WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

 

   На правах  рукописи

 

Неминущая Лариса Анатольевна

ТЕХНОЛОГИЯ ПРОИЗВОДСТВА И ОБЕСПЕЧЕНИЕ КАЧЕСТВА СИНБИОТИКОВ ЛАКТОСУБТИЛ-ФОРТЕ И АВИЛАКТ-ФОРТЕ, 

ЭФФЕКТИВНОСТЬ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ В ПТИЦЕВОДСТВЕ

03.00.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии)
 

 

  АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
  доктора биологических наук

 

Щелково – 2011 г.

Работа  выполнена  в ГНУ Всероссийский  научно-исследовательский и технологический институт  биологической  промышленности  Российской  академии  сельскохозяйственных  наук.

Научный  консультант: академик  РАСХН,  доктор ветеринарных наук, профессор,

лауреат Государственной премии РФ,

Заслуженный деятель науки РФ  Самуйленко  Анатолий Яковлевич 

Официальные  оппоненты:

доктор ветеринарных наук, профессор Белоусов Василий Иванович

доктор биологических  наук  Малик Нина Ивановна 

доктор биологических наук, профессор Тихонов Игорь Владимирович


Ведущая организация: ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р.Коваленко»

Защита  состоится  18 ноября  2011 г. в  10  часов на заседании диссертационного совета Д 006.069. при  Всероссийском научно-исследовательском и технологическом институте биологической промышленности РАСХН по адресу: 141142, Московская область, Щелковский район, пос. Биокомбината, д.17, ВНИТИБП, e-mail: vnitibp@mail.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке  Всероссийского научно-исследовательского и технологического института биологической промышленности.

Автореферат разослан  __________________ 2011г.

Ученый секретарь диссертационного совета,
кандидат биологических наук Фролов Юрий Дмитриевич

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1.

Актуальность темы. В приоритетном национальном проекте «Развитие агропромышленного комплекса» указано, что решение актуальных проблем развития сельского хозяйства напрямую связано с использованием инноваций и  наукоемких технологий, играющих ключевую роль в обеспечении населения качественной и безопасной продукцией животноводства.

Наиболее динамично развивающейся и наукоемкой отраслью АПК является птицеводство: в 2010 г. производство мяса птицы увеличилось на 13,5%, его доля на внутреннем рынке мясных ресурсов соответствовала мировым показателям и составила 40%, из них 83% обеспечено отечественным производством (Бобылева Г.А., 2010; Фисинин В.И., 2011). Успехи достигнуты за счет внедрения максимально продуктивных кроссов и интенсивных технологий выращивания.  В то же время увеличение поголовья привело к значительному усилению техногенной и микробиологической нагрузки на организм птицы, что особенно важно для бройлерного птицеводства (Шоль В.Г., 1999;  Малик Н.И., 2004; Салеева И.П., 2007).

Высокопродуктивная птица характеризуется повышенной чувствительностью к стрессам и нарушениям в режимах кормления и содержания, низкой иммунокомпетентностью. Основное место среди причин отхода молодняка занимают  дисбактериоз (Сидоров И.В., 1976;  Бессарабов Б.Ф. с соавт., 1988;  Груздев К.Н., 2005;  Виноходов В.О., Лысенко С.Н., 2008), вирусные болезни (ньюкаслская болезнь, грипп и др.) и микст-инфекции (Сафонов Г.А., 1984;  Смоленский В.И.,  2001, 2007; Алипер Т.И. с соавт., 2007; Тихонов И.В. с соавт., 2008; Джавадов Э.Д., 2010).

В сложившейся ситуации  необходимо качественное изменение характера кормовой базы за счет создания и применения экологически безопасных и эффективных биологически активных кормовых добавок, обладающих не только питательной ценностью, но и защитным действием на организм птицы (Егоров И.А., 2004; Околелова Т.М., 2004), что обусловило интенсивное развитие такого направления экобиотехнологии, как разработка и использование в ветеринарии пробиотиков, пребиотиков и синбиотиков (Антипов В.А. с соавт., 1995; Панин А.Н. с соавт., 2004; Субботин В.В., Данилевская Н.В., 2009). Это дает возможность решить проблему профилактики и терапии дисбактериозов, повысить эффективность вакцинопрофилактики инфекционных болезней за счет предотвращения/снижения риска развития вторичных иммунодефицитов, иммунодепрессивного действия ряда вакцинных штаммов на организм животных и птицы (Зинченко Е.В.,  2002; Борисенкова А.Н. с соавт., 2004; Федоров Ю. Н., 2005).

Лечебно-профилактические и ростостимулирующие экологически безопасные препараты  при малых расходах (в зависимости от их состава -  от 200 г до 5 кг на тонну корма) физиологичны по своему действию, безвредны для животных, технологичны в производстве и применении (Fuller R., 1989; Тараканов Б.В., 2000; Сидоров М.А., 2001; Малик Н.И., 2001; Грязнева Т. Н., 2005; Шендеров Б.А. , 2005; Рымарева Л.В. с соавт., 2008;  Воробьева Г.И.  с соавт.,  2010).  Их можно производить по унифицированным технологиям на гибких технологических линиях, тиражированных и размещенных  в непосредственной близости к потребителю - на модульных биозаводах, агропредприятиях и птицеводческих комплексах  (Самуйленко А.Я. с соавт., 2009). 

Конкурентоспособность инновационных разработок характеризуется оптимальным соотношением затраты/эффективность (Данилевская Н.В., Субботин А.В., 2005) и задается в процессе разработки новых препаратов, построенном с учетом требований современных международных и национальных законов («Об обращении лекарственных средств», «О ветеринарии») и стандартов ИСО c. 9000 (ГОСТ Р ИСО 9001-2008) и GMP (ГОСТ Р 52249-2009).  На этапе проектирования процесса создания новой продукции  (ИСО 10006:2003) закладываются характеристики  ее качества и безопасности. В методологию проектного подхода  входит планирование и проведение доклинических исследований (ДИ),  которые осуществляются в соответствии с Правилами GLP и требованиями  Директивы ЕС 86/609/ЕЭС от 1986 г. «О защите животных, используемых в экспериментальных и научных целях». Для оценки безопасности  в качестве альтернативы  опытам на животных рекомендуется использовать  чувствительные биотест-системы  доорганизменного уровня  (Крылов Ю.Ф., 1985; Виноходов Д. О., 2007).

Предметом настоящих исследований  явилась разработка на основе концепции «пробиотик+пребиотик» и «пробиотики+белковая кормовая добавка» новых синбиотических комплексов (далее – синбиотиков),  в которых препараты и способы их применения в птицеводстве подобраны таким образом, чтобы их можно было использовать как лечебно-профилактические кормовые добавки.

    1. Цель и задачи исследований. Цель работы - разработка рецептур новых синбиотиков, технологии их производства, средств и методов обеспечения качества, способов применения в птицеводстве  при выращивании цыплят-бройлеров.

Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи:

- научно обосновать выбор и исследовать характеристики штаммов микроорганизмов  - продуцентов пробиотиков, пребиотика и белковой кормовой добавки, входящих в состав синбиотиков;

- разработать систему изготовления и контроля посевного  материала для производства пробиотиков АВИЛАКТ-1К (лактобактерии), АВИСУБТИЛ (бациллы),  пребиотика АВИСТИМ (культуральная жидкость гриба Fusarium sambucinum)  и белковой кормовой добавки ЦЕРЕВЕТ (дрожжи  Saccharomyces cerevisiae);

- разработать схему доклинических исследований безвредности, эффективности и стабильности препаратов, новые методы контроля безвредности с помощью биологических тест-систем доорганизменного уровня;

- разработать технологию изготовления препаратов АВИЛАКТ-1К, АВИСУБТИЛ, АВИСТИМ и ЦЕРЕВЕТ с использованием универсальной питательной среды для культивирования микроорганизмов;

- изготовить опытные образцы препаратов и провести их доклинические испытания; исследовать антиоксидантное действие препарата АВИСТИМ в качестве новой характеристики биологической активности пребиотиков;

- определить эффективность применения синбиотиков АВИЛАКТ-ФОРТЕ (АВИЛАКТ-1К+АВИСТИМ) и ЛАКТОСУБТИЛ-ФОРТЕ (АВИЛАКТ-1К+АВИСУБТИЛ+ЦЕРЕВЕТ) при выращивании  цыплят-бройлеров; разработать способы их применения;

- определить экономический эффект применения  новых кормовых добавок на основе синбиотиков при выращивании бройлеров, разработать коммерческое предложение по их использованию в птицеводстве. 

1.3. Научная новизна. Научно обоснована концепция кормовых добавок на основе синбиотических комплексов («пробиотик+пребиотик» и «пробиотики+кормовая добавка»), сконструированы новые синбиотики для птицеводства ЛАКТОСУБТИЛ-ФОРТЕ и АВИЛАКТ-ФОРТЕ.

Установлено, что выбранные штаммы  лактобактерий (Lactobacillus acidophilus, штамм 1К)  и бацилл (Bacillus  subtilis,  штамм М8) по уровню антагонистической активности к патогенным микроорганизмам и резистентности к антибиотикам удовлетворяют требованиям, предъявляемым к  продуцентам пробиотиков. На их основе разработаны новые пробиотики АВИЛАКТ-1К и АВИСУБТИЛ.

Выделен новый штамм мицелиального гриба F. sambucinum, исследована его безопасность, химический состав биомассы и культуральной жидкости (Патент РФ «Штамм гриба Fusarium sambucinum – продуцент биологически активных веществ» №2259209, приор. от 26.03.2004 в соавт.). На основе культуральной жидкости гриба разработан новый пребиотик АВИСТИМ. Установлено антиоксидантное действие культуральной жидкости как показатель биологической активности пребиотиков.

Показана высокая питательная ценность биомассы инактивированных клеток дрожжей Saccharomyces cerevisiae, шт. diastaticus ВКПМ–-1218, разработана новая белковая кормовая добавка ЦЕРЕВЕТ.

В технологии изготовления входящих в состав синбиотиков  препаратов (пробиотиков, пребиотика и белковой кормовой добавки) для культивирования пробионтных бактерий, гриба и дрожжей-сахаромицетов использована универсальная питательная среда на основе ферментолизата отходов зерносырья. 

Разработан состав синбиотиков ЛАКТОСУБТИЛ-ФОРТЕ и АВИЛАКТ-ФОРТЕ и способы их применения при выращивании цыплят-бройлеров (Патент РФ «Кормовая добавка для птицеводства и способ выращивания птицы»  № 2286066, приоритет от 26.04.04, в соавт.). Установлен синергизм действия препаратов при их применении в составе комплексов.

Эффективность применения синбиотиков при выращивании цыплят-бройлеров определена с использованием широкого спектра показателей: европейский индекс продуктивности (интегральная характеристика зоотехнических параметров выращивания – живая масса и сохранность птицы, затраты корма); качество продукции (содержание белка и жира в мясе, выход мясных частей); экономический эффект; влияние на эффективность вакцинации птицы на модели ньюкаслской болезни (Патент РФ «Способ профилактики болезни Ньюкасла» №2035915, приоритет от 28.12.92г., в соавт.; Патент РФ «Вакцина против болезни Ньюкасла и способ ее применения»  №2035917, приоритет от 28.12.92г., в соавт.).

Впервые для обеспечения качества пробиотиков, пребиотика и белковой кормовой добавки в процессе их разработки и производства реализованы:

- методология проектного подхода согласно требованиям ГОСТ Р ИСО 9001-2008 «Системы менеджмента качества. Требования»  (алгоритм исследований соответствовал основным этапам разработки и внедрения в производство нового лекарственного средства: научная гипотеза и поисковые исследования; доклинические исследования; разработка технологии  производства и наработка опытных партий препаратов; клинические испытания в птицехозяйстве и оценка экономической эффективности);

- схема доклинических исследований безопасности, активности и стабильности препаратов в соответствии с Правилами GLP (обоснован выбор показателей и методы их определения;  установлены допустимые границы показателей; разработаны и применены для определения безопасности новые методы биотестирования на моделях доорганизменного уровня - тест эмбриотоксичности на развивающихся эмбрионах кур и модификация ХЕТ-КАМ теста на хориоаллантоисной оболочке куриного эмбриона; изготовлены и использованы в исследованиях стандартные образцы - лабораторные рабочие эталонные материалы).

1.4. Практическая ценность работы. Применение синбиотиков АВИЛАКТ-ФОРТЕ и ЛАКТОСУБТИЛ-ФОРТЕ в птицеводстве способствует повышению продуктивности птицы, обеспечению ветеринарного благополучия  птицехозяйств,  гарантии качества, биологической и экологической безопасности как самой продукции, так и процесса ее производства.

По разработанной технологии изготовлено 45 серий препаратов. В доклинических исследованиях и производственных  испытаниях подтверждена их безопасность и эффективность. В птицехозяйстве проведен 21 научно-производственный опыт и два производственных испытания на цыплятах-бройлерах различных кроссов (суммарное поголовье  - 10 000 голов).  Разработаны  способы применения синбиотиков при различных путях введения препаратов (выпаивание, смешивание с кормом, напыление на гранулы комбикорма). Результаты испытаний включены в «Методические рекомендации по использованию пробиотиков, пребиотиков и симбиотиков в птицеводстве» и «Методические рекомендации по технологии камерной аэрозольной вакцинации цыплят против НБ».

Экономический эффект от применения синбиотиков ЛАКТОСУБТИЛ-ФОРТЕ и АВИЛАКТ-ФОРТЕ при выращивании бройлеров составил (в расчете на 1000 голов) 7862 и 1374 руб. соответственно. 

С учетом требований системы менеджмента качества и Правил GMP разработана и утверждена в установленном порядке нормативная документация: на  препараты АВИЛАКТ-1К, АВИСУБТИЛ, АВИСТИМ и ЦЕРЕВЕТ - технологические регламенты, стандарты организации (ТУ) и инструкции по применению, на синбиотики ЛАКТОСУБТИЛ-ФОРТЕ и АВИЛАКТ-ФОРТЕ – инструкции по применению.

Опыт применения методологии проектного подхода и доклинических исследований  использован в «Методических рекомендациях по разработке и реализации проекта создания нового лекарственного средства»,  «Рекомендациях по проведению доклинических испытаний новых лекарственных средств для животных и биологически активных добавок к кормам», «Методических рекомендациях по исследованию стабильности иммунобиопрепаратов на этапе разработки и в условиях действующего производства»,  «Методике определения раздражающего действия лечебно-профилактических препаратов для животных и их ингредиентов с помощью теста на хориоаллантоисной оболочке куриного эмбриона (ХЕТ-КАМ тест)», «Методике определения потенциальной токсичности лечебно-профилактических препаратов для животных и их ингредиентов на куриных эмбрионах (тест эмбриотоксичности)».

Разработан в соавторстве  и внедрен ОСТ 100083-95 «Продукция агробиологической промышленности. Технологические регламенты производства. Содержание, порядок разработки, построения, согласования и утверждения.», основные положения которого в 2010 г. актуализированы с учетом требований  ГОСТ Р 52249-2009 «Правила производства и контроля качества лекарственных средств» и включены  в проект национального стандарта РФ «Средства лекарственные для животных. Технологические регламенты производства. Содержание, порядок разработки, согласования и утверждения». Материалы документов использованы в 2003-2011 г.г. при внедрении системы менеджмента качества на биопредприятиях: ФГУП «Щелковский биокомбинат», «Орловская биофабрика», «Курская биофабрика», ОАО «Покровский завод биопрепаратов».

Результаты работы использованы для обоснования разработанной во ВНИТИБП и одобренной Президиумом Россельхозакадемии  (протокол №4 от 21.04.2011) «Концепции научного обеспечения создания и развития региональных биологических предприятий по производству препаратов для защиты животных, растений и средств, повышающих эффективность функционирования агропромышленного комплекса Российской Федерации», а также  вошли в  лекционный материал курсов повышения квалификации руководителей и специалистов птицеводческих предприятий «Новые технологии и пути повышения эффективности производства мяса бройлеров» г. Сергиев Посад (ГНУ ВНИТИП Россельхозакадемии), 2011г.

1.5.  Основные  положения диссертационной работы,  которые выносятся на защиту:

- характеристика штаммов микроорганизмов  -  продуцентов пробиотиков, пребиотика и белковой кормовой добавки, входящих в состав синбиотиков;

- система получения и контроля посевного  материала для изготовления препаратов АВИЛАКТ-1К, АВИСУБТИЛ,  АВИСТИМ  и ЦЕРЕВЕТ;

- схема доклинических исследований безопасности, активности и стабильности препаратов, гармонизированная с  международными требованиями;

- методы  определения безвредности препаратов с помощью биологических тест-систем доорганизменного уровня;

- технология изготовления препаратов с использованием универсальной питательной среды на основе ферментолизата отходов  зерносырья;

- антиоксидантное действие как новая характеристика биологической активности пребиотиков;

- эффективность применения синбиотиков  при  выращивании  цыплят-бройлеров; влияние синбиотика АВИЛАКТ-ФОРТЕ на эффективность вакцинации птицы против ньюкаслской болезни;

- способы и экономическая эффективность применения синбиотиков АВИЛАКТ-ФОРТЕ и ЛАКТОСБТИЛ-ФОРТЕ в птицеводстве.

1.6. Апробация работы. Основные материалы диссертации  доложены и обсуждены:  в виде ежегодных отчетов по темам госзаданий на заседаниях ученого совета и методической комиссии ВНИТИБП (1991 - 2010 гг.);  на секции «Ветеринарная биотехнология» Отделения ветеринарной медицины РАСХН  (2004-2010 гг.); на пяти Международных конгрессах (XI International congress оf the World Veterinary poultry association, Будапешт,1997 г.; І и III Международные ветеринарные конгрессы по птицеводству, Москва, 2005 и 2007 г.г.;  конгрессы  «Биотехнология-2009, 2011», Москва, 2009,2011г.г.); на 42 Всесоюзных,  Республиканских, Международных и Всероссийских конференциях,  посвященных научным и практическим проблемам технологии промышленного производства ветеринарных биологических препаратов, проводившихся  в Москве, Минске, Риге, Киеве, Харькове, Алуште, Петербурге, Саранске, Владимире, Краснодаре, Курске, Пущино, Боровске, Светлогорске, Сергиевом Посаде, Покрове, Щелково  (1991 – 2011 гг.).

Разработки  удостоены: бронзовой медали и Диплома III степени (Российская агропромышленная выставка «Золотая осень», 2002г.), Дипломов V,VI и VII Международных выставок «Лаборатория Экспо» (2007, 2008, 2009 гг.), Диплома Россельхозакадемии  за лучшие  завершенные научные разработки 2010 года.

1.7. Публикации. Основные положения диссертационной работы  опубликованы в 70 научных работах, в том числе в 14  статьях  в изданиях по перечню, рекомендованному  ВАК  Минобрнауки  России для публикации материалов докторских диссертаций. По результатам исследований  получено 4  патента.

1.8. Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, включающих материалы и методы, результаты (4 главы), обсуждение, выводы и практические предложения, содержит 73 таблицы и 33 рисунка.  Список литературы включает 486 источников. В приложении представлены таблицы исходных данных и копии документов, подтверждающих достоверность результатов работы, ее научную и практическую значимость.

1.9. Личный вклад автора заключается в формулировании проблемы, постановке цели и задач исследований, методологическом обосновании путей решения поставленных задач, непосредственном планировании экспериментов и выполнении исследований, обобщении и интерпретации результатов, разработке нормативной документации. Автор принимала личное участие в изготовлении и контроле опытных серий  препаратов, их испытаниях  в птицехозяйстве, в подготовке научных публикаций и разработке методических документов.

1.10. Благодарности. Автор выражает благодарность научному консультанту, директору ВНИТИБП, академику РАСХН  А.Я. Самуйленко. В выполнении некоторых разделов диссертации принимали участие и оказывали практическую и консультативную помощь сотрудники института  Э.Ф. Токарик,  Г.И. Воробьева, В.И. Еремец, Т.А.Скотникова, Н.К.Еремец, А.А. Нежута, А.И. Албулов, Е.П.Сапегина, Е.И.Школьников, М.А.Фролова, Ю.Д. Фролов, Т.А. Авдеева, Т.А.Ломакина, Л.А.Елисеева, С.В.Калугин, а также сотрудники ВГНКИ:  В.И. Смоленский, О.А. Тугаринов; и ВНИТИП: В.И. Филоненко, В.Г. Шоль, И.П. Салеева, В.С.Лукашенко, Ш.А. Имангулов, Г.В. Игнатова - за что приносим им сердечную благодарность.

2.МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Работа выполнена в 1991-2011 гг. во ВНИТИБП и  его опытном производстве. Часть исследований проводили  совместно с  сотрудниками ВГНКИ, ГосНиисинтезбелок, ГНУ ВНИТИП Россельхозакадемии,  Института микробиологии РАН, кафедры микробиологии  МГАВМиБ им. К. И. Скрябина, эффективность разработок испытывали  в опытном хозяйстве ГУП  «Загорское ЭПХ ВНИТИП».

Объектами исследований служили: штаммы-продуценты (лактобактерии Lactobacillus acidophilus, шт. 1К, ВКПМ №В-2991;  бациллы Bacillus  subtilis, шт. М-8, ВКПМ №B-1948; дрожжи Saccharomyces cerevisiae (diastaticus) ВКПМ--1218;  новый штамм высшего гриба Fusarium sambucinum MKF 2001-3, ВКПМ №F-867; автолизат биомассы и культуральная жидкость гриба); новые препараты АВИЛАКТ-1К (жидкий или сухой пробиотик, содержащий живые клетки L. acidophilus, шт. 1К) и  АВИСУБТИЛ (жидкий или сухой пробиотик, содержащий живые клетки B.  subtili,s  шт.М-8); пребиотик АВИСТИМ (культуральная жидкость гриба F.sambucinum  шт. MKF 2001-3); белковая кормовая добавка ЦЕРЕВЕТ (сухая биомаса инактивированных клеток дрожжей S. cerevisiae diastaticus ВКПМ–-1218); синбиотики  АВИЛАКТ-ФОРТЕ  (комплекс препаратов АВИЛАКТ-1K+АВИСТИМ) и ЛАКТОСУБТИЛ-ФОРТЕ  (АВИЛАКТ-1K+АВИСУБТИЛ+ЦЕРЕВЕТ).

Для оценки безопасности  препаратов определяли: токсичность для белых  беспородных мышей (масса тела 12-14 г) после введения внутрибрюшинно препарата в широком интервале доз; токсичность  для 9-10 сутчных SPF-эмбрионов кур (тест эмбриотоксичности); безвредность для цыплят суточного возраста после введения препаратов с кормом или водой; раздражающее действие на слизистые оболочки (ХЕТ-КАМ Тест в модификации).

Антагонистическую активность пробиотиков характеризовали в опытах: in vitro - по величине задержки роста полевых штаммов патогенных культур эшерихий (К-88, К-99, А-20E) и сальмонелл (S. tuphimurium, S. dublin, S. gallinarum); in vivo - по выживаемости цыплят при контрольном заражении полевым изолятом патогенного штамма E. сoli, выделенного в хозяйстве.  Резистентность к антибиотикам определяли in vitro  дисковым методом. Устойчивость бактерий-пробиотиков к действию желудочного сока (сухой медицинский, желудочный сок «Эквин». НПО «Биомед», г. Пермь) и желчи (желчь медицинская, ООО «Самсон», г.Санкт-Петербург) определяли по изменению количества живых бактерий после контакта с ними. Количество жизнеспособных бактерий определяли высевом  на среды MRS-5 и  сусло-агар.

Для характеристики химического состава пребиотика, кормовой добавки и зерноотходов определяли: массовую долю сухих веществ (по ГОСТ 28561-90); массовую долю золы (по ГОСТ 12572-67); массовую долю жира (по ГОСТ 13496.15-97); общий белок (по ГОСТ 26889-86); общее содержание углеводов (по ГОСТ 26176-91); макро- и микроэлементы методом атомно-абсорбционной спектрофотометрии (на приборе ААS-1N); органические кислоты методом газо-жидкостной хроматографии (на хроматографе Хьюлетт - Паккард, колонка-полисорб); витамины (флюорометрическим методом по ГОСТ 29138-91, 19139-91, 29140-91); состав и содержание аминокислот  (на аминокислотном анализаторе Биотроник LC-7000).

Антиоксидантную активность культуральной жидкости гриба определяли амперометрически на приборе  «Яуза-ААА-01» (Яшин Я.И., Яшин А.Я., 2002).

Эффективность синбиотиков для цыплят-бройлеров (кроссов «Смена», «Конкурент-2», «Кобб – 500»  и «Кобб – авиан-48») оценивали по  зоотехническим показателям (масса и сохранность птицы, затраты корма);  европейскому индексу продуктивности (ЕИП, определяемому по формуле ЕИП = АхВ/CхD, где А – живая масса, кг; В – сохранность, %; С – срок выращивания, сутки; D – затраты корма на 1 кг привеса, кг) и  качеству мяса (выхода мясных частей, содержание в них белка и  жира) с использованием  соответствующих  рекомендаций, разработанных ГНУ ВНИТИП. Влияние синбиотика на эффективность вакцинации птицы против НБ (вакцина против НБ птиц, штамм Ла-Сота, ТУ 10-19-212-86) оценивали по содержанию антител в сыворотке крови цыплят в реакции торможения гемагглютинации.

Экономическую  эффективность синбиотиков рассчитывали по формуле:

Э = (Сб – Сн) х Ан, где: Сб и Сн – себестоимость 1 кг прироста живой массы в базовом и новом вариантах; Ан – валовый прирост живой массы в новом варианте, кг.

Сухие формы препаратов получали методами сублимационного и распылительного высушивания. Контроль готовых препаратов осуществляли в соответствии с разработанными стандартами организации (СТО).

Статистическую обработку результатов (с числом повторов 3) проводили методами Кербера в модификации Ашмарина, наименьших квадратов, статистических критериев  Стьюдента-Фишера (t-критерий),  Кокса-Стюарта и др. с использованием стандартных программ  MATHCad-2001.

    1. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Структурно-логическая  схема достижения цели диссертационной работы представлена на рис 1.

3.1.  Характеристика штаммов микроорганизмов продуцентов пробиотиков, пребиотика и белковой кормовой добавки

На основании анализа существующего в настоящее время научного подхода и  данных литературы сформулированы  основные критерии отбора штаммов микроорганизмов – продуцентов пробиотиков, пребиотиков и белковых кормовых добавок микробиологической природы.  Штаммы-продуценты получают селекцией по заданным свойствам или выбирают в коллекции промышленных микроорганизмов в соответствии с определенными требованиями. В качестве объектов исследований из Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов  (ВКПМ) ФГУП ГосНИИГенетика нами выбраны: лактобактерии L. acidophilus (группа симбионтов), штамм 1К (ВКПМ № В-2991);  бактерии Bacillus  subtilis (транзиторная группа), штамм M-8 (ВКПМ №: В-3121); дрожжи Saccharomyces cerevisiae diastaticus  (ВКПМ--1218).  Для получения пребиотика использован выделенный нами новый штамм высшего лечебного гриба Fusarium sambucinum шт. MKF 2001-3

В дополнение к паспортным данным исследованы характеристики штаммов как продуцентов пробиотиков, пребиотиков и белковых кормовых добавок.

      1. Характеристика штамма 1К Lactobacillus acidophilus, В-2991. В соответствии с паспортом штамм  имеет следующие характеристики:  выделен из кишечника курицы; по культурально-морфологические признакам  - крупные грамположительные палочки; генетически устойчив; генетически не модифицирован; не патогенен для человека (классификация микроорганизмов по СП 1.2.731-99), при работе не требует специальных мер предосторожности; растет на обезжиренном молоке при температуре 37-40°С.

Для штамма определены: чувствительность бактерий к действию желудочного сока и желчи;  антагонистическая активность (АнтА) в отношении патогенных микроорганизмов как основная  характеристика пробиотической активности; резистентность к  действию наиболее часто применяемых в птицехозяйствах антибиотиков.

Показано, что лактобактерии данного штамма устойчивы  к воздействию желчи и  несколько меньше –  желудочного сока: снижение концентрации живых бактерий  по сравнению с исходным значением составило (0,6±0,2) lg КОЕ/см3 и (1,7±0,3) lg КОЕ/см3 соответственно (n=5).

При определении АнтА в опытах in vitro (n=10)  установлен (рис.2) выраженный антагонизм штамма в отношении  патогенных микроорганизмов. Определение  (n=4)  резистентности бактерий штамма 1К к  действию антибиотиков показало (рис. 3), что лактобактерии высокочувствительны (диаметр зоны ЗР >25мм) к кламоксилу, левомицетину, тетрациклину, цефазолину, ампициллину и рифампицину; чувствительны (15-25 мм) к гентамицину; умеренно чувствительны (11-15мм) к офлоксацину, ципрофлоксацину, энрофлону, линкомицину и флавомицину.

Рис. 2. Антагонистическая активность бактерий-пробиотиков.

Рис. 3. Антибиотикорезистентность бактерий-пробиотиков.

      1. Характеристика штамма M-8 Bacillus subtilis (В-3121). Штамм M-8 B. subtilis выделен из молока; культурально-морфологические признаки -  грамположительные неоднородные палочки длиной 2-3 мкм; является продуцентом протеолитических ферментов;  генетически не модифицирован; не патогенен для человека (СП 1.2.731-99),  при работе не требует специальных мер предосторожности; культивируется на ОМ, МПА при рН 7,0-7,2 и температуре 400С.

Для характеристики безопасности штамма в опытах на мышах исследованы: безвредность (при введении per os дозы 10 и 50х109 КОЕ/0,5см3), возможная вирулентность (при введении в/б суспензии живых бактерий в дозе 5 и 10х109 КОЕ)/0,5см3),  токсичность (при введении в/б суспензии инактивированных бактерий в дозе 1,0 и 2,0х109 КОЕ/0,5см3) и токсигенность  (при введении в/б 0,5 и 1,0 см3 культуральной жидкости). Установлено, что за весь период наблюдения (5 суток) животные (по 20 голов в группе) были клинически здоровы, активны, их поведенческие реакции не изменялись.

Исследована чувствительность бактерий данного штамма  к действию желудочного сока и желчи. Концентрация бактерий после контакта с ними составила (8,6±0,3) lg КОЕ/см3  и (7,8±0,2) lg КОЕ/см3 соответственно при исходном значении (9,1±0,3) lg КОЕ/см3, что свидетельствовало об устойчивости  к желудочному соку и несколько большей чувствительности к желчи. При исследовании АнтА in vitro (n=10)  показано (рис.2),  что штамм обладает выраженным антагонизмом в отношении  патогенных микроорганизмов, превышающим по величине аналогичные значения АнтА для лактобактерий. Установлено (рис.3), что бактерии  B.subtilis более устойчивы к действию антибиотиков по сравнению с лактобактериями.

      1. Характеристика штамма  F. sambucinum MKF-2001-3 (F 867). Для разработки пребиотика использован новый штамм гриба Fusarium sambucinum MKF-2001-3.  Изучение физиолого-биохимических характеристик штамма, его поддержание, обеспечение чистоты и стабильности свойств проведено нами при участии доктора биологических наук, профессора Воробьевой Г.И. Штамм депонирован в ВКПМ (№F – 867).  В исследовании  безопасности штамма, проведенном ФГУП  «Государственный научный центр по антибиотикам», установлено, что он не патогенен для растений и животных, не токсичен; может использоваться  при производстве биологически активных веществ  (БАВ) для пищевой промышленности. 

В соответствии с разработанным паспортом штамм имеет следующие характеристики: выделен из растительного сырья;  культурально-морфологические  признаки  - на агаризованной среде Чапека и сусло-агаре образует колонии с хорошо развитым воздушным мицелием, сначала белым, затем розовеющим, при старении приобретающим охряно – коричневые тона; физиологические признаки -  сбраживает и ассимилирует сахара, усваивает уксусную, молочную, янтарную и лимонную кислоты, растет на аммонийном азоте;  продукт, синтезируемый штаммом, -  обильный, быстрорастущий мицелий, содержащий  биологически активные вещества в липидной и белковой фракциях и белок в количестве 40-42 %;  активность (продуктивность) штамма  - до 15 г сухого мицелия на 1л культуральной жидкости;  устойчив к антибиотикам и фагам,  лизирующим клетки  других штаммов того же вида грибов;  не является генномодифицированным, зоо- и  фитопатогенным, не токсичен;  культивируется на солодовом (6-7 Бал) сусло – агаре при 260С 72 часа; поддерживается путем периодических пересевов (3-4 раза в год), культура хранится при 18-200С.

Для оценки нового штамма как продуцента БАВ исследован (табл. 1) химический состав биомассы (БМ), культуральной жидкости (КЖ) и автолизата мицелия (АМ). Показано, что в их состав входят все незаменимые аминокислоты, полный набор микро- и макроэлементов в виде органических соединений, комплекс витаминов группы В.  Культуральная жидкость по сравнению с мицелием гриба содержала больше органических кислот  (10,9 г/л): лимонной (0,5 г/л), яблочной  (0,4 г/л),  фумаровой  (0,3 г/л), янтарной  (0,5 г/л), щавелево-уксусной (0,3 г/л), уксусной (0,5 г/л).

Таблица 1

Химический состав биомассы, культуральной жидкости и автолизата мицелия гриба

Показатели

КЖ

АМ

БМ

1

2

3

4

Общий анализ (масс %)

Сухие вещества

1,5

76,8

93,1

Общий белок

2,5

46,3

47,5

Жиры

0,02

4,8

7,1

Углеводы

13,0

18,7

22,0

Макро- и микроэлементы (мг/г)

Калий

45,0

13,35

19,35

Натрий

17,5

5,88

1,25

Кальций

12,5

1,935

29,95

Магний

1,75

1,225

2,95

Железо

0,005

0,922

0,65

Медь

0,003

0,028

0,015

Цинк

0,03

0,062

0,043

Марганец

0,012

0,043

0,244

Азот

10

23,6

34,9

Фосфор

23

11,8

17,45

Никель

0,001

0,006

0,01

Кобальт

0,001

0,002

Свинец

н/обн

н/обн

н/обн

Ртуть

н/обн

н/обн

н/обн

Мышьяк

н/обн

н/обн

н/обн

Аминокислоты (% АСВ)

Лизин

0,18

1,98

2,8

Гистидин

0,26

1,05

1,57

Аргинин

0,27

2,01

2,2

Аспарагиновая кислота

0,41

3,17

3,25

Треонин

0,18

1,33

2,00

Серин

0,15

1,23

1,70

Пролин

0,36

1,15

1,59

Глицин

0,24

1,35

1,75

Аланин

0,25

1,94

3,00

Цистин

0,10

0,18

  0,45

1

2

3

4

Валин

0,21

1,70

1,90

Метионин

0,08

0,42

0,80

Изолейцин

0,16

1,25

1,37

Лейцин

0,18

2,10

2,25

Тирозин

0,01

1,11

1,40

Фенилаланин

0,11

1,25

1,81

Глютаминовая кислота

0,72

3,67

4,60

Сумма аминокислот

3,87

26,89

34,44

Витамины (мг/г)

В1 (тиамина хлорид)

0,009

0,001

11,2

В2 (рибофлавин)

0,11

0,088

60,0

В3 (пантетеновая к-та)

0,06

0,145

305,0

1

2

3

4

В4(холин

н/обн

н/обн

следы

В5 (никотиновая кислота)

9,60

  0,087

49,5

В6 (пиридоксин)

0,05

0,008

15,0

В9 (фолиевая кислота)

0,025

  0,017

12,5

В12(цианокобаламин)

0,020

  0,0002

7,5

Н (биотин)

следы

0,001

1,5

А (ретинол)

н/обн

н/обн

н/обн

Е (токоферол)

0,031

0,032

0,1

Новый штамм гриба Fusarium sambucinum MKF 2001-3 сравнивали  с известным штаммом – Fusarium sambucinum PS-64 (ВКПМ F-165) по продуктивным свойствам и способности КЖ  гриба ускорять рост дрожжей. Установили, что масса мицелия, продуцируемая культурой гриба нового штамма, увеличилась на 25%, содержание белка - на 5,1%, углеводов - на 3,7% (в том числе гликанов на 6%);  время накопления биомассы гриба сократилось на 2-4 часа. КЖ нового штамма более эффективно влияла  на  рост дрожжей S. cerevisiae diastaticus ВКПМ - -1218, чем КЖ штамма гриба F. s. PS-64: скорость роста увеличивалась на 37,3%,  степень потребления сахаров - на 33,7%, азота  -  на 34,8%  (в пересчете на NH4 ), фосфора – на 35,9%  (в пересчете на Р2О5).

3.1.4. Характеристика штамма дрожжей Saccharomyces cerevisiae (diastaticus) ВКПМ--1218.  Селекция штамма проведена на гидролизных средах и смеси гидролизных и крахмалсодержащих субстратов. Культурально-морфологическим  признаки -  на сусло-агаре имеет вид  округлых, гладких, тускло-блестящих, светло-кремовых колоний;  устойчив к фагам,  лизирующим клетки других штаммов того же вида микроорганизмов; генетически не модифицирован; не патогенен для человека (СП 1.2.731-99),  при работе не требует специальных мер предосторожности; культивируется на различных углевод- и крахмалсодержащих средах, при рН - 4,2-5,8 и температуре  30-32°С,  способен накапливать биомассу на отходах зернопроизводства (зерно, отруби, мука).

Биомасса дрожжей исследуемого штамма исследована по  химическому составу в сравнении с другими белковыми кормовыми добавками (табл.2).

Таблица 2

Состав различных белковых кормовых добавок

Пока­затель, единицы

измерения

Подсолнечн. шрот

Соевый шрот

Дрожжи кормовые

Рыбная мука

ВКПМ--1218


Сырой протеин, %

38

45

45

60

45

Клетчатка, %

15

7

1,5

1

8

Лизин, %

1,2

2,7

2,9

4,7

3,07

Метионин, %

0,68

0,61

0,54

1,7

1,13

Триптофан, %

0,45

0,59

0,62

0,60

0,37

Фосфор, %

0,9

0,63

1,32

3,5

0,88

В1, мг/кг

3,2

3,1

16

1

38,7

В2, мг/кг

3,1

3,8

40

11

239,4

В3, мг/кг

13

16

60

17

67,8

В4 ,мг/кг

2300

2500

2800

3500

1040

В5, мг/кг

240

40

250

90

234

В6, мг/кг

11

5

30

4

29

В12, мг/кг

-

-

-

-

34

А, мг/кг

-

-

-

-

88,5

Д, мг/кг

-

-

-

-

119,2

Е, мг/кг

-

-

-

-

585

С, мг/кг

-

-

-

-

168

К, мг/кг

-

-

-

-

0,45

Обменная энергия, ккал/кг

2670

2500

2800

2810

2890

Переваримость белка, %

86

90

88

90

86,5

Показано, что по питательной ценности биомасса аналогична соевому и подсолнечному шротам,  по содержанию белка  уступала  толь­ко рыбной муке, в отличие от других кормовых добавок  содержала  витамины В12, А, Д, Е, С и К.

Таким образом, установлено, что выбранные штаммы отвечают предъявляемым к ним требованиям и могут служить продуцентами при разработке препаратов пробиотиков, пребиотиков и кормовых добавок с пребиотическими свойствами.

    1. Изготовление и контроль посевного  материала.

Согласно современным требованиям (ГОСТ Р 52249-2009, ГОСТ Р 2001-2008) разработка системы изготовления и методов контроля посевного материала, используемого в технологическом процессе производства биопрепаратов, является  обязательным условием обеспечения их качества. Реализация стандартной процедуры изготовления и контроля посевного материала позволяет: 1) гарантировать идентичность исходному штамму характеристик и свойств материала, используемого для изготовления конечного продукта; 2) разработать методы контроля безопасности, активности и стабильности препарата; 3) включить данную процедуру в виде самостоятельного документа в технологические регламенты производства. В отечественной практике разработки и производства лекарственных средств  для ветеринарии и кормовых добавок для животных системный подход к данной процедуре не имеет широкого распространения, поэтому его реализация является актуальной.

Система посевных материалов (Seed lot system, S.l.s.) – это технологическая система, в которой последовательные серии промежуточных продуктов (вирусной или микробиологической природы) получают посредством установленного количества пересевов (пассажей). Она состоит из главного (Master seed,  M.s.),  рабочего (Working seed, W.s.) и производственного посевного материала (Production seed, P.s.), предназначенного только для производства серии конечной продукции. Последовательность получения посевного материала: Master seed Working seed Production seed. Для изготовления  небольших объемов  продукции допускается использовать  непосредственно  рабочий посевной материал. 

Микроорганизмы выбранных штаммов-продуцентов культивировали в соответствии с условиями, указанными в паспорте на данный штамм.  Полученные культуры контролировали микроскопированием на отсутствие посторонней микрофлоры и подлинность (культурально-морфологические признаки), стабилизировали путем сублимационного высушивания  с защитной средой ОМ  (M.s. - в ампулах по 1 см3,  W.s. - в пенициллиновых флаконах по 2 см3) по режимам, разработанным при участии доктора биологических наук Нежуты А.А.  Готовый посевной материал (M.s.  и  W.s.) контролировали по показателям подлинности, безопасности и активности, а M.s. - дополнительно на соответствие основным характеристикам штамма.  Для характеристики безопасности определяли: контаминацию посторонней бактериальной и грибковой микрофлорой, безвредность для цыплят суточного возраста и токсичность  для развивающихся SPF-эмбрионов кур (РЭК) с использованием разработанного нами теста эмбриотоксичности. Активность пробиотиков оценивали по количеству жизнеспособных бактерий, антагонистической активности in vitro, резистентности к антибиотикам.  Полученные серии хранили: M.s. - 5 лет при  температуре   - 400С, W.s. - 18 месяцев при температуре 8-100С.

3.2.1. Посевной материал L. acidophilus для пробиотика  АВИЛАКТ-1К.  M.s. представлял собой 2-й пассаж коллекционного штамма, W.s. - 3-й пассаж M.S. Изготовлено 300 ампул серии M.s.  и  3 серии W.s. по 300 флаконов каждая. Одна серия W.s. использована в качестве лабораторного рабочего эталонного материала  (ЛРЭМ) для стандартизации определения количества жизнеспособных лактобактерий и исследования их термостабильности. Контроль изготовленных серий M.s.и W.s. показал: 1) отсутствие контаминации посторонней микрофлорой; 2) отсутствие эмбриотоксичности; 3) безвредность для  цыплят суточного возраста (при однократном выпаивании дозы препарата, составляющей 0,5 и 1,0% суточного количества корма);  4) соответствие показателей  активности характеристикам, определенным для коллекционного штамма; количество жизнеспособных лактобактерий составило не менее 5,0х108 КОЕ/г. Для M.s. установлено соответствие паспортным характеристикам по культурально-морфологическим  признакам  и чувствительности лактобактерий к действию желудочного сока и желчи.

3.2.2. Посевной материал B. subtilis для пробиотика АВИСУБТИЛ.  M.s. - 2-й пассаж коллекционного штамма, W.s. - 2-й пассаж M.s.  Изготовлено 300 ампул серии M.s. и 2 серии по W.s 300 флаконов. Контроль изготовленных серий M.s.и W.s. показал: 1) их безопасность; 2) соответствие показателей  активности характеристикам, определенным для коллекционного штамма;  количество жизнеспособных бациллобактерий  –  не менее 5х109КОЕ/г. M.s.  дополнительно контролировали на соответствие паспортным характеристикам штамма и отсутствие токсигенности, вирулентности, острой и хронической токсичности по методикам, использованным при характеристике штамма.

3.2.3. Посевной материал гриба F. sambucinum  для пребиотика АВИСТИМ.  M. s. - 2-й пассаж коллекционного штамма, W.s. - 2-й пассаж  M.s. Изготовлено 300 ампул серии M.s. и 2 серии W.s. по 300 флаконов. Готовый посевной материал (M.s. и W.s.) контролировали по культурально-морфологическим признакам, содержанию сырого протеина в биомассе, активности (продуктивности) штамма и показателям  безопасности. Культуральную  жидкость (КЖ) M.s. характеризовали по содержанию органических кислот, сухих веществ, величине рН.  Безопасность КЖ дополнительно  характеризовали по потенциальному раздражающему действию на слизистые оболочки ЖКТ  с использованием ХЕТ-КАМ теста в нашей модификации.

Контроль серий M.s. и W.s. показал: 1) соответствие культурально-морфологических признаков паспортным данным; 2) безопасность; 3) содержание белка в биомассе  40,7 и 41,3 %  для M.s. и  W.s. соответственно;  4) продуктивность - 14,1 и 13,8 г мицелия/1 л КЖ. При  контроле  КЖ установлено: 1) безопасность; 2) высокое содержание  органических кислот - 10,1 г/л (лимонной - 0,7 г/л, яблочной - 0,5 г/л,  фумаровой - 0,4 г/л, янтарной - 0,4 г/л, щавелево-уксусной  - 0,6 г/л,  уксусной  - 0,8 г/л);  3) содержание сухих  веществ  2,5 -3,1%;  4) рН  в пределах 6,6-7,0.

3.2.4. Посевной материал дрожжей S. cerevisiae для кормовой белковой добавки ЦЕРЕВЕТ. M.s. - 2-й пассаж коллекционного штамма, W.s. - 3-й пассаж  M.S. На базе ФГУП ГосНииСинтезбелок готовый посевной материал (M.s. и W.s.) контролировали: 1) по химическому составу (содержание в сухом продукте сырого протеина,  истинного белка, липидов, углеводов, золы); 2) на подлинность (культурально-морфологические  признаки) и содержание дрожжевых клеток (микроскопированием и посевом на плотную питательную среду); 3) безопасность (отсутствие посторонней микрофлоры,  безвредность  для цыплят суточного возраста, отсутствие эмбриотоксичности и токсичности для тест-культур инфузорий тетрахимена пириформис и стилонихий).  Результаты контроля серий M.s. и W.s. показали: подлинность; безопасность; содержание дрожжевых клеток  5,0х106 и 4,8х106 в 1 г для M.s.  и W.s соответственно; соответствие химического состава характеристикам, определенным для коллекционного штамма  (массовая доля  сырого протеина – не менее 38%, истинного белка – не менее 28% , липидов – не более 10%, углеводов – не более 28%, золы – не более 12%).

Разработанная и реализованная система изготовления и контроля посевных материалов обеспечивала их соответствие исходным штаммам и гарантировала получение конечного продукта с заданными свойствами. На процедуры изготовления и контроля посевных материалов разработаны и утверждены директором ВНИТИБП соответствующие стандарты организации (СТО).

3.3. Технология  производства и доклинические исследования препаратов (пробиотиков АВИЛАКТ-1К, АВИСУБТИЛ, пребиотика АВИСТИМ и белковой кормовой добавки ЦЕРЕВЕТ),  изготовление опытных серий.

3.3.1. Разработка технологии производства препаратов.

Процесс изготовления препаратов является типовым для микробиологических производств и подчиняется общей технологической схеме, состоящей из основных технологических процессов (ТП), подготовительных (ПР) и вспомогательных (ВР) работ.  ПР включали подготовку  воздуха, помещений, оборудования, одежды, посуды,  инструментов, материалов первичной упаковки,  укупоривания и этикетирования. ВР - получение производственного посевного материала (P.s.), приготовление питательных сред, вспомогательных растворов. ТП состояли из этапов приготовления питательной среды и  культивирования бактерий в реакторе, фасования, сублимационного высушивания (при получении сухой формы), укупоривания и этикетирования препарата. Качество препаратов в процессе производства обеспечивали  системой технологического контроля. Для разработки схемы контроля устанавливали контрольные точки (КТ), определяемые в этих точках показатели, их допустимые пределы и методы определения. Качество готового продукта контролировали по показателям, определенным нами при изготовлении посевных серий.  Определены требования к качеству исходных материалов и промежуточных продуктов,  безопасности производства и охране окружающей среды.

С целью унификации  процесса культивирования штаммов-продуцентов нами исследована возможность культивирования микроорганизмов с использованием универсальной питательной  среды  на основе ферментолизата отходов  зерносырья.

3.3.1.1. Технология изготовления пробиотиков АВИЛАКТ-1К и АВИСТИМ.

Культивирование бактерий – пробиотиков L. acidophilus и B. subtilis. Посевной материал (P.s.) для культивирования бактерий в реакторе получали из  рабочей  посевной серии (W.s.) при выращивании в колбах с питательной средой на основе молочной сыворотки (МС) или ферментолизата отходов зерносырья (ФЗ).

Состав среды МС: сухая молочная сыворотка – 30г; (NH4)2SО4 – 0,05г; КН2РО4 – 0,03г; дрожжевой автолизат – 0,01дм3; вода водопроводная – 1,0 дм3. Характеристика среды после стерилизации (0,5 атм 30 мин.): редуцирующих веществ (РВ) – 1,6%; NH4 – 0,9 г/ дм3; Р2О5 – 0,5 г/ дм3.

Состав среды ФЗ: (NH4)2SО4 – 0,05г; КН2РО4 – 0,02 г; дрожжевой автолизат  - 10 см3, мел - 3 г;  ферментолизат отходов зерносырья - 1,0 дм3. Среду стерилизовали при 1 атм. в течение 40 минут. Для получения ферментолизата смесь измельченной ржи и пшеничных отрубей (в соотношении 30:70) разбавляли водой (гидромодуль 1:6 или 1:8) и подвергали последовательно: термообработке при температуре (80±1)°С в течение 1 часа; обработке в роторно-пульсационном аппарате при температуре (75±1)°С в течение 40 мин.; ферментолизу зерновой пульпы глюкавамарином ГЗХ при температуре (55±1)°С в течение 4 часов при рН 5,0-5,2. Среду стерилизовали при 1 атм 40 мин. Характеристика среды после стерилизации:  редуцирующих веществ РВ – 2,5-3,0%; NH4 – 0,9 -1,0 г/ дм3; Р2О5 – 0,4-0,5 г/дм3.

Бактерии L. acidophilus культивировали в термостате при температуре (37±0,5)0С, в течение 70-72 часов при периодическом перемешивании (каждые 12 часов), B.subtilis - на качалке (g=200 об/мин) при температуре (37±1)0 С в течение  40-48 часов. После окончания процесса состояние каждой культуры  контролировали микроскопированием на  отсутствие посторонней микрофлоры и  соответствие культурально-морфологическим признакам, определяли накопление клеток, которое было одинаковым для обеих сред и составляло для L. acidophilus 1х109 – 1х1010 КОЕ/см3 ,  для 1х1010 – 1х1011КОЕ/см3 (количество спор 40-60%).  Полученный посевной материал использовали для культивирования бактерий в биореакторе (V=30 и 300дм3).

Режим культивирования L. acidophilus в реакторе: количество P.s. составляло 8-10% от объема питательной среды ФЗ; температура - 31-320 С, время – 20-24 часа; перемешивание в течение первых двух часов (по 15 минут в час, g=180 об/мин.); начальное значение рН  - 7,0-7,2; при культивировании рН поддерживали на уровне 6,5-7,0 (6%-ной аммиачной водой). Конечная концентрация сухих ве­ществ в биомассе - 10,0-12,0 г/дм3;  концентрация сахаров в среде снижалась до  0,2%.  Накопление лактобактерий  -  не менее 5х109 КОЕ/см3. Режим культивирования B.subtilis: объем посевного материала - 5-6%; температура - 37-380С,  время 36-48 часов; перемешивание мешалкой (300 об/мин); аэрация (1 дм3 воздуха/1 дм3 среды/мин.); начальное значение рН 7,0-7,2, в процессе культивирования не регулировалось. Конечная концентрация бактерий - 1х1010 – 1х1011  КОЕ/см3,  количество спор 30-50%.

Состояние культур бактерий контролировали микроскопированием.

Изготовление готовых форм препаратов. Для пробиотиков разработано две готовые формы – жидкая и сухая. После культивирования  и контроля качества продукт  в первом случае фасовали в первичную тару и укупоривали, во втором – фасовали в кассеты и подвергали сублимационному высушиванию по режимам, разработанным для двух питательных сред: МС и ФЗ.  Количество живых бактерий в сухом материале составляла не менее 3х109КОЕ/г и 1х1011КОЕ/г для L. acidophilus и B. subtilis соответственно. Жидкий препарат расфасовывали  в стеклянную или полиэтиленовую тару, предназначенную для лекарственных  средств и  пищевых продуктов. Сухой препарат расфасовывали в полимерные пакеты. 

3.3.1.2. Технология  производства пребиотика АВИСТИМ.  Культивирование гриба F. sambucinum. Посевной материал (P.s) получали культивированием в колбах со средой МС или ФЗ при температуре (26±1)0С на качалке (g=160 об/мин). Время культивирования пассажей: первого – 96 часов, второго – 48часов, третьего и последующих – 24 часа. Контролировали микроскопированием  состояние культуры, определяли накопление биомассы - 5-6 г/дм3 (одинаковое для обеих сред) и использовали для культивирования в биореакторе при следующих параметрах: объем P.s. - 2-4%; температура - (27±2)0С; время – 30-34 часа; перемешивание постоянное (g=120 об/мин.); барботаж воздухом (при 1,1 атм); остаточное давление 0,25 атм;  начальное значение рН 5,5-6,0; процесс заканчивали при снижении рН до 4,1±0,5. Через 12 часов после начала процесса отбирали пробы (1 раз каждые 3 часа) для определения рН среды, концентрации биомассы, контроля состояния мицелия. После окончания процесса культуральную среду  подкисляли до рН 3.,0-3,5 и выдерживали в течение 1-3 часов. Концентрация биомассы составляла 10-12 г/дм3, содержание белка  - 46-53%.

Получение готовой формы препарата. КЖ отделяли от биомассы фильтрацией на нутч-фильтрах (фильтрующая ткань типа лавсана, разрежение 0,05-0,07 МПа, скорость 90-110 л/м2/мин.), подвергали стерилизующей фильтрации и  расфасовывали  в стеклянную  или полиэтиленовую тару.

3.3.1.3. Технология  производства белковой кормовой добавки ЦЕРЕВЕТ.  Культивирование дрожжей-сахаромицетов. Посевной материал (P.s.) культивировали в колбах со средой МС или ФЗ на качалке (g=160 об/мин.) при температуре (33±1)0 С и рН 4,5-5,5 в течение 24-36 часов до полного потребления свободных углеводов. Контролировали состояние культуры, определяли концентрацию биомассы (23-25 г/дм3), содержание остаточных РВ в культуральной среде (0,1-0,2%) и использовали для культивирования в биореакторе при следующих параметрах: объем посевного материала – 4-5%; (P.s) начальное значение рН 5,0±0,5; температура - (31±1)0С; время - 18-19 часов; постоянное перемешивание (g=120 об/мин.), аэрация (1 дм3 воздуха/1 дм3 среды,  расход воздуха 7-9 м3/час); конечная концентрация биомассы - 20-25 г/дм3,  содержание РВ в среде  - 0,1-0,2%.

В качестве биокатализатора при культивировании дрожжей в промышленном биореакторе использовали КЖ гриба, которую добавляли в ферментолизат в количестве 0,1-1,0% от объема среды. При добавлении в питательную среду КЖ сокращалось время накопления биомассы с 19 до 10 часов, увеличивалась скорость потребления сахаров (на 32,1%), минерального азота  (на 21,5%)  и фосфора  (на 45,4%).

Получение готовой формы препарата. Биомассу  подвергали плазмолизу при 800 С в течение 1 часа, контролировали на отсутствие живых клеток и сушили на распылительной сушилке типа Niro Atomizer (температура на входе – 3000 С, на выходе - 950С). В полученном продукте содержание сырого протеина составляло 40-45%, истинного белка – 30-38%. Сухой препарат фасовали в полимерные пакеты. 

3.3.2. Разработка схемы доклинических исследований (ДИ) препаратов.

Исходя из общих требований к проведению ДИ, нами разработана для данного класса препаратов схема ДИ по основным показателям - безопасности, специфической активности и стабильности. Определена номенклатура показателей, методы их определения и допустимые значения. Методическую часть работы выполняли с использованием лабораторных рабочих эталонных материалов (ЛРЭМ).

3.3.2.1. Определение безопасности. Поскольку разрабатываемые препараты предназначены  для птицы, в качестве критериев оценки безопасности нами определены: отсутствие контаминации препарата посторонней микрофлорой, отсутствие токсичности для эмбрионов кур и безвредность  для цыплят суточного возраста. Поскольку КЖ  гриба впервые использована в качестве пребиотика для птиц, для нее введен дополнительный контроль - отсутствие потенциального раздражающего действия на слизистые оболочки ЖКТ. Требования к кормовой добавке ЦЕРЕВЕТ гармонизированы с существующей в РФ базой НД  на кормовые добавки (в том числе и кормовые дрожжи), для чего введены дополнительные контроли на отсутствие металломагнитных примесей и живых клеток дрожжей, а контроль на отсутствие контаминации посторонней микрофлорой  заменен на определение токсичности экспресс-методами  на инфузориях и общей бактериальной обсемененности.

Для контроля безопасности нами разработаны новые методы с использованием биотестирования на моделях доорганизменного уровня: тест эмбриотоксичности и модифицированный ХЕТ-КАМ тест.

Токсичность для куриных эмбрионов (тест эмбриотоксичности). Развивающиеся эмбрионы кур (РЭК) занимают среднее положение по чувствительности к токсическим веществам между лабораторными животными и культурой клеток и являются удобной моделью для оценки острой токсичности. Нами разработан и использован в  ДИ тест эмбриотоксичности -  экспресс-тест, принцип  которого заключался в следующем: 9-10 суточным SPF-эмбрионам  в аллантоисную полость вводили 0,1-0,2 см3 препарата и инкубировали при температуре  (37+0,5)оС до вывода цыплят, учитывая раз в сутки количество погибших эмбрионов. Критерием эмбриотоксичности препарата являлась эмбриональная смертность, суммированная по всем дням инкубации, а также состояние вылупившихся цыплят (отсутствие уродств и внешних патологий). Контроль служили интактные и инокулированные  физиологическим раствором (ФР) по 0,1-0,2 см3 эмбрионы.

Потенциальное раздражающее действие на слизистые оболочки ЖКТ. Для определения потенциального раздражающего действия КЖ на слизистые оболочки ЖКТ  использовали  ХЕТ-КАМ тест в нашей модификации. Принцип  ХЕТ-КАМ теста: раздражающее действие исследуемого вещества моделируется на  хориоаллантоисной оболочке (ХАО) 9-10 суточных развивающихся SPF эмбрионов кур (Лукьянов А.С., 1998). На ХАО наносили 0,5 см3 испытуемого раствора и наблюдали с помощью бинокулярного микроскопа за состоянием оболочки под каплей раствора. При отсутствии раздражающего действия за период наблюдения (1-3 мин) оболочка не должна нарушаться, сеть кровеносных сосудов и капилляров должна функционировать нормально. Изменения на оболочке могут выражаться в замедлении тока крови и тромбозе отдельных капилляров, покраснении оболочки или выходе из капилляров форменных элементов крови, остановке кровотока. Поскольку исследуемые объекты относятся к нетоксичным соединениям и  не могут обладать сильным раздражающим действием, тест нами модифицирован: 1) при наблюдении за изменениями на ХАО выбирали поле с мелкими сосудами и капиллярами; 2) время наблюдения увеличено до 10 минут; 3) реакцию считали положительной (+), если изменения наступали через 3-5 минут наблюдения; слабоположительной (+-) при наблюдении изменений в интервале 5-10 минут; отрицательной, если изменения не наступали в течение 10 минут; 4) состояние ХАО фотографировали; 5) в качестве положительного контроля  использовали 70%-ный этиловый спирт, обладающий  выраженным раздражающим  действием  на слизистые, отрицательного контроля  - физиологический раствор, не раздражающий слизистые.

Определение безвредности для суточных цыплят. Суточным цыплятам-бройлерам  перорально однократно вводили препараты АВИЛАКТ-1К и АВИСУБТИЛ в дозах 109КОЕ и 1010КОЕ/гол. соответственно; АВИСТИМ выпаивали в дозе, равной 50% суточного объема воды; ЦЕРЕВЕТ давали с кормом (3% от суточной нормы корма). Цыплят наблюдали в течение 10 суток, регистрируя их состояние (активность, аппетит, динамику массы, поведенческие реакции) и уровень падежа.

3.3.2.2. Определение специфической активности. Специфическую активность пробиотиков оценивали по подлинности, количеству жизнеспособных микроорганизмов, антагонистической активности in vitro и  in vivo,  резистентности к антибиотикам. Для биологически активных добавок (в частности пребиотиков), которые являюстя поликомпонентными по своему составу и полифункциональными по механизму действия, в настоящее время не существует общепринятых подходов к определению показателей их специфической активности. Нами определены интегральные показатели состава и определяемого им физиологического действия.  Благодаря своему составу КЖ может обладать антиоксидантным действием, которое является одним из антистрессовых механизмов, его величина (антиоксидантная активность - АА) может служить показателем специфической активности препарата. Поэтому для характеристики пребиотика выбраны следующие показатели: содержание сухих веществ,  величина рН  и АА. Специфическую активность кормовых добавок характеризовали по питательной ценности, которая согласно  НД на кормовые добавки определяется содержанием в них белка, углеводов, липидов, а также сухих веществ.

Определение подлинности бактерий-пробиотиков устанавливали  общепринятым методом окрашивания по Граму.

Количество жизнеспособных микроорганизмов в препаратах АВИЛАКТ-1К и АВИСУБТИЛ определяли стандартным методом подсчета колоний.  Метод характеризуется большим разбросом данных, поэтому проведена стандартизация условий определения количества жизнеспособных лактобактерий по разработанной нами и утвержденной директором ВНИТИБП «Методике построения гистограмм для оценки стабильности и точности технологических процессов и операций».  По результатам статистической обработки многократного (n = 68) определения количества жизнеспособных лактобактерий в образцах ЛРЭМ построена  гистограмма распределения данных, определено  среднее значение количества жизнеспособных бактерий

() и его среднеквадратичное отклонение (): ± = (6,7 ± 0,5)х108 КОЕ/см3. Характер гистограммы свидетельствовал о нормальном характере распределения данных и, следовательно, о стабильности результатов определения показателя в контролируемых сериях препарата. Если полученное для ЛРЭМ значение количества жизнеспособных лактобактерий укладывалось в интервал (6,7 ± 0,5)х108 КОЕ/см3, то условия определения считали стандартными, а полученное значение в контролируемой серии – достоверным при указанной величине ошибки определения.

Определение антагонистической активности (АнтА) препаратов АВИЛАКТ-1К и АВИСУБТИЛ  по отношению к патогенным микроорганизмам в опытах in vitro.  По данным, полученным при характеристике штаммов и контроле посевных материалов, установлены минимально допустимые значения АнтА для L. acidophilus (зона задержки роста  эшерихий – не менее 7 мм, сальмонелл – не менее 6 мм) и B. subtilis (зона задержки роста  эшерихий – не менее 15 мм, сальмонелл - не менее 10 мм). Для стандартизации условий определения АнтА использовали образцы ЛРЭМ. Если получали значения АнтА ниже заданных показателей, проводили повторное исследование параллельно с образцом ЛРЭМ. При подтверждении полученного результата серию считали не прошедшей контроль по данному показателю. Наличие антагонистической активности препаратов, установленное в опытах in vitro, подтвердили  исследованиями АнтА в опытах  in vivo.

Определение антагонистической активности пробиотиков  в опытах in vivo. Величину АнтА определяли  по выживаемости цыплят при контрольном заражении патогенным изолятом E. coli, выделенным в ЭПХ из организма больной птицы. Работа по выделению изолята и определению его патогенности для мышей (500 млн.кл./гол.) проведена совместно с ВГНКИ ветпрепаратов. Для цыплят 10-суточного возраста при внутримышечном введении 10-кратных разведений культуры E.coli определили летальную дозу (ЛД50) и ее доверительный интервал (Р 0,05) для контрольной группы (К) и групп, получавших L. acidophilus  и B.subtilis (Л и Б соответственно): lg ЛД50 (К) = - 2,9 ± 0,2;  lg ЛД50 (Л) = - 2,4 ± 0,2 и lg ЛД50 (Б) = - 1,92 ± 0,2. Показано, что препараты обладали антагонистической активностью по отношению к патогенной культуре E. сoli, т.к. защищали 30 и 40% птицы (соответственно) при контрольном заражении.

Определение резистентности препаратов АВИЛАКТ-1К и АВИСУБТИЛ к антибиотикам. Для стандартизации условий определения резистентность препаратов сравнивали со значениями, полученными при характеристике штамма-продуцента и контроле посевных материалов. Если получаемые значения были ниже заданных показателей, проводили повторное исследование параллельно с образцом ЛРЭМ.

Определение антиоксидантной активности (АА) пребиотика АВИСТИМ. С помощью  прибора «Яуза-ААА-01» на базе ОАО «НПО Химавтоматика» нами исследована АА трех образцов КЖ, полученных при изготовлении посевного материала, в сравнении с маркером дигидрокверцетином. Препарат АВИСТИМ обладал выраженной антиоксидантной активностью, превышающей АА маркера в 5,5-5,9 раза.

Для стандартизации состава пребиотика АВИСТИМ общепринятыми методами определили содержание в КЖ сухих веществ (ГОСТ Р 52838) – не менее2,5% и величину рН (фармстатья  ОФС 42-0048-07, Х11 изд. Гос. Фармакопеи РФ) - 6,6-7,0.

Состав кормовой добавки ЦЕРЕВЕТ стандартизовали по минимально допустимому содержанию белка (38% АСВ) и максимально допустимому содержанию липидов (10%) и углеводов (28%). Сравнение химического состава ЦЕРЕВЕТа и аналогичной ему лечебно-профилактической добавки «Естур» (США) показало, что ЦЕРЕВЕТ содержал больше белка (на 36,3%), макро- и микроэлементов (фосфора - на 13,8%, кальция - на 39,4%, железа - в 3 раза, марганца - в 2,8 раза), аминокислот (лизина, аргинина, фенилаланина, треонина и триптофана – в 1,5-2 раза).

3.3.2.3. Определение стабильности препаратов. Стабильность препаратов оценивали с целью определения их сроков годности и условий хранения.

Исследование стабильности препарата АВИЛАКТ-1К. На образцах ЛРЭМ определяли сохранность живых бактерий  (в жидкой и сухой формах) при повышенных температурах (термостабильность) и при длительном хранении. Исследование термостабильности осуществляли согласно разработанным с нашим участием «Методическим рекомендациям по исследованию стабильности иммунобиопрепаратов на этапе разработки и в условиях действующего производства».

Исследование термостабильности жидкой формы препарата. При прогревании жидких образцов трех серий препарата  в течение 15 минут при температурах 40, 45, 50, 55, 600С показано, что при 500С в течение 15 минут количество живых клеток снижалось, в среднем, на 52%, поэтому при 500С исследовали кинетику инактивации бактерий в течение 5, 10, 15, 20, 25 и 30 минут. Статистическая обработка показала, что снижение количества жизнеспособных бактерий в суспензии зависело от продолжительности теплового воздействия и описывалось (коэффициент  корреляции  r*= -0,92) кинетическим уравнением первого порядка lg y = lg y0 – Kt,  где: y0  - исходная активность препарата; y – величина активности через время t; K – константа скорости инактивации (сек-1). Рассчитана величина КТ = -1,6х10-3 сек-1. В качестве экспресс-теста оценки стабильности препарата АВИЛАКТ-1К в жидкой форме рекомендован тест «ускоренного старения»  - 500С в течение 15 минут.

Исследование  термостабильности сухого  препарата проводили по аналогичной схеме.  При 600С в течение 30 минут количество живых клеток снижалось, в среднем, на 44,4%. При температуре 600С (10,  20, 25, 30, 40 и 50  минут) исследовали кинетику инактивации бактерий. Показано,  что, как и для жидкого препарата, снижение количества жизнеспособных бактерий в суспензии имело линейный характер (коэффициент  корреляции  r*= -0,93), КТ = -3,8х10-4 сек-1. Условия теста «ускоренного старения» для препарата в сухой форме  - 600С в течение 30 минут.

Стабильность препарата при хранении определяли по снижению количества живых лактобактерий в течение 12 месяцев при 8-100С и при комнатной температуре 18-200С. Установлено, что с учетом определенной нами ошибки титрования (±0,5 lg КОЕ/см3) достоверное снижение количества жизнеспособных лактобактерий в препарате начиналось: для жидкой формы через 4 месяца хранения при 8-10С и после 1месяца - при 18-20С; для сухой формы через 8 месяцев хранения при 8-10С и после 4 месяцев - при 18-20С. Исходя из этого, определен срок годности жидкого препарата 3месяца, сухого пре­парата - 9 месяцев при  температуре 8-10С.

Исследование стабильности препарата АВИСУБТИЛ. Стабильность препарата определяли по снижению количества живых бактерий при 8-100С и при комнатной температуре 18-200С в течение 12мес. Показано, что жизнеспособность бактерий в препарате достоверно сохранялась: для жидкой формы в течение 10 месяцев хранения при 8-10С и 8 месяцев - при 18-20С; для сухой формы в течение 12 месяцев хранения при 8-10С и 18-20С. Установлен срок годности жидкого препарата 9 месяцев, сухого пре­парата - 12 месяцев при  8-10С.

Исследование стабильности препарата АВИСТИМ. Стабильность препарата оценивали по отсутствию осадка в течение 12 месяцев хранения при температуре 8-100С.  Осадок появлялся  через 4-5 месяцев, рН препарата за этот период не менялся. Определили срок хранения препарата – 3 месяца при 8-100С. 

Срок и условия хранения препарата ЦЕРЕВЕТ установлены согласно аналогичным требованиям, заложенным в нормативную документацию на родственные препараты кормовых дрожжей (ГОСТ 20083-74): 6 месяца при 8-100С.

3.3.3. Изготовление и контроль опытно-промышленных серий препаратов.

По разработанной технологии в условиях опытного производства  ВНИТИБП изготовлено: 17 серий пробиотика  АВИЛАКТ-1К (7 серий в жидкой форме  и 10 серий – в сухой); 13 серий  пробиотика  АВИСУБТИЛ  (7 серий в жидкой форме  и 6 серий – в сухой); 7 серий пребиотика  АВИСТИМ; 8 серий белковой кормовой добавки ЦЕРЕВЕТ. Все серии прошли ДИ в соответствии с разработанной схемой. Полученные результаты контроля по всем показателям соответствовали установленным нормам, что свидетельствовало о воспроизводимости разработанной технологии. Разработаны  и утверждены в установленном порядке технологические регламенты производства и стандарты организации (ТУ).

    1. Определение эффективности синбиотиков АВИЛАКТ-ФОРТЕ и ЛАКТОСУБТИЛ-ФОРТЕ при выращивании цыплят-бройлеров.

АВИЛАКТ-ФОРТЕ - синбиотический комплекс, включающий пробиотик АВИЛАКТ-1K и пребиотик АВИСТИМ; ЛАКТОСУБТИЛ-ФОРТЕ - синбиотический комплекс, включающий пробиотики АВИЛАКТ-1K и АВИСУБТИЛ, а также белковую кормовую (микробиологическую) добавку ЦЕРЕВЕТ.

Испытания (21 опыт и 2 производственных испытания) проводили на цыплятах – бройлерах (общее поголовье – 10 000 голов) кроссов «Конкурент-2» и «Смена» (период выращивания до 49-дневного возраста), «Кобб – 500» и «Кобб – авиан-48» (период выращивания до 35-дневного возраста).

3.4.1. Эффективность синбиотика  АВИЛАКТ-ФОРТЕ для цыплят-бройлеров кросса «Конкурент-2».

Определение дозы, количества  и длительности курсов применения  пробиотика  АВИЛАКТ-1K  в жидкой  и сухой форме. При определении дозы пробиотика  (1,0;  0,5;  0,1; 0,05 см3/гол. в сутки в течение всего периода выращивания) достоверно (Р0,05, n=40)  установлено (рис. 4, опыт 1), что доза препарата 0,1 см3 /гол. (107 КОЕ/гол.)/сут. была наиболее эффективной по динамике прироста живой массы,  затратам корма и европейскому индексу эффективности (ЕИП).

Рис. 4. Эффективность препарата АВИЛАКТ-1К.

С использованием этой дозы определяли количество курсов применения: один (весь период выращивания) и два (1-7 и 21-28 дни). Получили одинаковое увеличение живой массы на 9,9% (Р0,05) и снижение затрат корма на 3,3% по сравнению с контрольной группой. Таким образом, определена наиболее эффективная схема – доза 1х107 КОЕ/гол./сут., применение двумя курсами – 1-7 и 21-28 дни (рис. 4, опыт 2). Установили (Рис. 4, опыт 3), что данная схема эффективна и при  применении сухой формы препарата АВИЛАКТ-1К: живая масса и ЕИП увеличились на 10,4%  (Р0,05) и 27,7% соответственно, затраты корма  уменьшились на 13,8%.

Исследование микрофлоры кишечника  цыплят сразу после вывода не выявило наличия бактерий и грибов, т.е. цыпленок до первого получения воды и корма имел стерильный кишечник, поэтому необходимо применение пробиотика с первого дня жизни. К концу содержания количество лактобактерий в кишечнике птицы, получавшей пробиотик, в 100 раз превышало этот показатель в контроле.

Исследование эффективности пробиотика АВИЛАКТ-1К в сравнении с  «Лактобактерином» и «Бифидум СЖК». При применении одинаковым курсом (4х107 КОЕ/гол./сут. 1-7 и 21-28  дни) АВИЛАКТ-1К в большей степени способствовал увеличению живой массы (на 4,7 и 3,1% по сравнению с «Лактобактерином» и «Бифидум СЖК» соответственно) и сохранности птицы (на 2,5%),  снижению расхода корма (на 4,1 и 2,9%); содержание лактобактерий в кишечнике у цыплят, получавших АВИЛАКТ-1К, было больше в 100 раз по сравнению с  «Лактобактерином». 

Исследование эффективности применения синбиотика АВИЛАКТ-ФОРТЕ. В  5 опытах определяли: дозу пребиотика АВИСТИМ; пребиотические свойства  препарата АВИСТИМ  и биомассы (БМ) гриба F. sambucinum; эффективность синбиотика АВИЛАКТ-ФОРТЕ при клеточном и напольном способах содержания птицы, а также при совместном применении с другими антибактериальными средствами (органическими кислотами и кормовым антибиотиком). 

При сравнении двух доз АВИСТИМа (50 и 10% от суточного количества воды) установлено, что доза 10%  обеспечила  наибольшие отличия от контрольной группы (увеличение живой массы на 15,4%, ЕИП – на 32,3%; снижение затрат корма на 10,5%). Определена схема применения синбиотика АВИЛАКТ-ФОРТЕ - АВИЛАКТ-1К в дозе 1х107КОЕ/гол./сут.; АВИСТИМ 10%; двумя курсами (1-7  и 21-28 дни выращивания). Исследование мясных качеств птицы показало: применение синбиотика способствовало увеличению выхода съедобных частей в тушке на 1,0%, отношения съедобных частей к несъедобным  и отношения массы мышц к массе костей – на 1,1%; уменьшению содержания жира в мясе груди и ног на 2,2%  (по сравнению с контрольной группой).

Препарат АВИСТИМ  по пребиотическим свойствам не уступал более богатой по составу  БМ гриба: их применение (в комплексе с пробиотиком) способствовало увеличению сохранности цыплят на 5%, прироста живой массы на 5,5 и 4,5% и уменьшению затрат корма на 7,8 и 6% соответственно по сравнению с контролем.

Оценивали эффективность синбиотика АВИЛАКТ-ФОРТЕ при содержании птицы в клеточных батареях (200 голов) и на подстилке из опилок (650 голов).  Установлено, что синбиотик  эффективен как при клеточном, так и при напольном способах содержания: по сравнению с контролем живая масса увеличилась на 5,8 и 4,0%, сохранность на 2,5 и 7,5%, затраты корма сократились на 0,9 и 1,1%, содержание лактобактерий – в 100 и 10 раз соответственно.

В опытах по совместному применению синбиотика с органическими кислотами (молочной и препаратом Сал-карб) и кормовым антибиотиком флавомицином показано (табл.3), что добавление к синбиотику органических кислот достоверно не влияло на его эффективность;  синбиотик снижал отрицательное влияние антибиотика,  был более эффективен и экономически выгоден (за счет более краткого курса применения), может служить альтернативой кормовым антибиотикам.

Таблица 3

Результаты определения эффективности синбиотика при совместном применении с другими антибактериальными средствами

Показатель,

ед. измер.

№ группы* (n=40)

1

2

3

4

5

6(к)

1

Живая масса

1-42 суток, г  (M±m)

1689,16

±30,03

1600,98

±28,56

1599,32

±42,11

1695,60

±29,89

1638,18

±25,81

1570,75

±37,01

2

Сохранность

1-42 дня, %

97,5

90

95

97,5

100

87,5

3

Затраты корма на 1 кг прироста, г

2,36

2,56

2,42

 

2,45

2,38

2,58

4

Содержание

лактобактерий,

КОЕ/см3

2,3х106

9,6х103

2,3х103

9,1х105

5,3х104

1,0х103

*) 1 - АВИЛАКТ-ФОРТЕ; 2 – органические кислоты (ОК); 3 – ОК+флавомицин (Ф); 4 - АВИЛАКТ-ФОРТЕ+ОК; 5 - АВИЛАКТ-ФОРТЕ+ОК+Ф; 6 - контроль (ОР).

3.4.2. Эффективность синбиотика  АВИЛАКТ-ФОРТЕ  для цыплят-бройлеров кросса «Кобб-500».

Разработка схемы применения синбиотика  АВИЛАКТ-ФОРТЕ для цыплят-бройлеров кросса «Кобб-500». Проведено 2 опыта (по 40 гол. в  группе) и производственные испытания (по 105 гол.). В первом опыте определили эффективную дозу пробиотика АВИЛАКТ-1К (из трех - 1х107, 1х108, 1х109 КОЕ/1 кг корма) при дозе пребиотика  - 10% от суточной нормы воды. Препараты применяли 1-10 и 21-28 дни. При дозе 1х109 КОЕ/кг корма живая масса бройлеров была выше на 3,3% (Р0,05), ЕИП выше на 3,4%, затраты корма ниже на 1,4% по сравнению с контролем.

Во втором опыте определяли количество курсов  применения синбиотика АВИЛАКТ-ФОРТЕ  (доза пробиотика - 1х109 КОЕ/кг корма): однократно (1-7 или 1-14 дни) и двукратно (1-7 и 21-28 дни). При  двукратной схеме применения по сравнению с контролем сохранность повысилась на 2,5%, живая масса - на 4,3%, ЕИП – на 9,3%,  снижение затрат корма - на 1,3%.  В балансовом опыте,  проведенном в 28-дневном возрасте, установлена тенденция к повышению в опытных группах переваримости сухого вещества, сырого протеина и сырого жира на 1,0-1,2%, 1,0-2,3% и 1,0-1,3%  соответственно по сравнению с этими показателями в контроле.

В производственных  испытаниях определяли эффективность двух схем применения АВИЛАКТ ФОРТЕ (пробиотик АВИЛАКТ-1К - 1х109 КОЕ/кг корма, пребиотик АВИСТИМ - 10% от суточной нормы воды): однократно в 1-7 дни (1 вариант) и двукратно в 1-7 и 21-28 дни (2 вариант). В новых вариантах (табл.4) по сравнению с контролем сохранность цыплят выше на 3,8%,  затраты корма ниже на 3,8 и 1,7% соответственно, ЕИП повышался в ряду: контроль, вариант №1, вариант №2.

Таблица 4.

Результаты выращивания цыплят-бройлеров

Показатель

Вариант

1

2

Контроль

Сохранность, %

98,1

98,1

94,3

Живая масса 1 гол., г (1- 37 дни)

2054,1 ± 33,6

2060,4 ± 37,9

2049,3±35,1

Затраты корма на 1 кг прироста, кг

1,782

1,744

1,813

ЕИП

306

313

288

Определение эффективности комплекса АВИЛАКТ-ФОРТЕ при напольном способе содержания птицы и при совместном применении с флавомицином. Синбиотик применяли двумя курсами. Как и для кросса «Конкурент-2», показана его эффективность при напольном содержании (опытная группа - 450 голов, контроль - бройлеры в птичнике): увеличение живой массы на 12,4%, сохранности на 2,2%; снижение затрат корма на 4,2%). Результаты по совместному применению синбиотика и флавомицина аналогичны  результатам опыта для кросса «Конкурент-2».

3.4.3. Влияние синбиотика АВИЛАКТ-ФОРТЕ и пробиотика АВИЛАКТ-1К на эффективность вакцинации птицы против ньюкаслской болезни  (НБ).

В исследовании взаимодействия вакцинного вируса НБ штамм «Ла-Сота» и лактобактерий  пробиотика на модели развивающихся куриных эмбрионов кур (РЭК) показано, что при совместном культивировании в РЭК отсутствовало отрицательное влияние лактобактерий на репродукцию вируса НБ и не отмечено снижения количества жизнеспособных лактобактерий в присутствии вируса.

Влияние пробиотика  АВИЛАКТ-1К на эффективность вакцинации цыплят против НБ. Птицу (кросс «Смена», 2000 голов) в суточном возрасте вакцинировали аэрозольно в камере специальной конструкции с последующим применением АВИЛАКТ-1К (107КОЕ/гол./сутки, 1-7 и 18-25 дни). Установлено, что применение пробиотика не оказывало отрицательного влияния на эффективность вакцинации клинически здоровой птицы: средний (n=20) титр антигемагглютининов (анти-ГА)  у вакцинированных цыплят на 21 день наблюдения незначительно повышался (4,0 log2)  по сравнению с контрольной (без применения пробиотика) группой (2,9 log2).

Исследовали влияние пробиотика на динамику роста живой массы птицы (2000 голов) после плановой вакцинации (в возрасте 14 дней). Показано (рис.5), что применение пробиотика (107КОЕ/гол./сутки, 1-7 и 18-25 дни) улучшало (Р0,05) динамику роста живой массы птицы в течение периода наблюдения (2. 3, 4 и 8 недель).

Рис. 5. Влияние пробиотика на динамику роста живой  массы вакцинированной птицы  (1– вакцинация с пробиотиком,  2 - вакцинация без пробиотика, 3 –контроль).

Влияние синбиотика АВИЛАКТ-ФОРТЕ на эффективность вакцинации птицы против НБ. В настоящее время в РФ колибактериоз  составляет 52%  от общего числа инфекционных заболеваний птицы, поэтому исследования проводили на клинически здоровой и переболевшей колибактериозом птице. В опытах моделировали экспериментальное заражение птицы патогенным  изолятом  E.сoli, выделенным в данном хозяйстве, плановую вакцинацию птицы против НБ (120 голов в возрасте 18 суток) проводили через 12 дней после ее заражения. Результаты показали (рис. 6), что применение АВИЛАКТ-ФОРТЕ не оказывал отрицательного влияния на формирование уровня специфических антител к вирусу НБ у здоровой птицы.  Применение синбиотика АВИЛАКТ-ФОРТЕ при вакцинации больной птицы  повышало уровень специфических (к вирусу НБ) антител с 2,2 log2 в контрольной группе (заражение E.сoli + вакцинация) до 4,4 log2 в опытной (заражение E.сoli + вакцинация + синбиотик), т.е. позволило повысить эффективность вакцинации птицы против НБ в угрожающих по колибактериозу ситуациях.

Рис. 6. Влияние пробиотика на эффективность вакцинации птицы против НБ в угрожающей по колибактериозу ситуации.

3.4.4.  Эффективность применения синбиотика ЛАКТОСУБТИЛ-ФОРТЕ.

Определение эффективности кормовой добавки ЦЕРЕВЕТ. На бройлерах (по 70 голов в группе) кросса «Кобб-500» исследовали влияние кормовых дрожжей (ГОСТ 20083-74) - контроль и ЦЕРЕВЕТА (дозы препаратов - 3% от рациона). Показано, что применение ЦЕРЕВЕТА способствовало  увеличению (Р0,05) живой массы цыплят на 5% (по сравнению с контролем), среднесуточных привесов на 5,1%, снижению затрат корма на 6,9%, обеспечивало полную (100%) сохранность птицы.

Определение эффективности синбиотика ЛАКТОСУБТИЛ-ФОРТЕ. На цыплятах кросса «Кобб-авиан-48»  провели 3 опыта (по 40 голов в каждой группе) и производственные испытания (по 100 голов).

В первом опыте определяли эффективность препаратов АВИЛАКТ-1К +ЦЕРЕВЕТ при их совместном применении различными курсами: однократно (1-7 дни), двукратно (1-7 и 21-28 дни, 1-7 и 28-33 дни). АВИЛАКТ-1К напыляли на гранулы комбикорма из расчета 108КОЕ/гол/сут., ЦЕРЕВЕТ смешивали с кормом - 1,5% от суточной дозы корма. Лучшие показатели получены при применении в 1-7 и 18-24 дни: повышение живой массы и среднесуточного прироста цыплят на  2,5 %, снижение затрат корма на 3%  по сравнению с контролем, сохранность - 100 %.

Во втором опыте те же схемы применения испытывали при совместном использовании пробиотика АВИСУБТИЛ (напыление на гранулы комбикорма из расчета 109КОЕ/гол/сут.) и кормовой добавки ЦЕРЕВЕТ (1,5%). Лучшие результаты (Р0,05) получены при двукратных схемах приема (1-7 и 18-24 дни, 1-7 и 28-33 дни): по сравнению с контролем живая масса цыплят  была выше на  4,8%, конверсия корма - ниже по сравнению на 1,5%. Сохранность поголовья составила 100 %.

В третьем опыте те же схемы приема испытывали при применении синбиотика (АВИЛАКТ-1К+АВИСУБТИЛ+ЦЕРЕВЕТ). Более эффективным было двукратное применение (1-7 и 21-28 дни): прирост живой массы и снижение затрат корма на 3,7%  при 100%-ной сохранности птицы. ЕИП - 286 единиц (в контроле – 259).

В производственных испытаниях сравнивали лучшие варианты первых двух опытов и синбиотика, в котором дозировку пробиотиков уменьшили в два раза. В 35-дневном возрасте лучший результат получен при применении синбиотика: живая масса превышала контрольные показатели на 12,4% (1,46 и 4,24% для лучших  групп 1 и 2 опытов соответственно), затраты корма снизились на 6,6%  (0,51, и 6,1%), сохранность птицы  составила 100 % (по 97,5 %). Установлено, что при снижении дозировки препаратов в два раза эффективность комплекса  не уменьшалась (ЕИП  составлял 286 и 328 соответственно).

3.4.5. Разработка способов применения синбиотических комплексов.

Разработаны следующие способы применения синбиотиков:

- АВИЛАКТ-ФОРТЕ: двумя курсами (1-7 и  21-28 дни) из расчета АВИЛАКТ-1К в дозе 1х109 КОЕ/1 кг корма, АВИСТИМ в дозе 10%  от суточной нормы воды;

- ЛАКТОСУБТИЛ-ФОРТЕ: двумя курсами  (1-7 дни и 21-28 дни содержания) из расчета АВИЛАКТ-1К и АВИСУБТИЛ напылением на гранулы комбикорма из расчета 0,5х107  и 0,5х108КОЕ/гол/сут. соответственно,  ЦЕРЕВЕТ (1,5 %  от суточной дозы корма).

Разработаны инструкции по применению синбиотиков.

3.4.6. Расчет экономической эффективности применения синбиотиков.

Экономический эффект от применения синбиотических комплексов АВИЛАКТ ФОРТЕ и ЛАКТОСУБТИЛ ФОРТЕ получен за счет: повышения сохранности поголовья на 3,8% и 2,5%,  прироста живой массы на 6,9% и 10,5% , снижения затрат корма (в пересчете на 1 кг прироста живой массы) на 3,8% и 6,1% и составил в расчете на 1000 голов 1370,3 руб. и 7862,5 руб. (соответственно).

Результаты фармакоэкономических исследований  подтвердили оправданность использования разработанных синбиотических комплексов в промышленном бройлерном птицеводстве. Разработано коммерческое предложение по применению синбиотиков  для повышения эффективности выращивания бройлеров.

4. ВЫВОДЫ

1. Научно обоснована концепция создания кормовых добавок на основе синбиотических комплексов «пробиотик+пребиотик» и «пробиотики+белковая кормовая добавка». Разработаны новые препараты (пробиотики АВИЛАКТ-1К, АВИСУБТИЛ, пребиотик АВИСТИМ, белковая кормовая добавка ЦЕРЕВЕТ) и синбиотические комплексы на их основе АВИЛАКТ-ФОРТЕ и ЛАКТОСУБТИЛ-ФОРТЕ. 

Определены и охарактеризованы штаммы-продуценты микроорганизмов для получения препаратов, входящих в состав комплексов; разработана технология их изготовления и схема контроля качества (безопасность, активность, стабильность); определен состав комплексов, способы их применения  и  эффективность при выращивании бройлеров.

2. Штаммы Lactobacillus acidophilus, 1К (ВКПМ № В-2991) и  Bacillus  subtilis, М-8 (ВКПМ № В-3121), используемые для изготовления препаратов АВИЛАКТ-1К и АВИСУБТИЛ, обладали выраженным антагонистичеким действием по отношению к патогенным микроорганизмам. В опытах in vitro зоны задержки роста патогенных штаммов сальмонелл (S. gallinarum,  tuphimurium, dublin) и колибактерий (E. coli К-88,  К-99, А-20)  составили для лактобактерий - не менее 7 мм, для бацилл - не менее 15 мм.  В опытах in vivo они защищали соответственно 30 и 40% птицы при контрольном заражении патогенным изолятом E. сoli, выделенным  в хозяйстве.

3. Лактобактерии  умеренно чувствительны к офлоксацину, ципрофлоксацину, энрофлону, флавомицину, линкомицину; бациллы устойчивы к кламоксилу, левомицетину, тетрациклину, ампициллину, рифампицину, гентамицину,  энрофлону,  флавомицину,  линкомицину  и умеренно чувствительны к цефазолину, офлоксацину,  ципрофлоксацину.

4. Выделен из растительного сырья, изучен  и депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов новый штамм мицелиального гриба Fusarium sambucinum MKF-2001-3 (ВКПМ № F-867). Мицелий и культуральная жидкость гриба не патогенны для животных; содержат все незаменимые аминокислоты, углеводы (в том числе глюканы и галактоманнаны, хитиновую клетчатку), липиды (фосфолипиды, стерины, жирные кислоты), макро- и микроэлементы (железо, медь и цинк, магний, цинк, медь, марганец),  органические кислоты, полный комплекс витаминов группы В. На основе культуральной жидкости создан пребиотик АВИСТИМ, который обладает ростостимулирующими свойствами, содержит (по сравнению с мицелием гриба) больше органических кислот  (10,9 г/л): лимонной (0,5 г/л), яблочной  (0,4 г/л),  фумаровой  (0,3 г/л), янтарной  (0,5 г/л), щавелево-уксусной (0,3 г/л), уксусной (0,5 г/л).

5. Величина антиоксидантной  активности  препарата АВИСТИМ, определенная с помощью инструментального метода, превышает активность маркера  (дигидрокверцитин) в 5,5-5,9 раза и может служить характеристикой его биологического действия.

6.  Биомасса инактивированных клеток дрожжей Saccharomyces cerevisiae diastaticus (ВКПМ № -1218) – основа белковой кормовой добавки ЦЕРЕВЕТ - содержит в своем составе белки,  углеводы, минеральные элементы, аминокислоты, витамины, олигосахариды  (глюканы  и маннаны), ферменты (амилазы, протеазы, целлюлазы и гемицеллюлазы), обладает питательной ценностью и биологической активностью. По питательной ценности биомасса аналогична соевому и подсолнечному шротам, в отличие от других кормовых добавок  содержит  витамины В12, А, Д, Е, С и К.

7. Использование универсальных  питательных  сред на основе ферментолизата отходов зерносырья и молочной сыворотки при культивировании микроорганизмов обеспечивает высокое накопление продукта: лактобактерий  -  не менее 5х109 КОЕ/см3, бацилл – не менее 1х1010 КОЕ/см3, биомассы гриба  и дрожжей 10-12 г/л и 20-25 г/л соответственно. Добавление в питательную среду культуральной жидкости гриба (0,01-1% от объема среды) при культивировании дрожжей сокращает время накопления биомассы с 19 до 10 часов, способствует ее более интенсивному накоплению (на 65%), более быстрому усвоению сахаров (на 32,1%) и более активному потреблению минеральных азота  (на 21,5%)  и фосфора  (на 45,4%).

8.  Получение сухой формы пробиотиков АВИЛАКТ-1К и АВИСУБТИЛ методом сублимационного высушивания обеспечивает концентрацию бактерий в препаратах не менее  3х109 КОЕ/г и 5х1010 КОЕ/г (соответственно) и увеличивает срок их хранения (по сравнению с жидкой формой) с 3 до 9 и с 10 до 12 месяцев  (соответственно) при температуре 8-100С.

9. Обеспечение качества при разработке и изготовлении препаратов, входящих в состав синбиотиков, осуществлялось на основе методологии проектного подхода (ГОСТ Р ИСО 9001-2008), разработки и применения системы изготовления и контроля посевного материала, реализации схемы доклинических исследований безвредности, эффективности и стабильности препаратов (ГОСТ Р 52249-2009).

10. Препараты безвредны для суточных цыплят  при пероральном применении в дозах, в 5-10 раз превышающих рекомендуемые.  Для определения безопасности биотестированием  на моделях доорганизменного уровня разработан тест эмбриотоксичности (на развивающихся эмбрионах кур) и модифицирован ХЕТ-КАМ тест (определение раздражающего действия химических веществ на хориоаллантоисной оболочке куриного эмбриона).

11. Стандартизованы условия определения количества жизнеспособных лактобактерий (титра). Условия определения титра считали стандартными, а полученное значение для контролируемой серии – достоверным (при указанной величине ошибки определения), если полученное в ходе параллельного определения значение количества жизнеспособных лактобактерий в образце лабораторного эталонного рабочего материала укладывалось в интервал (6,7±0,5)х108КОЕ/см3.

12. При исследовании термостабильности препарата АВИЛАКТ-1К определены величины констант скоростей инактивации лактобактерий в жидком и сухом препарате КТ = -1,6х10-3 сек-1 и  КТ = -3,8х10-4 сек-1 соответственно. В качестве экспресс-теста оценки стабильности рекомендованы тесты «ускоренного старения»  - 500С в течение 15 минут (для  жидкой формы) и 600С - 30 минут (для сухой).

13. Определен состав синбиотиков АВИЛАКТ-ФОРТЕ (АВИЛАКТ-1К+АВИСТИМ) и ЛАКТОСУБТИЛ-ФОРТЕ  (АВИЛАКТ-1К+АВИСУБТИЛ+ЦЕРЕВЕТ) и эффективность их применения при выращивании цыплят-бройлеров кроссов различной продуктивности. Применение синбиотиков способствовало увеличению показателя европейского индекса продуктивности на 25 (АВИЛАКТ-ФОРТЕ) и 57 (ЛАКТОСУБТИЛ-ФОРТЕ) единиц, повышению зоотехнических показателей (увеличению привесов на 6,9; 10,2 %, сохранности птицы на 2,5; 3,8 %, уменьшению затрат корма на 3,8; 6,1 % соответственно) и улучшению качества мяса (увеличению выхода съедобных частей в тушке на 1,0%, уменьшению содержания жира в мясе на 2,2%).

Уменьшение дозировки препаратов в два раза (по сравнению с их самостоятельным применением) в составе синбиотика ЛАКТОСУБТИЛ-ФОРТЕ  не снижало его эффективность  (показатель европейского индекса продуктивности составлял 286 и 328 соответственно).

14. Исследовано влияние синбиотика АВИЛАКТ-ФОРТЕ на эффективность вакцинации птицы против ньюкаслской болезни. Установлено, что применение синбиотика повышало на 2,1 log2 уровень антигемагглютининов в сыворотке крови птицы, переболевшей колибактериозом после экспериментального заражения патогенным изолятом  E.сoli. Применение пробиотика АВИЛАКТ-1К при проведении плановой вакцинации способствовало увеличению (Р0,05) живой массы вакцинированной птицы на 21,1%, 31,3%, 16,7% в возрасте 3, 4 и 8  недель соответственно.

15. Совместное применение синбиотиков с флавомицином компенсирует на 90-95% негативное действие антибиотика (ухудшение зоотехнических показателей, снижение содержания лактобактерий в желудочно-кишечном тракте птицы). Применение синбиотиков более эффективно и безопасно, чем использование кормовых антибиотиков. Добавление органических кислот (молочной и препарата Сал-карб) к синбиотикам не влияет на их эффективность. 

16. Разработаны способы применения синбиотиков при выращивании цыплят-бройлеров: АВИЛАКТ-ФОРТЕ - двумя курсами (в 1-7 и  21-28 дни содержания) из расчета пробиотик АВИЛАКТ-1К в дозе 1х109 КОЕ/1 кг корма, пребиотик  АВИСТИМ в дозе 10%  от суточной нормы воды; ЛАКТОСУБТИЛ-ФОРТЕ - двумя курсами (1-7 дни и 21-28 дни) из расчета пробиотики  АВИЛАКТ-1К и АВИСУБТИЛ напылением на гранулы комбикорма в дозах 0,5х107  и 0,5х108КОЕ/гол/сут. соответственно,  ЦЕРЕВЕТ - 1,5 %  от суточной дозы корма.

Синбиотики  АВИЛАКТ-ФОРТЕ и ЛАКТОСУБТИЛ-ФОРТЕ  эффективны как при клеточном, так и при напольном способах содержания птицы: по сравнению с контролем живая масса увеличивалась на 4,0 и 5,8 % соответственно, сохранность - на 2,5%, затраты корма сократились на 0,9 и 1,1%.

5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Для практического использования предложены следующие документы.

Нормативная  документация: ТУ-10.07-023-93 («Авилакт-1К» - пробиотик для птиц); Технологические регламенты производства препаратов  АВИЛАКТ-1К, АВИСУБТИЛ, АВИСТИМ и ЦЕРЕВЕТ, утвержденные директором ВНИТИБП 07.09.2010; Стандарты организации (ТУ) на препараты АВИЛАКТ-1К, АВИСУБТИЛ, АВИСТИМ и ЦЕРЕВЕТ (№№ 9337-003-11734126-10;  9337-004-11734126-10;  9291-005-11734126-10; 9291-006-11734126-10 соответственно), утвержденные директором ВНИТИБП 03.10.2010, согласованные директором ФГУ ВГНКИ 27.12.2010; Инструкции по применению препаратов АВИЛАКТ-1К, АВИСУБТИЛ, АВИСТИМ, ЦЕРЕВЕТ и синбиотиков АВИЛАКТ-ФОРТЕ и ЛАКТОСУБТИЛ-ФОРТЕ, утвержденные директором ВНИТИБП 07.09.2010 и находящиеся на согласовании в Россельхознадзоре.

ОСТ 100083-95 Продукция агробиологической промышленности. Технологические регламенты производства. Содержание, порядок разработки, построения, согласования и утверждения. – 1994.-М.- 100 с.

Методические рекомендации: «Технология камерной аэрозольной вакцинации цыплят против ньюкаслской болезни» /РАСХН – ВНИиТИБП - ВНИТИП – Вирусологический центр НИИ микробиологии МОРФ.- С. Посад, -ВНИВИП, 1996 г. -  53 с.; «Использование пробиотиков, пребиотиков и симбиотиков в птицеводстве» /ГНУ ВНИТИП – ГНУ ВНИТИБП – ООО  «Биотроф» - ООО «Пробиотик Центр». - Сергиев Посад, 2008, 43с.; «Разработка и реализации проекта создания нового лекарственного средства. Обеспечение качества лекарственных средств для животных в процессе разработки», утв. РАСХН 28.03.08.- М..-2009.-62с.;  «Исследование стабильности иммунобиопрепаратов на этапе разработки и в условиях действующего производства»,  утв. РАСХН 28.03.08. - М.- 2009. - 32 с.

Рекомендации по проведению доклинических испытаний новых лекарственных средств для животных и биологически активных добавок к кормам (утв.  РАСХН, ноябрь 2005г.).

Руководство по разработке системы технологической документации на предприятии биологической промышленности или опытном производстве соответствующего профиля (утв. РАСХН, ноябрь 2004г.)// Новые методы исследований по проблемам ветеринарной медицины,  ч. 2. Методы  исследований в области паразитологии, эпизоотического мониторинга, биотехнологии. РАСХН отделение  вет. медицины, Москва, 2006,. - с. 312-348.

Методики: «Определение потенциальной токсичности лечебно-профилактических препаратов для животных и их ингредиентов на куриных эмбрионах (тест эмбриотоксичности)»,  утв.  РАСХН, ноябрь 2006г.; «Определение раздражающего действия лечебно-профилактических препаратов для животных и их ингредиентов с помощью теста на хориоаллантоисной оболочке куриного эмбриона (ХЕТ-КАМ тест)», утв.  РАСХН, ноябрь 2006г.

6. СПИСОК ОСНОВНЫХ ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
  6.1. Статьи в рецензируемых журналах, рекомендуемых ВАК

  1. Самуйленко А.Я. Эффективная вакцинация цыплят-бройлеров против ньюкаслской болезни / Самуйленко А.Я.,  Скотникова Т.А.,  Неминущая Л.А.:  труды Кубанского государственного аграрного  университетата (серия: Ветеринарные науки). -  2009. -  №1 (ч.1). - С. 89-90.
  2. Самуйленко А.Я. Стабильные иммунобиопрепараты – залог успешной вакцинопрофилактики птиц / Самуйленко А.Я.,  Неминущая Л.А.,  Скотникова Т.А: труды Кубанского государственного аграрного  университетата (серия: Ветеринарные науки). -  2009. -  №1 (ч.1). - С. 91-92.
  3. Воробьева Г.И. Белковые компоненты в стартовых комбикормах для рыб / Воробьева Г.И., Максимова Г.Н., Неминущая Л.А., Головин П.П., Шевченко Д., Приз В. // Комбикорма.-2009.-№3.-С.45-46.
  4. Неминущая Л.А., Токарик Э.Ф.,  Воробьева Г.И., Самуйленко А.Я.,  Салеева И.П., Игнатова Г.В.  Эффективность нового синбиотического комплекса  для птиц АВИЛАКТ ФОРТЕ // Птицеводство. -  2010. -  №1. -  С.45-46.
  5.   Неминущая Л.А. Исследование эффективности многофункциональных синбиотических комплексов в зависимости от их состава и схемы применения в промышленном птицеводстве /  Неминущая Л.А., Еремец В.И., Самуйленко А.Я., Салеева И.П. // Птицеводство. -  2010. -  №4. -  С.14-15. 
  6.   Неминущая Л.А.  Лечебно-профилактические кормовые белковые добавки на основе высшего лечебного гриба Fusarium sambucinum MKF-2001-3 // Ветеринария и кормление. – 2010. - №4. – С. 8-9.
  7. Неминущая Л.А. Использование статистических методов в управлении биотехнологическими процессами / Неминущая Л.А., Еремец О.В., Скотникова Т.А., Еремец Н.К., Токарик Э.Ф., Еремец В.И., Самуйленко А.Я., Безгин В.М., Егоров В.Е., Ганяев А.М.  // Ветеринарный врач. – 2010. – №5. – С.29-32.
  8. Неминущая Л. А. Антиоксидантная активность пребиотиков – новая характеристика их функциональной ценности // Бутлеровские сообщения. -2010. – Т.21. - №9. – С.71-77.
  9. Неминущая Л.А. Микроорганизмы  -  основа для создания лечебно-профилактических кормовых добавок // Ветеринарный врач. – 2010. – № 6.– С.47-50.
  10.   Еремец О.В. Проектный подход  в  обеспечении качества и безопасности лекарственных средств для животных / Еремец О.В.,  Малышева  М.А., Неминущая  Л.А.,  Люлькова Л.С., Еремец Н.К., Скотникова  Т.А. // Ветеринария и кормление. Спец. выпуск журнала, приуроченный к Международной научно-практической конференции молодых ученых ФГУ «ВНИИЗЖ», 2010г., С.60-61.
  11.   Неминущая Л.А. Роль доклинических испытаний в обеспечении качества лекарственных средств и биологически активных добавок к кормам для животных / Неминущая Л.А., Еремец Н.К., Люлькова Л.С.. Скотникова Т.А., Токарик Э.Ф., Бобровская И.В., Самуйленко А.Я. // Ветеринарная медицина. – 2010. - №5-6. – С.14-16
  12. Скотникова Т.А. Управление рисками в  производстве иммунобиологических ветеринарных препаратов / Скотникова Т.А., Неминущая Л.А., Люлькова Л.С., Еремец Н.К., Бобровская И.В., Самуйленко А.Я.  // Ветеринарная медицина. – 2010. - №5-6. – С. 16-1
  13. Самуйленко А.Я. Ветеринарные аспекты  обеспечения продовольственной безопасности России / Самуйленко А.Я.,………… Неминущая Л.А. // Ветеринария.- 2011.-№…….- С………..
  14. Самуйленко А.Я. Задачи биотехнологии в реализации доктрины продовольственной безопасности Российской Федерации / Самуйленко А.Я.,…………….. Неминущая Л.А. // Ветеринария и кормление.-2011.-№……-С…………

6.2. Патенты

  1. Токарик Э.Ф., Ковальская Л.А., Скотникова Т.А., Елисеева Л.А., Смоленский В.И., Филоненко В.И. Способ профилактики болезни Ньюкасла. Патент РФ №2035915, приоритет от 28.12.92.
  2. Токарик Э.Ф., Скотникова Т.А., Ковальская Л.А., Смоленский В.И., Шевырев Н.С., Самуйленко А.Я. Вакцина против болезни Ньюкасла и способ ее применения. Патент РФ №2035917, приоритет от 28.12.92.
  3. Зуев Е.Т., Брагинцева Л.М., Воробьева Г.И., Неминущая Л.А.,  Токарик Э.Ф., Еремец Н.К. Штамм гриба Fusarium sambucinum – продуцент биологически активных веществ. Патент РФ №2259209 от 27.08.05.
  4. Неминущая Л.А., Токарик Э.Ф., Шоль В.Г., Филоненко В.И., Салеева И.П., Скотникова Т.А., Воробьева Г.И., Самуйленко А.Я., Калугин С.В., Еремец В.И. Кормовая добавка для птицеводства и способ выращивания птицы.  Патент РФ № 2286066 приоритет от 26.04.04.

6.3. Публикации в других изданиях

  1. Ковальская Л.А. Использование теста эмбриотоксичности при оценке качества  ветеринарных препаратов / Ковальская Л.А., Елисеева Л.А., Иванова Н.А.: тез. докл. IV Всесоюз. конф. «Научные основы технологии промышленного производства ветеринарных биологических препаратов». – М.- 1991. – С.183-184.
  2. Скотникова Т.А. К вопросу о гармонизации международных и национальных требований к показателям качества и методам их определения / Скотникова Т.А., Ковальская Л.А., Иванова Н.А.: материалы Всерос. научно-практич. конф. «Вирусные болезни с/х животных».- Владимир.-1995.-С.185.
  3. Токарик Э.Ф. ОСТ 10089-95. Продукция агробиологической промышленности. Технологические регламенты производства. Содержание, порядок разработки, построения, согласования и утверждения / Токарик Э.Ф.,  Еремец Н.К., Иванова Н.А., Ковальская Л.А., Скотникова Т.А.- М.-1995.-100с.
  4. Филоненко В.И. Технология камерной аэрозольной вакцинации цыплят против ньюкаслской болезни / Филоненко В.И., Шоль В.Г., Фисинин В.И., Спирина С.И. Присяжный Г.И., Офицеров В.А., Королева Н.А., Филоненко Н.Н., Вострякова Г.В., Токарик Э.Ф., Скотникова Т.А., Ковальская Л.А., Елисеева Л.А., Смоленский В.И.,  Григоренко А.И., Власов Н.Г., Ананьевский С.М., Королев Б.М., Бильдев Н.П.  Методические рекомендации (РАСХН –ВНИиТИБП –ВНИТИП –Вирусолог. Центр НИИ микробиологии МО РФ). - Сергиев Посад.- 1996.- 53с.
  5. Токарик Э.Ф. О гармонизации отечественной нормативно-технической документации на производство лекарственных средств  для ветеринарии с международными требованиями / Токарик Э.Ф., Ковальская Л.А., Скотникова Т.А., Еремец Н.К., Чернявская О.А.: тез. докл. V Всерос. конф. «Научные основы технологии промышленного производства ветеринарных биологических препаратов». – Щелково.- 1996.-С.281-282.
  6. Ковальская Л.А. Новые препараты (биофармкомплекс) и способ их применения для профилактики ньюкаслской болезни / Ковальская Л.А., Скотникова Т.А., Елисеева Л.А., Марыгина А.Ф., Галибина Н.В., Токарик Э.Ф., Смоленский В.И., Филоненко А.И., Григоренко А.И.: тез. докл.V Всерос. конф. «Научные основы технологии промышленного производства ветеринарных биологических препаратов». - Щелково.- 1996. -  С.24-25.
  7. Ковальская Л.А. Лекарственные средства для защиты почв, растений и животных – новые подходы и разработки / Ковальская Л.А., Авдеева Т.А., Токарик Э.Ф., Самуйленко А.Я., Смолинский Е.А., Воробьева Г.И.: тез. докл. научно-производств. конф. «100 лет Курской биофабрике и агробиологической промышленности России».- Курск.- 1996.-  С.146-148.
  8. Skotnikova T.A. Newcastle disease vaccin : perfection and applikation method / Skotnikova T.A., Kovalskaya L.A., Eliseeva L.A., Samvilenko A.Y., Smolensky V.I. // XI–th International congress оf the World Vеterinary poultry association.- Budapest.- 1997.- Р.213.
  9. Токарик Э.Ф. Документирование  технологических процессов производства лекарственных средств  для ветеринарии и животноводства / Токарик Э.Ф., Еремец Н.К., Ковальская Л.А.. Скотникова Т.А., Самуйленко А.Я., Еремец В.И.: тез. докл. Всерос. научно-практич. конф. «Научные основы технологии промышленного производства ветеринарных биологических препаратов».- Щелково.- 1998.-с.6-7.
  10. Еремец Н.К. Научно-методическое обеспечение управления  качества лекарственных средств  для ветеринарии и животноводства / Еремец Н.К., Скотникова Т.А., Ковальская Л.А., Токарик Э.Ф., Самуйленко А.Я.: тез. докл. Всерос. научно-практич. конф. «Научные основы технологии промышленного производства ветеринарных биологических препаратов».- Щелково.- 1998.- С.8-9.
  11. Скотникова Т.А. Вопросы технологии производства безопасных лекарственных средств  для ветеринарии и животноводства / Скотникова Т.А., Ковальская Л.А., Еремец  Н.К., Токарик Э.Ф., Самуйленко А.Я.: тез. докл. Всерос. научно-практич. конф. «Научные основы технологии промышленного производства ветеринарных биологических препаратов».- Щелково.-1998.-С.42-43.
  12. Ковальская Л.А. Повышение эффективности профилактики ньюкаслской болезни птиц путем комплексного применения вакцины и пробиотика / Ковальская Л.А., Скотникова Т.А., Елисеева Л.А.,Токарик Э.Ф., Смоленский В.И.: тез. докл. Всерос. конф. «Политика здорового питания России: пробиотики и пробиотические продукты в профилактике и лечении наиболее распространенных заболеваний человека».- М.- 1999.-С.62-63.
  13. Сазанова Э.Я. Управляемое глубинное культивирование пробиотиков / Сазанова Э.Я., Андреев В.А.,  Ковальская Л.А.: тез. докл. Всерос. конф. «Политика здорового питания России: пробиотики и пробиотические продукты в профилактике и лечении наиболее распространенных заболеваний человека». - М.- 1999. - С.44
  14. Скотникова Т.А. Эффективная и экологически безопасная технология вакцинации цыплят-бройлеров против ньюкаслской болезни / Скотникова Т.А., Елисеева Л.А., Ковальская Л.А., Шоль В.Г.: материалы Всерос. научно-практич. конф. « Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов».-Щелково.- 2000.--С.45-47.
  15. Ковальская Л.А.  Препараты для птиц «Авилакт -1К» и «Авинорм-3» - биофармкомплексы на основе пробиотиков и биологически-активных добавок / Ковальская Л.А.,  Сазанова Э.Я., Калугин С.В., Токарик Э.Ф., Филоненко В.И., Воробьева Г.И.: тез. докл. Всерос. научно-практич. конф. « Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов».- Щелково.- 2000.С.345-346.
  16. Калугин С.В. Отработка технологических процессов изготовления и контроля пробиотика «Авилакт-1К» / Калугин С.В., Ипатов А.В., Ковальская Л.А., Еремец В.И.: сборник докл. Межд. Конф. молодых ученых «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов».- Щелково.- 2001.-С.88-91.
  17. Зуев Е.Т. Модификация ХЕТ-КАМ теста для определения раздражающего действия биологически активных добавок к пищевым продуктам и кормам для животных / Зуев Е.Т., Караваева С.А., Ковальская Л.А., Калугин С.В., Мальцев О.В., Еремец Н.К.: сборник докл. Межд. Конф. молодых ученых «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов». – Щелково.- 2002.-С. 148-161.
  18. Токарик Э.Ф. О структуре системы технологической документации биопредприятий / Токарик Э.Ф., Еремец Н.К., Скотникова Т.А., Ковальская Л.А., Еремец В.И.: материалы межд. научно-практич. конференции  «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов.- Щелково.-2003.- Ч.1.-С.12-16.
  19. Ковальская Л.А. Метод оценки стабильности и точности технологических процессов и операций производства лекарственных средств для животных / Ковальская Л.А., Скотникова Т.А.,  Еремец Н.К., Токарик Э.Ф., Безгин В.М.: материалы межд. научно-практич. конференции  «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов.-Щелково.-2003.- Ч.1.-С. 33-39.
  20. Зуев Е.Т. Культуры высших грибов – потенциальный источник БАВ для функциональных напитков / Зуев Е.Т., Ковальская Л.А., Воробьева Г.И., Брагинцева Л.М.: материалы VII Всеросс. Конгресса «Здоровое питание населения России».-М.-2003.– С.198-200.
  21. Ковальская Л.А., Еремец В.И.  Результаты доклинических испытаний препарата «Авилакт- форте» - биофармкомплекса для птиц / Ковальская Л.А., Еремец В.И.: материалы межд. научн.-практич. конф. «Современные вопросы патологии с/х животных».- Минск.- 2003.- С. 38-39.
  22. Неминущая Л.А. Эффективность применения пробиотиков «Авилакт-1К» и «Лактобактерин» при выращивании цыплят-бройлеров/ Неминущая Л.А., Токарик Э.Ф., Еремец В.И., Зуев И.В., Калугин С.В., Филоненко В.И., Салеева И.П.:материалы Межд. конф. «Пробиотики, пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания. Современное состояние и перспективы». М., 2004 : 153-154
  23. Зуев Е.Т. Применение метода гистограмм для статистического контроля производственных процессов в пищевой и биологической промышленности / Зуев Е.Т., Гурьев В.И., Неминущая Л.А., Скотникова Т.А. // Ветеринарна медицина. Межведомст. тематич. научн. сб. – Харьков.- 2004.-  Т.84.-С.823-827.
  24. Самуйленко А.Я. Некоторые вопросы технического регулирования в сфере разработки и производства лекарственных средств для животных в АПК России / Самуйленко А.Я., Еремец В.И., Токарик Э.Ф.,  Еремец Н.К., Неминущая Л.А., Скотникова Т.А.  // Ветеринарна медицина. Межведомст. тематич. научн. сб.- Харьков.- 2004.- Т.84.-С..850-851.
  25.   Неминущая Л.А. Эффективность различных лекарственных форм препарата «Авилакт-форте» для птиц / Неминущая Л.А., Токарик Э.Ф., Еремец Н.К., Еремец В.И., Зуев И.В., Салеева И.П.: материалы Всерос. научно-практич. конф. «Сельскохозяйственная наука Республики Мордовия: достижения, направления развития».- Саранск.- 2005.-Ч. 2.- С. 335-336.
  26.   Неминущая Л.А. Вакцинация бройлеров против ньюкаслской болезни с использованием пробиотического препарата «Авилакт-форте» / Неминущая Л.А., Скотникова Т.А., Еремец Н.К., Еремец В.И., Самуйленко А.Я.: материалы Всерос. научно-практич. конф. «Сельскохозяйственная наука Республики Мордовия: достижения, направления развития».- Саранск.- 2005.-Ч. 2.-С. 334-335.
  27. Неминущая Л.А. Возможность получения пребиотиков из биомассы дрожжей-сахаромицетов и гриба Fusarium sambucinum шт. MKF-2001-3 / Неминущая Л.А., Воробьева Г.И., Токарик Э.Ф., Еремец В.И., Самуйленко А.Я.: материалы Межд. конф. «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов».- Щелково.- 2005.- С.511-516.
  28. Неминущая Л.А. Новый штамм гриба Fusarium sambucinum – продуцента биологически активных добавок / Неминущая Л.А., Воробьева Г.И., Токарик Э.Ф.,  Еремец В.И.: материалы Межд. конф. «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов».- Щелково.- 2005.- С. 517-521.
  29. Еремец В.И. Перспективы использования пробиотического препарата «Авилакт-форте» при вакцинации бройлеров против ньюкаслской болезни / Еремец В.И.,  Неминущая Л.А., Скотникова Т.А., Еремец Н.К., Самуйленко А.Я.: материалы VI Украинской конференции по птицеводству с международным участием. -  Птахiвництво. – 2005. –Вип.57. – С.395-398. 
  30.   Скотникова Т.А. Лабораторный рабочий эталонный материал: назначение, принципы приготовления, характеристика и калибровка / Скотникова Т.А., Неминущая Л.А., Токарик Э.Ф., Смоленский В.И., Руденко Т.В., Горева И.П.: материалы 1 Межд. ветеринарного конгресса по птицеводству.- Москва.-2005.- С.147-152.
  31. Еремец В.И. Руководство по разработке системы технологической документации на предприятии биологической промышленности или опытном производстве при организациях соответствующего профиля / Еремец В.И., Токарик Э.Ф., Еремец Н.К., Скотникова Т.А., Неминущая Л.А.  Сб.: «Новые методы исследований по проблемам ветеринарной медицины. Методы исследований в области паразитологии, эпизоотического мониторинга, биотехнологии», РАСХН отд. ветеринарной медицины.- М. – 2006. –Ч. 2.- С.312-348.
  32. Скотникова Т.А. Способы реализации процессного и проектного подходов в системе целевых мероприятий по внедрению системы менеджмента качества на предприятиях АПК / Скотникова Т.А., Токарик Э.Ф., Неминущая Л.А., Еремец В.И., Еремец Н.К. Самуйленко А.Я.: материалы  Межд. научно-практич. конф. «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов». – Щелково.-2006.- С.32-35.
  33. Неминущая Л.А. Интегрированная система менеджмента  биофармпредприятия агробиологической промышленности. Управление рисками при производстве лекарственных средств / Неминущая Л.А., Скотникова Т.А., Спиридонов А.В.: материалы Межд. юбилейной научно-практической конференции, посв. 110-летию Курской биофабрики и агробиологической промышленности России.- Курск.-2006.- С.27-42.
  34. Скотникова Т.А. Интегрированная система менеджмента качества биофармпредприятия агробиологической промышленности. Базовые стандарты  ИСО 9000 и Правила СМР / Скотникова Т.А., Неминущая Л.А., Люлина Н.В.: материалы Межд. юбилейной научно-практической конференции, посв. 110-летию Курской биофабрики и агробиологической промышленности России.- Курск.-2006.- С.42-51.
  35. Неминущая Л.А. Исследование антиоксидантной активности препарата «Авистим» - пребиотика для птиц / Неминущая Л.А., Скотникова Т.А., Еремец Н.К., Самуйленко А.Я., Еремец В.И., Крыжановская Е.В., Чулков А.К.: материалы III Межд. ветеринарного конгресса по птицеводству.- Москва.- 2007.- С.214-215.
  36.   Скотникова Т.А. Вопросы обеспечения безопасности производства иммунобиотехнологических ветеринарных препаратов / Скотникова Т.А., Неминущая Л.А., Еремец Н.К., Самуйленко А.Я., Крыжановская Е.В., Чулков А.К.: материалы III Межд. ветеринарного конгресса по птицеводству.- Москва.- 2007.- С. .58-59.
  37. Еремец В.И. Информационно-справочные документы системы менеджмента качества для предпрятий агропромышленного комплекса / Еремец В.И., Токарик Э.Ф., Скотникова Т.А., Еремец Н.К. Неминущая Л.А., Самуйленко А.Я.: материалы  Межд. научно-практич. конф.  « Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов». – Щелково.-2007.-С.10-14.
  38. Неминущая Л.А. Исследование  in vitro антагонистической активности и чувствительности к антибиотикам бактерий-пробиотиков / Неминущая Л.А., Скотникова Т.А., Еремец Н.К., Еремец В.И., Самуйленко А.Я., Крыжановская Е.В.: материалы  Межд. научно-практич. конф.  « Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов». – Щелково.-2007.-С.284-289.
  39.   Воробьева Г.И. Производство лечебно-профилактических кормовых добавок – синбиотиков для сельского хозяйства / Воробьева Г.И., Максимова Г.Н., Неминущая Л.А., Токарик Э.Ф., Еремец В.И., Самуйленко А.Я., Крыжановская Е.В.: материалы  Межд. научно-практич. конф.  « Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов». – Щелково.-2007.-С.373-376.
  40. Имангулов Ш.А. Использование пробиотиков, пребиотиков и симбиотиков в птицеводстве / Имангулов Ш.А., Егоров И.А., Ленкова Т.Н., Игнатова Г.В., Паньков П.Н., Розанов Б.Л., Егорова Т.В., Харламов К.В., Елизаров И.В., Свиткин В.С., Кислюк С.М., Еремец В.И., Неминущая Л.А., Гинсбург А.С. Методические рекомендации (ГНУ ВНИТИП – ГНУ ВНИТИБП – ООО  «Биотроф» - ООО «Пробиотик Центр»).- Сергиев Посад.- 2008.- 43с.
  41. Самуйленко А.Я. Методические рекомендации по разработке и реализации проекта создания нового лекарственного средства. Обеспечение качества лекарственных средств для животных в процессе разработки / Самуйленко А.Я., Еремец В.И., Шурыгин А.И., Токарик Э.Ф., Еремец Н.К., Скотникова Т.А., Неминущая Л.А., Спиридонов А.В.- М.- 2009.-62с.
  42. Воробьева Г.И. Использование белковых компонентов на основе биомассы дрожжей-сахаромицетов при создании стартовых кормов для личинок рыб / Воробьева Г.И., Максимова Г.Н., Неминущая Л.А., Головин П.П.: материалы Межд. Конгресса «Биотехнология-2009».-М.- 2009.-С. 362.
  43. Скотникова Т.А. Интегрированная система менеджмента качества на предприятиях агропромышленного комплекса, выпускающих лекарственные средства / Скотникова Т.А., Неминущая Л.А., Токарик Э.Ф., Еремец Н.К., Еремец В.И., Самуйленко А.Я.: материалы Межд. научно-практич. конф. «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов». – Щелково.- 2009.- С. 90-95.
  44. Токарик Э.Ф. Разработка и оптимизация параметров технологического процесса сублимационной сушки биоматериалов: современный взгляд на достижения и перспективы научного направления / Э.Ф.Токарик, А.А.Нежута, Т.А.Скотникова, Л.А.Неминущая, В.В.Панферов.:  материалы Межд. научно-практич. конф. «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов». - Щелково,.- 2009.- С. 49-56.
  45. Неминущая Л.А. Синбиотики – белковый кормовой продукт 21 века / Неминущая Л.А., Воробьева Г.И., Токарик Э.Ф., Еремец В.И., Беро И.Л., Самуйленко А.Я.:  мат. Межд. научно-практич. конф. «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов». - Щелково,.- 2009.- С. 489-497.
  46. Скотникова Т.А.  Роль стабильности в обеспечении качества лекарственных средств (иммунобиологических препаратов) для животных / Скотникова Т.А., Неминущая Л.А., Токарик Э.Ф., Сапегина Е.П., Самуйленко А.Я.: мат. Межд. научно-практич. конф. «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов». - Щелково,.- 2009.- С. 656-662.
  47. Неминущая Л.А. Роль  синбиотика  АВИЛАКТ-ФОРТЕ  в повышении эффективности вакцинации бройлеров против ньюкаслской болезни / Неминущая Л.А., Скотникова Т.А., Еремец В.И., Самуйленко А.Я., Салеева И.П.: мат. V Межд.  научн.  конф.  «Актуальные проблемы биологии в животноводстве».- Боровск.– 2010. – С. 298-299.
  48. Неминущая Л.А.  Доклинические  исследования  безопасности  пребиотиков на био-тест-системах различной сложности: мат. V Межд.  научн.  конф.  «Актуальные проблемы биологии в животноводстве».- Боровск.– 2010. – С. 293-294.
  49. Неминущая Л.А. Новые синбиотические комплексы для птицеводства –разработка и перспективы применения: мат.V Межд.  научн.  конф.  «Актуальные проблемы биологии в животноводстве».- Боровск.- 2010. – С. 295-296.
  50. Неминушая Л.А.Фармакоэкономические аспекты разработки и применения новых синбиотиков в бройлерном птицеводстве / Неминушая Л.А., Ломакина Т.А., Самуйленко А.Я., Салеева И.П: мат. V Международной  научной  конференция  «Актуальные проблемы биологии в животноводстве» г. Боровск, 14-16  сентября 2010 г. – 2010. – С. 296-297.
  51.   Самуйленко А.Я. Актуализация нормативных и информационно-справочных документов по вопросам обеспечения биобезопасности и качества лекарственных средств для животных / Самуйленко А.Я., Еремец В.И., Токарик Э.Ф., Неминущая Л.А., Скотникова Т.А., Еремец Н.К., Люлькова Л.С. // Ветеринарна медицина. Мiжвiдомчий тематичный науковий збiрник. - Харькiв. – 2010. – Вип. 94. – С.346-347.
  52. Неминущая Л.А.  Биотехнологические аспекты получения синбиотических комплексов для сельского хозяйства / Неминущая Л.А., Самуйленко А.Я., Воробьева Г.И., Титова Е.И.,  Еремец О.В.:  мат. VI Моск.  Межд. конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития». -Москва. -2011. -С.215-216.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АнтА – антагонистическая активность

ЗР – задержка роста

ОМ – обезжиренное молоко

МПА – мясо-пептонный агар

СП – санитарные правила

КОЕ – колониеобразующие единицы

в/б – внутрибрюшинно

ВКПМ – Всероссийская Коллекция промышленных микроорганизмов

БАВ – биологически активные вещества

БМ – биомасса

КЖ – культуральная жидкость

АМ – автолизат мицелия

S.l.s. - Seed lot system, система посевных материалов

M.s. - Master seed, главный посевной  материал

W.s. - Working seed, рабочий посевной материал

P.s. - Production seed, производственный посевной материал

РЭК – развивающиеся эмбрионы кур

SPF (specific pathogen free) – свободный от специфических патогенов

ЛРЭМ - лабораторный рабочий эталонный материал (стандартный образец)

ТП - основные технологические процессы

ПР - подготовительные работы

ВР - вспомогательные работы

КТ - контрольные точки

МС - молочная сыворотка

ФЗ - ферментолизат отходов зерносырья

РВ - редуцирующие вещества

ЖКТ – желудочно-кишечный тракт

НД – нормативная документация

СТО – стандарт организации

ФР – физиологический раствор

ХЕТ-КАМ тест – Hen’s egg test at the chorio-allantoic membrane test

ХАО - хориоаллантоисная оболочка

АА - антиоксидантная активность

ЕИП – европейский индекс продуктивности

НБ – ньюкаслская болезнь

анти-ГА - антигемагглютинин






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.