них, либо уникальными особенностями их организации, обусловленными низкой сложностью содержащийся в них ДНК и отсутствием необходимых cis-элементов, участвующих в организации хроматина на высших уровнях компактизации.

Для более детального анализа пространственной организации хроматина в составе Xi, была проведена реконструкция нескольких телец Барра по серийным ультратонким срезам толщиной 40 нм. Оказалось, что наиболее часто встречающийся структурный мотив в тельцах Барра представляет собой сегменты фибрилл толщиной около 200 нм. Такие фибриллы примерно в 2 раза больше по толщине, чем типичные для окружающего хроматина хромонемы диаметром около 100 нм. Эти элементы высших уровней организации хроматина в Xi упакованы достаточно рыхло, в результате чего между ними образуются свободные от хроматина пространства размером до 400 нм, которые сообщаются с районами ядерных пор и окружающей нуклеоплазмой. На компьютерных 3D-моделях тельца Барра, созданных при помощи сегментации интерполированных серий ультратонких срезов по электронной плотности, пористая структура Xi и формирующие ее фибриллы хроматина высшего порядка проявляются наиболее отчетливо (рис.2).





При помощи флуоресцентной 3D-микроскопии с использованием антител против нуклеопоринов, а также на сериях ультратонких срезов было обнаружено, что во всех исследованных клетках Xi контактирует с ядерной оболочкой. В тех случаях, когда Xi занимал центральное положение в ядре (6 случаев из 23), этот контакт осуществлялся через глубокие инвагинации ядерной оболочки или тонкие хроматиновые фибриллы, вытягивавшиеся из компактной хромосомной территории Xi. По-видимому, подобная связь с оболочкой характерна для любого типа гетерохроматина, поскольку аналогичное расположение было выявлено и для всех хромоцентров фибробластах мыши, исследованных при помощи электронномикроскопического 3D-анализа.

Таким образом, полученные нами данные выявляют неоднородность в структуре хроматина и свидетельствуют о существенных локальных отличиях в компактизации хроматинового материала Xi. При этом именно формирование хроматиновых фибрилл высшего порядка в процессе образования факультативного гетерохроматина может являться одним из механизмов инактивации генов в Х-хромосоме.

3.2. Динамика структурной организации хроматина в процессе репликации.

Для специфического мечения сайтов репликации и пострепликативной организации хроматина с сохранением максимальной нативности хроматина мы использовали два экспериментальных подхода. Сайты, где происходит синтез ДНК мы визуализовли при помощи экспрессии в клетках культуры тканей химерного белка EGFP-PCNA. Для анализа взаимного расположения и динамики новореплицированного хроматина относительно репликативных фокусов мы использовали мечение ДНК EdU, что позволило нам сохранить интактную структуру хроматина и таким образом существенно повысить разрешение микроскокпического анализа. После импульсного мечения EdU (5 мин) клетки отмывали свежей средой и фиксировали немедленно или инкубировали в среде, содержащей 1 мМ тимидина в течение 20, 30 или 120 мин. При импульсном мечении наблюдалась полная колокализация сайтов включения EdU и PCNA-позитивных фокусов, которые представляли округлые или эллипсовидные структуры размером 0.2-0.3 мкм. В ряде случаев близко расположенные индивидуальные репликативные фокусы сливались в более крупные агрегаты. При этом репликативные фокусы представляют собой сегменты фибриллярных хроматиновых структур высшего порядка и чаще всего полностью совпадают с ними по диаметру. Важно отметить, что интенсивность флуоресценции ДАПИ непосредственно в местах расположения репликативных фокусов оказывалась несколько ниже, чем в соседних хроматиновых доменах с теми же линейными параметрами, что мы интерпретировали как результат частичной деконденсацией хроматина в реплицирующихся сегментах хромонемы.

Одновременно с удалением реплицированного хроматина от сайтов репликации во многих случаях наблюдаются изменения в структурной организации реплицированных локусов. Через 20 мин после мечения он принимает более вытянутую конфигурацию. Иногда можно наблюдать достаточно протяженные сегменты фибрилл высшего порядка, гомогенно меченые по всей длине.

Можно предположить, что наблюдаемые в экспериментах с отложенной меткой изменения конфигурации меченых сайтов отражают пост-репликативную перестройку высших уровней организации хроматина.

Увеличение интервала между введением метки и фиксацией вплоть до часов сопровождается дальнейшей сегрегацией и снижением коэффициента колокализации между GFP-PCNA и EdU, меченым Alexa-594. В этих случаях фибриллярная структура реплицированных сегментов хроматина становится еще более выраженной (рис.3).

Для исследования динамики высших уровней компактизации хроматина в процессе репликации на ультраструктурном уровне были использованы моноклональные антитела против EGFP и вторичные антитела, ковалентно связанных с 1.4 нм наночастицами золота. Для увеличения контраста с целью адекватной визуализации высших уровней организации хроматина, иммуномечение, а А Б В Г Д Рис.3. Колокализация новосинтезированной ДНК (красный) и PCNAпозитивных репликативных фокусов (зеленый) в поздней S-фазе (А) при импульсном (5 мин) мечении EdU. Через 20 мин (Б) и 2 часа (И) после мечения наблюдается сегрегация новосинтезированной ДНК и сайтов репликации.

ДАПИ (синий). (Г-Д) Пост-реплкативная реорганизация хроматина. (Г) При импульсном мечении локусы новореплицированного хроматина имеют компактную округлую форму, а через 2 часа после репликации реорганизуются в сегменты фибриллярных структур высшего порядка (Д).

также Ag-амплификация сигнала проводились перед заключением препаратов в смолу. В этих условиях репликативные сайты часто представляют собой меченые сегменты хроматиновых фибрилл высшего порядка диаметром около 2нм. Хроматин в их составе обладает меньшей электронной плотностью по сравнению с окружающими немечеными (нереплицирующимися) доменами, что может быть связано с частичной локальной деконденсацией реплицирующегося хроматина, однако тотального разворачивания хроматиновых доменов высшего порядка и появления протяженных нуклеосомных фибрилл в зоне репликации не наблюдается. При этом метка располагается преимущественно на поверхности этих доменов, что может быть связано как с расположением ДНКполимераз на периферии конденсированного хроматина (Jaunin et al, 2000), так и с ограниченной диффузией антител в области плотной упаковки ДНК. Чтобы А Б 0.5 m В Рис.4. Иммуноокрашивание репликативных сайтов в ядре клетки СНО, экспрессирующей EGFP-PCNA. (А-Б) При окрашивании фиксированных клеток метка располагается преимущественно на периферии репликацтивных сайтов. (В) При микроинъекции антител, меченых 1.4-ни частицами золота PCNA-GFP выявляется во всем объеме реплицирующихся хроматиновых доменов.

исключить влияние высокой степени конденсации хроматина на проникновение антител, был использован разработанный нами метод in-vivo иммуномечения, основанный на микроинъекции анти-GFP-Nanogold. На ультратонких срезах инъецированных клеток, находящихся в поздней S-фазе (как зафиксированных непосредственно 2.5% глутаральдегидом на буфере Зеренсена, так и предварительно пермеабилизованных в конденсирующем буфере) наблюдается интенсивное мечение дискретных ядерных доменов размером 200-350 нм, располагающихся на ядерной периферии или вокруг ядрышка. Важно отметить, что при in-vivo мечении частицы серебра распределялись практически равномерно в объеме меченого домена. Мы не наблюдали компактных агрегатов PCNA, окруженных немеченным хроматином. Это отчетливо видно как на ультратонких срезах, так и на стереоизображениях срезов толщиной 600 нм, включающих целые репликативные фокусы. Таким образом, наши наблюдения не укладываются в рамки модели «репликативных фабрик» - белковых комплексов, содержащих множество ДНК-полимераз, и окруженных хроматином, протягивающимся через фиксированные ДНК-полимеразы в ходе репликации.

3.3. Особенности структурной организации рано- и позднореплицирующихся доменов хроматина в составе митотических хромосом.

Для исследования структуры высших уровней организации митотических хромосом мы использовали разработанный нами метод повторяющегося гипотонического шока живых клеток с целью индукции деконденсации хромосом. Гипотоническое воздействие на митотические клетки выявляет поперечную дифференцированность хромосом (Howell, Hsu, 1979), а последующий возврат в нормотонические условия позволяет клеткам адаптироваться и возобновить движение по клеточному циклу. Повторный краткий гипотонический шок, воздействующий на клетки, достигшие митоза, выявляет в митотических хромосомах продольную неоднородность, соответствующую классическим G-бэндам. Короткие сроки инкубации в гипотонических растворах оказались пермиссивными и при возврате в нормотоническую среду через час после начала гипотонического шока клетки успешно адаптировались и возобновляли движение по клеточному циклу. Митотическая активность восстанавливалась через 3 часа, хотя митотический индекс снижался до 40% от контроля. Также через 30 мин востанавливался синтез ДНК в клетках, находившихся в S-фазе в момент гипотонического шока. Более того, по данным прижизненных наблюдений за клетками, эксперссирующими GFP-PCNA, репликация возобновлялась в тех же репликативных сайтах, которые были сформированы до начала гипотонического воздействия. Анализ динамики клеточного цикла, проведенный при помощи экспериментов с отложенной меткой, показал, что продолжительность SБ В А Б В А Рис. 5. Репликативные сайты, соответствующие рано реплицирующимся доменам хроматина локализуются преимущественно на периферии хромосом, полученных после двойной гипотонической обработки,. (А) ДНК окрашена бромистым этидием (красный), (Б) места включения БрдУ (зеленый), (В) наложение. Масштаб: 10 мкм.

фазы значительно не изменялась после гипотонического воздействия, однако наблюдалась существенное (примерно на 4 часа) удлинение G2-фазы.

На распластанных препаратах митотических хромосом, приготовленных с использованием 15% раствора Хэнкса вместо стандартного 75 мМ KСl, метафазные хромосомы выглядят сильно деконденсированными и не обнаруживают признаков продольной или поперечной неоднородности. Аналогичная обработка митотических хромосом, образовавшихся после реадаптации клеток к первому гипотоническому шоку, вызывает дифференциальную деконденсацию хромосом, в составе каждой хроматиды которых без дополнительных обработок выявляются отчетливые аксиальные глобулы, располагающиеся симметрично в сестринских хроматидах. Рисунок расположения аксиальных гранул маркерных хромосом выявил частичное соответствие этих структур G-бэндам, при этом наблюдалось 30%-ное удлинение хромосом по сравнению с контролем.

По-видимому, удлинение хромосом и выявление аксиальных гранул связаны с дифференциальной деконденсацией хромосом, в результате чего менее устойчивый к гипотоническому воздействию материал R-бэндов деконденсируется, тогда как матерал G-бэндов остается относительно более компактным. Мы предполагаем, что данный эффект может быть связан с частичной экстракцией Б В А Б В Рис. 6. Репликативные сайты, соответствующие позднореплицирующимся доменам хроматина, демонстрируют преимущественно осевую локализацию в хромосомах, полученных методом двойной гипотонической обработки. (А) ДНК окрашена бромистым этидием (красный), (Б) места включения БрдУ (зеленый), (В) наложение. Масштаб: 10 мкм.

и/или перераспределением структурных белков хроматина. Необычный ответ митотических хромосом, образовавшихся в процессе компактизации такого структурно модифицированного хроматина, на повторное гипотоническое воздействие показывает, что эти изменения хроматина сохраняются в течение интерфазы и сказываются на характере компактизации или структурной стабильности хромосом в митозе.

Окрашивание таких хромосом бромистым этидием выявляло отчетливо видимое гало ДНК-содержащего материала, окружающее сестринские хроматиды. Такое гало выявлялось исключительно в препаратах полученных после двойной гипотонической обработки. При анализе топологии рано- и поздно реплицирующегося хроматина в дифференциально деконденсированных хромосомах обнаружилось, что большинство рано реплицирующихся сайтов выявлялось в периферическом гало, окружающем хромосомы, или в пространстве между двумя сестринскими хроматидами, тогда как поздно реплицирующиеся домены располагались в осевых районах хромосом. Двойная гипотоническая обработка, вызывающая частичную деконденсацию хромосом, приводит также к пространственному разобщению индивидуальных репликативных сайтов, выявляя гетерогенную структуру таких доменов. Таким образом, полученные нами данные вполне соответствуют гипотезе о композитной организации многих больших репликативных сайтов (Berezney et al. 2000, Koberna et al, 2005). В контрольных препаратах, приготовленных по стандартной методике, рано- и поздно реплицирующиеся домены демонстрировали одинаковое расположение относительно хромосомной оси.

Причина поперечной (и продольной) дифференцированности хромосом может состоять в различиях молекулярной организации G- и R-бэндов, в частности, различные по составу ансамбли структурных белков хроматина могут обеспечивать компактизацию ДНК рано- и позднореплицирующихся районов хромосом, функционируя в качестве «скрепок», стабилизирующих высшие уровни организации хромосом. Выход рано реплицирующеся хроматина в гало при двойной гипотонической обработке может быть следствием более высокой чувствительности «скрепок», поддерживающих структуру R-бэндов, к гипотоническому воздействию. В качестве возможных кандидатов на роль таких скрепок можно рассматривать конденсины. Поскольку распределение конденсинов I и II отчасти симулирует продольную дифференцированность хромосом (Ono et al, 2004), можно предположить, что они (или другие структурные белки, прямо или опосредованно рекрутируемые конденсинами (Hudson et al, 2003)), определяют поперечную дифференцированность хромосом и различия в пространственной организации хроматина G- и R-бэндов в деконденсированных хромосомах.

3.4. Динамика высших уровней организации хроматина при активации транскрипции.

Для исследования поведения хроматиновых доменов высшего порядка при активации транскрипции была разработана модельная система, позволяющая визуализовать искусственные хромосомные локусы, содержащие индуцибельные гены, при помощи взаимодействия lac-оператор/lac-репрессор. Для этого были созданы генетические конструкции, в которых 256 копий тандемных повторов лак-оператора и ген устойчивости к канамицину/неомицину были фланкированы 19 п.н. cайтами узнавания транспозазы Tn5. Транспозицию данных конструкций в BAC-клоны, содержащие гены дигидрофолат-редуктаза (DHFR) мыши и человеческие гены металотионеина и белка теплового шока Hsp70, существляли in vitro при помощи очищенной транспозазы Tn5 и трансформировали рекомбинантные хромосомы в E.coli. Сайты интеграции транспозонов определяли путем секвенирования ДНК.

Таблица 1. Изменение уровня экспрессии трансгенных конструкций при активации транскрипции HSP70_контроль Тепловой шок эндогенный трансген эндогенный трансген Относительный 1 0.6±0.11 140±23 200±уровень мРНК На одну копию 1 0.14±0.02 140±23 45±MT1_1_4 DHFR D10_контроль Zn+2 2 часа Zn+2 16 ч Контроль (log-фаза) GОтносительный 1 2.9±0.14 51±8.3 1 0.31±0.0уровень мРНК Каждую рекомбинантную ВАС трансфицировали в клетки CHO DG44, стабильно экспрессирующие химерный белок EGFP- димер лак-репрессораNLS, отбирали стабильные клоны, содержащие несколько интегрированных копий трансгена на ядро, располагающихся в виде серии GFP-позитивных точек.

Преимущества разработанного нами экспериментального подхода с использованием ВАС состоят в том, что он дает возможность изучения структурных преобразований высших уровней организации хроматина при активации транскрипции в системе, наиболее точно соответствующей поведению нативных генов в их естественном хроматиновом контексте. Сравнение уровней экспрессии и степени индукции транскрипции эндогенных генов и ВАС трансгенов, при помощи количественной РТ-ПЦР с использованием видоспецифичных праймеров, при перерасчете на одну копию трансгена, показало, что после индукции эндогенные и трансгенные копии генов демонстрируют сходные уровни активности (см. таблицу 1).

Параллельно мы провели сравнительный анализ структурной организации высших уровней компактизации хроматина до и после индукции транскрипции во всех трех трансгенных линиях. Для этого на светооптическом уровне были измерены изменение числа GFP-позитивных точек, а также определена контурная длина кривой, соединяющей все точки (см. таблицу 2).

Оказалось, что средняя степень компактизации в неиндуцированных трансгенных локусах была в 25-50 раз выше, чем расчетный линейный коэффициент компактизации 30-нм фибриллы хроматина. 1.5-3-кратная деконденсация, наблюдаемая в результате индукции транскрипции, дает в результате коэффициент компактизации около 175, что все еще в несколько раз выше, чем компактизация 30-нм фибриллы. Полученные данные не исключают возможности того, что активно транскрибирующеся гены в составе трансгенной Таблица 2. Изменения степени компактизации трансгенных локусов при активации транскрипции Трансгенная линия DHFR D10_2 Hsp70_5 MT1_1_Копийность (QPCR) 13 (10-16) 10 (8-14) 9 (7-11) Копийность (Fiber- 11/12/11 9--12 16-FISH) Размер BAC (т.п.н) 187.1 192.6 185.Средняя контурная 0.65 0.52 0.длина локуса (контроль, мкм) Коэффициент 1125 1200 15компактизации (контроль) Средняя контурная 1.4 1.51 0.длина локуса (после активации, мкм) Коэффициент 520 410 10компактизации (после активации) конструкции образуют сильно деконденсированные петли ДНК, «выпетливающиеся» наружу из высоко конденсированной «коровой» фибриллы хроматина высшего порядка (хромонемы), содержащей повторы лак-оператора.

Для проверки этой возможности был проведен анализ взаимного расположения повторов лак-оператора и ВАС методом двухцветной FISH. Метка лакоператора обычно локализовалась колинеарно с последовательностями ВАС и обычно демонстрировала высокую степень колокализации с последней. Мы не наблюдали выпетливания участков ДНК ВАС на заметное расстояние от линейного «остова» трансгенного локуса (рис.7).

Далее мы использовали метод in vivo иммуномечения для визуализации структурной организации DHFR трансгенов в клетках линии В10 и B9, используя моноклональные антитела против GFP. В полном соответствии с наблюдениями, полученными при помощи 3D-FISH, мы обнаружили локусы лак-репрессора в составе структур высшего конденсированного хроматина, соответствующих элементам хромонемы толщиной 100-130 нм (рис. 7).

Чтобы выяснить, является ли транскрипционая активность гена необходимым условием декомпактизации высших уровней упаковки хроматина, был проведен ингибиторный анализ поведения трансгенов, содержащих Hsp70 или MT BAC с использованием альфа-аманитина и 5,6дихлоро-1-бета-D-рибобензимидазола А (DRB). При действии альфа-аманитина даже в условиях активации транскрипции трансгенных локусов степень их компактизации несколько увеличивается по сравнению с неиндуцированными контрольными клетками, что можно объяснить ингибированием конститутивного уровня экспрессии. При Б использовании DRB степень деконденсации была существенно ниже, чем в необработанных DRB клетках при индукции Hsp70. Для MT ВАС статистически достоверных отличий в степени компактизации трансгенного локуса в контрольных неиндуцированных клетках и в клетках, обработанных Zn в присутствие DRB, обнаружено не было.

Поскольку ген Hsp70 находится в 200 nm активированном состоянии и с ним постоянно связана РНК полимераза II (Price, 2008), различия в поведении Рис.7. А). Повторы лактрансгенов при действии этих оператора и участки ВАК, соингибиторов могут быть связаны с держащие транскрибирующиеналичием РНК полимеразы на промоторе ся гены, сохраняют колинеаргена Hsp70. Присутствие DRB, не ность при активации трансвлияющее на связь РНК полимеразы с крипции., Б) Хроматин, содерпромотором, таким образом, не жащий транскрибирующиеся препятствует инициации транскрипции локусы, сохраняет хромонемную после теплового шока.

структуру.

А Б В Г Рис.8. РНК-FISH с зондами против гена DHFR (B) показывает, что практически все копии в составе тандемных повторов DHFR ВАС, интегрировавшихся в хромосому, являются транскрипционно-активными.(Б) Lac-репрессор-GFP, (Г) совмещение.

Поскольку уровень экспрессии исследованных трансгенов оказывается в несколько раз ниже, чем у соответствующих эндогенных генов, мы оценили долю активных генов в составе исследуемых трансгенных локусов при помощи РНК-FISH. Гибридизационный сигнал при этом выявлялся в тесной ассоциации с большинством GFP-позитивных сайтов локализации повторов лак-оператора.

Также часто наблюдалась частичная или полная колокализация гибридизационного и GFP-сигналов. Таким образом, активация транскрипции, по-видимому, происходит в большинстве индивидуальных копий трансгена вне зависимости от локальной степени компактизации. Также РНК-FISH-анализ показал, что экспрессия Hsp70 начинается в 90% клеток через 5 мин после начала теплового шока, тогда как деконденсация высших уровней компактизации хроматина трансгенного локуса наблюдается лишь спустя 10-мин.

А При индукции трансгенные локусы DHFR и MTВАС как правило принимали линейную конформацию, гда как в случае активации гена Hspтепловым шоком в течение 30 мин значительная часть Hsp70 трансгена приобретала специфическую форму полукруга. Более того, при длительных тепловых воздействиях (30-40 мин) транскрипты аккумулировались в ДАПИ-негативной области, которую охватывала цепочка GFP-позитивных точек (рис. 6). Иммунофлуоресцентная микроскопия показала, что Hsp70 трансгены, в отБ личие от DHFR и MT трансгенов, тесно связаны с ядерными доменами, соответствующими кластерам интерхроматиновых гранул (nuclear speckles), окрашиваемыми антителами против SC35 и ASF/SF2 (рис.9). Такая ассоциация характерна для всех независимо полученных клеточных линий, содержащих Hsp70 трансген (но не для DHFR и MT-трансгенов). In vivo иммуномечение золотом лак-репрессора-GFP в составе Hsp70 ВАС трансгена демонстрирует расположение повторов лак-оператора на периферии кластеров интерхроРис. 9. Активация транматиновых гранул. Анализ пространственного скрипции трансгенного расположения трансгенов относительно кластера локуса, содержащего гены интерхроматиновых гранул на стереоизображенитеплового шока, стимулиях срезов толщиной 0.5 мкм или на сериях нарует ассоциацию трансклонных проекций показывает их локализацию в гена (зеленый) с класобласти аморфного фибриллярного материала, терами интерхроматиноокружающего плотный центральный гранулярный вых гранул (красный). До домен. Сочетание иммунофлуоресценции и РНК(А) и после активации (Б) FISH подтверждает, что аккумуляция транскриптов Hsp70 происходит внутри SC-35-позитивных ядерных доменов на более поздних сроках после начала тепловой обработки. Индекс ассоциации увеличивался с 47% до 85% в течение мин после теплового шока, тогда как средний размер ближайшего кластера оставался относительно стабильным. Это можно объяснить перемещением Hsp70 трансгена к уже существующему кластеру. Чтобы исследовать это явление более подробно, была проведена серия экспериментов по прижизненному наблюдению за клетками в процессе активации гена теплового шока. Для этой цели клетки, несущие трансгенную конструкцию Hsp-70 ВАС и экспрессирующе GFP-димер-Lac-репрессора, были трансформированы плазмидой, кодирующей mRFP-ASF/SF2.

Наблюдения за живыми клетками в процессе индукции тепловым шоком показали, что наиболее часто происходит образование новых кластеров по соседству с трансгеном или увеличение размеров предсуществующих соседних кластеров, однако в некоторых случаях происходило также и перемещение трансгенов по направлению к кластеру, причем это перемещение иногда осуществлялось на довольно значительные расстояния. При этом низкая частота наблюдавшихся перемещений трансгена по направлению к кластеру ИХГ может быть следствием фотоингибирования (Chuang et al, 2006). Действительно, в тех Рис. 10. Модель структурных преобразований высших уровней компактизации хроматина при активации транскрипции. Слева — классическая схема, постулирующая полную деконденсацию транскрибирующегося локуса (зеленый) и его взаимодействие с транскрипционными комплексами (синий), фиксированными на ядерном матриксе, справа — модель активации транскрипции в контексте высших уровней организации хроматина.

случаях, когда мы наблюдали такое перемещение, оно происходило в самом начале периода наблюдений, т.е. до достижения ингибирующего порога. Характерно, что локусы, меченые GFP, оставались на поверхности и не погружались в глубину кластера.

Экспериментальная модель, использованная в данных экспериментах, дала возможность проанализировать локальную динамику транскрибирующихся локусов. Мы использовали прижизненные наблюдения для визуализации подвижности индивидуальных GFP-позитивных точек, принадлежащих к одному хромосомному субрегиону, относительно друг друга. Была обнаружена сходная быстрая, но ограниченная подвижность трансгенов в секундной временной шкале. Поскольку множественные точки, соответствующие колинеарно интегрированным копиям ВАС, двигались друг относительно друга, в то же время сохраняя свою колинеарность, очевидно, что наблюдаемая подвижность не является следствием перемещения всего хромосомного субрегиона или целого ядерного субдомена, а отражает локальную подвижность или конформационные изменения хромосомных доменов размером в несколько сотен тпн относительно фланкирующих цис-последовательностей. Поскольку практически все копии трансгена демонстрируют транскрипционную активность и GFP-позитивные точки в составе DHFR ВАС трансгенного локуса колокализуются или контактируют с сайтами расположения транскриптов, а ген DHFR транскрибируется полностью за 10 мин, наши наблюдения не соответствует предсказаниям моделям, согласно которым транскрипция происходит на статичном ядерном матриксе или на транскрипционных фабриках, заякореных на ригидном ядерном скелете. По-видимому, транскрипционная машинерия совершает подобные движения вместе с транскрибирующимся хроматином, и любые локальные взаимодействия с неподвижными ядерными структрами являются весьма динамичными, если вообще такие взаимодействия и такие статичные структуры существуют в живой клетке (рис.10).

В целом, полученные данные демонстрируют тесную связь между деконденсацией высших уровней организации хроматина эухроматических районов хромосом и актвацией транскрипции с базального до активированного уровня.

Деконденсация, однако, не является абсолютно необходимой для транскрипции, тогда как транскрипция сама по себе, или по крайней мере компоненты транскрипционной машинерии, могут быть необходимыми факторами деконденсации. Таким образом, функциональная роль высших уровне организации хроматина может состоять в обеспечении тонкой настройки системы транскрипции посредством контроля крупномасштабной деконденсации хроматиновых локусов и/или ассоциации с ядерными субдоменами (такими, как кластеры ИХГ).

3.5. Высшие уровни упаковки хроматина, выявляемые в ходе еcтественной компактизации хромосом в митозе.

Ядра клеток, находящихся в фазе G2, демонстрируют практически равномерное распределение хроматина в объеме ядра с элементами фибриллярных структур с размерами, находящимися за пределами разрешающей способности светового микроскопа. Просвечивающая электронная микроскопия ядер в G2фазе выявляет эти фибриллярные элементы (хромонемы) более четко. Толщина хромонем в этих ядрах составляет около 80 нм. Реконструкция по серийным ультратонким срезам толщиной 30-40 нм показывает, что эти обособленные фибриллярные элементы могут быть прослежены на протяжение 0.5-1 мкм. Анализ проекций нескольких ультратонких срезов общей толщиной около 0.5 мкм выявил многочисленные участки, в которых хромонемные фибриллы неплотно упакованы в линейные структуры толщиной 0.2-0.4 мкм или более крупные агрегаты.

Первые видимые признаки конденсации состоят в индивидуализации и пространственном разобщении этих локальных агрегатов хроматина. При этом становятся более четко видны индивидуальные хроматиды, визуализуемые как линейные структуры. Характерным признаком ранней стадии профазной конденсации является общий коллапс хроматина по направлению к ядерной периферии и появление значительных зон внутри ядра, свободных от хроматина.

Дальнейшая компактизация приводит к формированию легко различимых компактных хромосом, в составе которых еще можно различить хромонемные элементы толщиной около 80 нм (рис. 11). Однако в целом упаковка хроматина остается гетерогенной, и индивидуальные хромосомы, а также разделенные сестринские хроматиды, невозможно проследить на большом расстоянии.

Клетки в ранней профазе составляют 10 и 35% через 7 и 13 часов после выхода из блока на границе G1/S, тогда как число клеток с типичной интерфазной структурой хроматина снижается с 85% до 50%.

Переход от ранней к средней профазе соответствует формированию четко различимых хромосом, которые можно проследить как индивидуальные линейные структуры с равномерной упаковкой а протяжение нескольких мкм (рис.11). На стадии средней профазы хромосомы тесно контактируют с ядерной оболочкой. Толщина хромосом на этой стадии составляет 0.4-0.5 мкм, что несколько меньше чем у более рыхло упакованных хромосом в ранней профазе.

Во многих районах хромосом на светооптическом уровне можно различить сестринские хроматиды, однако выявление сестринских хроматид на ультратонких срезах более затруднительно. Ультраструктурный анализ также выявил в составе конденсирующихся хромосом фибриллы хроматина толщиной около 100 нм, особенно на трехмерных реконструкциях протяженных серий (67 срезов по 80 нм каждый), где можно наблюдать сегменты таких фибрилл в областях с относительно более низкой степени компактизации.

А Б В Г Д Е Ж З Рис 11. Хромонемные элементы выявляются на всех этапах профазной компактизации. (А) Фаза G2. Компьютерная проекция 5 ультратонких срезов толщиной 35 нм (общая толщина 175 нм. Стрелки указывают на крупные домены конденсированного хроматина, маленькие стрелки — на распрямленные хромонемные фибриллы. В некоторых случаях в составе структурных элементов толщиной 200 нм видны рыхло уложенные хромонемы (стрелки). (Б-Г) Ранняя профаза. Формирующиеся хроматиды состоят из хромонемных элементов (стрелки). (Д-З) Средняя профаза.

Компьютерная проекция 11 срезов толщиной 80 нм каждый (Д) и индивидуальный срез (Е) показывают отдельные хромонемные элементы (стрелки). На проекции трех ультратонких срезов (Ж) и отдельном срезе (З) видны упакованные 100-130 нм хромонемы в составе 200-250 нм хроматиды. Масштаб: 0.5 мкм (длинный) и 0.2 мкм (короткий отрезок).

Поздняя профаза характеризуется увеличением диаметра хромосом примерно вдвое (до 0.8-1 мкм). Сестринские хроматиды на этой стадии все еще находятся в плотном контакте, однако их удается различить, когда хроматиды лежат в плоскости среза. Плечи хроматид однородны по толщине, поперечные сечения хромосом также выглядят равномерно конденсированными, однако на периферии хромосом, а также на тангентальных срезах, четко выявляются элементы высших уровней упаковки толщиной 100-130 нм. Средний диаметр хроматиды составляет 0.4 мкм, что примерно в два раза меньше, чем в метафазе (0.6-0.8 мкм), тогда как в средней профазе толщина хроматид составляет примерно 0.2-0.3 мкм.

Описанные выше ранние этапы конденсации хромосом хорошо соответствуют модели иерархической упаковки хромосомы, согласно которой хроматиновые фибриллы толщиной 30 нм укладываются в фибриллярные структуры высшего порядка. Последние, в свою очередь, компактизуются с образованием митотических хромосом.

Таким образом, в профазе митоза наблюдается 3 процесса: (1) формирование хромонем; (2) частичная сегрегация сестринских хроматид и (3) укорочение и утолщение хромосом (описываемые как компактизация или конденсация).

При этом образование метафазной хромосомы сопровождается формированием как минимум двух помежуточных уровней компактизации: 200-250 нм и 400 нм фибриллы.

Вопрос о молекулярном механизме конденсации остается открытым. Отсутствие высокой степени упорядоченности в структурной организации хромосом на ранних стадиях компактизации неизбежно требует, чтобы в основе процесса компактизации лежали несимметричные молекулярные механизмы, возможно, обеспечиваемые участием негистоновых белков. По данным литературы, наиболее вероятными кандидатами на роль архитектурных компонентов являются мажорные негистоновые белки хромосом: конденсины и топоизомераза II. В то же время, следует учитывать и важнейшую регуляторную роль двухвалентных катионов (в частности, ионов Са++), влияние которых на структур хроматина in vitro детально документирована, хотя механизмы их действия in vivo остаются невыясненными.

3.6. Роль ионов Са в стабилизации высших уровней компактизации ДНК.

Нами была разработана экспериментальная модель, позволяющая контролировать реконструкцию хромосом in vivo при помощи физиологических концентраций ионов Ca. В основе данной модели лежит предположение, что обработка живых клеток низкими концентрациями глутарового альдегида (0.001%) приводит к тому, что клетки теряют способность к восстановлению нормальной концентрации Ca, сниженной в результате гипотонического воздействия. Поскольку вхождение Са в клетку регулируется трансметилированием фосфатидилэтаноламина в цитоплазА матическом листке плазматической мембраны (Godeau et al., 1985), модификация фосфатидилэтаноламина глютаральдегидом предотвращает этот процесс и сопровождающую его активацию быстрых Са-каналов. Анализ реакции Б хромосом на гипотоническое воздействие в условиях модификации мембран, а также характер структурных перестроек, индуцированных восстановлением физиологических концентраций Са++ при помощи селективных ионофоров (например В А23187), таким образом, может дать информацию о роли внутриклеточного Са в стабилизации их структуры.

Через 5 мин после начала инкубации клеток в гипотоничной среде (30% раствора Хэнкса) хромосомы на светооптическом уровне выгляРис. 12. Ультраструктура митотических дят сильно деконденсированхромосом в живых клетках СПЭВ после ными, но по мере адаптации гипотонического воздействия. (А) контроль, клеток наблюдается рекон(Б) 5 мин, (В) 30 мин. Масштаб: 0.5 мкм денсация хромосом и через 20-30 мин после начала воздействия хромосомы выглядят достаточно плотными и мало отличаются по морфологии от контроля. Однако гипотоническое воздействие оказывает дезорганизующее влияние на митотический аппарат в целом, что выражается в разрушении микротрубочек веретена деления. Вследствие этого наблюдается распад метафазной пластинки и случайное распределение хромосом по клетке.

Перенос адаптированных к гипотоническим условиям клеток в нормальную среду культивирования приводит к их резкому сжатию. Таким образом, гипотоничная среда после адаптации становится для клеток «нормотоничной», а нормальная среда культивирования — гипертоничной.

На ультраструктурном А уровне, деконденсация хромосом выражается в практически полному разворачиванию всех высших уровней компактизации ДНК. Хромосомы представлены только рыхло упакованными фибриллами толщиной Б нм. В процессе адаптации к гипотоническому шоку общая плотность упаковки хроматиновых фибрилл в митотических хромосомах возрастает, что сопровождается укладкой нуклеосомных Рис. 13. В присутствии 0.001% глуарового фибрилл в 30-нм фибрилальдегида реконденсация хромосом блокируется лы хроматина, а через 20(А). При добавлении Са-ионофора А23130 мин после начала гипроисходит быстрое восстановление компактной потонического шока наструктуры хромосом (Б).

блюдается восстановление фибрилл высшего порядка — хромонем диаметром около 100 нм (рис.12).

Модификация клеточной мембраны глутаральдегидом не изменяет первичную реакцию клеток на гипотонический шок. В первые 5 мин воздействия клетки сильно набухают, а митотические хромосомы деконденсируются и значительно теряют свою плотность. Главные различия между контрольными и обработанными глютаровым альдегидом клетками наблюдаются на стадии адаптации. Через 15-30 мин гипотонического воздействия восстановления структуры хромосом в последних не происходит, и хромосомы остаются деконденсированными. Однако перенос клеток, обработанных глутаровым альдегидом, в нормотоническую среду приводит к их быстрому сжатию, что говорит об активной адаптации клеточной мембраны к гипотонии и нормальном функционировании систем транспорта ионов в целом.

Восстановление структуры хромосом в клетках, обработанных глутаровым альдегидом, можно стимулировать обработкой кальциевым ионофором А23187. При добавлении ионофора в концентрации 1 мкМ через 15-20 мин после начала действия гипотонического шока происходит быстрая реконденсация хромосом и восстановление структуры хромонемных элементов, что указывает на возможную роль ионов Са в формировании и поддержании структуры высших уровней организации хромосом in vivo. Отсюда также следует, что гипотоническое воздействие на живые клетки должно приводить к изменениям внутриклеточной концентрации Са, и эти изменения должны коррелировать с изменениями структурного состояния хромосом. Измерения внутриклеточной концентрации Ca++ при помощи красителя Fura-2 показало, что снижение осмолярности среды сопровождается резким падением концентрации свободного Ca, однако затем по мере адаптации уровень Ca возвращается на исходный уровень в течение 5-10 мин. В присутствие глютарового альдегида подобного восстановления не наблюдалось, и пониженная концентрация Са сохранялась в течение по крайней мере 20 мин. Добавление ионофора А23187 приводило к резкому повышению концентрации Ca до уровня, превышающего исходный, что коррелирует с быстрой реконденсацией хромосом.

Можно предложить по крайней мере два объяснения тому факту, что в живых клетках физиологических концентраций Са достаточно для поддержания хроматина в конденсированном состоянии. Во-первых, в живых клетках эффект Са может быть опосредован специфическими Са-связывающими структурными белками хроматина, которые непрочно связаны с хроматином и легко экстрагируются в процессе выделения хромосом и ядер. Во-вторых, действие Са может быть основано на его участии в регуляции энзиматических систем, например, протеинкиназ, фосфорилирующих гистоны. Однако, вне зависимости от того, каков механизм действия Са, важным является то, что высшие уровни организации хроматина, образующиеся в результате действия ионофора А23187, полостью соответствуют структурным элементам хроматина, наблюдаемым in situ. Это свидетельствует в пользу адекватности используемых условий для стабилизации хроматина in vitro и правомерности экстраполяции данных ультраструктурного анализа изолированных хромосом и ядер на нативную организацию хроматина in vivo.

3.7. Роль конденсинов в структурной организации митотических хромосом.

Для анализа роли конденсинов в компактизации хромосом в митозе важно установить хронологию ассоциации архитектурных белков хромосом с конденсирующимися профазными хромосомами и их пространственную локализацию.

В клетках, находящихся в G2-фазе, топоизомераза II alpha распределяется в объеме ядра более или менее диффузно, за исключением нескольких ярких фокусов, соответствующихся реплицированным центромерам (Rattner et al, 1996).

В противоположность топоизомеразе II, SMC2 локализуется в виде мелких точек, часто концентрирующихся на периферии масс конденсированного хроматина. На этой стадии колокализации SMC2 и топо II практически не наблюдается.

В ранней профазе окрашивание SMC2 более отчетливо концентрируется в мелких фокусах, ассоциированных с периферией хромосом. На этой стадии короткие параллельно лежащие линейные SMC2-позитивные структуры начинают выявляться на поверхности хромосом. Топоизомераза II распределяется более А Б В Рис.14. Распределение SMC2 и топоизомеразы II в средней профазе. (A) ДАПИ (зеленый) и SMC2 (красный); (Б) ДАПИ (зеленый) и топоизомераза II (красный); (В) топоизомерза II (зеленый) и SMC2 (красный). Стрелки указывают на области, увеличенные на врезках. В средней профазае окраска SMC2 и топоизомеразы II начинают частично совпадать, формируя колинеарные участки, расположенные преимущественно на поверхности хромосом (A–В, врезки, короткие стрелки).

диффузно, чем SMC2. Однако, в отличие от G2, в ранней профазе часто наблюдается колокализация SMC2-позитивных фокусов c парными фокусами топоизомеразы II, соответствующим центромерам. Вне центромерных районов топо II и SMC2 практически не колокализуются.

В средней профазе колокализации SMC2 и топоизомеразы II становится еще более выраженной, но SMC2 в большей степени локализуется на периферии конденсированных участков хромосом. Области колокализации включают протяженные (до 1-2 мкм) линейные окрашенные структуры, которые преимущественно располагаются на периферии хромосом. Интересно, что в некоторых случаях линейные сегменты топо II и SMC2 располагаются параллельно друг другу, но не колокализуются полностью, и только в центромерных районах яркие точки топо II и SMC2 полностью совпадают.

Только в поздней профазе колоклизация топо II и конденсинов становится очевидной во всех областях ядра. Топо II в основном концентрируется в центромерах, но также четко видно окрашивание топо II и SMC2 вдоль плеч хромосом.

При этом наблюдается как периферическая, так и осевая локализация этих окраРис. 15. Аксиальная локализация SMC2 в метафазных хромосомах.

Стереопары полутонких срезов изолированных метафазных хромосом, окрашенных Nanogold-коньюгатами антител с серебряным усилением, выявляют осевое распределение SMC2 в виде зоны шириной 0.15-0.2 мкм шенных зон, а к началу метафазы осевая локализация топоизомеразы II и SMCстановится очевидной. В полностью компактизованных хромосомах топо II и SMC2 демонстрируют высокую степень колокализации. Иммуноэлектронная микроскопия нативных метафазных хромосом позволила выявить внутри метафазных хромосом зоны окрашивания антителами против SMC2 шириной 0.150.2 мкм, что составляет примерно одну треть от общего диаметра хроматиды (0.5 мкм).

Таким образом, в ходе митотической компактизации хромосом наблюдается корреляция между морфологическими изменениями хромосом и динамическим перераспределением топо II и SMC2-cубъединицы конденсина. При этом первичное распределение топо и SMC в значительной степени связано с поверхностью компактизующихся хромосом, за исключением центромерных районов. Перераспределение этих белков с периферии в осевые области хромосом происходят значительно позже, чем завершается формирование равномерно упакованных хромосом со сформированной осью, характерное для средней профазы.

3.8. Исследование поведения конденсинов при искусственном изменении степени компактизации хромосом в живых клетках.

Локализация белков XCAP-E и pEg7 в митотических клетках при искусственной декомпактигации хромосом в условиях обратимого гипотонического шока.

Искусственную деконденсацию хромосом в живых клетках вызывали инкубацией клеток в гипотонической среде (30% среды L-15). Поскольку такое воздействие является структурно обратимым (см. выше), можно установить связь между присутствием конденсинов и структурной целостностью митотических хромосом.

Обработка живых клеток 30% раствором среды L-15 в течение 5 минут вызывает частичную деконденсацию митотических хромосом, общая морфология хромосом при этом сохраняется. Через 15 минут инкубации начинается постепенная адаптация клеток к гипотонической среде, сопровождающаяся реконденсацией хромосом; примерно через 30 минут внешний вид хромосом близок к исходному. При этом в фазе деконденсации наблюдается частичный выход субъединиц конденсина XCAP-E и pEg7 в цитоплазму. В то же время, в осевых областях деконденсированных хромосом сохраняется повышенная концентрация конденсинов. Таким образом, деконденсация хромосом in vivo не коррелирует с диссоциацией конденсинов, хотя нельзя исключить, что остающиеся связанными с хромосомами конденсиновые комплексы в этих условиях теряют активность и не выполняют своей функции стабилизации структуры хромосом. Через 30 минут после начала воздействия, когда наступает фаза реконденсации, антитела к pEg7 и ХСАР-Е перестают окрашивать хромосомы и выявляются преимущественно в цитоплазме. Однако диссоциация конденсинов не препятствует успешной реконденсации хромосом и восстановлению структуры хромонемных элементов. Таким образом, восстановление компактной структуры хромосом после гипотонического шока происходит без участия конденсинов, или по крайней мере, только незначительная доля популяции конденсинов, не выявляемая методами иммунофлуоресцентной микроскопии, остается связанной с митотическими хромосомами. Эти данные противоречат как общепринятым представлениям о конденсиновом комплексе как об интегральном компоненте хромосомного скэффолда, обеспечивающего специфическую радиально–петлевую организацию хроматина в интерфазных и митотических хромосомах (Gasser, 1995; Hirano, 1998), так и гипотезе о возможной энзиматической роли конденсинов, участвующих в активном реконфигурировании топологически замкнутых петлевых доменов хроматина в ходе конденсации хромосом (Kimura, Hirano,1997; Kimura et al, 1999).

Локализация белков XCAP-E и pEg7 в митотических клетках после воздействия цитостатиков.

Для стабилизации хромосом в живых клетках в компактном состоянии длительное время использовали цитостатики нокодазол и таксол. Обработка нокодазолом приводит к деполимеризации микротрубочек, и полному разрушению митотического веретена, таксол, напротив, понижает критическую концентрацию полимеризации тубулина, что приводит к формированию дополнительных нецентросомальных фокусов полимеризации микротрубочек в цитоплазме митотических клеток и вызывает блок митоза вследствие нарушения обмена тубулина. При обработке клеток 0.5 мкг/мл нокодазола или 10 мкг/мл таксола в течение 6 часов происходило накопление метафазных клеток, при этом хромосомы в них сохраняли компактную структуру. В данных условиях не наблюдалось реверсии митоза, то есть перехода клеток в интерфазу без расхождения хромосом. При этом в клетках, обработанных нокодазолом, антитела к pEg7 и к ХСАР-Е перестают окрашивать хромосомы уже через часа после начала воздействия. В клетках, инкубированных в среде, содержащей таксол, также наблюдается постепенный выход белков pEg7 и XCAP-E из митотических хромосом. В качестве контроля использовались антитела к топоизомеразе II, которая в метафазе локализуется вместе с конденсинами в осевых районах хромосом. Оказалось, что в этих условиях антитела успешно выявляют топоизомеразу II в осевых областях компактизованных хромосом, что делает маловероятным предположение об ограниченной диффузии антител против субъединиц конденсинового комплекса внутрь компактизованных хромосом.Данные наблюдения являются дополнительным аргументом против непосредственной структурной роли конденсинов в митотических хромосомах. Возможно, конденсины необходимы только на начальных этапах формирования высших уровней компактизации ДНК в митотических хромосомах, а не для стабилизации их макромолекулярной структуры, которая достигается в результате действия других структурных белков. Постоянное присутствие конденсинов на хромосомах в течение всего митоза может обеспечивать их пассивное перераспределение в дочерние ядра.

3.9. Конденсиновый комплекс в мейозе.

На стадии диплотены мейотической профазы I хромосомы амфибий приобретают конфигурацию «ламповых щеток», характерную наличием осевых структур, содержащих высококонденсированный транскрипционно неактивный хроматин, и отходящих от него петель хроматина, содержащих активно транскрибирующиеся гены. Хромосомные петли представлены сильно деконденсированными фибриллами хроматина, на которых размещены активно работающие РНК-полимеразы II. При этом, петли составляют лишь небольшую долю хромосомной ДНК, в то время как основная масса ДНК присутствует в компактной форме в осевых районах хромосом-гомологов, каждый из которых представлен двумя сестринскими хроматидами, сохраняющими тесную когезию. Осевые районы демонстрируют линейную неоднородность в содержании хроматина, выражающуюся в формировании многочисленных последовательно расположенных гранул высококомпактизованного хроматина, называемых хромомерами, чередующихся с участками относительно менее плотной упаковки хроматина. Мы изучили внутриклеточную локализацию конденсинов в ооцитах Xenopus laevis на стадии профазы мейоза I, обращая особое внимание на их взаимодействие с профазными хромосомами типа ламповые щетки.

Для исследования субклеточного распределения XCAP-E и pEg7, микрохирургическим методом были получены цитоплазматическая и ядерная фракции ооцитов и присутствие конденсинов в белковых экстрактах этих фракций было проанализировано методом Вестерн-блоттинга. Оба белка главным образом выявляются в цитоплазматической фракции ооцитов. Наиболее выраженную цитоплазматическую локализацию демонстрирует XCAP-D2, присутствие которого в ядерном экстракте удалось выявить только при использовании большого стартового количества исследуемого материала, но небольшая фракция конденсинов присутствует и в ядре.

Эти результаты согласуются А Б с нашими данными о хронологии ассоциации конденсинов с профазными хромосомами в митозе, где также наблюдается существенное усиление флуоресцентного сигнала ассоциированного с хромосомами SMC2 при В Г переходе от профазы к метафазе. Наличие значительного Рис.16. Анализ распределения XCAP-D2 вдоль количества XCAP-D2 и хромосомной оси. (А) Окраска иодистым XCAP-E в цитоплазме ооципропидие (PI) демонстрирует неравномерную та, по-видимому, объясняеткомпактизацию хрматина в осевой области ся необходимостью накоплехромосом, представленную компактными ния этих важнейших белков хромомерами, разделенными менее интенсивно для обеспечения сегрегации окрашенными деконденсированными геномов в ходе дробления.

межхромомерными участками. (Б) Хромомеры Далее мы исследовали внуинтенсивно окрашиваются антителами триядерную локализацию против XCAP-D2 (зеленый).(В-Г) совмещение.

XCAP-D2 и XCAP-E методами иммунофлуоресцентА Б ной микроскопии в зародышевых пузырьках ооцитов на разных стадиях созревания (стадии III-VI). На всех четырех исследованных стадиях XCAP-D2 преимущеВ Г ственно обнаруживался в хромосомах типа ламповые щетки. Более детальный анализ распределения XCAP-D2 в хромосомах при помощи лазерной конфокальной микроскопии показал, Рис. 17. XCAP-D2 локализуется в тельцах Кахаля.

что антитела против На распластанных препаратах зародышевых XCAP-D2 интенсивно пузырьков антитела против XCAP-D2 (сыворотка окрашивали осевые райG) интенсивно окрашивают матрикс телец оны хромосом и практиКахаля, но не выявляются в В-снурпосомах. Также чески не выявляли даннаблюдается слабое окрашивание ядрышек. (А) ный белок в петлевых дифференциальный интерференционный контраст.

доменах. Анализ профи(Б) XCAP-D2 (В) ДНК (окраска Picogreen), (Г) лей интенсивности вдоль совмещение.

оси хромосом в двух флуоресцентных каналах (красный для ДНК (иодистый пропидий) и зеленый XCAP-D2 (FITC)) в протяженных сегментах хромосом (до 10 мкм) показал высокий уровень колокализации, что свидетельствует о прямой корреляции между уровнем компактизации хроматина и концентрации XCAP-D2 в осевых районах хромосом.

В отличие от XCAP-D2, XCAP-E не обнаруживался в связи с мейотическими хромосомами на III-VI стадиях созревания ооцитов. Эти ярко выраженные различия в характере локализации XCAP-E в митотических и мейотических хромосомах, вероятно, связаны с тем, что диплотенные хромосомы находятся на более ранней стадии компактизации. Действительно, по мере созревания ооцитов и компактизации мейотических хромосом XCAP-E постепенно появляется в составе последних. Тем не менее, различия в хронологии ассоциации различных субъединиц конденсинового комплекса с мейотическими хромосомами позволяет сделать вывод о том, что 8S коровый комплекс и 11S регуляторный комплекс в живых клетках могут существовать независимо друг от друга и сборка холокомплекса конденсина (по крайней мере, конденсина I) происходит не в цитоплазме, как предплагалось ранее, а непосредственно на хромосомах.

При этом регуляторная субъединица pEg7/XCAP-D2, первой взаимодействующая с хромосомами, рекрутирует остальные субъединицы.

Отсутствие ключевых компонентов системы компактизации Б хроматина в мейотических хромосомах на стадии диплотены, по всей вероятности, связано с тем, что хромосомы поддерживаются в доВ Г статочно деконденсированном состоянии, тогда Рис. 18. XCAP-E не связан с мейотическими хромосомами и как конденсины локализуется перимущественно в ядрышках. (A) фазовый и топоизомераза контраст (Б) XCAP-E (В) ДНК (окраска Picogreen), (Г) II участвуют на совмещение.

более поздних этапах компактизации, или вообще не принимают участия в компактизации хромосом, а требуются в большей степени для разделения сестринских хроматид.

Помимо мейотических хромосом, мы обнаружили ассоциацию субъединиц конденсина с различными нехроматиновыми структурами ядра. Так, XCAPD2 выявляется в составе телец Кахаля, где он колокализуется с коилином в матриксе, и никогда не обнаруживается в B-снурпосомах. Функциональное значение ассоциации субъединиц конденсинов с тельцами Кахаля неясно, однако выявление в тельцах Кахаля белков, участвующих в репликации ДНК (B24, MCM3, cdc21; Bucci et al, 1993; Albani et al, 1998), предполагает, что функция телец Кахаля не ограничивается исключительно созреванием компонентов системы транскрипции и сплайсинга, но может включать и контроль сборки/созревания/модификации белковых комплексов, участвующих в ремоделировании хроматина.

Локализация XCAP-Е в ядрышке подтверждает наши данные, полученные ранее на соматических клетках Xenopus XL-2 (Тимирбулатова и др., 2003;

Uzbekov et al, 2003). Двойная окраска на XCAP-E и ДНК (с помощью высокочувствительного ДНК-специфичного флуорохрома PicoGreen) показала, что XCAP-E в ядрышке не связан с рибосомной ДНК и таким образом не может участвовать в структурной организации рибосомных генов. В дальнейших экспериментах были использованы антитела против маркерных белков гранулярного компонента (NO38) и плотного фибриллярного компонента ядрышка (Nopp180). Двойное окрашивание расправленных препаратов зародышевых пузырьков этими антителами и антителами против XCAP-E продемонстрировало высокую степень колокализации NO38 и XCAP-E, тогда как сигналы XCAP-E и Nopp180 практически не перекрывались, что свидетельствует в пользу преимущественной ассоциации XCAP-E с гранулярным компонентом ядрышка. Эта ассоциация не нарушается при сегрегации ядрышек в ответ на ингибирование транскрипции под действием актиномицина D или DRB. Возможно, секвестрирование 8S субкомплексов в ядрышке предотвращает их взаимодействие с регуляторными субъединицами, ассоциированными с профазными хромосомами и преждевременную сборку холокомплекса до завершения профазы I мейоза. Эта гипотеза хорошо согласуется с предложенной схемой двухступенчатой посадки конденсинового комплекса на хромосомы.

4. ВЫВОДЫ.

1. Митотическая компактизация хромосом — многостадийный процесс, сопровождающийся формированием двух промежуточных уровней упаковки хроматина: 200-250 нм и 400 нм фибрилл, образующихся путем иерархической укладки хромонем диаметром 100 нм.

2. Образование факультативного гетерохроматина при глобальная инактивации транскрипции Х-хромосомы сопровождается упаковкой хроматина в фибриллы диаметром 200-400 нм, при сохранении доступности внутренних областей хромосомной территории для трансфакторов 3. На ультраструктурном уровне гетерохроматиновые репликативные сайты представляют собой сегменты хроматиновых фибрилл высшего порядка. Индивидуальные реплисомы равномерно распределены в объеме реплицирующихся доменов, не образуя компактных репликативных «фабрик». Репликация гетерохроматиновых локусов не требует полного разворачивания хромонемных фибрилл.

4. Поперечная дифференцированность митотических хромосом на периферическое гало и плотный осевой кор, выявляемая при помощи гипотонической обработки живых клеток, коррелирует с распределением эу- и гетерохроматина: транскрипционно-активный рано реплицирующийся хроматин располагается на периферии хромосом, а гетерохроматин занимает центральное положение.

5. Активация транскрипции эухроматических генов сопровождается частичной деконденсацией высших уровней упаковки хроматина и транскрипция может осуществляться на высококонденсированной матрице.

6. Транскрибирующиеся гены демонстрируют высокую локальную подвижность, что указывает на отсутствие ассоциации транскрипционных комплексов с ригидными скелетными структурами клеточного ядра.

7. Нарушение реконденсации митотических хромосом после гипотонического воздействия in vivo в результате блокады транспорта Са++ через плазматическую мембрану свидетельствует о роли физиологических концентраций Ca++ в поддержании высших уровней организации хромосом.

8. Конденсины и топоизомераза II не принимают участия в формировании хромосомной оси в ходе профазной компактизации хромосом. Их роль в митотической компактизации хромосом связана со стабилизацией метафазных хромосом, возможно, путем рекрутирования других архитектурных хромосомных белков.

9. Нарушение связи конденсинов с метафазными хромосомами при индуцированной обратимой деконденсации, а также в процессе стабилизации конденсированного состояния хромосом при разрушении веретена деления свидетельствует о том, что конденсины не принимают участия в поддержании компактной структуры полностью сформированных хромосом.

10.В профазе мейоза I компактизация хроматина в осевых гранулах (хромомерах) не требует присутствия 13S конденсина.

11.Сборка 13S конденсинового комплекса осуществляется непосредственно на хромосомах (по крайней мере, в мейозе), причем XCAP-D2, по-видимому, связывается с хроматином первым и обеспечивает рекрутирование остальных субъединиц.

12.Субъединицы конденсина локализуются в различных структурно-функциональных доменах ядра независимо друг от друга. XCAPD2 связывается в осевыми структурами хромосом и тельцами Кахаля, тогда как XCAP-E взаимодействует с гранулярным компонентом ядрышек.

Список научных статей, опубликованных по теме диссертации:

1. Belmont AS, Hu Y, Sinclair PB, Wu W, Bian Q, Kireev I. Insights into Interphase Large-Scale Chromatin Structure from Analysis of Engineered Chromosome Regions. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. (2010). 75: 453460.

2. Hu Y., Kireev I., Plutz M., Ashourian N., Belmont AS. Large-scale chromatin structure of inducible genes: transcription on a condensed, linear template. J.

Cell Biol. (2009), 185:87-100.

3. Kireev I, Lakonishok M, Liu W, Joshi VN, Powell R, Belmont AS. In vivo immunogold labeling confirms large-scale chromatin folding motifs. Nat Methods. (2008), 5(4):311-313.

4. Rego A, Sinclair PB, Tao W, Kireev I, Belmont AS. The facultative heterochromatin of the inactive X chromosome has a distinctive condensed ultrastructure. J Cell Sci. (2008), 121(Pt 7):1119-1127.

5. Novikov DV, Kireev I, Belmont AS. High-pressure treatment of polytene chromosomes improves structural resolution. Nat Methods. (2007), 4(6):483485.

6. В.Ю. Поляков, О.В. Зацепина, И.И. Киреев, А.Н. Прусов, Д. Фаис, Е.В.

Шеваль, Ю.В. Коблякова, С.А. Голышев, Ю.С. Ченцов. Структурно-функциональная модель митотической хромосомы. Биохимия (2006), 71(1):6-16.

7. Kobliakova I, Zatsepina O, Stefanova V, Polyakov V, Kireev I. The topology of early- and late-replicating chromatin in differentially decondensed chromosomes. Chromosome Res. (2005), 13(2):169-181.

8. Sheval EV, Kireev II, Polyakov VY. Stabilization of macromolecular chromatin complexes in mitotic chromosomes by light irradiation in the presence of ethidium bromide. Cell Biol Int. (2004), 28(12):835-843.

9. Kireeva N, Lakonishok M, Kireev I, Hirano T, Belmont AS. Visualization of early chromosome condensation: a hierarchical folding, axial glue model of chromosome structure. J Cell Biol. (2004), 166(6):775-785.

10.Prusov A.N., Kireyev I.I., Polyakov V.Yu. Visible light irradiation of ethidium bromide-stained interphase nuclei causes DNA-protein linking and structural stabilization of nucleoprotein complexes. Photochemistry & Photobiology (2003), 78 (6):592-598.

11.Beenders B, Watrin E, Leganeux V, Kireev I, Bellini M. Distribution of XCAP-E and XCAP-D2 in the Xenopus oocyte nucleus.Chromosome Res., (2003), 11:549-564.

12.Тимирбулатова Э.Р., Киреев И.И., Картавенко Т.В., Гулак П.В., Поляков В.Ю., Ле Геллек К., Узбеков Р.Э. Исследование внутриклеточной локализации белка XCAP-E в клетках линии XL2 (Xenopus laevis) в норме и при ингибировании транскрипции и процессинга рРНК. Цитология (2003), 45:290-297.

13.Курчашова С.Ю., Филимоненко В.В., Гулак П.В., Киреев И.И., Поляков В.Ю., Гозак П. Индукция формирования ядерной оболочки вокруг индивидуальных хромосом под действием гипотонического шока. Цитология (2003), 45:298-307.

14.Uzbekov R, Timirbulatova E, Watrin E, Cubizolles F, Ogereau D, Gulak P, Legagneux V, Polyakov VJ, Le Guellec K, Kireev I. Nucleolar association of pEg7 and XCAP-E, two members of Xenopus laevis condensin complex in interphase cells. J Cell Sci. (2003); 116(Pt 9):1667-1678.

15.Тимирбулатова Э.Р., Киреев И.И., Грабеклис С.А.,Гулак П.В., Ле Геллек К., Поляков В.Ю., Узбеков Р.Э. Внутриклеточная локализация конденсинов XCAP-E pEg7 в норме и в условиях, вызывающих искусственное изменение структуного состояния митотических хромосом. Цитология (2002); 44(6):576-584.

16.Sheval EV, Prusov AN, Kireev II, Fais D, Polyakov VY. Organization of higher-level chromatin structures (chromomere, chromonema and chromatin block) examined using visible light-induced chromatin photo-stabilization.

Cell Biol Int. (2002), 26(7):579-591.

17.Chudinova EM, Kireev IL, Fais D, Gianguzza F, Giudice G, Morici G, Vorobjev IA, Poliakov VY. Noncanonical structural-functional organization of nucleoli in maturing oocytes of sea urchin Paracentrotus lividus. J Submicrosc Cytol Pathol. (2001), 33(3):301-311.

18.Шеваль Е.В., Гулак П.В., Киреев И.И., Чудинова Е.М., Фаис Д., Джангуцца Ф., Поляков В.Ю. Особенности сегрегации «неканонического» ядрышка ооцитов морского ежа Paracentrotus lividus. Онтогенез (2001), 32(5):377-383.

19.Коблякова Ю.В., Киреев И.И., Стефанова Е.Н., Зацепина О.В., Поляков В.Ю. Дифференциальная деконденсация митотических хромосом культуры СПЭВ вызванное двойным гипотоническим шоком. Цитология (2001), 43(5):462-470.

20.Шеваль Е.В., Прусов А.Н., Киреев И.И., Поляков В.Ю. Изучение структурных и структурно-функциональных субдоменов интерфазного ядра методом фотостабилизации. Цитология. (2001); 43(2):122-132.

21.Курчашова С.Ю., Прусов А.Н., Гулак П.В., Киреев И.И., Поляков В.Ю.

Особенности взаимодействия белка анкоросом p68 с ядерной оболочкой в клеточном цикле. Онтогенез (2000), 31(6):429-439. Russian.

22.Vladimirskaya EA, Kireyev II, Prusov AN, Fais D. Spatial localization of chromosome-nuclear envelope interaction sites. Membr Cell Biol. (1999), 12(6):857-869.

23.Amchenkova AA, Buzhurina IM, Gorgidze LA, Kireyev IV, Panov MA, Polyakov VJ. The role of Ca ions in restoration of the structure of interphase and mitotic chromosomes in PK living cells after hypotonic stress. Cell Biol Int. (1998), 22(7-8):509-515.

24.Ямшанов А.Н., Киреев И.И., Прусов А.Н., Поляков В.Ю. Стабилизация макромолекулярных комплексов хроматина под действием видимого света в присутствие бромистого этидия. Цитология. (1998), 40(4):340-346.

25.Чудинова Е.М., Зацепина О.В., Воробьев И.А., Файс Д., Киреев И.И., Джудиче Д., Поляков В.Ю. Локализация аргентофильных белков в ядрышках ооцитов морского ежа Paracentrotus lividus. Цитология (1998), 40:302-326.Крохина Т.Б., Терехов С.М., Киреев И.И., Ляпунова Н.А., Тодоров И.Н.

Действие циклогексимида на синтез белка, РНК и ДНК в культуре клеток CHO и диплоидных фибробластов человека. Бюлл. Эксп. Биол.Мед.

(1991), 112(8):139-141.

27.Киреев И.И., Зацепина О.В., Поляков В.Ю., Ченцов Ю.С. Динамика структурной реконструкции митотических хромосом после их искусственной деконденсации in vitro. Цитология (1990), 32(5):449-454.

28.Zatsepina O.V., Kireyev I.I., Frolova E.I., Polyakov V.Yu., Chentsov Yu.S.

(1990) Chromomere - the structural unit of the chromtin in the interphase nucleus. In: Nuclear structure and functions. Eds. Zbarsky I.B., Harris J.R.

Plenum Press, New York., pp. 301-304.

29.Киреев И.И., Зацепина О.В., Поляков В.Ю., Ченцов Ю.С.

Ультраструктура митотических хромосом клеток СПЭВ в ходе их обратимой искусственной деконденсации in vivo. Цитология (1988), 30(8):926-932.

По материалам диссертации было также сделано 24 доклада на Всесоюзных и Всероссийских научных конференциях и 8 докладов на международных научных конференциях, тезисы которых опубликованы в научных журналах (25 докладов) или специальных сборниках (7 докладов).

Структура и объём диссертации:

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы по теме исследования, описания методов исследования, 6 глав результатов, заключения, выводов, листа благодарностей, библиографического списка, включающего ____ наименований, и приложений. Работа изложена на ____ листах машинописного текста, содержит ___фотографии, ___графиков, __схем и рисунков, __таблиц.






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.