WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


 

На правах рукописи

Романова
Людмила Васильевна

FRANCISELLA TULARENSIS: НЕКОТОРЫЕ АСПЕКТЫ ЭКОЛОГИИ И ДИАГНОСТИКИ

03.00.07 - микробиология

Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
доктора биологических наук

Ставрополь – 2008

Работа выполнена в ФГУЗ «Ростовский-на-Дону научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора РФ.

Научный консультант:        доктор биологических наук, профессор

       Борис Николаевич Мишанькин.

Официальные оппоненты:        доктор медицинских наук, профессор

       Нина Пантелеймоновна Буравцева;

       доктор биологических наук, профессор

       Виктор Григорьевич Майский;

       доктор биологических наук

       Ирина Сергеевна Мещерякова.

Ведущая организация:        ФГУЗ «Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока» Роспотребнадзора РФ.

Защита диссертации состоится 18 июня 2008 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета ДМ 212.256.09 в Ставропольском государственном университете по адресу: 355009, г. Ставрополь, ул. Пушкина, 1, корп. 2, комн. 506.

С диссертацией можно познакомиться в библиотеке Ставропольского государственного университета.

Автореферат разослан ________________________________ 2008 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета        Ржепаковский И.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ



Актуальность проблемы. Туляремия - зоонозное природно-очаговое инфекционное заболевание, известное еще с давних времен. Упоминания о страшной эпидемии, сходной с бубонной чумой или тифом, которая поразила Древний Египет в середине бронзового века, были обнаружены в медицинских папирусах, датированных 1715 г. до н.э. (Trevisanoto S., 2004,2007). Она характеризуется различными механизмами и путями передачи возбудителя, лихорадкой, интоксикацией, образованием лимфаденитов, полиморфизмом клеточных проявлений, затяжным течением (Francis F., 1925; Олсуфьев Р.Г.,1970,1975; Гусева Е.В. и др. 2002; Ellis J. et al., 2002; Khoury J. et al., 2005; Petersen J. et al., 2005).

Несмотря на несомненные успехи в борьбе с возбудителями особо опасных болезней в целом, значимость туляремийного микроба, как этиологического фактора в патологии человека, не только не снижается, но и проявляет тенденцию к нарастанию (Мещерякова И.С., 1983, 1997, 2002, 2003; Онищенко Г.Г., 1998, 2001, 2002, 2005; Сергиев В.П. и др.,1999; Покровский В.И. и др., 1999; Шаханина И.Л. и др. 2001; Домарадский И.В., 2005). К тому же возбудитель туляремии входит в перечень патогенных биологических агентов, которые могут быть использованы в качестве биологического оружия. Такого рода агенты должны отвечать комплексу критериев, учитывающих их биологические параметры в сочетании с взаимоотношением с организмом человека, средой обитания, а также технологическими, техническими и экономическими показателями. Согласно классификации А.А. Воробьева (2001), возбудитель туляремии включен в I группу биоагентов. Реальная возможность применения противником биологического оружия в локальных войнах, вооруженных конфликтах или при террористических актах является серьезной проблемой для любой страны (Мельниченко П.И. и др., 2000; Лобзин Ю.В. и др., 2001; Воробьев А.А., 2001; Cronquist S., 2004; Онищенко Г.Г., 2005; Jones S. et al., 2005; Tomioka K. et al., 2005). Для решения проблемы национальной биологической безопасности издан Указ Президента Российской Федерации № 2194 от 4.12.2003 г., определяющий основы государственной политики в области обеспечения химической и биологической безопасности Российской Федерации на период до 2010 года и дальнейшую перспективу. Учитывая высокую инфекциозность возбудителя туляремии при минимальной заражающей дозе, длительную утрату трудоспособности инфицированных людей, его значительную устойчивость в окружающей среде, способность к эпидемическому распространению и др., возбудитель был включен в «Перечень возбудителей (патогенов) человека, животных и растений, генетически измененных микроорганизмов, токсинов, подлежащих экспортному контролю в целях защиты национальных интересов и обеспечения выполнения международных обязательств Российской Федерации, вытекающих из Конвенции о запрещении разработки, производства и пополнения запасов бактериального (биологического) и токсинного оружия и об их уничтожении» (Указ Президента РФ №1004 от 8.08.2001).

В настоящее время род Francisella включает два вида - Francisella tularensis и Francisella philomiragiа, а вид F. tularensis представлен четырьмя подвидами – F. tularensis subsp. tularensis (тип А), F. tularensis subsp. holarctica (тип В), F. tularensis subsp. mediaasiatica и F. tularensis subsp. novicida. Четыре подвида заметно различаются по вирулентности и по месту выделения в различных регионах мира, однако имеют сходную антигенную структуру (Broekhuijsen M. et al., 2003; Sjostedt A., 2003; Titball R.et al., 2003; Johansson A et al, 2004; Svensson K.et al., 2005). Наиболее вирулентные изоляты возбудителя принадлежат к F. tularensis subsp. tularensis. Хотя в настоящее время сфера распространения этого подвида ограничена Северной Америкой, сообщалось о выделении штаммов неарктического подвида в Европе (Gurycova D., 1998).

В последнее десятилетие эпидемиологическая и эпизоотологическая обстановка в России по туляремии оценивается как напряженная (Онищенко Г.Г., 2001, 2002; Мещерякова И.С., 1998, 2002; Горшенко В.Р. и др., 2001). Существование в естественных биоценозах стойких природных очагов туляремии, заметная тенденция к появлению новых эндемичных очагов объясняет необходимость проведения постоянного мониторинга за состоянием этих очагов с использованием комплекса бактериологических, серологических и генодиагностических методов исследования. Занимая около 80% территории Юга России, природные очаги туляремии характеризуются исключительной стойкостью, циклическим проявлением активности, что обусловливает периодические подъемы заболеваемости. К факторам, определяющим устойчивость природных очагов туляремии, относят полигостальность, поливекторность, множественность механизмов передачи возбудителя, его гидрофильность (способность длительно сохраняться в водных экосистемах, особенно при низких температурах и, вероятно, в ассоциациях с беспозвоночными животными гидробионтами), а также возможность персистировать в организме восприимчивых животных (Олсуфьев Н.Г., и др. 1969, 1970, 1979; Шеенко Н.В. и др.,2006) и во внешней среде.

В последние годы при эпизоотологическом обследовании природных очагов туляремии отмечается снижение количества культур возбудителя, изолированных от млекопитающих, членистоногих и из различных объектов окружающей среды (Мещерякова И.С., 1998). Однако, следует отметить, что относительно благополучная эпизоотологическая обстановка не дает представления об истинной ситуации в паразитарной системе. Проводимые при этом исследования не всегда учитывают в полном объеме условия циркуляции микроба и сохранения его во внешней среде. Не учитывается возможность пребывания туляремийного микроба в окружающей среде в виде некультивируемых форм. Существование подобных покоящихся форм, получивших название «некультивируемых» у ряда патогенных бактерий, имеет прямое отношение к закономерностям резервации возбудителей в природе и их адаптации к неблагоприятным условиям среды. Обладая сниженным метаболизмом, такие формы обеспечивают выживаемость популяции в неблагоприятных (стрессовых) экологических условиях в покоящемся состоянии в результате сохранения способности реверсировать в вегетативные вирулентные формы при изменении условий существования (Литвин В.Ю. и др., 1998; Colwell R.et al., 1986; Colwell R., Huq K., 1994). Используемые в лабораторной практике методы определения жизнеспособности бактериальных клеток (бактериологические) непригодны для выявления некультивируемых форм (НФ) бактерий в окружающей среде. Между тем проблема НФ возбудителя туляремии представляет не только теоретический интерес, но имеет огромное практическое значение, поскольку эти формы, по-видимому, способны поддерживать существование возбудителя в окружающей среде в межэпизоотические (межэпидемические) периоды.

В связи с этим возникла необходимость разработки новых, достаточно информативных методов обнаружения и идентификации туляремийного микроба, а также совершенствование тактики лабораторной диагностики в целом при эпизоотологическом надзоре за природными очагами туляремии.

Все это обусловило настоятельную необходимость внедрения принципиально нового и важного направления, связанного с изучением разных аспектов адаптационной изменчивости туляремийного микроба, позволяющей ему сохраняться в объектах внешней среды в межэпизоотические (межэпидемические) периоды, а также разработкой новых методических подходов обнаружения и идентификации возбудителя туляремии как в лабораторных условиях, так и при исследовании объектов внешней среды активных природных очагов.

Цель исследования: изучение феномена перехода возбудителя туляремии в некультивируемое состояние, в котором он может существовать в межэпизоотический период, исследование механизмов адаптации патогена к неблагоприятным условиям среды, разработка новых методических подходов к идентификации как типичных, так и атипичных штаммов F. tularensis, включая его некультивируемые формы, с использованием молекулярно-биологических методов.

Задачи исследования:

1. Выявить способность клеток туляремийного микроба к переходу в некультивируемое состояние.

2. Изучить влияние искусственно созданных неблагоприятных условий внешней среды на способность перехода туляремийного микроба в некультивируемое состояние.

3. Изучить влияние стрессовых факторов (голодание, тепловой, осмотический и солевой стресс) на основные свойства возбудителя туляремии.

4. Сконструировать ДНК-зонд для идентификации возбудителя туляремии.

5. Сконструировать специфические праймеры для индикации возбудителя туляремии в ПЦР.

6. Апробировать методы ДНК - зондирования и ПЦР - анализа для детекции и идентификации атипичных штаммов F. tularensis, включая некультивируемые формы возбудителя.

7. Подобрать универсальные (случайные) праймеры для исследования генома туляремийного микроба в системе однопраймерной ПЦР.

8. Определить место ПЦР в системе эпидемиологического надзора за туляремией (молекулярно - биологический уровень эпидемиологического надзора).

9. Усовершенствовать тактику лабораторной диагностики при эпидемиологическом надзоре за туляремией.

Научная новизна и теоретическая значимость работы. Впервые описан феномен перехода возбудителя туляремии в некультивируемое состояние под влиянием условий внешней среды. Показано, что ревертанты некультивируемых форм туляремийного микроба восстанавливают свои основные свойства, в том числе и вирулентность. Существование таких покоящихся форм имеет прямое отношение к резервации возбудителя и его адаптации к неблагоприятным условиям среды. Определено, что возбудитель туляремии наделен важной для персистенции адаптивной пластичностью, проявляющейся в его адекватной реакции на стрессовые факторы окружающей среды. Предложен комплекс молекулярно-биологических приемов для обнаружения и идентификации возбудителя туляремии. Сконструирован и апробирован ДНК-зонд для идентификации F. tularensis, сконструированы специфические праймеры для индикации возбудителя туляремии. Подобраны универсальные (случайные) праймеры для изучения генома (ПЦР-типирование, геномотипирования, генотипирование) туляремийного микроба в системе однопраймерной ПЦР. С помощью этих праймеров показана генетическая гетерогенность штаммов представителей рода Francisella. Впервые определено место ПЦР в практике эпизоотологического и эпидемиологического надзора за туляремией в природных очагах. Метод ПЦР при условии низкотемпературного хранения проб полевого материала повышает эффективность эпизоотологического мониторинга территорий, так как обеспечивает возможность ускоренного предварительного отбора положительных проб для последующего целенаправленного бактериологического анализа, а также дает возможность обнаружения туляремийных микробов, находящихся в некультивируемом состоянии, в котором они персистируют в окружающей среде в межэпизоотический период.

Наше исследование позволило предложить новый комплекс информативных методов обнаружения и идентификации как типичных, так и измененных форм туляремийного микроба, усовершенствовать тактику лабораторной диагностики при эпизотоологическом надзоре за природными очагами туляремии. Проведенные эксперименты по стрессовым воздействиям можно рассматривать как моделирование определенных экологических ситуаций, в которые попадает F.tularensis во время пребывания во внешней среде, а также его возможности для выживания. Они позволяют лучше понять экологию возбудителя вообще и его поведение в стрессовых условиях, в частности, выявить факторы внешней среды, вызывающие индукцию некультивируемых форм у туляремийного микроба, что важно для объективного прогнозирования состояния природных очагов туляремии и определения объема профилактических мероприятий, необходимых для предупреждения возникновения эпизоотических и эпидемических осложнений.

Практическая значимость. Результаты исследований оформлены, утверждены и нашли свое отражение в следующих документах.

  • В Государственной коллекции патогенных бактерий «Микроб» депонирован штамм - продуцент плазмидной ДНК E.coli JM 103 pRD6-KM7, Саратов, 1988.
  • Оформлена инструкция по изготовлению и контролю препарата ДНК – зонда для диагностики возбудителя туляремии, Ростов-на-Дону, 1990 (одобрена Ученым Советом и утверждена директором РПЧИ 14.05.90, протокол №6).
  • Получено авторское свидетельство « Рекомбинантная плазмидная ДНК pRD6 - источник зонда для тестирования представителей рода Francisella, штамм бактерий Echerichia coli, содержащий рекомбинантную плазмидную ДНК pRD6 - источник зонда для тестирования представителей рода Francisella», М., №1669981, 1991.
  • Предложены: «Методические рекомендации по использованию ПЦР для генотипического скрининга штаммов Francisella tularensis», Ростов-на-Дону, 1994 (одобрена Ученым Советом и утверждена директором РПЧИ 11.07.94, протокол №6).
  • Методические рекомендации. «Детекция туляремийного микроба методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с помощью родоспецифических праймеров», Ростов-на-Дону, 1997 (одобрены Ученым Советом и утверждена директором РПЧИ 19.07.97, протокол №5).
  • Методические рекомендации. «Иcпользование метода ПЦР для детекции Francisella tularensis», Саратов, «Микроб», 1998.
  • «Методические рекомендации по получению некультивируемых форм туляремийного микроба», Ростов-на-Дону, 1999 (одобрены Ученым Советом и утверждена директором РПЧИ 24.12.99, протокол №5).
  • Методические рекомендации. «Совершенствование эпидемиологического надзора и тактики лабораторных исследований при эпидемиологическом мониторинге природных очагов туляремии», Ростов-на-Дону, 2000 (одобрены Ученым Советом и утверждены директором РПЧИ 5.04.00, протокол №3).

Предложения и рекомендации используются в работе лабораторий различных противочумных учреждений (лаборатория туляремии РНИПЧИ, зоолого-паразитологический отдел ФГУЗ Северо-Кавказской противочумной станции Ростпотребнадзора, Ставропольский НИПЧИ, Иркутский НИПЧИ Сибири и Дальнего Востока и др.), а также при чтении лекций на курсах специализации и усовершенствования врачей и лаборантов по ООИ при Ростовском ПЧИ. Акты внедрения представлены в приложении.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Возбудитель туляремии под воздействием стрессовых условий окружающей среды способен обратимо переходить в некультивируемое состояние, что должно обеспечивать ему возможность персистировать в окружающей среде в межэпизоотический период. Полученные ревертанты некультивируемых форм туляремийного микроба сохраняют свои основные дифференциально-диагностические свойства, в том числе и вирулентность. Факт существования некультивируемых форм туляремийного микроба имеет прямое отношение к резервации возбудителей и их адаптации к неблагоприятным условиям среды.

2. Возбудитель туляремии наделен исключительно важной для персистенции адаптивной пластичностью, что проявляется в его адекватной реакции на стрессовые факторы окружающей среды. Возбудитель туляремии способен к индукции стрессового ответа in vivo и in vitro, который сопровождается заметной перестройкой его метаболизма и структуры хромосом.

3. С помощью современных молекулярно-генетических технологий, включающих клонирование, зондирование и ПЦР-анализ подобран комплекс молекулярно-биологических методических приемов для обнаружения и идентификации возбудителя туляремии. Сконструированный ДНК-зонд, а также полученные на его базе специфические праймеры позволяют выявлять туляремийный микроб в ПЦР как в чистой культуре, так и в смеси культур с другими микроорганизмами. ОП-ПЦР с универсальными праймерами позволяет осуществлять генотипический скрининг штаммов туляремийного микроба, идентификацию штаммов на межродовом и внутривидовом уровне и демонстрировать их генетическое разнообразие.

4. ПЦР-анализ в силу своей чувствительности и специфичности позволяет использовать его в качестве надежного инструмента в системе эпидемиологического надзора за туляремией. Применение ПЦР в комплексе с бактериологическим и иммуно-серологическими методами, а также криоконсервированием при исследовании различных компонентов паразитарной системы и абиотических объектов позволяет оперативно получать эпидемиологически значимую информацию, необходимую для углубленного суждения об эпидемическом потенциале природного очага или защиты общества от угрозы биологического нападения.

Апробация работы. Результаты исследований были представлены на научных конференциях:

Актуальные проблемы профилактики туляремии. Симферополь, 1991. Актуальные проблемы особо опасных и природноочаговых инфекционных болезней. Иркутск, 1994. Актуальные проблемы разработки мед. средств и методов сохранения и восстановления боеспособности личного состава вооруженных сил. Санкт-Петербург, 1994. Актуальные проблемы профилактики чумы и других инфекционных заболеваний. Ставрополь,1994. 7 European Сongress of Clinical Microbiology and Infection Diseases. Vienna, 1995. Научно-производственная конференция, посв. 100-летию образования противочумной службы России. Саратов, 1997. Second International Conference of Tularemia. Hradec Kralove, 1997, Чехия. Всероссийская конференция - ПЦР в диагностике и контроле лечения инфекционных заболеваний. Москва, 1998. Всероссийская конференция - Гомеостаз и инфекционный процесс. Саратов, 1998. Природноочаговые инфекции в России: Современная эпидемиология, диагностика, тактика защиты населения. Омск, 1998. I Всероссийская научно-практическая конференция - Генная диагностика ООИ. Саратов, 2000.VL Российско-Итальянская научная конференция. Инфекционные болезни. Диагностика, лечение, профилактика. Москва, 2000. 9 International Congress for Culture Collection. Brisban (Australia), 2000. Актуальные вопросы ООИ. Нальчик, 2000. 3 International Conference on Tularemia. Umea (Sweden), 2000. Российская научно-производственная конференция. Эпидемиологический надзор и социально-гигиенический мониторинг. Москва, 2002. 4 International Conference on Tularemia. The Assembly Rooms, City of Bath, United Kingdom, 2003. Медицинская микробиология - XXI век. Саратов, 2004. Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении в решениях Санкт-Петербургского саммита «Группы восьми» и санитарная охрана территорий государств - участников содружества независимых государств. Оболенск, 2006.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 44 (19 из них в центральной печати и в материалах международных конференций) работы, подготовлено 6 нормативно правовых документов. Исследования выполнены в течение 1990-2004 годов в рамках 5 плановых научных тем (номера государственной регистрации 01.93.0 003258, 01.9.50 003708, 01.9.70 009328, 01.9.70 009332, 01.200.1 15561), в которых автор являлся соруководителем или ответственным исполнителем.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 298 листах машинописного текста, состоит из Введения и 5 глав, включающих обзор литературы и результаты собственных исследований, заключения, выводов и приложения. Работа иллюстрирована 15 таблицами и 35 рисунками. Указатель литературы включает 601 источник, из них 234 отечественных и 367 иностранных авторов.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Материалы и методы

Бактериальные штаммы и плазмиды. В работе использовали штаммы F. tularensis, неарктического, среднеазиатского и голарктического подвидов а также штаммы F.novicida, F.novicida-like и F.philomiragia (любезно предоставленные И.С.Мещеряковой), штаммы бактерий родов Yersinia, Vibrio, Escherichia и др. из музея живых культур РПЧИ.

Методы. В разделе содержится описание бактериологических методов, использованных при выделении, культивировании и изучении свойств микроорганизмов, молекулярно-биологических методов выделения плазмидной и хромосомальной ДНК, гибридизации ДНК, рестрикционного анализа, ПЦР, а также биохимических методов и методов изучения фагоцитоза. Эпидемиологические проявления туляремии изучены по периодам, выделенным в соответствии с действующими на момент исследования «Методическими указаниями по лабораторным методам диагностики при эпизоотологическом обследовании природных очагов туляремии» (М., 1983).

Статистическую обработку материала проводили на ПЭВМ Pentium Intel Pioner с помощью программ APMCTAT, Exell 7.0 и FoxPro 2.6.5.

2. Результаты молекулярно - биологических исследований

Francisella tularensis

Молекулярное зондирование. Методом молекулярного клонирования на основе вектора pUC19 была сконструирована рекомбинантная плазмида с EcoRI-фрагментом ДНК размером в 800 п.н., комплементарным видоспецифическому участку хромосомной ДНК туляремийного микроба. Из случайно отобранных клонов с наименьшей подвижностью плазмид при электрофорезе по сравнению с исходным вектором pUC19 была отобрана молекула со встроенным EcoRI-фрагментом длиной 800 п.н. Плазмиду обозначили как pRD6.





В результате определения первичной структуры клонированного EcoRI-фрагмента ДНК F. tularensis и проведенного компьютерного анализа нуклеотидной последовательности построена физическая карта фрагмента по сайтам узнавания для 34 рестриктаз, определен GC-состав клонированного участка ДНК. Содержание GC составило 34,8%, причем распределение GC-пар по длине фрагмента оказалось неравномерным с явно выраженным минимумом в средней части, доходящим до 28% и ниже. Содержание GC-пар у изученного фрагмента является аномально низким, тогда как для большинства грамотрицательных микроорганизмов оно в среднем составляет 50-55% и лишь у немногих неродственных видов снижается до 35-40% (Hames B. et al.,1985). Вероятно, подобное низкое GC-содержание является особенностью клонированного фрагмента. На исследованном участке идентифицированны три потенциальных промотора, сходных с консенсусной последовательностью промотора кишечной палочки (85%, 89%, 85%, соответственно), на небольшом расстоянии за которыми находились последовательности, гомологичные последовательностям Шайна-Дальгарно, и АТG-кодоны. Транслируемые с этих инициирующих кодонов аминокислотные последовательности не прерывались стоп-кодонами до 3’-конца фрагмента.

При сравнении локализации первичной структуры полученного Eco RI-фрагмента ДНК туляремийного микроба в пределах недавно прочитанной полной нуклеотидной последовательностью хромосомной ДНК F. tularensis Schu (Larsson P. et al., 2005) удалось определить его местоположение (рис. 1). Наш EcoRI фрагмент расположен между 550 000 п.н. и 560 000 п.н. хромосомы возбудителя туляремии в области гена бифункционального белка – глутаредоксина 3.

В составе фрагмента ДНК, специфичном для представителей F. tularensis, удалось обнаружить структуру, весьма напоминающую IS-подобный элемент. При анализе EcoRI -фрагмента pRD6 были выявлены образования, характерные как для IS-элемента, так и для «генетического переключателя» (рис. 2).

Рис. 1. Локализация EcoRI фрагмента на физической карте
хромосомы туляремийного микроба.

Участок последовательности с 295 по 672 нуклеотид несет по концам несовершенные инвертированные повторы из 17 нуклеотидных пар и имеет в пяти рамках считывания из шести возможных большое количество стоп-кодонов. В оставшейся рамке нет ни одного терминируюшего кодона и находится последовательность, имеющая высокую степень гомологии с обобщенным промотором E.coli. Кроме того, этот участок фланкирован прямым совершенным повтором в 9 п.н., что характерно для IS-элементов, которые удваивают небольшой участок ДНК в области встраивания.

Рис. 2. Фланкирующий совершенный и концевой инвертированный
несовершенный повторы предполагаемого
мобильного элемента EcoRI-фрагмента pRD6.

Взаимодействие между основаниями: - -уотсон-криковское; *-неуотсон-криковское.

Перечисленные особенности позволяют с определенной долей вероятности утверждать, что представленный участок ДНК несет характерный для F. tularensis мобильный генетический элемент, который может выполнять различные функции, включая функцию генетического переключателя. В случае, если рассмотренная структура является реальным мобильным элементом, копийность которого на хромосоме может варьировать, становится понятным описанное ниже различие в гибридизационном сигнале между F. tularensis и F. novicida. Этот факт может дополнительно свидетельствовать в пользу самостоятельности вида F. novicida.

EcoRI фрагмент был использован в качестве ДНК зонда для тестирования Francisella spp. Результаты гибридизации приведены в табл. 1, из которой следует, что с зондом гибридизовались только 171 штамм представителей F. tularensis (ДНК F. novicida давала сигнал в 2 раза слабее) и не взаимодействовали представители других близкородственных (Brucella spp.) и отдаленных видов микроорганизмов, что позволяет использовать этот зонд для видоспецифического тестирования франсисел.

Следует отметить, что при переносе по Саузерну разделенных с помощью электрофореза в геле агарозы гидролизованных по EcoRI препаратов ДНК F. novicida и F. tularensis (неарктический, среднеазиатский и голарктический подвиды) с последующей гибридизацией с ДНК-зондом, расположение комплиментарных зонду последовательностей ДНК для различных подвидов было разным, что объясняется отличиями в структуре хромосом сравниваемых подвидов. Чувствительность ДНК-зонда на модели клеток штамма F. tularensis 15/10 составила 5Х104-6Х105 микробных клеток на пятно, или 5Х107-108 кл/мл, что является обычным для данного метода исследования.

ДНК-зонд был использован при сравнительном исследовании биологических свойств коллекции штаммов F.tularensis, выделенных в 1987-1998 гг. в различных регионах Советского Союза. В работе использовали 171 штамм F.tularensis, выделенный из различных источников в разных районах СССР в 1987-1989 гг., а также 3 музейных штамма голарктической, среднеазиатской и неарктической разновидностей (503, 543 и Schu, соответственно), изолированных более 20 лет назад. География выделения использованных в работе штаммов туляремийного микроба оказалась обширной и была представлена, в частности, Ленинградской, Ростовской, Одесской, Крымской областями, Калмыцкой АССР, а также Средней Азией (Казахской ССР) и Сибирью (Иркутская область).

Сконструированный на основе фрагмента хромосомы F.tularensis 15/10 зонд давал положительные результаты со всеми штаммами F.tularensis собранной коллекции вне зависимости от географии их выделения.

Ранее в лаборатории туляремии РостНИПЧИ была получена и охарактеризована коллекция авирулентных бескапсульных и капсулодефицитных мутантов F. tularensis (15 штаммов) (Павлович Н.В. и др., 1993; Sorokin V., 1997). Такие варианты возбудителя туляремии были авирулентны для высоко чувствительных лабораторных животных (белые мыши, морские свинки и кролики) и обладали измененной антигенной структурой (отрицательные результаты в РНАт с коммерческим диагностикумом) (Павлович Н.В., 1993).

Таблица 1.

Результаты гибридизации микроорганизмов разных видов с ДНК-зондом
для тестирования представителей Francisella tularensis

Вид микроорганизмов

Кол-во

штаммов

Гибридизация с

ДНК-зондом

Francisella tularensis (представители

голарктического, неарктического

и среднеазиатского подвидов)

171

++++

Francisella novicida

1

++

Francisella philomiragia

1

-

Escherichia coli

26

-

Yersinia pestis

6

-

Yersinia pseudotuberculosis

13

-

Yersinia enterocolitica

22

-

Yersinia kristensenii

5

-

Yersinia intermedia

2

-

Vibrio cholerae

13

-

Pseudomonas aeruginosa

2

-

Pastereulla multocida

2

-

Klebsiella pneumonia

2

-

Alcaligenes faecalis

2

-

Proteus vulgaris

2

-

Bacillus subtilis

2

-

Salmonella paratyphi

2

-

Shigella dysentheriae

2

-

Brucella mellitensis

2

-

Brucella abortus

2

-

Brucella suis

2

-

Sarcina flava

2

-

Streptococcus pyogenes

1

-

Streptococcus aureus

1

-

Нельзя исключить, что появление таких форм бактерий в природных условиях может пройти незамеченным при эпизоотологическом обследовании, так как биологический и иммунологический методы диагностики мало эффективны для их детекции. В связи с этим важным и интересным представлялась апробация разработанного нами зонда для выявления таких измененных форм возбудителя. Зондирование проводили как с типичными, так и с измененными штаммами туляремийного микроба (коллекция из 15 бескапсульных и капсулодефицитных авирулентных мутантов F. tularensis трех основных подвидов, были любезно предоставлена Н.В. Павлович, лаборатория туляремии, РостНИПЧИ) Как оказалось, ДНК-зонд гибридизовался как с типичными штаммами, так и полученными измененными (бескапсульными) вариантами этих штаммов. Таким образом, ДНК-зондирование, проведенное на репрезентативной коллекции природных (типичных) и измененных (атипичных) штаммах F. tularensis, показало его перспективность для детекции и идентификации туляремийного микроба.

Таким образом, скоструирована рекомбинантная плазмида pRD6 с EcoRI-фрагментом ДНК размером в 800 п.н., комплементарным видоспецифическому участку хромосомной ДНК туляремийного микроба. Построена физическая и функциональная карты клонированного участка ДНК. Плазмида несет фрагмент ДНК, который может служить зондом для эффективного обнаружения франсисел, выявляя при этом только штаммы F. tularensis и не взаимодействуя с представителями других близкородственных и отдаленных видов микроорганизмов. ДНК-зондирование сыграло важную роль на этапе идентификации возбудителя и позволила приступить к разработке вопросов генотипирования штаммов.

ОП - ПЦР - генотипирование

В своих исследованиях мы осуществили генотипирование штаммов различных микроорганизмов (молекулярное типирование) с различными универсальными, или случайными, праймерами в однопраймерной ПЦР (ОП-ПЦР или RAPD). Характерно, что каждый праймер дает различные картины распределения продуктов ПЦР в геле, что обеспечивает ему потенциальную способность к детекции различий между штаммами. В своих исследованиях по генотипированию возбудителей особо опасных заболеваний и их бактериофагов (данные не представлены) мы использовали преимущественно однопраймерный вариант ПЦР и набор случайных праймеров (1, 2, 9, 15, 21,45, Д9А). Оказалось, что все взятые праймеры в использованных для отжига условиях могли относительно неспецифически связываться с большим числом сайтов на ДНК - мишени и образовывать множество ПЦР - продуктов в виде дескретных фрагментов.

Приобретенный опыт работы с ОП-ПЦР и универсальными праймерами позволил осуществить генотипическую характеристику штаммов F. tularensis. Наиболее информативными оказались прамеры №15, №21, №45 и Д9А. Использовали 49 штаммов - F. tularensis subsp. tularensis (биотип А) (3 штамма) и F. tularensis subsp. holarctica (биотип В) (40 штаммов), F. tularensis subsp. mediaasiatica (6 штаммов), один штамм F. novicida (получен в 1956 г. из Гамильтоновского института, США) и штаммы различных микроорганизмов из МЖК РостНиПЧИ. Для характеристики геномов возбудителя туляремии мы воспользовались модифицированной методикой постановки ПЦР (Булат С.А. и др., 1990,1991). Исследование возможности ее применения в нашем случае показало способность каждого из использованных праймеров эффективно амплифицировать отдельные участки генома различных штаммов возбудителя туляремии (рис. 3), что проявлялось в виде 9 - 10 мажорных полос размером от 300 до 5000 п. н.

Для праймера № 15 (рис. 3а) было отмечено, что расположение, характер и интенсивность свечения ампликонов ДНК неарктического и среднеазиатского подвидов отличались только по наличию полос в области 4000-2000 п. н., в остальном они были практически одинаковы.

1  2  3 4 5 6 7  8 9  10  11 12

а

12 1 2 3 4 5 6 7  8 9 10 11

б

  1  2 3 4 5 6  12  7 8 9  10 11

в

Рис. 3. Электрофоретическое разделение продуктов ПЦР
с использованием ДНК из клеток штаммов F. tularensis
и олигонуклеотида № 15 (а). 21 (о) и Д9А (в):

1 - штамм Schu; 2- 261; 3 -nevada (биотип А, неарктического происхождения); 4 - 543;
5 - 240; 6 - 150 (среднеазиатского происхождения); 7 - 503: 8 - 1182; 9 - 822; 10- 250 (биотип В, голарктического происхождения); 11.-F.novicida; 12-PstI-гидролизат фага .

Резкое отличие наблюдали между ампликонами ДНК представителей этих двух подвидов и ампликоном ДНК представителей голарктического подвида, которое заключалось в постоянном присутствии и повышенной степени выраженности в ДНК первых подвидов мажорного фрагмента размером в 300 п. н. Различия были обнаружены также в ампликонах штамма F. novicida, который характеризовался появлением дополнительных полос размером около 600 и 450 п. н. Та же закономерность подвидовых различий прослеживалась и при использовании праймеров 21 (рис. 3б) и 45. Использование праймера Д9А позволяло осуществлять межвидовую дифференциацию штаммов (рис. 3в): так, штамм F. novicida характеризовался наличием фрагмента ДНК в 500 п. н., отсутствующим у представителей F. tularensis. У F. novicida отсутствовали также фрагменты в 5000 и 1700 п. н., наблюдаемые у F. tularensis.

Проведенное исследование показало возможность использования ОП-ПЦР для реальной демонстрации генотипической гетерогенности штаммов туляремийного микроба. Использованный прием позволяет выявлять различия в исследованной коллекции штаммов F. tularensis , которая четко делилась на четыре группы: первая - штаммы неарктического, вторая - среднеазиатского подвидов, третья - штаммы голарктического подвида, четвертая - F.novicida.

ПЦР: детекция представителей Francisella tularensis

Для детекции представителей F. tularensis в ПЦР мы использовали набор специфических праймеров. Основанием для выбора нуклеотидной последовательности праймеров явилось осуществленное нами ранее клонирование и детальное изучение фрагмента ДНК размером в 800 п. н., комплементарного видоспецифическому участку хромосомной ДНК туляремийного микроба и успешно использованному в качестве ДНК-зонда для идентификации большой группы штаммов представителей F. tularensis . Анализ структуры позволил выбрать и сконструировать для ПЦР синтетические олигонуклеотидные праймеры: "прямой" - Fl (22 п. н.), 5'-АСА ТАС ААG ССТ ТТТ ААС TАТ C-З' и "обратный" - F2 (21 п. н.), 5'-TTG ATC ATA ATA GTT CTG ACC-3'. Как показали результаты исследований (рис. 4), праймеры Fl и F2 были способны эффективно амплифицировать последовательности хромосомной ДНК туляремийного микроба, что выражалось в появлении в геле полосы ожидаемого размера в 210 п. н. С целью изучения специфичности выбранной пары праймеров (Fl + F2) их использовали для анализа других микроорганизмов, которые исследовали как индивидуально, так и в смеси с различными количествами ДНК возбудителя туляремии. Оказалось, что праймеры позволяли амплифицировать ДНК только F. tularensis и F. novicida и не амплифицировали ДНК из других видов бактерий. Следует отметить, что присутствие разных концентраций (до 1 мкг на пробу) ДНК гетерологичных бактерий на результаты амплификации не влияло.

1  2 3 4 5 6  7 8 9 10 11 12

Рис. 4. Анализ продуктов ПЦР с ДНК штаммов F. Tularensis
и специфических праймеров FI и F2:
1-штамм Schu; 2 - 261; 3 - 543; 4 - 240; 5 - Mspl-гидролизат ДНК pUC19;
6 - 503; 7 - 250; 8- 1182; 9 - 1510; 10 - LVS; 11 - F.novicida;12 - ДНК pRD6.

Интересными оказались результаты изучения возможности использования специфических праймеров в ПЦР при обнаружении возбудителя в крови и тканях зараженных биопробных животных.

Приведенные результаты свидетельствуют, что сконструированные нами праймеры специфически амплифицировуют ДНК туляремийного микроба и пригодны для детекции представителей F. tularensis.

Таким образом, показана возможность использования одно - и двухпраймерной ПЦР как для детекции, так и генетического типирования штаммов туляремийного микроба. С помощью сконструированных праймеров (F1 и F2) удается идентифицировать до 100 клеток туляремийного микроба в чистой культуре, в смеси культур с другими патогенными микроорганизмами и в органах зараженных биопробных животных. Универсальные (случайные) праймеры позволяют осуществлять генотипический скрининг штаммов туляремийного микроба и идентификацию штаммов на межвидовом и внутривидовом уровне, а также демонстрировать их генотипическую гетерогенность.

3. Некультивируемые формы возбудителя туляремии

Для индукции некультивируемого состояния у клеток штаммов F. tularensis Schu, 503 и 543, а также F. novicida, F. novicida-like, F. philomiragia использовали флаконы со стерильной деионизированной водой с 0,15 М NaCl, так как помещение клеток в воду без NaCl сопровождалось резким, «обвальным» снижением числа жизнеспособных клеток уже через сутки, независимо от испытуемого штамма и температуры инкубации колб.

Обнаружено, что высеваемость клеток различных штаммов туляремийного микроба на плотных питательных средах прекращалась при инкубации при различных температурах и в разные сроки наблюдения по-разному. Так, для штаммов F. tularensis Schu , 543 и 503 рост микроба на Т-агаре из колб, инкубируемых при 370С, прекращался уже на 6 сутки, при 280С - на 14 сутки, а из колб, содержавшихся при 40С, только на 28-48 сутки. На 48 сутки эксперимента все колбы помещали в условия холодильника (40С). В течение 130 суток (срок наблюдения) при высеве на плотные питательные среды роста не наблюдали, хотя в ПЦР постоянно регистрировали положительный результат, свидетельствовавший о присутствии недеградированной ДНК F. tularensis.

Для штаммов F. novicida и F. novicida-like рост клеток, инкубированных при 370С, прекращался на 8-20 сутки, при 280С - на 20-92 сутки (соответственно), а при 40С культуру высевали весь срок наблюдения.

Для штамма F. philomiragia рост клеток из колб, инкубированных при 370С, регистрировали на протяжении всего срока исследования. По-видимому, штаммы F.novicida, F.novicida-like и F.philomiragia более адаптированы к резко меняющимся условиям существования в воде (Кормилицина  М.И. и др., 1994).

Добавление необходимых для роста F. tularensis аминокислот (аргинин, лейцин, изолейцин, лизин, метионин, пролин, треонин, гистидин, валин, цистин, цистеин, серин, тирозин, аспарагиновая кислота) (Майский В.Г. и др.,1984) не влияло на скорость перехода возбудителя в НС.

Для оценки метоболического состояния клетки штамма F. tularensis Schu, содержавшиеся при 370 и 280С в деионизированной воде с 0,15М NaCl, метили 14С-глюкозой. Отбор проб для ПЦР и регистрацию включения метки осуществляли на 1-14-23-43 и 87 сутки. Контакт клеток с меткой продолжался 1-5-10-20-44 суток, соответственно (рис. 5). Отмечено возрастание включения метки клетками туляремийного микроба на 23 и 43 сутки наблюдения (инкубация при 28оС), что свидетельствовало в пользу жизнеспособности клеток, хотя культура на плотных питательных средах в эти сроки уже не высевалась. Это заключение подтвердилось и результатами авторадиографии гелей после электрофоретического разделения белков лизатов тех же клеток.

При электронно-микроскопическом изучении взвеси исходной культуры штамма F. tularensis Schu было обнаружено, что она представлена преимущественно клетками круглой или слегка овальной формы, имеющих размеры от 0,4 до 1,2 мкм. В ряде случаев наблюдали конгломераты из структур различной формы и размера, представленные, по-видимому, подвергнувшимися автолизу клеточными элементами. В целом, электронно-микроскопические данные указывают, что при индукции НФ туляремийного микроба в данных условиях эксперимента, образуются так называемые формы несбалансированного роста, относящиеся, вероятно, к начальным этапам L-трансформации (Прозоровский С.В. и др., 1981).

Получить ревертанты туляремийного микроба из НФ простым посевом на богатые питательные среды, как описано (Fields P. et al., 1989; Nilsson H. et al., 1991), не удалось. Высевы при этом производили в разные сроки в Т-бульон с 5% фетальной сыворотки и без нее, простым посевом и с предварительной температурной индукцией (430С) из проб после прекращения роста клеток на Т-агаре.

Рис.5. Включение радиоактивной метки [14C-глюкоза] клетками штамма F.tularensis Schu в процессе перехода в некультивируемое состояние.

Реверсию НФ F. tularensis в исходное состояние удалось получить при использовании модели чувствительных животных только для вариантов, перешедших в некультивируемое состояние при 40 и 280С. При подкожном заражении белых мышей 0,1 мл НФ-40С и НФ-280С штаммов F. tularensis Schu и 543 (69 сутки инкубации при 40С и 280С после перехода в некультивируемое состояние) животные погибали на 7-10 сутки с выделением культуры. НФ-370С гибели животных не вызывали. При заражении белых мышей культурой (92 сутки инкубации при 40С и 280С после перехода в некультивируемое состояние) мыши стали погибать (на 20-25 сутки). При последуюших пассажах (суспензии из органов павших мышей) сроки падежа биопроб сократились до 3-5 суток. В обоих случаях была выделена культура F. tularensis. Складывается впечатление, что содержание клеток при 280 и 370С сопровождается более глубокими изменениями, на устранение которых требуется больше времени и определенные условия.

Таким образом, в результате комбинированного стрессового воздействия - голодания и низкой температуры туляремийный микроб может переходить в «некультивируемое» состояние, в котором он персистирует в окружающей среде (микрокосме) в межэпидемический период. Следует указать на гетерогенность возникающих при этом НФ, обусловленную, видимо, сочетанием факторов окружающей среды (Макаров А.А. и др., 1998). Так, для возбудителя туляремии его адаптация к неблагоприятным условиям и адекватная перестройка метаболизма лучше происходит в условиях низкой температуры. Переход в НФ возможен и при иных, например, более высоких температурах, однако условия реверсии при этом остаются, по крайней мере, не выясненными.

Метод ПЦР со специфическими праймерами был использован для обнаружения возбудителя туляремии в пробах полевого материала (вода, солома, органы животных, кровососущие насекомые и др.), собранного при плановом эпизоотологическом обследовании степного и пойменно-болотного очагов туляремии в Ростовской области в весенне - летний и осенне - зимний периоды 1996 - 1998 г.г. Всего было исследовано более 400 проб биотических и абиотических объектов, из которых от 17 до 34% (в зависимости от сезона и типа природного очага) оказались положительными в ПЦР, хотя культуру удалось выделить только из 9 и 15 объектов. Расхождение результатов в использованных методах исследования можно объяснить персистированием туляремийного микроба в окружающей среде в виде некультивируемых форм (НФ), детекция которых традиционными способами оказывается практически не возможной. Подтверждением существования туляремийного микроба в окружающей среде в НФ могут служить результаты наших исследований с положительными в ПЦР образцами, но не вызвавшими гибели биопробных животных в определяемые инструкцией сроки (15 суток). Заражение белых мышей такими пробами не вызвало гибели животных в течение 15 - 28 суток. Однако положительный результат в ПЦР экстрактов из селезенок умерщвленных биопробных животных послужил ориентиром для продолжения пассажей. Таким способом после 3 - 5 пассажей удалось выделить культуру F. tularensis из 25 объектов. Полученные данные являются, на наш взгляд, весомым аргументом в пользу необходимости изменения методических подходов в практике эпизоотологического обследования природных очагов на туляремию. Наиболее перспективным в этом случае представляется метод ПЦР. Этот метод может оказаться особенно важным для повышения эффективности эпизоотологического мониторинга территорий, так как обеспечивает возможность ускоренного предварительного отбора положительных проб для последующего целенаправленного бактериологического анализа, а также дает возможность обнаружения туляремийных микробов, находящихся в «некультивируемом» состоянии, в котором возбудитель персистирует в окружающей среде в межэпизоотийный период. Таким образом, некультивируемое состояние туляремийного микроба следует рассматривать как реальную форму его существования в почвенных и водных экосистемах.

Так как переход в НС у туляремийного микроба происходит в ответ на стрессовые условия окружающей среды, представлялось необходимым более полно исследовать эти условия. Поэтому мы остановились на тепловом и осмотическом (солевом) стрессах, как наиболее вероятных, которые испытывают микроорганизмы при попадании в окружающую среду.

4. Стрессовый ответ у возбудителя туляремии.

Тепловой стресс у возбудителя туляремии

Клетки штаммов F. tularensis неарктического, среднеазиатского и голарктического подвидов, а также штамм F. novicida выращивали на Т - агаре (370С), отмывали физиологическим раствором, суспендировали в свежей порции Т-бульона и инкубировали в статических условиях при определенных значениях температуры (100С, 280С, 370С и 430С). Через 18 часов число жизнеспособных клеток определяли посевом на плотные питательные среды. В наших условиях эксперимента при температуре 370С и 280С отмечено возрастание числа жизнеспособных клеток, при 100С их число оставалось стабильным, а при 430С число жизнеспособных клеток снижалось и составляло примерно 3-5% для штаммов неарктического и среднеазиатского подвидов и 8-10% - для европейского от количества внесенных в пробу. Для штамма F. novicida при использованных температурах выращивания число жизнеспособных клеток оставалось примерно одинаковым, видимо, из-за состояния стаза, сопровождающегося прекращением клеточного деления (Водопьянов С.О. и др., 1993). Тем не менее, биосинтетические процессы у подвергнутых тепловому стрессу клеток, протекали активно, что удалось подтвердить путем введения в стрессированные клетки смеси [14С-] аминокислот и последующего выявления меченных полипептидов. Полученные данные свидетельствуют (рис. 6), что при температуре 100С включение метки не происходит (за данный промежуток времени), тогда как при повышении температуры туляремийный микроб способен к индукции стрессового ответа. Это выражается в ингибиции общего белкового синтеза и в нарастании интенсивности радиоактивной белковой полосы с молекулярной массой в районе 60-70 кДа. Белок с такой подвижностью регистрировали и у культур, меченных в условиях макроорганизма в диффузионных камерах (рис. 7). В качестве экспериментальной модели использовали морских свинок, которым подкожно имплантировали диффузионные камеры с диаметром пор 0,22 микрон, заполненные взвесью вакцинного 1510 и вирулентного 543 штаммов туляремийного микроба. В различные интервалы времени в камеры вводили смесь [14C]-аминокислот, спустя сутки после этого содержимое камер анализировали методом гель-электрофореза с последующей радиоавтографией на наличие вновь синтезированных белков. В содержимом диффузионных камер установлено резкое снижение числа жизнеспособных клеток вирулентного штамма возбудителя туляремии. Так, к исходу первых суток после имплантации число живых клеток составляло 4%, а к исходу вторых - лишь 2,8% от числа первоначально внесенных бактерий. Кроме того, обнаружен факт повышенной абсорбции клетками возбудителя туляремии белков плазмы крови (преимущественно альбуминов). Анализ радиоавтографов показал, что в условиях in vivo клетки возбудителя туляремии штамма 543 продуцируют мажорные полипептиды с молекулярной массой порядка 65, 70 и 90 кДа (рис. 7). Полипептиды с такой же массой были выявлены в контрольных экспериментах in vitro при воздействии фактора теплового стресса (430С) на клетки различных штаммов туляремийного микроба.

Таким образом, установлено, что возбудитель туляремии способен к индукции стрессового ответа в условиях in vivo и in vitro, который сопровождается заметной перестройкой белкового состава. Повышение температуры приводит к индукции синтеза типичных для стрессового ответа полипептидов, среди которых присутствуют возможные аналоги белков теплового стресса GroEL и DnaK (Georgopoulos C. et al, 1993).

Рис. 6. Радиоавтография белков различных штаммов возбудителя туляремии, меченных смесью 14С-аминокислот при различных температурах после
электрофореза в градиентном геле SDS-ПААГ и окраски Кумасси.

1-F.tularensis Schu-280C; 2-Schu-100C; 3-F.tularensis 543-420C; 4- 543-370C; 5-543-280C; 6-543-100C; 7-F.tularensis 15/10-420C; 8-15/10-370C; 9-15/10-280C; 10-15/10-100C; 11-Schu-280C; 12-Schu-370C; 13-Schu-420C; 14-F.tularensis 503-100C; 15-503-280C; 16-503-370C; 17-503-420C; 18-F.novicida-100C; 19-F.novicida-280C; 20-F.novicida-370C; 21-F.novicida-420С.

Рис. 7. Радиоавтография стрессовых белков возбудителя туляремии
в условиях диффузионной камеры.

1-Контрольные клетки F.tularensis 543, меченные при 280С, 2- 370С, 3- 420С; 4-Содержимое диффузионной камеры (первые сутки инкубации);

5-Содержимое диффузионной камеры (вторые сутки инкубации).

Известно, что белки стрессового ответа характеризуются высоким уровнем консерватизма, а нативный шаперон GroEL кишечной палочки является высокомолекулярным полимером, который построен из 14 идентичных белковых субъединиц с молекулярной массой около 60 кДа (Nеidhardt F. et al, 1987; Ericsson M. et al., 1994). Для выделения GroEL из клеток туляремийного микроба мы использовали методику, успешно использованную для очистки GroEL из клеток чумного микроба (Водопьянов С.О. и др., 1996). В результате ионообменной хроматографии осветленного экстракта клеток вакцинного штамма 15/10 туляремийного микроба на ДЕАЕ-целлюлозе, белок, состоящий из субъединиц с массой 60 кДа, был выявлен во фракциях, элюированных 0,2-0,3М NaCl. Объединение этих фракций позволило получить неочищенный препарат, содержавщий до 40% целевого продукта. Дальнейшая очистка предусматривала прием ультрафильтрации через ультрагель АсА 34 (LKB, Sweden). Практически весь белок, состоящий из субъединиц массой 60 кДа, выходил в составе первого пика в свободном объеме колонки. Обьединенный материал первого пика содержал гомогенный препарат белка массой 60 кДа. Согласно данным литературы (Потоцкая И.В. и др. 1991), нативный GroEL белок на электронных микрофотографиях представляет собой характерную структуру из двух сочлененных колец, каждое из которых включает 7 субъединиц. При электронно-микроскопическом изучении полученного белка из F. tularensis 15/10 обнаружено большое количества надмолекулярных комплексов с характерной звездчатой структурой (рис. 8), причем оказалось, что раствор белка содержит крупные и мелкие частицы. К первым относится множество дискообразных частиц, имеющих центральное отверстие и звездчатый наружний контур (А), частицы второго типа представляют более крупные цилиндрические структуры (А и Б) и образующие их при ассоциации дискообразные частицы (Б, В, Г). В целом, особенности структурной организации частиц первого типа, а также их размеры и, прежде всего, диаметр центрального канала, согласуется с характеристиками олигомерных структур, образуемых стрессовым белком шапероном 60 кД (GroEL-Cpn60) (Потоцкая И.В. идр. 1991; Водопьянов С.О. и др., 1996; Ericsson M. et al., 1997).

Рис. 8. Электронная микроскопия олигомеров
белка GroEL туляремийного микроба.

А - мелкие дискообразные частицы звездчатой формы и крупные цилиндрические структуры (увеличение х 163 000); Б - блоки, составляющие крупную цилиндрическую структуру (увеличение х 173 600); В, Г - неассоциированные в цилиндр крупные дискообразные частицы (увеличение х 240 000).

Осмотический (солевой) стресс у возбудителя туляремии

Найдено, что клетки возбудителя туляремии выдерживают значительную концентрацию хлористого натрия (до 4M NaCl) в течение 20 дней, что согласуется с данными литературы (Nano F., 1988), при этом солевой стресс сопровождается изменением содержания общих сахаров. Увеличение содержания сахаров в 3-4 раза наблюдали у стрессированных клеток штаммов Schu , 543 и в 2-3 раза - у штамма 503 по сравнению с контрольными клетками, причем увеличение содержания сахаров наблюдали как в результате выращивания клеток в среде с различным содержанием хлористого натрия в течение длительного времени, так и через 3 часа после приложения стрессовых условий (собственно солевой стресс).

При помещении клеток в условия высокого содержания соли отмечали также увеличение накопления глицинбетаина (таблица 2.) В первые 4 часа инкубации в условиях стресса наблюдали увеличение содержания бетаина в пробах в 5,5 раз для штамма Schu и в 4,8 раз - для штамма 503 (концентрация соли 2,0-4,0 M). Через 8 часов инкубирования содержание бетаина было примерно одинаковым для штаммов обоих подвидов, а затем начинало снижаться. Экзогенное внесение коммерческого препарата глицинбетаина несколько замедляло (до одной недели) сроки перехода клеток возбудителя туляремии в некультивируемое состояние.

Таблица 2.

Накопление глицинбетаина (mM) клетками возбудителя туляремии
при солевом стрессе

Штаммы

Контакт с NaCl (час)

0,15M NaCl

0,5M

NaCl

1,0M

NaCl

2,0M

NaCl

4,0M

NaCl

Schu

4

154

256

256

684

855

8

239

384,6

341

598

596

12

171

171

341

470

598

503

4

214

341

341

940

1026

8

171

256

341

855

641

12

171

214

256

641

596

При электронномикроскопическом изучении стрессированных клеток туляремийного микроба штаммов Schu и 503 по сравнению с контрольными были выявлены определенные различия в характере аутолитических изменений, которые выражались в той или иной степени нарушениях цитоплазматических структур. При этом характер этих изменений лучше прослеживался у штамма Schu. На поверхности стрессированных клеток туляремийного микроба штамма Schu обнаружен электронно - плотный слой, состоящий из хлопьевидного материала, включавшего мелкие плотные глыбки. Значительное количество подобного материала наблюдали и между клетками. В контрольных препаратах такого препарата на поверхности клеток было значительно меньше, а в межклеточном пространстве его не было вообще. На поверхности стрессированных клеток штамма 503 слой глобулярного контрастного материала был выражен слабо, хотя количество хлопьевидного плотного материала между клетками было почти таким же, как у штамма Schu. Таким образом, с помощью электронно-гистохимического метода показано, что в условиях солевого стресса туляремийный микроб штамма Schu активно продуцирует «вещество», которое локализуется на наружней мембране и которое выявляется с помощью красителя, имеющего выраженные катионные свойства. В отличие от Schu штамм 503 в таких условиях это «вещество» активно не продуцирует.

Фагоцитоз туляремийного микроба, который проводили на перитониальных макрофагах белых мышей, показал, что при воздействии осмотического (солевого) шока на клетки F. tularensis штаммов Schu и 503 (0,15М-1М -2М NaCl) происходит повышение антифагоцитарной активности микробов. Одновременно наблюдали снижение значения ИЗФ (клетки Schu - с 0,002 до 0,2; клетки 503- с 0,03 до 0,3) и повышение % ПМ (Schu - с 92 до 95%; 503- с 90 до 95%). На захват микроорганизмов осмотический шок заметного влияния не оказывал, но стимулировал размножение стрессированных микробов внутри фагоцитов, что, как минимум, свидетельствует в пользу усиления патогенных свойств возбудителя.

При генотипическом изучении ДНК клеток туляремийного микроба в ОП-ПЦР с праймером №15 отмечены отличия в геноме стрессированных клеток (клетки подвергали стрессу в течение 4 часов) по сравнению с интактными, что выражалось в изменении характера распределения полос ДНК-ампликонов, причем штамм американской разновидности отличался от штамма европейской разновидности явными перестройками хромосомы (рис. 9).

1 2 3  4 5  М  6  7  8  9  10

Рис. 9. ПЦР-профиль ДНК стрессированных клеток различных штаммов
туляремийного микроба с праймером №15 (контакт клеток с солью
в течение 3 часов при температуре 370С).

1-F.tularensis Schu-0,15M NaCl; 2-Schu-0,5 M NaCl; 3-Schu-1,0 M NaCl; 4-Schu-2,0 M NaCl; 5-Schu-4,0 M NaCl; 6-F.tularensis 503-0,15 M NaCl; 7-503-0,5 M NaCl; 8-503-1,0 M NaCl; 9-503-2,0 M NaCl; 10-503-4,0 M NaCl; M-маркер молекулярных весов.

ДНК стрессированных клеток штамма Schu изменила картину распределения амликонов: исчезли минорные полосы в районе 1500, 700 и 450 п.н. и появилась полоса в районе 300 п.н. Для штамма 503 таких наблюдений не отмечено. Картина распределения ДНК-ампликонов при солевом стрессе была фактически одинаковой.

Таким образом, возбудитель туляремии обладает устойчивостью (солетолерантностью) к повышенным содержаниям в среде хлористого натрия. В ответ на солевой стресс туляремийный микроб включает генотипические и фенотипические адаптационные механизмы, что позволяет ему адаптироваться к неблагоприятным условиям окружающей среды и персистировать в почвенных и водных экосистемах в межэпидемические (межэпизоотические) периоды.

5. ПЦР в практике эпизоотологического обследования и эпидемиологического надзора за туляремией (на примере Ростовской области)

В системе комплексного изучения природных очагов туляремии лабораторная диагностика имеет особое значение. Информация о состоянии компонентов паразитарной системы в совокупности с информацией о показателях заболеваемости служит основой рационального планирования и осуществления мероприятий по борьбе с инфекционными болезнями, а в межэпизоотийный период позволяет оценить эффективность этих мероприятий.

Лабораторными методами, позволяющими судить об инфицированности популяций носителей и переносчиков, а также контаминации абиотических объектов окружающей среды (экосистемный уровень), в настоящее время являются бактериологический, серологический (направленный на поиск антигена и антител), биологический (постановка биопробы на высокочувствительных животных) и молекулярно - биологический.

Выбор объекта для лабораторного исследования материала из природных очагов туляремии определяется типологией очага, сезоном обследования, конечными целями исследования (контроль за динамикой эпизоотологического процесса или территориального распределения эпизоотических участков). В природных очагах исследуют биотические и абиотические объекты различных уровней. Информативность молекулярно-биологического, бактериологического и биологического методов, используемых при изучении биотических объектов полевого материала, во многом определяется сроками доставки проб из природного очага в лабораторию. Хранение проб при неблагоприятных температурных условиях в летне-весенний период может сделать невозможным выделение инфекционных агентов. Рекомендуемые существующими инструктивно - методическими документами консерванты позволяют увеличить время сохранения биологических объектов, но не всегда способны обеспечить должное качество. Поэтому нами при обследовании природных очагов в Ростовской области был применен метод криоконсервирования (Терентьев А.Н., и др., 1993).

Для получения объективной, эпидемиологически значимой информации и оценки использованных приемов полевой материал, добытый в природных очагах туляремии, исследовали бактериологическим и молекулярно-биологическим методами в комплексе с серологическими реакциями. Серологические реакции включали поиск антигена (РКОА, РАО, РНАт) и антител к туляремийному микробу (РНГА). Молекулярно-биологический метод (метод ПЦР) с использованием видоспецифических праймеров - для детекции туляремийного микроба. Анализ результатов проводили по двум типам природных очагов туляремии, учитывая все структурные уровни и компоненты.

Метод ПЦР со специфическими праймерами был использован для обнаружения возбудителя туляремии в пробах полевого материала, собранного при плановом эпизоотологическом обследовании степного и пойменно-болотного очагов туляремии в Ростовской области в весенне - летний и осенне - зимний периоды 1996 - 1999 г.г. (более 4000 проб).

При анализе результатов, независимо от типа очага установлено преимущество ПЦР в сравнении с РНАт, РКОА и РАО при исследовании проб мышевидных грызунов (p<0,001, p<0,05, p<0,05, соответственно). При исследовании в степном очаге биотических и абиотических объектов подземного (гнездонорового) уровней позитивные результаты получены только в ПЦР. В пробах воды из очага этого типа частота позитивных результатов в ПЦР была ниже, чем в серологических реакциях(p<0,05). При исследовании воды поверхностных водоемов в очаге пойменно-болотного типа, где она играет несомненно большую роль в персистенции туляремийного микроба, чем в очаге степного типа, частота позитивных результатов была выше в ПЦР. Как отмечалось ранее, этот факт необходимо учитывать при проведении эпидемиологического надзора за туляремией (таблица 3).

Как уже отмечалось, методологической базой исследования полевого материала на туляремию явились положения, сформулированные на момент исследования в «Методических указаниях по лабораторным методам диагностики при эпизоотологическом обследовании природных очагов туляремии» (1983). В своих исследованиях мы внесли в них некоторые дополнения. Начальным этапом является разбор и сортировка проб полевого материала. Затем следуют серологические и молекулярно - биологические исследования, важнейшая задача которых состоит в получении информации для дальнейших лабораторных исследований: обнаружение ДНК, антигенов и антител к туляремийному микробу. Наличие такой информации на этапе, предшествующем постановке биологических проб, исключительно важно, так как она позволяет определить приоритетность проб и сконцентрировать внимание на наиболее значимых объектах. Подобный подход целесообразен, рационален и позволяет повысить производительность труда, в особенности при одномоментном поступлении в диагностическую лабораторию большого количества полевого материала. Следующим является этап постановки биологических проб с высокочувствительными лабораторными животными. Информационное обеспечение этого этапа (положительные результаты в ПЦР и серологических реакциях) является показанием для обязательной постановки биологической пробы с последующими пассажами и прямого посева полевого материала на плотные питательные среды. Если на этом этапе исследования падежа биопробных животных не наблюдается, то положительные результаты в ПЦР и нарастание титров серологический реакций, полученных при изучении материала от биологических проб, является показанием для проведения последующих пассажей. В нашем исследовании применение такого методического подхода как многопассажной методики, не предусмотренной действовавшими инструктивно-методическими документами, было выделено 16% культур туляремийного микроба. Заключительный этап исследования предполагает выделение туляремийного микроба на питательных средах и его идентификацию.

Таблица 3.

Информативность реакций коагглютинации, аггломерации, нейтрализации антител и полимеразной цепной реакции

Структурные уровни и объекты исследования

Превышение частоты положительных результатов в ПЦР по сравнению с серологическими реакциями

Степной очаг

Пойменно-болотный очаг

РКОА

РАО

РНАт

РКОА

РАО

РНАт

I. Наземный (воздушный) уровень

Биотические объекты

Мышь домовая

3,6

1,6

2,0

10,9

3,3

9,8

Полевка обыкновенная

3,7

1,3

4,6

3,4

2,0

3,3

Мышь лесная

3,8

0

3,0

4,0

2,3

3,2

Землеройка

2,5

0,9

2,3

Положительные результаты только в ПЦР

Хомячок серый

2,5

0

2,0

-

-

-

Клещи иксодовые

3,3

1,5

0

Комары

10,5

2,9

6,0

Абиотические объекты

Солома из скирд

0

0

0

2,8

0,8

2,5

II.Подземный (гнездоноровый) уровень

Биотические объекты

Клещи гамазовые

Положительные результаты только в ПЦР

Абиотические объекты

Гнездоноровый субстрат

Положительные результаты только в ПЦР

1,2

0,6

1,0

III. Водный уровень

Абиотические объекты

Вода поверхностных водоемов

0,8

0,4

0,8

5,2

1,3

2,3

Таким образом, при отработке тактики лабораторных исследований при эпидемиологическом надзоре за туляремией установлено, что информационными параметрами, характеризующими состояние паразитарной системы являются:

1. Выделение и идентификация туляремийного микроба из биотических и абиотических объектов всех трех уровней системы;

2. Детекция ДНК туляремийного микроба в ПЦР в биотических и абиотических объектах всех трех уровней системы;

3. Обнаружение антигена туляремийного микроба в биотических и абиотических объектах всех трех уровнях системы;

4. Обнаружение антител к туляремийному микробу в биотических объектах (позвоночные животные первого и второго уровней системы.

При сравнении информативности использованных методов показано преимущество использования ПЦР при эпизоотологическом обследовании территорий природных очагов туляремии.

Нами установлено, что применение ПЦР в комплексе с бактериологическими и иммуно - серологическими методами при исследовании различных компонентов паразитарной системы и абиотических объектов может быть использовано для характеристики эпизоотической активности очага: высокая - детекция специфической ДНК подтверждается выделением культур туляремийного микроба; повышенная - детекция специфической ДНК регистрируется на фоне обнаружения антигена; низкая - отрицательные результаты при использовании всех методов исследования.

Заключение

С использованием комплекса молекулярно-биологических приемов нам впервые удалось описать феномен некультивируемого состояния у возбудителя туляремии. Показано, что ревертанты некультивируемых форм туляремийного микроба сохраняют свои основные свойства, в том числе и вирулентность. Это может иметь значение в природных условиях в межэпизоотический период и явиться механизмом запуска начала эпизоотии среди чувствительных животных. Существование некультивируемых форм имеет прямое отношение к резервации возбудителей и их адаптации к неблагоприятным условиям среды. Определено, что возбудитель туляремии наделен адаптивной пластичностью, важной для персистенции, проявляющейся в его адекватной реакции на стрессовые факторы окружающей среды. Изучение механизма адаптационной изменчивости туляремийного микроба, роли в этом процессе стрессовых условий, возможность перехода возбудителя в некультивируемое состояние значительно расширило наши представления об экологии возбудителя туляремии. Проведенные исследования легли в основу совершенствования принципов лабораторной диагностики и специфической индикации возбудителя туляремии. Использованный нами впервые метод ПЦР-диагностики при обследовании природных очагов туляремии включен в приказ №125 Минздрава РФ, посвященный усилению мероприятий по профилактике туляремии (1999), что явилось основой для последующего обоснования введения молекулярно-биологических методов в методические указания по эпидемиологическому надзору за туляремией (1999, 2005). Разработанный новый комплекс информативных методов обнаружения и идентификации туляремийного микроба, усовершенствование тактики лабораторной диагностики при эпизоотологическом надзоре за природными очагами туляремии позволили лучше понять паразитарную систему возбудителя, его экологию вообще и в стрессовых условиях, в частности, выявить факторы окружающей среды, вызывающие индукцию некультивируемого состояния у туляремийного микроба, что позволяет по-новому и объективно подходить в прогнозированию состояния природных очагов туляремии и планировать объем профилактических мероприятий, необходимых для предупреждения возникновения эпизоотических и эпидемических осложнений.

Выводы

  1. Впервые показано, что в результате голодания и низкотемпературного стресса туляремийный микроб может обратимо переходить в «некультивируемое» состояние, в котором он персистирует в окружающей среде экосистемы в межэпизоотийный период. Существование «некультивируемых» форм имеет прямое отношение к резервации возбудителя и их адаптации к неблагоприятным условиям среды.
  2. Ревертанты «некультивируемых» форм туляремийного микроба сохраняют свои основные дифференциально-диагностические свойства в том числе и вирулентность. Реверсия в природных условиях в межэпизоотийный период и может явиться механизмом запуска начала эпизоотии туляремии среди чувствительных животных.
  3. Туляремийный микроб наделен генетически закрепленной адаптивной изменчивостью, важной для сохранения возбудителя в изменяющихся условиях окружающей среды и проявляющейся в адекватной реакции на стрессовые факторы.
  4. В силу своей природной пластичности возбудитель туляремии способен к индукции стрессового ответа in vivo и in vitro, сопровождаемого заметной перестройкой его метаболизма. В ответ на стрессовые условия туляремийный микроб включает генотипические и фенотипические адаптационные механизмы, что позволяет ему приспособиться к неблагоприятным условиям окружающей среды и персистировать (иногда в виде «некультивируемых форм») в почвенных и водных экосистемах в межэпизоотийные периоды.
  5. Для изучения различных аспектов экологии F. tularensis, его взаимоотношений с факторами окружающей среды, а также обнаружения и идентификации предложен комплекс молекулярно-биологических приемов, прошедший испытания в лабораторных и полевых условиях. Сконструирована рекомбинантная плазмида pRD6 с комплементарным видоспецифическому участку хромосомальной ДНК туляремийного микроба фрагментом, служащим ДНК-зондом для эффективного выявления только штаммов F. tularensis и не взаимодействующим с представителями других близкородственных и отдаленных микроорганизмов. На базе ДНК-зонда сконструированы видоспецифические праймеры F1 и F2 для идентификации в ПЦР клеток возбудителя туляремии в чистой культуре, смеси культур с другими микроорганизмами, в суспензиях из органов зараженных биопробных животных и пробах клещей.
  6. Осуществлен генотипический скрининг штаммов туляремийного микроба на межвидовом и внутривидовом уровне, а также продемонстрирована их генотипическая гетерогенность с помощью ОП-ПЦР и набора универсальных (случайных) праймеров. ОП-ПЦР с универсальными праймерами позволяет не только выявлять генетическую гетерогенность штаммов F. tularensis, но и четко делить их на неарктический, среднеазиатский, голарктический подвиды и F.novicida.
  7. Впервые определено место ПЦР как важного элемента совершенствования тактики лабораторной диагностики за туляремией в природных очагах. Внедрение ПЦР в практику эпидемиологического надзора за туляремией позволяет получать оперативную информацию, необходимую для углубленного суждения об эпидемическом потенциале природного очага.
  8. ПЦР-анализ обладает рядом важных моментов (скорость получения ответа, чувствительность, а также специфичность), позволяющих использовать его в качестве надежного инструмента эпидемиологического надзора. Применение ПЦР в комплексе с бактериологическим и иммуносерологическими методами при исследовании различных биотических и абиотических компонентов экосистемы может быть использовано для углубленной характеристики эпизоотической активности очага, так как этот метод учитывает, как типичные формы возбудителя туляремии, так и атипичные с измененной антигенной структурой, и микроорганизмы, находящиеся в «некультивируемом» состоянии.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

  1. Авторское свидетельство Госкомитета СССР по делам изобретений и открытий № 1669981 Рекомбинантная плазмидная ДНК-источник зонда для тестирования представителей рода Francisella. Штамм E.coli JM 103 pRD 6RM7-продуцент рекомбинантной плазмиды / Романова Л.В., Павлович Н.В., Мишанькин Б.Н. - Зарегистрировано в Гос. реестре изобретений СССР 15.04.1991.
  2. Павлович, Н.В. Сравнительная характеристика биологических свойств штаммов F.tularensis, выделенных на территории СССР / Н.В. Павлович, Б.Н. Мишанькин, Н.К. Тынкевич, И.В. Рыжко, Л.В. Романова, Г.И. Данилевская // Антибиотики и химиотерапия. - 1991. - Т. 36. - № 10. - С. 23-25.
  3. Романова, Л.В. Использование полимеразной цепной реакции для генотипического скрининга штаммов F.tularensis / Л.В. Романова, И.Ю. Сучков, Б.Н. Мишанькин // Актуальные проблемы профилактики туляремии: Тез. докл. Всесоюзн. конф. - Симферополь, 1991. - С. 160-161.
  4. Романова, Л.В. ДНК-зонд для обнаружения возбудителя туляремии / Л.В.Романова, Н.В. Павлович, Б.Н. Мишанькин // Актуальные проблемы профилактики туляремии: Тез. докл. Всесоюзн. конф. - Симферополь, 1991. - С. 162-163.
  5. Романова, Л.В. ДНК-зонд для идентификации представителей рода Francisella / Л.В.Романова, Н.В. Павлович, Б.Н. Мишанькин // Биотехнология. -1992. -№ 4. - С. 52-55.
  6. Романова, Л.В. Полимеразная цепная реакция: генотипический скрининг штаммов Francisella tularensis с использованием универсальных праймеров / Л.В. Романова, И.Ю. Сучков, Б.Н. Мишанькин // Биотехнология. - 1993. - № 6. - С. 8-9.
  7. Романова, Л.В. Анализ ДНК штаммов Brucella sp. в полимеразной цепной реакции с использованием универсальных праймеров / Л.В. Романова, Б.Н. Мишанькин // Биотехнология. - 1994. - № 4. - С. 8-10.
  8. Романова, Л.В. ПЦР-детекция представителей рода Francisella / Л.В. Романова, И.Ю. Сучков, Б.Н. Мишанькин // Актуальные проблемы разработки мед.средств и методов сохранения и восстановления боеспособности личного состава вооруженных сил: Тез. докл. - Санкт-Петербург, 1994. - С. 127.
  9. Романова, Л.В. Использование полимеразной цепной реакции для генотипического скрининга Y.pestis / Л.В. Романова, Б.Н. Мишанькин, В.К. Валенцев // Актуальные проблемы особо опасных природно-очаговых инфекционных болезней: Тез. докл. - Иркутск, 1994. - С. 133.
  10. Романова, Л.В. Стрессовый ответ у возбудителя туляремии / Л.В. Романова, С.О. Водопьянов, И.Л. Олейников, Б.Н. Мишанькин // Актуал. опр.профилакт. чумы и других инф. заболеваний: Матер. межгос. нучно-ракт. конф. - Ставрополь, 1994. - С. 203-204.
  11. Романова, Л.В. Праймеры для специфического обнаружения Francisella tularensis в полимеразной цепной реакции / Л.В. Романова, Б.Н. Мишанькин // Журн. микробиол. эпидемиол. иммунобиол. - 1995. - № . -С. 77-80.
  12. Romanova, L.V. Polymerase chain reaction species-specific primer set for rapid detection of Francisella tularensis / L.V. Romanova, B.N. Mischankin // Abstract 7th European congress of Clinical Microbiolog and Infectious Diseases-ECCMID-95.- Vienna - Austria. - March 26-30, 1995. - P. 97.
  13. Романова, Л.В. ПЦР-генотипувания холерных вiбрiонiв видiленных в Дагестане в 1993-1994 рр. / Л.В. Романова, Б.Н. Мишанькин, Ю.М. Ломов, И.Ю. Сучков // XII зьезд Украiнского наук. товариства миiроб. епiдем. параз. - Кiiв - Винниця, 1996. - С. 55.
  14. Романова, Л.В. Полимеразная цепная реакция: детекция и генотипирование представителей рода Francisella / Л.В. Романова, Б.Н. Мишанькин, И.Ю. Сучков // Биотехнология. - 1996. - № 3. - С. 27-32.
  15. Романова, Л.В. ПЦР-генотипирование ДНК-содержащих бактериофагов / Л.В. Романова, В.И. Марченков, Т.Н. Бородина, Б.Н. Мишанькин // Биотехнология. - 1997. - № 1. - С. 21-25.
  16. Москвитина, Э.А. Эпидемиологический надзор за туляремией с позиций социально-экологической концепции / Э.А. Москвитина, Б.Н. Мишанькин, Н.Л. Пичурина, Н.В. Павлович, Л.В. Романова и др. // Матер. научно-практ. конф. посвящ. 100-лет. образов. противочумной службы России. - Саратов, 1997. - Т.1. - С. 110-111.
  17. Романова, Л.В. Продукция основных белков теплового стрессового ответа клетками Francisella tularensis в подкожно имплантированных диффузионных камерах / Л.В. Романова, С.О. Водопьянов, И.П. Олейников, Б.Н. Мишанькин // Матер. научно-практ. конф. посвящ. 100-лет. образов. противочумной службы России. - Саратов, 1997. - Т. 2. - С. 113-114.
  18. Романова, Л.В. Стрессовый белок GroEL Francisella tularensis / Л.В. Романова, С.О. Водопьянов, С.Р. Саямов, Б.Н. Мишанькин // Матер. научно-практ. конф. посвящ. 100-лет. образов. противочумной службы России. - Саратов, 1997. - Т. 2. - С. 114.
  19. Романова, Л.В. Выявление некультивируемых форм Francisella tularensis с помощью полимеразной цепной реакции / Л.В. Романова, Б.Н. Мишанькин // Матер. научно-практ. конф. посвящ. 100-лет. образов. противочумной службы России. - Саратов, 1997. - Т. 2. - С. 115.
  20. Романова, Л.В. ПЦР - в практике эпизоотологического обследования природных очагов туляремии в Ростовской области / Л.В. Романова, Н.Л. Пичурина, Б.Н. Мишанькин // Матер. научно-практ. конф. посвящ. 100-лет. образов. противочумной службы России. - Саратов, 1997. - Т. 2. - С. 213.
  21. Romanova, L.V. Francisella tularensis stress protein / L.V. Romanova, S.O. Vodopyanov, S.R. Sajamov, B.N. Mischankin // Vojenske Zdravotniske Listy, Rocnik LXVI, 1997. - N. 1. - P. 18. - Second International Conferens on Tularemia.
  22. Mischankin, B.N. Nonculturable forms of Francisella tularensis and their possible epideviological significance / B.N. Mischankin, L.V. Romanova, N.L. Pichurina // Vojenske Zdravotniske Listy, Rocnik LXVI, 1997. - N. 1. - P. 25. - Second International Conferens on Tularemia.
  23. Мишанькин, Б.Н. База данных о нуклеотидных последовательностях, используемых в качестве базы данных «Праймеры микроорганизмов» / Б.Н. Мишанькин, Н.Л. Волохонская, Э.А. Москвитина, Л.В. Романова и др. // Журн. микробиол. эпидемиол. иммунобиол. - 1998. - № 5. - С. 39-43.
  24. Романова, Л.В. Использование метода ПЦР для детекции Francisella tularensis / Л.В. Романова, Б.Н. Мишанькин, Н.Л. Пичурина // Методические документы и отчеты по сан. - эпид. охране территории РФ. - Саратов, 1998. - С. 24-25.
  25. Романова, Л.В. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) в диагностике Francisella tularensis / Л.В. Романова, Б.Н. Мишанькин, Н.Л. Пичурина // Полимеразная цепная реакция в диагностике и контроле лечения инфекционных заболеваний: Матер. II Всерос. конф. 20-22 января 1998 г. -Москва, 1998. - С. 112-113.
  26. Мишанькин, Б.Н. Туляремия / Б.Н. Мишанькин, Н.В. Павлович, Л.В. Романова, И.Я. Черепахина и др. // Лабораторная диагностика возбудителей особо опасных инфекционных болезней. - Саратов. - 1998. - Т. 1. - С. 111-143.
  27. Орехов, И.В. Фауна переносчиков, как составная часть паразитарной системы природных очагов туляремии в Ростовской области / И.В. Орехов, А.В. Родионов, В.Г. Налетов, Б.Н. Мишанькин, Э.А. Москвитина, Н.Л. Пичурина, Л.В. Романова // Природноочаговые инфекции в России: Современная эпидемиология, диагностика, тактика защиты населения: Матер. Всесоюзн. научно-практ. конф. - Омск, 1998. - С. 150-151.
  28. Кадетов, В.В. ПЦР - диагностика криоконсервированного полевого материала / В.В. Кадетов, Н.Л. Пичурина, Л.В. Романова, В.Г. Налетов и др. // Природноочаговые инфекции в России: Современная эпидемиология, диагностика, тактика защиты населения: Матер. Всесоюзн. научно-практ. конф. - Омск, 1998. - С. 156-157.
  29. Романова, Л.В. Применение ПЦР в генотипической характеристике холерных бактериофагов / Л.В. Романова, Т.А. Кудрякова, Л.Д. Македонова, Г.В. Качкина и др. // Генная диагностика особо опасн. инф.: Матер. I-ой Всерос. научно-практ. конф. - Саратов, 2000. -С. 31-33.
  30. Романова, Л.В. Некультивируемые формы Francisella tularensis: условия получения и реверсии в исходное состояние / Л.В. Романова, Б.Н. Мишанькин, Н.Л. Пичурина, С.О. Водопьянов и др. // Журн. микробиол. эпидемиол. иммунобиол. - 2000. - № 2. - С. 11-15.
  31. Романова, Л.В ПЦР и проблема некультивируемых форм Francisella tularensis / Л.В. Романова, Б.Н. Мишанькин, Н.Л. Пичурина // Инфекционные болезни: диагностика, лечение, профилактика: Матер. VI Российско-Итальянской науч. конф. - Санкт Петербург, 2000. - С. 215.
  32. Пичурина, Н.Л. Совершенствование тактики лабораторных исследований при эпизоотологическом мониторинге природных очагов туляремии / Н.Л. Пичурина, Э.А. Москвитина, Б.Н. Мишанькин, Л.В. Романова, С.А. Гавринев, В.В. Баташов и др. // Инфекционные болезни: диагностика, лечение, профилактика: Матер. VI Российско-Итальянской науч. конф. -Санкт Петербург, 2000. - С. 197.
  33. Romanova, L.V., Kudryakova T.A., Makedonova L.D., Kachkina G.V., Mischankin B.N. Genotyping of Vibrio cholerae bacteriophages using arbitrary primer polymerase chain reaction (AP-PCR) / L.V. Romanova, T.A. Kudryakova, L.D. Makedonova, G.V. Kachkina, B.N. Mischankin // The 9th International Congress for Culture Collection (ICCCI). - Brisbane.-Australia, 2000. - P. 105.
  34. Мишанькин, Б.Н. Туляремия: перспективы использования полимеразной цепной реакции при эпидемиологическом надзоре / Б.Н. Мишанькин, Э.А. Москвитина, Н.Л. Пичурина. Л.В. Романова и др. // Актуальные вопросы особо опасных инфекций. - Нальчик, 2000. - С. 49-51.
  35. Romanova, L.V. Transfer of Francisella tularensis to the nonculturable state: indaction and condition favourable for reversion / L.V. Romanova, B.N. Mischankin, N.L. Pichurina // The 3-rd International Conference on Tularemia. - Umea. - Sweden, 2000. - P. 25.
  36. Романова, Л.В. Осмотический стресс у возбудителя туляремии / Л.В. Романова, Н.Я. Шиманюк, Т.Г. Мордвинцева, Б.Н. Мишанькин // Эпидемиологический надзор и социально-гигиенический мониторинг: Матер. Российской научно-практ. конф. - Москва, 2002. - С. 83.
  37. Москвитина, Э.А. Компьтерные базы данных для эпизоотического и эпидемического процессов при туляремии / Э.А. Москвитина, Г.Б. Анисимова, Н.Л. Пичурина, Б.Н. Мишанькин, И.В. Орехов, С.Ю. Водяницкая, Д.А. Феронов, Л.В. Романова // Эпидемиологический надзор и социально - гигиенический мониторинг: Матер. Российской научно - практ. конф. - Москва, 2002. - С. 67-68.
  38. Орехов, И.В. Особенности фаунистической структуры паразитарных систем некоторых природно-очаговых инфекций в условиях крупного города / И.В. Орехов, Э.А. Москвитина, Б.Н. Мишанькин, Н.Л. Пичурина, А.Д. Линкович, В.И. Адаменко, С.Ю. Водяницкая, Л.В. Романова и др. // Проблемы особо опасных инфекций. - 2002. - Вып. 1/83. - С. 64-72.
  39. Romanova, L.V. Influence of osmotic stress on Francisella tularensis / L.V. Romanova, N.Ya. Shimanyek, T.G. Mordvintseva, B.N. Mishankin // Fourth International Conference on Tularemia. The Assembly Room, City of Bath, Romsey. - UK, 2003. – P. 10.
  40. Романова, Л.В. Место ПЦР в эпидемиологическом мониторинге природных очагов туляремии Ростовской области / Л.В. Романова, Н.Л. Пичурина, Э.А. Москвитина, С.Ю. Водяницкая и др. // Современные технологии в диагностике особо опасных инфекционных болезней: Матер. 4-й Межгосударст. научно-практ. конф. государств - участников СНГ. - Саратов, 2003. - С. 157-160.
  41. Романова, Л.В. Тепловой стресс и белок теплового стресса GroEL у возбудителя туляремии / Л.В. Романова, С.О. Водопьянов, С.Р. Саямов, И.П. Олейников и др. // Биотехнология. - 2004. - № 5. - С. 33-39.
  42. Романова, Л.В. Солетолерантность и осмотический (солевой) стресс у возбудителя туляремии / Л.В. Романова, Н.Я. Шиманюк, С.Р. Саямов, А.К. Киселева и др. // Биотехнология. - 2004. - № 6. - С. 27-33.
  43. Романова, Л.В. Изучение солевого стресса туляремийного микроба с помощью ОП-ПЦР / Л.В. Романова, Б.Н. Мишанькин // Медицинская микробиология - XXI век: Матер. Всеросс. научно-практ. конф. - Саратов, 2004. - С. 192.
  44. Романова, Л.В. Возбудитель туляремии: современные аспекты экологии и диагностики / Л.В. Романова, Б.Н. Мишанькин // Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении в решениях Санкт - Петербургского саммита «Группы восьми» и санитарная охрана территорий государств - участников Содружества Независимых Государств: Матер.VII Межгосударств. научно-практ. конф. Оболенск, 2006. - С. 119-120.





© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.