WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


На правах рукописи

ШЕВЧУК ТАРАС ВАЛЕРЬЕВИЧ

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ САЙТ-СПЕЦИФИЧЕСКОГО МЕТИЛИРОВАНИЯ ДНК ЭУКАРИОТ

03.00.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Пущино – 2008

Работа выполнена в лаборатории биотехнологии растений Филиала Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН и в департаменте клеточной биологии Национального медицинского центра (Лос-Анжелес, США).

Научный консультант:

доктор биологических наук профессор Бурьянов Ярослав Иванович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Патрушев Лев Иванович доктор биологических наук Кирьянов Глеб Иванович доктор биологических наук профессор Романов Георгий Александрович

Ведущая организация: Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН, Москва

Защита состоится _______________2008 г. в _____ часов на заседании совета Д 501.001.76 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу 119992, Москва, Ленинские Горы, МГУ, НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского, лаб. корпус “А”, аудитория 536.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва.

Автореферат разослан ________________________________2008 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук И.А. Крашенинников

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Несмотря на изучение явления энзиматического метилирования ДНК эукариот в течение шестидесяти лет, мы ещё далеки от полного понимания функциональной роли этой модификации генома. В клетках эукариотических организмов метилирование ДНК участвует в регуляции генетической экспрессии, клеточной дифференцировки и морфогенеза, эпигенетическом контроле геномного импринтинга и инактивации мобильных генетических элементов. Эти функции установлены как у млекопитающих, так и у высших растений. Нарушение нормальной картины метилирования ДНК сопровождает канцерогенез и генетические заболевания человека. В настоящее время установлено, что большинство своих функций метилирование ДНК осуществляет в качестве интегральной части механизма модификации и ремоделирования структуры хроматина. В этом процессе участвуют многочисленные белки, осуществляющие различные ковалентные модификации гистонов, а также короткие некодирующие РНК. Согласно современным взглядам, метилирование ДНК служит эпигенетической меткой, позволяющей регуляторным факторам транскрипции отличать метилированные последовательности генома от гомологичных, но не метилированных последовательностей. Существенные успехи в исследовании метилирования ДНК получены после открытия белков, связывающихся с метилированной ДНК. В настоящее время особое внимание уделено белкам, связывающимся с метилированными CpG-последовательностями ДНК и мобилизующими в эти участки гистоновые деацетилазы и другие гистон-модифицирующие белки, формирующие транскрипционно неактивную структуру хроматина. Картина сложноразветвлённой сети многочисленных взаимосвязанных реакций модификации и ремоделирования структуры хроматина только устанавливается, в том числе устанавливается специфичность функций индивидуальных ДНК-метилтрансфераз эукариотической клетки.

В структурно-функциональном исследовании энзиматического метилирования эукариотических ДНК существует значительный пробел, связанный с изучением только CpG-типа этой модификации. Однако у эукариот обнаружен второй симметричный тип метилирования ДНК CpNpG (N — любой нуклеозид) и несимметричный тип метилирования CpN. Растущее внимание к картине метилирования эукариотического генома, на фоне которой развиваются нормальные и нарушенные процессы жизнедеятельности, ставит вопрос о раздельном анализе каждого из этих типов метилирования ДНК. Исследование различных типов сайт-специфического метилирования ДНК имеет фундаментальное значение для понимания функциональной роли этой модификации эукариотического генома.

Цели и задачи исследования. Целью работы было изучение CpG- и CpNpG-типов метилирования ДНК высших эукариот в условиях изменения метаболизма и клеточ ной дифференцировки и при трансген-индуцированном метилировании генома, а также разработка новых методических приёмов анализа метилирования ДНК и применения ДНК-метилтрансфераз в новых биотехнологиях.

В число основных экспериментальных задач входили:

- разработка метода определения уровня метилирования внутреннего цитозина в последовательностях CCWGG (W = А или Т) генома;

- исследование эффекта трансген-индуцированного CCWGG-метилирования (CpNpG-тип) ДНК клеток растений Nicotiana tabacum;

- анализ метилирования генома растений Mesembryanthemum crystallinum в условиях солевого стресса и переключения метаболизма на С4-путь фотосинтеза;

- анализ метилирования 5'-концевой области гена кальцитонина человека в норме и при лейкозах;

- исследование эффекта трансген-индуцированного CCWGG-метилирования ДНК клеток HK293 культуры эпителиального слоя почек человека;

- разработка приёмов применения цитозиновых ДНК-метилтрансфераз в новых биотехнологиях.

Научная новизна. На основе особенностей каталитической активности ДНКметилтрансфераз BstNI и EcoRII разработан метод определения уровня метилирования внутреннего цитозина в последовательностях CCWGG.

Впервые осуществлён перенос в клетки растений гена гетерологичной ДНКметилтрансферазы EcoRII (M·EcoRII) в составе Т-ДНК агробактериальной Tiплазмиды дикого типа и в модифицированной форме NLS-M·EcoRII в составе обезоруженной Т-ДНК. Обнаружено, что неэкспрессируемый ген M·EcoRII индуцирует у первичной трансформированной клеточной ткани N. tabacum образование новых морфологических и биохимических фенотипов. Установлен пониженный уровень метилирования внутреннего цитозина в последовательностях CCWGG в ДНК этих клеток. Показано, что экспрессия гена NLS-M·EcoRII индуцирует новый морфологический фенотип целого растения и вызывает в его геноме дополнительное метилирование последовательностей CCWGG. Установлено, что в условиях засоления, при переключении С3-фотосинтеза на С4-путь фотосинтеза, наблюдается двукратное повышение уровня метилирования последовательностей CCWGG в ДНК растений M.

crystallinum, связанное с гиперметилированием фракции повторяющейся ДНК. Полученные данные могут свидетельствовать о новой специфической функциональной роли CpNpG-метилирования повторяющейся ДНК в образовании специализированной структуры хроматина в клетках M. crystallinum при их адаптации к солевому стрессу и переключении на С4-фотосинтез.

Обнаружено, что при лейкозах гиперметилирование цитозина в последовательностях CpG в 5'-концевой области гена кальцитонина человека не распространяется на близлежащие последовательности CpNpG. Сформулировано положение о существовании особого безальтернативного CpG-метилирования генома высших эукариот.

Впервые осуществлён перенос в клетки HK293 культуры эпителиального слоя почек человека гена ДНК-метилтрансферазы EcoRII в модифицированной форме NLSM·EcoRII-GFP. Установлено, что трансген-индуцированное CCWGG-метилирование ДНК клеток HK293 не влияет на CpG-метилирование их генома. Показано отсутствие влияния CCWGG-метилирования промотора гена АРС на его экспрессию в клетках HK293. Установлено отсутствие эффекта CCWGG-метилирования олигодезоксинуклеотидных субстратов на активность ДНК-метилтрансферазы DNMT1 in vitro.

Выявлены особенности частоты встречаемости сайтов CWG и CCWGG в геноме человека, указывающие на их возможную различную структурно-функциональную роль.

Для применения в нанобиотехнологии и ингибирования цитозиновых ДНКметилтрансфераз in vivo сконструированы и исследованы олигодезоксинуклеотиды и олигодезоксинуклеотид-белковые комплексы на основе модифицированных производных цитозина и ДНК-метилтрансферазы EcoRII.

Практическая ценность работы. Разработанный метод определения уровня метилирования внутреннего цитозина в последовательностях CCWGG в геномной ДНК может применяться при анализе динамики сайт-специфического метилирования генома различных организмов в процессе их жизнедеятельности.

Получены генетические конструкции для экспрессии модифицированных форм гена ДНК-метилтрансферазы EcoRII: NLS-M·EcoRII и NLS-M·EcoRII-GFP в клетках растений и млекопитающих.

Экспрессию в клетках растений гетерологичных генов цитозиновых ДНКметилтрансфераз можно использовать для получения эпигенетического разнообразия клеточных культур растений, а полученные клетки и ткани использовать в качестве новых удобных объектов для исследования функциональной роли энзиматического метилирования ДНК.

Клетки млекопитающих, экспрессирующие гетерологичные гены цитозиновых ДНК-метилтрансфераз могут использоваться как удобные модели для изучения особенностей эпигенетических модификаций ДНК.

Сконструированные на основе модифицированных производных цитозина и ДНКметилтрансферазы EcoRII олигодезоксинуклеотиды и олигодезоксинуклеотидбелковые комплексы перспективны для восстановления нормальной картины метилирования ДНК эукариотической клетки.

Полученные в работе оригинальные экспериментальные данные могут быть использованы в теоретических и практических курсах современной молекулярной и клеточной биологии высших эукариот.

Структура и объём диссертации. Диссертация состоит из ведения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитированной литературы. Работа изложена на ___ страницах машинописного текста, содержит ___ рисунков и ____ таблиц. Библиография включает _____ источников.

Апробация результатов работы. Результаты данной работы были представлены на 4th New England Biolabs Workshop on Biological DNA Modification, (Австрия, 1997);

Annual Oncologycal Congress of American Urologic Association, (США, 2002);

Scholarship of Anticancer Drug Design, (США, 2003); FEBS-CNRS Workshop on DNA and RNA modification enzymes: Comparative Strucure, Mechanism, Function and Evolution, (Франция, 2007); 12th Congress of the European Hematology Association, (Австрия, 2007); VI Съезде Гематологов и трансфузиологов Республики Беларусь (Минск, 2007); III Съезде Биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002); VI Съезде Общества Физиологов растений России (Сыктывкар, 2007); Международном симпозиуме по физико-химической биологии (Москва, 2004); IV съезде Общества Биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова, (Пущино, 2006); IV Съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008).

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований и программы Президиума РАН «Динамика генофондов растений, животных и человека» Публикации. По теме диссертации опубликовано 16 печатных работ.

Личный вклад автора. Автору принадлежит ведущая роль в выборе стратегии исследования, разработке новых подходов к решению экспериментальных задач, в обсуждении и обобщении полученных результатов и написании публикаций. Все основные эксперименты, проведённые в работе, выполнены лично автором, а также руководимыми им сотрудниками и студентами. В работах, выполненных в соавторстве с сотрудниками ФИБХ РАН, сотрудниками других институтов РАН и с зарубежными коллегами, личный вклад автора заключался в постановке задачи, прямом участии в проведении экспериментов и получении результатов, их обсуждении и оформлении в виде публикаций.

Автор выражает особую признательность профессору Я.И. Бурьянову, в лаборатории которого были выполнены приоритетные исследования, положенные в основу настоящей работы. Автор благодарит всех сотрудников и студентов своей группы, а также всех зарубежных коллег за плодотворное сотрудничество.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Разработка метода определения уровня метилирования последовательностей CCWGG в ДНК У животных и растений в основном исследовано метилирование ДНК в последовательности CрG. Однако у растений ДНК метилирована в значительной степени не только в последовательности CрG, но и в последовательности CрNрG [Кирнос и др., 1981; Gruenbaum et al., 1981]. CpNpG-метилирование ДНК имеет место также в клетках млекопитающих [Clark et al., 1995]. Не исключено, что CpG- и CpNpG-типы метилирования ДНК могут выполнять особые функции в клетке. Растущее внимание к динамике метилирования генома, на фоне которого развиваются разнообразные генетические процессы, ставит вопрос о его раздельном анализе в последовательностях CpG и CpNpG.

В работе разработан энзиматический метод определения уровня метилирования цитозина в эукариотических ДНК в нуклеотидной последовательности, соответствующей CpNpG-метилированному мотиву. Предлагаемый метод основан на применении ДНК-метилтрансфераз EcoRII и BstNI. Оба фермента узнают в ДНК одинаковую последовательность CCWGG, в которой метилируют внутренний цитозин. Эти ферменты различаются продуктами ДНК-метилазной реакции. ДНК-метилаза EcoRII модифицирует цитозин, перенося метильную группу на С5-атом пиримидинового кольца с образованием 5-метилцитозина (m5C). ДНК-метилаза BstNI модифицирует этот же остаток цитозина, метилируя экзоциклическую аминогруппу и образуя N4метилцитозин (m4C). Особенностью ДНК-метилазы BstNI является её способность модифицировать ДНК, содержащую в последовательности CCWGG внутренний цитозин в форме m5C, образуя при этом N4,5-диметилцитозин (m4,m5C) (рис. 1).

H H CHCHH H CHCHN N NHNHN N CHCHCHCHN N N N N N O N O N O N O N O N O N H H H H H H 5-метилцитозин N4-метилцитозин N4,5-диметилцитозин (m5C) (m4C) (m4,m5C) Рис. 1. Метилированные производные цитозина.

Иными словами, по включению метильных групп в ДНК ферментом BstNI можно оценить в ней общее количество последовательностей CCWGG независимо от присутствия в ДНК m5C. С другой стороны, с помощью ДНК-метилазы EcoRII можно оценить в ДНК только количество неметилированных последовательностей CCWGG.

Таким образом, разность между метильными группами, включёнными в анализируемую ДНК ферментами BstNI и EcoRII, должна отражать степень недометилированности этой ДНК in vivo.

В предложенном методе необходимым требованием является полнота проведения энзиматической реакции метилирования ДНК в условиях отсутствия её лимитирования недостатком фермента или донором метильных групп S-аденозилметионина.

Условия реакции энзиматического метилирования ДНК. Реакционная смесь содержала 40 мМ трис-HCl (pH 8,0), 2 мМ ЭДТА, 7 мМ 2-меркаптоэтанол, 6,6 мкМ Sаденозил-L-[метил-3Н]-метионин (удельная активность 15 Ки/мМ), от 0,1 до 1,2 мкг ДНК и 20 ед.акт. ДНК-метилазы (1 ед.акт. — количество фермента, катализирующее перенос на ДНК фага dcm— 1 пмоль метильных групп за 1 час). Реакцию проводили в течение 2 ч при 37°С с метилазой EcoRII и 55°С с метилазой BstNI. Пробы наносили на DE-81 бумагу 22 см, промывали последовательно 0,2 М раствором NaHCO3, водой и этанолом. Образцы высушивали, помещали во флаконы с толуольным сцинтилляционным раствором и просчитывали на сцинтилляционном спектрометре.

Рис. 2. Включение метильных групп в ДНК E. coli ДНК-метилазами EcoRII и BstNI.

1 – ДНК E. coli B834(N3), включение ДНК-метилазой EcoRII; 2 – смесь (1:1) ДНК E. coli B834 и E. coli B834(N3), включение ДНК-метилазой EcoRII; 3 – смесь (1:1) ДНК E. coli B8и E. coli B834(N3), включение ДНК-метилазой BstNI. Общее количество ДНК в стандартной ферментативной реакции составляло 1 мкг.

Рис. 3. Включение метильных групп в стандартных условиях реакции в смесь (1:1) ДНК E. coli B834 и E. coli B834(N3) ДНК-метилазой EcoRII (1), и в ДНК E. coli B834(N3) ДНК-метилазой BstNI (2).

В случае определения радиоактивности m4C и m4,m5C ДНК после реакции энзиматического метилирования гидролизовали до азотистых оснований в 57% хлорной кислоте в течение 1 ч при 100°С. К полученному гидролизату добавляли синтетические метилированные азотистые основания m4C и m4,m5C. Разделение азотистых оснований проводили хроматографией на пластинках с целлюлозой (Merck, Германия) в системе бутанол-вода-аммиак (60:10:0,1). Сорбент из областей, соответствующих положению метилированных азотистых оснований, соскабливали, помещали во флаконы с толуольным сцинтилляционным раствором и просчитывали на сцинтилляционном спектрометре.

Требование проведения полного метилирования ДНК удовлетворяется при использовании в энзиматической реакции метилирования 0,1-1,0 мкг ДНК, 20 ед. ДНКметилазы, 6,6 мкМ концентрации SAM и проведении реакции в течение 1 ч (рис. 2, 3).

Определение уровня метилирования сайтов CCWGG в исследуемых ДНК можно проводить двумя способами. В первом способе используется пара ДНК-метилтрансфераз EcoRII и BstNI.

Отношение величин включения метильных групп в ДНК, осуществляемое метилазами EcoRII и BstNI, равно 1 в случае полного отсутствия m5C в последовательности CCWGG и уменьшается пропорционально его количественному содержанию в этой последовательности. Уровень метилирования in vivo последовательностей CCWGG в исследуемой ДНК можно определить по формуле:

1- IEcoRII M = 1 IBstNI где М — уровень метилирования ДНК in vivo (в процентах), IEcoRII — радиоактивность, включённая в ДНК метилазой EcoRII, IBstNI — радиоактивность, включённая в ДНК метилазой BstNI.

Этот способ проверен на модельных ДНК E. coli B834(N3), полностью модифицированной in vivo ДНК-метилтрансферазой EcoRII, и ДНК E. coli B834, не содержащей остатков m5C. Данные анализа этих ДНК, а также смеси этих ДНК в соотношении 1:1, полностью соответствуют ожидаемым результатам (табл. 1).

Второй способ определения уровня метилирования этой последовательности состоит в количественном анализе продуктов энзиматической модификации ДНК ферментом BstNI, которыми могут быть m4С или m4,m5C. При этом m4С образуется в случае присутствия в последовательности CCWGG внутреннего цитозина в неметилированной форме, в то время как образование m4,m5C зависит от присутствия в этом положении m5C. Уровень метилирования in vivo последовательностей CCWGG в исследуемой ДНК можно определить по формуле:

I(m4, m5C) M = 1 I(m4, m5C) + I(m4C) где М — уровень метилирования ДНК in vivo (в процентах), I(m4C) — радиоактивность (количество) N4-метилцитозина, I(m4,m5C) — радиоактивность (количество) N4,5-диметилцитозина.

Этот метод проверен на тех же модельных ДНК E. coli B834, E. coli B834(N3) и равной смеси этих ДНК. Данные анализа этих ДНК, представленные в табл. 1, соответствуют результатам их анализа по первому способу с помощью пары ДНКметилтрансфераз EcoRII и BstNI. Использование радиоактивного S-аденозил-L[метил-3Н]-метионина позволяет брать для анализа в реакцию энзиматического метилирования ДНК менее 1 мкг ДНК, что ставит этот метод в ряд современных методов аналитического микроанализа ДНК.

Таблица 1.

Уровень метилирования последовательностей CCWGG различных ДНК Уровень метилирования (%) ДНК Метилазы EcoRII+BstNI Метилаза BstNI (I способ) (II способ) E. coli B834 0* 1,8±0,E. coli B834(N3) 97,5±3,2 98,2±2,E. coli B834(N3)+E. coli B834 (1:1) 49,4±1,8 47,5±1,N. tabacum (листья) 64,5±2,7 63,3±1,* Включение метил-3Н групп в ДНК ферментом EcoRII на уровне фона.

Разработанный в данной работе метод можно использовать не только для анализа уровня метилирования последовательностей CCWGG, но, в приближении, оценивать состояние метилирования и всех последовательностей CpNpG в ДНК.

2. Трансген-индуцированное CCWGG-метилирование ДНК растений Nicotiana tabacum Новым экспериментальным подходом к выяснению функциональной роли метилирования ДНК у эукариот является изучение трансгенных клеток с различными генами ДНК-метилтрансфераз. ДНК-метилаза EcoRII (M·EcoRII) модифицирует внутренний цитозин в последовательностях ДНК CCWGG. Эта последовательность содержит центральный тринуклеотид, соответствующий CpNpG-метилированному мотиву ДНК растений. В начальной части работы были трансформированы растения табака N. tabacum рекомбинантной агробактериальной Т-ДНК с геном M·EcoRII и проведён анализ некоторых физиолого-биохимических свойств полученных трансформированных тканей и уровня метилирования последовательностей CCWGG в их геноме.

Интеграция гена ДНК-метилтрансферазы EcoRII в Т-ДНК агробактериальной Ti-плазмиды дикого типа. Клонированный в плазмиде pVK32 ген M·EcoRII был субклонирован в коинтегративном векторе pLGV2382, содержащем фрагмент Т-ДНК агробактериальной Ti-плазмиды pTiC58 для проведения гомологичной рекомбинации с Ti-плазмидой в клетках A. tumefaciens. (рис. 4).

Рис. 4. Схема клонирования гена M·EcoRII в Т-ДНК Ti-плазмиды дикого типа pLGV2382.

Плазмиду pLGV2382-M·EcoRII переносили из клеток E. coli B834 в клетки A. tumefaciens C58 в трёхродительском скрещивании с помощью штамма E. coli GJ23.

В результате были получены клетки A. tumefaciens с коинтегрированной Tiплазмидой, которая в дополнение к маркерным генам нопалинсинтазы (nos) и синтеза фитогормонов (tms1, tms2, tmr) несла также ген M·EcoRII под дополнительным nosпромотором.

В клетках A. tumefaciens, также как и в клетках E. coli B834, ген M·EcoRII определял CCWGG-специфичность метилирования клеточной ДНК и защищал её от гидролиза рестрикционной эндонуклеазой EcoRII. Аналогичным путём была получена коинтегрированная Ti-плазмида без гена M·EcoRII, использованная в контрольных вариантах эксперимента.

Интеграция модифицированного гена ДНК-метилтрансферазы EcoRII в обезоруженный агробактериальный вектор. Ген M·EcoRII был клонирован в плазмиду pRT103 под контроль конститутивного промотора 35S РНК вируса мозаики цветной капусты (CaMV) (рис. 5). В дальнейшем кодирующая часть гена МEcoRII была модифицирована вставкой сигнала ядерной локализации (NLS) вируса SV40. Продукт экспрессии полученной конструкции в dcm- клетках E. coli GM272 проявлял EcoRIIспецифический характер метилирования ДНК. В дальнейшем модифицированный ген NLS-МEcoRII был перенесён в бинарный вектор pGA482, и полученную плазмиду pGA482::NLS-МEcoRII переносили из клеток E. coli GM272 в клетки A. tumefaciens 3101 в трёхродительском скрещивании с помощью штамма E. coli GJ23.

Рис. 5. Схема клонирования модифицированного гена NLS-МEcoRII под контролем промотора 35S РНК вируса мозаики цветной капусты.

В результате были получены клетки A. tumefaciens с рекомбинантной Tiплазмидой, которая несла модифицированный ген NLS-МEcoRII под контролем промотора 35S CaMV и ген nptII маркерного белка неомицинфосфотрансферазы.

Присутствие целевого гена NLS-МEcoRII в агробактериях было подтверждено гибридизацией по Саузерну с геном МEcoRII в качестве зонда.

2.1. Получение трансгенных опухолевых линий Nicotiana tabacum, содержащих ген ДНК-метилтрансферазы EcoRII На раневую поверхность стеблей проростков N. tabacum наносили суспензию клеток A. tumefaciens, несущих Ti-плазмиду с геном МEcoRII или без него. Образованные опухоли вырезали и культивировали в виде каллусной культуры на агаризованной среде Мурасиге-Скуга (МS). Селекцию трансформированных клеток проводили в суспензионной культуре на безгормональной жидкой среде МS с цефотаксимом. Свободные от агробактерий клеточные микроагрегаты переносили на агаризованную среду МS без антибиотиков, содержащую фитогормоны нафтилуксусную кислоту и 6бензиламинопурин. В течение двух месяцев культивирования первичной опухолевой культуры N. tabacum, трансформированной Ti-плазмидой с геном МEcoRII, происходила её спонтанная морфологическая дифференциация. Эта культура дала начало несколькими новым стабильным морфологическим линиям с характерной структурой и цветом (рис. 6).

2 Рис. 6. Фенотип трансформированных линий культуры ткани N. tabacum с геном МEcoRII.

1 — «белая компактная» линия; 2 — первичная ткань с геном M·EcoRII; 3 — «жёлтая рыхлая» линия; 4 — тератомная линия. Названия линий соответствуют их морфологии, цвету и плотности.

Физиолого-биохимическая характеристика трансгенных опухолевых линий N. tabacum. Первичная трансформированная культура имела типичные свойства опухолевой ткани, определяемые специфическими генами T-ДНК агробактериальной Tiплазмиды дикого типа, и проявляла гормон-независимый рост и способность синтезировать нопалин. Однако образованные из первичной опухолевой культуры новые линии различались между собой по этим свойствам. Так, «белая компактная» каллусная линия проявляла нопалинсинтазную активность и гормон-независимый рост, а «жёлтая рыхлая» линия имела противоположные свойства, то есть не синтезировала нопалин и была гормон-зависимой (табл. 2). В то же время контрольная опухолевая культура ткани, полученная в результате трансформации Ti-плазмидой без гена МEcoRII, стабильно сохраняла свой исходный морфологический фенотип и по своим свойствам не отличалась от первичной опухолевой культуры с геном МEcoRII.

Таблица 2.

Фенотип трансформированных линий культуры ткани Nicotiana tabacum с геном МEcoRII Синтез Зависимость Уровень Линия культуры ткани нопалина от гормонов CCWGG-метилирования (%) Первичная ткань с геном + — 33,4±1,МEcoRII «Белая компактная» линия + — 42,5±1,«Жёлтая рыхлая» линия — + 34,8±1,Тератомная линия — — 37,1±1,Нетрансформированный — + 58,3±1,каллус (контроль 1) Трансформированная ткань + — 60,5±2,без гена МEcoRII Уровень метилирования последовательностей CCWGG в геноме трансгенных опухолевых линий N. tabacum. Блот-гибридизационный анализ ДНК показал присутствие гена МEcoRII в геноме всех трансформированных фенотипических линий (рис. 7). В то же время, анализ геномов этих линий методом ПЦР с применением праймеров к 5'-концам гена МEcoRII показал отсутствие у них полноразмерных копий этого гена (рис. 8). Амплификация этого гена в смеси с исследуемыми ДНК различных фенотипических опухолевых линий табака указывает на отсутствие у них диффузного ингибитора ПЦР.

Определение уровня метилирования цитозина в последовательности CCWGG проводили по разработанному нами методу, основанному на применении ДНК-метилаз EcoRII и BstNI. ДНК всех трансформированных опухолевых линий с геном ДНКметилазы EcoRII отличается пониженным уровнем метилирования последовательностей CCWGG по сравнению с ДНК контрольной нетрансформированной каллусной ткани и опухолевой линии, трансформированной Ti-плазмидой без гена МEcoRII (табл. 2). Таким образом, интеграция в ДНК клеток табака гена МEcoRII в составе агробактериальной Т-ДНК дикого типа не только не вызвала дополнительного метилирования генома клеток растений, но привела к его значительному понижению.

По-видимому, ген МEcoRII не экспрессируется в клетках трансформированных линий из-за нарушенной структуры его 5'-концевой области. Кроме того, в этих экспериментах ген МEcoRII не кодировал сигнал ядерной локализации для транслокации ДНК-метилтрансферазы EcoRII из цитоплазмы в ядро, что понижало вероятность проявления белком своей каталитической функции в ядре.

Влияние интегрированного в геном N. tabacum гена ДНК-метилтрансферазы МEcoRII на фенотип трансгенных опухолевых линий и пониженный уровень метилирования последовательностей CpNpG в их геноме можно объяснить возможностью гомологичной рекомбинации гена МEcoRII с одним из собственных ДНКметилтрансферазных генов N. tabacum и его инактивации («нокаута»).

Этому соответствует наблюдаемый в настоящей работе положительный сигнал гибридизации между геном ДНК-метилазы EcoRII и ДНК из клеток контрольной нормальной каллусной линии и опухолевой каллусной линии без гена МEcoRII (рис.7, дор. 1, 6). В случае гибридизационного анализа ДНК из трансформированных линий с геном МEcoRII этот сигнал отсутствовал или его положение было заметно смещено. Сохраняющийся пониженный уровень метилирования последовательности CCWGG в ДНК этих клеток может обеспечиваться активностью продуктов других интактных генов растительных ДНК-метилтрансфераз. Полученные данные указывают на существование выраженной причинно-следственной связи между интеграцией гена ДНК-метилазы EcoRII в геном N. tabacum и изменением фенотипических свойств трансформированных опухолевых тканей.

1 2 3 4 5 6 т.п.н.

23,9,6,4,Рис. 7. Блот-гибридизационный анализ ДНК культур тканей Nicotiana tabacum.

1 – опухолевая ткань без гена M·EcoRII; 2 – первичная опухолевая ткань с геном M·EcoRII; – «белая компактная» линия; 4 – тератомная линия; 5 – «жёлтая рыхлая» линия; 6 – нетрансформированный каллус.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 т.п.н.

1,Рис. 8. ПЦР-анализ ДНК культур тканей Nicotiana tabacum.

1 – ДНК плазмиды pLGV2383::M·EcoRII; 2 – ДНК трансгенных растений табака с геном M·EcoRII (Nt::M·EcoRII); 3 – «белая компактная» линия; 4 – «белая компактная» линия + Nt::M·EcoRII; 5 – «жёлтая рыхлая» линия; 6 - «жёлтая рыхлая» линия + Nt::M·EcoRII; 7 – тератомная линия; 8 – тератомная линия + Nt::M·EcoRII; 9 – первичная ткань с геном M·EcoRII;

10 – первичная ткань с геном M·EcoRII + Nt::M·EcoRII; 11 – нетрансформированный каллус;

12 – трансформированная ткань без гена M·EcoRII; 13 – pBR/RsaI Интеграция гена ДНК-метилтрансферазы EcoRII в геном трансформированных агробактериями клеток N. tabacum привела к появлению различных физиологических и морфолого-биохимических фенотипов опухолевой ткани. После публикации нашей работы [Buryanov et al., 1995] разнообразие морфологических фенотипов было отмечено также у растений Arabidopsis thaliana с пониженным метилированием генома [Finnegan et al., 1996; Kakutani et al., 1996].

Применение химерных генов ДНК-метилтрансфераз с сигналами ядерной локализации расширяет возможности этого подхода для исследования функциональной роли энзиматического метилирования ДНК. Продолжением этой части работы было получение и исследование физиолого-биохимических свойств и CCWGG-метилирования трансгенных растений N. tabacum, экспрессирующих ген ДНК-метилтрансферазы EcoRII с сигналом ядерной локализации.

2.2. Получение трансгенных растений Nicotiana tabacum, содержащих модифицированный ген NLS-МEcoRII Получение трансформированных растений табака N. tabacum. Агробактериальную трансформацию проводили методом инокуляции листовых дисков растений табака клетками A. tumefaciens 3101, несущих рекомбинантную Ti-плазмиду с геном NLS-МEcoRII. Образовавшиеся в ходе прямой регенерации растения переносили для укоренения на селективную безгормональную среду MS, содержащую цефотаксим и канамицин. Свободные от агробактерий растения переносили на среду MS без цефотаксима. Для дальнейшего анализа было отобрано 12 линий устойчивых к канамицину растений.

Физиолого-биохимическая характеристика трансгенных растений Nicotiana tabacum. Трансгенная природа 12 линий растений N. tabacum была подтверждена ПЦР-анализом, который показал наличие полноразмерного гена nptII во всех двенадцати исследуемых линиях (рис. 9). Для подтверждения интеграции гена NLSМEcoRII был проведён ПЦР-анализ ДНК полученных линий трансформантов с применением праймеров к 5'-концам этого гена. Анализ показал присутствие полноразмерных копий гена ДНК-метилтрансферазы M·EcoRII только у пяти исследуемых линий (рис. 10).

В нашей работе в различных линиях трансгенных каллусных культур N. tabacum с геном M·EcoRII без сигнала ядерной локализации также наблюдалось отсутствие полноразмерной формы этого гена. Это можно объяснить рекомбинационными перестройками между геном M·EcoRII и одним из генов ДНК-метилтрансфераз N. tabacum. Дальнейшая работа проводилась с растениями с полноразмерной формой гена M·EcoRII.

1 2 3 4 5 6 7 8 т.п.н.

1,Рис. 9. ПЦР-анализ ДНК трансгенных растений Nicotiana tabacum с праймерами к гену nptII.

1 – ДНК фага , гидролизованная рестриктазой HindIII; 2 – ДНК нетрансформированного растения N. tabacum;3 – ДНК плазмиды pGA482::МEcoRII; 4-8 – ДНК трансгенных растений N. tabacum.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 т.п.н.

1,Рис. 10. ПЦР-анализ ДНК трансгенных растений Nicotiana tabacum с праймерами к 5'-концам полноразмерного гена M·EcoRII.

1 – ДНК фага , гидролизованная рестриктазой HindIII; 2 – ДНК плазмиды pRT103; 3 – ДНК плазмиды pRT103::NLS-M·EcoRII; 4-10 – ДНК трансгенных растений N. tabacum Экспрессия чужеродного гена ДНК метилазы M·EcoRII в клетках трансгенных растений табака была подтверждена РНК-ДНК гибридизационным анализом, который показал транскрипцию этого гена во всех пяти линиях трансгенных растений (рис. 11). Трансгенные растения линий с полноразмерным геном M·EcoRII впоследствии были высажены в грунт в оранжерее. Через шесть недель после высадки в грунт эти растения обнаружили фенотипические отличия от нормального табака. В частности, их листья имели аномально развитые прилистники (рис. 12). Кроме того, трансгенные растения заметно отставали в росте, зацвели на две недели позже, и дали более мелкие семена.

1 2 3 4 5 6 7 Рис. 11. Нозерн-блот гибридизационный анализ трансгенных растений Nicotiana tabacum.

1 – ДНК плазмиды pRT103::M·EcoRII; 2 – РНК нетрансформированного растения; 3-7 – РНК трансгенных растений с полноразмерным геном M·EcoRII; 8 – РНК трансгенного растения с неполноразмерной копией гена M·EcoRII.

От всех линий трансгенных растений были получены жизнеспособные семена, которые показали классическое расщепление 3:1 на среде с канамицином. Полученные из семян трансформантов растения первого поколения F1 культивировались на среде MS с канамицином. После высадки в грунт в оранжерее они также как и родительские растения (поколение F0) имели аномально развитые прилистники (рис. 12 В, С), которые не только сохранялись в последующих поколениях трансгенных растений, но и становились более выраженными. В первом поколении трансгенных растений F1 с геном NLS-M·EcoRII прилистники не только имели больший размер, но и разрастались по всей длине листового черешка (рис. 12, С), в отличие от первичных трансформантов поколения F0, у которых прилистники развивались только у основания листового черешка.

Эти результаты вместе с ранними данными, полученными на трансгенных каллусных культурах с геном M·EcoRII, соответствуют наблюдениям других авторов о морфологических аномалиях мутантных растений A. thaliana с нарушенным уровнем метилирования своего генома, вызванным специфическими мутациями или эффектом антисмысловой формы собственного гена ДНК-метилазы [Kakutani et al., 1996].

В А С Рис. 12. Различия в морфологии между нетрансформированным растением N. tabacum (А), трансгенным растением поколения F0 с геном NLS-M·EcoRII (В) и трансгенным растением поколения F1 с геном NLS-M·EcoRII (С). Стрелками показаны прилистники.

Следует также отметить, что в этих работах аномальный фенотип во всей полноте проявлялся у таких растений только через несколько поколений. Полученные данные о фенотипических аномалиях трансгенных растений табака с геном M·EcoRII указывали на вероятное изменение картины метилирования генома полученных нами растений. Проведённый анализ подтвердил это предположение.

Определение уровня метилирования цитозина в последовательностях CCWGG ДНК трансформированных растений N. tabacum. ДНК всех линий первичных растений-трансформантов (поколение F0) с геном ДНК-метилтрансферазы NLSM·EcoRII и их первого поколения (F1) отличаются повышенным уровнем метилирования последовательностей CCWGG по сравнению с ДНК контрольных нетрансформированных растений (табл. 3). Экспрессия гена NLS-M·EcoRII в растениях приводит к повышению уровня CCWGG-метилирования ДНК, сохраняющемуся и в последующем поколении трансгенных растений с аномальным фенотипом.

Таким образом, интеграция различных форм гена M·EcoRII в геном трансформированных клеток N. tabacum приводила к появлению различных физиологических и морфолого-биохимических фенотипов у целых растений и каллусной ткани. Изменения уровня метилирования CpNpG-последовательностей ДНК, как в сторону его увеличения, так и в сторону его снижения приводили к появлению аномальных фенотипов каллусных тканей и целых растений.

Наши результаты показывают перспективность использования трансгенных растений с гетерологичными генами ДНК-метилтрансфераз как удобной модели для исследования функциональной роли энзиматического метилирования ДНК.

Таблица 3.

Фенотип трансформированных линий растений Nicotiana tabacum с геном NLS-МEcoRII Линии растений Наличие прилистников Уровень CCWGG-метилирования (%) Нетрансформированное — 58,2±1,растение №Нетрансформированное — 59,0±1,растение №Нетрансформированное — 58,7±1,растение №Линия №3 + 64,1±1,Линия №4 + 63,3±1,Линия №5 + 67,5±1,Линия №6 + 65,8±1,Линия №7 + 63,4±1,Линия №3 (F1) + 64,5±1,Линия №4 (F1) + 66,8±1,Линия №5 (F1) + 65,5±1,Линия №6 (F1) + 67,1±1,Линия №7 (F1) + 66,2±1,3. Исследование метилирования растений Mesembryanthemum crystallinum в стрессовых условиях Факультативные галофитные растения Mesembryanthemum crystallinum являются хорошо изученной физиологической моделью для исследования адаптации растений к засолению и водному дефициту. Особенностью этого растения является его способность в условиях водного дефицита, вызываемого засухой или засолением, переключаться с С3-пути фотосинтеза на САМ-путь С4-фотосинтеза (Сrassulacean acid metabolism). Благодаря своим физиолого-биохимическим особенностям и сравнительно небольшому размеру генома (около 350000 т.п.н.), M. crystallinum является удобным модельным организмом для исследования адаптации растений к условиям солевого стресса и водному дефициту.

САМ-специфическая форма фосфоенолпируват карбоксилазы (РЕР-карбоксилазы) является индикатором функционирования САМ-пути у растений M. crystallinum. В условиях водного дефицита или засолённости количество РЕР-карбоксилазы и соответствующей мРНК в клетках этих растений резко возрастает. В этих условиях у растений происходит индукция транскрипции гена Ppc1 cемейства генов РЕР карбоксилазы, а также других генов САМ-пути ассимиляции СО2 [Bohnert et al., 1988]. В то же время, механизмы индукции экспрессии этих генов остаются невыясненными. В этих механизмах специфическую функцию может играть энзиматическое метилирование ДНК. Однако до настоящего времени отсутствовала информация о специфических особенностях метилирования ДНК растений M. crystallinum в условиях солевого стресса и о возможном его участии в регуляции САМ-специфических генетических программ. Целью этой части работы был анализ уровня CCWGG (CpNpG) сайт-специфического метилирования ядерной ДНК и исследование специфичности метилирования некоторых генов растений M. crystallinum, растущих в условиях солевого стресса.

Определение уровня метилирования последовательностей CCWGG в ДНК M. crystallinum. С помощью энзиматического метода, основанного на применении ДНК-метилтрансфераз EcoRII и BstNI, обнаружено, что в условиях засоления (0,5 М NaCl), при переключении С3-фотосинтеза на САМ-метаболизм наблюдается двукратное повышение уровня метилирования последовательностей CCWGG в ядерном геноме растений M. crystallinum (табл. 4).

Таблица 4.

Уровень CCWGG-метилирования в ДНК растений M. crystallinum ДНК Уровень метилирования (%) Контрольные растения 31,5±3,Стресс (0,5М NaCl) 67,2±5,Поиск мишеней для CCWGG-гиперметилирования в геноме M. crystallinum. Блотгибридизационный анализ ДНК контрольных и подвергнутых солевому стрессу растений M. crystallinum не показал различий в картине CCWGG-метилирования 5регуляторно-промоторной области гена PEP-карбоксилазы. В то же время, CCWGGметилирование этого гена имеет место, о чём свидетельствуют различия в картине гидролиза гена рестриктазой EcoRII (рис. 13, дор. 2, 4) и рестриктазой BstNI (рис. 13, дор. 1, 3).

Различия в картине гидролиза гена Ppc1 PEP-карбоксилазы рестриктазами MboI и Sau3A (рис. 13, дор. 5-8) свидетельствуют о CpG-метилировании цитозина в последовательностях GATCG этого гена. Однако у растений, растущих в нормальных физиологических условиях и в условиях солевого стресса, картина метилирования этих последовательностей в гене PEP-карбоксилазы также не изменяется. Таким образом, у растений M. crystallinum картина CpG- и CCWGG-метилирования промоторной области гена PEP-карбоксилазы при переключении С3-фотосинтеза на САМ-метаболизм не изменяется.

т.п.н. 1 2 3 4 5 6 7 23,9, 6,4,2,2,0,Рис. 13. Блот-гибридизационный анализ гена РЕР-карбоксилазы растений M. crystallinum.

1, 2, 5, 6 – ДНК контрольных растений; 3, 4, 7, 8 – ДНК растений, культивированных в условиях солевого стресса; 1, 3 – гидролиз рестриктазой BstNI; 2, 4 – гидролиз рестриктазой EcoRII; 5, 7 – гидролиз рестриктазой MboI; 6, 8 – гидролиз рестриктазой Sau3A.

т.п.н. 1 2 3 4 5 6 7 23,9,6,4,2,2,0,Рис. 14. Блот-гибридизационный анализ рибосомной ДНК растений M. crystallinum.

1, 2, 5, 6 – ДНК контрольных растений; 3, 4, 7, 8 – ДНК растений, культивированных в условиях солевого стресса; 1, 3 – гидролиз рестриктазой MspI; 2, 4 – гидролиз рестриктазой HpaII; 5, 7 – гидролиз рестриктазой BstNI; 6, 8 – гидролиз рестриктазой EcoRII.

Солевой стресс не влияет также и на метилирование ядерной рибосомной ДНК.

Блот-гибридизационный анализ ДНК растений, растущих в нормальных условиях и при засолении, показал отсутствие различий в картине метилирования CCWGGпоследовательностей в этой области генома (рис. 14, дор. 5-8).

К CCWGG-гиперметилированным мишеням генома растений M. crystallinum, растущих в условиях солевого стресса, относится фракция повторяющейся («сателлитной») ДНК. На это указывают результаты блот-гибридизационного анализа геномной ДНК M. crystallinum, где в качестве зонда использована меченная тотальная ДНК этих растений (рис. 15).

Присутствие на радиоэлектрофореграмме дискретных полос ДНК указывает на существование у растений M. crystallinum специфической фракции «сателлитной» ДНК. Анализ этой ДНК с помощью рестриктаз BstNI и EcoRII показал её существенное CCWGG-метилирование у растений, растущих как в нормальных, так и в стрессовых условиях засолённости (рис. 15, дор. 5-8).

При этом у растений в условиях засолённости наблюдается гиперметилирование этих последовательностей ДНК. На это указывает существенное повышение уровня её устойчивости к расщеплению рестриктазой EcoRII, чему соответствует почти полное отсутствие дискретных полос ДНК (рис. 15, дор. 8).

т.п.н. 1 2 3 4 5 6 7 23, 9,6,4,2,2,0,Рис. 15. Блот-гибридизационный анализ повторяющейся ДНК растений M. crystallinum.

1, 2, 5, 6 – ДНК контрольных растений; 3, 4, 7, 8 – ДНК растений, культивированных в условиях солевого стресса; 1, 3 – гидролиз рестриктазой MspI; 2, 4 – гидролиз рестриктазой HpaII; 5, 7 — гидролиз рестриктазой BstNI; 6, 8 – гидролиз рестриктазой EcoRII.

Таким образом, нами впервые обнаружено специфическое CCWGGгиперметилирование повторяющейся ДНК в клетках M. crystallinum в условиях включения экспрессии новой метаболической программы. Функциональная роль CCWGGгиперметилирования «сателлитной» ДНК, вероятно, связана с формированием специализированной структуры хроматина, одновременно регулирующей экспрессию множества генов в клетках этих растений при их адаптации к засолению и переключении С3-фотосинтеза на CAM-метаболизм.

Дальнейшее развитие этой работы может быть связано с выделением и характеристикой фракции CCWGG-гиперметилируемой повторяющейся ДНК, установлением её локализации на хромосомах растений M. crystallinum и с исследованием «CAMспецифической» структуры хроматина.

4. Анализ метилирования гена кальцитонина человека при лейкозах Анализ последовательностей CCGG. Гиперметилирование гена кальцитонина человека (КТ) в последовательностях CpG при злокачественных новообразованиях, включая лейкемии, наблюдали в различных работах. Ген КТ подвержен гиперметилированию в последовательностях CpG не только при развитии различных форм лейкозов, но и при некоторых других видах онкологических заболеваний. Данные о характере метилирования гена КТ при различных видах лейкемий остаются противоречивыми.

Целью нашей работы было исследование сайт-специфических CpG- и CpNpG-типов метилирования 5'-области гена кальцитонина человека при различных формах лейкемий и лечении заболеваний.

В работе исследовано метилирование 5'-области гена КТ в клетках костного мозга и ядросодержащих клеток периферической крови у 25 человек при лейкозах и 27 человек здоровых доноров. В качестве специфического зонда применяли 5'-фрагмент гена КТ длиной 1700 п.н., любезно предоставленный доктором S. Baylin.

ДНК гидролизовали чувствительной к метилированию внутреннего цитозина в последовательности CCGG рестриктазой HpaII и не чувствительной к этому типу метилирования рестриктазой МspI. Рестрикционная карта гена КЧ и различные варианты картины гидролиза 5'-области гена КТ рестриктазами MspI и HpaII представлены на рис. 16.

Гидролиз 5'-области гена КТ рестриктазой MspI приводит к появлению нескольких фрагментов, из которых три с размерами 0,5, 0,6 и 1,0 т.п.н. видны при гибридизации с применяемым зондом (рис. 17, дор. 2). Гидролиз рестриктазой HpaII демонстрирует появление дополнительного фрагмента размером 2 т.п.н. вследствие частичного метилирования цитозина в специфической последовательности 5'-области гена КТ, что является нормой для здоровых тканей (рис. 17, дор. 1).

Рис. 16. Рестрикционная карта и возможные варианты гидролиза 5'-области гена кальцитонина человека рестриктазами HpaII и MspI. Указаны экзоны (1, 2, 3) и координаты использованного зонда 1,7 т.п.н.

При лейкозных заболеваниях и гиперметилированном состоянии последовательностей CCGG в 5'-области гена КТ HpaII-картина блот-гибридизационного анализа способен выявить появление дополнительных аномальных рестрикционных фрагментов размером 1,2, 2,2, 2,6, и 3,1 т.п.н. (рис. 18, 19). Ввиду малой информативности рестрикционной картины гена КТ в области ниже 1,0 т.п.н. эта область на рис. 18-19 не 1 2 т.п.н. приводится. Из-за нечувствительности рестриктазы MspI к метилированию внутреннего цитозина в по2,следовательности CCGG MspI-картина блотгибридизации гена КТ у здоровых и больных людей остаётся одинаковой. Этот специфический внутренний контроль с помощью рестриктазы MspI выполнен со всеми препаратами ДНК, но приведён лишь однажды на рис. 18 (дор. 2) и на рис. 19 (дор. 6).

Одинаковая картина гибридизации с зондом гена 1,КТ наблюдалась во всех контрольных образцах (здоровые доноры), а также в ДНК периферической крови лиц из области зоны жёсткого контроля Чернобыльской АЭС.

0,Рис. 17 Картина гидролиза гена кальцитонина человека в норме.

0,1 – гидролиз рестриктазой HpaII; 2 – гидролиз рестриктазой MspI Гиперметилирование гена КТ при миелоидных лейкозах. Описанная картина наблюдалась при всех формах заболеваний: хроническом миелоидном лейкозе (ХМЛ), остром миелоидном лейкозе (ОМЛ) и миелодиспластическом синдроме (МДС). Гиперметилирование гена КТ обнаружено у всех больных ХМЛ (рис. 18, дор. 1-5) и всех первичных больных ОМЛ как в крови, так и в костном мозге (рис. 18, дор. 6, 10-14).

Аналогичные изменения в картине метилирования наблюдаются и при рецидиве заболевания (рис. 18, дор. 9, 16). Аномалии метилирования полностью или почти полностью исчезали по достижении ремиссии (рис. 18, дор. 15, 17) и не были обнаружены в ДНК клеток костного мозга больного ОМЛ спустя два года стойкой ремиссии (рис. 18, дор. 8).

В отдельных случаях был прослежен характер изменения метилирования гена КЧ во времени, в зависимости от эффективности химиотерапевтического воздействия.

Картина «патологического» гиперметилирования гена КЧ при первично-резистентном ОМЛ после трёх курсов химиотерапии не изменилась (рис. 18, дор. 6, 7). В то же время у пациентов с благоприятным прогнозом она нормализовалась по достижении ремиссии (сравнить дор. 14 и 15; 16 и 17). У пациента с МДС присутствие аномального фрагмента размером 3,1 т.п.н. в ДНК клеток костного мозга обнаружено ещё в фазе клинического благополучия при нормальном лейкоцитозе за 4 месяца до трансформации МДС в острый лейкоз (дор. 18 и 19). Гиперметилирование обнаружено и у другого больного с МДС в фазе трансформации в ОМЛ (рис. 18, дор. 20).

Таким образом, метилирование CCGG сайтов 5'-области гена КЧ является характерной особенностью опухолевой прогрессии при различных формах лейкозов миелоидной природы. Вопросы диагностической значимости статуса метилирования гена кальцитонина в клинической практике лейкозов являются предметом профессионального исследования нашего соавтора Д.В. Маринича и не выносятся в нашей работе на обсуждение.

Гиперметилирование гена КТ при остром лимфоидном лейкозе. Аналогичная особенность гиперметилирования 5'-области гена КЧ характерна также для случаев лимфоидных лейкозов (рис. 19). После курса химиотерапии в клетках костного мозга пациента с клиническим диагнозом гематологической ремиссии детектировалось гиперметилирование 5'–области гена КТ (рис. 19, дор. 1). Таким образом, на фоне клинической ремиссии отчетливо наблюдается «молекулярный рецидив» болезни.

Аномальные HpaII-фрагменты, за исключением слабо выявляемого фрагмента размером 1,2 т.п.н., исчезли через 3 недели после проведения дополнительного курса лечения (рис. 19, дор. 2), однако через 4 недели эти фрагменты появились вновь (рис. 19, дор. 3) и уже не исчезали вплоть до клинико-лабораторной констатации рецидива через 6 месяцев (рис. 19, дор. 4-5).

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 т.п.н.

3,2,2,1,1,Рис. 18. Анализ CpG-метилирования 5'-области гена кальцитонина пациентов с различными формами миелоидных лейкозов.

1 – ХМЛ, рецидив; 2 – тот же пациент, что и 1, гидролиз MspI; 3-5 – ХМЛ, терминальная стадия; 6 – ОМЛ, первичная диагностика; 7 – тот же пациент, что и 6, устойчивость к химиотерапии; 8 – ОМЛ, полная ремиссия; 9 – ОМЛ, рецидив; 10–14 – ОМЛ, первичная диагностика; 15 – тот же пациент, что и 14, полная гематологическая ремиссия; 16 – ОМЛ, рецидив; 17 – тот же пациент, что и 16, повторная ремиссия, 18 – МДС; – тот же пациент, что и 18, через 4 месяца, ОМЛ; 20 –трансформация МДС в ОМЛ. Везде гидролиз рестриктазой HpaII, кроме дорожки 2 (гидролиз MspI).

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 т.п.н.

3,2,2,1,1,Рис. 19. Анализ CpG-метилирования 5'-области гена кальцитонина пациентов с острым лимфоидным лейкозов.

1 – гематологическая ремиссия, «молекулярный рецидив»; 2 – тот же пациент, что и 1, дополнительный курс лечения; 3 – тот же пациент, что и 1, гематологическая ремиссия; 4 – тот же пациент, что и 1, костный мозг, клинический рецидив болезни; 5 – тот же пациент, что и 1, периферическая кровь, клинический рецидив болезни; 6 – первичная диагностика, гидролиз MspI; 7 – тот же пациент, что и 6, первичная диагностика; 8 – тот же пациент, что и 6, гематологическая ремиссия; 9 – ОЛЛ в фазе неустойчивой ремиссии; 10 – тот же пациент, что и 9, дополнительный курс лечения; 11 – тот же пациент, что и 9, гематологическая ремиссия, 8 мес. до клинического рецидива, «молекулярный рецидив»; 12 – гематологическая ремиссия, «молекулярный рецидив»; 13 – тот же пациент, что и 12, клинический рецидив; 14 – гематологическая ремиссия, мес. до клинического рецидива, «молекулярный рецидив»; 15 – ДНК клеток донорского костного мозга; 16 – ОЛЛ, трансплантация костного мозга; 17-18 – неустойчивая повторная ремиссия; 19 – тот же пациент, что и 17, второй клинический рецидив; 20-21 – ОЛЛ, первичная диагностика; 22-23 – ОЛЛ, устойчивость к химиотерапии. Везде гидролиз рестриктазой HpaII, кроме дорожки 6 (гидролиз MspI).

Таким образом, картина «молекулярного рецидива» появилась на 5 месяцев раньше первых клинических признаков рецидива болезни. Сходная корреляция между картиной метилирования гена КТ и клиническим состоянием была отмечена также при лечении других пациентов (рис. 19, дор. 11-14).

Анализ последовательностей CCWGG. В клетках млекопитающих, как и в клетках высших растений, ДНК может быть метилирована как в CpG, так и в CCWGGпоследовательностях (CpNpG-тип метилирования) [Clark et al., 1995]. Это поднимает вопросы о функциональной роли CpNpG-метилирования ДНК у млекопитающих и о специфичности генетических областей, подвергающихся CpNpG-метилированию. В этой связи ген КТ представляет особый интерес. Мы обратили внимание на то, что этот ген в своей 5'-концевой области содержит наряду с динуклеотидами CpG также и кластер последовательностей CCWGG (рис. 20), являющихся потенциальными мишенями для CpNpG-специфического метилирования ДНК [Broad et al., 1989]. До настоящего времени анализ состояния метилирования CCWGG последовательностей в 5'-концевой области гена КТ не проводился.

Нами исследовано CCWGG-метилирование 5'-области гена КТ в ДНК лейкоцитов ядросодержащих клеток костного мозга и периферической крови пациентов с миелоидными и лимфоидными лейкозами. В качестве контроля были использованы ДНК лейкоцитов периферической крови здоровых доноров. ДНК гидролизовали рестриктазой EcoRII, чувствительной к метилированию внутреннего цитозина в последовательностях CCWGG, и рестриктазой BstNI, не чувствительной к этому типу метилирования ДНК. В качестве зонда использовали 1,7 т.п.н. фрагмент 5'-концевой области гена КТ. Рестрикционная карта гена КТ представлена на рис. 20.

Блот-гибридизационный анализ 5'-области гена КТ с помощью рестриктазы BstNI и указанного зонда выявил ожидаемые нуклеотидные фрагменты с размерами 962, 331, 274, 235, 205, 157, 130, 101 и 83/80 п.н. (рис. 21).

Рис. 20. Рестрикционная карта и возможные варианты гидролиза 5'-области гена кальцитонина человека рестриктазами EcoRII и BstNI. Указан экзон (1) и координаты использованного зонда 1,7 т.п.н.

Относительно слабая интенсивность радиоактивного сигнала фрагмента размером 962 п.н. связана с незначительным перекрыванием его гибридизуемым зондом. Во всех случаях картина гидролиза 5'-области гена КТ рестриктазой EcoRII, чувствительной к присутствию m5C в узнаваемой последовательности, не отличалась от соответствующей BstNI-картины. Это указывает на отсутствие m5C в CCWGG последовательностях этой области гена как в норме, так и при различных формах лейкемий, характеризующихся CpG-гиперметилированием этой области гена. Известно, что в клетках млекопитающих при установлении de novo картины метилирования ДНК волна метилирования может распространяться не только на соседние CpG-сайты, но даже на отдельные остатки цитозина в непалиндромных последовательностях [Toth et al., 1990]. Однако ни в одном из проанализированных случаев нам не удалось обнаружить такого распространения метилирования на близлежащие последовательности CCWGG в 5'-области гена КТ. Таким образом, нами обнаружено, что CCWGGпоследовательности 5'-области гена кальцитонина человека, в отличие от гиперметилирования CpG-динуклеотидов, сохраняются неметилированными в процессе развития лейкозов.

В работах американских авторов было показано, что у культуры клеток первичных линий В-клеточной лимфомы и миеломы в промоторе неэкспрессируемого гена В-метилируются последовательности CCGG или CCWGG, но не обе эти последовательности одновременно [Malone et al., 2001]. Жёсткая обратная связь между метилированием этих последовательностей отмечена также для генома вируса мышиной лейкемии Молони [Lorincz et al., 2000] и миотического гена myf-3 [Franchina, Kay, 2000].

Рис. 21. Анализ состояния метилирования сайтов CCWGG в 5'-области гена кальцитонина человека в норме и при лейкозах.

А – pUC19/MspI; 1, 2 – острый лимфоидный лейкоз, полная ремиссия; 3, 4 – острый лимфоидный лейкоз, рецидив; 5, 6 – острый миелоидный лейкоз, первая атака; 7, 8 – хронический миелоидный лейкоз, бластный криз; 9, 10 – норма. 1, 3, 5, 7, 9 – гидролиз рестриктазой EcoRII; 2, 4, 6, 8, 10 – гидролиз рестриктазой BstNI.

В то же время полученные нами данные о постоянном отсутствии CCWGGметилирования в 5'-области гена кальцитонина человека могут указывать на особый «безальтернативный» CpG-тип метилирования протяжённой последовательности ДНК.

С целью изучения влияния CpNpG-метилирования ДНК на уровень метилирования CpG-последовательностей в дальнейшей работе было проведено исследование экспрессии в клетках эпителиального слоя почек человека полученного нами модифицированного гена бактериальной ДНК-метилтрансферазы MEcoRII.

5. Трансген-индуцированное CCWGG метилирование ДНК клеток эпителиального слоя почек человека Получение трансгенных клеток, экспрессирующих модифицированный ген NLSМEcoRII-GFP Для трансфекции клеток HK293 получена плазмида pEcoGFP-N3, содержащая генетическую конструкцию, кодирующую модифицированный ген NLSМEcoRII, сшитый с зелёным флуоресцентным белком (GFP) под контролем промотора цитомегаловируса (CMV) (рис. 22). Поскольку клетки HK293 не чувствительны к антибиотику G418 неомицинового ряда, а полученная плазмида содержала только ген устойчивости к неомицину, то гены GFP и NLS-МEcoRII-GFP были перенесены в вектор с устойчивостью к пуромицину pIGFP (рис. 22). Этот бицистронный вектор содержит IRES (internal ribosome entry site) за полилинкером, что обеспечивает совместную транскрипцию генов GFP или NLS-МEcoRII-GFP вместе с геном устойчивости к пуромицину под контролем CMV-промотора.

Трансфекцию клеток проводили стандартным Ca-фосфатным методом. Свечение GFP наблюдали при ультрафиолетовом освещении в флуоресцентном микроскопе при экспрессии как самого GFP (контроль), так и NLS-МEcoRII-GFP слитого белка (рис. 23). Поскольку фолдинг белковых молекул начинается с N-конца, флуоресценция GFP, расположенного на С-конце химерного белка указывает на правильную укладку его N-концевой части, содержащей ДНК-метилтрансферазу EcoRII. Клетки после трансфекции были отобраны на среде с пуромицином и фракционированы с помощью сортировщика клеток MoFlo MLS (Daco Cytomation, США) по флуоресценции GFP (рис. 24).

5.1. Анализ метилирования генома трансформированных клеток, экспрессирующих ген химерного белка NLS-МEcoRII-GFP De novo метилирование сайтов CCWGG. Сравнительный гидролиз высокомолекулярной ДНК трансформированных клеток НК293 рестриктазами EcoRII и BstNI, подтверждает функциональную активность ДНК-метилазы EcoRII и её почти полное CCWGG метилирование в клетках с геном NLS-M·EcoRII-GFP (рис. 25, табл. 6).

HindIII HindIII XhoI HindIII EcoRI/NotI NheI/NotI Рис. 22. Схема клонирования гена NLS-МEcoRII в вектор для экспрессии в животных клетках.

А В Рис. 23. Вид трансформированных клеток НК293 в флуоресцентном микроскопе в обычном (А) и ультрафиолетовом (В) свете.

Рис. 24. Графики сортировки трансформированных клеток НК293, экспрессирующих только GFP (А) или слитый белок NLS-МEcoRII-GFP (В) Таблица Уровень CCWGG-метилирования в ДНК трансформированных клеток HK2Линия клеток Уровень метилирования, % M·EcoRII-GFP экспрессирующая 93,9±4,GFP экспрессирующая 55,2±3,Нетрансформированные клетки 57,6±3, Анализ метилирования последовательностей CCGG. С целью исследования эффекта экспрессии ДНК-метилтрансферазы M·EcoRII на CpG-метилирование был проведён анализ метилирования CCGG-последовательностей ДНК трансформированных клеток. Для этого сравнивали степень гидролиза геномной ДНК рестриктазами HpaII и MspI. После гидролиза липкие концы образовавшихся фрагментов ДНК были мечены включением [32P]dCTP с помощью фрагмента Клёнова.

т.п.н. 1 2 3 4 5 ДНК фага 10,8,6,5,4,3,2,1,1,0,Рис. 25. Рестрикционный анализ ДНК трансформированных клеток HK293.

1 – негидролизованная ДНК клеток HK293 (GFP); 2 – негидролизованная ДНК клеток HK293 (NLS-M·EcoRII-GFP); 3 – ДНК клеток HK293 (GFP), гидролиз EcoRII; 4 – ДНК клеток HK293 (GFP), гидролиз BstNI; 5 – ДНК клеток HK293 (NLS-M·EcoRIIGFP), гидролиз EcoRII; 6 – ДНК клеток HK293 (NLS-M·EcoRII-GFP), гидролиз BstNI Соотношение включённой метки в гидролизатах HpaII/MspI отражает относительное количество неметилированных CCGG сайтов. Результаты анализа указывают на отсутствие изменения общего уровня CpG-метилирования в ДНК клеток, экспрессирующих M·EcoRII-GFP (табл. 7). Таким образом, трансген-индуцированное CCWGGметилирование генома клеток НК293 не оказывает заметного влияния на уровень его CpG-метилирования.

Таблица Уровень метилирования CCGG сайтов в ДНК трансформированных клеток HK2R·HpaII концы R·MspI концы Линия клеток R·HpaII/R·MspI (имп/мин/мкг) (имп/мин/мкг) M·EcoRII-GFP экспрессирующая 2349±243 9752±994 0,2GFP экспрессирующая 1834±195 7582±810 0,2Нетрансформированные клетки 1957±213 8050±877 0,2Состояние CpG-метилирования промоторов генов SERPIN B5 и APC. Поскольку данные по тотальному метилированию в ДНК последовательностей CCGG прямо не отражают степень CpG-метилирования промоторных областей отдельных генов, был проведён анализ уровня метилирования CpG-последовательностей промоторов двух индивидуальных генов. Промотор гена SERPIN B5 характеризуется его полным CpGметилированием в клетках НК293, тогда как промотор гена супрессора опухолей АРС (adenomatous polyposis coli) отличается отсутствием метилирования его CpGдинуклеотидов. [Futscher et al., 2002; Esteller et al., 2000]. Такая особенность состояния CpG-метилирования этих промоторов наблюдалась в контрольных клетках, экспрессирующих только ген GFP, и сохранялась в клетках, экспрессирующих NLSМEcoRII-GFP (рис. 26, 27). Анализ метилирования промоторной области гена SERPIN B5 с помощью метода бисульфитного секвенирования показал, что во всех секвенированных клонах рекомбинантная метилаза M·EcoRII-GFP осуществляет полное CCWGG-метилирование этого промотора.

Рис. 26. Анализ метилирования промотора гена SERPIN B5.

Красным показана степень метилирования CpG-сайтов в клетках, экспрессирующих только ген GFP. Жёлтым показана степень метилирования CpG-сайтов в клетках, экспрессирующих NLS-МEcoRII-GFP Рис. 27. Анализ метилирования промотора гена APC.

Красным показана степень метилирования CpG-сайтов в клетках, экспрессирующих только ген GFP. Жёлтым показана степень метилирования CpG-сайтов в клетках, экспрессирующих NLS-МEcoRII-GFP При этом, несмотря на присутствие метилированных сайтов CCWGG в этом промоторе, уровень его CрG-метилирования не изменялся (рис. 26). Таким образом, трансген-индуцированное CCWGG-метилирование промотора гена SERPIN B5 не влияет на его CpG-метилирование.

Результаты анализа промоторной области гена АРС показали, что во всех 10 секвенированных клонах метилаза M·EcoRII-GFP также осуществляет его полное CCWGGметилирование. Появление метилированных сайтов CCWGG в этой промоторной области не индуцировало заметного метилирования практически всех CpG-сайтов (рис. 27).

Таким образом, CCWGG-метилирование ДНК не оказывает существенного эффекта как на индуцирование метилирования немодифицированных CpG-сайтов промоторных областей индивидуальных генов, так и на блокирование их CpGметилирования.

Анализ экспрессии CCWGG-метилированного гена АРС. Методом количественной RT-PCR определён уровень экспрессии генов АРС и hTERT. РНК выделяли из клеток экспрессирующих MEcoRII-GFP и клеток, экспрессирующих только GFP. Амплификацию проводили с использованием набора iScript RT-PCR с применением флуоресцентного красителя SYBR green (Bio-Rad, США). В каждом эксперименте для построения калибровочных кривых использовались пять точек разбавления РНК в диапазоне от 3,125 нг до 50 нг суммарной РНК. Уровень экспрессии гена hTERT использовали в качестве контроля, поскольку CpG-метилирование его промотора не приводит к обязательному замолканию гена [Devereuks et al., 1999; Dessain et al., 2000].

Уровень экспрессии генов АРС и hTERT в клетках с MEcoRII-GFP оставался на том же уровне, что и в клетках, экспрессирующих только GFP. Таким образом, CCWGG-метилирование промоторов исследованных генов не влияло на уровень их экспрессии (рис. 28).

Проведённый анализ также показал отсутствие влияния CCWGG-метилирования на уровень экспрессии гена hTERT. По-видимому, CCWGG-метилирование не участвует в регуляции экспрессии исследованных генов.

Можно заключить, что интеграция в геном клеток HK293 модифицированной бактериальной метилтрансферазы M·EcoRII приводит к метилированию большинства CCWGG сайтов в их геноме. Однако, несмотря на значительное повышение уровня CCWGG-метилирования ДНК, оно не влияет как на общее метилирование CpGпоследовательностей генома трансформированных клеток, так и на CpGметилирование индивидуальных генов.

Следует отметить, что в наших экспериментах мы не наблюдали индуцированное CCWGG-метилированием возникновение и распространение волны метилирования на любые другие остатки цитозина в исследуемых последовательностях ДНК. Результаты нашей работы не подтверждают существование жёсткой обратной взаимосвязи между CpG- и CpNpG-типами метилирования ДНК и указывают на отсутствие влияния CpNpG-метилирования на генетическую экспрессию. Эти данные, однако, не противоречат ситуации, когда в специфических областях генома трансформированных клеток может сохраняться безальтернативный CpG-тип метилирования.

А В Рис. 28. Сравнение уровней экспрессии генов APC и hTERT в клетках, экспрессирующих GFP или MEcoRII-GFP.

Показаны значения Ct (cycle threshold), соответствующие значениям разведения анализируемой РНК. А – данные для гена hTERT; B – данные для гена APC; квадраты – данные для клеток, экспрессирующих MEcoRII-GFP; ромбы – данные для клеток, экспрессирующих GFP. Полученные для каждого разведения данные указывают на отсутствие существенной разницы в уровне экспрессии генов APC и hTERT в обоих клеточных линиях.

Этому соответствуют данные, полученные нами при биоинформационном анализе генома человека. Нами была проанализирована встречаемость CG, CWG, CCWGG и некоторых других последовательностей во всём геноме и в областях, фланкирующих 28501 индивидуальных генов (табл. 8).

Из случайной встречаемости, CG-динуклеотидов должно было бы быть значительно больше, чем CWG-последовательностей, в то время как общее число последовательностей CG и CWG в геноме человека составляет соответственно 28163853 и 115802370. Это отражает уже известный многократный дефицит последовательностей CG в сравнении с GC-последовательностями в геномах высших животных.

Таблица Отношение реального к теоретически рассчитанному количеству некоторых фланкирующих гены последовательностей в геноме человека CG CWG CCWGG всего в геноме 0,2356507 1,341659605 3,313725104 п.н./5' 0,375492 1,346793 3,4230350 п.н./5' 0,371113 1,358913 3,5437300 п.н./5' 0,377446 1,347656 3,4441250 п.н./5' 0,385302 1,349094 3,4834200 п.н./5' 0,396256 1,360905 3,3464200 п.н./3' 0,225111 1,343136 3,1246250 п.н./3' 0,228525 1,337590 3,0911300 п.н./3' 0,230770 1,349032 3,1979350 п.н./3' 0,234954 1,352709 3,1289104 п.н./3' 0,227323 1,348970 3,282Эта величина для промоторной области больше, чем для 3'-области, что соответствует сблоченности этой последовательности в CpG-островках [Bird et al., 1986]. В то же время, частота встречаемости последовательности CCWGG более чем в три раза выше расчётной величины и значительно выше величины для последовательности CWG. Эта выявленная особенность, по-видимому, отражает различную структурнофункциональную роль последовательностей CWG и CCWGG в геноме человека.

Эффект CCWGG-метилирования на активность ДНК-метитрансферазы DNMT1. Проведено сравнение активности DNMT1 на субстратах, не содержащих 5метилцитозин, содержащих метилированный сайт CCWGG, содержащих метилированный сайт CG и одновременно содержащих метилированные сайты CCWGG и CG (рис. 29). Этот анализ подтвердил, что метилтрансфераза DNMT1 наиболее эффек тивна на асимметрично метилированных последовательностях CpG. При этом скорость метилирования асимметрично метилированных сайтов CpG существенно не изменялась в случае присутствия близкорасположенных метилированных сайтов CCWGG (рис. 29).

6. Применение ДНК-метилтрансфераз в нанобиотехнологии В настоящее время нанобиотехнология — одно из наиболее активно развивающихся и перспективных направлений биологических наук. Целью нанобиотехнологии является создание новых материалов и надмолекулярных конструкций с использованием биологических макромолекул, в первую очередь белков и нуклеиновых кислот.

Рис. 29. Эффективность включения CH3-групп в олигодезоксинуклеотидные субстраты с различным метилированием.

1 – 5'-tggCGgtgctgcCCAGGtgagccacCGctgcttctgcccagaca-3' 3'-accGCcacgacgGGTCCactcggtgGCgacgaagacgggtctgt-5' m 2 – 5'-tggCGgtgctgcCCAGGtgagccacCGctgcttctgcccagaca-3' 3'-accGCcacgacgGGTCCactcggtgGCgacgaagacgggtctgt-5' m m 3 – 5'-tggCGgtgctgcCCAGGtgagccacCGctgcttctgcccagaca-3' 3'-accGCcacgacgGGTCCactcggtgGCgacgaagacgggtctgt-5' 4 – 5'-tggCGgtgctgcCCAGGtgagccacCGctgcttctgcccagaca-3' 3'-accGCcacgacgGGTCCactcggtgGCgacgaagacgggtctgt-5' m В нанобиотехнологии можно использовать способность белков к связыванию со специфическими последовательностями ДНК. В этой связи перспективным объектом являются сайт-специфические (цитозин-С5)ДНК-метилтрансферазы. Одним из возможных практических применений нанобиотехнологий является создание противораковых препаратов. Развитие онкологических заболеваний сопровождается гиперметилированием специфических последовательностей ДНК, в том числе и геновсупрессоров опухолей. Ингибирование ДНК-метилтрансферазной активности может блокировать опухолевую прогрессию, что поднимает вопросы разработки ингибиторов ДНК-метилтрансфераз для их клинического применения.

Первые применяемые ингибиторы ДНК-метилтрансфераз представляли собой производные 5-азацитидина, которые ковалентно и необратимо связывались с цистеиновым остатком в активном центре фермента, тем самым блокируя его активность. Однако, включаясь в молекулы вновь синтезированной ДНК клетки и необратимо связываясь с молекулами цитозиновых ДНК-метилтрансфераз, 5-азацитидин способен инициировать нарушение нормальных процессов репликации и транскрипции и вызывать формирование аномальной структуры хроматина. Случайное включение 5азацитидина в ДНК способно вызвать её неспецифическое деметилирование, что может инициировать экспрессию онкогенов.

Для снижения неспецифического токсического воздействия 5-азацитидина на клетку нами были разработаны и проверены новые методы подбора ингибирующих структурных аналогов цитидина. Таким менее токсичным производным оказался 5фтордезоксицитидин.

Двуцепочечные олигонуклеотиды с 5-азацитидином в их составе относятся ко второму поколению ингибиторов цитозиновых ДНК-метилтрансфераз, не включающихся в ДНК.

Проведены эксперименты по оценке эффективности связывания модельной ДНКметилазы HhaI с ингибиторами ДНК-метилтрансфераз второго поколения. Для этого были синтезированы комплементарные олигонуклеотиды длиной 30 оснований: 5'TCACCAGATG(5FC)CTGTAGGTCGTGTG(5FC)GCTGGTTCCACCAGAG(5FC)GCTT GACCTGTAGTT-3' и 5'-AACTACAGGTCACAG(5mC)GCTCTGGTGGAACCAG(m5C) GCACACGACCTACAG(m5C)GCATCTGGTGA-3'. Олигонуклеотиды включали три асимметрично метилированных по одной цепи сайта узнавания CGCG для ДНКметилазы HhaI, причём в другой цепи метилируемый внутренний цитидин был заменен на 5-фтордезоксицитидин. Такие каталитические «капканы» предназначались для связывания метилазы DNMT1, которая имеет повышенное сродство к асимметрично метилированной ДНК в сайтах CрG.

Анализ продуктов связывания с помощью капиллярного электрофореза и электрофореза в полиакриламидном геле выявил образование всех теоретически ожидаемых комплексов: свободного олигонуклеотида и олигонуклеотида с одной присоединенной молекулой HhaI, с двумя и с тремя молекулами HhaI (рис. 30).

Рис. 30 Анализ продуктов связывания ДНК-метилтрансферазы HhaI c 30-членным дуплексным олигонуклеотидом-ингибитором:

5'-tcaccagatg5Fcctgtaggtcgtgtg5Fcgctggttccaccagag5Fcgcttgacctgtagtt-3' 3'-agtggtctacgmcgacatccagcacacgmcgaccaaggtggtctcgmcgacactggacatcaa-5' A – результаты анализа продуктов связывания, полученные капиллярным электрофорезом В – результаты анализа продуктов связывания, полученные электрофорезом в полиакриламиде Создание ингибиторов ДНК-метилтрансфераз третьего поколения. Вероятность встречи ДНК-метилазы с ингибирующим линейным олигонуклеотидным дуплексом (второе поколение ингибиторов) можно увеличить только повышением концентрации самого ингибитора. Негативным фактором остаётся также равномерное распределение ингибитора по объёму всей клетки вместо его локализации в клеточном ядре.

Ингибиторы третьего поколения, представляют собой сложные олигонуклеотидные структуры или олигонуклеотид-белковые комплексы (рис. 31).

Сконструированные ингибиторы имитировали форму репликативной вилки (Yструктуру), к которой ДНК-метилтрансфераза DNMT1 имеет повышенное сродство.

В процессе проектирования ингибиторов третьего поколения применялось трёхмерное молекулярное моделирование (рис. 32).

Сборку этой структуры проводили путём последовательного отжига всех трёх частично комплиментарных олигонуклеотидов.

Рис. 31. Схема сборки олигонуклеотидного ингибитора и его связывание с ДНКметилтрансферазой HhaI.

Рис. 32. Компьютерная модель связывания олигонуклеотидного ингибитора с ДНКметилтрансферазой HhaI.

При связывании модельной ДНК-метилтрансферазы HhaI с Y-структурой наблюдалось формирование всех трёх возможных форм, соответствующих комплексам с одной, двумя или тремя молекулами фермента (рис. 33). Степень насыщения всех трёх сайтов связывания была пропорциональна повышению концентрации ДНКметилтрансферазы HhaI и обратно пропорциональна концентрации самого ингибитора (рис. 34).

Рис. 33. Сборка и связывание ДНК-метилтрансферазы HhaI с олигонуклеотидной Yструктурой (анализ капиллярным электрофорезом) Рис. 34. Кинетика связывания HhaI ингибитором третьего поколения Проведены эксперименты по оценке специфичности связывания ДНКметилтрансфераз с полученными ингибиторами. Для этого была собрана Y-структура, содержащая различные сайты узнавания: два сайта для МHhaI и один сайт для МEcoRII. Обе ДНК-метилтрансферазы связывались специфично и с высокой избирательностью. В отдельном эксперименте была показана способность ингибитора специфично связывать метилазу МEcoRII из частично очищенного бесклеточного экстракта, то есть в условиях, имитирующих работу ингибитора в клетке. Комплекс МEcoRII с ингибитором выявлялся в виде единичной полосы с молекулярной массой несколько бльшей, чем продукт связывания с одной молекулой МHhaI, что соответствует разнице в молекулярной массе этих ферментов: 57,5 kDa для МEcoRII и 39,5 kDa для МHhaI.

В реакции с метилазой HhaI наблюдалось образование комплексов ингибитора с одной и двумя молекулами метилазы HhaI. В реакции одновременно с двумя ДНКметилтрансферазами МHhaI и МEcoRII наблюдалось формирование всех трёх возможных комплексов, что указывает на высокую специфичность ингибитора (рис. 35).

Для повышения стабильности Y-структуры к ней была ковалентно присоединена по сайту узнавания ДНК-метилтрансфераза МEcoRII. В полученной конструкции ДНК-метилтрансфераза МEcoRII содержала сигнал ядерной локализации для направленного переноса этого надмолекулярного комплекса в клеточное ядро.

Рис. 35. Сборка и связывание ДНК-метилтрансфераз HhaI и EcoRII с олигонуклеотидной Yструктурой (анализ капиллярным электрофорезом) ВЫВОДЫ 1. Разработан энзиматический метод определения уровня метилирования внутреннего цитозина в последовательности CCWGG эукариотических ДНК (CpNpG-тип метилирования) с помощью ДНК-метилтрансфераз EcoRII и BstNI.

2. Получена рекомбинантная агробактериальная Ti-плазмида дикого типа с интегрированным в область Т-ДНК неэкспрессируемым геном ДНКметилтрансферазы EcoRII (MEcoRII). Этой плазмидой осуществлена генетическая трансформация клеток Nicotiana tabacum. Ген MEcoRII индуцировал у первичной трансформированной клеточной линии образование новых морфологических и биохимических фенотипов. Установлен пониженный уровень CCWGG-метилирования ДНК этих клеток, что может быть связано с инактивацией одного из генов ДНК-метилтрансфераз.

3. Для трансген-индуцированного CCWGG-метилирования ДНК в клетках эукариот получены модифицированные формы экспрессируемого гена M·EcoRII, кодирующие этот фермент, слитый с сигналом ядерной локализации (NLS- M·EcoRII) и зеленым флуоресцентным белком (NLS- M·EcoRII-GFP).

4. Экспрессия гена NLS-M·EcoRII в клетках растений Nicotiana tabacum приводит к изменениям морфологического фенотипа трансформированных растений и к дополнительному CCWGG-метилированию их ДНК.

5. В условиях засоления, при переключении С3- на С4-фотосинтез, наблюдается двукратное повышение уровня метилирования последовательности CCWGG в ДНК растений Mesembryanthemum crystallinum. К CCWGG-гипер-метилированным мишеням генома растений относится фракция повторяющейся ДНК, что может указывать на специфическую функциональную роль CCWGG-метилирования этой ДНК в образовании специализированной структуры хроматина при адаптации растения к солевому стрессу и переключении на САМ-метаболизм.

6. Проведён анализ статуса метилирования внутреннего цитозина в последовательностях CCWGG 5'-концевой области гена кальцитонина человека в клетках периферической крови и костного мозга при различных видах лейкозов. Эти последовательности сохраняются неметилированными как в норме, так и при лейкозах, сопровождающихся их CpGгиперметилированием. Таким образом, гиперметилирование динуклеотидов CpG в промоторной области гена кальцитонина человека не распространяется на близлежащий блок последовательностей CCWGG. Сформулировано положение о существовании особого безальтернативного CpG-метилирования генома эукариот.

7. Осуществлена и исследована экспрессия ДНК-метилтрансферазы EcoRII в модифицированной форме NLS-M·EcoRII-GFP в клетках культуры эпителиального слоя почек человека. Трансген-индуцированное CCWGGметилирование ДНК этих клеток не влияет на CpG-метилирование их генома. CCWGG-метилирование промотора гена АРС не влияет на его экспрессию в трансформированных клетках. Установлено отсутствие эффекта CCWGG-метилирования олигодезоксинуклеотидных субстратов на активность ДНК-метилтрансферазы DNMT1 in vitro. Выявлены особенности частоты встречаемости сайтов CWG и CCWGG в геноме человека, указывающие на их возможную различную структурно-функциональную роль.

8. Для применения в нанобиотехнологии и для ингибирования цитозиновых ДНК-метилтрансфераз in vivo сконструированы и исследованы олигодезоксинуклеотиды и олигодезоксинуклеотид-белковые комплексы на основе модифицированных производных цитозина и ДНКметилтрансферазы EcoRII.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ Обзоры:

1. Buryanov Ya.I., Shevchuk T. The use of prokaryotic DNA methyltransferases as experimental and analytical tools in modern biology // Analitical Biochemistry, 2004, V.338, P.1-11.

2. Clark J., Shevchuk T., Swiderski P.M., Dabur R., Crocitto L.E., Buryanov Ya.I., Smith S.S. Construction of ordered protein arrays // Methods in Molecular Biology, 2004, V. 300, P.325-348.

3. Бурьянов Я.И., Шевчук Т.В. ДНК-метилтрансферазы и структурнофункциональная специфичность модификации эукариотических ДНК // Биохимия, 2005, Т. 70, № 7, С. 885-899.

Статьи:

4. Buryanov Ya.I., Shevchuk T.V., Belokopitov B.F. DNA resistance to specific restriction endonucleases as a genetic marker in microbial release experiments // Molecular Ecology, 1994,V.3,№6,P.606.

5. Buryanov Ya.I., Zacharchenko N.S., Shevchuk T.V., Bogdarina I.G. Effect of the M•EcoRII methyltransferase-encoding gene on the phenotype of Nicotiana tabacсum transgenic cells // Gene,1995,V.157, P.283-26. Маринич Д.В., Воробьев И.А., Смольникова В.В., Холмс Дж., Бабан Д., Шевчук Т.В., Бурьянов Я.И., Мирошников А.И. Гиперметилирование гена кальцитонина человека при лейкозах миелоидного происхождения // Гематология и трансфузиология, 1999,№4,C.7-10.

7. Бурьянов Я.И., Шевчук Т.В. Использование ДНК-метилтрансфераз для определения уровня метилирования цитозина в последовательности ДНК CCWGG // Биоорганическая Химия, 1999,Т.25,№8,С.630-633.

8. Бурьянов Я.И., Шевчук Т.В., Захарченко Н.С., Дьяченко О.В., Маринич Д.В., Воробьёв И.А. Отсутствие CNG-типа метилирования в 5’-концевой области гена кальцитонина человека в норме и при лейкозах // Биоорганическая химия, 2000,Т.26,№5,С.397-399.

9. Шевчук Т.В., Захарченко Н.С., Дьяченко О.В., Бурьянов Я.И. Влияние гена ДНК-метилтрансферазы EcoRII на фенотип трансгенных опухолевых линий Nicotiana tabacum и уровень метилирования последовательностей CpNpG в их геноме // Физиология Растений,2001,Т.48,№4,С.478-410. Маринич Д.В., Усс А.Л., Смирнова Л.А., Воробьев И.А., Холмс Дж., Сулимова Г.Е., Шевчук Т.В., Бурьянов Я.И. Гиперметилирование гена кальцитонина человека как молекулярный маркер острой лимфоидной лейкемии // Вопросы медицинской химии, 2001,Т.47,№5,С.537-546.

11. Clark J., Shevchuk T., Kho M.R., Smith S.S. Methods for the designs and analysis of oligodeoxynucleotide-based DNA (cytosine-5)methyltransferase inhibitors // Analitical Biochemistry,2003, V.321,P.50-64.

12. Clark J., Shevchuk T., Swiderski P.M., Dabur R., Crocitto L.E., Buryanov Ya.I., Smith S.S. Mobility-shift analysis with microfluidics chips // BioTechniques,2003,V.35,P.548-513. Маринич Д.В., Воробьев И.А., Холмс Дж., Захарченко Н.С., Дьяченко О.В., Бурьянов Я.И., Шевчук Т.В. Гиперметилирование 5’-области гена кальцитонина человека при лейкозах: структурные особенности и диагностическая значимость // Биохимия,2004,Т.69,№3,С.420-414. Shevchuk T., Kretzner L., Munson K., Axume J., Clark J., Dyachenko O., Caudill M., Buryanov Ya., Smith S. Trangene-induced CCWGG methylation does not alter CG methylation pattering in human kidney cells // Nucleic Acids Research,2005,V.33,No.19,P.6124-6115. Дьяченко О.В., Захарченко Н.С., Шевчук Т.В., Бонерт Х., Кушман Дж., Бурьянов Я.И. Гиперметилирование CCWGG последовательностей в ДНК растений Mesembryanthemum crystallinum при их адаптации к солевому стрессу // Биохимия,2006,Т.71,№4,С.570-516. Watson B., Munson K., Clark J., Shevchuk T., Smith S.S. Distribution of CWG and CCWGG in the Human Genome // Epigenetics, 2007,V.2,P.151-1






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.