WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

 

                               

                                                                               На правах рукописи

Одинцова Татьяна Игоревна

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ОСОБЕННОСТИ ЗАПАСНЫХ И ЗАЩИТНЫХ БЕЛКОВ РАСТЕНИЙ И ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ В ГЕНЕТИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ

Специальности: 03.00.15 – генетика

                                        03.00.04 – биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Москва - 2010

Работа выполнена в лаборатории генетики растений Учреждения Российской академии наук Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН

Официальные оппоненты: доктор биологических наук О.А. Огаркова

                      доктор биологических наук А.А. Соловьев

                      доктор биологических наук М.А. Белозерский

Ведущая организация: кафедра генетики Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова

Защита состоится «_24_»__июня__2010 г. в_14 час. 00 мин.

На заседании диссертационного совета Д 002.214.01 при Учреждении Российской академии наук Институте общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН по адресу: 119991, ГСП-1, Москва, ул. Губкина 3. Факс: (499)132-12-89, электронная почта: iogen@vigg.ru, Интернет: www.vigg.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН.

Автореферат разослан «___»_______________2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук Т.А. Синельщикова Т.А. Синельщикова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Секвенирование ряда геномов в последнее десятилетие позволило установить последовательности огромного числа генов, однако не решило всех вопросов, связанных с их функциями и регуляцией экспрессии. Исследование протеома – совокупности белков клетки, составляющих транслируемую часть генома, открывает новые возможности для идентификации генов, связанных с определенными функциональными состояниями отдельной клетки и организма в целом. Изучение белков - продуктов генов - с использованием современных методов анализа позволяет получить важную информацию о тонкой структуре генов и дополняет геномные исследования. Протеомный анализ растений уже сейчас с успехом используется для решения разнообразных генетических задач, таких как экспрессия генов в различных органах растения и на различных стадиях развития, при симбиозе, в ответ на биотический и абиотический стресс или иные воздействия), сравнение генотипов (характеристика мутантов, дифференциация линий, установление филогенетических взаимоотношений), изучение структуры генетической изменчивости в природных популяциях (Алтухов, 1989).

Запасные белки пшеницы, представленные мономерными глиадинами и полимерными глютенинами, контролируются несколькими локусами, состоящими из тесно сцепленных между собой генов. (Созинов, 1985). Наиболее полиморфными являются глиадинкодирующие локусы. И хотя генетический контроль глиадинов изучен, различия в структуре кодируемых ими белков в большинстве случаев неизвестны. Исследования первичной структуры глиадинов позволят понять структуру и эволюцию генов глиадинов, а также глиадинкодирующих кластеров в целом.

Сравнительный анализ глиадинов полиплоидной пшеницы и предполагаемых диплоидных доноров геномов предлагает подходы к решению проблемы филогении пшениц. Известно, что геном гексаплоидного вида T. aestivum состоит из трех геномов предковых диплоидных видов – доноров геномов АА, ВВ и DD. Вопрос о происхождении геномов, особенно генома В, до сих пор окончательно не решен (Feldman et al., 2001; Гончаров, 2007). В связи с этим исследования глиадинов диплоидных видов являются чрезвычайно актуальными, поскольку могут пролить свет на этот вопрос.

Интерес к изучению проламинов пшеницы связан также с уникальными физико-химическими свойствами этих белков, обусловливающими вязкоэластичные свойства клейковины. Несмотря на то, что проламины пшеницы интенсивно изучаются в последние десятилетия, структура клейковинного комплекса до сих пор не установлена (Shewry, 2009; Shewry and Halford, 2002). В этой связи особое значение имеет дисульфидное картирование проламинов, так как дисульфидным связям принадлежит решающая роль в формировании структуры клейковины (Wieser, 2007). Помимо фундаментального значения для выяснения организации и функционирования надмолекулярных белковых комплексов, структурно-функциональные исследования проламинов пшеницы важны для целенаправленной селекции на создание высокоурожайных сортов, обладающих улучшенными технологическими качествами (Salekdeh and Komatsu, 2007; Shewry et al., 2008).

Наряду со структурными исследованиями запасных белков, не меньшую роль играют и исследования их генетически детерминированного полиморфизма, который широко используется в филогенетических и популяционных исследованиях, а также в селекции для идентификации сортов, проверки их чистоты, выявления гибридов и др. (Созинов, 1985). Однако для ряда культур, в частности, для представителей семейства тыквенных, полиморфные белковые системы слабо изучены. Выявление таких систем является чрезвычайно актуальным, поскольку позволит использовать их в селекционной практике.

Другой важнейшей группой генов растений являются гены защитных белков, которые определяют устойчивость растений к патогенам и абиотическому стрессу. Изучение защитных белков – продуктов этих генов - имеет фундаментальное значение для выяснения молекулярных механизмов врожденного иммунитета растений. Кроме того, такие исследования имеют и большое практическое значение для поиска кандидатных генов, способных усилить защитный потенциал растений, которые могут быть использованы при трансформации растений для повышения их устойчивости к патогенам и абиотическому стрессу. Усиление устойчивости растений может быть достигнуто как путем повышения уровня экспрессии собственных генов, участвующих в защитных реакциях, так и путем встраивания генов, кодирующих белки и пептиды с антимикробными свойствами, из других видов растений. Все это требует детального анализа защитного арсенала растений, который слабо изучен. В растениях идентифицированы гены устойчивости (R гены), обеспечивающие защиту от определенных рас патогенов (Keller et al., 2000). Однако молекулярные процессы, инициируемые продуктами R генов, в большинстве случаев детально не исследованы. Роль важнейших компонентов защитной системы растений - PR-белков, также изучена недостаточно. Обнаружение в 90х годах в растениях антимикробных пептидов, обладающих широким спектром антимикробного действия, открыло новые возможности для создания устойчивых форм растений, поскольку гены антимикробных пептидов могут быть непосредственно встроены в геномы чувствительных к патогенам растений с использованием методов генетической трансформации (Carlini, Grossi-de-Sa, 2002). Кроме того, антимикробные пептиды растений рассматриваются в качестве альтернативы традиционно используемым антибиотикам и антимикотикам, что особенно актуально в эпоху появления большого количества устойчивых форм патогенов (De Lucca, 2000; Hancock, 2000; Marshall and Arenas, 2003). В связи с этим поиск новых высокоактивных пептидов и разработка методов их получения, в частности путем гетерологичной экспрессии, представляются чрезвычайно актуальными.

Цель и задачи исследования

       Цель настоящей работы состояла в структурно-функциональном исследовании двух важнейших групп белков растений – запасных и защитных, для решения фундаментальных проблем генетики (эволюция генов проламинов, структура глиадин-кодирующих кластеров генов, филогения пшениц, генетический контроль субъединиц кукурбитина, механизм действия генов устойчивости, исследование индуцированной устойчивости трансгенных растений, экспрессирующих двунитевую РНК), селекции (контроль сортовой чистоты, выявление гибридов и др.) и биохимии (структура и свойства запасных и защитных белков).

В связи с поставленной целью решались следующие конкретные задачи:

1. разработка методологии выделения высокоочищенных проламинов пшеницы, пригодных для структурных исследований;

2. изучение структурных особенностей глиадинов различных глиадинкодирующих локусов гексаплоидной пшеницы, а также видов рода Aegilops – предполагаемых доноров геномов полиплоидных пшениц;

3. изучение локализации дисульфидных связей в белках суперсемейства проламинов (глиадинов и 2S альбуминов);

4. разработка методологии выделения, разделения и структурного анализа субъединиц и полимерных глютенинов;

5. исследование полиморфизма запасных белков у представителей семейства Cucurbitaceae: разработка методов идентификации сортов и изучение генетического контроля субъединиц кукурбитина

6. изучение PR-белков и структурно-функциональных изменений хлоропластов у растений родов Nicotiana и Lycopersicon с разными генами устойчивости при вирусной инфекции и перекрестной защите;

7. изучение вирусоустойчивости и белков при инфекции ВТМ у трансгенных растений табака, несущих конструкцию, детерминирующую синтез двуцепочечной РНК.

8. разработка методологии выделения антимикробных пептидов из семян однодольных растений на примере семейства злаковых. Изучение их разнообразия, структуры и свойств, установление структуры предшественника и регуляции экспрессии гена нового гевеиноподобного пептида пшеницы;

9. разработка системы гетерологичной экспрессии генов новых антимикробных пептидов растений.

Научная новизна

Впервые разработана методология разделения и очистки различных запасных и защитных растительных белков: мономерных и полимерных проламинов (сем. Poaceae), 2S альбуминов (сем. Asteraceae) и глобулинов (сем. Cucurbitaceae), PR-белков (сем. Solanaceae) и антимикробных пептидов (сем. Poaceae). Впервые изучены структурные особенности глиадинов гексаплоидной пшеницы Triticum aestivum, кодируемых одним кластером генов (1D1 и 1B1), а также кластерами гомеологичных хромосом (D и B). Впервые установлено, что компоненты одного кластера генов значительно различаются по N-концевым аминокислотным последовательностям. Выявлено существование трех типов N-концевых аминокислотных последовательностей у -глиадинов. Показано, что N-концевые аминокислотные последовательности -глиадинов, кодируемых геномом D, заметно дивергировали от аналогичных последовательностей генома В. Высказано предположение о том, что гены - и - глиадинов произошли в результате многократных дупликаций коротких нуклеотидных последовательностей ДНК. Выявлен значительный консерватизм аминокислотных последовательностей -глиадинов, кодируемых хромосомами А, В и D геномов. Впервые проведено исследование глиадинов двух видов эгилопсов Ae. tauschii и Ae. longissima – предполагаемых доноров геномов полиплоидных пшениц и выявлена высокая внутривидовая изменчивость этих видов. Впервые определены N-концевые аминокислотные последовательности основных компонентов глиадинов Ae. tauschii и показано, что, как и у гексаплоидных пшениц, у эгилопсов встречаются те же типы N-концевых аминокислотных последовательностей глиадинов. Выдвинута гипотеза о том, что геном В культурных пшениц является сложным геномом, который модифицировался в ходе эволюции за счет интрогрессивной гибридизации с различными диплоидными видами, а также что генетический состав ныне существующих диплоидных видов не идентичен составу тех видов, которые участвовали в создании тетра- и гексаплоидных пшениц. Впервые для двух представителей суперсемейства проламинов - глиадина -46 и 2S альбумина подсолнечника, проведено дисульфидное картирование. Впервые выделены и охарактеризованы ряд субъединиц глютенина. Получены новые данные в пользу участия D субъединиц глютенина в терминации роста полимерной цепи глютенинов. Впервые методом светорассеяния установлены молекулярные массы полимеров глютенина. Разработаны электрофоретический и хроматографический методы анализа полиморфизма запасных белков тыквенных культур. Впервые изучен генетический контроль субъединиц кукурбитина – основного глобулина семян тыквенных растений. Впервые исследованы PR-белки растений томатов с разными генами устойчивости (Tm-1, Tm-2 и Tm-22) к ВТМ инфекции и выявлены специфические белки, характерные для каждого генотипа, которые могут быть использованы в качестве маркеров соответствующих генов в селекционном процессе. Исследованы белки хлоропластов листьев томатов с разными генами устойчивости к ВТМ при вирусной инфекции и выявлено снижение активности фотосистемы II и транскрипционной активности пластид. Выявлено наличие интерфероноподобных белков в листьях томатов различного генотипа. Впервые показано влияние экспрессии вставки, детерминирующей синтез двунитевой РНК, не имеющей гомологии с геномами вируса и растений табака, на уровень устойчивости трансгенных растений к тобамовирусам. В инфицированных трансгенных растениях выявлен индуцируемый синтез двух новых полипептидов, относящихся к семейству -эндоглюканаз растений. Высказано предположение об участии этих белков в системе антивирусной защиты растений. Впервые проведен систематический анализ антимикробных пептидов семян вида Triticum kiharae. Выделено 24 новых пептида, относящихся к 6 семействам антимикробных пептидов растений, и установлена первичная структура 12 из них. Изучена биологическая активность в системе in vitro 6 новых антимикробных пептидов. Обнаружено новое семейство глицин-богатых пептидов растений и новый структурный тип гевеиноподобных пептидов. Определена структура предшественника нового гевеиноподобного пептида. Исследована регуляция экспрессии гена этого пептида биотическими и абиотическими факторами среды. Разработана система гетерологичной экспрессии в прокариотической системе нового гевеиноподобного пептида Triticum kiharae. Впервые изучены дефензины предполагаемых доноров геномов полиплоидных пшениц и установлена геномная локализация генов дефензинов у гексаплоидной пшеницы. Показано, что в отличие от пшеницы, в семенах другого вида растений - Taraxacum officinale - основными детерминантами антифунгальной активности являются не антимикробные пептиды, а запасные 2S альбумины. Выдвинута гипотеза о специфичности «защитного арсенала» у разных видов растений.

Практическая ценность работы

Разработанные в ходе выполнения работы методы выделения -глиадинов путем иммобилизации на тиопропил-сефарозе и разделения полимеров глютенина в агарозном геле могут быть использованы при массовом анализе образцов, что имеет большое значение в таксономических и селекционных исследованиях, а также в исследованиях молекулярно-весового распределения полимеров глютенинов в зависимости от технологических характеристик клейковины и более детального исследования структуры полимеров глютенинов. Электрофорез полимеров глютенинов может найти и более широкое применение для исследования полимеров белков сходного размера.

Полиморфизм альбуминов и глобулинов семян тыквенных культур, выявляемый с помощью электрофоретических и хроматографических систем, разработанных в ходе проведенных исследований, может быть использован в селекции, поскольку позволяет идентифицировать генетически отдаленные образцы огурца и районированные сорта тыкв. Созданный каталог аллельных вариантов субъединиц кукурбитина позволяет идентифицировать сорта тыкв отечественной селекции и является экспресс-методом определения сортовой чистоты семян тыкв в сравнении с традиционно используемым грунтконтролем.

Специфические белки, синтезирующиеся в растениях томатов с разными генами устойчивости к ВТМ (Tm-1, Tm-2 и Tm-22) в ответ на инфицирование, могут быть использованы в качестве маркеров соответствующих генов в селекционном процессе. Гены выделенных в ходе выполнения настоящей работы антимикробных пептидов могут быть использованы для трансформации растений с целью повышения их устойчивости к фитопатогенным бактериям и грибам с использованием методов генетической инженерии. Сами пептиды могут найти применение в качестве безопасных консервантов пищевых продуктов в пищевой промышленности, поскольку они являются природными компонентами семян пшеницы. Серьезной проблемой практического применения растительных АМП является высокая стоимость производства. Получение растительных АМП с помощью методов генетической инженерии является перспективным путем решения этой проблемы. Предложенную нами систему гетерологичной экспрессии генов цистеинбогатых АМП в клетках прокариот предполагается использовать для разработки технологии производства АМП.

Основные положения, выносимые на защиту

1. глиадины, кодируемые генами одного кластера, локализованного на коротких плечах хромосом первой гомеологичной группы: хромосомы 1D (блок 1D1) и хромосомы 1В (блок 1В1), существенно различаются по N-концевым аминокислотным последовательностям. Это означает, что в процессе эволюции у предков пшеницы произошло объединение в один кластер генов, кодирующих - и -глиадины. N-концевые аминокислотные последовательности -глиадинов, кодируемых геномом D, значительно дивергировали от последовательностей -глиадинов генома В. В то же время аминокислотные последовательности -глиадинов, кодируемых хромосомами А, В и D, существенно более консервативны. Хромосомы шестой гомеологичной группы, по всей видимости, кодируют проламины, значительно отличающиеся от проламинов хромосом первой гомеологичной группы.

2. расположение дисульфидных связей – важнейших пост-трансляционных модификаций белков- в двух группах запасных белков суперсемейства проламинов, глиадинах и 2S альбуминах, сходно, но отличается от такового у других членов суперсемейства - ингибиторов -амилаз и трипсина злаков. Эти различия, по всей вероятности, связаны с необходимостью взаимодействия между ингибиторами и активными центрами ферментов-мишеней;

3. полиморфизм субъединиц кукурбитина, основного запасного глобулина семян тыквенных культур, контролируемого четырьмя локусами, выявляемый с помощью электрофореза, может эффективно использоваться в качестве экспресс-метода определения сортовой чистоты представителей семейства Cucurbitaceae;

4. у растений табака и томатов, содержащих различные гены устойчивости к ВТМ (гены N и N табака и гены Tm-1, Tm-2 и Tm-22 томата), в ответ на вирусную инфекцию синтезируются специфические PR-белки, относящиеся к защитной системе растений и отражающие особенности действия генов устойчивости, которые могут быть использованы в качестве маркеров соответствующих генов в селекционном процессе;

5. высокий молекулярный полиморфизм защитных пептидов у вида пшеницы Triticum kiharae Dorof. et Migusch, реализуемый как на генном, так и на пост-транскрипционном уровнях, обеспечивает эффективную защиту от разнообразных патогенов и стрессовых факторов среды, что обусловливает адаптацию пшеницы к неблагоприятным условиям окружающей среды и объясняет ее широкое распространение по всем континентам и климатическим зонам Земного шара. Детерминанты антифунгальной активности дефензинов семейства Poaceae локализованы в С-концевой области их молекул;

6. набор защитных полипептидов, участвующих в борьбе растений с патогенами и абиотическим стрессом («защитный арсенал» растений), видоспецифичен и уникален для каждого вида растений.

Апробация работы

Основные материалы диссертации были представлены на I национальной конференции по иммуногенетике растений (София, Болгария, 1986), III международном совещании по белкам клейковины (Будапешт, Венгрия, 1987), III международном симпозиуме по биохимической идентификации сортов (Ленинград, 1987), VI Всесоюзном симпозиуме «Молекулярные механизмы генетических процессов» (Москва, 1987), Всероссийской конференции “Физиолого-биохимические основы иммунитета” (Уфа, 1988), II съезде биохимического общества РАН (Москва, 1997), международной конференции «Биология клеток растений in vitro, биотехнология и сохранение генофонда» (Москва, 1997), международном симпозиуме по взаимодействиям белковых комплексов (Берлин, Германия, 1997), VII международной конференции по белкам клейковины (Бристоль, Великобритания, 2000), II международной конференции «Геномика, протеомика и биоинформатика для медицины» (Москва, 2004), III сьезде общества биотехнологов России (Москва, 2005), VIII чтениях, посвященных памяти академика Ю.А. Овчинникова (Москва, 2006), международном симпозиуме "Сигнальные системы клеток растений: роль в адаптации и иммунитете" (Казань, 2006), II Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Пущино, 2007), III международном симпозиуме «Проблемы биохимии, радиационной и космической биологии» (Дубна, 2007), международной конференции «Современная физиология растений: от молекул до экосистем» (Сыктывкар, Россия, 2007), международной конференции. «Научное наследие Н.И. Вавилова - фундамент развития отечественного и мирового сельского хозяйства» (Москва, 2007), 2-й Вавиловской международной конференции «Генетические ресурсы культурных растений в XXI веке» (С.-Петербург, 2007), Отчетных сессиях по программе Президиума РАН «Биоразнообразие и динамика генофондов» (подпрограмма II «Динамика генофондов») (Москва, 2005, 2006, 2007, 2008), IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008), V съезде общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова (Москва, 2008), II Всероссийской конференции «Современные проблемы иммунитета растений к вредным организмам» (С.-Петербург, 2008), IV Российского симпозиума «Белки и пептиды» (Казань, 2009), V съезде ВОГИС (Москва, 2009), V международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2009), международном симпозиуме по взаимоотношениям растений с патогенами (Квебек, Канада, 2009).

Декларация личного участия автора

В диссертационной работе использованы экспериментальные материалы, полученные лично автором. Автор лично принимал участие в разработке методологии, а также в разделении и структурном анализе всех представленных в диссертации групп белков: проламинов пшеницы, альбуминов и глобулинов тыквенных культур, PR-белков и антимикробных белков и пептидов. Автор лично проводил биохимический анализ хлоропластов при вирусной инфекции и анализ трансгенных растений, экспрессирующих двунитевую РНК. Автор принимал активное участие в разработке системы гетерологичной экспрессии антимикробных пептидов и клонировании гена одного из них. Автор лично оформлял результаты своих исследований в виде статей. Суммарное личное участие автора составило ~85%.

Публикации

       По теме диссертации опубликовано 49 статей, глава в зарубежной монографии, один патент и два авторских свидетельства.

Структура и объем работы

       Диссертационная работа изложена на 454 страницах, содержит 74 рисунка и 41 таблиц, имеет традиционную структуру и состоит из введения, обзора литературы, объектов и методов исследования, результатов и их обсуждения, заключения, выводов, списка цитируемой литературы, включающего 813 источников, и приложения.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава I. Запасные белки

1. Выделение глиадинов

       Поскольку белки зерновки пшеницы представляют собой чрезвычайно сложную смесь, которая состоит из сотен гомологичных полипептидов в молекулярно-весовом диапазоне от 15 до 100 кДа, разработка методологии выделения индивидуальных полипептидов, пригодных для структурного анализа, было первоочередной задачей. В качестве объекта исследования был выбран сорт озимой мягкой пшеницы Безостая 1. Электрофоретический профиль распределения глиадинов при двумерном разделении в ПААГ представлен на рис. 1.

Молекулярные массы основных полипептидов -глиадинов пшеницы Безостая 1 составили 67, 63, 62, 60 и 56 кДа. Молекулярные массы остальных глиадинов варьируют от 32 до 42 кДа.

Рис. 1. Распределение глиадинов пшеницы сорта Безостая 1 при двумерном электрофорезе в ПААГ. Направление I: 6%-ный ПААГ, рН 3,1; направление II: 10%-ный ПААГ, содержащий 0,1% ДДС-Na.

Для разделения глиадинов была использована иммобилизация белков спиртового экстракта на тиопропил-сефарозе 6В, в основе которой лежит реакция тиол-дисульфидного обмена между SH-группами белка и активными группами носителя (рис. 2). Белок иммобилизуется на тиопропил-сефарозе 6В (рис. 2) по остаткам цистеина, а затем может быть переведен в раствор восстановлением. Если смесь белков инкубировать с тиопропил-сефарозой, то с ней свяжутся только те из них, которые содержат свободные SH-группы. Поскольку по имевшимся данным -глиадины не содержат цистеина и (или) цистина, мы предположили, что эти белки не свяжутся с тиопропил-сефарозой, тогда как все остальные проламины содержат дисульфидные связи, которые после восстановления образуют свободные SH-группы, способные вступать в реакцию дисульфидного обмена.

Рис. 2. Схема иммобилизации белков зерновок пшеницы на тиопропил-сефарозе 6В.

В результате глиадины пшеницы сорта Безостая 1 были разделены на 2 фракции: -глиадины, не содержащие остатков цистеина (фракция I), и цистеинсодержащие глиадины (фракция II) (рис. 3).        

Рис. 3. Профиль электрофоретического распределения белков фракций I и II, полученных в результате иммобилизации на тиопропил-сефарозе 6В. А – 6%-ный ПААГ, рН 3,1: 1 – глиадины пшеницы, 2 – белки фракции I; Б – (10-17%)-ный ПААГ+0,1% ДДС-Na, рН 8,8: 1 – белки фракции II, 2 – белки спиртового экстракта, 3 – белки фракции I.

Разработанный нами метод позволил отделить -глиадины от других спирторастворимых белков пшеницы. Этот метод имеет ряд преимуществ по сравнению с описанными в литературе: 1) он позволяет сразу выделить всю группу -глиадинов, свободных от примесей других глиадинов; 2) в отличие от хроматографии на колонках, он позволяет работать с микроколичествами белков; 3) метод достаточно прост. Последнее дает возможность использовать метод при массовом анализе образцов, что имеет большое значение при генетических, таксономических и селекционных исследованиях.

Предложенный метод ковалентной хроматографии дает возможность оценить содержание и распределение свободных SH-групп и дисульфидных связей в различных фракциях глиадинов, кроме того, он открывает возможности для исследования первичной структуры проламинов, в частности, для выделения и анализа цистеинсодержащих пептидов, полученных при расщеплении белков, что и было нами успешно использовано при выделении цистеинсодержащих пептидов глиадина -46 (см. ниже).

После разделения глиадинов методом ковалентной хроматографии для выделения индивидуальных глиадинов -глиадины (фракция I) и цистеинсодержащие глиадины (фракция II) подвергали дальнейшему разделению с использованием различных хроматографических методов. В результате в высокоочищенном виде были получены ряд глиадинов, структурный анализ которых представлял интерес для решения проблем генетики, селекции и филогении пшениц.

2. Исследование структурных особенностей глиадинов пшеницы и родственных видов

2.1. Определение N-концевых аминокислотных последовательностей проламинов различных глиадинкодирующих локусов пшеницы

Для исследования структуры глиадинкодирующих кластеров генов, а также решения проблемы происхождения и эволюции генов проламинов из пшеницы сорта Безостая 1 был выделен ряд - и -глиадинов, кодируемых одним кластером генов, а также кластерами гомеологичных хромосом и определены их N-концевые аминокислотные последовательности. Среди проанализированных глиадинов были 0, 1, 2, и 2, кодируемые кластером генов хромосомы 1D (блок 1D1 по генетической классификации; Созинов, 1985), а также 5  и 3, кодируемые кластером генов хромосомы 1В. Особенно важно, что эти компоненты входят в наиболее распространенный у районированных сортов озимых и яровых пшениц блок 1В1. Были выделены также глиадин 1, кодируемый хромосомой 1А, и 5 – белок, контролируемый хромосомой 6В (блок 6В1), a priori наименее связанный с глиадинами, кодируемыми хромосомой первой гомеологичной группы. N-концевые аминокислотные последовательности выделенных глиадинов приведены в табл. 1. Анализ полученных результатов свидетельствует о том, что у -глиадинов есть три типа N-концевых аминокислотных последовательностей: KEL, ARE, SRL. У всех изученных -глиадинов обнаружены два участка гомологии, которые свидетельствуют об общности их происхождения, а также ряд повторяющихся олигопептидов типа PQQPY, которые могли образоваться в результате единичных замен в кодонах и многократных дупликаций коротких нуклеотидных последовательностей ДНК. Была выявлена бльшая гомология между -глиадинами, кодируемыми геномом D, чем между ними и -глиадинами, кодируемыми геномом В.

Таким образом, N-концевые аминокислотные последовательности -глиадинов, кодируемых геномом D, заметно дивергировали от аналогичных последовательностей генома В. Все изученные -глиадины, кодируемые хромосомами А, В и D, имели высокий уровень гомологии N-концевых аминокислотных последовательностей (табл. 1). Столь высокая гомология исследованных последовательностей -глиадинов свидетельствует о значительной консервативности соответствующих участков кодирующих их генов. В то же время глиадины, кодируемые хромосомой 6В (5), существенно отличаются от -глиадинов, кодируемых хромосомами первой гомеологичной группы, и имеют N-концевую последовательность, идентичную -глиадинам.

Таблица 1.

N-концевые аминокислотные последовательности - и -глиадинов пшеницы сорта Безостая 1*

Блок

Глиадин

N-концевая аминокислотная последовательность

1D1

0, 1

  KELQSPQQSFSHQQQPFPQQPYPQ

1D1

2

ARELNPSNKELQSPQQSFSPQQQPFXQQ

1B1

5

SRLLSPRGKELHTPQQQFPPQQQQFPQQQQFPQQQFPXSPXXQF

1D1

2

NIQVDPSGQVQWLQQQLVPQ

1B1

3

NMQVDPSGQVQWPQQQLVPQPQQPLQQQQ

1A4

1

NIQVDPSGQVQWPQQQPVPQFPQ

6B1

5

VRVPVPQLQPQNPSQQPQEQVPLVQQQQFL

-

**

NMQVDPSSQVQWPQQQPVPQPHQPFSQQPQQ

*Светло-серым цветом выделены идентичные аминокислотные остатки -глиадинов; темно-серым – идентичные остатки -глиадинов. **Последовательность -глиадина, определенная по структуре гена, включена для сравнения (Bartels et al., 1986).

       К началу нашей работы было известно, что группы компонентов проламинов, кодируемых одним кластером генов, наследуются сцепленно – блоками, как моногенный признак, причем рекомбинации в пределах блока наблюдаются редко (Созинов, Попереля, 1979). Можно было предположить, что гены одного кластера кодируют близкие по структуре белки. Однако нами установлено, что компоненты одного кластера генов, локализованного на коротком плече хромосомы 1D и 1В, существенно различаются по N-концевым аминокислотным последовательностям. Наиболее вероятно, что в процессе эволюции у предков пшеницы произошло совмещение в один кластер генов, кодирующих различающиеся по структуре белки - - и -глиадины. Хромосомы шестой гомеологичной группы, по всей видимости, кодируют проламины, существенно отличающиеся от проламинов хромосом первой гомеологичной группы, несмотря на то, что на электрофоретическом спектре -глиадины обеих групп хромосом располагаются в одной зоне. Полученные результаты свидетельствуют о том, что эти глиадины имеют N-концевую аминокислотную последовательность, идентичную –глиадинам, кодируемым хромосомами 6А и 6В.

2.2. Выделение и характеристика глиадинов семян Ae. squarrosa

Обнаруженные нами геном-специфичные различия между -глиадинами гексаплоидной пшеницы, позволили перейти к исследованию проламинов предполагаемых доноров В и D геномов – двух видов эгилопсов Ae. squarrosa и Ae. longissima, что представляет интерес для решения проблем филогении пшениц.

Исследование молекулярной гетерогенности глиадинов семян Ae. squarrosa показало высокую изменчивость этого вида. Разделение глиадинов образца Ae. squarrosa из Грузии путем ОФ-ВЭЖХ приведено на рис. 4.

       Сочетание ОФ-ВЭЖХ с использованием высокочувствительного газофазного секвенатора позволило нам впервые для Ae. squarrosa определить N-концевые аминокислотные последовательности основных компонентов глиадинов (табл. 2.)

Рис. 4. А. ОФ-ВЭЖХ белков спиртового экстракта Ae. squarrosa на колонке Pro-RPC 5/10; Б –электрофоретический анализ фракций.

Таблица 2.

N-концевые аминокислотные последовательности глиадинов Ae. squarrosa

Глиадин

N-концевая аминокислотная последовательность

1+2

XXLPSPQ

ARQLNPQNQELQSPQQ

4

SRQLSPRGKELQT/PQQEQFPQ

5

5 (T. aestivum)

SRQLSPRGKELQTPQEQFPQQQFPQQQQI

SRLLSPRGKELHTPQQQFPQQQQFPQQQFPQQQFPXSP

1,2*

XE/QLQ/PSPQQSF

2

NIQVDPSGQVQWLQQQLVPQLQQQLQQ

VRVPVPQLQPQNPSQQQPQEQ

       *Kasarda et al., 1983.

Оказалось, что глиадины 4 и 5 имеют практически одинаковую N-концевую аминокислотную последовательность, которая начинается с SRQ. Эта последовательность обладает высокой гомологией с N-концевой аминокислотной последовательностью этих белков у пшеницы Безостая 1. В связи с этим высказывалось предположение, что такой тип последовательности специфичен для генома В. Однако полученные нами данные свидетельствуют о том, что у Ae squarrosa, предполагаемого донора D генома, есть гомологичная последовательность. Хотя 1 и 2 нельзя былоразделить путем ОФ-ВЭЖХ, нам удалось вычленить последовательность, начинающуюся с ARQ. Гомологичная последовательность была обнаружена у T. aestivum. Секвенирование основного компонента -фракции, содержавшегося во фракции XI при элюции с колонки с обращенной фазой, показало, что он соответствует 2-последовательности, обнаруженной у T. aestivum. У -Фракции был выявлен лишь один тип N-концевой последовательности, соответствующий -типу глиадинов.

2.3. Выделение и характеристика глиадинов семян Ae. longissima

Поскольку Ae. longissima считался одним из возможных доноров В генома полиплоидных пшениц (Конарев, 2001), представляло интерес исследовать глиадины этого вида. В литературе подобного рода сведения отсутствовали.

       Электрофоретический и хроматографический анализ выявил существенную внутривидовую гетерогенность Ae. longissima (рис. 5,6). Исследованные образцы значительно различались как по числу компонентов, так и по их хроматографической подвижности (рис. 6).

Рис. 5. Электрофоретическое распределение глиадинов Ae. longissima и Ae. squarrosa в ПААГ (рН 3,1): а – к-202, б – к-908, в – к-1297, г – Ae. squarrosa.

Рис. 6. ОФ-ВЭЖХ белков спиртового экстракта Ae. longissima. А – к-202, Б – к-907, В – к-908,  Г – к-1297.

Высокая специфичность профилей разделения глиадинов при ОФ-ВЭЖХ позволяет использовать этот метод наряду с электрофорезом для изучения внутривидовой изменчивости Ae. longissima и характеристики образцов различного происхождения. N-концевые аминокислотные последовательности выделенных глиадинов Ae. longissima приведены на рис. 7.

Ae. longissima к-202

Фракция 1  SRQLSPIGK

Фракция 2  SRQLSPIGKELQTP

Фракция 3  SRQLSPRGQEL/QXTPQ

Фракция 4  блокирована

Фракция 13  VRVPVPQLQPQNPSQQQP

Ae. longissima к-907

Фракция 1  SRQLSPI

Фракция 2  SRQISPIGKELXXP

Ae. longissima к-1297

Фракция 2 блокирована

Ae. squarrosa 5

SRQLSPRGKELQTQQEQFPQ

T. aestivum 5

SRLLSPRGKELHTPQQQFPQQQQFPQQQFPQQQFPXS

T. aestivum /

VRVPVPQLQPQNPSQQQPQEQVPLVQQQQFL

Рис. 7. N-концевые аминокислотные последовательности глиадинов видов Ae. longissima, Ae. squarrosa и T. aestivum.

Установлено, что среди -фракции у всех проанализированных образцов обнаружены несколько глиадинов с SRQ-типом N-концевой последовательности, который выявлен также у гексаплоидных пшениц и Ae. squarrosa. Таким образом, N-концевые последовательности -глиадинов консервативны: гомологичные белки разных видов эгилопсов и гексаплоидных пшениц различаются лишь единичными аминокислотными заменами.

Помимо -глиадинов нами был просеквенирован -глиадин образца Ae. longissima к-202 (фракция 13, рис. 6). Его последовательность оказалась идентичной N-концевой последовательности -глиадина Ae. squarrosa и мягкой пшеницы Безостая 1. По всей видимости, в ходе эволюции на структуру глиадинов /-типа накладывались более жесткие ограничения, чем на структуру -глиадинов.

3. Дисульфидное картирование глиадинов

Для более детального исследования структурных особенностей глиадинов, и в частности для локализации в них дисульфидных связей, играющих ключевую роль в формировании надмолекулярной структуры клейковинного комплекса, был выбран глиадин -46 пшеницы сорта Харди. Предварительно с помощью масс-спектрометрии была определена молекулярная масса белка, которая составила 35191,3 Да и было показано, что все восемь остатков цистеина в молекуле образуют четыре дисульфидные связи.

Путем секвенирования восстановленного и алкилированного глиадина -46 была определена его N-концевая аминокислотная последовательность (29 аминокислотных остатков), которая оказалась идентичной N-концевой аминокислотной последовательности глиадина клона pW1621 и глиадина -2, но отличалась рядом аминокислотных замен от других глиадинов.

В результате гидролиза иммобилизованного на тиопропил-сефарозе 6В глиадина -46 трипсином были выделены цистеинсодержащие пептиды глиадина -46, полная или частичная структура которых была установлена путем автоматической деградации по Эдману. В результате было просеквенировано 207 аминокислотных остатка. Дисульфидсодержащие пептиды глиадина -46 были получены путем ограниченного протеолиза интактного белка химотрипсином с последующим перевариванием дисульфидсодержащих фрагментов трипсином и химотрипсином. Расположение дисульфидных связей устанавливали путем секвенирования дисульфидсодержащих фракций и составляющих их пептидов и сравнения полученных последовательностей с предварительно определенной частичной первичной структурой глиадина -46. В результате в глиадине -46 было установлено расположение дисульфидных связей: Cys-173—Cys-192, Cys-212—Cys291, Cys-165—Cys-199, Cys-165—Cys-199 (или Cys-200), Cys-283 –Cys-200 (или -Cys-199).

4. Дисульфидное картирование альбумина семян подсолнечника: консервативные и вариабельные дисульфидные связи в суперсемействе проламинов злаков

Суперемейство проламинов злаков включает 3 основные группы белков: запасные проламины пшеницы, ржи и ячменя, ингибиторы альфа-амилаз и трипсина злаков, а также 2S запасные альбумины двудольных растений (Kreis, Shewry, 1989). Эти белки характеризуются консервативно расположенными остатками цистеина. Было высказано предположение, что этот консерватизм отражает ключевую роль остатков цистеина в стабилизации структуры белка за счет образования дисульфидных связей. Это утверждение нуждалось в подтверждении и проверке. В связи с этим, помимо дисульфидного картирования проламинов пшеницы, было определено расположение дисульфидных связей в другой группе белков, относящихся к суперсемейству проламинов - 2S запасных альбуминах, а именно, в метионин-богатом альбумине подсолнечника SFA8 (рис. 8).

А. Аминокислотная последовательность SFA8

1PYGRGRTESGCYQQMEEAEMLNHCGMYLMKNLGERSQVSPRMREEDHKQLCCMQLKNLDEKCMCPAIMMMLNEPMWIRMRDQVMSMAHNLPIECNLMSQPCQM103

В. Расположение дисульфидных связей в SFA8

Рис. 8. Дисульфидное картирование альбумина SFA8 подсолнечника. А – Аминокислотная последовательность белка SFA8. В – Дисульфидная карта белка SFA8.

Сравнение расположения дисульфидных связей в белках семейства проламинов представлено на рис. 9. Полученные результаты свидетельствуют о высоком консерватизме в расположении дисульфидных связей в запасных белках как между глиадинами и 2S альбуминами, так и в пределах каждой из этих групп белков. Однако только две дисульфидные связи с участием двух соседних остатков цистеина (C/D) сохраняют свое положение в ингибиторах. Различия в расположении дисульфидных связей у ингибиторов по сравнению с запасными белками могут быть связаны с необходимостью поддерживать структуру активных центров для взаимодействия с ферментами-мишенями.

Рис. 9. Расположение дисульфидных связей в молекулах 2S альбуминов, глиадинов и ингибиторов ферментов злаков. Остатки цистеина обозначены буквами А-М. Дисульфидные связи в конглютине , WAI-0,28, WAI-0,53, - и -глиадинах приведены в работах (Maeda et al., 1983; Lilley, Inglis, 1986; Strobl et al., 1995; Егоров, Одинцова и др. 1999).

5. Выделение и структурный анализ глютенинов

       К началу наших исследований было известно, что качество клейковины зависит от нескольких параметров: размера полимеров глютенина, содержащих как низкомолекулярные (LMW), так и высокомолекулярные (HMW) субъединицы, соединенные, в отличие от глиадинов, межцепочечными дисульфидными связями (чем длиннее полимеры, тем лучше качество клейковины), а также от количества и состава HMW субъединиц. Было высказано предположение, что терминаторами роста полимерной цепи являются D субъединицы, которые являются глиадиноподобными белками, образовавшимися в результате мутаций генов -глиадинов, не содержащих остатков цистеина.

Был проведен поиск и выделение D субъединиц и родственных им -глиадинов из пшеницы сорта Чайниз Спринг. В результате было выделено 3 D субъединицы и несколько -глиадинов и показано, что D субъединицы имеют N-концевую последовательность, соответствующую -глиадинам, и содержат по одному остатку цистеина в молекуле, что подтвердило гипотезу о происхождении D субъединиц в результате мутаций генов -глиадинов. Кроме того, сравнительный анализ фракций глютенина, разделенных по размеру путем эксклюзионной жидкостной хроматографии, позволил выявить постепенное уменьшение содержания HMW субъединиц глютенина по мере уменьшения их молекулярного веса одновременно с увеличением содержания D субъединиц. Полученные результаты служат новым lдоказательством того, что D субъединицы играют роль терминаторов роста цепи глютенинов.

       Были исследованы также HMW субъединицы изогенной линии L88-31, которая содержит только 2 субъединицы – 17 и 18, являющиеся аллельными вариантами субъединиц 7 и 9, соответственно. Наличие этих субъединиц коррелируют с хорошими технологическими характеристиками муки. Определение числа остатков цистеина в молекулах HMWx17 и HMWy18 выявило наличие 3,5 и 6,5 остатков, соответственно, что согласуется с числом остатков цистеина в субъединицах 1Вх17 (4 остатка) и 1By9 (7 остатков).

Для более детального исследования первичной структуры субъединиц 17 и 18 были выделены и секвенированы их цистеинсодержащие пептиды. Полученные данные представлены в табл. 3.

Таблица 3.

N-концевые аминокислотные последовательности цистеинсодержащих триптических пептидов HMWx17 и HMWy18

Фракция

N-концевые аминокислотные последовательности

Гомологичная HMW

4

27DVSPGXXPI35; 13ELQE16

1Bx7; 1By9

6

540QLGQ543

1By9

7

747AQQLAAQ753; 661VQQPAXQ667

1Bx7; 1By9

8

1EGEA4

1Bx7; 1By9

Полученные результаты свидетельствуют о том, что аминокислотные последовательности в окружении остатков цистеина в HMWx17 и HMWy18 консервативны и сходны с аналогичными последовательностями аллельной пары субъединиц 1Вх7 и 1By9. Таким образом, полученные нами данные свидетельствуют о том, что сходные технологические характеристики муки, обусловленные аллельными парами HMWx17 и HMWy18, с одной стороны, и 1Вх7 и 1By9, с другой, связаны с одинаковыми дисульфидными связями, которые они образуют в полимерах.

Для определения размеров полимеров глютенина нами был разработан метод, сочетающий в себе разделение полимеров глютенина в агарозном геле (рис. 10), элюцию белков из геля и определение размеров полимеров методом светорассеяния. В результате были определены молекулярные массы полимеров глютенина (табл. 4).

Рис. 10. Электрофоретическое разделение белков клейковины пшеницы сорта Chinese Spring в агарозном геле (A). Гель, аналогичный представленному на рис. А, разрезали на 8 частей, белки экстрагировали из агарозы и подвергали электрофорезу в тех же условиях (В).

                                                       

Полученные нами результаты по измерению светорассеяния фракций глютенинов подтверждают, что электрофорез в агарозном геле разделяет полимеры глютенинов по Mr и показывают, что Mr этих полимеров варьирует от 500000 до 5 миллионов. Таким образом, нами предложен простой метод фракционирования глютенинов, а также других высокомолекулярных полимеров.

Таблица 4.

Вычисленные молекулярные веса фракций 1-8 (рис. 10А) полимеров глютенина

Фракция

Rh (нм)

Полидисперс-ность (нм)

Mr x 105

1

22,6

12,5

56,3

2

19,6

10,9

39,7

3

16,6

8,1

26,3

4

13,0

7,2

14,7

5

12,4

6,9

12,9

6

9,5

5,3

6,9

7

10,2

5,7

8,2

8

9,3

5,2

6,6

6. Исследование полиморфизма белков семян огурца

Выше было показано, как исследование полиморфизма проламинов злаков (по N-концевым последовательностям) может быть использовано для решения проблем структуры глиадинкодирующих кластеров генов и филогении пшеницы. Однако эти исследования имеют и практическое значение – для решения вопросов частной генетики и селекции важнейших сельскохозяйственных культур, таких как идентификация генотипов, определение сортовой чистоты, выявление гибридов. В то же время подобные маркеры у овощных культур, в частности, тыквенных, отсутствовали. Нами были проведены исследования по разработке методов электрофоретического анализа белков семян тыквенных для использования их в экспериментах по частной генетике и в сортовом семенном контроле данных культур. Исследованию подвергали фракции альбуминов, глобулинов и основного глобулина семян – кукурбитина. В качестве метода выявления полиморфизма белков использовали различные электрофоретические системы.

Исследование альбуминов семян огурца путем электрофореза в ПААГ в присутствии ДДС-Na выявил многокомпонентность электрофоретических спектров и незначительное количество сортоспецифических компонентов, что затрудняет использование данной системы для генетического анализа и массового применения в сортовом семенном контроле огурца.

Электрофоретический анализ глобулинов в этой же электрофоретической системе позволил обнаружить межлинейные различия по минорным компонентам в молекулярно-весовом диапазоне от 49 кДа и выше. Межсортовые различия как между зарубежными, так и между отечественными сортами огурца не были выявлены. Таким образом, на исследованном материале электрофорез глобулинов также не выявил сортоспецифичности спектров.

Исследование полиморфизма кукурбитина – основного запасного глобулина - с помощью электрофореза в ПААГ в присутствии ДДС-Na показало, что в использованной электрофоретической системе фракция кукурбитина у исследованных образцов огурца является инвариантной. У двадцати двух исследованных сортов и линий вариабельным оказался лишь компонент с молекулярной массой 36 кДа, который либо присутствовал, либо отсутствовал в спектре. Таким образом, на изученном материале удалось выделить лишь 2 типа электрофоретических спектров кукурбитина огурца. Суммируя полученные данные, можно сделать вывод о том, что альбумины и глобулины исследованных образцов огурца выявили низкий межсортовой полиморфизм, что затрудняет использование этих белков для идентификации сортов и установления процента гибридности семян в семенном контроле. Идентификация генетически отдаленных форм возможна.

7. Исследование полиморфизма белков семян тыквы

Изучение гетерогенности белков семян проводили на районированных сортах тыквы отечественной селекции. В коллекцию входили сорта Cucurbita pepo, Cucurbita maxima и Cucurbita moschata. Анализ альбуминов и глобулинов семян тыкв выявил их большую в сравнении с огурцом гетерогенность и специфичность. Более полиморфной у представителей рода Cucurbita оказалась и фракция кукурбитина. При разделении кукурбитина в денатурирующих условиях в электрофоретическом спектре было выделено 3 зоны: -, - и - (рис. 11). Вариабельные компоненты находились в -, и -зонах. Наиболее полиморфной оказалась низкомолекулярная -зона (молекулярная масса субъединиц 21-26 кДа), где в сортовых спектрах обнаруживалось от 4 до 7 компонентов (рис. 11, 12).









Рис. 11. Электрофореграммы кукурбитина семян сортов C. pepo, C. maxima и C. moschata.

Электрофоретический анализ белков гибридных семян и их родительских форм показал, что субъединицы кукурбитина наследуются кодоминантно, что делает возможным идентифицировать семена гибридов, которые возникают при естественном переопылении разновидностей C. pepo (рис. 12в).


Рис. 12. Электрофореграммы субъединиц кукурбитина в ПААГ в присутствии ДДС-Na, -зона: (а) сорта C. pepo (1 – Якорь, 2 – Белоплодные, 3 – Сотэ 38, 4 – Грибовские 37; 5 – Одесские 52; 6 – Греческие 110; 7 – Грибовская кустовая; 8 – Украинская многоплодная); 9 – C. maxima (Грибовская зимняя); 10 – C. moschata (Перехватка); (б) биотипы сорта Грибовские 37; (в) сорт Белые 13 (C. p. var. melopepo) – Б, сорт Грибовские 37 (биотип 2, C. p. var. giraumons) – Г2, гибрид Б х Г2-F12.

Таким образом, по электрофоретическим спектрам кукурбитина нами был выявлен межвидовой, внутривидовой и внутрисортовой полиморфизм, что открывает возможности использования метода электрофореза кукурбитина для экспресс-анализа сортовой чистоты образцов тыквы обыкновенной. Меньшая сортовая специфичность кукурбитина у крупноплодной и мускатной тыквы позволяет идентифицировать лишь группы сортов, что требует разработки и применения альтернативных систем. Таковой для представителей рода Cucurbita может служить система электрофореза альбуминов в кислой среде (рН 3,1).

Рис. 13. Электрофореграммы альбуминов семян сортов C. pepo, C. maxima, C. moschata.

В этой системе альбумины семян разделялись на 40 вариабельных компонентов (рис. 13). Были выделены компоненты, специфичные для каждого из изученных видов, для разновидностей «перехватка» (№56-58) и «продолговатая» (№59-60) мускатной тыквы. Различные сочетания альбуминов обеспечивают сортоспецифичность спектров всех изученных сортов. Исключение, как и по кукурбитину, составляли кабачки Зебра (№28) и Цукеша (№29), что делает возможным применение данной системы электрофореза в семенном контроле наряду с электрофорезом кукурбитина.

8. Генетический контроль компонентного состава кукурбитина

Одной из наиболее серьезных форм биологического засорения образцов тыквы является присутствие в нем гибридов от переопыления между разновидностями тыквы обыкновенной в коллекционных и селекционных питомниках. Выявление подобного типа засорения при грунтконтроле осложняется тем, что основной апробационный признак - форма семенника - у тыкв определяется комплементарным действием генов. В связи с этим нами была исследована возможность выявления гибридов в посевном материале по электрофоретическим спектрам белков семян на основе изучения генетического контроля отдельных компонентов кукурбитина.

Был проведен гибридологический анализ состава субъединиц кукурбитина в гибридной комбинации патиссон Белые 13 х кабачок Грибовские 37. Сорт кабачков Грибовские 37 обладает генотипом, типичным для стародавних сортов. В результате было установлено, что, во-первых, наследование вариабельных компонентов кукурбитина в спектрах сортов Белые 13 и Грибовские 37 осуществляется тремя локусами (А, В и С). Генотипы родительских сортов содержат различные аллельные варианты локусов А, В и С. Во-вторых, аллели одного локуса контролируют отдельные компоненты кукурбитина, различающиеся по молекулярной массе, в отличие от блоков компонентов, выделенных в качестве единицы наследования у проламинов злаков.

Анализ расщепления одновременно по трем кукурбитинкодирующим локусам свидетельствует о том, что они не сцеплены между собой: соотношение 18 классов, обнаруженных в F2, полностью соответствует теоретически ожидаемому расщеплению (1:2:1):(1:2:1): (3:1) при 2факт.=12,4, 2теор. = 27,6.

Для формализации данных гибридологического анализа нами предложена классификация кукурбитина, позволяющая выражать электрофореграммы в виде формул. Для этого в строку последовательно заносится название белковой системы, буквенное обозначение локуса и порядковый номер идентифицированного компонента, кодируемого соответствующим аллелем. Например, электрофореграмму сорта Грибовские 37 (рис. 12г) можно записать как CbnA2 B1 C1. В генетических формулах гетерозигот по кукурбитину аллели одного локуса разделяются запятой. Например, формула гибрида F1 от скрещивания Белые 13 х Грибовские 37 (рис. 12б,в) будет CbnA1,2 B1,2 C1,0. В сокращенном виде формула сорта Грибовские 37 будет 2.1.1., а упомянутого выше гибрида F1 – 1,2.1,2.1,0.

       Возможность идентификации гибридов была продемонстрирована также на комбинации скрещивания, включающей сорт кабачков современной селекции Якорь и патиссон Белые 13. Кроме того, была показана возможность идентификации гибридов еще одного варианта скрещивания: тыква х кабачок (на примере сортов Миндальная 35 х Сотэ 38).

Изучение коллекции сортов тыкв с применением гибридологического анализа, а также методов идентификации аллелей сравнительным анализом электрофореграмм разных биотипов гетерогенного сорта и с использованием эталонного сорта позволило составить каталог аллельных вариантов компонентов кукурбитина, контролируемых локусами Cbn A, Cbn B, Cbn C, Cbn D. По локусам А, С, D обнаружены пары аллелей, по локусу В – серия, состоящая из 7 множественных аллелей (рис. 14).

Рис. 14. Каталог аллельных вариантов компонентов электрофоретического спектра кукурбитина, контролируемых локусами Cbn A, Cbn B, Cbn C, Cbn D.

Каталог систематизирует полученные данные по генетическому контролю компонентов кукурбитина, делает возможным предсказание фенотипических классов по кукурбитину при гибридизации.

       При анализе характера распределения аллелей кукурбитинкодирующих локусов у сортов различных видов тыкв было установлено, что наибольшая генетическая изменчивость по четырем локусам наблюдается у вида C. pepo – H=0,116, несколько ниже она у C. moschata - H=0,056 и C. maxima – H=0,041. Полученные результаты совпадают с существующией точкой зрения, что тыква обыкновенная является наиболее полиморфной из трех культивируемых в нашей стране видов.

       Исследование полиморфизма кукурбитина на внутривидовом уровне показало, что электрофоретические спектры кукурбитина, как правило, сортоспецифичны. Однако при этом выделяются группы сортов, имеющих в генотипе одинаковый набор аллелей кукурбитинкодирующих локусов, различие между подобными образцами выражаются в интенсивности электрофоретически выявляемых компонентов.

Путем параллельной оценки чистосортности партии семян суперэлиты патиссонов Белые 13, выращенной на Симферопольской ОБОС, двумя методами была продемонстрирована высокая эффективность предложенного метода (по электрофоретическим спектрам куккрбитина) по сравнению с традиционно используемым грунтконтролем.

Глава II. Защитные белки

В настоящем разделе диссертации излагаются результаты исследования защитных PR-белков, образующихся в растениях в ответ на инфицирование, для выяснения механизмов устойчивости к патогенам. Цель работы состояла в выявлении и изучении свойств PR-белков у растений рода Nicotiana и Lycopersicon с разными генами устойчивости при вирусной инфекции и перекрестной защите.

1. Обнаружение PR-белков в листьях разных видов табака при вирусной инфекции

Предварительно было установлено, что механическое повреждение листьев табака индуцирует образование новых белков, Rf  которых составили 0,84 и 0,67. Такие растения были использованы в качестве контроля при изучении влияния вирусной инфекции на спектр кислоторастворимых белков листьев. Изучение состава белков листьев гибридного табака Терновского в динамике (на 3, 7, 10 и 14 день после заражения) показало, что содержание PR-белков наибольшее на 10 день после заражения, после чего (на 14 день) их содержание падает, что сопровождается некротизацией листьев. Исследование накопления PR-белков в разных участках ткани зараженного листа, а также в других частях растения показало, что PR-белки преимущественно накапливаются в непосредственной близости от места инокуляции вирусом. При удалении от места инфицирования их содержание падает: так, на расстоянии 2 см от некроза их содержание падает почти в 2 раза. В верхних неинокулированных листьях PR-белки обнаруживаются лишь в следовых количествах. Был проанализирован спектр PR-белков у разных видов и сортов табака и выявлена видоспецифичность набора PR-белков (табл. 4). Это позволяет использовать их в качестве генетических маркеров как при исследовании происхождения разных видов табака, так и при анализе устойчивости растений табака к вирусным заболеваниям. В то же время межсортовых различий по электрофоретическим спектрам PR-белков выявлено не было.

       Исследование кислоторастворимых белков листьев табака Терновского при системной реакции на заражение ВОМ-1 показало, что в отличие от других исследованных видов табака, у гибрида PR-белки образуются и при системном заражении (табл. 4).

Таблица 5.

PR-белки, выявленные у разных видов и сортов Nicotiana при вирусной инфекции

Вид, сорт

Ген

Реакция на ВТМ

PR-белки и их молекулярные массы, кДа

b0

b1

b1

b2

b3

b4

b5

b6

b7

16

16,6

14

16,2

16

-

34

35

35

N. glutinosa

N

сверхч.

-

-

+

-

-

-

-

-

-

N. rustica

N

сверхч.

-

-

-

+

-

-

+

+

+

N. sylvestris

N

сверхч.

+

+

-

-

+

-

-

-

-

системн.

-

-

-

-

-

-

-

-

-

N. tabacum сорт Samsun EN

N

сверхч.

-

+

-

+

+

+

-

-

-

системн.

-

-

-

-

-

-

-

-

-

N. tabacum сорт Java

N

сверхч.

-

+

-

+

+

+

-

-

-

системн.

-

-

-

-

-

-

-

-

-

Гибридный табак

N

сверхч.

-

+

-

+

+

+

+

+

+

системн.*

-

+

-

+

+

+

+

+

+

*заражение ВОМ-I; сверхч.- сверхчувствительная реакция; системн. – системная реакция.

2. Обнаружение PR-белков в листьях томатов при инфекции ВТМ и перекрестной защите

       Для выяснения механизмов устойчивости к вирусному заражению изучали PR-белки, которые появляются после заражения в растениях с разными генами устойчивости к ВТМ: геном толерантности Tm-I и генами сверхчувствительности Tm-2 и Tm-22. Хотя гены устойчивости у томатов известны давно, индуцируемые ими защитные реакции практически не изучены. Исследования проводили как на томатах-дифференциаторах, так и на изогенных линиях, различающихся только по генам устойчивости.

       В спектрах кислоторастворимых белков, выделенных из ткани зараженных растений после инфицирования соответствующими штаммами ВТМ, обнаружено 4 типа изменений по сравнению с контролем: (1) накопление отдельных полипептидов, (2) уменьшение относительного содержания некоторых полипептидов, (3) появление новых полипептидов, (4) исчезновение определенных полипептидов. Во всех случаях в зараженных ВТМ растениях в листьях с явными симптомами заболевания появляется вирус-специфический белок – белок оболочки вируса с молекулярной массой 17,4 кДа. На рис. 15 представлены результаты электрофоретического разделения белков листьев растений томатов I группы, содержащих ген толерантности Tm-I, при заражении разными штаммами ВТМ.

       Исследования спектров PR-белков показали, что заражение разными штаммами ВТМ как в томатах-дифференциаторах, так и в изогенных линиях томатов приводит к изменениям белкового состава листьев, причем наибольшие изменения наблюдаются через 2 недели после заражения и лишь в растениях с явными симптомами заболевания. Они могут быть связаны, с одной стороны, с развитием патофизиологического процесса, в пользу чего свидетельствует корреляции между изменениями в белках и тяжестью заболевания, а с другой, следствием развития приобретенной устойчивости.

Рис. 15. Электрофореграммы кислоторастворимых белков листьев томатов при инфекции ВТМ (13%-ный ПААГ, 0,1% ДДС-Na). I, II, 0, III – группы томатов, М – белки-маркеры, 1, 4, 7, 10 – здоровые растения томатов: 2 – I/I, 3 – I/0, 5 – II/2, 6 – II/I, 8 – 0/0, 9 – 0/V-69, II – III/N22, 12 – III/2 (первая цифра – группа томатов, вторая – группа штаммов ВТМ).

Отсутствие каких-либо видимых изменений в спектре кислоторастворимых белков в устойчивых растениях при заражении их непробивающими устойчивость штаммами ВТМ, на наш взгляд, связано с тем, что блокировка инфекции происходит в относительно небольшом числе первично инфицированных клеток. Изменений в спектре белков не было обнаружено не только в случае наличия в генотипе одного из генов устойчивости, но и в линиях, содержащих одновременно оба гена: толерантности (Tm-1) и сверхчувствительности (Tm-22).

Наиболее характерной особенностью развития инфекционного процесса в растениях томатов всех генотипов, зараженных пробивающими данный тип устойчивости штаммами ВТМ и при перекрестной защите, является появление в спектрах кислоторастворимых белков нового полипептида с молекулярной массой 15 кДа и названного Р15. Поскольку белок Р15 был обнаружен в томатах всех исследованных генотипов, его образование, по-видимому, не связано с генами устойчивости. При развитии мозаичного заболевания у томатов всех генотипов, помимо белка Р15, было отмечено увеличение синтеза двух других PR-белков- Р79 и Р31. Как и в случае белка Р15, синтез этих полипептидов, по всей видимости, не связан с генами устойчивости. Вероятно, белок Р79 является щелочной эндопротеиназой, идентифицированной в томатах (Vera, Conejero, 1988), а белок Р31 - хитиназой (Joosten, de Wit, 1989).

Помимо белков, которые появляются в растениях томатов различного генотипа в ответ на инфицирование, нами выявлены и специфические белки, индукция которых связана с генами устойчивости и отражает различия в механизмах устойчивости. Эти белки могут быть использованы в качестве маркеров в генетических исследованиях и селекционном процессе.

Были также исследованы изменения в спектре кислоторастворимых белков при перекрестной защите, заключающейся в том, что заражение растений апатогенным штаммом вируса предохраняет растение от последующей инфекции родственным штаммом того же вируса.

Поскольку одна из гипотез предполагала участие PR-белков в возникновении приобретенной устойчивости, были исследованы спектры кислоторастворимых белков при перекрестной защите. Анализировали кислоторастворимые белки растений 0 группы томатов, которые сначала заражали аттенуированным штаммом ВТМ V-69, а через 3 недели - резким штаммом R, который вызывает у растений зеленую мозаику. В качестве контролей использовали растения, зараженные отдельно штаммом V-69 и R штаммом ВТМ, соответственно, а также здоровые растения того же возраста.

При последовательном заражении томатов двумя штаммами ВТМ-аттенуированным V-69 и резким R - симптомы заболевания не развивались. При этом концентрация ВТМ в обоих случаях была сходной: 2,20 мкг/г в варианте 0/V-69 и 2,50 мкг/г в варианте 0/R. Таким образом, при перекрестной защите подавлено развитие симптомов заболевания. Это коррелирует с изменением содержания ряда белков: увеличивается содержание полипептидов с молекулярными массами 15 кДа (Р15) и 31 кДа (Р31), в то время как относительное содержание других белков с молекулярными массами 14, 14,5, 16,5, 17, 22, 23, 30, 36, 43 кДа уменьшается. Полученные нами данные позволяют предположить, что белки Р15 и Р31 участвуют в механизмах приобретенной устойчивости, а снижение экспрессии ряда белков приводит к подавлению развития симптомов мозаичного заболевания.

Поскольку во всех случаях заражения пробивающими устойчивость штаммами ВТМ в томатах разных генотипов появлялся белок с молекулярной массой 15 кДа, обозначенный Р15, этот белок был выделен и определен его аминокислотный состав. Полученные результаты свидетельствовали о том, что выделенный нами белок Р15 соответствует белку Р14, описанному Камачо и Сэнгером в восприимчивых растениях томатов при вирусной, грибной и вироидной инфекциях (Camacho, Snger, 1982, 1984).

  1. Структурно-функциональное исследование хлоропластов томатов с различными генами устойчивости к ВТМ при заражении разными штаммами вируса

Исследование структурно-функциональных характеристик хлоропластов растений томатов, несущих различные гены устойчивости к ВТМ, при вирусной инфекции показало, что в мозаичных растениях существенно подавлена активность фотосистемы II и транскрипционная активность хлоропластов. Подавление транскрипции хлоропластных генов при заражении резкими штаммами ВТМ происходит независимо от генотипа, однако оно выражено слабее в генотипах с генами устойчивости. В случае системного некроза функционирование хлоропластов нарушено в меньшей степени: активность фотосистемы II уменьшается на ~10%, а транскрипционная активность хлоропластов - на 20%. Одновременно с этим в растворимой фракции обнаружен ряд новых белков. При заражении аттенуированным штаммом V-69, хотя симптомы заболевания не развиваются, в хлоропластах происходят определенные структурно-функциональные изменения, однако, они проявляются слабее, чем при заражении резкими штаммами ВТМ.

4. Обнаружение интерфероноподобных белков в листьях томатов

Изучив PR-белки, синтезирующиеся в растениях в ответ на вирусную инфекцию и представляющие собой важнейшие компоненты защитной системы растений, представляло интерес выяснить, существует ли в растениях система защиты, связанная с синтезом интерфероноподобных белков, поскольку этот механизм защиты широко распространен у животных. В связи с этим, был проведен поиск интерфероноподобных белков в растениях томатов с различными генами устойчивости к ВТМ с использованием иммуноблоттинга с антителами к -интерферону человека.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что среди кислоторастворимых белков листьев томатов различного генотипа выявляются три белка в низкомолекулярной области спектра, иммунологически сходных с -интерфероном человека. Один из них практически совпадает по электрофоретической подвижности с -интерфероном человека, два других обладают несколько большей молекулярной массой. Заметное увеличение содержания интерфероноподобных белков наблюдалось в томатах с геном сверхчувствительности Tm-22 при инфицировании растений штаммом N22, вызывающим системный некроз. У растений с геном толерантности Tm-1 не происходит индукции интерфероноподобного механизма противовирусной защиты. Результаты настоящей работы свидетельствуют о том, что одним из сходных защитных механизмов растений и животных является индуцированное вирусной инфекцией образование антивирусных интерфероноподобных веществ.

5. Исследование трансгенных растений табака, экспрессирующих двунитевую РНК

Помимо PR-белков – компонентов врожденной иммунной системы растений, нами были исследованы белки растений при индуцированной устойчивости – в трансгенных растениях табака, экспрессирующих двунитевую РНК (днРНК).

В качестве объекта исследования были использованы трансгенные растения табака, стабильно сохраняющие в течение 3-х поколений конструкцию, несущую экспрессируемую последовательность бактериального происхождения (фрагмент гена устойчивости к тетрациклину) в виде протяженного инвертированного повтора. Данная конструкция обеспечивает синтез в трансгенных растениях РНК, имеющую шпилечную, двунитевую структуру (Смирнов и др., 1993).

       Была исследована устойчивость трансгенных растений табака поколения Т2, устойчивых к канамицину, к штаммам ВТМ, различающимся по степени патогенности. Было установлено, что хотя здоровые трансгенные и нетрансгенные растения табака не различаются фенотипически, у трансгенных зараженных растений наблюдались задержка в сроках развития симптомов, а также изменения в характере симптомов. Степень развития мозаичных симптомов у трансгенных растений табака была слабее, чем у нетрансгенных растений. Полученные результаты свидетельствовали об увеличении устойчивости к заражению ВТМ у трансгенных растений табака, экспрессирующих двунитевую РНК. При этом реакция на разные штаммы была различной.

       Электрофоретический анализ белков листьев здоровых нетрансгенных и трансгенных растений в денатурирующих условиях не выявил различий в электрофоретических спектрах. В трансгенных зараженных растениях было снижено содержание белка оболочки вируса (17,6 кДа) по сравнению с нетрансгенными растениями, что свидетельствовало о меньшем накоплении вируса и коррелировало с повышением устойчивости к ВТМ. Одновременно при заражении трансгенных растений штаммом N22, было обнаружено два новых белка, молекулярные массы которых составили 25 и 30 кДа, обозначенные Р25 и Р30. Структурный анализ белка Р30 выявил гомологию с ксилоглюкан-эндо-1,4--D-глюканазой томата и с глюкан-эндо-1,3--глюкозидазой сои. Белки, обладавшие гомологией с исследованными полипептидами, относятся к одному функциональному семейству растительных -эндоглюканаз. Эти ферменты связаны с метаболизмом углеводных компонентов клеточной стенки: гидролизом О-гликозидной связи в различных полисахаридах, что приводит к расщеплению сложных полимеров на фрагменты и образованию различных олигосахаридов.

Полученные данные позволяют предположить, что индуцированный инфекцией в трансгенных растениях белок с молекулярной массой 30 кДа является новым представителем семейства -эндоглюканаз, в регуляции экспрессии которого участвует днРНК. По всей видимости, активация синтеза этого белка зависит не только от присутствия днРНК, но требует дополнительно некоторого вирусного фактора. Это говорит в пользу участия этого белка в защите или патогенезе.

6. Исследование антимикробных пептидов пшеницы Triticum kiharae Dorof. et Migusch.

Важнейшей группой защитных полипептидов, относящихся к группе PR-белков, являются антимикробные пептиды. Хотя к началу настоящего исследования они были выделены из ряда растений, многие аспекты, касающиеся их молекулярного полиморфизма у отдельных видов растений, специфичности в отношении отдельных групп патогенов, механизма действия, структуры генов и регуляции их экспрессии оставались мало изученными. В связи с этим был проведен систематический анализ катионных АМП зерновок пшеницы вида Triticum kiharae Dorof. et Migusch., которая представляет собой синтетический аллополиплоид, полученный от скрещивания Triticum timopheevii с Aegilops tauschii, обладающий повышенной устойчивостью к патогенам. К началу наших исследований сведения об АМП пшеницы этого вида отсутствовали.

6.1. Выделение и характеристика антимикробных пептидов вида T. kiharae

Была разработана методика выделения АМП из этого вида растения, сочетающая в себе различные виды ВЭЖХ (аффинную, эксклюзионную и обращенно-фазовую) с масс-спектрометрией, секвенированием аминокислотных последовательностей и испытаниями биологической активности. В результате из пшеницы Т. kiharae было выделено 24 новых пептида. На основе гомологии аминокислотных последовательностей и цистеинового мотива, характерного для каждого семейства растительных АМП, все полученные пептиды были отнесены к известным семействам: дефензинов, тионинов, гевеиноподобных пептидов, ноттиноподобных пептидов и липид-переносящих белков. Кроме того, нами впервые было обнаружено новое семейство глицин-богатых пептидов, а также семейство 4-Cys пептидов, гомологов 4Cys-пептида кукурузы MBP-1 (Duvick et al., 1992). Обнаружены также новые структурные типы дефензинов и гевеиноподобных пептидов.

На рис. 16 приведены различные стадии очистки АМП семян пшеницы T. kiharae. .Выделенные пептиды были охарактеризованы по молекулярным массам, аминокислотным последовательностям и биологической активности в отношении важнейших фитопатогенных грибов и бактерий.

Рис. 16. Выделение АМП из семян Т. kiharae . I. 100-мМ фракция; II. 500-мМ фракция; (а) эксклюзионная ВЭЖХ на колонке Superdex HR 10/30, отмечены границы объединения фракций А-Е. ОФ-ВЭЖХ фракций С (b), D (c) и E (d).

6.2. Глицин-богатые пептиды

Новые глицин-богатые пептиды, выделенные из семян пшеницы, приведены в табл. 6.

Таблица 6.

Глицин-богатые пептиды пшеницы T. kiharae*

Пептид

N-концевая аминокислотная последовательность

Мол. масса, Да

Tk-AMP-G1

GGGGGGGGYHGGGGGGYPGH20

4294

Tk-AMP-G2

GGGGAGGGYPGHGGGGYPGHGGGGGGGGYPGHGGGGGGGGGGGGGGGGGG50

4375

Tk-AMP-G3

GGYPGGGGGG10

4668

Tk-AMP-G4

GGYPGGGGAG10

4750

Tk-AMP-G5

GGGGGXGY8

4844

4917

Tk-AMP-G6

Tk-AMP-G7

HHGGGDQAHGDR

HHGGGGHGHGDR

4360

4603

Tk-AMP-G8

XGXGGGGRGGGYPGRG16

4285

*Повторяющиеся аминокислотные мотивы выделены жирным шрифтом.

Для большинства из них показано отсутствие остатков цистеина в молекуле. Для этих пептидов, помимо высокого содержания глицина, характерно наличие повторяющихся олигопептидных мотивов, наличие которых отражает происхождение кодирующих их генов путем многократных дупликаций предкового гена.

6.3. Дефензины T. kiharae

В семенах T. kiharae нами были частично охарактеризованы 11 дефензинов, которые по гомологии N-концевых последовательностей были подразделены на 3 структурные группы: Tk-AMP-D (группа I), Tk-AMP-1, Tk-AMP-2, Tk-AMP-3 (группа II), Tk-AMP-2 и Tk-AMP-3 (группа III). Большинство из них (пептиды Tk-AMP-D) являются новыми, ранее не описанными, и представляют собой новый подкласс дефензинов пшеницы - дефензины группы I. Были установлены полные аминокислотные последовательности D дефензинов T. kiharae, а также родственных пшенице видов родов Triticum и Aegilops, которые рассматриваются как доноры геномов полиплоидных пшениц (табл. 7).

Таблица 7.

Аминокислотные последовательности дефензинов T. kiharae и T. monococcum

Пептид

Аминокислотная последовательностьa

Tk-AMP-D1

RTCQSQSHKFKGACFSDTNCDSVCRTENFPRGQCNQHHVERKCYCERDC

Tm-AMP-D1.2

RTCQSQSHKFKGACFSDTNCASVCRTENFPRGQCNQHHVERKCYCERDC

Tk-AMP-D2

RTCESQSHKFKGPCFSDSNCATVCRTENFPRGQCNQHHVERKCYCERSC

Tk-AMP-D1.1

RDCESDSHKFHGACFSDTNCANVCQTEGFTAGKCVG--VQRHCHCTKDC

Tk-AMP-D5

RECRSESKKFVGLCVSDTNCASVCLTERFPGGKCDG--Y-RRCFCTKDC

Tk-AMP-D6

RDCRSQSKTFVGLCVSDTNCASVCLTEHFPGGKCDG--Y-RRCFCTKDC

Tk-AMP-D6.1

RECRSQSKQFVGLCVSDTNCASVCLTEHFPGGKCDG--Y-RRCFCTKDC

Tk-AMP-D3

RDCKSDSHKFHGACFSDTNCANVCQTEGFTRGKCDG--I--HCHCIKDC

Tk-AMP-D4

RDCTSQSHKFVGLCLSDRNCASVCLTEYFTGGKCD-H---RRCVCTKGC

Консенсусная последовательность

R-C-S-Sb-F-GhChSD-NC--VC-TE-F--G-C-------bChC-b-C

В табл. 7 аминокислотные остатки, различающиеся у всех или некоторых последовательностей, выделены, соответственно, светло- и темносерым цветом. В нижней строке приведена консенсусная последовательность, в которой консервативные остатки цистеина и некоторых других аминокислот выделены жирным шрифтом. “h” и “b” обозначают гидрофобные и основные аминокислоты, соответственно.

Cравнение аминокислотных последовательностей D дефензинов с дефензинами других злаков по программе Clustal W (рис. 17) выявило наибольшую гомологию с TAD1, дефензиноподобным пептидом, экспрессирующимся в пшенице при холодовой адаптации (Koeke et al., 2002).

Растение Дефензин  Аминокислотная последовательность

Triticum kiharae Tk-AMP-D1  RTCQSQSHKFKGACFSDTNCDSVCRT-E--NFPRGQCNQHHVERKCYCERDC- 49

Triticum kiharae Tk-AMP-D1.2  RTCQSQSHKFKGACFSDTNCASVCRT-E--NFPRGQCNQHHVERKCYCERDC- 49

Triticum kiharae Tk-AMP-D2 RTCESQSHKFKGPCFSDSNCATVCRT-E--NFPRGQCNQHHVERKCYCERSC- 49

Triticum aestivum†  TAD1  RTCLSQSHKFKGTCLSNSNCAAVCRT-E--NFPDGECNTHLVERKCYCKRTC- 49

Triticum kiharae  Tk-AMP-D3  RDCKSDSHKFHGACFSDTNCANVCQT-E--GFTRGKCDG--I--HCHCIKDC- 45

Triticum kiharae  Tk-AMP-D1.1 RDCESDSHKFHGACFSDTNCANVCQT-E--GFTAGKCVGVQ--RHCHCTKDC- 47

Triticum kiharae  Tk-AMP-D6  RDCRSQSKTFVGLCVSDTNCASVCLT-E--HFPGGKCDG--Y-RRCFCTKDC- 46

Triticum kiharae  Tk-AMP-D6.1  RECRSQSKQFVGLCVSDTNCASVCLT-E--HFPGGKCDG--Y-RRCFCTKDC- 46

Triticum kiharae  Tk-AMP-D5  RECRSESKKFVGLCVSDTNCASVCLT-E--RFPGGKCDG--Y-RRCFCTKDC- 46

Triticum kiharae  Tk-AMP-D4  RDCTSQSHKFVGLCLSDRNCASVCLT-E--YFTGGKCD-H---RRCVCTKGC- 45

Zea mays 1-Z  RVCRRRSAGFKGVCMSDHNCAQVCLQ-E--GYGGGNCDG-IM-RQCKCIRQC- 47

Sorghum bicolor SI-1 RVCMGKSQHHSFPCISDRLCSNECVKEE-GGWTAGYCHLR-Y---CRCQKAC- 47

Sorghum bicolor SI-3 RVCRRRSAGFKGLCMSDHNCAQVCLQ-E--GWGGGNCDG-VI-RQCKCIRQC- 47

Sorghum bicolor SI-2 RVCMGKSAGFKGLCMRDQNCAQVCLQ-E—-GWGGGNCDG-VM-RQCKCIRQCW 48

Hordeum vulgare  1-H RICRRRSAGFKGPCVSNKNCAQVCMQ-E--GWGGGNCDGP-L-RRCKCMRRC- 47

Triticum turgidum  1-P KICRRRSAGFKGPCMSNKNCAQVCQQ-E--GWGGGNCDGP-F-RRCKCIRQC- 47

Triticum turgidum  2-P KVCRQRSAGFKGPCVSDKNCAQVCLQ-E--GWGGGNCDGP-F-RRCKCIRQC- 47

Zea mays  2-Z  RVCMGKSQHHSFPCISDRLCSNECVK-EDGGWTAGYCHLR-Y---CRCQKAC- 47

Raphanus sativum Rs-AFP2  QKLCQRPSGTWSGVCGNNNACKNQCIRLEK--ARHGSCNYVFPAHKCICYFPC- 51

Рис. 17. Аминокислотные последовательности некоторых дефензинов растений. †Последовательность  установлена по структуре гена. Элементы вторичной структуры отмечены темно-серым (-спирали) и серым (-тяжи) (Lay, Anderson, 2005).

Рис. 18. Филогенетическое древо, отражающее эволюционные связи между представителями семейства злаковых, построенное на основе данных о первичной структуре дефензинов.

6.4. Локализация детерминант антифунгальной активности в молекулах дефензинов

Для локализация детерминант антифунгальной активности в молекулах дефензинов злаков было проведено сравнение аминокислотных последовательностей дефензинов пшеницы Tk-AMP-D1 и Tk-AMP-D6, обладающих низкой антифунгальной активностью к ряду фитопатогенов (A. consortiale, B. cinerea, H. sativum, F. сulmorum, C. graminicola и D. maydis) с дефензином ежовника обыкновенного Echinochloa crusgalli (L.) Beauv., обладающим высокой ингибирующей активностью по отношению к этим патогенам. Дефензины ежовника и пшеницы обладают высокой гомологией первичной структуры, особенно в N-концевой области молекулы (остатки 1-27), которая достигает 85%. Таким образом, можно предположить, что различия в антифунгальной активности между дефензинами Tk-AMP-D1 T. kiharae и Ec-AMP-D1 E. crusgalli связаны с различиями в аминокислотной последовательности в С-концевой области молекул.

Выявленная нами высокая гомология дефензинов в N-концевой области молекул свидетельствует о значительном консерватизме этого участка в эволюции, который сохранился почти неизменным после дивергенции триб Paniceae (E. crusgalli) и Triticeae (T. kiharae). Можно предположить, что консерватизм этой части молекул дефензинов связан с какими-то общими жизненно важными функциями (например, структурной), в то время как С-концевой участок молекул отвечает за функциональную специфичность.

6.5. Дефензины видов Triticum и Aegilops

Помимо дефензинов T. kiharae, были выделены и охарактеризованы также дефензины диплоидных видов родов Triticum и Aegilops, предполагаемых доноров А, В и D геномов. Было установлено, что структура D дефензинов высоко консервативна в эволюции. Кроме того, набор дефензинов у исследованных видов специфичен: каждый из них содержит лишь некоторые дефензины, обнаруженные у гексаплоидной пшеницы (табл. 7). В результате была определена локализация генов, кодирующих дефензины, в геномах полиплоидной пшеницы. Сходство в наборе дефензинов у устойчивых (T. kiharae) и восприимчивых форм пшеницы (T. aestivum сорта Хакасская и Родина) свидетельствует о том, что различие в устойчивости, по всей видимости, связано с уровнем экспрессии генов дефензинов.

Таблица 8.

Состав дефензинов в семенах T. kiharae и родственных видов

Вид

Геномный состав

D1

D1.1

D1.2

D2

D3

D3.1

D4

D5

D6

D6.1

T. monococcum

AbAb

-

+

+

-

-

-

+

+

-

-

Ae. speltoides

BB

-

-

-

+

-

+

-

-

-

+

Ae. squarrosa

DD

-

-

-

+

+

-

-

-

+

-

T. timopheevii

AbAbGG

+

-

-

+

-

-

+

+

-

+

T. militinae

AbAbGG

-

-

+

+

-

-

+

+

-

+

T. aestivum сорт Родина

AuAuBBDD

+

+

-

+

+

-

+

+

+

+

T. aestivum сорт Хакасская

AuAuBBDD

+

+

-

+

+

-

+

+

+

+

T. kiharae

AbAbGGDD

+

+

-

+

+

-

+

+

+

+

6.6. Исследование нового структурного типа 10-Cys гевеиноподобного пептида WAMP T. kiharae

Из пшеницы были выделены и просеквенированы новые гевеиноподобные пептиды WAMP-1a и WAMP-1b, различающиеся по наличию дополнительного С-концевого остатка аргинина у WAMP-1b (рис. 19).

WAMP-1a и WAMP-1b представляют собой новый структурный тип АМП. Они обладают гомологией с гевеиноподобными АМП, однако в их молекулах содержится 10 остатков цистеина, расположенных уникальным образом, поэтому их можно отнести к новому структурному типу 10-Cys гевеиноподобных пептидов с новым цистеиновым мотивом (рис. 19). Обращает на себя внимание сходство пептидов WAMP с хитин-связывающими доменами хитиназ класса 1 (рис. 19). Другой особенностью новых пептидов является замена консервативного остатка серина на глицин в углеводсвязывающем сайте, хотя способность связываться с хитином сохраняется.

Pис. 19. Сравнение аминокислотных последовательностей пептидов WAMP с некоторыми гевеиноподобными АМП и хитин-связывающими доменами хитиназ класса I. Консервативные остатки цистеина выделены черным, идентичные или сходные аминокислотные остатки выделены серым цветом. Консервативные остатки углевод-связывающего сайта отмечены звездочками, как и остаток глицина, заменяющий консервативный остаток серина в хитин-связывающем сайте.

Исходя из гомологии с гевеином, мы предположили существование следующих дисульфидных связей в пептидах WAMP: Сys4-Сys19, Сys13-Сys25, Сys18-Сys32, Сys37-Сys41. дополнительная пятая дисульфидная связь образована между Сys16 и Сys44. Такое расположение дисульфидных связей подтверждается рентгеноструктурным анализом хитиназы класса 1 риса (Kezuka, Nishizawa, Watanabe, Nonaka, accession number 2DKV_A).

6.7. Получение рекомбинантного пептида WAMP-1a

Для того чтобы получить достаточное количество пептида для функциональных исследований, была проведена гетерологичная экспрессия синтетического гена этого пептида в клетках E. coli. Целевой пептид экспрессировали в составе гибридного белка с тиоредоксином, поскольку было известно, что в этом случае достигается высокий выход целевого пептида в нативной конформации. Используя данные по аминокислотной последовательности пептида WAMP-1a, из синтетических олигонуклеотидов методом ПЦР был сконструирован ген, кодирующий этот пептид. Этот ген был клонирован в экспрессионный вектор pET-32b и образовавшаяся плазмида (pET-32-M-WAMP-1a) была использована для трансформации клеток E. coli BL21(DE3). Образование гибридного белка Trx- WAMP-1a и его очистку контролировали с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии ДДС-Na (pис. 20). Химерный белок обрабатывали бромцианом, и рекомбинантный пептид WAMP-1a очищали путем ОФ-ВЭЖХ (рис. 20). Рекомбинантный пептид обладал тем же временем удерживания на колонке, что и нативный WAMP-1a при ОФ-ВЭЖХ и имел ту же N-концевую аминокислотную последовательность. Его молекулярная масса, измеренная методом MALDI-TOF MS, также совпадала с массой нативного пептида. Выход очищенного рекомбинантного пептида WAMP-1a составил около 8 мг/л культуры.

Рис. 20. Экспрессия и очистка гибридного белка Trx- WAMP-1a. ОФ-ВЭЖХ продуктов расщепления гибридного белка Trx-WAMP-1a бромцианом. Фракция, соответствующая WAMP-1a, отмечена стрелкой. На вставке - экспрессия и очистка гибридного белка Trx-WAMP-1a по данным электрофореза в ДДС-ПААГе (10%). (1) маркеры молекулярных масс, (2) лизат клеток E. coli BL21(DE3) с плазмидой pET-32b-M- WAMP-1a, до обработки IPTG, (3) после обработки 0,2 мМ IPTG, (4) растворимая фракция белков, (5) очищенный гибридный белок.

6.8. Антимикробная активность рекомбинантного пептида WAMP-1a

       Определение биологической активности пептида в отношении ряда грибов, включая дейтеромицеты и аскомицеты, выявило существенное ингибирование прорастания спор при микромолярных концентрациях пептида, IC50 варьировала от 5 до 30 мкг/мл в зависимости от гриба.

       Пептид также обладал способностью ингибировать рост фитопатогенных грамположительных (C. michiganense) и грамотрицательных (P. syringae и E. carotovora) бактерий. В случае грамположительных бактерий эффект был более выражен. Антифунгальные свойства пептида WAMP-1a, по всей видимости, связаны с его хитинсвязывающей активностью, в то время как активность в отношении оомицета Ph. infestans и бактерий, которые лишены хитина, обусловлена каким-то иным механизмом.

6.9. Установление структуры предшественника пептида WAMP-1a

Была установлена полная нуклеотидная последовательность мРНК, кодирующей пептид WAMP. Методом 3’- и 5’-RACE с использованием вырожденных праймеров, подобранных по аминокислотной последовательности пептида WAMP-1a была определена последовательность его кДНК длиной в 670 нуклеотидов (рис. 21).

ggaggaggcaccaagatcatgaagccacacatgtccgctacggtactgag

agccccgagggtggcggccatcctcctggccgtggtcctggcggcggtgc

tcgccacggccgtgaacggcgcccagaggtgcggcgaccaggcccgcggc

gcaaagtgccccaactgcctctgctgcggtaaatacggcttctgcggcag

tggcgacgcctactgcggcgccggcagctgccagagccagtgccgcggct

gccgggacgacgtcgtggggcaggcgttgccggccgaaccgggttctaca

agagctactgcggcgtcctcggcgtcggccaggggattaaacttgactgc

tacaaccggaggcccttgaacggctgggctcgcgtcgcagtgaagacggc

cggtgactacatagagcgtgagccctggacgaataatctcgacaagtact

agtatgtgaaaaaaataaatggacgaatgatttcccatttgtcttgtctt

atcgtgcatcagcatctttttgtcttcaataagaaatgggacagagaact

tgggtctagccagccggtggtaaagacctcctgaaggggtgtgttaattt

cgtcaatatttagagctctgcaattcagtctttaatatacatttgaaaaa

aaaaaaaaaaaaaaaaaaaa

Рис. 21. Нуклеотидная последовательность кДНК пептида WAMP-1а. Кодоны инициации и терминации трансляции выделены жирным шрифтом.

Оказалось, что структура экспрессируемого предшественника (препропептида) состоит из сигнального пептида и зрелой части, которая включает последовательность зрелого пептида и С-концевой продомен:

MKPHMSATVLRAPRVAAILLAVVLAAVLATAVNGAQRCGDQARGAKCPNCLCCGKYGFCGSGDAYCGAGSCQSQCRGCRDDVVGQALPAEPGSTRATAASSASARGLNLTATTGGP

Установлено, что, помимо изучаемого пептида WAMP-1а, в пшенице экспрессируется мРНК двух высокогомологичных ему пептидов сходной структуры, отличающихся от него заменой Аla34 на Lys34 в зрелой части.

6.10. Влияние биотических и абиотических факторов на экспрессию гена WAMP-1а

       Была исследована регуляция экспрессии гена пептида WAMP-1а стрессовыми факторами среды. Для оценки уровня экспрессии мРНК в ответ на стрессовые воздействия биотической и абиотической природы использовали метод полуколичественной ОТ-ПЦР. Биотический стресс создавали воздействием грибных патогенов при инфицировании ими прорастающих семян пшеницы. Для изучения воздействия абиотического стресса были выбраны температурный и солевой стресс разной интенсивности. При изучении воздействия температурного стресса достоверных различий обнаружено не было ни в случае гипотермического стресса, ни при воздействии повышенной температуры.

При изучении воздействия солевого стресса было выявлено значительное  увеличение экспрессии мРНК пептида WAMP-1a (рис. 22). Под действием соли количество транскриптов изучаемого гена возрастает в 4,3 - 5,7 раза, зависимость от концентрации NaCl не выражена.

При изучении воздействия биотического стресса было установлено, что грибные патогены оказывают различное действие на экспрессию мРНК пептида WAMP-1a. При заражении зерновок непатогенным для пшеницы грибом A. niger не наблюдалось достоверных различий в уровне экспрессии между опытным и контрольным образцом. При заражении патогенными грибами F. oxysporum происходило достоверное увеличение уровня экспрессии мРНК пептида WAMP-1а. Максимальный уровень увеличения экспрессии, наблюдавшийся у зараженных растений по сравнению с контрольной группой, состоял в 5-кратном усилении экспрессии.

При изучении воздействия биотического стресса было установлено, что грибные патогены оказывают дифференцированное действие на экспрессию мРНК пептида WAMP-1a. При заражении зерновок непатогенным для пшеницы грибом A. niger не наблюдалось достоверных различий в уровне экспрессии между опытным и контрольным образцом. При заражении  патогенными грибами F. oxysporum происходило достоверное увеличение уровня экспрессии мРНК пептида WAMP-1а. Максимальный уровень увеличения экспрессии, наблюдавшийся у зараженных растений по сравнению с контрольной группой, состоял в 5-кратном усилении экспрессии. Различия между контрольным образцом и образцами, пораженными F. graminearum и H. sativum, не были достоверными.

Полученные нами данные о том, что синтез WAMP-1a при нормальных условиях вегетации осуществляется  в 5-дневных проростках, свидетельствует о его роли на ранних стадиях развития растения, а накопление этого пептида при действии патогенов и в условиях солевого стресса дает основание предполагать его участие в устойчивости к биотическому и абиотическому стрессу.

6.11. 4-Cys пептиды

Помимо дефензинов из семян T. kiharae нами было выделено 2 новых АМП, названных Tk-AMP-X1 и Tk-AMP-Х2, содержащих по 4 остатка цистеина в молекуле. С помощью масс-спектрометрии были установлены точные молекулярные массы этих пептидов: 3517 и 3857 Да, соответственно и определены их полные аминокислотные последовательности.

Tk-AMP-X1        1TDDRCERMCQHYHDRREKKQCMKGCRYGESD31

Tk-AMP-X2        1ADDRCERMCQRYHDRREKKQCMKRCRYG28

Было установлено, что остатки цистеина в этих пептидах соединены следующим образом: Сys5-Cys25 и Cys9-Cys21.

Сравнение аминокислотных последовательностей пептидов Tk-AMP-X1 и Tk-AMP-X2 показало, что выделенные пептиды обладают высокой гомологией. Установлено, что они ингибируют прорастание спор некоторых фитопатогенных грибов (F. graminearum, F. verticillioides, C. graminicola и D. maydis) in vitro показало,  действуя в микромолярных концентрациях (табл. 9).

Таблица 9.

Антифунгальные свойства пептидов Tk-AMP-X1 и Tk-AMP-Х2*

Пептид

Tk-AMP-X1

Tk-AMP-Х2

Fusarium graminearum

7,5

7,5

Fusarium verticillioides

15

10

Diplodia maydis

30

17

*Приведены значения IC50, мкМ

       Подводя итог исследованию молекулярного полиморфизма антимикробных пептидов пшеницы, следует особо отметить, что в этом виде присутствуют практически все известные у растений семейства АМП.: тионины, дефензины, ноттиноподобные пептиды и липид-переносящие белки. Кроме ранее известных семейств, нами были обнаружены новые семейства, ранее не описанные у растений. Так, было открыто новое семейство глицин-богатых пептидов, семейство 4-Cys пептидов, новое подсемейство D дефензинов и новый структурный тип гевеиноподобных пептидов. Полученные нами результаты значительно расширяют наши представления о чрезвычайном структурном многообразии молекулярных компонентов защитной системы злаков.

Представляло интерес выяснить, является ли высокий молекулярный полиморфизм характерным лишь для злаковых, либо он присущ также другим видам растений. Для решения этого вопроса были исследованы антимикробные полипептиды у представителя двудольных растений семейства Asteraceae – одуванчика лекарственного Taraxacum officinale.

Исследование полипептидов семян Taraxacum officinale, обладающих антифунгальной активностью, показало, что в отличие от T. kiharae, основными детерминантами антифунгальной активности полипептидной природы в семенах T. officinale являются не АМП, а запасные 2S альбумины, представленные несколькими изоформами, каждая из которых состоит из двух субъединиц, соединенных двумя дисульфидными связями. Установлено, что эти белки способны подавлять рост ряда фитопатогенных грибов и оомицета Ph. infestans в микромолярных концентрациях, причем изоформы различаются по активности. Эти результаты свидетельствуют о многообразии и видоспецифичности защитного арсенала растений.

ВЫВОДЫ

1. Разработана методология разделения и очистки запасных и защитных белков растений, позволяющая проводить структурно-функциональный анализ мономерных и полимерных проламинов (сем. Poaceae), 2S альбуминов (сем. Asteraceae), глобулинов (сем. Cucurbitaceae), PR-белков (сем. Solanaceae) и антимикробных пептидов (сем. Poaceae).

2. Впервые у гексаплоидной пшеницы Triticum aestivum проведено определение и сравнение N-концевых аминокислотных последовательностей глиадинов, кодируемых одним кластером генов (1D1 и 1B1), а также кластерами гомеологичных хромосом (D и B). Установлено, что компоненты одного кластера генов, локализованного на коротком плече хромосомы 1D (блок 1D1 у пшеницы Безостая 1) и  хромосомы 1В (блок 1В1), существенно различаются по N-концевым аминокислотным последовательностям. У -глиадинов выявлено существование трех типов N-концевых аминокислотных последовательностей и показано, что N-концевые аминокислотные последовательности -глиадинов, кодируемых геномом D, значительно дивергировали от последовательностей -глиадинов генома В. В то же время выявлен значительный консерватизм аминокислотных последовательностей -глиадинов, кодируемых хромосомами А, В и D.

3. В - и -глиадинах обнаружены короткие повторяющиеся олигопептидные мотивы, что дает основание полагать, что гены - и - глиадинов произошли в результате многократных дупликаций коротких нуклеотидных последовательностей ДНК.

4. Исследование глиадинов двух видов эгилопсов Ae. squarrosa и Ae. longissima – предполагаемых доноров геномов B и D пшеницы, выявило высокую внутривидовую изменчивость этих видов и показало, что у эгилопсов встречаются те же типы N-концевых аминокислотных последовательностей глиадинов, как у гексаплоидных пшениц. Таким образом, хотя гены проламинов и претерпевали изменения в ходе эволюции за счет мутаций и хромосомных перестроек, определенная часть их последовательностей оставалась консервативной в течение длительного эволюционного периода.

5. Дисульфидное картирование двух представителей суперсемейства проламинов - глиадина -46 пшеницы и 2S альбумина подсолнечника выявило высокий консерватизм расположения дисульфидных связей как между глиадинами и 2S альбуминами, так и в пределах каждой из этих групп белков. В то же время у других членов суперсемейства проламинов, ингибиторов -амилаз и трипсина злаков, только две дисульфидные связи с участием двух соседних остатков цистеина сохраняют свое положение. Эти различия, по всей видимости, связаны с необходимостью поддерживать структуру активных центров при взаимодействии с ферментами-мишенями.

6. При исследовании субъединиц глютенина гексаплоидной пшеницы T. aestivum. обнаружена новая D субъединица глютенина и показана ее роль в терминации роста полимерной цепи глютенинов, определяющей качество клейковины пшеницы. Показан консерватизм аминокислотных последовательностей в окружении остатков цистеина у высокомолекулярных субъединиц глютенина HMWx7 и HMWy18, и аллельной пары HMWx7 и HMWy9, обусловливающих хорошие вязко-эластичные свойства клейковины, что свидетельствует о ключевой роли дисульфидных связей в формировании надмолекулярной структуры клейковинного комплекса..

7. При использовании разработанного метода разделения полимеров глютенина в агарозном геле с измерением светорассеяния установлено, что молекулярные массы полимеров глютенина варьирует от 500000 до 5 млн. дальтон. Предложенный метод может быть использован для фракционирования глютенинов сортов пшениц, различающихся по технологическим характеристикам, а также для разделения других высокомолекулярных полимерных белков.

8. Разработаны электрофоретический и хроматографический методы исследования полиморфизма запасных белков тыквенных культур. Показана возможность идентификации генетически отдаленных форм огурца по электрофоретическим спектрам альбуминов, разделенных методом электрофореза в денатурирующих и кислых условиях, а также районированных сортов тыкв по электрофоретическим спектрам кукурбитина и альбуминов, а также по профилю элюции кислоторастворимых альбуминов при ОФ-ВЭЖХ.

9. Впервые изучено наследование субъединиц кукурбитина – основного глобулина семян тыквенных культур. Показано, что: компоненты электрофоретического спектра кукурбитина наследуются кодоминантно при отсутствии эффекта дозы генов. Аллели представлены отдельными полипептидами в электрофоретическом спектре, различающимися по относительной подвижности, а синтез вариабельных компонентов кукурбитина контролируется 4 независимыми локусами.

10. Предложена генетическая классификация кукурбитина и способ записи электрофореграмм этого белка в виде генетических формул, составленных для 38 сортов тыкв отечественной селекции. Показано, что большинство районированных сортов тыкв гетерогенны по кукурбитину. Эффективность предложенного экспресс-метода определения сортовой чистоты семян тыкв по электрофоретическим спектрам кукурбитина превышает традиционно используемый грунтконтроль.

11. Изучены PR-белки, относящиеся к защитной системе растений, у томатов с разными генами устойчивости (Tm-1, Tm-2 и Tm-22) к ВТМ инфекции. Обнаружены специфические белки, характерные для каждого генотипа, которые могут быть использованы в качестве маркеров соответствующих генов в селекционном процессе.

12. Впервые исследованы трансгенные растения табака, экспрессирующие двунитевую РНК, не имеющую гомологии с геномами вируса и табака, и показано повышение устойчивости трансгенных растений к тобамовирусам. В инфицированных трансгенных растениях выявлен индуцируемый инфицированием синтез двух новых полипептидов, относящихся к PR-белкам -семейству -эндоглюканаз растений. Высказано предположение об участии этих белков в системе антивирусной защиты растений.

13. Среди PR-белков при вирусной инфекции в растениях томатов различного генотипа обнаружены интерфероноподобные белки, что свидетельствует о том, что у растений и животных действует сходный механизм защиты от патогенов, связанный с образованием антивирусных интерфероноподобных веществ.

14. Впервые при систематическом анализе антимикробных пептидов, важнейших компонентов врожденной защитной системы растений, у пшеницы Triticum kiharae Dorof. et Migusch. выделены 24 новых пептида, относящихся к 6 семействам, и установлена первичная структура 12 из них. Обнаружено новое семейство глицин-богатых пептидов растений и новый структурный тип гевеиноподобных пептидов. Выявлена высокая ингибирующая активность этих пептидов в системе in vitro в отношении ряда фитопатогенов.

15. Впервые показано наличие в зерновках пшеницы практически всех известных семейств антимикробных пептидов растений. Высокий молекулярный полиморфизм защитных пептидов у рода Triticum, вероятно, обеспечивает адаптацию к неблагоприятным факторам окружающей среды и является одной их причин, которые обусловливают распространение злаков по всем континентам и климатическим зонам Земного шара.

16. Выявлен молекулярный полиморфизм в пределах семейств антимикробных пептидов Triticum kiharae, который реализуется как на генном уровне (дефензины), так и на посттранскрипционном уровне (4-Cys и 6-Cys пептиды). Показано, что семейство дефензинов Triticum kiharae структурно неоднородно, и состоит, по крайней мере, из трех подсемейств, имеющих, по всей вероятности, различное эволюционное происхождение. Установлено, что детерминанты антифунгальной активности дефензинов семейства Poaceae локализованы в С-концевой области молекулы.

17. Впервые изучены дефензины Triticum monococcum, Triticum urartu, Triticum boeoticum, Aegilops squarrosa и Aegilops speltoides, предполагаемых доноров геномов полиплоидных пшениц. Сравнение дефензинов полиплоидных пшениц с дефензинами диплоидных видов свидетельствует о том, что структура дефензинов высоко консервативна в эволюции. Установлена геномная локализация генов дефензинов. Показано, что дефензины D1, D1.1 и D1.2 кодируются геномом А, D3.1 и D6.1 - геномом В, D3 и D6 - геномом D.

18. Среди антимикробных пептидов Triticum kiharae идентифицирован новый пептид WAMP-1, относящийся к ранее неизвестному структурному типу гевеиноподобных пептидов растений, обладающий высокой антифунгальной и антибактериальной активностями. Определена нуклеотидная последовательность кДНК, кодирующая предшественник пептида WAMP-1а и показано, что в пшенице экспрессируются еще две высокогомологичные мРНК. Установлена структура предшественников пептида WAMP-1а и его гомологов и показано, что они состоят из сигнального пептида, зрелого пептида и С-концевого продомена. Исследование регуляции экспрессии гена пептида WAMP-1 выявило высокий уровень экспрессии гена в проростках, а также повышение экспрессии в ответ на солевой стресс и заражение некоторыми фитопатогенными грибами, что свидетельствует об участии этого пептида в защите растений пшеницы от патогенов и солевого стресса. Разработана система гетерологичной экспрессии в прокариотической системе нового гевеиноподобного пептида Triticum kiharae WAMP-1а. позволившая получить рекомбинантный пептид, идентичный нативному, с высоким выходом. Предложенная бактериальная система экспрессии может быть использована при разработке технологии получения антимикробных пептидов.

19. Сравнение антимикробных полипептидов двух видов растений – однодольных Triticum kiharae и двудольных Taraxacum officinale, свидетельствует о видоспецифичности «защитного арсенала» растений. В отличие от пшеницы, в семенах Taraxacum officinale основными детерминантами антифунгальной активности являются не антимикробные пептиды, а запасные 2S альбумины.

20. Исследования запасных и защитных белков гексаплоидных пшениц и предполагаемых доноров их геномов свидетельствуют о том, что генетический состав ныне существующих диплоидных видов не идентичен составу тех видов, которые участвовали в создании тетра- и гексаплоидных пшениц, а также, что геном В культурных пшениц является сложным геномом, который модифицировался в ходе эволюции за счет интрогрессивной гибридизации с различными диплоидными видами родов Triticum и Aegilops.

СПИСОК ОСНОВНЫХ ПУБЛИКАЦИЙ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи:

  1. Чугунова Е.Ю., Одинцова Т.И., Егоров Ц.А., Созинов А.А. Электрофоретическое исследование гетерогенности солерастворимой фракции белков семян хлопчатника. Биохимия, 1985, т.50, №6, с. 1030-1038.
  2. Егоров Ц.А., Одинцова Т.И., Созинов А.А. Селективное выделение омега-глиадинов. Биоорг. химия, 1986, т. 12, №5, с. 599-605.
  3. Одинцова Т.И., Егоров Ц.А., Созинов А.А. Выделение омега-глиадинов с применением хроматографии на тиопропил-сефарозе. Биохимия, 1986, т. 51, №7, с. 1124-1131.
  4. Дегтяренко Л.В., Одинцова Т.И., Кононков П.Ф. Исследование гетерогенности белков семян огурца методом электрофореза. Вестник с.-х. науки, 1986, №2, 132-134.
  5. Батманова Л.С., Одинцова Т.И., Егоров Ц.А., Кононков П.Ф., Созинов А.А. Исследование белков семян капусты методом электрофореза для использования в семенном сортовом контроле, Докл. ВАСХНИЛ, 1987, №7, с. 16-19.
  6. Одинцова Т.И., Овчинников А.А., Егоров Ц.А., Созинов А.А. N-концевые последовательности глиадинов различных глиадин-кодирующих локусов. Докл. АН СССР, 1987, т. 296, №5, с. 156-164.
  7. Egorov Ts.A., Odintsova T.I. Microsequence analysis of prolamins with gas-phase protein sequencer, In: Gluten Proteins (Lastity R., Bekes F., eds.), 1987, World Scientific Publishing Co., Singapore, p.434-440.
  8. Дегтяренко Л.В., Одинцова Т.И., Кононков П.Ф. Электрофорез кукурбитина как метод сортового семенного контроля тыквенных. Доклады ВАСХНИЛ, 1989, №1, с. 17-19.
  9. Одинцова Т.И., Дегтяренко Л.В., Егоров Ц.А., Кононков П.Ф. Высокоэффективная жидкостная хроматография белков семян тыквенных культур. Доклады ВАСХНИЛ, 1989, №7, с. 26-28.
  10. Одинцова Т.И., Егоров Ц.А. Выделение и характеристика глиадинов из семян Aegilops squarrosa. Биохимия, 1989, т. 54, №3, с. 396-407.
  11. Кононков П.Ф., Одинцова Т.И., Дегтяренко Л.В., Батманова Л.С., Крашенинник Н.В., Бунин М.С., Старцев В.И., Осыко Е.В., Егоров Ц.А. Методические указания по анализу белков семян и изоферментов методом электрофореза для контроля сортовой чистоты и селекции капустных и тыквенных культур. ВНИИСиСОК, 1990, Москва, ВАСХНИЛ.
  12. Одинцова Т.И., Янаудите Р.Л., Егоров Ц.А., Извекова Л.И., Андреева Э.Н., Пухальский В.А. Белки томатов при инфекции ВТМ. Докл. АН СССР, 1990, т. 313, №3, с. 733-736.
  13. Одинцова Т.И., Егоров Ц.А. N-концевые аминокислотные последовательности омега-глиадинов Aegilops longissima. К вопросу о происхождении геномов полиплоидных пшениц. Биохимия, 1990, т. 55, № 3, с. 509-516.
  14. Одинцова Т.И., Янаудите Р.Л., Егоров Ц.А., Извекова Л.И., Андреева Э.Н., Пухальский В.А. Обнаружение интерфероноподобных белков в листьях томатов. Докл. АН СССРб 1990, т. 314, № 5, 1250-1252.
  15. Фетисов А.В., Одинцова Т.И., Извекова Л.И., Пухальский В.А. Белки листьев огурца при вирусной инфекции. Изв. Акад. Наук., сер. биол., 1991, №4, с. 619-624.
  16. Одинцова Т.И., Турищева М.С., Андреева Э.Н., Пухальский В.А. Структурно-функциональные изменения в хлоропластах томатов с разными генами устойчивости к вирусу табачной мозаики. Генетика, 1996, т. 32, №11, с. 1545-1552.
  17. Egorov T.A., Odintsova T.I., Musolyamov A.K., Fido R., Tatham A.S., Shewry P.R. Disulphide structure of a sunflower seed albumin: conserved and variant disulphide bonds in the cereal prolamin superfamily. FEBS Letters, 1996, v. 396, p. 285-288.
  18. Одинцова Т.И., Фетисов А.В., Егоров Ц.А., Извекова Л.И,, Андреева Э.Н., Пухальсий В.А. Структурные исследования белка оболочки вируса зеленой крапчатой мозаики огурца. Докл. РАСН, 1996, №6, с.26-28.
  19. Egorov T.A., Odintsova T.I., Shewry P.R., Tatham A.S. Characterisation of high Mr wheat glutenin polymers by agarose gel electrophoresis and dynamic light scattering. FEBS Letters, 1998, v. 434, p. 215-217.
  20. Egorov T.A., Odintsova T.I., Musolyamov A.K. Disulphide mapping of -46 gliadin. J. Protein Chem., 1998, v. 17, p. 531-532.
  21. Егоров Ц.А., Одинцова Т.И., Мусолямов А.Х., Барбашов С.Ф., Пустобаев В.Н., Андерсен Дж., Репсторф П., Попино И. Частичная аминокислотная последовательность глиадина гамма-46. Биохимия, 1998, т. 63, с. 1243-1250.
  22. Егоров Ц.А., Одинцова Т.И., Мусолямов А.Х. Определение дисульфидных связей в глиадине гамма-46. Биохимия, 1999, т. 64, с. 294-297.
  23. Oleskina Yu.P., Yurina N.P., Odintsova T.I., Egorov T.A., Otto A., Wittmann-Liebold B., Odintsova M.S. Nucleoid proteins of pea chloroplasts: detection of a protein homologous tо ribosomal protein.. Biochem. Mol. Biol. Int. 1999, v. 47, № 5, p. 757-763.
  24. Egorov T.A., Odintsova T.I., Musolyamov A., Tatham A, Shewry P., Hojrop P., and Roepstorff P. Biochemical analysis of alcohol soluble polymeric glutenins, D-subunits and omega-gliadins from wheat cv. Chinese Spring. In: Wheat gluten (Shewry P.R., Tatham, A.S., eds.), 2000, The Royal Society of Chemistry, MPG Books Ltd, Botmin, Cornwall, UK, p. 166-170.
  25. Odintsova T.I., Egorov T.A., Musolyamov A.K., Tatham A.S., Shewry P.R., Hojrup P., Roepstorff P. Isolation and characterization of the high-molecular-weight glutenin subunits 17 and 18 from wheat isogenic line L-88-31. In: Wheat gluten (Shewry, P.R., Tatham, A.S., eds.), The Royal Society of Chemistry, MPG Books Ltd, Botmin, Cornwall, UK, 2000, p. 171-174.
  26. Одинцова Т.И., Андреева Э.Н., Пухальский В.А., Мусолямов А.Х., Егоров Ц.А. Структурный анализ белка оболочки вируса зеленой крапчатости огурца. Биохимия, 2000, т. 65, №5, с. 672-679.
  27. Рожнова Н.А., Геращенков Г.А., Одинцова Т.И., Мусин С.М., Пухальский В.А. Синтез новых белков картофеля in vitro при защитном действии арахидоновой кислоты во время вирусной инфекции. Физиол. Раст., 2001, т. 48, №6, с. 897-905.
  28. Родионова Н.А., Дубовая Н.В., Одинцова Т.И., Грачева Т.И., Безбородов А.М. Выделение эндо-1,4-бета-ксиланазы из Geotrichum candidum 3C с разной сорбционной способностью на нерастворимом субстрате. Прикл. биохим. микробиол. 2002, т. 38, №5, с. 490-494.
  29. Odintsova T.I., Muller E.-C., Ivanov A.V., Egorov T.A., Bienert R., Vladimirov S.N., Kostka S., Otto A., Wittmann-Liebold B., Karpova G.G. Characterization and analysis of post-translational modifications of the human large cytoplasmic ribosomal subunit proteins by mass spectrometry and Edman sequencing. J. Protein Chem., 2003, v. 22, № 3, р. 249-258.
  30. Odintsova T.I., Pukhalsky V.A., Egorov T.A., and Musolyamov A.K. Isolation and characterization of antimicrobial peptides from Triticum kiharae. Annual wheat newsletter, 2003, v. 49, p. 124-125.
  31. Коростылева Т.В., Одинцова Т.И., Козловская Г.В., Пухальский В.А. Исследование белков листьев в трансгенных растениях табака, экспрессирующих двунитевую РНК, при вирусной инфекции. Генетика, 2004, т. 40, №4, с. 531-537.
  32. Odintsova T.I., Pukhalsky V.A., Musolyamov A.K., Egorov T.A. Analysis of antimicrobial peptides from seeds of Triticum kiharae Dorof. et Migush. Annual wheat newsletter, 2004, v. 50, p. 152-153.
  33. Egorov T.A., Odintsova T.I., Pukhalsky V.A., Grishin E.V. Diversity of wheat antimicrobial peptides. Peptides, 2005, v. 26, p. 2064-2073.
  34. Rozhnova N., Odintsova T.I., Musin S., Gerashchenkov G. Protein patterns in potato plants in vitro during systemic antiviral resistance induced by alpha-tocopherol acetatae. Proc. Latv. Acad. Sci., 2005, v. 59, p. 67-72.
  35. Odintsova T.I., Egorov T.A., Musolyamov A.K., Pukhalsky V.A. Gly-rich antimicrobial peptides from seeds of Triticum kiharae Dorof. et Migusch. Annual wheat newsletter, 2005, v. 51, p. 137-138.
  36. Odintsova T.I., Pukhalsky V.A., Musolyamov A.K., Egorov T.A. Defensins of Triticum kiharae and other wheat species. Annual wheat newsletter, 2006, v. 52, p. 119-121.
  37. Odintsova T.I., Egorov T.A., Musolyamov A.K., Odintsova M.S., Pukhalsky V.A., Grishin E.V. Seed defensins from T. kiharae and related species: Genome localization of defensin-encoding genes. Biochimie, 2007, v. 89, p. 605-612.
  38. Рожнова Н.А., Одинцова Т.И., Геращенков Г.А. Белковый состав листьев табака при индукции антивирусной устойчивости активаторами защитных реакций и ВТМ-инфекцией. Физиол. раст., 2007, т.54, № 6, с. 870-875.
  39. Odintsova T.I., Egorov T.A., Musolyamov A.K.,Korostyleva T.V. Kozlovskaya G.V.  Pukhalsky V.A. Defensins of Triticum kiharae and diploid Triticum and Aegilops species, Annual wheat newsletter, 2007, v. 53, p. 78-79.
  40. Одинцова Т.И., Егоров Ц.А., Коростылева Т.В., Козловская Г.В., Пухальский В.А. Исследование генома культурных растений и их сородичей: исследование спектров дефензинов у устойчивых и восприимчивых к фитопатогенам видов пшеницы. «Динамика генофондов», ФИАН, 2007, с. 139-141, ISBN978-5-902622-13-0.
  41. Пухальский В.А., Одинцова Т.И., Извекова Л.И., Андреева Э. Н. Коростылева Т.В., Истомина Е.А., Славохотова А.А., Шиян А.Н.. Козловская Г.В., Оболенкова Л.А., Бадаева Е.Д., Билинская Е.Н. Проблемы естественного и приобретенного иммунитета растений. К развитию идей Н.И. Вавилова, Вестник ВОГиС, 2007, т.11, №3/4, с. 631-650.
  42. Славохотова А.А., Андреева Э.Н., Шиян А.Н., Одинцова Т.И., Пухальский В.А. Особенности генов белка оболочки российских штаммов вируса зеленой крапчатой мозаики огурца, Генетика, 2007, т.43, № 11, 1535-1540.
  43. Odintsova T.I., Rogozhin E.A., Baranov Yu, Musolyamov A.Kh., Yalpani N., Egorov Ts.A., Grishin E.V. Seed defensins of barnyard grass Echinochloa crusgalli (L.) Beauv. Biochimie, 2008, v. 90, p. 1667-1673.
  44. Odintsova T.I., Korostyleva T.V., Odintsova M.S., Pukhalsky A.V., Grishin E.V., Egorov Ts.A. Analysis of Triticum boeoticum and Triticum urartu seed defensins: To the problem of the origin of polyploid wheat genomes. Biochimie, 2008, v. 90, p. 939-946.
  45. Рогожин Е.А., Одинцова Т.И., Мусолямов А.Х., Смирнов А.Н., Бабаков А.В., Егоров Ц.А., Гришин Е.В. Выделение и характеристика нового липид-переносящего белка из зерновок ежовника обыкновенного (Echinochloa сrusgalli). Прикладная биохимия и микробиология, 2009, т. 45, №4, с. 403-409.
  46. Ощепкова Ю. И., Вешкурова О. Н., Рогожин Е. А., Мусолямов А. Х., Смирнов А. Н., Одинцова Т.. И., Егоров Ц. А., Гришин Е. В., Салихов Ш. И. Выделение липидпереносящего белка Ns-LTP1 из семян чернушки посевной (Nigella sativa). Биоорг. химия, 2009, т. 35, №3; с. 344-349.
  47. Odintsova T.I., Vassilevski A.A., Slavokhotova A.A., Musolyamov A.K., Finkina E.I., Khadeeva N.V., Rogozhin E.A., Korostyleva T.V., Pukhalsky V.A., Grishin E.V., Egorov T.A. A novel antifungal hevein-type peptide from Triticum kiharae seeds with a unique 10-cysteine motif. FEBS J. 2009, v. 276, № 15, p. 4266-4275.
  48. Odintsova T.I., Rogozhin E.A., Sklyar I.V., Musolyamov A.K., Kudryavtsev A.M., Pukhalsky V.A., Smirnov A.N., Grishin E.V., Egorov T.A. Antifungal activity of storage 2S albumins from seeds of the invasive weed dandelion Taraxacum officinale Wigg. Protein Pept Lett. 2009, v. 17.
  49. Utkina L.L., Slavokhotova A.A., Odintsova T.I., Korostyleva T.V., Pukhalskiy V.A., Musolyamov A.K., Egorov T. A. Novel antimicrobial peptides from seeds of Triticum kiharae and Leymus arenarius. Annual Wheat Newsletter, 2009, v. 55, p. 181-183.

Глава в монографии:

       Odintsova T.I. and Egorov Ts.A. Wheat antimicrobial peptides. In: Peptidomics: Methods and        Applications (Soloviev M., Andren P., Shaw C., eds.), 2008, p. 99-117. John Wiley & Sons,        Hoboken, New Jersey.

Авторские свидетельства:

       1. Авторское свидетельство №1498410 на изобретение «Способ определения сортовой        чистоты семян тыквенных культур», Одинцова Т.И., Дегтяренко Л.В., Кононков П.Ф.,        зарегистр. в Гос. реестре изобретений СССР 27.05.1987.

       2. Авторское свидетельство № 1630703 на изобретение «Способ контроля сортовой        чистоты семян крестоцветных культур», Одинцова Т.И., Батманова Л.С., Глазкова-        Степаненко И.С., Кононков П.Ф., зарегистр. в Гос. реестре изобретений СССР        01.11.1990.

Патент:

Патент на изобретение №2380374 (РФ) «Пептид, обладающий антимикробной активностью», Одинцова Т.И., Егоров Ц.А., Гришин Е.В., Василевский А.А., Мусолямов А.Х., Рогожин Е.А., Славохотова А.А., Пухальский В.А., Шиян А.Н., зарегистр. в Гос. реестре изобретений РФ 27.01.2010.

Материалы конференций:

1. Одинцова Т.И., Егоров Ц.А. S-бедные проламины. Выделение и характеристика.        Всесоюзн. симп. «Молекулярные механизмы генетических процессов», 1987, Москва,,        c.133.

  1. Kononkov P.F., Degtyarenko L.V., Odintsova T.I. Identification of Cucurbitaceae species and varieties by electrophoresis of cucurbitin. III International symposium ISTA, 1988, Leningrad,
  2. Egorov T.A., Odintsova T.I., Pukhalsky V.A., Grishin E.V. Wheat peptidomics. 2nd International Conference “Genomics, Proteomics and Bioinformatics for Medicine”, 2004, Moscow.
  3. Егоров Ц.А., Одинцова Т.И., Бабаков Е.В, Пухальский А.В., Гришин Е.В. Разнообразие антимикробных пептидов растений. III сьезд общества биотехнологов России, 2005, Москва, с.111.
  4. Одинцова Т.И., Егоров Ц.А., Коростылева Т.В., Козловская Г.В., Пухальский В.А. Исследование дефензинов пшеницы Triticum kiharae Dorof. et Migusch. III международный симпозиум «Проблемы биохимии, радиационной и космической биологии», 2007, Дубна, Россия, с. 178-181.
  5. Одинцова Т.И., Егоров Ц.А., Коростылева Т.В., Козловская Г.В., Пухальский В.А. Уникальный антимикробный пептид семян пшеницы Triticum kiharae Dorof. et Migusch. Международная конференция «Современная физиология растений: от молекул до экосистем», 2007, Сыктывкар, Россия, с. 301-302.
  6. Одинцова Т.И., Рогожин Е.А., Жабон Е.О., Пухальский В.А., Егоров В.А. Антимикробные пептиды растений. Международная конференция «Научное наследие Н.И. Вавилова - фундамент развития отечественного и мирового сельского хозяйства», 2007, Москва РГАУ-МСХА им. К.А. Тимирязева, с. 178-179.
  7. Одинцова Т.И. Дефензины семян пшеницы. III Российский симпозиум «Белки и пептиды», 2007, Пущино-на-Оке, Россия, с.18.
  8. Уткина Л.Л., Славохотова А.А., Рогожин Е.А., Одинцова Т.И., Пухальский В.А., Кудрявцев А.М. Экспрессия гена нового антимикробного пептида колосняка песчанного Leumus arenarius в прокариотической системе. V сьезд генетиков и селекционеров, 2009, Москва, с.385.
  9. Odintsova T.I., Shcherbakova L, Flavel D., Egorov T.A., Suprunova T. Identification of a novel protein, a putative elicitor from a biocontrol Fusarium oxysporum, inducing tomato resistance to Fusarium wilt pathogen. XIV International Congress on Molecular Plant-Microbe Interactions, 2009, Quebec City, Canada, p.22.
  10. Уткина Л.Л., Славохотова А.А., Коростылева Т.В., Андреев Я.А., Василевский А.А., Рогожин Е.А., Одинцова Т.И., Егоров Ц.А., Гришин Е.В. Гетерологическая экспрессия генов, кодирующих новые защитные пептиды растений зерновок пшеницы Кихара (Triticum kiharae) и колосняка песчаного (Lemus arenarius) в клетках Escherichia coli. V Московский международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития», 2009, Москва.
  11. Коростылева Т.В., Рогожин Е.В., Андреев Я.А., Одинцова Т.И. Изучение влияния биотических и абиотических факторов на экспрессию гена антимикробного пептида WAMP-1а из пшеницы Triticum kiharae Dorof et Migush, Всероссийская научная конференция «Устойчивость организмов к неблагоприятным факторам внешней среды», 2009, Иркутск, Россия, с. 247-250.



© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.