WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

 

На правах рукописи

Давыдкин Валерий Юрьевич

ТЕХНОЛОГИЯ И КОНСТРУИРОВАНИЕ СУХИХ БИОПРЕПАРАТОВ

НА ОСНОВЕ МИКРОКАПЕЛЬНЫХ ПОРОШКОВ

03.01.06 – Биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

 

Москва – 2010

Работа выполнена в Федеральном Государственном учреждении науки «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г. Н. Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Научный консультант:

Засл. деятель науки РФ, доктор медицинских

наук, профессор

Афанасьев Станислав Степанович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

Кочеровец Владимир Иванович

доктор медицинских наук, профессор

Макаров Владимир Александрович

доктор биологических наук

Холоденко Василий Петрович

 

Ведущая организация:

Открытое акционерное общество «БИОХИММАШ» - ведущая организация в области разработки продуктов, технологии и оборудования микробиологического синтеза, г. Москва

Защита диссертации состоится «_____» _________________2011г. в________час. на заседании Диссертационного совета Д 208.046.01 при Федеральном Государственном учреждении науки «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г. Н. Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по адресу: 125212, г. Москва, ул. Адмирала Макарова, д.10.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Федерального Государственного учреждения науки «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г. Н. Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Автореферат разослан «______»___________2011г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор медицинских наук О.Ю.  Борисова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Важное значение симбиотической микрофлоры для организма человека к настоящему времени общепризнанно и обосновано результатами многочисленных исследований (Перетц Л.Г., 1955; Шендеров Б.А., 1998; Bongle D. et al., 1999).

Симбиотическая микрофлора составляет основу микроэкологии человека. Все сообщающиеся с внешней средой полости тела человека, а также кожные покровы заселены микроорганизмами, которые представлены несколькими сотнями видов бактерий, без учёта одновременной персистенции вирусов, простейших, грибов (Воробьев А.А. с соавт., 1998; Luckey T.D., 1987; Onderdonk A.B. et al., 1993).

Нарушения качественного и количественного состава симбиотической микрофлоры объединяются термином “дисбактериоз” (Грачева Н.М. с соавт., 1986; Воробьев А.А. с соавт., 1998).

В современных условиях на фоне частого воздействия неблагоприятных  экологических факторов и широкого распространения в повседневной практике противомикробных лекарственных средств, дисбиотические нарушения микрофлоры носят массовый характер и выявляются практически среди всех слоев населения (Ногаллер А.М. с соавт., 1991; Водилова О.В., 2000) .

Для коррекции дисбиотических нарушений микрофлоры применяется целый комплекс  лечебных мероприятий с учетом клинических проявлений основного заболевания и степени выраженности дисбактериоза, а также данных лабораторных исследований микрофлоры биотопа и состояния реактивности организма. Однако основную роль играет дифференцированное применение различных иммунобиологических препаратов, в том числе пробиотиков, являющихся наиболее физиологичными для коррекции микрофлоры и профилактики дисбиотических изменений, а также препаратов, применяемых для повышения резистентности организма, восстановления иммунного статуса  (Грачева Н.М. с соавт., 1986; Алешкин В.А с соавт., 2000).

Вместе с тем, до настоящего времени в производстве сухих биопрепаратов единственным широко используемым методом стабилизации свойств биологических субстанций остается сублимационное (лиофильное) высушивание. Этот способ, обеспечивая высокое качество продукта, отличается чрезмерной длительностью (до 2 суток), а получаемая сухая субстанция без дополнительной переработки непригодна для приготовления сухих дозированных форм препаратов (Халенева М.П., 1984; Несчисляев В.А., 2005). Кроме того, получаемые с использованием этого способа высушивания пероральные препараты на основе живых пробиотических микроорганизмов нуждаются в защите от кислотно-ферментного комплекса пищеварительной системы. По-видимому, этим, а также стремлением придать биологическому началу новые фармакокинетические свойства (повышенную биодоступность и защищенность от воздействия неблагоприятных факторов хранения и применения), объясняется появление разработок, направленных на создание технологий с иммобилизацией биокомпонентов, которая осуществляется сорбцией на различных носителях (Бородин Ю.И. с соавт., 1998; Молокеев А.В. с соавт., 2001; Бартоломойз Й. с соавт., 2003; Вайншток И.И. с соавт., 2007).

Одним из вариантов современной технологии с наименьшим количеством стадий и продолжительностью является описанный в патентной литературе способ с непосредственным обезвоживанием биомассы пробиотических микроорганизмов моно - или поликомпонентного состава сорбентами (Нахабин И.М. с соавт., 1996; Ходак В.И. с соавт., 1998). Высушивание биомассы и приготовление препарата происходит на одной технологической стадии. Однако вследствие прямого контакта биомассы с сорбентом выживаемость клеток пробиотических микроорганизмов не превышает 10-20%. Отсутствуют также сведения о принципиальной возможности и эффективности применения такого способа для получения сухих биопрепаратов немикробной природы (например, иммуноглобулинов).

Таким образом, не существует современной технологии приготовления пероральных иммунобиологических препаратов, отличающейся универсальностью в плане возможности переработки биологических компонентов различной природы. Вместе с тем рациональное использование особых свойств нового вида биологического материала – микрокапельного порошка в сочетании с обоснованным выбором обезвоживания создают предпосылку для разработки такой технологии. Однако системных исследований в этом направлении не проводилось, что и определило актуальность данной работы.

Цель исследования: На модели микроорганизмов Bifidobacterium adolescentis MC-42, Lactobacillus acidophilus (смесь штаммов NК1, 100аш, К3Ш24) и иммуноглобулиновых комплексов типа КИП экспериментально обосновать новый концептуальный принцип и практические подходы к конструированию и технологии приготовления  сухих комплексных биопрепаратов для профилактики и лечения заболеваний, ассоциированных с дисбалансом нормофлоры желудочно-кишечного тракта.

Задачи исследования: 

1. На основе анализа и в эксперименте идентифицировать микрокапельный порошок как дисперсную систему, определить его основные свойства и требования к размерам микрокапель жидкости. Обосновать выбор устройства для приготовления микрокапельного порошка.

2.  Определить технологические показатели состояния системы аэросил-биообъект, исследовать устойчивость биообъектов к механическим нагрузкам, возникающим при диспергировании жидкой субстанции, и выбрать оптимальный режим приготовления микрокапельных порошков в электромагнитном диспергаторе.

3. Определить требования к сорбенту как структурному элементу и биологически активному компоненту препарата и на примере модельного микроорганизма обосновать методический подход к проведению процесса сорбционно-контактной сушки микрокапельного порошка. Доказать общность установленных положений при обезвоживании микрокапельных порошков микроорганизмов и КИП.

4. Исследовать основные закономерности конвективной сушки микрокапельного порошка при атмосферном давлении. Обосновать компонентный состав и методический подход к конструированию биопрепаратов на основе комплекса сывороточных иммуноглобулинов и пробиотических микроорганизмов.

5. В экспериментах in vitro исследовать защитные свойства структурного компонента препарата – наноразмерного разобщителя аэросила.

6. Оценить нетоксичность и безвредность комплексного биопрепарата КИП и B. adolescentis МС-42 в экспериментах на мелких лабораторных животных и здоровых приматах. Изучить терапевтическую эффективность препарата при лечении обезьян, больных острой кишечной инфекцией с диарейным синдромом.

Научная новизна

Получены знания о структуре, основных свойствах и способе получения нового вида биоматериала – микрокапельного порошка, образующегося при диспергировании биологической жидкости во взвешенном слое  наноразмерного разобщителя аэросила. Наиболее эффективно процесс формирования порошка протекает в электромагнитном диспергаторе, принцип действия которого основан на передаче энергии вращающегося электромагнитного поля рабочим ферромагнитным телам, осуществляющим механическое дробление жидкости.

Показано, что степень инактивации биокомпонента при диспергировании жидкой субстанции обусловливается его восприимчивостью к механическим нагрузкам. Наиболее чувствительными оказались клетки L. acidophilus (смесь штаммов NК1, 100аш, К3Ш24) и B. adolescentis МС-42, клетки E. coli М-17 занимают промежуточное положение, и наименее чувствительным является энтерококк E. faecium ГНКИ-27. Значительно большей механоустойчивостью, чем энтеральные микроорганизмы, обладают сывороточные иммуноглобулины трех основных классов (IgG, IgA и IgM) в растворе КИП.

Доказано, что закономерности протекания процесса сорбционно-контактной сушки микрокапельного порошка являются общими для биологических субстанций различной природы. При этом гибель клеток энтеральных микроорганизмов независимо от их видовой принадлежности составляет от 30 до 70%, а наибольшее снижение антисальмонеллезной активности иммуноглобулинов - одно двукратное разведение. 

Впервые проведенными исследованиями атмосферного обезвоживания микрокапельных порошков бифидобактерий и лактобацилл установлено, что температура осушающего воздуха не должна превышать 35-40С, то есть величин, близких к оптимальной температуре роста этих микроорганизмов, во избежание интенсивной гибели клеток как в процессе конвективного обезвоживания, так и последующего досушивания сорбционно-контактным методом.

Исследованиями in vitro впервые показан защитный эффект аэросильной оболочки, проявляющийся в затруднении доступа к сухому биологическому началу паров воды из воздуха и агрессивных составляющих желудочного и кишечного соков, и таким образом обеспечивающий негигроскопичность препарата и повышенную биодоступность бактериального компонента.

Впервые проведенными доклиническими испытаниями комплексного биопрепарата КИП и B. adolescentis МС-42 показана его нетоксичность и безвредность для приматов, а также 100% терапевтическая эффективность при лечении обезьян, больных острой кишечной инфекцией с диарейным синдромом. Исчезновение клинических проявлений заболевания сопровождалось выраженными положительными изменениями в микробиоценозе желудочно-кишечного тракта обезьян – повышением содержания нормальных E. coli, существенным снижением количества таких условно-патогенных микроорганизмов, как Staph. epidermis, представители родов  Enterococcus, Proteus, Klebsiella, и полной элиминацией Citrobacter.

Теоретическое значение работы

Обоснован концептуальный принцип разработки биопрепаратов нового поколения для коррекции дисбиотических нарушений в биотопах организма, базирующийся на сочетании в одной лекарственной форме обогащенных иммуноглобулиновых комплексов типа КИП с микробными пробиотиками, обладающими широким спектром и высоким уровнем антагонистической активности в отношении как патогенных, так и условно-патогенных возбудителей заболеваний.

Предложен метод конструирования сухих биопрепаратов, заключающийся в использовании особых свойств микрокапельного порошка и обеспечивающий получение препаратов перорального применения на основе биологических субстанций различной природы. Этот метод может быть использован в дальнейшем при разработке иммунобиологических препаратов для профилактики и терапии других заболеваний.

Практическая значимость

Предложен новый вид биологических материалов – микрокапельный порошок, относящийся к трехфазным микрогетерогенным дисперсным системам и обладающий вследствие особой структуры одновременно свойствами сухого порошка и жидкого аэрозоля, что существенно расширяет возможности его технологической переработки и обусловливает наличие улучшенных фармакокинетических свойств у сухого препарата.

Разработан способ обработки материалов и конструкция электромагнитного диспергатора для осуществления технологического процесса получения микрокапельного порошка биологических жидкостей. Предложена упрощенная методика перехода при переработке суспензий микроорганизмов различных видов, базирующаяся на общей для большинства бактерий закономерности экспоненциальной их гибели с увеличением интенсивности механического воздействия.

Аналитически и экспериментально выдвинут ряд требований к физическим, физико-химическим и биологическим характеристикам сорбента, позволяющих обосновать его выбор в качестве структурного элемента сухого биопрепарата, получаемого сорбционно-контактной сушкой микрокапельного порошка.

Введение в технологическую схему двухэтапной стадии обезвоживания микрокапельных порошков приводит к несущественному увеличению длительности технологического цикла, обеспечивая повышение выживаемости бифидобактерий и лактобацилл до 50-70% и сохранение без потери антисальмонеллезной активности сывороточных иммуноглобулинов.  Полученные результаты по выживаемости микроорганизмов не уступают, а по соханению специфической активности иммуноглобулинов превосходят результаты их лифильного обезвоживания. 

Защита аэросильной оболочкой сухого биологического начала от воздействия влаги воздуха и агрессивных составляющих желудочного и кишечного соков обеспечивает следующие преимущества. Во-первых, исключается необходимость проведения специальных мероприятий, направленных на предотвращение гидратации препарата при выполнении технологических операций, что упрощает и удешевляет технологию в целом, а во-вторых, снижается инактивация биокомпонента при прохождении верхних отделов желудочно-кишечного тракта, что делает возможным уменьшение доз лекарственных веществ в препарате для достижения адекватного терапевтического эффекта.

С использованием разработанного метода сконструированы комплексные биопрепараты КИП и В. adolescentis МС-42, КИП и L. acidophilus (смесь штаммов NК1, 100аш и К3Ш24).

Внедрение результатов работы

На базе лаборатории медицинской биотехнологии ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора разработаны и приготовлены экспериментальные серии комплексных биопрепаратов КИП и B. adolescentis МС-42, КИП и L. acidophilus (штаммы NК1, 100аш и К3Ш24).

На основании проведенных исследований оформлено 10 патентов на изобретения:

1. Пат. 1831801 СССР, В01F 13/08. Устройство для обработки материалов. Зарегистрирован в Государственном реестре изобретений Российской Федерации  13.10.1992. Патентообладатель коллектив авторов.

2. Пат. 2026730 РФ, В01F 13/08. Способ обработки материалов. Зарегистрирован в Государственном реестре изобретений Российской Федерации  20.01.95. Патентообладатель коллектив авторов.

3. Пат.  2161887 RU, A23D 9/00. Биологическая активная добавка. Зарегистрирован в Государственном реестре изобретений Российской Федерации  20.01.2001. Патентообладатель коллектив авторов.

4. Пат. 2164765 RU, А23L 1/30. Биологически активная добавка. Зарегистрирован в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 10.04.2001. Патентообладатель коллектив авторов.

5. Пат. 2240136 RU, А61К 39/395. Композиция, содержащая иммуноглобулины и целевые добавки. Зарегистрирован в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 20.11.2004. Патентообладатель ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора.

6. Пат. 2247578 RU, А61К 39/395. Состав, обладающий противомикробным действием.  Зарегистрирован в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 10.03.2005. Патентообладатель ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора.

7.  Патент РФ № 2371200, МПК  А61К 39/395. Способ получения иммуноглобулинового препарата. Зарегистрирован в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 27.10.2009. Патентообладатель ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора.

8. Пат. 2317064 RU, МПК А61К 6/00. Способ определения защитного действия покрытия капсул от содержимого желудка. Зарегистрирован в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 20.04.2008. Патентообладатели ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора, ГУ НИИ МП РАМН.

9. Пат. 2317065 RU, МПК А61К 6/00. Способ определения целевой доставки в желудочно-кишечном тракте твердой лекарственной формы с защитным покрытием. Зарегистрирован в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 20.02.2008. Патентообладатель коллектив авторов.

10. Пат. 2322506 RU, МПК C12Q 1/02. Способ определения защитного действия покрытия капсул для штамма Bifidobacterium adolescentis MC42 от содержимого желудка. Зарегистрирован в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 20.04.2008. Патентообладатели ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора, ГУ НИИ МП РАМН.

Результаты исследований использованы в ОКБ А (г. Йошкар-Ола) при разработке и испытаниях аквабиодиспергатора на базе плоских двухсторонних индукторов, а также ОНОПБ (п. Восточный) при отработке промышленной технологии получения препаратов ветеринарного и медицинского назначения. Акты внедрения от 26 ноября 1991 г. и 22 октября 1992 г.

Экспериментальная серия комплексного биопрепарата КИП и B. adolescentis МС-42 прошла успешные доклинические испытания при лечении больных ОКИ обезьян в питомнике ГУ НИИ медицинской приматологии РАМН (г. Сочи - Адлер) под руководством академика РАМН, профессора Б.А. Лапина и доктора медицинских наук, профессора Э.К. Джикидзе.  Акт о доклинических испытаниях от 9 апреля 2009г.

Методика доклинических испытаний биопрепаратов, разработанная в ходе выполнения работы совместно с сотрудниками ГУ НИИ медицинской приматологии РАМН, легла в основу разработки «Новые алгоритмы доклинических испытаний неинъекционных иммунобиологических препаратов и БАД», награжденной серебряной медалью VII Московского международного салона инноваций и инвестиций на ВВЦ (Москва) в 2007 г.

Разработан лабораторный регламент приготовления комплексного биопрепарата КИП и B. adolescentis МС-42.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Разработанная универсальная технология приготовления сухих энтеральных биопрепаратов позволяет перерабатывать жидкие биологические субстанции различной природы и основана на переводе субстанций в устойчивое микрокапельное состояние в виде высокодисперсного порошка, что, в свою очередь, позволяет использовать различные интенсивные, в том числе и комбинированные, способы обезвоживания для получения сухих биопрепаратов.

2. Структурный компонент препарата – аэросил оказывает защитный эффект, проявляющийся в ограничении доступа к сухому биокомпоненту паров воды из воздуха и агрессивных составляющих желудочного и кишечного соков, в результате чего препарат приобретает повышенную устойчивость к неблагоприятным факторам пребывания в атмосфере воздуха и прохождения желудочно-кишечного тракта. 

3. Концепция разработки биопрепаратов нового поколения для коррекции дисбиотических нарушений в микробиоценозе желудочно-кишечного тракта базируется на конструировании комплексных препаратов на основе сочетания обогащенных иммуноглобулиновых комплексов типа КИП с микробными пробиотиками, в совокупности обладающими широким спектром и высоким уровнем антагонистической активности в отношении как патогенных, так и условно-патогенных возбудителей заболеваний.

Апробация работы:

Диссертация апробирована на заседании Ученого Совета ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора 28 апреля 2009 г. протокол № 4.

Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на VII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (г. Москва, 2000); VIII съезде Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (г.  Москва, 2002); Международной научно-практической конференции памяти Г.И. Гончаровой «Пробиотические микроорганизмы – современное состояние вопроса и перспективы использования» (г. Москва, 2002); IX Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (г. Москва, 2002); 1-м международном Конгрессе «Биотехнология – состояние и перспективы развития» (г. Москва, 2002); Третьей международной конференции, посвященной 80-летию института имени Пастера, «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями» (г. Санкт-Петербург, 2003); II-м Московском международном Конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (г. Москва, 2003); Научно-практической конференции «Иммуноглобулиновые препараты энтерального и внутривенного применения» (г. Москва, 2003);  XI Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (г. Москва, 2004); Международной конференции «Пробиотики, пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания. Современное состояние и перспективы» (г. Москва, 2004); Симпозиуме «Лабораторные приматы для решения актуальных проблем медицины и биологии» (г. Москва, 2004); Третьей международной конференции «Высокие медицинские технологии XXI века» (г. Бенидорм, Испания, 2004); Межрегиональной научно-практической конференции «Актуальные вопросы совершенствования технологии производства и переработки продукции сельского хозяйства» (г. Йошкар-Ола, 2005); Всероссийской научной конференции «Перспективные направления использования лабораторных приматов в медико-биологических исследованиях» (г. Сочи-Адлер, 2006); Всероссийской конференции, посвященной 75-летию со дня открытия Чувашской государственной сельскохозяйственной академии (г. Чебоксары, 2006); IX съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (г. Москва, 2007); Международной научной конференции «Фундаментальные и прикладные проблемы медицины и биологии в опытах на обезьянах» (г. Сочи-Адлер, 2007); Юбилейной Всероссийской научно-практической конференции "Научное обеспечение противоэпидемической защиты населения" (г. Н.Новгород, 2009).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 60 печатных работ, в том числе: 7 - в изданиях, рекомендованных ВАК Российской Федерации, 6 - в периодических изданиях, 4 - в сборниках научных трудов, 32 - в материалах конференций, разделы в 1 монографии, 10 патентов РФ на изобретения.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на русском языке и состоит из введения, 8 глав, заключения, выводов, списка литературы и приложения. Общий объем диссертации 271 страница. Работа иллюстрирована 43 таблицами и 41 рисунком. Список литературы включает 474 работы, в том числе 378  - отечественных и 96 - иностранных авторов. 

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Материалы. В качестве модельного микроорганизма использовали облигатные аэробные бактерии  Serratia marcescens ВКМ-851 (Всесоюзная коллекция микроорганизмов, Пущино). В исследованиях использовали также:  Entherococcus (Str.) faecium ГНКИ-27 – биокомпонент некоторых пробиотических препаратов (получен из НИИ прикладной микробиологии, Оболенск); Escherihia coli М-17 – биокомпонент пробиотического препарата Колибактерин (получен из НИИ особо чистых биопрепаратов, г. Санкт-Петербург); Bifidobacterium adolescentis MC-42 – биокомпонент пробиотического препарата Бифидин (коллекция МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского, Москва); Lactobacillus acidophilus штаммы NК1, 100аш и К3Ш24 – биокомпоненты пробиотика Ацилакт (коллекция МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского, Москва).

Для защиты коли – и бифидобактерий и лактобацилл от неблагоприятных факторов обезвоживания использовали сахарозо-желатиновую (СЖ) среду состава (% масс.): сахароза – 10, желатин пищевой – 1. Для остальных микроорганизмов – лактозо-тиомочевинную защитную среду (ЗС) состава (% масс.): лактоза – 20,0, тиомочевина – 6,6, полиглюкин – 1,5, аскорбиновая кислота – 3,6, вода дистиллированная – 68,3.

В качестве компонента разрабатываемого биопрепарата использовали комплексный иммуноглобулиновый препарат (КИП) жидкий (полуфабрикат), приготовленный в соответствии с патентом РФ № 2189833, А61К 39/395. Стабилизацию раствора КИП перед обезвоживанием осуществляли введением в белковый раствор глицина и глюкозы в концентрации соответственно 1 и 2 % от объема раствора.

Для анализа иммуноглобулиновых фракций КИП использовали моноспецифические антисыворотки к иммуноглобулинам человека – IgG, IgM и IgA (НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи), сыворотку крови человека с известным содержанием иммуноглобулинов (ППБП ЦНИИВС им. И.И. Мечникова), антисыворотку ко всем белкам плазмы крови человека (ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского).

Оценку изменения специфической активности КИП проводили с помощью диагностикума эритроцитарного сальмонеллезного О-антигенного жидкого (комплексного) по ФС 42-3408-97 (ГУП ПБП им. Г.Н. Габричевского).

Стабилизацию жидкости при получении микрокапельных порошков осуществляли гидрофобным аэросилом марки АМ-1-300 (Калуш, Украина) и R 972 (Degussa, Германия).

В качестве основных влагоемких сорбентов использовали карбоксильный катионит КБ-4П-2 с рН водной вытяжки 10,0-11,0 и окись алюминия основную с рН водной вытяжки 8,0-9,0.

Для регидратации микрокапельных порошков и полученных из них сухих биоматериалов использовали 0,85% раствор натрия хлорида с рН 5,6-5,8 с 1% Tween 20.

Животные. Испытания острой токсичности комплексного биопрепарата на основе КИП и бифидобактерий проведены на 50 беспородных белых мышах обоих полов на базе вивария ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора.

Изучение переносимости и терапевтической эффективности препарата проводили на обезьянах в клинике ГУ НИИ медицинской приматологии РАМН (г. Сочи - Адлер). В исследованиях использовали обезьян вида макак резус и макак яванский весом 1,0-9,5 кг в возрасте от 1,1 до 20 лет. Использовано 5 здоровых и 29 больных острой кишечной инфекцией с диарейным синдромом обезьян.

Микробиологические методы

Для глубинного выращивания S. marcescens применяли питательную среду (ПС) на основе гидролизата рыбо-костной муки (РКМ) с 0,8 % глюкозы. Культивирование E. faecium и E. coli проводили в ПС на основе ферментативного гидролизата казеина (ФГК). Накопление клеток B. adolescentis осуществляли в казеиново-дрожжевой (КД-5) среде и модифицированной среде КД-5с. Накопление клеток L. acidophilus проводили в гидролизатно-молочной (ГМ) среде. Питательные среды готовили в отделе питательных сред ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора.

Культивирование S. marcescens осуществляли в стеклянных колбах вместимостью 500 и 750 см3 при коэффициенте заполнения 0,2-0,3, частоте встряхивания 200-250 мин-1 в термостатируемой качалке G24 (New Brunswick Scientific, США).  Температура и длительность процесса выращивания S. marcescens составляли (29±1)С и 24-30 часов соответственно. Энтеробактерии культивировали без аэрации при (36,6±0,5)С  в течение 15-17 часов. Биомассу B. adolescentis МС-42 и смеси трех штаммов L. acidophilus выращивали в лаборатории биологии бифидобактерий ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора (рук. лаб., д.б.н. А.М. Амерханова).

Концентрирование выращенной биомассы S. marcescens, E. faecium и E. coli осуществляли гравитационным разделением в центрифугах MK-2 (MSE, Великобритания) и T-24D (MLW, Германия),  а также микрофильтрацией с использованием установок H1P100-43 (Amicon, США) и отечественного лабораторного аналога с половолоконным патроном типа АР-2 (Кириши). Бифидобактерии и лактобациллы использовали без концентрирования.

Подготовку биомассы к обезвоживанию проводили смешением  концентрированной биосуспензии соответствующих микроорганизмов с защитной средой в массовом соотношении 2:1.

Акустическое воздействие на клетки микроорганизмов осуществляли с использованием ультразвуковой ванны Laborette (Fritch, Германия).

Ресуспендирование проб биоматериалов осуществляли с использованием программируемого ротационного шуттель-аппарата Multi RS-60 (Вектор-Бест, Россия) не менее 30 мин.

Концентрацию энтеробактерий в материалах определяли по росту в пробирках с жидкой питательной средой методом последовательных десятикратных разведений. Количество жизнеспособных энтеробактерий в пробе препарата рассчитывали как произведение числа живых особей в последнем разведении на 10 в степени номера предпоследней пробирки (Бевз Н.И., 1991). Биологическую концентрацию живых аэробных микроорганизмов в материалах определяли методом Пастера-Коха путем высева проб материалов на плотные питательные среды (Перт С. Дж., 1978).

Жизнеспособность микроорганизмов после воздействия различных факторов оценивали по их выживаемости. Выживаемость микроорганизмов в процессе хранения материалов определяли по отношению концентрации живых клеток в хранившихся материалах к таковой в свежеприготовленных.

Иммунохимические методы

Преципитацию в геле по Оухтерлони проводили в 1 % агаре с использованием моноспецифических антиcывороток к  IgG, IgA, IgM  человека (Фримель Г.Ф., 1987).

Иммуноэлектрофорез проводили в 1,5 % агаре на стеклянной пластине размером 912 см в аппарате Multifor (LKB, Швеция) в течение 1,0-1,5 ч при силе тока 40 мА и напряжении 200 В (Чернохвостова Е.А. с соавт., 1984).

Определение концентрации иммуноглобулинов в образцах проводили методом радиальной иммунодиффузии по Манчини в 1% агарозе (Чернохвостова Е.А. с соавт., 1984).

Определение антисальмонеллезной активности осуществляли в реакции пассивной гемагглютинации с помощью соответствующих диагностикумов согласно инструкциям производителя.

Физико-химические методы

Концентрацию белка в образцах определяли спектрофотометрически на CФ-46 (ЛОМО, РОССИЯ) или КФК-3-01 (ЗОМЗ, Россия) по оптической плотности исследуемого белкового раствора при длине волны 280 и 260 нм.

Концентрацию ионов водорода в дистиллированной воде, различных растворах, защитных средах, суспензиях микроорганизмов измеряли с помощью рН-метров Seven Easy и МР 225 (Mettler Toledo, Швейцария).

Физические методы

Массы навесок материалов измеряли с использованием весов лабораторных 1212MP (Sartorius, Германия), Adventurer (Ohaus, Швейцария) и аналитических WA-35 (PRLT, Польша), Adventurer Pro (Ohaus, Швейцария).

Относительную и остаточную влажность различных материалов определяли гравиметрически, выдерживанием навесок в сухо-жаровом шкафу при 105С до постоянной массы по ГОСТ 24061-80.

Относительную влажность воздуха в помещениях измеряли гигрометром М-19 по ТУ 25-04-1862-72.

Вязкость растворов и биосуспензий определяли, используя стеклянные капиллярные вискозиметры типа ВПЖ, по методике изготовителя. Величину вязкости рассчитывали по известной формуле с учетом приведенной в паспорте постоянной вискозиметра. Плотность жидкостей измеряли с помощью набора стеклянных ареометров, а поверхностное натяжение - методом отрыва кольца (Тутова Э.Г. с соавт., 1987).

Изотермы сорбции-десорбции Брунауэра, Эммета и Теллера (БЭТ) паров воды сухими и влажными материалами строили по результатам определения равновесной влажности материалов при заданных значениях относительной влажности окружающей среды. Навески материалов выдерживались в эксикаторах над растворами серной кислоты различной концентрации до прекращения изменения массы навесок (Тутова Э.Г. с соавт., 1987).

Фракционно-дисперсный состав распылов суспензий и порошкообразных материалов определяли лазерным анализатором размеров частиц Master Particle Sizer M3.1 (Malvern Instruments, Великобритания) и микроскопией с использованием Ienamed 1 (Iena, Германия) по методикам производителей. 

Стерилизацию питательных, защитных и разводящих сред осуществляли автоклавированием их в ВК-75 (Россия) при 121С и избыточном давлении 0,11 МПа. Стерилизацию аэросила и сорбентов с одновременным обезвоживанием проводили в сухо-жаровом шкафу SUP-4 (Венгрия) и ШСВЛ-80 (Россия) при температуре 120-140С с выдержкой в установившемся тепловом режиме не менее 2 часов (Меньшиков В.В. с соавт., 2006).

Планирование эксперимента и статистическая обработка результатов

Планирование эксперимента осуществляли по Зейделю-Гауссу. При отыскании оптимума выхода по двум факторам использовали экспрессный метод (Ашмарин И.П. с соавт., 1975). 

Результаты 3-5 определений экспериментальной величины представляли средней арифметической с доверительным интервалом, рассчитанным для вероятности 95%.

Для оценки достоверности различий средних величин при сравнении независимых совокупностей вариант использовали непараметрический критерий U, фигурирующий в различных руководствах как критерий Мэнн-Уитнея (Манн-Утни), Уайта или Вилкоксона для независимых совокупностей. При сравнении совокупностей с количественными данными использовали также метод попарного сравнения сопряженных вариант, корреляционный анализ и дисперсионный анализ одно- и двухфакторных комплексов.

Исследования выполнены под руководством и личном участии автора на базе отдела № 6 ВНИИ Биохиммашпроект (НПО «Биомаш») РАО «Биопрепарат» и лаборатории медицинской биотехнологии ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора (рук. лаб. - к.т.н., с.н.с. И.Ю. Давыдкин) при содействии лабораторий биологии бифидобактерий (рук. лаб. - д.б.н. А.М. Амерханова), иммунобиологических препаратов (рук. лаб. - к.м.н. Л.И. Новикова), а также лаборатории инфекционной патологии (зав. лаб. - д.м.н., проф. Э.К. Джикидзе) ГУ НИИ медицинской приматологии РАМН (директор - академик РАМН, проф. Б.А. Лапин).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Формирование микрокапельного порошка

Известно, что вода может находиться в виде мелких капель в аэрозолях и эмульсиях, обладающих невысокой устойчивостью вследствие испарения капель или их слияния (коалесценции). Замедление испарения или предотвращение агрегации первичных капель возможно при использовании одного из факторов устойчивости дисперсных систем - структурно-механического. Если распылять жидкость в присутствии лиофобного сухого порошкообразного стабилизатора, то можно получить новый вид материала с особыми свойствами. Такой порошкообразный материал, названный микрокапельным порошком (первоначальное название - псевдосухой материал), был приготовлен нами диспергированием жидкости во взвешенный слой гидрофобного стабилизатора – наноразмерного диоксида кремния (торговая марка «Аэросил») с частицами размером 7-40 А (рис.1).

Аэросил - это ультрадисперсная гетерогенная система т/г, дисперсионной средой которой является воздух. Частицы аэросила не могут являться для капель жидкости (воды) дисперсионной средой, так как не обладают основным свойством дисперсионной среды - сплошностью. Однако это свойство имеет находящийся в агрегатах частиц аэросила и окружающий порошок воздух. Это означает, что для дисперсной фазы – микрокапель воды дисперсионной средой также является воздух, то есть налицо жидкий аэрозоль - система ж/г. Отсюда следует, что полученный материал представляет собой смешанную трехфазную микрогетерогенную дисперсную систему типа т-ж/г, в которой наноразмерная твердая дисперсная фаза (аэросил) является стабилизатором микрокапельного состояния жидкой дисперсной фазы.

Рис.1 – Фотография глобулы аэросила А-300, полученная методом просвечивающей электронной микроскопии (Нужный А.Ю. с соавт., 2007).

Получаемый вышеуказанным способом материал имеет вид порошка (рис. 2) и обладает присущими порошкам свойствами: сыпучестью (текучестью), насыпной плотностью, конусообразованием и сопротивлением сдвигу. Такие свойства, как слипаемость, гигроскопичность и смачиваемость у него отсутствуют. Микроскопический анализ этого материала показал, что жидкость не сорбирована частицами гидрофобного аэросила и находится в виде микрокапель в окружении (в слое) этих наноразмерных частиц (рис. 3), предотвращающих столкновение капель жидкости и их коалесценцию.  При этом все капли покрыты слоем аэросила и часто имеют сферическую форму.

В серии предварительных экспериментов была проведена оценка возможности получения микрокапельного порошка в устройствах различных типов. В исследованиях использовали лабораторные установки на основе гидравлической, пневматической, гидромеханической плунжерной и винтовой форсунок, а также гомогенизатор, дисковый распылитель и электромагнитный диспергатор (ЭМД). Пригодными для получения микрокапельных порошков оказались устройства, реализующие механическое диспергирование жидкости. Из них, по совокупности характеристик удобства обслуживания, легкости герметизации рабочей зоны и возможности проведения непрерывного процесса, нами был выбран ЭМД (рис. 4).

Рис. 2 - Микрокапельный порошок бифидобактерий

Рис. 3 - Порошок на предметном стекле микроскопа (увеличение 100)

Электромагнитный диспергатор имеет следующие конструктивные особенности. Электромагнитная система ЭМД представляет собой два параллельно расположенных линейных индуктора, каждый из которых создает бегущее магнитное поле. При достаточном сближении индукторов бегущие навстречу друг другу поля начинают взаимодействовать и образуют вращающееся магнитное поле. Если поместить в зазор

Рис. 4 - Лабораторный электромагнитный диспергатор.

1 - несущая платформа; 2 - линейные индукторы; 3 - рабочая камера; 4 - ферромагнитные частицы; 5 - пульт управления; 6 - маховик фиксирующего механизма.

между индукторами в зоне действия магнитного поля выполненную из немагнитного материала рабочую камеру с изготовленными из любого магнитовосприимчивого материала рабочими телами (ФМТ), то эти тела под действием магнитного поля будут магнитоожижены - придут в интенсивное поступательно-вращательное движение с траекторией, соответствующей траектории движения поля.

Существенной особенностью магнитоожиженного слоя ФМТ является то, что он может быть создан как при нормальном, так и избыточном давлении и разрежении, в жидкой, газообразной и гетерогенной среде. При этом в аппарате отсутствуют механические приводы, валы  и динамические уплотнения, что обеспечивает возможность полной герметизации реакционной зоны. Такой способ обработки материалов позволяет эффективно осуществлять различные технологические процессы (эмульгирование, диспергирование, экстрагирование, дезинтеграцию, ферментативный гидролиз и др.) и их комбинации, массообмен в которых протекает на микроуровне. Заложенная конструкцией возможность регулирования интенсивности воздействия ферромагнитных тел за счет варьирования целого ряда параметров (напряженность магнитного поля, масса, размеры и количество ФМТ и др.), позволяет подбирать щадящие режимы обработки материалов, содержащих биологическое начало.

Использованный нами технологический подход к обоснованию размеров микрокапель в порошке позволил прийти к следующему. Капли в порошке покрыты одним или несколькими слоями аэросила. Следовательно, скорость их испарения будет заведомо меньше, чем капель такого же размера в воздухе, так как потребуется время на диффузию паров воды от поверхности капли через «шубу» аэросила к поверхности частицы порошка. Таким образом, для увеличения скорости испарения и интенсификации процесса высушивания необходимо стремиться получать порошок с минимально возможным размером капель.

В результате проведения серии экспериментов было показано, что независимо от сочетания режимных параметров процесса получения порошка, массового соотношения аэросила и жидкости, вида (вода, растворы солей, белков, суспензии микроорганизмов) и физико-химических свойств диспергируемых жидкостей, распределение капель по размерам в получаемых порошках подчиняется логарифмически нормальному закону. Минимальный медианный диаметр микрокапель в порошках изменяется в диапазоне 20-40 мкм.

Результаты исследований данного раздела работы защищены патентами на изобретение: СССР № 1831001 SU, B01F 13/08 от  13.10.1992; РФ № 2026730 RU, B01F 13/08 от 29.01.1995.

Исследование технологических параметров переработки системы аэросил-биосуспензия в электромагнитном диспергаторе

Экспериментально установлено, что система аэросил-жидкость при диспергировании жидкости в присутствии аэросила в рабочей камере аппарата может иметь три состояния: первое – микрокапельный порошок, второе – паста, третье – пена.

Порошкообразное состояние системы можно характеризовать технологическим параметром τmin – продолжительностью процесса, при которой достигается наименьший медианный диаметр микрокапель. Для характеристики второго состояния можно использовать технологический параметр τп – длительность процесса переработки компонентов, при которой система переходит в пастообразное состояние. Между τп и τmin при переработке в ЭМД композиции аэросил-жидкость существует прямая связь (рис. 5). На характер этой связи не оказывают влияния ни физико-химические характеристики биосуспензий, ни режимные параметры работы электромагнитного диспергатора.

D50 

Рис. 5 - Связь между длительностью обработки τ и медианным диаметром микрокапель D50.

 

τmin  τ

τn 

Как указывалось выше, предложенный способ обработки материалов позволяет осуществлять различные технологические процессы, в том числе с использованием субстанций, содержащих биологическое начало. Причем, это начало может быть разной природы (ферменты, клетки микроорганизмов, включая вегетативные формы, спорообразующие бациллы и вирусы, и др.). Так, нами показаны положительные результаты при дезинтеграции клеток дрожжей с экстракцией белка щелочью, при получении устойчивых суспензий Bacillus thuringiensis, сухой высокодисперсной вакцины вируса болезни Ньюкасла, высокодисперсной эмульсии противоящурной вакцины и др. Процесс получения микрокапельного порошка так же, как и эмульсии, основан на диспергировании жидкости (кинетический фактор устойчивости) с тем отличием, что в качестве структурно-механического фактора устойчивости образующихся микрокапель применяют не жидкий стабилизатор, а сухой порошок с наноразмерными частицами. Поскольку при получении микрокапельного порошка для дробления жидкости используется кинетическая энергия вращающихся с большой скоростью ферромагнитных рабочих тел, необходимо было оценить степень их возможного влияния на инактивацию биологического начала в диспергируемых суспензиях.

Из данных литературы известно, что инактивация микроорганизмов независимо от их вида в результате действия интенсивных механических нагрузок,  термических факторов, неблагоприятных условий хранения соответствует реакции первого порядка и в графическом виде изображается экспоненциальной кривой. При логарифмировании величины выживаемости и построении графика в полулогарифмических координатах lnB –   кинетика приобретает вид прямой линии (рис. 6). Эта закономерность использована нами для разработки упрощенной методики с целью исключения необходимости проведения полномасштабных исследований  в случае перехода с одного вида перерабатываемого микроорганизма на другой. Суть ее заключается в следующем. В соответствии с вышеописанным способом получают микрокапельный порошок диспергированием в присутствии аэросила биомассы исследуемого живого микроорганизма. При достижении длительности процесса, большей τmin и меньшей τп (например, при величине τп равной 2 мин, можно выбрать 1,5 мин), останавливают процесс, отбирают пробу порошка и определяют выживаемость микроорганизма. Затем в координатах lnB – строят график, проводя прямую линию через две точки: первую – натуральный логарифм выживаемости, определенной в опыте при заданной длительности процесса; вторую – 4,6 (натуральный логарифм 100 % выживаемости) при длительности обработки 0 мин (см. рис. 6). По построенной прямой выбирают продолжительность процесса, обеспечивающую полную выживаемость или приемлемую инактивацию микроорганизма. 

Результаты определения по этой методике устойчивости некоторых энтеральных микроорганизмов к механическим нагрузкам, имеющим место при приготовлении микрокапельных порошков в ЭМД, представлены на рис. 6.

Рис. 6 - Изменение выживаемости энтеральных микроорганизмов с увеличением длительности обработки в рабочей камере аппарата: 1 - L. acidophilus (смесь штаммов NК1, 100аш и К3Ш24); 2 - E. coli М-17; 3 - E. faecium ГНКИ-27.

Из данных рис. 6 следует, что наименьшей устойчивостью к воздействию двигающихся в рабочей камере аппарата с большой скоростью ферромагнитных тел обладают лактобациллы. Наиболее механоустойчивым является энтерококк. Клетки эшерихий занимают промежуточное положение.

Предложенная методика может применяться не во всех случаях, например, при наличии факторов, защищающих клетки микроорганизмов от повреждения и искажающих картину инактивации. Поскольку исследуемый нами процесс основан на диспергировании жидкой биомассы ферромагнитными рабочими телами, то при получении микрокапельных порошков штаммов бифидобактерий, образующих межклеточный матрикс, мы столкнулись с эффектом увеличения концентрации бактериальных клеток (табл. 1).

Таблица 1 – Зависимость концентрации клеток B. adolescentis МС-42 от длительности диспергирования и исходного их содержания в биомассе

Длительность обработки в ЭМД, мин

Концентрация клеток B. adolescentis МС-42 (КОЕ/мл) в порошке при начальном содержании в биомассе

1107

1108

1,4109

0,5

1107

3108

2109

1,0

2107

4108

4109

1,5

3107

4108

4109

2,0

8107

5108

5109

Очевидно, дробление биосуспензии ферромагнитными телами в нашем случае, как и в случае обработки ими объемов культуральной жидкости, приводит к разрушению бифидопласта и высвобождению отдельных жизнеспособных клеток, способных образовывать колонии микроорганизмов. Величина возрастания количества жизнеспособных клеток B. adolescentis МС-42 зависела от исходного содержания их в биомассе перед приготовлением микрокапельного порошка: чем ниже концентрация бактерий, тем выше был выход их после диспергирования (табл. 1). Максимальное увеличение концентрации бифидобактерий составило 8 раз.

С целью определения кинетики инактивации бактериальных клеток при получении МП суспензию B. adolescentis МС-42 для разрушения межклеточного матрикса подвергали предварительной обработке ультразвуком напряженностью 10 Вт/см в течение 20 мин. По данным литературы, такой режим обработки приводил к снижению вязкости культуральной жидкости и увеличению числа КОЕ почти на порядок, не оказывая негативного воздействия на клетки бифидобактерий. Обработанную биомассу использовали для приготовления микрокапельного порошка. Величины выживаемости клеток на заданные моменты обработки в рабочей камере диспергатора логарифмировали и строили график (рис. 7), аналогичный рис. 6.

Рис. 7 – Выживаемость обработанных ультразвуком клеток B. adolescentis МС-42 при получении микрокапельного порошка в ЭМД.

Как следует из данных рис. 7, клетки бифидобактерий, как и лактобациллы, весьма чувствительны к воздействию рабочего органа ЭМД и могут быть отнесены к механолабильным микроорганизмам. 

Дальнейшими исследованиями было показано, что сывороточные иммуноглобулины (IgG, IgA и IgM) в растворе обладают большей устойчивостью к воздействию ферромагнитных тел, чем все ранее исследованные микроорганизмы (рис. 8). Только к 2 мин процесса обработки появляется тенденция к снижению активности антител (антисальмонеллезная активность составляет 1/160-1/320 в титрах РПГА). При достижении длительности диспергирования 2,5 мин антисальмонеллезная активность падает на одно двукратное разведение до 1/160. Этот факт дает большую свободу в выборе оптимального режима получения микрокапельного порошка раствора КИП.

Рис. 8 - Инактивация иммуноглобулинов IgG, IgA и IgM при получении микрокапельного порошка 6% раствора КИП (для наглядности антисальмонеллезная активность выражена в единицах, обратных титру РПГА).

Таким образом, в результате проведенных исследований был предложен способ и техническое средство для перевода биологических жидкостей в микрокапельное состояние, позволяющие с одинаковой эффективностью получать микрокапельные порошки биомассы микроорганизмов различных видов и растворов иммуноглобулинов. Выбранный режим переработки обеспечивал практически полное сохранение жизнеспособности микробных клеток и специфической антительной активности.

Показанная возможность приготовления МП на основе биологических субстанций различной природы может рассматриваться как первый элемент универсальности разработанной технологии.

Исследование процесса сорбционно-контактного обезвоживания микрокапельных порошков

Необходимость собственной разработки процесса была вызвана отсутствием в литературе данных о возможности применения метода сорбционно-контактной сушки для обезвоживания нового вида биологических материалов, каковыми являются микрокапельные порошки.

По данным литературы, механизм контактно-сорбционного массообмена определяется динамикой сорбции, которая, в свою очередь, является функцией ряда параметров (влагоемкости сорбента, длительности контакта материала с сорбентом, поверхности сорбции и др.). Учитывая это, применение для обезвоживания микрокапельных порошков сорбционно-контактного способа представляется перспективным по следующим соображениям: 1). развернутая поверхность жидкости в порошке, составляющая по нашим данным 0,04 – 0,09 м2 в 1 см3 порошка, может обеспечить большую площадь контакта с сорбентом; 2). сорбент будет являться одновременно наполнителем – компонентом готовой формы препарата.

Качественная оценка различных материалов, применение которых в виде сорбентов целесообразно с позиций технологии, физико-химического сродства к обезвоживаемому материалу и экономических соображений, основывается на сравнительном анализе их сорбционной емкости (влагоемкости). В результате экспериментального сопоставления ряда сорбентов по этому параметру, а также способности образовывать каркас – пространственную систему из сферических зерен (структурный элемент препарата), близости значений насыпной и утрясочной плотностей, механической прочности в сухом и увлажненном состоянии, величине рН, способности к неоднократной дегидратации сухим жаром при температуре до 200С в течение 2 часов нами были выбраны: для исследований на первом этапе катионит КБ-4П-2, и для приготовления комплексных биопрепаратов микрогранулированная окись алюминия основная (табл. 2).

Таблица 2 – Соответствие сорбентов предъявляемым требованиям

Параметр и его величина

Соответствие параметра требуемой величине для сорбентов

Цеолит 5А

Цеолит 13Х

Катионит КБ-4П-2

Катионит

КУ 8×2

Окись алюминия

Аэросил

А-300

МКЦ

Актив-ный

уголь

Влагоемкость (при φ=10%),

≥ 5 %

+

+

+

+

+

+

+

+

Диаметр гранул,

100 – 400 мкм

-

-

+

+

+

-

+

-

Насыпная плотность, 

≥ 0,5 г×см-3

-

-

+

+

+

-

-

-

Утрясочная плотность, 

≥ 0,6 г×см-3

-

-

+

+

+

-

-

-

Истираемость,

≤ 0,9

-

-

+

+

+

-

-

-

Величина рН,

≥ 8,0

-

-

+

-

+

-

-

-

Температура сушки, 200 С

+

+

+

-

+

+

-

+

Включение в ГФ XI

-

-

-

-

+

+

+

+

В результате обоснования методического подхода к обезвоживанию микрокапельных порошков сорбционно-контактным способом установлено следующее. Изучение ксероустойчивости S. marcescens, используемой рядом исследователей в качестве модели вегетативных форм микроорганизмов, в микрокапельном порошке методом бесконтактного сорбционного массообмена в атмосферных условиях показало ее низкую дегидратационную устойчивость и невозможность достижения удовлетворительной выживаемости этих бактерий при высушивании без введения защитных сред (ЗС). Далее оценивали влияние на выживаемость модельного микроорганизма S. marcescens ВКМ-851при сорбционно-контактной сушке вариантов состава лактозо-тиомочевинной (ЛТ) защитной среды, успешно применяемой при сублимационном обезвоживании, и соотношения масс защитной среды и биосуспензии. Введение в состав ЛТ пептона или  глицерина, замена ЛТ на водную суспензию каолина, уменьшение соотношения биосуспензии и защитной среды до 2:0,5 или увеличение этого соотношения до 2:1,5 не дали положительных результатов. Лучшие результаты по выживаемости клеток S. marcescens в процессе высушивания и последующего хранения препаратов в различных температурно-временных режимах достигались при использовании лактозо-тиомочевинной защитной среды без вариаций ее состава и соотношении масс биосуспензии и защитной среды 2:1.

Важным параметром процесса сорбционно-контактной сушки, влияющим на степень дегидратации биологического начала, является соотношение количества реагирующих компонентов - сорбента и обезвоживаемой биомассы, заключенной в микрокапельном порошке. Это соотношение получило название коэффициента сорбционного обезвоживания (КСО). В результате проведения следующей серии экспериментов не было отмечено существенных различий в выживаемости клеток модельного микроорганизма при высушивании микрокапельного порошка различными количествами смолы КБ-4П-2 (табл. 3, Fp<Fт при р=0,05).

Таблица 3 – Дисперсионный анализ выживаемости бактерий S. marcescens ВКМ-851 при варьировании величины КСО

Величина КСО

Выживаемость клеток (%) в опыте

Критерий значимости

1

2

3

расчетный

табличный при р=0,05

2

37,3

48,0

66,9

0,16

3,29

3

50,5

48,2

53,8

4

38,4

47,5

76,8

5

64,4

48,5

58,5

Однако величина КСО, определяя влажности сорбента и порошка,  оказывала существенное влияние на гибель клеток модельного микроорганизма при хранении препаратов. Так, в результате хранения в течение 6 месяцев при температуре 2-8С в препарате с КСО=2 осталось жизнеспособными только 34,5% клеток S. marcescens, в препарате с КСО=3 – 65,8%, в препаратах с КСО от 4 и выше – гибели клеток не наблюдалось.

При контакте сорбента с обезвоживаемым микрокапельным порошком выделяется некоторое количество тепла, о чем свидетельствует повышение температуры смеси до 25-30С, даже в случае применения охлажденных до отрицательных температур емкости и сорбента (рис. 9). Проведенная в серии экспериментов оценка эффективности вариантов отвода тепла от препарата через поверхность реактора  показала, что для повышения выживаемости бактерий реакционную емкость с сорбентом необходимо предварительно охлаждать до температуры минус (18-22)С. Смешение  сорбента с порошком следует осуществлять равномерным вращением емкости без встряхивания и других интенсивных механических воздействий.

Рис. 9 – Термограмма смешения МП S. marcescens ВКМ-851с сорбентом КБ-4П-2, охлажденным до минус 22С.

Другой важной характеристикой исследуемого процесса является динамика поглощения влаги сорбентом, в свою очередь определяющая изменение остаточной влажности высушиваемого материала и длительность технологического процесса. Как следует из результатов исследования динамики сушки МП E. faecium ГНКИ-27 катионитом КБ-4П-2 (рис. 10), наибольшая скорость обезвоживания микрокапельного порошка (с 65,3 до 21%) и увлажнения сорбента (с 0 до 10%) наблюдается в первую минуту смешения компонентов. В нашем случае, как и в других способах сушки, это - этап удаления из МП свободной влаги, протекающий с постоянной скоростью. Затем после 1 мин смешения скорость обезвоживания начинает снижаться, и наступает период сушки с убывающей скоростью удаления влаги, когда из порошка сорбируется связанная влага. После 5 мин процесса влажность порошка и сорбента изменяется незначительно. К этому же моменту прекращается подъем температуры смеси порошка и сорбента (рис. 9). Дальнейшее смешение компонентов нецелесообразно. Окончательное перераспределение влаги в смеси происходит к 8-10 часам выдержки, которую, как правило, осуществляют при 2-8С.

Дополнительные эксперименты с S. marcescens показали, что закономерности изменения влажности микрокапельного порошка и влагопоглотителя, определяемые величиной КСО, являются общими для микроорганизмов различных видов. А дальнейшими исследованиями с использованием энтеральных микроорганизмов и раствора иммуноглобулинов установлено отсутствие влияния величины КСО в интервале от 4 до 10 на выживаемость биокомпонента (табл. 4, Fp<Fт при р=0,05). Микрокапельные порошки S. marcescens ВКМ-851, E. faecium ГНКИ-27 и E. coli  М-17 обезвоживали катионитом КБ-4П-2, а L. acidophilus (смесь штаммов NК1, 100аш и К3Ш24), B. adolescentis MC-42 и КИП – окисью алюминия.

Рис. 10 – Динамика сорбционно-контактного высушивания МП E. faecium ГНКИ-27 (1) и набора влаги смолой КБ-4П-2 (2).

Таблица 4 – Дисперсионный анализ выживаемости биокомпонентов при различных величинах КСО

Биосуспензия

Диапазон изменения

Критерий значимости

КСО

выживаемости, %*

расчетный

табличный при р=0,05

S. marcescens

2 - 5

37,3 – 76,8

0,16

3,29

E. faecium

4 - 8

64,3 – 87,0

0,05

5,14

E. coli

4 - 10

41,7 – 81,9

2,95

3,59

B. adolescentis

4 - 8

21,4 – 62,5

0,25

5,14

L. acidophilus

6 - 10

19,3 – 81,5

0,49

5,14

6% раствор КИП

4 - 8

1/80 – 1/320

1,29

5,14

*Примечание – антисальмонеллезная активность Ig в образцах МП в титрах РПГА

Таким образом, результаты проведенных исследований позволяют заключить, что закономерности протекания процесса сорбционно-контактной сушки микрокапельных порошков являются общими для биологических субстанций различной природы.

Конструирование комплексных биопрепаратов

Нами были разработаны технологии и предложен запатентованный микробно-сывороточный комплекс пробиотических микроорганизмов с КИП в виде твердых и мягких готовых форм. С целью обеспечения высокой биологической активности и защиты биологически активных веществ при изготовлении и хранении препаратов предложено включать в их состав соответствующие протективные вещества. Используя этот подход, препарат для лечения ОКИ и дисбактериоза ЖКТ конструировали на основе двух высокоактивных биокомпонентов – комплексного иммуноглобулинового препарата и штамма бифидобактерий B. adolescentis МС-42.

Комплексный иммуноглобулиновый препарат наряду с IgG содержит повышенные количества иммуноглобулинов IgM и IgA. Благодаря этому КИП отличается от коммерческих препаратов нормального иммуноглобулина более высокими титрами антител против ряда возбудителей бактериальной природы (эшерихий, шигелл, сальмонелл и других энтеробактерий) и вирусов (грипп, ротавирус, герпес и др.). КИП применяют для терапии ОКИ у детей. В последнее время показана эффективность лечения препаратом больных кишечными инфекциями взрослых,  а также перспективность использования препарата для терапии некоторых респираторных заболеваний (аденовирусной, парагриппозной и респираторно-синцитиальной вирусной инфекции). 

Раствор КИП 6% получали патентованным способом. Стабилизацию иммуноглобулинов осуществляли введением в белковый раствор глицина и глюкозы в концентрации 1 и 2 % соответственно от объема раствора. Содержание антител против сальмонелл составляло не менее 1:320 в реакции пассивной гемагглютинации, распределение иммуноглобулинов по классам  - IgG (50-75%), IgA (15-25%), IgM (15-25%). Для повышения десорбции антител раствор мог содержать до 5% ПЭГ 6000.

Штамм бифидобактерий B. adolescentis МС-42, обладает широким спектром ферментативной активности и выраженными антагонистическими свойствами против патогенных и условно-патогенных микроорганизмов. Этот штамм отличается укороченным циклом размножения и более высоким уровнем накопления биомассы по сравнению с широко используемыми в производстве штаммами вида B. bifidum.  Как и штамму B. bifidum 1, B. adolescentis МС-42 свойственна высокая природная устойчивость к антибиотикам - стрептомицину, мономицину, левомицетину, канамицину, оксациллину, полимиксину, гентамицину, бензилпенициллину, нистатину. B. adolescentis МС-42 является основой препарата Бифидин, предназначенного для лечения заболеваний желудочно-кишечного тракта, сопровождающихся нарушениями симбиотической микрофлоры и профилактики дисбиотических расстройств у пациентов групп риска (в условиях стрессовых ситуаций, после гормоно-химио-антибиотикотерапии, у участников арктических, подводных, космических экспедиций и др.). Бифидин применяют детям всех возрастов, в том числе новорождённым, подросткам и взрослым.

В экспериментах использовали культуру B. adolescentis MC-42 3 генерации на ростовой среде КД-5 с содержанием живых клеток не менее 1108 КОЕ/мл. Для защиты бифидобактерий в биомассу вводили СЖ в соотношении 2:1 по массе.

Предполагалось, что действие разработанного комплексного биопрепарата нового поколения, наряду с местным коррекционным влиянием на микрофлору патологического очага, будет направлено на быстрое купирование воспаления и санацию от возбудителя при  помощи  противомикробных антител через иммунную систему. Его применение должно обеспечить не только местное подавление патогенного начала  в очаге  воспаления, но и стимуляцию быстрой противомикробной защиты через системный иммунитет.

Результаты исследований предыдущих глав работы позволили предложить технологическую схему приготовления комплексного препарата КИП и B. adolescentis МС-42 (рис. 11). Сравнительный анализ этой схемы и технологической схемы получения сухих биопрепаратов на основе сублимационного высушивания показывает, что стадий в новой технологии меньше на 1 (3 против 4), а этапов - на 4 (6 против 10). Длительность производственного цикла с учетом выдержки препарата в течение 8-10 ч короче на 24 часа.

На первой стадии после введения протективных веществ раздельно готовили микрокапельные порошки бифидобактерий и КИП. Порошки получали в электромагнитном диспергаторе в ранее найденном оптимальном режиме. После отбора проб для определения относительной влажности, концентрации клеток бифидобактерий и антисальмонеллезной активности иммуноглобулинов, порошки биокомпонентов смешивали в соотношении 1:1 по массе.

На второй стадии осуществляли сорбционно-контактное высушивание смеси микрокапельных порошков микрогранулированной основной окисью алюминия, предварительно обезвоженной до остаточной влажности менее 1%. В металлическую реакционную емкость, охлажденную вместе с навеской окиси алюминия до температуры минус (18-22)С, засыпали такое количество смеси порошков, чтобы обеспечить соотношение массы сорбента и массы жидкости в порошках 5:1 (КСО=5). Емкость герметично закрывали и плавным вращением ее смешивали компоненты в течение 5 мин.

На третьей стадии выдерживали препарат при низкой положительной температуре. Емкость помещали в холодильник с температурой 2-8С на 8-10 часов для установления термодинамического равновесия в препарате. По истечении времени выдержки отбирали пробы из емкости для анализа физико-химических и биологических характеристик сухого препарата.

Сухой препарат имел следующие характеристики: общая концентрация белка – 55%; распределение иммуноглобулинов (%) по классам IgG:IgA:IgM - 60,1:19,6:20,3; антисальмонеллезная активность (титр РПГА) – 1:320; содержание живых бифидобактерий (КОЕ/г) – 0,2108; КСО – 5; остаточная влажность (%) – 14,5 (влажность порошка – 5,6, сорбента – 14,7).

Препарат был расфасован в твердые желатиновые капсулы № 1. Каждая капсула содержала 0,4 г препарата: 85 мг комплексного иммуноглобулинового препарата, 8,5×106 КОЕ бифидобактерий B. adolescentis МС-42 и 0,28 г основной окиси алюминия и аэросила.

       

Рис. 11 – Технологическая схема приготовления сухого препарата КИП и B. adolescentis МС-42.

В результате 12-месячного хранения препарата при температуре от 2 до 8С гибели бифидобактерий и снижения специфической (антисальмонеллезной) активности иммуноглобулинов отмечено не было. Постепенное снижение концентрации живых клеток B. adolescentis МС-42 (10-15%) и тенденция к падению специфической антительной активности появились после 16 месяцев хранения препарата.

После испытания на острую токсичность препарат был отправлен в НИИ медицинской приматологии РАМН для проведения доклинических испытаний на обезьянах.

Следующий препарат для лечения ОКИ и дисбактериоза ЖКТ конструировали на основе комплексного иммуноглобулинового препарата и биомассы, взятых в соотношении 1:1:1, штаммов NК1, 100аш и К3Ш24 L. acidophilus.

Вышеуказанные штаммы лактобацилл являются основой пробиотика Ацилакт, сферы применения которого, как в моно, - так и комбинированной терапии разнообразны. Это и лечение атопического дерматита, и нормализация микробиоценоза ороназофарингеальной области, урогенитального тракта, ЖКТ при острых кишечных инфекциях, дисбактериозах кишечника и др. При лечении больных ротавирусным гастроэнтеритом отмечена несколько лучшая клиническая эффективность лактосодержащих препаратов по сравнению с коли - и бифидосодержащими препаратами, проявлявшаяся в более быстрой нормализации стула. В ряде случаев препараты лактобацилл при санации очага инфекции и лечении поражений слизистой оболочки желудка, тонкого и толстого кишечника оказывались более эффективными, чем другие микробные препараты

С целью исключения даже гипотетической возможности нежелательного перераспределения влаги в препарате в результате изменения термодинамического состояния системы (например, при изменении температуры хранения препарата), необходимо уменьшить влажность входящего в состав препарата сорбента.

Достижение этой цели возможно двумя способами: 1 -  увеличением КСО, то есть увеличением массы сорбента для обезвоживания порошка; 2 - уменьшением влажности микрокапельного порошка перед его сорбционно-контактной сушкой. Второй способ представлялся предпочтительным, так как позволял избежать разбавления препарата сорбентом и вызываемого этим разбавлением снижения концентрации клеток микроорганизмов и иммуноглобулинов. Как показали дальнейшие исследования, реализация второго способа возможна конвективной сушкой при атмосферном давлении, легко реализуемой и не требующей сложного оборудования.

Кроме СЖ среды в производстве ацилакта широко применяется сахарозо-желатино-молочная (СЖМ) среда, содержащая дополнительно 20% стерильного обезжиренного молока. Исследование влияния вида ЗС на выживаемость лактобацилл в процессе конвективного обезвоживания в неподвижном воздухе при 25С показали, что сахарозо-желатиновая среда обеспечивает лучшую стабилизацию свойств клеток лактобацилл при конвективной сушке биомассы в микрокапельном состоянии и сорбционно-контактном досушивании порошка окисью алюминия, чем сахарозо-желатино-молочная среда.  Выживаемость клеток L. acidophilus с СЖ на этапе атмосферного обезвоживания составила 100%, а при сорбционно-контактном высушивании в процессе получения сухого препарата выжило более 70% лактобацилл. В случае использования СЖМ отмирание клеток началось уже после 2 часов  выдерживания на воздухе и через 4 часа в порошке осталось 58% жизнеспособных микроорганизмов. Досушивание порошка окисью алюминия не привело к существенной гибели клеток, и выживаемость лактобацилл составила 52,6%, что сопоставимо с результатами сублимационного высушивания этого вида микроорганизмов. В дальнейших исследованиях для стабилизации свойств лактобацилл использовали СЖ защитную среду.

Ускорение процесса испарения влаги при повышении температуры воздуха наглядно демонстрируют результаты следующих опытов с МП L. acidophilus (рис. 12).

Повышение температуры выдержки на 10С, как это видно из данных рис. 12, приводило к сокращению длительности процесса более чем в полтора раза. Если при температуре воздуха 25С влажность МП достигала заданного диапазона (25-35%) через 4 часа (31,7%, кривая 1), то при 35С это происходило через 2,5 часа (32,2%, кривая 2). С увеличением температуры воздуха еще на 10С (до 45С) интенсификация процесса составляла уже более 2,5 раз. Влажность порошка снижалась до 30,8% через 1,5 часа выдержки (кривая 3). Повышенная температура в период удаления свободной влаги практически не влияла на жизнеспособность лактобацилл. Но при приближении влажности порошка к заданному диапазону происходила гибель примерно половины жизнеспособных микроорганизмов (при 35С выживало 55,4, а при 45С - 56,3% клеток). В случае высушивания МП при 25С гибели клеток не происходило.

Рис. 12 – Кинетические кривые сушки МП L. acidophilus (смесь штаммов NК1, 100аш и К3Ш24 ) при температуре воздуха в термостате 25 (1), 35 (2) и 45С (3).

При досушивании частично обезвоженных порошков сорбционно-контактным способом наблюдалось следующее. Обезвоживание окисью алюминия порошка лактобацилл, выдерживавшегося при 25С, привело к гибели только 29% клеток. В порошке, выдерживавшемся при 35С, погибло уже 75%, а в порошке, высушиваемом при 45С – 85% клеток лактобацилл.

Очевидно, использование для конвективного высушивания МП L. acidophilus температур, превышающих 35-40С, не способствует сохранению жизнеспособности лактобацилл и нецелесообразно.

Другим эффективным вариантом интенсификации конвективного обезвоживания МП оказалась эвакуация паров воды из пространства над лотками с порошком за счет движения воздуха. Наложение низкоамплитудной вибрации также способствовало ускорению процесса.

Проведенные исследования позволили предложить следующую технологическую схему приготовления комплексного биопрепарата КИП и L. acidophilus (смесь штаммов NК1, 100аш и К3Ш24) (рис. 13).

На первой стадии раздельно получали микрокапельные порошки биокомпонентов. Для получения порошка L. acidophilus использовали культуру третьей генерации с сахарозо-желатиновой защитной средой, введенной в биомассу в массовом соотношении 1:2. Для получения порошка КИП использовали 6% раствор комплекса иммуноглобулинов трех основных классов (IgG, IgA, IgM) с защитной средой (глицин – 1%, глюкоза – 2%). Порошки получали в электромагнитном диспергаторе.

На второй стадии осуществляли высушивание микрокапельных порошков. Процесс проводили в два этапа. На первом этапе раздельно осуществляли конвективное обезвоживание микрокапельных порошков КИП и L. acidophilus. Обезвоженные до 25-35% порошки КИП и L. acidophilus смешивали в соотношении 1:1. На втором этапе проводили сорбционно-контактное высушивание смеси микрокапельных порошков микрогранулированной основной окисью алюминия, предварительно обезвоженной до остаточной влажности менее 1% и охлажденной до температуры минус (18-22)С.

На третьей стадии выдерживали препарат в холодильнике с температурой 2-8С 8-10 часов для установления термодинамического равновесия.

Сухой препарат имел следующие характеристики: общая концентрация белка – 48%; распределение иммуноглобулинов (%) по классам IgG:IgA:IgM - 60,0:18,1:21,9; антисальмонеллезная активность (титр РПГА) – 1:320; содержание живых лактобацилл (КОЕ/г) – 1,3108; КСО – 6; остаточная влажность (%) – 9,5 (влажность биокомпонента – 4,4, сорбента – 9,7). Препарат был расфасован в твердые желатиновые капсулы № 1. Каждая капсула содержала 0,3 г препарата: 100 мг комплексного иммуноглобулинового препарата, 1,0×107 КОЕ L. acidophilus (смесь штаммов NК1, 100аш и К3Ш24) и 0,15 г основной окиси алюминия и аэросила.

Рис. 13 – Технологическая схема приготовления сухого препарата КИП и L. acidophilus (смесь штаммов NК1, 100аш и К3Ш24).

  В результате 12 месячного хранения препарата при температуре от 2 до 8С снижения концентрации лактобацилл и специфической (антисальмонеллезной) активности иммуноглобулинов не отмечено.

Подобранные режимы технологической переработки обеспечивают полное сохранение специфической активности иммуноглобулинов и 90-100% жизнеспособности L. acidophilus на стадии приготовления МП, а также отсутствие снижения антительной активности и выживаемость лактобацилл до 70% на стадии двухэтапного высушивания.

Показанная возможность одно- или двухстадийного обезвоживания МП на основе биологических субстанций различной природы может рассматриваться как второй элемент универсальности разработанной технологии.

Результаты исследований данного раздела работы защищены патентами РФ на изобретение: № 2161887 RU, A23D 9/00 от 20.01.2001; № 2164765 RU, А23L 1/30 от 10.04.2001; № 2240136 RU, А61К 39/395 от 20.11.2004; № 2247578 RU, А61К 39/395 от 10.03.2005; № 2371200 RU, А61К 39/395 от 27.10.2009.

Исследование защитных свойств структурного компонента препарата

Одним из основных недостатков биопрепаратов, получаемых сублимационным высушиванием, является их высокая гигроскопичность, приводящая к увлажнению препаратов при их пребывании в атмосфере (на воздухе) даже с невысокой относительной влажностью. Это привело к необходимости разработки специальных приемов, предотвращающих увлажнение сухой микробной биомассы в процессе технологической переработки, и в целом к усложнению и удорожанию технологии приготовления дозированных форм биопрепаратов.

Результаты оценки гигроскопичности сухого биопрепарата на примере высушенного микрокапельного порошка E. faecium ГНКИ-27, проведенной бесконтактным сорбционным массообменном по методике, аналогичной определению S-образных изотерм сорбции Брунауэра, Эммета и Теллера влагопоглотителей, показали следующее (рис. 14). Аэросильная оболочка, затрудняя диффузию паров воды из окружающей среды, предохраняет сухую биомассу стрептококка в порошке от увлажнения. В диапазоне средней относительной влажности воздуха 20-60% влажность клеток не превысила 10%. С увеличением влажности среды до 80% влажность порошка поднялась до 14,8%, в то время как лиофилизированная биомасса увлажнилась до 30,2%.

Дополнительные эксперименты, проведенные с микрокапельными порошками и сублимационно высушенной  биомассой S. marcescens с ЛТ защитной средой и пекарских дрожжей Saсh. cerevisiae без введения защитных добавок, показали аналогичные результаты. Пониженная гигроскопичность высушенного порошка, по нашему мнению, обеспечивается аэросильной оболочкой и не зависит от вида микроорганизма и присутствия в биомассе веществ различной природы, входящих в состав ростовых сред и сред высушивания. 

Рис. 14 – Равновесная влажность препарата E. faecium при различных значениях относительной влажности среды: 1 - лиофилизированная биомасса; 2 – сухой МП.

Следовательно, требования по минимальной гигроскопичности компонентов препарата, находящихся в контакте с живым биологическим началом, могут быть снижены или вообще исключены при конструировании сухих биопрепаратов на основе микрокапельных порошков.  Отпадает также необходимость проведения некоторых специальных мероприятий, направленных на осушения воздуха и поддержание низкой относительной влажности в помещении, где осуществляются такие технологические манипуляции с сухим препаратом, как дозирование, смешение, фасовка и др., что упрощает и удешевляет технологию приготовления биопрепарата в целом.

Как уже отмечалось ранее, разработки биопрепаратов нового поколения для коррекции дисбиозов направлены на улучшение фармакокинетических характеристик (повышенная биодоступность, пролонгированность действия и др.) и обеспечение широкого спектра действия препаратов. В отличие от фармацевтических препаратов для биопрепаратов живых пробиотических микроорганизмов под биодоступностью следует понимать, по-видимому, способность лекарственной формы доставить к месту аппликации максимальное число жизнеспособных клеток от их введенного количества. С этих позиций  актуальная проблема изыскания способов защиты биологического начала от инактивирующих факторов желудочно-кишечного тракта (ЖКТ), существующая с момента создания неампулированных форм биопрепаратов, преследует цель повышения биодоступности этого начала.

Проведенными нами in vitro исследованиями с использованием жидкой биомассы, лиофилизированного препарата и высушенного микрокапельного порошка B. adolescentis МС-42 установлено следующее (табл. 5).

Таблица 5 - Выживаемость клеток B. adolescentis MC-42 в препаратах через 2 часа выдержки в испытательных растворах

Препарат

Исходное содержание  клеток в сосуде (M±m), КОЕ

Концентрация клеток (M±m, КОЕ) в сосуде после выдержки в растворе

0,1 М HCl

рН 1,15

0,1 М HCl

рН 1,15

0,1 М HCl

рН 2,5

холензима

рН 9,15

с перемеши-

ванием

без перемешивания

Жидкая биомасса

(1,2±0,8)108

0

0

(2,4±0,9)107

(1,0±0,7)107

Лиофилизирован-

ная биомасса

(3,4±1,2)107

0

0

(1,5±0,4)107

(1,8±0,9)104

Сухой микрокапельный порошок

(3,6±0,9)107

0

(3,0±0,7)104

(2,5±0,8)107

(2,3±0,5)107

После 2 часов выдержки в моделировавшем кислую среду желудка растворе соляной кислоты с рН 2,5, соответствующим нормальной кислотности желудочного сока, снижение концентрации бифидобактерий штамма МС-42 во всех препаратах в среднем происходило в пределах одного разведения. Выживаемость клеток в порошке была выше, чем в жидкой биомассе и лиофилизированном препарате. Термостатирование в растворе HCl с рН 1,15, соответствующим повышенной кислотности желудочного сока, привело к гибели всех клеток бифидобактерий жидкой и сублимированной биомассы. При этом содержание клеток в высушенном МП снизилось на 3 порядка с 107  до 104 КОЕ. Еще большее ужесточение условий эксперимента введением интенсивного перемешивания растворов соляной кислоты с испытуемыми препаратами привело к гибели клеток во всех препаратах.

Выдерживание препаратов бифидобактерий в растворе холензима, содержащем желчь, протеолитические ферменты трипсин, амилазу и липазу и моделирующем кишечный сок, показало среднее снижение концентрации клеток в жидкой биомассе штамма МС-42 на одно разведение. В лиофилизированном препарате гибель клеток составляла 3 порядка. Высушенный микрокапельный порошок во всех случаях демонстрировал наибольшую выживаемость клеток в  растворе холензима – снижение концентрации бифидобактерий находилось в пределах одного разведения.

В аналогичных исследованиях, проведенных с препаратами L. acidophilus (смесь штаммов NК1, 100аш и К3Ш24), было показано (табл. 6), что в растворе соляной кислоты с рН 2,5, соответствующим нормальной кислотности желудочного сока, гибели клеток в жидкой биомассе и порошке не происходило, а в лиофилизированном препарате независимо от времени экспозиции гибель лактобацилл происходила в пределах 1 порядка. При выдерживании в растворе холензима снижение концентрации клеток жидкой биомассы было также в пределах 1 порядка, а в лиофилизированной биомассе отмирал примерно 1 порядок клеток. В сухом МП гибели лактобацилл не наблюдалось. 

Таблица 6 - Выживаемость L. acidophilus (смесь штаммов NК1, 100аш и К3Ш24) в препаратах при выдерживании в испытательных растворах

Препарат

Исходное содержание  клеток в сосуде (M±m), КОЕ

Концентрация клеток (M±m, КОЕ) в сосуде после выдержки в растворе

0,1 М HCl с рН 2,5

холензима с рН 9,15

1 ч

2 ч

1 ч

2 ч

Жидкая биомасса

(3,2±1,5)108

(3,0±1,2)108

(2,8±1,4)108

(1,3±1,1)108

(1,2±1,0)108

Лиофилизирован-ная биомасса

(1,2±1,0)108

(6,3±0,9)107

(6,7±0,7)107

(2,2±0,5)107

(1,5±0,9)107

Сухой микрокапельный порошок

(1,5±0,6)107

(1,4±0,7)107

(1,6±1,1)107

(1,3±0,8)107

(1,3±1,0)107

Таким образом, защитный эффект аэросильной оболочки проявился и в затруднении доступа к поверхности частиц сухого биокомпонента агрессивных составляющих модельных желудочного и кишечного соков. Этот эффект был более выражен в растворе кислоты с меньшим значением рН, соответствующим повышенной кислотности желудочного сока, и при выдерживании препаратов в модельном кишечном соке.

В аналогичных экспериментах с лиофилизированным и высушенным из микрокапельного состояния раствором комплексного иммуноглобулинового препарата  защитный эффект аэросильной оболочки не удалось подтвердить вследствие высокой устойчивости антител к действию раствора HCl с рН 2,5, соответствующим нормальной кислотности желудочного сока, и раствора желчи с протеолитическими ферментами при выбранной длительности экспонирования (рис. 15).

Рис. 15 – Иммуноэлектрофореграмма препаратов КИП после выдержки в испытательных растворах - исходный лиофилизированный КИП (1) после термостатирования в течение 2 часов в растворе HCl (2) и в растворе холензима (3);  сухой МП КИП после термостатирования в течение 2 часов в растворе HCl (4) и в растворе холензима (5). 

Результаты этого эксперимента полностью согласуются с результатами исследований И.В. Борисовой с соавторами (1986 г) и опровергают устоявшееся представление о «переваривании» иммуноглобулинов в желудке.

По данным литературы, желудочный сок обезьян в норме имеет рН 1,5-3,0 и по химическим показателям и составу аналогичен желудочному соку здоровых людей. Это позволяет моделировать на приматах прохождение испытуемой лекарственной формой верхних отделов ЖКТ человека и примерно оценить его длительность с тем, чтобы определить необходимость принятия мер по защите действующего вещества от агрессивных составляющих желудочного и кишечного соков.

Исследования по рентгенографии проводили в питомнике НИИ медицинской приматологии РАМН (г. Сочи-Адлер). В опытах использовали клинически здоровых обезьян (половозрелых самцов) вида макак резус  весом от 3 до 10 кг. Животные вылавливались из групповых клеток и вольер и размещались в индивидуальных клетках.  Для обездвижения обезьян с сохранением глоточных рефлексов и моторики кишечника им вводили в/м 0,5-0,7 см3 5% калипсола. Неглубокий наркоз наступал через 3-5 мин. В этом состоянии обезьян извлекали из индивидуальных клеток и корнцангом вводили глубоко в ротоглотку (глубже корня языка) твердые желатиновые капсулы. Для лучшего продвижения капсулы по пищеводу шприцом вводили 2-10 мл воды. Обезьянам давали два вида капсул: № 4 без покрытия, заполненные мелкой свинцовой дробью, и № 1 с кислото - и ферментоустойчивым покрытием, заполненные бария сульфатом. Первые ренгенограммы выполнялись через 10 мин после дачи капсул, для чего обездвиженную обезьяну помещали на снимочный стол рентгенаппарата в положении лежа на животе в передней прямой проекции.

На рентгенограммах, сделанных в ходе следующего эксперимента (рис. 16), видны этапы прохождения желудка и разрушения защищенных капсул в кишечнике обезьяны. Капсула с сульфатом бария через 10 мин после введения уже проникла с 4  дробинками из незащищенной и разрушившейся капсулы в двенадцатиперстную кишку (нижняя, рис. 16 а). На втором снимке (рис. 16 б), сделанном через 5 мин, видно разрушение этой капсулы, сопровождающееся выходом сульфата бария, и движение дроби по двенадцатиперстной кишке. При этом вторая защищенная капсула с 2 дробинками еще остается в желудке (верхняя, рис. 16 а, б). Ее попадание с остатками дроби в кишечник, и разрушение с высвобождением сульфата бария зафиксированы через 60 мин после введения (рис. 16 в).

Таким образом, длительность пребывания в желудке обезьяны введенных натощак твердых желатиновых капсул с кислотоустойчивым покрытием может достигать 120 мин, но в среднем составляет 30-60 мин. Высвобождение содержимого таких капсул происходит через 15-20 мин после попадания в двенадцатиперстную кишку, а длительность ее прохождения не превышает 60 мин.

  а б 

  в

Рис. 16 - Разрушение капсул в кишечнике обезьяны макак резус.

Длительность экспонирования: а - 10 мин; б - 15 мин; в - 60 мин.

(Рентгенограммы выполнены ст.н.с., к.м.н. Симавоняном К.В.)

Следовательно, общая продолжительность прохождения биологически активными компонентами препарата верхних отделов ЖКТ не должна превышать 2 часов. 

Исходя из результатов исследований, представленных в этом разделе работы, в совокупности с выявленным протективным эффектом аэросильной оболочки, можно сделать вывод об отсутствии необходимости противокислотной защиты твердых желатиновых капсул, выбранных в качестве лекарственной формы разработанного биопрепарата. Во избежание дополнительной задержки в желудке и двенадцатиперстной кишке препарат следует назначать натощак за 30-60 мин до приема пищи.

Поскольку защита биологического начала от повреждающего воздействия неблагоприятных факторов окружающей среды и желудочно-кишечного тракта создается структурным элементом препарата – аэросильной оболочкой, то это свойство препарата может расцениваться как еще один элемент универсальности разработанной технологии.

Результаты исследований данной главы работы защищены патентами РФ: № 2317064 RU, А61К 6/00 от 20.02.2008; № 2317065 RU, А61К 6/00 от 20.02.2008; № 2322506 RU, C12Q 1/02 от 20.04.2008.

Доклинические испытания комплексного препарата КИП и B. adolescentis МС-42

Доклинические испытания разработанного комплексного препарата включали  три этапа исследований.

На первом этапе проводили испытание препарата на острую токсичность в соответствии с требованиями ГФ XI  на беспородных здоровых белых мышах обоего пола. Каждую серию препарата испытывали на 5 мышах.  Всего в эксперименте было использовано 50 мышей (25 опытных животных и 25 контрольных). Препарат вводили опытным мышам per os однократно в количестве 0,05 г, что в 350 раз превышает человеческую дозу из расчета на единицу массы тела. Шестидневное наблюдение за животными показало отсутствие снижения веса животных, как в контрольной, так и опытной группах. В процессе испытаний препарата гибели животных не наблюдалось, не отмечено также признаков заболеваний. Все экспериментальные животные хорошо перенесли препарат и были активны.

Целью второго этапа исследований являлась оценка безвредности разработанного препарата на здоровых приматах. Для этого использовали 5 клинически здоровых обезьян вида макак резус (4 самца и 1 самка) в возрасте 2,2-3,4 года весом 2,7-5,0 кг. Отбирались обезьяны с хорошей упитанностью, активные, подвижные, с нормальной окраской слизистых оболочек и оформленным стулом. Обезьяны получали по 2 капсулы препарата ежедневно утром за 30 мин до кормления в течение 7 дней. Наблюдение за животными велось 14 дней.

При даче препарата признаков ухудшения состояния обезьян не отмечено, масса тела в среднем не изменялась, не наблюдалось также каких-либо желудочно-кишечных расстройств. В течение 10 дней наблюдения обезьяны оставались  здоровы и все были возвращены в вольеру. 

Целью третьего этапа являлась оценка терапевтической эффективности препарата. Из спонтанно болеющих острой кишечной инфекцией (ОКИ) с диарейным синдромом обезьян вида макак резус и макак яванский было сформировано 4 группы общей численностью 29 животных в возрасте от 1,1 до 20 лет весом 1,0-9,5 кг. Диарейный синдром - частый жидкий стул со зловонным запахом без патологической примеси от 6 до 8 раз в сутки, умеренная сниженная активность.

Группа I (опытная) получала разработанный комплексный иммунобиологический препарат в твердых желатиновых капсулах № 1. Каждая капсула содержала 0,4 г препарата: 85 мг комплексного иммуноглобулинового препарата (КИП), 8,5106 КОЕ бифидобактерий B. adolescentis МС-42, 0,28 г основной окиси алюминия и аэросила АМ-1-300. 

Группа II (сравнения) получала комплексный иммуноглобулиновый препарат в твердых желатиновых капсулах № 1. Каждая капсула содержала 150 мг КИП.

Группа III (сравнения) получала бифидобактерии в твердых желатиновых капсулах № 1. Каждая капсула содержала 2,3109 КОЕ B. adolescentis МС-42.

Группа IV (контрольная) получала офлоксацин в дозе 0,2 г и лаперамид (закрепляющие таблетки) 1 таблетку в день.

Капсулы приматам давали по вышеописанной отработанной методике.

Осуществлялось динамическое отслеживание клинических проявлений при диареях у обезьян с ежедневным наблюдением за состоянием животного (внешний вид, поза, активность, аппетит, агрессивность, частота и характер стула - ежедневно в процессе лечения и после его окончания в течение 7 дней). Взвешивали обезьян до, после окончания лечения и перед выпиской из клиники.

Сравнение результатов экспериментов свидетельствовало о том, что в опытной группе I обезьян период исчезновения клинических признаков заболевания был в

среднем в 1,2 раза длиннее, чем в группе сравнения II, в 1,8 и в 2,3 раза короче, чем в группе сравнения III и контрольной группе IV соответственно (рис. 17).

Рис. 17 – Длительность клинических проявлений ОКИ у обезьян, получавших лечение различными препаратами.

Обработка результатов исследований с помощью непараметрического критерия Мэнн-Уитнея (U) показала следующее (табл. 7). При сопоставлении групп I и II наименьшее расчетное суммарное число инверсий (Uр) для длительности клинических проявлений ОКИ в этих группах составило 24,5, что больше пограничного значения критерия Uт = 15 (при n1 = 7, n2 = 9  и уровне достоверности 95%). Различие средних характеристик этих групп отсутствует. При сопоставлении групп I и III наименьшее расчетное суммарное число инверсий по принятой характеристике составило 9, что  меньше пограничного значения критерия Uт = 11 (при n1 = 7, n2 = 7  и уровне достоверности 95%). Различие средних характеристик сравниваемых групп по длительности клинических проявлений у обезьян доказано. При сопоставлении групп I и IV наименьшее расчетное суммарное число инверсий для длительности клинических проявлений ОКИ в этих группах составило 0, что  меньше пограничного значения критерия Uт = 8 (при n1 = 6, n2 = 7  и уровне достоверности 95%). Различие средних характеристик сравниваемых групп по длительности клинических проявлений у обезьян доказано.

Следовательно, комплексный иммунобиологический препарат в твердых желатиновых капсулах  (№ 1, 85 мг КИП, 8,5106 КОЕ бифидобактерий B. adolescentis МС-42, 0,28 г основной окиси алюминия и аэросила АМ-1-300) при лечении острой кишечной инфекции обезьян обладает одинаковой терапевтической эффективностью с капсулами комплексного иммуноглобулинового препарата (№ 1, 150 мг КИП) и большей эффективностью, чем капсулы B. adolescentis МС-42 (№1, 2,3109 КОЕ бифидобактерий) и офлоксацин в таблетках по 0,2 г. 

Таблица 7 – Сравнение групп обезьян по длительности проявления клинических признаков ОКИ с помощью критерия Мэнн-Уитнея

Сравниваемые

препараты

Длительность болезни, дни (число обезьян)

Средняя длительность болезни, дни

Количество приматов в группе, n

Наименьшее суммарное число инверсий Up

Пограничное значение критерия Uт

при р<0,05

Комплексный в капсулах

5(2)-6(3)-7(1)-10(1)

6,4

7

24,5

15

КИП в капсулах

2(4)-3(1)-8(2)-9(1)-10(1)

5,1

9

Комплексный в капсулах

5(2)-6(3)-7(1)-10(1)

6,4

7

9

11

B. adolescentis МС-42 в капсулах

4(1)-8(1)-10(2)-12(1)-17(2)

11,4

7

Комплексный в капсулах

5(2)-6(3)-7(1)-10(1)

6,4

7

0

8

Офлоксацин в таблетках

11(2)-12(1)-14(1)-15(2)

13,0

6

Следует обратить внимание, что такой терапевтический эффект от применения разработанного биопрепарата был получен при том, что суточная доза его (2 капсулы) содержала КИП примерно в два раза меньше, чем в монопрепарате КИП, и бифидобактерий B. adolescentis МС-42 на два порядка меньше, чем в капсулах соответствующего монопрепарата. При этом в микробиоценозе ЖКТ обезьян происходили выраженные положительные изменения – возрастало количество нормальных представителей E. coli, существенно снижалось количество таких условно-патогенных микроорганизмов, как Staph. epidermis, представителей родов  Enterococcus, Proteus, Klebsiella, и были полностью элиминированы представители Citrobacter. Нормализация клинических показателей носила необратимый характер – не было ни одного случая рецидива заболевания при лечении приматов разработанным препаратом.

Таким образом, можно считать обоснованными новый концептуальный принцип сочетания иммуноглобулинового комплекса типа КИП с пробиотическими микроорганизмами и практические подходы к конструированию и технологии приготовления сухих  комплексных биопрепаратов для профилактики и лечения заболеваний, ассоциированных с дисбалансом нормофлоры желудочно-кишечного тракта.

Выводы

1. Показано, что микрокапельный порошок представляет собой смешанную трехфазную микрогетерогенную дисперсную систему типа т-ж/г и обладает одновременно свойствами сухого порошка и жидкого аэрозоля. Разработан способ и предложено техническое средство для приготовления микрокапельных порошков.

2.  Чувствительность биообъектов в жидкой субстанции к физическим факторам диспергирования определяется их природой: молекулы иммуноглобулинов трех основных классов (IgG, IgA и IgM) более устойчивы, чем энтеральные микроорганизмы E. faecium ГНКИ-27, E. coli М-17, L. acidophilus (смесь штаммов NК1, 100аш, К3Ш24) и B. adolescentis МС-42. Предложенный режим получения микрокапельных порошков в электромагнитном диспергаторе обеспечивает полное  сохранение специфической активности иммуноглобулинов и 90-100% жизнеспособности энтеральных микроорганизмов.

3. Определены требования к выбранной в качестве сорбента окиси алюминия по параметрам влагоемкости, величины рН, насыпной и утрясочной плотности, механической прочности и термостойкости. С применением биомассы различных микроорганизмов и растворов иммуноглобулинов показано, что закономерности протекания процесса сорбционно-контактной сушки микрокапельных порошков являются общими для биологических субстанций различной природы.

4. Разработан метод конструирования и технология приготовления комплексных биопрепаратов, включающая раздельное получение микрокапельных порошков биокомпонентов, их смешение, последующее одноэтапное обезвоживание сорбционно-контактной сушкой или двухэтапное с предварительным конвективным обезвоживанием и досушиванием влагоемким сорбентом, а также заключительную выдержку биопрепарата. Приготовлены экспериментальные серии препаратов КИП и B. adolescentis МС-42, КИП и L. acidophilus (смесь штаммов NК1, 100аш, К3Ш24).

5. Защитный эффект аэросила проявляется в пониженной гигроскопичности препарата при его нахождении на воздухе и устойчивости к повреждающему воздействию агрессивных составляющих желудочного и кишечного соков при моделировании прохождения верхних отделов желудочно-кишечного тракта.

6. Доклиническими испытаниями показана нетоксичность и безвредность комплексного биопрепарата КИП и B. adolescentis МС-42. Терапевтическая эффективность препарата при лечении обезьян, больных ОКИ с диарейным синдромом, составляет 100% и достоверно превосходит эффективность антибиотикотерапии.

Практические рекомендации

1. Для конструирования биопрепаратов с улучшенными фармакокинетическими свойствами целесообразно использовать новый вид биологических материалов – микрокапельный порошок, относящийся к трехфазным микрогетерогенным дисперсным системам и получаемый диспергированием биологической жидкости в присутствии наноразмерного гидрофобного разобщителя аэросила. Приготовление микрокапельного порошка наиболее эффективно осуществлять в электромагнитном диспергаторе.

2. С целью исключения необходимости проведения полномасштабных исследований для отработки  оптимального режима получения микрокапельного порошка в электромагнитном диспергаторе при переработке суспензий микроорганизмов различных видов может быть использована упрощенная методика перехода, базирующаяся на общей для большинства микроорганизмов закономерности экспоненциальной их гибели с увеличением интенсивности механического воздействия.

3. При выборе сорбента в качестве не только влагопоглотителя, но и структурного элемента сухого биопрепарата, необходимо учитывать его физические (фракционно-дисперсный состав, прочность, насыпную и утрясочную плотность), физико-химические (влагоемкость, термостойкость) и биологические (инертность, биологическая активность) свойства.

4. С целью повышения выживаемости пробиотических микроорганизмов и сохранения специфической активности сывороточных иммуноглобулинов технологическая схема приготовления комплексного биопрепарата должна включать легко реализуемую и не требующую сложного оборудования двухэтапную стадию сушки с обезвоживанием микрокапельного порошка до промежуточной влажности конвекцией при атмосферном давлении на первом этапе и досушиванием сорбционно-контактным способом - на втором. 

5. Для повышения терапевтической эффективности комплексного биопрепарата, предназначенного для профилактики и лечения дисбиотических нарушений микробиоценоза ЖКТ, целесообразно при его конструировании  использовать концептуальный принцип сочетания в одной лекарственной форме обогащенных иммуноглобулиновых комплексов типа КИП с микробными пробиотиками, в совокупности обладающими широким спектром и высоким уровнем антагонистической активности против как патогенных, так и условно-патогенных возбудителей заболеваний.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Давыдкин И.Ю. Способ получения высокодисперсного сухого пылевидного препарата / И.Ю. Давыдкин, Ю.П. Давыдкин, В.Ю. Давыдкин // Медицинская промышленность и биотехнология. Наука-производство-маркетинг. – 1992. – Вып. 5 – 6. – С. 58 – 62.

2. Давыдкин Ю.П. Анализ системы получения продуктов тонкого биотехнологического синтеза с позиции системного подхода. / Ю.П. Давыдкин, В.Д. Похиленко, В.Ю. Давыдкин, И.Ю. Давыдкин // Микробиологическое производство: Обзорн. информ. – М.: НИИСЭНТИ, 1992.- Вып. 1. – 20 с.

3. Давыдкин Ю.П. Принципы масштабирования процессов микробиологического синтеза / Ю.П. Давыдкин, Г.Я. Щербаков, И.Ю. Давыдкин, В.Ю. Давыдкин // Микробиол. пр-во: Обзорн. информ.  – М.: НИИСЭНТИ, 1992. – Вып. 6. – 24 с.

4. Давыдкин Ю.П. О движущей силе процесса сублимации влаги из различных материалов / Ю.П. Давыдкин, В.Д. Похиленко, И.Ю. Давыдкин, В.Ю. Давыдкин  // Системы управления, автоматизация и оптимизация технологических процессов в медицинской промышленности: Обзорн. информ. – М.: НИИСЭНТИ, 1993. – Вып. 1. – 40 с.

5. Давыдкин В.Ю. Отработка процесса сублимационного высушивания комплексного иммуноглобулинового препарата / В.Ю. Давыдкин, А.Г. Гаврин, В.А. Алешкин [и др.] // Проблемы инфекционных болезней. – М., 2000. – Ч. 2. – С. 61 - 66.

6. Давыдкин В.Ю. Разработка технологии приготовления твердой дозированной формы БАД «Биобактерин» / В.Ю. Давыдкин, В.А. Алешкин, А.Г. Гаврин [и др.] // Тез. докл. VII Российского национального конгресса «Человек и лекарство», 10-14 апреля 2000 г. – М.,2000. – С. 568.

7. Давыдкин В.Ю. Оценка способа получения сухой высокодисперсной вакцины вируса болезни Ньюкасла / В.Ю. Давыдкин, И.Ю. Давыдкин, В.А. Алешкин [и др.] // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2001. - № 2. С. 45 - 49.

8. Давыдкин В.Ю. Получение устойчивых суспензий Bacillus thuringiensis в электромагнитном аппарате / В.Ю. Давыдкин, В.А. Алешкин, И.Ю. Давыдкин, А.А. Воробьев [и др.] // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2001. - № 4. С. 7 - 10.

9. Алешкин В.А. Место иммунобиологических препаратов в восстановительной коррекции функционального состояния пожилого человека / В.А. Алешкин, Н.В. Лобачев, В.Ю. Давыдкин [и др.] // Клиническая геронтология. 2001. Т.7, №8. С. 74. 

10. Алешкин В.А. Перспективы использования иммунобиологических препаратов в профилактике и лечении хронического хламидийного и стафилококкового носительства у детей / В.А. Алешкин, С.С. Афанасьев, Н.В. Лобачев, В.Ю. Давыдкин [и др.] // Материалы VIII съезда Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. - М., 2002. - С. 135 - 137.

11. Давыдкин В.Ю. Получение экспериментальных серий новых лекарственных форм комплексного иммуноглобулинового препарата (КИП) / В.Ю. Давыдкин, В.А. Алешкин, А.В. Зорик [и др.] // Сб. материалов международной научно-практической конференции памяти Г.И.Гончаровой «Пробиотические микроорганизмы – современное состояние вопроса и перспективы использования». - М., 2002. - С. 66 - 67.

12. Давыдкин В.Ю. Особенности культивирования микроорганизмов в микрокаплях питательной среды / В.Ю. Давыдкин, С.С. Афанасьев, И.Ю. Давыдкин [и др.] // Сб. материалов международной научно-практической конференции памяти Г.И. Гончаровой «Пробиотические микроорганизмы – современное состояние вопроса и перспективы использования». - М., 2002. - С. 69.

13. Джикидзе Э.К. Лечение диареи у обезьян различными готовыми лекарственными формами комплексного иммуноглобулинового препарата / Э.К. Джикидзе, В.А. Алешкин, З.К. Стасилевич, С.С. Афанасьев, Т.И. Кебу, В.Ю. Давыдкин [и др.] // Тезисы докладов IX Российского национального конгресса «Человек и лекарство». - М., 2002. - С. 609.

14. Давыдкин И.Ю. К вопросу о выживаемости микроорганизмов / И.Ю. Давыдкин, В.Ю. Давыдкин, Е.Н. Канаева [и др.] // Материалы 1-го международного Конгресса «Биотехнология – состояние и перспективы развития» 14-18 октября в Москве. - М., 2002. - С. 348 - 349.

15. Давыдкин В.Ю. Выживаемость пробиотиков на разных стадиях приготовления биопрепаратов / В.Ю. Давыдкин, И.Ю. Давыдкин, В.А. Алешкин [и др.] // Материалы 1-го международного Конгресса «Биотехнология – состояние и перспективы развития» 14-18 октября в Москве. - М., 2002. - С. 349 - 350.

16. Иммунобиологические препараты и перспективы их применения в инфектологии / Под ред. Г.Г. Онищенко, В.А. Алешкина, С.С. Афанасьева, В.В. Поспеловой. - М.: ГОУ ВУНМЦ МЗ РФ, 2002. – 608 с.

17. Феклисова Л.В. Клинико-иммунологические параллели при ОРВИ с обструктивным синдромом у детей, получавших и не получавших Кипферон, суппозитории / Л.В. Феклисова, В.М. Шебекова, Е.Е. Целипанова, С.С. Афанасьев, В.А. Алешкин, Л.А. Денисов, В.Ю. Давыдкин // Сборник трудов 5-го Когресса «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии» 12-14 ноября 2002 г. – М., 2002. – С. 606. 

18. Афанасьев С.С. Интерфероновые иммунобиологические препараты. Перспективы их применения в лечении инфекционных больных / С.С. Афанасьев, В.А. Алешкин, Л.В. Феклисова, О.В. Рубальский, В.Ю. Давыдкин // Вестник Российской академии наук. - М.: Медицина, 2003. С. 44 - 48.

19. Алешкин В.А. Место иммуноглобулиновых препаратов в лечении и реабилитации инфекционных больных /В.А. Алешкин, А.Г. Лютов, С.С. Афанасьев, Л.В. Феклисова, Л.И. Новикова, Е.Р. Мескина, В.Ю. Давыдкин [и др.] // Новые лекарственные препараты.- Вып. 4. – М.: ЗАО АДИ «Бизнес-Карта», 2003. – С. 6 - 32.

20. Алешкин В.А. Применение препаратов интерферона в лечении воспалительных заболеваний лимфаденоидного кольца глотки /В.А. Алешкин, С.С. Афанасьев, В.Ю. Давыдкин [и др.] // Медицинская картотека. - № 1. – 2003. – С. 26 - 27.

21. Давыдкин В.Ю. Культивирование микроорганизмов в микрообъемах питательной среды / В.Ю. Давыдкин, С.С. Афанасьев, И.Ю. Давыдкин, В.А. Алешкин, А.А. Воробьев, А.Г. Гаврин, А.В. Зорик // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - № 3. 2003. С. 11 - 15.

22. Лапин Б.А. Оценка на обезьянах реактогенности и эффективности лекарственных форм комплексного иммуноглобулинового препарата / Б.А. Лапин, В.А. Алешкин, В.Ю. Давыдкин, А.А. Воробьев [и др.] // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии.  - №  3. 2003. С. 57 - 62.

23. Давыдкин В.Ю. Новые лекарственные формы комплексного иммуноглобулинового препарата / В.Ю. Давыдкин, В.А. Алешкин, А.В. Зорик [и др.] // Третья международная конференция, посвященная 80-летию института имени Пастера, «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями» в Санкт-Петербурге 4-5 сентября 2003 г. – С.-Петербург, 2003. – С. 160. 

24. Давыдкин И.Ю. Способ увеличения концентрации бифидобактерий в суспензии после культивирования / И.Ю. Давыдкин, В.Ю. Давыдкин, В.А. Алешкин [и др.] // Материалы II Московского международного Конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития», 10-14 ноября 2003 г. в Москве. – М.: ЗАО «ПИК «Максима», 2003. – Ч. 2. – С. 61.

25. Мелихова А.В. Стабилизация фракций иммуноглобулинов при сублимационном высушивании комплексного иммуноглобулинового препарата / А.В. Мелихова, А.Г. Лютов, В.А. Алешкин, А.Г. Гаврин, В.Ю. Давыдкин, И.Ю. Давыдкин // International Journal on Immunorehabilitation. Физиология и патология иммунной системы. – М.: «Медицина-Здоровье», 2003. – Т. 5., № 2. - С. 172.

26. Алешкин В.А. Биотехнология – основа лечебного и профилактического направлений здравоохранения / В.А. Алешкин, С.С. Афанасьев, В.Ю. Давыдкин [и др.] // Сборник материалов научно-практической конференции «Иммуноглобулиновые препараты энтерального и внутривенного применения»: Приложение к журналу «Вестник восстановительной медицины». – М., 2003. – С. 6 - 9.

27. Мелихова А.В. Технологические аспекты рецептуростроения лекарственных форм иммуноглобулинов: Влияние стабилизаторов на качество иммуноглобулинового препарата при сублимационном высушивании / А.В. Мелихова, А.Г. Лютов, А.Г. Гаврин, В.Ю. Давыдкин, И.Ю. Давыдкин // Сборник материалов научно-практической конференции «Иммуноглобулиновые препараты энтерального и внутривенного применения»: Приложение к журналу «Вестник восстановительной медицины». – М., 2003. – С. 22 - 23.

28. Давыдкин В.Ю. Технологические аспекты рецептуростроения лекарственных форм иммуноглобулинов: Сублимационное обезвоживание растворов иммуноглобулинового препарата / В.Ю. Давыдкин, В.А. Алешкин, А.Г. Гаврин [и др.] // Сборник материалов научно-практической конференции «Иммуноглобулиновые препараты энтерального и внутривенного применения»: Приложение к журналу «Вестник восстановительной медицины». – М., 2003. – С. 23 - 24.

29. Джикидзе Э.К. Применение комплексных иммунобиологических препаратов для лечения диарейных заболеваний обезьян / Э.К. Джикидзе, С.С. Афанасьев, З.К. Стасилевич, И.В. Борисова, Т.Е. Гвоздик, В.Ю. Давыдкин [и др.] // Сборник материалов научно-практической конференции «Иммуноглобулиновые препараты энтерального и внутривенного применения»: Приложение к журналу «Вестник восстановительной медицины». – М., 2003. – С. 36 - 37.

30. Давыдкин В.Ю. Выживаемость бифидобактерий после распылительного обезвоживания / В.Ю. Давыдкин, И.Ю. Давыдкин, В.А. Алешкин [и др.] // Сборник материалов международной конференции «Пробиотики, пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания. Современное состояние и перспективы» 2-4 июня в Москве. – М., 2004. – С. 175 - 176.

31. Давыдкин И.Ю. Эффективность фруктовых пюре в качестве защитных сред при сублимационном высушивании ацилакта / И.Ю. Давыдкин, В.Ю. Давыдкин, В.А. Алешкин [и др.] // Сборник материалов международной конференции «Пробиотики, пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания. Современное состояние и перспективы» 2-4 июня в Москве. – М., 2004. – С. 177 - 178.

32. Давыдкин И.Ю. Выживаемость различных штаммов бифидобактерий в процессе сублимационного обезвоживания. Сообщение 1/ И.Ю. Давыдкин, В.Ю. Давыдкин, В.А. Алешкин [и др.] // Сборник материалов международной конференции «Пробиотики, пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания. Современное состояние и перспективы» 2-4 июня в Москве. – М., 2004. – С. 178 - 179.

33. Давыдкин И.Ю. Выживаемость различных штаммов бифидобактерий при сублимационном обезвоживании. Сообщение 2 / И.Ю. Давыдкин, В.Ю. Давыдкин, В.А. Алешкин [и др.] // Сборник материалов международной конференции «Пробиотики, пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания. Современное состояние и перспективы» 2-4 июня в Москве. – М., 2004. – С. 179 - 180.

34. Давыдкин И.Ю. Перспективность распылительного обезвоживания бифидобактерий / И.Ю. Давыдкин, В.Ю. Давыдкин, С.С. Афанасьев [и др.] // Сборник материалов международной конференции «Пробиотики, пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания. Современное состояние и перспективы» 2-4 июня в Москве. – М., 2004. – С. 180 - 181.

35. Давыдкин В.Ю. Атмосферное обезвоживание клеток микроорганизмов / В.Ю. Давыдкин, И.Ю. Давыдкин, В.А. Алешкин [и др.] // Сборник материалов международной конференции «Пробиотики, пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания. Современное состояние и перспективы» 2-4 июня в Москве. – М., 2004. – С. 181 - 182.

36. Давыдкин В.Ю. Сохраняемость микроорганизмов в готовых формах пробиотиков / В.Ю. Давыдкин, И.Ю. Давыдкин, В.А. Алешкин [и др.] // Сборник материалов международной конференции «Пробиотики, пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания. Современное состояние и перспективы» 2-4 июня в Москве. – М., 2004. – С. 182 - 183.

37. Алешкин В.А. Обезьяны – адекватная модель для изучения готовых лекарственных форм иммунобиологических препаратов / В.А. Алешкин, С.С. Афанасьев, В.Ю. Давыдкин // Материалы симпозиума «Лабораторные приматы для решения актуальных проблем медицины и биологии» 20-21 октября 2004 г. – М., 2004. – С. 45 - 46.

38. Давыдкин В.Ю. Универсальная концепция создания энтеральных биопрепаратов / В.Ю. Давыдкин, В.А. Алешкин, С.С. Афанасьев, И.Ю. Давыдкин // Материалы третьей международной конференции «Высокие медицинские технологии XXI века», 31 октября – 7 ноября 2004 г. в Испании, Бенидорм. – С. 39 - 40.

39. Алешкин В.А. Становление пробиотикотерапии в России / В.А. Алешкин, С.С. Афанасьев, В.В. Поспелова, А.А. Воробьев, Л.В. Феклисова, Ю.В. Несвижский, А.М. Амерханова, Л.В. Пожалостина, Е.А. Воропаева, М.С. Афанасьев, В.Ю. Давыдкин, В.М. Лахтин, И.Ю. Давыдкин // Вестник Российской академии медицинских наук. 2005. - № 5. С. 3 - 13.

40. Алешкин В.А. Изучение иммунобиологических препаратов на обезьянах / В.А. Алешкин, Б.А. Лапин, С.С. Афанасьев, В.В. Поспелова, Э.К. Джикидзе, В.Ю. Давыдкин [и др.] // Материалы Всероссийской научной конференции «Перспективные направления использования лабораторных приматов в медико-биологических исследованиях», 8-10 августа 2006 г. в Сочи-Адлер. – Сочи-Адлер, 2006. – С. 49 - 54.

41. Давыдкин И.Ю. Высокодисперсная эмульсия в технологии приготовления противоящурной вакцины / И.Ю. Давыдкин, В.Ю. Давыдкин, В.М. Блинов // Материалы всероссийской конференции, посвященной 75-летию со дня открытия Чувашской государственной сельскохозяйственной академии. – Чебоксары: ЧГСХА, 2006. – С. 242 – 244.

42. Давыдкин И.Ю. Закономерности эмульгирования в электромагнитном аппарате / И.Ю. Давыдкин, В.Ю. Давыдкин, В.М. Блинов // Материалы всероссийской конференции, посвященной 75-летию со дня открытия Чувашской государственной сельскохозяйственной академии. – Чебоксары: ЧГСХА, 2006. – С. 245 – 247.

43. Лапин Б.А. Приматы как перспективная модель оценки энтеросолюбильных покрытий готовых лекарственных форм / Б.А. Лапин, В.А. Алешкин, В.Ю. Давыдкин [и др.] // Материалы международной научной конференции «Фундаментальные и прикладные проблемы медицины и биологии в опытах на обезьянах» 19-22 сентября 2007 г. – Сочи-Адлер, 2007. – С. 205-212.

44. Давыдкин В.Ю. Спектр чувствительности производственных штаммов бифидобактерий к антибактериальным препаратам / В.Ю. Давыдкин, И.Ю. Давыдкин, О.Г. Жиленкова [и др.] // Материалы IX съезда Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов 26-27 апреля 2007 г. в Москве. – М.: Санэпидмедиа, 2007. – Т.2. – С. 297 – 298. 

45. Давыдкин В.Ю. Аналитический метод обоснования готовой формы пробиотика / В.Ю. Давыдкин, И.Ю. Давыдкин  // Мат. юбил. Всеросс. науч.-практич. конф. "Научное обеспечение противоэпидемической защиты населения", посвящ. 90-летию Нижегородского НИИ эпидемиологии и микробиологии им. академика И.Н. Блохиной Роспотребнадзора и 20-летию Приволжского окружного центра по проф. и борьбе со СПИД. - Н.Новгород: Издатель Гладкова, 2009. - с. 337-340.

46. Давыдкин В.Ю. Некоторые аспекты культивирования бифидобактерий / В.Ю. Давыдкин, О.Г. Жиленкова, И.Ю. Давыдкин  // Мат. юбил. Всеросс. науч.-практич. конф. "Научное обеспечение противоэпидемической защиты населения", посвящ. 90-летию Нижегородского НИИ эпидемиологии и микробиологии им. академика И.Н. Блохиной Роспотребнадзора и 20-летию Приволжского окружного центра по проф. и борьбе со СПИД. - Н.Новгород: Издатель Гладкова, 2009. - с. 340-342.

47. Давыдкин В.Ю. Эффективность защитных сред при сублимационном обезвоживании бифидобактерий / В.Ю. Давыдкин, И.Ю. Давыдкин, О.Г. Жиленкова, А.В. Мелихова // Мат. юбил. Всеросс. науч.-практич. конф. "Научное обеспечение противоэпидемической защиты населения", посвящ. 90-летию Нижегородского НИИ эпидемиологии и микробиологии им. академика И.Н. Блохиной Роспотребнадзора и 20-летию Приволжского окружного центра по проф. и борьбе со СПИД. - Н.Новгород: Издатель Гладкова, 2009. - с. 342-344.

48. Давыдкин В.Ю. Разработка технологии приготовления биопрепаратов нового поколения / В.Ю. Давыдкин, И.Ю. Давыдкин, А.В. Мелихова, О.Г. Жиленкова // Мат. юбил. Всеросс. науч.-практич. конф. "Научное обеспечение противоэпидемической защиты населения", посвящ. 90-летию Нижегородского НИИ эпидемиологии и микробиологии им. академика И.Н. Блохиной Роспотребнадзора и 20-летию Приволжского окружного центра по проф. и борьбе со СПИД. - Н.Новгород: Издатель Гладкова, 2009. - с. 331-334.

  49. Давыдкин В.Ю. Доклинические испытания комплексного препарата КИП и B. adolescentis MC-42 / В.Ю. Давыдкин, Э.К. Джикидзе, А.В. Мелихова [и др.] // Мат. юбил. Всеросс. науч.-практич. конф. "Научное обеспечение противоэпидемической защиты населения", посвящ. 90-летию Нижегородского НИИ эпидемиологии и микробиологии им. академика И.Н. Блохиной Роспотребнадзора и 20-летию Приволжского окружного центра по проф. и борьбе со СПИД. - Н.Новгород: Издатель Гладкова, 2009. - с. 334-337.

50. Sinitsyn A.P. A hyperefficient process for enzymatic hydrolysis in the intensiv mass transfer reactor / A.P. Sinitsyn, A.V. Gusakov, I.Yu. Davydkin, V.Yu. Davydkin, O.V. Protas // Biotechnol. Letters. – 1993. -  V. 15, № 3. – P. 283 - 288.

Изобретения

1. Пат. 1831801 СССР, В01F 13/08. Устройство для обработки материалов / И.Ю. Давыдкин, Ю.П. Давыдкин, В.Ю. Давыдкин, В.М. Блинов, С.Д. Никитинский (СССР). Зарегистрирован в Государственном реестре изобретений Российской Федерации  13.10.1992. Патентообладатель коллектив авторов.

2. Пат. 2026730 РФ, В01F 13/08. Способ обработки материалов / И.Ю. Давыдкин, Ю.П. Давыдкин, В.Ю. Давыдкин, В.М. Блинов, С.Д. Никитинский (РФ). Зарегистрирован в Государственном реестре изобретений Российской Федерации  20.01.95. Патентообладатель коллектив авторов.

3. Пат.  2161887 RU, A23D 9/00. Биологическая активная добавка / В.А. Алешкин, С.С. Афанасьев, В.Ю. Давыдкин, О.В. Рубальский, И.Ю. Давыдкин, Г.И. Ханина, А.Г. Гаврин, А.В. Алешкин, Л.А. Денисов, Д.С. Афанасьев, М.С. Афанасьев (RU). Зарегистрирован в Государственном реестре изобретений Российской Федерации  20.01.2001. Патентообладатель коллектив авторов.

4. Пат. 2164765 RU, А23L 1/30. Биологически активная добавка / В.А. Алешкин, С.С. Афанасьев, О.В. Рубальский, В.Ю. Давыдкин, Л.А. Денисов, И.Ю. Давыдкин, А.Г. Гаврин, А.В. Алешкин, Д.С. Афанасьев, М.С. Афанасьев (RU). Зарегистрирован в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 10.04.2001. Патентообладатель коллектив авторов.

5. Пат. 2240136 RU, А61К 39/395. Композиция, содержащая иммуноглобулины и целевые добавки / В.А. Алешкин, С.С. Афанасьев, В.Ю. Давыдкин, И.Ю. Давыдкин, А.Г. Гаврин, О.В. Рубальский, А.В. Мелихова, И.В. Борисова, М.С. Афанасьев, Л.И. Новикова (RU). Зарегистрирован в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 20.11.2004. Патентообладатель ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора.

6. Пат. 2247578 RU, А61К 39/395. Состав, обладающий противомикробным действием / А.В. Мелихова, В.А. Алешкин, В.Ю. Давыдкин, И.Ю. Давыдкин, С.С. Афанасьев, И.В. Борисова, О.В. Рубальский, А.Г. Гаврин (RU).  Зарегистрирован в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 10.03.2005. Патентообладатель ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора.

7.  Патент РФ № 2371200, МПК  А61К 39/395. Способ получения иммуноглобулинового препарата / Мелихова А.В., Давыдкин В.Ю., Алешкин В.А., Давыдкин И.Ю. Зарегистрирован в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 27.10.2009. Патентообладатель ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора.

8. Пат. 2317064 RU, МПК А61К 6/00. Способ определения защитного действия покрытия капсул от содержимого желудка / Алешкин В.А., Лапин Б.А., Афанасьев С.С., Джикидзе Э.К., Симавонян К.В., Давыдкин В.Ю., Давыдкин И.Ю., Холодилова Л.И., Мелихова А.В., Трофимова Л.И., Кебу Т.И., Калашникова В.А., Егорова Т.П. (RU). Зарегистрирован в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 20.04.2008. Патентообладатели ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора, ГУ НИИ МП РАМН.

9. Пат. 2317065 RU, МПК А61К 6/00. Способ определения целевой доставки в желудочно-кишечном тракте твердой лекарственной формы с защитным покрытием / Алешкин В.А., Лапин Б.А., Давыдкин В.Ю., Джикидзе Э.К., Мелихова А.В., Симавонян К.В., Рубальский О.В., Давыдкин И.Ю. (RU). Зарегистрирован в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 20.02.2008. Патентообладатель коллектив авторов.

10. Пат. 2322506 RU, МПК C12Q 1/02. Способ определения защитного действия покрытия капсул для штамма Bifidobacterium adolescentis MC42 от содержимого желудка / Алешкин В.А., Лапин Б.А., Афанасьев С.С., Джикидзе Э.К., Симавонян К.В., Давыдкин В.Ю., Давыдкин И.Ю., Воропаева Е.А., Рубальский О.В., Холодилова Л.И., Мелихова А.В., Трофимова Л.И., Кебу Т.И., Байракова А.Л., Калашникова В.А., Афанасьев М.С., Егорова Т.П. (RU). Зарегистрирован в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 20.04.2008. Патентообладатели ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора, ГУ НИИ МП РАМН.

Список сокращений

БЭТ – изотермы сорбции Брунауэра, Эммета и Теллера

ГМ – гидролизатно-молочная среда

ГФ XI – государственная фармакопея XI издания

ЖКТ – желудочно-кишечный тракт

ЗС – защитная среда (среда высушивания)

КД-5 – казеиново-дрожжевая среда №5

КИП – комплексный иммуноглобулиновый препарат

КС – концентрированная суспензия

КСО – коэффициент сорбционного обезвоживания

ЛТ – лактозо-тиомочевинная защитная среда

МП – микрокапельный порошок

ОКИ – острая кишечная инфекция

ПС – питательная среда

ПЭГ – полиэтиленгликоль (полиэтиленоксид)

РИД – радиальная иммунодиффузия

РПГА – реакция пассивной гемагглютинации

СЖ – сахарозо-желатиновая защитная среда

СЖМ – сахарозо-желатино-молочная защитная среда

УПМ – условно-патогенные микроорганизмы

ФГК – ферментативный гидролизат казеина

ФМТ – ферромагнитные тела

ЭМД – электромагнитный диспергатор

Ig – иммуноглобулин

IgG, IgM, IgA – иммуноглобулины классов G, M и A




© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.